无血清培养基
阅读：673发布：2020-05-11
专利汇可以提供无血清培养基专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种干细胞无血清培养基，可用于培养间充质干细胞。所述的干细胞无血清培养基包含以下成分：DMEM/F12、细胞生长因子、 激素 、 蛋白质 、维生素及还原类物质、促贴壁物质、胰酶抑制物质和其它成分。本发明的无血清培养基添加成份明确， 质量 和批次稳定可控，安全性 稳定性 高。该干细胞培养基可抑制胰蛋白酶活性，且能够促进细胞贴壁。该干细胞培养基能够长期维持间充质干细胞特性和增殖能 力 ，可用于替代血清培养基。，下面是无血清培养基专利的具体信息内容。
1.一种无血清培养基，包含以下成分：
DMEM/F12；
细胞生长因子，激素，蛋白质，维生素及还原类物质，促贴壁物质，胰酶抑制物质，添加成分中的一种或多种。
2.如权利要求1所述的无血清培养基，其特征是：所述的生长因子包括组分及含量：
3.如权利要求1所述的无血清培养基，其特征是：所述的激素包括组分及含量：
4.如权利要求1所述的无血清培养基，其特征是：所述的蛋白质包括组分及含量：
血清白蛋白 1-50mg/ml
转铁蛋白 1-50μg/ml
胎球蛋白 1-50mg/ml。
5.如权利要求1所述的无血清培养基，其特征是：所述的维生素氨基酸以及还原类物质包括组分及含量：
谷氨酰胺 0.5-5mM
还原型谷胱甘肽 0.1-5mM
非必需氨基酸 0-500μg/ml。
6.如权利要求1所述的无血清培养基，其特征是：所述添加成分包括组分及含量：
7.如权利要求1所述的无血清培养基，其特征是：所述促贴壁物质包括如下组分中的一种或几种，组分及含量分别为：
8.如权利要求1所述的无血清培养基，其特征是：所述胰酶抑制物质包括组分及含量：
α1-抗胰蛋白酶 0.001-0.1％w/v
α2-巨球蛋白 0.001-0.1％w/v
抗凝血酶III 0.001-0.1％w/v。
无血清培养基
技术领域
背景技术
[0002] 间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是一类具有多向分化潜能的成体干细胞，来源于人体的多种组织器官包括脐带、胎盘、骨髓、牙髓、外周血、脐带血、和角膜缘等。越来越多的研究表明MSC能够修复受损的组织器官，对许多疾病具有治疗作用。MSC能够治疗并取得一定疗效的疾病包括心肌梗死、神经性疾病、脊柱损伤、肝硬化、红斑狼疮等，MSC能够促进伤口愈合，还具有支持造血和免疫调节的功能。由于MSC对多种疾病具有治疗作用，MSC广泛受到研究人员的关注，对MSC的研究也一直是细胞领域中的一大热点。随着对MSC研究的深入，MSC的治疗机理也逐渐被揭示。目前通过研究发现，MSC治疗疾病的主要机制不像人们最初认为的通过分化成和替换受损的组织细胞,而是通过旁分泌机制来调节其它细胞的活动和功能，从而修复受损的细胞。如MSC能够分泌IGF-1(胰岛素样生长因子，insulin-like growth factor 1)和Annexin-A1来增强胰岛组织的功能。MSC能够分泌肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor，HGF)来促进血管生成和损伤组织的修复。此外，由于一些MSC的免疫源性非常低，移植之后并不会发生明显的排斥反应，这也使得MSC的临床应用越来越受到人们的青睐，如脐带来源的MSC。
[0003] MSC的分离培养是对其科学研究和临床应用的一个重要前提条件，MSC的细胞质量和安全性是其应用前的两个关键因素。目前许多机构对MSC培养主要采用胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)。血清是去除了纤维蛋白的血浆，其成分十分复杂。血清之所以能保护细胞并促进细胞生长是因为血清中含有许多细胞需要的营养成分，能够长期维持细胞的生长和平衡细胞的生理功能。血清中的主要成份包括1)生长因子，如PDGF,FGF,IGF-1,EGF等，这些生长因子能够促进细胞的增殖和分裂。2)促贴壁物质，如纤连蛋白和氢化可的松，能够促进细胞贴壁和伸展。3)蛋白类物质，如白蛋白、转铁蛋白、球蛋白和蛋白酶抑制剂等，这些蛋白能够运输维生素、脂类等营养物质，促进细胞新陈代谢以及保护细胞不受蛋白酶的伤害。4)其它成分还包括微量元素、脂类、激素、维生素、碳水化合物、氨基酸、核甘酸、抗氧化物质以及缓冲成分等。
[0004] 由于血清具有丰富的营养成分和显著的细胞培养效果，近几十年来人们一直采用血清作为细胞生长的主要营养物质。尽管如此，血清在使用的过程中仍然存在一些问题。由于血清的来源不同，即不断的从不同的动物体内采集，个体差异会导致血清中所含有的营养成分和比例的差别。所以即使是相同品牌的血清也会存在批次之间的差异，而且有时这种差异较明显，这样会导致细胞培养的结果差别较大，难以控制细胞培养的稳定性和重复性。目前血清中的大部分成分虽然已知，但仍有一部分尚不清楚，其中可能包含一些无用的代谢产物以及一些不利于细胞生长的有害物质，在一定程度上会影响细胞的生长增殖。除此之外，由于血清来源于动物体内，可能会含有微生物和病毒等致病原。血清中的动物蛋白属于异源蛋白，使用血清培养的细胞进行治疗可能会造成免疫排斥反应。由于血清存在上述一些问题，用其培养的细胞并不适用于临床治疗。为了更好的满足细胞临床应用和科学研究的需要，组成成分明确的无血清培养基是更安全和理想的选择。开发无血清培养基需要使用已知的并对细胞无害的能维持细胞生长的各种化合物来进行配制。
[0005] 虽然目前市场上已经有商品化的无血清培养基，但这些无血清培养基使用时需要提前包被培养皿来促进细胞贴壁。由于这些培养基不能够像血清一样能抑制胰蛋白酶的活性，所以在终止消化细胞时需要额外使用胰蛋白酶抑制物质。因此目前商品化的无血清培养基在使用上不如有血清培养基使用方便。
[0006] 本发明采用成分明确的无机盐、蛋白质、生长因子、激素、维生素、氨基酸等化合物配制成一种无血清培养基，该培养基能够使间充质干细胞快速稳定的增殖，能够维持间充质干细胞的特性，且能够促进细胞贴壁和抑制胰蛋白酶的活性。发明内容：
[0007] 本发明的目的是针对现有技术的不足，开发出一种高效安全稳定的无血清培养基。为了实现上述要求和目的，本发明所采用的技术方案如下：
[0008] DMEM/F12；
[0009] 细胞生长因子，激素，蛋白质，维生素及还原类物质，促贴壁物质，胰酶抑制物质，添加成分中的一种或多种。
[0010] 进一步的：
[0011] 组合1：生长因子
[0012]中文名 英文名 浓度
成纤维细胞生长因子 Basic fibroblast growth factor,b-FGF 0.1-50ng/ml表皮细胞生长因子 Epidermal growth factor,EGF 0.1-50ng/ml
血小板源性生长因子 Platelet derived growth factor,PDGF 0.1-50ng/ml转化生长因子-β1 Transforming growth factor-β1,TGF-β1 0.1-50ng/ml白血病抑制因子 Leukemia Inhibitory Factor,LIF 0.1-50ng/ml
胰岛素样生长因子-1 Insulin-like Growth Factor-1,IGF-1 0.1-50ng/ml[0013] 组合2：激素
成纤维细胞生长因子 Basic fibroblast growth factor,b-FGF 0.1-50ng/ml表皮细胞生长因子 Epidermal growth factor,EGF 0.1-50ng/ml
血小板源性生长因子 Platelet derived growth factor,PDGF 0.1-50ng/ml转化生长因子-β1 Transforming growth factor-β1,TGF-β1 0.1-50ng/ml白血病抑制因子 Leukemia Inhibitory Factor,LIF 0.1-50ng/ml
胰岛素样生长因子-1 Insulin-like Growth Factor-1,IGF-1 0.1-50ng/ml[0013] 组合2：激素
[0014]中文名 英文名 浓度
氢化可的松 Hydrocortisone 2-20ng/ml
胰岛素 Insulin 2-20ug/ml
孕酮 Progesterone 2-50nM
地塞米松 Dexamethasone 2-50nM
氢化可的松 Hydrocortisone 2-20ng/ml
胰岛素 Insulin 2-20ug/ml
孕酮 Progesterone 2-50nM
地塞米松 Dexamethasone 2-50nM
[0015] 组合3：蛋白质
[0016]中文名 英文名 浓度
血清白蛋白 Human serum albumin 1-50mg/ml
转铁蛋白 Transferrin 1-50μg/ml
胎球蛋白 Fetuin 1-50mg/ml
血清白蛋白 Human serum albumin 1-50mg/ml
转铁蛋白 Transferrin 1-50μg/ml
胎球蛋白 Fetuin 1-50mg/ml
[0017] 组盒4：维生素氨基酸以及还原类物质
[0018]中文名 英文名 浓度
谷氨酰胺 Glutamine 0.5-5mM
还原型谷胱甘肽 Reduced glutathione 0.1-5mM
非必需氨基酸 non-essential amino acids,NEAA 1-500μg/ml
谷氨酰胺 Glutamine 0.5-5mM
还原型谷胱甘肽 Reduced glutathione 0.1-5mM
非必需氨基酸 non-essential amino acids,NEAA 1-500μg/ml
[0019] 组合5：其它物质
[0020]中文名 英文名 浓度
亚硒酸钠 sodium selenium 1-50ng/ml
胆固醇 Cholesterol 10-1000ng/ml
脂质浓缩物 Chemically Defined Lipid concentrate(Invitrogen) 0.01-1％v/v氨基乙醇 Ethanolamine 0.1-10ug/ml
γ-氨基丁酸 γ－aminobutyric acid 0.1-100ug/ml
亚硒酸钠 sodium selenium 1-50ng/ml
胆固醇 Cholesterol 10-1000ng/ml
脂质浓缩物 Chemically Defined Lipid concentrate(Invitrogen) 0.01-1％v/v氨基乙醇 Ethanolamine 0.1-10ug/ml
γ-氨基丁酸 γ－aminobutyric acid 0.1-100ug/ml
[0021] 组合6：促贴壁物质
[0022]中文名 英文名 浓度
纤连蛋白 Fibronectin 0.1-50ug/ml
层粘连蛋白 laminin 0.1-50ug/ml
胶原蛋白 collagen 0.1-50ug/ml
钙粘素 Cadherin 0.1-50ug/ml
纤连蛋白 Fibronectin 0.1-50ug/ml
层粘连蛋白 laminin 0.1-50ug/ml
胶原蛋白 collagen 0.1-50ug/ml
钙粘素 Cadherin 0.1-50ug/ml
[0023] 备注：组合6中的成分可仅用其中一种，也可以使用两种或更多种的组合[0024] 组合7：胰酶抑制物质
[0025]中文名 英文名 浓度
α1-抗胰蛋白酶 α1-Antitrypsin 0.001-0.1％(w/v)
α2-巨球蛋白 α2-Macroglobulin 0.001-0.1％(w/v)
抗凝血酶III Antithrombin III 0.001-0.1％(w/v)
α1-抗胰蛋白酶 α1-Antitrypsin 0.001-0.1％(w/v)
α2-巨球蛋白 α2-Macroglobulin 0.001-0.1％(w/v)
抗凝血酶III Antithrombin III 0.001-0.1％(w/v)
[0026] 本发明的无血清培养基添加成份明确，质量和批次稳定可控，安全性稳定性高。该培养基含有丰富的营养物质可维持细胞快速稳定生长，且能保持间充质干细胞的特性。其中的细胞因子包括成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、血小板源性生长因子、转化生长因子-β1、白血病抑制因子和胰岛素样生长因子-1，这些细胞因子能够快速有效的促进细胞生长分裂。
[0027] 该培养基中添加了胰蛋白酶抑制物质，包括α1-抗胰蛋白酶、α2-巨球蛋白和抗凝血酶III。这些物质可单独添加，也可组合添加，能够有效的抑制胰蛋白酶的活性，因此在消化细胞时不需要额外使用胰蛋白酶抑制物质，使用该培养基即可。
[0028] 该培养基中还添加了促贴壁物质，包括纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白、钙粘素，这些物质可单独添加也可以组合添加，能够有效促进细胞贴壁生长，因此使用该无血清培养基时无需预先包被培养皿，减少了细胞培养中的工序，节约时间成本。该培养基能够长期维持间充质干细胞特性和增殖能力，可用于替代血清培养基。
[0029] 本发明优点：
[0030] 1.采用多种生长因子组合促进细胞生长(组合1)。
[0031] 2.添加促贴壁物质(组合6，或仅使用其中一种或两种以上组合)，细胞培养时不需要包被培养皿，减少了细胞培养中的操作环节，节约时间成本。
[0033] 图1A：有血清培养基中培养的原代细胞，第15天。
[0034] 图1B：无血清培养基中培养的原代细胞，第15天。细胞数量和融合度明显要于图1A。
[0035] 图1C：无血清培养基中培养的P3代细胞。
[0036] 图1D：无血清培养基中培养的P5代细胞。
[0037] 图2：采用有血清和无血清培养基对脐带组织进行原代细胞分离培养所获得的细胞数量。培养15天后有血清培养基所获得的细胞数量为71.5±12.1万个/10cm培养皿；使用本发明无血清培养基所获得的细胞数量为119.2±17.1万个/10cm培养皿。
[0038] 图3：细胞在有血清(实心圆形折线)和无血清(实心方形折线)培养基中的生长曲线。第0天接种细胞数量均为1万个/孔(6孔板)。经过7天培养后，有血清培养条件下收获39±2.65万个细胞/孔；在无血清培养条件下收获62.3±2.55万个细胞/孔。
[0039] 图4：流式检测结果。对无血清培养的P3代脐带间充质干细胞进行流式检测，其中CD73，CD105，CD90，CD44和CD29阳性率大于95％，CD34，CD45和HLA-Dr阳性率小于2％，从流式结果来看，本方法分离培养得到的细胞符合MSC鉴定标准。
[0040] 图5A：无血清培养的P3代间充质干细胞向成骨细胞分化结果。细胞表面已经被茜素红染色液染成深红色，说明细胞已经向胞外分泌骨基质，说明细胞具有成骨分化潜能。
[0041] 图5B：无血清培养的P3代间充质干细胞向脂肪细胞分化结果。细胞中存在大量脂肪滴被油红氧染成红色，说明细胞具有脂肪分化潜能。
具体实施方式
[0042] 下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。
[0043] 无血清干细胞培养基：
[0044] 本发明的无血清培养基的基础成分使用：DMEM/F12(任何一种DMEM/F12培养基)[0045] 其它添加成分如下：
[0046] 组合1：生长因子，1乘浓度(1X)
[0047]中文名 英文名 浓度
成纤维细胞生长因子 Basic fibroblast growth factor，b-FGF 10ng/ml
表皮细胞生长因子 Epidermal growth factor，EGF 10ng/ml
血小板源性生长因子 Platelet derived growth factor，PDGF 10ng/ml
转化生长因子-β1 Transforming growth factor-β1，TGF-β1 10ng/ml
白血病抑制因子 Leukemia Inhibitory Factor，LIF 1000U/ml
胰岛素样生长因子-1 Insulin-like Growth Factor-1，IGF-1 10ng/ml
成纤维细胞生长因子 Basic fibroblast growth factor，b-FGF 10ng/ml
表皮细胞生长因子 Epidermal growth factor，EGF 10ng/ml
血小板源性生长因子 Platelet derived growth factor，PDGF 10ng/ml
转化生长因子-β1 Transforming growth factor-β1，TGF-β1 10ng/ml
白血病抑制因子 Leukemia Inhibitory Factor，LIF 1000U/ml
胰岛素样生长因子-1 Insulin-like Growth Factor-1，IGF-1 10ng/ml
[0048] 组合2：激素，1乘浓度(1X)
[0049]中文名 英文名 浓度
氢化可的松 Hydrocortisone 10ng/ml
胰岛素 Insulin 10ug/ml
孕酮 Progesterone 6.29ng/ml(20nM)
地塞米松 Dexamethasone 3.93ng/ml(10nM)
氢化可的松 Hydrocortisone 10ng/ml
胰岛素 Insulin 10ug/ml
孕酮 Progesterone 6.29ng/ml(20nM)
地塞米松 Dexamethasone 3.93ng/ml(10nM)
[0050] 组合3：蛋白质，1乘浓度(1X)
[0051]中文名 英文名 浓度
血清白蛋白 Human serum albumin 5mg/ml
转铁蛋白 Transferrin 10μg/ml
胎球蛋白 Fetuin 2mg/ml
血清白蛋白 Human serum albumin 5mg/ml
转铁蛋白 Transferrin 10μg/ml
胎球蛋白 Fetuin 2mg/ml
[0052] 组盒4：氨基酸和还原类物质，1乘浓度(1X)
[0053]中文名 英文名 浓度
谷氨酰胺 Glutamine 0.292mg/ml(2mM)
还原型谷胱甘肽 Reduced glutathione 0.307mg/ml(1mM)
非必需氨基酸 non-essential amino acids,NEAA 50ug/ml
谷氨酰胺 Glutamine 0.292mg/ml(2mM)
还原型谷胱甘肽 Reduced glutathione 0.307mg/ml(1mM)
非必需氨基酸 non-essential amino acids,NEAA 50ug/ml
[0054] 组合5：其它物质，1乘浓度(1X)
[0055]中文名 英文名 浓度
亚硒酸钠 sodium selenium 10ng/ml
胆固醇 Cholesterol 350ng/ml
脂质浓缩物 Chemically Defined Lipid concentrate(Invitrogen) 0.2％v/v氨基乙醇 Ethanolamine 2ug/ml
γ-氨基丁酸 γ－aminobutyric acid 10ug/ml
亚硒酸钠 sodium selenium 10ng/ml
胆固醇 Cholesterol 350ng/ml
脂质浓缩物 Chemically Defined Lipid concentrate(Invitrogen) 0.2％v/v氨基乙醇 Ethanolamine 2ug/ml
γ-氨基丁酸 γ－aminobutyric acid 10ug/ml
[0056] 组合6：促贴壁物质，1乘浓度(1X)
[0057]中文名 英文名 浓度
纤连蛋白 Fibronectin 2ug/ml
层粘连蛋白 laminin 2ug/ml
胶原蛋白 collagen 5ug/ml
钙粘素 Cadherin 2ug/ml
纤连蛋白 Fibronectin 2ug/ml
层粘连蛋白 laminin 2ug/ml
胶原蛋白 collagen 5ug/ml
钙粘素 Cadherin 2ug/ml
[0058] 备注：组合6中的成分可仅用其中一种，也可以使用两种或更多种的组合[0059] 组合7：胰酶抑制物质，1乘浓度(1X)
[0060]中文名 英文名 浓度
α1-抗胰蛋白酶 α1-Antitrypsin 0.01％(w/v)
α2-巨球蛋白 α2-Macroglobulin 0.01％(w/v)
抗凝血酶III Antithrombin III 0.01％(w/v)
α1-抗胰蛋白酶 α1-Antitrypsin 0.01％(w/v)
α2-巨球蛋白 α2-Macroglobulin 0.01％(w/v)
抗凝血酶III Antithrombin III 0.01％(w/v)
[0061] 含血清成分的干细胞培养基：
[0062] 本发明中对比实验使用的有血清培养基成分为：DMEM/F12+10％FBS+2mM Gln脐带样本采集和细胞分离培养(实验中所使用的试剂耗材均经过无菌处理)严格在无菌条件下采集产后足月胎儿的脐带组织，放入含有添加了100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素MSC培养基的无菌玻璃瓶中，4℃运输，运输过程中确保脐带组织完全浸没在培养基溶液液面以下，48小时内对脐带组织进行处理。在超净工作台中将胎儿脐带组织放入15cm培养皿中，用镊子将脐带中的血液挤出。再用PBS洗涤脐带组织直到将脐带表面的血液清洗干净。用剪刀将脐带组织剪成3-5cm长度，用镊子将脐带组织撕开暴露出胶体组织(华通氏胶，Wharton’s jelly)，去除动脉和静脉组织。剥掉脐带中的胶体组织。将胶体组织收集到一个50ml离心管中，用剪刀将胶体组织剪碎到1mm3大小的组织块。
[0063] 向六个10厘米培养皿中分别均匀加入1ml剪碎的胶体组织块，再分别补充8ml干细胞无血清培养基，放入37℃，5％CO2培养箱中进行原代细胞培养，作为本发明的测试样本，每五天换液。另外，向六个10厘米培养皿中分别均匀加入1ml剪碎的胶体组织块，再分别补充8ml含血清培养基，放入37℃，5％CO2培养箱中进行原代细胞培养，作为对照组，每五天换液。
[0064] 形态观察
[0065] 脐带组织培养到第15天后，从培养箱中取出细胞在倒置显微镜下观察，观察细胞从组织块中的爬出情况，并拍照记录。
[0066] 细胞传代培养
[0067] 原代脐带间充质干细胞培养到第15天，从培养箱中取出细胞，弃掉培养基和组织块，用PBS洗涤细胞。加入0.25％胰蛋白酶消化细胞3-5分钟。待细胞消化下来后，加入对应的生长培养基终止消化，充份吹打混匀。从每个培养皿中取少量细胞悬液用Countstar细胞计数仪进行计数，统计每个培养皿中收集的细胞数量。将剩余细胞200g离心10分钟，弃上清2
液。用对应的培养基重悬细胞，将细胞以5000个/cm的密度接种于新的10cm培养皿中。放置
37℃，5％CO2培养箱中进行传代细胞培养，每3天换液。待细胞融合度达到80％后，在显微镜下观察拍照，并继续传代培养。
液。用对应的培养基重悬细胞，将细胞以5000个/cm的密度接种于新的10cm培养皿中。放置
37℃，5％CO2培养箱中进行传代细胞培养，每3天换液。待细胞融合度达到80％后，在显微镜下观察拍照，并继续传代培养。
[0068] 细胞生长曲线
[0069] 采用P3代细胞绘制生长曲线。待脐带间充质干细胞融合度达到80％时，将细胞消化好，并终止消化，充份吹打混匀。将细胞200g离心10分钟，弃上清液。分别用对应的干培养基重悬细胞，用conster细胞计数仪计数，向6孔板中每孔加入2ml细胞悬液(含10000个细胞)，放置37℃，5％CO2培养箱中培养7天，每3天换液。每隔24小时取3孔细胞进行消化计数，取3孔平均值。连续检测7天。将检测结果绘制成脐带间充质干细胞生长曲线。
[0070] 流式检测
[0071] 采用无血清培养的P3代细胞进行流式检测。准备消化好的P3代脐带间充质干细胞，PBS洗涤后对细胞进行抗体标记，标记抗体分别是PE-CD73,PE-CD105,PE-CD90,PE-CD34,FITC-CD45,FITC-HLA-Dr,PE-CD44,PE-CD29,PE-Mouse IgG1和FITC-Mouse IgG1(抗体采购自BD bioscience)。经孵育洗涤后，上机检测。
[0072] 成骨细胞和脂肪细胞分化
[0073] 采用无血清培养的P3代细胞进行成骨和成脂细胞分化。脐带MSC向成骨细胞和脂肪细胞分化采用Gibco的成骨细胞分化和脂肪细胞分化试剂盒，货号分别是A10072-01，A10070-01。实验操作按说明书要求进行。
[0074] 实施例1：
[0075] 无血清培养基成分为：DMEM/F12，组合1(5X)，组合2(2X)，组合3(5X)，组合4(1X)，组合5(5X)，组合6(10X)，组合7(10X)。采用该配方进行细胞分离培养。
[0076] 实施例2：
[0077] 无血清培养基成分为：DMEM/F12，组合1(3X)，组合2(1X)，组合3(3X)，组合4(1X)，组合5(3X)，组合6(6X)，组合7(6X)。采用该配方进行细胞分离培养。
[0078] 实施例3：
[0079] 无血清培养基成分为：DMEM/F12，组合1(1X)，组合2(1X)，组合3(1X)，组合4(1X)，组合5(1X)，组合6(2X)，组合7(2X)。采用该配方进行细胞分离培养。
[0080] 实施例4：
[0081] 无血清培养基成分为：DMEM/F12，组合1(1X)，组合2(1X)，组合3(1X)，组合4(1X)，组合5(1X)，组合6(1X)，组合7(1X)。采用该配方进行细胞分离培养。
[0082] 实施例5：
[0083] 无血清培养基成分为：DMEM/F12，组合1(0.5X)，组合2(0.5X)，组合3(0.5X)，组合4(0.5X)，组合5(0.5X)，组合6(0.5X)，组合7(0.5X)。采用该配方进行细胞分离培养。
[0084] 实施例6：
[0085] 无血清培养基成分为：DMEM/F12，组合1(0.1X)，组合2(0.5X)，组合3(0.5X)，组合4(0.5X)，组合5(0.5X)，组合6(0.1X)，组合7(0.1X)。采用该配方进行细胞分离培养。
[0086] 实施例7：
[0087] 无血清培养基成分为：DMEM/F12，组合1(1X)，组合2(1X)，组合3(1X)，组合4(1X)，组合5(1X)，20ug/ml的纤维连蛋白、或层粘连蛋白、或胶原蛋白、或钙粘素，0.1％(V/V)的α1-抗胰蛋白酶、或α2-巨球蛋白、或抗凝血酶III。
[0088] 采用该配方进行细胞分离培养。
[0089] 实施例8：
[0090] 无血清培养基成分为：DMEM/F12，组合1(1X)，组合2(1X)，组合3(1X)，组合4(1X)，组合5(1X)，10ug/ml的纤维连蛋白、或层粘连蛋白、或胶原蛋白、或钙粘素，0.05％(V/V)的α1-抗胰蛋白酶、或α2-巨球蛋白、或抗凝血酶III。
[0091] 采用该配方进行细胞分离培养。
[0092] 实施例9：
[0093] 无血清培养基成分为：DMEM/F12，组合1(1X)，组合2(1X)，组合3(1X)，组合4(1X)，组合5(1X)，2ug/ml的纤维连蛋白、或层粘连蛋白、或胶原蛋白、或钙粘素，0.01％(V/V)的α1-抗胰蛋白酶、或α2-巨球蛋白、或抗凝血酶III。
[0094] 采用该配方进行细胞分离培养。
[0095] 实施例10：
[0096] 无血清培养基成分为：DMEM/F12，组合1(1X)，组合2(1X)，组合3(1X)，组合4(1X)，组合5(1X)，0.1ug/ml的纤维连蛋白、或层粘连蛋白、或胶原蛋白、或钙粘素，0.001％(V/V)的α1-抗胰蛋白酶、或α2-巨球蛋白、或抗凝血酶III。采用该配方进行细胞分离培养。
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