以蛋白质运输受损为特征的疾病很多，包括遗传病例如亨廷顿舞蹈病 (亨廷顿病)、泰-萨克斯病、家族性高胆固醇血症和囊性纤维化。与这些疾 病相关的基因突变常导致蛋白质的错误折叠和/或保留在内质网中。因此，这 些蛋白质常过早降解。
细胞(例如，在组织中)不能表达足够量的重要蛋白质例如酶，可导致 疾病状态，所述疾病状态在蛋白质运输疾病中的表现和严重度不同。例如， 囊性纤维化影响整个机体，导致进行性残疾和早死。呼吸困难是最常见的症 状，并且是由频繁的肺部感染导致的，所述肺部感染用抗生素和其它药物治 疗。许多其它症状，包括鼻窦感染、发育不全、腹泻和不育，是囊性纤维化 对身体其它部分的影响所导致的。囊性纤维化，如同许多以蛋白质运输受损 为特征的其它疾病一样，若不治疗可为致死性疾病。
发明简述
本发明基于，至少部分基于鉴定拯救蛋白质运输缺陷的化合物。这些化 合物能够用于治疗多种以蛋白质运输受损为特征的病症。本发明也基于，至 少部分基于发现在蛋白质运输中有缺陷的细胞能够用于筛选拯救蛋白质运 输缺陷的化合物。
本文涉及治疗或预防以蛋白质运输受损为特征的疾病的方法，该方法包 括向受试者给药式Ia的化合物：

或其药学可接受的衍生物。在式Ia中，Rj和Rk独立地选自氢、烷基、 烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基或芳烷基；或Rj和Rk和与它 们同时相连的碳一起为-C(＝O)-、-CH(OR*)-、-C(＝S)-、-CH(SR*)-、 -CH(NR*R*′)-或-C(＝NR*)-，其中R*和R*′独立地为氢、烷基、烯基、炔基、 环烷基、杂环基、芳基、杂芳基或芳烷基，Rs和Rt独立地选自氢、烷基、 卤素、拟卤素、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基或芳烷基；或 Rs和Rt与它们之间的碳-碳双键一起形成4-6元环烯基、芳基、杂环基或杂 芳基环，其中所述Rs和Rt形成的环任选被0-4个下文定义的取代基R2取代。
本文也涉及式Ia的化合物或其药学可接受的衍生物，其中Rj和Rk独立 地选自氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基或芳烷基； 或Rj和Rk和与它们同时相连的碳一起为-C(＝O)-、-CH(OR*)-、-C(＝S)-、 -CH(SR*)-、-CH(NR*R*′)-或-C(＝NR*)-；Y为NRR”、OR’、SR’或CRR”； 其中R”为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基或芳烷 基，或R”与R3和之间的原子一起为4-6元杂环基或杂芳基环；条件是当Rj 和Rk和与它们同时相连的碳一起为-C(＝O)-时，R”与R3和之间的原子一起 为4-6元杂环基或杂芳基环。在一些实施方案中，当Rj和Rk和与它们同时 相连的碳一起为-C(＝O)-、-CH(OR*)-、-C(＝S)-、-CH(SR*)-、-CH(NR*R*′)- 或-C(＝NR*)-时，Y为NRR”或CRR”，且R”与R3和之间的原子一起为4-6 元杂环基或杂芳基环。在多个式Ia表示的化合物的实施方案中，Rj和Rk独 立地选自氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基或芳烷基， 或Rj和Rk一起为-CH(OR*)-、-C(＝S)-、-CH(SR*)-、-CH(NR*R*′)-或 -C(＝NR*)-。在一些实施方案中，所述化合物为式Ia表示的化合物或其药学 可接受的衍生物，其中Rj和Rk独立地选自氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、 杂环基、芳基、杂芳基或芳烷基。本文也涉及包含该化合物和药学可接受的 载体的药物组合物。
在一些实施方案中，所述化合物为式I表示的结构：

或其药学可接受的衍生物。
在式Ia和I中：
X为O、S或NR，其中R为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、 芳基、杂芳基或芳烷基；在一些实施方案中，当式Ia中的Rj和Rk均为氢时， X为O；
Y为NRR’或OH；其中R’为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、 芳基、杂芳基或芳烷基；在一些实施方案中，Y为NRR”、OR’、SR’或CRR”； 其中R”为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基或芳烷 基，或R”与R3和之间的原子一起为4-6元杂环基或杂芳基环，例如，在下 述化合物中，环A和B表示的杂芳基环：

Z为直接键或NR；
R1为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、芳烷基、 芳烯基、杂芳烷基或杂芳烯基；在一些实施方案中，当式Ia中Rj和Rk均为 氢时，R1为环烷基；在一些实施方案中，当式Ia中Rj和Rk均为氢时，R1 为环烷基且Z为直接键；在一些实施方案中，当式Ia中Rj和Rk均为氢时， R1为环烷基，Z为直接键，且X为O；
n为0-4；
R2选自下述(i)或(ii)：
(i)氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、环烷基、杂环基、 C(A)R110、卤素、拟卤素、OR111、S(D)aR112、NR115R116或N+R115R116R117；或
(ii)取代环上相邻原子的任两个R2基团一起形成亚烷基、亚烯基、亚 炔基或杂亚烷基；
A为O、S或NR125；
R110为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、环烷基、杂环 基、C(A)R126、卤素、拟卤素、OR125、SR125、NR127R128或SiR122R123R124；
R111为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、环烷基、杂环 基、C(A)R129、NR130R131或SiR122R123R124；
D为O或NR125；
a为0、1或2；
当a为1或2时，R112选自氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂 芳鎓、环烷基、杂环基、卤素、拟卤素、OR125、SR125和NR132R133；
当a为0时，R112选自氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、 环烷基、杂环基、SR125和C(A)R129；
R115、R116和R117各自独立地选自下述(a)和(b)：
(a)氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、环烷基、杂环基、 C(A)R129、OR125或NR132R133；或
(b)R115、R116和R117中的任两个一起形成亚烷基、亚烯基、亚炔基、 杂亚烷基，且另一个选自(a)；
R122、R123和R124选自下述(i)或(ii)：
(i)R122、R123和R124各自独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂 芳基、杂芳鎓、环烷基、杂环基、OR125或NR132R133；或
(ii)R122、R123和R124中的任两个一起形成亚烷基、亚烯基、亚炔基、杂 亚烷基；且另一个选自(i)；
R125为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、环烷基或杂环 基；
R126为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、环烷基、杂环 基、OR125或NR134R135；其中R134和R135各自独立地为氢、烷基、烯基、炔 基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、环烷基、杂环基、OR136或NR132R133，或R134 和R135一起形成亚烷基、亚烯基、亚炔基、杂亚烷基，其中R136为氢、烷基、 烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、环烷基或杂环基；
R127和R128选自下述(i)或(ii)：
(i)R127和R128各自独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、 杂芳鎓、环烷基、杂环基、OR125、NR137R138或C(A)R139，其中R137和R138 各自独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、环烷基或杂 环基，或一起形成亚烷基、亚烯基、亚炔基、杂亚烷基；且R139为氢、烷基、 烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、环烷基、杂环基、OR140或NR132R133， 其中R140为烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、环烷基、杂环基； 或
(ii)R127和R128一起形成亚烷基、亚烯基、亚炔基、杂亚烷基；
R129为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、环烷基、杂环 基、OR140或NR132R133；
R130和R131各自独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳 鎓、环烷基、杂环基或C(A)R141，其中R141为烷基、烯基、炔基、芳基、杂 芳基、杂芳鎓、环烷基、杂环基、OR125或NR132R133；或R130和R131一起形 成亚烷基、亚烯基、亚炔基、杂亚烷基；
R132和R133各自独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳 鎓、环烷基、杂环基，或R132和R133一起形成亚烷基、亚烯基、亚炔基、杂 亚烷基；且
R3为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
其中X、Y、Z、R1、R2和R3，或在一些实施方案中，X、Y、Z、R、R’、 R”、R*、R1、R2和R3各自独立地未被取代或被一个或多个取代基取代，在 一个实施方案中被1个、2个或3个取代基取代，所述取代基各自独立地选 自Q1，其中Q1为卤素、拟卤素、羟基、氧代基团、硫代基团、腈、硝基、 甲酰基、巯基、羟基羰基、羟基羰基烷基、羟基羰基烯基、烷基、卤代烷基、 多卤代烷基、氨基烷基、二氨基烷基、含1至2个双键的烯基、含1至2个 三键的炔基、环烷基、环烷基烷基、杂环基、杂环基烷基、芳基、杂芳基、 芳烷基、芳烯基、芳炔基、杂芳基烷基、三烷基硅烷基、二烷基芳基硅烷基、 烷基二芳基硅烷基、三芳基硅烷基、烷叉基(alkylidene)、芳基烷叉基 (arylalkylidene)、烷基羰基、芳基羰基、杂芳基羰基、烷氧基羰基、烷氧基 羰基烷基、烷氧基羰基烷氧基、芳氧基羰基、芳氧基羰基烷基、芳烷氧基羰 基、芳烷氧基羰基烷基、芳烷氧基羰基烷氧基、芳基羰基烷基、氨基羰基、 氨基羰基烷基、氨基羰基烷氧基、烷基氨基羰基、烷基氨基羰基烷基、烷基 氨基羰基烷氧基、二烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基烷基、二烷基氨基羰基 烷氧基、芳基氨基羰基、芳基氨基羰基烷基、芳基氨基羰基烷氧基、二芳基 氨基羰基、二芳基氨基羰基烷基、二芳基氨基羰基烷氧基、芳基烷基氨基羰 基、芳基烷基氨基羰基烷基、芳基烷基氨基羰基烷氧基、烷氧基、芳氧基、 杂芳氧基、杂芳烷氧基、杂环基氧基、环烷氧基、全氟烷氧基、烯氧基、炔 氧基、芳烷氧基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、芳烷基羰基氧基、烷氧基 羰基氧基、芳氧基羰基氧基、芳烷氧基羰基氧基、氨基羰基氧基、烷基氨基 羰基氧基、二烷基氨基羰基氧基、烷基芳基氨基羰基氧基、二芳基氨基羰基 氧基、胍基、异硫脲基、脲基、N-烷基脲基、N-芳基脲基、N′-烷基脲基、 N′，N′-二烷基脲基、N′-烷基-N′-芳基脲基、N′，N′-二芳基脲基、N′-芳基脲基、 N，N′-二烷基脲基、N-烷基-N′-芳基脲基、N-芳基-N′-烷基脲基、N，N′-二芳基 脲基、N，N′，N′-三烷基脲基、N，N′-二烷基-N′-芳基脲基、N-烷基-N′，N′-二芳基 脲基、N-芳基-N′，N′-二烷基脲基、N，N′-二芳基-N′-烷基脲基、N，N′，N′-三芳基 脲基、脒基、烷基脒基、芳基脒基、氨基硫代羰基、烷基氨基硫代羰基、芳 基氨基硫代羰基、氨基、氨基烷基、烷基氨基烷基、二烷基氨基烷基、芳基 氨基烷基、二芳基氨基烷基、烷基芳基氨基烷基、烷基氨基、二烷基氨基、 卤代烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、烷基芳基氨基、烷基羰基氨基、烷 氧基羰基氨基、芳烷氧基羰基氨基、芳基羰基氨基、芳基羰基氨基烷基、芳 氧基羰基氨基烷基、芳氧基芳基羰基氨基、芳氧基羰基氨基、烷基磺酰基氨 基、芳基磺酰基氨基、杂芳基磺酰基氨基、杂环基磺酰基氨基、杂芳基硫基、 叠氮基、-N+R151R152R153、P(R150)2、P(＝O)(R150)2、OP(＝O)(R150)2、 -NR160C(＝O)R163、二烷基膦酰基、烷基芳基膦酰基、二芳基膦酰基、羟基膦 酰基、烷基硫基、芳基硫基、全氟烷基硫基、羟基羰基烷基硫基、氰硫基、 异氰硫基、烷基亚磺酰基氧基、烷基磺酰基氧基、芳基亚磺酰基氧基、芳基 磺酰基氧基、羟基磺酰基氧基、烷氧基磺酰基氧基、氨基磺酰基氧基、烷基 氨基磺酰基氧基、二烷基氨基磺酰基氧基、芳基氨基磺酰基氧基、二芳基氨 基磺酰基氧基、烷基芳基氨基磺酰基氧基、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基、芳 基亚磺酰基、芳基磺酰基、羟基磺酰基、烷氧基磺酰基、氨基磺酰基、烷基 氨基磺酰基、二烷基氨基磺酰基、芳基氨基磺酰基、二芳基氨基磺酰基或烷 基芳基氨基磺酰基；叠氮基、四唑基，或取代1，2或1，3排列中的原子的两 个Q1基团一起形成亚烷基二氧基(即，-O-(CH2)y-O-)、硫基亚烷基氧基(即， -S-(CH2)y-O-)或亚烷基二硫基(即，-S-(CH2)y-S-)，其中y为1或2；或取代相 同原子的两个Q1基团一起形成亚烷基；且
每个Q1独立地未被取代或被一个或多个取代基取代，在一个实施方案 中被1个、2个或3个取代基取代，所述取代基各自独立地选自Q2；
每个Q2独立地为卤素、拟卤素、羟基、氧代基团、硫代基团、腈、硝 基、甲酰基、巯基、羟基羰基、羟基羰基烷基、羟基羰基烯基、烷基、卤代 烷基、多卤代烷基、氨基烷基、二氨基烷基、含1至2个双键的烯基、含1 至2个三键的炔基、环烷基、环烷基烷基、杂环基、杂环基烷基、芳基、杂 芳基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、杂芳基烷基、三烷基硅烷基、二烷基芳基 硅烷基、烷基二芳基硅烷基、三芳基硅烷基、烷叉基、芳基烷叉基、烷基羰 基、芳基羰基、杂芳基羰基、烷氧基羰基、烷氧基羰基烷基、芳氧基羰基、 芳氧基羰基烷基、芳烷氧基羰基、芳烷氧基羰基烷基、芳基羰基烷基、氨基 羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、二芳基氨基羰基、 芳基烷基氨基羰基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、杂芳烷氧基、杂环基氧基、 环烷氧基、全氟烷氧基、烯氧基、炔氧基、芳烷氧基、烷基羰基氧基、芳基 羰基氧基、芳烷基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、芳烷氧基 羰基氧基、氨基羰基氧基、烷基氨基羰基氧基、二烷基氨基羰基氧基、烷基 芳基氨基羰基氧基、二芳基氨基羰基氧基、胍基、异硫脲基、脲基、N-烷基 脲基、N-芳基脲基、N′-烷基脲基、N′，N′-二烷基脲基、N′-烷基-N′-芳基脲基、 N′，N′-二芳基脲基、N′-芳基脲基、N，N′-二烷基脲基、N-烷基-N′-芳基脲基、 N-芳基-N′-烷基脲基、N，N′-二芳基脲基、N，N′，N′-三烷基脲基、N，N′-二烷基-N′- 芳基脲基、N-烷基-N′，N′-二芳基脲基、N-芳基-N′，N′-二烷基脲基、N，N′-二芳 基-N′-烷基脲基、N，N′，N′-三芳基脲基、脒基、烷基脒基、芳基脒基、氨基硫 代羰基、烷基氨基硫代羰基、芳基氨基硫代羰基、氨基、氨基烷基、烷基氨 基烷基、二烷基氨基烷基、芳基氨基烷基、二芳基氨基烷基、烷基芳基氨基 烷基、烷基氨基、二烷基氨基、卤代烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、烷 基芳基氨基、烷基羰基氨基、烷氧基羰基氨基、芳烷氧基羰基氨基、芳基羰 基氨基、芳基羰基氨基烷基、芳氧基羰基氨基烷基、芳氧基芳基羰基氨基、 芳氧基羰基氨基、烷基磺酰基氨基、芳基磺酰基氨基、杂芳基磺酰基氨基、 杂环基磺酰基氨基、杂芳基硫基、叠氮基、-N+R151R152R153、P(R150)2、 P(＝O)(R150)2、OP(＝O)(R150)2、-NR160C(＝O)R163、二烷基膦酰基、烷基芳基膦 酰基、二芳基膦酰基、羟基膦酰基、烷基硫基、芳基硫基、全氟烷基硫基、 羟基羰基烷基硫基、氰硫基、异氰硫基、烷基亚磺酰基氧基、烷基磺酰基氧 基、芳基亚磺酰基氧基、芳基磺酰基氧基、羟基磺酰基氧基、烷氧基磺酰基 氧基、氨基磺酰基氧基、烷基氨基磺酰基氧基、二烷基氨基磺酰基氧基、芳 基氨基磺酰基氧基、二芳基氨基磺酰基氧基、烷基芳基氨基磺酰基氧基、烷 基亚磺酰基、烷基磺酰基、芳基亚磺酰基、芳基磺酰基、羟基磺酰基、烷氧 基磺酰基、氨基磺酰基、烷基氨基磺酰基、二烷基氨基磺酰基、芳基氨基磺 酰基、二芳基氨基磺酰基或烷基芳基氨基磺酰基；或取代1，2或1，3排列中 的原子的两个Q2基团一起形成亚烷基二氧基(即，-O-(CH2)y-O-)、硫基亚烷 基氧基(即，-S-(CH2)y-O-)或亚烷基二硫基(即，-S-(CH2)y-S-)，其中y为1或 2；或取代相同原子的两个Q2基团一起形成亚烷基；
R150为羟基、烷氧基、芳烷氧基、烷基、杂芳基、杂环基、芳基或-NR170R171， 其中R170和R171各自独立地为氢、烷基、芳烷基、芳基、杂芳基、杂芳烷基 或杂环基，或R170和R171一起形成亚烷基、氮杂亚烷基、氧杂亚烷基或硫杂 亚烷基；
R151、R152和R153各自独立地为氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂 芳烷基、杂环基或杂环基烷基；
R160为氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基、杂环基或杂环基 烷基；且
R163为烷氧基、芳烷氧基、烷基、杂芳基、杂环基、芳基或-NR170R171。
在一些实施方案中，R1被一个或多个取代基取代，所述取代基独立地选自 芳氧基、芳基、杂芳基、卤素、拟卤素、烷基、烷氧基、环烷基、烷氧基羰 基、羟基羰基、烷基氨基和二烷基氨基。
本领域技术人员将识别式Ia和I结构上涉及其化合物所包括的一种互变 异构形式；本文包括了所有这些互变异构形式。例如，式Ia和I包括 -NH-CH(Y)＝N-表示的片段，当Y为NH2时，该片段为包括三种互变异构形 式-NH-CH(NH2)＝N-、-NH-CH(＝NH)-NH-和-N＝CH(NH2)-NH-的胍基。
在一些实施方案中，
X为O、S或NR，其中R为氢或烷基；
Y为NRR’或OH，其中R为氢或烷基；
Z为直接键或NR；
R1为烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂环基、杂芳基、芳烷基、芳 烯基、杂芳烷基或杂芳烯基；
R2为卤素、拟卤素、烷氧基或烷基；
n为0或1；
R3为氢或烷基；
其中X、Y、Z、R1、R2和R3各自独立地未被取代或被一个或多个取代 基取代，在一个实施方案中被1个、2个或3个取代基取代，所述取代基各 自独立地选自Q1。
在一些实施方案中，R为氢。
在一些实施方案中，n为0或1。
在一些实施方案中，X为S、O或NH。
在一些实施方案中，Y为NH2。
在一些实施方案中，Z为直接键或NH。
在一些实施方案中，R1为烷基、烯基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基， 且未被取代或被芳氧基、芳基、杂芳基、卤素、拟卤素、烷基、烷氧基、环 烷基、烷氧基羰基、羟基羰基、烷基氨基和二烷基氨基取代。
在一些实施方案中，R1为乙基、2-(2-呋喃基)乙烯基、苯基、甲基、2- 萘基氧基甲基、苄基、3-氯-2-苯并噻吩基、环丙基、环丙基甲基、异丁基、 4-叔丁基苯基、4-联苯基、叔丁基、3-氯苯基、2-呋喃基、2，4-二氯苯基、3，4- 二甲氧基苯基、2-(4-甲氧基苯基)乙烯基、4-甲氧基苯氧基甲基、异戊基、异 丙基、2-环戊基乙基、环戊基甲基、2-苯基丙基、2-苯基乙基、1-甲基-2-苯 基乙基、1-甲基-2-苯基乙烯基、2-苄基乙基、2-苯基乙烯基、5-己炔基、3- 丁炔基、4-戊炔基、丙基、丁基、戊基、己基、叔丁氧基甲基、叔丁基甲基、 1-乙基戊基、环丙基、环丙基甲基、环戊基、环己基、环丁基、2-环戊基乙 基、环戊基甲基、2-氟环丙基、2-甲基环丙基、2-苯基环丙基、2，2-二甲基乙 烯基、1，2-丙烯基、2-(3-三氟甲基苯基)乙烯基、3，4-丁烯基、2-(2-呋喃基)乙 基、2-氯乙烯基、2-(2-氯苯基)乙烯基、1-甲基-2，2-二氯环丙基、2，2-二氟环 丙基、丙酸甲酯、丙酸、丁酸甲酯、丁酸、戊酸、甲基-叔丁基醚、二甲基 氨基甲基、2-(2-四氢呋喃基)-乙基或2-(2-四氢呋喃基)-甲基。
在一些实施方案中，R2为卤素或烷基。
在一些实施方案中，R2为氯或甲基。
在一些实施方案中，R3为氢。
在多个实施方案中，所述化合物为式Ib-Im中的一个表示的化合物：

在式Ib-Im中，所述变量具有上述式I和Ia所述的值。
在多个实施方案中，式Ib-Im中的R1为氢、烷基、芳基、芳烷基、芳 烯基、炔基、杂芳基、杂芳烷基、杂芳基烯基、环烷基，这些基团被0、1 或2个选自下述的基团取代：苯基、烷基、环烷基、烷氧基、卤素、拟卤素、 氨基、烷基氨基或二烷基氨基。在多个实施方案中，式Ib-Im中的R1为苯基、 呋喃基、噻吩基、炔基、烷基、环丙基、环丁基或环戊基；或被下述基团取 代的烷基或烯基：苯基、呋喃基、噻吩基、炔基、烷基、环丙基、环丁基或 环戊基；在一些实施方案中，R1任选被0、1或2个下述基团取代，所述基 团选自：苯基、烷基、烷氧基、卤素或CN。
在一些实施方案中，式Ib-Im中的Rj和Rk均为氢。在一些实施方案中， 式Ib-Im中的R3为氢。
在多个式Ie表示的实施方案中，Rs’和Rt’独立地选自氢、烷基、卤素、 拟卤素、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基或芳烷基；在一些实 施方案中，Rs’和Rt’独立地选自氢、烷基和卤素；且在某些实施方案中，Rs’ 和Rt’独立地选自氢、烷基和Br，其中通常，Rs’和Rt’不都是氢。
在一些式Ih-Im的实施方案中，n为0、1或2，且每个R2独立地选自 卤素、烷基、烷氧基、卤代烷基和卤代烷氧基；在一些实施方案中，n为0、 1或2，且每个R2独立地选自氢、F、氟烷基(如CHF2、CF3)和氟烷氧基(如 OCHF2、OCF3).
在一些实施方案中，所述化合物选自表I中的化合物。在某些实施方案 中，所述化合物选自表I中的化合物I.1-I.57；在一些实施方案中，所述化合 物选自表I中的化合物I.1-I.35。在一些实施方案中，所述化合物选自表I 中的化合物I.1-I.6和I.36-I.57。在一些实施方案中，所述化合物选自表I中 的化合物I.7-I.35。
本发明也公开了治疗或预防以蛋白质运输受损为特征的疾病的方法，该 方法包括向受试者给药式IIa的化合物：

或其药学可接受的衍生物。在式IIa中，X*选自-O-、＝N-、-N(Ro)-、 ＝C(Ro)-和-C(RoRo′)-，且Y*选自＝O、-ORo、＝NRo′、-NRoRo′、＝CRoRo′和 -CHRoRo′；其中选择X*和Y*使得一条虚线(---)为单键，且另一条为双键， 或两条虚线为单键。每个Ro′独立地选自氢、卤素、拟卤素、氨基、酰氨基、 羧酰氨基、磺酰氨基、羧基、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、 杂芳基、芳烷基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基和芳烷 基氧基。每个Ro选自氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂 芳基和芳烷基。在一些实施方案中，Ro′独立地选自氢、烷基、烯基、炔基、 环烷基、杂环基、芳基、杂芳基或芳烷基。在某些实施方案中，Ro为氢或烷 基，通常为氢。
本文也涉及式IIa表示的化合物或其药学可接受的衍生物，其中X*选自 -O-、＝N-、-N(Ro)-、＝C(Ro)-和-C(RoRo′)-；且Y*选自＝O、-ORo、＝NRo′、-NRoRo′、 ＝CRoRo′和-CHRoRo′；其中选择X*和Y*使得两条虚线均为单键，或一条虚 线(---)为单键，且另一条为双键，条件是当X*为-N(H)-时，Y*不是＝O。在 多个式IIa表示的化合物的实施方案中，选择X*和Y*使得两条虚线均为单 键，或一条虚线(---)为单键，且另一条为双键，条件是当X*为-N(Ro)-时， Y*不是＝O。在式IIa表示的化合物的一些实施方案中，选择X*和Y*使得两 条虚线均为单键，或一条虚线(---)为单键，且另一条为双键，条件是当X* 为-N(Ro)-时，Y*不是＝O、＝NRo′或＝CRoRo′。本文也涉及包含式IIa化合物 和药学可接受的载体的药物组合物。
在一些实施方案中，式IIa的化合物也可以表示为式II：

或其药学可接受的衍生物。
式IIa和II中：
Ar1为芳基、杂芳基或环烷基；
R7为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基或NRR， 其中R为氢或烷基；
R10为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
R8和R9各自独立地选自下述(i)或(ii)：
(i)氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、环烷基、杂环基、 C(A)R110、卤素、拟卤素、OR111、S(D)aR112、NR115R116或N+R115R116R117；或
(ii)R8和R9一起形成亚烷基、亚烯基、亚炔基或杂亚烷基；例如，在 一些实施方案中，R8和R9与和它们相连的原子一起形成稠合的苯基环，该 环未被取代或被卤素、拟卤素、烷基、烷氧基、环烷基、稠合的环烷基、稠 合的杂环基、稠合的杂芳基或稠合的芳基取代，这些取代基未被取代或被卤 素、拟卤素、烷基、烷氧基、芳基、环烷基、杂环基、稠合的芳基、稠合的 杂环基和稠合的环烷基取代；
A为O、S或NR125；
R110为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、环烷基、杂环 基、C(A)R126、卤素、拟卤素、OR125、SR125、NR127R128和SiR122R123R124；
R111为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、环烷基、杂环 基、C(A)R129、NR130R131和SiR122R123R124；
D为O或NR125；
a为0、1或2；
当a为1或2时，R112选自氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂 芳鎓、环烷基、杂环基、卤素、拟卤素、OR125、SR125和NR132R133；
当a为0时，R112选自氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、 环烷基、杂环基、SR125和C(A)R129；
R115、R116和R117各自独立地选自下述(a)和(b)：
(a)氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、环烷基、杂环基、 C(A)R129、OR125或NR132R133；或
(b)R115、R116和R117中的任两个一起形成亚烷基、亚烯基、亚炔基、 杂亚烷基，且另一个选自(a)；
R122、R123和R124选自下述(i)或(ii)：
(i)R122、R123和R124各自独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂 芳基、杂芳鎓、环烷基、杂环基、OR125或NR132R133；或
(ii)R122、R123和R124中的任两个一起形成亚烷基、亚烯基、亚炔基、杂 亚烷基；且另一个选自(i)；
R125为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、环烷基或杂环 基；在一些实施方案中，其中R125为烷基、烯基或炔基，R125任选被芳基、 杂芳基、杂芳鎓、环烷基或杂环基取代；
R126为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、环烷基、杂环 基、OR125或NR134R135；其中R134和R135各自独立地为氢、烷基、烯基、炔 基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、环烷基、杂环基、OR136或NR132R133，或R134 和R135一起形成亚烷基、亚烯基、亚炔基、杂亚烷基，其中R136为氢、烷基、 烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、环烷基或杂环基；
R127和R128选自下述(i)或(ii)：
(i)R127和R128各自独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、 杂芳鎓、环烷基、杂环基、OR125、NR137R138或C(A)R139，其中R137和R138 各自独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、环烷基或杂 环基，或一起形成亚烷基、亚烯基、亚炔基、杂亚烷基；且R139为氢、烷基、 烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、环烷基、杂环基、OR140或NR132R133， 其中R140为烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、环烷基、杂环基； 或
(ii)R127和R128一起形成亚烷基、亚烯基、亚炔基、杂亚烷基；
R129为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、环烷基、杂环 基、OR140或NR132R133；
R130和R131各自独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳 鎓、环烷基、杂环基或C(A)R141，其中R141为烷基、烯基、炔基、芳基、杂 芳基、杂芳鎓、环烷基、杂环基、OR125或NR132R133；或R130和R131一起形 成亚烷基、亚烯基、亚炔基、杂亚烷基；
R132和R133各自独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳 鎓、环烷基、杂环基，或R132和R133一起形成亚烷基、亚烯基、亚炔基、杂 亚烷基；且
R10为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
其中Ar1、R7、R8、R9和R10各自独立地未被取代或被一个或多个取代 基取代，在一个实施方案中被1个、2个或3个取代基取代，所述取代基各 自独立地选自Q1，其中Q1为卤素、拟卤素、羟基、氧代基团、硫代基团、 腈、硝基、甲酰基、巯基、羟基羰基、羟基羰基烷基、羟基羰基烯基、烷基、 卤代烷基、多卤代烷基、氨基烷基、二氨基烷基、含1至2个双键的烯基、 含1至2个三键的炔基、环烷基、环烷基烷基、杂环基、杂环基烷基、芳基、 杂芳基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、杂芳基烷基、三烷基硅烷基、二烷基芳 基硅烷基、烷基二芳基硅烷基、三芳基硅烷基、烷叉基、芳基烷叉基、烷基 羰基、芳基羰基、杂芳基羰基、烷氧基羰基、烷氧基羰基烷基、烷氧基羰基 烷氧基、芳氧基羰基、芳氧基羰基烷基、芳烷氧基羰基、芳烷氧基羰基烷基、 芳烷氧基羰基烷氧基、芳基羰基烷基、氨基羰基、氨基羰基烷基、氨基羰基 烷氧基、烷基氨基羰基、烷基氨基羰基烷基、烷基氨基羰基烷氧基、二烷基 氨基羰基、二烷基氨基羰基烷基、二烷基氨基羰基烷氧基、芳基氨基羰基、 芳基氨基羰基烷基、芳基氨基羰基烷氧基、二芳基氨基羰基、二芳基氨基羰 基烷基、二芳基氨基羰基烷氧基、芳基烷基氨基羰基、芳基烷基氨基羰基烷 基、芳基烷基氨基羰基烷氧基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、杂芳烷氧基、 杂环基氧基、环烷氧基、全氟烷氧基、烯氧基、炔氧基、芳烷氧基、烷基羰 基氧基、芳基羰基氧基、芳烷基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧 基、芳烷氧基羰基氧基、氨基羰基氧基、烷基氨基羰基氧基、二烷基氨基羰 基氧基、烷基芳基氨基羰基氧基、二芳基氨基羰基氧基、胍基、异硫脲基、 脲基、N-烷基脲基、N-芳基脲基、N′-烷基脲基、N′，N′-二烷基脲基、N′-烷基 -N′-芳基脲基、N′，N′-二芳基脲基、N′-芳基脲基、N，N′-二烷基脲基、N-烷基-N′- 芳基脲基、N-芳基-N′-烷基脲基、N，N′-二芳基脲基、N，N′，N′-三烷基脲基、 N，N′-二烷基-N′-芳基脲基、N-烷基-N，N-芳基脲基、N-芳基-N′，N′-二烷基 脲基、N，N′-二芳基-N′-烷基脲基、N，N′，N′-三芳基脲基、脒基、烷基脒基、芳 基脒基、氨基硫代羰基、烷基氨基硫代羰基、芳基氨基硫代羰基、氨基、氨 基烷基、烷基氨基烷基、二烷基氨基烷基、芳基氨基烷基、二芳基氨基烷基、 烷基芳基氨基烷基、烷基氨基、二烷基氨基、卤代烷基氨基、芳基氨基、二 芳基氨基、烷基芳基氨基、烷基羰基氨基、烷氧基羰基氨基、芳烷氧基羰基 氨基、芳基羰基氨基、芳基羰基氨基烷基、芳氧基羰基氨基烷基、芳氧基芳 基羰基氨基、芳氧基羰基氨基、烷基磺酰基氨基、芳基磺酰基氨基、杂芳基 磺酰基氨基、杂环基磺酰基氨基、杂芳基硫基、叠氮基、-N+R151R152R153、 P(R150)2、P(＝O)(R150)2、OP(＝O)(R150)2、-NR160C(＝O)R163、二烷基膦酰基、烷 基芳基膦酰基、二芳基膦酰基、羟基膦酰基、烷基硫基、芳基硫基、全氟烷 基硫基、羟基羰基烷基硫基、氰硫基、异氰硫基、烷基亚磺酰基氧基、烷基 磺酰基氧基、芳基亚磺酰基氧基、芳基磺酰基氧基、羟基磺酰基氧基、烷氧 基磺酰基氧基、氨基磺酰基氧基、烷基氨基磺酰基氧基、二烷基氨基磺酰基 氧基、芳基氨基磺酰基氧基、二芳基氨基磺酰基氧基、烷基芳基氨基磺酰基 氧基、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基、芳基亚磺酰基、芳基磺酰基、羟基磺酰 基、烷氧基磺酰基、氨基磺酰基、烷基氨基磺酰基、二烷基氨基磺酰基、芳 基氨基磺酰基、二芳基氨基磺酰基或烷基芳基氨基磺酰基；叠氮基、四唑基， 或取代1，2或1，3排列中原子的两个Q1基团一起形成亚烷基二氧基(即， -O-(CH2)y-O-)、硫基亚烷基氧基(即，-S-(CH2)y-O-)或亚烷基二硫基(即， -S-(CH2)y-S-)，其中y为1或2；或取代相同原子的两个Q1基团一起形成亚 烷基；且
每个Q1独立地未被取代或被一个或多个取代基取代，在一个实施方案 中被1个、2个或3个取代基取代，所述取代基各自独立地选自Q2；
每个Q2独立地为卤素、拟卤素、羟基、氧代基团、硫代基团、腈、硝 基、甲酰基、巯基、羟基羰基、羟基羰基烷基、羟基羰基烯基、烷基、卤代 烷基、多卤代烷基、氨基烷基、二氨基烷基、含1至2个双键的烯基、含1 至2个三键的炔基、环烷基、环烷基烷基、杂环基、杂环基烷基、芳基、杂 芳基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、杂芳基烷基、三烷基硅烷基、二烷基芳基 硅烷基、烷基二芳基硅烷基、三芳基硅烷基、烷叉基、芳基烷叉基、烷基羰 基、芳基羰基、杂芳基羰基、烷氧基羰基、烷氧基羰基烷基、芳氧基羰基、 芳氧基羰基烷基、芳烷氧基羰基、芳烷氧基羰基烷基、芳基羰基烷基、氨基 羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、二芳基氨基羰基、 芳基烷基氨基羰基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、杂芳烷氧基、杂环基氧基、 环烷氧基、全氟烷氧基、烯氧基、炔氧基、芳烷氧基、烷基羰基氧基、芳基 羰基氧基、芳烷基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、芳烷氧基 羰基氧基、氨基羰基氧基、烷基氨基羰基氧基、二烷基氨基羰基氧基、烷基 芳基氨基羰基氧基、二芳基氨基羰基氧基、胍基、异硫脲基、脲基、N-烷基 脲基、N-芳基脲基、N′-烷基脲基、N′，N′-二烷基脲基、N′-烷基-N′-芳基脲基、 N′，N′-二芳基脲基、N′-芳基脲基、N，N′-二烷基脲基、N-烷基-N′-芳基脲基、 N-芳基-N′-烷基脲基、N，N′-二芳基脲基、N，N′，N′-三烷基脲基、N，N′-二烷基-N′- 芳基脲基、N-烷基-N′，N′-二芳基脲基、N-芳基-N′，N′-二烷基脲基、N，N′-二芳 基-N′-烷基脲基、N，N′，N′-三芳基脲基、脒基、烷基脒基、芳基脒基、氨基硫 代羰基、烷基氨基硫代羰基、芳基氨基硫代羰基、氨基、氨基烷基、烷基氨 基烷基、二烷基氨基烷基、芳基氨基烷基、二芳基氨基烷基、烷基芳基氨基 烷基、烷基氨基、二烷基氨基、卤代烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、烷 基芳基氨基、烷基羰基氨基、烷氧基羰基氨基、芳烷氧基羰基氨基、芳基羰 基氨基、芳基羰基氨基烷基、芳氧基羰基氨基烷基、芳氧基芳基羰基氨基、 芳氧基羰基氨基、烷基磺酰基氨基、芳基磺酰基氨基、杂芳基磺酰基氨基、 杂环基磺酰基氨基、杂芳基硫基、叠氮基、-N+R151R152R153、P(R150)2、 P(＝O)(R150)2、OP(＝O)(R150)2、-NR160C(＝O)R163、二烷基膦酰基、烷基芳基膦 酰基、二芳基膦酰基、羟基膦酰基、烷基硫基、芳基硫基、全氟烷基硫基、 羟基羰基烷基硫基、氰硫基、异氰硫基、烷基亚磺酰基氧基、烷基磺酰基氧 基、芳基亚磺酰基氧基、芳基磺酰基氧基、羟基磺酰基氧基、烷氧基磺酰基 氧基、氨基磺酰基氧基、烷基氨基磺酰基氧基、二烷基氨基磺酰基氧基、芳 基氨基磺酰基氧基、二芳基氨基磺酰基氧基、烷基芳基氨基磺酰基氧基、烷 基亚磺酰基、烷基磺酰基、芳基亚磺酰基、芳基磺酰基、羟基磺酰基、烷氧 基磺酰基、氨基磺酰基、烷基氨基磺酰基、二烷基氨基磺酰基、芳基氨基磺 酰基、二芳基氨基磺酰基或烷基芳基氨基磺酰基；或取代1，2或1，3排列中 原子的两个Q2基团一起形成亚烷基二氧基(即，-O-(CH2)y-O-)、硫基亚烷基 氧基(即，-S-(CH2)y-O-)或亚烷基二硫基(即，-S-(CH2)y-S-)，其中y为1或2； 或取代相同原子的两个Q2基团一起形成亚烷基；
R150为羟基、烷氧基、芳烷氧基、烷基、杂芳基、杂环基、芳基或-NR170R171， 其中R170和R171各自独立地为氢、烷基、芳烷基、芳基、杂芳基、杂芳烷基 或杂环基，或R170和R171一起形成亚烷基、氮杂亚烷基、氧杂亚烷基或硫杂 亚烷基；
R151、R152和R153各自独立地为氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂 芳烷基、杂环基或杂环基烷基；
R160为氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基、杂环基或杂环基 烷基；且
R163为烷氧基、芳烷氧基、烷基、杂芳基、杂环基、芳基或-NR170R171。
在一些实施方案中，Ar1为芳基、杂芳基或环烷基，且未被取代或被烷 基、烯基、炔基、杂芳基、卤素、拟卤素、二烷基氨基、芳氧基、芳烷氧基、 卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、环烷基或COOR取代，其中R为氢或烷 基；
R7为氢或NRR，其中R为氢或烷基；
R8和R9各自独立地选自下述(i)和(ii)：
(i)R8和R9与和它们相连的原子一起形成稠合的苯基环，该环未被取 代或被卤素、拟卤素、烷基、烷氧基、环烷基、稠合的环烷基、稠合的杂环 基、稠合的杂芳基或稠合的芳基取代，这些取代基未被取代或被卤素、拟卤 素、烷基、烷氧基、芳基、环烷基、杂环基、稠合的芳基、稠合的杂环基和 稠合的环烷基取代；且
(ii)R8为CN或COOR200，其中R200为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、 杂环基、芳基或杂芳基；且R9为氢、烷基或烷基硫基；且
R10为氢；
其中Ar1、R7、R8、R9和R10各自独立地未被取代或被一个或多个取代 基取代，在一个实施方案中被1个、2个或3个取代基取代，所述取代基各 自独立地选自Q1。
在一些实施方案中，Ar1为苯基、萘基、吡啶基、呋喃基或噻吩基，且 未被取代或被烷基、烯基、卤素、拟卤素、二烷基氨基、芳氧基、卤代烷基、 烷氧基、芳氧基、环烷基、杂环基、稠合的杂环基、芳基、稠合的芳基、杂 芳基、稠合的杂芳基或COOR取代，其中R为氢或烷基。
在一些实施方案中，Ar1被甲基、氟、溴、氯、碘、二甲基氨基、苯氧 基、三氟甲基或甲氧基羰基取代。
在一些实施方案中，Ar1为苯基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-呋喃基、3- 呋喃基、5-氯-2-噻吩基、5-溴-2-噻吩基、3-甲基-2-噻吩基、5-甲基-2-噻吩基、 5-乙基-2-噻吩基、2-甲基苯基、3-甲基苯基、4-氟-3-溴苯基、2-氟苯基、3，4- 二氟苯基、2-氯苯基、3-氯苯基、3，4-二氯苯基、3，4，5，-甲氧基苯基、2，4-甲 氧基苯基、2-氟-5-溴苯基、4-二甲基氨基苯基、3-三氟甲基、3-溴苯基、2- 三氟甲基-4-氟苯基、3-三氟甲基-4-氟苯基、2-氟-3-氯苯基、3-溴-4-氟苯基、 全氟苯基、3-吡啶基、4-吡啶基、4-溴苯基、4-氯苯基、3-苯氧基苯基、2，4- 二氯苯基、2，3-二氟苯基、2-氯苯基、2-氟-6-氯苯基、1-萘基、4-三氟甲基苯 基、2-三氟甲基苯基、4-三氟甲氧基苯基或4-甲氧基羰基苯基。
在一些实施方案中，R7为氢或二烷基氨基，或为氢或二乙基氨基。
在一些实施方案中，R8和R9各自独立地选自下述(i)和(ii)：
(i)R8和R9与和它们相连的原子一起形成稠合的苯基环，该环未被取 代或被甲基、氯、甲氧基、环戊基、稠合的环戊基或其它稠合的苯基环取代， 这些基团未被取代或被溴取代；和
(ii)R8为CN或COOR200，其中R200为甲基、苄基、乙基、4-甲氧基苄 基或2-苯基乙基；且R9为甲基、甲基硫基或苯基氨基羰基甲基硫基。
在多个实施方案中，所述化合物为式IIb-IIp表示的化合物：

式IIb-IIp中，各变量具有上述对于式II和IIa所述的值，其中选择X* 和Y*使得一条虚线(---)为单键且另一条为双键。在多个式Ib表示的实施方 案中，R8’和R9’独立地选自氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、 环烷基、杂环基、C(A)R110、卤素、拟卤素、OR111、S(D)aR112、NR115R116或 N+R115R116R117；在一些实施方案中，R8’为CN或COOR200，其中R200为氢、 烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；且R9’为氢、烷基或 烷基硫基；且在一些实施方案中，R8’为CN或COOR200，其中R200为甲基、 苄基、乙基、4-甲氧基苄基或2-苯基乙基；且R9’为甲基、甲基硫基或苯基 氨基羰基甲基硫基。在多个式IIh-IIp的实施方案中，每个Q1独立地选自卤 素、烷基、烷氧基、硝基、CN、N3、芳基、芳氧基、芳基烷基氧基、炔基、 氨基、烷基氨基、杂环基、杂芳基、被取代的羧基(如CO2-烷基、CO2-苄基)、 卤代烷基和卤代烷氧基，或在相同的苯基或相邻的稠合的苯基环上的两个相 邻Q1一起形成与苯基或相邻的稠合的苯基环稠合的环烷基或杂环基环。式 IIh-IIp中，从Q1出发的键表示每个Q1可独立地与任何该键交叉的环键合。
在一些实施方案中，所述化合物为式IIq、IIr和IIs表示的化合物：

式IIq、IIr和IIs中，Ar1、R7和R10可以具有本文所述的值；且每个q 独立地为0、1或2；
n为0、1或2；
R′1、R′2、R′3、R′4和每个R18独立地选自氢、烷基、烯基、炔基、芳 基、杂芳基、杂芳鎓、环烷基、杂环基、C(A)R110、卤素、拟卤素、OR111、 S(D)aR112、NR115R116或N+R115R116R117，其中选择对于A、R110、R111、D、a、 R112、R115、R116和R117的值为本文上述的值。
在一些实施方案中，所述化合物选自表II中的化合物。在某些实施方 案中，所述化合物选自表II中的化合物II.1-II.95；在一些实施方案中，所述 化合物选自表II中的化合物II.1-II.69。在一些实施方案中，所述化合物选自 表II中的化合物II.1-II.3和II.70-II.95。在一些实施方案中，所述化合物选自 表II中的化合物II.4-II.69。
本文也公开了治疗或预防以蛋白质运输受损为特征的疾病的方法，该方 法包括向受试者给药下述化合物，所述化合物选自：阿霉素(doxorubicin)、 放线菌酮(cycloheximide)、潮霉素、新生霉素、金担子素A和衣霉素。
本文也提供了本文所述的化合物的药学可接受的衍生物，包括其盐、酯、 烯醇醚、烯醇酯、溶剂合物、水合物和前药。药学可接受的盐包括，但不限 于胺盐，例如但不限制于N，N′-二苄基亚乙基二胺、氯普鲁卡因、胆碱、氨、 二乙醇胺和其它羟基烷基胺、亚乙基二胺、N-甲基葡萄糖胺、普鲁卡因、N- 苄基苯乙基胺、1-对氯苄基-2-吡咯烷-1′-基甲基苯并咪唑、二乙基胺和其它 烷基胺、哌嗪和三(羟基甲基)氨基甲烷；碱金属盐，例如但不限制于锂、钾 和钠；碱土金属盐，例如但不限制于钡、钙和镁；过渡金属盐，例如但不限 制于锌，铝，和其它金属盐，例如但不限制于磷酸二氢钠和磷酸氢二钠；且 包括但不限制于无机酸盐，例如但不限制于盐酸盐和硫酸盐；和有机酸盐， 例如但不限制于乙酸盐，乳酸盐，苹果酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、抗坏血 酸盐、琥珀酸盐、丁酸盐、戊酸盐和富马酸盐。
本发明还提供了含有任何本文所述的化合物和药学可接受的载体的药 物组合物。在一个实施方案中，配制该药物组合物用于单剂量给药。
在一些实施方案中，所述以蛋白质运输受损为特征的疾病为突触核蛋白 病(synucleinopathy)。突触核蛋白病的实例包括帕金森病、Lewy体病、阿尔 茨海默病的Lewy体变体、伴有Lewy体的痴呆、多系统萎缩症或关岛震颤 麻痹痴呆综合征。
突触核蛋白(synuclein)为一族包括α-、β-和γ-突触核蛋白的小突触前神 经元蛋白，其中只有α-突触核蛋白聚集体与一些神经病有关(Ian等人， Clinical Neurosc.Res.1：445-455，2001；Trojanowski和Lee，Neurotoxicology 23：457-460，2002)。从一些观测中揭示了突触核蛋白(且尤其是α-突触核蛋白) 在许多神经变性和/或淀粉样病的病因学中的作用。病理学上，确定α-突触 核蛋白是Lewy体的主要成分，帕金森病的标志内含物，且其片段从不同神 经病、阿尔茨海默病的淀粉样斑中分离。生物化学上，重组的α-突触核蛋白 表现出形成淀粉样原纤维，其概括了从患有伴随Lewy体的痴呆、帕金森病 和多系统萎缩症的患者中分离的α-突触核蛋白的超微结构特征。而且，在α- 突触核蛋白基因中的突变的鉴定(虽然仅在少数家族性帕金森病病例中)证 明突触核蛋白病和神经变性病之间的明确的联系。在例如帕金森病、伴随 Lewy体的痴呆、多系统萎缩症和阿尔茨海默病的Lewy体变体的疾病谱中 通常包括α-突触核蛋白已经导致这些疾病分类到术语“突触核蛋白病”下。
在一些实施方案中，所述以蛋白质运输受损为特征的疾病不是突触核蛋 白病。
在一些实施方案中，所述以蛋白质运输受损为特征的疾病为溶酶体贮存 症(lysosomal storage disorder)，如法布里病、法韦尔病、戈谢病、GM1-神经 节苷脂贮积病、泰-萨克斯病、桑德霍夫病、GM2激动剂病、克拉伯病、异 染性脑白质营养不良、尼曼-皮克二氏病(A、B和C型)、胡尔勒病、沙伊 病、亨特病、桑菲列普病、莫尔丘病、马-拉病、透明质酸酶缺乏症、天冬 氨酰葡糖胺尿症、岩藻糖苷贮积症、甘露糖苷贮积症、欣德勒病、1型唾液 酸贮积症、蓬佩病、致密性成骨不全症、蜡样脂褐质沉积症、胆固醇酯贮积 症、沃尔曼病、多重硫酸酯酶、半乳糖涎酸贮积症、粘多糖症(II、III和IV 型)、胱氨酸贮积症、唾液酸贮积症、伴随马-舍综合征的乳糜微粒滞留病、 赫曼斯基-普德拉克综合征、谢-希综合征、Danon病或Geleophysic发育不 良。溶酶体贮积症综述于，例如Wilcox(2004)J.Pediatr.144：S3-S14。
在一些实施方案中，所述以蛋白质运输受损为特征的疾病的特征在于物 质向细胞腔隙的递送受损。
在一些实施方案中，所述以蛋白质运输受损为特征的疾病的特征在于 Rab27a突变或Rab27a缺乏。该病症可以是，例如格里塞利综合征(Griscelli syndrome)。
在一些实施方案中，所述以蛋白质运输受损为特征的疾病为囊性纤维 化。
在一些实施方案中，所述以蛋白质运输受损为特征的疾病为糖尿病 (disbetes)(例如，营养不良性糖尿病(diabetes mellitus))。
在一些实施方案中，所述以蛋白质运输受损为特征的疾病为遗传性肺气 肿、遗传性血铁沉积症、眼皮肤白化病、蛋白质C缺乏、I型遗传性血管性 水肿、先天性蔗糖酶异麦芽糖酶缺乏、II型克-纳综合征、拉龙综合征、遗传 性髓过氧物酶(hereditary Myeloperoxidase)、原发性甲状腺机能低下、先天性 长QT综合征、酪氨酸结合的球蛋白缺乏、家族性高胆固醇血症、家族性乳 糜微粒血症、无β-脂蛋白血症、低血浆脂蛋白质水平、伴有肝受损的遗传性 肺气肿、先天性甲状腺功能减退症、成骨不全、遗传性低纤维蛋白原血症、 α1抗糜蛋白酶缺乏症、肾性尿崩症、垂体神经性尿崩症、夏科-马里-图思综 合征、佩利措伊斯-梅茨巴赫病、IIA型冯·威利布兰德病、结合因子V和VIII 缺乏、迟发性骨骺发育不良、无脉络膜症、I细胞病、巴藤病、共济失调-毛 细血管扩张症、急性成淋巴细胞性白血病、急性髓细胞样白血病、髓细胞性 白血病、ADPKD-常染色体显性多囊性肾病、微绒毛包含病、结节性硬化症、 洛氏眼-脑-肾综合征、肌萎缩侧索硬化、骨髓增生异常综合征、巴尔淋巴细 胞综合征、丹吉尔病、家族性肝内胆汁淤积、X-连锁肾上腺脑白质营养不良、 斯科特综合征、1型和2型赫曼斯基-普德拉克综合征、泽耳韦格综合征、斑 点状软骨发育异常、常染色体隐性原发性高草酸尿症、Mohr Tranebjaerg综 合征、脊髓延髓性肌萎缩症、原发性纤毛运动障碍(卡塔格纳综合征)、米- 迪综合征、无脑回畸形病、运动神经元病、乌斯赫尔综合征、威斯科特-奥 尔德里奇二氏综合征、Optiz综合征、亨廷顿舞蹈病、遗传性胰腺炎、抗磷 脂综合征、重叠结缔组织病、舍格伦综合征、僵体综合征、Brugada综合征、 芬兰型先天性肾综合征、杜宾-约翰逊综合征、X-连锁低磷血症、潘德雷德 综合征、持续性幼儿型胰岛素过度分泌低血糖症、遗传性球形红细胞增多症、 无铜蓝蛋白血症、婴儿型神经元蜡样质脂褐质沉积病、假性软骨发育不全和 多重骨骺、斯塔加特样黄斑营养不良(Stargardt-like macular dystrophy)、X-连 锁夏科-马里-图思病、常染色体显性视网膜色素变性、Wolcott-Rallison综合 征、库欣病、肢带型肌营养不良症、IV型粘多糖病(mucoploy-saccharidosis type IV)、完全遗传性家族性淀粉样变性、安德森病、肉瘤、慢性骨髓单核细胞 性白血病、心肌病、面生殖发育异常、Torsion病、亨廷顿和小脑萎缩症、遗 传性高同型半胱氨酸血症、多发性神经病、下肢运动神经元病、色素视网膜 炎、血清阴性多关节炎、间质性肺纤维化、雷诺现象、韦格纳肉芽肿病、蛋 白尿(preoteinuria)、CDG-Ia、CDG-Ib、CDG-Ic、CDG-Id、CDG-Ie、CDG-If、 CDG-IIa、CDG-IIb、CDG-IIc、CDG-IId、埃勒斯-当洛斯综合征、多发性外 生骨疣、格里塞利综合征(1型或2型)或X-连锁非特异性智力发育迟缓。以 蛋白质运输受损为特征的病症综述于Aridor等人(2000)Traffic 1：836-51和 Aridor等人(2002)Traffic 3：781-90。
根据本文所述的方法治疗的受试者可以是人或其它哺乳动物，如小鼠、 大鼠、牛、猪、狗、猫和猴。
本文也公开了鉴定拯救内质网-介导的转运受损的化合物的方法，该方 法包括：(i)提供对于内质网-介导的转运需要的蛋白质呈现表达或活性降低 的细胞；(ii)使该细胞与候选药物接触；和(iii)测定在候选药物存在下与候 选药物不存在下细胞生长是否增强，其中将增强细胞生长的化合物确定为拯 救内质网-介导的转运受损的化合物。所述蛋白质可以为，例如Ypt1、Rab1a、 Rab1b、Rab2、Sar1、Sar1a、Sar1b、Sec23、Sec23a或Sec23b。
在一些实施方案中，所述方法还包括测定被确定增强细胞生长的化合物 是否降低在表达毒性量的α-突触核蛋白或形成α-突触核蛋白的第二种细胞 中的毒性。
本发明也公开了鉴定增强蛋白质分泌的化合物的方法，该方法包括：(i) 提供对于内质网-介导的转运需要的蛋白质呈现表达或活性降低的细胞； (ii)使该细胞与候选药物接触；和(iii)测定该细胞在候选药物存在下与候选 药物不存在下相比，蛋白质分泌是否增强，其中将增强细胞生长的化合物确 定为增强蛋白质分泌的化合物。所述蛋白质可以为例如Ypt1、Rab1a、Rab1b、 Rab2、Sar1、Sar1a、Sar1b、Sec23、Sec23a或Sec23b。
本发明也公开了鉴定拯救受损的蛋白质运输的化合物的方法，该方法包 括：(i)提供对于蛋白质转运需要的蛋白质呈现表达或活性降低的细胞；(ii) 使该细胞与候选药物接触；和(iii)测定在蛋白质运输中的受损在候选药物存 在下与候选药物不存在下相比是否降低。
本发明也公开了鉴定拯救受损的蛋白质运输的化合物的方法，该方法包 括：(i)提供在蛋白质运输中有缺陷的细胞；(ii)使该细胞与候选药物接触； 和(iii)测定在蛋白质运输中的受损在候选药物存在下与候选药物不存在下 相比是否降低。
本发明也公开了鉴定拯救受损的Rab-介导的蛋白质运输的化合物的方 法，该方法包括：(i)提供在Rab-介导的蛋白质运输中有缺陷的细胞；(ii)使 该细胞与候选药物接触；和(iii)测定在Rab-介导的蛋白质运输中的受损在候 选药物存在下与候选药物不存在下相比是否降低。在一些实施方案中，在 Rab-介导的蛋白质运输中的缺陷为生物活性物质的有缺陷的胞吐。在一些实 施方案中，在Rab-介导的蛋白质运输中的缺陷是由于Rab调节蛋白的缺陷 产生的。在一些实施方案中，所述Rab为Rab27a。在其它实施方案中，所 述Rab选自Rab1a、Rab1b、Rab8b、Rab8a、Rab10、Rab13、Rab35、Rab11b、 Rab30、Rab11a、Rab3a、Rab3c、Rab3d、Rab3b、Rab2、Rab43、Rab4a、 Rab2b、Rab4b、Rab25、Rab14、Rab37、Rab18、Rab5b、Rab33a、Rab26、 Rab5a、Rab19b、Rab5c、Rab33b、Rab39b、Rab39、Rab31、Rab15、Rab40c、 Rab27b、Rab22a、Rab6b、Rab40b、Rasef、Rab21、Rab27a、Loc286526、 Rab40a、Rab6a、Rab17、Rab6c、Rab7、Rab9a、Rab7l1、Rab9b、Rab34、 Rab7b、Rab41、Rab23、Rab32、Rab38、Rab36、Rab28、Rab20或Rab12。
在一些本文所述的方法的实施方案中，所述细胞被透化。
在一些本文所述的方法的实施方案中，所述细胞为酵母细胞。
本发明也提供了监定拯救内质网-介导的转运受损的化合物的方法。该 方法可以包括下述步骤：从显示内质网-介导的转运受损的细胞制备细胞裂 解物；将细胞裂解物与候选药物接触；和测定与候选药物不存在时相比，该 候选药物是否增强细胞裂解物中的内质网-介导的转运，其中将增强细胞生 长的化合物确定为拯救内质网-介导的转运受损的化合物。
在一些实施方案中，所述细胞呈现形成COPII小囊泡的受损的能力或呈 现受损的COPII小囊泡停靠。
在一些实施方案中，所述细胞能够呈现对于内质网-介导的转运所需的 蛋白质表达或活性降低。所述蛋白质可以为Sec23、Sec23a、Sec23b、Sar1、 YPT1、Rab1a、Rab1b或Rab2。
本发明也涉及鉴定拯救内质网-介导的转运受损的化合物的方法，该方 法包括下述步骤：将呈现内质网-介导的转运受损的细胞与候选药物接触； 从该细胞制备细胞裂解物；和测定在该候选药物存在下与该候选药物不存在 下相比，裂解物中的内质网-介导的转运是否增强，其中将增强内质网-介导 的转运的化合物确定为拯救内质网-介导的转运受损的化合物。
在一些实施方案中，所述细胞可以呈现形成COPII小囊泡的受损的能力 或呈现受损的COPII小囊泡停靠。
在一些实施方案中，所述细胞能呈现对于内质网-介导的转运所需的蛋 白质表达或活性降低。所述蛋白质可以为Sec23、Sec23a、Sec23b、Sar1、 YPT1、Rab1a、Rab1b或Rab2。
本文的内容还提供了鉴定拯救内质网-介导的转运受损的化合物的方 法，该方法可以包括下述步骤：使呈现受损的COPII小囊泡的形成的细胞 物质与候选药物接触；和测定在候选药物存在下与候选药物不存在下相比， 细胞物质中COPII小囊泡的形成是否增强，其中将能够增强COPII小囊泡的 形成的化合物确定为拯救内质网-介导的转运受损的化合物。所述细胞物质 可以为细胞或从细胞产生的裂解物(即，细胞裂解物)。
在一些实施方案中，所述细胞物质能够呈现受损的形成COPII小囊泡 的能力或呈现受损的COPII小囊泡停靠。
在一些实施方案中，所述细胞物质能够呈现对于COPII小囊泡停靠所需 的蛋白质表达或活性降低。该蛋白质可以是Sec23、Sec23a、Sec23b或Sar1。
本发明也提供了鉴定拯救内质网-介导的转运受损的化合物的方法。该 方法可包括下述步骤：使呈现受损的COPII小囊泡停靠的细胞物质与候选药 物接触；和检测在候选药物存在下与候选药物不存在下相比，细胞物质中的 COPII小囊泡停靠是否增强，其中将增强COPII小囊泡停靠的化合物确定为 拯救内质网-介导的转运受损的化合物。该细胞物质可以为细胞或从细胞产 生的裂解物(即，细胞裂解物)。
在一些实施方案中，所述细胞物质可呈现对于COPII小囊泡停靠所需的 蛋白质表达或活性降低。该蛋白质可以为YPT1、Rab1a、Rab1b或Rab2。
本发明也提供了鉴定拯救内质网-介导的转运受损的化合物的方法，该 方法可以包括下述步骤：使呈现内质网-介导的转运受损的细胞物质与抑制 翻译、转录、热休克蛋白、鞘脂生物合成、蛋白质糖基化作用或蛋白酶体的 候选化合物接触；和检测在候选化合物存在下与候选化合物不存在下相比， 细胞物质中的内质网-介导的转运是否增强，其中将增强内质网-介导的转运 的候选化合物确定为拯救内质网-介导的转运受损的化合物。在细胞物质与 候选化合物接触之前，该方法也可以包括下述步骤：检测该化合物是否抑制 翻译、转录、热休克蛋白、蛋白酶体、鞘脂生物合成或蛋白质糖基化作用。 该细胞物质可以是细胞或从细胞产生的裂解物(即，细胞裂解物)。
在一些实施方案中，该细胞物质可以呈现受损的形成COPII小囊泡的 能力。在一些实施方案中，所述细胞物质可以呈现受损的COPII小囊泡停靠。
在一些实施方案中，所述细胞物质可以呈现对于内质网-介导的转运所 需的蛋白质表达或活性降低。该蛋白质可以为Sec23、Sec23a、Sec23b、Sar1、 YPT1、Rab1a、Rab1b或Rab2。
在一些实施方案中，该化合物可以抑制核糖体、Hsp90或磷脂酰肌醇合 成酶(inositol phosphorylceramide synthase)的大亚基。
本文公开的内容也包括鉴定增加内质网-介导的转运的化合物的方法， 该方法可以包括下述步骤：提供呈现内质网-介导的转运受损的细胞；使该 细胞与抑制Bst1、Emp24、PGAP1、TMED2、TMED10或TMED7的表达或 活性的药物接触；和在该药物存在下测定细胞中的内质网-介导的转运，其 中在药物存在下内质网-介导的转运与该药物不存在下内质网-介导的转运相 比提高确定该药物为增加内质网-介导的转运的化合物。所述药物可以是合 成的化合物、天然存在的化合物、小分子、核酸、抗体或肽模拟物。所述细 胞可以为酵母细胞或哺乳动物细胞，如小鼠细胞、大鼠细胞或人细胞。
本发明也提供了鉴定抑制蛋白质表达的化合物的方法。该方法包括下述 步骤：提供表达下述蛋白质的细胞，所述蛋白质选自Bst1、Emp24、PGAP1、 TMED2、TMED10和TMED7；
使该细胞与药物接触；和在该药物存在下测定蛋白质的表达，其中在该 药物存在下蛋白质的表达与该药物不存在下蛋白质的表达相比，下降确定该 药物为抑制蛋白质表达的化合物。该药物可以为合成的化合物、天然存在的 化合物、小分子、核酸、抗体或肽模拟物。该细胞可以是酵母细胞或哺乳动 物细胞，如小鼠细胞、大鼠细胞或人细胞。
本文也提供了鉴定抑制蛋白质表达的化合物的方法，该方法包括下述步 骤：提供包括报告构建物的细胞，所述报告构建物包括(i)编码下述蛋白质 的基因的启动子序列，所述蛋白质选自Bst1、Emp24、PGAP1、TMED2、 TMED10和TMED7，和(ii)编码报告蛋白的核苷酸序列；使该细胞与药物 接触；和在该药物存在下测定报告蛋白的表达，其中在该药物存在下报告蛋 白的表达与该药物不存在下报告蛋白的表达相比降低确定该药物为抑制蛋 白质表达的化合物。所述药物可以是合成的化合物、天然存在的化合物、小 分子、核酸、抗体或肽模拟物。所述细胞可以为酵母细胞或哺乳动物细胞， 如小鼠细胞、大鼠细胞或人细胞。
本文也提供了鉴定抑制蛋白质活性的化合物的方法。该方法可包括下述 步骤：提供选自Bst1、Emp24、PGAP1、TMED2、TMED10和TMED7的蛋 白质；使该蛋白质与药物接触；和在该药物存在下测定蛋白质的活性，其中 在该药物存在下的蛋白质活性与该药物不存在下的蛋白质活性相比降低确 定该药物为抑制蛋白质活性的化合物。该药物可以为合成的化合物、天然存 在的化合物、小分子、核酸、抗体或肽模拟物。该细胞可以为酵母细胞或哺 乳动物细胞，如小鼠细胞、大鼠细胞或人细胞。
本文也提供了鉴定增加内质网-介导的转运的化合物的方法。该方法可 以包括下述步骤：提供呈现内质网-介导的转运受损的细胞；使该细胞与增 强下述蛋白质表达或活性的药物接触，所述蛋白质选自SEC12、Sec12、SED4、 SEC16、HRD3、IRE1、STS1、SEC24、SEL1L、S20orf50、Ire1、Sec24A、 Sec24B、Sec24C和Sec24D；和在该药物存在下测定细胞存活率；其中在该 药物存在下的细胞存活率与该药物不存在下的细胞存活率相比增加确定该 药物为增加内质网-介导的转运的化合物。该药物可以为合成的化合物、天 然存在的化合物、小分子、核酸、抗体或肽模拟物。该细胞可以为酵母细胞 或哺乳动物细胞，如小鼠细胞、大鼠细胞或人细胞。
本发明也提供了鉴定增加内质网-介导的转运的化合物的方法，该方法 可包括下述步骤：筛选以确定增强下述蛋白质表达或活性的药物，所述蛋白 质选自SEC12、Sec12、SED4、SEC16、HRD3、IRE1、STS1、SEC24、SEL1L、 S20orf50、Ire1、Sec24A、Sec24B、Sec24C和Sec24D；提供呈现内质网-介 导的转运受损的细胞；使该细胞与该药物接触；和在该药物存在下测定内质 网-介导的转运，其中在该药物存在下的内质网-介导的转运与该药物不存在 下内质网-介导的转运相比增加确定该药物为拯救内质网-介导的转运的化合 物。该药物可以为合成的化合物、天然存在的化合物、小分子、核酸、抗体 或肽模拟物。该细胞可以为酵母细胞或哺乳动物细胞，如小鼠细胞、大鼠细 胞或人细胞。
本发明也提供了鉴定增加蛋白质表达的化合物的方法。该方法可包括下 述步骤：提供表达下述蛋白质的细胞，所述蛋白质选自SEC12、Sec12、SED4、 SEC16、HRD3、IRE1、STS1、SEC24、SEL1L、S20orf50、Ire1、Sec24A、 Sec24B、Sec24C和Sec24D；使该细胞与药物接触；和在该药物存在下测定 蛋白质的表达，其中在该药物存在下蛋白质的表达与该药物不存在下蛋白质 的表达相比增加确定该药物为增加蛋白质表达的化合物。该药物可以为合成 的化合物、天然存在的化合物、小分子、核酸、抗体或肽模拟物。该细胞可 以为酵母细胞或哺乳动物细胞，如小鼠细胞、大鼠细胞或人细胞。
本文也提供了鉴定增加蛋白质表达的化合物的方法。该方法可包括下述 步骤：提供包含报告构建物的细胞，所述报告构建物包含(i)编码下述蛋白 质的基因的启动子序列，所述蛋白质选自SEC12、Sec12、SED4、SEC16、 HRD3、IRE1、STS1、SEC24、SEL1L、S20orf50、Ire1、Sec24A、Sec24B、 Sec24C和Sec24D，和(ii)编码报告蛋白的核苷酸序列；使该细胞与药物接触； 和在该药物存在下测定报告蛋白的表达，其中在该药物存在下报告蛋白的表 达与该药物不存在下蛋白质的表达相比增加确定该药物为增加蛋白质表达 的化合物。该药物可以为合成的化合物、天然存在的化合物、小分子、核酸、 抗体或肽模拟物。该细胞可以为酵母细胞或哺乳动物细胞，如小鼠细胞、大 鼠细胞或人细胞。
本文的公开内容也提供了鉴定增加蛋白质活性的化合物的方法，该方法 可包括下述步骤：提供选自下述的蛋白质：SEC12、Sec12、SED4、SEC16、 HRD3、IRE1、STS1、SEC24、SEL1L、S20orf50、Ire1、Sec24A、Sec24B、 Sec24C和Sec24D；使该蛋白质与药物接触；和在该药物存在下测定蛋白质 活性，其中在该药物存在下的蛋白质活性与该药物不存在下蛋白质活性相比 增加确定该药物为增加蛋白质活性的化合物。该药物可以为合成的化合物、 天然存在的化合物、小分子、核酸、抗体或肽模拟物。该细胞可以为酵母细 胞或哺乳动物细胞，如小鼠细胞、大鼠细胞或人细胞。
本发明也提供了制备蛋白质的方法，该方法包括下述步骤：在本文所述 的化合物存在时(如表I或II中所述的化合物)培养细胞；和纯化细胞产生的 蛋白质，其中在化合物存在下培养细胞与该化合物不存在下培养细胞相比， 导致增加产生纯化的蛋白质。该蛋白质可以为异源核酸编码的重组蛋白质。 在一些实施方案中，该蛋白质为分泌蛋白和/或糖基化的蛋白质。例如，该蛋 白质可以为细胞因子、淋巴因子、生长因子或抗体。用于蛋白质制备方法中 的细胞可以为，例如昆虫细胞、哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞)、真菌 细胞或细菌细胞。
除非另有定义，否者所有本文所用的技术和科学术语具有与本发明所属 领域的技术人员通常理解的相同含义。虽然与本文所述的相似或等价的方法 和材料可以用于本发明的实际应用或检测，但下述内容描述了优选的方法和 材料。所有本文所述的出版物、专利申请、专利和其它文献在此引入作为参 考。当有冲突时，以本申请(包括定义)为准。而且，所述材料、方法和实 施例仅是示例性的而不是为了限制。
本发明的其它特点和益处以下述详细说明和权利要求表现。
附图简述
图1为描述通过蛋白酶体抑制剂MG132拯救ypt1ts突变表型的线图。
Y-轴表示ypt1ts酵母细胞在600nm(OD600)处的光密度(细胞生长的能力)。
X-轴表示MG132的浓度，暴露的该细胞的浓度范围为0至50μM。
图2为描述通过化合物I.3和化合物II.3拯救ypt1ts突变表型的柱状图。 Y-轴表示ypt1ts酵母细胞在600nm(OD600)处的光密度，作为细胞生长的能 力。所用的化合物I.3和化合物II.3的浓度分别为2.0μM和5.0μM。将用于 溶解的化合物的载体二甲亚砜(DMSO)作为对照。
图3A和3B为描述通过化合物I.3、化合物II.2和VRT-325稳定的CFBE 细胞中ΔF508CFTR蛋白质的蛋白质印迹照片。图3A表示对于化合物I.3、 化合物II.2和DMSO对照的数据。CFBE细胞在37℃下用10μM化合物或 DMSO孵育16小时。每个检测进行两次。图3B表示对于VRT-325和DMSO 对照的数据。CFBE细胞在37℃下用10μM化合物或DMSO孵育16小时。 使用对于CFTR特异性的抗体检测ΔF508CFTR。“C”和“B”分别表示蛋白质 凝胶上成熟型和ER型ΔF508CFTR的相对位置。
图4A为描述化合物I.3对于CFBE细胞中ΔF508CFTR的稳定的剂量 响应作用的蛋白质印迹照片。CFBE细胞在没有化合物(“0”泳道)或不同浓度 的化合物(1、2.5、5和10μM)存在下在37℃培养16小时。使用对于CFTR 特异性的抗体检测ΔF508CFTR。“C”和“B”分别表示蛋白质凝胶上成熟型和 ER型ΔF508CFTR的相对位置。
图4B为描述来自图4A的带“B”或“C”所绘的强度的线图，用光密度定 量。Y-轴表示相对强度，且X-轴表示化合物I.3的浓度。上面的线(曲线)(“带 B”)表示在每个浓度下带“B”的强度。下面的线(曲线)(“带C”)表示在每个浓 度下带“C”的强度的图像。
图4C为描述化合物II.2对于CFBE细胞中ΔF508CFTR的稳定的剂量 响应作用的蛋白质印迹照片。CFBE细胞在没有化合物(“0”泳道)或不同浓度 的化合物(1、2.5、5和10μM)存在下在37℃培养16小时。使用对于CFTR 特异性的抗体检测ΔF508CFTR。“C”和“B”分别表示蛋白质凝胶上成熟型和 ER型ΔF508CFTR的相对位置。
图4D为描述来自图4C的带“B”或“C”所绘的强度的线图，用光密度定 量。Y-轴表示相对强度，且X-轴表示化合物II.2的浓度。上面的线(曲线)(“带 B”)表示在每个浓度下带“B”的强度。下面的线(曲线)(“带C”)表示在每个浓 度下带“C”的强度的图像。
发明详述
A.定义
本文所用的化合物的药学可接受的衍生物包括其盐、酯、烯醇醚、烯醇 酯、缩醛、缩酮、原酸酯、半缩醛、半缩酮、酸、碱、溶剂合物、水合物或 前药。这些衍生物可以由本领域技术人员使用对于这些衍生化已知的方法方 便地制备。可以将制备化合物向动物或人给药而没有明显的毒性作用，且所 制备的化合物可以为药学活性的或前药。药学可接受的盐包括，但不限于， 胺盐，例如但不限制于N，N′-二苄基亚乙基二胺、氯普鲁卡因、胆碱、氨、 二乙醇胺和其它羟基烷基胺、亚乙基二胺、N-甲基葡萄糖胺、普鲁卡因、N- 苄基苯乙基胺、1-对氯苄基-2-吡咯烷-1′-基甲基-苯并咪唑、二乙基胺和其它 烷基胺、哌嗪和三(羟基甲基)氨基甲烷；碱金属盐，例如但不限制于锂、钾 和钠；碱土金属盐，例如但不限制于钡、钙和镁；过渡金属盐，例如但不限 制于锌；和其它金属盐，例如但不限制于磷酸二氢钠和磷酸氢二钠；且也包 括，但不限制于，硝酸盐、硼酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐，无 机酸盐，例如但不限制于盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐和硫酸盐；和有机酸 盐，例如但不限制于乙酸盐、三氟乙酸盐、马来酸盐、草酸盐、乳酸盐、苹 果酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、水杨酸盐、抗坏血酸盐、琥珀酸 盐、丁酸盐、戊酸盐和富马酸盐。药学可接受的酯包括，但不限于，烷基、 烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、环烷基和杂环基与酸性基 团的酯，所述酸性基团包括，但不限制于，羧酸、磷酸、膦酸、磺酸、亚磺 酸和硼酸。药学可接受的烯醇醚包括，但不限于，式C＝C(OR)的衍生物，其 中R为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、环烷基 或杂环基。药学可接受的烯醇酯包括，但不限于，式C＝C(OC(O)R)的衍生物， 其中R为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、环烷 基或杂环基。药学可接受的溶剂合物和水合物为化合物与一个或多个溶剂或 水分子，或1至约100，或1至约10，或1至约2、3或4个溶剂或水分子 的复合物。
本文所用的治疗指任何方式，其中一种或多种疾病或病症的症状被改善 或有利地改变。本文所用的通过给药特定化合物或药物组合物改善特定病症 的症状涉及由于给药组合物或与给药组合物有关的任何减轻，永久或暂时， 持续或瞬间。
本文所用的IC50是指在检测响应的实验中特定的检测化合物实现最大 响应(如调节蛋白质运输)的50％抑制的量、浓度或剂量。
本文所用的EC50是指剂量依赖响应为特定响应最大表现的50％的检测 化合物的剂量、浓度或量，所述特定响应是由特定检测化合物引起、产生或 导致的。
本文所用的前药为在体内给药后通过一个或多个步骤或过程代谢或转 化为生物学、药学或治疗活性形式化合物的化合物。为了制备前药，修饰药 学活性的化合物，使得活性化合物将通过代谢过程重新产生。可以设计前药 以改变药物的代谢稳定性或转运特点，以掩蔽药物的副作用或毒性，以改善 药物的味或以改变药物的其它特点或性质。由于体内的药效学过程和药物代 谢知识，当已知药物活性化合物后，本领域技术人员可以设计化合物的前药 (参见，例如Nogrady(1985)Medicinal Chemistry A Biochemical Approach， Oxford University Press，New York，第388-392页)。
将理解本文提供的化合物可以含有手性中心。这些手性中心可以是(R) 或(S)构型，或可以为其混合物。因此，本文提供的化合物可以为对映体纯， 或为立体异构体或非对映异构体混合物。在氨基酸残基的情况下，这些残基 可以是L-或D-型的。天然存在的氨基酸残基的构型通常为L。当没有特定 指明时，残基为L型。本文所用的术语″氨基酸″指α-氨基酸，它们为外消旋 体或D-或L-构型。在氨基酸前面的标示″d″(如dAla、dSer、dVal等)指D-型 的氨基酸。在氨基酸前面的标示″dl″(如dlPip)指L-和D-型的氨基酸的混合物。 将理解本文提供的化合物的手性中心可能经历体内差向异构化。这样，对于 经历体内差向异构化的化合物，本领域技术人员将识别给药(R)构型的化合 物等价于给药(S)构型的化合物。
本文所用的基本上纯指足够均质使得通过本领域技术人员使用检测纯 度的标准分析方法检测不到易于检测的杂质，所述标准分析方法如薄层色谱 法(TLC)、凝胶电泳法、高效液相法(HPLC)和质谱(MS)，或基本上纯指足够 纯使得进一步纯化不能检测到物质的物理和化学性质(例如酶和生物活性) 的改变。纯化化合物以制备基本上纯的化合物的方法是本领域技术人员已知 的。然而，基本上化学纯的化合物可以为立体异构体的混合物。这种情况中， 进一步纯化可能增加化合物的特定活性。
本文所用的“烷基”、“烯基”和“炔基”碳链，如果没有特别说明，含有1 至20个碳，或1或2至16个碳，且为直链或支链。2至20个碳的烯基碳链， 在某些实施方案中，含有1至8个双键；且2至16个碳的烯基碳链，在某 些实施方案中，含有1至5个双键。2至20个碳的炔基碳链，在某些实施方 案中，含有1至8个三键；且2至16个碳的炔基碳链，在某些实施方案中， 含有1至5个三键。本文的示例性烷基、烯基和炔基包括，但不限于，甲基、 乙基、丙基、异丙基、异丁基、正丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基、新戊基、 叔戊基、异己基、烯丙基(丙烯基)和炔丙基(丙炔基)。本文所用的低级烷基、 低级烯基和低级炔基是指具有约1或约2个碳最多约6个碳的碳链。本文所 用的″alk(en)(yn)yl″是指含有至少一个双键和至少一个三键的烷基。
本文所用的″环烷基″是指饱和的单-或多-环体系，在一些实施方案中含 3至10个碳原子，在其它实施方案中含3至6个碳原子；环烯基和环炔基指 单-或多环体系，其分别包括至少一个双键和至少一个三键。在某些实施方 案中，环烯基和环炔基可以含有3至10个碳原子；在另一些实施方案中， 环烯基含有4至7个碳原子；且在另一些实施方案中，环炔基含有8至10 个碳原子。环烷基、环烯基和环炔基的环体系可以包含1个环或2个或更多 个环，这些环可以通过稠合、桥接或螺环连接方式连接在一起。
″Cycloalk(en)(yn)yl″是指含有至少一个双键和至少一个三键的环烷基。
本文所用的″芳基″是指含有6-19个碳原子的芳香单环或多环基团。芳基 包括，但不限于，例如未被取代或被取代的芴基、未被取代或被取代苯基、 和未被取代或被取代萘基。
本文所用的″杂芳基″是指单环或多环芳香环体系，在某些实施方案中， 为约5至约15元环，其中一个或多个，在一个实施方案中1至3个，环体 系中的原子为杂原子，即非碳原子，包括但不限制于，氮、氧或硫。杂芳基 可以任选与苯环稠合。杂芳基包括，但不限于，呋喃基、咪唑基、嘧啶基、 四唑基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、噻唑基、异噻唑基、噁唑基、异噁唑基、 三唑基、喹啉基和异喹啉基。
本文所用的″杂芳鎓″基团为在一个或多个杂原子上带正电荷的杂芳基。
本文所用的″杂环基″是指单环或多环非芳香环体系，在一个实施方案中 为3至10元环，在另一个实施方案中为4至7元环，在另一个实施方案中， 为5至6元环，其中一个或多个，在某些实施方案中，1至3个，环体系中 的原子为杂原子，即非碳元素，包括但不限制于，氮、氧或硫。在所述杂原 子为氮的实施方案中，氮任选被下述基团取代：烷基、烯基、炔基、芳基、 杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、环烷基、杂环基、环烷基烷基、杂环基烷基、 酰基、胍基，或氮可以被季铵化形成铵基，其中取代基选自上述取代基。
本文所用的″芳烷基″是指其中烷基的一个氢原子被芳基替代的烷基。
本文所用的″杂芳烷基″是指其中烷基的一个氢原子被杂芳基替代的烷 基。
本文所用的″卤″、″卤素″或″卤化物″是指F、Cl、Br或I。
本文所用的拟卤化物或拟卤素基团是指性质基本上与卤化物相似的基 团。这些化合物可以以与卤化物相同的方式使用和以相同的方式处理。拟卤 化物包括，但不限于，氰化物、氰酸盐、硫氰酸盐、硒氰酸盐、三氟甲氧基 和叠氮化物。
本文所用的″卤代烷基″是指其中一个或多个氢原子被卤素替代的烷基。 这些基团包括，但不限于，氯甲基、三氟甲基和1-氯-2-氟乙基。
本文所用的″卤代烷氧基″是指RO-，其中R为卤代烷基。
本文所用的″亚磺酰基″或″亚硫酰基″是指-S(O)-。本文所用的″磺酰基″ 或″硫酰基″是指-S(O)2-。本文所用的″磺基″是指-S(O)2O-。
本文所用的″羧基″是指二价基团，-C(O)O-。
本文所用的″氨基羰基″是指-C(O)NH2。
本文所用的″烷基氨基羰基″是指-C(O)NHR，其中R为烷基，包括低级 烷基。本文所用的″二烷基氨基羰基″是指-C(O)NR′R，其中R′和R独立地为 烷基，包括低级烷基；″羧酰氨基″是指式-NR′COR基团，其中R′和R独立地 为烷基，包括低级烷基。
本文所用的″二芳基氨基羰基″是指-C(O)NRR′，其中R和R′独立地选自 芳基，包括低级芳基，如苯基。
本文所用的″芳基烷基氨基羰基″是指-C(O)NRR′，其中R和R′中的一个 为芳基，包括低级芳基，如苯基，且R和R′的另一个为烷基，包括低级烷基。
本文所用的″芳基氨基羰基″是指-C(O)NHR，其中R为芳基，包括低级 芳基，如苯基。
本文所用的″羟基羰基″是指-COOH。
本文所用的″烷氧基羰基″是指-C(O)OR，其中R为烷基，包括低级烷基。
本文所用的″芳氧基羰基″是指-C(O)OR，其中R为芳基，包括低级芳基， 如苯基。
本文所用的″烷氧基″和″烷基硫基″是指RO-和RS-，其中R为烷基，包 括低级烷基。
本文所用的″芳氧基″和″芳基硫基″是指RO-和RS-，其中R为芳基，包 括低级芳基，如苯基。
本文所用的″亚烷基″是指直链、支链或环状，在某些实施方案中，为直 链或支链的，二价脂肪烃基，在一个实施方案中具有1至约20个碳原子， 在另一个实施方案中具有1至12个碳。在另一个实施方案中，亚烷基包括 低级亚烷基。在亚烷基中可以任选插入一个或多个氧、硫包括S(＝O)和 S(＝O)2基团、或被取代或未被取代的氮原子包括-NR-和-N+RR-基团，其中 氮的取代基为烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基或COR′，其中R′为 烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基、-OY或-NYY，其中Y为氢、烷 基、芳基、杂芳基、环烷基或杂环基。亚烷基包括，但不限于，亚甲基(-CH2-)、 亚乙基(-CH2CH2-)、亚丙基(-(CH2)3-)、亚甲基二氧基(-O-CH2-O-)和亚乙 基二氧基(-O-(CH2)2-O-)。术语″低级亚烷基″是指具有1-6个碳的亚烷基。在 某些实施方案中，亚烷基为低级亚烷基，包括1-3个碳的亚烷基。
本文所用的″氮杂亚烷基″是指-(CRR)n-NR-(CRR)m-，其中n和m各自独 立地为0-4的整数。本文所用的″氧杂亚烷基″是指-(CRR)n-O-(CRR)m-，其中 n和m各自独立地为0-4的整数。本文所用的″硫杂亚烷基″是指 -(CRR)n-S-(CRR)m-、-(CRR)n-S(＝O)-(CRR)m-和-(CRR)n-S(＝O)2-(CRR)m-，其 中n和m各自独立地为0-4的整数。
本文所用的″亚烯基″是指直链、支链或环状，在一个实施方案中直链或 支链的，二价脂肪烃基，在一些实施方案中具有2至约20个碳原子和至少 一个双键，在其它实施方案中具有1至12个碳。在另一个实施方案中，亚 烯基包括低级亚烯基。在亚烯基中可任选插入一个或多个氧、硫或被取代或 未被取代的氮原子，其中氮的取代基为烷基。亚烯基包括，但不限于， -CH＝CH-CH＝CH-和-CH＝CH-CH2-。术语″低级亚烯基″是指具有2-6个碳 的亚烯基。在某些实施方案中，亚烯基为低级亚烯基，包括3-4个碳原子的 亚烯基。
本文所用的″亚炔基″是指直链、支链或环状，在一些实施方案中直链或 支链的，二价脂肪烃基，在一个实施方案中具有2至约20个碳原子和至少 一个三键，在另一个实施方案中1至12个碳。在另一个实施方案中，亚炔 基包括低级亚炔基。亚炔基中可任选插入一个或多个氧、硫或被取代或未被 取代的氮原子，其中氮的取代基为烷基。亚炔基包括，但不限于， -C≡C-C≡C-、-C≡C-和-C≡C-CH2-。术语″低级亚炔基″是指具有2-6个碳的 亚炔基。在某些实施方案中，亚炔基为低级亚炔基，包括3-4个碳原子的亚 炔基。
本文所用的″alk(en)(yn)ylene″是指直链、支链或环状，在一些实施方案 中直链或支链的，二价脂肪烃基，在一个实施方案中具有2至约20个碳原 子和至少一个三键，和至少一个双键；在另一个实施方案中1至12个碳。 在另一个实施方案中，alk(en)(yn)ylene包括低级alk(en)(yn)ylene。 alk(en)(yn)ylene中可任选插入一个或多个氧、硫或被取代或未被取代氮原子， 其中氮的取代基为烷基。Alk(en)(yn)ylene包括，但不限于， -C＝C-(CH2)n-C≡C-，其中n为1或2。术语″低级alk(en)(yn)ylene″是指具 有最多6个碳的alk(en)(yn)ylene。在某些实施方案中，alk(en)(yn)ylene具有 4个碳原子。
本文所用的″环亚烷基″是指二价饱和单-或多环体系，在一些实施方案中 具有3-10个碳原子，在其它实施方案中3-6个碳原子；环亚烯基和环亚炔基 是指二价单-或多环体系，其分别包括至少一个双键和至少一个三键。在某 些实施方案中，环亚烯基和环亚炔基可以含有3-10个碳原子，在一些实施方 案中环亚烯基含有4-7个碳原子，且在一些实施方案中环亚炔基含有8-10个 碳原子。环亚烷基、环亚烯基和环亚炔基的环体系可以包括1个环或2个或 更多环，它们通过稠合、桥接或螺环连接方式连接在一起。
″Cycloalk(en)(yn)ylene″是指含有至少一个双键和至少一个三键的环亚 烷基。
本文所用的″亚芳基″是指单环或多环，在一些实施方案中单环的，二价 芳香基团，在一个实施方案中具有5至约20个碳原子和至少一个芳香环， 在另一个实施方案中5至12个碳。在另一个实施方案中，亚芳基包括低级 亚芳基。亚芳基包括，但不限于，1，2-、1，3-和1，4-亚苯基。术语″低级亚芳 基″是指具有6个碳的亚芳基。
本文所用的″杂亚芳基″是指二价单环或多环芳香环体系，在一个实施 方案中该环中具有约5至约15个原子，其中环体系中一个或多个，在一些 实施方案中1至3个，原子为杂原子，即非碳元素，包括但不限制于，氮、 氧或硫。术语“低级杂亚芳基”是指在环中含有5或6个原子的杂亚芳基。
本文所用的″杂亚环基″是指二价单环或多环非芳香环体系，在一些实施 方案中3-10元，在一个实施方案中4-7元，在另一个实施方案中5-6元，其 中环体系中的一个或多个，包括1-3个原子为杂原子，即非碳元素，包括但 不限制于，氮、氧或硫。
本文所用的″被取代的烷基″、″被取代的烯基″、″被取代的炔基″、″被取 代的环烷基″、″被取代的环烯基″、″被取代的环炔基″、″被取代的芳基″、″ 被取代的杂芳基″、″被取代的杂环基″、″被取代的亚烷基″、″被取代的亚烯 基″、″被取代的亚炔基″、″被取代的环亚烷基″、″被取代的环亚烯基″、″被取 代的环亚炔基″、″被取代的亚芳基″、″被取代的杂亚芳基″和″被取代的杂亚 环基″分别指烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、 杂环基、亚烷基、亚烯基、亚炔基、环亚烷基、环亚烯基、环亚炔基、亚芳 基、杂亚芳基和杂亚环基，这些基团被一个或多个取代基取代，在一些实施 方案中被1个、2个、3个或4个取代基取代，其中所述取代基如本文中的 定义，在一个实施方案中选自Q1。
本文所用的″烷叉基″是指二价基团，如＝CR′R″，其与其它基团的一个 原子相连，形成双键。烷叉基包括，但不限于，甲叉基(＝CH2)和乙叉基 (＝CHCH3)。本文所用的″芳基烷叉基″是指烷叉基，其中R′或R″为芳基。″环 烷叉基″是指其中R′和R″连接形成碳环的基团。″杂环叉基″是指其中R′和R″ 中的至少一个在链中含有杂原子，且R′和R″连接形成杂环。
本文所用的″酰氨基″是指二价基团-C(O)NH-。″硫代酰氨基″是指二价基 团-C(S)NH-。″氧基酰氨基″是指二价基团-OC(O)NH-。″硫基酰氨基″是指二 价基团-SC(O)NH-。″二硫代酰氨基″是指二价基团-SC(S)NH-。″脲基″是指二 价基团-HNC(O)NH-。″硫脲基″是指二价基团-HNC(S)NH-。
本文所用的″氨基脲″是指-NHC(O)NHNH-。″羧酰肼″是指二价基团 -OC(O)NHNH-。″异硫代羧酰肼″是指二价基团-SC(O)NHNH-。″硫代羧酰肼″ 是指二价基团-OC(S)NHNH-。″磺酰肼″是指二价基团-SO2NHNH-。″酰肼″ 是指二价基团-C(O)NHNH-。″偶氮″是指二价基团-N＝N-。″肼基″是指二价基 团-NH-NH-。
当任何给出的取代基的数量没有说明时(如卤代烷基)，表示可以为一个 或多个取代基。例如，″卤代烷基″可以包括一个或多个相同或不同的卤素。
本文所用的对于任何保护基、氨基酸和其它化合物的缩写，除非另有说 明，与常用的可识别的缩写一致，或与IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature(参见，(1972)Biochem.11：942-944)一致。
B.化合物
本文公开的在本文提供的组合物和拯救蛋白质运输缺陷的方法中使用 的化合物可以用于治疗许多以蛋白质运输受损为特征的病症。
在一个实施方案中，在本文提供的组合物和方法中使用的化合物具有式 Ia：

或其药学可接受的衍生物。式Ia中，Rj和Rk独立地选自氢、烷基、烯 基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基或芳烷基；或Rj和Rk和与它们 同时相连的碳一起为-C(＝O)-、-CH(OR*)-、-C(＝S)-、-CH(SR*)-、 -CH(NR*R*′)-或-C(＝NR*)-，其中R*和R*′独立地为氢、烷基、烯基、炔基、 环烷基、杂环基、芳基、杂芳基或芳烷基，Rs和Rt独立地选自氢、烷基、 卤素、拟卤素、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基或芳烷基；或 Rs和Rt与它们之间的碳-碳双键一起形成4-6元环烯基、芳基、杂环基或杂 芳基环，其中Rs和Rt形成的环任选被0-4个下文定义的取代基R2取代。
本文也描述了式Ia表示的化合物或其药学可接受的衍生物，其中Rj和 Rk独立地选自氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基或芳 烷基；或Rj和Rk和与它们同时相连的碳一起为-C(＝O)-、-CH(OR*)-、 -C(＝S)-、-CH(SR*)-、-CH(NR*R*′)-或-C(＝NR*)-；Y为NRR”、OR’、SR’ 或CRR”；其中R”为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂 芳基或芳烷基，或R”与R3和之间的原子一起为4-6元杂环基或杂芳基环； 条件是当Rj和Rk和与它们同时相连的碳一起为-C(＝O)-时，R”与R3和之间 的原子一起为4-6元杂环基或杂芳基环。在一些实施方案中，当Rj和Rk和 与它们同时相连的碳一起为-C(＝O)-、-CH(OR*)-、-C(＝S)-、-CH(SR*)-、 -CH(NR*R*′)-或-C(＝NR*)-时，Y为NRR”或CRR”，且R”与R3和之间的原 子一起为4-6元杂环基或杂芳基环。在式Ia表示的化合物的多个实施方案中， Rj和Rk独立地选自氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳 基或芳烷基，或Rj和Rk一起为-CH(OR*)-、-C(＝S)-、-CH(SR*)-、 -CH(NR*R*′)-或-C(＝NR*)-。在一些实施方案中，所述化合物表示为式Ia或 其药学可接受的衍生物，其中Rj和Rk独立地选自氢、烷基、烯基、炔基、 环烷基、杂环基、芳基、杂芳基或芳烷基。本文也描述了药物组合物，其包 含化合物和药学可接受的载体。
在一些实施方案中，所述化合物为式I表示的化合物：

或其药学可接受的衍生物。
式Ia和I中：
X为O、S或NR，其中R为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、 芳基、杂芳基或芳烷基；在一些实施方案中，当式Ia中Rj和Rk均为氢时， X为O；
Y为NRR’或OH；其中R’为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、 芳基、杂芳基或芳烷基；在一些实施方案中，Y为NRR”、OR’、SR’或CRR”； 其中R”为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基或芳烷 基，或R”与R3和之间的原子一起为4-6元杂环基或杂芳基环，例如，在下 述化合物中环A和B表示的杂芳基环：

Z为直接键或NR；
R1为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、芳烷基、 芳烯基、杂芳烷基或杂芳烯基；在一些实施方案中，当式Ia中的Rj和Rk均 为氢时，R1为环烷基；在一些实施方案中，当式Ia中的Rj和Rk均为氢时， R1为环烷基且Z为直接键；在一些实施方案中，当式Ia中的Rj和Rk均为氢 时，R1为环烷基，Z为直接键且X为O；
n为0-4；
R2选自下述(i)或(ii)：
(i)氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、环烷基、杂环基、 C(A)R110、卤素、拟卤素、OR111、S(D)aR112、NR115R116或N+R115R116R117；或
(ii)取代环上相邻原子的任两个R2基团一起形成亚烷基、亚烯基、亚 炔基或杂亚烷基；
A为O、S或NR125；
R110为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、环烷基、杂环 基、C(A)R126、卤素、拟卤素、OR125、SR125、NR127R128或SiR122R123R124；
R111为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、环烷基、杂环 基、C(A)R129、NR130R131或SiR122R123R124；
D为O或NR125；
a为0、1或2；
当a为1或2时，R112选自氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂 芳鎓、环烷基、杂环基、卤素、拟卤素、OR125、SR125和NR132R133；
当a为0时，R112选自氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、 环烷基、杂环基、SR125和C(A)R129；
R115、R116和R117各自独立地选自下述(a)和(b)：
(a)氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、环烷基、杂环基、 C(A)R129、OR125或NR132R133；或
(b)R115、R116和R117中的任两个一起形成亚烷基、亚烯基、亚炔基、 杂亚烷基，且另一个选自(a)；
R122、R123和R124选自下述(i)或(ii)：
(i)R122、R123和R124各自独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂 芳基、杂芳鎓、环烷基、杂环基、OR125或NR132R133；或
(ii)R122、R123和R124中的任两个一起形成亚烷基、亚烯基、亚炔基、杂 亚烷基；且另一个选自(i)；
R125为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、环烷基或杂环 基；
R126为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、环烷基、杂环 基、OR125或NR134R135；其中R134和R135各自独立地为氢、烷基、烯基、炔 基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、环烷基、杂环基、OR136或NR132R133，或R134 和R135一起形成亚烷基、亚烯基、亚炔基、杂亚烷基，其中R136为氢、烷基、 烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、环烷基或杂环基；
R127和R128选自下述(i)或(ii)：
(i)R127和R128各自独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、 杂芳鎓、环烷基、杂环基、OR125、NR137R138或C(A)R139，其中R137和R138 各自独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、环烷基或杂 环基，或一起形成亚烷基、亚烯基、亚炔基、杂亚烷基；且R139为氢、烷基、 烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、环烷基、杂环基、OR140或NR132R133， 其中R140为烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、环烷基、杂环基； 或
(ii)R127和R128一起形成亚烷基、亚烯基、亚炔基、杂亚烷基；
R129为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、环烷基、杂环 基、OR140或NR132R133；
R130和R131各自独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳 鎓、环烷基、杂环基或C(A)R141，其中R141为烷基、烯基、炔基、芳基、杂 芳基、杂芳鎓、环烷基、杂环基、OR125或NR132R133；或R130和R131一起形 成亚烷基、亚烯基、亚炔基、杂亚烷基；
R132和R133各自独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳 鎓、环烷基、杂环基，或R132和R133一起形成亚烷基、亚烯基、亚炔基、杂 亚烷基；且
R3为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
其中X、Y、Z、R1、R2和R3，或在一些实施方案中，X、Y、Z、R、R’、 R”、R*、R1、R2和R3，各自独立地未被取代或被一个或多个取代基取代， 在一个实施方案中被1个、2个或3个取代基取代，所述取代基各自独立地 选自Q1，其中Q1为卤素、拟卤素、羟基、氧代基团、硫代基团、腈、硝基、 甲酰基、巯基、羟基羰基、羟基羰基烷基、羟基羰基烯基、烷基、卤代烷基、 多卤代烷基、氨基烷基、二氨基烷基、含1至2个双键的烯基、含1至2个 三键的炔基、环烷基、环烷基烷基、杂环基、杂环基烷基、芳基、杂芳基、 芳烷基、芳烯基、芳炔基、杂芳基烷基、三烷基硅烷基、二烷基芳基硅烷基、 烷基二芳基硅烷基、三芳基硅烷基、烷叉基、芳基烷叉基、烷基羰基、芳基 羰基、杂芳基羰基、烷氧基羰基、烷氧基羰基烷基、烷氧基羰基烷氧基、芳 氧基羰基、芳氧基羰基烷基、芳烷氧基羰基、芳烷氧基羰基烷基、芳烷氧基 羰基烷氧基、芳基羰基烷基、氨基羰基、氨基羰基烷基、氨基羰基烷氧基、 烷基氨基羰基、烷基氨基羰基烷基、烷基氨基羰基烷氧基、二烷基氨基羰基、 二烷基氨基羰基烷基、二烷基氨基羰基烷氧基、芳基氨基羰基、芳基氨基羰 基烷基、芳基氨基羰基烷氧基、二芳基氨基羰基、二芳基氨基羰基烷基、二 芳基氨基羰基烷氧基、芳基烷基氨基羰基、芳基烷基氨基羰基烷基、芳基烷 基氨基羰基烷氧基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、杂芳烷氧基、杂环基氧基、 环烷氧基、全氟烷氧基、烯氧基、炔氧基、芳烷氧基、烷基羰基氧基、芳基 羰基氧基、芳烷基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、芳烷氧基 羰基氧基、氨基羰基氧基、烷基氨基羰基氧基、二烷基氨基羰基氧基、烷基 芳基氨基羰基氧基、二芳基氨基羰基氧基、胍基、异硫脲基、脲基、N-烷基 脲基、N-芳基脲基、N′-烷基脲基、N′，N′-二烷基脲基、N′-烷基-N′-芳基脲基、 N，N-二芳基脲基、N′-芳基脲基、N，N′-二烷基脲基、N-烷基-N′-芳基脲基、 N-芳基-N′-烷基脲基、N，N′-二芳基脲基、N，N′，N′-三烷基脲基、N，N′-二烷基-N′- 芳基脲基、N-烷基-N，N-芳基脲基、N-芳基-N′，N′-二烷基脲基、N，N′-二芳 基-N′-烷基脲基、N，N′，N′-三芳基脲基、脒基、烷基脒基、芳基脒基、氨基硫 代羰基、烷基氨基硫代羰基、芳基氨基硫代羰基、氨基、氨基烷基、烷基氨 基烷基、二烷基氨基烷基、芳基氨基烷基、二芳基氨基烷基、烷基芳基氨基 烷基、烷基氨基、二烷基氨基、卤代烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、烷 基芳基氨基、烷基羰基氨基、烷氧基羰基氨基、芳烷氧基羰基氨基、芳基羰 基氨基、芳基羰基氨基烷基、芳氧基羰基氨基烷基、芳氧基芳基羰基氨基、 芳氧基羰基氨基、烷基磺酰基氨基、芳基磺酰基氨基、杂芳基磺酰基氨基、 杂环基磺酰基氨基、杂芳基硫基、叠氮基、-N+R151R152R153、P(R150)2、 P(＝O)(R150)2、OP(＝O)(R150)2、-NR160C(＝O)R163、二烷基膦酰基、烷基芳基膦 酰基、二芳基膦酰基、羟基膦酰基、烷基硫基、芳基硫基、全氟烷基硫基、 羟基羰基烷基硫基、氰硫基、异氰硫基、烷基亚磺酰基氧基、烷基磺酰基氧 基、芳基亚磺酰基氧基、芳基磺酰基氧基、羟基磺酰基氧基、烷氧基磺酰基 氧基、氨基磺酰基氧基、烷基氨基磺酰基氧基、二烷基氨基磺酰基氧基、芳 基氨基磺酰基氧基、二芳基氨基磺酰基氧基、烷基芳基氨基磺酰基氧基、烷 基亚磺酰基、烷基磺酰基、芳基亚磺酰基、芳基磺酰基、羟基磺酰基、烷氧 基磺酰基、氨基磺酰基、烷基氨基磺酰基、二烷基氨基磺酰基、芳基氨基磺 酰基、二芳基氨基磺酰基或烷基芳基氨基磺酰基；叠氮基、四唑基，或取代 1，2或1，3排列中的原子的两个Q1基团一起形成亚烷基二氧基(即， -O-(CH2)y-O-)、硫基亚烷基氧基(即，-S-(CH2)y-O-)或亚烷基二硫基(即， -S-(CH2)y-S-)，其中y为1或2；或取代相同原子的两个Q1基团一起形成亚 烷基；且
每个Q1独立地未被取代或被一个或多个取代基取代，在一个实施方案 中被1个、2个或3个取代基取代，所述取代基各自独立地选自Q2；
每个Q2独立地为卤素、拟卤素、羟基、氧代基团、硫代基团、腈、硝 基、甲酰基、巯基、羟基羰基、羟基羰基烷基、羟基羰基烯基、烷基、卤代 烷基、多卤代烷基、氨基烷基、二氨基烷基、含1至2个双键的烯基、含1 至2个三键的炔基、环烷基、环烷基烷基、杂环基、杂环基烷基、芳基、杂 芳基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、杂芳基烷基、三烷基硅烷基、二烷基芳基 硅烷基、烷基二芳基硅烷基、三芳基硅烷基、烷叉基、芳基烷叉基、烷基羰 基、芳基羰基、杂芳基羰基、烷氧基羰基、烷氧基羰基烷基、芳氧基羰基、 芳氧基羰基烷基、芳烷氧基羰基、芳烷氧基羰基烷基、芳基羰基烷基、氨基 羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、二芳基氨基羰基、 芳基烷基氨基羰基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、杂芳烷氧基、杂环基氧基、 环烷氧基、全氟烷氧基、烯氧基、炔氧基、芳烷氧基、烷基羰基氧基、芳基 羰基氧基、芳烷基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、芳烷氧基 羰基氧基、氨基羰基氧基、烷基氨基羰基氧基、二烷基氨基羰基氧基、烷基 芳基氨基羰基氧基、二芳基氨基羰基氧基、胍基、异硫脲基、脲基、N-烷基 脲基、N-芳基脲基、N′-烷基脲基、N′，N′-二烷基脲基、N′-烷基-N′-芳基脲基、 N′，N′-二芳基脲基、N′-芳基脲基、N，N′-二烷基脲基、N-烷基-N′-芳基脲基、 N-芳基-N′-烷基脲基、N，N′-二芳基脲基、N，N′，N′-三烷基脲基、N，N′-二烷基-N′- 芳基脲基、N-烷基-N′，N′-二芳基脲基、N-芳基-N′，N′-二烷基脲基、N，N′-二芳 基-N′-烷基脲基、N，N′，N′-三芳基脲基、脒基、烷基脒基、芳基脒基、氨基硫 代羰基、烷基氨基硫代羰基、芳基氨基硫代羰基、氨基、氨基烷基、烷基氨 基烷基、二烷基氨基烷基、芳基氨基烷基、二芳基氨基烷基、烷基芳基氨基 烷基、烷基氨基、二烷基氨基、卤代烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、烷 基芳基氨基、烷基羰基氨基、烷氧基羰基氨基、芳烷氧基羰基氨基、芳基羰 基氨基、芳基羰基氨基烷基、芳氧基羰基氨基烷基、芳氧基芳基羰基氨基、 芳氧基羰基氨基、烷基磺酰基氨基、芳基磺酰基氨基、杂芳基磺酰基氨基、 杂环基磺酰基氨基、杂芳基硫基、叠氮基、-N+R151R152R153、P(R150)2、 P(＝O)(R150)2、OP(＝O)(R150)2、-NR160C(＝O)R163、二烷基膦酰基、烷基芳基膦 酰基、二芳基膦酰基、羟基膦酰基、烷基硫基、芳基硫基、全氟烷基硫基、 羟基羰基烷基硫基、氰硫基、异氰硫基、烷基亚磺酰基氧基、烷基磺酰基氧 基、芳基亚磺酰基氧基、芳基磺酰基氧基、羟基磺酰基氧基、烷氧基磺酰基 氧基、氨基磺酰基氧基、烷基氨基磺酰基氧基、二烷基氨基磺酰基氧基、芳 基氨基磺酰基氧基、二芳基氨基磺酰基氧基、烷基芳基氨基磺酰基氧基、烷 基亚磺酰基、烷基磺酰基、芳基亚磺酰基、芳基磺酰基、羟基磺酰基、烷氧 基磺酰基、氨基磺酰基、烷基氨基磺酰基、二烷基氨基磺酰基、芳基氨基磺 酰基、二芳基氨基磺酰基或烷基芳基氨基磺酰基；或取代1，2或1，3排列中 的原子的两个Q2基团一起形成亚烷基二氧基(即，-O-(CH2)y-O-)、硫基亚烷 基氧基(即，-S-(CH2)y-O-)或亚烷基二硫基(即，-S-(CH2)y-S-)，其中y为1或 2；或取代相同原子的两个Q2基团一起形成亚烷基；
R150为羟基、烷氧基、芳烷氧基、烷基、杂芳基、杂环基、芳基或-NR170R171， 其中R170和R171各自独立地为氢、烷基、芳烷基、芳基、杂芳基、杂芳烷基 或杂环基，或R170和R171一起形成亚烷基、氮杂亚烷基、氧杂亚烷基或硫杂 亚烷基；
R151、R152和R153各自独立地为氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂 芳烷基、杂环基或杂环基烷基；
R160为氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基、杂环基或杂环基 烷基；且
R163为烷氧基、芳烷氧基、烷基、杂芳基、杂环基、芳基或-NR170R171。
在一些实施方案中，R1被一个或多个取代基取代，所述取代基独立地选自 芳氧基、芳基、杂芳基、卤素、拟卤素、烷基、烷氧基、环烷基、烷氧基羰 基、羟基羰基、烷基氨基和二烷基氨基。
本领域技术人员也将识别式Ia和I结构上涉及其中包括的化合物的一种 互变异构形式；本文也考虑了所有的这些互变异构形式。例如，式Ia和I 包括-NH-CH(Y)＝N-表示的部分，且当Y为NH2时，该部分为胍基，其包括 三种互变异构形式，-NH-CH(NH2)＝N-、-NH-CH(＝NH)-NH-和 -N＝CH(NH2)-NH-。
在一些实施方案中，
X为O、S或NR，其中R为氢或烷基；
Y为NRR’或OH，其中R为氢或烷基；
Z为直接键或NR；
R1为烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂环基、杂芳基、芳烷基、 芳烯基、杂芳烷基或杂芳烯基；
R2为卤素、拟卤素、烷氧基或烷基；
n为0或1；
R3为氢或烷基；
其中X、Y、Z、R1、R2和R3各自独立地未被取代或被一个或多个取代 基取代，在一个实施方案中被1个、2个或3个取代基取代，所述取代基各 自独立地选自Q1。
在一些实施方案中，R为氢。
在一些实施方案中，n为0或1。
在一些实施方案中，X为S、O或NH。
在一些实施方案中，Y为NH2。
在一些实施方案中，Z为直接键或NH。
在一些实施方案中，R1为烷基、烯基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基， 且未被取代或被芳氧基、芳基、杂芳基、卤素、拟卤素、烷基、烷氧基、环 烷基、烷氧基羰基、羟基羰基、烷基氨基和二烷基氨基取代。
在一些实施方案中，R1为乙基、2-(2-呋喃基)乙烯基、苯基、甲基、2- 萘基氧基甲基、苄基、3-氯-2-苯并噻吩基、环丙基、环丙基甲基、异丁基、 4-叔丁基苯基、4-联苯基、叔丁基、3-氯苯基、2-呋喃基、2，4-二氯苯基、3，4- 二甲氧基苯基、2-(4-甲氧基苯基)乙烯基、4-甲氧基苯氧基甲基、异戊基、异 丙基、2-环戊基乙基、环戊基甲基、2-苯基丙基、2-苯基乙基、1-甲基-2-苯 基乙基、1-甲基-2-苯基乙烯基、2-苄基乙基、2-苯基乙烯基、5-己炔基、3- 丁炔基、4-戊炔基、丙基、丁基、戊基、己基、叔丁氧基甲基、叔丁基甲基、 1-乙基戊基、环丙基、环丙基甲基、环戊基、环己基、环丁基、2-环戊基乙 基、环戊基甲基、2-氟环丙基、2-甲基环丙基、2-苯基环丙基、2，2-二甲基乙 烯基、1，2-丙烯基、2-(3-三氟甲基苯基)乙烯基、3，4-丁烯基、2-(2-呋喃基)乙 基、2-氯乙烯基、2-(2-氯苯基)乙烯基、1-甲基-2，2-二氯环丙基、2，2-二氟环 丙基、丙酸甲酯、丙酸、丁酸甲酯、丁酸、戊酸、甲基-叔丁基醚、二甲基 氨基甲基、2-(2-四氢呋喃基)-乙基或2-(2-四氢呋喃基)-甲基。
在一些实施方案中，R2为卤素或烷基。
在一些实施方案中，R2为氯或甲基。
在一些实施方案中，R3为氢。
在多个实施方案中，所述化合物为式Ib-Im表示的化合物：

式Ib-Im中，变量具有本文上述对于式I和Ia的值。
在多个实施方案中，式Ib-Im中R1为氢、烷基、芳基、芳烷基、芳烯 基、炔基、杂芳基、杂芳烷基、杂芳基烯基、环烷基，每个这些基团可以被 0、1或2个基团取代，所述基团选自苯基、烷基、环烷基、烷氧基、卤素、 拟卤素、氨基、烷基氨基或二烷基氨基。在多个实施方案中，式Ib-Im中R1 为苯基、呋喃基、噻吩基、炔基、烷基、环丙基、环丁基或环戊基；或被苯 基、呋喃基、噻吩基、炔基、烷基、环丙基、环丁基或环戊基取代的烷基或 烯基；在一些实施方案中，R1任选被0、1或2个基团取代，所述基团选自 苯基、烷基、烷氧基、卤素或CN。
在一些实施方案中，式Ib-Im中Rj和Rk均为氢。在一些实施方案中， 式Ib-Im中R3为氢。
在式Ie表示的多个实施方案中，Rs’和Rt’独立地选自氢、烷基、卤素、 拟卤素、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基或芳烷基；在一些实 施方案中，Rs’和Rt’独立地选自氢、烷基和卤素；且在某些实施方案中，Rs’ 和Rt’独立地选自氢、烷基和Br，其中通常Rs’和Rt’不都是氢。
在式Ih-Im的一些实施方案中，n为0、1或2且每个R2独立地选自卤 素、烷基、烷氧基、卤代烷基和卤代烷氧基；在一些实施方案中，n为0、1 或2且每个R2独立地选自氢、F、氟烷基(例如CHF2、CF3)、和氟烷氧基(例 如OCHF2、OCF3)。
在一些实施方案中，所述化合物选自表I中的化合物。在某些实施方案 中，所述化合物选自表I中的化合物I.1-I.57；在一些实施方案中，所述化合 物选自表I中的化合物I.1-I.35。在一些实施方案中，所述化合物选自表I中 的化合物I.1-I.6和I.36-I.57。在一些实施方案中，所述化合物选自表I中的 化合物I.7-I.35。
在另一个实施方案中，在本文提供的组合物和方法中使用的化合物具 有式IIa：

或其药学可接受的衍生物。式IIa中，X*选自-O-、＝N-、-N(Ro)-、＝C(Ro)- 和-C(RoRo′)-，且Y*选自＝O、-ORo、＝NRo′、-NRoRo′、＝CRoRo′和-CHRoRo′； 其中选择X*和Y*使得一条虚线(---)为单键且另一条为双键，或两条虚线均 为单键。每个Ro′独立地选自氢、卤素、拟卤素、氨基、酰氨基、羧酰氨基、 磺酰氨基、羧基、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、芳 烷基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、芳氧基、杂芳氧基和芳烷基氧基。每 个Ro选自氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基和芳烷 基。在一些实施方案中，Ro′独立地选自氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂 环基、芳基、杂芳基或芳烷基。在某些实施方案中，Ro为氢或烷基，通常为 氢。
本文也描述了式IIa表示的化合物或其药学可接受的衍生物，其中X* 选自-O-、＝N-、-N(Ro)-、＝C(Ro)-和-C(RoRo′)-；且Y*选自＝O、-ORo、＝NRo′、 -NRoRo′、＝CRoRo′和-CHRoRo′；其中选择X*和Y*使得两条虚线均为单键， 或一条虚线(---)为单键且另一条为双键，条件是当X*为-N(H)-时，Y*不是 ＝O。在式IIa表示的化合物的多种实施方案中，选择X*和Y*使得两条虚线 均为单键，或一条虚线(---)为单键且另一条为双键，条件是当X*为-N(Ro)- 时，Y*不是＝O。在式IIa表示的化合物的一些实施方案中，选择X*和Y* 使得两条虚线均为单键，或一条虚线(---)为单键且另一条为双键，条件是当 X*为-N(Ro)-时，Y*不是＝O、＝NRo′或＝CRoRo′。本文也描述了药物组合物， 其包含式IIa的化合物和药学可接受的载体。
在一些实施方案中，式IIa的化合物可以为式II表示的化合物：

或其药学可接受的衍生物。
式IIa和II中：
Ar1为芳基、杂芳基或环烷基；
R7为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基或NRR， 其中R为氢或烷基；
R10为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
R8和R9各自独立地选自下述(i)或(ii)：
(i)氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、环烷基、杂环基、 C(A)R110、卤素、拟卤素、OR111、S(D)aR112、NR115R116或N+R115R116R117；或
(ii)R8和R9一起形成亚烷基、亚烯基、亚炔基或杂亚烷基；例如，在 一些实施方案中，R8和R9与和它们相连的原子一起形成稠合的苯基环，该 环未被取代或被卤素、拟卤素、烷基、烷氧基、环烷基、稠合的环烷基、稠 合的杂环基、稠合的杂芳基，或稠合的芳基取代，这些取代基未被取代或被 卤素、拟卤素、烷基、烷氧基、芳基、环烷基、杂环基、稠合的芳基、稠合 的杂环基和稠合的环烷基取代；
A为O、S或NR125；
R110为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、环烷基、杂环 基、C(A)R126、卤素、拟卤素、OR125、SR125、NR127R128和SiR122R123R124；
R111为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、环烷基、杂环 基、C(A)R129、NR130R131和SiR122R123R124；
D为O或NR125；
a为0、1或2；
当a为1或2时，R112选自氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂 芳鎓、环烷基、杂环基、卤素、拟卤素、OR125、SR125和NR132R133；
当a为0时，R112选自氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、 环烷基、杂环基、SR125和C(A)R129；
R115、R116和R117各自独立地选自下述(a)和(b)：
(a)氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、环烷基、杂环基、 C(A)R129、OR125或NR132R133；或
(b)R115、R116和R117中的任两个一起形成亚烷基、亚烯基、亚炔基、 杂亚烷基，且另一个选自(a)；
R122、R123和R124选自下述(i)或(ii)：
(i)R122、R123和R124各自独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂 芳基、杂芳鎓、环烷基、杂环基、OR125或NR132R133；或
(ii)R122、R123和R124中的任两个一起形成亚烷基、亚烯基、亚炔基、杂 亚烷基；且另一个选自(i)；
R125为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、环烷基或杂环 基；在一些实施方案中，其中R125为烷基、烯基或炔基，R125任选被芳基、 杂芳基、杂芳鎓、环烷基或杂环基取代；
R126为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、环烷基、杂环 基、OR125或NR134R135；其中R134和135各自独立地为氢、烷基、烯基、炔基、 芳基、杂芳基、杂芳鎓、环烷基、杂环基、OR136或NR132R133，或R134和R135 一起形成亚烷基、亚烯基、亚炔基、杂亚烷基，其中R136为氢、烷基、烯基、 炔基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、环烷基或杂环基；
R127和R128选自下述(i)或(ii)：
(i)R127和R128各自独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、 杂芳鎓、环烷基、杂环基、OR125、NR137R138或C(A)R139，其中R137和R138 各自独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、环烷基或杂 环基，或一起形成亚烷基、亚烯基、亚炔基、杂亚烷基；且R139为氢、烷基、 烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、环烷基、杂环基、OR140或NR132R133， 其中R140为烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、环烷基、杂环基； 或
(ii)R127和R128一起形成亚烷基、亚烯基、亚炔基、杂亚烷基；
R129为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、环烷基、杂环 基、OR140或NR132R133；
R130和R131各自独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳 鎓、环烷基、杂环基或C(A)R141，其中R141为烷基、烯基、炔基、芳基、杂 芳基、杂芳鎓、环烷基、杂环基、OR125或NR132R133；或R130和R131一起形 成亚烷基、亚烯基、亚炔基、杂亚烷基；
R132和R133各自独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳 鎓、环烷基、杂环基，或R132和R133一起形成亚烷基、亚烯基、亚炔基、杂 亚烷基；且
R10为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
其中Ar1、R7、R8、R9和R10各自独立地未被取代或被一个或多个取代 基取代，在一个实施方案中被1个、2个或3个取代基取代，所述取代基各 自独立地选自Q1，其中Q1为卤素、拟卤素、羟基、氧代基团、硫代基团、 腈、硝基、甲酰基、巯基、羟基羰基、羟基羰基烷基、羟基羰基烯基、烷基、 卤代烷基、多卤代烷基、氨基烷基、二氨基烷基、含1至2个双键的烯基、 含1至2个三键的炔基、环烷基、环烷基烷基、杂环基、杂环基烷基、芳基、 杂芳基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、杂芳基烷基、三烷基硅烷基、二烷基芳 基硅烷基、烷基二芳基硅烷基、三芳基硅烷基、烷叉基、芳基烷叉基、烷基 羰基、芳基羰基、杂芳基羰基、烷氧基羰基、烷氧基羰基烷基、烷氧基羰基 烷氧基、芳氧基羰基、芳氧基羰基烷基、芳烷氧基羰基、芳烷氧基羰基烷基、 芳烷氧基羰基烷氧基、芳基羰基烷基、氨基羰基、氨基羰基烷基、氨基羰基 烷氧基、烷基氨基羰基、烷基氨基羰基烷基、烷基氨基羰基烷氧基、二烷基 氨基羰基、二烷基氨基羰基烷基、二烷基氨基羰基烷氧基、芳基氨基羰基、 芳基氨基羰基烷基、芳基氨基羰基烷氧基、二芳基氨基羰基、二芳基氨基羰 基烷基、二芳基氨基羰基烷氧基、芳基烷基氨基羰基、芳基烷基氨基羰基烷 基、芳基烷基氨基羰基烷氧基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、杂芳烷氧基、 杂环基氧基、环烷氧基、全氟烷氧基、烯氧基、炔氧基、芳烷氧基、烷基羰 基氧基、芳基羰基氧基、芳烷基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧 基、芳烷氧基羰基氧基、氨基羰基氧基、烷基氨基羰基氧基、二烷基氨基羰 基氧基、烷基芳基氨基羰基氧基、二芳基氨基羰基氧基、胍基、异硫脲基、 脲基、N-烷基脲基、N-芳基脲基、N′-烷基脲基、N′，N′-二烷基脲基、N′-烷基 -N′-芳基脲基、N′，N′-二芳基脲基、N′-芳基脲基、N，N′-二烷基脲基、N-烷基-N′- 芳基脲基、N-芳基-N′-烷基脲基、N，N′-二芳基脲基、N，N′，N′-三烷基脲基、 N，N′-二烷基-N′-芳基脲基、N-烷基-N′，N′-二芳基脲基、N-芳基-N′，N′-二烷基 脲基、N，N′-二芳基-N′-烷基脲基、N，N′，N′-三芳基脲基、脒基、烷基脒基、芳 基脒基、氨基硫代羰基、烷基氨基硫代羰基、芳基氨基硫代羰基、氨基、氨 基烷基、烷基氨基烷基、二烷基氨基烷基、芳基氨基烷基、二芳基氨基烷基、 烷基芳基氨基烷基、烷基氨基、二烷基氨基、卤代烷基氨基、芳基氨基、二 芳基氨基、烷基芳基氨基、烷基羰基氨基、烷氧基羰基氨基、芳烷氧基羰基 氨基、芳基羰基氨基、芳基羰基氨基烷基、芳氧基羰基氨基烷基、芳氧基芳 基羰基氨基、芳氧基羰基氨基、烷基磺酰基氨基、芳基磺酰基氨基、杂芳基 磺酰基氨基、杂环基磺酰基氨基、杂芳基硫基、叠氮基、-N+R151R152R153、 P(R150)2、P(＝O)(R150)2、OP(＝O)(R150)2、-NR160C(＝O)R163、二烷基膦酰基、烷 基芳基膦酰基、二芳基膦酰基、羟基膦酰基、烷基硫基、芳基硫基、全氟烷 基硫基、羟基羰基烷基硫基、氰硫基、异氰硫基、烷基亚磺酰基氧基、烷基 磺酰基氧基、芳基亚磺酰基氧基、芳基磺酰基氧基、羟基磺酰基氧基、烷氧 基磺酰基氧基、氨基磺酰基氧基、烷基氨基磺酰基氧基、二烷基氨基磺酰基 氧基、芳基氨基磺酰基氧基、二芳基氨基磺酰基氧基、烷基芳基氨基磺酰基 氧基、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基、芳基亚磺酰基、芳基磺酰基、羟基磺酰 基、烷氧基磺酰基、氨基磺酰基、烷基氨基磺酰基、二烷基氨基磺酰基、芳 基氨基磺酰基、二芳基氨基磺酰基或烷基芳基氨基磺酰基；叠氮基、四唑基， 或取代1，2或1，3排列中的原子的两个Q1基团一起形成亚烷基二氧基(即， -O-(CH2)y-O-)、硫基亚烷基氧基(即，-S-(CH2)y-O-)或亚烷基二硫基(即， -S-(CH2)y-S-)，其中y为1或2；或取代相同原子的两个Q1基团一起形成亚 烷基；且
每个Q1独立地未被取代或被一个或多个取代基取代，在一个实施方案 中被1个、2个或3个取代基取代，所述取代基各自独立地选自Q2；
每个Q2独立地为卤素、拟卤素、羟基、氧代基团、硫代基团、腈、硝 基、甲酰基、巯基、羟基羰基、羟基羰基烷基、羟基羰基烯基、烷基、卤代 烷基、多卤代烷基、氨基烷基、二氨基烷基、含1至2个双键的烯基、含1 至2个三键的炔基、环烷基、环烷基烷基、杂环基、杂环基烷基、芳基、杂 芳基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、杂芳基烷基、三烷基硅烷基、二烷基芳基 硅烷基、烷基二芳基硅烷基、三芳基硅烷基、烷叉基、芳基烷叉基、烷基羰 基、芳基羰基、杂芳基羰基、烷氧基羰基、烷氧基羰基烷基、芳氧基羰基、 芳氧基羰基烷基、芳烷氧基羰基、芳烷氧基羰基烷基、芳基羰基烷基、氨基 羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、二芳基氨基羰基、 芳基烷基氨基羰基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、杂芳烷氧基、杂环基氧基、 环烷氧基、全氟烷氧基、烯氧基、炔氧基、芳烷氧基、烷基羰基氧基、芳基 羰基氧基、芳烷基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、芳烷氧基 羰基氧基、氨基羰基氧基、烷基氨基羰基氧基、二烷基氨基羰基氧基、烷基 芳基氨基羰基氧基、二芳基氨基羰基氧基、胍基、异硫脲基、脲基、N-烷基 脲基、N-芳基脲基、N′-烷基脲基、N′，N′-二烷基脲基、N′-烷基-N′-芳基脲基、 N′，N′-二芳基脲基、N′-芳基脲基、N，N′-二烷基脲基、N-烷基-N′-芳基脲基、 N-芳基-N′-烷基脲基、N，N′-二芳基脲基、N，N′，N′-三烷基脲基、N，N′-二烷基-N′- 芳基脲基、N-烷基-N′，N′-二芳基脲基、N-芳基-N′，N′-二烷基脲基、N，N′-二芳 基-N′-烷基脲基、N，N′，N′-三芳基脲基、脒基、烷基脒基、芳基脒基、氨基硫 代羰基、烷基氨基硫代羰基、芳基氨基硫代羰基、氨基、氨基烷基、烷基氨 基烷基、二烷基氨基烷基、芳基氨基烷基、二芳基氨基烷基、烷基芳基氨基 烷基、烷基氨基、二烷基氨基、卤代烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、烷 基芳基氨基、烷基羰基氨基、烷氧基羰基氨基、芳烷氧基羰基氨基、芳基羰 基氨基、芳基羰基氨基烷基、芳氧基羰基氨基烷基、芳氧基芳基羰基氨基、 芳氧基羰基氨基、烷基磺酰基氨基、芳基磺酰基氨基、杂芳基磺酰基氨基、 杂环基磺酰基氨基、杂芳基硫基、叠氮基、-N+R151R152R153、P(R150)2、 P(＝O)(R150)2、OP(＝O)(R150)2、-NR160C(＝O)R163、二烷基膦酰基、烷基芳基膦 酰基、二芳基膦酰基、羟基膦酰基、烷基硫基、芳基硫基、全氟烷基硫基、 羟基羰基烷基硫基、氰硫基、异氰硫基、烷基亚磺酰基氧基、烷基磺酰基氧 基、芳基亚磺酰基氧基、芳基磺酰基氧基、羟基磺酰基氧基、烷氧基磺酰基 氧基、氨基磺酰基氧基、烷基氨基磺酰基氧基、二烷基氨基磺酰基氧基、芳 基氨基磺酰基氧基、二芳基氨基磺酰基氧基、烷基芳基氨基磺酰基氧基、烷 基亚磺酰基、烷基磺酰基、芳基亚磺酰基、芳基磺酰基、羟基磺酰基、烷氧 基磺酰基、氨基磺酰基、烷基氨基磺酰基、二烷基氨基磺酰基、芳基氨基磺 酰基、二芳基氨基磺酰基或烷基芳基氨基磺酰基；或取代1，2或1，3排列中 的原子的两个Q2基团一起形成亚烷基二氧基(即，-O-(CH2)y-O-)、硫基亚烷 基氧基(即，-S-(CH2)y-O-)或亚烷基二硫基(即，-S-(CH2)y-S-)，其中y为1或 2；或取代相同原子的两个Q2基团一起形成亚烷基；
R150为羟基、烷氧基、芳烷氧基、烷基、杂芳基、杂环基、芳基或-NR170R171， 其中R170和R171各自独立地为氢、烷基、芳烷基、芳基、杂芳基、杂芳烷基 或杂环基，或R170和R171一起形成亚烷基、氮杂亚烷基、氧杂亚烷基或硫杂 亚烷基；
R151、R152和R153各自独立地为氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂 芳烷基、杂环基或杂环基烷基；
R160为氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基、杂环基或杂环基 烷基；且
R163为烷氧基、芳烷氧基、烷基、杂芳基、杂环基、芳基或-NR170R171。
在一些实施方案中，Ar1为芳基、杂芳基或环烷基，且未被取代或被烷 基、烯基、炔基、杂芳基、卤素、拟卤素、二烷基氨基、芳氧基、芳烷氧基、 卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、环烷基或COOR取代，其中R为氢或烷 基；
R7为氢或NRR，其中R为氢或烷基；
R8和R9各自独立地选自下述(i)和(ii)：
(i)R8和R9与和它们相连的原子一起形成稠合的苯基环，该环未被取 代或被卤素、拟卤素、烷基、烷氧基、环烷基、稠合的环烷基、稠合的杂环 基、稠合的杂芳基或稠合的芳基取代，这些取代基未被取代或被卤素、拟卤 素、烷基、烷氧基、芳基、环烷基、杂环基、稠合的芳基、稠合的杂环基、 和稠合的环烷基取代；和
(ii)R8为CN或COOR200，其中R200为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、 杂环基、芳基或杂芳基；且R9为氢、烷基或烷基硫基；且
R10为氢；
其中Ar1、R7、R8、R9和R10各自独立地未被取代或被一个或多个取代 基取代，在一个实施方案中被1个、2个或3个取代基取代，所述取代基各 自独立地选自Q1。
在一些实施方案中，Ar1为苯基、萘基、吡啶基、呋喃基或噻吩基，且 未被取代或被烷基、烯基、卤素、拟卤素、二烷基氨基、芳氧基、卤代烷基、 烷氧基、芳氧基、环烷基、杂环基、稠合的杂环基、芳基、稠合的芳基、杂 芳基、稠合的杂芳基或COOR取代，其中R为氢或烷基。
在一些实施方案中，Ar1被甲基、氟、溴、氯、碘、二甲基氨基、苯氧 基、三氟甲基或甲氧基羰基取代。
在一些实施方案中，Ar1为苯基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-呋喃基、3- 呋喃基、5-氯-2-噻吩基、5-溴-2-噻吩基、3-甲基-2-噻吩基、5-甲基-2-噻吩基、 5-乙基-2-噻吩基、2-甲基苯基、3-甲基苯基、4-氟-3-溴苯基、2-氟苯基、3，4- 二氟苯基、2-氯苯基、3-氯苯基、3，4-二氯苯基、3，4，5，-甲氧基苯基、2，4-甲 氧基苯基、2-氟-5-溴苯基、4-二甲基氨基苯基、3-三氟甲基、3-溴苯基、2- 三氟甲基-4-氟苯基、3-三氟甲基-4-氟苯基、2-氟-3-氯苯基、3-溴-4-氟苯基、 全氟苯基、3-吡啶基、4-吡啶基、4-溴苯基、4-氯苯基、3-苯氧基苯基、2，4- 二氯苯基、2，3-二氟苯基、2-氯苯基、2-氟-6-氯苯基、1-萘基、4-三氟甲基苯 基、2-三氟甲基苯基、4-三氟甲氧基苯基或4-甲氧基羰基苯基。
在一些实施方案中，R7为氢或二烷基氨基，或为氢或二乙基氨基。
在一些实施方案中，R8和R9各自独立地选自下述(i)和(ii)：
(i)R8和R9与和它们相连的原子一起形成稠合的苯基环，该环未被取 代或被甲基、氯、甲氧基、环戊基、稠合的环戊基或其它稠合的苯基环取代， 这些取代基未被取代或被溴取代；和
(ii)R8为CN或COOR200，其中R200为甲基、苄基、乙基、4-甲氧基苄 基或2-苯基乙基；且R9为甲基、甲基硫基或苯基氨基羰基甲基硫基。
在多个实施方案中，所述化合物为式IIb-IIp中的一个表示的化合物：


式IIb-IIp中，变量具有本文上述式II和IIa的值，其中选择X*和Y*使 得一条虚线(---)为单键且另一条为双键。在多个式Ib表示的实施方案中， R8’和R9’独立地选自氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳鎓、环烷 基、杂环基、C(A)R110、卤素、拟卤素、OR111、S(D)aR112、NR115R116或 N+R115R116R117；在一些实施方案中，R8’为CN或COOR200，其中R200为氢、 烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；且R9’为氢、烷基或 烷基硫基；且在一些实施方案中，R8’为CN或COOR200，其中R200为甲基、 苄基、乙基、4-甲氧基苄基或2-苯基乙基；且R9’为甲基、甲基硫基或苯基 氨基羰基甲基硫基。在多个式IIh-IIp的实施方案中，每个Q1独立地选自卤 素、烷基、烷氧基、硝基、CN、N3、芳基、芳氧基、芳基烷基氧基、炔基、 氨基、烷基氨基、杂环基、杂芳基、被取代的羧基(如CO2-烷基、CO2-苄基)、 卤代烷基和卤代烷氧基，或在相同苯基或相邻的稠合的苯基环上的两个相邻 Q1一起形成与苯基或相邻的稠合的苯基环稠合的环烷基或杂环基环。式 IIh-IIp中，从Q1发出的键表示每个Q1可任选键合到通过该键交叉的任何环 上。
在一些实施方案中，所述化合物为式IIq、IIr和IIs中的一个表示的化 合物：

式IIq、IIr和IIs中，Ar1、R7和R10可以具有本文所述的值；且每个q 独立地为0、1或2；
n为0、1或2；
R′1、R′2、R′3、R′4和每个R18独立地选自氢、烷基、烯基、炔基、芳 基、杂芳基、杂芳鎓、环烷基、杂环基、C(A)R110、卤素、拟卤素、OR111、 S(D)aR112、NR115R116或N+R115R116R117，其中对于A、R110、R111、D、a、R112、 R115、R116和R117的值如本文上述选择。
在一些实施方案中，所述化合物选自表II的化合物。在某些实施方案 中，所述化合物选自表II中的化合物II.1-II.95；在一些实施方案中，所述化 合物选自表II中的化合物II.1-II.69。在一些实施方案中，所述化合物选自表 II中的化合物II.1-II.3和II.70-II.95。在一些实施方案中，所述化合物选自表 II中的化合物II.4-II.69。
C.化合物的制备
在本文提供的组合物和方法中使用的化合物可以从市售获得(如Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI)，可以通过本领域技术人员已知的方法制备， 或可以通过本文所示的方法制备。使用适合的起始物料，通过对这些方法的 常规改变，本领域技术人员将能够制备本文所用的所有化合物。
本文提供的一些化合物可以通过下述合成途径制备。简而言之，使用相 应的腈将芳基胺或杂芳基胺转化为1。化合物1也可以以其它方式合成，包 括从芳基卤化物或杂芳基卤化物使用相应的胍盐合成。用酰卤或酸酐处理化 合物1以制备相应的酰基化的化合物2，其可以通过与氨反应转化为相应的 酰胺3。通过反应试剂10和适合的碱(如吡啶或二甲基氨基吡啶)在二氯甲 烷中将化合物1转化为5元杂环化合物4。5元杂环化合物，如15f可以通 过芳基胺被化合物15a胍基化，然后分别通过与化合物15c和15e环化和酰 基化产生。通过反应试剂11或反应试剂12和适合的碱将化合物1转化为6 元杂环化合物5。通过反应试剂13和碱将化合物1转化为6元杂环化合物6。 通过反应试剂14与适合的碱和溶剂将化合物1转化为6元杂环化合物7。
通过反应试剂14与适合的碱和溶剂将芳基胺或杂芳基胺转化为化合物 8。化合物8可以进一步用氨处理以制备相应的亚胺，将其酰基化得到化合 物9。

本文提供的另一些化合物可以通过下述方案制备。简而言之，通过用乙 酸酐和碱处理将胺19酰基化。然后用适合的醛和路易斯或质子酸处理酰基 中间体产物以合成内酰胺20。内酰胺20的氮可以被保护且通过标准取代反 应将与羰基相邻的碳官能化。

本文提供的其它化合物可以通过下述方案合成。简而言之，醛21和乙 酸甲酯进行缩合反应以得到不饱和的酯，将该酯通过适合的碱水解得到相应 的酸。然后通过用质子酸处理将该酸直接转化为不饱和的羰基23。也可以通 过用亚硫酰氯处理将该酸转化为相应的酰氯22，然后用24该酰氯22进行 Friedel Crafts酰化得到不饱和的羰基23。

本发明提供的另一些化合物可以根据下述方案合成。简而言之，通过用 酰胺28和碱处理将肼24转化为胺25。用29酰化胺25得到26。通过用二 羰基化合物30处理将肼24转化为吡咯27。

本发明提供的另一些化合物可以根据下述方案1-5合成。简而言之，通 过与碱、乙酸酐反应环化化合物19，然后通过与醛的酸催化反应得到环化合 物20。在另一个实例中，在方案2中，相应于化合物19的胺可以使用碱偶 合试剂与酸或酰卤反应，然后用路易斯或质子酸环化。反应方案4表示使用 两种烯和路易斯酸如AlCl3的环化。方案6和7表示另一个碱偶合反应得到 环化的产物。方案3表示环氮上的脱保护反应。方案5表示环状酰胺向氨基 亚胺的转化。
方案1

方案2

方案3

方案4

方案5

D.配制药物组合物
本文提供的药物组合物含有治疗有效量的一种或多种本文提供的化合 物和药学可接受的载体，所述化合物用于治疗或改善以蛋白质运输受损为特 征的疾病和病症的一种或多种症状。适合给药本文提供的化合物的药物载体 包括任何本领域技术人员已知的适合用于特定给药方式的载体。
而且，配制化合物作为组合物中的单个药学活性成分或可以与其它活性 成分组合。
所述组合物含有一种或多种本文提供的化合物。在一个实施方案中，将 化合物配制为适合的药物制剂，如对于口服给药的溶液、混悬剂、片剂、分 散片剂、丸剂、胶囊、散剂、持续释放的制剂或酏剂，或对于胃肠外给药的 无菌溶液或混悬剂，以及透皮贴片制剂和干粉吸入剂。在一个实施方案中，使 用本领域已知的技术和方法将上述化合物配制为药物组合物(参见例如Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms，第4版，1985，126)。
在所述组合物中，有效浓度的一种或多种化合物或其药学可接受的衍生 物与适合的药学载体混合。如上所述的配制前，可以将化合物衍生为相应的 盐、酯、烯醇醚或酯、缩醛、缩酮、原酸酯、半缩醛、半缩酮、酸、碱、溶 剂合物、水合物或前药。组合物中的化合物的浓度对于给药后递送的治疗或 改善以蛋白质运输受损为特征的疾病或病症的一种或多种症状的量是有效 的。
在一个实施方案中，配制该组合物为单一剂量给药。为配制组合物，将 一定重量份的化合物以有效浓度溶解、混悬、分散或混合入所选的载体中， 使得缓解所治疗的病况或改善一种或多种症状。
活性化合物包括在药学可接受的载体中，所述活性化合物的量足以对治 疗的患者产生治疗有用的作用而没有不希望的副作用。治疗有效的浓度可以 通过在本文所述的系统中检测化合物而经验地确定(参见例如实施例1和2)， 然后推断用于人的剂量。
药物组合物中活性化合物的浓度将依赖于活性化合物的吸收、失活和排 泄速度，化合物的物理化学特点，剂量方案和给药量，以及本领域技术人员 已知的其它因素。例如，递送的量足以改善本文所述的以蛋白质运输受损为 特征的疾病和病症的一种或多种症状。
在一个实施方案中，治疗有效的剂量应该产生活性成分的血清浓度为约 0.1ng/ml至约50-100μg/ml。在另一个实施方案中，药物组合物应该提供的 剂量为约0.001mg至约2000mg化合物每千克体重每天。制备的药物剂量 单位形式为约0.01mg、0.1mg或1mg至约500mg、1000mg或2000mg， 且在一个实施方案中为约10mg至约500mg活性成分或主要成分的组合每 剂量单位形式。
给药活性成分可以一次进行或以间隔的时间多次小剂量给药。应该理解 治疗的精确剂量和持续时间依赖所要治疗的疾病，且使用已知的检测方法或 通过从体内或体外检测数据推测而经验地确定。应该注意浓度和剂量的值也 可以根据待减轻的病症的严重程度而改变。将进一步理解的是对于任何特定 的受试者，特定的给药方法应该根据个体需要和给药或指导给药组合物的人 的专业判断而随时间调整，且本文所述的浓度范围仅是示例性的且不是为了 限制要求保护的组合物的范围或应用。
在其中化合物呈现不足的溶解性的情况下，可以使用增溶化合物的方 法。这些方法是本领域技术人员已知的，且包括，但不限于，使用共溶剂， 如二甲亚砜(DMSO)；使用表面活性剂，如TWEEN；或溶于碳酸氢钠水 溶液中。在配制有效的药物组合物时，也可以使用化合物的衍生物，如化合 物的前药。
混合或加入化合物后，所得混合物可以为溶液、混悬液、乳液等。所得 混合物的形成依赖于许多因素，包括希望的给药方式和化合物在所选的载体 或溶媒中的溶解度。有效浓度足以改善要治疗的疾病、病症或病况的症状且 可以经验的确定。
对于向人和动物给药，以单位剂型提供药物组合物，如片剂、胶囊、丸 剂、散剂、颗粒剂、无菌胃肠外溶液或混悬剂，和口服溶液或混悬剂，和含 有适合量的化合物或其药学可接受的衍生物的油-水乳剂。在一个实施方案 中，以单位剂量形式或多剂量形式配制和给药药物治疗活性化合物及其衍生 物。如本领域是已知的，本文所用的单位剂量形式是指用于人和动物受试者 的物理离散的单位和被单个包装。每个单位剂量含有预定量的治疗活性化合 物(其足以产生所需的治疗效果)，以及所需的药物载体、溶媒或稀释剂。 单位剂量形式的实例包括安瓿和注射剂和单个包装的片剂或胶囊。单位剂量 形式可以以其部分或加倍给药。多剂量形式为多个包装在单个容器中的相同 单位剂量形式，以分离的单位剂量形式给药。多剂量形式的实例包括药水瓶、 药片或胶囊瓶、或品脱或加仑瓶。因此，多剂量形式为多个在包装中不分离 的单位剂量。
液体药物给药的组合物，可以例如，通过将上述定义的活性化合物，和 任选药物佐剂溶解、分散或混合到载体中，所述载体例如，水、盐水、葡萄 糖水溶液、甘油、乙二醇、乙醇等，由此形成溶液或混悬液。如果需要，待 给药的药物组合物也可以含有少量的无毒辅助物质，如润湿剂、乳化剂、助 溶剂、pH缓冲剂等，例如，乙酸盐、柠檬酸钠、环糊精衍生物、去水山梨 糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺乙酸钠、油酸三乙醇胺和其它这类试剂。
制备这些剂型的实际方法是抑制的，或对于本领域技术人员是明显的； 例如，参见Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company， Easton，Pa.，第15版，1975。
可以制备含有0.005％至100％活性成分和由无毒载体组成平衡成分的 剂型或组合物。制备这些组合物的方法对于本领域技术人员是已知的。关注 的组合物可含有0.001％-100％活性成分，在一个实施方案中为0.1-95％，在 另一个实施方案中为75-85％。
1.用于口服给药的组合物
口服药物剂型为固体、凝胶或液体。固体剂型为片剂、胶囊、颗粒剂和 整装散剂。口服片剂的类型包括压制片剂、咀嚼锭剂和包衣肠溶衣、糖衣或 膜衣的片剂。胶囊可以为硬或软明胶胶囊，而颗粒剂和散剂可以以非泡腾或 泡腾形式与其它本领域技术人员已知的成分混合提供。
a.用于口服给药的固体组合物
在某些实施方案中，所述制剂为固体剂型，在一个实施方案中，为胶囊 或片剂。片剂、丸剂、胶囊、含片等可以含有一种或多种下述成分或相似性 质的化合物：粘合剂；润滑剂；稀释剂；助流剂；崩解剂；着色剂；甜味剂； 香味剂；润湿剂；催吐包衣；和膜包衣。粘合剂的实例包括微晶纤维素、西 黄蓍胶、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶溶液、糖蜜、聚乙烯吡咯烷、聚维 酮、交联聚维酮、蔗糖和淀粉糊。润滑剂包括滑石粉、淀粉、硬脂酸镁或硬 脂酸钙、石松(lycopodium)和硬脂酸。稀释剂包括，例如，乳糖、蔗糖、淀 粉、高岭土、盐、甘露醇和磷酸氢钙。助流剂包括，但不限于，胶体二氧化 硅。崩解剂包括交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、海藻酸、玉米淀粉、 土豆淀粉、膨润土、甲基纤维素、琼脂和羧甲基纤维素。着色剂包括，例如， 任何批准上市的水溶性FD和C染料，其混合物；和水不溶性的混悬于水合 氧化铝的FD和C染料。甜味剂包括蔗糖、乳糖、甘露醇和人造甜味剂如糖 精和任何量的喷雾干燥的矫味剂。香味剂包括从植物(如水果)中提取的天 然香味剂和产生喜欢的感觉的化合物的合成混合物，如，但不限制于薄荷和 水杨酸甲酯。润湿剂包括丙二醇单硬脂酸酯、去水山梨糖醇单油酸酯、二甘 醇单硬脂酸酯和聚氧乙烯月桂醚。催吐包衣包括脂肪酸、脂肪、蜡、虫胶、 氨基化的虫胶和醋酸邻苯二甲酸纤维素。膜包衣包括羟乙基纤维素、羧甲基 纤维素钠、聚乙二醇4000和醋酸邻苯二甲酸纤维素。
化合物，或其药学可接受的衍生物可以在组合物中提供，该组合物保护 化合物不与胃的酸环境接触。例如，组合物可以配制在肠溶衣中，其在胃中 保持完整且在小肠中释放活性化合物。组合物也可以与抗酸剂或其它这类成 分组合配制。
当剂量单位形式为胶囊时，除上述物料外它可含有液体载体，如脂肪油。 而且，剂量单位形式可以含有多种其它改变剂量单位物理形式的物料，例如， 糖和其它肠溶试剂的包衣。化合物也可以作为酏剂、混悬剂、糖浆剂、薄片 (wafer)、喷洒剂、咀嚼胶等的成分给药。除活性化合物外，糖浆剂可含有 作为甜味剂的蔗糖和一些防腐剂、染料和着色剂、和矫味剂。
活性物质也可以与其它不损害所需作用的活性物质混合，或与补充所需 作用的物质混合，如抗酸剂、H2阻断剂、和利尿剂。活性成分为本文所述 的化合物或其药学可接受的衍生物。可以包括较高浓度，最多约98重量％ 的活性成分。
在所有实施方案中，片剂和胶囊制剂可以通过本领域技术人员已知的方 法包衣以改变或保持活性成分的溶出。因此，例如，它们可以用常规肠可消 化的包衣来包衣，如水杨酸苯酯、蜡和醋酸邻苯二甲酸纤维素。
b.用于口服的液体组合物
液体口服剂型包括水溶液、乳剂、混悬剂、从非泡腾颗粒重构的溶液和 /或混悬剂、和从泡腾颗粒重构的泡腾制剂。水溶液包括，例如，酏剂和糖浆 剂。乳剂为水包油或油包水。
酏剂是澄清的、加甜的含水酒精制剂。在酏剂中使用的药学可接受的载 体包括溶剂。糖浆剂为浓缩的糖(例如，蔗糖)水溶液，且可以含有防腐剂。 乳剂为二相体系，其中一种液体以小球形式分散到另一种液体。乳剂中使用 的药学可接受的载体为非水液体、乳化剂和防腐剂。混悬剂使用药学可接受 的助悬剂和防腐剂。待重构为液体口服剂型的非泡腾颗粒中使用的药学可接 受的物质包括稀释剂、甜味剂和润湿剂。待重构为液体口服剂型的泡腾颗粒 中使用的药学可接受的物质包括有机酸和二氧化碳源。在所有上述剂型中使 用着色剂和香味剂。
溶剂包括甘油、山梨糖醇、乙醇和糖浆。防腐剂的实例包括甘油、对羟 基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸、苯甲酸钠和酒精。在乳剂中使 用的非水液体的实例包括矿物油和棉子油。乳化剂的实例包括明胶、阿拉伯 胶、西黄蓍胶、膨润土和表面活性剂，如聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯。 助悬剂包括羧甲基纤维素钠、果胶、西黄蓍胶、硅酸镁铝(Veegum)和阿拉伯 胶。甜味剂包括蔗糖、糖浆剂、甘油和人造甜味剂，如糖精。润湿剂包括丙 二醇单硬脂酸酯、去水山梨糖醇单油酸酯、二甘醇单月桂酸酯和聚氧乙烯月 桂醚。有机酸包括柠檬酸和酒石酸。二氧化碳源包括碳酸氢钠和碳酸钠。着 色剂包括任何批准上市的水溶性FD和C染料及其混合物。香味剂包括从植 物(如水果)中提取的天然矫味剂，和产生好的味道感觉的化合物的合成混 合物。
对于固体剂型，在一个实施方案中，在例如碳酸丙烯(propylene carbonate)、植物油或甘油三酯中的溶液或混悬液包裹在明胶胶囊中。这些溶 液，及其制备和胶囊化公开于美国专利4,328,245；4,409,239；和4,410,545 中。对于液体剂型，为了对于给药方便测量，例如，在聚乙二醇中的溶液可 以用足量的药学可接受的液体载体(如水)稀释。
或者，液体或半固体口服制剂可以通过将活性化合物或盐溶解或分散到 植物油、乙二醇、甘油三酯、丙二醇酯(如碳酸丙烯)和其它这类载体中而制 备，并将这些溶液或混悬液包裹在硬或软明胶胶囊壳中。其它有用的制剂包 括美国专利RE28,819和4,358,603中所述的那些。简而言之，这些制剂包括， 但不限于，含有本文提供的化合物的那些制剂；二烷基化的单-或多-亚烷基 二醇，包括但不限制于，1，2-二甲氧基甲烷、二甘醇二甲醚、三甘醇二甲醚、 四甘醇二甲醚、聚乙二醇-350-二甲基醚、聚乙二醇-550-二甲基醚、聚乙二 醇-750-二甲基醚，其中350、550和750是指聚乙二醇近似的平均分子量； 和一种或多种抗氧化剂，如丁基化的羟基甲苯(BHT)、丁基化的羟基苯甲醚 (BHA)、没食子酸丙酯、维生素E、对苯二酚、羟基香豆素、乙醇胺、卵磷 脂、脑磷脂、抗坏血酸、苹果酸、山梨糖醇、磷酸、硫代二丙酸及其酯、和 二硫代氨基甲酸酯。
其它制剂包括但不限于，含醇水溶液包括药学可接受的缩醛。在这些制 剂中使用的醇为任何具有一个或多个羟基的药学可接受的与水混溶的溶剂， 包括但不限制于，丙二醇和乙醇。缩醛包括，但不限于，低级烷基醛的二(低 级烷基)缩醛，如乙醛缩二乙醇(acetaldehyde diethyl acetal)。
2.注射剂、溶液和乳剂
在一个实施方案中，本文也考虑胃肠外给药，其特征为注射，如皮下、 肌内或静脉内。注射剂可以常规形式制备，作为液体溶液或混悬剂，适合注 射前液体形式的溶液或混悬液的固体形式，或乳剂。注射剂、溶液和乳剂也 含有一种或多种赋形剂。适合的赋形剂为，例如，水、盐水、葡萄糖、甘油 或乙醇。而且，如果需要，待给药的药物组合物也可以含有少量无毒辅助物 质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、增溶剂和其它这类试剂，例 如，乙酸钠、脱水山梨醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺和环糊精。
本文也考虑了缓释或持续释放体系的植入使得维持一定的剂量水平(参 见，例如美国专利3,710,795)。简而言之，将本文提供的化合物分散到惰性 基质中，如聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸丁酯、增塑或未增塑的聚氯乙 烯、增塑的尼龙、增塑的聚对苯二甲酸乙二酯、天然橡胶、聚异戊二烯、聚 异丁烯、聚丁二烯、聚乙烯、亚乙基-乙酸乙烯共聚物、硅酮橡胶、聚二甲 基硅氧烷、硅酮碳酸酯共聚物、亲水聚合物如丙烯酸酯和甲基丙烯酸的水凝 胶、胶原、交联聚乙烯醇和交联的部分水解的聚醋酸乙烯酯，该基质被外层 聚合物膜包裹，所述聚合物膜如聚乙烯、聚丙烯、亚乙基/亚丙基共聚物、亚 乙基/丙烯酸乙酯共聚物、亚乙基/乙酸乙烯共聚物、硅酮橡胶、聚二甲基硅 氧烷、氯丁橡胶、氯化的聚乙烯、聚氯乙烯、氯乙烯与乙酸乙烯的共聚物、 偏二氯乙烯、亚乙基和亚丙基、离子聚合物聚对苯二酸乙烯酯、丁基橡胶表 氯醇橡胶、亚乙基/乙烯醇共聚物、亚乙基/乙酸乙烯/乙烯醇三聚物和亚乙基 /乙烯基氧基乙醇共聚物，该基质不溶于体液。化合物在控制释放速度的步骤 中通过外部聚合物膜发散。在这些胃肠外组合物中含有的活性化合物的百分 比极大地依赖于其特定的性质，以及化合物的活性和受试者的需要。
组合物的胃肠外给药包括静脉、皮下和肌内给药。胃肠外给药的制剂包 括准备用于注射的无菌溶液、准备在使用前与溶剂混合的无菌干燥的可溶物 质如冻干粉末(包括皮下片剂)、准备用于注射的无菌混悬剂、准备在使用 前与溶媒混合的无菌干燥不溶物质和无菌乳剂。溶液可以是水溶液或非水溶 液。
如果静脉给药，适合的载体包括生理盐水或磷酸盐缓冲的盐水(PBS)、 和含有增稠剂和增溶剂的溶液，如葡萄糖、聚乙二醇、和聚丙二醇及其混合 物。
胃肠外制剂中使用的药学可接受的载体包括水性溶媒、非水溶媒、抗菌 剂、等渗试剂、缓冲剂、抗氧化剂、局麻剂、助悬和分散剂、乳化剂、遮蔽 或螯合剂和其它药学可接受的物质。
水性溶媒的实例包括氯化钠注射液、林格注射液、等渗葡萄糖注射液、 无菌水注射液、葡萄糖和乳酸盐林格注射液。非水胃肠外溶媒包括植物源的 不挥发油、棉子油、玉米油、麻油和花生油。抑制细菌和真菌浓缩物中的抗 菌剂必须加入到包装在多剂量容器中的胃肠外制剂中，所述抗菌剂包括苯酚 或甲酚、汞剂、苄醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、硫 柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵。等渗试剂包括氯化钠和葡萄糖。缓冲剂包括磷 酸盐和柠檬酸盐。抗氧化剂包括亚硫酸氢钠(sodium bisulfate)。局麻剂包括 普鲁卡因盐酸盐。助悬和分散剂包括羧甲基纤维素钠、羟丙甲纤维素和聚乙 烯吡咯烷酮。乳化剂包括聚山梨酯80(TWEEN80)。金属离子的掩蔽或螯 合剂包括EDTA。对于水可混溶的溶媒，药物载体也包括乙醇、聚乙二醇和 丙二醇；和用于调节pH的氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。
调节药物活性化合物的浓度使得注射剂提供有效量以提供所需的药理 学作用。如在本领域是已知的，使用的剂量依赖于患者或动物的年龄、体重 和病况。
单位剂量的胃肠外制剂包装在安瓿、小瓶或有针的注射器中。如在本领 域是已知的，所有胃肠外给药的制剂必须是无菌的。
示例性地，含有活性化合物的无菌水溶液的静脉或动脉内输注是有效的 给药方式。另一个实施方案是含有视需要的可注射活性物质的无菌水性或油 性溶液或混悬剂以产生所需的药理学作用。
将注射剂设计为局部或全身给药。在一个实施方案中，配制治疗有效剂 量使所含浓度为至少约0.1％w/w至约90％w/w或更多，在一些实施方案中 向被治疗的组织给药多于1％w/w的活性化合物。
化合物可以以微粒化或其它适合的形式混悬，或可以衍生化以产生更易 溶的活性产物或产生前药。所得混合物的形式依赖于许多因素，包括打算的 给药方式和化合物在所选载体或溶媒中的溶解度。有效浓度足以改善病况的 症状，且可以被经验地确定。
3.冻干粉末
本文也关注冻干粉末，其可以重构作为溶液、乳剂和其它混合物给药。 它们也可以重构和配制为固体或凝胶。
通过将本文提供的化合物或其药学可接受的衍生物溶解在适合的溶剂 中而制备无菌冻干粉末。所述溶剂可以含有提高粉末或从粉末制备的重构溶 液的稳定性的赋形剂或其它药理学成分。可以使用的赋形剂包括，但不限于， 葡萄糖、山梨糖醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其它 适合的试剂。所述溶剂也可以含有缓冲剂，如柠檬酸盐、磷酸钠或磷酸钾或 其它本领域技术人员已知的缓冲剂，在一个实施方案中，约为中性pH。随 后，无菌过滤溶液，然后在本领域技术人员已知的标准条件下冻干得到所需 制剂。在一个实施方案中，将所得溶液均分到用于冻干的小瓶中。每个小瓶 将含有单一剂量或多剂量的化合物。冻干粉末可以在适合的条件下储存，如 在约4℃至室温。
用于注射的冻干粉末与水的重构提供了用于胃肠外给药的制剂。为了重 构，将冻干粉末加入到无菌水或其它适合的载体中。精确的量依赖于所选的 化合物。该量可以被经验地确定。
4.局部给药
制备局部混合物，如对于局部和全身给药所述。所得混合物可以是溶液、 混悬剂、乳剂等，且可以配制为乳膏、凝胶、软膏、乳剂、溶液、酏剂、洗 剂、混悬剂、酊剂、糊剂、泡沫剂、气雾剂、冲洗剂、喷雾剂、栓剂、绷带、 皮肤贴片或任何适合局部给药的制剂。
化合物或其药学可接受的衍生物可以配制为用于局部应用的气雾剂，如 通过吸入(参见例如美国专利4,044,126、4,414,209和4,364,923，它们描述了 用于递送甾体的气雾剂，用于治疗炎症疾病，尤其是哮喘)。这些用于向呼 吸道给药的制剂可以为气雾剂或用于喷雾的溶液，或用于吸入的微细粉末， 单独或与惰性载体(如乳糖)组合。在这种情况下，在一个实施方案中，该 制剂的颗粒将具有小于50微米的直径，在一个实施方案中小于10微米。
化合物可以配制用于部分或局部使用，如对于皮肤和粘膜的局部使用， 如用于眼，以凝胶、乳膏和洗剂的形式，且用于施用到眼或用于脑池内或脊 柱内施用。局部给药被考虑用于透皮递送且也用于向眼或粘膜给药，或用于 吸入治疗。可以单独给药活性化合物的鼻部溶液或与其它药学可接受的赋形 剂组合给药。
这些溶液，尤其是打算眼用的溶液，可以与适合的盐配制为0.01％-10％ 等渗溶液，pH约为5-7。
5.对于其它给药途径的组合物
本文也考虑了其它给药途径，如包括离子电渗和电泳设备的透皮贴片， 和直肠给药。
包括离子电渗和电泳设备的透皮贴片是本领域技术人员已知的。例如， 这些贴片描述于美国专利6,267,983、6,261,595、6,256,533、6,167,301、 6,024,975、6,010715、5,985,317、5,983,134、5,948,433和5,860,957中。
例如，用于直肠给药的药物剂型为直肠栓剂、用于全身作用的胶囊和片 剂。本文所用的直肠栓剂是指插入到直肠的固体，该固体在体温下融化或软 化释放一种或多种药理或治疗活性成分。在直肠栓剂中使用的药学可接受的 物质为基质或溶媒和提高熔点的试剂。基质的实例包括可可脂(可可豆油)、 甘油-明胶、碳蜡(聚乙二醇)和适合的脂肪酸单-、二和三甘油酯的混合物。 可以使用多种基质的组合。提高栓剂熔点的试剂包括鲸蜡和蜡。直肠栓剂可 以通过压制方法或模制制备。在一个实施方案中，直肠栓剂的重量为约2至 3mg。
使用相同的药学可接受的物质，且通过与对于口服给药的制剂相同的方 法制备用于直肠给药的片剂和胶囊。
6.靶向制剂
本文提供的化合物或其药学可接受的衍生物也可以配制为靶向于特定 在治疗的受试者的组织、受体或被身体其它区域。许多靶向方法是本领域技 术人员公知的。本文考虑所有这些靶向方法用于即用组合物(instant compositions)中。靶向方法的非限制性实例参见，例如美国专利6,316,652、 6,274,552、6,271,359、6,253,872、6,139,865、6,131,570、6,120,751、6,071,495、 6,060,082、6,048,736、6,039,975、6,004,534、5,985,307、5,972,366、5,900,252、 5,840,674、5,759,542和5,709,874。
在一个实施方案中，脂质体混悬剂，包括靶向组织的脂质体，如靶向肿 瘤的脂质体，也可以适合作为药学可接受的载体。这些可以根据本领域技术 人员已知的方法制备。例如，脂质体制剂可以如美国专利4,522,811中所述 的方法制备。简而言之，脂质体，如多层小囊泡(MLV′s)可以通过干燥卵磷 脂酰基胆碱和脑磷脂酰基丝氨酸(7∶3摩尔比)到烧瓶内侧上而成形。加入本文 提供的化合物在没有二价阳离子的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的溶液，且振荡 烧瓶直到脂质膜分散。洗涤所得小囊泡以移除未包裹的化合物，通过离心沉 淀，然后再悬于PBS中。
7.制造成品
化合物或药学可接受的衍生物可以包装成制造成品，其含有包装物质、 在包装物质中的本文提供的化合物或药学可接受的衍生物(其有效治疗或改 善以蛋白质运输受损为特征的疾病或病症的一种或多种症状)、和表示该化 合物或组合物或其药学可接受的衍生物的标记，该制造成品用于治疗或改善 以蛋白质运输受损为特征的疾病或病症的一种或多种症状。
本文提供的制造成品含有包装物质。用于包装药物产品的包装物质是本 领域技术人员公知的。参见，例如美国专利5,323,907、5,052,558和5,033,252。 药物包装物质的实例包括，但不限于，泡包装、瓶、管、吸入器、泵、袋、 小瓶、容器、注射器、瓶和任何适合所选的制剂和打算的给药和治疗方式的 包装物质。本文提供的化合物和组合物的大量制剂被考虑作为任何涉及受损 的蛋白质运输的疾病或病症的多种治疗，作为这些症状或原因的调节剂或作 用剂。
8.持续释放制剂
本文也提供了用于以高循环水平(10-9至10-4M)向所需靶点(即，脑或全 身器官)递送化合物的持续释放的制剂。在治疗以蛋白质运输受损为特征的 疾病的一些实施方案中，化合物的循环水平维持在高达10-7M。
要理解的是，在一定时间内维持化合物水平是需要的，且该水平可以由 本领域技术人员简单地确定。在一个实施方案中，有效给药持续释放的制剂， 使得在48至96小时血清中治疗化合物的一定水平维持在10-8至10-6M。
该持续和/或定时(timed)释放的制剂可以通过本领域技术人员公知的递 送设备的持续释放工具制备，如描述于美国专利3,845,770；3,916,899； 3,536,809；3,598,123；4,008,719；4,710,384；5,674,533；5,059,595；5,591,767； 5,120,548；5,073,543；5,639,476；5,354,556和5,733,566中的设备，这些公 开内容在此引入作为参考。这些药物组合物可以用于提供缓慢或持续释放一 种或多种活性化合物，例如，使用羟丙甲纤维素、其它聚合物基质、凝胶、 渗透膜、渗透体系、多层包衣、微粒、脂质体、微球等。本领域技术人员已 知的适合的持续释放制剂(包括本文所述的那些)可以根据本文提供的药物组 合物的使用方便地选择。因此，本文考虑了适合口服给药的单一单位剂型， 如但不限制于，片剂、胶囊、软胶囊、小胶囊、粉末等，它们适合用于持续 释放。
在一个实施方案中，持续释放的制剂含有活性化合物如，但不限制于微 晶纤维素、麦芽糊精、乙基纤维素和硬脂酸镁。如上所述，本文考虑了所有 已知的与所公开的化合物的性质相容的胶囊化方法。持续释放的制剂通过包 衣颗粒胶囊化，或通过本文提供的药物组合物颗粒与可变厚度的缓慢溶解的 聚合物胶囊化，或通过微囊化。在一个实施方案中，用可变厚度(如约1微 米至200微米)的包衣材料胶囊化持续释放的制剂，使得药物组合物在向哺 乳动物给药约48小时至约72小时后溶解。在另一个实施方案中，包衣材料 为食品添加剂。
在另一个实施方案中，持续释放的制剂为基质溶解设备，其通过将药物 与缓慢溶解的聚合物载体压制成片而制备。在一个实施方案中，包衣的颗粒 具有的粒径为约0.1至约300微米，如美国专利4,710,384和5,354,556所述， 将其全部引入作为参考。每个颗粒为微基质形式，其中活性成分均匀地分布 在聚合物中。
本文公开了持续释放制剂，如美国专利4,710,384所述，将其全部引入 作为参考，该制剂在包衣中具有相对高百分比的增塑剂，使得提供足够的柔 性在压制期间基本上防止断裂。增塑剂的特定的量根据包衣的性质和所用的 特定增塑剂改变。该量可以通过检测形成的片剂的释放特性经验性的方便的 确定。如果药物释放太快，那么使用更多的增塑剂。释放特性也依赖于包衣 的厚度。当使用基本量的增塑剂时，包衣的持续释放能力降低。因此，包衣 的厚度可以稍微增加以增加增塑剂的量。通常，在该实施方案中的增塑剂将 以包衣中持续释放物质的约15至30％的量存在，在一个实施方案中为20 至25％，且包衣的量将为活性物质重量的10至25％，且在另一个实施方案 中，为活性物质重量的15至20％。可以向包衣中掺入任何常规药学可接受 的增塑剂。
本文提供的化合物可以配制为持续和/或定时释放的制剂。所有持续释 放的药物产品具有的通常的目的是与非持续释放的类似物相比提高药物疗 效。理想地，在药物治疗中最佳设计的持续释放制剂的用途的特征在于使用 最少的药物治愈或控制疾病。持续释放的制剂的优点可以包括：1)组合物 的延长的活性，2)降低剂量频率，和3)增加患者顺应性。而且，持续释放 制剂可以用于影响发作时间或其它特点，如组合物的血液浓度，且因此能够 影响副作用的发生。
设计本文提供的持续释放的制剂以初始提供一定量的治疗组合物，其迅 速产生所需的治疗效果，且逐渐和持续释放其它量的组合物以在延长的时间 内维持产生治疗效果的量。为了在身体中保持一定水平，治疗组合物必须从 剂型中以一定速率释放，新释放的组合物将代替被代谢和从身体排泄的组合 物。
活性成分的持续释放可以被多种诱导因素影响，例如pH、温度、酶、 水或其它生理条件或化合物。
可以适合的配制口服给药的制剂以得到控释的活性化合物。在一个实施 方案中，将化合物配制为分开的微粒的控释粉末，其可以以液体形式方便地 配制。持续释放的粉末包含含有活性成分和任选含至少一种无毒聚合物的赋 形剂的颗粒。
粉末可以分散或混悬于液体溶媒中，且在有用的时间内将维持其释放特 点。这些分散剂或混悬剂同时具有化学稳定性和溶解速度稳定性。该粉末可 以含有含聚合物的赋形剂，其可以是可溶的、不溶的、可渗透的、不可渗透 的或生物可降解的。所述聚合物可以是聚合物或共聚物。所述聚合物可以为 天然或合成的聚合物。天然的聚合物包括多肽(如玉蜀黍蛋白)、多糖(如纤维 素)、和海藻酸。示例性的合成的聚合物包括，但不限制于，美国专利 5,354,556,第3栏，第33-45行所述的那些，其全部在此引入作为参考。尤 其适合的组合物包括，但不限制于，美国专利5,354,556，第3栏第46行至 第4栏第8行所述的那些，其全部在此引入作为参考。
可以配制本文提供的持续释放的组合物用于胃肠外给药，例如通过肌内 注射或皮下组织和各种体腔和透皮设备植入。在一个实施方案中，将肌内注 射剂配制为水性或油性混悬剂。在水性混悬剂，持续释放作用是部分由于当 复合后活性化合物的溶解度降低或溶出速度降低。对于油性混悬剂和溶液使 用相似的方法，其中通过将活性化合物分离出油而进入到周围水性介质中而 确定活性化合物的释放速度。只有油性可溶且具有所需的分配特性的活性化 合物是适合的。可以用于肌内注射的油包括，但不限于，麻油、橄榄油、花 生油、玉米油、杏仁油、大豆油、棉子油和蓖麻油。
在一定时间(几天至几年)产生持续释放的高度发展形式的药物递送将 带有药物的聚合物设备植入到皮下或多种体腔中。在植入中使用的聚合物材 料(其必须是生物相容的和无毒的)包括，但不限于，水凝胶、硅酮、聚乙 烯、亚乙基-乙酸乙烯共聚物、或生物可降解的聚合物。
E.化合物活性评价
可在本文描述的实验中测定作为蛋白质运输调节剂的化合物的活性，所 述实验评价化合物拯救蛋白质运输受损的能力。例如，可使用酵母突变细胞 株ypt1ts，确定从突变YPT1等位基因的致死表型拯救细胞的化合物(见，例 如，Examples和Schmitt等人(1988)Cell 53：635-47)。可测量活性，例如，在 全酵母细胞实验中使用384孔筛选方法和光密度测量。
表III详细列出了酵母基因YPT1和SAR1的人同源基因。如本文所述， 表现出蛋白质运输所需蛋白(例如表III中的蛋白质)表达或活性减少的细 胞(例如哺乳动物细胞或酵母细胞)可用于筛选候选药物，由于所述试剂具 有从蛋白质运输缺陷拯救细胞的能力。
表III：酵母基因YPT1和SAR1的人类似物
  酵母基因名   人基因名   DNA编号   (人基因)   蛋白质编号   (人基因)   YPT1   Rab1a   NM_004161   NP_004152.1
  酵母基因名   人基因名   DNA编号   (人基因)   蛋白质编号   (人基因)   Rab1b   NM_030981   NP_112243.1   Rab8b   NM_016530   NP_057614.1   Rab8a   NM_005370   NP_005361.2   Rab10   NM_016131   NP_057215.2   Rab13   NM_002870   NP_002861.1   Rab35   NM_006861   NP_006852.1   Rab11b   NM_004218   NP_004209.1   Rab30   NM_014488   NP_055303.2   Rab11a   NM_004663   NP_004654.1   Rab3a   NM_002866   NP_002857.1   Rab3c   NM_138453   NP_612462.1   Rab3d   NM_004283   NP_004274.1   Rab3b   NM_002867   NP_002858.2   Rab2   NM_002865   NP_002856.1   Rab43   NM_198490   NP_940892.1   Rab4a   NM_004578   NP_004569.2   Rab2b   NM_032846   NP_116235.2   Rab4b   NM_016154   NP_057238.2   Rab25   NM_020387   NP_065120.1   Rab14   NM_016322   NP_057406.2   Rab37   NM_001006638   NP_001006639.1   Rab18   NM_021252   NP_067075.1   Rab5b   NM_002868   NP_002859.1   Rab33a   NM_004794   NP_004785.1   Rab26   NM_014353   NP_055168.2   Rab5a   NM_004162   NP_004153.2   Rab19b   NM_001008749   NP_001008749.1   Rab5c   NM_201434   NP_958842.1
  酵母基因名   人基因名   DNA编号   (人基因)   蛋白质编号   (人基因)   Rab33b   NM_031296   NP_112586.1   Rab39b   NM_171998   NP_741995.1   Rab39   NM_017516   NP_059986.1   Rab31   NM_006868   NP_006859.2   Rab15   NM_198686   NP_941959.1   Rab40c   NM_021168   NP_066991.2   Rab27b   NM_004163   NP_004154.2   Rab22a   NM_020673   NP_065724.1   Rab6b   NM_016577   NP_057661.2   Rab40b   NM_006822   NP_006813.1   Rasef   NM_152573   NP_689786.2   Rab21   NM_014999   NP_055814.1   Rab27a   NM_183236   NP_899059.1   Loc286526   NM_001031834   NP_001027004.1   Rab40a   NM_080879   NP_543155.2   Rab6a   NM_198896   NP_942599.1   Rab17   NM_022449   NP_071894.1   Rab6c   NM_032144   NP_115520.1   Rab7   NM_004637   NP_004628.4   Rab9a   NM_004251   NP_004242.1   Rab711   NM_003929   NP_003920.1   Rab9b   NM_016370   NP_057454.1   Rab34   NM_031934   NP_114140.2   Rab7b   NM_177403   NP_796377.2   Rab41   NM_001032726   NP_001027898.1   Rab23   NM_183227   NP_899050.1   Rab32   NM_006834   NP_006825.1   Rab38   NM_022337   NP_071732
  酵母基因名   人基因名   DNA编号   (人基因)   蛋白质编号   (人基因)   Rab36   NM_004914   NP_004905   Rab28   NM_001017979   NP_001017979   Rab20   NM_017817   NP_060287   Rab12   NM_001025300   NP_001020471   SAR1   Sar1a   NM_020150   NP_064535   Sar1b   NM_001033503   NP_001028675   SEC23   Sec23a   NM_006364.2   NP_006355.2   Sec23b   NM_006363.4   NP_006354
此外，化合物的有效性可在上述测试方式之前(首先)、同时或其后， 通过监测，例如(i)调节(例如改善)运输缺陷蛋白的稳定性，(ii)调节(例 如改善)运输缺陷蛋白的适当的、生理的运输，(iii)调节(例如恢复)运输 缺陷蛋白的一种或多种功能进行评价。例如，在一些情况下，蛋白质(例如 蛋白突变，例如ΔF508CFTR)过早降解。因此，所述化合物调节蛋白质运 输的有效性可通过在化合物存在时对比无化合物时监测蛋白质的稳定性来 确定。例如，表达运输缺陷蛋白的细胞(例如内源性表达或表达外源性转基 因编码运输缺陷蛋白，例如ΔF508CFTR)可在化合物存在或无化合物时培 养至少1小时(例如，至少2小时、至少4小时、至少6小时、至少8小时， 至少12小时、至少16小时、至少24小时、至少36小时、或至少48小时)。 细胞裂解物可由不同细胞群制备，混悬在Laemmli缓冲液中(有或无还原剂) 并进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。使用特异性识别 运输缺陷蛋白(例如CFTR)的抗体，通过蛋白质印迹或点印迹技术测定在 化合物存在或无化合物时蛋白质的量。在化合物存在时对比无化合物时运输 缺陷蛋白量的增加说明化合物调节(例如稳定)运输缺陷蛋白(Vij等人(2006) J.Bio1.Chem.281(25)：17369-17378)。当蛋白质的修饰状态(例如糖基化或磷 酰化)说明稳定性增加时，蛋白质修饰状态的改变也可用于确定是否化合物 稳定了运输缺陷蛋白。例如，糖基化的CFTR(例如，ΔF508CFTR)的量可 在化合物存在或无化合物时评价。蛋白质的糖基化形式的增加表明化合物稳 足CFTR(例如，ΔF508CFTR)。
可以理解的是这种实验的常规改变可用于监测任何运输缺陷蛋白。此 外，也可在化合物存在或无化合物时监测蛋白质的稳定状态水平(例如，蛋 白质转换或降解率)(例如，见Van Goor等人(2006)Am.J.Physiol.Lung.Cell Mol.Physiol.290：L 1117-L 1130)。
确定运输缺陷蛋白调节的另一种方法是原位染色方法(in situ staining)。 例如，当蛋白质(例如，ΔF508CFTR或G601S-hERG)在到达细胞表面前 过早降解时，可以蛋白质的细胞表面表达量的变化(例如增加)确定化合物 调节运输缺陷蛋白的有效性。因此，在化合物存在时在细胞表面的蛋白表达 对比无化合物时表面表达量的增加说明化合物调节(例如稳定)运输缺陷蛋 白。免疫染色方法是本领域技术人员众所周知的，并且包括其中细胞仍存活 (例如，肝细胞例如哺乳动物细胞的共聚焦显微镜观察)或固定细胞的染色 (例如，免疫组织化学)的实施方案。细胞可附在固体支持物上(例如，组 织培养皿或多聚赖氨酸涂被的玻璃片)或可加至溶液中(例如用于荧光辅助 细胞分选(FACS)分析)。对细胞使用(例如，给药、运输、接触)运输缺陷 蛋白特异性的一抗(primary antibody)。一抗本身可用可检测的标记进行标记 (例如，不同颜色的荧光团(例如，罗丹明、德克萨斯红、FITC、绿色荧光 蛋白、Cy3、Cy5))。或者，第二种试剂，例如二抗，可被可检测地标记而 一抗未标记。一抗也可与结合对的第一个成员(例如，生物素或链霉亲合素) 结合，并且结合对的第二个成员被可检测地标记。合适的显微镜(例如共聚 焦显微镜)与合适的滤光片的使用可确定在指定细胞中标记的抗体的位置。 来自细胞表面的可检测标记信号的增加表明更多的蛋白在细胞表面表达。当 然，可以理解这种方法可用于定位于细胞的其它隔室(compartment)(例如， 细胞器例如核、溶酶体、内质网、高尔基体或线粒体)的运输缺陷蛋白。使 用另一种抗体或染料确定另一种已知定位于感兴趣的指定隔室的对照蛋白 是有用的。通常，第二种蛋白使用与感兴趣的运输缺陷蛋白不同的可检测标 记进行标记。之后通过前面所述的方法确定两种标记的位置。当两种蛋白的 位置分别确定时(即，通过抗体结合确定细胞中它们分别的可检测标记的位 置)，如果发现它们占据相同位置，称两种蛋白为共定位(co-localize)，并 因此运输缺陷蛋白定位在合适的细胞位置(即，当两种蛋白在无化合物时共 定位，但在化合物存在时没有共定位，这说明化合物抑制两种蛋白之间的相 互作用)。这种方法的实例描述在例如Morello等人(2000)J.Clin.Invest.105 (7)：887-895和Liu等人(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100(26)：15824-15829 中。任选的，可使用例如多聚甲醛或甲醛固定细胞，并使用去污剂(例如 Triton-X100)透化细胞。
化合物调节运输缺陷蛋白的有效性也可通过监测运输缺陷蛋白活性的 增加评价。例如，ΔF508CFTR是PKA调节的氯通道，并因此可通过例如对 福斯高林(forskolin)响应的膜电位的增加或cAMP介导的氯外流诱导的增加 确定CFTR蛋白稳定性的增加(见，例如Vij等人(2006)J.Biol.Chem. 281(25)：17369-17378和Van Goor等人(2006)Am.J.Physiol.Lung.Cell Mol. Physiol.290：L1117-L1130)。α-半乳糖苷酶A，法布里病中的运输缺陷蛋白， 是代谢特定脂质的酶。因此，可通过评价在化合物存在时对比无化合物时α- 半乳糖苷酶的细胞活性确定化合物调节α-半乳糖苷酶A的有效性。化合物 存在时对比无化合物时活性的增加说明化合物调节(例如，稳定)α-半乳糖 苷酶A蛋白。监测细胞中α-半乳糖苷酶A活性的方法可见例如Ioannou等 人(1998)Biochem.J.332：789-797。监测除CFTR和α-半乳糖苷酶A外，为 以蛋白质运输受损为特征的各个疾病成因的运输缺陷蛋白在体外和体内的 酶活性的方法在本领域是已知的。
蛋白质运输(例如，内质网-介导的蛋白质运输)也可使用体外(无细 胞)方法检测和测定。因此，化合物调节例如运输缺陷蛋白或蛋白质运输的 各个步骤(例如COPII囊泡的形成或停靠(docking))的有效性可使用这种 体外方法确定。用于检测或测定内质网介导的蛋白质运输的合适的体外方法 描述在例如Rexach等人(1991)J Cell Biol.114(2)：219-229；Segev(1991) Science 252(5012)：1553-1556；Balch等人(1984)Cell 39(2 Pt 1)：405-416； Wattenberg(1991)J Electron Microsc Tech 17(2)：150-164；Beckers等人(1989)J. Cell Biol.108(4)：1245-1256；和Moreau等人(1991)J Biol.Chem 266(7)： 4322-4328中，其内容在本文完整引用作为参考。例如，感兴趣的蛋白从内 质网至高尔基体的转运可被检测或测定。首先，标记细胞内的受体蛋白，例 如使用35S-甲硫氨酸通过代谢标记蛋白，或通过表达细胞内蛋白的可检测标 记形式(包括感兴趣的蛋白和绿色荧光蛋白的融合蛋白)。可从包含标记蛋 白的细胞获得包含内质网的“供体”膜部分。可从不包含标记蛋白的细胞制备 包含高尔基体的“受体”膜部分。标记蛋白的转运通过翻译后修饰完成。报告 子蛋白通常是糖蛋白，其糖链在内质网至高尔基体的转运期间被修饰。混合 并与需要的辅助因子一起孵育受体和供体部分。通过标记蛋白翻译后修饰形 式的增加监测转运。用于检测翻译后修饰的标记蛋白的方法在本文中描述， 并包括蛋白质印迹、点印迹、凝集素结合和对糖苷酶的易感性。当可检测标 记是荧光或发光标记时，可使用荧光计或光度计。当可检测标记是放射性标 记时(见下)，可使用闪烁计数器、X-射线片或辐射仪。可以理解蛋白质不 需要可被检测标记。最初出现在供体部分(例如，特异在供体细胞群中表达 的蛋白质)，但不出现在受体部分的蛋白质可使用例如蛋白印迹技术辨别。
用于检测蛋白质运输(例如，内质网-介导的蛋白质运输)的体外方法 也可包括测定囊泡出芽、脱壳、束缚(tethering)或停靠或与高尔基体的融 合(见例如Rexach等人，supra，和Bonifacino等人(2004)Cell 116：153-166)。
为确定是否化合物调节蛋白质从内质网至高尔基体的体外转运(例如蛋 白质从内质网至高尔基体转运的任何步骤)，可使化合物与受体部分、供体 部分或两者在孵育之前或期间接触化合物。在制备膜部分之前，化合物可加 入至供体或受体细胞群。如本文所述(见，例如实施例)，抑制蛋白酶体的 化合物(例如，蛋白酶体表达或活性)也可通过本文所述的实验(例如yptlts 突变实验)进行筛选以确定是否化合物拯救内质网-介导的转运。检测和/或 测定蛋白酶体活性的体内和体外(基于细胞)的方法在本领域是已知的，并 在例如Chuhan等人(2006)Br.J.Cancer 95(8)：961-965；Rubin等人(1998) EMBO J.17(17)：4909-4919；Glickman等人(1999)Mol.Biol.Rep.26(1-2)： 21-8；和Grimes等人(2005)Int.J.Oncol.27(4)：1047-1052中描述。确定是否 候选化合物抑制蛋白酶体，例如蛋白酶体活性的体外方法可包括候选化合物 与离体的蛋白酶体复合物接触，并测定与候选化合物接触的离体的蛋白酶体 活性。与化合物接触的蛋白酶体的活性对比无化合物时蛋白酶体活性的降低 说明候选化合物抑制蛋白酶体的体外活性。确定是否候选化合物抑制蛋白酶 体的体内方法可包括，例如候选化合物与细胞接触，并测定细胞中蛋白酶体 的活性。例如，测定细胞中已知通过蛋白酶体降解的蛋白质的周转 (turnover)。与化合物接触的细胞中的蛋白酶体活性对比无化合物接触的细 胞中的蛋白酶体活性的下降说明候选化合物抑制蛋白酶体的体内活性。蛋白 酶体抑制剂的实例包括，例如MG132、MG15、LLnL、ALLnL、 bortezomib/PS-341/Velcade、NPI-0052、epoxomicin和乳胞素(lactacystin) (Myung等人(2001)Med.Res.Reviews 21(4)：245-273；Montagut等人(2006) Clin Transl Oncol.8(5)：313-317；和Chuhan等人(2006)Br.J.Cancer 95(8)：961-965)。
抑制转录(例如mRNA的合成)的化合物也可通过本文所述的实验进 行筛选以确定是否这些化合物拯救内质网-介导的转运。检测和/或测定 mRNA转录的体外和体内(基于细胞)的方法在本领域是已知的，并且包括， 例如通过RT-PCR、RNA印迹(northern blotting)、基因芯片分析和原位杂交 技术测定mRNA的量。确定是否候选化合物抑制转录的方法可包括，例如 候选化合物与细胞接触，并测定细胞中感兴趣基因的转录。与化合物接触的 细胞中基因转录的量对比无化合物接触的细胞中基因转录的量的下降说明 候选化合物抑制转录。转录抑制剂的实例包括，例如雷怕霉素(rapamycin)、 环孢霉素、阿霉素和放射菌素D。
抑制翻译(例如mRNA翻译为蛋白质)的化合物也可通过本文描述的 实验(例如ypt1ts突变实验)进行筛选以确定是否这些化合物拯救内质网-介 导的转运。检测和/或测定翻译的体外和体内(基于细胞)的方法在本领域是 已知的，并且包括，例如使用蛋白免疫印迹、点印迹和酶联免疫吸附测定 (ELISA)技术检测蛋白表达。确定是否候选化合物抑制翻译的方法可包括， 例如候选化合物与细胞接触，并测定与化合物接触的细胞中多肽的量。在与 化合物接触的细胞中多肽的量对比无化合物接触的细胞中多肽的量的下降 说明候选化合物抑制翻译。翻译抑制剂的实例包括，例如放线菌酮、阿霉素、 茴香霉素、放线菌酮、依米丁、三尖杉酯碱、氯霉素和嘌呤霉素(见，例如 Sah等人(2003)J.Biol.Chem.278(23)：20593-20602)。可以理解化合物可直接 或间接抑制翻译，例如抑制基因转录的化合物也可间接地导致翻译的下降。
抑制热休克蛋白(例如，抑制热休克蛋白活性)的化合物也可通过本文 描述的方法(例如ypt1ts突变实验)进行筛选以确定是否这些化合物拯救内 质网-介导的转运。热休克蛋包括，例如Hsp90、Hsp70、Hsp60、Hsp40和 Hsp27，并且在例如Lindquist等人(1988)22：631-677中描述。检测和/或测定 热休克蛋白的方法在本领域是已知的，并且包括检测或测定例如已知被热休 克蛋白调节的靶蛋白的稳定性或活性，所述靶蛋白例如pp60v-src激酶(见， 例如Xu等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(15)：7074-7078)。确定是否 候选化合物抑制热休克蛋白的方法包括，例如候选化合物与细胞接触，并测 定细胞中感兴趣蛋白的稳定性或活性。与化合物接触的细胞中蛋白质活性 (或量)对比无化合物接触细胞中蛋白质活性(或量)的下降说明候选化合 物抑制热休克蛋白。在暴露于某些类型的应激后，例如温度升高，热休克蛋 白也调节细胞存活力。因此，热休克蛋白的抑制也可确定为在用候选化合物 处理的细胞中对比未处理细胞中热休克蛋白诱导的细胞毒性的增加。可以理 解减少热休克蛋白或热休克蛋白mRNA表达的化合物也是热休克蛋白的抑 制剂。热休克蛋白的抑制剂的实例包括，例如新生霉素、anasamysin、格尔 德霉素、根赤壳菌素(radicicol)和荠菜素(shepherdins)(Cox等人(2003)Mol. Pharmacol.64(6)：1549-1556和Xiao等人(2006)Mini Rev.Med Chem. 6(10)：1137-1143)。
抑制鞘脂生物合成的化合物(例如，抑制磷脂酰肌醇合成酶的活性或表 达的化合物)也可通过本文所述的实验(例如ypt1ts突变实验)进行筛选以 确定是否这些化合物拯救内质网-介导的转运。鞘脂包括，例如神经酰胺 (ceremide)、鞘磷脂和鞘糖脂。检测和/或测定鞘脂生物合成(例如鞘脂的产 生或量)的方法在例如Andreani等人(2006)Anal Biochem.358(2)：239-46中 描述。确定是否候选化合物抑制鞘脂生物合成的方法包括，例如候选化合物 与细胞接触，并测定细胞中感兴趣鞘脂的量。与化合物接触的细胞中鞘脂的 量对比无化合物接触的细胞中鞘脂的量的下降可说明候选化合物抑制鞘脂 生物合成。也可在化合物存在时和无化合物时测定参与鞘脂生物合成的特异 的酶的活性。候选化合物存在时的酶活性对比无化合物时的酶活性的下降说 明化合物抑制酶。参与鞘脂代谢的酶包括，但不限制于磷脂酰肌醇合成该酶。
抑制糖基化作用的化合物(例如，抑制蛋白糖基化酶活性或表达的化合 物)也可通过本文描述的实验(例如，ypt1st突变实验)进行筛选以确定是 否这些化合物拯救内质网-介导的转运。糖基化酶的活性可被这些化合物抑 制，包括GlcNAc转移酶、葡萄糖苷酶I和II，和α-甘露糖苷酶I和II。检 测和/或测定蛋白糖基化作用的方法在本领域是已知的，并在例如Paulik等 人(1999)Archives of Biochem.Biophys.367(2)：265-273中描述。蛋白糖基化作 用的抑制剂包括，例如衣霉素、葡糖胺、和苦马豆素(swainsonine)、 deoxymannojirimycin、和栗精胺(casanospermine)(见，例如Mori等人(1992) EMBO J 11(7)：2583-93)。
适合的但不详尽的筛选抑制例如翻译、转录、糖基化作用、鞘脂生物合 成或蛋白酶体的化合物的方法的列表见下。
F.sec23ts和sar1ts突变表型的抑制
表2和3列出了本文确定的每种人基因的核苷酸和蛋白序列对应的 GenBankTM序列号。如下列部分所详述，这些核苷酸和蛋白序列可用于产生 调节基因表达或编码的基因产物的活性的化合物(包括但不限制于核酸、肽、 抗体)。本文描述的基因作为Sec23ts或Sar1ts突变表型(例如内质网-介导的 蛋白质运输的受损)的调节剂，在以后的部分中(例如关于筛选实验的部分) 指“靶基因”，并且编码的蛋白指“靶蛋白”。
表IV.Sec23和Sar1的过表达抑制子
  酵母基因名   人基因名   DNA序列号   (人基因)   蛋白质序列号   (人基因)   SEC12   Sec12   NM_013388   Q9HCU5   SED4   未知   SEC16   未知   HRD3   SEL1L   NM_005065   NP_005056   C20orf50   AL109657   CAI22078   IRE1   Ire1   NM_001433   NP_001424   STS1   未知   SEC24   Sec24A   AJ131244   CAA10334   Sec24B   NM_006323   NP_006314   Sec24C   NM_198597   NP_940999   Sec24D   NM_014822   NP_055637
表V.sec23ts的功能缺失抑制子
  酵母基因名   人基因名   DNA序列号   (人基因)   蛋白质序列号   (人基因)   Bst1   PGAP1   NM_024989   NP_079265   Emp24   TMED2   NM_006815   NP_006806   TMED10   NM_006827   NP_006818
  酵母基因名   人基因名   DNA序列号   (人基因)   蛋白质序列号   (人基因)   TMED7   NM_181836   NP_861974
预期抑制Bst1(或人PGAP1)或Emp24(或人TMED2、TMED10和 TMED7)表达或活性的化合物可拯救受损的内质网-介导的蛋白质运输。预期 增强SEC12(或人Sec12)、SED4、SEC16、HRD3(或人SEL1L或C20orf50)、 IRE1(或人Ire1)、STS1、或SEC24(或人Sec24A、Sec24B、Sec24C、或Sec24D) 的表达或活性的化合物可拯救受损的内质网-介导的蛋白质运输。
如本文详述的，sar1ts和sec23ts酵母突变体表现出受损的内质网-介导的 蛋白质运输。已知几种基因是SAR1和SEC23功能缺失突变的抑制子。因此， 预期增强这些sar1ts或sec23ts抑制子基因表达或活性的化合物也可拯救受损 的内质网-介导的蛋白质运输。
筛选实验
本文所描述的方法包括用于确定调节(即，增加或降低)所选靶基因或 它们的蛋白质产物的表达或活性的化合物的方法(本文也指“筛选实验”)。 这些化合物包括，例如多肽、肽、抗体、肽模拟物、类肽、无机小分子、非 核酸有机小分子、核酸(例如反义核酸、siRNA、寡核苷酸、合成的寡核苷 酸)、碳水化合物、或其他结合靶蛋白的试剂，对例如靶基因的表达或靶蛋 白的活性有刺激或抑制作用。因此确定的化合物在治疗方案中可用于调节靶 基因或靶蛋白的表达或活性。
通常，筛选实验包括测定检测试剂对检测样品(即，包含靶核酸或靶蛋 白的样品)中的靶核酸或靶蛋白的表达或活性的作用。在检测化合物或试剂 存在下的表达或活性可与在对照样品(即，相同条件下孵育的包含靶蛋白的 样品，但没有检测化合物)中的表达或活性对比。与对照相比，在检测样品 中靶核酸或靶蛋白的表达或活性的改变说明检测试剂或化合物调节靶核酸 或靶蛋白的表达或活性，并且说明检测试剂或化合物是候选药物。
可检测化合物调节本文描述的靶蛋白介导的一种或多种活性的能力。例 如，可检测列于表IV或V中的调节基因表达或蛋白质活性的化合物调节表 现出受损的内质网-介导的蛋白质运输的细胞中的毒性的能力。检测化合物 的这些活性的方法在本领域是已知的(并在本文中描述)。在一些情况下， 检测化合物直接影响靶基因表达或结合至靶蛋白(例如，通过降低细胞中靶 RNA的量或通过降低细胞中靶蛋白的量)的能力，并检测化合物调节与靶 蛋白相关的代谢作用的能力。
在一个实施方案中，提供了用于筛选候选或检测分子的实验方法，所述 候选或检测分子是细胞中的靶蛋白或其生物活性部分的底物。在另一个实施 方案中，实验用于筛选结合至靶蛋白或调节靶蛋白或其生物活性部分活性的 候选或检测化合物。这些化合物包括破坏靶蛋白和其配体之间相互作用的化 合物。
在这些方法中使用的检测化合物可使用本领域中许多方法中的任何一 种获得，包括组合文库方法，包括：生物文库；类肽文库(具有肽的功能性， 但具有可抵抗酶的降解，但保留了生物活性的新的、非肽骨架的分子文库； 例如，Zuckermann等人(1994)J.Med.Chem.37：2678)；空间定位平行固相或 液相文库；要求重叠合法(deconvolution)的合成文库方法；“一珠一化合物 (one-bead one-compound)”文库方法；和使用亲和色谱选择的合成文库。 生物文库和类肽文库方法限制于肽文库，而其他四种方法可用于化合物的 肽、非肽寡聚物或小分子文库(Lam(1997)Anticancer Drug Des.12：145)。
分子文库的合成方法实例可见文献，例如：DeWitt等人，Proc.Natl.Acad. Sci.USA，90：6909，1993；Erb等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：11422，1994； Zuckermann等人，J.Med.Chem.37：2678，1994；Cho等人，Science 261：1303， 1993；Carrell等人，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2059，1994；Carell等人， Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，33：2061，1994；和Gallop等人，J.Med.Chem.， 37：1233，1994。
化合物文库可出现在溶液中(例如，Houghten，Bio/Techniques， 13：412421，1992)、或珠(beads)上(Lam，Nature，354：82-84，1991)、芯片上 (Fodor，Nature 364：555-556，1993)、细菌(美国专利5,223,409)、孢子(美国专 利5,571,698；5,403,484；和5,223,409)、质粒(Cull等人，Proc.Natl.Acad.Sci. USA，89：1865-1869，1992)或噬菌体(Scott和Smith，Science，249：386-390， 1990；Devlin，Science，249：404-406，1990；Cwirla等人，Proc.Natl.Acad.Sci. USA，87：6378-6382，1990；和Felici，J.Mol.Biol.，222：301-310，1991)上。
在一个实施方案中，使用基于细胞的实验，实验中表达靶蛋白或其生物 活性部分的细胞与检测化合物接触。之后确定检测化合物调节靶蛋白表达或 活性的能力。细胞可为例如酵母细胞或哺乳动物来源的细胞，例如大鼠、小 鼠或人。
也可评价检测化合物结合靶蛋白或调节结合至化合物(例如靶蛋白底物) 的靶蛋白的能力。这可通过例如化合物，例如底物，与放射性同位素或酶标 记偶联实现，从而通过检测在复合体中标记的化合物，例如底物，而确定化 合物，例如底物，与靶蛋白的结合。或者，靶蛋白可与放射性同位素或酶标 记偶联，以监测在复合物中检测化合物调节靶蛋白与靶蛋白底物结合的能 力。例如，化合物(例如，靶蛋白底物)可用125I、35S、14C、或3H直接或 间接标记，并且通过放射发射直接计数或通过闪烁计数检测放射性同位素。 或者，化合物可被酶标记，例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、或萤光素， 并且酶标记通过测定合适的底物至产物的转化而检测。
可评价化合物与靶蛋白相互作用的能力，有或无任何相互作用的标记。 例如，可使用微生理记录仪检测化合物与靶蛋白之间的相互作用，化合物或 靶蛋白无标记(McConnell等人，Science 257：1906-1912，1992)。如本文所使 用，“微生理记录仪”(例如CytosensorTM)是使用光定位电位传感器(LAPS) 测量细胞酸化其环境的速率的分析仪器。酸化速率的改变可作为化合物与靶 蛋白之间相互作用的指示剂。
然而在另一个实施方案中，提供了无细胞实验，其中靶蛋白或其生物活 性部分与检测化合物接触，并评价检测化合物与靶蛋白或其生物活性部分结 合的能力。通常，本文描述的用于本实验的靶蛋白的生物活性部分包括参与 与其他分子相互作用的片段，例如有高表面概率评分(surface probability scores)的片段。
无细胞实验包括在一定条件下制备靶蛋白和检测化合物的反应混合物， 并允许两种成分相互作用和结合充足的时间，从而形成可被去除和/或检测的 复合物。
两种分子之间的相互作用也可使用荧光能量转移(FET)检测(见，例如 Lakowicz等人，美国专利5,631,169；Stavrianopoulos等人，美国专利 4,868,103)。选择在第一个“供体”分子上的荧光基团标记，以便荧光基团标记 发射的荧光能量将被第二个“受体”分子上的荧光标记吸收，然后由于吸收的 能量第二个“受体”分子上的荧光标记发出荧光。或者，“供体”蛋白分子可利 用色氨酸残基的天然荧光能量。选择发射不同波长光的标记，从而使“受体” 分子标记可与“供体”区分。由于标记之间的能量转移效力与分子间隔的距离 有关，因此可以评价分子之间的空间关系。在分子之间发生结合的情况下， 实验中的“受体”分子标记的荧光发射应最大。FET结合事件可通过本领域 已知的标准的荧光检测方法方便地测量(例如，使用荧光计)。
在另一个实施方案中，可使用实时生物分子间相互作用分析(BIA)确定 靶蛋白与靶分子结合的能力(例如，Sjolander等人，Anal.Chem.，63：2338-2345， 1991，和Szabo等人，Curr.Opin.Struct.Biol.，5：699-705，1995)。“表面等离 子共振(surface plasmon resonance)”或“BIA”实时地检测生物特异性相互作 用，无任何相互作用物的标记(例如，BIAcore)。在结合表面质量的改变(说 明结合事件)导致表面附近光的折光率的变化(表面等离子共振(SPR)的光 学现象)，从而导致产生了可作为生物分子之间实时反应指征的可检测信号。
在多个实验中，靶蛋白或检测物质锚定在固相上。可在反应结束时检测 锚定在固相上的靶蛋白/检测化合物复合物。通常，靶蛋白锚定在固相表面， 并且检测化合物(未锚定)可被直接或间接地使用本文讨论的可检测标签所 标记。
理想的是固定靶蛋白、抗-靶蛋白抗体或其靶分子，以促进一种或两种 蛋白从未复合形式中分离复合形式，以及以适应实验的自动化。在检测化合 物存在和无检测化合物存在时，检测化合物与靶蛋白的结合，或靶蛋白与靶 分子的相互作用可在任何适合容纳反应物的容器中完成。这些容器的实例包 括微量滴定板、检测管和微型离心管。在一个实施方案中，提供了增加了结 构域的融合蛋白，所述结构域可使一种或两种蛋白都与基质结合。例如，谷 光苷肽-S-转移酶/靶蛋白融合蛋白或谷光苷肽-S-转移酶/靶融合蛋白可被吸 收至谷光苷肽SepharoseTM珠上(Sigma Chemical，St.Louis，Mo.)或谷光苷 肽衍生的微量滴定板上，之后与检测化合物结合，或检测化合物和未吸收的 靶蛋白结合。之后混合物在有助于复合物形成的条件下(例如，在生理条件 的盐和pH下)孵育。孵育后，清洗珠或微量滴定板的孔，从而去除任何未 结合成分、使用珠情况下固定的基质、和例如如上所述直接或间接测定的复 合物。或者，复合物可从基质分离，并且使用标准技术测定靶蛋白结合的水 平或活性。
用于在基质上固定靶蛋白的其它技术包括使用生物素和链霉亲合素的 轭合。生物素化的靶蛋白可从生物素-NHS(N-羟基-琥珀酰亚胺)，使用本领 域已知的技术(例如，生物素化试剂盒，Pierce Chemicals，Rockford，Ill.)制 备，并且固定在链霉亲合素-涂被的96孔板中(Pierce Chemical)。
为了进行实验，非固定的成分加至包含锚定成分的涂被表面。在反应完 成后，在一定条件下去除(例如通过清洗)未反应的成分，从而使任何形成 的复合物保持固定在固相表面。锚定在固相表面的复合物可用许多方法检 测。当之前未固定的成分被预标记时，固定在表面的标记的存在说明复合物 形成。当之前未固定的成分未被预标记时，可使用间接标记检测锚定在表面 的复合物；例如，使用标记的对固定成分特异性的抗体(抗体，这时可被直 接标记或使用例如标记的抗-Ig抗体间接标记)。
在一些情况下，使用与靶蛋白反应的抗体进行实验，但抗体不干扰靶蛋 白与其靶分子的结合。这种抗体可被衍生(be derivatized)至板的孔中，并 且通过抗体轭合结合孔中未结合的靶蛋白。用于检测这些复合物的方法，除 了上述用于检测GST-固定的复合物的方法外，还包括使用与靶蛋白或靶分 子反应的抗体的复合物免疫检测，和依赖于检测与靶蛋白相关的酶活性的酶 联实验。
或者，可在液相中进行无细胞实验。在这种实验中，反应产物通过许多 标准技术中的任何一种从未反应的成分中分离，所述技术包括但不限制于： 差速离心(见，例如Rivas和Minton，Trends Biochem.Sci.，18：284-7，1993)； 色谱(凝胶过滤色谱、离子交换色谱)；电泳(例如，Ausubel等人，eds.Current Protocols in Molecular Biology 1999，J.Wiley：New York.)；和免疫沉淀(见， 例如，Ausubel等人，eds.，1999，Current Protocols in Molecular Biology，J.Wiley： New York)。这些树脂和色谱技术对本领域的技术人员是已知的(例如， Heegaard，J.Mol.Recognit.，11：141-148，1998；Hage等人，J.Chromatogr.B. Biomed.Sci.Appl.，699：499-525，1997)。此外，如本文所述，也可方便地使用 荧光能量转移，从而无需进一步从溶液中纯化复合物而检测结合。
实验可包括使靶蛋白或其生物活性部分与已知化合物接触(所述化合物 与靶蛋白结合形成实验混合物)，实验混合物与检测化合物接触，和测定检 测化合物与靶蛋白相互作用的能力，其中测定检测化合物与靶蛋白相互作用 的能力包括测定检测化合物对比已知化合物优先地结合靶蛋白或其生物活 性部分，或调节靶分子的活性的能力。
靶蛋白在体内可与一种或多种细胞或细胞外大分子(例如蛋白质)相互 作用。为了此讨论，这些细胞和细胞外大分子在本文指“结合配偶体(binding partners)”。破坏这种相互作用的化合物可用于调节靶蛋白活性。这种化合 物包括，但不限制于例如抗体、肽和小分子的分子。通常，用于确定破坏相 互作用的试剂的靶蛋白是本文确定的靶蛋白。在另外的实施方案中，本发明 提供了通过调节靶蛋白下游效应器的活性测定检测化合物调节靶蛋白活性 的能力的方法。例如，如本文所述可测定在合适的靶点上的效应分子的活性， 或可测定效应器与合适的靶分子的结合。
为了确定干扰靶蛋白和其结合配偶体之间相互作用的化合物，制备包含 靶蛋白和结合配体的反应混合物，在合适的条件下并经过充足的时间，使两 种产物形成复合物。为了检测抗体试剂，在检测化合物存在(检测样品)和 无检测化合物(对照样品)时提供反应混合物。检测化合物可起初包含在反 应混合物中，或可在加入靶基因和其细胞或细胞外结合配偶体后加入检测化 合物。对照反应混合物在无检测化合物下孵育，或与对照化合物孵育。之后 检测在靶蛋白和其细胞或细胞外结合配体之间的复合物的形成。在对照反应 中复合物的形成，和在包含检测化合物的反应复合物中较少的复合物的形成 说明化合物干扰靶蛋白和相互作用的结合配偶体之间的相互作用。这些化合 物是用于抑制靶蛋白表达或活性的候选化合物。此外，也可以将包含检测化 合物和正常的靶蛋白的反应混合物中复合物的形成与包含检测化合物和突 变的靶基因产物的反应混合物中的复合物形成相比，较。这种比较在想要确 定破坏突变的而不是正常的靶蛋白的相互作用的化合物情况中是重要的。
结合实验可在液相或异种形式中进行。在一类异种实验系统中，靶蛋白 或相互作用的细胞或细胞外结合配偶体被锚定在固体表面(例如，微量滴定 板)上，而非锚定的种类被直接或间接地标记。锚定的种类可通过非共价或 共价连接固定。或者，使用对待锚定的种类有特异性的固定的抗体将该种类 锚定在固体表面上。
为了进行实验，将固定的种类的配偶体暴露于有或无检测化合物涂被的 表面。在反应完成后，去除(例如，通过清洗)去除未反应的成分，并且任 何形成的复合物将保持固定在固体表面上。当未固定的种类被预标记时，检 测到被固定在表面上的标记说明复合物形成。当未固定的种类未被预标记 时，可使用间接标记检测停靠在表面上的检测复合物；例如，使用对起初未 固定的种类有特异性的标记抗体(抗体，这时被直接或用例如标记的抗-Ig 抗体间接地标记)。依赖于反应成分加入的顺序，可检测抑制复合物形成或 破坏预形成的复合物的检测化合物。
在另一个实施方案中，确定靶基因表达的调节子(RNA或蛋白质)。例 如，细胞或无细胞混合物与检测化合物接触，并且评价靶mRNA或蛋白质 的表达相对于无检测化合物时靶mRNA或蛋白质的表达水平。当靶mRNA 或蛋白质的表达在检测化合物存在时大于无检测化合物时，确认检测化合物 为靶mRNA或蛋白质表达的刺激剂(候选化合物)。或者，当靶mRNA或蛋 白质的表达在检测化合物存在时小于(有统计学差异)无检测化合物时，确 认检测化合物为靶mRNA或蛋白质表达的抑制剂(候选化合物)。可通过本 文描述的方法测定靶mRNA或蛋白质表达的水平，并且用于检测靶mRNA 或蛋白质的方法例如RNA印迹或蛋白免疫印迹在本领域是已知的。
在另一方面，本文描述的方法涉及本文描述的两种或更多实验的组合。 例如，可使用基于细胞或无细胞实验确定调节试剂，并且可确认体内调节靶 蛋白活性的试剂的能力，例如，在例如囊性纤维化或其它本文描述的以蛋白 质运输受损为特征的疾病的动物模型中的动物体内。
本发明还涉及上述筛选实验确定的新试剂。因此，本发明的范围还包括 在合适的动物模型中，使用本文确定的试剂(化合物)(例如，靶蛋白的调 节试剂、反义核酸分子、siRNA、靶蛋白-特异性抗体、或靶蛋白-结合配体)， 以确定用这种试剂治疗的有效性、毒性、副作用、或作用机制。此外，通过 上述筛选实验确定的新试剂可用于如本文所述的治疗。
使用本领域已知的方法和本文描述的方法，可检测调节靶蛋白表达或活 性的化合物(靶蛋白调节剂)影响与靶蛋白相关的代谢作用(例如降低的靶蛋 白表达或活性)的能力。例如，可使用例如囊性纤维化或其它本文描述的以 蛋白质运输受损为特征的病症的体外或体内模型检测化合物调节α-突触核 蛋白介导的毒性的能力。
靶蛋白调节剂
调节靶蛋白表达或活性的方法可使用包括靶向靶核酸序列或其片段或 靶蛋白的核酸分子的多种化合物完成。可用于抑制靶蛋白表达或活性的化合 物包括多聚核苷酸、多肽、非核酸有机小分子、无机小分子、抗体或其片段、 反义寡核苷酸、siRNAs和核酶。本文描述了确定这些化合物的方法。
RNA抑制(RNAi)
靶向靶RNA的分子可用于本文描述的方法，例如靶蛋白表达的抑制， 例如用于治疗突触核蛋白病(synucleinopathies)例如帕金森氏病的方法。核 酸的实例包括siRNAs。也可使用其它利用RNAi相关的机制发挥作用的分 子，包括化学修饰的siRNAs和驱动发夹RNA的表达之后被裂解为siRNA 的载体。如本文所描述的有用的核酸分子或构建(constructs)包括dsRNA(例 如，siRNA)分子，每个链包含16-30个核苷酸，例如16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸，其中一条链与mRNA 中的靶区域大体上相同，例如至少80％(或更多，例如85％、90％、95％或 100％)相同，例如有3、2、1或0个错配的核苷酸，并且另一条链与第一 条链互补。dsRNA分子可被化学合成，可在体外从DNA模板转录，或可在 体内从例如shRNA转录。dsRNA分子可使用本领域已知的方法设计，例如 Dharmacon.com(见，siDESIGN CENTER)或″siRNA使用指南，″见网址 mpibpc.gwdg.de/abteilunge-n/100/105/sirna.html。
阴性对照siRNAs(″乱序的″)通常与选定的siRNA有相同的核苷酸组 成，但没有与合适的基因组有互补性的有意义序列。这种阴性对照可通过随 机乱序选定siRNA的核苷酸序列设计；可执行同源性检索以保证阴性对照对 于合适的基因组中的任何其它基因缺乏同源性。对照也可通过将合适数量的 碱基错配引入至选定的siRNA序列设计。
可用于本文所述方法的核酸组合物包括siRNA和交联的siRNA衍生物。 交联可用于改变组合物的药代动力学，例如增加在体内的半衰期。因此，本 发明包括siRNA衍生物，所述siRNA衍生物包括有核酸的两条互补链的 siRNA，以便两条链交联。例如，可修饰一条链的3′OH末端，或者可交联 并在3′OH末端修饰两条链。siRNA衍生物可包含单个交联(例如，补骨脂 素(psoralen)交联)。在一些情况下，siRNA衍生物在其3′末端有生物素 分子(例如，光致断裂生物素(photocleavable biotin))、肽(例如，Tat肽)、 纳米颗粒、肽模拟物、有机化合物(例如染料，例如荧光染料)、或树枝体 (dendrimer)。用这种方法修饰siRNA的衍生物与相应的siRNA对比可提高 获得的siRNA衍生物的细胞摄取或增强细胞靶向活性，可用于追踪细胞中的 siRNA衍生物，或与相应的siRNA对比提高获得siRNA衍生物的稳定性。
本文所述的核酸组合物可非轭合或与另一个部分，例如纳米颗粒轭合， 以增强组合物的性质，例如药代动力学参数(例如吸收)、有效性、生物利 用度和/或半衰期。轭合可使用本领域已知的方法完成，例如使用Lambert 等人，Drug Deliv.Rev.，47，99-112，2001(描述了负载于聚氰基丙烯酸烷基酯 (PACA)纳米颗粒上的核酸)；Fattal等人，J.Control Release，53：137-143，1998 (描述了结合于纳米颗粒的核酸)；Schwab等人，Ann.Oncol.，5 Suppl.4：55-8， 1994(描述了结合于嵌入试剂、疏水基、多聚阳离子或PACA纳米颗粒的核 酸)；和Godard等人，Eur.J.Biochem.，232：404-410，1995(描述了结合于纳米 颗粒的核酸)中的方法。
也可使用任何本领域已知的方法标记核酸分子，例如核酸组合物可用荧 光基团，例如Cy3、荧光素或罗丹明标记。可使用试剂盒，例如SILENCER.TM. siRNA标记试剂盒(Ambion)执行标记。此外，分子可被放射性标记，例如使 用3H、32P或其它合适的同位素。
可通过阳离子脂质体转染和电穿孔将合成的siRNAs运输至细胞中。可 使用修饰以提高稳定性的序列。使用本领域已知的方法进行这种修饰(例如， siSTABLE3，Dharmacon)。这种稳定化的分子对于例如向受试者给药以降低 靶蛋白表达的体内方法是特别有用的。通过运输表达siRNA分子(或其它核 酸)的载体至细胞，例如脂肪、肝脏或肌肉细胞，也可实现更长期的表达。 几种在细胞中从重组DNA构建表达siRNA双链的方法得到细胞中更长期的 基因抑制，包括哺乳动物Pol III启动子系统(例如，HI或U6/snRNA启动 子系统)(Tuschl，Nature Biotechnol.，20：440-448，2002)，该系统能表达功能 性双链siRNAs(Bagella等人，J.Cell.Physiol.，177：206-1998；Lee等人，Nature Biotechnol.，20：500-505，2002；Paul等人，Nature Biotechnol.，20：505-508， 2002；Yu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，99(9)：6047-6052，2002；Sui等人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA，99(6)：5515-5520，2002)。通过RNA Pol III的转录 终止在DNA模板中连续四个T时发生，提供了在特异序列终止siRNA转录 的机制。siRNA与靶向基因序列的5′-3′和3′-5′方向是互补的，并且siRNA的 两条链可在相同或分别的构建中表达。发夹siRNAs，由H1或U6snRNA启 动子驱使并在细胞中表达，可抑制靶基因的表达(Bagella等人，1998，supra； Lee等人，2002，supra；Paul等人，2002，supra；Yu等人，2002，supra；Sui等人， 2002，supra)。当与表达T7RNA聚合酶的载体共转染至细胞中时，在T7启 动子的控制下，包含siRNA序列的构建也产生功能性的siRNAs。(Jacque， Nature，418：435-438，2002)。
动物细胞表达一定范围的约22个核苷酸的非编码RNA，称为小RNA (miRNAs)，并且可在动物发育期间在转录后或翻译水平调节基因表达。 miRNAs从约70个核苷酸的前体RNA茎-环(stem-loop)上剪切下来。通过用 与靶mRNA互补的miRNA序列取代miRNA前体的茎序列，表达新的miRNA 的载体构建可用于产生siRNAs，以引起对于哺乳动物细胞中特异mRNA靶 标的RNAi(Zeng，Mol.Cell，9：1327-1333，2002)。当被包含聚合酶III启动子 的DNA载体表达时，设计小RNA的发夹可沉默基因表达(McManus，RNA 8：842-850，2002)。通过siRNA的表达，例如在RNA Pol II启动子转录控制 下通过产生携带siRNA的重组腺病毒，病毒-介导的运输机制也可用于诱导 靶基因的特异沉默(Xia等人，Nat Biotechnol.，20(10)：1006-10，2002)。
重组腺病毒载体注射入表达siRNA的靶基因的转基因小鼠导致靶基因 表达在体内的减少。在动物模型中，全-胚胎电穿孔术可有效运输合成的 siRNA至植入后的小鼠胚胎(Calegari等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，99： 14236-14240，2002)。在成年小鼠中，siRNA的有效运输可通过“高压”运输技 术完成，所述“高压”运输技术是快速尾静脉注射(在5秒内)大体积的包含 溶液的siRNA进入动物(Liu，Gene Ther.，6：1258-1266，1999；McCaffrey， Nature，418：38-39，2002；路易斯，Nature Genetics，32：107-108，2002)。纳米颗 粒和脂质体也可用于运输siRNA进入动物。同样，在一些实施方案中，病毒 基因运输、直接运输、纳米颗粒-介导的注射、或脂质体注射可用于表达人 siRNA。在一些情况下，使用siRNA库(pool)调节靶基因的表达。该库包含 至少2、3、4、5、8或10个靶向靶基因的不同序列。
当靶RNA水平降低至少25％、50％、75％、90％或95％时，抑制靶蛋 白表达或活性的siRNAs或其它组合物对于改善α-突触核蛋白毒性相关疾病 的不希望的作用是有效的。在一些情况下，理想的是靶RNA水平降低不超 过10％、25％、50％或75％。测定靶基因表达水平的方法可使用本领域已知 的方法确定。例如，使用对来自细胞珠或受试者样品的RNA印迹检测靶RNA 的水平。靶蛋白的水平也可使用例如免疫测定法测量。
反义核酸
反义核酸用于抑制靶蛋白。这种反义核酸分子，即核酸分子，其核苷酸 序列与编码靶蛋白的mRNA全部或部分互补。反义核酸分子可反义于编码 靶蛋白的核苷酸序列的编码链的全部或部分非编码区。非编码区(“5′和3′ 非翻译区)是编码区两侧的并不翻译为氨基酸的5’和3’序列。
根据本文公开的核苷酸序列，本领域的技术人员可容易地选择和合成任 何靶向本文所述基因的大量合适的反义分子。例如，可制备由一系列核酸(例 如，靶核酸)长度在15-30个核苷酸的寡核苷酸组成的“基因步移(gene walk)”，随后检测基因表达的抑制。可选的，在寡核苷酸之间可留出5-10 个核苷酸的间隙，以减少合成和检测的寡核苷酸的数量。
反义寡核苷酸可为例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50 个核苷酸或更长。本文所述的反义核酸可使用本领域已知的方法使用化学合 成和酶配体反应进行构建。例如，反义核酸(例如，反义寡核苷酸)可使用天 然产生的核苷酸或各种修饰的核苷酸化学合成，所述修饰以增强分子的生物 稳定性或增强反义核酸和有意义核酸之间形成的双链的物理稳定性，例如可 用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可用于产生反义核酸的修饰的核 苷酸实例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌 呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧羟基甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2- 硫脲苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖Q核苷 (beta-D-galatosylqueosine)、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1- 甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、 5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧 基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖Q核苷(beta-D-mannosylqueosine)、5′- 甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿 嘧啶-5-氧基乙酸(v)、假尿苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、Q核苷(queosine)、 2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、 尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3- 氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。或者，可使用表达 载体生物产生反义核酸，所述载体中已在反义方向亚克隆核酸(即，插入核 酸转录的RNA将为感兴趣靶核苷酸的反义方向，在下面小节中进一步描 述)。
新的反义核酸分子可向哺乳动物给药，例如人患者。或者，可在原位产 生新的反义核酸分子，以便它们与细胞mRNA和/或编码选定的多肽的基因 组DNA杂交或结合，从而抑制表达，例如通过抑制转录和/或翻译。杂交可 通过常规的核苷酸互补性以形成稳定的双链，或例如对于结合DNA双链的 反义核酸分子，通过双螺旋的大沟中特异性的相互作用。本发明的反义核酸 分子的给药途径的实例包括在组织部位的直接注射。或者，可修饰反义核酸 分子，以靶向选定的细胞，并且之后全身给药。例如，对于全身给药，可修 饰反义分子，以便反义分子与表达在选定细胞表面的受体或抗原特异性地结 合，例如通过连接反义核酸分子与结合细胞表面的受体或抗原的肽或抗体。 反义核酸分子也可使用本文所述的的载体运输至细胞。例如，为了达到足够 的反义分子细胞内浓度，可使用载体构建，载体中反义核酸分子置于pol II 或pol III强启动子的控制下。
反义核酸分子可为α-异头核酸分子。α-异头核酸分子与互补的RNA形 成特异性的双链杂合子，其中，与通常的β单元相反，链彼此平行(Gaultier 等人，Nucleic Acids Res.，15：6625-6641，1987)。反义核酸分子也可包括2′-邻- 甲基核糖核苷酸(Inoue等人，Nucleic Acids Res.，15：6131-6148，1987)或嵌合 RNA-DNA类似物(Inoue等人，FEBS Lett.，215：327-330，1987)。
与本文所述的靶基因的全部或部分互补的反义分子也可用于使用本领 域已知的杂交方法测定这种基因的表达。例如，可标记(例如，用放射性活 性分子)反义分子，并且过量的被标记的反义分子与RNA样品杂交。去除 (例如，通过清洗)未杂交的被标记的反义分子，并且测定杂交的反义分子 的量。测定杂交分子的量，用于计算靶基因表达的量。通常，在例如本文所 述的那些高度严格的条件下，用于此目的的反义分子可与从来自靶基因的序 列杂交。当RNA样品首次用于合成cDNA时，可使用正义链分子。也可在 这些实验种使用双链分子，只要双链分子在杂交前充分地变性。
核酶
对靶核酸序列有特异性的核酶也可用于抑制靶基因的表达。核酶是具有 核糖核酸酶活性的催化RNA分子，可裂解单链核酸，例如mRNA，核酶具 有对单链核酸的互补区。因此，核酶(例如，锤头核酶(在Haselhoff and Gerlach，Nature，334：585-591，1988中描述))可用于催化裂解mRNA转录物， 从而抑制mRNA编码的蛋白质的翻译。设计和生产核酶的方法在本领域是 已知的(见，例如Scanlon，1999，Therapeutic Applications of ribozymes，Humana Press)。可基于靶cDNA的核苷酸序列设计具有对靶核酸分子或其片段特异 性的核酶。例如，可构建Tetrahymena L-19IVS RNA的衍生物，所述衍生物 中活性位点的核苷酸序列与在靶RNA中将被裂解的核苷酸序列互补(Cech 等人美国专利4,987,071；和Cech等人，美国专利5,116,742)。或者，编码 靶蛋白或其片段的mRNA可用于从RNA分子库中选择具有特异性的核糖核 酸酶活性的催化RNA(见，例如，Bartel and Szostak，Science，261：1411-1418， 1993)。
来自三螺旋结构的核酸分子也可用于调节靶蛋白的表达。例如，可通过 靶向核苷酸序列抑制靶蛋白的表达(所述核苷酸序列与编码多肽(例如，启 动子和/或增强子)的基因的调控区互补)以形成三螺旋结构，所述三螺旋结 构阻止在靶细胞中的基因转录。通常见Helene，Anticancer Drug Des.， 6(6)：569-84，1991；Helene，Ann.N.Y.Acad.Sci.，660：27-36，1992；和Maher， Bioassays，14(12)：807-15，1992。
可在碱基部分、糖部分或磷酸(phosphate)骨架部分修饰如本文所述使用 的核酸分子，以改善例如分子的稳定性、杂交或溶解性。例如，可修饰核酸 的脱氧核糖磷酸骨架，以产生肽核酸(见Hyrup等人，Bioorganic & Medicinal Chem.，4(1)：5-23，1996)。肽核酸(PNAs)是核酸模拟物，例如DNA模拟物， 其中脱氧核糖磷酸骨架被假肽骨架替代，且只有四个天然核碱基保留。PNAs 的中性骨架允许在低离子强度的条件下与DNA和RNA的特异性杂交。PNA 寡聚体的合成可使用标准的固相肽合成方法进行，例如如在Hyrup等人， 1996，supra；Perry-O′Keefe等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：14670-675， 1996中描述的方法。
PNAs可用于治疗和诊断应用。例如PNAs可作为反义或反基因试剂， 通过例如诱导转录或翻译停止，或抑制复制，用于基因表达的序列特异的调 节。通过例如PNA定向的PCR夹(clamping)，PNAs也可用于例如分析基 因中的单碱基对突变；当与其它酶合并时使用，作为人造限制性酶，所述其 它酶例如S1核酸酶(Hyrup，1996，supra)；或作为DNA序列和杂交的探针或 引物(Hyrup，1996，supra；Perry-O′Keefe等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93： 14670-675，1996)。
通过使PNA连接上亲脂或其它帮助基团、通过PNA-DNA嵌合体的形 成、或通过使用脂质体或其它在本领域是已知的药物运输技术，可修饰 PNAs，例如以增强其稳定性或细胞摄取。例如，可产生PNA-DNA嵌合体， 嵌合体可组合PNA和DNA的有利性质。这些嵌合体使DNA识别酶，例如 RNAse H和DNA聚合酶，从而与DNA部分相互作用，而PNA部分提供了 高的结合亲和力和特异性。根据碱基堆积、核碱基之间形成的键的数量、和 方向选择合适长度的连接子，用于连接PNA-DNA嵌合体(Hyrup，1996， supra)。可如Hyrup，1996，supra，和Finn等人，Nucleic acids Res.，24：3357-63， 1996中描述的方法进行PNA-DNA嵌合体的合成。例如，DNA链可在固体 支持物上使用标准的亚磷酰胺偶合化学和修饰的核苷类似物合成。例如 5′-(4-甲氧基三苯甲基)氨基-5′-脱氧-胸苷亚磷酰胺的化合物可作为在PNA和 DNA的5′末端的连接子(Mag等人.，Nucleic acids Res.，17：5973-88，1989)。之 后PNA单体分步偶联，从而与5′PNA片段和3′DNA片段产生嵌合体分子 (Finn等人，Nucleic acids Res.，24：3357-63，1996)。或者，嵌合体分子可用5′ DNA片段和3′PNA片段合成(Peterser等人，Bioorganic Med.Chem.Lett.， 5：1119-11124，1975)。
靶向靶核酸序列的核酸可包括附加基团，例如肽(例如用于体内靶向宿 主细胞受体)，或促进跨细胞膜转运的试剂(见，例如Letsinger等人，Proc.Natl. Acad.Sci.USA，86：6553-6556，1989；Lemaitre等人，Proc.Natl.Acad.Sci. USA，84：648-652，1989；WO 88/09810)或促进跨血脑屏障转运的试剂(见， 例如WO 89/10134)。此外，可用杂交引发的裂解试剂(见，例如Krol等人， Bio/Techniques，6：958-976，1988)或内催化试剂(见，等人Zon，Pharm.Res.， 5：539-549，1988)修饰寡核苷酸。最终，寡核苷酸可与另一种分子轭合，所述 另一种分子例如肽、杂交引发的交联试剂、转运试剂、或杂交引发的裂解试 剂。
多肽
本文提供了离体的靶蛋白，其片段，和其变异体。在筛选方法或在治疗 受试者的方法中，例如通过给药靶蛋白，可使用多肽，例如作为免疫原以产 生抗体。“分离的”或“纯化的”多肽或其生物活性部分基本上无细胞材料或来 自衍生蛋白质的细胞或组织来源的其它污染的蛋白，或当化学合成时，基本 上无化学前体或其它化学试剂。文字“基本上无细胞材料”包括多肽的制剂， 其中从分离或重组地产生的细胞的细胞成分中分离感兴趣的多肽。因此，基 本无细胞材料的多肽包括多肽的制剂，所述制剂有少于约30％、20％、10％、 或5％(干重)的异源蛋白(本文也指“污染蛋白”)。通常，当多肽或其生物 活性部分是重组产生的时，也基本上无培养基，即培养基少于蛋白质制剂体 积的约20％、10％、或5％。通常，当多肽是化学合成产生的时，基本无化 学前体或其它化学试剂，即从多肽的合成中包括的化学前体或其它化学试剂 中分离多肽。因此这种多肽的制剂除了感兴趣的多肽外，有少于约30％、20％、 10％、或5％(干重)的化学前体或化合物。
可测定靶蛋白的表达以确定表达量。测定蛋白质表达的方法在本领域是 已知的，并且包括蛋白免疫印迹、免疫沉淀和放射免疫测定。
如本文所用，靶蛋白的“生物活性部分”包括参与靶蛋白和非靶蛋白之间 相互作用的靶蛋白片段。靶蛋白的生物活性部分包括肽，所述肽包括与靶蛋 白的氨基酸序列充分同源的氨基酸序列，所述靶蛋白的氨基酸序列与全长的 靶蛋白相比，包括较少的氨基酸，并表现出靶蛋白的至少一种活性。通常， 生物活性部分包括有靶蛋白的至少一种活性的结构域或模体。靶蛋白的生物 活性部分可为多肽，例如10、25、50、100、200个或更长的氨基酸。靶蛋 白的生物活性部分可作为靶点，用于开发调节靶蛋白介导活性的试剂，例如 抑制靶蛋白活性的化合物。
在一些实施方案中，靶蛋白有与本文公开的序列(例如，表III中列出 的GenBankTM序列号下的氨基酸序列)相同的序列。其他有用的多肽与本文 公开的序列(例如，表III中列出的GenBankTM序列号下的氨基酸序列)基 本相同(例如，至少约45％、55％、65％、75％、85％、95％、或99％相同)， 并且(a)保留靶蛋白的功能性活性，但由于天然的等位基因变异或突变导致氨 基酸序列不同，或(b)当需要时，表现出改变的功能性活性(例如，显性负 相(dominant negative))。本文提供的变异体有改变的氨基酸序列，可作为激 动剂(模拟物)或拮抗剂发挥作用。变异体可通过突变产生，例如不连续的 点突变或截断。激动剂可基本保留相同的、或亚型的天然产生形式多肽的生 物活性。多肽的拮抗剂可抑制一种或多种天然产生形式多肽的活性，这是通 过例如与包括多肽的细胞信号通路的下游或上游成分的竞争性结合。因此， 可通过用限制性功能的变异体处理而产生特异性的生物学作用。受试者用具 有天然产生形式多肽的生物活性的亚型的变异体处理，与用天然产生形式多 肽处理对比，受试者具有较少的副作用。在一些实施方案中，变异靶蛋白是 显性负相形式的靶蛋白。例如在想要抑制靶蛋白的方法中，显性负相是理想 的。
本文还提供了嵌合体或融合蛋白。
两个序列之间的序列比较和相同百分比(percent identity)的确定使用数 学算法完成。在两个氨基酸序列之间的相同百分比使用Needleman和Wunsch， J.Mol.Biol.，48：444-453，1970)算法确定，该算法已被整合入GCG软件包的 GAP程序(见网址gcg.com)，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，并且 隙(gap)重16，长重1。在两个核苷酸序列之间的相同百分比使用GCG软 件包的GAP程序(也见网址gcg.com)，使用NWSgapdna.CMP百分比，隙 重40，长重1。
通常，本文涉及的两个核苷酸序列之间的相同百分比使用BLAST 2.0 程序确定，BLAST 2.0程序公开在英特网上ncbi.nlm.nih.gov/BLAST。序列 比较使用非隙(ungapped)算法并使用默认的参数(Blossum 62矩阵，带隙值 (gap existence cost)11，每个残基的隙值1，并且lambda比为0.85)。BLAST 程序中使用的数学算法在Altschul等人，Nucleid Acids Research 25：3389-3402， 1997中描述。
“保守的氨基酸取代基”是用有相似侧链的氨基酸取代氨基酸残基。在本 领域中定义了有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括有碱性侧链的氨 基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链的氨基酸(例如天门冬氨 酸、谷氨酸)、不带电极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天门冬酰胺、谷氨 酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链的氨基酸(例如 丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨 酸)、β-支化侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链 的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，靶蛋白中的 预测的非必需氨基酸残基通常被来自相同侧链家族的另一种氨基酸残基取 代。或者，可沿所有或部分的靶蛋白编码序列随机地引入突变，例如通过饱 和突变，并且获得的突变可用于筛选靶蛋白的生物活性，以确定保留活性的 突变。编码的蛋白质可被重组表达，并可确定蛋白质活性。
抗体
使用多克隆和单克隆抗体制备的标准技术，靶蛋白或其片段可用作免疫 原以产生抗体。可使用全长的多肽或蛋白质，或者，抗原肽片段可用作免疫 原。蛋白质的抗原肽包含靶蛋白的氨基酸序列的至少8个(例如，至少10、 15、20、或30)氨基酸残基，并且包含靶蛋白的表位，以便抵抗肽的抗体与 多肽形成特异的免疫复合物。
免疫原通常通过免疫合适的受试者(例如，兔、山羊、小鼠或其它哺乳 动物)用于制备抗体。合适的免疫原制剂可包括，例如，重组表达或化学合 成的多肽。制剂还可包括佐剂，例如Freund′s完全或不完全佐剂，或相似的 免疫刺激试剂。
可通过免疫合适的具有靶蛋白作为免疫原的受试者，如上述方法制备多 克隆抗体。可通过标准技术，例如酶联免疫吸附实验(ELISA)，使用固定 的多肽，随时间监测在被免疫的受试者中的抗体效价(titer)。如果需要，抗体 分子可从哺乳动物(例如，从血液)中分离，并进一步通过众所周知的技术 纯化，例如蛋白质A色谱法，以获得IgG片段。在免疫后的合适时间，例如， 当特异性抗体效价最高时，可从受试者获得产生抗体的细胞，并通过标准技 术，例如最先在Kohler and Milstein，Nature，256：495-497，1975中描述的杂交 瘤技术、EBV-杂交瘤技术(Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96，1985)，三体瘤杂交技术，用于制备单克 隆抗体。产生杂交瘤的技术是众所周知的(通常见Current Protocols in Immunology，301994，Coligan等人(eds.)John Wiley & Sons，Inc.，New York， N.Y.)。对于与感兴趣多肽结合的抗体通过筛选杂交瘤培养上清液，检测产 生单克隆抗体的杂交瘤细胞，例如使用标准ELISA实验。
或者为了制备单克隆抗体分泌的杂交瘤，通过筛选感兴趣多肽的重组组 合免疫球蛋白库(例如，抗体噬菌体展示文库)，可确定并分离定向于多肽 的单克隆抗体。用于产生并筛选噬菌体展示文库的试剂盒是市售的(例如， Pharmacia Recombinant Phage Antibody System，编号27-9400-01；和 Stratagene SurfZAP3Phage Display Kit，编号240612)。此外，特别适用于产 生和筛选抗体展示文库的方法和试剂可见，例如美国专利5,223,409；WO 92/18619；WO 91/17271；WO 92/20791；WO 92/15679；WO 93/01288；WO 92/01047；WO 92/09690；WO 90/02809；Fuchs等人，Bio/Technology， 9：1370-1372，1991；Hay等人，Hum.Antibod.hybridomas，3：81-85，1992；Huse 等人，Science，246：1275-1281，1989；Griffiths等人，EMBO J.，12：725-734， 1993。
此外，本文提供了包括人源和非人源部分的，可使用标准重组DNA 技术制备的重组抗体，例如嵌合体和人源化单克隆抗体。这种嵌合体和人源 化单克隆抗体可通过本领域已知的重组DNA技术生产，例如使用WO 87/02671；欧洲专利申请184,187；欧洲专利申请171,496；欧洲专利申请 173,494；WO 86/01533；美国专利4,816,567；欧洲专利申请125,023；Better 等人，Science，240：1041-1043，1988；Liu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：3439-3443，1987；Liu等人，J.Immunol.，139：3521-3526，1987；Sun等人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84：214-218，1987；Nishimura等人，Canc.Res.， 47：999-1005，1987；Wood等人，Nature，314：446-449，1985；和Shaw等人，J. Natl.Cancer Inst.，80：1553-1559，1988)；Morrison，Science，229：1202-1207， 1985；Oi等人，Bio/Techniques，4：214，1986；美国专利5,225,539；Jones等人， Nature，321：552-525，1986；Verhoeyan等人，Science，239：1534，1988；和Beidler 等人，J.Immunol.，141：4053-4060，1988中描述的方法。
完全人源的抗体对于人患者的治疗是特别理想的。可使用不能表达内源 性免疫球蛋白重链和轻链基因，但可表达人源重链和轻链基因的转基因小鼠 产生这种抗体。转基因鼠用选定的抗原以正常形式免疫，选定的抗原例如全 部或部分的靶蛋白。可使用常规的杂交瘤技术获得定向抗原的单克隆抗体。 转基因小鼠包含的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化期间重排，并随后经历 了类别转换和体细胞突变。因此，使用这种技术，可以产生治疗有用的IgG、 IgA和IgE抗体。产生人源抗体的技术综述见Lonberg和Huszar(Int.Rev. Immunol.，13：65-93，1995)。对产生人源抗体和人源单克隆抗体的技术和产生 这种抗体的方法的详细讨论见例如美国专利5,625,126；美国专利5,633,425； 美国专利5,569,825；美国专利5,661,016；和美国专利5,545,806。
识别选定表位的完全人源的抗体可使用“定向选择”技术产生。在这种方 法中，选定的非人源的单克隆抗体，例如鼠抗体，用于指导选择识别相同表 位的完全人源抗体。(Jespers等人，Biotechnology，12：899-903，1994)。
定向靶蛋白的抗体可用于检测多肽(例如，在细胞裂解物或细胞上清液 中)，以评价多肽表达的丰度和形式。抗体也可诊断使用，作为临床检测程 序的一部分，以监测组织中的蛋白质水平，例如以确定给定的治疗给药方法 的有效性。可通过偶合抗体与可检测物质而促进检测。可检测物质的实例包 括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质和放射性物质。合适 的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶； 合适的辅基复合物的实例包括链霉亲合素/生物素和亲和素/生物素；合适的 荧光物质的实例包括伞形酮、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、二氯三 嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的实例包括鲁米诺；生物发 光物质的实例包括萤光素酶、萤光素、和水母发光蛋白，和合适的放射性物 质实例包括125I、131I、35S或3H。
G.以蛋白质运输受损为特征的疾病的治疗方法
GTP-结合的Rab蛋白，例如Rab1，酵母ypt1同系物，参与囊泡转运的 整体调节。如整个说明书和实施例中所详述的，在yptts突变拯救筛选实验中 确定的化合物通过例如调节Rab-ypt1通路可用于稳定运输缺陷蛋白。因此， 本文公开的化合物(和包含该化合物的药物组合物)可在治疗以蛋白质运输 受损为特征的各种疾病的一种或多种症状的方法中使用。如实施例4中所述， 使用ypt1ts突变拯救筛选实验确定的化合物也可用于稳定ΔF508CFTR。因 此，本文所述的化合物在治疗或预防囊性纤维化的一种或多种症状中特别有 用。
可通过给药一种或多种本文所述的化合物(或该化合物的药物组合物) 治疗的以蛋白质运输受损为特征的疾病的类型包括，例如遗传性肺气肿、遗 传性血铁沉积症、眼皮肤白化病、蛋白质C缺乏症、I型遗传性血管性水肿、 先天性蔗糖酶异麦芽糖酶缺乏、II型克-纳综合征综合征、拉龙综合征、遗传 性髓过氧物酶症、原发性甲状腺机能低下、先天性长QT综合征、酪氨酸结 合球蛋白缺乏症、家族性高胆固醇血症、家族性乳糜微粒血症、无β-脂蛋白 血症、低血浆脂蛋白水平、伴随肝受损的遗传性肺气肿、先天性甲状腺功能 减退症、成骨不全、遗传性低纤维蛋白原血症、α1抗糜蛋白酶缺乏症、肾性 尿崩症、垂体神经性尿崩症、夏科-马里-图思综合征、佩利措伊斯-梅茨巴赫 病、IIA型冯·威利布兰德病、结合因子V和VIII缺乏症、迟发性骨骺发育 不良、无脉络膜症、I细胞疾病、巴藤病、共济失调-毛细血管扩张症、急性 成淋巴细胞性白血病、急性髓细胞样白血病、髓细胞性白血病、ADPKD-常 染色体显性多囊性肾病、微绒毛包含病、结节性硬化症、洛氏眼-脑-肾综合 征、肌萎缩侧索硬化、骨髓增生异常综合征、巴尔淋巴细胞综合征、丹吉尔 病、家族性肝内胆汁淤积、X-连锁肾上腺脑白质营养不良、斯科特综合征、 1型和2型赫曼斯基-普德拉克综合征、泽耳韦格综合征、斑点状软骨发育异 常(rhizomelic chondrodysplasia puncta)、常染色体隐性原发性高草酸尿症、 Mohr Tranebjaerg综合征、脊髓延髓性肌萎缩症、原发性纤毛运动障碍(卡 塔格纳综合征)、米-迪综合征、无脑回畸形、运动神经元病、乌斯赫尔综合 征、威斯科特-奥尔德里奇二氏综合征、Optiz综合征、亨廷顿舞蹈病、遗传 性胰腺炎、抗磷脂综合征、重叠结缔组织病、舍格伦综合征、僵体综合征、 Brugada综合征、芬兰型型先天性肾炎综合征、杜宾-约翰逊综合征、X-连 锁低磷血症、潘德雷德综合征、持续性幼儿型胰岛素过度分泌低血糖症、遗 传性持续性幼儿型胰岛素过度分泌低血糖症、遗传性球形红细胞增多症、无 铜蓝蛋白血症、婴儿型神经元蜡样质脂褐质沉积病、假性软骨发育不全和多 重骨骺、斯塔加特样黄斑营养不良、X-连锁夏科-马里-图思病、常染色体显 性视网膜色素变性、Wolcott-Rallison综合征、库欣病、肢带型肌营养不良症、 IV型粘多糖病、完全遗传性家族性淀粉样变性、安德森病、肉瘤、慢性骨 髓单核细胞性白血病、心肌病、面生殖发育异常、Torsion病、亨廷顿和小脑 萎缩症、遗传性高同型半胱氨酸血症、多发性神经病、下肢运动神经元病、 色素视网膜炎、血清阴性多关节炎、间质性肺纤维化、雷诺现象、韦格纳肉 芽肿病、蛋白尿、CDG-Ia、CDG-Ib、CDG-Ic、CDG-Id、CDG-Ie、CDG-If、 CDG-IIa、CDG-IIb、CDG-IIc、CDG-IId、埃勒斯-当洛斯综合征、多发性外 生骨疣、格里塞利综合征(1型或2型)、或X-连锁非特异性智力发育迟缓。 此外、以蛋白质运输受损为特征的疾病也可包括溶酶体贮积症，例如但不限 制于法布里病、法韦尔病、戈谢病、GM1-神经节苷脂贮积病、泰-萨克斯病、 桑德霍夫病、GM2激动剂病、克拉伯病、异染性脑白质营养不良、尼曼-皮 克二氏病(A、B和C型)、胡尔勒病、沙伊病、亨特病、桑菲列普病、莫 尔丘病、马-拉病、透明质酸酶缺乏症、天冬氨酰葡糖胺尿症、岩藻糖苷贮 积症、甘露糖苷贮积症、欣德勒病、1型唾液酸贮积症、蓬佩病、致密性成 骨不全症、蜡样脂褐质沉积症、胆固醇酯贮积症、沃尔曼病、多重硫酸酯酶、 半乳糖涎酸贮积症、粘多糖症(II、III和IV型)、胱氨酸贮积症、唾液酸贮 积症、乳糜微粒滞留病伴随马-舍综合征、赫曼斯基-普德拉克综合征、谢- 希综合征、Danon病、或Geleophysic发育不良。
有许多以蛋白质运输受损为特征的疾病的症状并且不同，并包括例如贫 血、疲劳、容易擦伤、低血小板、肝增大、脾增大、骨骼虚弱、肺受损、感 染(例如，胸感染或肺炎)、肾受损、进行性脑受损、癫痫发作、胎粪增厚、 咳嗽、喘鸣、过量唾液或粘液产生、呼吸急促、腹痛、肠或消化道闭塞、生 育问题、鼻息肉、手指/脚趾指甲和皮肤杵状变、手或脚痛、血管角质瘤、排 汗减少、角膜和晶状体混浊、白内障、二尖瓣脱垂和/或反流、心脏肥大、温 度不耐受、行走困难、吞咽困难、进行性视力丧失、进行性听力丧失、张力 减退、巨舌症、反射消失、下腰痛、睡眠性呼吸暂停、端坐呼吸、嗜睡、脊 柱前凸或脊柱侧凸中的一种或多种。可以理解由于运输缺陷蛋白的多种特性 和所导致的疾病的表型(例如，以蛋白质运输受损为特征的疾病)，指定疾 病通常仅展现特殊疾病的症状特征。例如，患有囊性纤维化的患者表现特殊 亚型的上述症状，例如但不限制于，持续咳嗽、过量唾液或粘液产生、喘鸣、 咳嗽、呼吸急促、肝和/或脾增大、鼻息肉、糖尿病、生育问题、感染增加(例 如，呼吸道感染，例如肺炎)，或消化道或肠闭塞。
根据疾病的特殊性质，患者在任何年龄可表现出这些症状。在许多情况 下，可在儿童期或成人早期表现出症状。例如，当婴儿的消化道被增厚胎粪 阻塞时，通常在出生时表现出囊性纤维化的症状。
对受试者(例如人患者)给药一种或多种公开的化合物(或药物组合物) 后，可通过比较患者治疗前和后表现出的一种或多种症状的数量和/或严重 度，评价治疗在改善以蛋白质运输受损为特征的疾病的一种或多种症状中的 有效性。或者，当给药化合物用于预防以蛋白质运输受损为特征的疾病的发 生时，治疗效力可评价为以蛋白质运输受损为特征的疾病的一种或几种症状 的出现延迟或不出现。可通过在治疗后的多个时间点评价，例如一种或多种 症状的数量或严重度，确定随时间(例如，进行性改善)的治疗(例如，本 文所述的化合物或组合物)在改善以蛋白质运输受损为特征的疾病的一种或 多种症状中的有效性。例如，受试者(例如患者)可拥有对他或她的疾病的 严重度(例如，以蛋白质运输受损为特征的疾病的一种或多种症状的数量或 严重度)的初始评价，给药治疗，并随后在治疗两次或更多次后(例如，在 一周和一个月；在一个月、两个月；在两周、一个月和六个月；或六周、六 个月和一年)进行评价。当在限定时期内(例如，预先确定的时期)或以限 定的给药次数对受试者给药一种或多种化合物或组合物时，可在最终治疗后 在各个时间点评价治疗对改善以蛋白质运输受损为特征的疾病的一种或多 种症状的作用。例如，在一种或多种化合物的最后给药剂量后，可在最终治 疗的一个月(例如，在两个月、在六个月、在一年、在两年、在五年或更长 时间)后评价患者症状的数量和严重度。
本文所述的一种或多种化合物(或组合物)对以蛋白质运输受损为特征 的疾病的一种或多种症状的治疗的有效性可评定为单一治疗或作为多重治 疗方案的一部分。例如，化合物可与其它临床相关的用于以蛋白质运输受损 为特征的疾病的治疗结合给药，所述用于以蛋白质运输受损为特征的疾病的 治疗包括，但不限制于，物理或呼吸治疗、抗生素、抗哮喘治疗、皮质类固 醇、维生素补充、阿法链道酶治疗、Cerezyme、Ceredase、Myozyme 胰岛素、Fabryzyme、透析、移植物(例如肝或肾)、软便药或缓泻药、抗- 血液凝固试剂(抗凝剂)、疼痛治疗、和/或血管成形术。可以理解由于运输 缺陷蛋白的不同活性和相关疾病的不同临床表现(例如，法布里病、囊性纤 维化、戈谢病、蓬佩病等)，“其它临床相关治疗”也可包括上述治疗之外的 治疗。例如，对于囊性纤维化的其它或另外的临床相关治疗包括，例如抗生 素、阿法链道酶治疗、维生素补充、软便药或缓泻药、用于囊性纤维化相关 糖尿病的胰岛素、抗哮喘治疗、或皮质类固醇。
可向受试者给药本文所述的的化合物或其药物组合物，作为与其它治疗 (其它活性成分)的组合治疗，所述其它治疗例如以蛋白质运输受损为特征 的疾病的治疗，例如囊性纤维化或溶酶体贮积病的治疗。例如，组合治疗可 包括向受试者(例如，人患者)给药一种或多种其它试剂，所述试剂可向患 有，或有风险发展为(或怀疑患有)以蛋白质运输受损为特征的疾病，例如 囊性纤维化的受试者提供治疗益处。因此，化合物或药物组合物和一种或多 种其它试剂同时给药。或者，可首先给药所述化合物，再给药一种或多种其 它试剂。所述化合物可取代或提高之前或同时给药的治疗(也见下)。例如， 在用本发明的化合物治疗后，一种或多种其它试剂的给药可停止或减少，例 如较低水平给药。之前的治疗给药也可保持。在一些实例中，之前的治疗可 保持，直至化合物水平(例如剂量或给药时间)到达足够提供治疗作用的水 平。两种治疗可组合给药。
可以理解在一些实例中，当之前的治疗毒性特别大时(例如，以蛋白质 运输受损为特征的疾病的治疗伴随显著的副作用)或受试者(例如患者)不 能耐受时，给药该化合物可用于抵消和/或减少之前治疗的量，至足够给予相 同的或改善的治疗益处，而不伴随毒性的水平。
在一些实例中，当向受试者给药本发明的化合物或药物组合物时，第一 种治疗停止。监测受试者的首先预选择的结果，例如以蛋白质运输受损为特 征的疾病的一种或多种症状，如任何本文所述的症状(例如，见上)的改善。 在一些情况下，当观察到首先预选择的结果时，用化合物的治疗被减少或停 止。之后可在用化合物的治疗被停止后监测受试者的第二种预选择的结果， 例如以蛋白质运输受损为特征的疾病的症状的加重。当观察到第二种预选择 的结果时，化合物对受试者的给药可恢复或增加，或者恢复第一种治疗给药， 或者向受试者同时给药该化合物和第一种治疗，或该化合物和第一种治疗方 案的量增加。
评价治疗(例如本发明的化合物或组合物)作用的方法在本领域是已知 的，并且包括评价以蛋白质运输受损为特征的疾病的一种或多种症状，例如 本文所述的症状(见上)的改变(例如，改善)。此外，本发明不限制于任 何特殊理论或作用机制，由于本文确定的化合物可在分子水平发挥作用以纠 正以蛋白质运输受损为特征的疾病，对患有以蛋白质运输受损为特征的疾病 的患者的治疗可通过评价例如(i)运输缺陷蛋白的稳定性的改善；(ii)运输缺 陷蛋白的适当的、生理的运输的改善，或者(iii)运输缺陷蛋白的一种或多种 功能的恢复(见上，“E.化合物活性的评价”中)进行评价。
特别的，囊性纤维化治疗的有效性(例如给药本文所述的一种或多种化 合物或药物组合物)可例如在治疗之前和之后通过执行“发汗检测”进行监 测。发汗检测通常由医生或医务人员进行操作。将无色、无味的化学药品置 于皮肤上，导致发汗，并且用仪器收集汗液。发汗检测可花费30分钟至1 小时，这依赖于收集受试者排汗的所花费的时间。检测受试者的排汗中的氯 水平(例如，使用Sweat-ChekTM发汗传导分析仪(Sweat Conductivity Analyzer)、Discovery Diagnostics，Ontario，加拿大)，并且例如＜40的相对评 分说明正常，40-59的评分为中间范围，＞60的评分说明受试者仍患病较重。 囊性纤维化治疗的有效性也可使用鼻内电势差(NPD)检测。该检测对于通过 发汗检测确定的具有正常氯水平的受试者(例如患者)是特别有用的。NPD 检测需要2个电极，与电压表例如Tholy-Medicap仪器连接，一个电极放置 于下鼻甲的鼻粘膜上，另一个电极皮下放置于前臂。通常，认为低于-40mV 的读数是正常的。因此，认为NPD检测读数超过-40mV的患者疾病改善(见， 例如，Domingo-Ribas等人(2006)Arch Bronconeumol.42：33-38)。
H.产生蛋白质的方法
本文所述的的化合物增强内质网-介导的转运，并因此可在增强细胞中 蛋白质产生的方法中使用。由本方法产生的蛋白质可为天然的，或非天然的 蛋白质。蛋白质可由细胞自然产生(例如，没有任何细胞的基因操作)、可 通过异源核酸导入细胞编码产生，或可通过插入或激活调节编码蛋白质基因 的表达后由细胞产生。
“异源性核酸”指通过使用重组技术引入细胞的核苷酸序列。因此，出现 在指定细胞中的“异源性核酸”不在细胞中自然产生(例如，在细胞的基因组 中没有对应的相同序列)，和/或在细胞中在与对应的相同序列自然存在的不 同的位置产生(例如，核苷酸序列在细胞基因组的不同位置出现，或在细胞 中以构建物出现而没有整合入基因组)。
由细胞产生的任何蛋白质可在本文所述的方法中使用。例如，可产生蛋 白质例如细胞因子、淋巴因子、和/或生长因子。这种蛋白质的实例包括，但 不限制于，红细胞生成素、白介素1-α、白介素1-β、白介素-2、白介素-3、 白介素-4、白介素-5、白介素-6、白介素-7、白介素-8、白介素-9、白介素-10、 白介素-11、白介素-12、白介素-13、白介素-14、白介素-15、淋巴细胞趋化 因子、淋巴细胞毒素α、单核细胞趋化蛋白-1、单核细胞趋化蛋白-2、单核 细胞趋化蛋白-3、Megapoietin、抑瘤素M、青灰因子(steel factor)、血小板生 成素、血管内皮细胞生长因子、骨形成蛋白、白介素-1受体拮抗剂、粒细胞 集落刺激因子、白血病抑制因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、巨噬细 胞集落刺激因子、干扰素γ、干扰素β、成纤维细胞生长因子、肿瘤坏死因 子α、肿瘤坏死因子β、转化生长因子α、绒促性素、神经生长因子、血小 板衍生生长因子、巨噬细胞炎性蛋白1α、巨噬细胞炎性蛋白1β、和Fas配 体。产生上述多肽的非自然发生的、变异体的细胞也可在本文所述的方法中 使用。
除上述蛋白质，本文所述的方法也可用于产生融合蛋白，所述融合蛋白 包含与指导来自细胞的融合蛋白质分泌的氨基酸序列融合的全部或部分的 指定蛋白质。在一些情况下，这种融合蛋白可允许从细胞非典型分泌的多肽 序列的分泌。例如，蛋白质的全部或部分(例如，膜相关蛋白，例如受体或 细胞内蛋白)可与免疫球蛋白分子的部分融合(例如，与铰链区和人IgG1 重链的恒定区CH2和CH3结构域融合)。
本文所述的方法产生的蛋白质可为抗体或抗体的抗原结合片段。抗体可 定向于抗原，例如蛋白质抗原，例如可溶性多肽或细胞表面受体。例如，抗 体可定向于参与免疫细胞活化的细胞表面受体、疾病相关抗原、或病原体产 生的抗原。术语“抗体”指免疫球蛋白分子或其抗原结合部分。如本文所使用 的术语“抗体”指包含至少一个，例如两个重链可变区(“VH”)，并且包含至少 一个，例如两个轻链可变区(“VL”)的蛋白质。VH和VL区可进一步再分为 高度变异区，又称“互补性决定区”(″CDR″)；更加保守的散开区，又称“框架 区”(FR)。抗体还可包括重链和轻链恒定区，由此分别形成重和轻免疫球蛋 白链。在一个实施方案中，抗体为两个重免疫球蛋白链和两个轻免疫球蛋白 链的四聚体，其中重和轻的免疫球蛋白链通过例如二硫键相互连接。重链恒 定区包含三个结构域，CH1、CH2、和CH3。轻链的恒定区包含一个结构域， CL。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。
蛋白质可为完全人源抗体(例如，在小鼠中从人的免疫球蛋白序列遗传 工程产生的抗体)、人源化抗体、或非人源抗体，例如啮齿动物(小鼠或大 鼠)、山羊或灵长类(例如猴子)抗体。
下列为本发明实用实施例。不解释为以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1：恢复ypt1ts突变株生长的化合物
酵母突变细胞株ypt1ts以温度依赖方式抑制突变YPT1等位基因的显性 致死表型(Schmitt等人(1988)Cell 53：635-47)。酵母突变细胞株ypt1ts包含有 两个点突变的YPT1等位基因：一个在121位从天门冬酰胺改为异亮氨酸 (N121I)，另一个突变是在161位从丙氨酸改为缬氨酸(A161V)。N121I突变 引发自身的显性致死性，但致死性被第二个突变抑制，导致功能表型在限制 性温度隐性丧失。ypt1ts细胞在高达25℃的温度正常生长，但在37℃生长 停止(Id.)。在非许可温度37℃，ypt1ts突变株累积ER膜、小囊泡，和未加工 的转化酶，并表现出细胞骨架缺陷和钙摄取增强(Id.)。ypt1ts突变细胞可通过 提供细胞外钙而从细胞生长停滞中恢复。
筛选使细胞从α-突触核蛋白毒性中恢复的化合物，以评价化合物恢复 ypt1ts细胞生长的能力。对在室温(许可温度)、37℃(非许可温度)和35℃ (半许可温度)培养的ypt1ts细胞测定化合物的作用。发现拯救α-突触核蛋 白毒性的特定化合物(和其类似物)也可拯救ypt1ts毒性。
为了确定是否待测化合物可拯救ypt1ts突变表型，ypt1ts细胞在补充2％ 葡萄糖的合成的完全(SC)培养基中在室温生长过夜。将对数期细胞稀释到 SC 2％葡萄糖培养基中至OD600为0.003。之后将100μL的这种培养基等分 加入96-孔平底微量滴定板的每个孔中。向每孔中加入溶解在DMSO中的 1μL的检测化合物(浓度范围在5mM-0.005mM)或单独DMSO(在1％ DMSO中的终浓度为50uM-0.05uM)。通过涡旋混合培养板，并在35℃和 37℃孵育。通过测定培养物的OD600(在600nm的光密度；细胞生长)，测 定化合物对温度敏感缺陷的ypt1ts株拯救。在35℃孵育的板在孵育24和40 小时检测，而在37℃生长的板在孵育40小时后检测。
监测拯救ypt1ts突变株的实验使用溶媒、阳性对照(钙)、来自α-突触 核蛋白筛选的活性化合物(化合物I.1和化合物II.1)、化合物I.1的α-突触核 蛋白-活性类似物(化合物I.2和化合物I.3)、和化合物I.1的α-突触核蛋白-无 活性类似物(化合物I.4和化合物I.5)进行。
如所期望的，钙(阳性对照)在35℃和37℃均拯救ypt1ts。此外，在 35℃和37℃发现化合物I.1和化合物II.1化合物均拯救ypt1ts。化合物I.1 的活性类似物(化合物I.2和化合物I.3)也拯救ypt1的功能缺失，而化合物I.1 的非活性类似物(化合物I.4和化合物I.5)无此作用。
此外，也检测化合物II.3拯救ypt1ts突变表型的能力。ypt1ts细胞在5.0μM 化合物II.3、2.0μM化合物I.3或作为对照的DMSO存在下，在37℃培养 40小时。化合物II.3和化合物I.3拯救ypt1ts表型(图2)。
在上述ypt1ts拯救实验中还检测化合物I.7-I.35、I.58-I.75、II.4-II.69、和 II.96-II.134。化合物I.7-I.35和II.4-II.69拯救ypt1ts表型。化合物I.58-I.75和 II.96-II.134在更高浓度表现出在ypt1ts实验中的活性。
上述化合物可拯救ypt1ts的蛋白质运输缺陷的发现，说明化合物可用于 治疗或预防以蛋白质运输受损为特征的多种疾病。
实施例2：多柔比星、放线菌酮、潮霉素、新生霉素、金担子素A和衣 霉素恢复ypt1ts突变株的生长
除了实施例1中描述的化合物，在ypt1ts生长筛选中也检测几种其它的 化合物。这些筛选实验确定了多柔比星、放线菌酮、潮霉素、新生霉素、金 担子素A、和衣霉素在35℃和37℃中拯救ypt1的功能缺失和ypt1ts的恢复 生长中是有效的。这些化合物可拯救ypt1ts的蛋白质运输缺陷的发现，说明 化合物可用于治疗或预防以蛋白质运输受损为特征的多种疾病。
实施例3：蛋白体抑制剂拯救ypt1ts突变表型
使用基于细胞的研究，蛋白酶体抑制剂如bortezomib(PS-341/Velcade)， 已表现出稳定ΔF508CFTR突变，阻止过早降解并恢复细胞的氯离子外流(Vij 等人(2006)J.Bio1.Chem.281：17369-17378)。检测蛋白酶体抑制剂MG132 (Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)拯救ypt1ts突变表型的能力。将ypt1ts突变细胞 置于96-孔组织培养板中，并在37℃(非许可温度，见上)在各种浓度的 MG132(范围在0.05-50μM)存在下培养40小时(图1)。当在非许可温度 培养的细胞，在无MG132条件下，表现出严重的生长抑制时，中间浓度的 化合物拯救ypt1ts的功能缺失。
这些数据表明ypt1ts突变筛选实验在确定治疗囊性纤维化的化合物中是 有用的。此外，这些结果表明在治疗ΔF508CFTR中(即，在治疗一种特定 类型的运输疾病中)有用的化合物具有治疗大范围的以蛋白质运输受损为特 征的疾病，例如任何本文所述的疾病。
实施例4：ypt1ts突变活性化合物稳定ΔF508CTFR
进一步测定在ypt1ts筛选中鉴定的选定的化合物稳定ΔF508CTFR的能 力。CFBE细胞，通过用SV40转化囊性纤维化气管支气管细胞(ΔF508CTFR 纯合子)产生的细胞株(Bruscia等人(2002)Gene Ther.9(11)：683-685)，用10μM 的化合物I.3、10μM化合物II.2或10μM的VRT-325在37℃培养16小时 (VRT-325在例如Van Goor等人(2006)Am.J.Physiol.Lung Cell Mol.Physiol. 290：L1117-L1130中描述)。还用二甲基亚砜(DMSO)溶剂培养细胞群落， 作为对照。
在孵育后，裂解细胞，在Laemmli缓冲液中溶解，并加至SDS-PAGE。 使用对CFTR特异性抗体进行蛋白质印迹可视化CFTR蛋白。与化合物I.3 或化合物II.2一起培养的CFBE细胞增加了细胞ΔF508CFTR蛋白的量(见 图3A带“B”)。化合物I.3和化合物II.2也增加了ΔF508CFTR的糖基化形式 (图4A见带“C”)，说明这种蛋白质通过高尔基体的运输增加。化合物I.3 或化合物II.2在稳定ΔF508CFTR的作用可与已知的CFTR稳定剂VRT-325 相当或更好(图3B)。
然后，为检测不同浓度的化合物I.3和化合物II.2对ΔF508CFTR的作 用，进行了剂量响应实验。在1、2.5、5或10μM的Cpd.I.3或Cpd.II.2存 在下，CFBE细胞在37℃生长16小时。孵育后，从多种处理的细胞群落制 备细胞裂解物，将细胞裂解物溶于Laemmli缓冲液中，并加至SDS-PAGE。 通过上述蛋白质印迹可视化糖基化(带“C”)和非糖基化的(带“B”)ΔF508 CFTR蛋白的相对量(图4A和4C)。通过扫描和光密度测定定量带强度。 与无化合物时的蛋白质量比较，所有检测浓度(1-10μM)表现出在两种化合 物存在时糖基化和非糖基化的ΔF508CFTR蛋白的量的增加(见图4A和 4C)。从蛋白质印迹数据产生的剂量响应曲线表明，在此实验中，化合物I.3 (图4B)和化合物II.2(图4D)的有效性分别在1-2.5mM和2.5-5mM 时到达最大。
总之，这些数据表明在ypt1ts突变拯救筛选实验中确定的化合物可稳定 ΔF508CFTR蛋白，并因此可用于治疗囊性纤维化。
实施例5：恢复sar1ts突变株生长的化合物
sar1ts突变酵母菌株(ATCC，Manassas，VA)携带SAR1基因的温度敏 感突变等位基因，允许菌株在25℃生长，但在35℃或更高温度下生长停止。 在35℃的突变Sar1ts蛋白的失活阻止在ER的转运小泡的形成，导致ER至 高尔基体运输的阻断(Saito等人(1998)J.Biochem.(Tokyo)124(4)：816-823)。
为了确定拯救sar1ts突变表型的化合物，突变菌株首先在25℃在富集的 培养基中过夜。之后菌株稀释至含有2％葡萄糖的SC培养基中至OD600为 0.004，并与在有2％葡萄糖的SC培养基中多种稀释浓度的待测化合物(0.05 至50μM)混合。之后细胞在25℃或35℃孵育72小时。在检测化合物存 在与无检测化合物相比，OD600(酵母细胞浓度)的增加时，认为sar1ts拯救 突变表型。
除了对照化合物放线菌酮和潮霉素，使用上述实验确定拯救sar1ts突变 的表型的下列待测化合物：化合物I.1、化合物I.3、化合物I.5、和化合物I.6。 在此实验中没有检测化合物II.2、II.59、II.57、II.27、II.1、II.12、多柔比星、 和金担子素A的活性。
实施例6：使sec23ts突变株恢复生长的化合物
sec23-2ts突变酵母菌株携带SEC23基因的温度敏感突变等位基因，允许 菌株在25℃正常生长，但在30℃或更高生长停止。在限定温度，Sec23温 度敏感的突变蛋白的失活阻止在ER的转运小泡的形成，导致ER至高尔基 的运输阻断(见，例如Hicke等人(1989)EMBO J.8(6)：1677-1684和 Castillo-Flores等人(2005)J.Biol.Chem.280(40)：34033-34041)。
为了确定拯救sec23ts突变表型的化合物，突变菌株首先在25℃在富集 的培养基中过夜。之后菌株稀释至含有2％葡萄糖的SC培养基中至OD600 为0.004，并与在有2％葡萄糖的SC培养基中多种稀释浓度的待测化合物 (0.05至50μM)混合。之后细胞在25℃或35℃孵育24小时。在检测化 合物存在与无检测化合物相比，OD600的增加时，认为拯救sar23ts突变表型。
确定化合物I.1和化合物I.3可拯救ses23ts突变表型。在此实验中没有 检测化合物I.5、II.2、I.6、II.59、II.57、II.27、II.1、II.12、放线菌酮、多柔 比星、和金担子素A的活性。
其它实施方案
可以理解当本发明与其详细描述结合时，上述描述旨在说明，并不限制 本发明的范围。本发明的其它方面、优点和改变在所附的权利要求的范围内。
表I





表II











相关申请的交叉参考
本申请要求2006年1月26日提交的美国申请系列号60/762,955和2006 年11月9日提交的美国申请系列号60/857,940的优先权，每篇的内容在此 引入作为参考。