人血浆培养基
阅读：522发布：2020-05-11
专利汇可以提供人血浆培养基专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且在一些方面，本文描述了可用于 哺乳动物 细胞的体外培养的细胞培养基。培养基含有在正常成人血液中发现的多种小有机化合物。还描述了将培养基用于多种目的的方法。还描述了 治疗 癌症的方法。，下面是人血浆培养基专利的具体信息内容。
1.基础培养基，包含：
至少9种蛋白质原氨基酸；
一种或多种维生素；
一种或多种无机离子；
葡萄糖；和
至少10种小有机化合物，选自4-羟基脯氨酸、乙酰甘氨酸、α-氨基丁酸盐、甜菜碱、肉毒碱、瓜氨酸、鸟氨酸、牛磺酸、2-羟基丁酸盐、3-羟基丁酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、甲酸盐、乳酸盐、丙二酸盐、丙酮酸盐、琥珀酸盐、丙酮、肌酸、肌酸酐、谷胱甘肽、甘油、尿素、半乳糖、果糖、次黄嘌呤和尿酸。
2.权利要求1的基础培养基，其中至少10种小有机化合物包括：
选自4-羟基脯氨酸、乙酰甘氨酸、α-氨基丁酸盐、甜菜碱、肉毒碱、瓜氨酸、鸟氨酸、牛磺酸的至少4种氨基酸或氨基酸衍生物；和
选自2-羟基丁酸盐、3-羟基丁酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、甲酸盐、乳酸盐、丙二酸盐、丙酮酸盐和琥珀酸盐的至少6种小有机化合物。
3.权利要求1或2的基础培养基，其中至少10种小有机化合物包括选自4-羟基脯氨酸、乙酰甘氨酸、α-氨基丁酸盐、甜菜碱、肉毒碱、瓜氨酸、鸟氨酸和牛磺酸的至少6种氨基酸或氨基酸衍生物。
4.前述权利要求之任一项的基础培养基，其中至少10种小有机化合物包括4-羟基脯氨酸、乙酰甘氨酸、α-氨基丁酸盐、甜菜碱、肉毒碱、瓜氨酸、鸟氨酸和牛磺酸。
5.前述权利要求之任一项的基础培养基，其中至少10种小有机化合物包括选自2-羟基丁酸盐、3-羟基丁酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、甲酸盐、乳酸盐、丙二酸盐、丙酮酸盐和琥珀酸盐的至少8种小有机化合物。
6.前述权利要求之任一项的基础培养基，其中至少10种小有机化合物包括选自丙酮、肌酸、肌酸酐、谷胱甘肽、甘油和尿素的至少3种小有机化合物。
7.前述权利要求之任一项的基础培养基，其中至少10种小有机化合物包括丙酮、肌酸、肌酸酐、谷胱甘肽、甘油和尿素。
8.前述权利要求之任一项的基础培养基，其中至少10种小有机化合物包括次黄嘌呤、尿酸或两者。
9.前述权利要求之任一项的基础培养基，其中至少10种小有机化合物包括半乳糖、果糖或两者。
10.前述权利要求之任一项的基础培养基，其中至少10种小有机化合物包括2-羟基丁酸盐、3-羟基丁酸盐、4-羟基脯氨酸、乙酸盐、丙酮、乙酰甘氨酸、α-氨基丁酸盐、甜菜碱、肉毒碱、柠檬酸盐、瓜氨酸、肌酸、肌酸酐、甲酸盐、果糖、半乳糖、谷胱甘肽、甘油、次黄嘌呤、乳酸盐、丙二酸盐、鸟氨酸、丙酮酸盐、琥珀酸盐、牛磺酸、尿素和尿酸。
11.前述权利要求之任一项的基础培养基，其中至少9种蛋白原氨基酸包括甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸和L-胱氨酸。
12.前述权利要求之任一项的基础培养基，其中一种或多种维生素包括以下维生素中的至少8种：D-生物素、胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、对氨基苯甲酸、D-泛酸、维生素B6、核黄素、硫胺素和维生素B12。
13.前述权利要求之任一项的基础培养基，其中一种或多种无机离子包括以下离子中的至少8种：Na+、K+、Ca2+、Mg2+、NH4+、Cl-、HCO3-、PO43-、SO42-和NO3-。
14.权利要求13的基础培养基，其中培养基中存在的每种所述离子的浓度在表1中对于该离子所列浓度的±50％内。
15.权利要求13的基础培养基，其中培养基中存在的每种所述离子的浓度在表1中对于该离子所列浓度的±25％内。
16.权利要求13的基础培养基，其中培养基中存在的每种所述离子的浓度在表1中对于该离子所列浓度的±10％内。
17.权利要求13的基础培养基，其中培养基中存在的每种所述离子的浓度是表1中对于该离子所列浓度。
18.前述权利要求之任一项的基础培养基，其中一种或多种无机离子包括Na+、K+、Ca2+、Mg2+、NH4+、Cl-、HCO3-、PO43-、SO42-和NO3-。
19.前述权利要求之任一项的基础培养基，其中一种或多种无机离子作为无机盐存在，并且至少6种无机盐选自CaCl2、KCl、MgCl2、MgSO4、NaCl、NaHCO3、Na2HPO4、Ca(NO3)2·4H2O和NH4Cl。
20.前述权利要求之任一项的基础培养基，其中表2中所列基础培养基中存在的每种组分的浓度在表2中对于该组分所列浓度的±50％内。
21.前述权利要求之任一项的培养基，其中表2中所列基础培养基中存在的每种组分的浓度在表2中对于该组分所列浓度的±25％内。
22.前述权利要求之任一项的基础培养基，其中表2中所列基础培养基中存在的每种组分的浓度在表2中对于该组分所列浓度的±10％内。
23.前述权利要求之任一项的基础培养基，其中表2中所列基础培养基中存在的每种组分的浓度以表2中对于该组分所列浓度存在。
24.前述权利要求之任一项的基础培养基，其中表2中所列每种组分存在于培养基中。
25.前述权利要求之任一项的基础培养基，还包含一种或多种抗生素、pH指示剂或两者。
26.包含前述权利要求之任一项的基础培养基的培养基，其中培养基还包含血清或血清替代物。
27.权利要求26的培养基，其中培养基包含1％至20％的血清。
28.权利要求27的培养基，其中培养基包含1％至5％的血清，或5％至10％的血清，或
10％至20％的血清。
29.权利要求27的培养基，其中培养基包含约10％的血清。
30.权利要求26～29之任一项的培养基，其中血清是胎牛血清。
31.权利要求26～30之任一项的培养基，其中血清是透析的血清。
32.权利要求26～31之任一项的培养基，其中血清是热灭活的血清。
33.试剂盒，其包含一个或多个容器，所述容器共同包含权利要求1～25的基础培养基或权利要求26～32的培养基的组分。
34.权利要求33的试剂盒，其中试剂盒包含至少两个容器，每个容器包含培养基的多个相互兼容的组分。
35.权利要求33或34的试剂盒，还包含用于制备培养基的说明书，用于在培养基中培养细胞的说明书，或两者。
36.制备权利要求1～25的基础培养基或权利要求26～32的培养基的方法，包括组合其各自的组分。
37.组合物，其包含权利要求1～25的基础培养基或权利要求26～32的培养基和一种或多种哺乳动物细胞。
38.权利要求37的组合物，其中哺乳动物细胞包括人细胞。
39.权利要求37或38的组合物，其中细胞包括血细胞。
40.权利要求37～39之任一项的组合物，其中细胞包括癌细胞。
41.权利要求1～25的基础培养基、权利要求26～32的培养基或权利要求37～40的组合物，还包含测试剂。
42.权利要求41的基础培养基、培养基或组合物，其中测试剂是小分子。
43.权利要求41或42的基础培养基、培养基或组合物，其中测试剂是化学治疗剂。
44.培养一种或多种哺乳动物细胞的方法，包括提供权利要求1～25的基础培养基、权利要求26～32的培养基或权利要求37～40的组合物，并在培养基中培养一种或多种哺乳动物细胞。
45.权利要求44的方法，其中所述一种或多种哺乳动物细胞包括人细胞。
46.权利要求44或45的方法，其中一种或多种哺乳动物细胞包括血细胞。
47.权利要求44～46之任一项的方法，其中一种或多种哺乳动物细胞包括癌细胞。
48.权利要求44～47之任一项的方法，还包括向培养基中加入测试剂。
49.表征哺乳动物细胞群体或细胞系的方法，包括：(a)在权利要求1～25的基础培养基或权利要求26～32的培养基中培养哺乳动物细胞群体或细胞系的一种或多种细胞；和(b)检测在培养基中培养的细胞的表型或获得用在培养基中培养的细胞进行的测定法的结果。
50.权利要求49的方法，还包括(c)在第二培养基中培养来自相同群体或细胞系的一种或多种细胞；(d)检测在第二培养基中培养的细胞的表型或获得用在第二培养基中培养的细胞进行的测定法的结果；和(e)将步骤(b)中检测到的表型与来自已经在第二培养基中培养的相同群体或细胞系的一种或多种细胞的表型进行比较，或者将测定法的结果与用来自已经在第二培养基中培养的相同群体或细胞系的一种或多种细胞进行的相同测定法的结果进行比较。
51.权利要求49或50的方法，其中方法包括检测从在第一培养基中培养的细胞获得的表型或测定法结果与从在第二培养基中培养的细胞获得的表型或测定法结果之间的差异。
52.权利要求49～51之任一项的方法，其中方法包括在培养基中培养细胞的部分或全部期间使细胞与测试剂接触。
53.权利要求52的方法，其中方法包括将在测试剂存在下在培养基中培养的细胞的表型与来自已经在测试剂存在下在第二培养基中培养的相同群体或细胞系的细胞的表型进行比较，或者将用在测试剂存在下在培养基中培养的细胞进行的测定法结果与用来自已经在测试剂存在下在第二培养基中培养的相同群体或细胞系的细胞进行相同测定法的结果进行比较。
54.权利要求50～53之任一项的方法，其中第二培养基是标准培养基。
55.权利要求49～54之任一项的方法，其中测定法是活力测定法、增殖测定法、细胞凋亡测定法、自噬测定法、报道子测定法或细胞毒性测定法。
56.表征测试剂的方法，包括：(a)在测试剂存在下，在权利要求1～25的基础培养基或权利要求26～32的培养基中培养一种或多种哺乳动物细胞；和(b)获得用细胞进行的测定法结果。
57.权利要求56的方法，还包括(c)在测试剂存在下在第二培养基中培养来自相同群体或细胞系的一种或多种细胞，和(d)获得用已经在第二培养基中培养的细胞进行的测定法结果。
58.权利要求56或57的方法，还包括将测定法的结果与用已经在测试剂存在下在第二培养基中培养的相同的群体或细胞系中的一种或多种细胞进行的相同测定法的结果进行比较。
59.权利要求56～58之任一项的方法，其中方法包括使细胞与测试剂接触至少24小时。
60.权利要求56～59之任一项的方法，其中第二培养基是标准培养基。
61.权利要求56～60之任一项的方法，其中方法包括检测从在测试剂存在下在第一培养基中培养的细胞获得的测定法结果与从在测试剂存在下在第二培养基中培养的细胞获得的测定法结果之间的差异。
62.权利要求49～61之任一项的方法，其中一种或多种细胞包括人细胞。
63.权利要求49～62之任一项的方法，其中一种或多种细胞包括血细胞。
64.权利要求49～63之任一项的方法，其中一种或多种细胞包括癌细胞。
65.权利要求56～64之任一项的方法，其中测定法是活力测定法、增殖测定法、细胞凋亡测定法、自噬测定法、报道子测定法或细胞毒性测定法。
66.权利要求56～65之任一项的方法，其中测试剂是小分子。
67.权利要求56～66之任一项的方法，其中测试剂是化学治疗剂。
68.治疗有需要的受试者的癌症的方法，包括向受试者施用以下一种或两种：(a)5-氟尿嘧啶(5-FU)或5-FU前药；(b)和尿酸降低剂，使受试者暴露于5-FU和尿酸降低剂。
69.权利要求68的方法，其中尿酸降低剂是尿酸酶。
70.权利要求69的方法，其中尿酸降低剂是促尿酸排泄剂，任选地其中促尿酸排泄剂是丙磺舒、苯溴马隆或磺吡酮。
71.权利要求70的方法，其中所述尿酸降低剂是氨氯地平、阿托伐他汀、非诺贝特，愈创甘油醚或莱茵拉德。
72.权利要求68～71之任一项的方法，其中5-FU前药是替加氟或卡培他滨。
73.权利要求68～72之任一项的方法，其中方法包括向已施用尿酸降低剂的受试者施用5-FU或5-FU前药。
人血浆培养基
[0001] 【相关申请的交叉引用】
[0003] 【政府支持】
[0004] 本发明是在国立卫生研究院授予的批准号R01CA103866和R37AI047389的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。【技术背景】
[0005] 开发了传统的合成细胞培养基以解决对大量介质的需求，其具有比诸如生物流体和组织提取物的天然介质更少的固有可变性(Freshney，2010)。在确定了两种细胞类型的最低营养需求(Eagle，1955a；1955b)后，Eagle在半个多世纪前制定了第一种标准化合成培养基之一Basal Medium Eagle(BME)(Eagle，1955c)。不久之后，Eagle开发了Minimal Essential Medium(MEM)(Eagle，1959)，并且在随后的十年中，Dulbecco和Freeman配制了DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)，最初用于培养小鼠胚胎细胞(Dulbecco和Freeman，1959)，以及和Moore及其同事开发了用于血细胞的RPMI 1640(Moore等，1967)。
[0006] 【发明概述】
[0007] 在一些方面，本公开内容提供了可用于培养哺乳动物细胞的细胞培养基。在一些实施方案中，本文描述的是基础培养基，包含：(a)至少9种蛋白质原氨基酸；(b)一种或多种维生素；(c)一种或多种无机离子；(d)葡萄糖；(e)至少10种小有机化合物，选自4-羟基脯氨酸、乙酰甘氨酸、α-氨基丁酸盐、甜菜碱、肉毒碱、瓜氨酸、鸟氨酸、牛磺酸、2-羟基丁酸盐、3-羟基丁酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、甲酸盐、乳酸盐、丙二酸盐、丙酮酸盐、琥珀酸盐、丙酮、肌酸、肌酐、谷胱甘肽、甘油、尿素、半乳糖、果糖、次黄嘌呤和尿酸。在一些实施方案中，至少10种小有机化合物包括：选自4-羟基脯氨酸、乙酰甘氨酸、α-氨基丁酸盐、甜菜碱、肉毒碱、瓜氨酸、鸟氨酸和牛磺酸的至少4种氨基酸或氨基酸衍生物；和选自2-羟基丁酸盐、3-羟基丁酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、甲酸盐、乳酸盐、丙二酸盐、丙酮酸盐和琥珀酸盐的至少6种小有机化合物。在一些实施方案中，至少10种小有机化合物包括至少选自4-羟基脯氨酸、乙酰甘氨酸、α-氨基丁酸盐、甜菜碱、肉毒碱、瓜氨酸、鸟氨酸和牛磺酸的6种氨基酸或氨基酸衍生物，并且在一些实施方案中，还包括选自2-羟基丁酸盐、3-羟基丁酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、甲酸盐、乳酸盐、丙二酸盐、丙酮酸盐和琥珀酸盐的至少4种小有机化合物。在一些实施方案中，至少10种小有机化合物包括4-羟基脯氨酸、乙酰甘氨酸、α-氨基丁酸盐、甜菜碱、肉毒碱、瓜氨酸、鸟氨酸和牛磺酸，并且在一些实施方案中，还包括选自2-羟基丁酸盐、3-羟基丁酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、甲酸盐、乳酸盐、丙二酸盐、丙酮酸盐和琥珀酸盐的至少6种小有机化合物。在一些实施方案中，至少10种小有机化合物包括选自2-羟基丁酸盐、3-羟基丁酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、甲酸盐、乳酸盐、丙二酸盐、丙酮酸盐和琥珀酸盐的至少8种小有机化合物，并且在一些实施方案中，还包括选自4-羟基脯氨酸、乙酰甘氨酸、α-氨基丁酸盐、甜菜碱、肉毒碱、瓜氨酸、鸟氨酸和牛磺酸的至少4种(或至少6种)氨基酸或氨基酸衍生物。在一些实施方案中，至少10种小有机化合物包括选自丙酮、肌酸、肌酸酐、谷胱甘肽、甘油和尿素的至少3、4、5或6种小有机化合物，并且在一些实施方案中，还包括组分的任何上述组合。
[0008] 在一些实施方案中，至少10种小有机化合物包括次黄嘌呤、尿酸或两者，并且在一些实施方案中，还包括组分的任何上述组合。
[0009] 在一些实施方案中，至少10种小有机化合物包括半乳糖、果糖或两者，并且在一些实施方案中，还包括组分的任何上述组合。
[0010] 在一些实施方案中，至少10种小有机化合物包括2-羟基丁酸盐、3-羟基丁酸盐、4-羟基脯氨酸、乙酸盐、丙酮、乙酰甘氨酸、α-氨基丁酸盐、甜菜碱、肉毒碱、柠檬酸盐、瓜氨酸、肌酸、肌酸酐、甲酸盐、果糖、半乳糖、谷胱甘肽、甘油、次黄嘌呤、乳酸盐、丙二酸盐、鸟氨酸、丙酮酸盐、琥珀酸盐、牛磺酸、尿素和尿酸。
[0011] 在一些实施方案中，至少9种蛋白原氨基酸包括甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸和L-胱氨酸。
[0012] 在一些实施方案中，所述一种或多种维生素包括以下维生素中的至少8、9、10或11种：D-生物素、胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、对氨基苯甲酸、D-泛酸、维生素B6、核黄素、硫胺素和维生素B12。
[0013] 在一些实施方案中，一种或多种无机离子包括以下离子中的至少8、9或10种：Na+、K+、Ca2+、Mg2+、NH4+、Cl-、HCO3-、PO43-、SO42-和NO3-。在一些实施方案中，培养基中存在的每种所述离子的浓度在表1中对于该离子所列浓度的约±50％内。在一些实施方案中，培养基中存在的每种所述离子的浓度在表1中对于该离子所列浓度的约±25％内。在一些实施方案中，培养基中存在的每种所述离子的浓度在表1中对于该离子所列浓度的约±10％内。在一些实施方案中，培养基中存在的每种所述离子的浓度在表1中对于该离子所列浓度的约±0.1％内。在一些实施方案中，每种所述离子存在于培养基中。
[0014] 在一些实施方案中，一种或多种无机盐包括选自以下的至少6、7、8或9种无机盐：CaCl2、KCl、MgCl2、MgSO4、NaCl、NaHCO3、Na2HPO4、Ca(NO3)2·4H2O和NH4Cl。
[0015] 在一些实施方案中，培养基中存在的表2中所列每种组分的浓度在表2中对于该组分所列浓度的约±50％内。在一些实施方案中，培养基中存在的表2中所列每种组分的浓度在表2中对于该组分所列浓度的约±25％内。在一些实施方案中，培养基中存在的表2中所列每种组分的浓度在表2中对于该组分所列浓度的约±10％内。在一些实施方案中，培养基中存在的表2中所列每种组分的浓度在表2中对于该组分所列浓度的约±0.1％内。在一些实施方案中，表2中所列每种组分存在于培养基中。
[0016] 在一些实施方案中，培养基包含一种或多种抗生素、pH指示剂或两者。
[0017] 在一些方面，本文描述了包含本文所述的确定组分的任何组合的培养基，其中所述培养基还包含血清或血清替代物。在一些实施方案中，培养基包含约1％至约20％的血清。在一些实施方案中，培养基包含约1％至约5％的血清或约5％至约10％的血清或约10％至约20％的血清。在一些实施方案中，培养基包含约10％的血清。在一些实施方案中，血清是胎牛血清。在一些实施方案中，血清是透析的血清。在一些实施方案中，血清是热灭活的血清。
[0018] 在一些方面，本文描述了包含一个或多个容器的试剂盒，所述容器共同包含培养基的组分。在一些实施方案中，试剂盒包含至少两个容器，每个容器包含培养基的多个相互兼容的组分。在一些实施方案中，试剂盒还包含用于制备培养基的说明书，用于在培养基中培养细胞的说明书或两者。
[0019] 在一些方面，本文描述了制备如本文所述的培养基的方法，包括组合其各自的组分。
[0020] 在一些方面，本文描述了包含本文所述的培养基和一种或多种哺乳动物细胞的组合物。在一些实施方案中，哺乳动物细胞包括人细胞。在一些实施方案中，细胞包括血细胞。在一些实施方案中，细胞包括癌细胞。
[0022] 在一些方面，本公开内容提供了使用本文公开的培养基培养细胞的方法。例如，本文描述了培养一种或多种哺乳动物细胞的方法，包括提供本文所述的培养基或组合物，以及在培养基中培养一种或多种哺乳动物细胞。在一些实施方案中，一种或多种哺乳动物细胞包括人细胞。在一些实施方案中，一种或多种哺乳动物细胞包括血细胞。在一些实施方案中，一种或多种哺乳动物细胞包括癌细胞。在一些实施方案中，方法还包括将测试剂添加到培养基中。
[0023] 在一些方面，本文描述了表征哺乳动物细胞群体或细胞系的方法，包括：(a)在本文描述的培养基中培养哺乳动物细胞群体或细胞系的一种或多种细胞；和(b)检测在培养基中培养的细胞的表型或获得用在培养基中培养的细胞进行的测定法的结果。在一些实施方案中，该方法还包括(c)在第二培养基中培养来自相同群体或细胞系的一种或多种细胞；(d)检测在第二培养基中培养的细胞的表型或获得用在第二培养基中培养的细胞进行的测定法的结果；和(e)将步骤(b)中检测到的表型与来自已经在第二培养基中培养的相同群体或细胞系的一种或多种细胞的表型进行比较，或者将测定法的结果与用来自已经在第二培养基中培养的相同群体或细胞系的一种或多种细胞进行的相同测定法的结果进行比较。在一些实施方案中，方法包括检测从在第一培养基中培养的细胞获得的表型或测定法结果与从在第二培养基中培养的细胞获得的表型或测定法结果之间的差异。在一些实施方案中，方法包括在培养基中培养细胞的部分或全部期间使细胞与测试剂接触。在一些实施方案中，方法包括将在测试剂存在下在培养基中培养的细胞的表型与来自已经在测试剂存在下在第二培养基中培养的相同群体或细胞系的细胞的表型进行比较，或者将用在测试剂存在下在培养基中培养的细胞进行的测定法结果与用已经在测试剂存在下在第二培养基中培养的相同种群或细胞系的细胞进行相同测定法的结果进行比较。在一些实施方案中，第二培养基是标准培养基。在一些实施方案中，测定法是活力测定法、增殖测定法、细胞凋亡测定法、自噬测定法、报道子测定法或细胞毒性测定法。
[0024] 在一些方面，本文描述了表征测试剂的方法，包括：(a)在测试剂存在下在如本文所述的培养基中培养一种或多种哺乳动物细胞；和(b)获得用细胞进行的测定法的结果。在一些实施方案中，方法还包括(c)在测试剂存在下在第二培养基中培养来自相同群体或细胞系的一种或多种细胞，和(d)获得用在第二培养基中培养的细胞进行的测定法的结果。在一些实施方案中，方法还包括将测定法的结果与用来自已经在测试剂存在下在第二培养基中培养的相同群体或细胞系的一种或多种细胞进行的相同测定法的结果进行比较。在一些实施方案中，方法还包括使细胞与测试剂接触至少约24小时。在一些实施方案中，第二培养基是标准培养基。在一些实施方案中，方法包括检测从在测试剂存在下在第一培养基中培养的细胞获得的测定法结果与从在测试剂存在下在第二培养基中培养的细胞获得的测定法结果之间的差异。在一些实施方案中，一种或多种细胞包括人细胞。在一些实施方案中，一种或多种细胞包括血细胞。在一些实施方案中，一种或多种细胞包括癌细胞。在一些实施方案中，测定法是活力测定法、增殖测定法、细胞凋亡测定法、自噬测定法、报道子测定法或细胞毒性测定法。在一些实施方案中，测试剂是小分子。在一些实施方案中，测试剂是化学治疗剂。
[0025] 在一些方面，本公开内容提供了鉴定可能影响治疗剂的功效的物质(例如代谢物)的方法。
[0026] 在一些方面，本公开内容提供了调控哺乳动物细胞中UMP合酶(UMPS)的活性的方法，方法包括使细胞与调控尿酸水平的试剂接触。在一些实施方案中，试剂增加尿酸水平，从而降低UMPS的活性。在一些实施方案中，试剂降低尿酸水平，从而增加UPMS的活性。在一些实施方案中，将尿酸调控剂施用于哺乳动物受试者。
[0027] 在一些方面，本文描述了治疗有需要的受试者的癌症的方法，包括向受试者施用以下一种或两种：(a)5-氟尿嘧啶(5-FU)或5-FU前药；(b)和尿酸降低剂，使受试者暴露于5-FU和尿酸降低剂，例如使得5-FU或5-FU前药和尿酸降低剂在活性和/或效果上重叠。在一些实施方案中，尿酸降低剂是尿酸酶。在一些实施方案中，尿酸降低剂是促尿酸排泄剂，任选地其中促尿酸排泄剂是丙磺舒、苯溴马隆或磺吡酮。在一些实施方案中，尿酸降低剂是氨氯地平、阿托伐他汀、非诺贝特，愈创甘油醚或莱茵拉德。在一些实施方案中，5-FU前药是替加氟或卡培他滨。在一些实施方案中，方法包括向已施用尿酸降低剂的受试者施用5-FU或5-FU前药。【附图说明】
[0029] 图1A描绘了与成人血浆中的那些相比，BME、MEM、DMEM和RPMI 1640的指定组分的相对浓度的热图(log2-转化的倍数变化)。培养基中不存在的组分被标记为不存在。关于多种常规培养基中所有代谢物的浓度，参见表4。图1B是描绘培养和体内细胞暴露于其中的不同代谢环境的示意图。图1C描绘了人血浆样培养基(HPLM)的组分。绿色框所示组分的浓度反映了成人血浆中的浓度。HPLM的详细配方列于表2中。图1D描绘了与人血浆中的那些相比，所表示的培养基和小鼠血浆中所指定组分的相对浓度的热图(log2-转化的倍数变化)。N/D，无法确定倍数变化值。RPMI+IFS：具有5mM葡萄糖和10％IFS的RPMI 1640。RPMI+dIFS：具有
5mM葡萄糖和10％透析的IFS的RPMI 1640。HPLM+dIFS：含有10％透析IFS的HPLM。*通过所用的代谢物分析方法，在介质样品中不容易检测到以下代谢物：乙酸盐、丙酮、半胱氨酸、甲酸+IFS +dIFS
盐、半乳糖、谷胱甘肽和丙二酸盐。图1E描绘了在RPMI (深灰色)、RPMI (浅灰色)或
HPLM+dIFS(绿色)(左)中培养的六种血液癌细胞系的比生长速率(平均值±SD，n＝3)。使用自然对数转换的生长曲线计算比生长速率(μ)(右)。细胞系代表以下血液学癌症：K562(慢性髓性白血病)、KMS12BM(多发性骨髓瘤)、NOMO1(急性髓性白血病)、P12-Ichikawa(T细胞急性淋巴细胞白血病)、SEM(B细胞急性淋巴细胞白血病)、SUDHL4(B细胞淋巴瘤)。
5mM葡萄糖和10％透析的IFS的RPMI 1640。HPLM+dIFS：含有10％透析IFS的HPLM。*通过所用的代谢物分析方法，在介质样品中不容易检测到以下代谢物：乙酸盐、丙酮、半胱氨酸、甲酸+IFS +dIFS
盐、半乳糖、谷胱甘肽和丙二酸盐。图1E描绘了在RPMI (深灰色)、RPMI (浅灰色)或
HPLM+dIFS(绿色)(左)中培养的六种血液癌细胞系的比生长速率(平均值±SD，n＝3)。使用自然对数转换的生长曲线计算比生长速率(μ)(右)。细胞系代表以下血液学癌症：K562(慢性髓性白血病)、KMS12BM(多发性骨髓瘤)、NOMO1(急性髓性白血病)、P12-Ichikawa(T细胞急性淋巴细胞白血病)、SEM(B细胞急性淋巴细胞白血病)、SUDHL4(B细胞淋巴瘤)。
[0030] 图2A描绘了与在RPMI+IFS(前六行)或RPMI+dIFS(下六行)中相比，在HPLM+dIFS中培养后相对细胞内代谢物浓度的热图。在每组中，代谢物通过前六行的平均log2-转化的倍数变化进行分类(n＝3)。N/D，倍数变化值无法确定，因为在一种或多种培养基中培养后不易检测到代谢物。为了包括在热图中，代谢物必须在六种细胞系中的至少四种中测量倍数变化。代谢物缩写见表6。图2B描绘了与在RPMI+IFS(蓝色)或RPMI+dIFS(红色)中相比，在HPLM+dIFS中培养后(通过显示的方程式计算)的能量电荷值(平均值±SD，n＝3)。图2C描绘了与在RPMI+IFS(蓝色)或RPMI+dIFS(红色)中相比，在HPLM+dIFS中培养后的细胞内GSH/GSSG比率(平均值±SD，n＝3，*p＜0.05)。图2D描绘了与RPMI+IFS(蓝色)或RPMI+dIFS(红色)中相比，在HPLM+dIFS中培养后的细胞内乳酸盐/丙酮酸盐比率(平均值±SD，n＝3，*p＜0.05)。
[0031] 图3A是描绘将13C从葡萄糖掺入从糖酵解分枝并进入丙酮酸的途径，以及来自丙酮酸和乙酰-CoA的葡萄糖衍生的碳的多种命运(包括进入TCA循环)的示意图。G1P：葡萄糖1-磷酸。G6P：葡萄糖-6-磷酸。F6P：果糖-6-磷酸。DHAP：磷酸二羟丙酮。GPC：甘油磷酸胆碱。PDH：丙酮酸脱氢酶。LDH：乳酸脱氢酶。GPT：丙氨酸氨基转移酶。图3B描绘了在RPMI+IFS(深灰+dIFS 13
色)或HPLM (绿色)中细胞培养后用三个 C(M3)加标签的丙酮酸的级分(平均值±SD，n
＝3)(左)。通过基于LC/MS的代谢物谱分析测量的RPMI+IFS和HPLM+dIFS中丙酮酸的浓度(n＝
4)(右)。图3C描绘了在RPMI+IFS(深灰色)或HPLM+dIFS(绿色)中培养细胞后用两个13C(M2)加标签的柠檬酸盐的级分(平均值±SD，n＝3；*p＜0.0001)。图3D描绘了在RPMI+IFS(深灰色)或HPLM+dIFS(绿色)中培养细胞后用6个13C(M6)加标签的F6P/G1P的级分(平均值±SD，n＝3；*p＜0.0001)。图3E描绘了在RPMI+IFS(深灰色)或HPLM+dIFS(绿色)中培养细胞后用三个13C(M3)加标签的丙氨酸的级分(平均值±SD，n＝3；*p＜0.0001)。图3F描绘了在RPMI+IFS(深灰色)或HPLM+dIFS(绿色)中培养细胞后用三个13C(M3)加标签的GPC的级分(平均值±SD，n＝3；*p＜0.0001)。
色)或HPLM (绿色)中细胞培养后用三个 C(M3)加标签的丙酮酸的级分(平均值±SD，n
＝3)(左)。通过基于LC/MS的代谢物谱分析测量的RPMI+IFS和HPLM+dIFS中丙酮酸的浓度(n＝
4)(右)。图3C描绘了在RPMI+IFS(深灰色)或HPLM+dIFS(绿色)中培养细胞后用两个13C(M2)加标签的柠檬酸盐的级分(平均值±SD，n＝3；*p＜0.0001)。图3D描绘了在RPMI+IFS(深灰色)或HPLM+dIFS(绿色)中培养细胞后用6个13C(M6)加标签的F6P/G1P的级分(平均值±SD，n＝3；*p＜0.0001)。图3E描绘了在RPMI+IFS(深灰色)或HPLM+dIFS(绿色)中培养细胞后用三个13C(M3)加标签的丙氨酸的级分(平均值±SD，n＝3；*p＜0.0001)。图3F描绘了在RPMI+IFS(深灰色)或HPLM+dIFS(绿色)中培养细胞后用三个13C(M3)加标签的GPC的级分(平均值±SD，n＝3；*p＜0.0001)。
[0032] 以下附图显示了与在RPMI+IFS(蓝色)或RPMI+dIFS(红色)中相比，在HPLM+dIFS中细胞培养后的氨基甲酰天冬氨酸盐(图4A)、二氢乳清酸盐(图4B)、乳清酸盐(图4C)和乳清酸核苷(图4D)的相对细胞内丰度(平均值±SD，n＝3；所有条形图p＜0.0001)。图4E是描绘从头嘧啶合成途径的示意图。NT：核苷酸酶。与在RPMI+IFS(蓝色)或RPMI+dIFS(红色)中相比，在HPLM+dIFS中细胞培养后CTP(图4F)和UTP(图4G)的相对细胞内丰度(平均值±SD，n＝3，*p＜0.05)。
[0033] 图5A描绘了最小HPLM的组成(顶部)和从HPLM+dIFS移除以产生指定的脱落制剂的组分列表(底部)。图5B描绘了与在完全HPLM+dIFS中相比，在每种HPLM+dIFS衍生物或最小HPLM(MH)中细胞培养后乳清酸盐(顶部)和乳清酸核苷(底部)的相对细胞内丰度(平均值±SD，n＝3)。HPLM+dIFS衍生物的编号名称对应于图板A中的编号。图5C描绘了通过基于LC/MS的代谢物谱分析测量的RPMI+IFS和HPLM+dIFS中的尿酸浓度(n＝4)。通过所用的代谢物分析方法，在RPMI+dIFS中不易检测到尿酸。因此，RPMI+dIFS的指定浓度大致对应于介质样品中的最小检测+IFS +dIFS +dIFS浓度。图5D描绘了在RPMI 、RPMI 或HPLM 中培养细胞后尿酸的细胞内浓度(平均值
±SD，n＝3)。图5E描绘了与在含有350μM尿酸的标准HPLM+dIFS中相比，在含有增加浓度的尿酸的HPLM+dIFS中培养K562细胞后乳清酸盐和乳清酸核苷的相对细胞内丰度(平均值±SD，n＝3)。图5F描绘了与在RPMI+IFS中相比，在补充350μM尿酸的RPMI+IFS中细胞培养后乳清酸盐、乳清酸核苷(左)(平均值±SD，n＝3；所有条形图p＜0.0001)和UTP(平均值±SD，n＝3；*p＜
0.05)(右)的相对细胞内丰度。图5G描绘了与缺乏尿酸的HPLM+dIFS相比，在含有350μM尿酸(绿色)或350μM尿酸9-甲基尿酸(9-MUA)(白色)的HPLM+dIFS中培养K562细胞后，氨甲酰天冬氨酸盐、二氢乳清酸盐、乳清酸盐和乳清酸核苷的相对细胞内丰度(平均值±SD，n＝3)。图
5H是描绘影响尿酸的血浆浓度的途径的示意图；1：肾小球滤过(70％)，2：分泌(10％)，3：重吸收(90％)，4：排泄(30％)(Bobulescu和Moe，2012)。与大多数哺乳动物相比，人类和许多高等灵长类动物缺乏尿酸酶(UOX)活性，其将尿酸转化为尿囊素(左)。通过LC/MS代谢物谱分析测量的小鼠血浆中尿酸和尿囊素的浓度(n＝4)。根据人代谢组数据库(Human
Metabolome Database)中的注释值计算人血浆中尿酸的平均浓度。其他地方报道的人血浆中尿囊素的浓度(Kand'ár和Záková，2008)(右)。
±SD，n＝3)。图5E描绘了与在含有350μM尿酸的标准HPLM+dIFS中相比，在含有增加浓度的尿酸的HPLM+dIFS中培养K562细胞后乳清酸盐和乳清酸核苷的相对细胞内丰度(平均值±SD，n＝3)。图5F描绘了与在RPMI+IFS中相比，在补充350μM尿酸的RPMI+IFS中细胞培养后乳清酸盐、乳清酸核苷(左)(平均值±SD，n＝3；所有条形图p＜0.0001)和UTP(平均值±SD，n＝3；*p＜
0.05)(右)的相对细胞内丰度。图5G描绘了与缺乏尿酸的HPLM+dIFS相比，在含有350μM尿酸(绿色)或350μM尿酸9-甲基尿酸(9-MUA)(白色)的HPLM+dIFS中培养K562细胞后，氨甲酰天冬氨酸盐、二氢乳清酸盐、乳清酸盐和乳清酸核苷的相对细胞内丰度(平均值±SD，n＝3)。图
5H是描绘影响尿酸的血浆浓度的途径的示意图；1：肾小球滤过(70％)，2：分泌(10％)，3：重吸收(90％)，4：排泄(30％)(Bobulescu和Moe，2012)。与大多数哺乳动物相比，人类和许多高等灵长类动物缺乏尿酸酶(UOX)活性，其将尿酸转化为尿囊素(左)。通过LC/MS代谢物谱分析测量的小鼠血浆中尿酸和尿囊素的浓度(n＝4)。根据人代谢组数据库(Human
Metabolome Database)中的注释值计算人血浆中尿酸的平均浓度。其他地方报道的人血浆中尿囊素的浓度(Kand'ár和Záková，2008)(右)。
[0034] 图6A是描绘由双功能UMP合酶(UMPS)的每个结构域催化的反应的示意图。OPRT：乳清酸盐磷酸核糖转移酶。ODC：OMP脱羧酶。图6B是描绘别嘌呤醇核糖核苷酸(上图)和6-氮杂-UMP(下图)对UMPS的ODC结构域的竞争性抑制的示意图。次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)催化别嘌呤醇转化为其核糖核苷酸衍生物，以及尿苷-胞苷激酶(UCK)催化6-氮杂尿苷至6-氮杂-UMP的转化。图6C描绘了在将重组UMPS(WT或Y37A、R155A突变体)与其底物乳清酸盐和PRPP以指定浓度温育后OMP(左)和UMP(右)的定量(平均值±SD，n＝3)。WT：野生型。图6D描绘了在增加浓度的6-氮杂-UMP或媒介物加入UMPS活性测定法后，OMP(左)和UMP(右)的相对丰度(平均值±SD，n＝3)。图6E描绘了在将增加浓度的尿酸或媒介物加入UMPS活性测定法后，OMP(左)和UMP(中)的相对丰度(平均值±SD，n＝3)。描述尿酸对UMPS的ODC结构域的竞争性抑制的示意图(右)。图6F描绘了在将9-甲基尿酸、尿囊素、别嘌呤醇、6-氮杂尿苷、尿酸或媒介物加入UMPS活性测定法中后，OMP(左)和UMP(右)的相对丰度(平均值±SD，n＝3)。
[0035] 图7A是描绘5-氟尿嘧啶(5-FU)的代谢(上图)的示意图。5-FU被转化为介导其细胞毒性作用的多种氟核苷酸衍生物。氟尿苷三磷酸(FUTP)和氟脱氧尿苷三磷酸分别在错误掺入RNA和DNA时导致细胞死亡。氟脱氧尿苷一磷酸(FdUMP)通过抑制胸苷酸合成酶(TYMS)导致细胞死亡(Longley等，2003)。所描绘的酶是尿苷磷酸化酶(UPP)、尿苷-胞苷激酶(UCK)、胸苷磷酸化酶(TYMP)、胸苷激酶(TK)和核糖核苷酸还原酶(RRM)。指定的其他代谢物是氟尿苷(FUR)、氟尿苷一磷酸(FUMP)、氟尿苷二磷酸(FUDP)、氟脱氧尿苷(FUDR)和氟脱氧尿苷二磷酸(FdUDP)。UMPS的OPRT结构域催化5-FU直接转化为FUMP(底部)。图7B是显示UMPS的OPRT结构域催化乳清酸盐转化为OMP和5-FU转化FUMP的转化的示意图。当在RPMI+IFS(深灰色)、RPMI+dIFS(浅灰色)或HPLM+dIFS(绿色)中培养时，NOMO1细胞对5-FU(图7C)或多柔比星(图7D)的剂量应答(平均值±SD，n＝9)。数据点是三个独立生物实验的平均值，每个实验由三个技术重复组成(左图)。当在RPMI+IFS(深灰色)、RPMI+dIFS(浅灰色)或HPLM+dIFS(绿色)中培养时，NOMO1细胞中的5-FU(图7C)或多柔比星(图7D)的EC50。水平条指示三次独立生物实验的平均值；*p＜0.001；ns：不显著(右图)。当在HPLM+1IFS(绿色)或缺乏尿酸的HPLM+dIFS(蓝色)中培养时，NOMO1细胞对5-FU(图7E)或多柔比星(图7F)的剂量应答(平均值±SD，n＝9)。数据点是三个独立生物实验的平均值，每个实验由三个技术重复组成(左图)。当在HPLM+IFS(绿色)或缺乏尿酸的HPLM+dIFS(蓝色)中培养时，NOMO1细胞中5-FU或多柔比星的EC50。水平条表示三次独立生物实验的平均值；*p＜0.001；ns：不显著(右图)。图7G描绘了用20μM的5-FU处理并在HPLM+dIFS(绿色)或缺乏尿酸的HPLM+dIFS(蓝色)中培养24小时的NOMO1细胞中5-FU(左)、FdUMP(中)和FUMP(右)的细胞内丰度(平均值±SD，n＝3)。ND：未检测到。图7H描绘了对5-FU引起的细胞毒性的尿酸介导拮抗作用的所提出的机制。不希望受任何理论束缚，无论是UMPS的OPRT结构域还是UPP和UCK的顺序作用都能将5-FU转化为FUMP，尿酸对5-FU敏感性的影响可能取决于给定细胞类型通过OPRT介导的合成产生FUMP的程度。
[0036] 在RPMI+IFS(图8A)、RPMI+dIFS(图8B)和HPLM+dIFS中培养的细胞的葡萄糖(q，葡萄糖)的净消耗率与乳酸盐(q，乳酸盐)的净消耗率的比较。(图8C)(两个轴的平均值±SEM，n＝3)。有关用于计算净转换率的等式，请参见示例部分中的方法。在GraphPad Prism中绘制点并使用线性回归方程拟合。
[0037] 与在RPMI+IFS(蓝色)或RPMI+dIFS(红色)中相比，在HPLM+dIFS中培养细胞后的ATP(图9A)和GTP(图9B)的相对细胞内丰度(平均值±SD，n＝3)。
[0038] 图10A描绘了与在RPMI+IFS(蓝色)或RPMI+dIFS(红色)中相比，在HPLM+dIFS中培养细胞期间乳清酸盐的相对净分泌率(平均值±SEM，n＝3；所有条形均p＜0.05)。有关用于计算净转换率的等式，请参见示例部分中的方法。图10B描绘了在RPMI+IFS(深灰色)、RPMI+dIFS(浅灰+dIFS色)或HPLM (绿色)中培养细胞期间乳清酸核苷的净分泌率(q)(平均值±SEM，n＝3；*p＜
0.05)。对于除KMS12BM之外的指定细胞系，在RPMI+IFS或RPMI+IFS中培养细胞期间，在一个或多个生物学重复中不容易检测到乳清酸核苷的净分泌。有关用于计算净转换率的等式，请参见示例部分中的方法。
0.05)。对于除KMS12BM之外的指定细胞系，在RPMI+IFS或RPMI+IFS中培养细胞期间，在一个或多个生物学重复中不容易检测到乳清酸核苷的净分泌。有关用于计算净转换率的等式，请参见示例部分中的方法。
[0039] 图11A描绘了与在缺乏尿酸的HPLM+dlFS中相比，在HPLM+dIFS(绿色)或缺乏尿酸并且含有增加浓度的别嘌呤醇的HPLM+dIFS中(橙色)培养K562细胞后，卡巴酰天冬氨酸盐、二氢乳清酸盐、乳清酸盐和乳清酸核苷的相对细胞内丰度(平均值±SD，n＝3)。图11B描绘了在含有递增浓度的尿酸的HPLM+dIFS中或在缺乏尿酸并且含有递增浓度的别嘌呤醇的HPLM+dIFS中培养K562细胞后，OMP的细胞内丰度(平均值±SD，n＝3)。图11C描绘了与含有350μM尿酸的标准HPLM+dIFS中相比，在含有700μM尿酸的HPLM+dIFS中或在缺乏尿酸并且含有增加浓度的别嘌呤醇的HPLM+dIFS中培养K562细胞后，UTP的相对细胞内丰度(平均值±SD，n＝3)。图11D描绘了提取的离子色谱图，其显示在缺乏尿酸并且含有浓度增加的别嘌呤醇的HPLM+dIFS中培养后来自代表性K562样品的指定保留时间之间的质荷比(m/z)为347.0398(负电离模式)的峰。峰对应于IMP(黑色轮廓)和推定的别嘌呤醇核糖核苷酸(红色轮廓)(顶部)。别嘌呤醇核糖核苷酸(红色框)和IMP(黑色框)的化学结构，它们具有相同的m/z，但保留时间不同(底部)。
[0040] 图12A描绘了与OMP复合的人UMPS的OPRT结构域的活性位点(黄色)(蛋白质数据库条目2WNS，链A和B)；显示的残基包括其他地方报道的活性位点(Zhang等，2013)。残基在工程化改造的UMPS变体中突变为丙氨酸(粗体)。图12B描绘了1：M.W.标准；2：野生型UMPS-3×FLAG；3：UMPS(Y37A，R155A)-3×FLAG。
[0041] 图13A描绘了与在RPMI+IFS(蓝色)或RPMI+dIFS(红色)中相比，在HPLM+dIFS中培养SW620细胞后乳清酸盐的相对细胞内丰度(平均值±SD，n＝3；对于两个条均p＜0.0001)。当在HPLM+IFS(绿色)或缺乏尿酸的HPLM+dIFS(蓝色)中培养时，SW620细胞对5-FU(图13B)或多柔比星(图13C)的剂量应答(平均值±SD，n＝9)。数据点是三个独立生物实验的平均值，每个实验由三个技术重复组成(左)。当在HPLM+IFS(绿色)或缺乏尿酸的HPLM+dIFS(蓝色)中培养时，SW620细胞中5-FU或多柔比星的EC50。水平条表示三次独立生物实验的平均值；*p＜0.005；ns：不显著(右图)。
[0042] 【发明详述】
[0043] 【I.培养基制剂】
[0044] 在一些方面，本公开内容涉及认识到广泛使用的哺乳动物细胞培养基的组合物，虽然被设计为提供体外哺乳动物细胞的存活和增殖所必需的营养物，但仅很少反映体内营养条件。在一些方面，本公开内容涉及在人血液中发现的某些代谢物在培养基中的存在对测定法中哺乳动物细胞表型和哺乳动物细胞的行为具有深远影响。例如，培养基中这些代谢物的存在可以显著地改变细胞对外源物质(例如已知或潜在的治疗剂)的应答。
[0045] 在一些方面，本公开内容提供了细胞培养基，其支持培养物中人细胞的存活和增殖，并提供比传统培养基更接近地反映细胞在体内暴露的环境。本文描述的培养基包含通常在人血液中存在的多种代谢物。这些代谢物也存在于血液的液体部分(血浆)以及在血液被允许凝结之后剩余的血液的液体部分(血清)中。在一些实施方案中，代谢物的浓度在血浆和血清中可以相同或近似相同。在一些实施方案中，一种或多种代谢物的浓度可以在血浆和血清之间不同。在一些实施方案中，血液、血浆和血清中代谢物的浓度被认为是等同的并且可互换使用。如本文所用，“代谢物”是指代谢的中间体和产物。在一些实施方案中，培养基包含在常规培养基中未发现的一种或多种代谢物。“常规培养基”是指那些用于或已经广泛用于细胞培养的培养基，包括至少那些可商购的细胞培养基。常规培养基的实例包括例如Basal Medium Eagle(BME)(Eagle，1955c)、Minimal Essential Medium(MEM)(Eagle，1959)、Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)、Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM)、Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640、Ham’s营养混合物(例如，F10、F12)、Medium 199、McCoy's 5a及其混合物，例如DMEM/F10、DMEM/F12。参见，例如，Freshney，2010。这种培养基通常补充有动物血清，以提供额外的支持物质，例如生长因子和激素。本领域普通技术人员将理解，本领域已知的这种常规培养基存在许多变体，这些变体也被认为是常规的。例如，常规培养基还包括任何上述介质的修饰形式，其与常规制剂相比允许哺乳动物细胞的培养具有降低的血清补充(例如，减少约50％-90％)，例如高级RPMI和高级DMEM(ThermoFisher)。常规培养基的混合物可包含约10％至约90％的第一介质，其余部分由第二介质组成。在一些实施方案中，混合物为约50:50的混合物。
[0046] 本文所述的细胞培养基是水基的，即该介质在水(例如去离子蒸馏水)中包含许多成分。在某些实施方案中，介质可以由干粉和/或冷冻组分重构。
[0047] 术语“成分”是指化学或生物来源的任何化合物，其可用于细胞培养基中以维持或促进细胞的存活或增殖，或者至少不与存在量的细胞的存活以及通常的增殖相矛盾。术语“组分”和“成分”可互换使用，并且都意指这些化合物。在本公开内容描述特定成分或成分组的情况下，应当理解，在某些实施方案中，这些成分或成分组可与本文所述的任何其他成分或成分组合一起存在于培养基中，除非另有说明或从上下文清楚地显而易见。
[0048] “细胞培养”或“培养”是指在人工的体外环境中维持细胞。然而，应理解，术语“细胞培养物”是通用术语，并且可用于不仅包括单个细胞的培养，还包括组织、类器官、器官或器官系统的培养，对此也可以使用术语“组织培养”、“器官培养”、“器官培养”、“器官系统培养”或“器官型培养”。
[0049] 在一些方面，本文描述的是基础培养基，其包含：(a)至少9种蛋白原氨基酸；(b)一种或多种维生素；(c)一种或多种无机盐；(d)葡萄糖；(e)至少10种小有机化合物，选自4-羟基脯氨酸、乙酰甘氨酸、α-氨基丁酸盐、甜菜碱、肉毒碱、瓜氨酸、鸟氨酸、牛磺酸、2-羟基丁酸盐、3-羟基丁酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、甲酸盐、乳酸盐、丙二酸盐、丙酮酸盐、琥珀酸、丙酮、肌酸、肌酸酐、谷胱甘肽、甘油、尿素、半乳糖、果糖、次黄嘌呤和尿酸。在一些实施方案中，培养基包含选自上述组的至少5种小有机化合物。
[0050] 如本文所用，术语“基础培养基”或“基础介质”是指含有蛋白质原氨基酸、糖(通常为葡萄糖)、水溶性维生素和离子，但缺乏生长因子和激素的细胞培养基，并且通常补充有血清或这些支持物质的其他来源，以生产支持广泛多种哺乳动物细胞的活力和增殖的完全培养基。在本公开内容涉及培养基或介质的情况下，应当理解，除非另有说明或从上下文中清楚地显而易见，否则培养基或介质可以是基础培养基。
[0051] 培养基包含可用作蛋白质合成前体的氨基酸(“蛋白质原氨基酸”)。除非另有说明，本文提及的可以作为L-或D-氨基酸存在的氨基酸应理解为L-氨基酸。在某些实施方案中，可以包括在培养基中的蛋白质原氨基酸包括L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸。在一些实施方案中，所有这些氨基酸都存在于培养基中。在一些实施方案中，所有这些氨基酸加胱氨酸都存在于培养基中。备选地，在一些实施方案中，培养基中仅包含必需氨基酸。某些哺乳动物细胞，例如人类细胞，必须具有足够量的9种氨基酸才能存活。这些所谓的“必需”氨基酸不能通过这些细胞从其他前体合成。然而，半胱氨酸可以部分地满足对甲硫氨酸的需要(它们都含有硫)，并且酪氨酸可以部分替代苯丙氨酸。这些必需氨基酸包括：组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸(和/或半胱氨酸)、苯丙氨酸(和/或酪氨酸)、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸。在一些实施方案中，组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸(和/或半胱氨酸)、苯丙氨酸(和/或酪氨酸)、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸以及非必需蛋白质原氨基酸的一种或多种另外的蛋白质原氨基酸(例如、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11)存在于培养基中。在一些实施方案中，除至少必需氨基酸外，培养基包含胱氨酸。胱氨酸是半胱氨酸的氧化二聚体形式，具有式(SCH2CH(NH2)CO2H)2。为了本公开的目的，它可以容易地还原为半胱氨酸并且被认为是蛋白质原氨基酸。
[0052] 在某些实施方案中，一种或多种氨基酸可以至少部分地作为肽(例如，二肽或三肽)提供。例如，在一些实施方案中，谷氨酰胺可以至少部分地作为L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(由Life Technologies以GlutaMAXTM-I出售)提供。在某些实施方案中，本公开内容的培养基不含有二肽或三肽作为组分。
[0053] 在某些实施方案中，培养基包含选自以下的一种或多种维生素：生物素(例如，D-生物素)、胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、对氨基苯甲酸、D-泛酸、维生素B6、核黄素、硫胺素和维生素B12。在某些实施方案中，培养基包含至少6、7、8、9、10或所有11种所述维生素。在某些实施方案中，培养基至少包含胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、维生素B6、核黄素和硫胺素。在某些实施方案中，培养基包含生物素(例如D-生物素)、胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、对氨基苯甲酸、D-泛酸、吡哆醇、吡哆醛核黄素、硫胺素和维生素B12。
[0054] 维生素B6是指一组化学上相似的化合物，它们可以在生物系统中相互转化。这些包括吡哆醇(PN)、5'-磷酸吡哆醇(PNP)、吡哆醛(PL)、5'-磷酸吡哆醛(PLP)、吡哆胺(PM)和5'-磷酸吡哆胺(PMP)。在某些实施方案中，培养基中的维生素B6可以是这些化合物中的任何一种或其组合。例如，在某些实施方案中，维生素B6是吡哆醇。在某些实施方案中，维生素B6是吡哆醛。在某些实施方案中，培养基含有吡哆醇和吡哆醛。维生素B12是指一类化学上类似的化合物，它们含有钴，位于称为角蛋白环的平面四吡咯环的中心。这些包括氰钴胺素、羟钴胺素、甲钴胺素和腺苷钴胺素。维生素B12可以作为这些化合物中的任何一种或其混合物提供。
[0055] 培养基可以包含多种无机或有机离子中的任何一种。在一些实施方案中，培养基包含以下离子中的至少7种(即，7、8、9或全部10种)：Na+、K+、Ca2+、Mg2+、NH4+、Cl-、HCO3-、PO43-、SO42-和NO3-。离子可以以盐的形式提供。本文描述了可用作成分的示例性盐。在一些实施方案中，一种或多种离子至少部分地以盐形式提供，其中抗衡离子是无机离子。例如，在一些实施方案中，所有Mg2+以MgCl2和MgSO4提供。在一些实施方案中，一种或多种离子至少部分地以盐形式提供，其中抗衡离子是小有机分子。例如，在一些实施方案中，一些Na+离子以无机钠盐(例如NaCl)提供，一些Na+离子以乙酸钠提供。
[0056] 在某些实施方案中，选择培养基的组分以提供任何一种或多种前述离子(即Na+、K+、Ca2+、Mg2+、NH4+、Cl-、HCO3-、PO43-、SO42-和NO3-)的浓度为表1中对于所述离子所列浓度的0.3至3倍，例如表1中对于所述离子所列浓度的约0.5至约2倍，例如表1中对于所述离子所列浓度的约0.67至约1.5倍，在表1中对于所述离子所列浓度的约±30％内，在表1中对于所述离子所列浓度的约±20％范围内，在表1中对于所述离子所列浓度的约±10％内，在表1中对于所述离子所列浓度的约±5％内，在表1中对于所述离子所列浓度的约±2％内，或在表1中对于所述离子所列浓度的约±1％内。在某些实施方案中，选择培养基的组分以提供存在于介质中的任何一种或多种所述离子的浓度是表1中对于所述离子所列浓度。
[0057] 在某些实施方案中，选择培养基的组分以提供介质中存在的每种所述离子的浓度为表1中对于所述离子所列浓度的约0.3至约3倍，例如表1中对于所述离子所列浓度的约0.5至约2倍，例如表1中对于所述离子所列浓度的约0.67至约1.5倍，在表1中对于所述离子所列浓度的约±30％内，在表1中对于所述离子所列浓度的约±20％内，在表1中对于所述离子所列浓度的±10％内，在表1中对于所述离子所列浓度的约±5％内，在表1中对于所述离子所列浓度的约±2％内，或在表1中对于所述离子所列浓度的约±1％内。在某些实施方案中，选择培养基的组分以提供介质中存在的每种所述离子的浓度是表1中对于所述离子所列浓度。
[0058] 【表1：盐离子和离子浓度(微摩尔)】
[0059]离子 浓度
+
Na 132271
K+ 4142
Ca2+ 2390
Mg2+ 830
+
NH4 40
Cl- 116196
HCO3- 24000
PO43- 966
SO42- 350
NO3- 80
+
Na 132271
K+ 4142
Ca2+ 2390
Mg2+ 830
+
NH4 40
Cl- 116196
HCO3- 24000
PO43- 966
SO42- 350
NO3- 80
[0060] 可以包含在培养基中以提供无机离子的无机盐成分包括但不限于钙盐(例如，CaCl2、Ca(NO3)2·4H2O)、钾盐(例如，KCl、K2SO4)，镁盐(例如，MgCl2、MgSO4)，钠盐(例如，NaCl、NaHCO3、Na2HPO4、Na2SO4)、铵盐(例如，NH4Cl、NH4HCO3、(NH4)2SO4)。在一些实施方案中，培养基包含至少一种钙盐、至少一种钾盐、至少一种镁盐、至少一种钠盐和至少一种铵盐。
在一些实施方案中，培养基包含选自CaCl2、KCl、MgCl2、MgSO4、NaCl、NaHCO3、Na2HPO4、Ca(NO3)2·4H2O和NH4Cl的至少6种、至少7种、至少8种或9种盐。
在一些实施方案中，培养基包含选自CaCl2、KCl、MgCl2、MgSO4、NaCl、NaHCO3、Na2HPO4、Ca(NO3)2·4H2O和NH4Cl的至少6种、至少7种、至少8种或9种盐。
[0061] 在一些实施方案中，培养基包含表2中所列的一种或多种小极性化合物。这些化合物可称为“极性代谢物”或“小极性代谢物”。例如，在一些实施方案中，培养基包含表2中所列的至少5，例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27种小极性化合物。可能存在于培养基中的小极性化合物包括多种非蛋白质原氨基酸、氨基酸衍生物、水溶性酸、糖、嘌呤代谢物等。
[0062] 可存在于培养基中的非蛋白质原氨基酸包括4-羟基脯氨酸、乙酰甘氨酸、α-氨基丁酸盐、瓜氨酸和鸟氨酸。在一些实施方案中，前述非蛋白质原氨基酸中的至少3种、即3、4或5种存在于培养基中。至少3种非蛋白质原氨基酸可以以任何组合存在。
[0063] 可存在于培养基中的氨基酸衍生物包括甜菜碱(三甲基甘氨酸)、肉毒碱和牛磺酸。在一些实施方案中，前述氨基酸衍生物中的至少1种，即1、2或3种存在于培养基中。当存在两种或更多种氨基酸衍生物时，它们可以以任何组合存在。
[0064] 在一些实施方案中，培养基包含选自4-羟基脯氨酸、乙酰甘氨酸、α-氨基丁酸盐、甜菜碱、肉毒碱、瓜氨酸、鸟氨酸和牛磺酸的至少4种，即4、5、6、7或8种非蛋白质原氨基酸或氨基酸衍生物。至少4种非蛋白质原氨基酸或氨基酸衍生物可以以任何组合存在。
[0065] 在一些实施方案中，培养基包含至少6种(即，6、7、8或9种)小极性化合物，其选自2-羟基丁酸盐、3-羟基丁酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、甲酸盐、乳酸盐、丙二酸盐、丙酮酸盐和琥珀酸盐。出于本公开内容的目的，2-羟基丁酸盐、3-羟基丁酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、甲酸盐、乳酸盐、丙二酸盐、丙酮酸盐和琥珀酸盐可称为“第1组小极性代谢物”。至少6种第1组小极性代谢物可以以任何组合存在。在一些实施方案中，存在所有的所述第1组小极性代谢物。
在一些实施方案中，所述第1组小极性代谢物中的任何一种或多种可以作为盐提供，例如作为钠盐。
在一些实施方案中，所述第1组小极性代谢物中的任何一种或多种可以作为盐提供，例如作为钠盐。
[0066] 在一些实施方案中，培养基包含一种或多种，例如，至少3种(即，3、4、5或6种)小极性化合物，其选自：丙酮、肌酸、肌酸酐、谷胱甘肽、甘油和尿素。出于本公开内容的目的，丙酮、肌酸、肌酸酐、谷胱甘肽、甘油和尿素可称为“第2组小极性化合物”。至少3种第2组小极性化合物可以以任何组合存在。在一些实施方案中，存在所有的所述第2组小极性化合物。
[0067] 在一些实施方案中，除了至少7种第1组小极性代谢物之外，培养基还包含至少4种(即4、5或6种)所述第2组小极性化合物。在一些实施方案中，除了至少3种非蛋白原氨基酸和/或除了至少1种氨基酸衍生物外，培养基还包含至少4种第2组小极性代谢物和/或至少7种第1组小极性代谢物。在一些实施方案中，例如，培养基包含至少7种第1组小极性代谢物，至少4种第2组小极性代谢物，和至少4种(即，4、5、6、7或8种)非蛋白质原氨基酸或氨基酸衍生物，其选自4-羟基脯氨酸、乙酰甘氨酸、α-氨基丁酸盐、甜菜碱、肉毒碱、瓜氨酸、鸟氨酸和牛磺酸。在一些实施方案中，培养基包含至少8种第1组小极性代谢物，至少5种第2组小极性代谢物和至少4种(即，4、5、6、7或8种)非蛋白质原氨基酸或氨基酸衍生物，其选自4-羟基脯氨酸、乙酰甘氨酸、α-氨基丁酸盐、甜菜碱、肉毒碱、瓜氨酸、鸟氨酸和牛磺酸。在一些实施方案中，培养基包含8或9种第1组小极性代谢物，5或6种第2组小极性代谢物，和7或8种非蛋白质原氨基酸或氨基酸衍生物，其选自4-羟基脯氨酸、乙酰甘氨酸、α-氨基丁酸盐、甜菜碱、肉碱、瓜氨酸、鸟氨酸和牛磺酸。
[0068] 在一些实施方案中，培养基包含至少一种嘌呤代谢物。在一些实施方案中，嘌呤代谢物选自次黄嘌呤和尿酸。在一些实施方案中，介质包含次黄嘌呤和尿酸。除本文所述的蛋白质原氨基酸、维生素、非蛋白质原氨基酸、氨基酸衍生物、离子、盐、第1组小极性代谢物、第2组小极性代谢物、糖和其他成分的任何组合外，还可以存在此类嘌呤代谢物。
[0069] 在某些实施方案中，培养基包含葡萄糖。在某些实施方案中，培养基中葡萄糖的浓度为约3mM至约20mM，例如约5mM至约10mM，例如约5mM。
[0070] 在某些实施方案中，培养基包含葡萄糖和一种或多种另外的糖，例如半乳糖、果糖或两者。在某些实施方案中，培养基包含葡萄糖和半乳糖。在某些实施方案中，培养基包含葡萄糖和果糖。在某些实施方案中，培养基包含葡萄糖、半乳糖和果糖。在某些实施方案中，培养基中半乳糖的浓度为约30μm至约120μm，例如约50μm至约80μm，例如约60μm，例如55μm至65μm，例如60μm。在某些实施方案中，培养基中果糖的浓度为约20μm至约80μm，例如约30μm至约60μm，例如约35μm至约45μm，例如约40μm。
[0071] 除了本文所述的蛋白质原氨基酸、维生素、非蛋白质原氨基酸、氨基酸衍生物、离子、盐、第1组小极性代谢物、第2组小极性代谢物、嘌呤代谢物和其他成分的任何组合之外，还可以存在糖。
[0072] 在一些实施方案中，培养基包含至少20、21、22、23、24、25、26或27种小有机化合物，其选自2-羟基丁酸盐、3-羟基丁酸盐、4-羟基脯氨酸、乙酸盐、丙酮、乙酰甘氨酸、α-氨基丁酸盐、甜菜碱、肉毒碱、柠檬酸盐、瓜氨酸、肌酸、肌酸酐、甲酸盐、果糖、半乳糖、谷胱甘肽、甘油、次黄嘌呤、乳酸盐、丙二酸盐、鸟氨酸、丙酮酸盐、琥珀酸盐、牛磺酸、尿素和尿酸，以及葡萄糖和蛋白质原氨基酸、维生素、非蛋白质原氨基酸、氨基酸衍生物、离子、盐、糖，和本文所述的其他成分的任何组合。
[0073] 在某些实施方案中，培养基具有的任何一种或多种代谢物的浓度为表2中对于此类代谢物所列浓度的约0.3至约3倍，例如表2中对于此类代谢物所列浓度的0.5至约2倍，例如表2中对于此类代谢物所列浓度的约0.67至约1.5倍，在表2中对于此类代谢物所列浓度的约±30％内，在表2中对于此类代谢物所列浓度的约±20％内，在表2中对于此类代谢物所列浓度的约±10％内，在表2中对于此类代谢物所列浓度的约±5％内，在表2中对于此类代谢物所列浓度的约±2％内，或在表2中对于此类代谢物所列浓度的约±1％，或约等于表2中对于此类代谢物所列浓度。在一些实施方案中，任何此类代谢物可以以正常成人血浆中的此类代谢产物浓度的多至约0.25、约0.5、约0.75、约1、约1.25、约1.5、约2、约2.5或约3倍存在。
[0074] 在某些实施方案中，培养基具有介质中存在的表2中所列每种代谢物的浓度是表2中对于此类代谢物所列浓度的约0.3至约3倍，例如，表2中对于此类代谢物所列浓度的约0.5至约2倍，例如，表2中对于此类代谢物所列浓度的约0.67至约1.5倍，在表2中对于此类代谢物所列浓度的约±30％内，在表2中对于此类代谢物所列浓度的约±20％内，在表2中对于此类代谢物所列浓度的约±10％内，在表2中对于此类代谢物所列浓度的约±5％内，在表2中对于此类代谢物所列浓度的约±2％内，或在表2中对于此类代谢物所列浓度的约±1％，或约等于表2中对于此类代谢物所列浓度。在一些实施方案中，培养基具有介质中存在的表2中所列每种代谢物的浓度是正常成人血浆中的此类组分浓度的多至约0.25、约
0.5、约0.75、约1、约1.25、约1.5、约2、约2.5或约3倍。
0.5、约0.75、约1、约1.25、约1.5、约2、约2.5或约3倍。
[0075] 在某些实施方案中，培养基的重量摩尔渗透压浓度为约260mOsm/kg至约320mOsm/kg。在某些实施方案中，介质的重量摩尔渗透压浓度为至少约275mOsm/kg、至少约280mOsm/kg、至少约285mOsm/kg、至少约290mOsm/kg、或至少约295mOsm/kg或多至约320mOsm/kg。在某些实施方案中，重量摩尔渗透压浓度为约285mOsm/kg至305mOsm/kg。在某些实施方案中，重量摩尔渗透压浓度为约290mOsm/kg至约300mOsm/kg，例如约295mOsm/kg。
[0076] 在一些实施方案中，培养基可以包含一种或多种pH指示剂，例如酚红。在一些实施方案中，在介质中存在的酚红是表2中所列浓度的约0.3至约3倍，例如表2中所列浓度的约0.5至约2倍，例如表2中所列浓度的约0.67至1.5倍，或在表2中所列浓度的约±30％、约±
20％、约±10％、约±5％、约±2％、约±1％内，或约等于表2中所列浓度。在一些实施方案中，酚红可以以表2中所列浓度的多至约0.25、约0.5、约0.75、约1、约1.25、约1.5、约2、约
2.5或约3倍存在。在一些实施方案中，培养基不包含酚红。
20％、约±10％、约±5％、约±2％、约±1％内，或约等于表2中所列浓度。在一些实施方案中，酚红可以以表2中所列浓度的多至约0.25、约0.5、约0.75、约1、约1.25、约1.5、约2、约
2.5或约3倍存在。在一些实施方案中，培养基不包含酚红。
[0077] 在一些实施方案中，培养基可以包含一种或多种缓冲剂，以帮助在培养期间维持所需的pH。频繁、持续或连续的更换培养基也可以帮助恢复快速生长细胞中的介质pH。在某些实施方案中，缓冲剂是碳酸氢盐或2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(HEPES)。
[0078] 在某些实施方案中，当在溶液中混合在一起时，一些或所有上述成分形成基础培养基。例如，在一些实施方案中，培养基包含以表2中所列浓度的表2中公开的组分。表2还列出了多种组分的商业供应商。应该理解，组分可以从任何来源获得。
[0079] 【表2：示例性基础介质组分和浓度(微摩尔)】
[0080]
[0081]
[0082] 在一些方面，本文描述的细胞培养基是化学上确定的基础培养基。“化学上确定的”是指化学组合物中各种单独组分的结构、化学式和百分比是已知的或可以确定的。血清和组织提取物不是化学上确定的，至少部分是因为并非所有单个组分都是已知的。对于那些已知的组分，各种组分的量和相对百分比可以(并且通常确实)在批次间变化。
[0083] 在某些实施方案中，本公开内容的基础培养基在补充有血清时支持广泛哺乳动物细胞的增殖，所述血清用作支持物质如生长因子、激素和脂质的来源。在一些实施方案中，可以使用牛血清，例如胎牛血清或小牛血清。其他血清来源包括马和人。在一些实施方案中，基础培养基补充有约5％至约20％的血清，例如约7.5％至约15％的血清，例如约10％的血清(例如，胎牛血清)。在一些实施方案中，血清是热灭活的。例如，血清可以在约56℃加热约30分钟(或对于马或人血清约25分钟)。在一些实施方案中，血清不是热灭活的。
[0084] 在一些实施方案中，可以使用其他支持物质来代替血清或除血清外使用其他支持物质。例如，可以使用血清替代物例如KnockOutTM Serum Replacement(ThermoFisher)或BIT 9500(Stemcell Technologies)，血小板裂解物，动物提取物例如牛垂体提取物(BPE)，或其组合。在一些实施方案中，支持物质的来源可以是至少部分不确定的，如血清和动物提取物的情况。在一些实施方案中，可以根据其结构和量来确定支持物质。例如，以已知量添加的单个脂质或者化学合成或纯化的重组蛋白质(例如，由基因工程化改造的细菌或真菌产生)被认为是确定的成分。可以作为单独确定的组分、作为单独确定的组分的混合物或作为血清或其他至少部分不确定的物质的组分添加到基础培养基中的支持物质的实例包括胰岛素或胰岛素样生长因子、表皮生长因子、转铁蛋白、白蛋白、脂肪酸(例如，脂质、亚油酸和/或亚麻酸)、磷脂和胆固醇。在一些实施方案中，基础培养基可以支持某些哺乳动物细胞的增殖而不添加支持物质。
[0085] 在一些实施方案中，可以将有助于支持细胞活力和增殖的血清、动物提取物、生长因子、激素和/或其他物质添加到本公开内容的基础培养基中。这些组分可以单独地加入基础培养基中，或者可以将两种或多种这样的组分混合，例如形成储备溶液，然后将其加入基础培养基中。
[0086] 在一些实施方案中，可以透析或以其他方式处理血清或其他支持物质的来源以除去小极性代谢物。在一些实施方案中，可以使用截留分子量为约2,500-约5,000道尔顿，例如约3500道尔顿的透析膜。透析可以进行足够长的时间，使得至少一些小极性代谢物包括表2中所列的至少一些极性代谢物，被大量除去。例如，在一些实施方案中，任何一种或多种极性代谢物的水平可降低至少约50％、至少约75％或更多。在一些实施方案中，任何特定代谢物的量减少约50％至约99％。较大的物质，例如大多数血清蛋白质(例如白蛋白、转铁蛋白、胰岛素、生长因子)和与这些蛋白质结合的物质例如脂质，在很大程度上得以保留。在一些实施方案中，盐溶液，例如缓冲盐水溶液，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)，可以用作透析缓冲液。在一些实施方案中，透析缓冲液具有约250mOsm/kg至约350mOsm/kg，例如约280mOsm/kg至约320mOsm/kg的重量摩尔渗透压浓度。
[0087] 许多细胞培养基通常含有一种或多种抗生素，其本身对于细胞生长/增殖不是必需的，但是其存在可以抑制不期望的微生物如细菌和/或真菌的生长。本领域普通技术人员认识到，可以在培养基用于培养细胞的时候或之前不久将抗生素添加到培养基中。抗生素包括由多种微生物产生的相对低分子量的天然的和合成的化学物质，微生物例如细菌(包括芽孢杆菌属(Bacillus)物种)，放线菌(包括链霉菌属(Streptomyces))和真菌，其抑制其他微生物的生长或破坏其他微生物。可以化学合成在结构和/或作用方式上与天然抗生素相似的物质，或者可以修饰天然化合物以产生半合成抗生素。主要类别的抗生素是：(1)β-内酰胺类，包括青霉素类、头孢菌素类和单环内酰胺类；(2)氨基糖苷类，例如链霉素、庆大霉素、妥布霉素、新霉素、奈替霉素和阿米卡星；(3)四环素；(4)磺胺类和甲氧苄氨嘧啶；(5)氟喹诺酮类，例如环丙沙星、诺氟沙星和氧氟沙星；(6)万古霉素；(7)大环内酯类，其包括例如红霉素、阿奇霉素、泰乐菌素和克拉霉素；和(8)其他抗生素、例如多粘菌素、氯霉素和林可酰胺。培养基可以补充有一种或多种抑制细菌、真菌和/或病毒的生长/增殖的抗生素。因此，在某些实施方案中，培养基包含一种或多种抗生素。在某些实施方案中，一种或多种抗生素包括青霉素抗生素。在某些实施方案中，一种或多种抗生素包括氨基糖苷类抗生素。在某些实施方案中，一种或多种抗生素包括苄基青霉素。在某些实施方案中，一种或多种抗生素包括链霉素。在某些实施方案中，培养基包含苄基青霉素和链霉素。然而，在一些实施方案中，培养基可以基本上不含抗生素。在一些实施方案中，除了pH指示剂、抗生素或两者之外，培养基可以基本上不含可检测量的在成人血液中不存在的物质。
[0088] 在一些方面，本公开内容提供了常规培养基的修饰形式。常规培养基的修饰形式含有与常规培养基相同量的相同组分，并且还包含量为成人血浆中其浓度的约0.3至约3倍的一种或多种第1组小极性代谢物和/或一种或多种第2组小极性代谢物。在一些实施方案中，常规培养基是RPMI、DMEM、BME、MEM、IMDM、Ham's营养混合物(例如F10、F12)、培养基199、McCoy's 5a、或者两种或更多种此类培养基的混合物。表4中提供了几种常规培养基的示例性制剂。除非另有说明，表4中的所有浓度均为微摩尔。在一些实施方案中，存在的一种或多种小极性代谢物是表2中对于此类代谢物所列浓度的约0.5至约2倍，例如表2中对于此类代谢物所列浓度的约0.67至约1.5倍，在表2中对于此类代谢物所列浓度的约±30％范围内，在表2中对于此类代谢物所列浓度的约±20％内，在表2中对于此类代谢物所列浓度的约±10％内，在表2中对于此类代谢物所列浓度的约±5％内，在表2中对于此类代谢物所列浓度的约±2％内，或在表2中对于此类代谢物所列浓度的约±1％内，或约等于表2中对于此类代谢物所列浓度。
[0089] 表4：示例性常规介质配方
[0090]
[0091]
[0092] *Thermo Fisher Scientific提供的制剂配方中不含谷氨酰胺。指示的浓度是标准BME的浓度
[0093] 在一些方面，本公开涉及认识到以在对于成人血液中存在的典型水平的尿酸抑制UMPS。UMPS催化从头嘧啶生物合成途径的最后两个步骤以产生UMP。不希望受任何理论束缚，在与常规培养基相比含有增加水平的尿酸的细胞培养基中培养的人细胞可以具有比常规培养基中培养的人细胞更接近地反映体内人细胞UMPS水平的UMPS活性水平。在一些实施方案中，本文描述的是具有至少约200μm，例如约200μm至约1mM的尿酸浓度的细胞培养基。在一些实施方案中，浓度为约200μm至约700μm，例如约300μm至约400μm，例如约350μm。培养基包含足够的蛋白质原氨基酸、无机离子、糖(例如葡萄糖)和维生素以支持至少一些哺乳动物细胞的活力和增殖。在一些实施方案中，可以通过用适当量的尿酸补充常规培养基以获得所选择的尿酸浓度，来制备培养基。例如，RPMI、DMEM、BME、MEM、IMDM、Ham’s营养混合物(例如F10、F12)、培养基199、McCoy's 5a或其混合物可以如此补充。在一些实施方案中，与常规培养基相比含有增加水平的尿酸的细胞培养基可用于涉及嘧啶生物合成和/或涉及作用于参与嘧啶生物合成的酶或通过参与嘧啶生物合成的酶起作用的化合物的研究中。
[0094] 在某些实施方案中，一种或多种介质组分可以被具有类似性质的其他化学品取代。没有一种或多种非必要/非必需组分的如此修饰的介质在本公开的范围内。类似地，如果需要，技术人员可以通过例如基于特定组分的所列浓度或浓度范围或从其开始，测试每种组分的一系列浓度(例如，约10％、约25％、约50％、约75％、约100％、约2-、约5-、约10-、约20-、约50-、约100-、约200-、约500-、约1000-倍高，或者约10％、约25％、约50％、约75％、约100％、约2-、约5-、约10-、约20-、约50-、约100-、约200-、约500-、约1000-倍低)来确定特定细胞类型或应用的任何给定组分的最佳水平。在进行此类测试时，可以根据初始实验的结果随后收窄初始的宽范围浓度测试。例如，对于初始测试，一种目的组分的浓度可以改变为表2中所列浓度的约10-3、约10-2、约10-1、约10倍，约100倍或约1000倍。如果约10-2的测试仍然支持所需的生长，而大约10-3的测试不能，则可以在第二轮测试中进一步探索约10-2和约10-3之间的约10倍浓度差异，以确定最佳范围。因此，针对特定细胞类型或应用进行优化的介质也在本公开的范围内。
[0095] 对于本领域普通技术人员显而易见的是，给定成分的浓度可以增加或减少超过本文公开的范围，并且可以确定增加或减少浓度的影响。可以使用Ham(Ham，Methods for Preparation of Media,Supplements and Substrata for serum-Free Animal Culture,Alan R.Liss，Inc.,New York，pp.3-21,1984)和Waymouth(Waymouth，C.，Methods for Preparation of Media，Supplements and Substrata for serum-Free Animal Culture,Alan R.Liss，Inc.,New York,pp.23-68,1984)所描述的方法进行对于任何特定细胞类型和应用的本发美介质制剂的优化。介质成分的最佳终浓度可通过实证研究、单组分滴定研究或通过历史和当前科学文献的解释来确定。在单组分滴定研究中，使用动物细胞，改变单一培养基组分的浓度，同时保持所有其他成分和变量恒定，并测量单一组分对动物细胞的活力、生长或持续健康的影响。类似地，可以使用单组分滴定研究来确定哪种介质组分负责或影响特定细胞表型或应答，其可以包括完全省略给定的非必需组分和/或测试不同浓度的此类组分对目的细胞表型或应答的影响。
[0096] 应当理解，本文提及的某些维生素、生长因子、激素或细胞因子可以以本领域已知的不同形式存在(例如，不同的天然存在的或非天然存在的形式)，并且可以使用作为彼此的替代品。在本申请指定使用特定维生素、生长因子、激素或细胞因子的情况下，本公开内容应理解为涵盖使用具有相似生物学活性的任何形式的此类维生素、生长因子、激素或细胞因子(或使用可以在细胞培养基中或细胞内修饰或代谢以提供生物学活性形式的化合物)的实施方案。可以调整量以提供相同的生物学活性。
[0097] 在一些实施方案中，在各种实施方案中，培养基成分可以溶解在液体运载体(carrier)中或保持干燥形式。如果以本文所述的优选浓度溶解在液体运载体中(即，“1×制剂”)，则可将介质的pH调节至约7.0-7.6，例如约7.1-7.5，例如约7.2-7.4。可以将介质的重量摩尔渗透压浓度调节至上述优选范围，例如通过补充NaCl。液体运载体的类型和用于将成分溶解到溶液中的方法可以变化，并且可以由本领域普通技术人员确定。通常，可以以任何顺序添加介质成分。
[0098] 细胞培养基由许多成分组成，并且这些成分在培养基之间变化。“1×制剂”是指含有以工作浓度在细胞培养基中发现的一些或所有成分的任何水溶液。术语“1×制剂”可以指例如细胞培养基或该介质成分的任何亚组。1×溶液中成分的浓度与用于体外维持或培养细胞的细胞培养制剂中发现的成分的浓度大致相同。根据定义，用于体外培养细胞的细胞培养基是1×制剂。当存在许多成分时，1×制剂中的每种成分的浓度约等于细胞培养基中那些成分的浓度。例如，RPMI-1640培养基含有0.2g/L L-精氨酸、0.05g/L L-天冬酰胺和0.02g/L L-天冬氨酸等成分。这些氨基酸的“1×制剂”在溶液中含有大约相同浓度的这些成分。因此，当提及“1×制剂”时，是指溶液中的每种成分具有与所述细胞培养基中发现的相同或大致相同的浓度。多种细胞培养基的1×制剂中成分的浓度是本领域普通技术人员所熟知的。参见，例如，Freshney，2010和Liss，同上。然而，与培养基相比，重量摩尔渗透压浓度和/或pH在1×制剂中可能不同，特别是当1×制剂中含有较少的成分时。
[0099] “10×制剂”意指一种溶液，其中该溶液中的每种成分是细胞培养基中相同成分的约10倍浓缩。例如，RPMI-1640培养基的10×制剂可以含有2.0g/L L-精氨酸、0.5g/L L-天冬酰胺和0.2g/L L-天冬氨酸等成分(与1×制剂相比较，以上)。“10×制剂”可以含有浓度是在1×培养基中浓度的约10倍的许多其他成分。显而易见的是，“25×制剂”、“50×制剂”、“100×制剂”、“500×制剂”和“1000×制剂”表示与1×细胞培养基相比，分别含有约25-、约50-、约100-、约500-或约1000-倍浓度的成分的溶液。同样，介质制剂和浓缩溶液的重量摩尔渗透压浓度和pH可以变化。当本文提及培养基的组分浓度时，这些浓度用于1×制剂，除非另有说明或从上下文中清楚地显而易见。本公开内容还提供10×制剂、25×制剂、50×制剂、100×制剂、250×制剂、500×制剂和1000×制剂，以及具有1×至1000×之间的中间浓
度的其他制剂。可以制备更高浓度的制剂，条件是成分保持可溶和稳定。参见美国专利号5,
474,931，其涉及以高浓度溶解培养基组分的方法。培养基的某些组分可以制备成任何上述浓度或更高浓度的溶液，例如2500×、5000×、10000×或更高。
度的其他制剂。可以制备更高浓度的制剂，条件是成分保持可溶和稳定。参见美国专利号5,
474,931，其涉及以高浓度溶解培养基组分的方法。培养基的某些组分可以制备成任何上述浓度或更高浓度的溶液，例如2500×、5000×、10000×或更高。
[0100] 如果将培养基成分制备成单独的浓缩溶液，则将适当(足够)量的每种浓缩物与稀释剂混合以生产1×培养基制剂。通常，使用的稀释剂是水，但在某些实施方案中可以使用其他溶液，包括水性缓冲液、水性盐溶液或其他水性溶液。
[0101] 通常对本发明的培养基进行灭菌以防止不希望的污染。灭菌可以通过例如在混合浓缩成分以生产无菌培养基之后通过孔径为约0.1-1.0μm的低蛋白质结合膜过滤器(可商购获得，例如，来自Millipore，Bedford，Mass.)进行过滤来完成。备选地，可以将成分的浓缩亚组过滤灭菌并作为无菌溶液储存。然后可以在无菌条件下将这些无菌浓缩物与无菌稀释剂混合以生产浓缩的1×无菌培养基制剂。高压灭菌或其它基于高温的灭菌方法不受青睐，因为本发明培养基的许多组分是热不稳定的，并且会在诸如在大多数热灭菌方法期间达到的温度下不可逆地降解。
[0102] 对于本领域普通技术人员显而易见的是，培养基的每种组分可以与溶液中的一种或多种其他组分反应。因此，本发明涵盖本文公开的制剂(例如，包含表2中所列组分的制剂)，以及在这些成分组合后形成的任何反应混合物。
[0103] 本文所述的培养基可以由分别从多种化学品供应商如Sigma购买的单个组分制成。表2列出了根据多个供应商的当前目录的某些介质组分的产品编号，但是应该理解，这些组分可以从不同的供应商获得或合成。
[0104] 在一些实施方案中，可以方便地将包含多种组分的某些市售组合物混合和补充另外的组分以制备培养基。例如，在某些实施方案中，培养基可包含与本文所述的其他组分(例如，盐、氨基酸、葡萄糖、极性代谢物)组合的RPMI 100X维生素混合物(Sigma R7256)至大约如本文所述的其相应浓度。
[0105] 在一些方面，本公开内容提供了制备细胞培养基的方法，包括将本文公开的组分组合以形成本文所述的任何培养基。在一些方面，本公开内容提供了制备细胞培养基的方法，包括将本文公开的组分组合以形成本文所述的任何基础培养基，并将血清或支持物质的另一种来源添加至基础培养基。
[0106] 除非另有说明，如本文所用，变化多至X％意味着相对于所列值±X％的变化。例如，如果所列值是100μM，则变化25％意味着该值的范围可以是约75μM至约125μM(即约75-125μM)。除非另有说明，否则在公开一系列值的情况下，端点包括在该范围内。还提供了其中排除端点的实施方案，以及其中包括一个端点而排除另一个端点的实施方案。此外，应理解，除非另外指出或从上下文和本领域普通技术人员的理解中另外显而易见，否则表示为范围的值可以在各种实施方案中假定在所述范围内的任何特定值或子范围，例如在范围下限的十分之一单位内，除非上下文另有明确规定。还应理解，在本文中陈述一系列数值的情况下，本发明包括涉及由系列中的任何两个值确定的任何居间值或范围的实施方案，其中最低值可以被视为最小和最大值可以被视为最大。
[0107] 应当理解，某些组分可以作为盐、酯、生物学活性代谢物或衍生物提供，或作为由细胞或在培养基中代谢、加工或分解以产生本文公开的某些组分的生物学活性形式的前体提供。在该上下文中，“生物学活性”是指组分在细胞培养基中存在时对细胞发挥其所需作用的能力。某些化合物，例如某些介质组分，可以以特定的几何或立体异构形式存在。包括顺式和反式异构体，E-和Z-异构体，R-和S-对映体，非对映体，(D)-异构体，(L)-异构体，(-)-和(+)-异构体，其外消旋混合物和其它混合物的这些化合物包括在本公开内容的各种实施方案中，除非另有说明。某些化合物可以以实体或质子化状态存在，可以具有多种构型，可以作为溶剂化物(例如，与水(即水合物)或普通溶剂)存在和/或可以具有不同的结晶形式(例如，多晶型物)或不同的互变异构形式。在适用的情况下，本公开内容涵盖表现出这种替代质子化状态、构型、溶剂化物和形式的实施方案。
[0108] 本文所述的介质可以是液体或固体粉末，或者两者的组合。在一些实施方案中，液体形式可以含有介质的所有组分。备选地，液体介质可以作为单独的包装储存，使得每个单独的包装可以在其适当的条件(温度、湿度等)储存。例如，如果需要在本公开的介质中，表2中所列的大多数或所有组分可以预先溶解在单一溶液中并在适当的条件储存(例如，约2-8℃，例如，约4℃，在黑暗和干燥的地方等)。其他组分，可能在其他组分的储存条件长期条件下不稳定，或者可能与其他组分反应缓慢，或者可能更好地保存为单独的储存，例如，为了方便或优选，可能是存储在不同的条件(例如约-20℃或约-80℃等)。仅在使用之前很短时间或之前立即，将这些单独存储的组分放在一起以构成整个介质。每个单独的包装可以单独市售或出售，或者作为不同的浓缩储备液(例如2×、5×、10×、100×、1000×等)。
[0109] 类似地，介质或单个组分可以是干粉形式，其在用含水性介质(例如水)重构时将产生所需的介质或其浓缩的储备液(例如，2×、5×、或10×等)。在一些实施方案中，介质的至少一些组分是液体/水性形式。在一些实施方案中，介质的至少一些或所有组分是固体/粉末形式。应根据组分的特性适当地储存组分，例如储备溶液，包括在储存温度的稳定性(例如，液氮、约-80℃、约-20℃、约4℃、室温或约20-25℃等)，对光的敏感性，在水性溶液或有机溶液中的自然半衰期等。一些储备溶液可优选定期重制以保持新鲜储备液。在一些实施方案中，一种或多种组分可以新鲜制备，例如由介质的使用者从粉末或更高浓度的溶液并添加到作为液体提供的其他组分中。在一些实施方案中，例如，可以新鲜制备葡萄糖、尿素和/或尿酸。在实施例中描述了制备示例性储备溶液的方法(参见表7)。本领域普通技术人员将理解，可以使用许多其他类似或等同的方法和浓度的储备溶液。在一些实施方案中，介质可以作为一组储备溶液、粉末或两者提供，例如作为包含多个单独容器的试剂盒，每个容器包含含有一种或多种组分的储备溶液或粉末。试剂盒可包括一种或多种稀释剂，用于溶解作为粉末提供的组分。
[0110] 在一种或多种组分基本上不影响(例如，不利地影响)介质对于期望的应用的性能的程度上，培养基在某些实施方案中可以包括并耐受一种或多种这样的组分的存在。可存在于基础培养基的某些实施方案中的其他组分的实例包括痕量金属、亲脂性代谢物和维生素。在某些实施方案中，本公开内容的介质可以基本上不含这些或其他组分中的任何一种或多种。在一些实施方案中，介质基本上不含一种或多种特定的组分。在一些实施方案中，“基本上不含”是指对细胞生长和/或代谢没有统计学显着影响的低量组分。在一些实施方案中，“基本上不含”是指小于约0.01％、约0.001％或约0.0001％的v/v液体或w/v溶质。在一些实施方案中，“基本上不含”是指小于约0.001mg/L、约0.0001mg/L、约0.00001mg/L、约0.000001mg/L或约0.0000001mg/L的浓度。在一些实施方案中，“基本上不含”是指小于约
10nM、约1nM、约1μM、约10μM或约100μM的浓度。在一些实施方案中，“基本上不含”是指不含该物质的介质，这意味着该物质不存在于介质中，或者如果存在，则低于该物质的最敏感的本领域公认的测定法的检测限，可以是生物测定法、质谱、NMR、色谱测定法等。
10nM、约1nM、约1μM、约10μM或约100μM的浓度。在一些实施方案中，“基本上不含”是指不含该物质的介质，这意味着该物质不存在于介质中，或者如果存在，则低于该物质的最敏感的本领域公认的测定法的检测限，可以是生物测定法、质谱、NMR、色谱测定法等。
[0111] 在一些实施方案中，基础培养基基本上不含至少以下痕量金属：铁(Fe)、锌(Zn)、锂(Li)、硒(Se)、铬(Cr)、铜(Cu)、锰(Mn)、钒(Vn)、钼(Mo)、硅(Si)、镍(Ni)、钴(Co)和锡(Sn)。在一些实施方案中，可以包含一种或多种这样的痕量金属作为基础介质的组分或添加到基础介质或完全介质中。痕量金属可以以各种形式提供，例如以盐的形式，例如CuSO4、ZnSO4、FeSO4、Fe(NO3)3)、MnCl2、Na2SeO3、Na2SiO3、(NH4)6Mo7O24、NH4VO3、NiSO4或SnCl2。在一些实施方案中，任何这样的痕量金属可以以在正常成人血浆中这种痕量金属的浓度多至约0.25、约0.5、约0.75、约1、约1.25、约1.5、约2、约2.5或约3倍的浓度存在。
[0112] 在一些实施方案中，基础培养基基本上不含亲脂性代谢物。如本文所用，“亲脂性代谢物”是指包含或是以下任何一种的衍生物的化合物：脂肪酸、胆固醇、胆固醇酯、神经酰胺、甘油二酯、神经节苷脂、甘油磷酸胆碱、单酰基甘油酯、磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、鞘磷脂和甘油三酯。在一些实施方案中，可以包含一种或多种这样的亲脂性代谢物作为基础介质的组分或添加到基础介质或完全介质中。在一些实施方案中，任何此类亲脂性代谢物可以以在正常成人血浆中此类亲脂性代谢物浓度的至多约0.25、约0.5、约0.75、约1、约1.25、约1.5、约2、约2.5或约3倍的浓度存在。
[0113] 在一些实施方案中，基础培养基基本上不含除生物素、胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、对氨基苯甲酸、D-泛酸、维生素B6、核黄素、硫胺素和维生素B12之外的维生素。在一些实施方案中，除一种或多种前述维生素外，基础培养基还包含一种或多种维生素。可以作为基础介质的组分包含或添加到基础介质或完全介质中的其他维生素包括例如维生素C、维生素D、维生素K3、维生素E和维生素A。在一些实施方案中，任何这样的维生素可以以在正常成人血浆中此类维生素的浓度多至约0.25、约0.5、约0.75、约1、约1.25、约1.5、约2、约2.5或约3倍的浓度存在。在一些实施方案中，一种或多种小极性代谢物以正常成人血浆中此类维生素浓度的约0.5至约2倍存在，例如，表2中对于此类代谢物所列浓度的约0.67至约1.5倍，在正常成人血浆中此类维生素浓度的约±30％，约±20％，约±10％，或约±5％内。
[0114] 在一些实施方案中，基础培养基基本上不含在正常成年人血液中的典型浓度<约6μM的代谢物，不同于可以如本文所述存在的维生素。在一些实施方案中，可以包括在正常成人血液中浓度<约6μM的一种或多种代谢物作为基础介质的组分或添加到基础介质或完全介质中。在某些实施方案中，例如，将在缺乏一种或多种特定代谢物的培养基中培养的细胞与在相同培养基但添加在正常成人血液中浓度<6μM的所选一种或多种代谢物中培养的细胞进行比较可能是有意义的。这种比较可包括进行本文所述的任何测定法并比较结果。在一些实施方案中，任何此类代谢物可以以成人血浆中此类代谢物浓度的多至约0.25、约0.5、约0.75、约1、约1.25、约1.5、约2、约2.5或约3倍的浓度存在。
[0115] 在某些实施方案中，在基础培养基或完全培养基中可明确包括或明确排除选自2-羟基戊二酸、乙酰天冬氨酸盐、乙酰肉碱、乙酰丝氨酸、乌头酸盐、尿囊素、氨基己二酸盐、精氨琥珀酸盐、不对称二甲基精氨酸、β-丙氨酸、肌肽、胞苷、脱氧胞苷、富马酸盐、犬尿氨酸、苹果酸盐、甲硫氨酸亚砜、假尿嘧啶核苷、核糖醇、山梨糖醇、胸苷、三甲基赖氨酸、尿嘧啶、尿苷、黄嘌呤和黄嘌呤核苷的任何一种或多种代谢物。在一些实施方案中，包括在前述化合物列表中的至少一种氨基酸或氨基酸衍生物。在一些实施方案中，包括至少一种化合物，其包含化合物列表中所列任何这些化合物的嘌呤、嘧啶、核苷、核苷酸或衍生物。例如，在一些实施方案中，介质包含尿苷，例如浓度为约2μM至约4μM。例如，在某些实施方案中，培养基含有一种或多种(例如2种、3种或全部)的乙酰肉碱、α-酮戊二酸盐，尿苷和苹果酸盐。
[0116] 在一些实施方案中，任何此类代谢物可以以表3中所列此类代谢物浓度的多至约0.25、约0.5、约0.75、约1、约1.25、约1.5、约2、约2.5或约3倍的浓度存在。在某些实施方案中，培养基具有的任何一种或多种代谢物的浓度为表3中所列此类代谢物浓度的约0.3至约
3倍，例如，表3中所列此类代谢物浓度的约0.5至约2倍，例如，表3中所列此类代谢物浓度的约0.67至约1.5倍，在表3中所列这些代谢物浓度的约±30％内，在表3中所列此类代谢物浓度的约±20％内，在表3中所列此类代谢物浓度的约±10％内，在表3中所列此类代谢物浓度的约±5％内，在表3中种所列此类代谢物浓度的约±2％内，或在表3中所列此类代谢物浓度的约±1％内，或约等于表3中所列这些代谢物的浓度。在某些实施方案中，培养基具有表3中所列每种代谢物的浓度，其存在于介质中为表3中所列此类代谢物浓度的约0.3至约3倍，例如，表3中所列此类代谢物浓度的约0.5至约2倍，例如，表3中所列此类代谢物浓度的约0.67至约1.5倍，在表3中所列此类代谢物浓度的约±30％内，在表3中所列此类代谢物浓度的约±20％内，在表3中所列此类代谢物浓度的约±10％内，在表3中所列此类代谢物浓度的约±5％内，在表3中此类这些代谢物浓度的±2％内，或在表3中所列此类代谢物浓度的约±1％内，或约等于在表3中所列这些代谢物的浓度，或等于在表3中所列这些代谢物的浓度。
3倍，例如，表3中所列此类代谢物浓度的约0.5至约2倍，例如，表3中所列此类代谢物浓度的约0.67至约1.5倍，在表3中所列这些代谢物浓度的约±30％内，在表3中所列此类代谢物浓度的约±20％内，在表3中所列此类代谢物浓度的约±10％内，在表3中所列此类代谢物浓度的约±5％内，在表3中种所列此类代谢物浓度的约±2％内，或在表3中所列此类代谢物浓度的约±1％内，或约等于表3中所列这些代谢物的浓度。在某些实施方案中，培养基具有表3中所列每种代谢物的浓度，其存在于介质中为表3中所列此类代谢物浓度的约0.3至约3倍，例如，表3中所列此类代谢物浓度的约0.5至约2倍，例如，表3中所列此类代谢物浓度的约0.67至约1.5倍，在表3中所列此类代谢物浓度的约±30％内，在表3中所列此类代谢物浓度的约±20％内，在表3中所列此类代谢物浓度的约±10％内，在表3中所列此类代谢物浓度的约±5％内，在表3中此类这些代谢物浓度的±2％内，或在表3中所列此类代谢物浓度的约±1％内，或约等于在表3中所列这些代谢物的浓度，或等于在表3中所列这些代谢物的浓度。
[0117] 表3：某些其他代谢物
[0118]代谢物名称 浓度(uM)
2-羟基 0.7
乙酰 5.79
尿囊素 2.1
己二酸 2
不对称二甲基精氨酸 0.505
β-丙氨酸 2.72
肌肽 6.54
胞苷 0.175
脱氧胞苷 0.2
富马酸盐 1.5
犬尿氨酸 1.8
苹果酸盐 7.6
甲硫氨酸亚砜 4
假尿嘧啶核苷 3.18
核糖醇 0.46
山梨糖醇 7.045
胸苷 0.205
尿嘧啶 1.135
尿苷 3.11
黄嘌呤 1.43
黄嘌呤核苷 5.08
2-羟基 0.7
乙酰 5.79
尿囊素 2.1
己二酸 2
不对称二甲基精氨酸 0.505
β-丙氨酸 2.72
肌肽 6.54
胞苷 0.175
脱氧胞苷 0.2
富马酸盐 1.5
犬尿氨酸 1.8
苹果酸盐 7.6
甲硫氨酸亚砜 4
假尿嘧啶核苷 3.18
核糖醇 0.46
山梨糖醇 7.045
胸苷 0.205
尿嘧啶 1.135
尿苷 3.11
黄嘌呤 1.43
黄嘌呤核苷 5.08
[0119] 在某些实施方案中，培养基含有浓度为4μM至8μM，例如5μM至6μM，进一步例如5μM的苹果酸盐。在某些实施方案中，培养基含有浓度为4μM至8μM，例如5μM至6μM，进一步例如5μM的α-酮戊二酸盐。在某些实施方案中，培养基含有浓度为4μM至8μM，例如5μM至6μM，进一步例如5μM的乙酰肉碱。在某些实施方案中，培养基含有浓度为1μM至5μM，例如2μM至4μM，进一步例如3μM的尿苷。
[0120] 在某些实施方案中，基础细胞培养基基本上不含以下生长因子中的任何一种或多种：EGF、FGF、IGF-1、IGF-2、PDGF、VEGF、集落刺激因子1(CSF-1)、集落刺激因子2(CSF-2)和集落刺激因子2(CSF-3)。在一些实施方案中，可以将一种或多种生长因子添加至基础介质或完全介质中。在一些实施方案中，可以添加任何这样的因子，使得其以正常成人血浆中的这种因子浓度的多至约0.25、约0.5、约0.75、约1、约1.25、约1.5、约2、约2.5或约3倍的浓度存在。在某些实施方案中，基础细胞培养基基本上不含生长因子。
[0121] 在某些实施方案中，基础细胞培养基基本上不含以下激素中的任何一种或多种：皮质醇、雌激素、生长激素、胰岛素、孕酮、睾酮和三碘甲状腺原氨酸(T3)。在一些实施方案中，可以将一种或多种激素添加到基础介质或完全介质中。在一些实施方案中，可以添加任何这样的激素，使得其以正常成人血浆中这种激素浓度的多至约0.25、约0.5、约0.75、约1、约1.25、约1.5、约2、约2.5或约3倍的浓度存在。在某些实施方案中，基础细胞培养基基本上不含激素。
[0122] 在包含血清或其他至少部分未确定物质的培养基的那些实施方案中，任何一种或多种代谢物、生长因子、激素或其他化合物可以以血清或其他至少部分未确定物质所赋予的量存在于培养基中，除了基础培养基中存在的量(如果有的话)之外。生长因子、激素或其他蛋白质可以是重组蛋白质或可以从天然存在的来源中纯化。在某些实施方案中，可以使用重组人蛋白质。
[0123] 【II.使用方法】
[0124] 本文描述的培养基可用于培养广泛多种真核细胞中的任何一种。在一些实施方案中，本文所述的组合物和/或方法中使用的细胞是动物细胞。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞是灵长类动物细胞(人或非人灵长类动物)，啮齿动物(例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠)细胞，或犬科动物、猫科动物或牛细胞。在特别感兴趣的某些实施方案中，细胞是人细胞。应当理解，除非另有说明或从上下文中清楚地显而易见，否则本文中提及的细胞可以是人细胞。
[0125] 在多个实施方案中，细胞可以是原代细胞、永生化细胞、正常细胞、异常细胞、癌细胞、非癌细胞等。在一些实施方案中，细胞是体细胞。细胞可以源自特定的目的组织或器官，或者可以是特定细胞类型。原代细胞可以从受试者中新鲜分离，或者可以在培养中传代有限次数，例如在1-5次或在培养中经历少量群体倍增，例如1-5次群体倍增。在一些实施方案中，细胞是细胞群体的成员，例如非永生化或永生化细胞系的成员。在一些实施方案中，“细胞系”是指在培养中已经维持至少10次传代或至少10次群体倍增的细胞群体。在一些实施方案中，细胞系衍生自单个细胞。在一些实施方案中，细胞系衍生自多个细胞。在一些实施方案中，细胞系的细胞传代自源自单个样品(例如，获自肿瘤的样品)或个体的一个或多个细胞。细胞可以是细胞系的成员，其能够在培养中延长增殖，例如长于约3个月(适当时传代)或长于约25次群体倍增)。非永生化细胞系可以例如在衰老之前能够在培养物中进行约20-80次群体倍增。永生化细胞系已经获得了基本上无限的寿命，即细胞系似乎能够基本上无限增殖。出于此目的，在培养中已经经历或能够经历至少约100次群体倍增的细胞系可被认为是永生的。
[0126] 许多细胞系是本领域已知的。细胞系可以例如从保藏库或细胞库获得，例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Coriell Cell Repositories、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen和Zellkulturen(德国微生物和细胞培养物保藏中心；DSMZ)、欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)、日本研究生物资源集合(JCRB)、RIKEN、Cell Bank Australia等。上述保藏库和细胞库的论文和在线目录通过引用并入本文。如果需要，可以通过本领域已知的多种方法中的任何一种测试细胞以确认它们是否衍生自单个个体还是特定细胞系，例如DNA指纹分析(例如，短串联重复(STR)分析)或单核苷酸多态性(SNP)分析(可以使用例如SNP阵列(例如，SNP芯片)或测序进行)。
[0127] 在某些实施方案中，细胞依赖于锚定，这意味着细胞需要接触并锚定到稳定的表面以便存活、发挥功能和分裂。在某些实施方案中，细胞不依赖于锚定，这意味着细胞不需要接触并锚定到稳定的表面以便存活、发挥功能和分裂。不依赖锚定的细胞可以是通常依赖于锚定，但是天然地或通过人为干预操作的结果丧失了这种依赖性的细胞类型。
[0128] 在某些实施方案中，细胞包括血液细胞，在本文中也称为血细胞。血液细胞包括骨髓和淋巴谱系的细胞。骨髓谱系细胞包括但不限于单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞和血小板。淋巴谱系细胞包括淋巴细胞，例如T细胞、B细胞和天然杀伤细胞。T细胞可以包括CD4+辅助性T细胞(其包括Th1、Th2和Th17细胞)、CD8+细胞毒性T细胞和/或杀伤性T细胞。在一些实施方案中，血液细胞包括外周血单核细胞。在一些实施方案中，血液细胞包括树突细胞。在某些实施方案中，细胞包括血液癌细胞。在一些实施方案中，细胞包括内皮细胞。在一些实施方案中，细胞包括上皮细胞。在一些实施方案中，细胞包括肝细胞、，成纤维细胞、角质形成细胞、黑素细胞、成骨细胞、破骨细胞、软骨细胞、神经元、神经胶质细胞、间充质细胞或脂肪细胞。
[0129] 在某些实施方案中，细胞包括干细胞。干细胞可以是多能干细胞，例如胚胎干细胞或诱导多能干细胞(iPS)，或可以是具有更受限制的发育潜力的干细胞，例如成体干细胞，例如造血干细胞、肠干细胞、神经干细胞、间充质干细胞、脂肪来源的干细胞或内皮干细胞。在一些实施方案中，干细胞是多能的。在一些实施方案中，干细胞是单能的。
[0130] 在某些实施方案中，细胞包括正常的非癌细胞。在一些实施方案中，细胞包括癌细胞。癌细胞可以源自任何类型的癌症，例如本文提及的任何癌症类型。在一些实施方案中，癌细胞是基因工程化改造的细胞，其可以通过将一种或多种癌基因引入非癌细胞和/或通过灭活非癌细胞中的一种或多种肿瘤抑制细胞来产生。示例性癌细胞系描述于实施例中。许多其他癌细胞系是本领域已知的。在一些实施方案中，癌细胞系是包括在癌细胞系百科全书(CCLE)中的癌细胞系(Barretina，J.,et al.,(2012)Nature 483:603-607；
portals.broadinstitute.org/ccle/home)。在一些实施方案中，癌细胞，例如癌细胞系，源自人肿瘤。在一些实施方案中，癌细胞(例如癌细胞系)源自在非人动物中产生的肿瘤。在一些实施方案中，癌细胞，例如癌细胞系，源自天然产生的癌症(即，例如，为了实验目的而不是故意诱导或产生的肿瘤)。在一些实施方案中，癌细胞包括血液癌细胞，例如白血病或淋巴瘤细胞。在一些实施方案中，癌细胞包括癌或肉瘤细胞。在一些实施方案中，癌细胞包括癌干细胞。
portals.broadinstitute.org/ccle/home)。在一些实施方案中，癌细胞，例如癌细胞系，源自人肿瘤。在一些实施方案中，癌细胞(例如癌细胞系)源自在非人动物中产生的肿瘤。在一些实施方案中，癌细胞，例如癌细胞系，源自天然产生的癌症(即，例如，为了实验目的而不是故意诱导或产生的肿瘤)。在一些实施方案中，癌细胞包括血液癌细胞，例如白血病或淋巴瘤细胞。在一些实施方案中，癌细胞包括癌或肉瘤细胞。在一些实施方案中，癌细胞包括癌干细胞。
[0131] 在一些实施方案中，细胞源自患有目的疾病的受试者。细胞可以具有一个或多个突变和/或可以表现出与疾病相关的一种或多种表型。本领域普通技术人员知道许多与疾病相关的突变。许多人类基因和人类疾病相关突变的概要提供在McKusick V.A.(1998)Mendelian Inheritance in Man.A Catalog of Human Genes and Genetic Disorders,12th Ed.The Johns Hopkins University Press.Baltimore.Md.及其在线更新版本
Online Mendelian Inheritance in Man(OMIM)，可在国家生物技术信息中心(NCBI)网站上获得。本领域普通技术人员知道可能引起多种疾病(例如癌症)的许多散发性突变。在一些实施方案中，衍生自患有目的疾病和/或具有一种或多种疾病相关突变的受试者的细胞可以用作疾病的细胞模型。这些细胞可以在培养基中培养并用于例如研究疾病和/或鉴定或表征潜在的治疗剂。
Online Mendelian Inheritance in Man(OMIM)，可在国家生物技术信息中心(NCBI)网站上获得。本领域普通技术人员知道可能引起多种疾病(例如癌症)的许多散发性突变。在一些实施方案中，衍生自患有目的疾病和/或具有一种或多种疾病相关突变的受试者的细胞可以用作疾病的细胞模型。这些细胞可以在培养基中培养并用于例如研究疾病和/或鉴定或表征潜在的治疗剂。
[0132] 在一些实施方案中，细胞包括遗传修饰的细胞。遗传修饰的细胞包括基因组的稳定修饰或稳定的染色体外元件的引入以及瞬时修饰，其中用作转录或翻译的模板的外源核酸已被引入细胞但随着细胞分裂，基因组的序列不被修饰并且核酸不被复制和/或丢失。产生遗传修饰细胞的方法是本领域熟知的。例如，在一些实施方案中，通过引入包含编码目的蛋白质或RNA的序列的载体，从初始细胞群体产生测试细胞。可以通过转染、感染或本领域已知的其他方法将核酸或载体引入细胞中。可以使细胞与合适的试剂(例如转染试剂)接触，以促进细胞对核酸或载体的摄取。在一些实施方案中，遗传修饰是稳定的，使得其被引入载体或核酸的细胞的后代遗传。稳定的遗传修饰通常包括改变细胞的基因组DNA，例如将外源核酸插入基因组或者缺失或替换基因组DNA的一个或多个核苷酸。应理解，术语“遗传修饰的”是指原始的遗传修饰的细胞或细胞群体及其后代。因此，本文所述方法中使用的遗传修饰的细胞可以是原始遗传修饰的细胞的后代。遗传修饰涵盖通过例如引入转基因、基因敲除和基因组编辑来稳定修饰基因组，例如通过使用聚集的规则间隔短回文重复/CRISPR相关蛋白(CRISPR/Cas)技术、转录激活因子样效应核酸酶(TALENs)或锌指。修饰可以包括基因组的编码区或非编码区中的插入、取代、缺失和/或易位。在一些实施方案中，修饰包括插入表位标签或编码蛋白质的基因，所述蛋白质产生光学可检测信号(例如，光的发射和/或吸收)。这些蛋白质包括例如荧光素酶(例如，来自Oplophorus gracilirostris的萤火虫、海肾或Gaussia荧光素酶或荧光素酶(NanoLuc[NL]))和荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)。荧光蛋白的非限制性实例包括GFP及其衍生物，包含发射不同颜色光的发色团的蛋白质，例如红色、黄色和青色荧光蛋白等。示例性荧光蛋白包括例如天狼星、蓝铜矿、EBFP2、TagBFP、mTurquoise、ECFP、Cerulean、TagCFP、mTFP1、mUkG1、mAG1、AcGFP1、TagGFP2、EGFP、mWasabi、EmGFP、TagYPF、EYFP、Topaz、SYFP2、Venus、Citrine、mKO、mKO2、mOrange、mOrange2、TagRFP、TagRFP-T、mStrawberry、mRuby、mCherry、mRaspberry、mKate2、mPlum、mNeptune、mTomato、T-Sapphire、mAmetrine、mKeima。参见，例如，Chalfie,M.和Kain,SR(eds.)Green fluorescent protein:properties,applications,and protocols(Methods of biochemical analysis,v.47)。Wiley-Interscience,Hoboken,N.J.,2006和/或
Chudakov,D M,et al.,Physiol Rev.90(3):1103-63,2010，用于讨论GFP和许多其他荧光或发光蛋白。在一些实施方案中，遗传修饰包括产生或纠正疾病相关突变。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞表达癌基因或嵌合抗原受体，例如嵌合T细胞受体。例如，细胞可以是嵌合抗原受体(CAR)T细胞。
Chudakov,D M,et al.,Physiol Rev.90(3):1103-63,2010，用于讨论GFP和许多其他荧光或发光蛋白。在一些实施方案中，遗传修饰包括产生或纠正疾病相关突变。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞表达癌基因或嵌合抗原受体，例如嵌合T细胞受体。例如，细胞可以是嵌合抗原受体(CAR)T细胞。
[0133] 在一些实施方案中，在本公开内容的培养基中培养的细胞是特定细胞类型或细胞系的纯细胞群体。在一些实施方案中，群体是至少约80％纯，例如至少约85％、约90％、约95％、约99％或更纯。在一些实施方案中，可以基于例如细胞表面标志物表达来分离或纯化特定类型的细胞。在一些实施方案中，共培养两种或更多种可区分的哺乳动物细胞群体。细胞可以是不同细胞类型。在一些实施方案中，细胞包括癌症细胞和癌症相关细胞(例如，基质细胞)。在一些实施方案中，细胞包括两种或更多种类型的免疫细胞，例如淋巴细胞的混合群体。在一些实施方案中，在介质中培养包含不同DNA条形码的多个细胞。此类细胞可具有不同的遗传修饰(例如，不同基因的敲除)。
[0134] 可以使用本领域已知的标准培养技术培养细胞。在一些实施方案中，细胞可以维持在约5％-10％的CO2环境中。在一些实施方案中，细胞可以维持在约2％-20％的O2环境中。通常，哺乳动物细胞可以维持在通常用于培养哺乳动物细胞的范围内的温度的培养中，例如，约36-38℃，例如37℃。应当理解，哺乳动物细胞也可以耐受更低或更高的温度。细胞可以作为贴壁细胞在悬浮液中或在表面上培养。它们可以在各种类型的培养容器中培养，例如烧瓶、瓶子、盘子、平板、管等，其可以由塑料、玻璃或其他合适的物质制成。在一些实施方案中，可以处理这种容器的表面以使其适合于哺乳动物细胞培养。在一些实施方案中，细胞可以在多孔板中的培养基中培养，多孔板例如，具有4至9600个孔，例如6、24、96、384或1536个孔。
[0135] 在一些实施方案中，细胞可以在介质上或在包含一种或多种细胞外基质(ECM)组分(例如胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖等)的物质中培养。例如，细胞可以培养在 上或中。在一些方面，细胞可以在三维水凝胶或可以用作支架的其他材料中培养。合适的材料包括例如动物ECM提取物水凝胶、蛋白质水凝胶、肽水凝胶，包含一种或多种非多肽聚合物的聚合物水凝胶等。在一些实施方案中，培养基可以与一种或多种聚合物混合并用于产生水凝胶。在某些实施方案中，如果需要，培养基可以例如通过添加合适的冷冻保存剂来用于冷冻哺乳动物细胞。
[0136] 如实施例中进一步详细描述的，在本公开内容的培养基中培养哺乳动物细胞影响跨越多个途径的许多代谢物的细胞内丰度。在一些方面，本公开内容提供了哺乳动物细胞+IFS的群体，其与如果哺乳动物细胞在RPMI+10％IFS(也称为RPMI )中培养存在的一种或多种代谢物的水平相比，此类代谢物水平改变。
[0137] 在一些方面，本公开内容提供了已经在培养基中培养至少约24小时的哺乳动物细胞的群体。如果细胞是从一个或多个细胞传代的，那么细胞群体被认为已经在特定培养基中培养了给定的时间长度X，所述一个或多个细胞首先被放置在该培养基中至少那个时间长度并且培养在从那时起，介质一直不间断地进行(适当时用新介质替换)。在一些实施方案中，本公开内容提供了在本公开内容的培养基中培养至少约2、约3、约4、约5、约7、约14、约21或约28天或更长时间的哺乳动物细胞的群体。在一些实施方案中，本公开内容提供了在本公开内容的培养基中培养至少1、2、3、5、10、15、20或25代或更多代的哺乳动物细胞的群体。在一些实施方案中，本公开内容提供了在本公开内容的培养基中培养至少1、2、3、5、10、15、20或25个细胞倍增时间或更长的哺乳动物细胞的群体。
[0138] 如实施例中所述，在一些实施方案中，发现在如本文公开的培养基中培养的细胞具有比在RPMI+IFS中培养的相同细胞系的细胞更高的细胞内水平的卡巴酰天冬氨酸盐、二氢乳清酸盐、乳清酸盐和/或乳清酸核苷。在一些方面，本公开内容提供了哺乳动物细胞或哺乳动物细胞群体，其具有的氨基甲酰基天冬氨酸盐、二氢乳清酸盐、乳清酸盐和/或乳清酸盐的细胞内浓度是当细胞在RPMI+IFS中培养时，这种代谢物的细胞内浓度高于细胞内浓度至少2倍高(例如，在2倍至约1500倍之间)。
[0139] 在一些方面，本公开内容提供了哺乳动物细胞或细胞群体，其具有尿酸的细胞内浓度是当细胞在RPMI+IFS中培养时，尿酸的细胞内浓度的至少约2倍(例如，约2倍至约1500倍)。在一些方面，本公开提供了哺乳动物细胞或细胞群体，其具有至少约50μm，例如，约50μm至约1500μm，例如，约100μm至约500μm，约500μm至约1000μm，或约1000μm至约1500μm，例如约1000μm或约1100μm的尿酸的细胞内浓度。
[0140] 在一些方面，本公开内容的培养基可用于培养在其上进行一种或多种测定法的哺乳动物细胞。使用哺乳动物细胞的许多测定法是本领域已知的。测定法可用于广泛多种目的。例如，它们可用于鉴定候选治疗剂或针对活性表征试剂，例如针对潜在治疗或毒性活性，针对对一种或多种内源基因产物(例如蛋白质)的表达或活性或者生物途径的抑制性或刺激性作用，或鉴定影响一种或多种目的细胞表型的基因。筛选可以包括对受到不同扰动的细胞群体或多个单独的细胞群体进行测定法。扰动可以是，例如，暴露于不同的化合物和/或遗传修饰。可以进行筛选以鉴定对细胞或基因产物具有目的作用的试剂或基因。目的作用可以是例如抗增殖作用、增殖促进作用、促细胞凋亡作用、抗细胞凋亡作用、抑制作用、活化作用等。在一些实施方案中，筛选包括测试至少约10、至少约100、至少约1,000、至少约10,000或更多种不同的测试剂或遗传修饰。可以对全细胞或从细胞分离的细胞器(例如，线粒体、细胞核)、细胞裂解物、蛋白质、RNA或其他细胞成分进行测定法。
[0141] 如本文所用的“试剂”是指任何物质、分子、超分子复合物、材料或者其组合或混合物。术语“试剂”与本文的“化合物”可互换使用。在一些方面，试剂可以由化学式、化学结构或序列表示。试剂的实例包括例如小分子、多肽、核酸(例如，RNAi试剂，例如短干扰RNA、反义寡核苷酸、适体)、脂质、多糖等。在一些实施方案中，试剂是细胞可渗透的，例如，在细胞摄取并在细胞内作用的典型试剂范围内，例如在哺乳动物细胞内，产生生物学作用。“测试剂”是指任何待测试或正在测试或已经测试其对细胞的影响或与细胞相互作用的试剂。测试可以包括测试剂对细胞的影响的任何类型的表征或分析。本文描述的任何试剂可以用作测试剂。在一些实施方案中，测试剂不是本文描述为培养基组分的任何化合物。
[0142] 在一些实施方案中，试剂是小分子。如本文所用，“小分子”是指质量小于约2千道尔顿(kDa)的有机化合物。在一些实施方案中，小分子小于约1.5kDa，或小于约1kDa。在一些实施方案中，小分子小于约800道尔顿(Da)、约600Da、约500Da、约400Da、约300Da、约200Da或约100Da。通常，小分子具有至少约50Da的质量。在一些实施方案中，小分子是非聚合的。在一些实施方案中，小分子不是氨基酸或氨基酸衍生物。在一些实施方案中，小分子不是核苷酸。在一些实施方案中，小分子不是糖。在一些实施方案中，小分子含有多个碳-碳键并且可以包含一个或多个杂原子和/或一个或多个对于与蛋白质的结构相互作用重要的官能团(例如，氢键)，例如胺、羰基、羟基、羧基或羧基，并且在一些实施方案中，至少两个官能团。
小分子通常包含一个或多个环碳或杂环结构和/或芳族或多芳族结构，任选地被一个或多个上述官能团取代。应当理解，小分子包括电中性化合物以及多原子离子，其可以作为盐提供。
小分子通常包含一个或多个环碳或杂环结构和/或芳族或多芳族结构，任选地被一个或多个上述官能团取代。应当理解，小分子包括电中性化合物以及多原子离子，其可以作为盐提供。
[0143] 在一些实施方案中，试剂是批准的药物。“批准的药物”是指经政府管理机构(例如美国FDA或对其他管辖区域的治疗性试剂批准具有类似权限的政府机构)批准的试剂或组合物，以允许试剂或组合物市售、推广、分销、出售或以其他方式提供商业用于治疗人类或用于兽医目的。
[0144] 在一些实施方案中，试剂是酶调控剂或受体调控剂。“调控”(和诸如“在调控”、“调控的”的相关术语)意指引起或促进目的分子、过程、途径或现象的定性或定量改变、变化或修饰。“调控”包括引起目的分子、过程、途径或现象的水平或活性的增加或降低，例如，抑制或激活目的分子、过程、途径或现象。
[0145] 在一些实施方案中，试剂包含可检测标签。如本文所用，“可检测标签”是指具有至少一个并入到该部分中的元件、同位素或官能团的部分，其能够检测分子，例如小分子、核酸或多肽，或其他标签所附的实体。标签可以直接附着(即，通过键合)或可以通过系绳附着。应当理解，标签可以在任何位置附着或掺入分子，例如小分子、多肽或其他实体。通常，标签可以属于五类中的任何一种(或更多种)：(a)含有同位素部分的标签，其可以是放射性的或是重同位素，包括但不限于2H、3H、13C、14C、.15N、18F、31P、32P、35S、67Ga、76Br、99mTc(Tc-99m)、111In、123I、125I、131I、153Gd、169Yb和186Re；(b)含有免疫部分的标签，所述免疫部分可以是抗体或抗原，其可以与酶结合(例如辣根过氧化物酶)；(c)是有色、发光、磷光或荧光部分(例如荧光标签异硫氰酸荧光素(FITC))的标签；(d)具有一个或多个光亲和部分的标签；
(e)是一种或多种已知结合配偶体(例如，生物素-链霉抗生物素蛋白，FK506-FKBP)的配体的标签。在某些实施方案中，标签包括放射性同位素，例如发射可检测粒子例如β粒子的同位素。在某些实施方案中，试剂包含放射性标记的糖、氨基酸、嘌呤、嘧啶、核苷或核苷酸。
(e)是一种或多种已知结合配偶体(例如，生物素-链霉抗生物素蛋白，FK506-FKBP)的配体的标签。在某些实施方案中，标签包括放射性同位素，例如发射可检测粒子例如β粒子的同位素。在某些实施方案中，试剂包含放射性标记的糖、氨基酸、嘌呤、嘧啶、核苷或核苷酸。
[0146] 在一些实施方案中，试剂是抗癌剂。“抗癌剂”是指用于或开发用于治疗癌症的试剂。这些试剂包括多种小分子、蛋白质(例如单克隆抗体)，以及细胞疗法，例如过继细胞转移。“抗癌剂”包括相对非特异性细胞毒性剂或细胞抑制剂，例如抑制有丝分裂的那些(也称为“化学治疗剂”)，以及更有选择性地阻断细胞外生长信号的那些试剂(例如，信号转导的阻断剂)和来自经典内分泌激素(主要是乳腺癌的雌激素和前列腺癌的雄激素)的生长促进信号的阻断剂。化学治疗剂包括例如烷基化剂和类烷基化剂如氮芥(例如苯丁酸氮芥、氯甲炔、环磷酰胺、异环磷酰胺和美法仑)，亚硝基脲(例如卡莫司汀、福莫司汀、洛莫司汀、链脲佐菌素)；铂剂(例如，类烷基化剂如卡铂、顺铂、奥沙利铂、BBR3464、沙铂)，白消安，达卡巴嗪，丙卡巴肼，替莫唑胺，硫代TEPA，硫丹和奥莫司汀；抗代谢物如叶酸(如氨基喋呤、甲氨蝶呤、培美曲塞、雷替曲塞)；嘌呤例如克拉屈滨、氯法拉滨、氟达拉滨、巯嘌呤、喷司他丁、硫鸟嘌呤；嘧啶例如卡培他滨、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、氟尿嘧啶、吉西他滨；纺锤体毒物/有丝分裂抑制剂如紫杉烷(例如多西他赛、紫杉醇)，长春花碱(例如长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨)，埃坡霉素；细胞毒性/抗肿瘤抗生素如蒽环霉素(例如柔红霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌、匹克生琼和戊柔比星)，由各种链霉菌天然生产的化合物(例如放线菌素、博来霉素、丝裂霉素、普鲁卡霉素)和羟基脲；拓扑异构酶抑制剂如喜树(例如喜树碱、托泊替康、伊立替康)和鬼臼(例如依托泊苷、替尼泊苷)。其他抗癌剂包括用于癌症疗法的单克隆抗体，例如抗受体酪氨酸激酶抗体(例如，西妥昔单抗、帕尼单抗、曲妥珠单抗)，抗CD20(例如利妥昔单抗和托西莫单抗)，以及其他例如阿仑单抗、贝伐单抗、吉妥珠单抗；光敏剂如氨基乙酰丙酸、甲基氨基乙酰丙酸盐、卟吩姆钠和维替泊芬；酪氨酸和/或丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂，例如Abl的抑制剂、试剂盒、胰岛素受体家族成员、VEGF受体家族成员、EGF受体家族成员、PDGF受体家族成员、FGF受体家族成员、mTOR、Raf激酶家族成员、磷脂酰肌醇(PI)激酶如PI3激酶、PI激酶样激酶家族成员、MEK激酶家族成员，JAK激酶家族成员、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)家庭成员、极光激酶家族成员。市场上用于治疗癌症或已在癌症的至少一项III期试验中显示功效的激酶抑制剂包括西地尼布、克唑替尼、达沙替尼、达布拉非尼、厄洛替尼、依维莫司、吉非替尼、伊马替尼、拉帕替尼、尼罗替尼、索拉非尼、舒尼替尼、托法替尼、坦罗莫司、曲美替尼、凡德他尼和维罗非尼。其他抗癌剂包括生长因子受体拮抗剂；类视黄醇(例如，阿利维A酸和维A酸)，六甲蜜胺，安吖啶，阿那格雷，三氧化二砷，天冬酰胺酶(例如培门冬酶)，贝沙罗汀，地尼白介素，雌莫司汀，伊沙匹隆，马索罗酚，米托坦和睾内酯，Hsp90抑制剂，蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米、卡非佐米、伊沙佐米、德兰佐米、奥普佐米和marizomib)；血管生成抑制剂，例如抗血管内皮生长因子剂如贝伐单抗(Avastin)或包含可溶性VEGF受体结构域的试剂(例如阿柏西普)，基质金属蛋白酶抑制剂，促细胞凋亡剂(例如细胞凋亡诱导剂，例如Bcl-2抑制剂(例如obatoclax、navitoclax、gossypol)，Ras抑制剂；癌症疫苗；其他免疫调控疗法，如检查点抑制剂(例如，与免疫检查点分子结合的单克隆抗体，例如CTLA4抑制剂如伊匹单抗(ipilimumab)，PD-1抑制剂如纳武单抗(nivolumab)和pembrolizumab，PD-L1拮抗剂如atezolizumab)；靶向癌基因的RNAi剂等。应当理解，许多抗癌剂具有多种活性或作用机制，并且可以分为多个类别或种类或者有额外的作用机制或目标。
[0147] 可以使用任何合适的方法测量试剂或遗传修饰对细胞活力、增殖、基因表达、蛋白质活性、形态、迁移或任何其他细胞特性、过程、表型或生物学途径的影响。在某些实施方案中，细胞或细胞群体的存活和/或增殖可以通过以下来确定：细胞计数测定法(例如，使用视觉检查、自动图像分析、流式细胞仪等)，复制测定法，细胞膜完整性测定法，基于细胞ATP的测定法，线粒体还原酶活性测定法，BrdU、EdU或H3-胸苷掺入测定法，钙黄绿素染色，使用核酸染料例如Hoechst染料，DAPI，放线菌素D，7-氨基放线菌素D或碘化丙啶的DNA含量测定法，细胞代谢测定法如刃天青(有时称为AlamarBlue或其他各种名称)、MTT、XTT和CellTitre Glo等，蛋白质含量测定法如SRB(磺酰罗丹明B)测定法；核片段化测定法；细胞质组蛋白相关DNA片段化测定法；PARP裂解测定法；TUNEL染色；或膜联蛋白染色。在一些实施方案中，通过测量编码介导细胞存活或增殖或细胞死亡的基因产物的一种或多种基因的表达来评估细胞存活或增殖，例如编码在细胞周期中发挥作用或调节细胞周期或细胞死亡(例如，细胞凋亡)的产物的基因。此类基因的实例包括例如细胞周期蛋白依赖性激酶、细胞周期蛋白、BAX/BCL2家族成员、胱天冬酶等。本领域普通技术人员将能够选择适当的基因用作细胞存活或增殖的指标。在一些实施方案中，细胞存活和/或增殖的测定法可以确定细胞数量，例如活细胞的数量，并且可以不特别地区分细胞存活本身和细胞增殖，例如，测定法结果可以反映存活和增殖的组合。在一些实施方案中，可以使用能够特异性评估存活或增殖或细胞死亡(例如细胞凋亡或坏死)的测定法。
[0148] 在一些方面，培养基可特别用于分析细胞代谢和/或鉴定或表征通过细胞代谢物或代谢途径起作用或与其相互作用的试剂。常规培养基和小鼠血浆很难反映人血浆的代谢物组成。如实施例中所述，在本发明培养基(称为HPLM并补充有10％IFS)的实施方案中培养，其比常规培养基更好地反映人血浆的代谢物组成，与在标准媒体中培养相比对细胞代谢具有广泛的作用。其中最重要的是参与嘧啶代谢的代谢物的细胞内丰度的改变。这种效应可追溯到尿酸，其在人血浆中的血浆浓度比大多数其他哺乳动物(包括小鼠和牛)高出一个数量级( 和Macarrón-Vicente，2010；Kratzer等，2014；Wu等，1992)。以人血浆中存在的浓度的尿酸是UMP合酶(UMPS)的内源性抑制剂，UMPS是催化从头嘧啶生物合成途径的最后两个步骤的酶。与UMPS的其他小分子抑制剂类似，尿酸诱导乳清酸盐积累，其进而拮抗5-FU至介导其细胞毒性作用的氟核苷酸衍生物的代谢。所公开的培养基可以使得能够研究例如细胞代谢并鉴定受环境代谢组成影响的新的肿瘤特异性负责或代谢物-药物相互作用。
[0149] 如实施例中所述，多种人类血液学癌症在HPLM+dIFS中以与在RPMI+IFS和RPMI+dIFS中的那些相当的速率(尽管通常较低)增殖。不希望受任何理论的束缚，如果使用所公开的培养基而不是在常规细胞培养基中进行，旨在预测试剂对体内人细胞增殖的影响的测定法可能更准确。
[0150] 在一些实施方案中，测定法包括测量(i)一种或多种细胞内物质(例如，代谢物、RNA、蛋白质)的水平，(ii)一种或多种物质(例如，代谢物、分泌蛋白质)的分泌进入培养基，(iii)氧化还原状态，(iv)葡萄糖利用；或(v)一种或多种代谢途径、细胞信号传导途径或酶的活性水平。本领域普通技术人员知道可用于检测或测量代谢物、RNA和蛋白质的水平的适当测定法。例如，可以使用质谱法检测或测量代谢物(其可以在使用例如气相色谱、高效液相色谱或质谱法进行分离之前)，核磁共振(NMR)，离子迁移谱，电化学检测(与HPLC相连)，拉曼光谱或放射性标签。可以使用涉及杂交和/或扩增的方法检测或测量RNA，例如Northern印迹，微阵列，nCounter技术，定量逆转录PCR，或通过基于测序的方法，例如基因表达的连续分析(SAGE)或RNA测序(RNA-Seq)。蛋白质可以使用免疫学方法使用结合待检测蛋白质的抗体或其他基于亲和力的方法来测量。可用于检测和测量蛋白质的示例性方法包括例如免疫组织化学(IHC)；酶联免疫吸附测定法(ELISA)，基于珠子的测定法例如
测定平台，流式细胞术，蛋白质微阵列，表面等离子体共振测定法，免疫沉淀，
免疫印迹(Western印迹)和质谱。可以对细胞进行的其他目的测定法包括例如报道子测定法，ChIP-芯片，ChIP-Seq，亚硫酸氢盐测序和染色体构象捕获。在一些实施方案中，测定法包括检测DNA修饰(例如甲基化)，蛋白质修饰(例如组蛋白修饰或蛋白质磷酸化)，转录或DNA修复。在一些实施方案中，使用在测试剂存在下在培养基中培养的细胞进行测定法，并将结果与参考值进行比较。参考值可以是在不存在测试剂的情况下使用相同类型的细胞进行相同测定法时获得的结果。如果结果与参考值不同，则可以得出结论，测试剂影响在测定法中测量的分子、途径或过程的水平或活性。
测定平台，流式细胞术，蛋白质微阵列，表面等离子体共振测定法，免疫沉淀，
免疫印迹(Western印迹)和质谱。可以对细胞进行的其他目的测定法包括例如报道子测定法，ChIP-芯片，ChIP-Seq，亚硫酸氢盐测序和染色体构象捕获。在一些实施方案中，测定法包括检测DNA修饰(例如甲基化)，蛋白质修饰(例如组蛋白修饰或蛋白质磷酸化)，转录或DNA修复。在一些实施方案中，使用在测试剂存在下在培养基中培养的细胞进行测定法，并将结果与参考值进行比较。参考值可以是在不存在测试剂的情况下使用相同类型的细胞进行相同测定法时获得的结果。如果结果与参考值不同，则可以得出结论，测试剂影响在测定法中测量的分子、途径或过程的水平或活性。
[0151] 目的代谢途径包括例如糖酵解、氧化磷酸化、嘌呤生物合成、嘧啶生物合成、脂肪酸生物合成，仅举几个例子。在一些实施方案中，在培养基中培养的细胞可用于鉴定或表征可影响葡萄糖代谢、脂质代谢、DNA或RNA合成和氧化磷酸化的试剂。这些过程中的缺陷涉及广泛的人类疾病，包括例如心血管疾病、糖尿病、动脉粥样硬化和代谢综合征。在培养基中培养的细胞可用于鉴定或表征可能有效用于治疗此类疾病的试剂，例如，纠正与此类疾病相关的代谢缺陷。
[0152] 目的细胞信号传导途径包括例如TGFβ、Wnt、BMP、Notch、Hedgehog、HGF-Met、EGF、IGF、PDGF、FGF、P38-MAP激酶、Ras、PI3Kinase-Akt、Src和NF-kB途径。在一些实施方案中、测定法包括鉴定或表征抑制或激活一种或多种所述途径的试剂。
[0153] 在一些实施方案中，测定法包括检测细胞凋亡、坏死、自噬、迁移、上皮-间充质转换、T细胞活化、T细胞效应子功能或细胞的任何功能活性。
[0154] 在一些实施方案中，可以在培养基中培养期间或之后使细胞与可检测标签接触。在一些实施方案中，测定法包括成像或荧光激活细胞分选。
[0155] 在一些实施方案中，测试剂或试剂组合以确定其是否具有抗癌作用或使用在培养基中培养的细胞来量化抗癌作用。在一些实施方案中，抗癌作用是抑制癌细胞存活或增殖。应当理解，试剂或试剂组合对细胞增殖或存活的抑制可能是或可能不是完全的。例如，细胞增殖可以或可以不降低至完全停滞的状态，其效果被认为是抑制或减少细胞增殖之一。在一些实施方案中，“抑制”可以包括抑制处于非增殖状态的细胞的增殖(例如，处于G0状态的细胞，也称为“静止”)和/或抑制增殖中细胞(例如，非静止的细胞)的增殖。类似地，细胞存活的抑制可以指杀死一个或多个细胞，例如通过引起或促进坏死或细胞凋亡，和/或使细胞易于死亡的过程，例如，引起或增加细胞发生细胞凋亡或坏死的倾向。抑制可以是参考水平(例如，对照水平)的至少约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或约100％。在一些实施方案中，抗癌作用是抑制癌细胞在悬浮培养物中或在半固体介质(例如软琼脂或甲基纤维素)中形成集落的能力或在低附着表面如聚(2-甲基丙烯酸羟乙酯)上生长的能力。在一些实施方案中，抗癌作用是抑制一种或多种癌细胞在培养物中形成肿瘤球的能力。可以在集落形成测定法、生长测定法或肿瘤球形成测定法之前和/或期间在培养基中培养癌细胞。在一些实施方案中，抗癌作用是在引入至非人哺乳动物例如小鼠中后抑制一种或多种癌细胞在体内形成癌症的能力。
[0156] 在一些实施方案中，测定法包括测量在本文公开的培养基中培养的细胞的生长速率。在一些实施方案中，细胞在已加入测试剂的培养基中培养。在一些实施方案中，测定法包括使用在已添加测试剂的培养基中培养的细胞测量测试剂的EC50。
[0157] 在一些实施方案中，使用在培养基中培养的细胞进行测定法，并将结果与使用相同类型但在常规培养基(例如，RPMI+IFS)中培养的细胞进行相同的测定法获得的结果进行比较。如果结果存在差异，则可以得出结论，在测定法中分析或测试的测试剂(或其活性)或者细胞过程、性质、表型或生物途径受环境代谢组成的影响。如果需要，可以鉴定影响测试剂、活性、细胞过程、性质、表型或生物途径的特定代谢物，例如，通过从培养基中系统地省略一种或多种代谢物或代谢物组并确定哪种由此产生的培养基产生不再显示作用。如果省略特定代谢物或代谢物组在很大程度上或完全消除了这种作用，则可以推断这些代谢物是造成这种作用的原因。该方法可用于例如鉴定可能影响治疗剂的功效和/或毒性的代谢物-药物相互作用。
[0158] 在一些方面，测定法可以包括将一种或多种试剂或遗传修饰对癌细胞的作用与这些试剂或遗传修饰对非癌细胞(例如，与癌细胞相同细胞类型的非癌细胞)的作用进行比较，或比较一种或多种试剂或遗传修饰对两种或更多种不同类型癌细胞的作用。例如，这种比较可以鉴定肿瘤特异性可靠性(与非癌细胞相比，在癌细胞(或特定癌症类型)中存在或更明显的脆弱性)，然后可以将其开发用于治疗目的。
[0159] 在一些实施方案中，在培养基中培养的细胞可以用于个性化医疗。例如，细胞可以从受试者中分离，在介质中培养，并用于测试一种或多种治疗剂的作用，例如，以鉴定有效杀死细胞的试剂或试剂组合。在某些实施方案中，细胞包括癌细胞，并且该方法可用于选择合适的试剂或试剂组合来治疗受试者。如本文所用，术语“受试者”是指可从中分离细胞和/或可向其施用试剂的个体，是指任何动物。在某些实施方案中，受试者是哺乳动物。在特别感兴趣的某些实施方案中，术语“受试者”是指人。
[0160] 在一些实施方案中，在本文公开的培养基中培养的细胞可以用于细胞疗法目的。在此类实施方案中，培养基可以不含血清和其他至少部分未表征的动物衍生产物。“细胞疗法”是指为了治疗目的将活细胞引入受试者体内。细胞可以是自体的或非自体的。细胞疗法涵盖过继免疫疗法(其中将免疫细胞如T细胞引入受试者)，细胞或组织移植(例如，干细胞或祖细胞疗法，例如用于再生医学目的)，以及引入具有释放可溶性因子如细胞因子、趋化因子和生长因子的能力。不希望受任何理论的束缚，已经在含有成人血液中存在但在常规培养基中不存在的小极性化合物的培养基中培养的细胞或组织比在缺乏这些组分的培养基中培养的细胞或组织，可能更好地适应一旦被引入受体它们将遇到的条件。不希望受任何理论的束缚，已经在含有成人血液中存在但在常规培养基中不存在的小极性化合物的培养基中培养的细胞或组织比在缺乏这些成分的培养基中培养的细胞或组织，可能在引入受体后更有效地存活和/或起作用。
[0161] 在一些实施方案中，在所公开的培养基中培养的细胞可以用于诊断目的。例如，细胞可以衍生自怀疑患有病症(例如代谢病症)的受试者，并在介质中培养，随后可以测量一种或多种细胞内的或分泌的代谢物的水平并与参考水平进行比较。参考水平可以是，例如，衍生自健康受试者的对照细胞中存在或分泌的此类代谢物的水平，或衍生自已知患有特定疾病的受试者的细胞中存在或分泌的此类代谢物的水平。
[0162] 在一些实施方案中，在培养基中培养的细胞可用于生产目的产物，例如治疗上有用的蛋白质。
[0163] 【III.其他方法和组合物】
[0164] 在一些方面，尿酸可以充当UMP合酶(UMPS)的抑制剂，该酶催化从头嘧啶生物合成途径的最后两个步骤。本文描述了调控哺乳动物细胞中UMPS活性的方法，该方法包括使细胞与调控细胞中尿酸水平的试剂接触。在一些实施方案中，该方法包括使细胞与增加尿酸水平的试剂接触，从而抑制UMPS。在一些实施方案中，该方法包括使细胞与降低尿酸水平的试剂接触，从而增加UMPS的活性。本文还描述了调控哺乳动物受试者中UMPS活性的方法，该方法包括向受试者施用调控尿酸水平的试剂。在一些实施方案中，该方法包括向受试者施用尿酸降低剂，从而增加UMPS的活性。在一些实施方案中，该方法包括向受试者施用尿酸升高剂，从而降低UMPS的活性。
[0165] 在一些方面，本公开提供了对细胞内代谢物可以影响治疗剂活性的见解。例如，代谢物可以抑制治疗剂，从而降低其功效。代谢物可直接地(即通过与其结合)或间接地影响治疗剂的活性。间接抑制可以是由于代谢物调控，例如抑制细胞内酶的活性引起。细胞内酶可以是作用于治疗剂以将其转化为更具活性形式的酶。
[0166] 在一些方面，本文描述了调控治疗剂活性的方法，该方法包括调控影响治疗剂活性的代谢物的细胞内水平。在一些实施方案中，代谢物增加治疗剂的活性，从而增加其功效，并且该方法包括增加代谢物的水平。可以通过例如施用代谢物本身、施用代谢物的前体或者施用导致代谢物排泄减少或代谢物生产增加的试剂来增加代谢物的水平。在一些实施方案中，代谢物降低治疗剂的活性，从而降低其功效，并且该方法包括降低代谢物的水平。可以通过例如施用导致代谢物的排泄增加或生产减少或者使代谢物降解的试剂来降低代谢物的水平。本文举例说明了调控治疗剂活性的某些方法，其中治疗剂是5-氟尿嘧啶(5-FU；CAS登记号51-21-8)或5-FU前药，并且代谢物是尿酸。例如，如本文所述，尿酸抑制UMPS。
通过抑制UMPS，尿酸诱导乳清酸盐的积累，这进而拮抗5-FU对介导其细胞毒性作用的氟核苷酸衍生物的代谢。例如，乳清酸盐与5-FU竞争通过UMPS的乳清酸盐磷酸核糖转移酶
(OPRT)结构域而直接转化为FUMP。因此，尿酸在人血浆中发现的典型浓度抑制5-FU的活性。
然而，所公开的方法适用于其他治疗剂和代谢物。在一些实施方案中，治疗剂是抗癌剂。在一些实施方案中，治疗剂是抗代谢物。在一些实施方案中，治疗剂是嘌呤类似物、嘧啶类似物、核苷类似物或核苷酸类似物。
通过抑制UMPS，尿酸诱导乳清酸盐的积累，这进而拮抗5-FU对介导其细胞毒性作用的氟核苷酸衍生物的代谢。例如，乳清酸盐与5-FU竞争通过UMPS的乳清酸盐磷酸核糖转移酶
(OPRT)结构域而直接转化为FUMP。因此，尿酸在人血浆中发现的典型浓度抑制5-FU的活性。
然而，所公开的方法适用于其他治疗剂和代谢物。在一些实施方案中，治疗剂是抗癌剂。在一些实施方案中，治疗剂是抗代谢物。在一些实施方案中，治疗剂是嘌呤类似物、嘧啶类似物、核苷类似物或核苷酸类似物。
[0167] 在某些实施方案中，治疗剂是5-FU或5-FU前药。如本文所用的术语“前药”是指在施用于受试者后转化为药理学活性的或药理学活性更高的化合物的化合物。5-FU本身就是一种前药。5-FU和5-FU前药用于治疗多种癌症。“癌症”是指一类疾病，其特征在于异常细胞(癌细胞)的发展，其不受控制地增殖并且具有渗透和破坏正常身体组织的能力。术语“癌症”可与本文的“肿瘤”或“赘生物”互换使用，并且可用于指受试者中特定的实体肿瘤块或癌症细胞组以及疾病本身。癌症包括以恶性实体肿瘤块(例如，癌、肉瘤)的形成为特征的那些疾病，以及可能没有可检测的实体肿瘤块的血液癌，例如白血病。如本文所用，术语“癌症”包括但不限于以下类型的癌症：乳腺癌；胆道癌；膀胱癌；脑癌(例如，胶质母细胞瘤(例如，星形细胞瘤)、成神经管细胞瘤)；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠癌；子宫内膜癌；食道癌；胃癌；血液系统癌症；上皮内赘生物包括Bowen病和Paget病；肝癌(例如，肝细胞癌)；肺癌(例如，支气管肺癌、小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺腺癌)；淋巴瘤包括霍奇金病和非霍奇金淋巴瘤；神经母细胞瘤；黑色素瘤；眼癌(例如，眼内黑素瘤、视网膜母细胞瘤)；口腔癌(例如口腔鳞状细胞癌)；卵巢癌(例如，由上皮细胞、基质细胞、生殖细胞或间充质细胞产生)；胰腺癌；前列腺癌；直肠癌；肛门癌；肉瘤包括血管肉瘤、胃肠道间质瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤和骨肉瘤；肾癌包括肾细胞癌和肾母细胞瘤(Wilms tumor)；皮肤癌，包括基底细胞癌和鳞状细胞癌；睾丸癌包括生殖器肿瘤，如精原细胞瘤，非精原细胞瘤(畸胎瘤、绒毛膜癌)，间质瘤和生殖细胞肿瘤；喉癌(例如，喉癌、咽癌、鼻咽癌、口咽癌)，甲状腺癌(例如，甲状腺腺癌和髓样癌)。“癌”是指由上皮细胞产生或认为产生的癌症，例如，癌症的细胞具有上皮细胞典型的各种分子、细胞和/或组织学特征。“血液学癌症”是指造血和淋巴组织的癌症。血液学癌症包括例如白血病，淋巴瘤，多发性骨髓瘤，其他恶性浆细胞肿瘤，例如髓外浆细胞瘤，骨髓增生异常综合征和骨髓增生性疾病。白血病包括例如髓性白血病(例如，急性髓性白血病(AML，也称为急性髓性白血病或急性非淋巴细胞白血病)、急性早幼粒细胞白血病(APL)、急性髓单核细胞白血病(AMMoL))、慢性髓性白血病(CML))和淋巴样白血病(例如，急性淋巴细胞白血病(ALL，也称为急性淋巴细胞白血病)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和毛细胞白血病)。淋巴瘤包括例如非霍奇金淋巴瘤(例如，B细胞淋巴瘤(例如，套细胞淋巴瘤、小B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、巨球蛋白血症(也称为淋巴浆细胞淋巴瘤))、T细胞淋巴瘤(例如，间变性
大细胞淋巴瘤(例如，ALK阳性或ALK阴性)、外周T细胞淋巴瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤)和NK细胞淋巴瘤)和霍奇金淋巴瘤。
大细胞淋巴瘤(例如，ALK阳性或ALK阴性)、外周T细胞淋巴瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤)和NK细胞淋巴瘤)和霍奇金淋巴瘤。
[0168] 5-FU前药包括氟嘧啶卡培他滨(CAS登记号154361-50-9)和替加氟(CAS登记号0017902-23-7)。根据本公开的某些实施方案，通过向受试者施用尿酸降低剂，增强哺乳动物受试者(例如人受试者)中氟嘧啶(例如5-FU)的活性。本公开内容提供了治疗需要治疗癌症的受试者的方法，该方法包括向受试者施用5-FU、5-FU前药或尿酸降低剂，使得受试者暴露于5-FU和尿酸降低剂。因此，在一些方面，本公开提供了组合疗法，其包含(i)5-FU或5-FU前药和(ii)尿酸降低剂。如本文所用，“组合疗法”是指施用两种或更多种试剂使得受试者同时暴露于两种试剂和/或根据预定的给药方案施用两种或更多种试剂，所述给药方案指定在允许试剂一起实现相对于任一试剂(或在3的情况下试剂的任何亚组合)单独施用而总体改善的治疗效果(可以增加功效，减少副作用或两者)的时间间隔内施用两种或更多试剂。在一些实施方案中，两种或更多种试剂可以在彼此的24、48或72小时内施用。在一些实施方案中，可以在彼此的1、2或4周内施用两种或更多种试剂。在一些实施方案中，5-FU或5-FU前药和尿酸降低剂在同一个组合物中施用。在一些实施方案中，5-FU或5-FU前药和尿酸降低剂在分开的组合物中施用。当在分开的组合物中施用时，在一些实施方案中，两种或更多种试剂可以在例如间隔多至24、48或72小时施用，或者在一些实施方案中，相隔多至1、2、
3或4周施用。在一些实施方案中，尿酸降低剂可以在施用-FU或5-FU前药之前至少多至24、
48或72小时施用，或反之亦然。在一些实施方案中，尿酸降低剂可以在施用-FU或5-FU前药之前至少多至1、2、3或4周施用，或反之亦然。应当理解，可以施用多剂量的每种试剂(例如，在数周或数月的时间内)。在一些实施方案中，施用一个或多个疗程。
3或4周施用。在一些实施方案中，尿酸降低剂可以在施用-FU或5-FU前药之前至少多至24、
48或72小时施用，或反之亦然。在一些实施方案中，尿酸降低剂可以在施用-FU或5-FU前药之前至少多至1、2、3或4周施用，或反之亦然。应当理解，可以施用多剂量的每种试剂(例如，在数周或数月的时间内)。在一些实施方案中，施用一个或多个疗程。
[0169] 在一些实施方案中，癌症选自肛门癌、乳腺癌、结肠直肠癌、食道癌、头颈癌、胰腺癌、胃癌和皮肤癌。
[0170] 在一些实施方案中，癌症包括癌症细胞(例如，在不存在尿酸抑制的情况下)至少部分地通过OPRT介导的合成来产生FUMP。例如，在一些实施方案中，通过OPRT介导的合成产生在癌症中产生的FUMP的至少约25％，至少约50％，至少约75％或更多(例如，在没有尿酸抑制的情况下)。
[0171] 在一些实施方案中，还可以用增加5-FU生物利用度的试剂治疗受试者，例如二氢嘧啶脱氢酶的抑制剂(例如，尿嘧啶、恩尿嘧啶或吉美嘧啶)和/或降低5-FU毒性的试剂，例如乳清酸盐磷酸核糖转移酶的抑制剂(例如，奥替拉西)。治疗癌症的方法可以进一步包括向受试者施用一种或多种这样的试剂。本领域普通技术人员认识到5-FU和5-FU前药通常与其他抗癌剂组合使用。例如，5-FU或5-FU前药可以与亚叶酸(也称为甲酰四氢叶酸)、奥沙利铂(或其他铂类药物，例如顺铂)和/或伊立替康(例如5-氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸和伊立替康)组合使用。治疗癌症的方法可以进一步包括向受试者施用一种或多种这样的试剂。
[0172] 如本文所用，关于受试者的“治疗”或“处理”，包括改善、治愈和/或维持治愈(即，预防或延迟复发和/或降低复发的可能性)疾病(例如，癌症)。疾病开始后的治疗旨在减少、改善或完全消除病症和/或其相关症状，以防止病症恶化，减缓进展速度，或防止病症一旦被消除后的再次发生(即，以防止复发)。治疗包括施用可能对病症本身不具有有益作用，但增加施用于受试者的对病症具有有益作用的第二试剂功效的试剂。
[0173] 在本文所述的任何组合物和/或方法的一些实施方案中，涉及增加尿酸水平的试剂，增加尿酸水平的试剂是尿酸本身。在一些实施方案中，降低尿酸水平的试剂是促尿酸排泄剂、黄嘌呤氧化酶抑制剂或尿酸酶。
[0174] 在本文所述的涉及尿酸降低剂的任何组合物和/或方法的一些实施方案中，尿酸降低剂是促尿酸排泄剂。促尿酸排泄剂是增加尿液中尿酸排泄，从而降低血液中尿酸的浓度的物质。这些试剂通常作用于肾脏的近端小管，在那里它们干扰尿酸从尿液中吸收回到血液中。在一些实施方案中，促尿酸排泄剂是URAT1抑制剂，即抑制尿酸转运蛋白1(URAT1)的化合物，URAT1是由基因SLC22A12编码的蛋白质并且通常在尿酸盐跨越肾近端小管的顶膜转运进入管状细胞中起作用。URAT1抑制剂包括氯沙坦、lesinurad(2-((5-溴-4-(4-环丙基萘-1-基)-4H-1,2,4-三唑-3-基)硫代)乙酸)(Miner,J.,等,(2016)Arthritis Res Ther.18(1):214)、UR-1102(Ahn,SO.,等,(2016)J Pharmacol Exp Ther.357(1):157-66)、丙磺舒和苯溴马隆。在一些实施方案中，尿酸降低剂例如URAT1抑制剂，是美国专利号2013/
0202573、2014/0142185、2015/0203490、2015/0191463、2015/0322006；2016/0221970；和/或2016/0250193中任一项所述的化合物。
0202573、2014/0142185、2015/0203490、2015/0191463、2015/0322006；2016/0221970；和/或2016/0250193中任一项所述的化合物。
[0175] 在本文所述的与尿酸降低剂有关的任何组合物和/或方法的一些实施方案中，尿酸降低剂包括尿酸氧化酶(UO)，也称为尿酸酶，是催化尿酸氧化为5-羟基异脲的酶。尿酸酶可以从天然来源纯化或重组产生。拉布立酶(rasburicase)(美国的商品名 和欧洲的Fasturtec)是由遗传修饰的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株产生的尿酸氧化酶的重组形式。从黄曲霉(Aspergillus flavus)菌株克隆编码拉布立酶的cDNA。拉布立酶是一种四聚体蛋白，具有相同的多肽亚基，长301个氨基酸。本领域普通技术人员将理解可以使用来自其他生物(例如，其他真菌、植物、非人动物)的尿酸酶。用于其批准的适应症，即用于接受抗癌疗法的白血病、淋巴瘤和实体瘤恶性肿瘤患者中血浆尿酸水平的初始管理，接受抗癌疗法预计会导致肿瘤溶解和随后的血浆尿酸升高，拉布立酶的推荐剂量为
0.20mg/kg/天，每天静脉输注多至5天(Jena，2010)，但已经发现治疗期较短(如单次给药)、剂量较低或固定剂量(如3mg、6mg、7.5mg)在许多研究中是有效的(参见，例如，Trifilio SM.(2006)。单一3mg拉布立酶剂量用于管理血液恶性肿瘤患者中高尿酸血症的有效性已经描述在Bone Marrow Transplant.37:997–1001；McBride A,等(2013)Comparative
evaluation of single fixed dosing and weight-based dosing of rasburicase for tumor lysis syndrome has been described in Pharmacotherapy.33(3):295–303)。在一些实施方案中，本公开内容涵盖以约10μg/kg至约0.2mg/kg的剂量施用尿酸酶。在一些实施方案中，本公开内容涵盖向可能不是其施用候选者的受试者施用尿酸酶，例如，预期不会经历肿瘤溶解和血浆尿酸升高的受试者。
0.20mg/kg/天，每天静脉输注多至5天(Jena，2010)，但已经发现治疗期较短(如单次给药)、剂量较低或固定剂量(如3mg、6mg、7.5mg)在许多研究中是有效的(参见，例如，Trifilio SM.(2006)。单一3mg拉布立酶剂量用于管理血液恶性肿瘤患者中高尿酸血症的有效性已经描述在Bone Marrow Transplant.37:997–1001；McBride A,等(2013)Comparative
evaluation of single fixed dosing and weight-based dosing of rasburicase for tumor lysis syndrome has been described in Pharmacotherapy.33(3):295–303)。在一些实施方案中，本公开内容涵盖以约10μg/kg至约0.2mg/kg的剂量施用尿酸酶。在一些实施方案中，本公开内容涵盖向可能不是其施用候选者的受试者施用尿酸酶，例如，预期不会经历肿瘤溶解和血浆尿酸升高的受试者。
[0176] 在一些实施方案中，与5-FU或5-FU前药组合施用尿酸降低剂的受试者具有高于正常范围的尿酸水平。在一些实施方案中，与5-FU或5-FU前药组合施用尿酸降低剂的受试者具有正常范围内的尿酸水平。在一些实施方案中，施用尿酸降低剂的受试者不患有与异常升高的尿酸水平相关的病症，例如痛风。在一些实施方案中，使受试者的血浆尿酸水平降低约5％至约95％，例如至少约5％、约10％、约20％、约20％。30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％的量施用尿酸降低剂。在一些实施方案中，受试者的尿酸水平降低至低于约350μM，例如低于约300μM、低于约200μM、低于约150μM或低于约100μM。在一些实施方案中，血浆尿酸水平可以是在施用药物后约24小时测量的水平。
[0177] 在本文所述的涉及尿酸降低剂的任何组合物和/或方法的一些实施方案中，尿酸降低剂包括黄嘌呤氧化酶抑制剂。术语“黄嘌呤氧化酶抑制剂”是指抑制黄嘌呤氧化酶活性的物质，黄嘌呤氧化酶是参与嘌呤代谢的酶。对黄嘌呤氧化酶的抑制减少了尿酸的生产。在一些实施方案中，黄嘌呤氧化酶抑制剂包括非布索坦(febuxostat)或托匹司他(topiroxostat)。在一些实施方案中，黄嘌呤氧化酶抑制剂包括噻二唑并嘧啶-5-酮
(Sathisha KR，等(2016)Eur J Pharmacol.776：99-105)、芳基-2H-吡唑衍生物(Sun ZG，等(2015)Chem Pharm Bull(东京)；63(8):603-7)或2-氨基-5-亚烷基-噻唑-4-酮
(Smelcerovic Z，等(2015)Chem Biol Interact.2015；229:73-81)、2-(吲哚-5-基)噻唑衍生物(Song JU，等人(2015)Bioorg Med Chem Lett.25(6):1254-58)或1-羟基/甲氧基-4-甲基-2-苯基-1H-咪唑-5-羧酸衍生物(Chen S，等(2015)Eur J Med Chem.103:343-53)。在优选的实施方案中，黄嘌呤氧化酶抑制剂不抑制UMPS。例如，在一些实施方案中，黄嘌呤氧化酶抑制剂不包括抑制UMPS的嘌呤核苷酸，例如别嘌呤醇。在一些实施方案中，黄嘌呤氧化酶抑制剂不包括羟基嘌呤醇或tisupurine。在一些实施方案中，黄嘌呤氧化酶抑制剂不包括嘌呤核苷酸。在一些实施方案中，尿酸降低剂不包括黄嘌呤氧化酶抑制剂。
(Sathisha KR，等(2016)Eur J Pharmacol.776：99-105)、芳基-2H-吡唑衍生物(Sun ZG，等(2015)Chem Pharm Bull(东京)；63(8):603-7)或2-氨基-5-亚烷基-噻唑-4-酮
(Smelcerovic Z，等(2015)Chem Biol Interact.2015；229:73-81)、2-(吲哚-5-基)噻唑衍生物(Song JU，等人(2015)Bioorg Med Chem Lett.25(6):1254-58)或1-羟基/甲氧基-4-甲基-2-苯基-1H-咪唑-5-羧酸衍生物(Chen S，等(2015)Eur J Med Chem.103:343-53)。在优选的实施方案中，黄嘌呤氧化酶抑制剂不抑制UMPS。例如，在一些实施方案中，黄嘌呤氧化酶抑制剂不包括抑制UMPS的嘌呤核苷酸，例如别嘌呤醇。在一些实施方案中，黄嘌呤氧化酶抑制剂不包括羟基嘌呤醇或tisupurine。在一些实施方案中，黄嘌呤氧化酶抑制剂不包括嘌呤核苷酸。在一些实施方案中，尿酸降低剂不包括黄嘌呤氧化酶抑制剂。
[0178] 可以将试剂(例如，5-FU、5-FU前药或尿酸降低剂)与药学上可接受的运载体或媒介物等组合，以生产合适的药物组合物。术语“药学上可接受的运载体或媒介物”是指不破坏用其配制的化合物的药理学活性的无毒运载体或媒介物。本领域技术人员将理解，如果运载体或媒介物与以适于递送化合物而不引起过度毒性的量施用于受试者相容，则该运载体或媒介物是“无毒的”。可以使用的药学上可接受的运载体或媒介物包括但不限于水、生理盐水、林格氏溶液、乙酸钠或乙酸钾溶液、5％葡萄糖等。组合物可包括适合于所需制剂的其他组分。
[0179] 药物组合物可以通过任何合适的施用途径给予受试者，包括但不限于肠胃外途径，例如血管内(静脉内、动脉内)、肌肉内、皮下、脑内、鞘内、鼻内和肺部，以及肠内途径，例如口腔、舌下和直肠。在一些实施方案中，可以使用系统施用途径。在一些实施方案中，可以使用对受病症影响的组织或器官的局部施用。例如，在一些实施方案中，可以使用肿瘤内施用。
[0180] 化合物或组合物，例如药物组合物，可以以有效量使用或施用于受试者。在一些实施方案中，“有效量”是指足以在例如施用活性剂(或组合物)的受试者中引发一种或多种目的生物学应答的量。如本领域普通技术人员所理解的，有效的绝对量可以根据诸如生物学终点、特定活性剂、靶组织等因素而变化。本领域普通技术人员将进一步应理解，“有效量”可以以单剂量施用，或者可以通过施用多剂量来实现。在一些实施方案中，有效量的尿酸降低剂是足以将受试者的血尿酸水平降低至少约10％或至少约30μM的量。在一些实施方案中，有效量的尿酸降低剂可以是足以改善患有癌症的受试者中5-FU或5-FU前药的功效的量。在某些实施方案中，可以使用患有癌症的受试者的客观应答，例如，如使用实体瘤应答评价标准(RECIST)指南所定义的(Therasse，P.等，Journal of the National Cancer Institute，92(3):205-216(2000)或修订的RECIST指南(1.1版)(Eisenhauer，EA等，Eur J Cancer.45(2):228-47(2009))或其他公认的指南所定义的，例如对于血液癌症或脑肿瘤。例如，可以将结果分类为完全应答、部分应答、进行性疾病或稳定疾病。
[0181] 通常，合适的剂量将至少部分地取决于试剂的效力，施用药途径等。通常，本领域普通技术人员可以选择有效且耐受良好的剂量范围。可以使用本领域已知的临床试验确定这样的剂量。任选地，可以针对特定接受者定制剂量，例如，通过施用递增剂量直至达到预定的所需应答。如果需要，可以至少部分地基于多种因素选择任何特定受试者的特定剂量水平，所述因素包括所用特定化合物的活性、所治疗的具体病况和/或其严重程度、年龄、体重、一般健康、使用途径、任何并发医疗状态。在一些实施方案中，有效量或剂量范围为约0.001mg/kg体重至约500mg/kg体重，例如约0.01至约100mg/kg体重。可以基于体表面积而不是体重来计算剂量。在一些实施方案中，使用固定的剂量。在一些实施方案中，固定的剂量可以是，例如，约0.1mg至约1g活性剂。
[0182] 本领域普通技术人员容易理解，本发明非常适合于实现所述目标并获得所述的结果和优点，以及其中固有的结果和优点。本文的描述和实施例的细节是某些实施方案的代表，是示例性的，并不意图作为对本发明范围的限制。本领域技术人员将想到其中的修改和其他用途。这些修改涵盖在本发明的精神内。对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的范围和精神的情况下，可以对本文公开的发明进行各种替换和修改。
[0183] 除非明确相反指出，否则本说明书和权利要求书中使用的冠词“一”，“一个”和“该”应理解为包括复数指示物。如果组中一个、多于一个或所有组成员存在于给定产品或过程中，在其中使用或以其他方式与给定产品或过程相关，则认为在组中的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或描述是满足的，除非另有说明相反或从上下文中清楚地显而易见。本公开内容提供了实施方案，其中组的恰好一个成员存在于给定产品或过程中，在其中使用或以其他方式与给定产品或过程相关。本公开还提供了其中一个以上或所有组成员存在于给定产品或过程中，在其中使用或以其他方式与给定产品或过程相关的实施方案。此外，应理解，本公开内容提供了所有变型、组合和置换，其中来自所列出的一个或多个权利要求的一个或多个限制、要素、条款、描述性术语等被引入到从属于相同基础权利要求的另一个权利要求(或相关的任何其他权利要求)中，除非另有说明或者除非本领域普通技术人员明白会出现矛盾或不一致。涵盖本文描述的所有实施方案在适当的情况下适用于本文描述的所有不同方面。还涵盖任何实施例或方面或教导可以在适当时自由地与一个或多个其他这样的实施例或方面组合，并且不管这些实施例、方面或教导在何处出现在本公开。在元素以列表形式呈现的情况下，例如，以马库什组或类似格式表示，应当理解，还公开了元素的每个亚组，并且可以从组中移除任何元素。应当理解，通常，在本发明或本发明的方面被称为包括特定元件、特征等的情况下，本发明的某些实施例或本发明的方面由这些元件、特征等组成或基本上由这些元件、特征等组成。为简化起见，这些实施例并未在本文中以如此多的词语具体阐述。还应该理解，可以从权利要求中明确地排除任何实施例或方面，而不管说明书中是否叙述了特定排除。例如，可排除任何一种或多种组分、试剂、病症、受试者或其组合。
[0184] 在权利要求或描述涉及产品(例如，物质的组合物)的情况下，应当理解根据本文公开的任何方法制造或使用产品的方法，以及将产品用于本文共的任何一种或多种目的的方法在适用时涵盖在本公开内容内，除非另有说明或者除非本领域普通技术人员明白会出现矛盾或不一致。在权利要求或描述涉及方法的情况下，应当理解，用于执行该方法的一个或多个步骤的产品(例如，物质、装置或系统的组合)在适用时涵盖在本公开内容内，除非另有说明或者除非本领域普通技术人员明白会出现矛盾或不一致。
[0185] 在本文中陈述了一系列数值的情况下，提供了与由序列中的任何两个值定义的任何居间值或范围类似地关联的实施例，并且可以将最低值视为最小，并且可以将最大值视为最大。在诸如“至少”，“多至”或类似短语之类的短语在本文中的一系列数字之前的情况下，应理解该短语适用于各种实施方法中的列表中的每个数字，除非上下文另有明确说明。例如，在各种实施方案中，“至少1、2或3”应理解为表示“至少1、至少2、或至少3”。在适用的情况下，明确地涵盖任何和所有合理的下限和上限。本领域普通技术人员可以基于例如便利性、成本、时间、努力、可用性(例如，样品，试剂或试剂)、统计考虑等因素来选择或确定合理的下限或上限。在一些实施方案中，上限或下限可以与特定值相差2、3、5或10倍。
[0186] “近似”或“约”通常包括在任一方向上的1％的范围内或在一些实施方案中数字的5％范围内或在一些实施方案中数字的10％范围内的数字(大于或小于该数字)，除非另有说明或从上下文中清楚地显而易见(除非此类数字不允许超过可能值的100％)。因此，如本文所用，“约”包括比所述值高10％或低10％的值。在某些实施方案中，“约”表示所述值的±
10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％、±1％、±0.5或±0.1％。对于其中数值以“约”或“近似”开头的每个实施方案，提供了其中列举精确值的实施方案。对于其中数值不以“约”或“近似”开头的每个实施方案，提供了其中值以“约”或“近似”为前缀的实施方案。如本文所用，数值包括数字以及表示为百分比的值。
10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％、±1％、±0.5或±0.1％。对于其中数值以“约”或“近似”开头的每个实施方案，提供了其中列举精确值的实施方案。对于其中数值不以“约”或“近似”开头的每个实施方案，提供了其中值以“约”或“近似”为前缀的实施方案。如本文所用，数值包括数字以及表示为百分比的值。
[0187] 应当理解，除非明确相反地指出，否则在本文要求保护的包括一个以上动作的任何方法中，该方法的动作的顺序不必限于所述该方法的动作的顺序，但是本发明包括这样的实施例，其中顺序是这样限制的。在一些实施例中，方法可以由个人或实体执行。在一些实施例中，方法的步骤可以由两个或更多的个人或实体执行，使得共同执行方法。在一些实施例中，可以至少部分地通过请求或授权另一个人或实体执行方法的一个、多于一个或所有步骤来执行方法。
[0188] 还应理解，除非另有说明或从上下文中显而易见，否则本文所述的任何产品或组合物可被认为是“分离的”。
[0189] 本文使用的章节标题不应被解释为以任何方式进行限制。明确地涵盖在任何章节标题下呈现的主题可适用于本文描述的任何方面或实施方案。
[0190] 本文的实施方案或方面可涉及本文所述的任何组合物、制品、试剂盒和/或方法。涵盖任何一个或多个实施方案或方面可以在适当时自由地与任何一个或多个其他实施方案或方面组合。应当理解，本文任何地方的术语的任何描述或示例可以应用于此术语出现的任何地方(例如，在该术语相关的任何方面或实施方案中)，除非另有说明或明显不同。
[0191] 本文提及的所有出版物、专利、数据库和其他参考文献均通过引用整体并入本文。【实施例】
[0192] 【实施例1：反映人血浆的极性代谢物组成的细胞培养基】
[0193] 已知的合成细胞培养基，BME，MEM，DMEM和RPMI 1640含有葡萄糖、氨基酸、维生素和盐，其浓度在很大程度上不反映人血浆的浓度(图1A)。这些介质基还缺乏通过血浆的质谱和NMR分析显示而存在的其他组分(Psychogios等，2011)。相反，基础介质通常补充有热灭活的胎牛血清(IFS)，其对于代谢物的混合物以及细胞增殖所需的生长因子和激素是不确定且常常不明的(Freshney，2010)。因此，虽然环境因素对细胞代谢的影响得到重视(Davidson等，2016；DeNicola和Cantley，2015；Hensley等，2016；Maddocks等，2013；Mayers等，2016；Pavlova和Thompson，2016；Yuneva等人，2012)，但没有很大程度上探索在更好地反映人血浆的代谢物组成的培养基中培养细胞的询问(图1B)。
[0194] 本文公开了一种培养基，其具有以针对来自健康成年人的血浆而报告的浓度(人血浆样培养基；HPLM)的代谢物和盐离子的确定的集合(Psychogios等，2011；Wishart等，2013)。尽管一些无血清培养基已完全确定了配方，但它们通常需要对生长因子进行细致的定制以支持不同细胞类型的培养(Freshney，2010)。因此，已知的生长培养基补充有10％透析的IFS的HPLM(HPLM+dIFS)，以添加广泛细胞增殖所需的生长因子和激素，同时最小化未知浓度的极性代谢物的添加。本文详细描述了HPLM+dIFS，但是，简而言之，它含有葡萄糖、蛋白质原氨基酸、盐、27种另外的极性代谢物、10％透析的IFS和与RPMI 1640相同浓度的维生素(图1C，表2)；使用在生理pH的碳酸氢盐缓冲系统；并具有～295mOsm/kg的重量摩尔渗透压浓度。
[0195] 因为RPMI 1640(本文为RPMI)用于培养正常血细胞以及血液癌症细胞(Freshney，2010；Moore等，1967)，该介质用作比较HPLM+dIFS对细胞的作用的参考。使用两种RPMI制剂，每种制剂具有生理葡萄糖(5mM)，但补充有10％IFS(RPMI+IFS)或10％透析的IFS(RPMI+dIFS)。
代谢物谱分析证实IFS的透析显著地降低了其极性代谢物的水平(图1D，表5A和5B)。此外，它还揭示了胎牛血清不能很好地反映成人血浆的代谢组成，因为向RPMI添加10％IFS在人血浆中报告的值的10％时不会产生许多代谢物的浓度。相似地，虽然小鼠血浆中葡萄糖和许多氨基酸的浓度大部分与人血浆中的浓度相似，但其他代谢物的浓度却非常不同，包括在小鼠血浆中至少3-10倍低(例如肉毒碱和尿酸)或高(例如3-羟基丁酸盐和牛磺酸)(图+dIFS
1D)的例子。因此，虽然鼠肿瘤模型可用于研究基质和免疫细胞中的代谢，但HPLM 比小鼠血浆更接近地反映人血浆的极性代谢物组成。
代谢物谱分析证实IFS的透析显著地降低了其极性代谢物的水平(图1D，表5A和5B)。此外，它还揭示了胎牛血清不能很好地反映成人血浆的代谢组成，因为向RPMI添加10％IFS在人血浆中报告的值的10％时不会产生许多代谢物的浓度。相似地，虽然小鼠血浆中葡萄糖和许多氨基酸的浓度大部分与人血浆中的浓度相似，但其他代谢物的浓度却非常不同，包括在小鼠血浆中至少3-10倍低(例如肉毒碱和尿酸)或高(例如3-羟基丁酸盐和牛磺酸)(图+dIFS
1D)的例子。因此，虽然鼠肿瘤模型可用于研究基质和免疫细胞中的代谢，但HPLM 比小鼠血浆更接近地反映人血浆的极性代谢物组成。
[0196] 【表5A：培养基的代谢物谱分析的代表性结果】
[0197]
[0198]
[0199] *值表示标准化的峰面积而不是μM；对于热图，与HPLM相比，计算倍数变化值[0200] 除非另有说明，表5A和5B中的所有浓度均为微摩尔浓度。
[0201] 表5A和5B中的平均值和标准偏差值由4个生物学重复计算。
[0202] N/D：未检测到。
[0203] 在表5A中，对于那些浓度列为N/D的代谢物，将对应于介质样品中最小检测浓度的浓度用于图1D中的热图，除了α-氨基丁酸盐的情况。这些值如下：2-羟基丁酸盐：0.4μM；3-羟基丁酸盐：2μM；乙酰甘氨酸：4μM；甜菜碱：0.5μM；次黄嘌呤：0.02μM；丙酮酸：2μM；牛磺酸：4uM；尿酸：0.5uM。α-氨基丁酸盐的最小检测浓度(20μM)使得其对RPMI的分配将导致折叠变化值落入热图的标度限制内。因此，比较被排除在热图之外，以避免混淆解释。应当注意，乙酸盐、丙酮、半胱氨酸、甲酸盐、半乳糖、谷胱甘肽和丙二酸盐是HPLM的确定组分，但是在该实验中用于培养基样品的代谢物谱分析方法不能容易地检测到。
[0204] 如表5B中所示，在含有IFS或dIFS的培养基制剂中检测和定量另外的代谢物。这些化合物不是HPLM(或RMPI)的确定组分，但可能由IFS/dIFS贡献，因此不包括在图1D的热图中。
[0205] 【表5B：培养基的代谢物谱分析的代表性结果】
[0206]
[0207] HPLM+dIFS提供了癌细胞增殖所需的代谢物，因为代表多种人血液癌症的六种细胞系在HPLM+dIFS中以与在RPMI+IFS和RPMI+dIFS中相当的速率(尽管通常较低)增殖(图1E)。
[0208] 【实施例2：HPLM中细胞的培养广泛地改变了它们的代谢景象和葡萄糖碳的命运】[0209] 为了测试与已建立的培养基相比，在更好地模拟人血浆的代谢组成的培养基中培养细胞改变细胞代谢的假设，将在HPLM+dIFS中培养的细胞的代谢物谱与在RPMI+IFS或RPMI+dIFS中的代谢物谱进行比较。实际上，HPLM+dIFS显著地影响多种途径中许多代谢物的细胞内丰度，包括氨基酸、脂质和核苷酸代谢(图2A；缩写见表6)。
[0210] 【表6：某些代谢物缩写】
[0211]
[0212] 对于几种代谢物，例如精氨酸、天冬酰胺和牛磺酸，差异反映了培养基本身中的那些，而对于其他代谢物，例如天冬氨酸和乳酸，它们没有。大多数HPLM+dIFS诱导的变化由所检查的所有六种细胞系共享，但一些是细胞系特异性的，强调了癌症的异质性(Cantor和Sabatini，2012；Davidson等，2016；Eason和Sadanandam，2016；Hensley等，2016；Hu等，2013；Mayers等，2016；Shaul等，2016；Yuneva等，2012)可以影响细胞对环境条件的应答。例如，尽管HPLM+dIFS减少了5种细胞系中精氨基琥珀酸的丰度，但它在P12-Ichikawa细胞中增加了它。类似地，HPLM+dIFS仅在K562，P12-Ichikawa和SUDHL4细胞中引起果糖-6-磷酸/葡萄糖-1-磷酸(F6P/G1P)的显著升高，并且仅在KMS12BM细胞中适度降低氧代戊二酸。
[0213] HPLM+dIFS中培养不影响任何细胞系中的能量电荷(Atkinson，1968)(图2B)，但确实具有对氧化还原状态的细胞系特异性作用，如通过两个氧化还原对的比率变化所反映的：GSH/GSSG(图2C)和NADH/NAD+，由乳酸盐/丙酮酸盐估计(Ido等，2004；Williamson等，1967；
Zhang等，2002)(图2D)。
Zhang等，2002)(图2D)。
[0214] 最后，HPLM+dIFS没有显著地改变葡萄糖消耗和乳酸分泌速率之间的相关性(图8)，表明它对大多数癌症细胞常见的有氧糖酵解表型几乎没有影响(Hosios等，2016；Jain等，2012)。
[0215] 为了具体研究葡萄糖利用，比较了在含有[U-13C]-葡萄糖的HPLM+dIFS中和在RPMI+IFS或RPMI+dIFS中培养三种细胞系(K562、NOMO1和P12-Ichikawa)后，几种代谢物的加13C标签模式(图3A)。有趣的是，虽然HPLM+dIFS含有浓度为～40μM的丙酮酸，比RPMI+IFS高10倍以上，但它不影响用三种13C(M3)加标签的丙酮酸的比例(图3B)。然而，HPLM+dIFS确实影响由丙酮酸的氧化产生的葡萄糖衍生的乙酰-CoA的代谢，如通过TCA循环中柠檬酸盐的加M2标签的减少所反映的(图3C)。
[0216] 与代谢组一样，HPLM+dIFS也对葡萄糖利用具有细胞系依赖性作用。其中最突出的是仅在K562和P12-Ichikawa细胞中F6P/G1P的加M6标签显著减少(图3D)，表明当这些细胞在HPLM+dIFS中培养时，超出外源葡萄糖的来源对F6P/G1P库有贡献。此外，虽然HPLM+dIFS含有～620μM的丙氨酸，浓度比RPMI+IFS高近5倍，但它不影响两种细胞系中M3-丙氨酸的级分。然而，它降低了P12-Ichikawa细胞中丙氨酸的加M3标签的2倍以上(图3E)，揭示了HPLM+dIFS影+dIFS
响这些细胞中葡萄糖衍生的丙酮酸的命运。最后，HPLM 也仅在K562和P12-Ichikawa细胞中降低甘油磷酸胆碱的加M3标签，表明HPLM+dIFS诱导用于脂质合成的葡萄糖利用的细胞系特异性改变(图3F)。当比较在HPLM+dIFS中培养的细胞与RPMI+dIFS中的细胞时，也观察到几乎所有这些变化，尽管某些外源代谢物(例如丙酮酸和丙氨酸)水平的较大差异影响了它们相
13
应的加 C标签模式。
响这些细胞中葡萄糖衍生的丙酮酸的命运。最后，HPLM 也仅在K562和P12-Ichikawa细胞中降低甘油磷酸胆碱的加M3标签，表明HPLM+dIFS诱导用于脂质合成的葡萄糖利用的细胞系特异性改变(图3F)。当比较在HPLM+dIFS中培养的细胞与RPMI+dIFS中的细胞时，也观察到几乎所有这些变化，尽管某些外源代谢物(例如丙酮酸和丙氨酸)水平的较大差异影响了它们相
13
应的加 C标签模式。
[0217] 总的来说，这些数据表明，虽然氧糖酵解基本上不受影响，但与在RPMI种相比，在HPLM+dIFS中培养对细胞的代谢景象具有广泛的影响。这些包括对代谢组、氧化还原状态和葡萄糖利用的广泛改变，并且对于所有测试的细胞系是常见的或者是细胞系特异性的。
[0218] 【实施例3：HPLM的尿酸组分对从头嘧啶生物合成具有显著影响】
[0219] 与在RPMI中相比，HPLM+dIFS中培养的最显著后果是参与核苷酸代谢的四种代谢物的细胞内丰度增加：氨基甲酰天冬氨酸盐、二氢乳清酸盐、乳清酸盐和乳清酸核苷(图4A-D)。在这两种介质中都无法检测到这四种物质。前三个是产生UMP的从头嘧啶生物合成途径中的中间体，而乳清酸核苷是OMP的去磷酸化产物，OMP是该途径中UMP的直接前体(图4E)。在所检查的六种细胞系中的四种中，在HPLM+dIFS中培养也使UTP和CTP嘧啶核苷酸的细胞内水平降低40-60％(图4F-G)，但对嘌呤核苷酸没有类似的作用(图9)。虽然不希望受任何理论的束缚，但是补救途径活性的细胞系依赖性贡献(Evans和Guy，2004)或嘧啶核苷酸库的消耗改变可以解释为什么HPLM+dIFS不降低所有细胞中嘧啶核苷酸的丰度。
[0220] 为了确定HPLM+dIFS的哪种组分影响从头嘧啶合成途径，在缺乏以下的HPLM+dIFS衍生物中培养K562细胞：(1)丙酮、肌酸、肌酸酐、甲酸盐、果糖、半乳糖、谷胱甘肽、甘油和次黄嘌呤；(2)非蛋白原氨基酸(8种代谢产物)；(3)水溶性酸(8种代谢物)；(4)尿素；或(5)尿酸(图5A)。值得注意的是，单独的尿酸调节观察到的效果，因为从HPLM+dIFS中去除尿酸将乳清酸盐和乳清酸核苷水平降低到在RPMI中(图3C-D)或在缺少27种组分(总共从制剂中修饰)的最小HPLM中(图5B)培养细胞的水平。HPLM+dIFS含有350mM的尿酸，其浓度分别是RPMI+IFS和RPMI+dIFS的40倍和至少500倍高(图5C)，并且重要的是，其细胞内浓度反映了相应的培养基(图5D)。在K562细胞中，尿酸剂量依赖性地增加乳清酸盐和乳清酸核苷的丰度(图5E)，并且+IFS在其最高测试浓度(700μM)，导致OMP的可检测积累。向RPMI 添加350μM尿酸也极大地增强了乳清酸盐和乳清酸核苷水平，但是，与完全HPLM一样，对UTP丰度具有细胞系依赖性作用(图5F)。最后，密切相关的分子9-甲基尿酸(9-MUA)进入K562细胞但不改变从头嘧啶生物合成途径中的乳清酸盐、乳清酸核苷或其他中间体的水平(图5G)。
[0221] 尿酸对嘧啶代谢的作用表明，与其他哺乳动物相比，人、黑猩猩、大猩猩和其他更高级灵长类动物的血浆浓度增加多至一个数量级( 和Macarrón-Vicente，2010；Kratzer等，2014；Wu等，1992)。大多数哺乳动物物种，包括小鼠和牛，通过肝酶尿酸酶将尿酸代谢为尿囊素，编码尿酸酶的基因(UOX)在人类进化过程中通过假化而失活
(Kratzer等，2014；Oda等，2002；Wu等，1992；1989)。因此，尿酸而不是尿囊素是许多高级灵长类动物中嘌呤分解代谢的最终产物(图5H)。此外，在血浆尿酸浓度为～30μM的小鼠中，尿酸酶活性是必需的，因为大多数UOX缺失小鼠在生命的四周内死于极度高尿酸血症和肾病(Wu等，1994)。因此，通过研究在小鼠中生长或在常规培养基中培养的细胞，难以获得尿酸影响重新嘧啶生物合成途径的发现。
(Kratzer等，2014；Oda等，2002；Wu等，1992；1989)。因此，尿酸而不是尿囊素是许多高级灵长类动物中嘌呤分解代谢的最终产物(图5H)。此外，在血浆尿酸浓度为～30μM的小鼠中，尿酸酶活性是必需的，因为大多数UOX缺失小鼠在生命的四周内死于极度高尿酸血症和肾病(Wu等，1994)。因此，通过研究在小鼠中生长或在常规培养基中培养的细胞，难以获得尿酸影响重新嘧啶生物合成途径的发现。
[0222] 【实施例4：尿酸是UMPS的直接抑制剂】
[0223] 除了增强乳清酸盐和乳清酸核苷的细胞内水平之外，HPLM还显著地增加其分泌到介质中(图10)-这一现象使人联想到具有乳清酸盐尿症和耳聋尿症的患者中这些代谢物的高尿排泄。由于这种病症可能由UMP合成酶(UMPS)的遗传学(Bailey，2009；Fox等，1973；Smith等，1961；Suchi等，1997)或药理学(Bono等，1964；Fallon等，1961年；Fox等人，1970；
Kelley和Beardmore，1970)抑制引起的，HPLM的尿酸组分可能导致对细胞中这种酶的抑制。
UMPS是双功能双结构域酶，其催化从头嘧啶生物合成途径的最后两个步骤以产生UMP
(Jones，1980)。在第一步中，乳清酸盐磷酸核糖转移酶(OPRT)结构域从乳清酸盐和PRPP合成OMP，并且在第二步中，OMP脱羧酶(ODC)结构域将OMP转化为UMP(图6A)。
Kelley和Beardmore，1970)抑制引起的，HPLM的尿酸组分可能导致对细胞中这种酶的抑制。
UMPS是双功能双结构域酶，其催化从头嘧啶生物合成途径的最后两个步骤以产生UMP
(Jones，1980)。在第一步中，乳清酸盐磷酸核糖转移酶(OPRT)结构域从乳清酸盐和PRPP合成OMP，并且在第二步中，OMP脱羧酶(ODC)结构域将OMP转化为UMP(图6A)。
[0224] 为了确定尿酸是否可能引起对UMPS的抑制，研究了已建立的UMPS抑制剂，以观察其是否对从头嘧啶生物合成途径具有与再所公开的细胞中的尿酸相似的作用。小分子别嘌呤醇和6-氮杂尿苷是转化成别嘌呤醇核糖核苷酸和6-氮杂-UMP后的前药(Bono等，1964；Handschumacher，1960；Kelley和Beardmore，1970；Murrell和Rapeport，1986)，分别地竞争性抑制UMPS的ODC结构域(图6B)。在K562细胞中，别嘌呤醇剂量依赖性地增加氨基甲酰天冬氨酸盐、二氢乳清酸盐、乳清酸盐、乳清酸核苷和OMP的水平(图11A-B)。此外，在其最高测试浓度下，别嘌呤醇还使这些细胞中UTP的丰度降低了近30％(图11C)。使用基于LC/MS的代谢物谱分析，检测其质荷比(m/z)与别嘌呤醇核糖核苷酸的预测m/z匹配的物质，并且其量值与介质中别嘌呤醇的浓度相关(图11D)。重要的是，通过不同的色谱保留时间，可以将该物质与其异构体IMP区分开来。这些数据与细胞内别嘌呤醇转化为别嘌呤醇核糖核苷酸一致。
然而，未检测到与推定的尿酸核糖核苷酸一致的代谢物峰。
然而，未检测到与推定的尿酸核糖核苷酸一致的代谢物峰。
[0225] 为了研究尿酸本身是否可以直接抑制UMPS，我们开发了含有重组UMPS及其底物，乳清酸盐和PRPP的体外UMPS活性测定法，并通过OMP和UMP的LC/MS检测验证了其活性(图6C)。基于最近保藏的人UMPS的OPRT结构域(蛋白质数据库条目2WNS，链A和B)(图12)设计的UMPS突变体(Y37A，R155A)没有活性并且用作测定法中的阴性对照。已建立的ODC抑制剂6-氮杂-UMP剂量依赖性地降低UMPS的UMP产生，并且在50μM时，UMP水平降低至含有载体的反应中的～约3％(图6D)。6-氮杂-UMP也显著增加了OMP的丰度，但OMP的增加并未与UMP的减少密切相关。虽然不希望受任何理论的束缚，但这一结果可能是由于OPRT反应的已知可逆性(Traut和Jones，1977)。
[0226] 值得注意的是，尿酸也剂量依赖性地抑制UMPS的UMP生产，并且像6-氮杂-UMP一样，也以与UMP降低不完全相关的方式增加OMP(图6E)。尿酸的效力低于6-氮杂-UMP，在1mM时，它只能将UMP水平降低至含有载体的反应中的约30％。然而，重要的是，尿酸在体外抑制UMPS的浓度与培养细胞中促进乳清酸盐和乳清酸核苷水平的浓度一致。最后，别嘌呤醇和6-氮杂尿苷不直接抑制UMPS，并且9-MUA或尿囊素也没有(图6F)。
[0227] 因此，以人血浆存在的浓度的尿酸是UMPS的ODC结构域的直接抑制剂。
[0228] 【实施例5：尿酸拮抗5-氟尿嘧啶的细胞毒性】
[0229] 5-氟尿嘧啶(5-FU)是一种抗代谢药物，虽然在五十多年前开发，但仍广泛用于治疗几种类型的癌症(Longley等，2003)。在细胞中，5-FU被代谢成介导其细胞毒性作用的多种氟核苷酸衍生物(图7A)。其中包括氟尿苷三磷酸(FUTP)，其在错误掺入RNA后导致细胞死亡。FUTP合成开始于将5-FU转化为氟尿苷一磷酸(FUMP)，直接地通过UMPS的OPRT结构域或间接地通过尿苷磷酸化酶和尿苷激酶的顺序活性(Longley等，2003)。先前的动力学研究表明，乳清酸盐与5-FU竞争通过OPRT活性直接转化为FUMP(Reyes和Guganig，1975)(图7B)。与这些发现一致，别嘌呤醇降低了某些癌症细胞系对5-FU的敏感性(Schwartz和Handschumacher，1979)，这是由于由别嘌呤醇核糖核苷酸介导的UMPS的ODC结构域的竞争性抑制所诱导的乳清酸盐积累。因此，不希望受任何理论的束缚，尿酸可能通过类似的机制影响细胞对5-FU的敏感性。
[0230] 实际上，分别与在RPMI+IFS和RPMI+dIFS中相比，在HPLM+dIFS中培养NOMO1细胞使5-FU的EC50降低～5倍和～8倍(图7C)，而不影响多柔比星的效力-多柔比星是一种DNA损伤药物，也常用于治疗癌症(图7D)。此外，从HPLM+dIFS中仅去除尿酸使NOMO1细胞中5-FU的EC50降低了近6倍(图7E)，同样不影响阿霉素的敏感性(图7F)。在用5-FU处理并在缺乏尿酸的HPLM+dIFS中培养的细胞中，检测到FUMP、氟脱氧尿苷一磷酸(FdUMP)以及5-FU(图7G)。虽然在含有尿酸的HPLM+dIFS中的培养对FdUMP和5-FU的细胞内丰度几乎没有影响，但它将FUMP水平降低至低于检测限，与通过乳清酸盐的OPRT介导的FUMP合成的拮抗作用一致(图7G)。
[0231] 由于5-FU不再用于治疗血液癌症，因此研究了尿酸对更临床相关的癌症细胞系的5-FU敏感性(Longley等人，2003)的影响。如在六种血液癌症细胞系中，HPLM+dIFS中培养SW620结肠直肠癌细胞系增加了乳清酸盐的细胞内丰度(图13A)，表明尿酸也可能影响这些细胞的5-FU敏感性。实际上，从HPLM+dIFS中仅去除尿酸使SW620细胞的5-FU EC50相对于HPLM+dIFS中的5-FU EC50降低3倍(图S6B)，但不影响阿霉素的敏感性(图13C)。
[0232] 因此，在人血浆中发现的浓度，内源代谢物尿酸影响癌细胞对常见化学治疗剂的敏感性(图7H)，表明血浆尿酸水平的操作，例如通过施用尿酸酶(Jeha等人，2004)，可以通过OPRT介导的合成提高产生FUMP的人肿瘤的5-FU敏感性。
[0233] 【材料和方法】
[0234] 【细胞系和试剂】
[0235] 以下细胞系由以下细胞系提供：K562和NOMO1，James Griffin博士(Dana Farber癌症研究所)；P12-Ichikawa，Thomas Look博士(Dana Farber癌症研究所)；SUDHL4，Margaret Shipp博士(Dana Farber癌症研究所)；以及来自Cancer Cell Line Encyclopedia(Broad Institute)的KMS12BM和SEM。SW620细胞系购自ATCC。证实细胞系没有支原体污染(Freshney，2010)，并且通过STR谱分析验证所有细胞系的身份。SW620的STR谱分析显示，在评估的10个基因座中的2个中具有非常小的背景。
[0236] 5-氟尿嘧啶(F6627)、6-氮杂尿苷(A1882)、尿囊素(05670)、别嘌呤醇(PHR1377)、多柔比星(44583)、乳清酸盐(O8402)、磷酸核糖焦磷酸盐(PRPP)(P8296)、UMP(U6375)获自Sigma；6-氮杂-UMP(sc-291171)和9-甲基尿酸(sc-362184)获自Santa Cruz Biotechnologies；[U-13C6]-D-葡萄糖(CLM-1396)和苯丙氨酸-d8(DLM-372)获自Cambridge Isotope Laboratories。
[0237] 表7中列出了HPLM制剂中使用的化合物的供应商和目录号。HPLM中使用的化合物制备为含有表7中所列一种或多种化合物的储备溶液，除了提供生物素、胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、对氨基苯甲酸、泛酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素和维生素B-12的RPMI之外。
[0238] 【表7：用于HPLM制备的储备溶液】
[0239]
[0240] 【质粒和质粒构建】
[0241] pDONR223-KRASV12和pLJM1-eGFP获自Addgene(分别为Addgene 31200和19319)。pDONR223-UMPS来自Human ORFeome 7.1，并由Susan Lindquist博士友情提供。如下所述构建所有其他质粒。
[0242] 【1.慢病毒质粒pLJC2的构建】
[0243] 使用引物JC4/JC5从pDONR223-KRASV12模板扩增KRASV12基因，用AgeI-BamHI消化，并克隆到pLJM1-eGFP中以产生pLJM1-KRASV12-3×FLAG。使用QuickChange PCR构建质粒pLJC1-KRASV12，分别用引物JC48/JC49和JC50/JC51除去pLJM1-KRASV12-3×FLAG的两个NotI位点。使用引物JC68/JC69从pLJM1-Rap2A模板扩增Rap2A基因，用PacI-NotI消化，并克隆到pLJC1-KRASV12-3×FLAG中以产生pLJC1-Rap2A-3×FLAG。然后使用引物JC_LJC2-F/JC79从pLJC1-Rap2A-3×FLAG扩增编码Rap2A-3×FLAG的序列，用AgeI-EcoRI消化，并克隆到pLJM1-eGFP中以产生pLJM1-Rap2A-3×FLAG。然后使用QuickChange PCR构建质粒pLJC2-Rap2A-3×FLAG，分别用引物JC48/JC49和JC50/JC51除去pLJM1-Rap2A-3×FLAG的两个NotI位点。
[0244] 【2.构建UMPS质粒】
[0245] 使用引物JC624/JC625从pDONR223-UMPS模板扩增UMPS基因，用PacI-NotI消化，并克隆到pLJC2-Rap2A-3×FLAG中以产生pLJC2-UMPS-3×FLAG。使用基于重叠延伸PCR方法的2步方案构建质粒pLJC2-UMPS(Y37A，R155A)-3×FLAG。在第一步中，使用以下引物对从pLJC2-UMPS-3×FLAG模板扩增三个片段：JC_LJC2-F/JC716、JC715/JC720和JC719/JC_
LJC2-R。在第二步中，在含有引物JC_LJC2-F/JC_LJC2_R的第二PCR中合并三个片段，然后用PacI-NotI消化，并克隆到pLJC2-UMPS-3×FLAG中。
LJC2-R。在第二步中，在含有引物JC_LJC2-F/JC_LJC2_R的第二PCR中合并三个片段，然后用PacI-NotI消化，并克隆到pLJC2-UMPS-3×FLAG中。
[0246] 【引物】
[0247] JC4：
[0248] GCACCGGTTTAATTAACGCCACCATGGGCACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGG(SEQ ID NO：1)[0249] JC5：
[0250] CGCGGATCCTTATTACTTGTCATCGTCATCCTTGTAATCAATGTCATGATCTTTATAATCACCGTCATGGTCTTTGT(SEQ ID NO：2)
[0251] AGTCGCCTGCGGCCGCCATAATTACACACTTTGTCTTTGACTTC(SEQ ID NO：3)
[0252] JC48：CCACCGCACAGCAAGCAGCAGCTGATCTTCAGACC(SEQ ID NO：4)
[0253] JC49：GCTGCTTGATGCCCCAGACTGTGAGTTGCAACAG(SEQID NO：5)
[0254] JC50：CGAGACTAGCCTCGAGCAGCAGCCCCCTTCACCGAG(SEQ ID NO：6)
[0255] JC51：CCGCATCACCATGGTAATAGCGATGACTAATACG(SEQID NO：7)
[0256] JC68：
[0257] CCGTTAATTAAAGGGACGATGCGCGAGTACAAAGTGGTGGTGCTG(SEQ ID NO：8)
[0258] JC69：
[0259] CCCTTGCGGCCGCGCTGCCTCCTTGTATGTTACATGCAGAACAGC(SEQ ID NO：9)
[0260] JC_LJC2-F：TGTACGGTGGGAGGTCTATATAAG(SEQ ID NO：10)
[0261] JC79：
[0262] CGGCGGGAATTCTTATTACTTGTCATCGTCATCCTTGTAATCAATGTCATG(SEQ ID NO：11)
[0263] JC624：
[0264] CCGTTAATTAACGCGACAATGGCGGTCGCTCGTGCAGCTTTGGGGCCATTGGTGAC(SEQ ID NO：12)
[0265] JC625：
[0266] CCCTTGCGGCCGCGCTGCCTCCAACACCAAGTCTACTCAAATACGCTTCCCAAGC(SEQ ID NO：13)[0267] JC715：CTTTCCTCCCCCATCGCCATCGATCTGCGGGGC(SEQID NO：14)
[0268] JC716：GCCCCGCAGATCGATGGCGATGGGGGAGGAAAG(SEQ ID NO：15)
[0269] JC719：GTGCTGTTGGACGCCGAGCAGGGAGGCAAG(SEQ ID NO：16)
[0270] JC720：CTTGCCTCCCTGCTCGGCGTCCAACAGCAC(SEQ ID NO：17)
[0271] JC_LJC2-R：CCCTTTTCTTTTAAAATTGTGGATGAATACTGCC(SEQ ID NO：18)
[0272] 【HPLM的设计】
[0273] 与血清代谢组数据库(Serum Metabolome Database)整合的人代谢物组数据库(Human Metabolome Database)(Psychogios等，2011；Wishart等，2013)含有2,192种代谢物，其被设计为在至少一种人类生物流体中被检测和定量。从该集合中，除去符合以下手动应用的过滤标准之一的分子：(1)未显示正常成人血液中浓度的代谢物；(2)亲脂性代谢物，包括脂肪酸、胆固醇和以下衍生物：胆固醇酯、神经酰胺、甘油二酯、神经节苷脂、甘油磷酸胆碱、单酰基甘油酯、磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、鞘磷脂和甘油三酯；
(3)代谢物，其在正常成人血液中的浓度<6μM，由至少一个参考源表示；(4)代谢物，其在正常成人血液中的浓度只有一种参考来源表示；和(5)不可商购的代谢物。虽然维生素是培养细胞的营养需求之一(Eagle，1955)，但大多数的注释血浆浓度远低于我们设定的6μM阈值。
因此，不是省略这些代谢物，而是HPLM补充有浓度相当于RPMI 1640的商业浓缩维生素混合物。此外，虽然例如铜和锌的微量元素对培养细胞也很重要，但它们通常有助于通过IFS中的转运分子(例如白蛋白和胰岛素)的足量，并且超过其必需水平通常对细胞增殖是有害的(Sigma Media Expert)。因此，痕量元素不包括在HPLM的确定组分中。还进行了其他修改，例如去除非内源性化合物和气体，以生成HPLM制剂中包含的蛋白质原氨基酸、27种其他极性代谢物和10种小离子的最终清单，其浓度与报告的正常成人血液计算的平均值相似。
(3)代谢物，其在正常成人血液中的浓度<6μM，由至少一个参考源表示；(4)代谢物，其在正常成人血液中的浓度只有一种参考来源表示；和(5)不可商购的代谢物。虽然维生素是培养细胞的营养需求之一(Eagle，1955)，但大多数的注释血浆浓度远低于我们设定的6μM阈值。
因此，不是省略这些代谢物，而是HPLM补充有浓度相当于RPMI 1640的商业浓缩维生素混合物。此外，虽然例如铜和锌的微量元素对培养细胞也很重要，但它们通常有助于通过IFS中的转运分子(例如白蛋白和胰岛素)的足量，并且超过其必需水平通常对细胞增殖是有害的(Sigma Media Expert)。因此，痕量元素不包括在HPLM的确定组分中。还进行了其他修改，例如去除非内源性化合物和气体，以生成HPLM制剂中包含的蛋白质原氨基酸、27种其他极性代谢物和10种小离子的最终清单，其浓度与报告的正常成人血液计算的平均值相似。
[0274] 【细胞培养基配方】
[0275] 细胞主要维持在以下三种介质中：
[0276] (1)RPMI+IFS：缺乏葡萄糖的RPMI 1640(Thermo Fisher Scientific 11879020)，其中我们添加了5mM葡萄糖、10％热灭活的胎牛血清(IFS)、青霉素和链霉素。
[0277] (2)RPMI+dIFS：缺乏葡萄糖的RPMI 1640(Thermo Fisher Scientific 11879020)，我们向其中加入5mM葡萄糖、10％透析的IFS、青霉素和链霉素。
[0278] (3)HPLM+dIFS：HPLM(参见表2)，其中我们添加10％透析的IFS、RPMI 1640 100X维生素(Sigma R7256)、青霉素和链霉素。
[0279] 使用SnakeSkin透析管，3.5K MWCO，35mm(Thermo Fisher Scientific PI88244)，针对20×体积的PBS透析热灭活的胎牛血清(Sigma F4135)。透析在4℃进行48小时，每9-12小时进行全部PBS更换。使用瓶顶真空过滤器，醋酸纤维素膜，孔径0.45μm(Sigma CLS430514)对所有介质进行无菌过滤。
[0280] 【细胞培养条件】
[0281] 在所有实验之前，使细胞在目的介质基中生长至少7天以允许适应。所有细胞维持在37℃和5％CO2。
[0282] 对于生长曲线，将所有细胞系以100,000细胞/mL的密度接种，并在25cm2矩形倾斜颈细胞培养瓶(Westnet 430639)中在12mL介质中生长。使用直径设定为8-30μm的Beckman Z2Coulter计数器每9-12小时记录细胞密度测量值。
[0283] 【代谢物谱分析和代谢物丰度的定量】
[0284] 在配备有Ion Max源和HESI II探针的QExactive台式orbitrap质谱仪上进行基于LC/MS的分析，质谱仪与Dionex UltiMate 3000UPLC系统(Thermo Fisher Scientific)偶联。每7天使用标准校准混合物进行外部质量校准。乙腈是LC/MS HyperGrade(EMD Millipore)。所有其他溶剂均为LC/MS Optima等级(Thermo Fisher Scientific)。
[0285] 对于培养基和血浆的代谢物谱分析，将样品在含有50％甲醇、30％乙腈、20％水并且10ng/mL苯丙氨酸-d8作为内标的溶液中1:40稀释，然后储存在-80℃。在5分钟涡旋并在4℃以21130g离心5分钟后，将2μL每种介质代谢物样品注射到配备有2.1×20mm保护柱的ZIC-pHILIC 2.1×150mm分析柱上(均为5μm粒径，EMD Millipore)。缓冲液A是20mM碳酸铵、0.1％氢氧化铵；缓冲液B是乙腈。色谱梯度以0.150mL/min的流速如下进行：0-20分钟：线性梯度为80％至20％B；20-20.5分钟：线性梯度从20％到80％B；20.5-28min：保持在80％B。质谱仪以全扫描，极性切换模式操作，喷雾电压设定为3.0kV，加热的毛细管保持在275℃并且HESI探针保持在350℃。鞘气流量设定为40个单位，辅助气体流量设定为15个单位，并且吹扫气体流量设定为1个单位。MS数据采集在70-1000m/z的范围内进行，分辨率设定为70,
000，AGC靶设定为106，最大注入时间设定为20msec。
000，AGC靶设定为106，最大注入时间设定为20msec。
[0286] 对于全细胞样品的代谢物谱分析，将细胞沉淀，然后以200,000个细胞/mL的密度接种在6孔板中的3mL新鲜培养基中。温育24小时后，将细胞以250g离心5分钟，重悬于1mL冰冷的0.9％无菌NaCl中，再次在4℃以250g离心5分钟。代谢物在1mL含有10ng/mL苯丙氨酸-d8作为内标物的80％甲醇溶液中提取。在10分钟涡旋并以21130g离心3分钟在4℃10分钟后，将样品在氮气下干燥。将干燥的样品储存在-80℃，然后重悬于100μL水中；注入4μL每种细胞样品用于LC/MS分析，如针对培养基样品的谱分析所述。对于所有实验，相同地设置另外的培养物重复并用于测量细胞数量和体积，其各自使用直径设定为8-30μm的Beckman Z2Coulter计数器测量。
[0287] 对于UMPS活性测定法样品的代谢物谱分析，如所述提取反应混合物(参见UMPS活性测定法)，并注入5μL每种样品用于LC/MS分析，如描述用于介质样品的谱分析，除了质谱仪是仅在全扫描、负电离模式下操作。
[0288] 创建了包含多种代谢途径和过程的近170种代谢物的列表。在Whitehead Institute Metabolite Profiling核心设施组装的化学标准库中，我们构建了六个标准库，这些标准共占该列表的近90％。通过LC/MS验证标准，以确认它们在预期的m/z比下产生稳健的峰。每个库的储备溶液(含有1mM的每种代谢物的水溶液)储存在-80℃。在每次运行当天，将这些储备液在水中连续稀释，进一步1:10稀释到合适的提取溶液中，然后与给定批次的生物样品平行运行。
[0289] 使用XCalibur QuanBrowser 2.2(Thermo Fisher Scientific)，使用10ppm质量准确度窗口和0.5分钟保留时间窗口进行代谢物鉴定和定量。为了确认代谢物的身份并进行定量，使用上述代谢物化学标准库。通常，标准品的最终浓度为10nM、100nM、1μM、10μM和100μM。对于葡萄糖，还制备浓度为125μM和250μM的化学标准溶液。对于某些代谢物，化学标准仅用于代谢物鉴定。对于那些缺乏化学标准的代谢物，峰识别仅限于高置信度峰分配(Smith等，2005)。
[0290] 因为代谢物提取方案因样品类型不同，加工样品中苯丙氨酸-d8的浓度变化：化学标准库(9ng/mL)，介质和血浆样品(9.75ng/mL)和细胞样品(100ng/mL)。因此，首先将给定批次的每个样品中苯丙氨酸-d8的原始峰面积标准化以解释这些差异。为了定量代谢物，我们首先将每种代谢物的原始峰面积除以其相应的标准化苯丙氨酸-d8峰面积。从给定化学标准的标准化代谢物峰面积，我们然后生成符合二次对数-对数方程的相应标准曲线，通常r2＞0.95，其用于确定每种生物代谢物提取物中的代谢物浓度。然后从样品浓度和相应的样品体积计算特定全细胞或培养基/血浆提取物中代谢物的总摩尔数。因此，生物样品中的最终代谢物浓度使用下面的适当等式计算：
[0291] 介质和血浆样品：通过标准曲线浓度×40
[0292] 全细胞样品：通过标准曲线的浓度×100/(细胞体积，以μL计)
[0293] 对于那些未使用标准曲线定量的代谢物，在上述计算中使用标准化的峰面积。
[0294] 【葡萄糖追踪】
[0295] 将细胞沉淀，然后以200,000个细胞/mL的密度接种在6孔板中的3mL含有5mM[U-13
C]-葡萄糖的培养基中。温育24小时后，与上述全细胞样品所述相同地进行代谢物提取。
C]-葡萄糖的培养基中。温育24小时后，与上述全细胞样品所述相同地进行代谢物提取。
[0296] 【用于LC/MS的5-FU处理】
[0297] 沉淀NOMO1细胞，然后以200,000细胞/mL的密度接种在6孔板中的3mL含有20μM 5-FU的培养基中。温育24小时后，与上述全细胞样品所述相同地进行代谢物提取。
[0298] 【高度靶向的代谢组学】
[0299] 对于5-FU处理后全细胞样品中FdUMP和FUMP的高度靶向分析，如上所述运行仪器，但在负电离模式下进行另外的tSIM(靶向选择离子监测)扫描。tSIM设置如下：分辨率设置为70,000，AGC靶为105，并且最大积分时间为250msec。靶质量为325.0243(对应于FdUMP)和341.0192(对应于FUMP)。围绕每个靶质量的隔离窗口设定为1.0m/z。
[0300] 对于UMPS测定法样品中的乳清酸盐、PRPP、OMP和UMP，对于用于FdUMP和FUMP的tSIM扫描所描述的所有设置是相同的，除了最大积分时间是200msec，并且靶质量是155.0088(对应于乳清酸盐)、323.0286(对应于UMP)、367.0184(对应于OMP)和388.9445(对应于PRPP)。
[0301] 【消耗和分泌速率】
[0302] 在生长曲线构建中测量细胞密度的每个时间点，小心取出小等分试样培养物，在4℃以250g离心5分钟，并如上介质和血浆样品所述从所得上清液中提取代谢物。在完成每条生长曲线后，我们确定了落在增殖指数期内的时间点，并对在该时间点收集的条件介质的代谢物提取进行了谱分析。我们对新鲜培养基平行地进行谱分析，根据简化的Monod模型得到了给定代谢物的特定消耗/分泌速率，q＝μ/YX/S，扩展到：q＝μ×V×(ΔM/ΔX)，其中μ是比生长速率，V是培养体积，ΔM＝代谢物浓度，t终-代谢物浓度，t初，和ΔX＝细胞密度，t终-细胞密度，t初。以这种方式，我们计算了以下代谢物的q：葡萄糖、乳酸盐、乳清酸盐和乳清酸核苷。
[0303] 【重组UMPS的表达和免疫纯化】
[0304] 为了转染HEK-293T细胞，将4百万个细胞铺板在15cm培养皿中。24小时后，使用聚乙烯亚胺法(Boussif等，1995)，用15μg的pLJC2-UMPS-3×FLAG或pLJC2-UMPS(Y37A，R155A)-3×FLAG转染细胞。48小时后，用冰冷的PBS冲洗细胞一次，然后立即用裂解缓冲液(1％Triton X-100、40mM Tris-HCl pH 7.5、100mM NaCl、5mM MgCl2、1片无EDTA蛋白酶抑制剂(Roche 11580800；每25mL缓冲液)，1片PhosStop磷酸酶抑制剂(Roche 04906845001；
每10mL缓冲液))进行裂解。通过在4℃以21130g离心10分钟来澄清细胞裂解物。对于抗FLAG免疫沉淀，将FLAG-M2亲和凝胶(Sigma A2220)在裂解缓冲液中洗涤3次。对于每个实验，然后将500μL的亲和凝胶的50/50浆液加入到从5个单独的15cm培养皿收集的澄清裂解物的池中，并在4℃旋转温育3小时。免疫沉淀后，将珠子在裂解缓冲液中洗涤2次，并用含有500mM NaCl的裂解缓冲液洗涤3次。然后将重组蛋白质在含有1mg/mL FLAG肽的裂解缓冲液中在于
4℃洗脱1小时。通过在4℃以100g离心4分钟(BioRad micro bio-spin column 732-6204)，针对20体积的储存缓冲液(40mM Tris-HCl pH 7.5、100mM NaCl、1.5mM dTT)交换缓冲液(Amicon Ultra 30K NMWL)来分离洗脱液，与甘油混合(终浓度15％v/v)，最后用液氮快速冷冻并储存在-80℃。使用Bradford试剂和BSA标准对蛋白质样品进行定量，并通过12％SDS-PAGE验证。
每10mL缓冲液))进行裂解。通过在4℃以21130g离心10分钟来澄清细胞裂解物。对于抗FLAG免疫沉淀，将FLAG-M2亲和凝胶(Sigma A2220)在裂解缓冲液中洗涤3次。对于每个实验，然后将500μL的亲和凝胶的50/50浆液加入到从5个单独的15cm培养皿收集的澄清裂解物的池中，并在4℃旋转温育3小时。免疫沉淀后，将珠子在裂解缓冲液中洗涤2次，并用含有500mM NaCl的裂解缓冲液洗涤3次。然后将重组蛋白质在含有1mg/mL FLAG肽的裂解缓冲液中在于
4℃洗脱1小时。通过在4℃以100g离心4分钟(BioRad micro bio-spin column 732-6204)，针对20体积的储存缓冲液(40mM Tris-HCl pH 7.5、100mM NaCl、1.5mM dTT)交换缓冲液(Amicon Ultra 30K NMWL)来分离洗脱液，与甘油混合(终浓度15％v/v)，最后用液氮快速冷冻并储存在-80℃。使用Bradford试剂和BSA标准对蛋白质样品进行定量，并通过12％SDS-PAGE验证。
[0305] 【UMPS活性测定法】
[0306] 每种纯化的UMPS变体(20-40nM酶)与乳清酸盐(100μM)和PRPP(300μM)的反应在37℃在20mM Tris-HCl pH 7.5、5mM Na2HPO4、5mM MgCl2、2mM dTT、100μM EDTA(改编自(Han等人，1995))，和多种浓度的推定抑制剂，总体积为100μL中进行。温育20分钟后，取出15μL等份的反应混合物并立即加入到85μL冰冷的80％甲醇中进行代谢物提取，涡旋5分钟，并在4℃以21130g离心1分钟。
[0307] 将6-氮杂尿苷、6-氮杂-UMP、9-甲基尿酸、尿囊素、别嘌呤醇和尿酸的储备溶液在200mM的1M NaOH中新鲜配制，并且在适当的稀释下，对反应pH值几乎没有影响。
[0308] 使用在80％甲醇中相同制备的UMP化学标准物的峰面积(最终浓度625nM、1.25μM、2.5μM、5μM和10μM)，我们生成拟合线性方程的标准曲线以确保反应样品中的UMP浓度不超过初始乳清酸盐浓度的10％。没有OMP化学标准。
[0309] 【药物治疗测定法】
[0310] 将NOMO1细胞以16,667个细胞/mL的密度接种在6孔板中的3mL培养基中。温育24小时后，用5-FU(100nM、1μM、10μM、100μM或1mM)或多柔比星(1.95nM、7.81nM、31.25nM、125nM或500nM)处理细胞。所有孔，包括未处理的对照，含有0.5％DMSO。加入药物后，轻轻摇动平板2分钟。处理4天后，将来自每个孔的200μL转移至白色96孔板(Greiner)，并用Cell Titer-Glo(Promega)评估细胞活力。用SpectraMax M5Plate Reader(Molecular Devices)测量发光，并将其对于未处理的对照进行标准化。
[0311] 以2000个细胞/孔的密度接种SW620细胞并使其附着24小时。在DMSO中制备5-FU和多柔比星，并使用HP D300复合分配器进行分配。在处理后4天用Cell-Titer Glo评估细胞活力，并如上所述测量发光。
[0312] 在GraphPad Prism中绘制剂量-应答值并使用One Site-Fit logIC50方程拟合。
[0313] 【小鼠血浆的采集】
[0314] 麻省理工学院动物护理和使用委员会(MIT Institutional Animal Care and Use Committee)批准了血液采集程序。将小鼠保持在怀特黑德研究所(Whitehead
Institute)的无特定病原体动物设施，常规食物上，并在采血前禁食18小时。在上午10:00，从年龄为3.5个月的C57Bl/6J背景的雄性野生型小鼠(n＝4)的面静脉收集100μL血液到肝素化管中。为了分离血浆，将采集的血液在4℃以850g离心6分钟。然后将血浆级分转移到新管中，取出等分试样用于代谢物提取，其操作与上述培养基样品所述相同。
Institute)的无特定病原体动物设施，常规食物上，并在采血前禁食18小时。在上午10:00，从年龄为3.5个月的C57Bl/6J背景的雄性野生型小鼠(n＝4)的面静脉收集100μL血液到肝素化管中。为了分离血浆，将采集的血液在4℃以850g离心6分钟。然后将血浆级分转移到新管中，取出等分试样用于代谢物提取，其操作与上述培养基样品所述相同。
[0315] 【统计分析】
[0316] 使用GraphPad Prism 6中的双尾非配对t检验计算所有p值。
[0317] 【参考文献】
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