颤蛋白缺乏或机能不良及其相关的方法
阅读：105发布：2020-07-25
专利汇可以提供颤蛋白缺乏或机能不良及其相关的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且记载了一种测量作为 生物 标志物的颤蛋白的方法，以非破坏性地评估或预测在目前无法接近或难以接近的脑中以及其他部位的DHA 水 平，后者为中枢神经系统(CNS)中的关键成分。还记载了一种 预防 、延缓颤蛋白缺乏或机能不良和/或与颤蛋白缺乏或机能不良有关的 疾病 或病症的发作或进行 治疗 的方法，包括对诊断具有或怀疑患有颤蛋白缺乏或机能不良的患者 给药 一定量的PUFA，并且尤其是ω－3 PUFA，以及更具体地，二十二 碳 六烯酸(DHA)或前体或其来源，以补偿患者中颤蛋白缺乏或机能不良的效果。还记载了一种预防或减少与颤蛋白机能不良或缺乏有关的发育 缺陷 或病症的方法，通过补充使用多不饱和 脂肪酸 (PUFAs－具有两个或多个双键的不 饱和脂肪酸 )，并且尤其是高度不饱和脂肪酸(HUFAs－具有三个或多个双键的不饱和脂肪酸)，并且更具体地HUFA选自花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)以及二十二碳五烯酸(DPA)，以及更具体地ω－3HUFAs，以及更具体地DHA，以达到：补偿患者中降低的脂肪酸结合蛋白或其功能；补偿患者中降低的脑脂质结合蛋白或其功能；改善患者中脂肪酸结合蛋白的活性；增加患者中脑脂质结合蛋白(BLBPs)的表达；改善患者中脑脂质结合蛋白作用机制的至少一个参数；克服中枢神经系统(CNS)结构中的DHA缺乏并且改善其导致的功能；增加功能性DHA以及其他的PUFAs向患者中胶质细胞以及神经细胞磷脂膜中的掺入；增加颤蛋白的水平和/或改善患者中颤蛋白的活性；和/或改善与颤蛋白缺乏或机能不良有关的疾病或病症的至少一种症状。，下面是颤蛋白缺乏或机能不良及其相关的方法专利的具体信息内容。
1.一种治疗颤蛋白缺乏或机能不良的方法，包括向诊断具有或怀疑患 有颤蛋白缺乏或机能不良的患者给药一定量的选自ω-3PUFA以及ω-6 PUFA，或前体或其来源的多不饱和脂肪酸(PUFA)，以补偿患者中颤蛋白缺 乏或机能不良的作用。
2.权利要求1的方法，其中颤蛋白缺乏或机能不良与患者中脂肪酸结 合蛋白的表达或功能的降低相关。
3.权利要求2的方法，其中所述的脂肪酸结合蛋白为脑脂质结合蛋白 (BLBP)。
4.权利要求1的方法，其中对患者给药PUFA补偿患者中降低的脂肪 酸结合蛋白或其功能。
5.权利要求1的方法，其中对患者给药PUFA补偿患者中降低的脑脂 质结合蛋白或其功能。
6.权利要求1的方法，其中对患者给药PUFA改善患者中脂肪酸结合 蛋白的活性。
7.权利要求1的方法，其中对患者给药PUFA改善患者中脑脂质结合 蛋白作用机制的至少一个参数。
8.权利要求1的方法，其中对患者给药PUFA导致功能性DHA向患 者中胶质细胞和神经细胞的磷脂膜中的掺入的增加。
9.权利要求1的方法，其中对患者给药PUFA增加患者中颤蛋白的水 平或改善颤蛋白的活性。
10.权利要求1的方法，其中所述的患者罹患与颤蛋白缺乏或机能不 良与有关的疾病或病症，并且其中对患者给药PUFA改善所述的疾病或病 症的至少一种症状。
11.权利要求1的方法，其中所述的患者处于发展为与颤蛋白缺乏或 机能不良与有关的疾病或病症的风险中，并且其中对患者给药PUFA预防 或延缓所述的疾病或病症的发作。
12.权利要求1的方法，其中，在给药步骤之前，所述的方法包括测 量源自患者的生物样品中的颤蛋白的含量或生物活性。
13.权利要求12的方法，还包括比较患者样品中颤蛋白的量以及同样 类型的样品中颤蛋白的基线量，其中患者样品中颤蛋白的量与基线量相比 的变化表明所述的患者具有颤蛋白缺乏。
14.权利要求12的方法，其中测量的步骤利用选自下列的方法进行： mRNA转录分析、蛋白质印迹、免疫印迹、酶-联免疫吸附测定(ELISA)、放 射免疫测定(RIA)、免疫沉淀反应、表面等离振子共振、化学发光、荧光偏 振、磷光、免疫组织化学分析、基质-辅助激光解吸/离子时间飞行 (MALDI-TOF)质谱、微细胞术、微阵列、显微镜、荧光激活细胞分选(FACS)、 流式细胞术、以及蛋白质微芯片或微阵列。
15.权利要求12的方法，还包括测定患者中不同的颤蛋白大小形式的 相对的表达或活性以建立患者样品中的颤蛋白大小形式谱，并比较所述的 患者颤蛋白大小形式谱以及同样类型的样品中的颤蛋白大小形式基线谱， 其中与基线谱中大小形式相对表达或活性相比，一或多种颤蛋白大小形式 表达的变化的变化表明所述的患者具有颤蛋白缺乏或机能不良。
16.权利要求15的方法，其中测量的步骤利用选自下列的技术进行： mRNA转录分析、蛋白质印迹、免疫印迹以及毛细管电泳。
17.权利要求12的方法，还包括比较患者样品中颤蛋白的活性以及同 样类型样品中的颤蛋白的基线活性，其中与基线水平相比，患者样品中颤 蛋白活性水平的变化表明所述的患者具有颤蛋白机能不良。
18.权利要求17的方法，其中测量活性的步骤通过选自下列的技术实 现：受体-配体测定和磷酸化测定。
19.权利要求12的方法，还包括测量患者样品中促甲状腺素(TSH)的 水平并且比较患者样品中TSH的量以及同样类型样品中的TSH基线量，其 中与基线量相比，患者样品中TSH的量的变化表明所述的患者具有TSH缺 乏。
20.权利要求19的方法，还包括对患者给药甲状腺药物联合PUFA。
21.权利要求12-20中任一项的方法，其中所述的生物样品选自细胞 样品、组织样品以及体液样品。
22.权利要求21的方法，其中所述的生物样品为血液样品。
23.权利要求1的方法，还包括在给药步骤之后至少一次监测给药 PUFA对患者中颤蛋白水平或生物活性的效果。
24.权利要求1的方法，还包括在给药步骤之后至少一次监测给药 PUFA对患者中颤蛋白一或多种大小形式的表达或生物活性变化的效果。
25.权利要求23或24的方法，还包括基于监测的效果治疗的结果调 整后续治疗中对患者给药PUFA。
26.权利要求1的方法，其中所述的患者具有下述疾病，怀疑具有下 述疾病，或处于发展下述疾病的风险中：神经疾病或神经精神疾病。
27.权利要求1的方法，其中所述的患者罹患癫痫发作。
28.权利要求1的方法，其中所述的患者具有下述疾病，怀疑具有下 述疾病，或处于发展下述疾病的风险中：与神经病机能不良有关的自体免 疫疾病。
29.权利要求1的方法，其中所述的患者具有抗-磷脂疾病。
30.权利要求1的方法，其中所述的患者具有下述疾病，怀疑具有下 述疾病，或处于发展下述疾病的风险中，所述的疾病选自精神分裂症、双 相性精神障碍、诵读困难、运动障碍、注意力不集中的过度反应症(ADHD)、 癫痫、孤独症、帕金森病、老年痴呆、阿耳茨海默(氏)病、过氧化物酶体增 殖子激活疾病(PPAR)、多发性硬化症、糖尿病诱导的神经疾病、黄斑变性、 早产儿视网膜病、亨延顿(氏)舞蹈病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、色素性视网 膜炎、脑性麻痹、肌肉萎缩症、癌症、囊性纤维化病、神经管缺陷、抑郁 症、泽韦格综合征、无脑回、唐氏综合征、肌肉-眼睛-脑疾病、Walker-Warburg 综合征、Charoct-Marie-Tooth疾病、包涵体肌炎(IBM)以及Aniridia。
31.权利要求1的方法，其中所述的患者具有甲状腺疾病。
32.权利要求1的方法，其中PUFA对所述的患者给药的同时联用一 或多种用于治疗与颤蛋白缺乏或机能不良有关的疾病的其他治疗化合物。
33.一种调节组织或流体颤蛋白表达的方法，包括对患者给药一定量 的选自ω-3PUFA以及ω-6PUFA，或前体或其来源的多不饱和脂肪酸 (PUFA)，有效调节患者的组织或流体中的颤蛋白表达。
34.权利要求33的方法，其中PUFA的量足以增加患者组织或流体中 颤蛋白的表达。
35.一种预防、减少或延缓视网膜发育缺陷或病症的发作的方法，包 括对所述的患者给药选自ω-3PUFA以及ω-6PUFA，或前体或其来源的多 不饱和脂肪酸(PUFA)，以有效预防、减少或延缓视网膜发育缺陷或病症的 发作并补偿患者中颤蛋白缺乏或机能不良的作用。
36.一种预防、减少或延缓与颤蛋白缺乏或机能不良有关的发育缺陷 或病症的发作的方法，包括：
a)测量源自患者的生物样品中颤蛋白的表达或生物活性；
b)对所述的患者给药选自ω-3PUFA以及ω-6PUFA，或前体或其来源 的多不饱和脂肪酸(PUFA)，其中PUFA的给药量基于颤蛋白样品中表达或 生物活性进行确定。
37.权利要求36的方法，其中测量颤蛋白表达或活性的步骤还包括测 定样品中单个颤蛋白大小形式的相对表达或活性。
38.权利要求36的方法，其中对所述的患者给药PUFA的量通过下述 步骤确定：比较患者样品中颤蛋白表达或生物活性的水平以及相应于推荐 剂量的PUFA的颤蛋白表达或活性基线水平，并相应地调节针对所述的患 者的PUFA剂量。
39.权利要求38的方法，其中当患者中颤蛋白的表达或生物活性低于 基线水平的时候，对所述的患者给药的PUFA的量相对于推荐剂量的PUFA 增加。
40.权利要求36的方法，其中对所述的患者给药PUFA的量通过下述 步骤确定：比较患者样品中不同的颤蛋白大小形式的表达或活性以及相应 于推荐剂量的PUFA的颤蛋白大小形式的基线谱，并相应地调节针对所述 的患者的PUFA。
41.权利要求40的方法，其中当患者样品中一或多种颤蛋白大小形式 的相对表达或活性不同于基线谱中颤蛋白大小形式的相对表达或活性的时 候，针对所述的患者给药PUFA的量相对于推荐剂量的PUFA增加。
42.权利要求36的方法，其中源自所述的患者的生物样品中的颤蛋白 表达或生物活性的测量步骤在对患者给药PUFA后重复一或多次。
43.权利要求42的方法，其中对所述的患者给药PUFA的量根据患者 中颤蛋白表达或生物活性的重复测量进行调节。
44.权利要求36的方法，其中源自所述的患者的生物样品中颤蛋白表 达或生物活性的测量步骤在患者的生命一部分时间或患者的整个生命过程 中间歇重复，并且其中对所述的患者给药PUFA的量相应于患者中颤蛋白 表达或生物活性的每次新的测量进行调节。
45.权利要求36的方法，其中患者中颤蛋白的表达或生物活性基本正 常，并且其中PUFA以增补剂进行给药以预防或减少颤蛋白缺乏或机能不 良的发展的风险。
46.权利要求36的方法，其中所述的患者为怀孕女性。
47.权利要求36的方法，其中所述的患者为泌乳女性。
48.权利要求36的方法，其中所述的患者为成人。
49.权利要求36的方法，其中所述的患者为儿童或青少年。
50.权利要求36的方法，其中所述的患者为胚胎或胎儿，并且其中通 过将PUFA给药予胚胎或胎儿的母亲对胚胎或胎儿给药PUFA。
51.权利要求36的方法，其中所述的患者具有或处于发展与颤蛋白缺 乏或机能不良或脂肪酸结合蛋白缺乏有关的神经疾病或神经精神疾病的风 险中。
52.权利要求36的方法，其中所述的患者具有或处于发展与颤蛋白缺 乏或机能不良或脂肪酸结合蛋白缺乏有关的自体免疫疾病的风险中。
53.权利要求36的方法，其中所述的患者具有或处于发展与颤蛋白缺 乏或机能不良或脂肪酸结合蛋白缺乏有关的发育缺陷的风险中。
54.一种监测患者脑中DHA水平的方法，包括测量来自所述的患者的 生物样品中的颤蛋白表达或生物活性水平并且基于颤蛋白的测量估计所述 的患者脑中的DHA水平。
55.权利要求54的方法，还包括对所述的患者给药一定量的相应于颤 蛋白表达或生物活性的测量水平的DHA。
56.权利要求55的方法，其中DHA的给药量足以补偿患者中脑脂质 结合蛋白的降低的表达或活性或以改善患者中脑脂质结合蛋白的活性。
57.权利要求54的方法，还包括比较源自所述的患者的生物样品中的 颤蛋白表达或生物活性的水平以及颤蛋白表达或生物活性的基线水平，其 中颤蛋白表达或生物活性的基线水平与研究对象脑中的DHA基线水平相 关，其中基线水平通过选自如下的方法建立：
a)对源自患者的先前样品的颤蛋白表达或活性的在先测量，建立颤蛋白 表达或活性的基线水平，其中先前样品为同样的细胞类型、组织型或体液 型；以及
b)利用源自与患者样品同样的细胞类型、组织型或体液型对照样品， 建立颤蛋白表达或活性的基线水平，对照样品从匹配的单体群获得。
58.权利要求57的方法，其中与DHA的基线水平相比，所述的患者 脑中的估计的低水平的DHA表明所述的患者应该给药一定量的DHA以补 偿患者脑中的DHA水平。
59.一种预测HUFA掺入到患者的磷脂膜中的功效的方法，包括：
a)测量源自患者的生物样品中颤蛋白表达或生物活性；
b)比较所述的生物样品的颤蛋白表达或生物活性以及颤蛋白的基线水 平；并且
c)预测所述的患者的HUFA掺入到磷脂膜中的功效，其中与颤蛋白表 达或生物活性基线水平相比，所述的生物样品中颤蛋白表达或生物活性水 平的差异表明所述的患者有效地掺入HUFA到磷脂膜中的预测能力的修正。
60.权利要求59的方法，还包括对患者开出一定量的HUFA处方，其 中所述的量基于所述的患者的有效地掺入HUFA到磷脂膜中的预测能力确 定。
61.一种诊断患者中DHA缺乏的方法，包括：
a)测量源自患者的生物样品中的颤蛋白表达或生物活性；
b)比较所述的生物样品中颤蛋白表达或生物活性以及颤蛋白的基线水 平；以及
c)对患者进行诊断，其中与颤蛋白表达或生物活性基线水平相比，检测 出所述的生物样品中的颤蛋白表达或生物活性的水平差异，表明患者中 DHA缺乏的阳性诊断。
62.权利要求61的方法，其中与颤蛋白表达或生物活性基线水平相比， 所述的生物样品颤蛋白表达或生物的活性较低水平的检测，表明患者中 DHA缺乏的阳性诊断。
63.权利要求61的方法，其中所述的生物样品选自细胞样品、组织样 品以及体液样品。
64.权利要求63的方法，其中所述的生物样品为血液样品。
65.权利要求61的方法，其中步骤(a)的测量包括测量颤蛋白的mRNA 转录。
66.权利要求65的方法，其中步骤(a)的测量通过选自逆转录酶 -PCR(RT-PCR)、原位杂交、Northern印迹、序列分析、微阵列分析以及报 告基因的检测的方法进行。
67.权利要求61的方法，其中步骤(a)的测量包括测量颤蛋白蛋白质表 达。
68.权利要求67的方法，其中步骤(a)的测量利用选自下述的方法进行： 免疫印迹、酶-联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫沉淀反 应、表面等离振子共振、化学发光、荧光偏振、磷光、免疫组织化学分析、 基质-辅助激光解吸/离子时间飞行(MALDI-TOF)质谱、微细胞术、显微镜、 荧光激活细胞分选、流式细胞术以及蛋白质微芯片或微阵列。
69.权利要求61的方法，其中步骤(a)的测量包括测量颤蛋白的生物活 性。
70.权利要求69的方法，其中步骤(a)的测量利用选自受体-配体测定 以及磷酸化测定的方法进行。
71.权利要求61的方法，其中基线水平利用选自下述的方法建立：
a)建立源自患者的自体同源对照样品中的颤蛋白表达或活性的基线水 平，其中自体同源样品为与步骤(a)样品同样的细胞类型、组织型或体液型；
b)建立颤蛋白表达或活性的基线水平，所述的基线水平为源自患者的 先前样品中的颤蛋白表达或活性至少两次先前测量，其中每次的先前样品 为与步骤(a)样品同样的细胞类型、组织型或体液型，并且其中先前测量得 到阴性的诊断；以及
c)利用源自与步骤(a)样品同样的细胞类型、组织型或体液型的对照样 品建立颤蛋白表达或活性的基线水平，对照样品从匹配的单体群中得到。
72.一种对怀孕以及哺乳期的女性增补PUFAs的方法，包括：
a)测量或源自胎儿或儿童的双亲之一或二者的生物样品中的颤蛋白表 达或生物活性；
b)对胎儿或儿童的母亲给药选自ω-3PUFA以及ω-6PUFA，或前体或 其来源的多不饱和脂肪酸(PUFA)，其中PUFA的给药量基于源自双亲的颤 蛋白样品中的表达或生物活性测量而确定，其中PUFA增补女性以及其胎 儿或儿童中的PUFA。
73.权利要求72的方法，其中PUFA的给药量足以补偿胎儿或儿童中 的降低的脑脂质结合蛋白表达或活性或改善胎儿或儿童中脑脂质结合蛋白 的活性。
74.权利要求72的方法，其中PUFA的给药量足以降低生产患有颤蛋 白缺乏或机能不良婴儿的风险。
75.权利要求72的方法，其中PUFA的给药量足以降低生产患有颤蛋 白缺乏或机能不良男性婴儿的风险。
76.权利要求72的方法，其中PUFA的给药量足以预防、延缓母亲、 儿童或胎儿孤独症的发作或减少症状。
77.权利要求72的方法，其中PUFA的给药量足以预防、延缓母亲、 儿童或胎儿的神经元移行病症的发作或减少症状。
78.权利要求72的方法，其中PUFA的给药量足以预防、延缓母亲、 儿童或胎儿中与颤蛋白缺乏或机能不良有关的症状的发作或减少症状。
79.一种增补怀孕以及哺乳期女性中的PUFAs以降低生产具有或处于 发展为颤蛋白缺乏或机能不良的婴儿的风险的方法，包括：
a)鉴别怀孕女性怀孕的胎儿性别；
b)在怀孕以及哺乳期的整个阶段或者部分阶段给药选自ω-3PUFA以及 ω-6PUFA，或前体或其来源的多不饱和脂肪酸(PUFA)以降低出生时候带有 颤蛋白缺乏或机能不良的胎儿或出生后发展为颤蛋白缺乏或机能不良的婴 儿的风险，其中与女性胎儿为相比，对男性胎儿给药PUFA增加。
80.一种预防、延缓儿童中与颤蛋白缺乏或机能不良有关的症状或疾 病的发作或减少症状的方法，包括：
a)测量源自儿童的生物样品中的颤蛋白的表达或生物活性；以及
b)对儿童给药选自ω-3PUFA以及ω-6PUFA，或前体或其来源多不饱 和脂肪酸(PUFA)，其中PUFA的给药量基于样品中颤蛋白表达或生物活性 的测量进行确定。
81.权利要求80的方法，其中PUFA以婴儿制剂提供，增补包括DHA 和ARA的脂肪酸。
82.权利要求80的方法，其中PUFA的给药量足以补偿儿童中脑脂质 结合蛋白降低的表达或活性或改善儿童中脑脂质结合蛋白的活性。
83.权利要求80的方法，其中给药PUFA足以预防、延缓孤独症的发 作或减少症状。
84.权利要求80的方法，其中给药PUFA足以预防、延缓神经元移行 病症的发作或减少症状。
85.一种预防、延缓与低分子量颤蛋白表型有关的阿耳茨海默(氏)病的 发作或减少症状的方法，包括：
a)鉴别患有颤蛋白缺乏或机能不良的患者，包括带有低分子量颤蛋白表 型的患者；以及
b)对所述的(a)中的患者给药选自ω-3PUFA以及ω-6PUFA，或前体或 其来源的多不饱和脂肪酸(PUFA)，足以补偿患者中颤蛋白缺乏或机能不良 的效果。
86.一种上调患者中脂肪酸结合蛋白的方法，包括对患者给药选自ω-3 PUFA以及ω-6PUFA，或前体或其来源的多不饱和脂肪酸(PUFA)以有效上 调FABP。
87.一种上调患者中颤蛋白表达或活性的方法，包括对所述的患者给 药选自ω-3PUFA以及ω-6PUFA，或前体或其来源的多不饱和脂肪酸(PUFA) 以有效上调颤蛋白表达或活性。
88.一种改善患者中神经元移行的方法，包括对所述的患者给药选自 ω-3PUFA以及ω-6PUFA，或前体或其来源的多不饱和脂肪酸(PUFA)以有 效患者中改善神经元移行。
89.权利要求88的方法，其中神经元移行通过测量患者中颤蛋白表达 或活性的水平进行测量。
90.权利要求88的方法，其中神经功能利用成像技术以及表型评价进 行。
91.一种鉴别神经祖细胞细胞的方法，包括检测细胞群中的颤蛋白表 达或生物活性，其中确定水平的颤蛋白表达或生物活性与神经祖细胞细胞 相关。
92.权利要求91的方法，还包括选择检测了颤蛋白表达或生物活性的 神经祖细胞。
93.一种监测神经发育的方法，包括：
a)提供包括神经祖细胞细胞的细胞群；
b)检测细胞群中的颤蛋白表达或活性；
c)将细胞群暴露在神经祖细胞将发展为分化的神经细胞的条件下；并且
d)监测经过步骤(c)之后的细胞中的颤蛋白的表达或活性，以评价神经 祖细胞向分化的神经细胞的发育。
94.权利要求93的方法，还包括在步骤(b)之前或同时将步骤(a)的细胞 群与推定的发育调节化合物接触，并测定推定的调节化合物是否影响神经 祖细胞向分化的神经细胞的发育，通过检测细胞群中的颤蛋白表达或活性。
95.一种治疗或预防与脂肪酸结合蛋白缺乏或机能不良有关的疾病的 方法，包括：
a)鉴别带有至少一种脂肪酸结合蛋白的表达或活性降低的患者；以及
b)对所述的患者给药多选自ω-3PUFA以及ω-6PUFA，或前体或其来 源的不饱和脂肪酸(PUFA)，给药量足以补偿所述的脂肪酸结合蛋白的降低 表达或活性的效果。
96.权利要求95的方法，其中所述的脂肪酸结合蛋白为脑脂质结合蛋 白(BLBP)。
97.权利要求95的方法，其中所述的脂肪酸结合蛋白为心脏中的脂肪 酸结合蛋白。
98.一种治疗或预防与降低脂肪酸结合蛋白受体的活性或机能不良有 关的疾病的方法，包括：
a)鉴别带有脂肪酸结合蛋白受体降低的活性或机能不良的患者；以及
b)对所述的患者给药选自ω-3PUFA以及ω-6PUFA，或前体或其来源 的多不饱和脂肪酸(PUFA)，给药量足以补偿降低的脂肪酸结合蛋白受体的 活性或机能不良的效果。
99.一种药物组合物，包括一定量的选自ω-3PUFA以及ω-6PUFA， 或前体或其来源的多不饱和脂肪酸(PUFA)，以及至少一种治疗化合物以用 于治疗或预防与颤蛋白缺乏有关的疾病，足以补偿患者中脂肪酸结合蛋白 降低的表达或活性，所述的患者具有或处于发展颤蛋白缺乏的风险中。
100.权利要求99的药物组合物，其中治疗化合物为甲状腺药物。
101.一种诊断患者中DHA缺乏的方法，包括：
a)测量源自患者的生物样品中的颤蛋白表达或生物活性；
b)比较所述的生物样品的颤蛋白表达或生物活性以及颤蛋白的基线水 平；
c)测量源自患者的生物样品中的促甲状腺素(TSH)表达或生物活性；
d)比较所述的生物样品的TSH表达或生物活性以及TSH的基线水平； 以及
e)进行患者的诊断，其中与颤蛋白表达或生物活性基线水平相比，所述 的生物样品中颤蛋白表达或生物活性的水平检测出差异，并且其中与TSH 表达或生物活性基线水平相比，检测出所述的生物样品中TSH表达或生物 活性的水平的差异，表明患者中DHA缺乏的阳性诊断。
102.权利要求102的方法，其中所述的生物样品选自细胞样品、组织 样品以及体液样品。
103.权利要求102的方法，其中所述的患者为怀孕的或怀疑为怀孕的。
104.一种增补怀孕以及哺乳期女性PUFAs的方法，包括：
a)测量源自胎儿或儿童的母亲生物样品中的颤蛋白的表达以及生物活 性；
b)测量所述的生物样品中的促甲状腺素表达或生物活性；
c)对胎儿或儿童的母亲给药选自ω-3PUFA以及ω-6PUFA，或前体或 其来源多不饱和脂肪酸(PUFA)，其中PUFA的给药量基于源自母亲颤蛋白 样品中表达或生物活性的测量，其中PUFA增补女性以及其胎儿或儿童中 的PUFA；以及
d)如果源自母亲样品中的颤蛋白和促甲状腺素的测量低于颤蛋白和 促甲状腺素的基线水平，对胎儿的母亲或儿童给药至少一种甲状腺药物。
105.一种诊断胎儿神经发育疾病的方法，包括：
a)测量源自胎儿的羊膜流体样品中的颤蛋白表达或生物活性；
b)比较样品中的颤蛋白表达或生物活性以及颤蛋白的基线水平；以及
c)进行胎儿的诊断，其中与颤蛋白表达或生物活性基线水平相比，检测 出样品中颤蛋白表达或生物活性的水平的差异，表明胎儿神经发育疾病的 阳性诊断。
106.权利要求105的方法，其中对(c)中的阳性诊断胎儿在子宫内给药 一定量的颤蛋白或颤蛋白基因足以治疗神经发育疾病。
107.权利要求105的方法，其中对(c)中的阳性诊断的胎儿出生后给药 一定量的颤蛋白足以治疗神经发育疾病。
108.权利要求107的方法，其中颤蛋白以婴儿制剂给药。
109.一种营养增补剂或口服药物，包括足以延缓或预防颤蛋白-缺乏 或机能不良或与之相关的疾病或病症的发展量的颤蛋白。
110.权利要求109的营养增补剂或口服药物，其中增补剂以婴儿剂型 的形式提供。
111.权利要求109的营养增补剂或口服药物，其中增补剂通过婴儿的 母亲产生的乳汁对婴儿提供，其中婴儿的母亲在哺乳期之前或期间增补颤 蛋白。
112.权利要求1、33、35、36、60、72、79、80、81、85、86、87、 88、95、98、99，或104，其中PUFA为高度不饱和脂肪酸(HUFA)。
113.权利要求1、33、35、36、60、72、79、80、81、85、86、87、 88、95、98、99，或104，其中PUFA选自花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯 酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)和二十二碳五烯酸(DPA)。
114权利要求1、33、35、36、60、72、79、80、81、85、86、87、 88、95、98、99或者104中任一项的方法，其中PUFA选自ARA、EPA和 DHA。
115权利要求1、33、35、36、60、72、79、80、81、85、86、87、 88、95、98、99，或104中任一项的方法，其中PUFA为DHA。
116权利要求1、33、35、36、60、72、79、80、81、85、86、87、 88、95、98、99，或104中任一项的方法，其中PUFA的来源选自：鱼油、 海藻和植物油。
117权利要求1、33、35、36、60、72、79、80、81、85、86、87、 88、95、98、99，或104中任一项的方法，其中PUFA为DHA并且其中 DHA的前体选自：α-亚麻酸(LNA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸 (DPA)，以及选自LNA、EPA和DPA的前体的混合物。
118.权利要求1、33、35、36、60、72、79、80、81、85、86、87、 88、95、98、99，或104中任一项的方法，其中PUFA以下述形式给药选自： 包括甘油三酯形式PUFA的高度纯净的海藻油、包括PUFA的甘油三酯油、 包括PUFA的磷脂、包括PUFA的蛋白质和磷脂组合、干燥的海洋微藻、包 括PUFA的鞘脂类、酯、游离的脂肪酸、PUFA与其他的生物活性分子偶联 物及其组合。
119.权利要求118的方法，其中所述的生物活性分子选自蛋白质、氨 基酸、药物和糖。
120.权利要求1、33、35、36、60、72、79、80、81、85、86、87、 88、95、98、99，或104中任一项的方法，其中PUFA经口服给药。
121.权利要求1、33、35、36、60、72、79、80、81、85、86、87、 88、95、98、99，或104中任一项的方法，其中PUFA以包括PUFA或前体 或其来源的制剂给药，所述的制剂选自：咀嚼片剂、速溶片剂、泡腾片剂、 可重构粉末、酏剂、液体、溶液、混悬剂、乳剂、片剂、多层片剂，双层片 剂、胶囊、软明胶胶囊、硬明胶胶囊、囊片、锭剂、咀嚼锭剂、小珠、粉 末、颗粒、粒、微粒、可分散颗粒、扁囊剂、灌肠剂、栓剂、乳膏剂、局 用剂型、吸入剂、气雾吸入剂、贴剂、粒吸入剂、植入剂、长效植入剂、 可吸收剂、注射剂、输液剂、health bars、糖膏剂、米粉、米粉敷料、食品、 营养食品、功能性食品及其组合。
122.权利要求121的方法，其中PUFA以选自下述形式的制剂提供： 包括PUFA的高度纯净的海藻油、包括PUFA的甘油三酯油、包括PUFA的 磷脂、蛋白质以及包括PUFA的磷脂的组合物、包括PUFA的干燥的海洋微 藻，包括PUFA的鞘脂类、PUFA的酯、游离脂肪酸、PUFA与另一种生物 活性分子的复合物，及其组合。
123.权利要求1、33、35、36、60、72、79、80、81、85、86、87、 88、95、98、99，或104中任一项的方法，其中PUFA以约0.05mg的PUFA 每公斤患者体重至约200mg的PUFA每公斤患者体重的剂量进行给药。
发明领域
本发明一般性涉及一种治疗颤蛋白(Reelin)缺乏或机能不良以及与其相 关的疾病或病症的方法，通过补充使用与脑脂质结合蛋白(BLBPs)具有高度 亲和力的药物，并且尤其是ω-3和/或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFAs)，如二十 二碳六烯酸(DHA 22：6n-3)。本发明还涉及使用颤蛋白作为脑以及其他组织 中DHA以及其他的PUFA水平的作为生物标志物的用途。
发明背景
神经病或神经精神病病症以及疾病持续面临预测、鉴别以及诊断的挑 战。一些较重要的神经退行性异常(例如，精神分裂症、双相性精神障碍、 诵读困难、运动障碍、注意力不集中的过度反应症(ADHD)、癫痫、孤独症、 帕金森病、老年痴呆、阿耳茨海默(氏)病、过氧化物酶体增殖子激活疾病 (PPAR)、多发性硬化症、糖尿病诱导的神经疾病、黄斑变性、早产儿视网 膜病、亨延顿(氏)舞蹈病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、色素性视网膜炎、脑性 麻痹、肌肉萎缩症、癌症、囊性纤维化病、神经管缺陷、抑郁症、泽韦格 综合征、无脑回、唐氏综合征、肌肉-眼睛-脑疾病、Walker-Warburg综合征、 Charoct-Marie-Tooth疾病、包涵体肌炎(IBM)以及Aniridia)的病因可能部分 脑中的神经元移行(neuronal migration)或神经元定位(neuronal positioning)的 机能不良。
颤蛋白，一种外源性信号传导糖蛋白质，在神经元移行、神经元定位中 发挥重要的作用，并且通过维持中枢以及外周神经系统中的放射神经胶质 系统作为发育调节因子。颤蛋白还参与神经细胞的正确迭片。在发育阶段， 在肝脏、肾脏、脑、脊髓以及视网膜中发现高水平的颤蛋白(D′Arcangelo等， Nature 374：719-723，1995)。但是，与许多其他的发育基因不同的是，颤蛋 白在整个生命过程中表达。
在发育的脑中与颤蛋白的水平有关的是脑脂质结合蛋白(BLBP)的水 平，后者充当脂肪酸结合蛋白(FABP)家族成员。Hartfuss等(Development， 2003；130，4597-4609)证实体外加入颤蛋白增加脑皮层中的BLBP含量。通 常见于发育的中枢以及外周神经系统的胶质细胞中，BLBP(或者脑-FABP) 似乎在一些脂质(例如，ω-3脂肪酸)的转运、沉积或者保护行储藏中发挥作 用以保证脂肪酸对发育的中枢神经系统(CNS)的持续供给(Ganesaratnam K. Balendiran等，2000The Journal of Biological Chemistry，275，No.35， 27045-27054)。
一种所述的基本的ω-3脂肪酸，DHA，(4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸； 22：6n-3)，是脑中最为丰富的n-3多不饱和脂肪酸(Williard等，Journal of Lipid Research，2001，42，1368-1376)。BLBP(脑-FABP)对DHA具有高度的亲 和力以及特异性，并且认为BLBP可以发挥保护DHA免受自由基过氧化的 作用(Ganesaratnam K.Balendiran等，2000)。
在罹患神经病病症的患者中发现了不同水平的颤蛋白。例如，根据 Fatemi等的报道(Neuroreport 2001 Oct 29；12(15)：3209-3215)，在罹患精神 分裂症、双相性精神障碍以及严重抑郁症的患者的脑中发现不同降低的水 平的颤蛋白。此外，Chen等(Nuclei Acids Res.2002 Jul 1：30(13)：2930-2939) 表明罹患精神分裂症或带有精神症状的双相性疾病的患者在脑中具有低于 正常值的颤蛋白水平。Persico等(Mol Psychiatry，2001 Mar；6(2)：150-159) 证实具有长变体颤蛋白基因(＞11GGC重复)的孤独症患者在脑中具有较低的 颤蛋白水平并且为孤独症提供了另外的治疗靶标。
针对预防、减少或治愈神经病或损伤的治疗传统上着眼于药物方法。例 如，持续开发出了减轻症状的神经精神病或神经退行性药物，但是仍然不 能减轻神经病问题的固有的原因。因此，本领域还需要新的治疗策略以用 于治疗神经病病症、疾病或损伤。
发明概述
本发明的一个实施方案涉及一种治疗颤蛋白缺乏或者机能不良的方法。 所述的方法包括对诊断患有或者怀疑具有颤蛋白缺乏或者机能不良的患者 给药一定量的选自ω-3 PUFA以及ω-6 PUFA，或者其前体或者其来源的多 不饱和脂肪酸(PUFA)，以补偿所述的患者中颤蛋白缺乏或者机能不良的作 用。在一个方面，颤蛋白缺乏或者机能不良与患者中的脂肪酸结合蛋白(例 如，脑脂质结合蛋白(BLBP))的表达或者功能的下降有关。
优选地，对患者给药PUFA：补偿所述的患者中降低的脂肪酸结合蛋白 或者其功能，补偿患者中降低的脑脂质结合蛋白或者其功能，改善所述的 患者中脂肪酸结合蛋白的活性，改善所述的患者中脑脂质结合蛋白作用机 制的至少一个参数，导致掺入到所述的患者中神经胶质细胞和神经元的磷 脂膜中的功能性DHA的增加，增加所述的患者中颤蛋白的水平，和/或改善 所述的患者中颤蛋白的活性。
根据本发明的方法治疗的患者包括罹患与颤蛋白缺乏或者机能不良相 关联的疾病或者病症或者处于罹患的风险中的患者，从而对患者给药PUFA 改善所述疾病或者病症的至少一种症状，或者预防或者延迟所述疾病或者 病症的发作。一个方面，所述的患者具有神经疾病或神经精神疾病，怀疑 具有神经疾病或神经精神疾病，或者处于发展的风险中。另一方面，所述 的患者罹患癫痫发作。另一方面，所述的患者具有下述疾病，怀疑具有下 述疾病，或处于发展下述疾病的风险中：与神经病机能不良有关的自体免 疫疾病。在另一方面，所述的患者具有抗-磷脂疾病(anti-phospholipid disorder)。另一方面，所述的患者具有下述疾病，怀疑具有下述疾病，或处 于发展下述疾病的风险中，所述的疾病选自精神分裂症、双相性精神障碍、 诵读困难、运动障碍、注意力不集中的过度反应症(ADHD)、癫痫、孤独症、 帕金森病、老年痴呆、阿耳茨海默(氏)病、过氧化物酶体增殖子激活疾病 (PPAR)、多发性硬化症、糖尿病诱导的神经疾病、黄斑变性、早产儿视网 膜病、亨延顿(氏)舞蹈病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、色素性视网膜炎、脑性 麻痹、肌肉萎缩症、癌症、囊性纤维化病、神经管缺陷、抑郁症、泽韦格 综合征、无脑回、唐氏综合征、肌肉-眼睛-脑疾病、Walker-Warburg综合征、 Charoct-Marie-Tooth疾病、包涵体肌炎(IBM)以及Aniridia。在另一方面，所 述的患者具有甲状腺疾病。
在该实施方案的一个方面，在给药步骤之前，所述的方法包括测量源自 患者的生物样品中的颤蛋白的含量或者生物活性。例如，所述的方法能够 包括比较所述的患者样品中的颤蛋白以及同样类型样品中的颤蛋白的基线 量，其中与基线量相比所述的患者样品中颤蛋白量的变化表明所述的患者 具有颤蛋白缺乏。测量步骤能够利用下述方法进行，所述的方法包括但不 限于：mRNA转录分析、蛋白质印迹、免疫印迹、酶-联免疫吸附测定(ELISA)、 放射免疫测定(RIA)、免疫沉淀反应、表面等离振子共振、化学发光、荧光 偏振、磷光、免疫组织化学分析、基质-辅助激光解吸/离子时间飞行 (MALDI-TOF)质谱、微细胞术、微阵列、显微镜、荧光激活细胞分选(FACS)、 流式细胞术、以及蛋白质微芯片或微阵列。
在一个方面，所述的方法能够包括下述步骤：测定患者中不同的颤蛋白 大小形式的相对的表达或活性以建立患者样品中的颤蛋白大小形式谱，并 比较所述的患者颤蛋白大小形式谱以及同样类型的样品中的颤蛋白大小形 式基线谱，其中与基线谱中大小形式相对表达或活性相比，一或多种颤蛋 白大小形式表达的变化的变化表明所述的患者具有颤蛋白缺乏或机能不 良。测量步骤能够利用但不限于选自下列的技术进行：mRNA转录分析、 蛋白质印迹、免疫印迹以及毛细管电泳。
另一方面，所述的方法能够包括包括比较患者样品中颤蛋白的活性以及 同样类型样品中的颤蛋白的基线活性，其中与基线水平相比，患者样品中 颤蛋白活性水平的变化表明所述的患者具有颤蛋白机能不良。测量活性的 步骤通过选自但不限于下列的技术实现：受体-配体测定和磷酸化测定。
在另一方面，所述的方法能够包括测量患者样品中促甲状腺素(TSH)的 水平并且比较患者样品中TSH的量以及同样类型样品中的TSH基线量，其 中与基线量相比，患者样品中TSH的量的变化表明所述的患者具有TSH缺 乏。在该方面，所述的方法还包括对患者给药甲状腺药物联合PUFA。
在上述方法中，当得到生物样品的时候，所述的样品能够包括但不限于： 细胞样品、组织样品以及体液样品，但是特别优选血液样品。
在该实施方案的一个方面，所述的方法还能够包括在给药步骤之后至少 一次监测给药PUFA对患者中颤蛋白水平或生物活性的效果；或者还包括 在给药步骤之后至少一次监测给药PUFA对患者中颤蛋白一或多种大小形 式的表达或生物活性变化的效果。在这些方面，所述的方法还能够包括基 于监测的效果治疗的结果调整后续治疗中对患者给药PUFA的步骤。
本发明的另一实施方案涉及一种调节组织或流体颤蛋白表达的方法。所 述的方法包括对患者给药一定量的选自ω-3 PUFA以及ω-6 PUFA，或前体 或其来源的多不饱和脂肪酸(PUFA)，有效调节患者的组织或流体中的颤蛋 白表达。一个方面，其中PUFA的量足以增加患者组织或流体中颤蛋白的 表达。
本发明的另一实施方案涉及一种预防、减少或延缓视网膜发育缺陷或病 症的发作的方法。所述的方法包括包括对所述的患者给药选自ω-3 PUFA以 及ω-6 PUFA，或前体或其来源的多不饱和脂肪酸(PUFA)，有效预防、减少 或延缓视网膜发育缺陷或病症的发作并以补偿患者中颤蛋白缺乏或机能不 良的作用。
本发明的另一实施方案一种预防、减少或延缓与颤蛋白缺乏或机能不良 有关的发育缺陷或病症的发作的方法。所述的方法包括：a)测量源自患者的 生物样品中颤蛋白的表达或生物活性；b)对所述的患者给药选自ω-3 PUFA 以及ω-6 PUFA，或前体或其来源的多不饱和脂肪酸(PUFA)，其中PUFA的 给药量基于颤蛋白样品中表达或生物活性进行确定。一个方面，测量颤蛋 白表达或活性的步骤还包括测定样品中单个颤蛋白大小形式的相对表达或 活性。一个方面，其中对所述的患者给药PUFA的量通过下述步骤确定： 比较患者样品中颤蛋白表达或生物活性的水平以及相应于推荐剂量的 PUFA的颤蛋白表达或活性基线水平，并相应地调节针对所述的患者的 PUFA剂量。在该方面，当患者中颤蛋白的表达或生物活性低于基线水平的 时候，对所述的患者给药的PUFA的量相对于推荐剂量的PUFA增加。在另 一方面，其中对所述的患者给药PUFA的量通过下述步骤确定：比较患者 样品中不同的颤蛋白大小形式的表达或活性以及相应于推荐剂量的PUFA 的颤蛋白大小形式的基线谱，并相应地调节针对所述的患者的PUFA。在这 方面，针对所述的患者给药PUFA的量相对于推荐剂量的PUFA增加，当患 者样品中一或多种颤蛋白大小形式的相对表达或活性不同于基线谱中颤蛋 白大小形式的相对表达或活性的时候。源自所述的患者的生物样品中的颤 蛋白表达或生物活性的测量步骤在对患者给药PUFA后重复一或多次。其 中对所述的患者给药PUFA的量根据患者中颤蛋白表达或生物活性的重复 测量进行调节。其中源自所述的患者的生物样品中颤蛋白表达或生物活性 的测量步骤在患者的生命一部分时间或患者的整个生命过程中间歇重复， 并且其中对所述的患者给药PUFA的量相应于患者中颤蛋白表达或生物活 性的每次新的测量进行调节。其中患者中颤蛋白的表达或生物活性基本正 常，并且其中PUFA以增补剂进行给药以预防或减少颤蛋白缺乏或机能不 良的发展的风险。利用该方法治疗的患者包括但不限于：怀孕女性、泌乳 女性、成人、儿童或青少年、胚胎或胎儿，并且其中通过将PUFA给药予 胚胎或胎儿的母亲对胚胎或胎儿给药PUFA。其中所述的患者具有或处于发 展与颤蛋白缺乏或机能不良或脂肪酸结合蛋白缺乏有关的神经疾病或神经 精神疾病的风险中；其中所述的患者具有或处于发展与颤蛋白缺乏或机能 不良或脂肪酸结合蛋白缺乏有关的自体免疫疾病的风险中。其中所述的患 者具有或处于发展与颤蛋白缺乏或机能不良或脂肪酸结合蛋白缺乏有关的 发育缺陷的风险中。
本发明的另一实施方案一种监测患者脑中DHA水平的方法。所述的方 法包括测量来自所述的患者的生物样品中的颤蛋白表达或生物活性水平并 且基于颤蛋白的测量估计所述的患者脑中的DHA水平。一个方面，所述的 方法还包括对所述的患者给药一定量的相应于颤蛋白表达或生物活性的测 量水平的DHA。优选地，其中DHA的给药量足以补偿患者中脑脂质结合 蛋白的降低的表达或活性或以改善患者中脑脂质结合蛋白的活性。所述的 方法还能够包括比较源自所述的患者的生物样品中的颤蛋白表达或生物活 性的水平以及颤蛋白表达或生物活性的基线水平，其中颤蛋白表达或生物 活性的基线水平与研究对象脑中的DHA基线水平相关，其中基线水平通过 选自如下的方法建立：a)对源自患者的先前样品的颤蛋白表达或活性的在先 测量，建立颤蛋白表达或活性的基线水平，其中先前样品为同样的细胞类 型、组织型或体液型；以及b)利用源自与患者样品同样的细胞类型、组织 型或体液型对照样品，建立颤蛋白表达或活性的基线水平，对照样品从匹 配的单体群获得。与DHA的基线水平相比，所述的患者脑中的估计的低水 平的DHA表明所述的患者应该给药一定量的DHA以补偿患者脑中的DHA 水平。
本发明的另一实施方案涉及一种诊断患者中DHA缺乏的方法。所述的 方法包括下述步骤：a)测量源自患者的生物样品中的颤蛋白表达或生物活 性；b)比较所述的生物样品中颤蛋白表达或生物活性以及颤蛋白的基线水 平；以及c)进行患者的诊断，其中与颤蛋白表达或生物活性基线水平相比， 检测出所述的生物样品中的颤蛋白表达或生物活性的水平差异，表明患者 中DHA缺乏的阳性诊断。一个方面，其中与颤蛋白表达或生物活性基线水 平相比，所述的生物样品颤蛋白表达或生物的活性较低水平的检测，表明 患者中DHA缺乏的阳性诊断。所述的生物样品选自细胞样品、组织样品以 及体液样品。并且优选地血液样品。步骤(a)的测量包括测量颤蛋白的mRNA 转录，例如通过通过选自逆转录酶-PCR(RT-PCR)、原位杂交、Northern印 迹、序列分析、微阵列分析以及报告基因的检测的方法进行。步骤(a)的测 量包括测量颤蛋白蛋白表达，例如利用选自下述的方法进行：免疫印迹、 酶-联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫沉淀反应、表面等 离振子共振、化学发光、荧光偏振、磷光、免疫组织化学分析、基质-辅助 激光解吸/离子时间飞行(MALDI-TOF)质谱、微细胞术、显微镜、荧光激活 细胞分选、流式细胞术以及蛋白质微芯片或微阵列。步骤(a)的测量包括测 量颤蛋白的生物活性，利用选自受体-配体测定以及磷酸化测定的方法进行。
在该实施方案的一个方面，基线水平利用选自下述的方法建立：a)建立 源自患者的自体同源对照样品中的颤蛋白表达或活性的基线水平，其中自 体同源样品为与步骤(a)样品同样的细胞类型、组织型或体液型；b)建立颤蛋 白表达或活性的基线水平，所述的基线水平为源自患者的先前样品中的颤 蛋白表达或活性至少两次先前测量，其中每次的先前样品为与步骤(a)样品 同样的细胞类型、组织型或体液型，并且其中先前测量得到阴性的诊断； 以及c)利用源自与步骤(a)样品同样的细胞类型、组织型或体液型的对照样 品建立颤蛋白表达或活性的基线水平，对照样品已经从匹配的单体群中得 到。
本发明的另一实施方案涉及一种预测HUFA掺入到患者的磷脂膜中的 功效的方法。所述的方法包括下述步骤：a)测量源自患者的生物样品中颤蛋 白表达或生物活性；b)比较所述的生物样品的颤蛋白表达或生物活性以及颤 蛋白的基线水平；并且c)预测所述的患者的HUFA掺入到磷脂膜中的功效， 其中与颤蛋白表达或生物活性基线水平相比，所述的生物样品中颤蛋白表 达或生物活性水平的差异表明所述的患者有效地掺入HUFA到磷脂膜中的 预测能力的修正。一个方面，所述的方法还包括对患者开出一定量的HUFA 处方，其中所述的量基于所述的患者的有效地掺入HUFA到磷脂膜中的预 测能力确定。
本发明的另一实施方案涉及一种对怀孕以及哺乳期的女性增补PUFAs 的方法。所述的方法包括下述步骤：a)测量或源自胎儿或儿童的双亲之一或 二者的生物样品中的颤蛋白表达或生物活性；b)对胎儿或儿童的母亲给药选 自ω-3 PUFA以及ω-6 PUFA，或前体或其来源的多不饱和脂肪酸(PUFA)， 其中PUFA的给药量基于源自双亲的颤蛋白样品中的表达或生物活性测量 而确定，其中PUFA增补女性以及其胎儿或儿童中的PUFA。优选地，其中 PUFA的给药量足以补偿胎儿或儿童中的降低的脑脂质结合蛋白表达或活 性或改善胎儿或儿童中脑脂质结合蛋白的活性。
一个方面，其中PUFA的给药量足以降低生产患有颤蛋白缺乏或机能不 良婴儿尤其是男性婴儿的风险。另一方面，PUFA的给药量足以预防、延缓 母亲、儿童或胎儿孤独症的发作或减少症状；或者PUFA的给药量足以预 防、延缓母亲、儿童或胎儿的神经元移行病症的发作或减少症状；或者PUFA 的给药量足以预防、延缓母亲、儿童或胎儿中与颤蛋白缺乏或机能不良有 关的症状的发作或减少症状。
本发明的另一实施方案涉及一种增补怀孕以及哺乳期女性中的PUFAs 以降低生产具有或处于发展为颤蛋白缺乏或机能不良的婴儿的风险的方 法。所述的方法包括下述步骤：a)鉴别怀孕女性怀孕的胎儿性别；b)在怀孕 以及哺乳期的整个阶段或者部分阶段给药选自ω-3 PUFA以及ω-6 PUFA， 或前体或其来源的多不饱和脂肪酸(PUFA)以降低出生时候带有颤蛋白缺乏 或机能不良的胎儿或出生后发展为颤蛋白缺乏或机能不良的婴儿的风险， 其中与女性胎儿为相比，对男性胎儿给药PUFA增加。
本发明的另一实施方案涉及一种预防、延缓儿童中与颤蛋白缺乏或机能 不良有关的症状或疾病的发作或减少症状的方法。所述的方法包括下述步 骤：a)测量源自儿童的生物样品中的颤蛋白的表达或生物活性；以及b)对儿 童给药选自ω-3 PUFA以及ω-6 PUFA，或前体或其来源多不饱和脂肪酸 (PUFA)，其中PUFA的给药量基于样品中颤蛋白表达或生物活性的测量进 行确定。一个方面，PUFA以婴儿制剂提供，增补包括DHA和ARA的脂肪 酸。一个方面，PUFA的给药量足以补偿儿童中脑脂质结合蛋白降低的表达 或活性或改善儿童中脑脂质结合蛋白的活性；足以预防、延缓孤独症的发 作或减少症状；或者足以预防、延缓神经元移行病症的发作或减少症状。
本发明的另一实施方案涉及一种预防、延缓与低分子量颤蛋白表型有关 的阿耳茨海默(氏)病的发作或减少症状的方法。所述的方法包括下述步骤： a)鉴别患有颤蛋白缺乏或机能不良的患者，包括带有低分子量颤蛋白表型的 患者；以及b)对所述的(a)中的患者给药选自ω-3 PUFA以及ω-6 PUFA，或 前体或其来源的多不饱和脂肪酸(PUFA)以足以补偿患者中颤蛋白缺乏或机 能不良的效果。
本发明的另一实施方案涉及一种上调患者中脂肪酸结合蛋白的方法。所 述的方法包括包括对患者给药选自ω-3 PUFA以及ω-6 PUFA，或前体或其 来源的多不饱和脂肪酸(PUFA)以有效上调FABP。
本发明的另一实施方案涉及一种上调患者中脂肪酸结合蛋白的方法，包 括对所述的患者给药选自ω-3 PUFA以及ω-6 PUFA，或前体或其来源的多 不饱和脂肪酸(PUFA)以有效上调颤蛋白表达或活性。
本发明的另一实施方案涉及一种改善患者中神经元移行的方法，包括对 所述的患者给药选自ω-3 PUFA以及ω-6 PUFA，或前体或其来源的多不饱 和脂肪酸(PUFA)以有效患者中改善神经元移行。在该方面，神经元移行通 过测量患者中颤蛋白表达或活性的水平进行测量。神经功能利用例如成像 技术以及表型评价进行。
本发明的另一实施方案涉及一种鉴别神经祖细胞细胞的方法，包括检测 细胞群中的颤蛋白表达或生物活性，其中确定水平的颤蛋白表达或生物活 性与神经祖细胞细胞相关。所述的方法还能够包括选择检测了颤蛋白表达 或生物活性的神经祖细胞。
本发明的另一实施方案涉及一种监测神经发育的方法。所述的方法包括 下述步骤：a)提供包括神经祖细胞细胞的细胞群；b)检测细胞群中的颤蛋白 表达或活性；c)将细胞群暴露在神经祖细胞将发展为分化的神经细胞的条件 下；并且d)监测经过步骤(c)之后的细胞中的颤蛋白的表达或活性，以评价 神经祖细胞向分化的神经细胞的发育。所述的方法还能够包括还包括在步 骤(b)之前或同时将步骤(a)的细胞群与推定的发育调节化合物接触，并测定 推定的调节化合物是否影响神经祖细胞向分化的神经细胞的发育，通过检 测细胞群中的颤蛋白表达或活性。
本发明的另一实施方案涉及一种治疗或预防与脂肪酸结合蛋白缺乏或 机能不良有关的疾病的方法。所述的方法包括下述步骤：a)鉴别带有至少一 种脂肪酸结合蛋白的表达或活性降低的患者；以及b)对所述的患者给药多 选自ω-3 PUFA以及ω-6 PUFA，或前体或其来源的不饱和脂肪酸(PUFA)， 给药量足以补偿所述的脂肪酸结合蛋白的降低表达或活性的效果。一个方 面，其中所述的脂肪酸结合蛋白为脑脂质结合蛋白(BLBP)。一个方面，所 述的脂肪酸结合蛋白为心脏中的脂肪酸结合蛋白。
本发明的另一实施方案为一种治疗或预防与降低脂肪酸结合蛋白受体 的活性或机能不良有关的疾病的方法。所述的方法包括下述步骤：a)鉴别带 有脂肪酸结合蛋白受体降低的活性或机能不良的患者；以及b)对所述的患 者给药选自ω-3 PUFA以及ω-6 PUFA，或前体或其来源的多不饱和脂肪酸 (PUFA)，给药量足以补偿降低的脂肪酸结合蛋白受体的活性或机能不良的 效果。
本发明的另一实施方案涉及一种药物组合物，包括一定量的选自ω-3 PUFA以及ω-6 PUFA，或前体或其来源的多不饱和脂肪酸(PUFA)，以及至 少一种治疗化合物以用于治疗或预防与颤蛋白缺乏有关的疾病，足以补偿 患者中脂肪酸结合蛋白降低的表达或活性，所述的患者具有或处于发展颤 蛋白缺乏的风险中。一个方面，治疗化合物为甲状腺药物。
本发明的另一实施方案涉及一种诊断患者中DHA缺乏的方法。所述的 方法包括下述步骤：a)测量源自患者的生物样品中的颤蛋白表达或生物活 性；b)比较所述的生物样品的颤蛋白表达或生物活性以及颤蛋白的基线水 平；c)测量源自患者的生物样品中的促甲状腺素(TSH)表达或生物活性；d) 比较所述的生物样品的TSH表达或生物活性以及TSH的基线水平；以及e) 进行患者的诊断，其中与颤蛋白表达或生物活性基线水平相比，所述的生 物样品中颤蛋白表达或生物活性的水平检测出差异，并且其中与TSH表达 或生物活性基线水平相比，检测出所述的生物样品中TSH表达或生物活性 的水平的差异，表明患者中DHA缺乏的阳性诊断。生物样品所述的生物样 品选自细胞样品、组织样品以及体液样品。一个方面，所述的患者为怀孕 的或怀疑为怀孕的。
本发明的另一实施方案涉及一种增补怀孕以及哺乳期女性PUFAs的方 法。所述的方法包括下述步骤：a)测量源自胎儿或儿童的母亲生物样品中的 颤蛋白的表达以及生物活性；b)测量所述的生物样品中的促甲状腺素表达或 生物活性；c)对胎儿或儿童的母亲给药选自ω-3 PUFA以及ω-6 PUFA，或前 体或其来源多不饱和脂肪酸(PUFA)，其中PUFA的给药量基于源自母亲颤 蛋白样品中表达或生物活性的测量，其中PUFA增补女性以及其胎儿或儿 童中的PUFA；以及d)对胎儿的母亲或儿童给药至少一种甲状腺药物，如果 源自母亲样品中的颤蛋白和促甲状腺素的测量低于颤蛋白和促甲状腺素的 基线水平。
本发明的另一实施方案涉及一种诊断胎儿神经发育疾病的方法。所述的 方法包括下述步骤：a)测量源自胎儿的羊膜流体样品中的颤蛋白表达或生物 活性；b)比较样品中的颤蛋白表达或生物活性以及颤蛋白的基线水平；以及 c)进行胎儿的诊断，其中与颤蛋白表达或生物活性基线水平相比，检测出样 品中颤蛋白表达或生物活性的水平的差异，表明胎儿神经发育疾病的阳性 诊断。一个方面，对(c)中的阳性诊断胎儿在子宫内给药一定量的颤蛋白或 颤蛋白基因足以治疗神经发育疾病。另一方面，其中对(c)中的阳性诊断的 胎儿出生后给药一定量的颤蛋白足以治疗神经发育疾病，例如以婴儿制剂 给药。
本发明的另一实施方案涉及一种营养增补剂或口服药物，包括一定量的 颤蛋白足以延缓或预防颤蛋白-缺乏或机能不良或与之相关的疾病或病症的 发展。一个方面，增补剂或者药物以婴儿剂型的形式提供。另一方面，其 中增补剂或者药物通过婴儿的母亲产生的乳汁对婴儿提供，其中婴儿的母 亲在哺乳期之前或期间增补颤蛋白。
在上述的各方法中，当给药PUFA的时候，一个方面，其中PUFA为高 度不饱和脂肪酸(HUFA)。另一方面，其中PUFA选自花生四烯酸(ARA)、 二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)和二十二碳五烯酸(DPA)。另一 方面，PUFA选自ARA、EPA和DHA。在另一方面，PUFA为DHA。另一 方面，PUFA的来源选自：鱼油、海藻和植物油。在另一方面，当其中PUFA 为DHA的时候，其中DHA的前体选自：α-亚麻酸(LNA)、二十碳五烯酸 (EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)，以及选自LNA、EPA和DPA的前体的混合 物。另一方面，其中PUFA以下述形式给药选自：包括甘油三酯形式PUFA 的高度纯净的海藻油、包括PUFA的甘油三酯油、包括PUFA的磷脂、包括 PUFA的蛋白质和磷脂组合、干燥的海洋微藻、包括PUFA的鞘脂类、酯、 游离的脂肪酸、PUFA与其他的生物活性分子偶联物及其组合。所述的生物 活性分子选自蛋白质、氨基酸、药物和糖。一个方面，其中PUFA经口服 给药。另一方面，其中PUFA以包括PUFA或前体或其来源的制剂给药，所 述的制剂选自：咀嚼片剂、速溶片剂、泡腾片剂、可重构粉末、酏剂、液 体、溶液、混悬剂、乳剂、片剂、多层片剂、双层片剂、胶囊、软明胶胶 囊、硬明胶胶囊、囊片(caplet)、锭剂、咀嚼锭剂、小珠(bead)、粉末、颗粒 (granule)、粒(particle)、微粒(micro-particle)、可分散颗粒、扁囊剂、灌肠剂、 栓剂、乳膏剂、局用剂型、吸入剂、气雾吸入剂、贴剂、粒吸入剂、植入 剂、长效植入剂、可吸收剂、注射剂、输液剂、health bars、糖膏剂、米粉、 米粉敷料、食品、营养食品、功能性食品及其组合。在该方面，PUFA以选 自下述形式的制剂提供：包括PUFA的高度纯净的海藻油、包括PUFA的甘 油三酯油、包括PUFA的磷脂、蛋白质以及包括PUFA的磷脂的组合物、包 括PUFA的干燥的海洋微藻，包括PUFA的鞘脂类、PUFA的酯、游离脂肪 酸、PUFA与另一种生物活性分子的复合物，及其组合。其中PUFA以约 0.05mg的PUFA每公斤患者体重至约200mg的PUFA每公斤患者体重的剂 量进行给药。另一方面，PUFA能够组合一种或者多种其他的治疗化合物对 患者或者对象给药用于治疗与颤蛋白缺乏或者机能不良有关的病症。
发明详述
本发明一般性地涉及一种利用脂肪酸补充的方法，并且具体地，ω-3和 /或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA)补充(例如，DHA)以减轻或者补偿颤蛋白缺 乏或者机能不良的作用以及体内脂肪酸结合蛋白降低的水平，并且在一个 实施方案中，为脑中。本发明的方法优选地以预防与颤蛋白缺乏或者机能 不良和/或降低的脂肪酸结合蛋白有关的各种疾病和病症、延迟发作，或者 治疗，为患者提供益处。更具体地，本发明涉及用PUFAs例如DHA补充 患者以减轻或者补偿降低的脑脂质结合蛋白并且补偿脑中由低水平引起的 或者与低水平相关中不适当的神经移行，糖蛋白颤蛋白不适当的表达或者 失调。不适当的神经元移行与多种神经病症相关包括诵读困难、运动障碍、 癫痫发作、癫痫以及注意力不集中的过度反应症(ADHD)以及精神病症如精 神分裂症、双相性精神障碍、抑郁症、Zellweger综合征、无脑回病、唐氏 综合征、肌肉-眼睛-脑疾病、Walker-Warburg综合征、Charoct-Marie-Tooth 疾病，包涵体肌炎(IBM)以及Aniridia。
正确的功能性颤蛋白信号通路对发育的脑的脑皮质中的正确的神经元 移行非常重要。该通路中的偏离能够引起放射神经胶质细胞和星形胶质细 胞中的多不饱和的脂肪酸-特异结合蛋白或者脑脂质结合蛋白(BLBP)的低 表达，导致缩短的放射神经胶质作用延伸以及由此导致的不适当的神经移 行。不受理论束缚，本发明者认为表达BLBP以储存并保护发育的脑中的 多不饱和的脂肪酸，并且具体地DHA，免受氧化以及磷脂酶活性。在本发 明中，ω-3脂肪酸补充剂对患有颤蛋白缺乏和/或失调患者提供以弥补低 BLBP表达的作用，通过对脑提供正确的量的功能性DHA，后者能够掺入 到发育的神经胶质细胞和神经元的磷脂膜中。
因此，在一个实施方案中，本发明一般性地涉及一种测量作为生物标志 物的颤蛋白的方法，以非破坏性地评估或预测在目前无法接近或难以接近 的脑中以及其他部位的DHA水平，后者为中枢神经系统(CNS)中的关键成 分。例如，颤蛋白大小形式(颤蛋白成分)，包括颤蛋白表达和/或生物活性 水平能够定量测量推断脑中的DHA水平的相对量。这种测量能够用来间接 地跟踪个体整个生命过程中的脑中的DHA水平并用作。在生命周期的一些 点上需要用DHA进行营养干预的指标。在本发明之前，在不潜在地伤害患 者的条件下，难以评估脑中的DHA水平。
本发明还涉及一种预防、延缓颤蛋白缺乏或机能不良和/或与颤蛋白缺 乏或机能不良有关的疾病或病症的发作或进行治疗的方法，包括对诊断具 有或怀疑患有颤蛋白缺乏或机能不良的患者给药一定量的PUFA，并且尤其 是ω-3 PUFA，以及更具体地，二十二碳六烯酸(DHA)或前体或其来源，以 补偿患者中颤蛋白缺乏或机能不良的效果。在本发明之前，尽管已经建议 DHA用于治疗一些神经退行性病症，但是没有认识到存在能够预测给药 DHA或者其他的PUFA特别有效的患有神经退行性病症特定的患者群。本 发明通过测量患者中颤蛋白的水平可以确定这样的患者。
本发明还涉及一种预防或减少与颤蛋白机能不良或缺乏有关的发育缺 陷或病症的方法，通过补充使用多不饱和脂肪酸(PUFAs-具有两个或多个双 键的不饱和脂肪酸)，并且尤其是高度不饱和脂肪酸(HUFAs-具有三个或多 个双键的不饱和脂肪酸)，并且更具体地HUFA选自花生四烯酸(ARA)、二 十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)以及二十二碳五烯酸(DPA)，以及 更具体地ω-3 HUFAs，以及更具体地DHA，以达到：补偿患者中降低的脂 肪酸结合蛋白或其功能；补偿患者中降低的脑脂质结合蛋白或其功能；改 善患者中脂肪酸结合蛋白的活性；增加患者中脑脂质结合蛋白(BLBPs)的表 达；改善患者中脑脂质结合蛋白作用机制的至少一个参数；克服中枢神经 系统(CNS)结构中的DHA缺乏并且改善其导致的功能；增加功能性DHA以 及其他的PUFAs向患者中胶质细胞以及神经细胞磷脂膜中的掺入；增加颤 蛋白的水平和/或改善患者中颤蛋白的活性；和/或改善与颤蛋白缺乏或机能 不良有关的疾病或病症的至少一种症状。
本发明的具体的实施方案包括，但不限于，在怀孕和/或哺乳期补充至 少一种PUFA和/或前体或者其来源以预防与儿童中颤蛋白缺乏或者机能不 良相关的病症(例如，孤独症、神经移行病症)；对带有低分子量颤蛋白表型 的成人补充以预防多种病症和疾病、减少发作，或者治疗，包括但是不限 于：神经病症或者神经精神病症、癫痫发作以及与神经机能不良相关的自 体免疫病症，或者抗-磷脂病症。所述的病症以及疾病更具体地包括，但不 限于：精神分裂症、双相性精神障碍、诵读困难、运动障碍、注意力不集 中的过度反应症(ADHD)、癫痫、孤独症、帕金森病、老年痴呆、阿耳茨海 默(氏)病、过氧化物酶体增殖子激活疾病(PPAR)、多发性硬化症、糖尿病诱 导的神经疾病、黄斑变性、早产儿视网膜病、亨延顿(氏)舞蹈病、肌萎缩侧 索硬化(ALS)、色素性视网膜炎、脑性麻痹、肌肉萎缩症、癌症、囊性纤维 化病、神经管缺陷、抑郁症、泽韦格综合征、无脑回、唐氏综合征、肌肉- 眼晴-脑疾病、Walker-Warburg综合征、Charoct-Marie-Tooth疾病、包涵体肌 炎(IBM)以及Aniridia。
在一个本发明的实施方案中，增补怀孕以及哺乳期女性中的PUFAs以 降低生产具有或处于发展为颤蛋白缺乏或机能不良的婴儿的风险。一个方 面，PUFA补充特别可以用于降低生产具有或处于发展为颤蛋白缺乏或机能 不良的男性婴儿的风险。在一个本发明的实施方案中，在对怀孕雌性补充 PUFA之前，首先确定胎儿的性别。本发明者已经发现PUFA补充能够减少 出生患有颤蛋白缺乏或者机能不良的婴儿的风险，并在本发明的一个方面， 当胎儿为雄性的时候，这种效果特别有效。在该实施方案中，怀孕雌性在 怀孕以及哺乳期的整个阶段或者部分阶段给药选自ω-3 PUFA以及ω-6 PUFA。与如果怀孕雌性怀有雌性胎儿相比，如果怀孕雌性怀有至少一个雄 性胎儿，则PUFA补充可以增加的。
本发明还涉及一种测量颤蛋白和促甲状腺素(TSH)的方法以非破坏性地 评估或者预测患者中的DHA水平是否应该补充，并且尤其在怀孕期间。甲 状腺是大反馈过程的一部分。脑中的下丘脑释放促甲状腺激素释放激素 (TRH)。TRH的释放“告诉”脑垂体释放促甲状腺素(TSH)。TSH，在血液 中循环，然后引起甲状腺制造甲状腺激素并释放进入血液中。TSH能够增 加颤蛋白的产生。因此，在怀孕期间低于正常TSH水平可与颤蛋白水平不 足相关或者促进颤蛋白水平不足，后者对发育的胎儿具有负面的影响。尽 管存在怀孕期间的妇女使用的TSH的测试(例如，Abbott Laboratories)，但 是在本发明之前，还没有记载针对TSH水平和颤蛋白水平的组合的测试。 由于TSH能够影响数种生物功能，本发明者相信的患者中TSH和颤蛋白水 平的组合测试将针对患者(以及胎儿，如果是怀孕的妇女)处于不适当的神经 发育的风险给出更准确的评估。因此，所述的双重检测可用于评估怀孕妇 女的风险并提供PUFA补充策略，后者可能对胎儿发育具有积极的作用。 颤蛋白水平能够如这里描述的方法测量，并且同时或者之前或者之后测量 促甲状腺素水平。测量患者中TSH水平的方法是本领域中公知的并且目前 已经有多种商业提供的TSH检测试剂盒(例如，Biosafe，Abbott Laboratories)。 如果判断颤蛋白和TSH水平低于基线对照水平，则对患者开出补充DHA 或者其他的PUFA的处方，单用或者联用甲状腺药物。PUFA补充已经在别 处更详细地进行了讨论。建立以及评估颤蛋白基线水平的方法在这里进行 了描述(见下文)并且在本领域中是公知的(例如，参见PCT公开号 WO03/063110)。人的TSH基线水平在本领域中是公知的。例如，TSH水平 在约0.3-0.5以及约5.0-6.0MU升之间，或者从2003开始(由American Association of Clinical Endocrinologists最近修改的)，在约0.3和约3.0MU/ 升之间，被认为个体中TSH的正常(基线)范围。
本发明还涉及一种调节组织中颤蛋白表达的方法以促进干细胞的生长， 通过使用至少一种ω-3和/或ω-6 PUFA和/或前体或者其源。
本发明还涉及一种监测患者脑中的DHA的水平的方法，包括测量源自 患者的生物样品中的颤蛋白表达和/或生物活性的水平，并基于颤蛋白的测 量估计患者脑中的DHA水平。
本发明者还已经证实(参见实施例部分)可以利用源自患者的生物样品 中的颤蛋白浓度的检测来预测，其他的组织包括CNS以及生殖组织中的 DHA含量。例如，可以按照本文别处的描述测量、得到或者确定患者样品 中颤蛋白表达和/或生物活性。颤蛋白水平能够与基线对照进行比较，还按 照本文别处的描述。由于本发明者已经证明颤蛋白缺乏或者机能不良预示 有效掺入功能性HUFA到体内的能力降低。就能够开出一定的量补充性 HUFA(例如，作为营养性或者治疗性组合物给药)，可以解决患者掺入功能 性HUFA到身体组织以及细胞中的预测能力。例如，与不具有颤蛋白缺乏 或者机能不良的患者相比，显示颤蛋白缺乏或者机能不良的患者可以开出 更高剂量的HUFA，并且类似地，患者需要服用的HUFA量能够随时间进 行调节或者修正，根据患者中颤蛋白表达和/或生物活性新的评估。因此， 本发明的另一实施方案涉及一种预测HUFA掺入到患者的磷脂膜中的功效 的方法，包括：a)测量源自患者的生物样品中颤蛋白表达或生物活性；b) 比较所述的生物样品的颤蛋白表达或生物活性以及颤蛋白的基线水平；并 且c)预测所述的患者的HUFA掺入到磷脂膜中的功效，其中与颤蛋白表达 或生物活性基线水平相比，所述的生物样品中颤蛋白表达或生物活性水平 的差异表明所述的患者有效地掺入HUFA到磷脂膜中的预测能力的修正。 一个方面，所述的方法还包括对患者开出一定量的HUFA处方的步骤，其 中所述的量基于所述的患者的有效地掺入HUFA到磷脂膜中的预测能力确 定。
本发明还涉及一种改善患者的神经移行和/或神经功能方法，包括对患 者给药一定量的至少一种ω-3和/或ω-6 PUFA和/或前体或者其来源以改善 所述的患者中神经移行和/或神经功能的至少一个参数。
本发明还涉及一种鉴别神经祖细胞细胞的方法，包括检测细胞群中的颤 蛋白表达或生物活性，其中确定水平的颤蛋白表达或生物活性与神经祖细 胞细胞相关。
本发明还涉及一种监测神经发育的方法，a)提供包括神经祖细胞细胞的 细胞群；b)检测细胞群中的颤蛋白表达或活性；c)将细胞群暴露在神经祖细 胞将发展为分化的神经细胞的条件下；并且d)监测经过步骤(c)之后的细胞 中的颤蛋白的表达或活性，以评价神经祖细胞向分化的神经细胞的发育。
本发明还涉及在上述任一方法中利用DHA联用其他的多不饱和脂肪酸 (PUFAs)(例如，EPA、ARA、DPA)。
本发明还涉及治疗性组合物，包括一定量的至少一种ω-3和/或ω-6 PUFA和/或前体或者其源，足以补偿具有颤蛋白缺乏或者处于发展为颤蛋 白缺乏的风险中的患者中的降低的脂肪酸结合蛋白表达和/或活性。
本发明还涉及治疗性组合物，包括一定量的至少一种ω-3和/或ω-6 PUFA和/或前体或者其源，足以补偿具有颤蛋白缺乏或者处于发展为颤蛋 白缺乏的风险中的患者中的降低的脂肪酸结合蛋白表达和/或活性，以及至 少一种用于治疗或者预防与颤蛋白缺乏相关的病症的治疗化合物。
本发明还涉及利用PUFA补充，包括DHA，位于除CNS以外的部位(例 如，与相关心脏和/或免疫/淋巴系统)以预防这些部位中的脂肪酸脂质结合蛋 白的缺乏、延迟发作，或者治疗。
本发明的另一实施方案涉及一种诊断胎儿神经发育疾病的方法，包括： a)测量源自胎儿的羊膜流体样品中的颤蛋白表达或生物活性；b)比较样品中 的颤蛋白表达或生物活性以及颤蛋白的基线水平；以及c)进行胎儿的诊断， 其中与颤蛋白表达或生物活性基线水平相比，检测出样品中颤蛋白表达或 生物活性的水平的差异，表明胎儿神经发育疾病的阳性诊断。测量颤蛋白 表达和活性的方法在本文中的别处讨论。一个方面，对(c)中的阳性诊断胎 儿在子宫内给药一定量的颤蛋白或颤蛋白基因足以治疗神经发育疾病。另 一实施方案，对(c)中的阳性诊断的胎儿出生后给药一定量的颤蛋白足以治 疗神经发育疾病。例如，颤蛋白以婴儿制剂给药。对患者给药颤蛋白的量， 包括从约1μg每天至约10,000μg每天或者更多，包括在0.1μg每天增量 之间的任何增量(例如，1μg每天，1.1μg每天，1.2μg每天，等)。
本发明的另一实施方案涉及一种营养增补剂或口服药物，包括一定量的 颤蛋白，足以延缓或预防颤蛋白-缺乏或机能不良或与之相关的疾病或病症 的发展。所述的补充能够以婴儿制剂或者其他的食品产品的形式提供。并 在一个方面，通过婴儿的母亲产生的乳汁对婴儿提供，其中婴儿的母亲在 哺乳期之前或期间增补颤蛋白。
本发明的各方面在下面将进行更详细的说明。
颤蛋白为细胞外信号糖蛋白(＞400kDa)，由Cajal-Retzius细胞分泌到脑 的新皮质的边缘区，尽管有证据表明颤蛋白结合钙粘蛋白-相关的神经受体 以及B1-类整联蛋白，颤蛋白主要结合低密度脂蛋白受体家族的两个成员， VLDLR和ApoER2，具有对受体ApoER2具有更高的亲和力。颤蛋白对 VLDLR或者ApoER2的细胞外的结构域的结合引起或者诱导例如Dab1的酪 氨酸的磷酸化，信号通路cdk5/p35中的一种细胞质衔接子蛋白，丝氨酸/苏 氨酸激酶。
颤蛋白分子还聚集形成大的蛋白复合物，但是还具有自催化性质，裂解 颤蛋白复合物成小的实体。在哺乳动物中枢神经系统(CNS)中，颤蛋白以及， 更具体地，一些其特定大小变体特异(这里还称为颤蛋白大小形式或者颤蛋 白成分)，已经发现控制正确的神经移行以及定位，通过诱导对VLDLR和 ApoER2的Dab1的磷酸化。这种神经移行对脑中的正常皮质的发育是必须 的。
颤蛋白信号中的Dab1酪氨酸磷酸化的重要性是意义深远的。它可能， 激活，例如，磷酸肌醇-3-激酶(PI3K，Akt和Src家族激酶(SFKs)(Ballif等， Molecular Brain Research，2003，117，pp 152-159)。由于这些激酶的激活或者 信号级联中下游其他的蛋白上调(Notch、NckB、erbB2、erbB4、神经调节 蛋白，包括可溶的神经调节蛋白，GGF等)，星形胶质细胞将在形态上延伸 转化为放射神经胶质细胞并上调其他的神经受体以及脑脂质结合蛋白 (BLBPs)的表达(Brody，T.，The Interactive Fly：Gene networks，development， 1996)。
编码颤蛋白的核苷酸序列已经在人以及小鼠中克隆，并且颤蛋白的 cDNA以及编码的氨基酸序列，能够在公开的数据库中找到，如National Center for Biotechnology Information(NCBI)数据库。例如，人或者小鼠颤蛋 白的核苷酸以及氨基酸序列能够在NCBI数据库中分别以主索取号U24703 和U79716找到(这些数据库中的索取号这里以其整体引入作为参考)。小鼠 和人的氨基酸序列具有94％的一致性，暗示小鼠和人颤蛋白多肽在结构上 以及功能上具有高度类似性。正如PCT公开号WO03/063110中所讨论的， 该公开这里以其整体引入作为参考，在其N-端，颤蛋白具有可以裂解的信 号肽，接着为类似于F-spondin的片段。颤蛋白还具有350-390氨基酸的8 个中间重复，各自包含上皮生长因子-样基序，侧面为两个相关的片段。中 间重复系列前面为链结构域，并且接着为高度碱性的33氨基酸C-端结构域。
发现颤蛋白天然存在一或者多个不同的″大小形式″(颤蛋白蛋白具有不 同的分子量)，这里还称为颤蛋白成分″。全长的颤蛋白分子量为约410kD， 并且天然的蛋白水解的产物存在，例如，约330kD和180kD的分子量。在 个体中能够检测到的任何其他的颤蛋白大小形式也包括在本发明中。这些 大小形式能够利用本领域的方法轻易地检测，包括，但是不限于，免疫印 迹技术。
本发明的一些实施方案包括对患者给药一定量的一种或者多种多不饱 和脂肪酸(PUFAs)的步骤，并且更优选地，高度不饱和的脂肪酸(HUFAs)， 并且更优选地，DHA，或者前体或者其他的其源。多不饱和脂肪酸(PUFAs) 为多数真核细胞地膜脂质中的关键成分(Lauritzen等，Prog.Lipid Res.40 1(2001)；McConn等，Plant J.15，521(1998))，以及一些激素以及信号分子的 前体(Heller等，Drugs 55，487(1998)；Creelman等，Annu.Rev.PlantPhysiol. Plant Mol.Biol.48，355(1997))。根据本发明，优选的PUFA为长链的PUFA， 为具有18个碳原子或者更长的PUFA。
任何PUFA来源能够用于本发明的组合物和方法中，包括，例如，动物、 植物以及微生物源。优选的多不饱和脂肪酸(PUFA)源能够为适合用于本发 明的任何PUFAs来源。优选的多不饱和脂肪酸源包括生物来源，如动物、 植物和/或微生物源。这里使用的术语″脂质″包括磷脂；游离的脂肪酸；脂 肪酸酯；三酰基甘油；二酰基甘油酯；单酰基甘油酯；溶血脂质；皂类； 磷脂；甾醇以及甾醇酯；类胡罗卜素；叶黄素(例如，氧合类胡萝卜素)；烃； 以及本领域的普通技术人员公知的其他的脂质。动物源的实例包括水生动 物(例如，鱼、海洋哺乳动物、甲壳类、轮虫等)以及提取自动物组织(例如， 脑、肝脏、眼睛等)的脂质。植物源的实例包括巨藻类、亚麻籽、油菜籽、 玉米、夜来香、大豆以及琉璃苣。微生物的实例包括海藻、原生生物、细 菌以及真菌(包括酵母)。利用微生物源，如海藻能够提供影响器官优势，即， 源自微生物源的脂肪酸可能不具有鱼腥味道并且闻到鱼源的脂肪酸。更优 选地，长链脂肪酸源包括海藻。
优选地，当微生物为长链脂肪酸源的时候，微生物在发酵罐中在发酵培 养基中培养。或者，微生物能够在光生物反应器或者池中进行光合成培养。 优选地，微生物为富含脂质的微生物，更优选地，微生物选自海藻、细菌、 真菌以及原生生物。更优选地，微生物选自：金藻、绿藻、甲藻、酵母、 被孢霉属和Stramenopiles属的真菌。优选地，微生物包括属Crypthecodinium 以及破囊壶菌目以及被孢霉属丝状(真)菌的微生物，并且更优选地，微生物 选自破囊壶菌属、Schizochytrium或者其混合物，并且更优选地，微生物选 自下述微生物，具有ATCC号20888、ATCC号20889、ATCC号20890、ATCC 号20891以及ATCC号20892的识别特性、被孢霉属schmuckeri株以及被 孢霉属alpina、Crypthecodinium cohnii株衍生自前述的突变株及其混合物。
根据本发明，术语″Thraustochytrid″、″破囊壶菌属微生物″以及″破囊壶 菌目微生物″能够互换使用并且指破囊壶菌目的任何成员，其包括破囊壶菌 科以及科网粘菌科。术语″Labyrinthulid″和″网粘菌科″这里用来具体地指科 网粘菌科的成员。为了具体地指Thraustochytrids为破囊壶菌科的成员，这 里使用术语″破囊壶菌科″。因此，对于本发明，Labyrinthulids的成员被认为 包括在Thraustochytrids中。
发展导致Thraustochytrids的分类法经常改变。分类法理论家一般性地 将Thraustochytrids与藻类或者类藻类原生生物放在一起。但是，由于分 类不明确，最好的方法是对于本发明认为本发明中描述为Thraustochytrids 株包括下述生物体：目：破囊壶菌属；科：破囊壶菌科(属：破囊壶菌属， Schizochytrium″Japonochytrium，Aplanochytrium，或者Elina)或者网粘菌科 (网粘菌属，Labyrinthuloides，或者Labyrinthomyxa)。此外，下述属有时候 包括在破囊壶菌科或者网粘菌科中：Althornia，Corallochytrium，Diplophyrys 以及Pyrrhosorus)，并且对于本发明包括在Thraustochytrid或者破囊壶菌目 的成员中。公认的是在本发明有时候，Thraustochytrids分类的修改属 Labyrinthuloides放在科网粘菌科中并证实了将破囊壶菌科和网粘菌科放在 Stramenopile世系的范围之内。应该注意的是网粘菌科有时候称为 labyrinthulids或者网粘菌属，或者labyrinthuloides并且破囊壶菌科一般称为 thraustochytrids，尽管，如上讨论，为了清楚本发明的目的，Thraustochytrids 包括破囊壶菌目的任何成员和/或包括破囊壶菌科以及网粘菌科的任何成 员。最近的分类变化总结在下面。
这里公开的一些单细胞微生物株为破囊壶菌目的成员。Thraustochytrids 为海洋真核细胞，具有进化的分类学历史。有关Thraustochytrids的分类学 位置的问题已经由Moss(in″The Biology of Marine Fungi″，Cambridge University Press p.105(1986))，Bahnweb以及Jackle(ibid.p.131)以及 Chamberlain和Moss(BioSystems 21：341(1988))评述。
为了方便的目的，Thraustochytrids首先由分类学家与其他的无色的动孢 子真核细胞放在藻菌(类藻类真菌)下。名称藻菌，但是，最终从分类学中剔 除，并且Thraustochytrids保留在卵菌(双鞭毛动孢子真菌)中。最初认为卵菌 与异鞭毛藻类相关的，以及最终地广泛的超结构以及生物化学研究，由Barr 总结(Barr.Biosystems 14：359(1981))，支持了该假定。卵菌实际上被 Leedale(Leedale.Taxon 23：261(1974))以及其他的藻类学专家作为异鞭毛藻 类部分。但是，由于源自异养的特性的便利，卵菌以及Thraustochytrids主 要由真菌学者(研究真菌的科学家)研究，而不是由藻类学专家(研究藻类的 科学家)研究。
从另一种分类学来看，进化生物学者发展了两派关于真核细胞进化的思 想。一种理论认为膜-结合的细胞器通过一系列的内共生的外生起源 (Margulis，1970，Origin of Eukaryotic Cell.Yale University Press，New Haven)； 例如，线粒体源自细菌的endosymbionts，叶绿体源自蓝藻类，并且鞭毛源 自螺旋菌。其他的理论认为膜-结合的细胞器通过渐进的进化从非-膜-结合 体系的原核祖先而来，通过自生过程(Cavalier-Smith，1975，Nature(Lond.) 256：462-468)。但是两组进化生物学者将卵菌和Thraustochytrids从真菌种 去除并将其放置在或者与色质体藻类放在界色质体下(Cavalier-Smith BioSystems 14：461(1981))(该界最近已经扩展到包括其他的原生生物并且该 界成员现在称为Stramenopiles)或者与所有的藻类放在界Protoctista下 (Margulis和Sagen.Biosystems 18：141(1985))。
随着电子显微镜的发展，对两个属Thraustochytrids、破囊壶菌属的游动 孢子以及Schizochytrium的超结构的研究(Perkins，1976，pp.279-312 in ″Recent Advances in Aquatic Mycology″(ed.E.B.G.Jones)，John Wiley & Sons， New York；Kazama.Can.J.Bot.58：2434(1980)；Barr，1981，Biosystems 14： 359-370)已经提供了足够的证据表明破囊壶菌科只与卵菌有较远的关系。此 外，5-S核糖体RNA序列的遗传数据提供了相应的分析(多变量统计学形式) 表明破囊壶菌属清楚地为独特的一组真核细胞，完全与真菌区分开，并且 与红以及褐藻类最相关，并且为卵菌的成员(Mannella等Mol.Evol.24： 228(1987))。最近分类学者已经同意将Thraustochytrids从卵菌移出(Bartnicki- Garcia.p.389in″Evolutionary Biology of the Fungi″(eds.Rayner，A.D.M.， Brasier，C.M.& Moore，D.)，Cambridge University Press，Cambridge)。
总之，利用Cavalier-Smith的分类学系统(Cavalier-Smith.BioSystems 14： 461(1981)；Cavalier-Smith.Microbiol Rev.57：953(1993))，Thraustochytrids 与色质体藻类一起归类于界Chromophyta(Stramenopiles)。该分类学布置最 近由Cavalier-Smith等再次肯定，利用不等鞭毛(藻)门的18srRNA信号证实 Thraustochytrids为chromists而不是真菌(Cavalier-Smith等Phil.Tran.Roy. Soc.London Series BioSciences 346：387(1994))。这种放置将Thraustochytrids 与真菌放在完全不同的界，真菌都放在界Eufungi中。
目前，有71组完全不同的真核生物体(Patterson.Am.Nat.154：S96(1999)) 并且在这些组种，基于下述原因分为四个主要的世系：(1)Alveolates， (2)Stramenopiles，(3)a Land Plant-green藻类-Rhodophyte-Glaucophyte(″plant″) 进化枝以及(4)Opisthokont进化枝(真菌以及动物)。以前这四个主要的世系 会被标上界但是使用″界″概念不再被一些研究者认为有用。
如Armstrong所注意到的，Stramenopile指三股-分开的管状绒毛，并且 绝大多数该世系的成员具有带有这些绒毛的鞭毛。Stramenopiles的能动细胞 (单细胞生物体、精子、游动孢子)是不对称的具有两个侧部附着的鞭毛，一 个长，带有三股-分开的管状绒毛，其反转鞭毛的推进，并且一个短并且光 滑。以前，当该组范围较窄的时候，Stramenopiles称为界Chromista或者 heterokont(＝不同的鞭毛)藻类，由于这些组包括褐藻类或者Phaeophytes以 及黄-绿藻类、金-褐藻类、Eustigmatophytes以及Diatoms。随后，一些异养 的、真菌样的生物体、水霉以及labyrinthulids(slime net amoebas)，发现具有 类似的运动细胞，称为光合颜料或者藻类的名称就不合适。目前， Stramenopile世系中的两个科为网粘菌科和破囊壶菌科。历史上，对这些独 特的微生物存在许多分类策略并且它们通常归类在相同的目(即，破囊壶菌 属)下。该组成员中的关系仍然在发展。Porter以及Leander发展了基于18S 小亚基核糖体DNA的数据，表明thraustochytrid-labyrinthulid进化枝是单源 的。但是，进化枝被两个分支支持；第一个包括破囊壶菌属和Ulkenia profunda中的3个物种，并且第二支包括网粘菌属中的3个物种， Labyrinthuloides和Schizochytrium aggregatum中的两个物种。
用于本发明的Thraustochytrids分类学放置因此总结如下：
界：色质界(Stramenopiles)
门：不等鞭毛(藻)门
目：破囊壶菌属(Thraustochytrids)
科：破囊壶菌科或者网粘菌科
属：破囊壶菌属，Schizochytrium，Japonochytrium，Aplanochytrium，Elina， 网粘菌属、Labyrinthuloides，或者Labyrinthulomyxa
一些早期的分类学者将破囊壶菌属中的数种最初成员(具有似变形虫生 命阶段的那些)分到另外一个称为Ulkenia的属中。但是现在已经直到，尽 管不是所有也是大多数Thraustochytrids(包括破囊壶菌属以及 Schizochytrium)，显示似变形虫阶段并因此，一些学者并不认为Ulkenia是 有效的属。这里使用的破囊壶菌属包括Ulkenia。
尽管在门和界的高级分类中分类学位置不确定，Thraustochytrids保持了 特色以及特征性质分组，其成员仍然可以分类到破囊壶菌目中。有关所述 的微生物及其培养微生物的方法参见U.S.5,407,957；5,130,242和5,340, 594，这里以其整体引入作为参考。
被本发明覆盖的脂质包括脂质包括多不饱和脂肪酸，更具体地，长链多 不饱和脂肪酸，并且甚至更具体地，多不饱和脂肪酸在所述的脂质具有至 少18、20或者22个碳链长度的。所述的多不饱和脂肪酸能够具有至少3 或者至少4双键。更具体地，多不饱和脂肪酸能够包括二十二碳六烯酸(至 少10、20、30或者35重量百分比)，二十二碳五烯酸(至少5、10、15，或 者20重量百分比)，和/或花生四烯酸(至少20、30、40或者50重量百分比)。 多不饱和的脂肪酸包括游离的脂肪酸以及包括PUFA残基的化合物，包括 磷脂；脂肪酸酯；三酰基甘油；二酰基甘油酯；单酰基甘油酯；溶血磷脂； 磷脂；等。
磷脂的来源包括家禽蛋、强化家禽蛋、藻、鱼、鱼籽以及基因工程(GE) 植物籽或者藻。具体地优选的PUFAs源，包括DHA包括，但不限于，鱼 油、海洋藻以及植物油。
优选的PUFA，DHA的前体，包括，但不限于，a-亚麻酸(LNA)；二十 碳五烯酸(EPA)；二十二碳五烯酸(DPA)；LNA、EPA，和/或DPA的混合物。
在本发明的一个实施方案中，脂肪酸并且具体地，ω-3脂肪酸和ω-6脂 肪酸的混合物能够用于本发明的方法中。
优选的PUFAs包括ω-3和ω-6多不饱和脂肪酸具有3个或者多个双键。 ω-3 PUFAs为多乙烯类型的脂肪酸其中最后的乙烯键为3碳形式并包括脂 肪酸的末端甲基并包括，例如，二十二碳六烯酸C22：6(n-3)(DHA)以及ω-3 二十二碳五烯酸C22：5(n-3)(DPAn-3)。ω-6 PUFAs为多乙烯型脂肪酸，其 中作后的乙烯键为6碳形式并脂肪酸的末端甲基并包括，例如，花生四烯 酸C20：4(n-6)(ARA)，C22：4(n-6)，ω-6二十二碳五烯酸C22：5(n-6)(DPAn-6) 以及二高γ亚麻酸C20：3(n-6)(二高GLA)。
根据本发明，可用于这里描述的补充剂以及治疗性组合物中的长链的脂 肪酸为多种形式。例如，所述的形式包括，但不限于：包括PUFA的高度 纯化的海藻油，包括PUFA的甘油三酸酯油，包括PUFA的磷脂，包括PUFA 的蛋白和磷脂的组合，包括PUFA的干燥的海洋微藻，包括PUFA的鞘类磷 脂，PUFA的酯类、游离脂肪酸、PUFA与另一中生物活性分子的偶联物及 其组合。生物活性分子能够包括任何合适的包括，但是不限于，蛋白、氨 基酸(例如天然存在的氨基酸如DHA-氨基乙酸、DHA-赖氨酸，或者氨基酸 类似物)、药物以及糖。
这里列出的形式容许食品制剂在具有高度的感觉性质、饮食补充以及药 物方面具有灵活性。例如，目前已有的微海藻油包含约40％DHA。这些油 能够转化为酯的形式并且然后利用技术如分子蒸馏的技术纯化使DHA含量 达到70％以及更高，提供浓缩的产品，能够用于大小受限的产品，即，小 的服务大小如具有受限的可行的口服大小的婴儿食品或者饮食补充剂。油 以及磷脂组合的使用有助于提高氧化稳定性并且因此微海藻油的感觉以及 以及营养性品质。氧化裂解损害了营养性甘油三酸酯形式的PUFAs的感觉 品质。通过利用磷脂形式，需要的PUFAs更为稳定并且脂肪酸更加生物可 利用，当为甘油三酸酯形式的时候。尽管微生物油比通常的鱼油更稳定， 二者都易氧化降解。氧化降解降低了这些脂肪酸的营养价值。此外氧化的 脂肪酸据信对健康有害。利用磷脂DHA/DPA/ARA/二高-GLA，一种更稳定 的脂肪酸体系，提高了这些补充剂的健康以及营养价值。与甘油三酸酯油 相比，磷脂还更易于混合到水体系中。利用蛋白以及磷脂组合可以形成更 营养的复合食品制剂，由于蛋白和脂肪酸二者都提供。利用干燥的海洋微 藻在其中提供高温稳定的油，并且对在高温焙烤食品的制剂是游离的。
在本发明的一个实施方案中，需要的磷脂源包括源自蛋、植物油以及动 物器官的纯化的磷脂，利用Friolex方法制备以及磷脂萃取过程(PEP)(或相 关的方法)用于制备富含DHA，DPA，ARA和/或二高-GLA的营养性补充剂。 Friolex和PEP以及相关的方法更详细地记载在下述专利文献中：PCT专利 PCT/IB01/00841，标题″Method for the Fractionation ofOil and Polar Lipid- Containing Native Raw Material″，2001年4月12日提交，以WO01/76715 在2001年10月18日出版；PCT/IB01/00963，标题″Method for the Fractionation of Oil and Polar Lipid-Containing Native Raw Material Using Alcohol and Centrifugation″，2001年4月12日提交，以WO01/76385在2001 年10月10日出版；以及PCT/DE95/01065标题″Process For Extracting Native Product Which Are Not Water-Soluble From Native Substance Mixtures By Centrifugal Force″，1995年8月12日提交，以WO 96/05278在1996年 2月22日出版；每篇专利这里以其全文引入作为参考。
优选地，高度纯化的海藻油包括：需要的甘油三酸酯形式的PUFA、甘 油三酸酯油组合磷脂、单独磷脂、蛋白和磷脂组合，或者干燥的海洋微藻， 包括选自由DHA和/或DPA(n-3)和/或DPA(n-6)和/或ARA和/或二高-GLA 制成的脂肪酸残基。更优选地，高度纯化的海藻油包括甘油三酸酯形式的 需要的PUFA、甘油三酸酯油组合磷脂、单独磷脂、蛋白和磷脂组合，或者 干燥的海洋微藻，包括选自由DHA、ARA或者DPA(n-6)制成的脂肪酸残基。 更优选地，高度纯化的海藻油包括甘油三酸酯形式的需要的PUFA、甘油三 酸酯油组合磷脂、单独磷脂、蛋白和磷脂组合，或者干燥的海洋微藻，包 括选自由DHA和DPA(n-6)制成的脂肪酸残基。在最优选的实施方案中，高 度纯化的海藻油包括甘油三酸酯形式的需要的PUFA、甘油三酸酯油组合磷 脂、单独磷脂、蛋白和磷脂组合，或者干燥的海洋微藻，包括DHA的脂肪 酸残基。
尽管脂肪酸如DHA能够局部给药或者以注射剂型给药，最优选的给药 途径是口服给药。优选地，脂肪酸(例如，PUFAs)以营养性补充剂和/或食品 和/或药用制剂和/或饮料的形式对患者给药，更优选地食品、饮料，和/或营 养性补充剂，更优选地，食品和饮料，更优选地食品。
对于婴儿，脂肪酸以婴儿制剂、断奶食品、罐装婴儿食品以及婴儿米粉 的形式对婴儿给药。
任何生物可以接受的剂型及其组合，都包括在本发明的主题之中。所述 剂型的实例包括，不限于，咀嚼片剂、速溶片剂、泡腾片剂、可重构粉末、 酏剂、液体、溶液、混悬剂、乳剂、片剂、多层片剂，双层片剂、胶囊、软 明胶胶囊、硬明胶胶囊、囊片、锭剂、咀嚼锭剂、小珠、粉末、颗粒、粒、 微粒、可分散颗粒、扁囊剂、灌肠剂、栓剂、乳膏剂、局用剂型、吸入剂、 气雾吸入剂、贴剂、粒吸入剂、植入剂、长效植入剂、可吸收剂、注射剂、 输液剂、health bars、糖膏剂、米粉、米粉敷料、食品、营养食品、功能性 食品及其组合。上述制剂形式的配制对本领域的普通技术人员而言是公知 的。优选地，用需要的PUFA强化的食品选自包括，但是不限于：焙烤物 品及其混合物；口香糖；早餐米粉食物；干酪产品；坚果以及基于坚果的 产品；白明胶、布丁以及饼馅；冰冷奶制品；牛奶产品；牛奶产品类似物； 软糖；汤以及汤混合物；快餐食品；加工的果汁；加工的蔬菜汁；脂肪以 及油类；鱼产品；植物蛋白产品；家禽产品；以及肉类产品。
对患者给药PUFA的量能够为适合提供下述结果的任何量：补偿所述的 患者中降低的脂肪酸结合蛋白或者其功能；补偿所述的患者中降低的脑脂 质结合蛋白或者其功能；改善所述的患者中脂肪酸结合蛋白的活性；增加 所述的患者中脑脂质结合蛋白(BLBPs)的表达；改善所述的患者中脑脂质结 合蛋白作用机制中至少一个参数；克服中枢神经系统(CNS)结构及其功能中 脂肪酸如DHA的缺乏；增加功能性脂肪酸如DHA向患者中神经胶质细胞 和神经元磷脂膜中掺入；增加所述的患者中颤蛋白的水平和/或改善颤蛋白 的活性；和/或改善与颤蛋白缺乏或者机能不良相关疾病或者病症的至少一 种症状。在一个实施方案中，脂肪酸(PUFA)以从约0.05mg的PUFA每公斤 患者体重至约200mg的PUFA每公斤患者体重或者更高的剂量给药，包括 在其之间0.01mg增量的任何增量，(例如，0.06mg，0.07mg等)，或者剂量 范围在约50mg和约20,000mg每个对象每天之间，通过口服、注射、乳剂 或者总肠胃外营养、局部、腹膜内、胎盘、透皮或者颅内给药。典型的胶 囊DHA补充剂例如，可以制备成为100mg至200mg剂量每胶囊，尽管本 发明不限于胶囊形式或者包含这些量的DHA或者另一种PUFA的胶囊。在 本发明的一个实施方案中，对患者给药PUFA补充剂组合一种或者多种治 疗化合物用于治疗与颤蛋白缺乏或者机能不良相关病症。针对特定的治疗 的疾病或者病症而言，所述的治疗化合物对本领域的普通技术人员而言是 公知的。
如上讨论，对选择的患者给药PUFA补充剂如DHA优选地一或者多种 下述结果：补偿所述的患者中降低的脂肪酸结合蛋白或者其功能；补偿所 述的患者中降低的脑脂质结合蛋白或者其功能；改善患者中脂肪酸结合蛋 白的活性；改善患者中脑脂质结合蛋白作用机制的至少一个参数；导致功 能性DHA掺入到所述的患者中神经胶质细胞和神经元的磷脂膜中的增加； 颤蛋白水平的增加和/或患者中颤蛋白活性的改善。在一个实施方案中，患 者罹患与颤蛋白缺乏或者机能不良相关联的疾病或者病症，并且对患者给 药PUFA改善所述疾病或者病症的至少一种症状。
接受治疗的患者能够为处于发展任何与颤蛋白缺乏或者机能不良相关 联的疾病或者病症的风险中或者可能已经罹患任何与颤蛋白缺乏或者机能 不良相关联的疾病或者病症。所述的疾病和病症，包括，但不限于：神经 病症或者神经精神病症、癫痫发作、与神经机能不良相关的自体免疫病症， 以及抗-磷脂病症。更具体地，所述的疾病或者病症包括，但不限于：精神 分裂症、双相性精神障碍、诵读困难、运动障碍、注意力不集中的过度反 应症(ADHD)、癫痫、孤独症、帕金森病、老年痴呆、阿耳茨海默(氏)病、 过氧化物酶体增殖子激活疾病(PPAR)、多发性硬化症、糖尿病诱导的神经 疾病、黄斑变性、早产儿视网膜病、亨延顿(氏)舞蹈病、肌萎缩侧索硬化 (ALS)、色素性视网膜炎、脑性麻痹、肌肉萎缩症、癌症、囊性纤维化病、 神经管缺陷、抑郁症、泽韦格综合征、无脑回、唐氏综合征、肌肉-眼睛- 脑疾病、Walker-Warburg综合征、Charoct-Marie-Tooth疾病、包涵体肌炎(IBM) 以及Aniridia。
优选地，对患者给药PUFA如DHA预防与颤蛋白缺乏或者机能不良相 关的疾病或者病症的至少一种症状、延迟发作，或者减少严重程度或者持 续。在优选的实施方案中，患者不再罹患不适和/或改变的功能，源自不合 适的颤蛋白水平或者与不合适的颤蛋白水平相关或者为本发明的方法的结 果。
同样地，治疗性益处并不必要地治愈具体的疾病或者病症，而是，优选 地包含下述结果：最通常包括减轻所述疾病或者病症、消去所述疾病或者 病症、减少与疾病或者病症相关联的症状、补偿或者恢复至正常的细胞或 者细胞内机制，预防或者减轻源自原发的疾病或者病症的继发的疾病或者 病症、和/或预防所述疾病或者病症。这里使用的，术语″预防疾病″指减轻 所述疾病的症状；减少所述疾病的发生，和/或降低疾病的严重程度。保护 患者能够指本发明的组合物，当对患者给药后，预防疾病发生和/或治愈或 者减轻疾病症状、征候或者病因的能力。同样地，保护患者以免患疾病包 括预防疾病发生(预防性治疗)以及治疗患有疾病的患者(治疗性治疗)。有益 的作用能够轻易地由本领域的普通技术人员和/或由治疗患者的接受过训练 的临床医生评估。术语，″疾病″指哺乳动物的正常健康的任何偏离并包括下 述状态，其中存在疾病症状，以及其中偏离(例如，感染、基因突变、遗传 缺陷等)已经发生但是症状还没有显示出来的情形。根据本发明，″患者″不 是必要地具有疾病、病症或者颤蛋白缺乏或者机能不良或者不是必要地处 于发展疾病、病症或者颤蛋白缺乏或者机能不良的风险中，但是，该术语 能够与″对象″、″个体″互换，并且最一般性地指个体动物(例如，人对象或 者驯养地动物)，其接受本发明的方法或者组合物进行评价、诊断、治疗或 者其他的作用。
许多上述本发明方法的一个步骤包括检测、测量或者评价患者生物样品 中的颤蛋白表达或者生物活性。样品能够为细胞样品、组织样品和/或体液 样品。根据本发明，术语″细胞样品″可以用来一般性地指任何类型的样品， 其包含利用本发明进行评价的细胞，包括但是不限于，分离的细胞样品、 组织样品和/或体液样品。根据本发明，分离的细胞样品为细胞样本，通常 为悬浮状态或者从结缔组织分离得到，在体内的组织中连接细胞，其从器 官、组织或者流体收集得到，利用任何合适的方法以收集合适数目的细胞 以用于利用本发明的方法进行评价。细胞样品中的细胞并不必须地为同样 类型，尽管纯化方法能够用来富集优选地进行评价的同样类型的细胞。细 胞能够利用下述方法得到，例如，通过刮组织，处理组织样品以释放单个 细胞，或者从体液中分离得到。组织样品，尽管与分离的细胞样品类似， 这里定义为身体器官或者组织的部分，通常包括数种细胞类型和/或细胞骨 架结构，后者支持细胞在一起。本领域的普通技术人员将意识到术语″组织 样品″在某些情形下与″细胞样品″互换使用，尽管其优选地用来表明比细胞 样品更复杂的结构。组织样品能够通过活组织检查得到，例如，包括通过 切、切(片)，或者刺的方式。体液样品，与组织样品一样，可以包含细胞并 且为利用适于进行取样的具体体液的任何方法获得的液体。适合取样的体 液包括，但不限于，血液、黏液、精液、唾液、乳汁、胆汁以及尿。在本 发明优选的实施方案中，生物样品为血液样品，包括任何血液组分(例如， 全血液、血浆、血清)。
通常，样品类型(即，细胞、组织或者体液)基于样品的易得到以及所述 的方法的目的进行选择。通常，能够利用最少侵入的方法得到的生物样品 是优选的(例如，血液)，尽管在一些实施方案中，得到细胞或者组织样品用 于评价有用或者必须。一旦从患者获得样品，样品用于评价检测样品细胞 中的颤蛋白表达或者生物活性。术语″颤蛋白表达″能够一般性地指颤蛋白 mRNA转录或者颤蛋白蛋白翻译(例如，检测样品中颤蛋白的蛋白量)。优选 地，所述的检测患者中颤蛋白表达或者生物活性的方法与下述方法相同或 者性质上等价：用于检测样品中颤蛋白表达或者生物活性以建立颤蛋白基 线或者对照水平的方法。
适于检测颤蛋白转录的方法包括用于检测和/或测量流体、细胞或者细 胞提取物中mRNA水平的任何合适的方法。所述的方法包括，但不限于： 聚合酶链式反应、逆转录酶-PCR(RT-PCR)、原位杂交、Northern印迹、序 列分析、微阵列分析以及报告基因的检测。用于检测转录水平的方法在本 领域中是公知的，并且许多这样的方法已经描述，例如，在Sambrook等， Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Labs Press， 1989和/或在Glick等，Molecular Biotechnology：Principles and Applications of Reconbinant DNA，ASM Press，1998；Sambrook等，ibid.and Glick等，ibid. 中，这里以其整体引入作为参考。当样品为细胞或者组织样品的时候，颤 蛋白转录的测量主要合适的；因此，当样品是包含细胞或者细胞提取物的 体液样品的时候，细胞通常从体液中分离出来以进行表达测定。
颤蛋白表达还能够通过检测颤蛋白翻译进行确定(即，检测样品中的颤 蛋白蛋白)。适于检测颤蛋白蛋白的方法包括用于检测和/或测量蛋白流体、 细胞或者细胞提取物中的任何适合方法。所述的方法包括，但不限于，蛋 白质印迹、免疫印迹、酶-联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、 免疫沉淀反应、表面等离振子共振、化学发光、荧光偏振、磷光、免疫组 织化学分析、基质-辅助激光解吸/离子时间飞行(MALDI-TOF)质谱、微细胞 术、微阵列、显微镜、荧光激活细胞分选(FACS)、流式细胞术、以及蛋白 质微芯片或微阵列。所述的方法在本领域中是公知的。抗颤蛋白的抗体已 经制备出来并记载在现有技术中(例如，参见，Ogawa等，1995，Neuron，14： 890-912；DeBergeyck等，1998，J；Neurosci.15 Meth.，82：17-24)并且能够 用于测定检测颤蛋白蛋白。在PCT公开号WO03/063110中，例如，免疫印 迹技术用来检测患有各种神经/心理病症患者的血液样品中的颤蛋白大小形 式并与基线对照群中的颤蛋白水平进行比较。所述的方法可以用于检测生 物样品中的颤蛋白，尽管对本领域的普通技术人员而言，多种颤蛋白检测 和测量技术能够用来评价个体中的颤蛋白状况。
或者，可以利用本领域中公知的技术轻易地制备抗颤蛋白的抗体。选择 性结合样品中的颤蛋白抗体能够利用本领域已知的颤蛋白蛋白信息产生。 更具体地，术语″选择性结合″指一种蛋白与另一种蛋白(例如，对应抗原的 抗体、其片段，或者结合伴侣)的特异性结合，其中结合水平，可以利用标 准的测定测量(例如，免疫测定)，统计学上显著地高于用于测定的背景对照。 例如，当进行免疫测定的时候，对照通常包括单独包含抗体或者抗原结合 片段(即，不存在抗原)反应孔/管，其中在不存在抗原的情形下，抗体或者 其抗原结合片段的反应量(例如，对孔的非特异结合)被认为是背景。结合能 够利用本领域中的多种标准方法进行测量，包括酶免疫测定(例如，ELISA)， 免疫印迹测定等)。用于测定试剂盒以及本发明的方法中的抗体能够包括多 克隆和单克隆抗体、二价以及单价抗体、二-或多-特异抗体、包含所述抗体 的血清、已经纯化至一定程度的抗体以及全抗体的任何功能性等价物。本 发明的分离的抗体能够包括包含所述抗体的血清，或者已经纯化至一定程 度的抗体。本发明的全抗体能够为多克隆或者单克隆。或者，全抗体功能 性等当物，如抗原结合片段其中一或者多个抗体结构域被截短或者不存在 (例如，Fv、Fab、Fab′，或者F(ab)2片段)，以及基因工程抗体或者其抗原结 合片段，包括单链抗体或者能够结合多于一个表位的抗体(例如，二-特异抗 体)，或者能够结合一个或者多个不同的抗原的抗体(例如，二-或多-特异抗 体)，也可以用于本发明。
基因工程抗体包括利用标准的重组DNA技术产生的那些，涉及编码抗 体可变和/或不变区域的DNA的操作以及再表达。具体的实例包括，嵌合型 抗体，其中抗体的VH和/或VL结构域以及抗体的其他部分来自不同的来源， 以及CDR嫁接抗体(以及其抗原结合片段)，其中至少一个CDR序列以及任 选地至少一个可变区域骨架的氨基酸来自一个来源并且一个源并且可变以 及不变区域(适当地)的剩余部分来自不同的来源。嵌合以及CDR-嫁接抗体 地构建记载在例如欧洲专利申请：EP-A 0194276、EP-A 0239400、EP-A 0451216和EP-A 0460617中。
一般性地，在产生抗体的时候，合适的实验动物，如，例如，但是不限 于，兔、羊、仓鼠、豚鼠、小鼠、大鼠或者鸡，暴露于需要产生抗体的抗 原。通常，动物用有效量的抗原进行免疫，注射到动物中。有效量的抗原 指诱导动物产生抗体的需要量。动物的免疫系统然后反应预定的一段时间。 免疫过程能够重复直到免疫系统发现产生针对抗原的抗体。为了得到抗原 特异的多克隆抗体，从包含需要的抗体的动物收集血清(或在鸡的情形下， 抗体能够从蛋收集得到)。所述的血清可以用作试剂。多克隆抗体能够可以 从血清(或者蛋)纯化，利用，例如，将血清用硫酸铵处理。
单克隆抗体可根据Kohler和Milstein的方法制备(Nature 256： 495-497，1975)。例如，从免疫的动物的脾脏(或者任何合适的组织)收集B淋 巴细胞并且然后与骨髓瘤细胞融合以得到杂交瘤细胞群，后者能够在合适 的培养基中生长。通过检测杂交瘤产生的抗体与需要的抗原的结合选择产 生需要抗体的杂交瘤。
如上讨论，发现颤蛋白在患者中存在一或者多种不同的″大小形式″(具 有不同的分子量的颤蛋白蛋白)。这些″颤蛋白成分″或者″大小形式″还可以 进行检测并将一种与另外一种进行比较，或者具体大小形式的颤蛋白(颤蛋 白成分)能够与基线或者对照样品中的同样的颤蛋白成分(同样分子量的颤 蛋白成分)进行比较。此外，可以检测患者生物样品中的不同的颤蛋白大小 形式比率，或者谱，并将所述的谱与基线对照进行比较。需要检测的特别 有用的颤蛋白大小形式(成分)包括具有表观分子量约410kD(全长颤蛋白)以 及天然存在的蛋白酶解约330kD以及180kD的产品。利用许多上述检测颤 蛋白蛋白的方法，能够检测颤蛋白大小形式并将一种与另一种进行区分。 检测样品中颤蛋白蛋白水平的方法，包括颤蛋白大小形式，还详细地记载 在PCT公开WO 03/063110中，这里以其整体引入作为参考。例如，在该公 开中，测定了患重度抑郁症、精神分裂症、双相性精神障碍病症地患者中 的颤蛋白大小形式的比率以及数量与正常(未受累)对照的颤蛋白大小形式 水平在统计学上显著地不同。类似的结果也在孤独症患者及其家族成员中， 与家族中没有孤独症的对照对象相比。因此，测试对象生物样品中的颤蛋 白大小形式相对水平以及颤蛋白中的总体水平的变化的检测，能够轻易地 与对照或者基线水平进行比较以评价给定测试对象中的颤蛋白状况并因此 确定颤蛋白缺乏或者机能不良，包括颤蛋白异常。
术语″颤蛋白生物活性″指颤蛋白蛋白任何生物作用，包括，但是不限于， 结合颤蛋白受体(例如，钙粘蛋白-相关的神经受体，B1-类整联蛋白、低密 度脂蛋白受体，以及具体地，VLDLR和ApoER2)，颤蛋白受体的激活、颤 蛋白细胞信号转导通路的激活(例如，cdk5/p35对Dab1的酪氨酸磷酸化)； 以及由于颤蛋白结合结合受体的下游的生物事件(例如，磷酸肌醇-3-激酶 (PI3K)，Akt和Src家族激酶(SFKs)的激活；蛋白如Notch、NckB、erbB2、 erbB4、神经调节蛋白的上调；星形胶质细胞形态转化为放射神经胶质细胞； 神经受体表达上调；脑脂质结合蛋白(BLBPs)上调等)。检测颤蛋白生物活性 的方法是本领域中公知的并包括，但不限于，受体-配体测定以及磷酸化测 定。
本发明的诊断和监测方法具有不同的用途。首先，所述的方法能够用来 诊断以及监测具有给定病症(例如，神经病症)大量患者中的具有颤蛋白缺乏 或者机能不良患者亚组，其最可能受益于本发明的方法(例如，利用PUFAs 补充)。所述的方法还能够用来诊断并监测患者，通过确定具有DHA或者 其他的PUFA缺乏，或者脂肪酸结合蛋白(FABP)缺乏或者机能不良的患者， 或者确定具有DHA或者其他的PUFA缺乏或者FABP缺乏或者机能不良可 能性的患者。所述的患者能够为怀疑具有DHA或者其他的PUFA缺乏或者 FABP缺乏或者机能不良的个体，或者认为为健康的个体，但是接受DHA 或者其他的PUFA缺乏或者FABP缺乏或者机能不良的常规检测。患者还能 够以前诊断患有DHA或者其他的PUFA缺乏或者FABP缺乏或者机能不良 并接受治疗的个体，并且接受关于再发DHA或者其他的PUFA缺乏或者 aFABP缺乏或者机能不良常规的监督。
术语″诊断″、″诊断″、″接受诊断″及其变体指在征候以及症状的基础上 确定疾病或者病症。这里使用的，″阳性诊断″表明已经确定所述疾病或者病 症，或者发展所述疾病或者病症的可能，或者需要PUFA补充等。与此不 同的是，″阴性诊断″表明没有确定疾病或者病症，或者发展疾病或者病症的 可能，或者PUFA补充的需要。因此，在本发明中，阳性诊断(即，阳性评 估)DHA或者其他的PUFA缺乏或者FABP缺乏或者机能不良，或者其可能 性，指根据本发明的DHA或者其他的PUFA缺乏或者FABP缺乏或者机能 不良(例如，颤蛋白缺乏或者机能不良)的标志(例如，征候、症状)已经在患 者样品识别出来。然后所述的患者能够接受治疗以减少或者消除DHA或者 其他的PUFA缺乏或者FABP缺乏或者机能不良。类似地，阴性诊断(即， 阴性评估)DHA或者其他的PUFA缺乏或者FABP缺乏或者机能不良，或者 其可能性指，DHA或者其他的PUFA缺乏或者FABP缺乏或者机能不良， 或者发展如这里描述的DHA或者其他的PUFA缺乏或者FABP缺乏或者机 能不良的可能性(例如，颤蛋白缺乏或者机能不良)的标志(例如，征候、症 状)没有在患者样品识别出来。在这种情形下，患者通常不接受任何治疗， 或者接受低水平DHA或者其他的PUFA补充，但是在将来的时间再评价一 次或者多次以评估DHA或者其他的PUFA缺乏或者FABP缺乏或者机能不 良。针对评估本发明的方法的该具体实施方案的基线水平通常基于来自同 样身体源作为测试样品的″正常″或者″健康″样品(即，同样的组织、细胞或 者体液)，详细讨论如下。
在本发明的该方法的一个实施方案中，所述的方法用来监测治疗患者中 颤蛋白缺乏或者机能不良、PUFA缺乏、脂肪酸结合蛋白缺乏或者机能不良， 或者与其相关的病症或者疾病的治疗成功或者失败，所述的患者已经诊断 出具有一种病症。在该实施方案中，颤蛋白表达或者生物活性的基线水平 通常包括源自待监测患者样品种检测的颤蛋白表达或者生物活性的在先水 平，因此，新颤蛋白表达或者生物活性的水平能够进行比较以判断颤蛋白、 PUFA和/或脂肪酸结合蛋白表达或者功能是降低、增加，或者基本上没有 变化，与以前或者第一个样品相比。此外，或者，已建立的颤蛋白表达或 者生物活性的″正常″或者″健康″基线水平能够用于该实施方案。该实施方案 容许医护人员监测患者治疗(例如，PUFA补充)的成功，或者失败，所述的 患者患有指定的病症(例如神经病症)，并且能够帮助医护人员判断治疗是否 应该调整(例如，PUFA补充是否应该增加、降低的，或者保持完全一样)。 在一个本发明的实施方案中，所述的方法包括调整针对患者的PUFA补充 治疗的另外的步骤，基于通过评价所述的患者中的颤蛋白表达和/或生物活 性判断PUFA缺乏是增加或者降低。
因此，本发明的诊断和监测方法包括比较患者样品中检测的颤蛋白表达 或者生物活性的水平以及颤蛋白表达或者生物活性的基线水平的步骤。根 据本发明，″基线水平″是对照水平，并且在一些实施方案中，颤蛋白表达或 者活性的正常水平以及颤蛋白表达或者生物活性的测试水平(即，患者样品 中)能够进行比较。因此基于颤蛋白表达或者生物活性的对照或者基线水平， 能够判断，评价的样品中颤蛋白表达或者生物活性是否具有可测量的增加、 降低或者基本上没有变化，与相比基线水平。与这里讨论，基线水平能够 为所述的患者中脂肪酸结合蛋白的水平和/或功能中的指标，并且具体地， 患者中PUFA水平(例如，DHA)，并且能够用来建立所述的患者中DHA和/ 或其他的PUFA补充的方案。例如，颤蛋白基线水平能够为正常(即，健康 或者阴性对照)患者的脑或者其他的组织中预期的DHA水平或者其他的 PUFA水平。因此，用来指颤蛋白表达或者生物活性基线水平的术语″阴性 对照″指利用源自患者的或者个体群样品已建立的基线水平，对于颤蛋白表 达和/或功能而言是正常的。在另一实施方案中，基线能够为DHA缺乏或者 脂肪酸结合蛋白缺乏或者机能不良的阳性诊断的指标。所述的基线水平， 还这里还称为″阳性对照″基线，指源自患者、另一患者，或者个体群样品已 建立的颤蛋白表达或者生物活性水平，其中样品中的颤蛋白水平或者功能 据信相应于DHA或者其他的PUFA或者脂肪酸结合蛋白缺乏或者相应于与 颤蛋白缺乏或者机能不良相关的疾病或者病症。在另一实施方案，基线水 平能够基于源自已经测试的患者的在先样品建立，因此患者的颤蛋白状况 和PUFA状况能够随之间监测。检测颤蛋白表达或者生物活性的方法已经 在上面详细描述。
建立颤蛋白表达或者活性基线水平的方法基于样品类型、获得样品的组 织或者器官、评价患者的状况，并且，如上讨论，测定的焦点或者目标(例 如，初始诊断、监测)。优选地，所述的方法与用于评价患者样品的方法相 同。
在一个实施方案中，颤蛋白表达或者生物活性基线水平已经利用源自患 者的自体同源的对照样品建立。自体同源对照样品能够为分离的细胞、组 织样品或者体液样品，并优选地体液样品。根据本发明，以及如本领域中 所使用的，术语″自体同源″指样品与待评价的样品来自同样的患者。优选地， 与待评价的样品一样，对照样品来自同样的流体、器官或者组织，这样对 照样品为待评价的样品充当最可能基线。该实施方案常常用于当源自患者 样品的水平已建立作为颤蛋白缺乏或者机能不良或者DHA缺乏的阳性或者 阴性诊断。然后该基线能够用来监测患者的进展，发展或者偏离疾病或者 病症，或者用来监测治疗(例如，PUFA补充)的成功。在该实施方案中，定 期评价样品(例如，以年为单位体检)，以及在各点确定通过脂肪酸补充的预 防或者治疗性治疗。对于首次评价，能够使用其他对照，如下所述，如果 需要的话，或者可以进行其他的测试以证实初始的颤蛋白缺乏或者机能不 良阴性或者阳性诊断，并且患者样品的颤蛋白表达或者生物活性数值能够 用作以后的基线。这种类型的基线对照通常用在其他的临床诊断步骤中， 其中″正常″水平可能随病人不同而异和/或其中在诊断的时候得到自体同源 对照样品不可能、不实际或者不有利。
另一种建立颤蛋白表达或者生物活性基线水平的方法是建立对照样品 的颤蛋白表达或者生物活性的基线水平，并且优选地对照样品来自匹配的 个体群。优选地对照样品为同样地样品类型，与用于颤蛋白表达或者生物 活性样品类型相比。根据本发明，术语″匹配的个体″指对照个体的匹配，基 于对要评价的细胞或者肿瘤生长的参数类型适合的一种或者多种特性。例 如，对照个体能够与待评价的患者在下述方面匹配：性别、年龄、种族或 者任何相关的生物或者可能影响对照个体以及患者基线(例如，在先存在的 病症、消费的特定的物质、其他的生物或者生理因素水平)社会学因素。例 如，正常个体血液中的颤蛋白表达水平在给定类型的个体较高(例如，老年 人与年轻人，妇女与男人)。为了建立对照或者颤蛋白表达或者生物活性的 基线水平，从匹配的个体得到许多样品并评价颤蛋白表达或者生物活性。 样品类型优选地为同样的样品类型并得自相同的器官、组织或者体液，与 测试患者待测的样品类型相比。建立合适对照水平需要的匹配的个体的数 目(例如，群)能够由本领域的普通技术人员确定，但是应该在统计学上适于 建立合适的基线以用于与待评价的患者(即，测试患者)进行比较。从对照样 品获得的数值进行统计学上处理以建立合适的基线水平，利用本领域建立 所述值的标准方法。
如上描述的基线，能够为阴性对照基线，如从明显正常对照个体群建立 的基线。或者，如上讨论，所述的基线能够利用已经阳性诊断为具有颤蛋 白缺乏或者机能不良的个体群建立，这样能够建立一或者多个基线水平用 于评价患者。然后将所述的患者样品中颤蛋白表达或者生物活性的水平与 每一种基线水平进行比较以确定哪种类型基线(阳性或者阴性)与患者的颤 蛋白水平统计学上最接近。应该意识到给定患者样品可能落在基线水平之 间，这样最佳的诊断是患者可能开始显示颤蛋白缺乏或者机能不良需要至 少一些脂肪酸补充的指标，并且可能在向更高阶段发展的过程中。本发明 的目标在于逆转、纠正，或者补偿所述的发展的疾病。
本领域的普通技术人员应该意识到基线不需要针对每个测定建立的，基 线能够参照关对于指定的对照样品在先确定的颤蛋白表达基线水平储存信 息的形式建立，如利用任何上述方法建立的基线水平。所述的储存信息的 形式能够包括，例如，但不限于，关于″正常″(阴性对照)或者阳性颤蛋白表 达的参考表、列表或者电子文件群或者个体数据；源自在先评价记录患者 数据的医学表格；或者可以用于患者诊断的关于基线颤蛋白表达的任何其 他的数据来源。
待评价样品中的颤蛋白表达或者生物活性的水平检测后，所述的水平与 已建立的颤蛋白表达或者生物活性基线水平相比，后者利用如上描述的方 法建立。并且此外，如上描述，优选地，所述用于待测样品的检测方法与 用于建立基线水平的方法相同或者质量上和/或定量相当，以使测试样品以 及基线的水平能够直接进行比较。在比较测试样品以及基线对照的时候， 判断测试样品在颤蛋白表达或者生物活性方面是否具有可以测量的降低或 者增加，相对于基线水平，或者在测试和基线水平之间是否存在统计学上 显著差异。在比较样品中的颤蛋白表达或者生物活性水平之后，最终的步 骤是作出诊断、监测，或者确定患者能够进行的治疗。
与基线水平相比，待测的样品(即，测试样品)中检测出降低水平的颤蛋 白表达或者生物活性(或至少一些大小形式的颤蛋白)，一般性地表明，与基 线样品相比，患者将具有降低的FABP水平以及降低的DHA或者其他的 PUFA掺入到脑组织中。更具体地，如果基线为正常或者阴性对照样品，与 对照样品相比，测试样品中检测出降低的颤蛋白表达或者生物活性表明具 有患者降低的以及可能不适当的DHA或者其他的PUFA水平(DHA或者其 他的PUFA缺乏)。如果基线样品是源自患者的在先样品(或者群对照)并且为 患者中颤蛋白缺乏或者机能不良阳性诊断的代表，与基线相比，样品检测 出降低的颤蛋白表达或者生物活性表明患者病症正在恶化、而不是改善并 且治疗应该重新评估或者调整。
与基线水平相比，在待测的样品(即测试样品)中检测出增加水平的颤蛋 白表达或者生物活性(或者至少一些颤蛋白大小形式)表明，与基线样品相 比，患者正经历更少的FABP表达或者功能，以及更少的DHA或者其他的 PUFA缺乏。更具体地，如果基线为正常或者阴性对照，与对照样品相比， 测试样品中检测出增加的颤蛋白表达或者生物活性表明测试样品可能还正 常并且可能患者比正常患者产生和/或消耗更多的DHA或者其他的PUFAs。 如果基线样品是源自患者(或源自群对照)的在先样品并且为患者颤蛋白缺 乏或者机能不良的阳性诊断(即，阳性对照)，与基线相比，样品中检测出增 加的颤蛋白表达或者生物活性表明测试样品预测具有改善FABP的水平或 者功能以及预计患者脑中具有增加的DHA或者其他的PUFAs。
最终，检测的颤蛋白表达与基线样品的颤蛋白表达或者生物活性统计学 上不存在显著地不同，表明与基线样品相比，测试样品中的FABP状况或者 DHA(或者其他的PUFA)状况没有显示差别。更具体地，如果基线为正常或 者阴性对照，测试样品中检测出颤蛋白表达或者生物活性与基线样品中不 存在统计学上显著地不同的，表明测试样品基本上正常并且目前不表现为 FABP或者DHA或者其他的PUFA缺乏或者与颤蛋白缺乏或者机能不良相 关的疾病或者病症。如果基线样品为源自患者(或者来自群对照)的在先样 品，并且为患者颤蛋白缺乏或者机能不良阳性诊断的标志(即，阳性对照)， 测试样品中检测出颤蛋白表达或者生物活性与基线样品中不存在统计学上 显著地不同的，表明患者具有充分地类似的颤蛋白缺乏或者机能不良并且 应该治疗。因此，所述的诊断可能提示医生目前进行的治疗，例如，对控 制该病症没有效果。
为了建立与基线水平相比颤蛋白表达或者活性变化的诊断，与已建立的 基线相比，颤蛋白表达或者活性的水平的变化量统计学上显著(即，至少95％ 置信水平，或者p＜0.05)。优选地，与基线水平相比，样品中颤蛋白表达或 者生物活性检测至少约5％变化，并且更优选地，至少约10％变化，并且更 优选地，至少约20％变化，并且更优选地，至少约30％变化，并且更优选 地，至少约40％变化，并且更优选地，至少约50％变化，产生在测试样品 和基线样品之间不同的诊断。在一个实施方案中，与基线水平相比，样品 中颤蛋白表达或者生物活性的1.5倍变化，并且更优选地，检测至少约3倍 变化，并且更优选地至少约6倍变化，并且更优选地，至少约12倍变化， 并且更优选地，至少约24倍变化的颤蛋白表达或者生物活性与相比基线水 平，得到与基线样品相比，颤蛋白表达或者活性显著变化诊断。
应该理解为在一些病症中，单个大小形式的颤蛋白的水平在血液中可能 实际上增加并且为例如脑中颤蛋白缺乏或者机能不良的治疗。在这些实施 方案中，所述的方法相应地进行调整。此外，对于更敏感的诊断或者监测 测定，检测单个的大小形式的颤蛋白并与基线对照进行比较。在这种方式 中，颤蛋白大小形式的整个谱能够相对于相应的基线谱进行评价。在该实 施方案中，样品中一些形式的颤蛋白与基线相比可能增加，而其他的形式 可能同时降低或者保持基本相同。在该实施方案中，比较颤蛋白表达或者 活性的变化并且以及该变化是否表明患者中FABP或者DHA或者其他的 PUFA缺乏的判断的作出，是通过与基线比较至少一个大小形式或者通过比 较整个谱进行的。评价患者中的颤蛋白形式谱详细地记载在PCT公开号 WO 03/063110中，这里以其整体引入作为参考。
一旦利用本发明的方法作出了颤蛋白缺乏或者机能不良的阳性诊断，需 要的时候，诊断能够利用任何合适的替代检测DHA(或者其他的PUFA)或者 FABP缺乏或者机能不良的方法进行确证。
诊断有颤蛋白缺乏或者机能不良的患者的治疗通过给药PUFA补充进 行提供，并且在一个实施方案中，优选地DHA补充。本发明记载了颤蛋白 表达以及活性用来预测患者脑或者其他的组织DHA的水平的用途，然后用 来提供适当剂量的DHA和/或其他的PUFA以补偿患者中颤蛋白缺乏或者机 能不良的作用。对患者提供的PUFA量记载在上文中，并且能够基于将患 者样品与已建立的对照样品进行比较而确定，其中对照样品与脑或者其他 的组织中的DHA水平相关，并且PUFA的需要量对患者提供益处。优选的 PUFA的剂量如上讨论。一个实施方案中，对患者提供最少量的PUFA补充 并且一段时间后对患者进行再评价(例如，数天、周或者月)以评价PUFA补 充对颤蛋白表达或者活性的作用，或者对与颤蛋白缺乏相关的症状或者疾 病或者病症作用。如果患者中没有显著变化或者改善，临床医护人员上调 PUFA补充并且在后续的时间点评价患者中的颤蛋白表达或者活性。除了评 价PUFA的补充量以外，对患者给药的PUFAs比率以及类型可以周期性地 进行调整。
在本发明的一个实施方案中，提供了一种鉴别神经祖细胞细胞的方法。 所述的方法包括检测细胞群中的颤蛋白表达或生物活性，其中确定水平的 颤蛋白表达或生物活性与神经祖细胞细胞相关。在一个实施方案中，所述 的方法还包括选择检测了颤蛋白表达或生物活性的神经祖细胞。
在另一实施方案中，本发明提供了一种监测神经发育的方法，包括：a) 提供包括神经祖细胞细胞的细胞群；b)检测细胞群中的颤蛋白表达或活性； c)将细胞群暴露在神经祖细胞将发展为分化的神经细胞的条件下；并且d) 监测经过步骤(c)之后的细胞中的颤蛋白的表达或活性，以评价神经祖细胞 向分化的神经细胞的发育。在此实施方案中，所述的方法能够包括在步骤(b) 之前或同时将步骤(a)的细胞群与推定的发育调节化合物接触，并测定推定 的调节化合物是否影响神经祖细胞向分化的神经细胞的发育，通过检测细 胞群中的颤蛋白表达或活性。
检测细胞中的颤蛋白表达或者活性能够按照前述讨论的方法进行。这里 使用的，术语″推定的调节化合物″指在具体的过程中具有未知或者以前未被 认识到的调节活性的化合物。上述用于识别本发明化合物的方法包括将测 试细胞与测试的化合物接触的步骤，以测试其调节神经祖细胞发育的能力， 利用颤蛋白表达作为追踪神经细胞分化以及发育的标志物。例如，测试细 胞能够在液体培养基中培养或者在固体培养基中生长，其中液体培养基或 者固体培养基包含测试的化合物。此外，液体培养基或者固体培养基包含 细胞生长必要的成分，如能被吸收的碳、氮以及微量营养素。
上述方法，一个方面，涉及将细胞与测试的化合物接触足够的时间以使 推定的调节化合物与影响细胞发育的成分相互作用。这里使用的术语″接触 时期″指在细胞与测试的化合物接触的时期。术语″孵育时期″指在评价前使 细胞生长的整个时间，并且能够包括接触时期。因此，孵育时期包括全部 的接触时期并且还可以包括测试的化合物还不存在但是在评分之前继续生 长的时期。本发明的细胞与推定的调节化合物接触的条件，如混合，是任 何合适的培养或者测定条件并包括有效的培养基，在其中细胞能够培养或 者其中细胞能够在存在或者不存在推定的调节化合物条件下倍评价。本发 明的细胞能够在多种容器中培养，包括，但是不限于，组织培养瓶，测试 管，微量滴定器皿以及皮氏培养皿。培养在适合细胞的一定的温度、pH以 及二氧化碳含量下进行。所述的培养条件在本领域中是公知的。细胞与推 定的调节化合物接触的时候考虑每个接触的容器细胞中的细胞的数目、与 细胞接触的推定的调节化合物浓度、推定的调节化合物与细胞的孵育时间 以及接触细胞的化合物的浓度。本领域的普通技术人员能够基于下述变量 确定有效的方案，如容器的大小、容器中液体的溶积、已知的针对测定中 使用的具体的细胞类型的培养条件，以及测试的推定的调节化合物(即，大 小、电荷等)的化学组成。推定的调节化合物优选的量包括在约1nM～约 10mM的推定的调节化合物/96孔板的孔。
根据本发明，本发明的方法适于用于患者为脊椎动物、哺乳动物，包括， 不限于灵长类、牲畜以及家庭宠物(例如，伴侣动物)。最通常，患者为人患 者。
提供下述下述实施例用于说明本发明而不在于用来限制本发明的范围。
实施例
实施例1：
婴儿患者样品中颤蛋白水平的定量测定以确定神经机能不良的性质以 及接受治疗
下述实施例证实了如何诊断孤独症以及因此进行的DHA治疗可以通过 测试患者样品中颤蛋白的浓度进行判断。
患者样品
患者血液样品通过在1月龄到18月龄的婴儿进行静脉穿刺或者抽取。 样品收集在包含抗凝血剂(EDTA或者肝素)的试管中，并且旋转以将血浆与 细胞沉淀分离。得到的血浆在-80℃冷冻直至需要。
对照样品
血液样品抽自合适的、疾病-阴性的对照对象，以如测试对象同样的方 式。类似地，得到的血浆在-80℃冷冻直至需要。
利用定量蛋白印迹定量测定颤蛋白水平
5微升的每位患者血浆稀释到SDS-PAGE样品缓冲液中并在95℃加热 10分钟以完全变性样品。适当量的各样品上样到固定浓度的分离胶顶部的 固定浓度的堆积胶的单道中。样品与稀释成多个已知浓度的血浆对照样品 以及适当的分子量标志分子一起上样。在标准的条件下进行电泳，将分开 的蛋白电印迹道纤维素膜上。将形成的点在包含1％BSA和0.1％Tween-20 的PBS中在室温封闭2小时。去除缓冲液并将斑点与包含5-10μg/mL of兔 抗-颤蛋白IgG抗体的封闭缓冲液孵育过夜。第二天洗涤斑点并用包含 5-10μg/mL偶联至辣根过氧化酶的羊抗-兔IgG的缓冲液在室温孵育1小 时。再次洗涤斑点并用化学发光底板曝光膜检测。利用抗-颤蛋白抗体，在 患者以及对照样品中检测到对应不同大小颤蛋白变体的不同分子量带。密 度计量学测量用于测量所述的患者中测试样品以及已知的对照样品中的颤 蛋白反应带。然后测定患者样品中的颤蛋白定量水平，通过将这些样品的 密度计量学结果与利用由包含多个已知浓度的颤蛋白的样品得到的曲线进 行比较。
分析
通过将所述的患者样品中各个不同大小形式的颤蛋白(颤蛋白成分)与 疾病-阴性对照样品中那些的水平进行比较，作出孤独症的诊断。所述的患 者样品中一或者多种颤蛋白形式的水平相对于对照样品的增加或者降低是 患者中孤独症的指示。
治疗和监测
基于如上测定的颤蛋白水平，设计针对患者的治疗方案。给药补充比正 常婴儿制剂更高水平的DHA和ARA的婴儿制剂进行预防性干预，直到婴 儿达到12月龄(例如，以约0.2g/天～约1g/天的剂量)。然后补充改变为约 1g的DHA/天，以单用扯掉胶囊的形式提供，直到婴儿达到3岁。
每3个月评估颤蛋白水平，如果颤蛋白水平没有增加平均基线水平85％ 的范围之内，剂量进行相应调整。
实施例2：
定量测定患者中的颤蛋白水平用于诊断精神分裂症
下述实施例证实如何诊断精神分裂症以及因此的用DHA的治疗疗程能 够通过定量测量外周血液样品中的颤蛋白水平而推动。
患者样品
血液样品通过对患者进行静脉穿刺抽取并将样品收集在包含抗凝血剂 (EDTA或者肝素)的管中。将样品离心以聪全细胞中取出血浆并将得到的血 浆在-80℃冷冻直至需要。
对照样品
血液样品抽自合适的、疾病-阴性对照对象，以如测试对象同样的方式。 得到的血浆类似地在-80℃冷冻直至需要。
通过荧光微量板免疫测定定量测定颤蛋白水平
50微升的每位患者的血浆在等体积的测定缓冲液中稀释两倍，测定缓 冲液由PBS以及0.5％BSA和0.05％Tween-20组成。包含已知浓度的颤蛋 白的对照样品也在测定缓冲液中进行连续稀释以构建已知的标准曲线。稀 释的样品和对照加入到黑色的聚苯乙烯微量板的每孔中，聚苯乙烯已经用 兔抗-颤蛋白N-端IgG抗体包被，并且然后由PBS和1％BSA和0.1％ Tween-20的封闭缓冲液封闭。使用的抗-颤蛋白包被抗体对在测定中测量的 所有3种大小形式的颤蛋白都特异的。稀释的样品在微量板孔中在37℃孵 育2小时，然后从孔中吸出来，并将孔用由PBS和0.1％Tween-20组成的洗 涤缓冲液洗涤4次。将孔中的吸水纸吸水干燥并加入100μL三种不同的兔 抗-颤蛋白IgG抗体的混合物加入至板的各孔中，每种抗体偶联不同的荧光 探针并且稀释的1-10μg/ml的测定缓冲液溶液。各个不同的抗-颤蛋白检 测抗体对测量的三种不同的大小形式颤蛋白中的每一种都是特异的。将 孔在37℃孵育1小时，并且然后用洗涤缓冲液洗涤4次。将孔中的吸水纸 吸水干燥，并向各孔中加入100μL的PBS。然后将微量板在荧光微量板读 数器中读数，读数器设置成测量即时的荧光，利用针对每种抗体-荧光探针 偶联物的合适的激发以及发射滤波器组。测量各种荧光探针的发射强度， 并将其与在已知的标准中得到的测量进行比较，能够确定每个患者或者对 照样品中的每种大小形式的颤蛋白的浓度。
分析
通过比较所述的患者样品中每种不同的大小形式的颤蛋白(颤蛋白成分) 水平以及疾病-阴性对照样品中不同大小形式的水平，作出精神分裂症诊断。 所述的患者样品中一或者多种颤蛋白形式的水平相对于对照样品的增加或 者降低是患者中精神分裂症的指示。
治疗以及监测
基于如上测定颤蛋白的水平，设计针对患者的治疗方案。通过以约0.2g/ 天～约1g/天的剂量给药胶囊形式的DHA，实现治疗性干预。然后通过每2 个月监测循环的颤蛋白水平，并与临床症状关联。如果在6～8月内，颤蛋 白水平不增加显著地或者临床症状不改善或者减轻，能够增加DHA的剂量 并且还补其他的脂肪酸化合物，包括其他的n-3脂肪酸前体。
实施例3：定量测定患者中的颤蛋白水平用于诊断双相性精神障碍病 症。
下述实施例证实如何诊断双相性精神障碍以及因此的用DHA的治疗疗 程能够通过定量测量外周血液样品中的颤蛋白水平而推动。
患者样品
血液样品通过对患者进行静脉穿刺抽取并将样品收集在包含抗凝血剂 (EDTA或者肝素)的管中。将样品离心以聪全细胞中取出血浆并将得到的血 浆在-80℃冷冻直至需要。
对照样品
血液样品抽自合适的、疾病-阴性对照对象，以如测试对象同样的方式。 得到的血浆类似地在-80℃冷冻直至需要。
用多孔荧光蛋白微芯片免疫测定定量测定颤蛋白水平利
25微升的每位患者的血浆在75mL的测定缓冲液中稀释4倍，测定缓 冲液由PBS以及0.5％BSA和0.05％Tween-20组成。包含已知浓度的颤蛋 白的对照样品也在测定缓冲液中进行连续稀释以构建已知的标准曲线。稀 释的样品以及对照加入到载玻片上的各孔中，在其上不同的兔抗-颤蛋白 IgG捕获抗体保持距离斑点的形式已经印在上面。各孔包含多个斑点，每个 点相应于针对测量的不同的大小形式的颤蛋白的三种捕获抗体特异中的一 种，以二维的形式排列。除了固定个体捕获抗体以外，载玻片的各孔还用 PBS和1％BSA和0.1％Tween-20进行封闭。载玻片上的各孔中的稀释的样 品和对照在37℃在湿度室中孵育2小时。孵育后，吸干各孔并将孔用由PBS 和0.1％Tween-20组成的洗涤缓冲液洗涤4次。将孔吸水纸干燥后，向各 孔中加入100mL测定缓冲液，缓冲液包含0.5-5mg/ml的对所有三种测量 的大小形式颤蛋白广泛特异的生物素标记的兔抗-颤蛋白IgG抗体。然后将 载玻片在37℃在湿度室中孵育1小时。孵育后，吸干各孔并将孔用洗涤缓 冲液洗涤4次，将孔吸水纸干燥后。此时，向各孔中加入100mL的测定缓 冲液，缓冲液包含10-20mg/ml偶联荧光探针的链亲和素。然后将载玻片在 室温在湿度室中孵育1小时，吸干各孔并将孔用洗涤缓冲液洗涤4次，从 载玻片上小心地撤去各孔并将整个载玻片在去离子水中清洗并在氮气气流 下干燥。一旦干燥，将载玻片在激光共聚焦扫描仪中扫描，发射滤波器对 测定中使用的。链亲和素-荧光探针偶联物合适。得到载玻片的数字、双位 图像，并且利用微阵列图像分析软件测定所有点的强度。通过比较所述的 患者样品孔中各种个体颤蛋白斑点的强度以及已知的标准曲线孔中的相应 点的强度。就能够确定在各个患者或者对照样品中的各种大小形式的颤蛋 白的浓度。
分柝
通过比较所述的患者样品中每种不同的大小形式的颤蛋白(颤蛋白成分) 水平以及疾病-阴性对照样品中不同大小形式的水平，作出双相性精神障碍 病症诊断。所述的患者样品中一或者多种颤蛋白形式的水平相对于对照样 品的增加或者降低是患者中双相性精神障碍病症的指示。
治疗和监测
基于如上测定颤蛋白的水平，设计针对患者的治疗方案。通过以约0.2g/ 天～约1g/天剂量补充乳剂形式的DHA形式的食品，能够对患者实现治疗 性干预。监测患者的心理或者行为变化，并且每3个月获取血液样品以测 定循环的颤蛋白水平。根据患者持续的心理或者行为情形，以及其颤蛋白 水平，可以调节治疗以提供不同的剂量的DHA或者不同的DHA制剂以及 其他的脂质。
实施例4
该实施例证实了与野生型和杂合的动物或者雌性动物相比，雄性、纯合 的突变的reeler小鼠的颞叶中具有显著地升高的DHA含量，并且与野生型 和杂合的动物相比，纯合的突变的reeler动物具有显著地升高的颞叶ARA。
″Reeler小鼠″(rein1n)为对表达细胞外信号糖蛋白颤蛋白的基因纯合的隐 性小鼠，并且表现″突变的reeler表型″，并且由于颤蛋白水平的不足显示出 发育以及明显的运动的缺陷。颤蛋白在身体的各种组织中表达，包括脑、 肝脏、肾脏以及视网膜以及脊髓。由于颤蛋白是脑以及其他的组织中的DHA 水平的生物标志物，颤蛋白缺乏还能够通过治疗性使用DHA进行纠正。
如源自Jackson Laboratories，Bar Harbor，Maine中的材料所述，纯合的 reeler小鼠在约2周龄的时候显示共济失调步态、张力障碍的体态以及战栗。 这些突变体不能保持其后腿及臀部直立并且通常在运动中跌倒。生存能力 以及生殖力极大地降低。杂合子从视觉上不能与野生型对照区别并因此必 须进行基因型评估以证实存在reeler基因。行为表型是由于严重地小脑发育 不全所导致。
本发明者进行的下述研究判断颤蛋白是否能够充当中枢神经系统中长 链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)缺乏的基于血清生物标志物。
具体目标：为了评价正常或者异常颤蛋白表达小鼠的脑组织中的长链多 不饱和脂肪酸状况差异是否明显。
材料和方法：36只在6以及12周龄之间的动物用于该实验。该组包含 带有两个拷贝的颤蛋白基因突变的小鼠(纯合的，n＝12)；带有一个拷贝的颤 蛋白基因突变的小鼠(杂合的；n＝12)，以及在颤蛋白基因中无突变的小鼠(野 生型；n＝12，对照)。在各基因型组中，雄性和雌性的数量大约相等。通过 表型确定纯合的reeler突变的小鼠。杂合的reeler突变的小鼠和正常野生型 对照进行基因分型以确定。在研究过程中，小鼠喂食正常啮齿动物食物。
小鼠脑组织脂肪酸分析：小鼠脑组织直接分析脂肪酸含量。样品中的总 脂质进行皂化并转化成脂肪酸甲基酯然后分析。简言之，小鼠颞叶在-80℃ 冻存直至分析。分析前冻干样品。冻干样品直接称量到螺帽测试管中，玻 璃棒研磨成粉。包含内标(十九酸甲酯的1.0mL甲苯加入到样品中，同时加 入1.0mL的0.5N NaOH。将管充入氮气，密封，并在加热块中在约100℃ 加热约5分钟。移出管并使之冷却。向管中加入2mL的14％BF3的甲醇溶 液，向管中充入氮气并密封。将管在加热块中在约100℃加热约30分钟。 30分钟之后，移出管并使之冷却。向管中加入一毫升的饱和的氯化钠水溶 液并将管涡旋。分层并将有机层取出用于分析。在配备有焰离子化检测器 的Agilent Technologies气相色谱(型号5890)上，通过带有火焰离子化检测 (GLC-FID)的气-液色谱分析脂肪酸甲基酯。脂肪酸甲基酯在30米 FAMEWAX毛细管柱(Restek，Bellefonte，PA；0.25mm直径，0.25μm涂层 厚度)中进行分离，利用氦流速为2.0mL/分，裂分率为15∶1。色谱运行参 数包括加热室起始温度130℃，以5℃/分钟的速率增加至225℃，保持20 分钟，然后以15℃/分钟增加至250℃，最终保持5分钟。注射器以及检测 器分别恒定在220℃以及230℃。通过与源自NuCheck Prep(Elysian，MN， U.S.A.)的脂肪酸甲基酯标准混合物的保留时间进行比较确定各峰。单个的 脂肪酸表述为总脂肪酸的百分比(重量百分比)。
数据利用2-way全面线性模型ANOVA进行分析，p＜0.05。当存在相 互作用的时候，利用t-检测评估平均值之间的显著差异。
结果：
颞叶中的二十二碳六烯酸含量
主要结果：颞叶中的DHA含量的显示在表1中。在不同的颤蛋白表达 水平的小鼠的颞叶中的DHA脂肪酸组成方面差异不显著(P＝0.406)。雄性或 者雌性小鼠颞叶中的DHA脂肪酸组成没有差异(P＝0.267)。但是，不同的组 以及性别相互作用是明显的(P＝0.019)，使各基因型-性别亚组可以进行具体 的统计学比较。这种比较表明最高水平的颞叶DHA在纯合的雄性reelers 中是很明显的，并且最低水平的DHA存在纯合的雌性reelers中(P＝0.006)。
与杂合的雄性相比，纯合的雄性reeler小鼠具有显著地更高的颞叶DHA 含量，但是与野生型雄性相比并非如此。纯合的雌性动物中的颞叶DHA含 量没有显著地随基因型而呈现出差异。
表1：颞叶DHA含量(wt％，总脂肪酸) 野生型 纯合的 杂合的 所有的 雌性 雄性 19.51±0.24 19.62±0.39ab 19.40±0.31ab 19.62±0.21 19.10±0.25a 20.18±0.12b 19.29±0.15 19.34±0.29ab 19.22±0.11a
注意：平均值±sem表明不同的上标在p＜0.05的水平是显著地不同的；在为雄性动物的情形下， 野生型动物颞叶中的DHA含量低于纯合的动物，但是没有达到本研究规定的显著的水平(p＝0.055)。 纯合的雌性与纯合的雄性不同，p＜0.05。
结论：在颞叶中，雄性、纯合的突变的reeler小鼠具有显著地升高的 DHA含量。
结果：
颞叶中的花生四烯酸含量
主要结果：在不同的基因型的小鼠之间，颞叶DHA含量显著差异是明 显的(P＝0.004)。纯合的reeler动物具有更显著地颞叶ARA，与野生型动物 相比(P＜0.001)，但是与杂合的动物相比具有类似的颞叶ARA。杂合的小鼠 的颞叶ARA含量高于野生型动物，但是没有达到统计学显著的标准 (P＝0.061)。在雄性和雌性动物之间的颞叶ARA含量没有显著差异。
相互作用结果：在基因型和性别之间没有显著的相互作用。
表2：颞叶花生四烯酸含量(wt％，总脂肪酸) 野生型 纯合的 杂合的 所有的 雌性 雄性 9.43±0.16a 9.37±0.15 9.50±0.29 10.26±0.21b 10.05±0.27 10.48±0.16 9.87±0.16ab 9.77±0.31 9.98±0.06
数据为平均值±sem。与野生型或者杂合的基团相比，纯合的突变的reeler动物具有显著地升高 的颞叶ARA。在雄性和雌性动物之间颞叶的ARA含量不存在显著差异。
结论：纯合的突变的reeler动物具有显著地升高的颞叶ARA。
实施例5
下述实施例证实了在颤蛋白和红细胞HUFA状况之间的相互关系。具 体地，本发明者确定了具有不同的水平颤蛋白表达的动物是否在红细胞中 表现出不同的DHA和ARA含量。
材料和方法：(与上述实施例4相同)。
结果：
表3：性别/红细胞脂肪酸含量(wt％，总脂肪酸) 基因型 性别 (n) DHA (n) ARA 对照 对照 对照 Homo Homo Homo Hetero Hetero Hetero 雌性 雄性 所有的 雌性 雄性 所有的 雌性 雄性 所有的 6 6 12 6 6 12 6 5 11 4.92±0.39a 6.15±0.20a 5.54±0.28a 5.13±0.64a 6.13±0.32ac 5.63±0.37a 3.66±0.35bc 5.86±0.49a 4.66±0.44a 6 6 12 6 6 12 6 5 12 6.10±0.49ab 6.98±0.36a 6.54±0.32a 6.72±0.76b 7.84±0.28a 7.29±0.42a 4.61±0.40b 6.52±0.67a 5.56±0.47a
各栏中具有不同上标的平均值差异显著(P＜0.05)
总结：
RBC DHA
主要结果：在具有不同基因型的动物之间的RBC DHA含量没有观察到 统计学上显著差异。与雌性动物相比，雄性动物具有显著地更高的RBC DHA含量(6.06±0.76 vs 4.57±1.29％)。
相互作用结果：对于RBC DHA，在不同的基因型和性别之间没有检测 到显著的相互作用。
结论：不同的颤蛋白状况的小鼠中RBC DHA含量没有呈现出差异。 雄性的RBC DHA含量高于雌性RBC DHA的含量。
RBC ARA
主要结果：对于RBC ARA含量，在具有不同的基因型以及性别的动物 之间观察到统计学上显著差异，分别为(P＜0.01)以及(P＜0.005)。具有2个 拷贝的突变的颤蛋白基因的小鼠具有显著地更低水平的RBC ARA，与具有 1个拷贝的突变的颤蛋白基因的小鼠相比。与具有一个或者2个拷贝的突变 的颤蛋白基因的小鼠相比，野生型对照的RBC ARA含量差异不显著。与 雌性动物相比，雄性动物具有显著地更高的RBC ARA。
相互作用结果：对于RBC ARA，在不同的基因型和性别之间没有检测 到显著的相互作用。
结论：小鼠的RBC ARA含量被颤蛋白状况所限制。具有低颤蛋白状况 的小鼠倾向于具有低RBC ARA水平。与雌性相比，雄性动物倾向于显著地 更高的RBC ARA。
实施例6
下述实施例证实了对具有异常reeler基因表达的小鼠提供DHA能够减 少带有reeler显型症状的雄性后代的数目。在下述实验中，本发明者测试 了对缺乏一个或者多个正常颤蛋白基因的小鼠，LC-PUFA饮食富集(DHA) 是否纠正在颤蛋白-缺乏小鼠观察到的颤蛋白组织病理学/症状以及是否能 正常化脂肪酸谱。具体地，本发明者评价了富集长链多不饱和脂肪酸(DHA) 的饮食是否能够纠正或者调节颤蛋白-缺乏小鼠中的颤蛋白组织病理学/症 状。
材料和方法：颤蛋白给食研究由Martek Biosciences Corporation发起并 由Jackson Labs，Bar Harbor，Maine(Stock used：300235 B6C3Fe a/a-Reln /J)启动。杂合的雌性与杂合的雄性配对并接受下述两种实验饮食中的一种： DHA缺乏饮食(0％DHA重量；0.14％α亚麻酸重量)，或者DHA足量饮食 (0.462％DHA重量，含有0.115％α亚麻酸重量)。雌性在怀孕和哺乳期继续 接受特定的饮食。怀孕雌性生产的纯合的、杂合的和野生型幼仔放置在同 样的特定的母性饮食中使之断奶。记录在各饮食组中的reeler小鼠数。对没 有显现reeler表型的幼仔进行基因分型以确定其reeler基因状况。对在8和 14周龄之间的幼仔处死并收集组织用于脂肪酸分析。
结果：
DHA足量饮食：
出生的94只幼仔中，14只小鼠(10F，4M)观察具有reeler表型(14.8％)。 40只雄性中的4只(10％)表现reeler表型。54只雌性中的10只(18.5％)表现 出reeler表型。
DHA缺乏饮食：
出生的89只幼仔中19只小鼠(8F，11M)观察具有reeler表型(或者21.3％。 40只雄性中的11只(27.5％)表现reeler表型，而48只雌性中的8只(16.6％) 表现出reeler表型。
秩和分析表明与DHA缺乏饮食组相比，显著地在DHA足量饮食组中 出生的reeler小鼠更少。此外，秩和分析检测雄性reeler小鼠的出生率表明 在怀孕以及哺乳期间提供DHA以及在断奶之后对幼仔提供DHA以几乎3- 倍的方式降低雄性reeler动物出生率(P＝0.04)。DHA缺乏饮食组中，40只 雄性中的11只雄性，或者27.5％的雄性显示reeler表型，而DHA足量饮食 组中，40只雄性中只有4只，或者10％的雄性显示reeler表型。
表4：DHA足量和DHA缺乏饮食vs％Reeler表型 平均 喂食天数 出生 幼仔 雄性Reeler 小鼠表型％ 雌性Reeler 小鼠表型％ 总％ Reeler小鼠 DHA足量饮食 28 94 4/40(10％) 10/54(18.5％) 14/94(14.8％) DHA缺乏饮食 27 89 11/40(27.5％) 8/48(16.6％) 19/89(21.3％) DHA补充饮食的雄性reeler小鼠的出生率显著地低于DHA缺乏饮食的雄性reeler小鼠的出 生率。在饮食组之间，reeler小鼠(雄性加上雌性)的总的出生率没有表现出不同。
结论：在怀孕期间对颤蛋白-缺乏小鼠补充DHA能够充分地减少带有 reeler表型的雄性后代的数目。
实施例7：饮食DHA对红细胞脂肪酸含量的调节
下述实施例显示了处于颤蛋白状况以及饮食DHA暴露下的小鼠的红细 胞DHA和ARA中的变化。具体地，发明者确定了饮食含量是否能够纠正 不同的颤蛋白状况小鼠中的RBC的脂肪酸组合物的差异。由于发明者上 面显示了带有突变的颤蛋白基因表达的雄性小鼠倾向于具有异常高RBC ARA含量，确定了DHA补充是否能够调节带有突变的颤蛋白基因的雄性 小鼠RBCs中的ARA表达。
材料和方法：颤蛋白给食研究由Martek Biosciences Corp.发起并在 Jackson Labs，Bar Harbor，Maine(Stock used：300235 B6C3Fea/a-Reln/J) 启动。杂合的雌性与杂合的雄性配对并接受下述两种实验饮食中的一种： DHA缺乏饮食(0％DHA重量；0.14％α亚麻酸重量)，或者DHA足量饮食 (0.462％DHA重量，含有0.115％α亚麻酸重量)。雌性在怀孕和哺乳期继续 接受特定的饮食。怀孕雌性生产的纯合的、杂合的和野生型幼仔放置在同 样的特定的母性饮食中使之断奶。在6和12周龄之间的36只动物用于本 实验。所述的组包含带有2个拷贝的颤蛋白基因突变的小鼠(纯合的，n＝12)； 一个拷贝颤蛋白基因突变的小鼠(杂合的；n＝12)，以及在颤蛋白基因中没有 突变的小鼠(野生型；n＝12，对照)。在各基因型组中，雄性和雌性的数量大 约相等。记录在各饮食组中的reeler小鼠数。对没有显现reeler表型的幼仔 进行基因分型以确定其reeler基因状况。对在8和14周龄之间的幼仔处死 并收集组织用于脂肪酸分析。
小鼠红细胞的脂肪酸分析：提取小鼠红细胞(RBCs)并分析脂肪酸含量。 样品中的总脂质进行皂化并转化成脂肪酸甲基酯然后分析。简言之，RBCs 在-80℃冻存直至分析。包含内标(二十三酸甲酯)的50微升的氯仿加入到带 螺帽的测试管中。在氮气气流下蒸发氯仿。将约300微升样品加入到内标 中，同时加入1.5mL的1∶2氯仿∶甲醇。将管密封并涡旋约30秒。将管 放置在冰中超声约20分钟。20分钟后，取出管并向管中加入一毫升的氯仿 和一毫升水。将管涡旋约30秒并在约2000rpm离心约10分钟。将下层转 移至另一螺帽测试管中，并在氮气气氛下蒸发。向样品中加入1毫升甲苯， 同时加入1.0mL的0.5N NaOH。将管充入氮气、密封并在加热块中在约100 ℃加热约5分钟。移出管并使之冷却。向管中加入2mL的14％BF3的甲醇 溶液，向管中充入氮气并密封。将管在加热块中在约100℃加热30分钟。 30分钟之后，移出管并使之冷却。向管中加入一毫升的饱和的氯化钠水溶 液并将管涡旋。分层并将有机层取出用于分析。在配备有焰离子化检测器 的Agilent Technologies气相色谱(型号5890)上，通过带有火焰离子化检测 (GLC-FID)的气-液色谱分析脂肪酸甲基酯。脂肪酸甲基酯在30米 FAMEWAX毛细管柱(Restek，Bellefonte，PA；0.25mm直径，0.25μm涂层厚 度)中进行分离，利用氦流速为2.0mL/分，裂分率为15∶1。色谱运行参数 包括加热室起始温度130℃，以5℃/分钟的速率增加至225℃，保持20分 钟，然后以15℃/分钟增加至250℃，最终保持5分钟。注射器以及检测器 分别恒定在220℃以及230℃。通过与源自NuCheck Prep(Elysian，MN，U.S.A.) 的脂肪酸甲基酯标准混合物的保留时间进行比较确定各峰。单个的脂肪酸 表述为总脂肪酸的百分比(重量百分比)。
结果：
DHA
与喂食包含0.5％重量DHA的预制的饮食的动物相比，喂食预制的DHA 缺乏的饮食的动物显著地具有低水平的RBC DHA。纯合子以及雄性杂合子 更易于出现饮食DHA缺乏的作用，由于这些动物具有显著地更低水平的 RBC DHA，与喂食DHA缺乏饮食的野生型对照雄性和雌性以及杂合的雌 性动物相比。将DHA加入到饮食中显著地增加所有组中的RBC DHA水平。 但是，在带有突变的颤蛋白基因的雌性动物上，DHA补充饮食没有完全将 RBC DHA的水平恢复到在野生型对照动物中观察到的水平。具体地，喂食 DHA补充饮食的纯合的雌性具有显著地更低的RBC DHA，与喂食DHA足 量饮食的所有其他的基因型/性别小组相比。喂食DHA补充饮食的杂合的雌 性具有显著地更低的RBC DHA，与野生型对照雌性相比。雄性杂合的以及 纯合的动物中，DHA补充饮食恢复RBC DHA水平至在野生型雄性中观察 的类似的水平。
表5：红细胞/DHA含量(wt％，总脂肪酸) 平均值±SD 黄 平均值±SD 绿 DHA 缺乏饮食 (n) DHA 足量饮食 (n) 对照 对照 杂合的 杂合的 纯合的 纯合的 雌性 雄性 雌性 雄性 雌性 雄性 4.06±0.34a 3.60±0.06a 3.71±0.06a 3.29±0.10b 3.20±0.13b 2.94±0.30b 3 3 3 3 3 3 11.20±0.21c 10.92±0.45cd 10.12±0.25d 10.29±0.52cd 7.99±0.47e 10.23±1.17cd 4 3 3 3 5 3 a vs b a vs c，d，或者e b vs c，d或者e c vs d c或者d vs e d vs c P＜0.05 P＜0.0001 P＜0.001 P＜0.05 P＜0.0001 P＜0.0001
结论：带有1或者2拷贝颤蛋白基因的雌性动物的红细胞DHA含量通 过给食包含0.5％DHA重量的饮食不能完全正常化。当喂食包含0.5％DHA 重量的饮食的时候，带有1或者2拷贝的颤蛋白基因的雄性动物的RBC DHA含量以类似于野生型对照动物中的方式被调节。
ARA
喂食未预制的DHA的饮食动物的红细胞ARA水平显著地高于喂食包 含0.5％DHA重量饮食动物的RBC ARA水平。在喂食预制的DHA缺乏饮 食的动物中，野生型对照和杂合的reeler小鼠的RBC ARA水平显著地高于 在纯合的reeler小鼠中检测的水平。给食包含0.5％DHA的饮食抑制RBC ARA水平约2-倍并且消除了在基因型小组之间的RBC ARA水平的差异。 当动物喂食0.5％DHA重量的时候，RBC ARA水平在雄性和雌性动物之间 没有检测到显著差异，或者在基因型之间也没有检测到差异。
表6：红细胞/ARA含量(wt％总脂肪酸)
RBC ARA(wt％) 对照 杂合的 纯合的 a vs b DHA缺乏饮食 DHA足量饮食 平均值±sem (n) (n) 15.72±0.48b 6 6.84±0.61a 7 14.89±1.47b 6 6.45±0.77a 6 12.51±1.77c 5 6.14±0.95a 6 P＜0.0001 a vs c P＜0.0001 b vs c P＜0.001
结论：接受无预制DHA的饮食的动物倾向于具有高水平的RBC ARA。 低颤蛋白表达与低RBC DHA含量相关。饮食DHA抑制ARA掺入到RBC 膜中并补偿了野生型对照以及具有低颤蛋白表达的动物(即，杂合子和纯合 子)中的RBC ARA含量。
各篇参考文献以及公开这里以其整体引入作为参考。U.S.临时申请号 60/537,600，2004年1月19日提交，以及U.S.临时申请号60/605,219，27，2004 年8月27日提交，这里以其整体引入作为参考。
尽管本发明的各种实施方案已经进行了详细的描述，这些实施方案的 修改以及改写对本领域的普通技术人员而言是显而易见的。应该清楚地理 解为，这些修改以及改写都在如后续的权利要求阐释的本发明的范围之内。
颤蛋白，一种外源性信号传导糖蛋白质，在神经元移行、神经元定位中 发挥重要的作用，并且通过维持中枢以及外周神经系统中的放射神经胶质 系统作为发育调节因子。颤蛋白还参与神经细胞的正确迭片。在发育阶段， 在肝脏、肾脏、脑、脊髓以及视网膜中发现高水平的颤蛋白(D′Arcangelo等， Nature 374：719-723，1995)。但是，与许多其他的发育基因不同的是，颤蛋 白在整个生命过程中表达。
在发育的脑中与颤蛋白的水平有关的是脑脂质结合蛋白(BLBP)的水 平，后者充当脂肪酸结合蛋白(FABP)家族成员。Hartfuss等(Development， 2003；130，4597-4609)证实体外加入颤蛋白增加脑皮层中的BLBP含量。通 常见于发育的中枢以及外周神经系统的胶质细胞中，BLBP(或者脑-FABP) 似乎在一些脂质(例如，ω-3脂肪酸)的转运、沉积或者保护行储藏中发挥作 用以保证脂肪酸对发育的中枢神经系统(CNS)的持续供给(Ganesaratnam K. Balendiran等，2000The Journal of Biological Chemistry，275，No.35， 27045-27054)。
一种所述的基本的ω-3脂肪酸，DHA，(4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸； 22：6n-3)，是脑中最为丰富的n-3多不饱和脂肪酸(Williard等，Journal of Lipid Research，2001，42，1368-1376)。BLBP(脑-FABP)对DHA具有高度的亲 和力以及特异性，并且认为BLBP可以发挥保护DHA免受自由基过氧化的 作用(Ganesaratnam K.Balendiran等，2000)。
在罹患神经病病症的患者中发现了不同水平的颤蛋白。例如，根据 Fatemi等的报道(Neuroreport 2001 Oct 29；12(15)：3209-3215)，在罹患精神 分裂症、双相性精神障碍以及严重抑郁症的患者的脑中发现不同降低的水 平的颤蛋白。此外，Chen等(Nuclei Acids Res.2002 Jul 1：30(13)：2930-2939) 表明罹患精神分裂症或带有精神症状的双相性疾病的患者在脑中具有低于 正常值的颤蛋白水平。Persico等(Mol Psychiatry，2001 Mar；6(2)：150-159) 证实具有长变体颤蛋白基因(＞11GGC重复)的孤独症患者在脑中具有较低的 颤蛋白水平并且为孤独症提供了另外的治疗靶标。
针对预防、减少或治愈神经病或损伤的治疗传统上着眼于药物方法。例 如，持续开发出了减轻症状的神经精神病或神经退行性药物，但是仍然不 能减轻神经病问题的固有的原因。因此，本领域还需要新的治疗策略以用 于治疗神经病病症、疾病或损伤。
发明概述
本发明的一个实施方案涉及一种治疗颤蛋白缺乏或者机能不良的方法。 所述的方法包括对诊断患有或者怀疑具有颤蛋白缺乏或者机能不良的患者 给药一定量的选自ω-3 PUFA以及ω-6 PUFA，或者其前体或者其来源的多 不饱和脂肪酸(PUFA)，以补偿所述的患者中颤蛋白缺乏或者机能不良的作 用。在一个方面，颤蛋白缺乏或者机能不良与患者中的脂肪酸结合蛋白(例 如，脑脂质结合蛋白(BLBP))的表达或者功能的下降有关。
优选地，对患者给药PUFA：补偿所述的患者中降低的脂肪酸结合蛋白 或者其功能，补偿患者中降低的脑脂质结合蛋白或者其功能，改善所述的 患者中脂肪酸结合蛋白的活性，改善所述的患者中脑脂质结合蛋白作用机 制的至少一个参数，导致掺入到所述的患者中神经胶质细胞和神经元的磷 脂膜中的功能性DHA的增加，增加所述的患者中颤蛋白的水平，和/或改善 所述的患者中颤蛋白的活性。
根据本发明的方法治疗的患者包括罹患与颤蛋白缺乏或者机能不良相 关联的疾病或者病症或者处于罹患的风险中的患者，从而对患者给药PUFA 改善所述疾病或者病症的至少一种症状，或者预防或者延迟所述疾病或者 病症的发作。一个方面，所述的患者具有神经疾病或神经精神疾病，怀疑 具有神经疾病或神经精神疾病，或者处于发展的风险中。另一方面，所述 的患者罹患癫痫发作。另一方面，所述的患者具有下述疾病，怀疑具有下 述疾病，或处于发展下述疾病的风险中：与神经病机能不良有关的自体免 疫疾病。在另一方面，所述的患者具有抗-磷脂疾病(anti-phospholipid disorder)。另一方面，所述的患者具有下述疾病，怀疑具有下述疾病，或处 于发展下述疾病的风险中，所述的疾病选自精神分裂症、双相性精神障碍、 诵读困难、运动障碍、注意力不集中的过度反应症(ADHD)、癫痫、孤独症、 帕金森病、老年痴呆、阿耳茨海默(氏)病、过氧化物酶体增殖子激活疾病 (PPAR)、多发性硬化症、糖尿病诱导的神经疾病、黄斑变性、早产儿视网 膜病、亨延顿(氏)舞蹈病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、色素性视网膜炎、脑性 麻痹、肌肉萎缩症、癌症、囊性纤维化病、神经管缺陷、抑郁症、泽韦格 综合征、无脑回、唐氏综合征、肌肉-眼睛-脑疾病、Walker-Warburg综合征、 Charoct-Marie-Tooth疾病、包涵体肌炎(IBM)以及Aniridia。在另一方面，所 述的患者具有甲状腺疾病。
在该实施方案的一个方面，在给药步骤之前，所述的方法包括测量源自 患者的生物样品中的颤蛋白的含量或者生物活性。例如，所述的方法能够 包括比较所述的患者样品中的颤蛋白以及同样类型样品中的颤蛋白的基线 量，其中与基线量相比所述的患者样品中颤蛋白量的变化表明所述的患者 具有颤蛋白缺乏。测量步骤能够利用下述方法进行，所述的方法包括但不 限于：mRNA转录分析、蛋白质印迹、免疫印迹、酶-联免疫吸附测定(ELISA)、 放射免疫测定(RIA)、免疫沉淀反应、表面等离振子共振、化学发光、荧光 偏振、磷光、免疫组织化学分析、基质-辅助激光解吸/离子时间飞行 (MALDI-TOF)质谱、微细胞术、微阵列、显微镜、荧光激活细胞分选(FACS)、 流式细胞术、以及蛋白质微芯片或微阵列。
在一个方面，所述的方法能够包括下述步骤：测定患者中不同的颤蛋白 大小形式的相对的表达或活性以建立患者样品中的颤蛋白大小形式谱，并 比较所述的患者颤蛋白大小形式谱以及同样类型的样品中的颤蛋白大小形 式基线谱，其中与基线谱中大小形式相对表达或活性相比，一或多种颤蛋 白大小形式表达的变化的变化表明所述的患者具有颤蛋白缺乏或机能不 良。测量步骤能够利用但不限于选自下列的技术进行：mRNA转录分析、 蛋白质印迹、免疫印迹以及毛细管电泳。
另一方面，所述的方法能够包括包括比较患者样品中颤蛋白的活性以及 同样类型样品中的颤蛋白的基线活性，其中与基线水平相比，患者样品中 颤蛋白活性水平的变化表明所述的患者具有颤蛋白机能不良。测量活性的 步骤通过选自但不限于下列的技术实现：受体-配体测定和磷酸化测定。
在另一方面，所述的方法能够包括测量患者样品中促甲状腺素(TSH)的 水平并且比较患者样品中TSH的量以及同样类型样品中的TSH基线量，其 中与基线量相比，患者样品中TSH的量的变化表明所述的患者具有TSH缺 乏。在该方面，所述的方法还包括对患者给药甲状腺药物联合PUFA。
在上述方法中，当得到生物样品的时候，所述的样品能够包括但不限于： 细胞样品、组织样品以及体液样品，但是特别优选血液样品。
在该实施方案的一个方面，所述的方法还能够包括在给药步骤之后至少 一次监测给药PUFA对患者中颤蛋白水平或生物活性的效果；或者还包括 在给药步骤之后至少一次监测给药PUFA对患者中颤蛋白一或多种大小形 式的表达或生物活性变化的效果。在这些方面，所述的方法还能够包括基 于监测的效果治疗的结果调整后续治疗中对患者给药PUFA的步骤。
本发明的另一实施方案涉及一种调节组织或流体颤蛋白表达的方法。所 述的方法包括对患者给药一定量的选自ω-3 PUFA以及ω-6 PUFA，或前体 或其来源的多不饱和脂肪酸(PUFA)，有效调节患者的组织或流体中的颤蛋 白表达。一个方面，其中PUFA的量足以增加患者组织或流体中颤蛋白的 表达。
本发明的另一实施方案涉及一种预防、减少或延缓视网膜发育缺陷或病 症的发作的方法。所述的方法包括包括对所述的患者给药选自ω-3 PUFA以 及ω-6 PUFA，或前体或其来源的多不饱和脂肪酸(PUFA)，有效预防、减少 或延缓视网膜发育缺陷或病症的发作并以补偿患者中颤蛋白缺乏或机能不 良的作用。
本发明的另一实施方案一种预防、减少或延缓与颤蛋白缺乏或机能不良 有关的发育缺陷或病症的发作的方法。所述的方法包括：a)测量源自患者的 生物样品中颤蛋白的表达或生物活性；b)对所述的患者给药选自ω-3 PUFA 以及ω-6 PUFA，或前体或其来源的多不饱和脂肪酸(PUFA)，其中PUFA的 给药量基于颤蛋白样品中表达或生物活性进行确定。一个方面，测量颤蛋 白表达或活性的步骤还包括测定样品中单个颤蛋白大小形式的相对表达或 活性。一个方面，其中对所述的患者给药PUFA的量通过下述步骤确定： 比较患者样品中颤蛋白表达或生物活性的水平以及相应于推荐剂量的 PUFA的颤蛋白表达或活性基线水平，并相应地调节针对所述的患者的 PUFA剂量。在该方面，当患者中颤蛋白的表达或生物活性低于基线水平的 时候，对所述的患者给药的PUFA的量相对于推荐剂量的PUFA增加。在另 一方面，其中对所述的患者给药PUFA的量通过下述步骤确定：比较患者 样品中不同的颤蛋白大小形式的表达或活性以及相应于推荐剂量的PUFA 的颤蛋白大小形式的基线谱，并相应地调节针对所述的患者的PUFA。在这 方面，针对所述的患者给药PUFA的量相对于推荐剂量的PUFA增加，当患 者样品中一或多种颤蛋白大小形式的相对表达或活性不同于基线谱中颤蛋 白大小形式的相对表达或活性的时候。源自所述的患者的生物样品中的颤 蛋白表达或生物活性的测量步骤在对患者给药PUFA后重复一或多次。其 中对所述的患者给药PUFA的量根据患者中颤蛋白表达或生物活性的重复 测量进行调节。其中源自所述的患者的生物样品中颤蛋白表达或生物活性 的测量步骤在患者的生命一部分时间或患者的整个生命过程中间歇重复， 并且其中对所述的患者给药PUFA的量相应于患者中颤蛋白表达或生物活 性的每次新的测量进行调节。其中患者中颤蛋白的表达或生物活性基本正 常，并且其中PUFA以增补剂进行给药以预防或减少颤蛋白缺乏或机能不 良的发展的风险。利用该方法治疗的患者包括但不限于：怀孕女性、泌乳 女性、成人、儿童或青少年、胚胎或胎儿，并且其中通过将PUFA给药予 胚胎或胎儿的母亲对胚胎或胎儿给药PUFA。其中所述的患者具有或处于发 展与颤蛋白缺乏或机能不良或脂肪酸结合蛋白缺乏有关的神经疾病或神经 精神疾病的风险中；其中所述的患者具有或处于发展与颤蛋白缺乏或机能 不良或脂肪酸结合蛋白缺乏有关的自体免疫疾病的风险中。其中所述的患 者具有或处于发展与颤蛋白缺乏或机能不良或脂肪酸结合蛋白缺乏有关的 发育缺陷的风险中。
本发明的另一实施方案一种监测患者脑中DHA水平的方法。所述的方 法包括测量来自所述的患者的生物样品中的颤蛋白表达或生物活性水平并 且基于颤蛋白的测量估计所述的患者脑中的DHA水平。一个方面，所述的 方法还包括对所述的患者给药一定量的相应于颤蛋白表达或生物活性的测 量水平的DHA。优选地，其中DHA的给药量足以补偿患者中脑脂质结合 蛋白的降低的表达或活性或以改善患者中脑脂质结合蛋白的活性。所述的 方法还能够包括比较源自所述的患者的生物样品中的颤蛋白表达或生物活 性的水平以及颤蛋白表达或生物活性的基线水平，其中颤蛋白表达或生物 活性的基线水平与研究对象脑中的DHA基线水平相关，其中基线水平通过 选自如下的方法建立：a)对源自患者的先前样品的颤蛋白表达或活性的在先 测量，建立颤蛋白表达或活性的基线水平，其中先前样品为同样的细胞类 型、组织型或体液型；以及b)利用源自与患者样品同样的细胞类型、组织 型或体液型对照样品，建立颤蛋白表达或活性的基线水平，对照样品从匹 配的单体群获得。与DHA的基线水平相比，所述的患者脑中的估计的低水 平的DHA表明所述的患者应该给药一定量的DHA以补偿患者脑中的DHA 水平。
本发明的另一实施方案涉及一种诊断患者中DHA缺乏的方法。所述的 方法包括下述步骤：a)测量源自患者的生物样品中的颤蛋白表达或生物活 性；b)比较所述的生物样品中颤蛋白表达或生物活性以及颤蛋白的基线水 平；以及c)进行患者的诊断，其中与颤蛋白表达或生物活性基线水平相比， 检测出所述的生物样品中的颤蛋白表达或生物活性的水平差异，表明患者 中DHA缺乏的阳性诊断。一个方面，其中与颤蛋白表达或生物活性基线水 平相比，所述的生物样品颤蛋白表达或生物的活性较低水平的检测，表明 患者中DHA缺乏的阳性诊断。所述的生物样品选自细胞样品、组织样品以 及体液样品。并且优选地血液样品。步骤(a)的测量包括测量颤蛋白的mRNA 转录，例如通过通过选自逆转录酶-PCR(RT-PCR)、原位杂交、Northern印 迹、序列分析、微阵列分析以及报告基因的检测的方法进行。步骤(a)的测 量包括测量颤蛋白蛋白表达，例如利用选自下述的方法进行：免疫印迹、 酶-联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫沉淀反应、表面等 离振子共振、化学发光、荧光偏振、磷光、免疫组织化学分析、基质-辅助 激光解吸/离子时间飞行(MALDI-TOF)质谱、微细胞术、显微镜、荧光激活 细胞分选、流式细胞术以及蛋白质微芯片或微阵列。步骤(a)的测量包括测 量颤蛋白的生物活性，利用选自受体-配体测定以及磷酸化测定的方法进行。
在该实施方案的一个方面，基线水平利用选自下述的方法建立：a)建立 源自患者的自体同源对照样品中的颤蛋白表达或活性的基线水平，其中自 体同源样品为与步骤(a)样品同样的细胞类型、组织型或体液型；b)建立颤蛋 白表达或活性的基线水平，所述的基线水平为源自患者的先前样品中的颤 蛋白表达或活性至少两次先前测量，其中每次的先前样品为与步骤(a)样品 同样的细胞类型、组织型或体液型，并且其中先前测量得到阴性的诊断； 以及c)利用源自与步骤(a)样品同样的细胞类型、组织型或体液型的对照样 品建立颤蛋白表达或活性的基线水平，对照样品已经从匹配的单体群中得 到。
本发明的另一实施方案涉及一种预测HUFA掺入到患者的磷脂膜中的 功效的方法。所述的方法包括下述步骤：a)测量源自患者的生物样品中颤蛋 白表达或生物活性；b)比较所述的生物样品的颤蛋白表达或生物活性以及颤 蛋白的基线水平；并且c)预测所述的患者的HUFA掺入到磷脂膜中的功效， 其中与颤蛋白表达或生物活性基线水平相比，所述的生物样品中颤蛋白表 达或生物活性水平的差异表明所述的患者有效地掺入HUFA到磷脂膜中的 预测能力的修正。一个方面，所述的方法还包括对患者开出一定量的HUFA 处方，其中所述的量基于所述的患者的有效地掺入HUFA到磷脂膜中的预 测能力确定。
本发明的另一实施方案涉及一种对怀孕以及哺乳期的女性增补PUFAs 的方法。所述的方法包括下述步骤：a)测量或源自胎儿或儿童的双亲之一或 二者的生物样品中的颤蛋白表达或生物活性；b)对胎儿或儿童的母亲给药选 自ω-3 PUFA以及ω-6 PUFA，或前体或其来源的多不饱和脂肪酸(PUFA)， 其中PUFA的给药量基于源自双亲的颤蛋白样品中的表达或生物活性测量 而确定，其中PUFA增补女性以及其胎儿或儿童中的PUFA。优选地，其中 PUFA的给药量足以补偿胎儿或儿童中的降低的脑脂质结合蛋白表达或活 性或改善胎儿或儿童中脑脂质结合蛋白的活性。
一个方面，其中PUFA的给药量足以降低生产患有颤蛋白缺乏或机能不 良婴儿尤其是男性婴儿的风险。另一方面，PUFA的给药量足以预防、延缓 母亲、儿童或胎儿孤独症的发作或减少症状；或者PUFA的给药量足以预 防、延缓母亲、儿童或胎儿的神经元移行病症的发作或减少症状；或者PUFA 的给药量足以预防、延缓母亲、儿童或胎儿中与颤蛋白缺乏或机能不良有 关的症状的发作或减少症状。
本发明的另一实施方案涉及一种增补怀孕以及哺乳期女性中的PUFAs 以降低生产具有或处于发展为颤蛋白缺乏或机能不良的婴儿的风险的方 法。所述的方法包括下述步骤：a)鉴别怀孕女性怀孕的胎儿性别；b)在怀孕 以及哺乳期的整个阶段或者部分阶段给药选自ω-3 PUFA以及ω-6 PUFA， 或前体或其来源的多不饱和脂肪酸(PUFA)以降低出生时候带有颤蛋白缺乏 或机能不良的胎儿或出生后发展为颤蛋白缺乏或机能不良的婴儿的风险， 其中与女性胎儿为相比，对男性胎儿给药PUFA增加。
本发明的另一实施方案涉及一种预防、延缓儿童中与颤蛋白缺乏或机能 不良有关的症状或疾病的发作或减少症状的方法。所述的方法包括下述步 骤：a)测量源自儿童的生物样品中的颤蛋白的表达或生物活性；以及b)对儿 童给药选自ω-3 PUFA以及ω-6 PUFA，或前体或其来源多不饱和脂肪酸 (PUFA)，其中PUFA的给药量基于样品中颤蛋白表达或生物活性的测量进 行确定。一个方面，PUFA以婴儿制剂提供，增补包括DHA和ARA的脂肪 酸。一个方面，PUFA的给药量足以补偿儿童中脑脂质结合蛋白降低的表达 或活性或改善儿童中脑脂质结合蛋白的活性；足以预防、延缓孤独症的发 作或减少症状；或者足以预防、延缓神经元移行病症的发作或减少症状。
本发明的另一实施方案涉及一种预防、延缓与低分子量颤蛋白表型有关 的阿耳茨海默(氏)病的发作或减少症状的方法。所述的方法包括下述步骤： a)鉴别患有颤蛋白缺乏或机能不良的患者，包括带有低分子量颤蛋白表型的 患者；以及b)对所述的(a)中的患者给药选自ω-3 PUFA以及ω-6 PUFA，或 前体或其来源的多不饱和脂肪酸(PUFA)以足以补偿患者中颤蛋白缺乏或机 能不良的效果。
本发明的另一实施方案涉及一种上调患者中脂肪酸结合蛋白的方法。所 述的方法包括包括对患者给药选自ω-3 PUFA以及ω-6 PUFA，或前体或其 来源的多不饱和脂肪酸(PUFA)以有效上调FABP。
本发明的另一实施方案涉及一种上调患者中脂肪酸结合蛋白的方法，包 括对所述的患者给药选自ω-3 PUFA以及ω-6 PUFA，或前体或其来源的多 不饱和脂肪酸(PUFA)以有效上调颤蛋白表达或活性。
本发明的另一实施方案涉及一种改善患者中神经元移行的方法，包括对 所述的患者给药选自ω-3 PUFA以及ω-6 PUFA，或前体或其来源的多不饱 和脂肪酸(PUFA)以有效患者中改善神经元移行。在该方面，神经元移行通 过测量患者中颤蛋白表达或活性的水平进行测量。神经功能利用例如成像 技术以及表型评价进行。
本发明的另一实施方案涉及一种鉴别神经祖细胞细胞的方法，包括检测 细胞群中的颤蛋白表达或生物活性，其中确定水平的颤蛋白表达或生物活 性与神经祖细胞细胞相关。所述的方法还能够包括选择检测了颤蛋白表达 或生物活性的神经祖细胞。
本发明的另一实施方案涉及一种监测神经发育的方法。所述的方法包括 下述步骤：a)提供包括神经祖细胞细胞的细胞群；b)检测细胞群中的颤蛋白 表达或活性；c)将细胞群暴露在神经祖细胞将发展为分化的神经细胞的条件 下；并且d)监测经过步骤(c)之后的细胞中的颤蛋白的表达或活性，以评价 神经祖细胞向分化的神经细胞的发育。所述的方法还能够包括还包括在步 骤(b)之前或同时将步骤(a)的细胞群与推定的发育调节化合物接触，并测定 推定的调节化合物是否影响神经祖细胞向分化的神经细胞的发育，通过检 测细胞群中的颤蛋白表达或活性。
本发明的另一实施方案涉及一种治疗或预防与脂肪酸结合蛋白缺乏或 机能不良有关的疾病的方法。所述的方法包括下述步骤：a)鉴别带有至少一 种脂肪酸结合蛋白的表达或活性降低的患者；以及b)对所述的患者给药多 选自ω-3 PUFA以及ω-6 PUFA，或前体或其来源的不饱和脂肪酸(PUFA)， 给药量足以补偿所述的脂肪酸结合蛋白的降低表达或活性的效果。一个方 面，其中所述的脂肪酸结合蛋白为脑脂质结合蛋白(BLBP)。一个方面，所 述的脂肪酸结合蛋白为心脏中的脂肪酸结合蛋白。
本发明的另一实施方案为一种治疗或预防与降低脂肪酸结合蛋白受体 的活性或机能不良有关的疾病的方法。所述的方法包括下述步骤：a)鉴别带 有脂肪酸结合蛋白受体降低的活性或机能不良的患者；以及b)对所述的患 者给药选自ω-3 PUFA以及ω-6 PUFA，或前体或其来源的多不饱和脂肪酸 (PUFA)，给药量足以补偿降低的脂肪酸结合蛋白受体的活性或机能不良的 效果。
本发明的另一实施方案涉及一种药物组合物，包括一定量的选自ω-3 PUFA以及ω-6 PUFA，或前体或其来源的多不饱和脂肪酸(PUFA)，以及至 少一种治疗化合物以用于治疗或预防与颤蛋白缺乏有关的疾病，足以补偿 患者中脂肪酸结合蛋白降低的表达或活性，所述的患者具有或处于发展颤 蛋白缺乏的风险中。一个方面，治疗化合物为甲状腺药物。
本发明的另一实施方案涉及一种诊断患者中DHA缺乏的方法。所述的 方法包括下述步骤：a)测量源自患者的生物样品中的颤蛋白表达或生物活 性；b)比较所述的生物样品的颤蛋白表达或生物活性以及颤蛋白的基线水 平；c)测量源自患者的生物样品中的促甲状腺素(TSH)表达或生物活性；d) 比较所述的生物样品的TSH表达或生物活性以及TSH的基线水平；以及e) 进行患者的诊断，其中与颤蛋白表达或生物活性基线水平相比，所述的生 物样品中颤蛋白表达或生物活性的水平检测出差异，并且其中与TSH表达 或生物活性基线水平相比，检测出所述的生物样品中TSH表达或生物活性 的水平的差异，表明患者中DHA缺乏的阳性诊断。生物样品所述的生物样 品选自细胞样品、组织样品以及体液样品。一个方面，所述的患者为怀孕 的或怀疑为怀孕的。
本发明的另一实施方案涉及一种增补怀孕以及哺乳期女性PUFAs的方 法。所述的方法包括下述步骤：a)测量源自胎儿或儿童的母亲生物样品中的 颤蛋白的表达以及生物活性；b)测量所述的生物样品中的促甲状腺素表达或 生物活性；c)对胎儿或儿童的母亲给药选自ω-3 PUFA以及ω-6 PUFA，或前 体或其来源多不饱和脂肪酸(PUFA)，其中PUFA的给药量基于源自母亲颤 蛋白样品中表达或生物活性的测量，其中PUFA增补女性以及其胎儿或儿 童中的PUFA；以及d)对胎儿的母亲或儿童给药至少一种甲状腺药物，如果 源自母亲样品中的颤蛋白和促甲状腺素的测量低于颤蛋白和促甲状腺素的 基线水平。
本发明的另一实施方案涉及一种诊断胎儿神经发育疾病的方法。所述的 方法包括下述步骤：a)测量源自胎儿的羊膜流体样品中的颤蛋白表达或生物 活性；b)比较样品中的颤蛋白表达或生物活性以及颤蛋白的基线水平；以及 c)进行胎儿的诊断，其中与颤蛋白表达或生物活性基线水平相比，检测出样 品中颤蛋白表达或生物活性的水平的差异，表明胎儿神经发育疾病的阳性 诊断。一个方面，对(c)中的阳性诊断胎儿在子宫内给药一定量的颤蛋白或 颤蛋白基因足以治疗神经发育疾病。另一方面，其中对(c)中的阳性诊断的 胎儿出生后给药一定量的颤蛋白足以治疗神经发育疾病，例如以婴儿制剂 给药。
本发明的另一实施方案涉及一种营养增补剂或口服药物，包括一定量的 颤蛋白足以延缓或预防颤蛋白-缺乏或机能不良或与之相关的疾病或病症的 发展。一个方面，增补剂或者药物以婴儿剂型的形式提供。另一方面，其 中增补剂或者药物通过婴儿的母亲产生的乳汁对婴儿提供，其中婴儿的母 亲在哺乳期之前或期间增补颤蛋白。
在上述的各方法中，当给药PUFA的时候，一个方面，其中PUFA为高 度不饱和脂肪酸(HUFA)。另一方面，其中PUFA选自花生四烯酸(ARA)、 二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)和二十二碳五烯酸(DPA)。另一 方面，PUFA选自ARA、EPA和DHA。在另一方面，PUFA为DHA。另一 方面，PUFA的来源选自：鱼油、海藻和植物油。在另一方面，当其中PUFA 为DHA的时候，其中DHA的前体选自：α-亚麻酸(LNA)、二十碳五烯酸 (EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)，以及选自LNA、EPA和DPA的前体的混合 物。另一方面，其中PUFA以下述形式给药选自：包括甘油三酯形式PUFA 的高度纯净的海藻油、包括PUFA的甘油三酯油、包括PUFA的磷脂、包括 PUFA的蛋白质和磷脂组合、干燥的海洋微藻、包括PUFA的鞘脂类、酯、 游离的脂肪酸、PUFA与其他的生物活性分子偶联物及其组合。所述的生物 活性分子选自蛋白质、氨基酸、药物和糖。一个方面，其中PUFA经口服 给药。另一方面，其中PUFA以包括PUFA或前体或其来源的制剂给药，所 述的制剂选自：咀嚼片剂、速溶片剂、泡腾片剂、可重构粉末、酏剂、液 体、溶液、混悬剂、乳剂、片剂、多层片剂、双层片剂、胶囊、软明胶胶 囊、硬明胶胶囊、囊片(caplet)、锭剂、咀嚼锭剂、小珠(bead)、粉末、颗粒 (granule)、粒(particle)、微粒(micro-particle)、可分散颗粒、扁囊剂、灌肠剂、 栓剂、乳膏剂、局用剂型、吸入剂、气雾吸入剂、贴剂、粒吸入剂、植入 剂、长效植入剂、可吸收剂、注射剂、输液剂、health bars、糖膏剂、米粉、 米粉敷料、食品、营养食品、功能性食品及其组合。在该方面，PUFA以选 自下述形式的制剂提供：包括PUFA的高度纯净的海藻油、包括PUFA的甘 油三酯油、包括PUFA的磷脂、蛋白质以及包括PUFA的磷脂的组合物、包 括PUFA的干燥的海洋微藻，包括PUFA的鞘脂类、PUFA的酯、游离脂肪 酸、PUFA与另一种生物活性分子的复合物，及其组合。其中PUFA以约 0.05mg的PUFA每公斤患者体重至约200mg的PUFA每公斤患者体重的剂 量进行给药。另一方面，PUFA能够组合一种或者多种其他的治疗化合物对 患者或者对象给药用于治疗与颤蛋白缺乏或者机能不良有关的病症。
发明详述
本发明一般性地涉及一种利用脂肪酸补充的方法，并且具体地，ω-3和 /或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA)补充(例如，DHA)以减轻或者补偿颤蛋白缺 乏或者机能不良的作用以及体内脂肪酸结合蛋白降低的水平，并且在一个 实施方案中，为脑中。本发明的方法优选地以预防与颤蛋白缺乏或者机能 不良和/或降低的脂肪酸结合蛋白有关的各种疾病和病症、延迟发作，或者 治疗，为患者提供益处。更具体地，本发明涉及用PUFAs例如DHA补充 患者以减轻或者补偿降低的脑脂质结合蛋白并且补偿脑中由低水平引起的 或者与低水平相关中不适当的神经移行，糖蛋白颤蛋白不适当的表达或者 失调。不适当的神经元移行与多种神经病症相关包括诵读困难、运动障碍、 癫痫发作、癫痫以及注意力不集中的过度反应症(ADHD)以及精神病症如精 神分裂症、双相性精神障碍、抑郁症、Zellweger综合征、无脑回病、唐氏 综合征、肌肉-眼睛-脑疾病、Walker-Warburg综合征、Charoct-Marie-Tooth 疾病，包涵体肌炎(IBM)以及Aniridia。
正确的功能性颤蛋白信号通路对发育的脑的脑皮质中的正确的神经元 移行非常重要。该通路中的偏离能够引起放射神经胶质细胞和星形胶质细 胞中的多不饱和的脂肪酸-特异结合蛋白或者脑脂质结合蛋白(BLBP)的低 表达，导致缩短的放射神经胶质作用延伸以及由此导致的不适当的神经移 行。不受理论束缚，本发明者认为表达BLBP以储存并保护发育的脑中的 多不饱和的脂肪酸，并且具体地DHA，免受氧化以及磷脂酶活性。在本发 明中，ω-3脂肪酸补充剂对患有颤蛋白缺乏和/或失调患者提供以弥补低 BLBP表达的作用，通过对脑提供正确的量的功能性DHA，后者能够掺入 到发育的神经胶质细胞和神经元的磷脂膜中。
因此，在一个实施方案中，本发明一般性地涉及一种测量作为生物标志 物的颤蛋白的方法，以非破坏性地评估或预测在目前无法接近或难以接近 的脑中以及其他部位的DHA水平，后者为中枢神经系统(CNS)中的关键成 分。例如，颤蛋白大小形式(颤蛋白成分)，包括颤蛋白表达和/或生物活性 水平能够定量测量推断脑中的DHA水平的相对量。这种测量能够用来间接 地跟踪个体整个生命过程中的脑中的DHA水平并用作。在生命周期的一些 点上需要用DHA进行营养干预的指标。在本发明之前，在不潜在地伤害患 者的条件下，难以评估脑中的DHA水平。
本发明还涉及一种预防、延缓颤蛋白缺乏或机能不良和/或与颤蛋白缺 乏或机能不良有关的疾病或病症的发作或进行治疗的方法，包括对诊断具 有或怀疑患有颤蛋白缺乏或机能不良的患者给药一定量的PUFA，并且尤其 是ω-3 PUFA，以及更具体地，二十二碳六烯酸(DHA)或前体或其来源，以 补偿患者中颤蛋白缺乏或机能不良的效果。在本发明之前，尽管已经建议 DHA用于治疗一些神经退行性病症，但是没有认识到存在能够预测给药 DHA或者其他的PUFA特别有效的患有神经退行性病症特定的患者群。本 发明通过测量患者中颤蛋白的水平可以确定这样的患者。
本发明还涉及一种预防或减少与颤蛋白机能不良或缺乏有关的发育缺 陷或病症的方法，通过补充使用多不饱和脂肪酸(PUFAs-具有两个或多个双 键的不饱和脂肪酸)，并且尤其是高度不饱和脂肪酸(HUFAs-具有三个或多 个双键的不饱和脂肪酸)，并且更具体地HUFA选自花生四烯酸(ARA)、二 十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)以及二十二碳五烯酸(DPA)，以及 更具体地ω-3 HUFAs，以及更具体地DHA，以达到：补偿患者中降低的脂 肪酸结合蛋白或其功能；补偿患者中降低的脑脂质结合蛋白或其功能；改 善患者中脂肪酸结合蛋白的活性；增加患者中脑脂质结合蛋白(BLBPs)的表 达；改善患者中脑脂质结合蛋白作用机制的至少一个参数；克服中枢神经 系统(CNS)结构中的DHA缺乏并且改善其导致的功能；增加功能性DHA以 及其他的PUFAs向患者中胶质细胞以及神经细胞磷脂膜中的掺入；增加颤 蛋白的水平和/或改善患者中颤蛋白的活性；和/或改善与颤蛋白缺乏或机能 不良有关的疾病或病症的至少一种症状。
本发明的具体的实施方案包括，但不限于，在怀孕和/或哺乳期补充至 少一种PUFA和/或前体或者其来源以预防与儿童中颤蛋白缺乏或者机能不 良相关的病症(例如，孤独症、神经移行病症)；对带有低分子量颤蛋白表型 的成人补充以预防多种病症和疾病、减少发作，或者治疗，包括但是不限 于：神经病症或者神经精神病症、癫痫发作以及与神经机能不良相关的自 体免疫病症，或者抗-磷脂病症。所述的病症以及疾病更具体地包括，但不 限于：精神分裂症、双相性精神障碍、诵读困难、运动障碍、注意力不集 中的过度反应症(ADHD)、癫痫、孤独症、帕金森病、老年痴呆、阿耳茨海 默(氏)病、过氧化物酶体增殖子激活疾病(PPAR)、多发性硬化症、糖尿病诱 导的神经疾病、黄斑变性、早产儿视网膜病、亨延顿(氏)舞蹈病、肌萎缩侧 索硬化(ALS)、色素性视网膜炎、脑性麻痹、肌肉萎缩症、癌症、囊性纤维 化病、神经管缺陷、抑郁症、泽韦格综合征、无脑回、唐氏综合征、肌肉- 眼晴-脑疾病、Walker-Warburg综合征、Charoct-Marie-Tooth疾病、包涵体肌 炎(IBM)以及Aniridia。
在一个本发明的实施方案中，增补怀孕以及哺乳期女性中的PUFAs以 降低生产具有或处于发展为颤蛋白缺乏或机能不良的婴儿的风险。一个方 面，PUFA补充特别可以用于降低生产具有或处于发展为颤蛋白缺乏或机能 不良的男性婴儿的风险。在一个本发明的实施方案中，在对怀孕雌性补充 PUFA之前，首先确定胎儿的性别。本发明者已经发现PUFA补充能够减少 出生患有颤蛋白缺乏或者机能不良的婴儿的风险，并在本发明的一个方面， 当胎儿为雄性的时候，这种效果特别有效。在该实施方案中，怀孕雌性在 怀孕以及哺乳期的整个阶段或者部分阶段给药选自ω-3 PUFA以及ω-6 PUFA。与如果怀孕雌性怀有雌性胎儿相比，如果怀孕雌性怀有至少一个雄 性胎儿，则PUFA补充可以增加的。
本发明还涉及一种测量颤蛋白和促甲状腺素(TSH)的方法以非破坏性地 评估或者预测患者中的DHA水平是否应该补充，并且尤其在怀孕期间。甲 状腺是大反馈过程的一部分。脑中的下丘脑释放促甲状腺激素释放激素 (TRH)。TRH的释放“告诉”脑垂体释放促甲状腺素(TSH)。TSH，在血液 中循环，然后引起甲状腺制造甲状腺激素并释放进入血液中。TSH能够增 加颤蛋白的产生。因此，在怀孕期间低于正常TSH水平可与颤蛋白水平不 足相关或者促进颤蛋白水平不足，后者对发育的胎儿具有负面的影响。尽 管存在怀孕期间的妇女使用的TSH的测试(例如，Abbott Laboratories)，但 是在本发明之前，还没有记载针对TSH水平和颤蛋白水平的组合的测试。 由于TSH能够影响数种生物功能，本发明者相信的患者中TSH和颤蛋白水 平的组合测试将针对患者(以及胎儿，如果是怀孕的妇女)处于不适当的神经 发育的风险给出更准确的评估。因此，所述的双重检测可用于评估怀孕妇 女的风险并提供PUFA补充策略，后者可能对胎儿发育具有积极的作用。 颤蛋白水平能够如这里描述的方法测量，并且同时或者之前或者之后测量 促甲状腺素水平。测量患者中TSH水平的方法是本领域中公知的并且目前 已经有多种商业提供的TSH检测试剂盒(例如，Biosafe，Abbott Laboratories)。 如果判断颤蛋白和TSH水平低于基线对照水平，则对患者开出补充DHA 或者其他的PUFA的处方，单用或者联用甲状腺药物。PUFA补充已经在别 处更详细地进行了讨论。建立以及评估颤蛋白基线水平的方法在这里进行 了描述(见下文)并且在本领域中是公知的(例如，参见PCT公开号 WO03/063110)。人的TSH基线水平在本领域中是公知的。例如，TSH水平 在约0.3-0.5以及约5.0-6.0MU升之间，或者从2003开始(由American Association of Clinical Endocrinologists最近修改的)，在约0.3和约3.0MU/ 升之间，被认为个体中TSH的正常(基线)范围。
本发明还涉及一种调节组织中颤蛋白表达的方法以促进干细胞的生长， 通过使用至少一种ω-3和/或ω-6 PUFA和/或前体或者其源。
本发明还涉及一种监测患者脑中的DHA的水平的方法，包括测量源自 患者的生物样品中的颤蛋白表达和/或生物活性的水平，并基于颤蛋白的测 量估计患者脑中的DHA水平。
本发明者还已经证实(参见实施例部分)可以利用源自患者的生物样品 中的颤蛋白浓度的检测来预测，其他的组织包括CNS以及生殖组织中的 DHA含量。例如，可以按照本文别处的描述测量、得到或者确定患者样品 中颤蛋白表达和/或生物活性。颤蛋白水平能够与基线对照进行比较，还按 照本文别处的描述。由于本发明者已经证明颤蛋白缺乏或者机能不良预示 有效掺入功能性HUFA到体内的能力降低。就能够开出一定的量补充性 HUFA(例如，作为营养性或者治疗性组合物给药)，可以解决患者掺入功能 性HUFA到身体组织以及细胞中的预测能力。例如，与不具有颤蛋白缺乏 或者机能不良的患者相比，显示颤蛋白缺乏或者机能不良的患者可以开出 更高剂量的HUFA，并且类似地，患者需要服用的HUFA量能够随时间进 行调节或者修正，根据患者中颤蛋白表达和/或生物活性新的评估。因此， 本发明的另一实施方案涉及一种预测HUFA掺入到患者的磷脂膜中的功效 的方法，包括：a)测量源自患者的生物样品中颤蛋白表达或生物活性；b) 比较所述的生物样品的颤蛋白表达或生物活性以及颤蛋白的基线水平；并 且c)预测所述的患者的HUFA掺入到磷脂膜中的功效，其中与颤蛋白表达 或生物活性基线水平相比，所述的生物样品中颤蛋白表达或生物活性水平 的差异表明所述的患者有效地掺入HUFA到磷脂膜中的预测能力的修正。 一个方面，所述的方法还包括对患者开出一定量的HUFA处方的步骤，其 中所述的量基于所述的患者的有效地掺入HUFA到磷脂膜中的预测能力确 定。
本发明还涉及一种改善患者的神经移行和/或神经功能方法，包括对患 者给药一定量的至少一种ω-3和/或ω-6 PUFA和/或前体或者其来源以改善 所述的患者中神经移行和/或神经功能的至少一个参数。
本发明还涉及一种鉴别神经祖细胞细胞的方法，包括检测细胞群中的颤 蛋白表达或生物活性，其中确定水平的颤蛋白表达或生物活性与神经祖细 胞细胞相关。
本发明还涉及一种监测神经发育的方法，a)提供包括神经祖细胞细胞的 细胞群；b)检测细胞群中的颤蛋白表达或活性；c)将细胞群暴露在神经祖细 胞将发展为分化的神经细胞的条件下；并且d)监测经过步骤(c)之后的细胞 中的颤蛋白的表达或活性，以评价神经祖细胞向分化的神经细胞的发育。
本发明还涉及在上述任一方法中利用DHA联用其他的多不饱和脂肪酸 (PUFAs)(例如，EPA、ARA、DPA)。
本发明还涉及治疗性组合物，包括一定量的至少一种ω-3和/或ω-6 PUFA和/或前体或者其源，足以补偿具有颤蛋白缺乏或者处于发展为颤蛋 白缺乏的风险中的患者中的降低的脂肪酸结合蛋白表达和/或活性。
本发明还涉及治疗性组合物，包括一定量的至少一种ω-3和/或ω-6 PUFA和/或前体或者其源，足以补偿具有颤蛋白缺乏或者处于发展为颤蛋 白缺乏的风险中的患者中的降低的脂肪酸结合蛋白表达和/或活性，以及至 少一种用于治疗或者预防与颤蛋白缺乏相关的病症的治疗化合物。
本发明还涉及利用PUFA补充，包括DHA，位于除CNS以外的部位(例 如，与相关心脏和/或免疫/淋巴系统)以预防这些部位中的脂肪酸脂质结合蛋 白的缺乏、延迟发作，或者治疗。
本发明的另一实施方案涉及一种诊断胎儿神经发育疾病的方法，包括： a)测量源自胎儿的羊膜流体样品中的颤蛋白表达或生物活性；b)比较样品中 的颤蛋白表达或生物活性以及颤蛋白的基线水平；以及c)进行胎儿的诊断， 其中与颤蛋白表达或生物活性基线水平相比，检测出样品中颤蛋白表达或 生物活性的水平的差异，表明胎儿神经发育疾病的阳性诊断。测量颤蛋白 表达和活性的方法在本文中的别处讨论。一个方面，对(c)中的阳性诊断胎 儿在子宫内给药一定量的颤蛋白或颤蛋白基因足以治疗神经发育疾病。另 一实施方案，对(c)中的阳性诊断的胎儿出生后给药一定量的颤蛋白足以治 疗神经发育疾病。例如，颤蛋白以婴儿制剂给药。对患者给药颤蛋白的量， 包括从约1μg每天至约10,000μg每天或者更多，包括在0.1μg每天增量 之间的任何增量(例如，1μg每天，1.1μg每天，1.2μg每天，等)。
本发明的另一实施方案涉及一种营养增补剂或口服药物，包括一定量的 颤蛋白，足以延缓或预防颤蛋白-缺乏或机能不良或与之相关的疾病或病症 的发展。所述的补充能够以婴儿制剂或者其他的食品产品的形式提供。并 在一个方面，通过婴儿的母亲产生的乳汁对婴儿提供，其中婴儿的母亲在 哺乳期之前或期间增补颤蛋白。
本发明的各方面在下面将进行更详细的说明。
颤蛋白为细胞外信号糖蛋白(＞400kDa)，由Cajal-Retzius细胞分泌到脑 的新皮质的边缘区，尽管有证据表明颤蛋白结合钙粘蛋白-相关的神经受体 以及B1-类整联蛋白，颤蛋白主要结合低密度脂蛋白受体家族的两个成员， VLDLR和ApoER2，具有对受体ApoER2具有更高的亲和力。颤蛋白对 VLDLR或者ApoER2的细胞外的结构域的结合引起或者诱导例如Dab1的酪 氨酸的磷酸化，信号通路cdk5/p35中的一种细胞质衔接子蛋白，丝氨酸/苏 氨酸激酶。
颤蛋白分子还聚集形成大的蛋白复合物，但是还具有自催化性质，裂解 颤蛋白复合物成小的实体。在哺乳动物中枢神经系统(CNS)中，颤蛋白以及， 更具体地，一些其特定大小变体特异(这里还称为颤蛋白大小形式或者颤蛋 白成分)，已经发现控制正确的神经移行以及定位，通过诱导对VLDLR和 ApoER2的Dab1的磷酸化。这种神经移行对脑中的正常皮质的发育是必须 的。
颤蛋白信号中的Dab1酪氨酸磷酸化的重要性是意义深远的。它可能， 激活，例如，磷酸肌醇-3-激酶(PI3K，Akt和Src家族激酶(SFKs)(Ballif等， Molecular Brain Research，2003，117，pp 152-159)。由于这些激酶的激活或者 信号级联中下游其他的蛋白上调(Notch、NckB、erbB2、erbB4、神经调节 蛋白，包括可溶的神经调节蛋白，GGF等)，星形胶质细胞将在形态上延伸 转化为放射神经胶质细胞并上调其他的神经受体以及脑脂质结合蛋白 (BLBPs)的表达(Brody，T.，The Interactive Fly：Gene networks，development， 1996)。
编码颤蛋白的核苷酸序列已经在人以及小鼠中克隆，并且颤蛋白的 cDNA以及编码的氨基酸序列，能够在公开的数据库中找到，如National Center for Biotechnology Information(NCBI)数据库。例如，人或者小鼠颤蛋 白的核苷酸以及氨基酸序列能够在NCBI数据库中分别以主索取号U24703 和U79716找到(这些数据库中的索取号这里以其整体引入作为参考)。小鼠 和人的氨基酸序列具有94％的一致性，暗示小鼠和人颤蛋白多肽在结构上 以及功能上具有高度类似性。正如PCT公开号WO03/063110中所讨论的， 该公开这里以其整体引入作为参考，在其N-端，颤蛋白具有可以裂解的信 号肽，接着为类似于F-spondin的片段。颤蛋白还具有350-390氨基酸的8 个中间重复，各自包含上皮生长因子-样基序，侧面为两个相关的片段。中 间重复系列前面为链结构域，并且接着为高度碱性的33氨基酸C-端结构域。
发现颤蛋白天然存在一或者多个不同的″大小形式″(颤蛋白蛋白具有不 同的分子量)，这里还称为颤蛋白成分″。全长的颤蛋白分子量为约410kD， 并且天然的蛋白水解的产物存在，例如，约330kD和180kD的分子量。在 个体中能够检测到的任何其他的颤蛋白大小形式也包括在本发明中。这些 大小形式能够利用本领域的方法轻易地检测，包括，但是不限于，免疫印 迹技术。
本发明的一些实施方案包括对患者给药一定量的一种或者多种多不饱 和脂肪酸(PUFAs)的步骤，并且更优选地，高度不饱和的脂肪酸(HUFAs)， 并且更优选地，DHA，或者前体或者其他的其源。多不饱和脂肪酸(PUFAs) 为多数真核细胞地膜脂质中的关键成分(Lauritzen等，Prog.Lipid Res.40 1(2001)；McConn等，Plant J.15，521(1998))，以及一些激素以及信号分子的 前体(Heller等，Drugs 55，487(1998)；Creelman等，Annu.Rev.PlantPhysiol. Plant Mol.Biol.48，355(1997))。根据本发明，优选的PUFA为长链的PUFA， 为具有18个碳原子或者更长的PUFA。
任何PUFA来源能够用于本发明的组合物和方法中，包括，例如，动物、 植物以及微生物源。优选的多不饱和脂肪酸(PUFA)源能够为适合用于本发 明的任何PUFAs来源。优选的多不饱和脂肪酸源包括生物来源，如动物、 植物和/或微生物源。这里使用的术语″脂质″包括磷脂；游离的脂肪酸；脂 肪酸酯；三酰基甘油；二酰基甘油酯；单酰基甘油酯；溶血脂质；皂类； 磷脂；甾醇以及甾醇酯；类胡罗卜素；叶黄素(例如，氧合类胡萝卜素)；烃； 以及本领域的普通技术人员公知的其他的脂质。动物源的实例包括水生动 物(例如，鱼、海洋哺乳动物、甲壳类、轮虫等)以及提取自动物组织(例如， 脑、肝脏、眼睛等)的脂质。植物源的实例包括巨藻类、亚麻籽、油菜籽、 玉米、夜来香、大豆以及琉璃苣。微生物的实例包括海藻、原生生物、细 菌以及真菌(包括酵母)。利用微生物源，如海藻能够提供影响器官优势，即， 源自微生物源的脂肪酸可能不具有鱼腥味道并且闻到鱼源的脂肪酸。更优 选地，长链脂肪酸源包括海藻。
优选地，当微生物为长链脂肪酸源的时候，微生物在发酵罐中在发酵培 养基中培养。或者，微生物能够在光生物反应器或者池中进行光合成培养。 优选地，微生物为富含脂质的微生物，更优选地，微生物选自海藻、细菌、 真菌以及原生生物。更优选地，微生物选自：金藻、绿藻、甲藻、酵母、 被孢霉属和Stramenopiles属的真菌。优选地，微生物包括属Crypthecodinium 以及破囊壶菌目以及被孢霉属丝状(真)菌的微生物，并且更优选地，微生物 选自破囊壶菌属、Schizochytrium或者其混合物，并且更优选地，微生物选 自下述微生物，具有ATCC号20888、ATCC号20889、ATCC号20890、ATCC 号20891以及ATCC号20892的识别特性、被孢霉属schmuckeri株以及被 孢霉属alpina、Crypthecodinium cohnii株衍生自前述的突变株及其混合物。
根据本发明，术语″Thraustochytrid″、″破囊壶菌属微生物″以及″破囊壶 菌目微生物″能够互换使用并且指破囊壶菌目的任何成员，其包括破囊壶菌 科以及科网粘菌科。术语″Labyrinthulid″和″网粘菌科″这里用来具体地指科 网粘菌科的成员。为了具体地指Thraustochytrids为破囊壶菌科的成员，这 里使用术语″破囊壶菌科″。因此，对于本发明，Labyrinthulids的成员被认为 包括在Thraustochytrids中。
发展导致Thraustochytrids的分类法经常改变。分类法理论家一般性地 将Thraustochytrids与藻类或者类藻类原生生物放在一起。但是，由于分 类不明确，最好的方法是对于本发明认为本发明中描述为Thraustochytrids 株包括下述生物体：目：破囊壶菌属；科：破囊壶菌科(属：破囊壶菌属， Schizochytrium″Japonochytrium，Aplanochytrium，或者Elina)或者网粘菌科 (网粘菌属，Labyrinthuloides，或者Labyrinthomyxa)。此外，下述属有时候 包括在破囊壶菌科或者网粘菌科中：Althornia，Corallochytrium，Diplophyrys 以及Pyrrhosorus)，并且对于本发明包括在Thraustochytrid或者破囊壶菌目 的成员中。公认的是在本发明有时候，Thraustochytrids分类的修改属 Labyrinthuloides放在科网粘菌科中并证实了将破囊壶菌科和网粘菌科放在 Stramenopile世系的范围之内。应该注意的是网粘菌科有时候称为 labyrinthulids或者网粘菌属，或者labyrinthuloides并且破囊壶菌科一般称为 thraustochytrids，尽管，如上讨论，为了清楚本发明的目的，Thraustochytrids 包括破囊壶菌目的任何成员和/或包括破囊壶菌科以及网粘菌科的任何成 员。最近的分类变化总结在下面。
这里公开的一些单细胞微生物株为破囊壶菌目的成员。Thraustochytrids 为海洋真核细胞，具有进化的分类学历史。有关Thraustochytrids的分类学 位置的问题已经由Moss(in″The Biology of Marine Fungi″，Cambridge University Press p.105(1986))，Bahnweb以及Jackle(ibid.p.131)以及 Chamberlain和Moss(BioSystems 21：341(1988))评述。
为了方便的目的，Thraustochytrids首先由分类学家与其他的无色的动孢 子真核细胞放在藻菌(类藻类真菌)下。名称藻菌，但是，最终从分类学中剔 除，并且Thraustochytrids保留在卵菌(双鞭毛动孢子真菌)中。最初认为卵菌 与异鞭毛藻类相关的，以及最终地广泛的超结构以及生物化学研究，由Barr 总结(Barr.Biosystems 14：359(1981))，支持了该假定。卵菌实际上被 Leedale(Leedale.Taxon 23：261(1974))以及其他的藻类学专家作为异鞭毛藻 类部分。但是，由于源自异养的特性的便利，卵菌以及Thraustochytrids主 要由真菌学者(研究真菌的科学家)研究，而不是由藻类学专家(研究藻类的 科学家)研究。
从另一种分类学来看，进化生物学者发展了两派关于真核细胞进化的思 想。一种理论认为膜-结合的细胞器通过一系列的内共生的外生起源 (Margulis，1970，Origin of Eukaryotic Cell.Yale University Press，New Haven)； 例如，线粒体源自细菌的endosymbionts，叶绿体源自蓝藻类，并且鞭毛源 自螺旋菌。其他的理论认为膜-结合的细胞器通过渐进的进化从非-膜-结合 体系的原核祖先而来，通过自生过程(Cavalier-Smith，1975，Nature(Lond.) 256：462-468)。但是两组进化生物学者将卵菌和Thraustochytrids从真菌种 去除并将其放置在或者与色质体藻类放在界色质体下(Cavalier-Smith BioSystems 14：461(1981))(该界最近已经扩展到包括其他的原生生物并且该 界成员现在称为Stramenopiles)或者与所有的藻类放在界Protoctista下 (Margulis和Sagen.Biosystems 18：141(1985))。
随着电子显微镜的发展，对两个属Thraustochytrids、破囊壶菌属的游动 孢子以及Schizochytrium的超结构的研究(Perkins，1976，pp.279-312 in ″Recent Advances in Aquatic Mycology″(ed.E.B.G.Jones)，John Wiley & Sons， New York；Kazama.Can.J.Bot.58：2434(1980)；Barr，1981，Biosystems 14： 359-370)已经提供了足够的证据表明破囊壶菌科只与卵菌有较远的关系。此 外，5-S核糖体RNA序列的遗传数据提供了相应的分析(多变量统计学形式) 表明破囊壶菌属清楚地为独特的一组真核细胞，完全与真菌区分开，并且 与红以及褐藻类最相关，并且为卵菌的成员(Mannella等Mol.Evol.24： 228(1987))。最近分类学者已经同意将Thraustochytrids从卵菌移出(Bartnicki- Garcia.p.389in″Evolutionary Biology of the Fungi″(eds.Rayner，A.D.M.， Brasier，C.M.& Moore，D.)，Cambridge University Press，Cambridge)。
总之，利用Cavalier-Smith的分类学系统(Cavalier-Smith.BioSystems 14： 461(1981)；Cavalier-Smith.Microbiol Rev.57：953(1993))，Thraustochytrids 与色质体藻类一起归类于界Chromophyta(Stramenopiles)。该分类学布置最 近由Cavalier-Smith等再次肯定，利用不等鞭毛(藻)门的18srRNA信号证实 Thraustochytrids为chromists而不是真菌(Cavalier-Smith等Phil.Tran.Roy. Soc.London Series BioSciences 346：387(1994))。这种放置将Thraustochytrids 与真菌放在完全不同的界，真菌都放在界Eufungi中。
目前，有71组完全不同的真核生物体(Patterson.Am.Nat.154：S96(1999)) 并且在这些组种，基于下述原因分为四个主要的世系：(1)Alveolates， (2)Stramenopiles，(3)a Land Plant-green藻类-Rhodophyte-Glaucophyte(″plant″) 进化枝以及(4)Opisthokont进化枝(真菌以及动物)。以前这四个主要的世系 会被标上界但是使用″界″概念不再被一些研究者认为有用。
如Armstrong所注意到的，Stramenopile指三股-分开的管状绒毛，并且 绝大多数该世系的成员具有带有这些绒毛的鞭毛。Stramenopiles的能动细胞 (单细胞生物体、精子、游动孢子)是不对称的具有两个侧部附着的鞭毛，一 个长，带有三股-分开的管状绒毛，其反转鞭毛的推进，并且一个短并且光 滑。以前，当该组范围较窄的时候，Stramenopiles称为界Chromista或者 heterokont(＝不同的鞭毛)藻类，由于这些组包括褐藻类或者Phaeophytes以 及黄-绿藻类、金-褐藻类、Eustigmatophytes以及Diatoms。随后，一些异养 的、真菌样的生物体、水霉以及labyrinthulids(slime net amoebas)，发现具有 类似的运动细胞，称为光合颜料或者藻类的名称就不合适。目前， Stramenopile世系中的两个科为网粘菌科和破囊壶菌科。历史上，对这些独 特的微生物存在许多分类策略并且它们通常归类在相同的目(即，破囊壶菌 属)下。该组成员中的关系仍然在发展。Porter以及Leander发展了基于18S 小亚基核糖体DNA的数据，表明thraustochytrid-labyrinthulid进化枝是单源 的。但是，进化枝被两个分支支持；第一个包括破囊壶菌属和Ulkenia profunda中的3个物种，并且第二支包括网粘菌属中的3个物种， Labyrinthuloides和Schizochytrium aggregatum中的两个物种。
用于本发明的Thraustochytrids分类学放置因此总结如下：
界：色质界(Stramenopiles)
门：不等鞭毛(藻)门
目：破囊壶菌属(Thraustochytrids)
科：破囊壶菌科或者网粘菌科
属：破囊壶菌属，Schizochytrium，Japonochytrium，Aplanochytrium，Elina， 网粘菌属、Labyrinthuloides，或者Labyrinthulomyxa
一些早期的分类学者将破囊壶菌属中的数种最初成员(具有似变形虫生 命阶段的那些)分到另外一个称为Ulkenia的属中。但是现在已经直到，尽 管不是所有也是大多数Thraustochytrids(包括破囊壶菌属以及 Schizochytrium)，显示似变形虫阶段并因此，一些学者并不认为Ulkenia是 有效的属。这里使用的破囊壶菌属包括Ulkenia。
尽管在门和界的高级分类中分类学位置不确定，Thraustochytrids保持了 特色以及特征性质分组，其成员仍然可以分类到破囊壶菌目中。有关所述 的微生物及其培养微生物的方法参见U.S.5,407,957；5,130,242和5,340, 594，这里以其整体引入作为参考。
被本发明覆盖的脂质包括脂质包括多不饱和脂肪酸，更具体地，长链多 不饱和脂肪酸，并且甚至更具体地，多不饱和脂肪酸在所述的脂质具有至 少18、20或者22个碳链长度的。所述的多不饱和脂肪酸能够具有至少3 或者至少4双键。更具体地，多不饱和脂肪酸能够包括二十二碳六烯酸(至 少10、20、30或者35重量百分比)，二十二碳五烯酸(至少5、10、15，或 者20重量百分比)，和/或花生四烯酸(至少20、30、40或者50重量百分比)。 多不饱和的脂肪酸包括游离的脂肪酸以及包括PUFA残基的化合物，包括 磷脂；脂肪酸酯；三酰基甘油；二酰基甘油酯；单酰基甘油酯；溶血磷脂； 磷脂；等。
磷脂的来源包括家禽蛋、强化家禽蛋、藻、鱼、鱼籽以及基因工程(GE) 植物籽或者藻。具体地优选的PUFAs源，包括DHA包括，但不限于，鱼 油、海洋藻以及植物油。
优选的PUFA，DHA的前体，包括，但不限于，a-亚麻酸(LNA)；二十 碳五烯酸(EPA)；二十二碳五烯酸(DPA)；LNA、EPA，和/或DPA的混合物。
在本发明的一个实施方案中，脂肪酸并且具体地，ω-3脂肪酸和ω-6脂 肪酸的混合物能够用于本发明的方法中。
优选的PUFAs包括ω-3和ω-6多不饱和脂肪酸具有3个或者多个双键。 ω-3 PUFAs为多乙烯类型的脂肪酸其中最后的乙烯键为3碳形式并包括脂 肪酸的末端甲基并包括，例如，二十二碳六烯酸C22：6(n-3)(DHA)以及ω-3 二十二碳五烯酸C22：5(n-3)(DPAn-3)。ω-6 PUFAs为多乙烯型脂肪酸，其 中作后的乙烯键为6碳形式并脂肪酸的末端甲基并包括，例如，花生四烯 酸C20：4(n-6)(ARA)，C22：4(n-6)，ω-6二十二碳五烯酸C22：5(n-6)(DPAn-6) 以及二高γ亚麻酸C20：3(n-6)(二高GLA)。
根据本发明，可用于这里描述的补充剂以及治疗性组合物中的长链的脂 肪酸为多种形式。例如，所述的形式包括，但不限于：包括PUFA的高度 纯化的海藻油，包括PUFA的甘油三酸酯油，包括PUFA的磷脂，包括PUFA 的蛋白和磷脂的组合，包括PUFA的干燥的海洋微藻，包括PUFA的鞘类磷 脂，PUFA的酯类、游离脂肪酸、PUFA与另一中生物活性分子的偶联物及 其组合。生物活性分子能够包括任何合适的包括，但是不限于，蛋白、氨 基酸(例如天然存在的氨基酸如DHA-氨基乙酸、DHA-赖氨酸，或者氨基酸 类似物)、药物以及糖。
这里列出的形式容许食品制剂在具有高度的感觉性质、饮食补充以及药 物方面具有灵活性。例如，目前已有的微海藻油包含约40％DHA。这些油 能够转化为酯的形式并且然后利用技术如分子蒸馏的技术纯化使DHA含量 达到70％以及更高，提供浓缩的产品，能够用于大小受限的产品，即，小 的服务大小如具有受限的可行的口服大小的婴儿食品或者饮食补充剂。油 以及磷脂组合的使用有助于提高氧化稳定性并且因此微海藻油的感觉以及 以及营养性品质。氧化裂解损害了营养性甘油三酸酯形式的PUFAs的感觉 品质。通过利用磷脂形式，需要的PUFAs更为稳定并且脂肪酸更加生物可 利用，当为甘油三酸酯形式的时候。尽管微生物油比通常的鱼油更稳定， 二者都易氧化降解。氧化降解降低了这些脂肪酸的营养价值。此外氧化的 脂肪酸据信对健康有害。利用磷脂DHA/DPA/ARA/二高-GLA，一种更稳定 的脂肪酸体系，提高了这些补充剂的健康以及营养价值。与甘油三酸酯油 相比，磷脂还更易于混合到水体系中。利用蛋白以及磷脂组合可以形成更 营养的复合食品制剂，由于蛋白和脂肪酸二者都提供。利用干燥的海洋微 藻在其中提供高温稳定的油，并且对在高温焙烤食品的制剂是游离的。
在本发明的一个实施方案中，需要的磷脂源包括源自蛋、植物油以及动 物器官的纯化的磷脂，利用Friolex方法制备以及磷脂萃取过程(PEP)(或相 关的方法)用于制备富含DHA，DPA，ARA和/或二高-GLA的营养性补充剂。 Friolex和PEP以及相关的方法更详细地记载在下述专利文献中：PCT专利 PCT/IB01/00841，标题″Method for the Fractionation ofOil and Polar Lipid- Containing Native Raw Material″，2001年4月12日提交，以WO01/76715 在2001年10月18日出版；PCT/IB01/00963，标题″Method for the Fractionation of Oil and Polar Lipid-Containing Native Raw Material Using Alcohol and Centrifugation″，2001年4月12日提交，以WO01/76385在2001 年10月10日出版；以及PCT/DE95/01065标题″Process For Extracting Native Product Which Are Not Water-Soluble From Native Substance Mixtures By Centrifugal Force″，1995年8月12日提交，以WO 96/05278在1996年 2月22日出版；每篇专利这里以其全文引入作为参考。
优选地，高度纯化的海藻油包括：需要的甘油三酸酯形式的PUFA、甘 油三酸酯油组合磷脂、单独磷脂、蛋白和磷脂组合，或者干燥的海洋微藻， 包括选自由DHA和/或DPA(n-3)和/或DPA(n-6)和/或ARA和/或二高-GLA 制成的脂肪酸残基。更优选地，高度纯化的海藻油包括甘油三酸酯形式的 需要的PUFA、甘油三酸酯油组合磷脂、单独磷脂、蛋白和磷脂组合，或者 干燥的海洋微藻，包括选自由DHA、ARA或者DPA(n-6)制成的脂肪酸残基。 更优选地，高度纯化的海藻油包括甘油三酸酯形式的需要的PUFA、甘油三 酸酯油组合磷脂、单独磷脂、蛋白和磷脂组合，或者干燥的海洋微藻，包 括选自由DHA和DPA(n-6)制成的脂肪酸残基。在最优选的实施方案中，高 度纯化的海藻油包括甘油三酸酯形式的需要的PUFA、甘油三酸酯油组合磷 脂、单独磷脂、蛋白和磷脂组合，或者干燥的海洋微藻，包括DHA的脂肪 酸残基。
尽管脂肪酸如DHA能够局部给药或者以注射剂型给药，最优选的给药 途径是口服给药。优选地，脂肪酸(例如，PUFAs)以营养性补充剂和/或食品 和/或药用制剂和/或饮料的形式对患者给药，更优选地食品、饮料，和/或营 养性补充剂，更优选地，食品和饮料，更优选地食品。
对于婴儿，脂肪酸以婴儿制剂、断奶食品、罐装婴儿食品以及婴儿米粉 的形式对婴儿给药。
任何生物可以接受的剂型及其组合，都包括在本发明的主题之中。所述 剂型的实例包括，不限于，咀嚼片剂、速溶片剂、泡腾片剂、可重构粉末、 酏剂、液体、溶液、混悬剂、乳剂、片剂、多层片剂，双层片剂、胶囊、软 明胶胶囊、硬明胶胶囊、囊片、锭剂、咀嚼锭剂、小珠、粉末、颗粒、粒、 微粒、可分散颗粒、扁囊剂、灌肠剂、栓剂、乳膏剂、局用剂型、吸入剂、 气雾吸入剂、贴剂、粒吸入剂、植入剂、长效植入剂、可吸收剂、注射剂、 输液剂、health bars、糖膏剂、米粉、米粉敷料、食品、营养食品、功能性 食品及其组合。上述制剂形式的配制对本领域的普通技术人员而言是公知 的。优选地，用需要的PUFA强化的食品选自包括，但是不限于：焙烤物 品及其混合物；口香糖；早餐米粉食物；干酪产品；坚果以及基于坚果的 产品；白明胶、布丁以及饼馅；冰冷奶制品；牛奶产品；牛奶产品类似物； 软糖；汤以及汤混合物；快餐食品；加工的果汁；加工的蔬菜汁；脂肪以 及油类；鱼产品；植物蛋白产品；家禽产品；以及肉类产品。
对患者给药PUFA的量能够为适合提供下述结果的任何量：补偿所述的 患者中降低的脂肪酸结合蛋白或者其功能；补偿所述的患者中降低的脑脂 质结合蛋白或者其功能；改善所述的患者中脂肪酸结合蛋白的活性；增加 所述的患者中脑脂质结合蛋白(BLBPs)的表达；改善所述的患者中脑脂质结 合蛋白作用机制中至少一个参数；克服中枢神经系统(CNS)结构及其功能中 脂肪酸如DHA的缺乏；增加功能性脂肪酸如DHA向患者中神经胶质细胞 和神经元磷脂膜中掺入；增加所述的患者中颤蛋白的水平和/或改善颤蛋白 的活性；和/或改善与颤蛋白缺乏或者机能不良相关疾病或者病症的至少一 种症状。在一个实施方案中，脂肪酸(PUFA)以从约0.05mg的PUFA每公斤 患者体重至约200mg的PUFA每公斤患者体重或者更高的剂量给药，包括 在其之间0.01mg增量的任何增量，(例如，0.06mg，0.07mg等)，或者剂量 范围在约50mg和约20,000mg每个对象每天之间，通过口服、注射、乳剂 或者总肠胃外营养、局部、腹膜内、胎盘、透皮或者颅内给药。典型的胶 囊DHA补充剂例如，可以制备成为100mg至200mg剂量每胶囊，尽管本 发明不限于胶囊形式或者包含这些量的DHA或者另一种PUFA的胶囊。在 本发明的一个实施方案中，对患者给药PUFA补充剂组合一种或者多种治 疗化合物用于治疗与颤蛋白缺乏或者机能不良相关病症。针对特定的治疗 的疾病或者病症而言，所述的治疗化合物对本领域的普通技术人员而言是 公知的。
如上讨论，对选择的患者给药PUFA补充剂如DHA优选地一或者多种 下述结果：补偿所述的患者中降低的脂肪酸结合蛋白或者其功能；补偿所 述的患者中降低的脑脂质结合蛋白或者其功能；改善患者中脂肪酸结合蛋 白的活性；改善患者中脑脂质结合蛋白作用机制的至少一个参数；导致功 能性DHA掺入到所述的患者中神经胶质细胞和神经元的磷脂膜中的增加； 颤蛋白水平的增加和/或患者中颤蛋白活性的改善。在一个实施方案中，患 者罹患与颤蛋白缺乏或者机能不良相关联的疾病或者病症，并且对患者给 药PUFA改善所述疾病或者病症的至少一种症状。
接受治疗的患者能够为处于发展任何与颤蛋白缺乏或者机能不良相关 联的疾病或者病症的风险中或者可能已经罹患任何与颤蛋白缺乏或者机能 不良相关联的疾病或者病症。所述的疾病和病症，包括，但不限于：神经 病症或者神经精神病症、癫痫发作、与神经机能不良相关的自体免疫病症， 以及抗-磷脂病症。更具体地，所述的疾病或者病症包括，但不限于：精神 分裂症、双相性精神障碍、诵读困难、运动障碍、注意力不集中的过度反 应症(ADHD)、癫痫、孤独症、帕金森病、老年痴呆、阿耳茨海默(氏)病、 过氧化物酶体增殖子激活疾病(PPAR)、多发性硬化症、糖尿病诱导的神经 疾病、黄斑变性、早产儿视网膜病、亨延顿(氏)舞蹈病、肌萎缩侧索硬化 (ALS)、色素性视网膜炎、脑性麻痹、肌肉萎缩症、癌症、囊性纤维化病、 神经管缺陷、抑郁症、泽韦格综合征、无脑回、唐氏综合征、肌肉-眼睛- 脑疾病、Walker-Warburg综合征、Charoct-Marie-Tooth疾病、包涵体肌炎(IBM) 以及Aniridia。
优选地，对患者给药PUFA如DHA预防与颤蛋白缺乏或者机能不良相 关的疾病或者病症的至少一种症状、延迟发作，或者减少严重程度或者持 续。在优选的实施方案中，患者不再罹患不适和/或改变的功能，源自不合 适的颤蛋白水平或者与不合适的颤蛋白水平相关或者为本发明的方法的结 果。
同样地，治疗性益处并不必要地治愈具体的疾病或者病症，而是，优选 地包含下述结果：最通常包括减轻所述疾病或者病症、消去所述疾病或者 病症、减少与疾病或者病症相关联的症状、补偿或者恢复至正常的细胞或 者细胞内机制，预防或者减轻源自原发的疾病或者病症的继发的疾病或者 病症、和/或预防所述疾病或者病症。这里使用的，术语″预防疾病″指减轻 所述疾病的症状；减少所述疾病的发生，和/或降低疾病的严重程度。保护 患者能够指本发明的组合物，当对患者给药后，预防疾病发生和/或治愈或 者减轻疾病症状、征候或者病因的能力。同样地，保护患者以免患疾病包 括预防疾病发生(预防性治疗)以及治疗患有疾病的患者(治疗性治疗)。有益 的作用能够轻易地由本领域的普通技术人员和/或由治疗患者的接受过训练 的临床医生评估。术语，″疾病″指哺乳动物的正常健康的任何偏离并包括下 述状态，其中存在疾病症状，以及其中偏离(例如，感染、基因突变、遗传 缺陷等)已经发生但是症状还没有显示出来的情形。根据本发明，″患者″不 是必要地具有疾病、病症或者颤蛋白缺乏或者机能不良或者不是必要地处 于发展疾病、病症或者颤蛋白缺乏或者机能不良的风险中，但是，该术语 能够与″对象″、″个体″互换，并且最一般性地指个体动物(例如，人对象或 者驯养地动物)，其接受本发明的方法或者组合物进行评价、诊断、治疗或 者其他的作用。
许多上述本发明方法的一个步骤包括检测、测量或者评价患者生物样品 中的颤蛋白表达或者生物活性。样品能够为细胞样品、组织样品和/或体液 样品。根据本发明，术语″细胞样品″可以用来一般性地指任何类型的样品， 其包含利用本发明进行评价的细胞，包括但是不限于，分离的细胞样品、 组织样品和/或体液样品。根据本发明，分离的细胞样品为细胞样本，通常 为悬浮状态或者从结缔组织分离得到，在体内的组织中连接细胞，其从器 官、组织或者流体收集得到，利用任何合适的方法以收集合适数目的细胞 以用于利用本发明的方法进行评价。细胞样品中的细胞并不必须地为同样 类型，尽管纯化方法能够用来富集优选地进行评价的同样类型的细胞。细 胞能够利用下述方法得到，例如，通过刮组织，处理组织样品以释放单个 细胞，或者从体液中分离得到。组织样品，尽管与分离的细胞样品类似， 这里定义为身体器官或者组织的部分，通常包括数种细胞类型和/或细胞骨 架结构，后者支持细胞在一起。本领域的普通技术人员将意识到术语″组织 样品″在某些情形下与″细胞样品″互换使用，尽管其优选地用来表明比细胞 样品更复杂的结构。组织样品能够通过活组织检查得到，例如，包括通过 切、切(片)，或者刺的方式。体液样品，与组织样品一样，可以包含细胞并 且为利用适于进行取样的具体体液的任何方法获得的液体。适合取样的体 液包括，但不限于，血液、黏液、精液、唾液、乳汁、胆汁以及尿。在本 发明优选的实施方案中，生物样品为血液样品，包括任何血液组分(例如， 全血液、血浆、血清)。
通常，样品类型(即，细胞、组织或者体液)基于样品的易得到以及所述 的方法的目的进行选择。通常，能够利用最少侵入的方法得到的生物样品 是优选的(例如，血液)，尽管在一些实施方案中，得到细胞或者组织样品用 于评价有用或者必须。一旦从患者获得样品，样品用于评价检测样品细胞 中的颤蛋白表达或者生物活性。术语″颤蛋白表达″能够一般性地指颤蛋白 mRNA转录或者颤蛋白蛋白翻译(例如，检测样品中颤蛋白的蛋白量)。优选 地，所述的检测患者中颤蛋白表达或者生物活性的方法与下述方法相同或 者性质上等价：用于检测样品中颤蛋白表达或者生物活性以建立颤蛋白基 线或者对照水平的方法。
适于检测颤蛋白转录的方法包括用于检测和/或测量流体、细胞或者细 胞提取物中mRNA水平的任何合适的方法。所述的方法包括，但不限于： 聚合酶链式反应、逆转录酶-PCR(RT-PCR)、原位杂交、Northern印迹、序 列分析、微阵列分析以及报告基因的检测。用于检测转录水平的方法在本 领域中是公知的，并且许多这样的方法已经描述，例如，在Sambrook等， Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Labs Press， 1989和/或在Glick等，Molecular Biotechnology：Principles and Applications of Reconbinant DNA，ASM Press，1998；Sambrook等，ibid.and Glick等，ibid. 中，这里以其整体引入作为参考。当样品为细胞或者组织样品的时候，颤 蛋白转录的测量主要合适的；因此，当样品是包含细胞或者细胞提取物的 体液样品的时候，细胞通常从体液中分离出来以进行表达测定。
颤蛋白表达还能够通过检测颤蛋白翻译进行确定(即，检测样品中的颤 蛋白蛋白)。适于检测颤蛋白蛋白的方法包括用于检测和/或测量蛋白流体、 细胞或者细胞提取物中的任何适合方法。所述的方法包括，但不限于，蛋 白质印迹、免疫印迹、酶-联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、 免疫沉淀反应、表面等离振子共振、化学发光、荧光偏振、磷光、免疫组 织化学分析、基质-辅助激光解吸/离子时间飞行(MALDI-TOF)质谱、微细胞 术、微阵列、显微镜、荧光激活细胞分选(FACS)、流式细胞术、以及蛋白 质微芯片或微阵列。所述的方法在本领域中是公知的。抗颤蛋白的抗体已 经制备出来并记载在现有技术中(例如，参见，Ogawa等，1995，Neuron，14： 890-912；DeBergeyck等，1998，J；Neurosci.15 Meth.，82：17-24)并且能够 用于测定检测颤蛋白蛋白。在PCT公开号WO03/063110中，例如，免疫印 迹技术用来检测患有各种神经/心理病症患者的血液样品中的颤蛋白大小形 式并与基线对照群中的颤蛋白水平进行比较。所述的方法可以用于检测生 物样品中的颤蛋白，尽管对本领域的普通技术人员而言，多种颤蛋白检测 和测量技术能够用来评价个体中的颤蛋白状况。
或者，可以利用本领域中公知的技术轻易地制备抗颤蛋白的抗体。选择 性结合样品中的颤蛋白抗体能够利用本领域已知的颤蛋白蛋白信息产生。 更具体地，术语″选择性结合″指一种蛋白与另一种蛋白(例如，对应抗原的 抗体、其片段，或者结合伴侣)的特异性结合，其中结合水平，可以利用标 准的测定测量(例如，免疫测定)，统计学上显著地高于用于测定的背景对照。 例如，当进行免疫测定的时候，对照通常包括单独包含抗体或者抗原结合 片段(即，不存在抗原)反应孔/管，其中在不存在抗原的情形下，抗体或者 其抗原结合片段的反应量(例如，对孔的非特异结合)被认为是背景。结合能 够利用本领域中的多种标准方法进行测量，包括酶免疫测定(例如，ELISA)， 免疫印迹测定等)。用于测定试剂盒以及本发明的方法中的抗体能够包括多 克隆和单克隆抗体、二价以及单价抗体、二-或多-特异抗体、包含所述抗体 的血清、已经纯化至一定程度的抗体以及全抗体的任何功能性等价物。本 发明的分离的抗体能够包括包含所述抗体的血清，或者已经纯化至一定程 度的抗体。本发明的全抗体能够为多克隆或者单克隆。或者，全抗体功能 性等当物，如抗原结合片段其中一或者多个抗体结构域被截短或者不存在 (例如，Fv、Fab、Fab′，或者F(ab)2片段)，以及基因工程抗体或者其抗原结 合片段，包括单链抗体或者能够结合多于一个表位的抗体(例如，二-特异抗 体)，或者能够结合一个或者多个不同的抗原的抗体(例如，二-或多-特异抗 体)，也可以用于本发明。
基因工程抗体包括利用标准的重组DNA技术产生的那些，涉及编码抗 体可变和/或不变区域的DNA的操作以及再表达。具体的实例包括，嵌合型 抗体，其中抗体的VH和/或VL结构域以及抗体的其他部分来自不同的来源， 以及CDR嫁接抗体(以及其抗原结合片段)，其中至少一个CDR序列以及任 选地至少一个可变区域骨架的氨基酸来自一个来源并且一个源并且可变以 及不变区域(适当地)的剩余部分来自不同的来源。嵌合以及CDR-嫁接抗体 地构建记载在例如欧洲专利申请：EP-A 0194276、EP-A 0239400、EP-A 0451216和EP-A 0460617中。
一般性地，在产生抗体的时候，合适的实验动物，如，例如，但是不限 于，兔、羊、仓鼠、豚鼠、小鼠、大鼠或者鸡，暴露于需要产生抗体的抗 原。通常，动物用有效量的抗原进行免疫，注射到动物中。有效量的抗原 指诱导动物产生抗体的需要量。动物的免疫系统然后反应预定的一段时间。 免疫过程能够重复直到免疫系统发现产生针对抗原的抗体。为了得到抗原 特异的多克隆抗体，从包含需要的抗体的动物收集血清(或在鸡的情形下， 抗体能够从蛋收集得到)。所述的血清可以用作试剂。多克隆抗体能够可以 从血清(或者蛋)纯化，利用，例如，将血清用硫酸铵处理。
单克隆抗体可根据Kohler和Milstein的方法制备(Nature 256： 495-497，1975)。例如，从免疫的动物的脾脏(或者任何合适的组织)收集B淋 巴细胞并且然后与骨髓瘤细胞融合以得到杂交瘤细胞群，后者能够在合适 的培养基中生长。通过检测杂交瘤产生的抗体与需要的抗原的结合选择产 生需要抗体的杂交瘤。
如上讨论，发现颤蛋白在患者中存在一或者多种不同的″大小形式″(具 有不同的分子量的颤蛋白蛋白)。这些″颤蛋白成分″或者″大小形式″还可以 进行检测并将一种与另外一种进行比较，或者具体大小形式的颤蛋白(颤蛋 白成分)能够与基线或者对照样品中的同样的颤蛋白成分(同样分子量的颤 蛋白成分)进行比较。此外，可以检测患者生物样品中的不同的颤蛋白大小 形式比率，或者谱，并将所述的谱与基线对照进行比较。需要检测的特别 有用的颤蛋白大小形式(成分)包括具有表观分子量约410kD(全长颤蛋白)以 及天然存在的蛋白酶解约330kD以及180kD的产品。利用许多上述检测颤 蛋白蛋白的方法，能够检测颤蛋白大小形式并将一种与另一种进行区分。 检测样品中颤蛋白蛋白水平的方法，包括颤蛋白大小形式，还详细地记载 在PCT公开WO 03/063110中，这里以其整体引入作为参考。例如，在该公 开中，测定了患重度抑郁症、精神分裂症、双相性精神障碍病症地患者中 的颤蛋白大小形式的比率以及数量与正常(未受累)对照的颤蛋白大小形式 水平在统计学上显著地不同。类似的结果也在孤独症患者及其家族成员中， 与家族中没有孤独症的对照对象相比。因此，测试对象生物样品中的颤蛋 白大小形式相对水平以及颤蛋白中的总体水平的变化的检测，能够轻易地 与对照或者基线水平进行比较以评价给定测试对象中的颤蛋白状况并因此 确定颤蛋白缺乏或者机能不良，包括颤蛋白异常。
术语″颤蛋白生物活性″指颤蛋白蛋白任何生物作用，包括，但是不限于， 结合颤蛋白受体(例如，钙粘蛋白-相关的神经受体，B1-类整联蛋白、低密 度脂蛋白受体，以及具体地，VLDLR和ApoER2)，颤蛋白受体的激活、颤 蛋白细胞信号转导通路的激活(例如，cdk5/p35对Dab1的酪氨酸磷酸化)； 以及由于颤蛋白结合结合受体的下游的生物事件(例如，磷酸肌醇-3-激酶 (PI3K)，Akt和Src家族激酶(SFKs)的激活；蛋白如Notch、NckB、erbB2、 erbB4、神经调节蛋白的上调；星形胶质细胞形态转化为放射神经胶质细胞； 神经受体表达上调；脑脂质结合蛋白(BLBPs)上调等)。检测颤蛋白生物活性 的方法是本领域中公知的并包括，但不限于，受体-配体测定以及磷酸化测 定。
本发明的诊断和监测方法具有不同的用途。首先，所述的方法能够用来 诊断以及监测具有给定病症(例如，神经病症)大量患者中的具有颤蛋白缺乏 或者机能不良患者亚组，其最可能受益于本发明的方法(例如，利用PUFAs 补充)。所述的方法还能够用来诊断并监测患者，通过确定具有DHA或者 其他的PUFA缺乏，或者脂肪酸结合蛋白(FABP)缺乏或者机能不良的患者， 或者确定具有DHA或者其他的PUFA缺乏或者FABP缺乏或者机能不良可 能性的患者。所述的患者能够为怀疑具有DHA或者其他的PUFA缺乏或者 FABP缺乏或者机能不良的个体，或者认为为健康的个体，但是接受DHA 或者其他的PUFA缺乏或者FABP缺乏或者机能不良的常规检测。患者还能 够以前诊断患有DHA或者其他的PUFA缺乏或者FABP缺乏或者机能不良 并接受治疗的个体，并且接受关于再发DHA或者其他的PUFA缺乏或者 aFABP缺乏或者机能不良常规的监督。
术语″诊断″、″诊断″、″接受诊断″及其变体指在征候以及症状的基础上 确定疾病或者病症。这里使用的，″阳性诊断″表明已经确定所述疾病或者病 症，或者发展所述疾病或者病症的可能，或者需要PUFA补充等。与此不 同的是，″阴性诊断″表明没有确定疾病或者病症，或者发展疾病或者病症的 可能，或者PUFA补充的需要。因此，在本发明中，阳性诊断(即，阳性评 估)DHA或者其他的PUFA缺乏或者FABP缺乏或者机能不良，或者其可能 性，指根据本发明的DHA或者其他的PUFA缺乏或者FABP缺乏或者机能 不良(例如，颤蛋白缺乏或者机能不良)的标志(例如，征候、症状)已经在患 者样品识别出来。然后所述的患者能够接受治疗以减少或者消除DHA或者 其他的PUFA缺乏或者FABP缺乏或者机能不良。类似地，阴性诊断(即， 阴性评估)DHA或者其他的PUFA缺乏或者FABP缺乏或者机能不良，或者 其可能性指，DHA或者其他的PUFA缺乏或者FABP缺乏或者机能不良， 或者发展如这里描述的DHA或者其他的PUFA缺乏或者FABP缺乏或者机 能不良的可能性(例如，颤蛋白缺乏或者机能不良)的标志(例如，征候、症 状)没有在患者样品识别出来。在这种情形下，患者通常不接受任何治疗， 或者接受低水平DHA或者其他的PUFA补充，但是在将来的时间再评价一 次或者多次以评估DHA或者其他的PUFA缺乏或者FABP缺乏或者机能不 良。针对评估本发明的方法的该具体实施方案的基线水平通常基于来自同 样身体源作为测试样品的″正常″或者″健康″样品(即，同样的组织、细胞或 者体液)，详细讨论如下。
在本发明的该方法的一个实施方案中，所述的方法用来监测治疗患者中 颤蛋白缺乏或者机能不良、PUFA缺乏、脂肪酸结合蛋白缺乏或者机能不良， 或者与其相关的病症或者疾病的治疗成功或者失败，所述的患者已经诊断 出具有一种病症。在该实施方案中，颤蛋白表达或者生物活性的基线水平 通常包括源自待监测患者样品种检测的颤蛋白表达或者生物活性的在先水 平，因此，新颤蛋白表达或者生物活性的水平能够进行比较以判断颤蛋白、 PUFA和/或脂肪酸结合蛋白表达或者功能是降低、增加，或者基本上没有 变化，与以前或者第一个样品相比。此外，或者，已建立的颤蛋白表达或 者生物活性的″正常″或者″健康″基线水平能够用于该实施方案。该实施方案 容许医护人员监测患者治疗(例如，PUFA补充)的成功，或者失败，所述的 患者患有指定的病症(例如神经病症)，并且能够帮助医护人员判断治疗是否 应该调整(例如，PUFA补充是否应该增加、降低的，或者保持完全一样)。 在一个本发明的实施方案中，所述的方法包括调整针对患者的PUFA补充 治疗的另外的步骤，基于通过评价所述的患者中的颤蛋白表达和/或生物活 性判断PUFA缺乏是增加或者降低。
因此，本发明的诊断和监测方法包括比较患者样品中检测的颤蛋白表达 或者生物活性的水平以及颤蛋白表达或者生物活性的基线水平的步骤。根 据本发明，″基线水平″是对照水平，并且在一些实施方案中，颤蛋白表达或 者活性的正常水平以及颤蛋白表达或者生物活性的测试水平(即，患者样品 中)能够进行比较。因此基于颤蛋白表达或者生物活性的对照或者基线水平， 能够判断，评价的样品中颤蛋白表达或者生物活性是否具有可测量的增加、 降低或者基本上没有变化，与相比基线水平。与这里讨论，基线水平能够 为所述的患者中脂肪酸结合蛋白的水平和/或功能中的指标，并且具体地， 患者中PUFA水平(例如，DHA)，并且能够用来建立所述的患者中DHA和/ 或其他的PUFA补充的方案。例如，颤蛋白基线水平能够为正常(即，健康 或者阴性对照)患者的脑或者其他的组织中预期的DHA水平或者其他的 PUFA水平。因此，用来指颤蛋白表达或者生物活性基线水平的术语″阴性 对照″指利用源自患者的或者个体群样品已建立的基线水平，对于颤蛋白表 达和/或功能而言是正常的。在另一实施方案中，基线能够为DHA缺乏或者 脂肪酸结合蛋白缺乏或者机能不良的阳性诊断的指标。所述的基线水平， 还这里还称为″阳性对照″基线，指源自患者、另一患者，或者个体群样品已 建立的颤蛋白表达或者生物活性水平，其中样品中的颤蛋白水平或者功能 据信相应于DHA或者其他的PUFA或者脂肪酸结合蛋白缺乏或者相应于与 颤蛋白缺乏或者机能不良相关的疾病或者病症。在另一实施方案，基线水 平能够基于源自已经测试的患者的在先样品建立，因此患者的颤蛋白状况 和PUFA状况能够随之间监测。检测颤蛋白表达或者生物活性的方法已经 在上面详细描述。
建立颤蛋白表达或者活性基线水平的方法基于样品类型、获得样品的组 织或者器官、评价患者的状况，并且，如上讨论，测定的焦点或者目标(例 如，初始诊断、监测)。优选地，所述的方法与用于评价患者样品的方法相 同。
在一个实施方案中，颤蛋白表达或者生物活性基线水平已经利用源自患 者的自体同源的对照样品建立。自体同源对照样品能够为分离的细胞、组 织样品或者体液样品，并优选地体液样品。根据本发明，以及如本领域中 所使用的，术语″自体同源″指样品与待评价的样品来自同样的患者。优选地， 与待评价的样品一样，对照样品来自同样的流体、器官或者组织，这样对 照样品为待评价的样品充当最可能基线。该实施方案常常用于当源自患者 样品的水平已建立作为颤蛋白缺乏或者机能不良或者DHA缺乏的阳性或者 阴性诊断。然后该基线能够用来监测患者的进展，发展或者偏离疾病或者 病症，或者用来监测治疗(例如，PUFA补充)的成功。在该实施方案中，定 期评价样品(例如，以年为单位体检)，以及在各点确定通过脂肪酸补充的预 防或者治疗性治疗。对于首次评价，能够使用其他对照，如下所述，如果 需要的话，或者可以进行其他的测试以证实初始的颤蛋白缺乏或者机能不 良阴性或者阳性诊断，并且患者样品的颤蛋白表达或者生物活性数值能够 用作以后的基线。这种类型的基线对照通常用在其他的临床诊断步骤中， 其中″正常″水平可能随病人不同而异和/或其中在诊断的时候得到自体同源 对照样品不可能、不实际或者不有利。
另一种建立颤蛋白表达或者生物活性基线水平的方法是建立对照样品 的颤蛋白表达或者生物活性的基线水平，并且优选地对照样品来自匹配的 个体群。优选地对照样品为同样地样品类型，与用于颤蛋白表达或者生物 活性样品类型相比。根据本发明，术语″匹配的个体″指对照个体的匹配，基 于对要评价的细胞或者肿瘤生长的参数类型适合的一种或者多种特性。例 如，对照个体能够与待评价的患者在下述方面匹配：性别、年龄、种族或 者任何相关的生物或者可能影响对照个体以及患者基线(例如，在先存在的 病症、消费的特定的物质、其他的生物或者生理因素水平)社会学因素。例 如，正常个体血液中的颤蛋白表达水平在给定类型的个体较高(例如，老年 人与年轻人，妇女与男人)。为了建立对照或者颤蛋白表达或者生物活性的 基线水平，从匹配的个体得到许多样品并评价颤蛋白表达或者生物活性。 样品类型优选地为同样的样品类型并得自相同的器官、组织或者体液，与 测试患者待测的样品类型相比。建立合适对照水平需要的匹配的个体的数 目(例如，群)能够由本领域的普通技术人员确定，但是应该在统计学上适于 建立合适的基线以用于与待评价的患者(即，测试患者)进行比较。从对照样 品获得的数值进行统计学上处理以建立合适的基线水平，利用本领域建立 所述值的标准方法。
如上描述的基线，能够为阴性对照基线，如从明显正常对照个体群建立 的基线。或者，如上讨论，所述的基线能够利用已经阳性诊断为具有颤蛋 白缺乏或者机能不良的个体群建立，这样能够建立一或者多个基线水平用 于评价患者。然后将所述的患者样品中颤蛋白表达或者生物活性的水平与 每一种基线水平进行比较以确定哪种类型基线(阳性或者阴性)与患者的颤 蛋白水平统计学上最接近。应该意识到给定患者样品可能落在基线水平之 间，这样最佳的诊断是患者可能开始显示颤蛋白缺乏或者机能不良需要至 少一些脂肪酸补充的指标，并且可能在向更高阶段发展的过程中。本发明 的目标在于逆转、纠正，或者补偿所述的发展的疾病。
本领域的普通技术人员应该意识到基线不需要针对每个测定建立的，基 线能够参照关对于指定的对照样品在先确定的颤蛋白表达基线水平储存信 息的形式建立，如利用任何上述方法建立的基线水平。所述的储存信息的 形式能够包括，例如，但不限于，关于″正常″(阴性对照)或者阳性颤蛋白表 达的参考表、列表或者电子文件群或者个体数据；源自在先评价记录患者 数据的医学表格；或者可以用于患者诊断的关于基线颤蛋白表达的任何其 他的数据来源。
待评价样品中的颤蛋白表达或者生物活性的水平检测后，所述的水平与 已建立的颤蛋白表达或者生物活性基线水平相比，后者利用如上描述的方 法建立。并且此外，如上描述，优选地，所述用于待测样品的检测方法与 用于建立基线水平的方法相同或者质量上和/或定量相当，以使测试样品以 及基线的水平能够直接进行比较。在比较测试样品以及基线对照的时候， 判断测试样品在颤蛋白表达或者生物活性方面是否具有可以测量的降低或 者增加，相对于基线水平，或者在测试和基线水平之间是否存在统计学上 显著差异。在比较样品中的颤蛋白表达或者生物活性水平之后，最终的步 骤是作出诊断、监测，或者确定患者能够进行的治疗。
与基线水平相比，待测的样品(即，测试样品)中检测出降低水平的颤蛋 白表达或者生物活性(或至少一些大小形式的颤蛋白)，一般性地表明，与基 线样品相比，患者将具有降低的FABP水平以及降低的DHA或者其他的 PUFA掺入到脑组织中。更具体地，如果基线为正常或者阴性对照样品，与 对照样品相比，测试样品中检测出降低的颤蛋白表达或者生物活性表明具 有患者降低的以及可能不适当的DHA或者其他的PUFA水平(DHA或者其 他的PUFA缺乏)。如果基线样品是源自患者的在先样品(或者群对照)并且为 患者中颤蛋白缺乏或者机能不良阳性诊断的代表，与基线相比，样品检测 出降低的颤蛋白表达或者生物活性表明患者病症正在恶化、而不是改善并 且治疗应该重新评估或者调整。
与基线水平相比，在待测的样品(即测试样品)中检测出增加水平的颤蛋 白表达或者生物活性(或者至少一些颤蛋白大小形式)表明，与基线样品相 比，患者正经历更少的FABP表达或者功能，以及更少的DHA或者其他的 PUFA缺乏。更具体地，如果基线为正常或者阴性对照，与对照样品相比， 测试样品中检测出增加的颤蛋白表达或者生物活性表明测试样品可能还正 常并且可能患者比正常患者产生和/或消耗更多的DHA或者其他的PUFAs。 如果基线样品是源自患者(或源自群对照)的在先样品并且为患者颤蛋白缺 乏或者机能不良的阳性诊断(即，阳性对照)，与基线相比，样品中检测出增 加的颤蛋白表达或者生物活性表明测试样品预测具有改善FABP的水平或 者功能以及预计患者脑中具有增加的DHA或者其他的PUFAs。
最终，检测的颤蛋白表达与基线样品的颤蛋白表达或者生物活性统计学 上不存在显著地不同，表明与基线样品相比，测试样品中的FABP状况或者 DHA(或者其他的PUFA)状况没有显示差别。更具体地，如果基线为正常或 者阴性对照，测试样品中检测出颤蛋白表达或者生物活性与基线样品中不 存在统计学上显著地不同的，表明测试样品基本上正常并且目前不表现为 FABP或者DHA或者其他的PUFA缺乏或者与颤蛋白缺乏或者机能不良相 关的疾病或者病症。如果基线样品为源自患者(或者来自群对照)的在先样 品，并且为患者颤蛋白缺乏或者机能不良阳性诊断的标志(即，阳性对照)， 测试样品中检测出颤蛋白表达或者生物活性与基线样品中不存在统计学上 显著地不同的，表明患者具有充分地类似的颤蛋白缺乏或者机能不良并且 应该治疗。因此，所述的诊断可能提示医生目前进行的治疗，例如，对控 制该病症没有效果。
为了建立与基线水平相比颤蛋白表达或者活性变化的诊断，与已建立的 基线相比，颤蛋白表达或者活性的水平的变化量统计学上显著(即，至少95％ 置信水平，或者p＜0.05)。优选地，与基线水平相比，样品中颤蛋白表达或 者生物活性检测至少约5％变化，并且更优选地，至少约10％变化，并且更 优选地，至少约20％变化，并且更优选地，至少约30％变化，并且更优选 地，至少约40％变化，并且更优选地，至少约50％变化，产生在测试样品 和基线样品之间不同的诊断。在一个实施方案中，与基线水平相比，样品 中颤蛋白表达或者生物活性的1.5倍变化，并且更优选地，检测至少约3倍 变化，并且更优选地至少约6倍变化，并且更优选地，至少约12倍变化， 并且更优选地，至少约24倍变化的颤蛋白表达或者生物活性与相比基线水 平，得到与基线样品相比，颤蛋白表达或者活性显著变化诊断。
应该理解为在一些病症中，单个大小形式的颤蛋白的水平在血液中可能 实际上增加并且为例如脑中颤蛋白缺乏或者机能不良的治疗。在这些实施 方案中，所述的方法相应地进行调整。此外，对于更敏感的诊断或者监测 测定，检测单个的大小形式的颤蛋白并与基线对照进行比较。在这种方式 中，颤蛋白大小形式的整个谱能够相对于相应的基线谱进行评价。在该实 施方案中，样品中一些形式的颤蛋白与基线相比可能增加，而其他的形式 可能同时降低或者保持基本相同。在该实施方案中，比较颤蛋白表达或者 活性的变化并且以及该变化是否表明患者中FABP或者DHA或者其他的 PUFA缺乏的判断的作出，是通过与基线比较至少一个大小形式或者通过比 较整个谱进行的。评价患者中的颤蛋白形式谱详细地记载在PCT公开号 WO 03/063110中，这里以其整体引入作为参考。
一旦利用本发明的方法作出了颤蛋白缺乏或者机能不良的阳性诊断，需 要的时候，诊断能够利用任何合适的替代检测DHA(或者其他的PUFA)或者 FABP缺乏或者机能不良的方法进行确证。
诊断有颤蛋白缺乏或者机能不良的患者的治疗通过给药PUFA补充进 行提供，并且在一个实施方案中，优选地DHA补充。本发明记载了颤蛋白 表达以及活性用来预测患者脑或者其他的组织DHA的水平的用途，然后用 来提供适当剂量的DHA和/或其他的PUFA以补偿患者中颤蛋白缺乏或者机 能不良的作用。对患者提供的PUFA量记载在上文中，并且能够基于将患 者样品与已建立的对照样品进行比较而确定，其中对照样品与脑或者其他 的组织中的DHA水平相关，并且PUFA的需要量对患者提供益处。优选的 PUFA的剂量如上讨论。一个实施方案中，对患者提供最少量的PUFA补充 并且一段时间后对患者进行再评价(例如，数天、周或者月)以评价PUFA补 充对颤蛋白表达或者活性的作用，或者对与颤蛋白缺乏相关的症状或者疾 病或者病症作用。如果患者中没有显著变化或者改善，临床医护人员上调 PUFA补充并且在后续的时间点评价患者中的颤蛋白表达或者活性。除了评 价PUFA的补充量以外，对患者给药的PUFAs比率以及类型可以周期性地 进行调整。
在本发明的一个实施方案中，提供了一种鉴别神经祖细胞细胞的方法。 所述的方法包括检测细胞群中的颤蛋白表达或生物活性，其中确定水平的 颤蛋白表达或生物活性与神经祖细胞细胞相关。在一个实施方案中，所述 的方法还包括选择检测了颤蛋白表达或生物活性的神经祖细胞。
在另一实施方案中，本发明提供了一种监测神经发育的方法，包括：a) 提供包括神经祖细胞细胞的细胞群；b)检测细胞群中的颤蛋白表达或活性； c)将细胞群暴露在神经祖细胞将发展为分化的神经细胞的条件下；并且d) 监测经过步骤(c)之后的细胞中的颤蛋白的表达或活性，以评价神经祖细胞 向分化的神经细胞的发育。在此实施方案中，所述的方法能够包括在步骤(b) 之前或同时将步骤(a)的细胞群与推定的发育调节化合物接触，并测定推定 的调节化合物是否影响神经祖细胞向分化的神经细胞的发育，通过检测细 胞群中的颤蛋白表达或活性。
检测细胞中的颤蛋白表达或者活性能够按照前述讨论的方法进行。这里 使用的，术语″推定的调节化合物″指在具体的过程中具有未知或者以前未被 认识到的调节活性的化合物。上述用于识别本发明化合物的方法包括将测 试细胞与测试的化合物接触的步骤，以测试其调节神经祖细胞发育的能力， 利用颤蛋白表达作为追踪神经细胞分化以及发育的标志物。例如，测试细 胞能够在液体培养基中培养或者在固体培养基中生长，其中液体培养基或 者固体培养基包含测试的化合物。此外，液体培养基或者固体培养基包含 细胞生长必要的成分，如能被吸收的碳、氮以及微量营养素。
上述方法，一个方面，涉及将细胞与测试的化合物接触足够的时间以使 推定的调节化合物与影响细胞发育的成分相互作用。这里使用的术语″接触 时期″指在细胞与测试的化合物接触的时期。术语″孵育时期″指在评价前使 细胞生长的整个时间，并且能够包括接触时期。因此，孵育时期包括全部 的接触时期并且还可以包括测试的化合物还不存在但是在评分之前继续生 长的时期。本发明的细胞与推定的调节化合物接触的条件，如混合，是任 何合适的培养或者测定条件并包括有效的培养基，在其中细胞能够培养或 者其中细胞能够在存在或者不存在推定的调节化合物条件下倍评价。本发 明的细胞能够在多种容器中培养，包括，但是不限于，组织培养瓶，测试 管，微量滴定器皿以及皮氏培养皿。培养在适合细胞的一定的温度、pH以 及二氧化碳含量下进行。所述的培养条件在本领域中是公知的。细胞与推 定的调节化合物接触的时候考虑每个接触的容器细胞中的细胞的数目、与 细胞接触的推定的调节化合物浓度、推定的调节化合物与细胞的孵育时间 以及接触细胞的化合物的浓度。本领域的普通技术人员能够基于下述变量 确定有效的方案，如容器的大小、容器中液体的溶积、已知的针对测定中 使用的具体的细胞类型的培养条件，以及测试的推定的调节化合物(即，大 小、电荷等)的化学组成。推定的调节化合物优选的量包括在约1nM～约 10mM的推定的调节化合物/96孔板的孔。
根据本发明，本发明的方法适于用于患者为脊椎动物、哺乳动物，包括， 不限于灵长类、牲畜以及家庭宠物(例如，伴侣动物)。最通常，患者为人患 者。
提供下述下述实施例用于说明本发明而不在于用来限制本发明的范围。
实施例
实施例1：
婴儿患者样品中颤蛋白水平的定量测定以确定神经机能不良的性质以 及接受治疗
下述实施例证实了如何诊断孤独症以及因此进行的DHA治疗可以通过 测试患者样品中颤蛋白的浓度进行判断。
患者样品
患者血液样品通过在1月龄到18月龄的婴儿进行静脉穿刺或者抽取。 样品收集在包含抗凝血剂(EDTA或者肝素)的试管中，并且旋转以将血浆与 细胞沉淀分离。得到的血浆在-80℃冷冻直至需要。
对照样品
血液样品抽自合适的、疾病-阴性的对照对象，以如测试对象同样的方 式。类似地，得到的血浆在-80℃冷冻直至需要。
利用定量蛋白印迹定量测定颤蛋白水平
5微升的每位患者血浆稀释到SDS-PAGE样品缓冲液中并在95℃加热 10分钟以完全变性样品。适当量的各样品上样到固定浓度的分离胶顶部的 固定浓度的堆积胶的单道中。样品与稀释成多个已知浓度的血浆对照样品 以及适当的分子量标志分子一起上样。在标准的条件下进行电泳，将分开 的蛋白电印迹道纤维素膜上。将形成的点在包含1％BSA和0.1％Tween-20 的PBS中在室温封闭2小时。去除缓冲液并将斑点与包含5-10μg/mL of兔 抗-颤蛋白IgG抗体的封闭缓冲液孵育过夜。第二天洗涤斑点并用包含 5-10μg/mL偶联至辣根过氧化酶的羊抗-兔IgG的缓冲液在室温孵育1小 时。再次洗涤斑点并用化学发光底板曝光膜检测。利用抗-颤蛋白抗体，在 患者以及对照样品中检测到对应不同大小颤蛋白变体的不同分子量带。密 度计量学测量用于测量所述的患者中测试样品以及已知的对照样品中的颤 蛋白反应带。然后测定患者样品中的颤蛋白定量水平，通过将这些样品的 密度计量学结果与利用由包含多个已知浓度的颤蛋白的样品得到的曲线进 行比较。
分析
通过将所述的患者样品中各个不同大小形式的颤蛋白(颤蛋白成分)与 疾病-阴性对照样品中那些的水平进行比较，作出孤独症的诊断。所述的患 者样品中一或者多种颤蛋白形式的水平相对于对照样品的增加或者降低是 患者中孤独症的指示。
治疗和监测
基于如上测定的颤蛋白水平，设计针对患者的治疗方案。给药补充比正 常婴儿制剂更高水平的DHA和ARA的婴儿制剂进行预防性干预，直到婴 儿达到12月龄(例如，以约0.2g/天～约1g/天的剂量)。然后补充改变为约 1g的DHA/天，以单用扯掉胶囊的形式提供，直到婴儿达到3岁。
每3个月评估颤蛋白水平，如果颤蛋白水平没有增加平均基线水平85％ 的范围之内，剂量进行相应调整。
实施例2：
定量测定患者中的颤蛋白水平用于诊断精神分裂症
下述实施例证实如何诊断精神分裂症以及因此的用DHA的治疗疗程能 够通过定量测量外周血液样品中的颤蛋白水平而推动。
患者样品
血液样品通过对患者进行静脉穿刺抽取并将样品收集在包含抗凝血剂 (EDTA或者肝素)的管中。将样品离心以聪全细胞中取出血浆并将得到的血 浆在-80℃冷冻直至需要。
对照样品
血液样品抽自合适的、疾病-阴性对照对象，以如测试对象同样的方式。 得到的血浆类似地在-80℃冷冻直至需要。
通过荧光微量板免疫测定定量测定颤蛋白水平
50微升的每位患者的血浆在等体积的测定缓冲液中稀释两倍，测定缓 冲液由PBS以及0.5％BSA和0.05％Tween-20组成。包含已知浓度的颤蛋 白的对照样品也在测定缓冲液中进行连续稀释以构建已知的标准曲线。稀 释的样品和对照加入到黑色的聚苯乙烯微量板的每孔中，聚苯乙烯已经用 兔抗-颤蛋白N-端IgG抗体包被，并且然后由PBS和1％BSA和0.1％ Tween-20的封闭缓冲液封闭。使用的抗-颤蛋白包被抗体对在测定中测量的 所有3种大小形式的颤蛋白都特异的。稀释的样品在微量板孔中在37℃孵 育2小时，然后从孔中吸出来，并将孔用由PBS和0.1％Tween-20组成的洗 涤缓冲液洗涤4次。将孔中的吸水纸吸水干燥并加入100μL三种不同的兔 抗-颤蛋白IgG抗体的混合物加入至板的各孔中，每种抗体偶联不同的荧光 探针并且稀释的1-10μg/ml的测定缓冲液溶液。各个不同的抗-颤蛋白检 测抗体对测量的三种不同的大小形式颤蛋白中的每一种都是特异的。将 孔在37℃孵育1小时，并且然后用洗涤缓冲液洗涤4次。将孔中的吸水纸 吸水干燥，并向各孔中加入100μL的PBS。然后将微量板在荧光微量板读 数器中读数，读数器设置成测量即时的荧光，利用针对每种抗体-荧光探针 偶联物的合适的激发以及发射滤波器组。测量各种荧光探针的发射强度， 并将其与在已知的标准中得到的测量进行比较，能够确定每个患者或者对 照样品中的每种大小形式的颤蛋白的浓度。
分析
通过比较所述的患者样品中每种不同的大小形式的颤蛋白(颤蛋白成分) 水平以及疾病-阴性对照样品中不同大小形式的水平，作出精神分裂症诊断。 所述的患者样品中一或者多种颤蛋白形式的水平相对于对照样品的增加或 者降低是患者中精神分裂症的指示。
治疗以及监测
基于如上测定颤蛋白的水平，设计针对患者的治疗方案。通过以约0.2g/ 天～约1g/天的剂量给药胶囊形式的DHA，实现治疗性干预。然后通过每2 个月监测循环的颤蛋白水平，并与临床症状关联。如果在6～8月内，颤蛋 白水平不增加显著地或者临床症状不改善或者减轻，能够增加DHA的剂量 并且还补其他的脂肪酸化合物，包括其他的n-3脂肪酸前体。
实施例3：定量测定患者中的颤蛋白水平用于诊断双相性精神障碍病 症。
下述实施例证实如何诊断双相性精神障碍以及因此的用DHA的治疗疗 程能够通过定量测量外周血液样品中的颤蛋白水平而推动。
患者样品
血液样品通过对患者进行静脉穿刺抽取并将样品收集在包含抗凝血剂 (EDTA或者肝素)的管中。将样品离心以聪全细胞中取出血浆并将得到的血 浆在-80℃冷冻直至需要。
对照样品
血液样品抽自合适的、疾病-阴性对照对象，以如测试对象同样的方式。 得到的血浆类似地在-80℃冷冻直至需要。
用多孔荧光蛋白微芯片免疫测定定量测定颤蛋白水平利
25微升的每位患者的血浆在75mL的测定缓冲液中稀释4倍，测定缓 冲液由PBS以及0.5％BSA和0.05％Tween-20组成。包含已知浓度的颤蛋 白的对照样品也在测定缓冲液中进行连续稀释以构建已知的标准曲线。稀 释的样品以及对照加入到载玻片上的各孔中，在其上不同的兔抗-颤蛋白 IgG捕获抗体保持距离斑点的形式已经印在上面。各孔包含多个斑点，每个 点相应于针对测量的不同的大小形式的颤蛋白的三种捕获抗体特异中的一 种，以二维的形式排列。除了固定个体捕获抗体以外，载玻片的各孔还用 PBS和1％BSA和0.1％Tween-20进行封闭。载玻片上的各孔中的稀释的样 品和对照在37℃在湿度室中孵育2小时。孵育后，吸干各孔并将孔用由PBS 和0.1％Tween-20组成的洗涤缓冲液洗涤4次。将孔吸水纸干燥后，向各 孔中加入100mL测定缓冲液，缓冲液包含0.5-5mg/ml的对所有三种测量 的大小形式颤蛋白广泛特异的生物素标记的兔抗-颤蛋白IgG抗体。然后将 载玻片在37℃在湿度室中孵育1小时。孵育后，吸干各孔并将孔用洗涤缓 冲液洗涤4次，将孔吸水纸干燥后。此时，向各孔中加入100mL的测定缓 冲液，缓冲液包含10-20mg/ml偶联荧光探针的链亲和素。然后将载玻片在 室温在湿度室中孵育1小时，吸干各孔并将孔用洗涤缓冲液洗涤4次，从 载玻片上小心地撤去各孔并将整个载玻片在去离子水中清洗并在氮气气流 下干燥。一旦干燥，将载玻片在激光共聚焦扫描仪中扫描，发射滤波器对 测定中使用的。链亲和素-荧光探针偶联物合适。得到载玻片的数字、双位 图像，并且利用微阵列图像分析软件测定所有点的强度。通过比较所述的 患者样品孔中各种个体颤蛋白斑点的强度以及已知的标准曲线孔中的相应 点的强度。就能够确定在各个患者或者对照样品中的各种大小形式的颤蛋 白的浓度。
分柝
通过比较所述的患者样品中每种不同的大小形式的颤蛋白(颤蛋白成分) 水平以及疾病-阴性对照样品中不同大小形式的水平，作出双相性精神障碍 病症诊断。所述的患者样品中一或者多种颤蛋白形式的水平相对于对照样 品的增加或者降低是患者中双相性精神障碍病症的指示。
治疗和监测
基于如上测定颤蛋白的水平，设计针对患者的治疗方案。通过以约0.2g/ 天～约1g/天剂量补充乳剂形式的DHA形式的食品，能够对患者实现治疗 性干预。监测患者的心理或者行为变化，并且每3个月获取血液样品以测 定循环的颤蛋白水平。根据患者持续的心理或者行为情形，以及其颤蛋白 水平，可以调节治疗以提供不同的剂量的DHA或者不同的DHA制剂以及 其他的脂质。
实施例4
该实施例证实了与野生型和杂合的动物或者雌性动物相比，雄性、纯合 的突变的reeler小鼠的颞叶中具有显著地升高的DHA含量，并且与野生型 和杂合的动物相比，纯合的突变的reeler动物具有显著地升高的颞叶ARA。
″Reeler小鼠″(rein1n)为对表达细胞外信号糖蛋白颤蛋白的基因纯合的隐 性小鼠，并且表现″突变的reeler表型″，并且由于颤蛋白水平的不足显示出 发育以及明显的运动的缺陷。颤蛋白在身体的各种组织中表达，包括脑、 肝脏、肾脏以及视网膜以及脊髓。由于颤蛋白是脑以及其他的组织中的DHA 水平的生物标志物，颤蛋白缺乏还能够通过治疗性使用DHA进行纠正。
如源自Jackson Laboratories，Bar Harbor，Maine中的材料所述，纯合的 reeler小鼠在约2周龄的时候显示共济失调步态、张力障碍的体态以及战栗。 这些突变体不能保持其后腿及臀部直立并且通常在运动中跌倒。生存能力 以及生殖力极大地降低。杂合子从视觉上不能与野生型对照区别并因此必 须进行基因型评估以证实存在reeler基因。行为表型是由于严重地小脑发育 不全所导致。
本发明者进行的下述研究判断颤蛋白是否能够充当中枢神经系统中长 链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)缺乏的基于血清生物标志物。
具体目标：为了评价正常或者异常颤蛋白表达小鼠的脑组织中的长链多 不饱和脂肪酸状况差异是否明显。
材料和方法：36只在6以及12周龄之间的动物用于该实验。该组包含 带有两个拷贝的颤蛋白基因突变的小鼠(纯合的，n＝12)；带有一个拷贝的颤 蛋白基因突变的小鼠(杂合的；n＝12)，以及在颤蛋白基因中无突变的小鼠(野 生型；n＝12，对照)。在各基因型组中，雄性和雌性的数量大约相等。通过 表型确定纯合的reeler突变的小鼠。杂合的reeler突变的小鼠和正常野生型 对照进行基因分型以确定。在研究过程中，小鼠喂食正常啮齿动物食物。
小鼠脑组织脂肪酸分析：小鼠脑组织直接分析脂肪酸含量。样品中的总 脂质进行皂化并转化成脂肪酸甲基酯然后分析。简言之，小鼠颞叶在-80℃ 冻存直至分析。分析前冻干样品。冻干样品直接称量到螺帽测试管中，玻 璃棒研磨成粉。包含内标(十九酸甲酯的1.0mL甲苯加入到样品中，同时加 入1.0mL的0.5N NaOH。将管充入氮气，密封，并在加热块中在约100℃ 加热约5分钟。移出管并使之冷却。向管中加入2mL的14％BF3的甲醇溶 液，向管中充入氮气并密封。将管在加热块中在约100℃加热约30分钟。 30分钟之后，移出管并使之冷却。向管中加入一毫升的饱和的氯化钠水溶 液并将管涡旋。分层并将有机层取出用于分析。在配备有焰离子化检测器 的Agilent Technologies气相色谱(型号5890)上，通过带有火焰离子化检测 (GLC-FID)的气-液色谱分析脂肪酸甲基酯。脂肪酸甲基酯在30米 FAMEWAX毛细管柱(Restek，Bellefonte，PA；0.25mm直径，0.25μm涂层 厚度)中进行分离，利用氦流速为2.0mL/分，裂分率为15∶1。色谱运行参 数包括加热室起始温度130℃，以5℃/分钟的速率增加至225℃，保持20 分钟，然后以15℃/分钟增加至250℃，最终保持5分钟。注射器以及检测 器分别恒定在220℃以及230℃。通过与源自NuCheck Prep(Elysian，MN， U.S.A.)的脂肪酸甲基酯标准混合物的保留时间进行比较确定各峰。单个的 脂肪酸表述为总脂肪酸的百分比(重量百分比)。
数据利用2-way全面线性模型ANOVA进行分析，p＜0.05。当存在相 互作用的时候，利用t-检测评估平均值之间的显著差异。
结果：
颞叶中的二十二碳六烯酸含量
主要结果：颞叶中的DHA含量的显示在表1中。在不同的颤蛋白表达 水平的小鼠的颞叶中的DHA脂肪酸组成方面差异不显著(P＝0.406)。雄性或 者雌性小鼠颞叶中的DHA脂肪酸组成没有差异(P＝0.267)。但是，不同的组 以及性别相互作用是明显的(P＝0.019)，使各基因型-性别亚组可以进行具体 的统计学比较。这种比较表明最高水平的颞叶DHA在纯合的雄性reelers 中是很明显的，并且最低水平的DHA存在纯合的雌性reelers中(P＝0.006)。
与杂合的雄性相比，纯合的雄性reeler小鼠具有显著地更高的颞叶DHA 含量，但是与野生型雄性相比并非如此。纯合的雌性动物中的颞叶DHA含 量没有显著地随基因型而呈现出差异。
表1：颞叶DHA含量(wt％，总脂肪酸) 野生型 纯合的 杂合的 所有的 雌性 雄性 19.51±0.24 19.62±0.39ab 19.40±0.31ab 19.62±0.21 19.10±0.25a 20.18±0.12b 19.29±0.15 19.34±0.29ab 19.22±0.11a
注意：平均值±sem表明不同的上标在p＜0.05的水平是显著地不同的；在为雄性动物的情形下， 野生型动物颞叶中的DHA含量低于纯合的动物，但是没有达到本研究规定的显著的水平(p＝0.055)。 纯合的雌性与纯合的雄性不同，p＜0.05。
结论：在颞叶中，雄性、纯合的突变的reeler小鼠具有显著地升高的 DHA含量。
结果：
颞叶中的花生四烯酸含量
主要结果：在不同的基因型的小鼠之间，颞叶DHA含量显著差异是明 显的(P＝0.004)。纯合的reeler动物具有更显著地颞叶ARA，与野生型动物 相比(P＜0.001)，但是与杂合的动物相比具有类似的颞叶ARA。杂合的小鼠 的颞叶ARA含量高于野生型动物，但是没有达到统计学显著的标准 (P＝0.061)。在雄性和雌性动物之间的颞叶ARA含量没有显著差异。
相互作用结果：在基因型和性别之间没有显著的相互作用。
表2：颞叶花生四烯酸含量(wt％，总脂肪酸) 野生型 纯合的 杂合的 所有的 雌性 雄性 9.43±0.16a 9.37±0.15 9.50±0.29 10.26±0.21b 10.05±0.27 10.48±0.16 9.87±0.16ab 9.77±0.31 9.98±0.06
数据为平均值±sem。与野生型或者杂合的基团相比，纯合的突变的reeler动物具有显著地升高 的颞叶ARA。在雄性和雌性动物之间颞叶的ARA含量不存在显著差异。
结论：纯合的突变的reeler动物具有显著地升高的颞叶ARA。
实施例5
下述实施例证实了在颤蛋白和红细胞HUFA状况之间的相互关系。具 体地，本发明者确定了具有不同的水平颤蛋白表达的动物是否在红细胞中 表现出不同的DHA和ARA含量。
材料和方法：(与上述实施例4相同)。
结果：
表3：性别/红细胞脂肪酸含量(wt％，总脂肪酸) 基因型 性别 (n) DHA (n) ARA 对照 对照 对照 Homo Homo Homo Hetero Hetero Hetero 雌性 雄性 所有的 雌性 雄性 所有的 雌性 雄性 所有的 6 6 12 6 6 12 6 5 11 4.92±0.39a 6.15±0.20a 5.54±0.28a 5.13±0.64a 6.13±0.32ac 5.63±0.37a 3.66±0.35bc 5.86±0.49a 4.66±0.44a 6 6 12 6 6 12 6 5 12 6.10±0.49ab 6.98±0.36a 6.54±0.32a 6.72±0.76b 7.84±0.28a 7.29±0.42a 4.61±0.40b 6.52±0.67a 5.56±0.47a
各栏中具有不同上标的平均值差异显著(P＜0.05)
总结：
RBC DHA
主要结果：在具有不同基因型的动物之间的RBC DHA含量没有观察到 统计学上显著差异。与雌性动物相比，雄性动物具有显著地更高的RBC DHA含量(6.06±0.76 vs 4.57±1.29％)。
相互作用结果：对于RBC DHA，在不同的基因型和性别之间没有检测 到显著的相互作用。
结论：不同的颤蛋白状况的小鼠中RBC DHA含量没有呈现出差异。 雄性的RBC DHA含量高于雌性RBC DHA的含量。
RBC ARA
主要结果：对于RBC ARA含量，在具有不同的基因型以及性别的动物 之间观察到统计学上显著差异，分别为(P＜0.01)以及(P＜0.005)。具有2个 拷贝的突变的颤蛋白基因的小鼠具有显著地更低水平的RBC ARA，与具有 1个拷贝的突变的颤蛋白基因的小鼠相比。与具有一个或者2个拷贝的突变 的颤蛋白基因的小鼠相比，野生型对照的RBC ARA含量差异不显著。与 雌性动物相比，雄性动物具有显著地更高的RBC ARA。
相互作用结果：对于RBC ARA，在不同的基因型和性别之间没有检测 到显著的相互作用。
结论：小鼠的RBC ARA含量被颤蛋白状况所限制。具有低颤蛋白状况 的小鼠倾向于具有低RBC ARA水平。与雌性相比，雄性动物倾向于显著地 更高的RBC ARA。
实施例6
下述实施例证实了对具有异常reeler基因表达的小鼠提供DHA能够减 少带有reeler显型症状的雄性后代的数目。在下述实验中，本发明者测试 了对缺乏一个或者多个正常颤蛋白基因的小鼠，LC-PUFA饮食富集(DHA) 是否纠正在颤蛋白-缺乏小鼠观察到的颤蛋白组织病理学/症状以及是否能 正常化脂肪酸谱。具体地，本发明者评价了富集长链多不饱和脂肪酸(DHA) 的饮食是否能够纠正或者调节颤蛋白-缺乏小鼠中的颤蛋白组织病理学/症 状。
材料和方法：颤蛋白给食研究由Martek Biosciences Corporation发起并 由Jackson Labs，Bar Harbor，Maine(Stock used：300235 B6C3Fe a/a-Reln
结果：
DHA足量饮食：
出生的94只幼仔中，14只小鼠(10F，4M)观察具有reeler表型(14.8％)。 40只雄性中的4只(10％)表现reeler表型。54只雌性中的10只(18.5％)表现 出reeler表型。
DHA缺乏饮食：
出生的89只幼仔中19只小鼠(8F，11M)观察具有reeler表型(或者21.3％。 40只雄性中的11只(27.5％)表现reeler表型，而48只雌性中的8只(16.6％) 表现出reeler表型。
秩和分析表明与DHA缺乏饮食组相比，显著地在DHA足量饮食组中 出生的reeler小鼠更少。此外，秩和分析检测雄性reeler小鼠的出生率表明 在怀孕以及哺乳期间提供DHA以及在断奶之后对幼仔提供DHA以几乎3- 倍的方式降低雄性reeler动物出生率(P＝0.04)。DHA缺乏饮食组中，40只 雄性中的11只雄性，或者27.5％的雄性显示reeler表型，而DHA足量饮食 组中，40只雄性中只有4只，或者10％的雄性显示reeler表型。
表4：DHA足量和DHA缺乏饮食vs％Reeler表型 平均 喂食天数 出生 幼仔 雄性Reeler 小鼠表型％ 雌性Reeler 小鼠表型％ 总％ Reeler小鼠 DHA足量饮食 28 94 4/40(10％) 10/54(18.5％) 14/94(14.8％) DHA缺乏饮食 27 89 11/40(27.5％) 8/48(16.6％) 19/89(21.3％) DHA补充饮食的雄性reeler小鼠的出生率显著地低于DHA缺乏饮食的雄性reeler小鼠的出 生率。在饮食组之间，reeler小鼠(雄性加上雌性)的总的出生率没有表现出不同。
结论：在怀孕期间对颤蛋白-缺乏小鼠补充DHA能够充分地减少带有 reeler表型的雄性后代的数目。
实施例7：饮食DHA对红细胞脂肪酸含量的调节
下述实施例显示了处于颤蛋白状况以及饮食DHA暴露下的小鼠的红细 胞DHA和ARA中的变化。具体地，发明者确定了饮食含量是否能够纠正 不同的颤蛋白状况小鼠中的RBC的脂肪酸组合物的差异。由于发明者上 面显示了带有突变的颤蛋白基因表达的雄性小鼠倾向于具有异常高RBC ARA含量，确定了DHA补充是否能够调节带有突变的颤蛋白基因的雄性 小鼠RBCs中的ARA表达。
材料和方法：颤蛋白给食研究由Martek Biosciences Corp.发起并在 Jackson Labs，Bar Harbor，Maine(Stock used：300235 B6C3Fea/a-Reln
小鼠红细胞的脂肪酸分析：提取小鼠红细胞(RBCs)并分析脂肪酸含量。 样品中的总脂质进行皂化并转化成脂肪酸甲基酯然后分析。简言之，RBCs 在-80℃冻存直至分析。包含内标(二十三酸甲酯)的50微升的氯仿加入到带 螺帽的测试管中。在氮气气流下蒸发氯仿。将约300微升样品加入到内标 中，同时加入1.5mL的1∶2氯仿∶甲醇。将管密封并涡旋约30秒。将管 放置在冰中超声约20分钟。20分钟后，取出管并向管中加入一毫升的氯仿 和一毫升水。将管涡旋约30秒并在约2000rpm离心约10分钟。将下层转 移至另一螺帽测试管中，并在氮气气氛下蒸发。向样品中加入1毫升甲苯， 同时加入1.0mL的0.5N NaOH。将管充入氮气、密封并在加热块中在约100 ℃加热约5分钟。移出管并使之冷却。向管中加入2mL的14％BF3的甲醇 溶液，向管中充入氮气并密封。将管在加热块中在约100℃加热30分钟。 30分钟之后，移出管并使之冷却。向管中加入一毫升的饱和的氯化钠水溶 液并将管涡旋。分层并将有机层取出用于分析。在配备有焰离子化检测器 的Agilent Technologies气相色谱(型号5890)上，通过带有火焰离子化检测 (GLC-FID)的气-液色谱分析脂肪酸甲基酯。脂肪酸甲基酯在30米 FAMEWAX毛细管柱(Restek，Bellefonte，PA；0.25mm直径，0.25μm涂层厚 度)中进行分离，利用氦流速为2.0mL/分，裂分率为15∶1。色谱运行参数 包括加热室起始温度130℃，以5℃/分钟的速率增加至225℃，保持20分 钟，然后以15℃/分钟增加至250℃，最终保持5分钟。注射器以及检测器 分别恒定在220℃以及230℃。通过与源自NuCheck Prep(Elysian，MN，U.S.A.) 的脂肪酸甲基酯标准混合物的保留时间进行比较确定各峰。单个的脂肪酸 表述为总脂肪酸的百分比(重量百分比)。
结果：
DHA
与喂食包含0.5％重量DHA的预制的饮食的动物相比，喂食预制的DHA 缺乏的饮食的动物显著地具有低水平的RBC DHA。纯合子以及雄性杂合子 更易于出现饮食DHA缺乏的作用，由于这些动物具有显著地更低水平的 RBC DHA，与喂食DHA缺乏饮食的野生型对照雄性和雌性以及杂合的雌 性动物相比。将DHA加入到饮食中显著地增加所有组中的RBC DHA水平。 但是，在带有突变的颤蛋白基因的雌性动物上，DHA补充饮食没有完全将 RBC DHA的水平恢复到在野生型对照动物中观察到的水平。具体地，喂食 DHA补充饮食的纯合的雌性具有显著地更低的RBC DHA，与喂食DHA足 量饮食的所有其他的基因型/性别小组相比。喂食DHA补充饮食的杂合的雌 性具有显著地更低的RBC DHA，与野生型对照雌性相比。雄性杂合的以及 纯合的动物中，DHA补充饮食恢复RBC DHA水平至在野生型雄性中观察 的类似的水平。
表5：红细胞/DHA含量(wt％，总脂肪酸) 平均值±SD 黄 平均值±SD 绿 DHA 缺乏饮食 (n) DHA 足量饮食 (n) 对照 对照 杂合的 杂合的 纯合的 纯合的 雌性 雄性 雌性 雄性 雌性 雄性 4.06±0.34a 3.60±0.06a 3.71±0.06a 3.29±0.10b 3.20±0.13b 2.94±0.30b 3 3 3 3 3 3 11.20±0.21c 10.92±0.45cd 10.12±0.25d 10.29±0.52cd 7.99±0.47e 10.23±1.17cd 4 3 3 3 5 3 a vs b a vs c，d，或者e b vs c，d或者e c vs d c或者d vs e d vs c P＜0.05 P＜0.0001 P＜0.001 P＜0.05 P＜0.0001 P＜0.0001
结论：带有1或者2拷贝颤蛋白基因的雌性动物的红细胞DHA含量通 过给食包含0.5％DHA重量的饮食不能完全正常化。当喂食包含0.5％DHA 重量的饮食的时候，带有1或者2拷贝的颤蛋白基因的雄性动物的RBC DHA含量以类似于野生型对照动物中的方式被调节。
ARA
喂食未预制的DHA的饮食动物的红细胞ARA水平显著地高于喂食包 含0.5％DHA重量饮食动物的RBC ARA水平。在喂食预制的DHA缺乏饮 食的动物中，野生型对照和杂合的reeler小鼠的RBC ARA水平显著地高于 在纯合的reeler小鼠中检测的水平。给食包含0.5％DHA的饮食抑制RBC ARA水平约2-倍并且消除了在基因型小组之间的RBC ARA水平的差异。 当动物喂食0.5％DHA重量的时候，RBC ARA水平在雄性和雌性动物之间 没有检测到显著差异，或者在基因型之间也没有检测到差异。
表6：红细胞/ARA含量(wt％总脂肪酸)
RBC ARA(wt％) 对照 杂合的 纯合的 a vs b DHA缺乏饮食 DHA足量饮食 平均值±sem (n) (n) 15.72±0.48b 6 6.84±0.61a 7 14.89±1.47b 6 6.45±0.77a 6 12.51±1.77c 5 6.14±0.95a 6 P＜0.0001 a vs c P＜0.0001 b vs c P＜0.001
结论：接受无预制DHA的饮食的动物倾向于具有高水平的RBC ARA。 低颤蛋白表达与低RBC DHA含量相关。饮食DHA抑制ARA掺入到RBC 膜中并补偿了野生型对照以及具有低颤蛋白表达的动物(即，杂合子和纯合 子)中的RBC ARA含量。
各篇参考文献以及公开这里以其整体引入作为参考。U.S.临时申请号 60/537,600，2004年1月19日提交，以及U.S.临时申请号60/605,219，27，2004 年8月27日提交，这里以其整体引入作为参考。
尽管本发明的各种实施方案已经进行了详细的描述，这些实施方案的 修改以及改写对本领域的普通技术人员而言是显而易见的。应该清楚地理 解为，这些修改以及改写都在如后续的权利要求阐释的本发明的范围之内。
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