鸡传染性喉气管炎活疫苗中A、B、J亚群禽白血病病毒的检测
方法
技术领域
背景技术
[0002] 禽白血病病毒(avian leukosis virus，ALV)属于反转录病毒科，d反转录病毒属，可引起禽类的良性、恶性可传播
肿瘤性
疾病。ALV分为A-K共11个亚群，其中A、B、C、D、E、J、K这7个亚群可自然感染鸡，A、B、J亚群在临床易分离到，K亚群为近期发现的新亚群。ALV引起的临床感染和亚临床症状给世界养禽业造成了巨大的经济损失。在鸡群中，由ALV感染造成的死亡率有1％-2％，偶尔可达到20％甚至更高。除此之外，ALV还能造成亚临床感染，造成产蛋率下降，影响
机体免疫抑制，降低疫苗免疫的成功率，严重影响生产性能。
[0003] ALV既可以通过种蛋垂直传播，也可以通过
接触水平传播。此外，使用污染了ALV的活疫苗也可能会造成病毒的传播。尽管目前部分大型种禽公司开展了对ALV的
净化工作并取得成效，但临床生产中仍时有禽白血病的发生，而且表现各异，因此活疫苗中外源性禽白血病病毒的检测对于禽白血病的净化和防控具有极其重要的意义。
[0004] 市售商品化活疫苗中A、B、J亚群禽白血病病毒的检测方法主要是采用直接PCR的方法，但是直接PCR检测可能因为病毒含量少而出现漏检的情况；另外，也可能出现直接PCR扩增出的目的
片段是基因片段而不是完整的活病毒的情况。
发明内容
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种有效、准确、可靠的鸡传染性喉气管炎活疫苗中A、B、J亚群禽白血病病毒的检测方法。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
[0007] 鸡传染性喉气管炎活疫苗中A、B、J亚群禽白血病病毒的检测方法，采用DMEM对商品化鸡传染性喉气管炎活疫苗进行稀释，然后接种DF-1细胞，37℃作用1h后换成含1％FBS的DMEM进行培养7天；收集细胞培养上清进行禽白血病病毒p27群特异性
抗原ALV-p27检测；对ALV-p27阳性样品收集细胞培养物并
抽取cDNA，用亚群特异性引物进行A、B、J亚群禽白血病病毒的鉴定，其对应阳性孔细胞，用亚群特异性单抗进行IFA检测。
[0008] 上述检测方法，按以下步骤操作进行：
[0009] (1)无菌条件下将2mL DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)加入商品化鸡传染性喉气管炎活疫苗中，使其溶解；
[0010] (2)将溶解的疫苗使用DMEM进行倍比稀释，稀释比例分别为1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64，采用各稀释比例的疫苗稀释液作用于
单层DF-1细胞1h，随后换成含1％FBS(Foetal Bovine Serum)的DMEM维持培养至7天后，通过观察细胞生长状况，筛选出疫苗的最优稀释比例为1∶16，然后进行A、B、J亚群禽白血病病毒检测；
[0011] (3)按1∶16稀释疫苗，疫苗稀释液以24孔板复孔作用于单层DF-1细胞1h，随后换成含1％FBS的DMEM维持培养至7天；
[0012] (4)收集细胞培养物上清，进行ALV-p27抗原检测；ALV-p27阳性样品收集细胞培养物抽取cDNA，用亚群特异性引物进行A、B、J亚群禽白血病病毒的鉴定，其对应阳性孔细胞，用亚群特异性单抗进行IFA检测；
[0013] (5)鉴定为阳性者则取同一批号另一瓶疫苗按照上述步骤进行复检，以排除操作污染的可能性。
[0014] ALV-p27抗原检测所用
试剂盒为IDEXX ALV-p27试剂盒。
[0015] 稀释液为Gibco生产的DMEM。
[0016] 维持培养液为含1％FBS的DMEM。
[0017] 由于传染性喉气管炎
病毒感染DF-1细胞后会有溶细胞的表现，且疫苗中传染性喉气管炎病毒含量高，破坏细胞快，但ALV病毒含量少，在细胞中复制较慢。据此，
发明人建立了一种鸡传染性喉气管炎活疫苗中A、B、J亚群禽白血病病毒的检测方法，采用DMEM对商品化鸡传染性喉气管炎活疫苗进行稀释，然后接种DF-1细胞，37℃作用1h后换成含1％FBS的DMEM进行培养7天；收集细胞培养上清进行禽白血病病毒p27群特异性抗原ALV-p27检测；对ALV-p27阳性样品收集细胞培养物并抽取cDNA，用亚群特异性引物进行A、B、J亚群禽白血病病毒的鉴定，其对应阳性孔细胞，用亚群特异性单抗进行IFA检测。该法可以使活病毒在细胞中进行增殖，弥补了直接PCR检测的不足，同时具有有效、准确、可靠等特点，对于禽白血病的防控具有重要的意义。实验结果证明，该法成功从鸡传染性喉气管炎活疫苗中检测出一株ALV-J并命名为GX14YYD2。
附图说明
[0018] 图1是商品化鸡传染性喉气管炎活疫苗培养条件优化的结果图，图中：从上至下、从左至右的稀释比例分别为1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64。
[0019] 图2是本发明鸡传染性喉气管炎活疫苗中A、B、J亚群禽白血病病毒的检测方法的
流程图。
[0020] 图3是具体实施方式中使用分型引物对纯化后细胞培养物的PCR鉴定结果图，图中：M为DL2000DNAMaker；1为阴性对照；2为ALV-A扩增结果；3为ALV-B扩增结果；4为ALV-J扩增结果。
[0021] 图4是间接免疫
荧光检测结果图，图中分别为毒株GX14YYD2在DF-1细胞中针对J亚群单抗IFA结果；毒株GX14YYD2在DF-1细胞中针对A亚群单抗IFA结果；毒株GX14YYD2在DF-1细胞中针对B亚群单抗IFA结果；阴性对照结果。
具体实施方式
[0022] 1.疫苗
[0023] 市售商品化鸡传染性喉气管炎活疫苗。
[0024] 2.方法
[0025] 2.1引物设计
[0026] 引物参照文献设计，并由上海华大
生物工程有限公司合成，ALV的分型引物见表1。
[0027] 表1引物序列
[0028]
[0029] 2.2市售商品化鸡传染性喉气管炎活疫苗培养条件的优化
[0030] 无菌条件下将2mL DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium，Gibco生产，C11995500BT，500ml/瓶)加入商品化鸡传染性喉气管炎活疫苗中，使其溶解；将溶解的疫苗使用DMEM进行倍比稀释，稀释比例分别为1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64，稀释后不同浓度的疫苗种DF-1细胞，37℃继续孵育1h，1h后弃上清液，更换为含1％FBS(Foetal Bovine Serum，胎
牛血清)的DMEM，在37℃，5％CO2条件下培养7天。然后荧光倒置
显微镜下观察细胞状态，结果如图1所示，1∶2，1∶4，1∶8可见细胞脱落较多，1∶16，1∶32和1∶64细胞生长良好，故采用其最小稀释度1∶16为最优条件。
[0031] 2.3病毒分离
[0032] 采用前述中最优稀释倍数(1∶16)稀释后的疫苗以24孔板复孔作用于单层DF-1细胞1h，随后换液含1％FBS的DMEM维持培养至7天。一部分细胞培养上清置于-80℃直至进行ALV-p27抗原的检测，剩下的细胞培养物冻融3次后用通用型柱式基因组DNA抽提试剂盒按照产品
说明书提取cDNA样品，置于-20℃直至进行PCR检测。
[0033] 2.4病原鉴定
[0034] 用ALV-p27抗原检测试剂盒(ALV-p27试剂盒，IDEXX生产，99-09254，5*96)并按试剂盒的说明对细胞培养上清进行p27抗原的检测。
[0035] 以收集的细胞培养物按试剂盒说明书提取cDNA分别进行A、B、J亚群的PCR检测。ALV-A/B的PCR反应程序为94℃预变性5分钟，94℃变性45秒，50℃
退火45秒，72℃延伸2分钟，共35个循环，最后72℃延伸10分钟。ALV-J的PCR反应程序为94℃预变性5分钟，94℃变性
45秒，56℃退火45秒，72℃延伸2分钟，共35个循环，最后72℃延伸10分钟。1％琼脂糖凝胶
电泳鉴定PCR产物。结果如图3所示，ALV-A和ALV-B为阴性，ALV-J为阳性。
[0036] 将上述在37℃，5％CO2条件下培养7天后的细胞孔，用PBS洗涤3次，每次5min；然后用4℃保存的冷
乙醇∶丙
酮(v/v＝2∶3)固定细胞5min，PBS洗涤3次，每次5min；将ALV-J单抗JE9按1∶250稀释，分别加至试验组和空白对照组细胞孔中，每孔150μL，在37℃湿盒中孵育3h，PBS洗涤3次，每次5min；加入FITC标记的兔抗鼠荧光
抗体，按1∶300稀释，每孔150μL，在
37℃湿盒中继续孵育1h。PBS洗涤3次后在倒置荧光显微镜下观察。
[0037] 如图4所示，抗ALV-A和ALV-B单克隆抗体呈阴性反应，抗ALV-J单克隆抗体呈阳性反应，感染组DF-1细胞胞浆中可见明显的绿色荧光，而阴性对照组中未见绿色荧光。结果表明，实验用市售商品化鸡传染性喉气管炎活疫苗中检测到一株ALV-J(命名为GX14YYD2)。
