颅内动脉瘤诊治标志物
阅读：478发布：2020-05-14
专利汇可以提供颅内动脉瘤诊治标志物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了CXCL16基因可以作为颅内 动脉瘤 诊断的分子标志物，本发明的实验证明：与正常人相比，CXCL16基因在颅内动脉瘤患者中表达量高。本发明还公开了CXCL16基因可以用于制备 治疗 颅内动脉瘤的药物，细胞凋亡实验证明CXCL16基因过表达能促进血管平滑肌细胞凋亡。本发明的研究成果提供了一种新的颅内动脉瘤临床诊断方法，同时提供了一种治疗颅内动脉瘤的药物新靶标。，下面是颅内动脉瘤诊治标志物专利的具体信息内容。
1.检测CXCL16基因表达的产品在制备诊断颅内动脉瘤的工具中的应用，其特征在于，所述CXCL16基因是人的CXCL16基因，所述CXCL16基因的编码序列是SEQ ID NO.1所示的DNA 序列。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测CXCL16基因表达以诊断颅内动脉瘤的产品；所述用RT-PCR诊断颅内动脉瘤的产品至少包括一对特异扩增CXCL16基因的引物；所述用实时定量PCR诊断颅内动脉瘤的产品至少包括一对特异扩增CXCL16基因的引物；所述用免疫检测诊断颅内动脉瘤的产品包括：与CXCL16蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断颅内动脉瘤的产品包括：与CXCL16基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断颅内动脉瘤的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与CXCL16蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与CXCL16基因的核酸序列杂交的探针。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用实时定量PCR诊断颅内动脉瘤的产品至少包括一对特异扩增CXCL16基因的引物，其序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
4.CXCL16基因和/或其表达产物的抑制剂在制备治疗颅内动脉瘤的药物中的应用，其特征在于，所述CXCL16基因是人的CXCL16基因，所述CXCL16基因的编码序列是SEQ ID NO.1所示的DNA 序列。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抑制剂包括抑制CXCL16基因表达的试剂和/或抑制CXCL16基因表达产物的试剂。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抑制CXCL16基因表达产物的试剂包括针对CXCL16基因的siRNA和/或CXCL16蛋白的抗体。
颅内动脉瘤诊治标志物
技术领域
背景技术
[0002] 颅内动脉瘤是指脑动脉内腔的局限性异常扩大造成动脉壁的一种瘤状突出。颅内动脉瘤多因脑动脉管壁局部的先天性缺陷和腔内压力增高的基础上引起囊性膨出，是造成蛛网膜下腔出血的首位病因。过去人们称之为先天性脑动脉瘤，事实上先天性脑动脉瘤占脑动脉瘤的70％～80％。
[0003] 目前用于颅内动脉瘤的诊断方法包括以下几类：(1)头部CT是诊断SAH的首选方法，头颅MRI(核磁共振成像)是有压迫症状或无症状患者首先检查的方法。CT血管造影(CTA)和磁共振血管造影(MRA)，可初步筛选动脉瘤；(2)脑血管造影(DSA)：是诊断动脉瘤的金标准，可动态以及三维重建了解动脉瘤，是决策治疗方案的主要依据；(3)磁共振成像MRA或磁共振血管造影DSA：是无创性的检查方法，可诊断未破裂的动脉瘤。
[0004] 一般的诊断步骤为：首先进行CT检查判断脑部是否有出血的情况，确认脑部有出血情形，应争取在许可范围内尽早进行CTA、MRA或DSA检查，其中DSA检查是必须的，因为DSA检查目前是诊断动脉瘤的金标准，是最确切的诊断方法。但是上述诊断方法在颅内动脉瘤发生早期并不适用，因此寻找一种在颅内动脉瘤早期即可判断出疾病存在与否的方法是亟待解决的问题。
发明内容
[0005] 为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于颅内动脉瘤早期诊断的分子标志物。相比传统的颅内动脉瘤的诊断方法，使用基因标志物来诊断颅内动脉瘤的具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患者在疾病早期就能知晓疾病风险，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] 本发明提供了检测CXCL16基因表达的产品在制备诊断颅内动脉瘤的工具中的应用。
[0008] 进一步，所述检测CXCL16基因表达的产品包括检测CXCL16基因mRNA水平的产品、和/或检测CXCL16蛋白水平的产品。
[0009] 进一步，所述检测CXCL16基因表达的产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测CXCL16基因表达以诊断颅内动脉瘤的产品。
[0010] 进一步，所述用RT-PCR诊断颅内动脉瘤的产品至少包括一对特异扩增CXCL16基因的引物；所述用实时定量PCR诊断颅内动脉瘤的产品至少包括一对特异扩增CXCL16基因的引物；所述用免疫检测诊断颅内动脉瘤的产品包括：与CXCL16蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断颅内动脉瘤的产品包括：与CXCL16基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断颅内动脉瘤的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与CXCL16蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与CXCL16基因的核酸序列杂交的探针。
[0011] 所述用实时定量PCR诊断颅内动脉瘤的产品至少包括的一对特异扩增CXCL16基因的引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
[0013] 所述诊断颅内动脉瘤的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断颅内动脉瘤的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知CXCL16基因的异常与颅内动脉瘤相关也属于CXCL16基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。
[0014] 本发明还提供了一种诊断颅内动脉瘤的工具，所述工具包括检测CXCL16基因表达的试剂；所述试剂包括检测CXCL16基因mRNA的引物和/或探针、和/或检测CXCL16蛋白的抗体。
[0015] 所述工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。
[0016] 其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测CXCL16基因转录水平的针对CXCL16基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的CXCL16蛋白的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括CXCL16基因在内的多个基因(例如，与颅内动脉瘤相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括CXCL16蛋白在内的多个蛋白质(例如与颅内动脉瘤相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与颅内动脉瘤的标志物同时检测，可大大提高颅内动脉瘤诊断的准确率。
[0017] 其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测CXCL16基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括CXCL16蛋白的特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测CXCL16基因表达水平过程中所需的试剂。优选度，所述试剂包括针对CXCL16基因的引物和/或探针。根据CXCL16基因的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测CXCL16基因表达水平的引物和探针。
[0018] 所述试纸包括检测CXCL16基因表达的试剂。
[0019] 所述高通量测序平台包括检测CXCL16基因表达的试剂。
[0020] 与CXCL16基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
[0021] 进一步，所述CXCL16蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述CXCL16蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与CXCL16蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。
[0022] 在本发明的具体实施方案中，所述检测CXCL16基因mRNA的引物包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对。
[0023] 本发明还提供了CXCL16基因和/或其表达产物的抑制剂在制备治疗颅内动脉瘤的药物中的应用。所述抑制剂包括抑制CXCL16基因表达的试剂、和/或抑制CXCL16基因表达产物的试剂。
[0024] 进一步，所述抑制CXCL16基因表达的试剂包括抑制基因转录的试剂、抑制基因翻译的试剂；所述抑制CXCL16基因表达产物的试剂包括抑制CXCL16基因mRNA的试剂、抑制CXCL16蛋白的试剂。所述抑制CXCL16基因mRNA的试剂包括抑制mRNA稳定性的试剂、抑制mRNA翻译活性的试剂。所述抑制CXCL16蛋白的试剂包括抑制CXCL16蛋白稳定性的试剂、抑制CXCL16蛋白活性的试剂、抑制CXCL16蛋白功能的试剂。
[0025] 进一步，抑制CXCL16基因mRNA的试剂包括针对CXCL16基因mRNA的双链核糖核酸；抑制CXCL16蛋白功能的试剂包括CXCL16抗原蛋白的肿瘤疫苗、抑制CXCL16蛋白功能的抗体。所述抗体可以是多克隆抗体，或是单克隆抗体。
[0026] 所述针对CXCL16基因mRNA的双链核糖核酸可以是siRNA。为了确保CXCL16基因能够被高效剔除或沉默，根据CXCL16基因的mRNA序列设计siRNA特异性片段。siRNA的设计根据已发表的通用设计原则(Elbashir et.al 2001，Schwarz et.al 2003，Khvorova et.al 2003，Reynolds et.al 2004，Hsieh et.al 2004，Ui-Tei et.al 2004)，通过在线工具完成设计，该在线工具为：siRNASelectionProgram of Whitehead Institute(BingbingYuan et.al 2004，http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/)和BLOCK-iTTM RNAi Designer ofINVITROGEN(winner of the 2004Frost&Sullivan Excellence in Research Award，https://rnaidesigner.invitrogen.com/sirna/)。为了进一步提高siRNA片断的有效性，综合两个在线设计工具的优点来设计用于筛选的siRNA片断。最后，通过同源性比对(NCBI BLAST)来过滤siRNA序列，以提高siRNA片断的特异性并减少RNAi干扰的脱靶效应。
[0027] 本发明还提供了一种用于治疗颅内动脉瘤的药物组合物，所述药物组合物包括上面所述的CXCL16基因和/或其表达产物的抑制剂。
[0028] 本发明的药物组合物还包括药学上可接受的载体，载体，这类载体包括(但并不限于)：稀释剂、赋形剂如水等、填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇等。
[0029] 本发明的药物组合物还可与其他治疗颅内动脉瘤的药物联用，多种药物联合使用可以大大提到治疗的成功率。
[0030] 在本发明的上下文中，“CXCL16基因”包括人CXCL16基因以及人CXCL16基因的任何功能等同物的多核苷酸。CXCL16基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中CXCL16基因(NC_000017.11)DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
[0031] 优选地，CXCL16基因的编码序列包括以下任一一种DNA分子：
[0033] (2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
[0034] (3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有70％、优选地，90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。
[0035] 在本发明的具体实施方案中，所述CXCL16基因的编码序列是SEQ ID NO.1所示的DNA序列。
[0036] 在本发明的上下文中，CXCL16基因表达产物包括人CXCL16蛋白以及人CXCL16蛋白的部分肽。所述CXCL16蛋白的部分肽含有与颅内动脉瘤相关的功能域。
[0037] “CXCL16蛋白”包括人CXCL16蛋白以及人CXCL16蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括人CXCL16蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与人CXCL16的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。
[0038] 优选地，CXCL16蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：
[0039] (1)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0040] (2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。
[0041] (3)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(又称为序列同一性)，更优选地，与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列至少约90％至95％的同源性，常为96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列构成的多肽。
[0042] 在本发明的具体实施方案中，所述CXCL16蛋白是具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。
[0043] 通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。
[0044] 通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是CXCL16蛋白的融合蛋白。对于与CXCL16蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留CXCL16蛋白的生物学活性即可。
[0045] 本发明的CXCL16蛋白也包括对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留CXCL16蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。
[0046] 在本发明的上下文中，“诊断颅内动脉瘤”既包括判断受试者是否已经患有颅内动脉瘤、也包括判断受试者是否存在患有颅内动脉瘤的风险。
[0047] 在本发明的上下文中，“治疗颅内动脉瘤”从疾病的状态变化来分，可以包括疾病的缓解、疾病的完全治愈。
[0048] 本发明使用体外培养的血管平滑肌细胞来研究CXCL16基因对颅内动脉瘤的治疗作用。本领域技术人员可知，颅内动脉瘤发生的一个重要的生理特征在于血管平滑肌细胞的凋亡加剧，因此本发明利用血管平滑肌细胞的凋亡实验来研究CXCL16基因与颅内动脉瘤治疗的关系。
[0049] 本发明的优点和有益效果：
[0050] 本发明首次发现了CXCL16基因表达与颅内动脉瘤相关，通过检测受试者CXCL16的表达，可以判断受试者是否患有颅内动脉瘤、或者判断受试者是否存在患有颅内动脉瘤的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。
[0052] 图1显示利用QPCR检测CXCL16基因在颅内动脉瘤组织中的表达情况；
[0053] 图2显示利用免疫印记检测CXCL16蛋白在颅内动脉瘤组织中的表达情况；
[0054] 图3显示利用QPCR检测CXCL16基因的过表达情况；
[0055] 图4显示利用免疫印记检测CXCL16蛋白的过表达情况；
[0056] 图5显示利用TUNEL检测CXCL16基因表达对细胞凋亡的影响。
[0057] 具体的实施方式
[0058] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0059] 实施例1正常对照组织和颅内动脉瘤组织中CXCL16基因的表达差异
[0060] 1、样本收集
[0061] 收集5例颅内动脉瘤患者，手术夹闭瘤颈后切除动脉瘤标本，去除粘连组织及附壁血栓，立即投入液氮中保存。取5例脑外伤患者的颞浅动脉，投入液氮中保存作为正常对照组织。样本收集时均得到患者及其家属同意。
[0062] 2、组织总RNA的提取
[0064] ①加入Trizol，室温保存5min；
[0065] ②加氯仿0.2ml，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5min-10min；
[0066] ③12000rpm高速离心15min后吸取上层水相(吸70％)到另一新离心管中,注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管，加入等体积的-20℃预冷异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10min；
[0067] ④12000rpm高速离15min后小心弃掉上清液，按1ml/ml Trizol的比例加入75％DEPC乙醇洗涤沉淀(4℃保存)，洗涤沉淀物，振荡混合，4℃下12000rpm高速离心5min；
[0068] ⑤弃去乙醇液体，室温下放置5min以充分晾干沉淀，加入DEPC处理过的水溶解沉淀；
[0069] ⑥用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-70℃。
[0070] 3、RNA样品的质量分析(NanoDrop1000分光光度计)
[0071] NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。
[0072] 4、RNA样品的质量分析(Agilent Technologies 2100Bioanalyzer)[0073] Agilent Technologies 2100Bioanalyzer检测RNA样品质量，观察28S rRNA和18S rRNA主带明显、无降解、RNA完整性指数合格、浓度达到要求的符合RNA-seq测序cDNA文库构建的要求，可以用于文库构建及测序。
[0074] 5、高通量转录组测序
[0075] (1)RNA-seq读段定位
[0076] 首先将低质量的读段去除得到清洁读段，然后利用TopHat v1.3.1将清洁片段与UCSC H.sapiens参考基因组(hg19)进行匹配，H.sapiens UCSC hg19版的预先构建的索引从TopHat主页下载，并作为参考基因组，利用TopHat与基因组匹配时，允许每个读段(默认到20)有多个匹配位点，最多2次错配。TopHat根据外显子区域和GT-AG剪切信号建立可能的剪切位点库，根据这些剪切位点库将没有定位到基因组的读段定位到基因组上。我们使用TopHat方法的系统默认参数。
[0077] (2)转录丰度评估
[0078] 匹配上的读段文件通过Cufflinks v1.0.3处理，Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。FPKM值指的是每一百万测序片段中匹配到特定基因1kb长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算FPKM估计值的置信区间。Cufflinks使用的参考的GTF注释文件从Ensembl数据库下载(Homo_
sapiens.GRCh37.63.gtf)。
sapiens.GRCh37.63.gtf)。
[0079] (3)差异表达基因的检测
[0080] 将下载的Ensembl GTF文件和通过TopHat匹配的原始文件传输到Cuffdiff，Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的转录本的表达丰度，检测差异表达。在Cuffidff输出中只有q值＜0.01，测试显示成功的比较才被认为是差异表达。
[0081] 6、结果
[0082] RNA-seq结果显示，与正常对照组织相比，颅内动脉瘤组织中CXCL16基因的mRNA水平显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。
[0083] 实施例2大样本验证差异表达基因
[0084] 1、样本收集
[0085] 收集40例颅内动脉瘤患者，手术夹闭瘤颈后切除动脉瘤标本，去除粘连组织及附壁血栓，立即投入液氮中保存。取40例脑外伤患者的颗浅动脉，投入液氮中保存作为正常对照组织。样本收集时均得到患者及其家属同意。
[0086] 2、转录水平上检测CXCL16基因的差异表达
[0087] 2.1提取组织总RNA
[0088] 步骤同实施例1。
[0089] 2.2逆转录
[0090] 利用TAKARA公司的逆转录试剂盒进行RNA的逆转录。
[0091] 2.3QPCR
[0092] (1)引物设计
[0093] 根据Genbank中CXCL16基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：
[0094] CXCL16基因：
[0095] 正向引物为5’-CTGGAAGTTGTTATTGTG-3’(SEQ ID NO.3)；
[0096] 反向引物为5’-AACCTCGTGTAGTATAGA-3’(SEQ ID NO.4),
[0097] GAPDH基因：
[0098] 正向引物为5’-AAAGGGTCATCATCTCTG-3’(SEQ ID NO.5)；
[0099] 反向引物为5’-GCTGTTGTCATACTTCTC-3’(SEQ ID NO.6)。
[0100] (2)按照表1配制PCR反应体系：
[0101] 其中，SYBR Green聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。
[0102] 表1PCR反应体系
[0103]试剂 体积
正向引物 1μl
反向引物 1μl
SYBR Green聚合酶链式反应体系 12.5μl
正向引物 1μl
反向引物 1μl
SYBR Green聚合酶链式反应体系 12.5μl
[0104]模板 2μl
去离子水 补足25μl
去离子水 补足25μl
[0105] (3)PCR反应条件：95℃5min，(95℃5s，60℃60s)*45个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。
[0106] 2.4统计学方法
[0108] 2.5结果
[0109] 结果如图1所示，与正常对照组织相比，颅内动脉瘤组织中CXCL16基因表达量显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。
[0110] 3、蛋白水平上检测CXCL16基因的差异表达
[0111] 3.1组织总蛋白的提取
[0113] 3.2 Western blot
[0114] 总蛋白用Brandford法定量，取适量与样品缓冲液混合煮沸5min，冷却5min；取30pg蛋白上样到制备好的15％聚丙烯酰胺凝胶，进行电泳，开始设为80V恒压，看见Marker后增加至120V；将电泳后的胶取出，使用Bio.Rad半干转印系统于100V转移50min；转膜完毕后，用1xPBS洗一次，浸入封闭液，40C过夜；倒掉封闭液，加入Western洗涤液洗涤5-10min，加入一抗摇床室温杂交2h；按照适当比例用Western二抗稀释液稀释于封闭缓冲液中，孵育
60min；洗膜液洗3次，每次10min；使用ECL试剂显影、定影检测蛋白表达。
60min；洗膜液洗3次，每次10min；使用ECL试剂显影、定影检测蛋白表达。
[0115] 3.3统计学处理
[0116] 将蛋白条带的灰度值使用Image J软件进行分析，以β-actin为内参，将CXCL16蛋白条带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
[0117] 3.4结果
[0118] 结果如图2所示，与正常对照组织相比，颅内动脉瘤组织中CXCL16蛋白的表达量显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。
[0119] 实施例3CXCL16基因过表达
[0120] 1、CXCL16基因表达载体的构建
[0121] 根据CXCL16基因的编码序列(如SEQ ID NO.1所示)设计扩增引物，引物序列如下：正向引物为5’-ATGTCTGGGAGTCAGAGCG-3’(SEQ ID NO.7)，反向引物为5’-TCAGGTATTAGAGTCAGGTG-3’(SEQ ID NO.8)。从成人胎脑的cDNA文库(clontech公司，货号：
638831)中扩增全长的CXCL16基因的编码序列，上述cDNA序列经限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切后插入到经限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切的真核细胞表达载体pcDNA3.1中，连接获得的重组载体pcDNA3.1-CXCL16用于后续实验。
638831)中扩增全长的CXCL16基因的编码序列，上述cDNA序列经限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切后插入到经限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切的真核细胞表达载体pcDNA3.1中，连接获得的重组载体pcDNA3.1-CXCL16用于后续实验。
[0122] 2、细胞培养
[0124] 3、细胞转染
[0125] 将血管平滑肌细胞按1.5×104/孔接种到24孔细胞培养板中，在37℃、5％CO2培养箱中细胞培养24h，在无双抗、含10％FBS的高糖1640培养基中，转染按照脂质体转染试剂2000(购自于Invitrogen公司)的说明书转染，实验分为对照组(转染空载体pcDNA3.1)和过表达组(转染pcDNA3.1-CXCL16)，pcDNA3.1空载体和pcDNA3.1-CXCL16的工作浓度均为0.5μg/ml。
[0126] 4、利用QPCR实验检测CXCL16基因过表达情况
[0127] 4.1提取细胞总RNA
[0128] 利用QIAGEN公司的组织/细胞RNA提取试剂盒提取细胞总RNA。
[0129] 4.2逆转录和QPCR
[0130] 步骤同实施例2。
[0131] 4.3统计学方法
[0132] 实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，CXCL16基因过表达组与对照组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
[0133] 4.4结果
[0134] 结果如图3显示，与对照组相比，转染pcDNA3.1-CXCL16的细胞中CXCL16基因表达升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。
[0135] 5、利用Western blot检测CXCL16蛋白的表达情况
[0136] 5.1细胞总蛋白的提取
[0137] 使用北京普利莱基因技术有限公司的总蛋白提取试剂盒(货号：P1250)提取细胞中的总蛋白，具体操作步骤参见说明书。
[0138] 5.2 Western blot
[0139] 步骤同实施例2。
[0140] 5.3统计学处理
[0141] 同实施例2。
[0142] 5.4结果
[0143] 结果如图4所示，与对照组相比，转染pcDNA3.1-CXCL16的细胞中CXCL16蛋白的表达量显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。
[0144] 实施例4 CXCL16基因对血管平滑肌细胞凋亡的影响
[0145] 1、细胞培养步骤同实施例3。
[0146] 2、细胞转染血管平滑肌细胞悬液3.0×104/ml接种于预置盖玻片的6孔板，之后按照实施例3的步骤进行转染。
[0147] 3、TUNEL法原位检测细胞凋亡：转染48h后，取出盖玻片用新鲜配制的4％多聚甲醛固定，按TUNEL试剂盒(购自武汉博士德生物工程有限公司)说明书进行操作，BLIP/NBT显色，核固红复染，甘油封片。用PBS代替TUNEL染色液作对照组，高倍镜下计数300个细胞。TUNEL凋亡指数计算公式为：阳性细胞数/总细胞数。
[0148] 4、统计学方法
[0149] 实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
[0150] 5、结果：
[0151] 结果如图5所示，与转染pcDNA3.1的细胞相比，转染pcDNA3.1-CXCL16的细胞凋亡指数明显增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。上述结果表明，CXCL16基因的高表达可以促进血管平滑肌细胞的凋亡。
[0152] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
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