白三烯B4拮抗剂化合物
阅读：1028发布：2020-09-12
专利汇可以提供白三烯B4拮抗剂化合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供式(I)化合物：或其药学上可接受的盐。此外，本发明提供包含式(I)化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体的药物组合物。本发明进一步提供 治疗 腹主 动脉瘤 或动脉粥样硬化的方法，其包括给予 治疗有效量 的式(I)化合物或其药学上可接受的盐，或包含药学上可接受的载体和治疗有效量的式(I)化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物。，下面是白三烯B4拮抗剂化合物专利的具体信息内容。
白三烯B4拮抗剂化合物
[0001] 白三烯B4(LTB4)是由酶5-脂氧合酶和白三烯A4水解酶下游的途径产生的类花生酸促炎脂质介质。LTB4激活多个白细胞亚群，导致细胞招募、产生活性氧族并诱导基因表达。LTB4主要通过其高亲和力G蛋白偶联受体BLT1进行信号传导，且在较小程度上通过其低亲和力BLT2受体进行信号传导。BLT1受体在循环外周血白细胞的特定子集中以及在非白细胞包括内皮细胞和平滑肌细胞上高表达。LTB4参与几种炎性疾病包括腹主动脉瘤(AAA)和动脉粥样硬化的血管病理学。
[0002] 退行性病症AAA的特征在于以下的持续进展：主动脉壁的炎症，破坏性蛋白酶不受控制的局部产生，结构蛋白的破坏，和中间平滑肌细胞的耗竭。早期或急性期以炎性细胞的招募开始。当局部活性氧、白三烯、趋化因子和基质降解产物一起作用来激活各种蛋白酶系统时，导致损伤。腹主动脉的细胞外基质也可以被过度降解弱化，导致被称为AAA的病况。
[0003] 脂质沉积在动脉内膜中动脉粥样硬化斑块形成中的作用是公认的。动脉粥样硬化形成的另一个主要因素是炎性细胞招募到内膜病变。具有高脂质和炎性细胞含量的斑块容易发生破裂和随后的事件，包括心肌梗塞和脑缺血。
[0004] 目前，AAA是大于55岁男性中第十位的死亡主要原因。没有已知批准适用于AAA的药物治疗。此外，尽管药物治疗处理高胆固醇水平和高血压的可用性，但动脉粥样硬化仍然是具有进一步医疗需求的领域。此外，尽管白三烯拮抗剂诸如美国专利5,462,954和WO98/42346中的那些有希望，但还没有LTB4拮抗剂被批准用于炎性适应症。已经显示LTB4拮抗剂化合物也是过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)的配体，这被认为是限制开发它们作为抗炎剂。没有有意义的PPAR结合的LTB4的拮抗作用为解决对于治疗AAA、动脉粥样硬化或两者的医疗需求提供了选择。
[0005] 本发明提供式(I)化合物：
[0006]
[0007] 或其药学上可接受的盐。根据Symyx版本3.2.NET中IUPAC命名特征，式(I)化合物命名为4-[[3-[3-[2-乙基-4-(4-氟苯基)-5-羟基-苯氧基]丙氧基]-2-丙基-苯基]氨基]-2,2-二甲基-4-氧代-丁酸。
[0008] 本发明的第二个方面提供了式I化合物的钠盐，其为4-[[3-[3-[2-乙基-4-(4-氟苯基)-5-羟基-苯氧基]丙氧基]-2-丙基-苯基]氨基]-2,2-二甲基-4-氧代-丁酸钠。
[0009] 本发明的第三个方面提供了包含式(I)化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体的药物组合物。
[0010] 本发明的第四个方面提供了包含4-[[3-[3-[2-乙基-4-(4-氟苯基)-5-羟基-苯氧基]丙氧基]-2-丙基-苯基]氨基]-2,2-二甲基-4-氧代-丁酸钠和药学上可接受的载体的药物组合物。
[0011] 本发明的第五个方面提供了在有此需要的患者中治疗AAA、动脉粥样硬化或两者的方法，其包括将治疗有效量的式(I)化合物，或其药学上可接受的盐，或包含药学上可接受的载体和治疗有效量的式(I)化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物给予所述患者。
[0012] 本发明的第六个方面提供了在有此需要的患者中治疗AAA、动脉粥样硬化或两者的方法，其包括将治疗有效量的化合物4-[[3-[3-[2-乙基-4-(4-氟苯基)-5-羟基-苯氧基]丙氧基]-2-丙基-苯基]氨基]-2,2-二甲基-4-氧代-丁酸钠，或包含药学上可接受的载体和治疗有效量的化合物4-[[3-[3-[2-乙基-4-(4-氟苯基)-5-羟基-苯氧基]丙氧基]-2-丙基-苯基]氨基]-2,2-二甲基-4-氧代-丁酸钠的药物组合物给予所述患者。
[0013] 本发明的第七个方面提供了式(I)化合物或其药学上可接受的盐，其用于治疗。
[0014] 本发明的第八个方面提供了化合物4-[[3-[3-[2-乙基-4-(4-氟苯基)-5-羟基-苯氧基]丙氧基]-2-丙基-苯基]氨基]-2,2-二甲基-4-氧代-丁酸钠，其用于治疗。
[0015] 本发明的第九个方面提供了式(I)化合物或其药学上可接受的盐，其用于治疗AAA、动脉粥样硬化或两者。
[0016] 本发明的第十个方面提供了化合物4-[[3-[3-[2-乙基-4-(4-氟苯基)-5-羟基-苯氧基]丙氧基]-2-丙基-苯基]氨基]-2,2-二甲基-4-氧代-丁酸钠，其用于治疗AAA、动脉粥样硬化或两者。
[0017] 本发明的第十一个方面为式(I)化合物或其药学上可接受的盐用于制备用于治疗AAA、动脉粥样硬化或两者的药物的用途。
[0018] 本发明的第十二个方面为化合物4-[[3-[3-[2-乙基-4-(4-氟苯基)-5-羟基-苯氧基]丙氧基]-2-丙基-苯基]氨基]-2,2-二甲基-4-氧代-丁酸钠用于制备用于治疗AAA、动脉粥样硬化或两者的药物的用途。
[0019] 本发明的另一个方面提供了包含式(I)化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体和任选的一种或多种其它治疗剂的药物组合物。
[0020] 本发明的另一个方面提供了包含化合物4-[[3-[3-[2-乙基-4-(4-氟苯基)-5-羟基-苯氧基]丙氧基]-2-丙基-苯基]氨基]-2,2-二甲基-4-氧代-丁酸钠以及药学上可接受的载体和任选的一种或多种其它治疗剂的药物组合物。
[0021] 本发明的又一个方面提供了式(I)化合物或其药学上可接受的盐，其用于治疗AAA、或动脉粥样硬化或两者。
[0022] 本发明的另一个方面提供了化合物4-[[3-[3-[2-乙基-4-(4-氟苯基)-5-羟基-苯氧基]丙氧基]-2-丙基-苯基]氨基]-2,2-二甲基-4-氧代-丁酸钠，其用于治疗AAA或动脉粥样硬化或两者。
[0023] 本发明的又一个方面提供了式(I)化合物或其药学上可接受的盐用于制备用于治疗AAA或动脉粥样硬化或两者的药物的用途。
[0024] 本发明的再一方面提供了化合物4-[[3-[3-[2-乙基-4-(4-氟苯基)-5-羟基-苯氧基]丙氧基]-2-丙基-苯基]氨基]-2,2-二甲基-4-氧代-丁酸钠用于制备用于治疗AAA或动脉粥样硬化或两者的药物的用途。
[0026] 本文所用的术语“腹主动脉瘤”(或“AAA”)应指哺乳动物中腹主动脉(通常理解为在隔膜下的那部分主动脉)的局部扩张或膨隆，其引起至少一段腹主动脉的尺寸超过其它被认为正常状态的2 cm的尺寸。腹主动脉可以在任何测量尺寸(包括但不限于外直径、腔直径、腔周长和腔面积)方面进行测量和比较。测量和诊断的方式可以是通过使用超声、CT扫描或其它成像技术。例如，当外主动脉直径大于3 cm时在人中存在AAA。然而，如果外主动脉直径大于5 cm，则为了防止破裂和可能的致命性，立即手术或血管内修复(支架或移植)是标准治疗。然而，如果得不到此类治疗，或由于任何原因例如年龄而不是选项，则该人群也可利用本发明进行治疗。
[0027] 本文所用的术语“动脉粥样硬化”应当是指动脉内膜中的富含脂质的斑块或病变。
[0028] 本文所用的术语“有此需要的”应指已经或被诊断出患有需要治疗的病况AAA或动脉粥样硬化。
[0030] 术语“其药学上可接受的盐”是指本发明化合物的盐。制备它们的实例和方法完全在本领域技术人员的知识范畴之内。参见例如，Stahl等人, “Handbook of Pharmaceutical Salts：Properties, Selection and Use,” VCHA/Wiley-VCH, 2002; 和S.M. Berge, 等人, “Pharmaceutical Salts, “Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 66, No. 1, January 1977, 1-19页。特别药学上可接受的盐包括钠盐、钾盐、钙盐和镁盐。本发明的优选的药学上可接受的盐是钠盐。
[0031] 术语“治疗有效量”是指式(I)化合物或其药学上可接受的盐，或包含式(I)化合物或其药学上可接受的盐的组合物实现治疗的量或剂量。式(I)化合物或其药学上可接受的盐的预期剂量在60至1000 mg/患者/天的范围内。优选剂量预期在100至800 mg/患者/天的范围内。最优选剂量预期在130至650 mg/患者/天的范围内。主治医师，作为本领域技术人员，通过考虑本领域技术人员已知的许多因素诸如患者的体重、身高、年龄、总体健康状况、病况严重度、给药方式、给药方案等，可容易地确定治疗有效量。尽管以基于每天的剂量表示，但可以调整给药方案以便为患者提供更优化的治疗益处。除了每天给药以外，每天两次(BID)或每天三次给药可能是适当的。目前考虑BID的给药方案作为优选方案。
[0032] 本文所用的术语“治疗”是指使疾病状态的速率或进展减缓。它还可以包括中止疾病状态。该术语可以进一步地不仅包括中止疾病，而且包括减轻任何已经存在的疾病状态。例如，在AAA的背景下，术语“治疗”可以指减缓腹主动脉瘤的扩展速率。它还可以包括停止腹主动脉瘤的扩展。此外，它可以包括减轻任何已存在的扩展。在动脉粥样硬化的背景下，术语“治疗”可以指减慢或停止动脉粥样硬化斑块的进展。它也可以包括减少现有斑块。
[0033] 本发明化合物优选配制为药物组合物并通过多种途径给药。优选地，此类组合物用于口服给药。制备它们的实例和方法完全在本领域技术人员的知识范畴之内。参见例如，thRemington：The Science and Practice of Pharmacy (A. Gennaro等人编辑， 19 ed., Mack Publishing Co., 1995)。
[0034] 可以通过本领域已知的各种程序，以及以下方案、制备和实施例中所述的程序来制备本发明的化合物及其药学上可接受的盐。然而，以下论述并不旨在以任何方式限制本发明的范围。例如，每一描述的途径的特定合成步骤可以以多种方式组合，或与来自不同方案的步骤组合，以制备本发明的化合物或药学上可接受的盐。方案2说明用于合成本发明的化合物的替代方法。
[0035] 以下制备和实施例进一步说明本发明，并代表式(I)化合物(包括任何新型中间体化合物)的典型合成。试剂和起始原料是本领域普通技术人员容易获得的，或者可以通过选自有机和杂环化学的标准技术、与已知结构类似化合物的合成类似的技术以及下文实施例中描述的程序(包括任何新的步骤)进行制备。
[0036] 已知程序和方法的实例包括诸如以下的一般性参考文献中所述的那些：Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers Inc, 1989; Compendium of Organic Synthetic Methods, 1-10卷, 1974-2002, Wiley Interscience; Advanced Organic Chemistry, Reactions Mechanisms, and Structure, 第5版, Michael B. Smith和Jerry March, Wiley Interscience, 2001; Advanced Organic Chemistry, 第
4版, B部, Reactions and Synthesis, Francis A. Carey和Richard J. Sundberg, Kluwer Academic / Plenum Publishers, 2000等, 以及其中引用的参考文献。
4版, B部, Reactions and Synthesis, Francis A. Carey和Richard J. Sundberg, Kluwer Academic / Plenum Publishers, 2000等, 以及其中引用的参考文献。
[0037] 以下制备和实施例的命名一般采用Symyx® Draw版本3.2.NET中的IUPAC命名特征来完成。使用不同命名方法的替代名称可用于明确地鉴定制备和式(I)化合物。
[0038] 本文所用的以下术语具有所指明的含义：“Bn”是指苄基；“DBU”是指1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯；“DMF”是指二甲基甲酰胺；“DMSO”是指二甲亚砜；“EtOAc”是指乙酸乙酯；“EtOH”是指乙醇；“MeOH”是指甲醇；“NBS”是指N-溴代琥珀酰亚胺；和“THF”是指四氢呋喃。
[0039]
[0040] 在方案1中描述了中间体2-丙基苯胺(6)的形成。
[0041] 在步骤1中，3-羟基-2-丙基-苯甲酸甲酯(2)用1-苄氧基-5-(3-氯丙氧基)-4-乙基-2-(4-氟苯基)苯 (1) (按照Org. Process Res. Dev. (2009), 13：268-275制备)烷基化以提供丙氧基苯甲酸甲酯(3)。技术人员将认识到存在可实现此类烷基化的多种反应条件。例如，该反应可以在惰性溶剂(诸如DMSO)中，在作为碱的N,N-二甲基吡啶-4-胺与碳酸钾存在的情况下，在约50-90℃进行2-4天。或者，该反应可以在DMF中，在碘化钾与无机碱诸如碳酸钾或优选碳酸铯存在的情况下进行。该反应在50-110℃的温度下进行8-24 h。可以使用的其它碱包括，例如氢化钠。
[0042] 在步骤2中，在90-140℃的温度下使用N-甲基吡咯烷酮中的KOH将苯甲酸甲酯(3)水解为苯甲酸(未显示)。这之后，在步骤3中，用亚硫酰氯处理以制备酰基卤并与氢氧化铵反应以获得苯甲酰胺(4)。
[0043] 在步骤4中，苯甲酰胺(4)经历霍夫曼重排，以得到异氰酸酯，其在作为溶剂的MeOH存在的情况下，提供氨基甲酸酯(5)。该反应在碱诸如DBU和溴化剂诸如NBS存在的情况下发生。使用的溶剂是甲醇，并且反应在-10至10℃的温度下进行12至30 h。
[0044] 在步骤5中，在90-140℃的温度下使用惰性溶剂诸如N-甲基吡咯烷酮中的固体氢氧化钾将氨基甲酸酯(5)水解为2-丙基苯胺(6)，持续1-8 h。
[0045] 从2,3-二甲氧基苯甲酸制备3-羟基-2-丙基-苯甲酸甲酯(2)。通过酰基卤将苯甲酸转化为2,3-二甲氧基苯甲酸叔丁酯。用格氏试剂丙基氯化镁处理导致邻位甲氧基的取代，以提供3-甲氧基-2-丙基-苯甲酸叔丁酯。用BBr3脱保护得到3-羟基-2-丙基-苯甲酸，然后将其酯化，以提供3-羟基-2-丙基苯甲酸甲酯(6)。替代合成可以在文献中得到，其以3-苄氧基苯甲醛开始(Bioorg. Med. Chem. 1998, 6, 595-604)。
[0046]
[0047] 在方案2中描述了中间体2-烯丙基苯胺(10)的形成。
[0048] 在步骤1中，N-3(-烯丙基氧基苯基)乙酰胺(7)经历Claisen重排，以提供N-(2-烯丙基-3-羟基-苯基)乙酰胺(8)。该反应在高沸点惰性溶剂诸如二甲基苯胺中，在溶剂的回流温度下进行12-24 h。
[0049] 在步骤2中，使用先前在方案1，步骤1中描述的条件，N-(2-烯丙基-3-羟基-苯基)乙酰胺(8)用苄氧基-5-(3-氯丙氧基)-4-乙基-2-(4-氟苯基)苯(1)烷基化，以提供苯氧基乙酰胺 (9)。
[0050] 在步骤3中，水解苯氧基乙酰胺(9)，以得到2-烯丙基苯胺(10)。该反应在50℃至溶剂的回流温度下在6 N HCl/乙醇的溶剂混合物中进行约1-12 h。
[0051] 通过用3-碘丙烯烷基化乙酰胺基苯酚制备N-3(-烯丙基氧基苯基)乙酰胺(7)。
[0052]
[0053] 在方案3中描述了本发明的化合物(13)的合成。
[0054] 在步骤1中，式(11)的苯胺(Y =烯丙基或丙基)用3,3-二甲基四氢呋喃-2,5-二酮酰化，以提供酰胺(12)。该反应在惰性溶剂诸如二氯甲烷或THF中进行。可以添加有机碱，诸如N-甲基吗啉或二异丙基乙基胺。该反应在10-40℃的温度下进行6-72 h。
[0055] 在步骤2中，利用氢化去除化合物(12)的苄基保护基，以提供本发明的化合物(13)。该反应在溶剂或溶剂混合物诸如THF、EtOH/THF、EtOH、MeOH或EtOAc/MeOH中使用5或10％碳载钯在氢气气氛下进行。如果Y = 烯丙基，则烯丙基在反应条件下被还原为丙基。如果需要，该产物可以使用NaOH水溶液(1当量)转化为羧酸钠并在真空下浓缩。
[0056] 制备1
[0057] 2,3-二甲氧基苯甲酸叔丁酯
[0058]
[0059] 将亚硫酰氯(67.6 mL, 928 mmol)逐滴添加至保持在40℃的2,3-二甲氧基苯甲酸 (132 g, 714 mmol)和DMF (1.32 mL)在甲苯 (528 mL)中的溶液。添加完成之后，将溶液在40℃搅拌1 h。将混合物在真空下浓缩，并且将残余物溶解在二氯甲烷 (528 mL)中。将混合物升温至回流并添加叔丁醇(203.4 mL)。经5 min逐滴添加吡啶 (86.6 mL)，随后添加N,N-二甲基吡啶-4-胺 (4.36 g, 35.7 mmol)，并将混合物搅拌1 h同时冷却至室温。将混合物用水(200 mL)稀释，并将混合物用2 N 盐酸酸化(pH = 2)。分离各相并将有机相用0.5 N 盐酸 (2 × 30 mL)洗涤。将有机相用15% 碳酸钾、水和盐水洗涤。将有机相在真空下浓缩，以得到为白色固体的标题化合物(141.2 g, 83%)。ES/MS m/z 165 +[M-(C 4H9O)]。
[0060] 制备2
[0061] 3-甲氧基-2-丙基-苯甲酸叔丁酯
[0062]
[0063] 向2,3-二甲氧基苯甲酸叔丁酯(171 g, 718 mmol)于THF (855 mL)中的冰冷溶液(-34℃)中以足以保持低于-10℃的内部温度的速率逐滴添加2 M 丙基氯化镁/乙醚 (448.5 mL, 897 mmol)。保持温度近℃，将混合物搅拌3.5 h。将乙酸 (51.4 mL)逐滴添加至混合物中同时保持温度低于℃，然后用水(340 mL)稀释。分离各相并将水相用甲基-叔丁基醚 (3 × 100 mL)萃取。将合并的有机萃取物用盐水洗涤并将有机相在真空下浓缩，以得到为无色油状物的含有痕量的THF和甲基-叔丁基醚的标题化合物(190 g, 定量)。
[0064]
[0065] 制备3
[0066] 3-羟基-2-丙基-苯甲酸
[0067]
[0068] 在保持低于0℃的温度的同时将三溴化硼(305.6 mL, 305.6 mmol)逐滴添加至已经冷却至-25℃的3-甲氧基-2-丙基-苯甲酸叔丁酯(61.2 g, 244 mmol)于甲苯 (428 mL)中的溶液。在℃搅拌3 h。逐滴添加水(100 mL)，将温度升温至7℃并搅拌30 min。将混合物在真空下浓缩，然后将半固体悬浮在水 (200 mL)中。搅拌1 h并将悬浮液通过玻璃料过滤。将收集的固体用水洗涤并将固体干燥，以得到标题化合物(43.1 g, 98%)。
[0069]
[0070] 制备4
[0071] 3-羟基-2-丙基-苯甲酸甲酯
[0072]
[0073] 将3-羟基-2-丙基-苯甲酸 (59.79 g, 332 mmol)于MeOH (598 mL)中的溶液冷却至-10℃，并经35分钟用注射泵添加亚硫酰氯 (36.26 mL, 497.1 mmol)。将反应物升温至室温同时搅拌35 h。将混合物在真空下浓缩，并将残余物用甲基-叔丁基醚 (360 mL)稀释。将获得的混合物在真空浓缩至干燥，以得到为黄褐色固体的标题化合物(64.4 g,87%)。
[0074]
[0075] 制备5
[0076] 3-[3-[5-苄氧基-2-乙基-4-(4-氟苯基)苯氧基]丙氧基]-2-丙基-苯甲酸甲酯
[0077]
[0078] 向3-羟基-2-丙基-苯甲酸甲酯(40.0 g, 206 mmol) 和 1-苄氧基-5-(3-氯丙氧基)-4-乙基-2-(4-氟苯基)苯(按照 Org. Process Res. Dev. (2009), 13：268-275制备) (82.15 g, 206 mmol)于二甲亚砜 (240 mL)中的溶液中依次添加碳酸钾 (30.2 g,219 mmol) 和N,N-二甲基吡啶-4-胺 (2.0 g, 16 mmol)。将悬浮液在60℃搅拌87 h，然后使其冷却。将混合物用水(600 mL)和甲基-叔丁基醚 (100 mL)稀释，并搅拌15 min。
分离各相并将水性部分用甲基-叔丁基醚(3 × 30 mL)洗涤。将合并的有机萃取物用水和盐水洗涤。将有机部分在真空下浓缩，以得到为棕色油状物的标题化合物(123.0 g, 定量)。ES/MS m/z 557 (M+1)。
分离各相并将水性部分用甲基-叔丁基醚(3 × 30 mL)洗涤。将合并的有机萃取物用水和盐水洗涤。将有机部分在真空下浓缩，以得到为棕色油状物的标题化合物(123.0 g, 定量)。ES/MS m/z 557 (M+1)。
[0079] 制备6
[0080] 3-[3-[5-苄氧基-2-乙基-4-(4-氟苯基)苯氧基]丙氧基]-2-丙基-苯甲酸[0081]
[0082] 向3-[3-[5-苄氧基-2-乙基-4-(4-氟苯基)苯氧基]丙氧基]-2-丙基-苯甲酸甲酯(119 g, 181 mmol)于N-甲基吡咯烷酮 (476 mL)中的溶液中添加氢氧化钾 (21.2 g, 378 mmol)，并在120℃搅拌25 min。将混合物冷却，然后用水 (240 mL)和甲基-叔丁基醚 (100 mL)稀释。用12 N 盐酸调整至pH = 2.5。分离各相并将水相用甲基-叔丁基醚(3 × 35 mL)洗涤。将合并的有机萃取物用水洗涤两次，用盐水洗涤一次。将有机萃取物在真空下浓缩。将所得残余物从乙腈中重结晶，过滤，干燥，以得到为白色固体的标题化合物(78 g, 67%)。
[0083]
[0084] 制备7
[0085] 3-[3-[5-苄氧基-2-乙基-4-(4-氟苯基)苯氧基]丙氧基]-2-丙基-苯甲酰胺[0086]
[0087] 将亚硫酰氯 (8.22 mL, 113 mmol)逐滴添加至3-[3-[5-苄氧基-2-乙基-4-(4-氟苯基)苯氧基]丙氧基]-2-丙基-苯甲酸(50.0 g, 92 mmol)和DMF (2.5 mL, 32 mmol)于THF (250 mL)中的溶液。搅拌1 h，然后在0-5℃将反应添加至氢氧化铵 (102.5 mL, 1.52 mol)的溶液。以逐滴方式添加MeOH (250 mL)和水 (500 mL)。在真空中浓缩至约一半体积，并在0-5℃搅拌所得悬浮液30 min。将悬浮液通过玻璃料过滤并将所得固体真空干燥，以得到为灰白色固体的标题化合物(50.3 g, 定量)。ES/MS m/z 542 (M+1)。
[0088] 制备8
[0089] N-[3-[3-[5-苄氧基-2-乙基-4-(4-氟苯基)苯氧基]丙氧基]-2-丙基-苯基]氨基甲酸甲酯
[0090]
[0091] 依次将1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯 (51.6 mL, 345 mmol)和N-溴代琥珀酰亚胺 (34.6 g, 194 mmol)添加至3-[3-[5-苄氧基-2-乙基-4-(4-氟苯基)苯氧基]丙氧基]-2-丙基-苯甲酰胺 (62.0 g, 114 mmol)于MeOH (620 mL)中的机械搅拌悬浮液中，在该时间过程中在1 min内温度从-4.1℃升高至-3.2℃。在℃至℃将反应搅拌22 h。在搅拌的情况下，逐滴添加亚硫酸氢钠(25.1 g, 209 mmol, 25 mL水中)的溶液。
逐滴添加水(620 mL)，并在10℃搅拌30 min。将悬浮液通过玻璃料过滤，将收集的固体用水洗涤并真空干燥，以得到为灰白色粉末的标题化合物(65.8 g, 定量)。ES/MS m/z 572 (M+1)。
逐滴添加水(620 mL)，并在10℃搅拌30 min。将悬浮液通过玻璃料过滤，将收集的固体用水洗涤并真空干燥，以得到为灰白色粉末的标题化合物(65.8 g, 定量)。ES/MS m/z 572 (M+1)。
[0092] 制备9
[0093] 3-[3-[5-苄氧基-2-乙基-4-(4-氟苯基)苯氧基]丙氧基]-2-丙基-苯胺盐酸盐
[0094]
[0095] 将氢氧化钾 (12.97 g, 231 mmol)添加至N-[3-[3-[5-苄氧基-2-乙基-4-(4-氟苯基)苯氧基]丙氧基]-2-丙基-苯基]氨基甲酸甲酯 (65.8 g, 115 mmol)于N-甲基吡咯烷酮 (203 mL)中的溶液，并在110-120℃搅拌2 h。将混合物冷却，然后将其倾倒至水 (450 mL)和甲基-叔丁基醚 (180 mL)的混合物中。将混合物搅拌20 min并分离各相。将水相用额外的甲基-叔丁基醚 (3 × 50 mL)萃取。将合并的有机萃取物通过玻璃料过滤并将滤液用15% 盐水溶液洗涤。将滤液在真空下浓缩，并将残余物溶解在乙酸乙酯 (300 mL)和甲基-叔丁基醚 (300 mL)的混合物中。将4 N 盐酸 (43.1 mL)逐滴添加至该溶液中，同时搅拌并用冰/盐浴冷却所得悬浮液。通过在玻璃料上过滤收集固体，用冷甲基叔丁基醚洗涤，并在真空下干燥，以得到为灰白色固体的标题化合物(57.8 g, 91%)。ES/MS m/z 514 (M+1, 游离碱)。
[0096] 制备10
[0097] 4-[[3-[3-[5-苄氧基-2-乙基-4-(4-氟苯基)苯氧基]丙氧基]-2-丙基-苯基]氨基]-2,2-二甲基-4-氧代-丁酸
[0098]
[0099] 将二异丙基乙基胺 (57 mL, 327 mmol)添加至3-[3-[5-苄氧基-2-乙基-4-(4-氟苯基)苯氧基]丙氧基]-2-丙基-苯胺盐酸盐 (90 g, 175 mmol)于THF (450 mL)中的悬浮液中。向该混合物中添加二氢-3,3-二甲基-2,5-呋喃二酮 (32.1 g, 251 mmol)并在35℃搅拌，直到LCMS表明剩余5％起始原料。将混合物在真空下浓缩，并添加甲基叔丁基醚 (100 mL) 和水 (75 mL)。用磷酸调整至pH = 2-3，并分离各层。将水层用额外的甲基叔丁基醚 (2 × 50 mL)洗涤。将合并的有机萃取物用盐水洗涤并在真空下浓缩。将粗残余物溶解在甲基叔丁基醚 (180 mL)中并添加己烷 (450 mL)，以得到悬浮液并搅拌
30 min。将悬浮液通过过滤收集并干燥，以得到为白色固体的标题化合物(92.5 g, 88%)。
ES/MS m/z 642 (M+1)。
30 min。将悬浮液通过过滤收集并干燥，以得到为白色固体的标题化合物(92.5 g, 88%)。
ES/MS m/z 642 (M+1)。
[0100] 实施例1
[0101] 4-[[3-[3-[2-乙基-4-(4-氟苯基)-5-羟基-苯氧基]丙氧基]-2-丙基-苯基]氨基]-2,2-二甲基-4-氧代-丁酸
[0102]
[0103] 以900 psi的氢气压力开始氢化10％炭载钯、50％湿(水的重量百分比) (13 g)和4-[[3-[3-[5-苄氧基-2-乙基-4-(4-氟苯基)苯氧基]丙氧基]-2-丙基-苯基]氨基]-2,2-二甲基-4-氧代-丁酸 (260 g, 405 mmol))于THF (1560 mL)中的浆料。继续氢化20 h，同时不添加额外的氢。氢化额外2天，维持200 psi的氢气压力。将混合物通过硅藻土过滤并将滤液在真空下浓缩，以得到为固体的标题化合物(251 g, 定量)。过量重量是由于THF的存在。ES/MS m/z 552 (M+1)。
[0104] 实施例2
[0105] 4-[[3-[3-[2-乙基-4-(4-氟苯基)-5-羟基-苯氧基]丙氧基]-2-丙基-苯基]氨基]-2,2-二甲基-4-氧代-丁酸钠
[0106] 将1 N 氢氧化钠 (404 mL)逐滴添加至4-[[3-[3-[2-乙基-4-(4-氟苯基)-5-羟基-苯氧基]丙氧基]-2-丙基-苯基]氨基]-2,2-二甲基-4-氧代-丁酸 (223 g, 404 mmol)于THF (1115 mL)中的溶液中，并在室温搅拌15 min。在真空下减少体积并添加水(1300 mL)。使用膜式泵去除额外溶剂，以避免加热溶液，获得1250 mL的最终体积。分批冻干剩余溶液，以得到为灰白色固体的标题化合物(230 g, 99%)。ES/MS m/z 552 (M+1, 游离碱)。
[0107] 动物研究已经越来越多涉及慢性炎性疾病，包括动脉粥样硬化和AAA中的白三烯合成途径。Poeckel等人. Cardiovascular Research (2010), 86：243-253。动脉粥样硬化是其中动脉粥样硬化斑块或病变在动脉内膜中形成并建立的病况。它是主要由巨噬细胞白细胞的聚集引起并由低密度脂蛋白促进且功能高密度脂蛋白没有从巨噬细胞足够去除脂肪和胆固醇的动脉壁的慢性炎症反应。动脉变得发炎。LTB4因为其促进白细胞沿内皮粘附和趋化的能力而在动脉粥样硬化中起促动脉粥样硬化作用。Bäck, Current Atherosclerosis Reports (2008), 10：244-251; Aiello 等人，Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. (2002) 22：443-449; Rosenfeld, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. (2002) 22：361-363。胆固醇斑块引起肌肉细胞放大并在患处形成硬壳。Spanbroek 等人 PNAS, (2003), 100(3)：1238-1243。
[0108] 在细胞外基质和平滑肌细胞中富含倾向于无症状的稳定动脉粥样硬化斑块。巨噬细胞和泡沫细胞中富含不稳定斑块，并且将病变从动脉腔(纤维帽)分离的细胞外基质通常较弱且容易破裂。纤维帽的破裂将血栓形成材料诸如胶原蛋白暴露于循环并最终诱导管腔中的血栓形成。一旦形成，腔内血栓可能完全堵塞动脉或可能分离、移动进入循环并最终堵塞较小的下游动脉分支，引起血栓栓塞 (Ross, N. Engl. J. Med. (1999), 340(2)：115-126)。
[0109] 退行性疾病AAA的特征在于以下的持续进展：1) 主动脉壁的炎症；2) 破坏性蛋白酶不受控制的局部产生；3) 结构蛋白的破坏；和4) 中间平滑肌细胞的耗竭。早期或急性期以血管中层和血管外膜中炎性细胞的招募开始。当局部活性氧、白三烯、趋化因子和基质降解产物一起作用来激活各种蛋白酶系统时，导致壁内损伤。主动脉壁中的这些病理改变导致节段性减弱、渐进性扩张和自发性破裂 (Nanda等人 Recent Patents on Cardiovascular Drug Discovery (2009), 4：150-159)。
[0110] 慢性透壁炎症是确立的AAA的主要组织学特征之一。这种炎性反应由单核吞噬细胞、淋巴细胞和血浆细胞组成。AAA中慢性炎症反应的性质似乎不同于动脉粥样硬化中观察到的性质。AAA中的炎性反应在分布上通常是透壁的，密集浸润主要集中在外层和动脉外膜。在动脉粥样硬化中，浸润炎性细胞主要局限于病变内膜，并且它们似乎没有变得如AAA中一样集中或广泛分布。尽管存在常见的慢性炎症组分，但外部主动脉壁中结构蛋白的破坏在动脉粥样硬化中没有看到，其似乎负责动脉瘤变性 (Thompson 等人 Curr. Probl. Surg. (2002), 39(2)：110-230, 在115, 137和142)。
[0111] 尽管存在发表的相反研究(参见，例如，Cao等人Prostaglandins & other Lipid Mediators, (2007) 84:34-42)，但相信大多数发表的研究支持该5-脂肪氧合酶途径和LTB4在AAA发病机制中的作用。衍生自中性粒细胞的LTB4的水平升高在AAA的发病机制中发挥关键作用 (Houard 等人 FASEB J.(2009), 23：1376-1383; Ahluwalia, 等人 J. Immunol. (2007), 179：691-697; Kristo 等人 Atherosclerosis, (2010), 210：107-113)。
[0112] 下面体外和体内研究表明式(I)化合物或其钠盐在通过拮抗LTB4治疗动脉粥样硬化和AAA中的活性和效力。这些测定通常由本领域技术人员认识到表明人临床治疗活性。证明LTB4信号传导拮抗活性和效力的测定法可以基本上如下或通过得到类似数据的类似测定来进行。
[0113] 体外测定程序：
[0114] LTB4对BLT1的结合和激活增加细胞内肌醇1,4,5-三磷酸(triphosphase)水平，导致细胞内钙释放，并通过与特异性G-蛋白偶联的信号转导途径亚基偶联并通过其进行信号传导而介导钙内流(Gaudreau 等人 Biochem. J. (1998), 335 (Pt 1)：15-18)。以下是两种体外测定法，其用来证实实施例2对 BLT1邻近信号传导级联事件的拮抗作用：使3
用从BLT1和BLT2稳定细胞系生成的膜制备物的[H]-LTB4配体置换测定法和全细胞钙动员测定法。
用从BLT1和BLT2稳定细胞系生成的膜制备物的[H]-LTB4配体置换测定法和全细胞钙动员测定法。
[0115] LTB4配体置换测定法
[0116] 使用[3H]-LTB4和已知BLT1和BLT2拮抗剂来生成LTB4置换曲线和本发明化合物的IC50值。本发明化合物的受体抑制相对于BLT1抑制剂和BLT2抑制剂参考分子来测定以获得百分比效力。
[0117] hBLT1测试化合物制备：对于hBLT1测定，在DMSO中制备测试化合物以制备10mM储备溶液。储备溶液最初在缓冲液A(50 mM 4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-乙磺酸(HEPES) pH7.4, 10 mM MgCl2, 10 mM NaCl, 10%甘油(v/v), 1% 牛血清白蛋白(BSA) (w/v))中1:10稀释，随后在缓冲液B(50 mM HEPES pH 7.4, 10 mM MgCl2, 10 mM NaCl, 10% 甘油 (v/v),
1 % BSA (w/v), 10% DMSO (v/v))中3X系列稀释，生成十点稀释曲线。将浓度范围为30 µM至1.52 nM的最终化合物铺板在用于进行体外测定的96孔圆底板中。
1 % BSA (w/v), 10% DMSO (v/v))中3X系列稀释，生成十点稀释曲线。将浓度范围为30 µM至1.52 nM的最终化合物铺板在用于进行体外测定的96孔圆底板中。
[0118] hBLT2测试化合物制备：对于hBLT2测定，在DMSO中制备测试化合物以制备10mM储备溶液。储备溶液最初在缓冲液A(50 mM HEPES pH 7.4, 10 mM MgCl2, 10 mM NaCl,10%甘油(v/v), 1 % BSA (w/v))中1:10稀释，随后在缓冲液B(50 mM HEPES pH 7.4, 10 mM MgCl2, 10 mM NaCl, 10% 甘油(v/v), 1 % BSA (w/v), 10% DMSO (v/v))中3X系列稀释，生成十点稀释曲线。将浓度范围为300 µM至15.2 nM的最终化合物铺板在用于进行体外测定的96孔圆底板中。
[0119] 生成BLT1/CHO-K1和BLT2/CHO-K1稳定细胞系的方法：
[0120] 通常，使用商购材料并通过本领域技术人员已知的程序生成这些细胞系。
[0121] hBLT1/CHO-K1稳定 x细胞系制备：合成人BLT1受体DNA(美国国家生物技术信息中心(NCBI)，参考序列NM_181657)并克隆到表达载体pcDNA3.1/Hygro(+) (Invitrogen V87020)中。使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)作为转染试剂将cDNA表达载体构建体转染到中国仓鼠卵巢(CHO-K1)细胞(American Type Culture Collection (ATCC) CCL-61)中。转染后24小时，将细胞在含有200 μg/mL潮霉素的选择性Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中培养。分离单克隆并使用Western印迹分析和荧光成像读板仪(FLIPR®)钙释放测定法筛选其BLT1表达和功能。
[0122] hBLT2/CHO-K1稳定细胞系制备：合成人BLT2短型受体DNA(美国国家生物技术信息中心(NCBI)，参考序列GenBank AB029892，其在N-末端比长型BLT2短32个氨基酸)并克隆到表达载体pcDNA3.1/Hygro(+) (Invitrogen V87020)中。使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)作为转染试剂将cDNA表达载体构建体转染到CHO-K1细胞(ATCC CCL-61)中。转染后48小时，将细胞在含有200 μg/mL潮霉素的选择性DMEM培养基中培养。分离单克隆并使用Western印迹分析和FLIPR®钙释放测定法筛选其BLT2表达和功能。
[0123] hBLT1膜制备：将hBLT1转染的CHO-K1细胞悬浮在50 mM HEPES pH 7.4, 10 mM MgCl2, 10 mM NaCl缓冲液中，超声处理，并通过差速离心浓缩。简而言之，超声处理后，将匀浆以1000 X g离心10 min。将上清液回收，并再次以50,000 X g离心60 min。将沉淀(pellet)收集，再悬浮于含有50 mM HEPES (pH 7.4)、10 mM MgCl2、10 mM NaCl、10%甘油的缓冲液中，并用作hBLT1膜。
[0124] hBLT2膜制备：将hBLT2转染的CHO-K1细胞悬浮在50 mM HEPES pH 7.4, 10 mM MgCl2, 10 mM NaCl缓冲液中，超声处理，并通过差速离心浓缩。简而言之，超声处理后，将匀浆以1000 X g离心10 min。将上清液回收，并再次以50,000 X g离心60 min。将沉淀收集，再悬浮于含有50 mM HEPE pH 7.4、10 mM MgCl2、10 mM NaCl、10%甘油的缓冲液中，并用作hBLT2膜。
[0125] 含有hBLT1的膜中的[3H]-LTB4结合测定：
[0126] 将[3H]-LTB4 (30 μL 1.3 nM, PerkinElmer NET-852)等分至用缓冲液A(50 mM HEPES pH 7.4, 10 mM MgCl2, 10 mM NaCl, 10%甘油, 1% BSA)预先润湿的96孔Millipore Multiscreen-滤膜结合板(目录号MAFBNOB10)。然后将预先制备的剂量响应范围的测试化合物(10 μL)添加至第2-11列，最终化合物浓度范围为3μM至152 pM。对于结合对照，将2-[3-[3-[(5-乙基-4'-氟-2-羟基[1,1'-联苯]4-基)氧基]丙氧基]-2-丙基苯氧基]-苯甲酸钠(LY293111 Na, 商购的已知的hBLT1抑制剂；Sawyer 等人 J. Med. Chem. (1995), 38：4411-4432, 化合物43b) (10 μL 3 μM, 最终浓度)的等分试样(作为阳性对照)或10 μL缓冲液B(50 mM HEPES pH 7.4, 10 mM MgCl2, 10 mM NaCl, 10%甘油, 1 % BSA, 10% DMSO) (阴性对照)添加至选择的孔中。将hBLT1膜蛋白(0.7 μg)添加至微量滴定板的适当孔中，总体积为100 μL。将该板放置在低速板混合器上并孵育1 h。孵育后，将板抽吸，然后用200 μL冰冷的缓冲液C(50 mM HEPES pH 7.4,
10 mM MgCl2, 10 mM NaCl)洗涤，随后额外100 μL洗涤两次，洗涤之间进行抽吸。将该板在空气中干燥，然后添加Microscint® 20 (PerkinElmer) (100 μL)。使该板静置16 h，然后在Packard Instrument Company Topcount®上读取1 min。将CPM(每分钟计数)相对于抑制剂浓度进行绘图，以固定底部用3-参数逻辑拟合法拟合曲线，以获得IC50值。通
3
过除以2.7(先前计算的)将IC50转换为Ki值。(2.7是先前通过用[ H]-LTB4和hBLT1运行饱和结合曲线并使用式Ki =IC50/ 1+[底物]/KM及简化Ki= IC50/2.7确定KM而确定的常数)。
10 mM MgCl2, 10 mM NaCl)洗涤，随后额外100 μL洗涤两次，洗涤之间进行抽吸。将该板在空气中干燥，然后添加Microscint® 20 (PerkinElmer) (100 μL)。使该板静置16 h，然后在Packard Instrument Company Topcount®上读取1 min。将CPM(每分钟计数)相对于抑制剂浓度进行绘图，以固定底部用3-参数逻辑拟合法拟合曲线，以获得IC50值。通
3
过除以2.7(先前计算的)将IC50转换为Ki值。(2.7是先前通过用[ H]-LTB4和hBLT1运行饱和结合曲线并使用式Ki =IC50/ 1+[底物]/KM及简化Ki= IC50/2.7确定KM而确定的常数)。
[0127] 遵循基本上如上所述的方案，实施例2的化合物在这些条件下表现出5.5 nM的绝对Ki (10.4 nM的相对Ki)。这些数据证明在高亲合力LTB4受体时实施例2的化合物对LTB4的有效拮抗作用。
[0128] 含有hBLT2的膜中的[3H]-LTB4结合测定：
[0129] 将[3H]-LTB4 (30 μL 2.8 nM, PerkinElmer NET-852)等分到Falcon® 3072微量滴定板(BD Biosciences)的每个孔中。然后将预先制备的10点剂量响应范围的测试化合物(10μL)添加至第2-11列，最终化合物浓度范围为30 μM至1.5 nM。对于结合对照，将1-(5-乙基-2-羟基-4-(6-甲基-6-1H-四唑-5-基)庚基氧基)苯基)乙酮 (LY255283, 商购的已知的hBLT2抑制剂 (10 μL 100 μM, 10 μM的最终浓度)的等分试样(作为阳性对照)或10 μL缓冲液B(50 mM HEPES pH 7.4, 10 mM MgCl2, 10 mM NaCl, 10%甘油,
1% BSA, 10% DMSO) (阴性对照)添加至选择的孔中。将hBLT2膜蛋白(7.5 μg)添加至微量滴定板的适当孔中，总体积为100 μL。将该板放置在低速板混合器上并孵育1 h。孵育后，将90 μL反应混合物从各孔转移至用缓冲液A(50 mM HEPES pH 7.4, 10 mM MgCl2,
10 mM NaCl, 10%甘油, 0.03 % BSA)预先润湿的96孔Millipore Multiscreen-滤膜结合板(目录号MAFBNOB10)。将板抽吸，然后用300 μL冰冷的缓冲液C(50 mM HEPES pH
7.4, 10 mM MgCl2, 10 mM NaCl)洗涤3次，每次洗涤步骤之后进行抽吸。将该板在空气中干燥，然后添加Microscint® 20 (PerkinElmer) (100 μL)。使该板静置16 h，然后在Packard Instrument Company Topcount®上读取1 min。将CPM(每分钟计数)相对于抑制剂浓度进行绘图，以固定底部用3-参数逻辑拟合法拟合曲线，以获得IC50值。
1% BSA, 10% DMSO) (阴性对照)添加至选择的孔中。将hBLT2膜蛋白(7.5 μg)添加至微量滴定板的适当孔中，总体积为100 μL。将该板放置在低速板混合器上并孵育1 h。孵育后，将90 μL反应混合物从各孔转移至用缓冲液A(50 mM HEPES pH 7.4, 10 mM MgCl2,
10 mM NaCl, 10%甘油, 0.03 % BSA)预先润湿的96孔Millipore Multiscreen-滤膜结合板(目录号MAFBNOB10)。将板抽吸，然后用300 μL冰冷的缓冲液C(50 mM HEPES pH
7.4, 10 mM MgCl2, 10 mM NaCl)洗涤3次，每次洗涤步骤之后进行抽吸。将该板在空气中干燥，然后添加Microscint® 20 (PerkinElmer) (100 μL)。使该板静置16 h，然后在Packard Instrument Company Topcount®上读取1 min。将CPM(每分钟计数)相对于抑制剂浓度进行绘图，以固定底部用3-参数逻辑拟合法拟合曲线，以获得IC50值。
[0130] 遵循基本上如上所述的方案，实施例2的化合物在这些条件下表现出16.5 μM的绝对IC50 (15.4 μM的相对IC50)。这些数据证明在低亲合力LTB4受体时实施例2的化合物对LTB4的统计学上不显著的拮抗作用。
[0131] FLIPR®钙释放测定法：
[0132] 将稳定表达高亲和力(BLT1) LTB4受体的中国仓鼠卵巢(CHO-K1)细胞以10,000个细胞/孔接种在96孔板(Corning)中的含有DMEM/F-12 (3:1) w/o酚红(Invitrogen),5%胎牛血清(FBS) (Hyclone), 20 mM HEPES (Invitrogen), 200 μg/mL潮霉素B (Invitrogen)和40 μg/mL L-脯氨酸(Sigma)的生长培养基中。将板在37℃ 5% CO2下孵育22-24 h，然后将生长培养基替换为50 μL/孔的含有Roswell Park Memorial Institute(RPMI) RPMI-1640 w/o酚红, 20 mM HEPES (都来自Invitrogen)和0.2% w/v牛血清白蛋白(Sigma)的测试培养基。在37℃ 5% CO2下孵育30-60 min后，将50 μL含有
5 mM丙磺舒(Sigma)的稀释的FLIPR Calcium 3 Assay Kit试剂(Molecular Devices)添加至孔中，并且将板在37℃ 5% CO2下再孵育1.25h。将板放置在FLIPR®仪器(Molecular Devices)内，并添加50 μL 4% v/v DMSO或化合物，随后6 min后添加50 μL媒介物或LTB4。LTB4的最终浓度为8 nM。使用0.5秒曝光长度和0.6瓦特激光功率读取该板。
5 mM丙磺舒(Sigma)的稀释的FLIPR Calcium 3 Assay Kit试剂(Molecular Devices)添加至孔中，并且将板在37℃ 5% CO2下再孵育1.25h。将板放置在FLIPR®仪器(Molecular Devices)内，并添加50 μL 4% v/v DMSO或化合物，随后6 min后添加50 μL媒介物或LTB4。LTB4的最终浓度为8 nM。使用0.5秒曝光长度和0.6瓦特激光功率读取该板。
[0133] 实施例2的化合物证明LTB4-诱导的钙动员的抑制(效力和选择性)，Kb (nM)为0.98 (n为2; +/- 1.64)且相对IC50 (nM)为6.48 (n为2; +/- 10.8)。
[0134] 进一步，下面是几种用来测量由LTB4结合BLT1诱导的下游事件的另外的测定法，所述下游事件包括单核细胞中细胞外信号调节激酶1和2(ERK)的磷酸化(Lindsay 等人 J. Leukoc. Biol. (1998), 64:555-562)和小鼠和人血液中相关细胞类型中中性粒细胞中CD11b的诱导以及LTB4与过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)的核受体亚家族的结合亲和力。
[0135] 人磷酸化细胞外相关激酶(pERK)测定：
[0136] 在获自健康人志愿者和用于临床前AAA效力评估的129SvEv小鼠的全血中评估实施例2的化合物通过BLT1阻断LTB4诱导的信号传导的能力。
[0137] 将全血自捐赠人收集在10 mL K2乙二胺四乙酸(EDTA)真空容器管(BD Biosciences)中。将全血的等分试样在37℃预热20分钟。在20nM–10μM的最终浓度测定测试化合物的10点剂量响应曲线。在DMSO中制备最终测定浓度的1000倍的化合物的10点½系列稀释液。然后将化合物在Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中稀释至10倍(DMSO浓度现在是1％)。将10μL化合物稀释液(在DPBS中10倍)或1％DMSO/DPBS添加至2.0 mL体积96深孔板(Nunc)中的孔中，并放置在37℃加热块中。
[0138] 紧随其后，添加80 μL全血并在37℃孵育20 min(最后10 min添加10 μL来自BD Biosciences的抗-人CD14-FITC)。添加11 μL预热的来自Cayman Chemicals的10x LTB4 (最终浓度为10 nM)，并在37℃孵育1 min。反应用1.5 mL来自BD Biosciences 的1X Phosflow Lyse/Fix(预热至37℃)终止。将板密封，涡旋，并在37℃孵育10 min。将细胞用1.5 mL DPBS (Hyclone)洗涤一次，然后在冰上用100 μL 2% Cytofix (BD Biosciences) + 900 μL冷甲醇透化30 min。将细胞用1 mL洗涤缓冲液(Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)+5% FBS)洗涤一次，然后在室温用100 μL pERK抗体(Cell Signaling，1:100稀释)孵育1小时。将细胞用洗涤缓冲液洗涤一次，然后在室温在黑暗中用100 μL 2 μg/mL抗-兔IgG-PE (Invitrogen)孵育30 min。将细胞再次用洗涤缓冲液洗涤，然后在400 μL 1% Cytofix (BD Biosciences)中固定。将细胞转移到12×75管中，然后冷冻直至分析。将样品加热至室温，并在Beckman Coulter FC500流式细胞仪上分析。人单核细胞通过针对CD14-FITC阳性的门控策略侧向散射而分离。用WinList软件(Verity Software House)分析数据，以测定来自单核细胞群体的pERK-PE的平均值和中值荧光强度值。
[0139] 当将实施例2的化合物以不同浓度添加至全血时，单核细胞中ERK的LTB4诱导的磷酸化被阻断，IC50为814 nM，证明实施例2的化合物对下游信号传导事件的拮抗作用。
[0140] 小鼠pERK测定：
[0141] 将全血自129SvEv小鼠收集在50 mM EDTA (Gibco)中。对于体外实验，在20nM –10μM的最终浓度测定测试化合物的10点剂量响应曲线。在DMSO中制备最终测定浓度的
1000倍的化合物的10点½系列稀释液。然后将化合物在DPBS中稀释至10倍(DMSO浓度现在是1％)。将10μL化合物稀释液(在DPBS中10倍稀释)或1％DMSO/DPBS添加至96深孔板中的孔中。添加80 μL全血并在室温孵育20 min(最后10 min以1 μg/mL最终浓度添加10 μL抗-小鼠LY6G-FITC抗体(BD Pharmingen)和10μl抗-小鼠CD11b-APC BD Biosciences)。添加11 μL 10x预热的LTB4 (最终浓度20 nM)，并在37℃孵育2 min。
反应用1.5 mL来自BD Biosciences 的1X Phosflow Lyse/Fix(预热至37℃)终止。将板密封，涡旋，并在37℃孵育10 min。将细胞用1.5 mL DPBS洗涤一次，然后在室温用1 mL BD Perm/Wash缓冲液(BD Biosciences)透化10 min。将细胞用1 mL Perm/Wash缓冲液洗涤一次，然后在室温用100 μL pERK抗体(Cell Signaling，1:100稀释)孵育1 h。将细胞再次用Perm/Wash缓冲液洗涤，然后在室温在黑暗中用100 μL 2 μg/mL抗-兔IgG-PE (Invitrogen)孵育30 min。将细胞再次用Perm/Wash缓冲液洗涤，然后在400 μL 1% BD Cytofix中固定。小鼠单核细胞通过门控策略LY6G-FITC阴性/CD11b-APC阳性而分离。
1000倍的化合物的10点½系列稀释液。然后将化合物在DPBS中稀释至10倍(DMSO浓度现在是1％)。将10μL化合物稀释液(在DPBS中10倍稀释)或1％DMSO/DPBS添加至96深孔板中的孔中。添加80 μL全血并在室温孵育20 min(最后10 min以1 μg/mL最终浓度添加10 μL抗-小鼠LY6G-FITC抗体(BD Pharmingen)和10μl抗-小鼠CD11b-APC BD Biosciences)。添加11 μL 10x预热的LTB4 (最终浓度20 nM)，并在37℃孵育2 min。
反应用1.5 mL来自BD Biosciences 的1X Phosflow Lyse/Fix(预热至37℃)终止。将板密封，涡旋，并在37℃孵育10 min。将细胞用1.5 mL DPBS洗涤一次，然后在室温用1 mL BD Perm/Wash缓冲液(BD Biosciences)透化10 min。将细胞用1 mL Perm/Wash缓冲液洗涤一次，然后在室温用100 μL pERK抗体(Cell Signaling，1:100稀释)孵育1 h。将细胞再次用Perm/Wash缓冲液洗涤，然后在室温在黑暗中用100 μL 2 μg/mL抗-兔IgG-PE (Invitrogen)孵育30 min。将细胞再次用Perm/Wash缓冲液洗涤，然后在400 μL 1% BD Cytofix中固定。小鼠单核细胞通过门控策略LY6G-FITC阴性/CD11b-APC阳性而分离。
[0142] 实施例2的化合物阻断小鼠全血单核细胞中ERK的LTB4诱导的磷酸化，IC50为243 nM，证明下游信号传导事件的拮抗作用。
[0143] CD11b测定:
[0144] 炎症是一种易于开发生物标志物的病理生理过程。例如，一种简单的血液测试可以充当组织活检的替代物来监测中性粒细胞活化。中性粒细胞活化导致其从血液迁移到组织损伤部位且对于炎症过程是极为重要的(Busse, Am. J. Respir. Crit Care Med. (1998), 157:S210-213)，并且中性粒细胞在健康组织中通常不存在。基于对于血液中的中性粒细胞活化特异性的生物标志物的测定法是组织中炎症反应的侵入性较小的指标。β2整合素CD11b/CD18 (Mac-1)(中性粒细胞表面上的糖蛋白)表达的增加是中性粒细胞迁移到炎症区域中的一个早期步骤(Parkos, BioEssays (1997), 19：865-873)。CD11b作为BLT1受体拮抗作用的临床前和临床生物标志物的效用是基于以下事实，即LTB4有效上调中性粒细胞上的CD11b表达(Turner 等人 J. Clin. Invest. (1996), 97:381-387)，且已经显示LTB4受体的拮抗剂显著降低LTB4对CD11b的刺激 (Allen 等人 J. Pharmacol. Exp. Ther. (1996), 277：341-349; Davis 等人 J. Immunol. Methods (2000), 240：125-132; Marder 等人 Biochem. Pharmacol. (1995), 49：1683-1690)。
[0145] 如前所述从捐赠人或小鼠收集EDTA抗凝血液。对于体外实验，分别在78nM –10μM或20nM – 10μM的最终浓度测定测试化合物的8或10点剂量响应曲线。在DMSO中制备最终测定浓度的1000倍的化合物的½系列稀释液。然后将化合物在DPBS中稀释至
10倍(DMSO浓度现在是1％)。将10μL化合物稀释液(在DPBS中10倍)或1％DMSO/DPBS添加至96深孔板中的孔中。添加90 μL全血，并在室温孵育20 min。添加11 μL
10x LTB4 (对于小鼠，最终浓度为25nM，或对于人，最终浓度为10 nM)，并在37℃孵育30 min。通过在冰上将板孵育5 min而终止反应。将细胞用10 μL抗-小鼠或抗-人CD11b-PE (BD Biosciences，对于小鼠，1:20稀释，对于人，未稀释)染色，并在冰上在黑暗中孵育30 min(对于小鼠实验，最后10 min添加10μL 1:25稀释的抗-小鼠LY6G-FITC抗体(BD Pharmingen))。通过添加1.5 mL 1X BD FACSlyse (BD Biosciences)并在室温在黑暗中孵育10 min而裂解红细胞(RBCs)。将细胞用1.5 mL DPBS洗涤一次，然后在400 μL 1% Cytofix中固定。小鼠中性粒细胞通过门控策略LY6G-FITC阳性分离，且人中性粒细胞通过光散射特性分离。用WinList软件(Verity Software House)分析数据，以测定来自中性粒细胞群体的CD11b-PE的平均值和中值荧光强度值。
10倍(DMSO浓度现在是1％)。将10μL化合物稀释液(在DPBS中10倍)或1％DMSO/DPBS添加至96深孔板中的孔中。添加90 μL全血，并在室温孵育20 min。添加11 μL
10x LTB4 (对于小鼠，最终浓度为25nM，或对于人，最终浓度为10 nM)，并在37℃孵育30 min。通过在冰上将板孵育5 min而终止反应。将细胞用10 μL抗-小鼠或抗-人CD11b-PE (BD Biosciences，对于小鼠，1:20稀释，对于人，未稀释)染色，并在冰上在黑暗中孵育30 min(对于小鼠实验，最后10 min添加10μL 1:25稀释的抗-小鼠LY6G-FITC抗体(BD Pharmingen))。通过添加1.5 mL 1X BD FACSlyse (BD Biosciences)并在室温在黑暗中孵育10 min而裂解红细胞(RBCs)。将细胞用1.5 mL DPBS洗涤一次，然后在400 μL 1% Cytofix中固定。小鼠中性粒细胞通过门控策略LY6G-FITC阳性分离，且人中性粒细胞通过光散射特性分离。用WinList软件(Verity Software House)分析数据，以测定来自中性粒细胞群体的CD11b-PE的平均值和中值荧光强度值。
[0146] 实施例2的化合物在该临床前模型中剂量依赖地抑制中性粒细胞中LTB4诱导的CD11b表达，并且实施例2阻断小鼠和人全血中性粒细胞中LTB4诱导的CD11b表达。人全血中性粒细胞中LTB4诱导的CD11b表达受到阻断，IC50为193 nM。类似地，实施例2的化合物抑制小鼠全血中性粒细胞中的CD11b表达，IC50为1.45 μM。
[0147] 配体激活过氧化物酶体增殖物激活受体α、δ和γ(PPARα、δ、γ)结合测定：
[0148] 已经显示LTB4和BLT受体拮抗剂是过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)的核受体亚家族的配体，并且被认为限制其发展机会(Devchand 等人 J. Biol. Chem. (1999),274：23341-23348; Devchand 等人 Nature (1996), 384：39-43)。
[0149] PPAR功能裂解物制备：
[0150] 通常，使用商购材料并通过本领域技术人员已知的程序生成这些细胞系。
[0151] 合成编码全长PPARα受体DNA(美国国家生物技术信息中心(NCBI)参考序列NM_005036.4)、PPARδ受体DNA (NCBI参考序列NM_006238.4)、PPARγ受体DNA (NCBI参考序列NM_015869.4)和类视黄醇X受体(RXR)αDNA(NCBI参考序列NM_002957.4)的核苷酸序列，并与来自载体的N-末端HIS标签同框插入pFastBacHTb (Invitrogen)载体中。根据制造商的Bac-to-Bac Baculovirus Expression系统的方案(Invitrogen; 还参见Invitrogen User Manual, Version F, 2010年9月4日;和Invitrogen Instruction Manual 2002年2月27日)通过转化DH10Bac细胞并从白色菌落分离DNA而生成重组杆6
粒(杆状病毒穿梭载体质粒)。使用CellFectin试剂(Invitrogen)以0.9 × 10细胞/孔在6孔板中转染Sf9细胞。P0病毒在转染后72 h收集并用来以100 µL P0病毒/每50
6
mL细胞(1.5 × 10细胞/mL)感染悬浮的Sf9昆虫细胞。96 h后收集P1病毒。对于蛋白
6
产生，用5 mL P1病毒以1.5 × 10细胞/ mL感染1L Sf9细胞，并在48 h后收获细胞。
为了制备细胞裂解物，将来自1L培养物的细胞沉淀用12.5 mL冰冷的裂解缓冲液(20 mM HEPES, pH7.8, 160 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM二硫苏糖醇(DTT), 1% 3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS), 40%甘油, 1 x Roche蛋白酶抑制剂混合物)(对于PPAR)或裂解缓冲液B(10 mM Tris-HCl, pH7.5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 50%甘油, 1 x Roche蛋白酶抑制剂混合物)(对于RXRα)重悬浮，然后均质化，并在冰上超声处理。在4℃在Beckman JA18转子上以16,500 rpm离心45 min之后，将上清液等分并冷冻在-80℃。蛋白浓度通过Bradford测定法使用BSA作为标准品进行测定。
粒(杆状病毒穿梭载体质粒)。使用CellFectin试剂(Invitrogen)以0.9 × 10细胞/孔在6孔板中转染Sf9细胞。P0病毒在转染后72 h收集并用来以100 µL P0病毒/每50
6
mL细胞(1.5 × 10细胞/mL)感染悬浮的Sf9昆虫细胞。96 h后收集P1病毒。对于蛋白
6
产生，用5 mL P1病毒以1.5 × 10细胞/ mL感染1L Sf9细胞，并在48 h后收获细胞。
为了制备细胞裂解物，将来自1L培养物的细胞沉淀用12.5 mL冰冷的裂解缓冲液(20 mM HEPES, pH7.8, 160 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM二硫苏糖醇(DTT), 1% 3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS), 40%甘油, 1 x Roche蛋白酶抑制剂混合物)(对于PPAR)或裂解缓冲液B(10 mM Tris-HCl, pH7.5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 50%甘油, 1 x Roche蛋白酶抑制剂混合物)(对于RXRα)重悬浮，然后均质化，并在冰上超声处理。在4℃在Beckman JA18转子上以16,500 rpm离心45 min之后，将上清液等分并冷冻在-80℃。蛋白浓度通过Bradford测定法使用BSA作为标准品进行测定。
[0152] 使用闪烁邻近测定法(SPA)技术评估化合物对PPARα、δ、γ受体的结合亲合力[0153] 生物素化的寡核苷酸(DR2)5 TAATGTAGGTAATAGTTCAATAGGTCAAAGGG3’(SEQ ID NO：1)用于使受体结合于涂覆有硅酸钇链霉亲和素的SPA小珠(Perkin Elmer)。PPAR α、δ、γ和类视黄醇X受体(RXR)α受体(内源表达为异源二聚体)是来自Sf9细胞中杆状病毒表达系统的细胞裂解物。通过在室温在结合缓冲液中混合30 min而将DR2结合至链霉亲和素SPA珠粒，所述结合缓冲液含有10 mM HEPES, pH 7.8, 80 mM KCl, 0.5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0.5% CHAPS和16.6 μg牛血清白蛋白。将混合物以2000 rpm旋转3 min以沉淀珠粒–寡聚物混合物。去除上清液，并将珠粒–寡聚物沉淀在与上述相同的结合缓冲液中重悬浮。在上述结合缓冲液加上14%甘油和5 μg剪切的鲑精DNA中，在~0.0338μCi氚标记的GW2331(外消旋的2-[4-[2-[[(2,4-二氟苯基)氨基甲酰基](庚基)氨基]乙基]苯氧基]-2-甲基丁酸)(对于α和δ受体)和~0.0373 μCi氚标记的2-甲基-2-[4-[3-[丙基[(5-吡啶-2-基噻吩-2-基)磺酰基]氨基]丙基]苯氧基]丙酸(对于γ受体)、110.3 μg SPA链霉亲和素包被的珠粒、0.126 nM HD Oligo DR2、和0.3 μg PPARα与0.5 μg RXRα、0.5 μg PPARδ与0.5 μg RXRα、或1.25 μg PPARγ与3.03 μg RXRα存在的情况下，将细胞裂解物与范围为0.17至10,000 nM的11种浓度之一的化合物在各孔中孵育。在10000 nM未标记的GW2331 (Kliewer, S. A. 等人Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997), 94:4318-4323) (对于α和δ受体)和2-甲基-2-[4-[3-[丙基[(5-吡啶-2-基噻吩-2-基)磺酰基]氨基]-丙基]苯氧基]丙酸(WO 2004/073606)(对于γ受体)存在的情况下确定非特异性结合。将结合反应(96孔[Costar 3632]板中每孔100 μL)孵育10 h，并在Wallac Microbeta Luminometer Liquid Scintillation Counter上计算为每分钟衰变(dpm)。通过使用4-参数逻辑方程(Logistic Equation)拟合11点浓度-响应曲线来测定化合物的受体结合亲合力(IC50)。使用Cheng-Prussoff方程从IC50确定Ki，并通过饱和结合确定Kd。
[0154] 可以通过通常遵循文献中用于合成偕二甲基类似物(WO 92/10468; Hawke, R. L. 等人J. Lipid Res.1997, 38:1189-1203)以获得未氚标记材料的程序获得氚标记的GW2331。氚标记可以使用氚气和将氚放置在二氟苯基的邻位的Crabtree氏催化剂(Heys, J. R. 等人 J. Labelled Cpd. Radiopharm. (1999), 42:797-807)来完成。或者，可以通过庚烯类似物与氚气的钯催化还原将氚放置在分子的庚基部分(同上，Kliewer，S. A)。
[0155] 可以通过联合前体与氚气的催化还原制备氚标记的2-甲基-2-[4-[3-[丙基[(5-吡啶-2-基噻吩-2-基)磺酰基]氨基]丙基]苯氧基]丙酸。可以通过通常遵循WO 2004/073606中的程序，以烯丙胺与2-甲基-2-[4-[3-(对甲苯基磺酰基氧基)丙基]苯氧基]丙酸乙酯的反应开始，随后用5-(2-吡啶基)-2-噻吩磺酰氯进行磺酰化并水解乙基酯而制备联合前体(2-[4-[3-[烯丙基-[[5-(2-吡啶基)-2-噻吩基]磺酰基]氨基]丙基]苯氧基]-2-甲基-丙酸)。
[0156] 两种放射性配体的使用可以在文献中找到(Burris 等人 Molecular Pharmacology, 2004 67：948-954和Xu 等人 J. Med. Chem. 2004, 47：2422-2425)。
[0157] 遵循基本上如上所述的方案，实施例2的化合物在PPAR α、δ、γ结合测定中分别表现出约617 nM (n = 3)、> 8830 nM (n = 4)和1380 nM (n = 2)的Ki。这些数据表明，实施例2的化合物只是与PPAR受体弱相互作用。该活性被认为证明选择性，并且不表示开发限制。
[0158] 体内测定程序：
[0159] CaCl2-诱导的AAA动物效力模型：
[0160] 将氯化钙溶液靶向施用于小鼠主动脉诱导血管扩张 Chiou 等人 J. Surg. Res. (2001), 99：371-376; Lomgo 等人 J. Clin. Invest. (2002), 110：625-632。处理后两周，与初始血管直径相比的血管扩张变得统计学显著，4周后主动脉腔周长增加最高达75％。钙沉淀已经主要定位在血管中层的弹性网络内。钙弹性组织复合物对这种结构的破坏弱化了血管壁，有助于动脉瘤形成。这种损伤也充当促炎刺激，招募中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞和肥大细胞。
[0161] 动物：
[0162] 小鼠：129SvEv雄性，7周龄，获自Taconic Farms, Germantown, New York, USA。
[0163] 大鼠：Sprague-Dawley大鼠，7-8周龄，获自Harlan, Indianapolis, Indiana, USA。
[0164] 动脉瘤诱导模型：所有程序都根据礼来公司机构动物护理和使用指南(Eli Lilly and Company Institutional Animal Care and Use guidelines)进行。动物到来之后，它们具有一周适应期，在此期间，它们自由采食标准啮齿动物食物(Purina #2014)和室内用水。适应期之后，将动物用异氟烷麻醉，并进行剖腹手术，用于CaCl2刺激诱导腹主动脉瘤(AAA)。使用显微外科技术，将从肾动脉水平至髂分叉处的腹主动脉与下腔静脉和周围的结缔组织分离开。一旦分离，将腹主动脉的目标区域(ROI)用预浸在0.25M CaCl2溶液中的无菌棉纱布包裹。在假手术对照动物中，用0.9%盐水代替CaCl2。7分钟后，移除所述纱布，再次运用第二个CaCl2浸泡的纱布。第二个7分钟后，移除所述纱布，用0.9%盐水冲洗主动脉，并闭合腹腔。动物在它们手术当天结束时回到一般饲养。
[0165] 化合物给药：小鼠通过口腔强喂法以10 mL/kg体重的剂量体积接受测试化合物(实施例2)，大鼠通过口腔强喂法以2.5 mL/kg体重的剂量体积接受测试化合物(实施例2)。化合物给药是BID(上午和下午)，第一剂量在手术前一天(下午)给予，第二剂量在手术的早上给予。在手术当天，动物不接受下午剂量。手术后第二天，继续BID 给药，持续28天。
[0166] 通过超声测量主动脉：手术后二十八天，将动物麻醉，并使用配备7.5 MHz探头的eSaote MyLab 30 Gold Biosound Ultrasound单元进行腹部超声测量。由于临床前CaCl2啮齿动物模型中腹主动脉瘤的不对称发展，在高峰收缩过程中沿纵向和横截面轴线采集外直径和腔(内)直径的动脉测量值以鉴定ROI内的最扩张区段。在该点采集内横截面腔周长测量值(mm)，以便评估效力，并用JMP® 7软件(Cary, North Carolina)进行统计分析。
[0167] 统计分析：腔周长的测量值表示为平均值±SE。为了确定药物治疗组的AAA抑制的百分比，来自媒介物处理的假手术对照组的测量值代表AAA发展的100％抑制，而来自媒介物处理的CaCl2组的测量值代表AAA发展的0％抑制。统计分析使用JMP®7软件(Cary, North Carolina)进行，并且Dunnett氏检验用于各治疗组间的统计比较。统计学显著性在P<0.05时被接受。
[0168] 通过用盐水浸泡的纱布处理且随后用媒介物(“假手术媒介物”)4周给药的小鼠中主动脉的腔周长确定100％效力和通过用CaCl2浸泡的纱布处理且随后用媒介物(“媒介物”)4周给药的小鼠中主动脉的腔周长确定0％效力而确定CaCl2诱导的腹主动脉瘤模型中的效力信号窗口。
[0169] 遵循基本上如上面所述的方案，使用129SvEv小鼠，与媒介物处理的小鼠相比，使用实施例2的化合物的主动脉的腔周长统计学减小(表1)，并证明实施例2的化合物减小了该动物模型中的AAA。
[0170] 表1. 小鼠中AAA的体内百分比(%)减小
[0171] 。
[0172] 在相似的研究设计中，在Sprague-Dawley 大鼠中评估CaCl2诱导的损伤之后实施例2的化合物调节主动脉瘤扩张的能力。与媒介物处理的大鼠相比，主动脉的腔周长统计学减小(表2)，并证明实施例2的化合物减小AAA。
[0173] 表2. 大鼠中AAA的体内百分比(%)减小
[0174] 。
[0175] LDLr KO小鼠头臂动脉弓动脉粥样硬化模型：
[0176] 在动脉粥样硬化的低密度脂蛋白(LDL)受体敲除(LDLr KO)小鼠模型中测试实施例2的化合物。编码和合成LDL受体(LDLr KO)的能力缺陷的小鼠是高胆固醇血症的，尤其当维持高胆固醇饮食时(Ishibashi 等人 J. Clin. Invest. (1994), 93：1885-1893)。在大动脉，LDLr KO小鼠自发发展出模拟人类病变的细胞、脂质和细胞外基质组成的主要特征的动脉粥样硬化病变。人和小鼠病变两者的一个重要组成部分是动脉内皮下膜中的载脂巨噬细胞或“泡沫细胞”。巨噬细胞储存的酯化胆固醇是病变发展的替代物(surrogate)。
直接来自小鼠动脉组织的酯化胆固醇的测定(通过LC/MS)提供了病变负担的快速指数。在本研究中使用的LDLr KO模型利用头臂动脉(BCA)中成熟动脉粥样硬化斑块的快速发展。
该研究的主要端点是通过光学显微镜测量动脉的连续横截面中的病变获得的动脉胆固醇酯含量和病变尺寸。
直接来自小鼠动脉组织的酯化胆固醇的测定(通过LC/MS)提供了病变负担的快速指数。在本研究中使用的LDLr KO模型利用头臂动脉(BCA)中成熟动脉粥样硬化斑块的快速发展。
该研究的主要端点是通过光学显微镜测量动脉的连续横截面中的病变获得的动脉胆固醇酯含量和病变尺寸。
[0177] LDLr KO 小鼠 (JAX #002207), 7周龄雄性，获自The Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine)。到达测试设施并持续总共10周之后，小鼠单独饲养并自由采食致动脉粥样硬化的饮食TD.88137 (Teklad)。在前6周过程中，小鼠在它们的笼子中不受干扰地休息。在最后4周过程中，小鼠经口腔强喂法每天两次接受测试化合物。来自评估的数据报道于下表3中。
[0178] 表 3： LDLr KO小鼠BCA动脉粥样硬化病变面积表明动脉粥样硬化端点的剂量依赖性降低。治疗组之间的比较用单因素方差分析和随后的Dunnett氏检验进行。
[0179]
[0180] 表3显示，与媒介物处理组相比，以30 mg/kg b.i.d给药的实施例2的化合物使BCA胆固醇酯(CE)含量降低23％(p < 0.04)。10 mg/kg b.i.d的实施例2的化合物，尽管比30 mg/kg b.i.d.效力要低，但与媒介物处理相比使CE含量降低18％(p < 0.09)。BCA病变的直接测量确认并扩展了这些替代数据表明的BCA动脉粥样硬化显著减轻的趋势。表3显示以30 mg/kg口服b.i.d给药的实施例2的化合物产生的病变面积的显著减小。以该剂量处理导致与单独媒介物处理相比病变面积的66％的减小(p < 0.017)。10 mg/kg b.i.d和3 mg/kg b.i.d.给药的实施例2的化合物分别产生病变面积的58％和53％减小，表明与对BCA CE含量的影响相比类似的剂量-反应效应。
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