技术领域
[0001] 本
发明涉及组织工程皮肤增殖分化活力检测技术领域，具体是涉及一种hAECs-DED组织工程皮肤增殖分化活力的检测方法。
背景技术
[0002] 应用组织工程技术构建人工皮肤是解决大面积皮肤缺损患者自体皮移植时供皮不足问题的最有效的途径之一。从临床应用
角度考虑,用于体外三维培养构建的组织工程皮肤应满足以下三个基本条件(1)具有特定的分化表型或定向分化潜能；(2)细胞的来源可靠；(3)移植后不引发排斥反应。我们选择的hAECs是非常理想的
种子细胞。另我们选择的真皮替代物DED，由于它部分保留了基底膜成分，如
胶原蛋白，板层素等，理论上具备了诱导表皮发育、增殖和分化的初始条件。体外重建的人工皮肤应具有与正常皮肤相似的组织结构和功能，关键是应具备正常表皮增殖和分化的某些特征。本发明就是在体外应用hAECs接种在DED上，构建出与正常皮肤类似的组织工程皮肤，对hAECs-DED组织工程皮肤增殖分化活力进行检测。
发明内容
[0003] 本发明解决的技术问题是提供一种hAECs-DED组织工程皮肤增殖分化活力的检测方法，以评估构建的组织工程皮肤的功能。
[0004] 本发明的技术方案是：
[0005] 一种hAECs-DED组织工程皮肤增殖分化活力的检测方法，包括以下步骤：
[0006] 1)构建hAECs-DED组织工程皮肤结构：以人羊膜上皮细胞(hAECs)作为种子细胞，以人去表皮的真皮组织(De-epidermized dermis,DED)作为
支架材料，将种子细胞种植于支架材料上构建hAECs-DED组织工程皮肤；
[0007] 2)组织工程皮肤
组织学观察：将体外培养的hAECs-DED组织工程皮肤气-液面培养2周后进行肉眼观察，主要观察表面是否光滑，是否有膜状物形成；再进行常规
石蜡切片(约
4um)，苏木精-伊红
染色(HE染色)，在光镜下观察组织学特征，观察新生表皮结构是否清晰，层次是否分明，角质层角化是否完全，细胞排列是否整齐；
[0008] 3)免疫组化染色：包括广谱细胞角蛋白免疫组化染色(CKpan染色)、
波形蛋白免疫组化染色(vimentin染色)、Ki67免疫组化染色、角蛋白19(CK19)免疫组化染色、角蛋白18(CK18)免疫组化染色、角蛋白14(CK14)免疫组化染色、角蛋白10(CK10)免疫组化染色、丝聚合蛋白(Filaggrin)免疫组化染色、过碘酸
雪夫氏染色(PAS)、Ⅳ型胶原染色、层粘蛋白染色(laminin染色)、桥粒芯蛋白免疫组化染色(desmoglein)；
[0009] 4)透射电镜观察组织工程皮肤超微结构，并拍片；主要观察
细胞质内线粒体(mitochondria，Mt)和角蛋白细丝(keratin filaments,KF)结构、以及相邻的细胞膜上的细胞桥粒(desmosomes，D)结构、新生表皮与DED之间是否可见基底膜结构，以及基底膜带的近表皮侧是否可见半桥粒(Hemidesmosomes，HD)结构。
[0010] 进一步地，在上述方案中，步骤2)所述苏木精-伊红染色(HE染色)的具体操作方法为：二
甲苯4min，二甲苯4min，二甲苯4min,100％
乙醇4min,100％乙醇4min,95％乙醇4min,95％乙醇4min,95％乙醇4min,70％乙醇4min,蒸馏
水,苏木素染色4min,水洗5min,伊红染色3Osec,70％乙醇15sec,70％乙醇15sec,95％乙醇15sec,95％乙醇15sec,100％乙醇
3Osec,100％乙醇3Osec,二甲苯5min,二甲苯5min,固定，封片。
[0011] 进一步地，在上述方案中，步骤3)所述广谱细胞角蛋白免疫组化染色(CKpan染色)的方法为：取石蜡包埋的标本，连续切片，常规免疫组化染色，一抗为小鼠抗人pan-Cytokeratin
抗体(1:100)，二抗为辣根过
氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，ABC法，二
氨基联苯胺显色，苏木素复染；以PBS代替一抗做阴性对照；
[0012] 所述波形蛋白免疫组化染色(vimentin染色)的方法为：取石蜡包埋的标本，连续切片，常规免疫组化染色，一抗为鼠抗人vimentin单抗(1:100)，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，ABC法，二氨基联苯胺显色，苏木素复染，以PBS代替一抗做阴性对照；
[0013] 所述Ki67免疫组化染色的方法为：取石蜡包埋的标本，连续切片，常规免疫组化染色，一抗为鼠抗人Ki67单抗(1:50)，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，ABC法，二氨基联苯胺显色，苏木素复染；以PBS代替一抗做阴性对照；
[0014] 所述角蛋白19(CK19)免疫组化染色的方法为：取石蜡包埋的标本，连续切片，常规免疫组化染色，一抗为鼠抗人CK19单抗(1:100)，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，ABC法，二氨基联苯胺显色，苏木素复染，以PBS代替一抗做阴性对照；
[0015] 所述角蛋白18(CK18)免疫组化染色的方法为：取石蜡包埋的标本，连续切片，常规免疫组化染色，一抗为鼠抗人CK18单抗(1:100)，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，ABC法，二氨基联苯胺显色，苏木素复染，以PBS代替一抗做阴性对照；
[0016] 所述角蛋白14(CK14)免疫组化染色的方法为：取石蜡包埋的标本，连续切片，常规免疫组化染色，一抗为鼠抗人CK14单抗(1:100)，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，ABC法，二氨基联苯胺显色，苏木素复染，以PBS代替一抗做阴性对照；
[0017] 所述角蛋白10(CK10)免疫组化染色的方法为：取石蜡包埋的标本，连续切片，常规免疫组化染色，一抗为鼠抗人CK10单抗(1:100)，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，ABC法，二氨基联苯胺显色，苏木素复染，以PBS代替一抗做阴性对照；
[0018] 所述丝聚合蛋白(Filaggrin)免疫组化染色的方法为：取石蜡包埋的标本，连续切片，常规免疫组化染色，一抗为鼠抗人Filaggrin单抗(1:100)，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，ABC法，二氨基联苯胺显色，苏木素复染，以PBS代替一抗做阴性对照；
[0019] 所述过碘酸雪夫氏染色(PAS)的方法为：检测组织工程皮肤基底膜情况。染色步骤:脱蜡，水洗，0.5％过碘酸(Periodicacid)溶液1Omin,蒸溜水漂洗,雪夫(Schiff)氏液1Omin,蒸溜水漂洗,1％亚
硫酸氢钠(Sodium bisulfite)溶液两次，每次3min,水洗5min,脱水固定，
封存，染色结果判断:基底膜染为紫红色为阳性反应；
[0020] 所述Ⅳ型胶原染色的方法为：观察组织工程皮肤基底膜成分。取石蜡包埋的标本，连续切片，常规免疫组化染色，一抗为鼠抗人type IV collagen单抗(1:150)，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，ABC法，二氨基联苯胺显色，苏木素复染，以PBS代替一抗做阴性对照。
[0021] 所述层粘蛋白染色(laminin染色)的方法为：观察组织工程皮肤基底膜成分。取石蜡包埋的标本，连续切片，常规免疫组化染色，一抗为鼠抗人laminin单抗(1:150)，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，ABC法，二氨基联苯胺显色，苏木素复染，以PBS代替一抗做阴性对照；
[0022] 所述桥粒芯蛋白免疫组化染色(desmoglein)的方法为：取石蜡包埋的标本，连续切片，常规免疫组化染色，一抗为鼠抗人desmoglein-3单抗(1:100)，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，ABC法，二氨基联苯胺显色，苏木素复染，以PBS代替一抗做阴性对照。
[0023]
细胞增殖标记物为Ki-67，通过其免疫组化染色可观察到增殖细胞的细胞核染色，从而提供了一个可以评估角质形成细胞分裂和表皮增殖的量化指标。细胞角蛋白是中间丝蛋白家族，共分为两个类型，Ⅰ型角蛋白包括上皮细胞角蛋白K9-K23、K25-K28和毛发角蛋白K31-K40，II型角蛋白包括20种上皮角蛋白K1-K8、K71-K80和6种毛发角蛋白K81-K86。角蛋白是表皮分化的标志，不同的角蛋白特异表达在特定的组织中。角蛋白18(CK18)分子量为44kDa，pH值为5.5。外胚层的上皮细胞和人
胎儿皮肤均表达CK18，故CK18是简单上皮的标志。随着表皮的生长发育，在成熟的表皮中CK18不表达。CK14分子量为50kDa，pH值为5.3。
CK14是一个重要的复层表皮细胞的角蛋白。CK14在基底细胞的和毛囊外根鞘的上部合成，毛囊外根鞘的部分远端的的基底细胞和创伤边缘的基底细胞可产生少量的CK14，但随其分化CK14的合成增加。CK5/CK14在复层表皮的基底层表达,在复层上皮的基底上层细胞中，CK14的表达减少或不表达。CK14的表达与基底细胞的核分裂能力和多能性相关。CK10分子量为56.5kDa，pH值为5.3，它是复层角化上皮基底上层细胞中主要的Ⅰ型角蛋白。在正常的皮肤结构中，它表达于表皮基底层以上的角质形成细胞。CK10可与II型角蛋白CK1形成异二聚体，它们是由表皮的基底上层细胞产生，因此它们被认为是复层角化上皮终末分化的标志。故在正常皮肤组织中，简单上皮的标志CK18不表达，表皮基底层的角质形成细胞在基底膜蛋白成分的诱导下表达角蛋白CK5/CK14。一旦离开基底层进入棘细胞层，角质形成细胞不再表达CK5/CK14而表达角蛋白CK1/CK10，因此，CKl/CK10被认为是角质形成细胞早期分化的标志，其后在棘细胞层和颗粒层可见到CKl/CKIO的表达。
[0024] 丝聚蛋白(Filaggrin)是与表皮角蛋白相关的一种蛋白，在表皮含量丰富，主要存在于表皮的最外层，它能够连接角蛋白(主要是CK1和CK10)，并使其聚集成角蛋白
纤维束，因而它与表皮终末分化有关，且它在表皮的屏障功能中具有重要作用。故认为丝聚蛋白是表皮发育分
化成熟且具有一定屏障功能的标记性蛋白。
[0025] 进一步地，在上述方案中，步骤4)所述的透射电镜观察组织工程皮肤超微结构具体方法为：将培养的hAECs-DED组织工程皮肤标本切成约1立方毫米大小组织
块，迅速投入2.5％戊二
醛固定液中，4℃固定24小时；0.1M
磷酸漂洗液漂洗三次，每次15分钟，1％锇酸固定液固定2-3小时，后0.1M磷酸漂洗液漂洗三次，每次15分钟；分别在以下浓度梯度的乙醇条件下脱水，50％乙醇，15-20分；70％乙醇，15-20分；90％乙醇，15-20分；90％乙醇与90％丙
酮(1：1)，15-20分；90％丙酮，15-20分；100％丙酮，室温，15-20分三次；包埋：纯丙酮+包埋液(2:1)室温3-4小时；纯丙酮+包埋液(1:2)室温，过夜；纯包埋液，37℃，2-3小时；
固化：
37℃烘箱内过夜；45℃烘箱内12小时，60℃烘箱内24小时；超薄切片机切片80nm，3％
醋酸铀-枸橼酸铅双染色，透射电镜观察(Hitachi-7500,Japan)。
[0026] 进一步地，在上述方案中，所述hAECs-DED组织工程皮肤的构建方法为：采用低浓度胰蛋白酶多步消化分离法来提取hAEC,并用两步酶消化法处理健康小儿包皮，获得
成纤维细胞悬液，传代培养；将体外扩增培养至第3-5代的成纤维细胞和第2代的hAECs分别接种在DED真皮面和基底膜面，体外器官培养构建组织工程皮肤。具体步骤为：
[0027] a.hAECs的分离培养及hAECs细胞悬液的制备：
[0028] 将羊膜组织用
磷酸盐缓冲液(PBS)反复加以冲洗后剪成细碎小块，加入含有0.05％胰蛋白酶-0.02％
乙二胺四乙酸(EDTA)溶液，37℃消化10min，弃消化液；后重复上述方法消化上皮细胞，37℃消化30-40min，200目不锈
钢网过滤；收集单细胞悬液，加含10％胎
牛血清的培养基终止消化；过滤后组织碎片用同样方法重复消化1次；离心收集的细胞用添加10ng/ml EGF的DMEM完全培养基培养，置于37℃、5％CO2孵育箱内培养；24h首次换液，后每3天全量换液一次，约10天后细胞可按常规方法传代培养；第二代hAEC细胞爬片后用4％多聚甲醛固定，分别进行Oct-3/4、SSEA-4免疫
荧光检测；倒置
显微镜观察hAECs生长状态，取第1-2代对数生长期hAECs；吸去培养基，以PBS液清洗两遍；加入0.25％胰蛋白酶，轻摇培养瓶，消化贴壁细胞；镜下观察细胞由卵圆形变圆、细胞间隙增大，少量细胞开始脱落时，加入含10％FBS的DMEM培养基终止消化；吹打培养瓶壁上细胞，离心收集细胞；弃上清液，重悬于hAECs完全培养基中制成细胞悬液，计数，调整细胞浓度至5x106/ml，待用；
[0029] b.成纤维细胞(FB)的分离培养及Fb细胞悬液的制备：
[0030] 将表皮组织标本浸入D-Hanks溶液中，4℃保存备用，6个小时内使用；将包皮在无菌条件下用PBS冲洗5遍，用眼科剪剪去
皮下组织,将皮肤组织剪成大小约0.5cm×1cm的细长条，放入2.5mg/ml Dispase酶中4℃消化16～18h；次日取出，将表皮与真皮分离；将分离出的真皮组织放入10ml的无菌青霉素瓶中，加入0.2％Ⅳ型胶原酶溶液3ml，37℃消化2～3h，消化后用眼科
剪刀将真皮组织剪碎，向瓶中加入含10％FBS的DMEM 3ml终止消化，巴氏吸管吹打数十次，低速离心，弃上清液，用含10％FBS的DMEM培养基1ml重悬，计数板计算，调整细胞
密度为2×106/ml，接种于一次性培养瓶中；置5％CO2、37℃孵箱中培养，24h后首次换液去除未贴壁的细胞，以后2～3天换液1次；7～10天后培养细胞达到70％～80％融合状态时，传代纯化培养，可获得成纤维细胞(FB)；倒置显微镜观察Fb生长状态，取第3代对数生长期Fb；吸去培养基，以PBS液清洗两遍；加入0.25％胰蛋白酶，轻摇培养瓶，消化贴壁细胞，加入含10％FBS的DMEM培养基终止消化；吹打培养瓶壁上细胞，离心收集细胞；弃上清液，重悬于含10％FBS的DMEM培养基中制成细胞悬液，计数，调整细胞浓度至5x105/ml，待用；
[0031] c.DED的制备及预处理：
[0032] 取成人皮肤标本常规消毒，加入适量PBS，置于4℃
冰箱中备用；制备前用PBS清洗标本数次，常规消毒；用眼科剪小心去除皮下脂肪组织层，制成lcm×1cm大小皮片；浸于56℃PBS中30min；用眼科镊去除表皮，将人去表皮的真皮组织(De-epidermized dermis,DED)置于Epp管中，迅速置入液氮中约5min，取出后室温放置30min，然后再置入液氮中，连续10个循环；后置于-20℃冰箱中保存备用；将DED置于4℃冰箱中12h，然后浸于hAECs完全培养基中；5％CO2、37℃环境中浸泡48h，备用；
[0033] d.hAECs-DED组织工程皮肤的构建：
[0034] 将经预处理的DED，置于六孔板中，DED基底膜面向下，加入hAEC完全培养基，1ml/孔，用移液器将备好的FB细胞悬液150μl接种于1-5孔的DED上，第6孔中DED上加150μlPBS作为空白对照；置于5％CO2、37℃环境中孵育过夜，以促使FB能够贴附于DED的网状真皮面；孵育过夜后，把DED翻转，使DED的基底膜面朝上，将备好的hAEC细胞悬液150μl接种于1-5孔的DED基底膜面上，第6孔中加入150μlPBS作为空白对照，后每孔加入hAEC完全培养基，使之浸没DED，置于5％CO2、37℃环境中培养；液下培养3天，使得hAEC达到融合，后将DED置于
支撑架上，调整培养基的量，使hAEC在气液界面上培养生长；5％CO2、37℃环境中继续气-液面培养2周。
[0035] 更进一步地，所述hAECs完全培养基的配方为：
基础DMEM培养基，10％胎牛血清，10ng/mLEGF，青、
链霉素各30U/ml，表皮生长因子0.5～1.5ng/ml、DKK1蛋白10～18ng/ml、转
铁蛋白12～18ug/ml、丙酸睾酮1×10-9～1.2×10-7mol/L。
[0036] 本发明用免疫组化的方法检测了器官培养的人工皮肤的基底膜成分，结果显示在新生上皮与凹凸不平的DED表面交界区存在基底膜结构，且也存在如IV型胶原和laminin等基底膜蛋白成分。我们进一步用透射电镜观察可见在新生表皮的基底细胞与DED间可见半桥粒结构，其下可见锚丝，且基底膜带的致密层和透明层清晰可见，说明在表皮培养过程中，完整的基底膜带得以进一步完成。
[0037] 正常皮肤的角质形成细胞之间借助桥粒互相连接，这使得细胞间连接更为牢固。若新生表皮中缺乏桥粒，则会引起角质形成细胞的松解而出现表皮内疱。桥粒主要由桥粒芯(desmosomal core)和桥粒斑(desmosomal plaque)两类蛋白组成,其中桥粒芯蛋白属于跨膜蛋白，它主要是由桥粒芯糖蛋白(desmoglein)和桥粒芯胶蛋白(desmocollin)构成。在新生表皮中，desmoglein-3几乎在整个表皮层的细胞连接处表达，超微结构下也可观察到在相邻的细胞膜上有细胞桥粒结构。故新生表皮中细胞间紧密连接形成。
[0038] 本发明的有益效果是：本发明以Ki-67为细胞增殖标记物，通过其免疫组化染色可观察到增殖细胞的细胞核染色，从而提供了一个可以评估角质形成细胞分裂和表皮增殖的量化指标。通过免疫组化的方法检测了器官培养的人工皮肤的基底膜成分，结果显示在新生上皮与凹凸不平的DED表面交界区存在基底膜结构，且也存在如IV型胶原和laminin等基底膜蛋白成分。我们进一步用透射电镜观察可见在新生表皮的基底细胞与DED间可见半桥粒结构，其下可见锚丝，且基底膜带的致密层和透明层清晰可见，说明在表皮培养过程中，完整的基底膜带得以进一步完成。本发明对重建的组织工程皮肤表皮完整的性，角质层丰富性、以及其结构和功能与人体正常皮肤的差异等进行了研究，为重建的组织工程皮肤的应用奠定了基础。
附图说明
[0039] 图1是组织工程皮肤培养2周后，组织学观察4-9层分化较好的新生表皮情况，其中，图1-A为×40，图1-B为×400。
[0040] 图2是新生表皮与正常人皮肤广谱细胞角蛋白(CKpan)免疫组化染色结果，其中图2-A为新生表皮广谱细胞角蛋白(CKpan)免疫组化染色结果，图2-B为正常人皮肤CKpan染色反应结果。
[0041] 图3-A为体外重建组织工程皮肤的新生表皮无vimentin表达，图3-B为对照组，正常人表皮无vimentin表达。
[0042] 图4-A为体外重建组织工程皮肤的DED网状真皮表面的Fb生长状态，图4-B为对照组，正常人真皮组织内有vimentin表达。
[0043] 图5-A为Ki67染色结果，图5-B为正常皮肤对照组染色结果。
[0044] 图6-A为CK19在组织工程皮肤的新生表皮中的整个上皮细胞层弱表达结果图，图6-B为CK19在在正常人皮肤中上皮基底层的细胞质中强表达。
[0045] 图7-A为组织工程皮肤的新生表皮中CK18表达结果，图7-B为正常人表皮中CK18表达结果。
[0046] 图8-A为CK14在组织工程皮肤的新生表皮中的表达结果，图8-B为CK14在正常人皮肤中的表达结果。
[0047] 图9-A为CK10在组织工程皮肤的新生表皮中的表达结果，图9-B为CK10在正常人皮肤中的表达结果。
[0048] 图10-A为filaggrin在组织工程皮肤的新生表皮中的表达结果，图10-B为filaggrin在正常人皮肤中的表达结果。
具体实施方式
[0049] 一种hAECs-DED组织工程皮肤增殖分化活力的检测方法，包括以下步骤：
[0050] 1)构建hAECs-DED组织工程皮肤结构：以人羊膜上皮细胞(hAECs)作为种子细胞，以人去表皮的真皮组织(De-epidermized dermis,DED)作为支架材料，将种子细胞种植于支架材料上构建hAECs-DED组织工程皮肤；hAECs-DED组织工程皮肤的构建方法为：采用低浓度胰蛋白酶多步消化分离法来提取hAEC,并用两步酶消化法处理健康小儿包皮，获得成纤维细胞悬液，传代培养；将体外扩增培养至第3-5代的成纤维细胞和第2代的hAECs分别接种在DED真皮面和基底膜面，体外器官培养构建组织工程皮肤；具体步骤为：
[0051] a.hAECs的分离培养及hAECs细胞悬液的制备：
[0052] 将羊膜组织用磷酸盐缓冲液(PBS)反复加以冲洗后剪成细碎小块，加入含有0.05％胰蛋白酶-0.02％乙二胺四乙酸(EDTA)溶液，37℃消化10min，弃消化液(主要去除杂细胞和细胞碎片)；后重复上述方法消化上皮细胞，37℃消化30-40min，200目
不锈钢网过滤；收集单细胞悬液，加含10％胎牛血清的培养基终止消化；过滤后组织碎片用同样方法重复消化1次；离心收集的细胞用添加10ng/ml EGF的DMEM完全培养基培养，置于37℃、5％CO2孵育箱内培养；24h首次换液，后每3天全量换液一次，约10天后细胞可按常规方法传代培养；第二代hAEC细胞爬片后用4％多聚甲醛固定，分别进行Oct-3/4、SSEA-4免疫荧光检测；
倒置显微镜观察hAECs生长状态，取第1-2代对数生长期hAECs；吸去培养基，以PBS液清洗两遍；加入0.25％胰蛋白酶，轻摇培养瓶，消化贴壁细胞；镜下观察细胞由卵圆形变圆、细胞间隙增大，少量细胞开始脱落时，加入含10％FBS的DMEM培养基终止消化；吹打培养瓶壁上细胞，离心收集细胞(1000r/min，5min)；弃上清液，重悬于hAECs完全培养基中制成细胞悬液，计数，调整细胞浓度至5x106/ml，待用；
[0053] b.成纤维细胞(FB)的分离培养及Fb细胞悬液的制备：
[0054] 将表皮组织标本浸入D-Hanks溶液中，4℃保存备用，6个小时内使用；将包皮在无菌条件下用PBS(含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素)冲洗5遍，用眼科剪剪去皮下组织,将皮肤组织剪成大小约0.5cm×1cm的细长条，放入2.5mg/ml Dispase酶中4℃消化16～18h；次日取出，将表皮与真皮分离；将分离出的真皮组织放入10ml的无菌青霉素瓶中，加入
0.2％Ⅳ型胶原酶溶液3ml，37℃消化2～3h，消化后用眼科剪刀将真皮组织剪碎，向瓶中加入含10％FBS的DMEM 3ml终止消化，巴氏吸管吹打数十次，低速离心(1000r/min)5min，弃上清液，用含10％FBS的DMEM培养基1ml重悬，计数板计算，调整细胞密度为2×106/ml，接种于一次性培养瓶中；置5％CO2、37℃孵箱中培养，24h后首次换液去除未贴壁的细胞，以后2～3天换液1次；7～10天后培养细胞达到70％～80％融合状态时，传代纯化培养，可获得成纤维细胞(FB)；倒置显微镜观察Fb生长状态，取第3代对数生长期Fb；吸去培养基，以PBS液清洗两遍；加入0.25％胰蛋白酶，轻摇培养瓶，消化贴壁细胞，加入含10％FBS的DMEM培养基终止消化；吹打培养瓶壁上细胞，离心收集细胞(1000r/min，5min)；弃上清液，重悬于含10％FBS的DMEM培养基中制成细胞悬液，计数，调整细胞浓度至5x105/ml，待用；
[0055] c.DED的制备及预处理：
[0056] 取成人皮肤标本常规消毒，加入适量PBS，置于4℃冰箱中备用；制备前用PBS清洗标本数次，常规消毒；用眼科剪小心去除皮下脂肪组织层，制成lcm×1cm大小皮片；浸于56℃PBS中30min；用眼科镊去除表皮，将人去表皮的真皮组织(De-epidermized dermis,DED)置于Epp管中，迅速置入液氮中约5min，取出后室温放置30min，然后再置入液氮中，连续10个循环；后置于-20℃冰箱中保存备用；将DED置于4℃冰箱中12h，然后浸于hAECs完全培养基中；5％CO2、37℃环境中浸泡48h，备用；为促使hAECs能够更好地贴附生长，接种前须将DED预处理；
[0057] d.hAECs-DED组织工程皮肤的构建：
[0058] 将经预处理的DED，置于六孔板中，DED基底膜面向下，加入hAEC完全培养基，1ml/孔，用移液器将备好的FB细胞悬液150μl接种于1-5孔的DED上，第6孔中DED上加150μlPBS作为空白对照；置于5％CO2、37℃环境中孵育过夜，以促使FB能够贴附于DED的网状真皮面；孵育过夜后，把DED翻转，使DED的基底膜面朝上，将备好的hAEC细胞悬液150μl接种于1-5孔的DED基底膜面上，第6孔中加入150μlPBS作为空白对照，后每孔加入hAEC完全培养基，使之浸没DED，置于5％CO2、37℃环境中培养；液下培养3天，使得hAEC达到融合，后将DED置于支撑架上，调整培养基的量，使hAEC在气液界面上培养生长；5％CO2、37℃环境中继续气-液面培养2周。
[0059] 2)组织工程皮肤组织学观察：将体外培养的hAECs-DED组织工程皮肤气-液面培养2周后进行肉眼观察，主要观察表面是否光滑，是否有膜状物形成；再进行常规石蜡切片(约
4um)，苏木精-伊红染色(HE染色)，在光镜下观察组织学特征，观察新生表皮结构是否清晰，层次是否分明，角质层角化是否完全，细胞排列是否整齐；
[0060] 苏木精-伊红染色(HE染色)的具体操作方法为：二甲苯4min，二甲苯4min，二甲苯4min,100％乙醇4min,100％乙醇4min,95％乙醇4min,95％乙醇4min,95％乙醇4min,70％乙醇4min,蒸馏水,苏木素染色4min,水洗5min,伊红染色3Osec,70％乙醇15sec,70％乙醇
15sec,95％乙醇15sec,95％乙醇15sec,100％乙醇3Osec,100％乙醇3Osec,二甲苯5min,二甲苯5min,固定，封片；
[0061] 3)免疫组化染色：包括广谱细胞角蛋白免疫组化染色(CKpan染色)、波形蛋白免疫组化染色(vimentin染色)、Ki67免疫组化染色、角蛋白19(CK19)免疫组化染色、角蛋白18(CK18)免疫组化染色、角蛋白14(CK14)免疫组化染色、角蛋白10(CK10)免疫组化染色、丝聚合蛋白(Filaggrin)免疫组化染色、过碘酸雪夫氏染色(PAS)、Ⅳ型胶原染色、层粘蛋白染色(laminin染色)、桥粒芯蛋白免疫组化染色(desmoglein)；
[0062] 广谱细胞角蛋白免疫组化染色(CKpan染色)的方法为：取石蜡包埋的标本，连续切片，常规免疫组化染色，一抗为小鼠抗人pan-Cytokeratin抗体(1:100)，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，ABC法，二氨基联苯胺显色，苏木素复染；以PBS代替一抗做阴性对照；
[0063] 波形蛋白免疫组化染色(vimentin染色)的方法为：取石蜡包埋的标本，连续切片，常规免疫组化染色，一抗为鼠抗人vimentin单抗(1:100)，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，ABC法，二氨基联苯胺显色，苏木素复染，以PBS代替一抗做阴性对照；
[0064] Ki67免疫组化染色的方法为：取石蜡包埋的标本，连续切片，常规免疫组化染色，一抗为鼠抗人Ki67单抗(1:50)，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，ABC法，二氨基联苯胺显色，苏木素复染；以PBS代替一抗做阴性对照；
[0065] 角蛋白19(CK19)免疫组化染色的方法为：取石蜡包埋的标本，连续切片，常规免疫组化染色，一抗为鼠抗人CK19单抗(1:100)，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，ABC法，二氨基联苯胺显色，苏木素复染，以PBS代替一抗做阴性对照；
[0066] 角蛋白18(CK18)免疫组化染色的方法为：取石蜡包埋的标本，连续切片，常规免疫组化染色，一抗为鼠抗人CK18单抗(1:100)，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，ABC法，二氨基联苯胺显色，苏木素复染，以PBS代替一抗做阴性对照；
[0067] 角蛋白14(CK14)免疫组化染色的方法为：取石蜡包埋的标本，连续切片，常规免疫组化染色，一抗为鼠抗人CK14单抗(1:100)，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，ABC法，二氨基联苯胺显色，苏木素复染，以PBS代替一抗做阴性对照；
[0068] 角蛋白10(CK10)免疫组化染色的方法为：取石蜡包埋的标本，连续切片，常规免疫组化染色，一抗为鼠抗人CK10单抗(1:100)，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，ABC法，二氨基联苯胺显色，苏木素复染，以PBS代替一抗做阴性对照；
[0069] 丝聚合蛋白(Filaggrin)免疫组化染色的方法为：取石蜡包埋的标本，连续切片，常规免疫组化染色，一抗为鼠抗人Filaggrin单抗(1:100)，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，ABC法，二氨基联苯胺显色，苏木素复染，以PBS代替一抗做阴性对照；
[0070] 过碘酸雪夫氏染色(PAS)的方法为：检测组织工程皮肤基底膜情况。染色步骤:脱蜡，水洗，0.5％过碘酸(Periodicacid)溶液1Omin,蒸溜水漂洗,雪夫(Schiff)氏液1Omin,蒸溜水漂洗,1％亚硫酸氢钠(Sodium bisulfite)溶液两次，每次3min,水洗5min,脱水固定，封存，染色结果判断:基底膜染为紫红色为阳性反应；
[0071] Ⅳ型胶原染色的方法为：观察组织工程皮肤基底膜成分。取石蜡包埋的标本，连续切片，常规免疫组化染色，一抗为鼠抗人type IV collagen单抗(1:150)，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，ABC法，二氨基联苯胺显色，苏木素复染，以PBS代替一抗做阴性对照。
[0072] 层粘蛋白染色(laminin染色)的方法为：观察组织工程皮肤基底膜成分。取石蜡包埋的标本，连续切片，常规免疫组化染色，一抗为鼠抗人laminin单抗(1:150)，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，ABC法，二氨基联苯胺显色，苏木素复染，以PBS代替一抗做阴性对照；
[0073] 桥粒芯蛋白免疫组化染色(desmoglein)的方法为：取石蜡包埋的标本，连续切片，常规免疫组化染色，一抗为鼠抗人desmoglein-3单抗(1:100)，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，ABC法，二氨基联苯胺显色，苏木素复染，以PBS代替一抗做阴性对照。
[0074] 4)透射电镜观察组织工程皮肤超微结构，并拍片；主要观察细胞质内线粒体(mitochondria，Mt)和角蛋白细丝(keratin filaments,KF)结构、以及相邻的细胞膜上的细胞桥粒(desmosomes，D)结构、新生表皮与DED之间是否可见基底膜结构，以及基底膜带的近表皮侧是否可见半桥粒(Hemidesmosomes，HD)结构。透射电镜观察组织工程皮肤超微结构具体方法为：将培养的hAECs-DED组织工程皮肤标本切成约1立方毫米大小组织块，迅速投入2.5％戊二醛固定液中，4℃固定24小时；0.1M磷酸漂洗液漂洗三次，每次15分钟，1％锇酸固定液固定2-3小时，后0.1M磷酸漂洗液漂洗三次，每次15分钟；分别在以下浓度梯度的乙醇条件下脱水，50％乙醇，15-20分；70％乙醇，15-20分；90％乙醇，15-20分；90％乙醇与90％丙酮(1：1)，15-20分；90％丙酮，15-20分；100％丙酮，室温，15-20分三次；包埋：纯丙酮+包埋液(2:1)室温3-4小时；纯丙酮+包埋液(1:2)室温，过夜；纯包埋液，37℃，2-3小时；固化：37℃烘箱内过夜；45℃烘箱内12小时，60℃烘箱内24小时；超薄切片机切片80nm，3％醋酸铀-枸橼酸铅双染色，透射电镜观察(Hitachi-7500,Japan)。
[0075] 上述
实施例1的hAECs-DED组织工程皮肤增殖分化活力的检测结果如下：
[0076] 气-液面培养2周后，光镜下可见DED上有4-9层完整的新生表皮结构。新生表皮结构清晰，层次分明，角质层角化完全，细胞排列整齐。表皮与DED犬牙交错，表皮突呈高低不平的
乳头状伸入真皮，如图1所示，其中图1-A为×40，图1-B为×400。新生表皮广谱细胞角蛋白(CKpan)免疫组化染色呈阳性反应，即呈棕褐色，正常人皮肤CKpan染色也呈阳性反应，如图2所示，其中图2-A为新生表皮广谱细胞角蛋白(CKpan)免疫组化染色结果，图2-B为正常人皮肤CKpan染色反应结果。新生表皮vimentin染色呈阴性反应，如图3所示，其中，图3-A为体外重建组织工程皮肤的新生表皮无vimentin表达，图3-B对照组，正常人表皮无vimentin表达。说明构建的组织工程皮肤的新生上皮具有表皮样特征，且接种在DED基底膜面的细胞中没有混杂如成纤维细胞、羊膜间充质细胞等间质细胞。接种在DED网状真皮表面的Fb生长状态好，且部分向下穿透,vimentin染色阳性，呈棕褐色如图4所示，其中，图4-A为体外重建组织工程皮肤的DED网状真皮表面的Fb生长状态，图4-B为对照组，正常人真皮组织内有vimentin表达。
[0077] 免疫组化染色显示Ki67主要强表达在新生表皮基底层细胞的细胞核中,在基底上层细胞中很少表达或少量的弱表达,此结果与正常皮肤对照组染色结果相似，如图5所示，其中，图5-A为Ki67染色结果，图5-B为正常皮肤对照组染色结果。CK19被认为是潜在的皮肤干细胞的标志。在正常人皮肤中,CK19在上皮基底层的细胞质中强表达，在组织工程皮肤的新生表皮中，K19在整个上皮细胞层弱表达，如图6所示，其中，图6-A为CK19在组织工程皮肤的新生表皮中的整个上皮细胞层弱表达结果图，图5-B为CK19在在正常人皮肤中上皮基底层的细胞质中强表达。由此表明，体外构建的组织工程皮肤具有支持表皮再生的能力。为评估接种的hAECs向表皮样细胞分化的程度，我们用免疫组化的方法检测了CK18,CK14,CK10,filaggrin等分化指标。CK18是简单上皮的标志。免疫组化结果显示，组织工程皮肤的新生表皮及正常人表皮中CK18均不表达，如图7所示，组织工程皮肤的新生表皮(图7-A)及正常人表皮(图7-B)中CK18均不表达。CK14是复层表皮的标志，在正常人皮肤的基底层表达。免疫组化结果显示，在正常人皮肤中，随着基底层细胞向基底上层迁徙和分化，CK14表达逐渐减弱。在组织工程皮肤的新生表皮中，CK14几乎在整个表皮层都表达，如图8所示，其中，图8-A为CK14在组织工程皮肤的新生表皮中的表达结果，图8-B为CK14在正常人皮肤中的表达结果。丝聚合蛋白(filaggrin)是形成角质层和表皮终末分化的重要蛋白成分，故CK10和filaggrin是表皮终末分化和角质化的重要标志。免疫组化染色显示，组织工程皮肤的新生表皮与正常人皮肤类似，CK10和filaggrin主要在基底上层细胞中表达如图9和图10所示，其中，图9-A为CK10在组织工程皮肤的新生表皮中的表达结果，图9-B为CK10在正常人皮肤中的表达结果；图10-A为filaggrin在组织工程皮肤的新生表皮中的表达结果，图10-B为filaggrin在正常人皮肤中的表达结果。
