[0001] 本发明属于生物化学和医药技术领域，涉及一种能特异性靶向肺泡表面活性蛋白A(SP-A)的纳米抗体。

[0002] 20世纪初，诺贝尔奖获得者德国科学家Paul Ehrlich针对未来药物发展提出了“魔法子弹”这一想法，即理想的治疗药物能只选择性地破坏患病细胞而不影响健康细胞。在过去的几十年里，科学家们一直致力于探索这种理想药物的开发。

[0003] 20世纪70年代，靶向给药系统诞生，并在肿瘤治疗应用领域得到了迅速发展。据报道，目前在全球最畅销的抗癌药销售额中，靶向抗癌药物已占30%以上的份额，预测2015年将升至55%。同时，随着研究的逐步深入，新型靶向给药载体的不断出现及给药途径的拓宽，靶向药物的研究扩展至肿瘤以外的其他系统疾病的治疗中。

[0004] 呼吸系统疾病的靶向药物开发也是研究热点之一，目前主要集中在以下方面：1.通过吸入给药实现部分气道疾病的靶向治疗。

[0005] 例如，从20世纪50年代始，吸入激素逐渐用于哮喘和COPD的治疗。此后，随着吸入药物和装置的不断改进，目前吸入激素已成为哮喘和COPD治疗的主要措施。但吸入药物主要适用于气道疾病的局部治疗，而对于气道之外的肺实质和肺间质性疾病，吸入激素因生物利用度过低而疗效较差。

[0006] 2.通过药物载体实现药物的被动肺靶向。

[0007] 目前已有多种药物载体如脂质体、微粒、微球等用于肺靶向药物的研究。然而，这种被动靶向对组织器官的选择性差，无法避免肝脾等其他器官的大量截留，因此，仍未获得理想的靶向效果。

[0008] 由于配体-受体或抗原-抗体结合是人体内的一种特殊识别机制，据文献报道，利用该识别机制可实现药物的主动靶向，增强药物疗效，减少副作用。比如用紫杉醇脂质体与针对表皮生长因子的单克隆抗体制成的复合物，抗肿瘤效果较无单抗组增强25倍。因此，要实现理想的肺主动靶向，寻找具有高度特异性的肺组织靶向分子和制备高亲和力的靶向配体是最关键的因素。现有研究表明，在肺组织中，Ⅱ型肺泡上皮细胞是肺组织所特有的具有增殖和分泌功能的细胞，约占肺实质细胞总数的16%。Ⅱ型细胞能合成和分泌肺泡表面活性物质。肺泡表面活性物质的主要成份为脂质（90％）和蛋白(10％)，其中蛋白成份为特异性肺泡表面活性蛋白(surfactant protein ,SP)。目前按SP被发现的先后命名为 SP-A、SP-B、SP-C、SP-D，其中SP-A是最早发现且在Ⅱ型肺泡上皮细胞中强烈表达、信号最为丰富的蛋白，而在肺外表达量极少，表现为高度肺特异性，是一种理想的特异性肺组织靶向分子。

[0009] 理想的靶向配体除具有高亲和力外，还应具备分子量小、穿透力强、免疫原性弱的特点。抗原-抗体结合是最强的识别机制，因此，抗体是配体制备的首选。然而，完整的抗体分子虽亲和力高，但分子量大（相对分子量为150 000），组织穿透能力弱，免疫原性强，并不是理想的配体。随着抗体工程、基因工程等技术的发展，对抗体进行工程化改造而成的抗体片段（Fab、ScFv）现已具备了分子量小、免疫原性弱的优势，但相对完整抗体分子，其稳定性、亲和力均降低。

[0010] 1993年比利时科学家首次报道在骆驼类动物血中存在没有轻链的重链抗体(HCAbs)。该重链抗体的重链可变区（variable domain of heavy chains of HCAbs,VHH）具有完整、独立的抗原结合能力，若克隆该可变区，即可得到一个大小尺寸在纳米级别的单域抗体，又称纳米抗体(nanobodies®, Nbs)。纳米抗体作为配体具有许多优势：1）分子量小，组织穿透力强，亲和力高。它是目前已知分子量最小的抗体分子，其相对分子量仅为15000；穿透能力明显优于完整抗体分子，与特异抗原的亲和力达nmol级。2）结构稳定，即使在37℃放置一周或在高温条件(90℃)下保存,或在离液剂、蛋白酶和极性PH值等强变性条件下，均能保持高度稳定性。3）免疫原性小，其基因与人源VH基因Ⅲ家族序列具有较高的同源性，对人体的免疫原性弱,生物相容性好。由于纳米抗体的这些优势，现作为一种新型的抗体药物正在广泛研究。但其作为SP-A靶向配体及是否可实现肺靶向性的研究在国内外尚未见报导。

[0011] 本发明要解决的问题是提供一种肺靶向性的纳米抗体及其应用。

[0012]SP-A是最早发现且在Ⅱ型肺泡上皮细胞中强烈表达、信号最为丰富的蛋白，而在肺外表达量极少，表现为高度肺特异性，是一种理想的特异性肺组织靶向分子。本发明首次用SP-A作为抗原免疫羊驼，通过构建免疫抗体库，利用亲和淘筛对海量的抗体进行筛选确定具有特异性肺靶向的基因，然后采用原核表达的方法获得与SP-A具有高亲和力的纳米抗体。并通过动物体内、外实验验证了其可实现高度特异性肺组织靶向分布。

[0013] 本发明提供了一种靶向肺组织的纳米抗体，亦可称为SPA-Nb。所述的抗体含有如 Q(x)2LVESGG(x)2V (x)2G(x) SL(x) LS(x)24E (x)n2KG(x)4S(x)n3T(x)2Y(x) C(x)n4S(x)n5V(x)n6R（即SEQ ID NO 68）所示的氨基酸序列； x表示任意氨基酸；n2～n6为正整数；1≤n2≤21；1≤n3≤19；1≤n4≤50；1≤n5≤22；1≤n6≤8。

[0014] 较好的，17≤n2≤21；n3为18或者19；16≤n4≤50；17≤n5≤22； n6为8或者7。

[0015] 例如，所述的抗体含有如MQAQLAGQLQ LVESGGGLVQ PGGSLRLSCV xSGTISxYGM GWxRQAPGKG RExVSTIxSx GxTxxxxYYA DSVKGRFTIS RDNAKNTLYL QMNSLKPEDT AxYYCxLxGx xxxxxxxxxx xxxxxxxxxH RGQGxxxxxx xxxTQVTVSS xxEPKTPKPQ GPRGLAAAGA PVPYPDPLEP RAA（SEQ ID NO 69）所示的氨基酸序列；其中，x表示任意氨基酸。

[0016] 氨基酸的简写详见表1。

[0017] 表1 氨基酸的简写符号名称 三字母符号 单字母符号 名称 三字母符号 单字母符号
丙氨酸（alanine） Ala A 亮氨酸（leucine） Leu L
精氨酸（arginine） Arg R 赖氨酸(lysine) Lys K
天冬酰胺（asparagine） Asn N 甲硫氨酸（methionine） Met M
天冬氨酸（asparticacid） Asp D 笨丙氨酸（phenylalanine） Phe F
半胱氨酸（cysteine） Cys C 脯氨酸（proline） Pro P
谷氨酰胺（glutanine） Gln Q 丝胺酸（serine） Ser S
谷氨酸（glutamicacid） Glu E 苏氨酸（threonine） Thr T
甘氨酸（Glicine） Gly G 色氨酸（tryptophan） Trp W
组氨酸（histidine） His H 酪氨酸（tyrosine） Tyr Y
异亮氨酸（isoleucine） Ile I 颉氨酸（valine） Val V
更好地，所述的纳米抗体含有如Q（X1)LVESGG(X2)V(X3)G (X4)SL(X5) LS(X6) E (X 7) KG(X8) S(X 9) T(X10) Y(X11) C(X 12) S(X 13) V(X 14) R所示的氨基酸序列； 其中，
X1是LQ或者VK；
X2是GS、GL、GR、GM、RL或者GT；
X3是QA、QP、QI、AP或者EV；
X4是R、G或者E；
X5是K、N、R、M或者T；
X6 是 CTASGSDYRWMYIARFRQCPGKER、CAASGRAFSVYAVGWYRQIPGNQR、
CTASETTFEIYPMAWYRQAPGKQR、CAASGSDFSIYHMGWYRQAPGKQR、CAASGDIFTLASMGWYREDLHKKR、CEASGFTFDDYAIGWFRQAPGKER、CVALGFTLDGYAIGWFRQAPGKER、CTASKFHLDSYAVAWFRQTPGKER、CVVSGVTISNYGMTWVRQAPGKGL、CVVSGVTFNNYGMTWVRQAPGKGL、CVTSGFTFSRHDMSWVRQAPGKGP、CAASGFIFSRYDMGWVRQTPGKGR、CAASGIILNFYGMGWDRQTPGQGL、CTASEFTLDYHSIGWFRQAPGKER、CAASGRAFSVYAVGWYRQPPGKQR、CEVSGSRGSIYFSGWYRQAPGKQR、CVASGSMFNFYGMAWYRQAPGKQR或者RTFSGLYLHSSAFGWFPHVPREAR；
X7 是 GVAAIYTDDTDDSSPIYATSA、MVAAISSGGNTKYSDSV、LVAGINMISSTKYIDSV、LVAAITSGGSTNYADSV、LVAQLMSDGTANYGDSV、EVSCISHNGGTTNYADSV、KISCISSTGDSTNYDDSV、AVSFINTSDDVTYFADSV、WISTIYSNGHTYSADSV、WISSIYSNGHTYSADSV、WISGIGTSGTSGRYASSV、WVSGINSGGGRTYYADSV、GVSYVNNNGMTNYADSV、GVSCISYGDGTTFYTDSV、LVASITDGGSTNYADSV、LVASITSGGTTNYADSV、LVASIDSEGRTTNYPDSL或者GVAFLCNSGSDPIYLHPE；
X8是RFTI、RVTI、RFSI、RFTA、RFTV或者IFTL；
X9 是 QDKDKNAVYLQMNSPKPED、RDNDKNTMYLQMNSLKPED、SDNAKNTVYLQMNSLKPED、RDDVDTTVHLRMNTLQPSD、RDNAKNTVYLQMNGLKPED、RDTAKSTVFLQMNNLIPED、
RDNSKNTVYLQMNVLKPED、RDNANNTLYLQMNSLKPED、RDNAKNTLYLQMISLKPED、
RDNAKDTLYLQMDSLKPED、RDDDKATLYLSMDGLKPED、RDNAKNTMYLQMNSLKPED、
RDNAKNTVTLQMNSLKPED、RDNARNTAYLDMNSLKVED、RDNAKNTVYLQMNSLKPED、
RDDAKSTAYLQMNNLIPDD、RHCVKTVSPFEDNDTVEH、RDNAKNTLYLQMNSLKPED或者空白； X10是PT、AV、AD、AL、GL、AK、AN、AI、SV、GE、AM或者空白；
X11表示一个任意氨基酸残基或者空白；
X12 是 AARAFGGTWSLSSPDDFSAWGQGTQVTVS、NLDTTMVEGVEYWGQGTQVTVS、
NADGVPEYSDYASGPVYWGQGTQVTVS、YIHTSREITWGRGTQVTVSQGESSAPQSSAPQATVS、AGARSGLCVFFELQDYDYWGQGTQVTVS、GADLLARCGRVWYFPPDLNYRGQGTQVTVS、AAVRSPGPTGPSMQPMWSVPDLYDYWGQGTQVTVS、KLTGETHRGQGTQVTVS、KLVGETHRGQGTQVTVS、RLTGETYRGQGTQVTVS、TTGGVYSAYVQPRGKGTQVTVS、VRFTVKTPQGYYYLNDFDYWGQGTQVTVS、NVSAYTYRSNYYYPWGQANHVTVS、AASPGRLLLFRLCMSEDEYDFWGQGTQVTVS、
NANYGGSVLYNYWGPGTQVTVS、NIGRYGLGGSWGQGTQVTVS、NAFRGRMYDYWGQGTQVTVS、PTHLVITHPCICIPSAMDYRGKGTLVPLS或者空白；
X13 是 STNEVCKWPPRPCGRRCAGA、SHHSEDPGPRGLAAAGAP、SEPKTPKPQGPRGLAAAGAP、TEPKTPKPQGPRGLAAAGAP、SKPTTPKPRAPKALRPQ、SAHHSEDPGPRGLAAAGAP 或 者SQRKTRKAQGRARLADAGAP；
X14是PYPDPLEP、SGSAGTAC、PHADQMEQ、或者PRCRIRF。

[0018] 所述的“空白”是指该部分无相应氨基酸残基，可以缺失。

[0019] 在本发明的优选例中，所述的X11是Q、Y、H、V、或者F。

[0020] 在本发明的一个实施例中，所述的抗体含有如SEQ ID NO 37～SEQ ID NO 67所示的氨基酸序列。

[0021] 本发明还包括编码上述靶向肺组织的纳米抗体的核酸分子。

[0022] 在本发明的一个实施例中，所述的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO 6～SEQ ID NO 36所示。

[0023] 本发明的纳米抗体可以作为肺的靶向配体。可以将肺泡表面活性蛋白A作为肺靶向的特异性靶点。

[0024] 另一方面，本发明还提供了上述纳米抗体的制备方法。

[0025] 该方法依次包括以下步骤：（a）用肺泡表面活性蛋白A作为抗原免疫羊驼；
（b）筛选获得能与肺泡表面活性蛋白A具有高结合力的基因序列；
（c）对步骤（b）获得的基因序列进行蛋白诱导表达。

[0026] 其中，步骤（2）所述的筛选采用亲和淘筛的方法。

[0027] 所用的技术路线参见图8。

[0028] 具体而言，在本发明中，先采用基因合成、原核表达的方法制备高纯度的大鼠肺泡表面活性蛋白A(rSP-A)作为抗原免疫羊驼；通过分离免疫羊驼外周血淋巴细胞、提取RNA、6
cDNA合成、基因扩增等过程构建羊驼免疫抗体库，其库容量为5.7×10cfu；通过亲和淘筛及间接phage Elisa，最后获得能与rSP-A具有高结合力的31个克隆株，经测序分析表明均为VHH序列（纳米抗体序列）。

[0029] 从中选出结合力最好的Nb6，Nb17作为优选例，首先进行原核蛋白表达，得到分子量在170 000左右，大小为纳米级别的纳米抗体。在体外Werstern Blot 和Elisa实验中，Nb6，Nb17与rSP-A显示出良好的结合活性,进一步的免疫组化和动物体内显像结果则表明其能通过靶向肺组织中天然的SP-A而实现特异性肺靶向。

[0030] 也可以采用人工合成的方法获得本发明的纳米抗体的多肽。

[0031] 为了进一步优化本发明的纳米抗体，对筛选获得克隆株的多肽序列活性部分进行了分段试验。其中，采用人工合成的方法获得Nb6，Nb17的功能多肽（缺少MQAQKAG部分），结果显示，所得多肽仍具有较好的特异性肺靶向分布特质。

[0032] 为了更进一步验证所获得的31个纳米抗体序列时候均存在与大鼠肺泡表面活性蛋白A的结合活性剂肺靶向性，分别表达和纯化了除与、Nb17同一序列以外的其余21个克隆株蛋白，所有蛋白均可获得可溶性表达，表达量最少为Nb1，表达量为3mg/L,其余蛋白表达浓度平均为8mg/L。

[0033] 在对21个表达蛋白进行的Western blot及 Elisa检测中，均可见明显的结合活性，其中Nb9、Nb11、 Nb18、Nb19、Nb36、Nb32、Nb48等7个纳米抗体蛋白在Elisa检测中，OD450检测值达到阴性对照的5倍。

[0034] 组织免疫组化结果显示，这些克隆株具有较强结合性。所有的克隆均与阴性对照存在明显的差异性。

[0035] 小鼠体内靶向性检测显示，Nb9、Nb11、 Nb18、Nb19、Nb36、Nb32、Nb48等7个纳米抗体蛋白的靶向效果相似于Nb17，虽然聚集强度略有差异，但是都有明显的肺部聚集影像。

[0036] 同样，以Nb18和Nb36为代表，人工合成了相应的功能多肽（Nb36去除了N端MQAQLAV，Nb18去除了N端MQAQKAG部分），Western blot和免疫组化结果显示，结合活性未受影响。

[0037] 本发明提供了针对大鼠肺泡表面活性蛋白A（SP-A）的纳米抗体（SPA-Nb）。并经过多种方法验证，证明本发明所制备的SPA-Nb具有高度特异性肺靶向分布特质。本发明内容实施操作流程如图8所示。

[0038] 在本发明中， SPA-Nb编码序列指编码具有SPA-Nb蛋白的肺靶向活性的多肽的核苷酸序列，如序列号为SEQ ID NO. 37～ SEQ ID NO. 67的核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO. 37～ SEQ ID NO. 67序列的编码框中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。

[0039] 与氨基酸相对应的密码子详见图9。

[0040] SPA-Nb编码序列还包括能编码具有与SPA-Nb相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.37～ SEQ ID NO. 67序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

[0041] 一旦获得了SPA-Nb的编码序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

[0042] 此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，因为本发明的抑制因子的长度较短。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

[0043] 在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。

[0044] 如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA; 如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列; 如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于” 意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

[0045] 在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。

[0046] 本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的SPA或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达SPA或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的各类抗体可以利用SPA基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与SPA基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E. Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

[0047] 本发明提供了一种能特异性靶向肺泡表面活性蛋白A(SP-A)的纳米抗体。本发明中用大鼠SP-A作为抗原免疫羊驼，通过构建羊驼免疫抗体库及亲和淘筛的方法获得能与大鼠SP-A具有高结合力的基因序列，再通过原核表达载体对这些基因序列进行蛋白诱导表达，即得到分子量小，亲和力强的纳米抗体。随后使用免疫组化和大鼠体内显像的方法检测出所获得的纳米抗体存在高度特异性肺靶向性。因此，本发明在技术上涉及到特异性肺靶向纳米抗体的制备，为肺靶向配体的研究提供了新的思路，也为肺部疾病的靶向治疗提供重要工具。附图说明

[0048] 图1.大鼠肺泡表面活性蛋白A（rSP-A）的SDS-PAGE，Western Blot,Elisa检测。

[0049] 其中1A为：大鼠SP-A蛋白 SDA-PAGE：1,Mark;2,rSP-A。1B为：大鼠SP-A蛋白的Western Blot：1，rSP-A；2，Mark。1C为 Elisa检测:1,阴性蛋白；2, rSP-A。

[0050] 图2. 31个克隆蛋白编码序列对比。

[0051] 图3. Nb6,Nb17的SDS-PAGE。

[0052] 其中：M,Mark;1,Nb6;2,Nb17。

[0053] 图4. Nb17电镜图谱。

[0054] 图5. 纯化SPA-Nb的Western Blot，Elisa检测。

[0055] 5A为Western Blot：1,Nb6;2,Nb17。

[0056] 5B为Elisa检测: 1,Nb6;2,Nb17;3,阴性对照。

[0057] 图6. Nb6,Nb17与大鼠肺、心、肝、脾、肌肉快速冰冻切片的免疫组化 。

[0058] 图7.FITC标记的Nb17在小鼠体内不同时间点的全身显像。

[0059] 其中：A,尾静脉注射后15min;B, 尾静脉注射后1h;C, 尾静脉注射后2h;D,尾静脉注射后3h; E, 尾静脉注射后5h;F, 经鼻吸入后15min。

[0060] 图8. SPA-Nb的制备过程。

[0061] 图9.氨基酸相对应的密码子。

[0062] 本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。

[0063] 实施例1.大鼠肺泡表面活性蛋白A（rSP-A）的制备及鉴定1.1大鼠肺泡表面活性蛋白A（rSP-A）的制备
从NCBI基因库中搜索rSP-A基因序列（Rattus norvegicus Sftpa-1）的蛋白编码序列（CDS）。对其进行人工基因合成及测序验证，构建原核表达载体，以包涵体表达形式表达出相对分子量为26 000的rSP-A。通过镍柱亲和层析等方法纯化并用透析的方法复性及冷冻制备干粉备用（图 1A）。

[0064] 1.2. rSP-A的鉴定1.2.1 Western blot 检测
纯化的rSP-A经SDS-PAGE分离并电转移至硝酸纤维素膜。以5 g/L 脱脂奶粉封闭2 h , 依次滴加兔抗rSP-A多克隆抗体免疫血清 (室温2 h、PBS洗3 次) 及羊抗兔IgG-HRP血清染色(室温反应1 h、PBS 洗涤3 次),最后加底物DAB 显色并拍照显示目标条带为
26Kd,条带单一（图 1B）。

[0065] 1.2.2 Elisa检测Elisa检测纯化后蛋白质的免疫活性。分别用纯化的rSP-A蛋白、无关蛋白（GST）包被
96孔酶联吸附板，于4 ℃过夜。次日以3% 脱脂奶粉 37℃封闭1h，依次滴加兔抗rSP-A多克隆抗体(室温2 h、PBS洗3 次) 及羊抗兔IgG-HRP血清染色(室温反应1h、PBS 洗涤
3 次)，最后加底物TMB显色，硫酸终止反应，以酶标仪测量显色后各孔的OD值，结果显示：
与对照组比较，纯化rSP-A蛋白与SP-A多抗存在明显的结合活性(图 1C)。

[0066] 1.2.3蛋白质谱分析将冷冻后获得的rSPA蛋白干粉进行蛋白质谱分析，结果示其序列与原始基因序列完全吻合。

[0067] 实施例2.羊驼免疫及免疫效果检测2.1羊驼免疫
将所制备的rSP-A与等体积弗氏完全佐剂充分乳化后，对羊驼进行颈部皮下、四肢内侧皮下多点注射，免疫总剂量为1mg/次，此后每隔2周，同剂量与不完全弗氏佐剂混匀后进行5次加强免疫。收集每次免疫前及终免14天后的外周血10ml，分离血清，用于抗体滴度检测，同时，对初免前收集的血清进行纯化、分离，用于制备兔抗羊驼IgG多克隆抗体。

[0068] 2.2 兔抗羊驼IgG多克隆抗体血清制备将纯化获得的羊驼IgG与完全弗氏佐剂混匀后，对新西兰大白兔进行背部多点皮下注射，免疫剂量为200µg/只，之后每隔1周，免疫剂量减半与不完全弗氏佐剂混匀后加强免疫。共进行4次免疫，于终免14天后收集外周血，分离血清，并进行HRP标记，－50℃保存备用。

[0069] 2.3羊驼血清中rSP-A抗体水平检测用所制备的兔抗羊驼血清作为检测抗体，采用ELISA法检测羊驼抗rSPA抗体水平变化，结果显示免疫4次后抗体滴度维持在1:10,000水平。

[0070] 实施例3.羊驼免疫抗体库的构建及鉴定3.1外周血淋巴细胞总RNA提取及cDNA合成
收集终免14天后的羊驼外周血200ml，分离淋巴细胞，用Trizol Reagent试剂进行一步法提取总RNA，经超微量分光光度仪（Nanodrop spectrophotometer）测定其浓度为
1205ng/ul，OD260/OD280=1.82，总RNA经1 %琼脂糖凝胶电泳检测可见三条带，分别为28S，
18S，5S RNA，其中28S RNA比18S RNA条带亮，说明总RNA的完整性较好，适合进行cDNA合成。

[0071] 3.2 VHH基因扩增及酶切3.2.1基因扩增引物设计及扩增方案
以cDNA产物为模板，用引物VHH-LD与CH2-R进行第一次PCR扩增，反应体系均为50ul。
并用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测VHH基因片段的PCR产物，并于紫外灯下切胶，以胶回收试剂盒对回收片段进行纯化，纯化的产物片段再作为第二次PCR的反应模板，用两套引物进行PCR扩增两种亚型重链抗体VHH基因片段。引物设计如下：
3.3基因扩增产物酶切及VHH抗体库构建
3.3.1 基因扩增产物及噬菌粒pCANTAB 5E载体酶切
对上述PCR产物及噬菌粒pCANTAB 5E载体进行SfiⅠ限制性酶切消化。

[0072] 3.3.2 噬菌粒载体pCANTAB 5E与VHH基因连接经SfiⅠ限制性酶切消化的噬菌粒pCANTAB 5E载体及基因片段进行纯化和定量，并按载体:目的基因的质量比为1:3进行连接反应，16℃水浴中反应14h。

[0073] 3.3.3 VHH抗体文库构建将上述连接产物转化大肠杆菌TG1，并取出1ul转化液涂布，隔日计数生长的阳性克隆子为280个。从中随机挑取20个克隆进行菌液扩繁及测序，结果显示19个克隆含构建序列，且大部分序列均不同，可判断VHH重组片段插入率约为95%，该抗体库多样性较好。由此
5
计算VHH抗体库库容约为2.66×10 cfu。

[0074] 3.3.4辅助噬菌体M13KO7扩繁及滴度测定在2YT固体培养基上划线接种M13KO7辅助噬菌体。挑取相隔良好的噬菌斑进行扩繁。
对扩繁后的噬菌体原液按1:10，1:100，1:1000以此类推，进行倍比稀释进行滴度测定。

[0075] 并以噬菌斑数×稀释倍数×10来计算噬菌体滴度为3.8×1015pfu。

[0076] 3.3.5 VHH噬菌体抗体库表达及分离15
用上述滴度为10 pfu的辅助噬菌体M13KO7感染所构建的VHH抗体库，并用20% PEG8000-NaCl进行沉淀，无菌PBS悬浮沉淀，分离重组噬菌体颗粒，即VHH噬菌体文库。对
12
噬菌体文库库容进行测定，所获得的噬菌体文库滴度为3.5×10 。

[0077] 实施例4．rSPA特异性纳米抗体(rSPA-Nb)的筛选采用亲和淘洗技术，用rSP-A对VHH抗体库进行特异性筛选。

[0078] 4.1亲和淘洗的简化步骤：用rSP-A包被免疫管,4℃过夜。

[0079] PBS洗管3次，拍干。

[0080] 3%MPBS(3%脱脂牛奶加入PBS中)封闭，37℃孵育2 h，倾去封闭液，用PBS洗管3次，拍干。

[0081] 向封闭好的免疫管加入制备的噬菌体文库，2 ml/管，轻摇温育30 min后，再静置温育1.5h。

[0082] 弃管内噬菌体文库，用PBST洗涤3次，再用PBS洗涤3次，拍干。

[0083] 加入宿主菌TG1对结合噬菌体文库进行洗脱。此即完成第一轮淘筛，获得一级筛选抗体库。计算一级筛选抗体库输出量。

[0084] 重复上述淘筛步骤，进行循环淘筛，最终经过3轮淘筛，即获得三级筛选抗体库。

[0085] 4.2.间接Phage Elisa初步筛选抗原阳性纳米抗体:(1)挑取3轮淘筛后涂布在2YTAG平板上长出的单个菌落，接种至72孔培养板中，
30℃，振荡培养过夜。

[0086] (2)次日，另取72孔培养板，取400ul含辅助 M13K07至每孔，此板标为P1 Plate。

[0087] (3)从过夜培养的Master Plate上每孔取40ul培养液至P1 Plate，37 ℃振荡培养振荡培养过夜；1500g离心20 min，小心留上清待用，即为重组表达抗体。

[0088] (4)用rSP-A包被96孔酶标板。

[0089] (5)提前将上述重组抗体160μL与40μLMPBS混匀，室温孵育20 min。加入封闭好的酶标孔中，37℃结合反应2小时。

[0090] (6)洗涤及加酶标二抗：将酶标抗M13K07抗体用PBS做1:4000稀释，200ul/孔，37 ℃孵育反应1小时。

[0091] (7)加入200ul/孔TMB显色液，37 ℃孵育显色45 min左右显色及用100ul/孔终止液，终止显色，在450 nm处读值。初步筛选出与rSP-A特异性结合的阳性克隆株，读数大于阴性对照3倍视为阳性克隆株。

[0092] 经间接Phage Elisa初筛，与阴性对照比较，其中31个序列与抗原表现出3倍以上的结合力，视为初筛阳性克隆。

[0093] 实施例5.特异性(rSPA-Nb)的表达与纯化5.1 构建rSPA-Nb原核表达载体
将经Phage Elisa初筛阳性的31个克隆株送测序分析（图2）。挑选出结合值较低的6号(Nb6)和结合值较高的17号(Nb17)2个克隆株质粒，以携带BamHⅠ，XhoⅠ限制性酶切位点的上下游引物进行PCR扩增，经酶切后克隆至PET-30a质粒，送测序。

[0094] 5.2 纳米抗体的表达及纯化选定测序鉴定正确的重组质粒转化E.coli BL21（DE3），优化表达条件，选定25℃，以
0.8mmol/L IPTG 诱导表达蛋白，表达产物用镍柱亲和层析及Superdex 75柱进行纯化，其SDS-PAGE电泳显示所表达纳米抗体分子量为17kDa（图3）,纯化蛋白经BCA法测定其浓度分别为10mg/L、12mg/L。电镜下观察2个抗体的大小在纳米范围（图4）。

[0095] 本发明中所获得的31个克隆株的核苷酸序列和氨基酸序列因能特异性靶向肺泡表面活性蛋白A，可作为有效的肺靶向配体。其核苷酸序列及氨基酸序列如下：1）核苷酸序列表：
N0.1 ，即Nb1（SEQ ID NO 6）ATGCAGGCCCAGCTGGCCGGTCAGTTGCAGCTCGTGGAGTCCGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAAACTCTCCTGTACAGCCTCAGAAACCACGTTCGAGATCTATCCCATGGCCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAAGCAGCGCGAGTTGGTCGCGGGCATTAATATGATCAGTAGTACAAAGTATATAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGACAAGAACACGATGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGATACGGCCGTCTATTACTGTAATTTAGACACCACAATGGTGGAAGGTGTCGAGTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCCGCGCACCACAGCGAAGACCCCGGCCCCCGAGGCCTTGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCATAG
N0.2，即Nb2（SEQ ID NO 7）
ATGCAGGCCCAGCTGGCCGTTCAGTTGCAGCTCGTGGAGTCAGGGGGAGGCTTGGTGCAACCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGTAGTCTCTGGAGTCACCATCAGTAATTATGGTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGAAAGGGGCTCGAGTGGATCTCAACTATTTATAGTAATGGTCACACATACTCTGCGGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCAAGTATTATTGTAAATTGGTGGGAGAGACCCACCGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGAACCCAAGACACCAAAACCACAAGGCCCCCGAGGCCTTGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCATAGN0.3，即Nb3（SEQ ID NO 8）
ATGCAGGCCCAGCTGGCCGTTCAGTTGCAGCTCGTGGAGTCAGGGGGAGGCTTGGTGCAACCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGTAGTCTCTGGAGTCACCTTCAATAATTATGGTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGAAAGGGGCTCGAGTGGATCTCAAGTATTTATAGTAATGGTCACACATACTCTGCGGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAACAACACCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCAACTATTATTGTAAATTGGTGGGAGAGACCCACCGGGGCCAGGGGACCCAAGTCACCGTCTCCTCAGAACCCAACACACCAAAACCACAAGGCCCCCGAGGCCTTGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCATATACTGTTGAAAGTTGTTTAGCATAACCTCATACAGAAAATTCATTTACTAG
N0.4，即Nb4（SEQ ID NO 9）
ATGCAGGCCCAGCTGGCCGTTCAGTTGCAGCTCGTGGAGTCAGGGGGAGGCTTGGTGCAACCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGTAGTCTCTGGAGTCACCATCAGTAATTATGGTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGAAAGGGGCTCGAGTGGATCTCAACTATTTATAGTAATGGTCACACATACTCTGCGGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCAAGTATTATTGTAAATTGGTGGGAGAGACCCACCGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGAACCCAAGACACCAAAACCACAAGGCCCCCGAGGCCTTGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCATAGN0.6，即Nb6（SEQ ID NO 10）
ATGCAGGCCCAGCTGGCCGTTCAGTTGCAGCTCGTGGAGTCGGGAGGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTACAGCCTCCGAGATCACTTTGGATTATTATGTCATAGGCTGGTTCCGCCAGGCCCCAGGGAAGGAGCGTGAGCGCCTCTCATGTATTAGTAACAATGATGATAATGGCCACATTGAGCCTTCCGTCAAGGGCCGATTCGCTATTTCCAGAGACAGCGCCAAGAACACGCTGTGTCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGATTTTTGGCGTGCTATCTATAATGGGACCATATCTACTGGGGCCAGGGGAGCCAGGTCACCAGCTCCTCAGCGCACCACAGCGAAGACCCCGGCCCCCGAGGCCTTGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCATAG
N0.7，即Nb7（SEQ ID NO 11）
ATGTTCTTTCTATGCAGGCCCAGCTGGCCGGTCAGTTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAACCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGTAGTCTCTGGAGTCACCATCAGTAATTATGGTATGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGAAAGGGGCTCGAATGGATCTCAACTGTTTATAGTAATGGTCACACATACTATGCGGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCAAGTATTATTGTAAATTGACGGGAGAGACCCACCGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGAACCCAAGACACCAAAACCACAAGGCCCCCGAGGCCTTGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCATAG
N0.8，即Nb8（SEQ ID NO 12）
ATGCAGGCCAGCTGGCCGGTCAGTTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAACCTGGGGGGTCTCTGATGCTCTCCTGTGTAGTCTCTGGAGTCACCATCAGTAATTATGGTATGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGAAAGGGGCTCGAGTGGATCTCAACTATTTATAGTAATGGTCACACATACTATGCGGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCGCCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCAAGTATTATTGTAAATTGACGGGAGAGACCCACCGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGAACCCAAGACACCAAAACCACAAGGCCCCCGAGGCCTTGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCATAGN0.9，即Nb9（SEQ ID NO 13）
ATGTCCTTTCATGCAGGCCCAGCTGGCCGGTCAGTTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTACAGCCTCTGAATTCACTTTGGATTACCATTCCATAGGCTGGTTCCGCCAGGCCCCAGGGAAGGAGCGTGAGGGGGTCTCATGTATTAGTTATGGTGATGGTACCACATTTTATACAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGACTCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACAGCCGTTTATTACTGTGCAGCATCACCCGGTCGATTACTATTGTTCAGGCTATGTATGTCCGAGGATGAATATGACTTTTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGAACCCAAGACACCAAAACCACAAGGCCCCCGAGGCCTTGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCATAG
N0.11，即Nb11（SEQ ID NO 14）
ATGCAGGCCCAGCTGGCCGGTCAGTTGCAGCTCGTGGAGTCCGGGGGAGGCTTGGTGCAACCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGTAGTCTCTGGAGTCACCTTCAATAATTATGGTATGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGAAAGGGGCTCGAGTGGATCTCAACTATTTATAGTAATGGTCACACATACTATGCGGACTTCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGTTGTATCTGCAAATGATCAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCAAGTATTATTGTAGATTGACGGGAGAGACCTACCGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGAACCCAAGACACGAAAACCACAAGGCCCCCGAGGCCTTGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCATATACTGTTGAAAGTTGTTTAGCAAAACCTCATACAGAAAATTCATTTACTAG
N0.12，即Nb12（SEQ ID NO 15）
ATGCAGGCCCAGCTGGCCGGTCAGTTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAACCTGGGGGGTCTCTGATGCTCTCCTGTGTAGTCTCTGGAGTCACCATCAGTAATTATGGTATGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGAAAGGGGCTCGAGTGGATCTCAACTATTTATAGTAATGGTCACACATACTATGCGGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCGCCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCAAGTATTATTGTAAATTGACGGGAGAGACCCACCGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGAACCCAAGACACCAAAACCACAAGGCCCCCGAGGCCTTGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCATAGN0.13，即Nb13（SEQ ID NO 16）
ATGCAGGCCCAGCTGGCCGTTCAGTTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAACCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAATCATCTTGAATTTCTATGGGATGGGCTGGGACCGCCAGACTCCAGGCCAGGGGCTCGAGGGGGTCTCATATGTTAATAATAATGGTATGACAAACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACAATGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGACTATTACTGTAATGTGAGTGCATACACCTATAGGAGTAATTACTACTACCCCTGGGGCCAGGCAAACCACGTCACAGTCTCATCACAACGCAAGACACGAAAAGCACAAGGACGCGCACGCCTTGCGGACGCAGGTGCGCCGGTGCCGCATGCCGATCAGATGGAACAACGTGCCTCATAAACTGTTGAAAGTTGTTTATCAAATCCTCATATATAAAATTAATATACAAATTTCTATAAATACGATAAATCTTAAGATCGTTAG
N0.16，即Nb16（SEQ ID NO 17）
ATGCAGGCCCAGCTGGCCGGTCAGTTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAACCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGTAGTCTCTGGAGTCACCATCAGTAATTATGGTATGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGAAAGGGGCTCGAATGGATCTCAACTGTTTATAGTAATGGTCACACATACTATGCGGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCAAGTATTATTGTAAATTGACGGGAGAGACCCACCGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGAACCCAAGACACCAAAACCACAAGGCCCCCGAGGCCTTGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCATAGN0.17，即Nb17（SEQ ID NO 18）
ATGCAGGCCCAGCTGGCCGTTCAGTTGCAGCTCGTGGAGTCAGGGGGAGGCTTGGTGCAACCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGTAGTCTCTGGAGTCACCATCAGTAATTATGGTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGAAAGGGGCTCGAGTGGATCTCAACTATTTATAGTAATGGTCACACATACTCTGCGGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCAAGTATTATTGTAAATTGGTGGGAGAGACCCACCGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGAACCCAAGACACCAAAACCACAAGGCCCCCGAGGCCTTGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCATAGN0.18，即Nb18（SEQ ID NO 19）
ATGCAGGCCCAGCTGGCCGGTCAGTTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAACCTGGGGGGTCTCTGATGCTCTCCTGTGTAGTCTCTGGAGTCACCATCAGTAATTATGGTATGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGAAAGGGGCTCGAGTGGATCTCAACTATTTATAGTAATGGTCACACATACTATGCGGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCGCCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCAAGTATTATTGTAAATTGACGGGAGAGACCCACCGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGAACCCAAGACACCAAAACCACAAGGCCCCCGAGGCCTTGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCATAGN0.19，即Nb19（SEQ ID NO 20）
ATGTATTAGTTATGGTGATGGTACCACATTTTATACAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGACTCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACAGCCGTTTATTACTGTGCAGCATCACCCGGTCGATTACTATTGTTCAGGCTATGTATGTCCGAGGATGAATATGACTTTTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGAACCCAAGACACCAAAACCACAAGGCCCCCGAGGCCTTGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCATAG
N0.20，即Nb20（SEQ ID NO 21）
ATGCAGGCCCAGCTGGCCGTTCAGTTGCAGCTCGTGGAGTCGGGGGGAGGCTTGGTGCAACCTGGGGGGTCTCTGATGCTCTCCTGTGTAGTCTCTGGAGTCACCATCAGTAATTATGGTATGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGAAAGGGGCTCGAGTGGATCTCAACTATTTATAGTAATGGTCACACATACTATGCGGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCGCCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCAAGTATTATTGTAAATTGACGGGAGAGACCCACCGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGAACCCAAGACACCAAAACCACAAGGCCCCCGAGGCCTTGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCATAGN0.22，即Nb22（SEQ ID NO 22）
ATGCAGGCCCAGCTGGCCGGTCAGTTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGAAGAGCCTTCAGTGTGTATGCCGTGGGCTGGTATCGCCAGCCTCCAGGGAAGCAGCGCGAGCTGGTCGCGAGTATCACTGATGGTGGAAGCACAAACTATGCAGACTCGGTGAAGGGCCGATTCACCGTCTCCAGAGACAACGCCAGAAATACGGCGTACCTGGATATGAACAGCCTGAAAGTTGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTAATGCAAATTATGGGGGTAGTGTCCTATACAACTACTGGGGCCCGGGAACCCAAGTCACCGTCTCCACAGAACCCAAGACACCAAAACCACAAGGCCCCCGAGGCCTTGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCATAG
N0.25，即Nb25（SEQ ID NO 23）
ATGCAGGCCCAGCTGGCCGGTCAGTTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAACCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGTAGTCTCTGGAGTCACCATCAGTAATTATGGTATGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGAAAGGGGCTCGAATGGATCTCAACTGTTTATAGTAATGGTCACACATACTATGCGGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCAAGTATTATTGTAAATTGACGGGAGAGACCCACCGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGAACCCAAGACACCAAAACCACAAGGCCCCCGAGGCCTTGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCATAGN0.27，即Nb27（SEQ ID NO 24）
ATGCAGGCCCAGCTGGCCGTTCAGTTGCAGCTCGTGGAGTCAGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGAAGTCTCTGGAAGCAGAGGCAGTATCTATTTCTCGGGCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAAGCAGCGCGAGTTGGTCGCAAGTATTACTAGTGGTGGTACTACAAATTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTAATATAGGTCGATACGGATTGGGCGGGTCCTGGGGTCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGAACCCAAGACACCAAAACCACAAGGCCCCCGAGGCCTTGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCATAG
N0.28，即Nb28（SEQ ID NO 25）
ATGCAGGCCCAGCTGGCCGGTCAGTTGCAGCTCGTGGAGTCCGGTGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGAAGCCTCTGGCTTCACTTTCGACGATTATGCCATAGGCTGGTTCCGCCAGGCCCCAGGGAAGGAGCGTGAGGAGGTCTCATGTATTAGTCATAATGGAGGTACCACAAACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCTCCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACGGCCTGAAACCTGAGGACACAGCCAACTATTACTGTGCAGGCGCGCGTTCCGGACTATGTGTGTTTTTTGAGTTGCAAGATTATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGCGCACCACAGCGAAGACCCCGGCCCCCGAGGCCTTGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCATAG
N0.29，即Nb29（SEQ ID NO 26）
ATGCAGGCCCAGCCGGCCGTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGGTGTCCAGGCTCAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTACAGCCTCTGGATCAGACTACAGATGGATGTACATCGCCCGGTTTCGCCAATGTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAGCAATTTATACTGATGATACTGATGATAGTAGTCCGATCTATGCCACCTCCGCCAAGGGCCGATTCACCATCTCCCAAGACAAGGACAAGAACGCGGTATATCTGCAAATGAACAGCCCGAAACCTGAGGACACTGCCATGTACTACTGTGCGGCAAGAGCGTTCGGTGGTACCTGGAGCTTGAGCTCCCCGGACGACTTTAGTGCCTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGGAACGAATGAAGTATGCAAGTGGCCCCCGAGGCCTTGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCATAGN0.32，即Nb32（SEQ ID NO 27）
ATGCAGGCCCAGCTGGCCGGTCAGTTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTACAGCCTCTAAATTCCATTTGGATTCTTATGCCGTAGCCTGGTTCCGCCAGACCCCAGGGAAGGAGCGTGAGGCGGTCTCATTTATAAATACTAGTGATGATGTCACATACTTTGCTGACTCCGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACTCCAAGAACACGGTATATCTGCAAATGAACGTCCTGAAACCAGAAGACACTTCCGTTTATGTGTGTGCAGCGGTAAGAAGTCCCGGCCCTACCGGCCCTAGTATGCAGCCTATGTGGTCGGTGCCTGACCTGTATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGCGCACCACAGCGAAGACCCCGGCCCCCGAGGCCTTGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCATAG
N0.34，即Nb34（SEQ ID NO 28）
ATGCAGGCCCAGCTGGCCGTTCAGTTGCAGCTCGTGGAGTCCGGTGGAGGCACGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAACCTCTCCTGTGTAACTTCTGGATTCACCTTCAGTAGGCATGATATGAGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCCCGAGTGGATCTCAGGTATTGGTACTAGTGGTACAAGCGGACGTTATGCGAGCTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGGATACGCTGTATCTCCAAATGGATAGCCTGAAACCTGAAGACACGGGCCTATATTACTGCACGACCGGCGGCGTTTATAGCGCCTATGTACAACCCCGGGGCAAGGGGACGCAGGTCACCGTCTCCTCGGCGCACCACAGCGAAGACCCCGGCCCCCGAGGCCTTGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCATAG
N0.36，即Nb36（SEQ ID NO 29）
ATGCAGGCCCAGCTGGCCGTTCAGTTGCAGCTCGTGGAGTCGGGTGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGAAGAGCCTTCAGTGTGTATGCCGTGGGCTGGTACCGCCAGATTCCAGGGAATCAGCGCGAAATGGTCGCAGCTATTAGTAGCGGTGGTAACACAAAATACTCGGACTCCGTGAAGGGCCGCTTCACCGTCTCCTCAGAACCCAAGACACCAAAACCACAAGGCCCCCGAGGCCTTGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCATAG
N0.38，即Nb38（SEQ ID NO 30）
ATGCAGGCCCAGCCGGCCGTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGGTGTCCAGGCTCAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTACAGCCTCTGGATCAGACTACAGATGGATGTACATCGCCCGGTTTCGCCAATGTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAGCAATTTATACTGATGATACTGATGATAGTAGTCCGATCTATGCCACCTCCGCCAAGGGCCGATTCACCATCTCCCAAGACAAGGACAAGAACGCGGTATATCTGCAAATGAACAGCCCGAAACCTGAGGACACTGCCATGTACTACTGTGCGGCAAGAGCGTTCGGTGGTACCTGGAGCTTGAGCTCCCCGGACGACTTTAGTGCCTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGGAACGAATGAAGTATGCAAGTGGCCCCCGAGGCCTTGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCATAGN0.41，即Nb41（SEQ ID NO 31）
ATGCAGGCCCAGCTGGCCGGTCAGTTGCAGCTCGTGGAGTCGGGTGGAGGCATGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCATTTTCAGTCGCTATGACATGGGTTGGGTCCGCCAAACTCCAGGGAAGGGGCGCGAGTGGGTCTCAGGTATTAATTCTGGTGGTGGGCGTACATACTATGCGGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACGACGATAAGGCTACGTTGTATTTGTCAATGGACGGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCCTGTACCATTGTGTGAGATTCACCGTGAAAACGCCGCAAGGTTACTACTACCTGAACGATTTCGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCCGAACCCAAGACACCAAAACCACAAGGCCCCCGAGGCCTTGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCATA
N0.43，即Nb43（SEQ ID NO 32）
ATGCAGGCCCAGCTGGCCGGTCAGTTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGATTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAAGCGACTTCAGTATCTATCACATGGGCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAAGCAGCGCGAGTTGGTCGCAGCTATTACTAGTGGTGGTAGCACAAACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGTGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTCTATTATTGTAATGCAGATGGGGTCCCCGAGTATAGCGACTATGCCTCCGGCCCGGTGTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGCGCACCACAGCGAAGACCCCGGCCCCCGAGGCCTTGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCATAG
N0.45，即Nb45（SEQ ID NO 33）
ATGCAGGCCCAGCTGGCCGTTCAGTTGCAGCTCGTGGAGTCGGGTGGAGGCTTGGTGCAGGCTGGGGGGTCTCTGAGACTGTCCTGTGTGGCCTCTGGAAGTATGTTCAATTTCTATGGCATGGCCTGGTACCGGCAGGCTCCAGGGAAGCAGCGCGAGTTGGTCGCATCAATTGATAGTGAGGGTAGAACGACAAACTATCCAGACTCCCTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGGGACGACGCCAAGAGCACGGCGTATCTGCAAATGAACAACCTGATTCCTGACGACACGGCCGTCTATTACTGTAATGCCTTCCGAGGGAGGATGTATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGAACCCAAGACACCAAAACCACAAGGCCCCCGAGGCCTTGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCATAG
N0.46，即Nb46（SEQ ID NO 34）
ATGCAGGCCCAGCTGGCCGGTCAGTTGCAGCTCGTGGAGTCTGGTGGAAGGTTGGTTGCACCCGGGAGGTCTTTGAAACTCTCCCGGACCTTCTCTGGTCTCTATTTGCATTCAAGTGCCTTTGGCTGGTTTCCCCACGTTCCCAGGGAAGCGCGTGAAGGGGTTGCCTTCCTTTGTAATTCCGGTTCTGACCCAATATATTTACACCCCGAGAAGGGCATTTTCACTCTCTCCAGACACTGTGTCAAATGAACGGTTTCTCCGTTTGAGGACAACGATACTGTAGAACACACCCCTACTTATCAGTGCCCAACACATCTAG
N0.47，即Nb47（SEQ ID NO 35）
ATGCAGGCCCAGCTGGCCGGTCAGTTGCAGCTCGTGGAGTCGGGTGGAGGCAGGGTGCAGGCTGGGGGGTCTCTGACACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAGACATCTTCACTCTCGCTTCCATGGGATGGTATCGTGAAGATCTACACAAAAAGCGCGAGTTGGTGGCCCAACTGATGAGTGATGGTACCGCGAATTATGGAGATTCCGTGAAGGGCCGAGTCACCATCTCCAGAGACGACGTCGATACCACAGTGCATCTGCGAATGAATACCCTGCAACCGTCCGACACGGGAGAATATTTTTGTTATATCCATACTTCCCGCGAAATTACCTGGGGCCGGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCCAGGGAGAGTCCTCGGCGCCTCAGTCCTCGGCGCCTCAGGCCACCGTCTCCTCGGCGCACCACAGCGAAGACCCCGGCCCCCGAGGCCTTGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCATAG
N0.48，即Nb48（SEQ ID NO 36）
ATGCAGGCCCAGCTGGCCGGTCAGTTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCGAAGTTGGGGAGTCTCTGAGACTCTCCTGTGTAGCACTCGGATTCACTTTGGACGGGTATGCCATTGGCTGGTTCCGCCAGGCCCCGGGGAAGGAGCGTGAGAAAATCTCATGCATTAGTAGTACTGGCGATAGTACAAATTATGATGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACACTGCCAAGAGCACGGTGTTTCTGCAAATGAACAACCTGATACCTGAGGACACAGCCATTTATTACTGTGGCGCAGACCTCTTGGCGCGGTGTGGTCGTGTTTGGTACTTCCCGCCCGACCTTAATTACCGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTTTCTTCAGCGCACCACAGCGAAGACCCCGGCCCCCGAGGCCTTGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCATAG
2）氨基酸序列表：
(1) （SEQ ID NO 37）Nb1
1 MQAQLAGQLQ LVESGGGLVQ PGGSLKLSCT ASETTFEIYP MAWYRQAPGK QRELVAGINM
61 ISSTKYIDSV KGRFTISRDN DKNTMYLQMN SLKPEDTAVY YCNLDTTMVE GVEYWGQGTQ
121 VTVSSAHHSE DPGPRGLAAA GAPVPYPDPL EPRAA
(2) （SEQ ID NO 38）Nb2
1 MQAQLAVQLQ LVESGGGLVQ PGGSLRLSCV VSGVTISNYG MSWVRQAPGK GLEWISTIYS
61 NGHTYSADSV KGRFTISRDN AKNTLYLQMN SLKPEDTAKY YCKLVGETHR GQGTQVTVSS
121 EPKTPKPQGP RGLAAAGAPV PYPDPLEPRA A
(3) （SEQ ID NO 39）Nb3
1 MQAQLAVQLQ LVESGGGLVQ PGGSLRLSCV VSGVTFNNYG MSWVRQAPGK GLEWISSIYS
61 NGHTYSADSV KGRFTISRDN ANNTLYLQMN SLKPEDTANY YCKLVGETHR GQGTQVTVSS
121 EPNTPKPQGP RGLAAAGAPV PYPDPLEPRA AYTVESCLA
(4) （SEQ ID NO 40）Nb4
1 MQAQLAVQLQ LVESGGGLVQ PGGSLRLSCV VSGVTISNYG MSWVRQAPGK GLEWISTIYS
61 NGHTYSADSV KGRFTISRDN AKNTLYLQMN SLKPEDTAKY YCKLVGETHR GQGTQVTVSS
121 EPKTPKPQGP RGLAAAGAPV PYPDPLEPRA A
(6) （SEQ ID NO 41）Nb6
1 LQAQLAGQLQ LVESGGGLVQ PGGSLRLSCV VSGVTISNYG MTWVRQAPGK GLEWISTVYS
61 NGHTYYADSV KGRFTISRDN AKNTLYLQMN SLKPEDTAKY YCKLTGETHR GQGTQVTVSS
121 EPKTPKPQGP RGLAAAGAPV PYPDPLEPRA A
(7) （SEQ ID NO 42）Nb7
1 MQAQLAGQLQ LVESGGGLVQ PGGSLRLSCV VSGVTISNYG MTWVRQAPGK GLEWISTVYS
61 NGHTYYADSV KGRFTISRDN AKNTLYLQMN SLKPEDTAKY YCKLTGETHR GQGTQVTVSS
121 EPKTPKPQGP RGLAAAGAPV PYPDPLEPRA A
(8) （SEQ ID NO 43）Nb8
1 AGQLQLVESG GGLVQPGGSL MLSCVVSGVT ISNYGMTWVR QAPGKGLEWI STIYSNGHTY
61 YADSVKGRFT ASRDNAKNTL YLQMNSLKPE DTAKYYCKLT GETHRGQGTQ VTVSSEPKTP
121 KPQGPRGLAA AGAPVPYPDP LEPRAA
(9) （SEQ ID NO 44）Nb9
1 MQAQLAGQLQ LVESGGGLVQ PGGSLRLSCT ASEFTLDYHS IGWFRQAPGK EREGVSCISY
61 GDGTTFYTDS VKGRFTISRD NAKNTVTLQM NSLKPEDTAV YYCAASPGRL LLFRLCMSED
121 EYDFWGQGTQ VTVSSEPKTP KPQGPRGLAA AGAPVPYPDP LEPRAA
(11) （SEQ ID NO 45）Nb11
1 MQAQLAGQLQ LVESGGGLVQ PGGSLRLSCV VSGVTFNNYG MTWVRQAPGK GLEWISTIYS
61 NGHTYYADFV KGRFTISRDN AKNTLYLQMI SLKPEDTAKY YCRLTGETYR GQGTQVTVSS
121 EPKTRKPQGP RGLAAAGAPV PYPDPLEPRA A
(12) （SEQ ID NO 46）Nb12
1 MQAQLAGQLQ LVESGGGLVQ PGGSLMLSCV VSGVTISNYG MTWVRQAPGK GLEWISTIYS
61 NGHTYYADSV KGRFTASRDN AKNTLYLQMN SLKPEDTAKY YCKLTGETHR GQGTQVTVSS
121 EPKTPKPQGP RGLAAAGAPV PYPDPLEPRA A
(13) （SEQ ID NO 47）Nb13
1 MQAQLAVQLQ LVESGGGLVQ PGGSLRLSCA ASGIILNFYG MGWDRQTPGQ GLEGVSYVNN
61 NGMTNYADSV KGRFTISRDN AKNTMYLQMN SLKPEDTADY YCNVSAYTYR SNYYYPWGQA
121 NHVTVSSQRK TRKAQGRARL ADAGAPVPHA DQMEQRAS
(16) （SEQ ID NO 48）Nb16
1 MQAQLAGQLQ LVESGGGLVQ PGGSLRLSCV VSGVTISNYG MTWVRQAPGK GLEWISTVYS
61 NGHTYYADSV KGRFTISRDN AKNTLYLQMN SLKPEDTAKY YCKLTGETHR GQGTQVTVSS
121 EPKTPKPQGP RGLAAAGAPV PYPDPLEPRA A
(17) （SEQ ID NO 49）Nb17
1 MQAQLAVQLQ LVESGGGLVQ PGGSLRLSCV VSGVTISNYG MSWVRQAPGK GLEWISTIYS
61 NGHTYSADSV KGRFTISRDN AKNTLYLQMN SLKPEDTAKY YCKLVGETHR GQGTQVTVSS
121 EPKTPKPQGP RGLAAAGAPV PYPDPLEPRA A
(18) （SEQ ID NO 50）Nb18
1 MQAQLAGQLQ LVESGGGLVQ PGGSLMLSCV VSGVTISNYG MTWVRQAPGK GLEWISTIYS
61 NGHTYYADSV KGRFTASRDN AKNTLYLQMN SLKPEDTAKY YCKLTGETHR GQGTQVTVSS
121 EPKTPKPQGP RGLAAAGAPV PYPDPLEPRA A
(19) （SEQ ID NO 51）Nb19
1 MQAQLAGQLQ LVESGGGLVQ PGGSLRLSCT ASEFTLDYHS IGWFRQAPGK EREGVSCISY
61 GDGTTFYTDS VKGRFTISRD NAKNTVTLQM NSLKPEDTAV YYCAASPGRL LLFRLCMSED
121 EYDFWGQGTQ VTVSSEPKTP KPQGPRGLAA AGAPVPYPDP LEPRAA
(20) （SEQ ID NO 52）Nb20
1 MQAQLAVQLQ LVESGGGLVQ PGGSLMLSCV VSGVTISNYG MTWVRQAPGK GLEWISTIYS
61 NGHTYYADSV KGRFTASRDN AKNTLYLQMN SLKPEDTAKY YCKLTGETHR GQGTQVTVSS
121 EPKTPKPQGP RGLAAAGAPV PYPDPLEPRA A
(22) （SEQ ID NO 53）Nb22
1 MQAQLAGQLQ LVESGGGLVQ PGGSLRLSCA ASGRAFSVYA VGWYRQPPGK QRELVASITD
61 GGSTNYADSV KGRFTVSRDN ARNTAYLDMN SLKVEDTAVY YCNANYGGSV LYNYWGPGTQ
121 VTVSTEPKTP KPQGPRGLAA AGAPVPYPDP LEPRAA
(25) （SEQ ID NO 54）Nb25
1 MQAQLAGQLQ LVESGGGLVQ PGGSLRLSCV VSGVTISNYG MTWVRQAPGK GLEWISTVYS
61 NGHTYYADSV KGRFTISRDN AKNTLYLQMN SLKPEDTAKY YCKLTGETHR GQGTQVTVSS
121 EPKTPKPQGP RGLAAAGAPV PYPDPLEPRA A
(27) （SEQ ID NO 55）Nb27
1 MQAQLAVQLQ LVESGGGLVQ PGGSLRLSCE VSGSRGSIYF SGWYRQAPGK QRELVASITS
61 GGTTNYADSV KGRFTISRDN AKNTVYLQMN SLKPEDTAVY YCNIGRYGLG GSWGQGTQVT
121 VSSEPKTPKP QGPRGLAAAG APVPYPDPLE PRAA
(28) （SEQ ID NO 56）Nb28
1 MQAQLAGQLQ LVESGGGLVQ PGGSLRLSCE ASGFTFDDYA IGWFRQAPGK EREEVSCISH
61 NGGTTNYADS VKGRFSISRD NAKNTVYLQM NGLKPEDTAN YYCAGARSGL CVFFELQDYD
121 YWGQGTQVTV SSAHHSEDPG PRGLAAAGAP VPYPDPLEPR AA
(29) （SEQ ID NO 57）Nb29
1 MQAQPAVLAA LLQGVQAQVK LVESGGGSVQ AGGSLRLSCT ASGSDYRWMY IARFRQCPGK
61 EREGVAAIYT DDTDDSSPIY ATSAKGRFTI SQDKDKNAVY LQMNSPKPED TAMYYCAARA
121 FGGTWSLSSP DDFSAWGQGT QVTVSSGTNE VCKWPPRPCG RRCAGAVSGS AGTACRID
(32) （SEQ ID NO 58）Nb32
1 MQAQLAGQLQ LVESGGGLVQ PGGSLRLSCT ASKFHLDSYA VAWFRQTPGK EREAVSFINT
61 SDDVTYFADS VKGRFTISRD NSKNTVYLQM NVLKPEDTSV YVCAAVRSPG PTGPSMQPMW
121 SVPDLYDYWG QGTQVTVSSA HHSEDPGPRG LAAAGAPVPY PDPLEPRAA
(34) （SEQ ID NO 59）Nb34
1 MQAQLAVQLQ LVESGGGTVQ PGGSLNLSCV TSGFTFSRHD MSWVRQAPGK GPEWISGIGT
61 SGTSGRYASS VKGRFTISRD NAKDTLYLQM DSLKPEDTGL YYCTTGGVYS AYVQPRGKGT
121 QVTVSSAHHS EDPGPRGLAA AGAPVPYPDP LEPRAA
(36) （SEQ ID NO 60）Nb36
1 MQAQLAVQLQ LVESGGGLVQ PGGSLRLSCA ASGRAFSVYA VGWYRQIPGN QREMVAAISS
61 GGNTKYSDSV KGRFTVSSEP KTPKPQGPRG LAAAGAPVPY PDPLEPRAA
(38) （SEQ ID NO 61）Nb38
1 MQAQPAVLAA LLQGVQAQVK LVESGGGSVQ AGGSLRLSCT ASGSDYRWMY IARFRQCPGK
61 EREGVAAIYT DDTDDSSPIY ATSAKGRFTI SQDKDKNAVY LQMNSPKPED TAMYYCAARA
121 FGGTWSLSSP DDFSAWGQGT QVTVSSGTNE VCKWPPRPCG RRCAGAVSGS AGTACRIDC
(41) （SEQ ID NO 62）Nb41
1 MQAQLAGQLQ LVESGGGMVQ PGGSLRLSCA ASGFIFSRYD MGWVRQTPGK GREWVSGINS
61 GGGRTYYADS VKGRFTISRD DDKATLYLSM DGLKPEDTAL YHCVRFTVKT PQGYYYLNDF
121 DYWGQGTQVT VSSEPKTPKP QGPRGLAAAG APVPYPDPLE PRAA
(43) （SEQ ID NO 63）Nb43
1 MQAQLAGQLQ LVESGGGLVQ IGGSLRLSCA ASGSDFSIYH MGWYRQAPGK QRELVAAITS
61 GGSTNYADSV KGRFTISSDN AKNTVYLQMN SLKPEDTAVY YCNADGVPEY SDYASGPVYW
121 GQGTQVTVSS AHHSEDPGPR GLAAAGAPVP YPDPLEPRAA
(45) （SEQ ID NO 64）Nb45
1 MQAQLAVQLQ LVESGGGLVQ AGGSLRLSCV ASGSMFNFYG MAWYRQAPGK QRELVASIDS
61 EGRTTNYPDS LKGRFTISRD DAKSTAYLQM NNLIPDDTAV YYCNAFRGRM YDYWGQGTQV
121 TVSSEPKTPK PQGPRGLAAA GAPVPYPDPL EPRAA
(46) （SEQ ID NO 65）Nb46
1 MQAQLAGQLQ LVESGGRLVA PGRSLKLSRT FSGLYLHSSA FGWFPHVPRE AREGVAFLCN
61 SGSDPIYLHP EKGIFTLSRH CVKTVSPFED NDTVEHTPTY QCPTHLVITH PCICIPSAMD
121 YRGKGTLVPL SSKPTTPKPR APKALRPQVP RCRIRFR
(47) （SEQ ID NO 66）Nb47
1 MQAQLAGQLQ LVESGGGRVQ AGGSLTLSCA ASGDIFTLAS MGWYREDLHK KRELVAQLMS
61 DGTANYGDSV KGRVTISRDD VDTTVHLRMN TLQPSDTGEY FCYIHTSREI TWGRGTQVTV
121 SQGESSAPQS SAPQATVSSA HHSEDPGPRG LAAAGAPVPY PDPLEPRAA
(48) （SEQ ID NO 67）Nb48
1 MQAQLAGQLQ LVESGGGLVE VGESLRLSCV ALGFTLDGYA IGWFRQAPGK EREKISCISS
61 TGDSTNYDDS VKGRFTISRD TAKSTVFLQM NNLIPEDTAI YYCGADLLAR CGRVWYFPPD
121 LNYRGQGTQV TVSSAHHSED PGPRGLAAAG APVPYPDPLE PRAA
其中，SEQ ID NO 6～36与SEQ ID NO 37～67分别一一对应。

[0096] 实施例6. rSPA-Nb的肺靶向性检测为了进一步验证rSPA-Nb与天然大鼠肺泡表面活性蛋白A结合性及是否可实现特异性肺靶向效应，选用Western blot及 Elisa初步检测rSPA-Nb的抗原特异性，用免疫组化及活体内显影方法验证其体内肺靶向效应。

[0097] 6.1 Western blot及Elisa分析选用抗His单克隆抗体作为一抗对纯化的rSPA-Nb与抗原rSPA结合能力进行Western blot及Elisa验证（方法同1.2）。结果表明所表达的Nb6，Nb17与抗原rSPA存在明显结合特异性（图5A,B）。

[0098] 6.2免疫组化将大鼠新鲜肺、心、肝、脾、肾、肌肉等组织切片固定,滴加稀释的一抗（Nb6,Nb17为实验组，SPA多克隆抗体为阳性对照组，另-针对蒜氨酸酶的纳米抗体为阴性对照组），二抗为His-IgG-HRP。结果表明：Nb6,Nb17，SPA多克隆抗体（SPA-poly-ant）与大鼠肺组织存在明显的结合(棕色部分)，其中Nb17结合能力与SPA-poly-ant相似，而Nb6较Nb17弱，考虑因两者之间存在抗原结合位点的氨基酸序列不同有关。但三者均未见与大鼠心、肝、脾、肾、肌肉组织存在明显结合，阴性对照也未见结合（图6）。

[0099] 6.3 FITC标记的纳米抗体小鼠体内肺靶向性检测同源序列分析表明，大、小鼠rSPA的氨基酸序列存在高度的同源性，由于选用裸鼠易于进行体内显像，故体内靶向性检测实验动物为裸鼠。选取2周龄裸鼠，经腹腔麻醉后，尾静脉注射10ul经FITC标记的纳米抗体蛋白剂量为1mg/Kg动物体重，分别于注射后15min，
1h，2h，3h，5h显像观察其体内分布情况，同时，以鼻腔吸入作为肺靶向的阳性对照（图7）。
结果显示：在尾静脉注入后0.5h，FITC标记的纳米抗体即开始出现明显的肺部聚集，在注射后5h，仍可见明显的肺部聚集影像，其肺靶向效果与鼻部吸入所表面的肺靶向区域相似。

[0100] 人工合成Nb6,Nb17的功能多肽部分（缺少MQAQKAG部分），重复上述实验，发现人工合成的多肽同样能与抗原rSPA特异性结合，在动物水平试验中能在肺部特异性聚集。

[0101] 实施例7. 其它克隆株蛋白的表达及靶向性检测对筛选获得的31个序列进行同源性对比分析，Nb16、Nb25、Nb7、Nb6相似度较高，Nb17、 Nb4、 Nb2多肽序列相同，Nb20、Nb18、 Nb12、 Nb8相似度较高，其余序列均存在差异性。

[0102] 为了更进一步验证所获得的31个纳米抗体序列时候均存在与大鼠肺泡表面活性蛋白A的结合活性剂肺靶向性，按照实例5、6所述的方法，分别表达和纯化了除与、Nb17同一序列以外的其余21个克隆株蛋白，所有蛋白均可获得可溶性表达，表达量最少为Nb1，表达量为3mg/L,其余蛋白表达浓度平均为8mg/L。

[0103] 在对21个表达蛋白进行的Western blot及 Elisa检测中，均可见明显的结合活性，其中Nb9、Nb11、 Nb18、Nb19、Nb36、Nb32、Nb48等7个纳米抗体蛋白在Elisa检测中，OD450检测值达到阴性对照的5倍。组织免疫组化结果显示，这些克隆株具有较强结合性。所有的克隆均与阴性对照存在明显的差异性。

[0104] 小鼠体内靶向性检测显示，Nb9、Nb11、 Nb18、Nb19、Nb36、Nb32、Nb48等7个纳米抗体蛋白的靶向效果相似于Nb17，虽然聚集强度略有差异，但是都有明显的肺部聚集影像。