技术领域
[0001] 本
发明涉及组合物及其制备工艺技术领域，尤其涉及一种具有活性因子的组合物及其制备方法。
背景技术
[0002] 间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是一组源于基质的异质细胞群，可以从人体大多数组织获取。它们具有自我更新能
力、组织修复、免疫调节能力，可以向中胚层谱系分化，例如：脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞等，此外还能够向及其它胚层谱系细胞分化，例如向表皮细胞、血管内皮细胞分化。
[0003] 间充质干细胞培养体系中含有多种大量的活性成分，如：干细胞生长因子(SCF)、
成纤维细胞生长因子(FGF)、内皮细胞生长因子(VEGF)、表皮细胞生长因子(EGF)、细胞集落刺激因子、白细胞介素(IL)、
胶原蛋白、透明质酸等80余种活性物质。这些活性物质可以应用于
皮肤创口的修复及其他皮肤问题，因此对于活性物质的提取以及在提取过程中保证足够的活性至关重要。
[0004] 目前市面上已有一些活性物质的及其提取的工艺，主要存在以下问题：
[0005] 1、市售很多宣称产含有活性因子的产品，实际上并没有添加，或者添加了重组活性因子却不能保证重组因子的活性；
[0006] 2、产品中往往添加一种单一的活性因子组分，但单一因子的添加并不能很好的发挥其本身的作用，像EGF、FGF、IGF需要多种因子需要协同的作用才能有效发挥活性作用；
[0007] 3、来源于基因工程的活性因子获得的生长因子往往缺乏化学修饰，因子活性不够，且容易造成过敏反应；
[0008] 4、活性产品很容易在常温下失活，保存期限短。可见，亟待产生一种具有足够高活性的活性因子的组合物及能保证足够高活性的制备方法。
发明内容
[0009] 本发明的目的在于提供一种具有活性因子的组合物及其制备方法和应用；一方面，本发明
实施例提供了一种组合物，所述组合物包括以下原料：间充质干细胞活性因子复合物、
水解胎盘提取物、透明质酸和胶原蛋白、水、辅助
试剂；
[0010] 所述间充质干细胞活性因子复合物由间充质干细胞的细胞培养上清液与细胞裂解液经过
超滤方法制备得到；
[0011] 所述水解胎盘提取物由胎盘组织经过脱细胞和酶消化的方法制得；
[0012] 所述组合物中活性因子含量为0.1-50ug/ml。
[0013] 作为本发明实施方式的进一步改进，所述间充质干细胞提取自动物、同种异体或自体，或者提取自胎盘组织、脐带、骨髓、脂肪组织。
[0014] 作为本发明实施方式的进一步改进，所述水解胎盘提取物提取自动物的胎盘或人异体的胎盘、产妇自身分娩产生的胎盘。
[0015] 作为本发明实施方式的进一步改进，所述间充质干细胞活性因子复合物包括表皮生长因子EGF、成纤维细胞生长因子FGF、
角质细胞生长因子KGF-2、血小板衍生因子PDGF、转化生长因子TGF-β、血管内皮生长因子VEGF、
肝细胞生长因子HGF、胰岛素样生长因子IGF、白细胞介素6、白细胞介素8。
[0016] 作为本发明实施方式的进一步改进，所述辅助试剂包括甘油、1，3-丙二醇、水解壳多糖、甘露糖醇、羊毛脂、山梨酸。
[0017] 另一方面，本发明实施例还提供了所述组合物的制备方法，包括以下步骤：
[0018] S1、分离培养间充质干细胞；
[0019] S2、将间充质干细胞细胞传代扩增；
[0020] S3、制备具有活性因子的组合物，具体包括：
[0021] S301、当间充质干细胞MSC融合度为70-95％时，刺激细胞，收集上清培养液；
[0022] S302、将收集到的上清培养液离心去除培养基中残余细胞，收集上清液；使用滤膜孔径为50K的超滤膜浓缩，收集过滤液；取过滤液加入到3KD的超滤管中，离心将培养液浓缩10倍，无菌水洗涤一次后超滤，并收集培养基浓缩液，得到浓缩液A；
[0023] S303、将间充质干细胞PBS清洗3次，消化计数，取至少1×10^8，无菌水重悬，超声
破碎细胞；
[0024] S304、将破碎细胞的
混合液离心10-20min，收集上清液，去除细胞碎片，用滤膜孔径50K的超滤膜浓缩，取过滤液加入到3KD的超滤管中，离心浓缩10倍得到浓缩液B，将浓缩液A与浓缩液B混合定容为20ml；0.22um
过滤器对混合液除菌，制备得到具有活性因子的复合物；
[0025] S4、制备水解胎盘提取物，具体包括：
[0027] 将分离间充质干细胞时剥离下的红色松散组织及剩余胎盘组织用纯化水冲洗去掉表面的血块，加DMEM浸没后-80℃冷冻，然后37℃水浴20min，重复多次后加入纯化水放入4℃的摇床上震荡24h，每6h换一次去离子水，用1％Triton x-100和0.1％的氢
氧化铵进行洗脱3天，去离子水洗涤组织块1天；用PBS洗涤组织块1天，去离子水洗涤组织块1天；将组织块沥干后称重记录；
[0028] S402、制备不同粒径的胎盘冻干组织；
[0029] 将沥干后的组织放置于-80℃
冰箱24h，将冷冻后的组织冻干24h，将冻干组织用高速
粉碎机进行粉碎；用100um、70um、4um细胞筛进行分筛，分出不同粒径；将100um、70um粒径的胎盘组织进行重复粉碎；
[0030] S403、制备水解胎盘提取物；
[0031] 用4um细胞筛分筛，将小于4um粒径的胎盘粉每克加入9mL 0.1M的HCl，室温下(26℃)进行震荡48h，1500rpm，15min离心3次，每次取上清液沉淀物质加入40ml去离子水混匀后再次离心，得到上清液，用1M NaOH调pH至7.4，用0.22um的过滤器进行过滤，制成水解胎盘提取物。
[0032] S5、将间充质干细胞活性因子复合物、水解胎盘提取物、透明质酸和胶原蛋白、水、辅助试剂进行混合，制备得到具有活性因子含量为0.1-50ug/ml的组合物。
[0033] 作为本发明实施方式的进一步改进，所述步骤S1分离培养间充质干细胞的具体步骤包括：
[0034] 取健康供体胎盘组织，用PBS反复清洗数次，剥离胎盘表面的羊膜。取小块组织，用虎齿镊刮掉上面附着的红色松散组织，保留所有血管，生理盐水清洗，将胎盘组织剪切成1～4mm2的组织匀浆块，胶原酶消化，离心消化液10min，细胞沉淀用无血清无酚红的间充质干细胞专用培养基培养，在
温度为37℃，CO2体积分数为5％的
培养箱中培养。
[0035] 作为本发明实施方式的进一步改进，所述步骤S2将间充质干细胞细胞传代扩增的具体步骤包括：
[0036] 当细胞汇合率达70％时进行传代，加入预热后的0.05％胰酶，轻轻旋转
覆盖瓶底，置37℃培养箱中消化3～5min；消化3min后
显微镜下观察；大多数细胞变圆，且部分细胞已经悬浮时终止消化；
[0037] 吸出细胞悬液后用DMEM清洗培养瓶，离心10min后，吸出上清，培养基重悬细胞沉淀，计数，3000-6000个cell/cm2
密度接种入T75培养瓶中，当P1细胞汇合率达70％时进行第二次传代操作，3000-6000个cell/cm2密度接种入T175培养瓶中。
[0038] 作为本发明实施方式的进一步改进，所述水解胎盘提取物由胎盘组织脱细胞效率达到99％-99.9％。
[0039] 作为本发明实施方式的进一步改进，所述间充质干细胞活性因子复合物包括表皮生长因子EGF、成纤维细胞生长因子FGF、角质细胞生长因子KGF-2、血小板衍生因子PDGF、转化生长因子TGF-β、血管内皮生长因子VEGF、肝细胞生长因子HGF、胰岛素样生长因子IGF、白细胞介素6、白细胞介素8。
[0040] 作为本发明实施方式的进一步改进，所述辅助试剂包括甘油、1，3-丙二醇、水解壳多糖、甘露糖醇、羊毛脂、山梨酸。
[0041] 再一方面，本发明实施例还提供了上述组合物在制备创伤修复的药物和/或制剂中的应用。
[0042] 与
现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
[0043] 1、本发明实施例以间充质干细胞分泌的活性因子复合物、水解胎盘提取物、透明质酸和胶原蛋白为主要有效成分的组合物，具有调节皮肤活性的作用，搭配水解胎盘提取物为肌肤提供营养，在肌肤恢复的药物中发挥全方位协调作用；
[0044] 2、本发明实施例利用人体干细胞，具有强大再生、修复、分化能力，能明显促进衰老细胞的修复再生，间充质干细胞分泌物，拥有更多种类和含量的
生物活性物质，活性因子EGF配合FGF和KGF等协同作用，能够支持受损细胞的修复和增殖，提供组织再生和
细胞增殖的微环境，帮助真皮成纤维细胞的增殖，促进胶原合成；
[0045] 3、本发明实施例中应用干细胞分泌物和脱细胞胎盘组织，降低了直接使用干细胞可能造成的过敏反应的
风险，且有效调节因子均来自细胞分泌，相比重组的活性因子来说具有更高的活性；
[0046] 5、本发明实施例中采用复合活性因子的组分，相比单一或相对单一的活性因子来说更能发挥协同作用。
附图说明
[0047] 此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
[0049] 图2为实施例成纤维细胞7天生长曲线图。
具体实施方式
[0050] 为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，均属于本发明保护的范围。
[0051] 实施例一
[0052] 本发明实施例提供了一种组合物，组合物包括以下原料：间充质干细胞活性因子复合物、水解胎盘提取物、透明质酸和胶原蛋白、水、辅助试剂；
[0053] 间充质干细胞活性因子复合物由间充质干细胞的细胞培养上清液与细胞裂解液经过超滤方法制备得到；
[0054] 水解胎盘提取物由胎盘组织经过脱细胞和酶消化的方法制得；
[0055] 组合物中活性因子含量为0.1-50ug/ml。
[0056] 其中，间充质干细胞提取自动物、同种异体或自体，或者提取自胎盘组织、脐带、骨髓、脂肪组织；即可以选用人脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、月经血间充质干细胞、
牙髓间充质干细胞。
[0057] 而水解胎盘提取物提取自动物的胎盘或人异体的胎盘、产妇自身分娩产生的胎盘。
[0058] 具体地，间充质干细胞活性因子复合物包括表皮生长因子EGF、成纤维细胞生长因子FGF、角质细胞生长因子KGF-2、血小板衍生因子PDGF、转化生长因子TGF-β、血管内皮生长因子VEGF、肝细胞生长因子HGF、胰岛素样生长因子IGF、白细胞介素6、白细胞介素8。
[0059] 在本发明实施例中，使用Elisa法测得本实施例中活性因子复合物含量测定结果，如表一所示：
[0060] 表一各种活性因子含量
[0061]
[0062] 在本发明实施例中，辅助试剂包括甘油、1，3-丙二醇、水解壳多糖、甘露糖醇、羊毛脂、山梨酸。
[0063] 实施例二
[0064] 本发明实施例还提供了所述组合物的制备方法，包括以下步骤：
[0065] S1、分离培养间充质干细胞；
[0066] S2、将间充质干细胞细胞传代扩增；
[0067] S3、制备具有活性因子的组合物，具体包括：
[0068] S301、当间充质干细胞MSC融合度为70-95％时，刺激细胞，收集上清培养液；
[0069] S302、将收集到的上清培养液离心去除培养基中残余细胞，收集上清液；使用滤膜孔径为50K的超滤膜浓缩，收集过滤液；取过滤液加入到3KD的超滤管中，离心将培养液浓缩10倍，无菌水洗涤一次后超滤，并收集培养基浓缩液，得到浓缩液A；
[0070] S303、将间充质干细胞PBS清洗3次，消化计数，取至少1×10^8，无菌水重悬，超声破碎细胞；
[0071] S304、将破碎细胞的混合液离心20min，收集上清液，去除细胞碎片，用滤膜孔径50K的超滤膜浓缩，取过滤液加入到3KD的超滤管中，离心浓缩10倍得到为浓缩液B，将浓缩液A和浓缩液B混合定容20ml；0.22um过滤器对混合液除菌，制备得到具有活性因子的复合物；
[0072] S4、制备水解胎盘提取物，具体包括：
[0073] S401、制备胎盘组织块；
[0074] 将分离间充质干细胞时剥离下的红色松散组织及剩余胎盘组织用纯化水冲洗去掉表面的血块，加DMEM浸没后-80℃冷冻，然后37℃水浴20min，重复多次后加入纯化水放入4℃的摇床上震荡24h，每6h换一次去离子水，用1％Triton x-100和0.1％的
氢氧化铵进行洗脱3天，去离子水洗涤组织块1天；用PBS洗涤组织块1天，去离子水洗涤组织块1天；将组织块沥干后称重记录；
[0075] S402、制备不同粒径的胎盘冻干组织；
[0076] 将沥干后的组织放置于-80℃冰箱24h，将冷冻后的组织冻干24h，将冻干组织用高速粉碎机进行粉碎；用100um、70um、4um细胞筛进行分筛，分出不同粒径；将100um、70um粒径的胎盘组织进行重复粉碎；
[0077] S403、制备水解胎盘提取物；
[0078] 用4um细胞筛分筛，将小于4um粒径的胎盘粉每克加入9mL 0.1M的HCl，室温下(26℃)进行震荡48h，1500rpm，15min离心3次，每次取上清液沉淀物质加入40ml去离子水混匀后再次离心，得到上清液，用1M NaOH调pH至7.4，用0.22um的过滤器进行过滤，制成水解胎盘提取物。
[0079] S5、将间充质干细胞活性因子复合物、水解胎盘提取物、透明质酸和胶原蛋白、水、辅助试剂进行混合，制备得到具有活性因子含量为0.1-50ug/ml的组合物。
[0080] 其中，步骤S1分离培养间充质干细胞的具体步骤包括：
[0081] 取健康供体胎盘组织，用PBS反复清洗数次，剥离胎盘表面的羊膜。取小块组织，用虎齿镊刮掉上面附着的红色松散组织，保留所有血管，生理盐水清洗，将胎盘组织剪切成1～4mm2的组织匀浆块，胶原酶消化，离心消化液10min，细胞沉淀用无血清无酚红的间充质干细胞专用培养基培养，在温度为37℃，CO2体积分数为5％的培养箱中培养。
[0082] 进一步地，步骤S2将间充质干细胞细胞传代扩增的具体步骤包括：
[0083] 当细胞汇合率达70％时进行传代，加入预热后的0.05％胰酶，轻轻旋转覆盖瓶底，置37℃培养箱中消化3～5min；消化3min后显微镜下观察；大多数细胞变圆，且部分细胞已经悬浮时终止消化；
[0084] 吸出细胞悬液后用DMEM清洗培养瓶，离心10min后，吸出上清，培养基重悬细胞沉淀，计数，3000-6000个cell/cm2密度接种入T75培养瓶中，当P1细胞汇合率达70％时进行第二次传代操作，3000-6000个cell/cm2密度接种入T175培养瓶中。
[0085] 在本发明实施例中，水解胎盘提取物由胎盘组织脱细胞效率达到99％-99.9％。
[0086] 优选地，间充质干细胞活性因子复合物包括表皮生长因子EGF、成纤维细胞生长因子FGF、角质细胞生长因子KGF-2、血小板衍生因子PDGF、转化生长因子TGF-β、血管内皮生长因子VEGF、肝细胞生长因子HGF、胰岛素样生长因子IGF、白细胞介素6、白细胞介素8。
[0087] 其中，辅助试剂包括甘油、1，3-丙二醇、水解壳多糖、甘露糖醇、羊毛脂、山梨酸。
[0088] 在步骤S4之后，用天根DP304
试剂盒提取DNA并用微量核酸测定仪测得100g胎盘新鲜组织中的DNA含量约为1789.2ng/mg，脱细胞后的9.1g冻干粉DNA含量平均为44.6ng/mg，脱细胞效率为99.8％；对脱细胞后的组织进行HE染色切片结果如图1所示，图中没有明显可见的细胞核分布，说明脱细胞效果达到要求，有效去除过敏源。
[0089] 实施例三
[0090] 本发明实施例还提供了上述组合物在制备创伤修复的药物和/或制剂中的应用。
[0091] 将本发明制备的组合物对表皮成纤维细胞生长的影响进行测试，实验设计如下：
[0092] 皮肤成纤维细胞1×10^4/孔接种于六孔板中，在一个六孔板上，设置A：干细胞活性成分复合物实验组3板；B：培养基阴性对照组3板；接种7个六孔板；实施例1制备的干细胞活性成分复合物按1∶1比例添加到培养基中，阴性对照组添加等量DMEM；所述培养基为90％的DMEM+10％胎
牛血清；第二天取一块六孔板将细胞消化，计数，取三孔平均值，以后每天同一时间测定一板，记录7天的生长数据，结果如图2所示；
[0093] 结果显示，添加干细胞活性成分复合物实验组培养基的成纤维细胞比阴性对照组的成纤维细胞增殖更快，干细胞活性成分复合物能促进成纤维细胞生长。
[0094] 进一步地，将本发明实施例2制备的组合物进行皮肤对比试验，30位受试者肌肤均存在不同程度痘痘、红血丝等受损问题，随机分为两组，其中15位受试者为A组，每日早晚涂抹该组合物成品，另外15名受试者为B组，每日涂抹涂抹不包含间充质干细胞活性因子复合物、水解胎盘提取物的阴性对照组的组合物，1月后填写试用报告，按综合效果评分，分值为0-10分，没有效果或肤质更差为0-3分，效果不明显为4-6分，效果显著为7-10分，结果如表二所示，使用本实施例组合物的受试者对修复效果更为满意；试验结果如表二所示。
[0095] 表二实施例2制备的组合物和阴性对照组产品进行皮肤对比试验
[0096]受试者分组 综合评分平均值 结果
A组 4.2 效果不明显
B组 7.7 效果显著
[0097] 与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
[0098] 1、本发明实施例以间充质干细胞分泌的活性因子复合物、水解胎盘提取物、透明质酸和胶原蛋白为主要有效成分的组合物，具有调节皮肤活性的作用，搭配水解胎盘提取物为肌肤提供营养，在肌肤恢复的药物中发挥全方位协调作用；
[0099] 2、本发明实施例利用人体干细胞，具有强大再生、修复、分化能力，能明显促进衰老细胞的修复再生，间充质干细胞分泌物，拥有更多种类和含量的生物活性物质，活性因子EGF配合FGF和KGF等协同作用，能够支持受损细胞的修复和增殖，提供组织再生和细胞增殖的微环境，帮助真皮成纤维细胞的增殖，促进胶原合成；
[0100] 3、本发明实施例中应用干细胞分泌物和脱细胞胎盘组织，降低了直接使用干细胞可能造成的过敏反应的风险，且有效调节因子均来自细胞分泌，相比重组的活性因子来说具有更高的活性；
[0101] 5、本发明实施例中采用复合活性因子的组分，相比单一或相对单一的活性因子来说更能发挥协同作用。
[0102] 在上述实施方式的描述中，具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0103] 以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉
本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述
权利要求的保护范围为准。
