原发性支气管肺癌(简称肺癌)，是最常见的肺部原发性恶性肿瘤，在全世界肿瘤的发生率和患者因肿瘤死亡率的统计中居首位，约占癌症病人总数的18％。目前临床上常用的肺癌治疗药物有多种，包括紫杉碱类药物紫杉醇(paclitaxel)，拓扑异构酶II抑制药替尼泊苷(etoposide)、铂类化合物卡铂(carboplatin)和多西紫杉醇(docetaxel)等用于治疗非小型细胞肺癌(NSCLC)，虽有一定疗效，仍然差强人意，最重要的不足之处乃是，这些化疗药物仍不能严格区分肿瘤组织和正常组织，在使用过程中，常伴发多种毒副作用，严重者危及生命。
如果说肿瘤是攻向人身的一把利剑，肿瘤转移则堪称那最致命的一击。研究发现，肿瘤转移是90％的肿瘤病人死亡的原因，即使是在科学技术飞速发展，肿瘤的发生、治疗、诊断研究都有了长足进步的今天，肿瘤转移依然是癌症治愈率无法明显提升的最大绊脚石，肺癌也不例外。肿瘤组织每天向血液中释放癌细胞，脱落的癌细胞随血液或淋巴流布全身，一旦条件成熟，散落的癌细胞会像种子一样在身体的任何组织器官种植，并迅速生长起来，破坏脏器功能，最终导致病人死亡。而肺部由于淋巴组织分布广泛，血流运行丰富，肺癌细胞更容易发生远处病灶转移。肺癌转移可经过四个途径：①直接蔓延：肺癌可从支气管发生处沿支气管壁浸润生长，直接向其近侧或远侧端扩散，可侵至气管隆突平面，亦可空透支气管壁向肺实质浸润生长，进一步可达纵膈及胸膜。两层胸膜的种植性扩散，可侵及胸壁及横膈，或至食管和心包。②淋巴道转移：肺癌在早期就有可能发生淋巴道转移。一般小细胞癌比鳞癌转移要早且多见。淋巴道转移首先见于支气管肺淋巴结、肺门淋巴结、气管支气管旁淋巴结。由此可至纵膈淋巴结(这是远距离转移的指针)肺癌尸检病例约有半数可见腹膜后淋巴结转移。③血路转移：肺癌经血路转移，常引起全身广泛转移而致死亡，总死亡率为92％。特别是未分化型肺癌如小细胞癌、大细胞癌可早期发生血路转移，而鳞癌及腺癌则较晚。④种植性转移：体腔内器官的肿瘤蔓延至器官表面时，瘤细胞可以脱落并像播种一样，种植在体腔和体腔内各器官的表面，形成多数的转移瘤。这种转移方式称为种植性转移或播种，多发生于腹腔或胸腔内器官的癌瘤。肺癌也常在胸腔内形成广泛的种植性转移。值得注意的是，手术也可能造成肺癌种植转移。
恶性肿瘤在晚期多可转移到肺部，可以是血行播散、淋巴道转移或邻近器官直接侵犯。肺脏是恶性肿瘤最常见的转移部位之一，据统计，死于恶性肿瘤的患者中大约20％发生肺转移；肺转移瘤主要来源于乳腺癌、肾癌、结肠癌、直肠癌、骨肉瘤、恶性黑色素瘤、皮肤癌、软组织肉瘤等；一旦肺部出现转移时，肿瘤已属晚期。两侧肺出现广泛转移的病例已不可以外科治疗，对仅有单个转移结节，或虽有几个转移灶但均属限于一个肺叶或一侧肺内的少数肺转移瘤，才考虑手术治疗，所以对肺转移瘤的治疗是非常棘手的难题。
在1971年，Folkman提出肿瘤新生血管生成假说，认为“肿瘤生长依赖于血管生成，肿瘤血管生成是由于肿瘤分泌TAF(tumor angiogenesis factor)引起”，之后逐渐建立了一系列模型对该假说进行验证，并在实验基础上奠定了整个肿瘤新生血管生成的框架。许多重要的肿瘤血管生长因子和抗肿瘤血管生长因子陆续被发现，致使针对各种血管生成调节因子的药物研究方兴未艾。
在世界范围内约70余种抗血管生成药物进入临床研究。但临床研究结果表明，单用抗血管生成药物对肿瘤的疗效非常有限，就连Folkman研究小组发现的被寄予极大希望的抗血管生成因子Angiostatin和Endostatin也被FDA宣判了“死刑”。研究人员认为其中最关键的原因是瘤体内难以达到有效药物浓度，或不能长时间维持有效药物浓度。基因治疗药物，可以实现目的蛋白在人体内的长期稳定的表达，为解决上述问题提供了思路。国内李雷等以重组腺病毒(rAd)为载体，进行了Vasostatin基因治疗药物对胰腺癌生长的抑制作用研究(李雷，袁耀宗，章永平，乔敏敏，卢健。Vasostatin基因重组腺病毒载体的构建及其对胰腺癌生长的抑制作用。肿瘤，2004，24(6)：538-541)。陈红等以rAAV为载体，进行了血管抑素(angiostatin)基因治疗药物治疗大鼠脑胶质瘤的研究(陈红，佡剑非，任常山。重组腺相关病毒载体介导血管抑素基因治疗大鼠脑胶质瘤的实验研究。辽宁医学杂志，2005，19(3)：113-114)。迄今，尚无人采用rAAV载体介导Vasostatin、kallistatin和angiostatin进行肺癌的治疗报导，更没有进行抑制肺癌转移和肺转移瘤的报导。
因rAAV介导的外源基因能长期稳定表达，没有免疫反应或免疫反应极低，宿主范围广泛，成为最有前景的基因治疗载体之一。在肿瘤治疗方面，用rAAV携带p53、金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP1)、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)、干扰素(IFN)、内皮抑素和血管抑素等基因，在结肠癌、肺癌和肝癌等动物实验中显示了很好的抑制肿瘤发生、肿瘤血管形成和肿瘤生长作用，提高了动物的抗肿瘤免疫功能及其生存率。
发明人在前期研究中以肺靶向性rAAV为载体，进行了多种抗肿瘤血管生长因子，如Vasostatin、Angiostatin和Kallistatin等基因治疗药物对肺癌的动物试验研究。研究结果表明，以上基因治疗药物虽然能够抑制肺癌的生长，但仍不能实现根治肿瘤的目的。但令人惊喜的是，上述基因治疗药物可以大大降低肺癌转移和肺转移瘤的发生，为抑制肺癌转移和肺转移瘤提供了希望。
另外，抗肿瘤血管生长因子基因治疗的研究，均采用肌肉注射、静脉注射等系统给药的模式，生成的抗肿瘤血管生长因子在靶器官浓度低，不能较好地发挥靶器官肿瘤的治疗目的。血管生成既是肿瘤生长等病理过程，也是创伤修复、心血管功能等生理过程，非靶向的血管生成抑制也不可避免地会引起不良反应的发生。

本发明的目的即从解决目前尚无办法的肺癌转移和肺转移瘤为治疗目标，采用肺靶向性转染和表达的病毒载体，在肺局部长期表达抗肿瘤血管生长因子基因，积极地预防和治疗肺癌转移和肺转移瘤，而在其它器官无病毒载体的侵染，避免了不良反应的发生。
本发明公开了一种靶向性基因治疗药物，以rAAV载体介导Vasostatin、kallistatin和angiostatin对治疗肺癌效果很好，在进一步的研究中，发明人惊奇地发现，当病毒载体选用rAAV2/1、rAAV2/2或rAAV2/5，启动子选用CMV增强子/鸡β-actin启动子、CCT启动子或CC10启动子时，本发明的基因药物仅在肺部特异表达目的基因，不仅能有效治疗肺癌，并且对抑制肺癌的转移，以及对原发性肿瘤造成的肺转移瘤有很好的抑制作用，还有利于避免不良反应的发生。
本发明的靶向性基因治疗药物，由病毒载体介导抗肿瘤血管生长因子基因的表达，其特征是：病毒载体选自rAAV2/1、rAAV2/2或rAAV2/5；抗肿瘤血管生长因子基因选自Vasostatin、kallistatin或angiostatin；基因表达框的启动子选自CMV增强子/鸡β-actin启动子、CCT启动子或CC10启动子；转基因表达调控元件是WPRE(woodchuck hepatitis viruspost-transcriptional regulatory element)。其中基因表达框的启动子优选CCT启动子或CC10启动子。
在本发明采用的rAAV载体中，其基因表达框依次含有启动子、转基因、转基因表达调控元件、polyA尾巴，基因表达框两端为AAV2ITR(inverted terminal repeat sequence)。目的基因经合适酶切后，插入上述表达框中，得到表达质粒。经无辅助病毒多质粒法制备重组病毒，便得到本发明基因治疗药物。
不同血清型的rAAV，其衣壳蛋白虽然具有高度的同源性，但氨基酸序列的细微差异，决定了其细胞趋向性(tropism)的差别。细胞趋向性的差别，导致不同血清型的AAV转染细胞的类型和感染效率各有差异。本发明以rAAV2质粒为基因表达质粒，分别采用rAAV1-11辅助质粒进行包装，得到不同血清型的rAAV病毒。采用Lewis肺癌细胞(LLC)和人肺上皮细胞(HLEC)对rAAV的趋向性进行筛选，结果发现选用rAAV2/1，或rAAV2/2，或rAAV2/5作为肺靶向载体效果最好(见实施例3)。
启动子对基因表达的强弱发挥重要作用，并且具有细胞选择性。本发明采用293细胞，Lewis肺癌细胞(LLC)和人肺上皮细胞(HLEC)对不同的启动子进行筛选，确定选用CMV增强子/鸡β-actin启动子、CCT启动子(CTP：phosphocholine cytidylyltransferase promoter)、CC10启动子(Clara cell 10-kd promoter)(见药理学试验7)。
肺癌原位瘤模型小鼠经气管灌注本发明药物后，用药组原位瘤较对照组有所缩小，但无显著性差异。对照组在胸膜、纵隔腔淋巴结以及两侧肺均见明显的肺癌转移，但用药组小鼠的肺癌转移得到了显著的抑制。
本发明的基因药物的制备方法采用无辅助病毒多质粒法，即采用磷酸钙法将表达质粒与辅助质粒共转染293细胞，60-72小时后收获重组病毒，经层析纯化后备用。
本发明的基因药物给药途径优选用气管灌注或雾化后吸入的方式。
本发明的基因药物可以和药学上可接受的载体制备成各种制剂，优选喷雾剂或溶液剂。
本发明公开的基因药物可以单独使用，也可以合并使用。
下面是本发明的基因药物的部分药理学试验，其中VAS是vasostatin缩写，KAL是kallistatin缩写，AS是angiostatin的缩写，hm-LLC是high metastasis Lewis LungCarcinoma的缩写。
1.rAAV2/2-VAS对高转移性LLC(hm-LLC)皮下移植瘤向肺转移的抑制作用
hm-LLC为高转移性肺癌细胞，小鼠皮下接种后可形成偶发性转移肺癌模型。
用rAAV2/2-VAS体外转染hm-LLC细胞(MOI：5x104)后，皮下接种(5x106个细胞)到C57BL小鼠，采用PBS和rAAV2/2-eGFP为对照。
接种7天后，检查各组小鼠皮下移植瘤的血液供应情况。rAAV2/2-VAS组小鼠平均供血血管数为3.2±0.8，显著少于PBS和rAAV2/2-eGFP对照组(7.8±0.9和8.0±0.8)(p＜0.001，n＝5)。肿瘤组织切片(HE染色)显示对照组中存在多条含红细胞的腔道，而rAAV2/2-VAS组不存在此类腔道(见图1)。说明vasostatin抑制了皮下移植瘤的血管形成。
E-cadherin是与肿瘤细胞侵入性有关的一类细胞粘附因子，其表达下调表明肿瘤的转移倾向增加。肿瘤组织切片免疫染色显示(见图2)，rAAV2/2-VAS组E-cadherin的表达明显超过对照组，说明其转移倾向受到抑制。
接种21天后，rAAV2/2-VAS组皮下移植瘤体积为对照组的65％。
所有rAAV2/2-eGFP对照组小鼠的肺部，均出现了明显的转移性肺癌结节，平均结节数为20±10，所有对照组小鼠的结节数多于10个，而rAAV2/2-VAS组小鼠的肺部平均结节数为9±6(p＜0.05，n＝5)，其中3只小鼠的结节数少于10个。
以上结果说明：本发明的rAAV2/2-VAS对肿瘤血管生成具有抑制作用，限制了肿瘤的生长。更重要的是，该药可以有效降低肿瘤细胞的转移倾向，减少肺转移瘤的发生。
2.气管灌注rAAV2/1-CCT-KAL对A549肺癌原位瘤转移的抑制作用
因肿瘤细胞的移植位置对其生长有重要影响，肺癌原位瘤模型更能模拟人肺癌的发展情况。小鼠左肺注射A549细胞形成的肺癌原位瘤模型，可以观察原位癌的生长、侵入胸膜和纵膈淋巴结、并转移至对侧肺的过程。
在7周龄BALB/c裸鼠左肺注射A549细胞(1x106)后1周，经气管灌注rAAV2/1-CCT-KAL，剂量为3x1011vp/鼠。对照组为PBS或rAAV2/1-eGFP。
50天后，所有小鼠均生长了肺癌原位瘤，实验组和对照组的瘤体积无明显差异。但rAAV2/1-CC10-KAL组纵膈淋巴结重量仅为对照组的50％(p＜0.05，n＝8)。对照组所有小鼠(8/8)的右肺淋巴结数量均超过30个，而rAAV2/1-CCT-KAL组有3只(3/8)小鼠右肺淋巴结数量少于10个。
通过CD34免疫染色测定原位瘤的微血管密度(见图3)，结果显示rAAV2/1-CCT-KAL组的微血管密度仅为对照组的0.63(p＜0.05，n＝8)。
以上结果说明：气管灌注rAAV2/1-CCT-KAL后，对肿瘤血管生成具有抑制作用，降低了肺癌原位瘤向纵膈及对侧肺的转移的发生。
3.气管灌注rAAV2/5-CCT-VAS对皮下移植瘤术后肺转移的抑制作用
hm-LLC细胞(5x106)皮下接种到C57BL小鼠，待肿瘤长径达0.5cm左右时(1周后)，手术切除原位瘤，导致肿瘤细胞向肺转移加速。
术后当日小鼠经气管灌注rAAV2/5-CCT-VAS，剂量为2x1011vp/鼠。对照组为PBS或rAAV2/5-eGFP。
术后30日，所有对照组小鼠(n＝4)发生严重肺转移现象，出现血胸，肺中有转移结节，肿瘤体积大，血管丰富，且有出血现象。而rAAV2/5-VAS组中1只小鼠(1/4)没有发生肺转移现象，2只小鼠(2/4)仅出现少量肺中转移结节，平均肺增重较对照组降低40％。
每组有6只小鼠进行了生存时间实验，实验周期为治疗后10周。对照组平均生存时间为21天，rAAV2/5-CCT-VAS组为52天，延长2倍以上(见图4)。10周时对小鼠肺部进行光镜检查，治疗组中有1只小鼠未见肿瘤转移，但组织免疫检查发现该鼠肺血管周围有潜伏的微转移存在(见图5)，说明rAAV2/5-CCT-VAS对移植瘤术后肺转移的生长具有抑制作用。4.气管合并灌注rAAV2/5-CCT-VAS和rAAV2/5-CCT-AS对皮下移植瘤术后肺转移的抑制作用
实验方法同3，治疗组改为气管合并灌注rAAV2/5-CCT-VAS和rAAV2/5-CCT-AS，剂量为2x1011vp/鼠。对照组为PBS或rAAV2/5-eGFP。
术后30日，治疗组中1只小鼠(1/3)没有发生肺转移现象，2只小鼠(2/3)仅出现少量肺中转移结节，平均肺增重较对照组降低40％以上。
治疗组中半数生存时间超过10周(见图4)，10周时体重增加，行为正常。10周时对小鼠肺部进行光镜检查，治疗组中有4只小鼠未见肿瘤转移。但组织免疫检查发现肺血管周围有潜伏的微转移存在(见图5)，说明rAAV2/5-CCT-VAS和rAAV2/5-CCT-AS对移植瘤术后肺转移的生长具有抑制作用。
在气管用药后第4周和第10周对存活鼠肺部组织切片，检查angiostatin的表达(见图6)。在气管用药后第4周和第10周，在肺上皮细胞可见angiostatin的表达。
5.气管灌注rAAV2/1-CC10-VAS、rAAV2/1-CC10-AS、或二者合用对肺原位瘤转移的抑制作用
C57B6小鼠左肺实质注射LLC细胞(1x103)，3天后气管灌注治疗药或对照，剂量为2x1011vp/鼠。21天后，检查肺部及纵隔淋巴结，评价肺原位瘤及转移情况。
表1.各组肺原位瘤体积
  组别   肺原位瘤体积(mm3)   PBS   81.4±28.83   rAAV2/1-eGFP   73.39±16.60   rAAV2/1-CC10-VAS   60.3±28.0   rAAV2/1-CC10-AS   54.3±18.9   rAAV2/1-CC10-VAS和  rAAV2/1-CC10-AS   57.3±14.5

从表1可见治疗组肺原位瘤体积均小于对照组，但无显著性差异。
表2.各组纵隔淋巴结重量
  组别   纵隔淋巴结重量(mg)   PBS   138.4±33.2
  组别   纵隔淋巴结重量(mg)   rAAV2/1-eGFP   162.8±42.2   rAAV2/1-CC10-VAS   84.8±43.5*   rAAV2/1-CC10-AS   120.7±33.5   rAAV2/1-CC10-VAS和  rAAV2/1-CC10-AS   59.6±27.7**
*：p＜0.05；**：p＜0.01与PBS相比。
纵隔淋巴结重量是反映肺原位瘤转移的指标，从表2可见治疗组肺原位瘤转移明显得到了抑制。
6.气管灌注rAAV2/5-CC10-KAL后转基因在肺中的长期特异表达
正常小鼠气管灌注rAAV2/5-CC10-KAL，剂量为2x1011vp/鼠。1月后，取部分小鼠处死，RT-PCR法检查肺、心、肝、肾、小肠中Kallistatin的表达(图7)。可见仅肺部有Kallistatin的特异表达，其它脏器均未见表达。说明气管灌注rAAV2/5-CC10-AS后转基因的表达具有肺特异性，实现了靶向作用。
气管灌注rAAV2/5-CC10-KAL 1、2和3月后，RT-PCR法检查肺中Kallistatin的表达(图8)。可见肺部Kallistatin的特异表达可持续6个月以上。
7.不同启动子在HLEC肺上皮细胞的特异表达
以rAAV2/1-CC10-AS分别体外转染293细胞，HLEC细胞和LLC细胞(MOI＝104)，WesternBlot方法测定angiostatin的表达强弱(图9)。
从图9可以看出，rAAV2/1-CC10-AS在HLEC细胞的表达要强于293细胞和LLC细胞。
以rAAV2/5-CCT-AS体外转染293细胞，HLEC细胞和LLC细胞，也得到了类似的结果。
由上述药理试验可见，本发明的基因药物不仅具有肺靶向性，能治疗肺癌，更为重要的是本发明的基因药物能抑制肺癌转移和肺转移瘤。
附图说明
图1.小鼠皮下移植经rAAV2/5-VAS转染的hm-LLC 7天后肿瘤的组织切片(HE染色)。上图为PBS对照组，中图为rAAV2/5-eGFP对照组，下图为rAAV2/5-VAS治疗组。放大倍数200。对照组(上图和中图)中存在多条含红细胞的腔道，而rAAV2/2-VAS组(下图)不存在此类腔道。
图2.小鼠皮下移植经rAAV2/5-VAS转染的hm-LLC 7天后，肿瘤组织切片进行E-cadherin免疫染色。上图为PBS对照组，中图为rAAV2/5-eGFP对照组，下图为rAAV2/5-VAS治疗组。放大倍数400。rAAV2/5-VAS治疗组(下图)E-cadherin的表达明显增加。
图3.左图为rAAV2/1-eGFP对照组A549肺癌原位瘤免疫组化切片(CD34染色，放大倍数100)，右图为rAAV2/1-CCT-KAL治疗组A549肺癌原位瘤免疫组化切片(CD34染色，放大倍数100)。治疗组(右图)微血管密度明显低于对照组(左图)。
图4.手术切除hm-LLC皮下原位瘤后，各组的生存率比较(n＝6)。各组分别为rAAV2/5-CCT-VAS和rAAV2/5-CCT-AS治疗组(V+A，**)，rAAV2/5-CCT-VAS治疗组(V*)，rAAV2/5-eGFP对照组(G)，PBS对照组(P)。(*p＜0.05，**p＜0.01)
图5.手术切除hm-LLC皮下原位瘤后，肺组织切片检查微肿瘤转移(箭头为肺静脉周围存在的微肿瘤转移，放大倍数200)。上图为rAAV2/5-CCT-VAS治疗组，下图为rAAV2/5-CCT-VAS和rAAV2/5-CCT-AS治疗组。
图6.鼠肺部组织切片免疫组化分析angiostatin的表达(棕色染色)。上左图为rAAV2/5-CCT-VAS和rAAV2/5-CCT-AS治疗组4周时，上右图为rAAV2/5-CCT-VAS和rAAV2/5-CCT-AS治疗组10周时，下图为rAAV2/5-eGFP对照组4周时。放大倍数100。治疗组(上图)的肺气管表面上皮细胞中有明显的棕色染色，而对照组(下图)无。
图7.上图为气管灌注rAAV2/5-CC10-KAL 30天后，RT-PCR法检查肺(Lung 9，10)、心(heart 7，8)、肝(livet 5，6)、肾(kidney 3，4)、小肠(intestine 1，2)中Kallistatin的表达，含Kallistatin cDNA的质粒为阳性对照(PC)。下图为以18S rRNA为方法学对照。M为分子量标准。仅在肺中检出Kallistatin的表达。
图8.上图为气管灌注rAAV2/5-CC10-KAL 1月(1，2)，2月(3，4)和6月(5，6)后，RT-PCR法检查肺中Kallistatin的表达，含Kallistatin cDNA的质粒为阳性对照(PC)。下图为以18S rRNA为方法学对照，NC为阴性对照。M为分子量标准。
图9.293细胞，HLEC细胞和LLC细胞转染rAAV2/1-CC10-AS(MOI＝104)60后，WesternBlot方法测定angiostatin的表达。1为rAAV2/1-CC10-AS转染293细胞的上清液；2为rAAV2/1-CC10-AS转染HLEC细胞的上清液；3为rAAV2/1-CC10-AS转染LLC细胞的上清液；4为rAAV2/1-eGFP转染293细胞的上清液；5为rAAV2/1-eGFP转染HLEC细胞的上清液；6为rAAV2/1-eGFP转染LLC细胞的上清液。

实施例1
rAAV2/2-eGFP的制备
eGFP表达质粒的表达框的组成依次为：启动子为CMV增强子/鸡β-actin启动子，eGFPcDNA，polyA，WPRE。表达框两端为AAV2ITR。
采用磷酸钙无辅助病毒多质粒法制备重组病毒：将eGFP表达质粒，AV辅助质粒，与rAAV2辅助质粒共转染293细胞，60-72小时后收获细胞，用去氧胆酸钠(0.5％)和benzonase(30u/m1)裂解，离心(3000g 30min)去细胞碎片，氯化铯梯度离心，即得重组病毒rAAV2/2-eGFP，色谱层析法纯化。
实施例2
rAAV2/1-eGFP、rAAV2/3-eGFP、rAAV2/4-eGFP、rAAV2/5-eGFP、rAAV2/6-eGFP、rAAV2/7-eGFP、rAAV2/8-eGFP、rAAV2/9-eGFP、rAAV2/10-eGFP、rAAV2/11-eGFP的制备
参照实施例1步骤，将rAAV2辅助质粒分别换为rAAV1、rAAV3、rAAV4、rAAV5、rAAV6、rAAV7、rAAV8、rAAV9、rAAV10、rAAV11，其余操作同实施例1，得到11种不同血清型rAAV病毒。
实施例3
肺趋向性rAAV血清型的筛选
采用Real-PCR方法，测定实施例2得到的各种血清型rAAV的滴度。所用引物根据WPRE序列设计，分别为WPRE-F(5’-TGGCGTGGTGTGCACTGT)和WPRE-R(5’-GTTCCGCCGTGGCAATAG)。
将LLC细胞或HLEC细胞接种至24孔板，培养过夜。分别加入含实施例2得到的各种血清型rAAV病毒(MOI 104)的无血清培养基，孵育5小时后，用正常培养基替换。72小时后，用荧光显微镜观察，并用流式细胞仪进行细胞分类，并计算转导效率(n＝3)。
表3不同血清型rAAV对LLC细胞或HLEC细胞的转导效率
  rAAV血清型  LLC细胞转导效率(％)   HLEC细胞转导效率(％)   rAAV2/1   58   78   rAAV2/2   53   50   rAAV2/3   19   20   rAAV2/4   34   29   rAAV2/5   73   49   rAAV2/6   45   32   rAAV2/7   26   19   rAAV2/8   23   18   rAAV2/9   49   45   rAAV2/10   38   28   rAAV2/11   36   35

可见各种血清型rAAV对LLC细胞或HLEC细胞的转导效率均有所不同，但比较而言，rAAV2/1，rAAV2/2和rAAV2/5对LLC细胞或HLEC细胞的转导效率较高。
实施例4
rAAV2/2-VAS，rAAV2/1-VAS和rAAV2/5-VAS的制备
人vasostatin全长cDNA通过PCR由人肝第一链cDNA扩增。扩增vasostatin的专属引物为Vas-F(5’-AACTCGAGCCCGCCATGCTGCTATCC)和Vas-R(5’-AAAAGCTTCTAGTTGTCTGGCCGCACAAT)。限制性酶切位点CTCGAG(Xho I)和AAGCTT(HindIII)被引入以方便亚克隆，在引物Vas-R中引入了终止密码子CTA。PCR条件为94℃，50℃和68℃各45秒，共36循环。PCR产物经测序验证其正确性，并亚克隆至AAV-2表达载体上，获得rAAV2-VAS表达质粒。该表达质粒的启动子为CMV增强子/鸡β-actin启动子。为加强表达，在插入基因后，还引入了WPRE元件。
采用磷酸钙无辅助病毒多质粒法制备重组病毒：将该表达质粒，AV辅助质粒，与rAAV2辅助质粒共转染293细胞，60-72小时后收获细胞，用去氧胆酸钠(0.5％)和benzonase(30u/ml)裂解，离心(3000g 30min)去细胞碎片，氯化铯梯度离心，亲和层析纯化即得重组病毒rAAV2/2-VAS。
病毒制备时，将rAAV2辅助质粒分别替换为rAAV1辅助质粒和rAAV5辅助质粒，其余方法同上，则得到rAAV2/1-VAS和rAAV2/5-VAS病毒。
实施例5
rAAV2/1-CCT-VAS、rAAV2/2-CCT-VAS、rAAV2/5-CCT-VAS的制备
将实施例4表达质粒中CMV增强子/鸡β-actin启动子换为CCT启动子，其余步骤分别按照实施例4进行。
实施例6
rAAV2/1-CC10-VAS、rAAV2/2-CC10-VAS、rAAV2/5-CC10-VAS的制备
将实施例4表达质粒中CMV增强子/鸡β-actin启动子换为CC10启动子，其余步骤分别按照实施例4进行。
实施例7
rAAV2/2-KAL，rAAV2/1-KAL和rAAV2/5-KAL的制备
将实施例4表达质粒中目的基因vasostatin换为kallistatin，其余步骤分别按照实施例4进行。
实施例8
rAAV2/1-CCT-KAL、rAAV2/2-CCT-KAL、rAAV2/5-CCT-KAL的制备
将实施例5表达质粒中目的基因vasostatin换为kallistatin，其余步骤分别按照实施例5进行。
实施例9
rAAV2/1-CC10-KAL、rAAV2/2-CC10-KAL、rAAV2/5-CC10-KAL的制备
将实施例6表达质粒中目的基因vasostatin换为kallistatin，其余步骤分别按照实施例6进行。
实施例10
rAAV2/2-AS，rAAV2/1-AS和rAAV2/5-AS的制备
将实施例4表达质粒中目的基因vasostatin换为angiostatin，其余步骤分别按照实施例4进行。
实施例11
rAAV2/1-CCT-AS、rAAV2/2-CCT-AS、rAAV2/5-CCT-AS的制备
将实施例5表达质粒中目的基因vasostatin换为angiostatin，其余步骤分别按照实施例5进行。
实施例12
rAAV2/1-CC10-AS、rAAV2/2-CC10-AS、rAAV2/5-CC10-AS的制备
将实施例6表达质粒中目的基因vasostatin换为angiostatin，其余步骤分别按照实施例6进行。
实施例13
重组病毒rAAV2/5-CCT-AS溶液剂的制备
取氯化钠0.58g，枸橼酸钠0.58g，枸橼酸0.006g，20％人血白蛋白1ml，加入注射用水约80ml，溶解后，加注射用水至100ml，无菌过滤，得稀释用缓冲液(pH6.5-7.5)。
取实施例11方法制得的重组病毒rAAV2/5-CCT-AS病毒5x1014vp，加稀释用缓冲液至100ml，无菌过滤，即得。
实施例14
重组病毒rAAV2/1-CCT-KAL溶液剂的制备
取氯化钠0.58g，枸橼酸钠0.58g，枸橼酸0.006g，20％人血白蛋白1ml，加入注射用水约80ml，溶解后，加注射用水至100ml，无菌过滤，得稀释用缓冲液(pH6.5-7.5)。
取实施例8方法制得的重组病毒rAAV2/1-CCT-KAL病毒5x1014vp，加稀释用缓冲液至100ml，无菌过滤，即得。
实施例15
重组病毒rAAV2/5-CCT-VAS溶液剂的制备
取氯化钠0.58g，枸橼酸钠0.58g，枸橼酸0.006g，20％人血白蛋白1ml，加入注射用水约80ml，溶解后，加注射用水至100ml，无菌过滤，得稀释用缓冲液(pH6.5-7.5)。
取实施例5方法制得的重组病毒rAAV2/5-CCT-VAS病毒5x1014vp，加稀释用缓冲液至100ml，无菌过滤，即得。
实施例16
重组病毒rAAV2/1-CC10-VAS溶液剂的制备
取氯化钠0.58g，枸橼酸钠0.58g，枸橼酸0.006g，20％人血白蛋白1ml，加入注射用水约80ml，溶解后，加注射用水至100ml，无菌过滤，得稀释用缓冲液(pH6.5-7.5)。
取实施例6方法制得的重组病毒rAAV2/1-CC10-VAS病毒5x1014vp，加稀释用缓冲液至100ml，无菌过滤，即得。
实施例17
重组病毒rAAV2/5-CC10-KAL喷雾剂的制备
取氯化钠0.58g，枸橼酸钠0.58g，枸橼酸0.006g，20％人血白蛋白1ml，加入注射用水约80ml，溶解后，加注射用水至100ml，无菌过滤，得稀释用缓冲液(pH6.5-7.5)。
取实施例9方法制得的重组病毒rAAV2/5-CC10-KAL病毒5x1014vp，加稀释用缓冲液至100ml，无菌过滤，分装至喷雾剂容器中，即得。
实施例18
重组病毒rAAV2/1-CC10-AS溶液剂的制备
取氯化钠0.58g，枸橼酸钠0.58g，枸橼酸0.006g，20％人血白蛋白1ml，加入注射用水约80ml，溶解后，加注射用水至100ml，无菌过滤，得稀释用缓冲液(pH6.5-7.5)。
取实施例12方法制得的重组病毒rAAV2/1-CC10-AS病毒5x1014vp，加稀释用缓冲液至100ml，无菌过滤，即得。