一种人绒毛膜间充质干细胞的分离培养方法
阅读：961发布：2020-06-15
专利汇可以提供一种人绒毛膜间充质干细胞的分离培养方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种人绒毛膜间充质干细胞的分离培养方法，属于 生物 医药技术领域。本发明经过人胎盘绒毛膜组织的采集、绒毛膜组织剥离，消毒、洗涤、剪碎、原代分离获得间充质干细胞及间充质干细胞的体外培养和冻存，并对分离获得的细胞进行相关检测。本发明能够从人胎盘绒毛膜组织中分离获得大量表型均一稳定的间充质干细胞，经检测符合临床应用标准。通过培养体外扩增获得满足冻存或临床使用的细胞数量。，下面是一种人绒毛膜间充质干细胞的分离培养方法专利的具体信息内容。
1.一种人绒毛膜间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤（1），人胎盘组织的采集：人胎盘组织娩出后，用生理盐水对胎盘组织进行清洗以除去胎盘组织周围的血液和胎粪，然后将胎盘组织浸在胎盘保护液中，暂存于2-8℃环境中；
所述的胎盘保护液为含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的1640培养基；
步骤（2），绒毛膜组织的剥离：在无菌环境下，将步骤（1）得到的浸在胎盘保护液中的胎盘组织的靠近胎儿一侧的胎盘面朝上，然后剥离羊膜并暴露出羊膜下层的绒毛膜层，接着剪取脐带周围的绒毛膜层，并将剪取得到的绒毛膜组织置于0.9%氯化钠注射液中；
步骤（3），绒毛膜组织的洗涤与消毒：先用0.9%氯化钠注射液漂洗步骤（2）得到的绒毛膜组织以去除血液，并用镊子剥去毛细血管，再用含有100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的
0.9%氯化钠注射液浸泡绒毛膜组织，接着用甲硝唑注射液浸泡绒毛膜组织，浸泡时间均为
5-10分钟，最后再用0.9%氯化钠注射液清洗绒毛膜以去除残留的青霉素、链霉素和甲硝唑注射液；
步骤（4），绒毛膜组织的剪碎：将经步骤（3）清洗得到的绒毛膜组织放入无菌容器内，并加入间充质干细胞无血清培养基，按照每10g绒毛膜组织加入1-2ml间充质干细胞无血清培养基，然后用无菌剪刀将绒毛膜剪成1mm3大小的组织块；
步骤（5），人绒毛膜间充质干细胞原代培养：将步骤（4）得到的绒毛膜组织块均匀的平铺于细胞培养瓶中，然后置于细胞培养箱内静置30-60min，之后向细胞培养瓶中添加间充质干细胞无血清培养基，使培养基刚好没过绒毛膜组织块，接着于5%CO2、37℃的细胞培养箱中静止培养，6-8天后，可见组织块周围有细胞长出，即人绒毛膜间充质干细胞；
步骤（6），人绒毛膜间充质干细胞传代培养：待长出细胞汇合率达50-60%时对人绒毛膜间充质干细胞进行传代培养，弃培养基，加入重组细胞胰酶溶液消化细胞，待细胞消化完全后，加入是本步骤所用重组细胞胰酶溶液体积5倍的间充质干细胞无血清培养基，以终止重组细胞胰酶作用，然后离心去除上清液，之后加入间充质干细胞无血清培养基重悬细胞，并移至新的培养瓶中置于5%CO2、37℃的细胞培养箱中培养；
步骤（7），人绒毛膜间充质干细胞的冻存：当步骤（6）培养的细胞汇合率达90%后进行细胞冻存，先用重组细胞胰酶溶液将细胞消化成单个细胞后，再加入是本步骤所用重组细胞胰酶溶液体积5倍的间充质干细胞无血清培养基终止重组细胞胰酶溶液作用，离心去除上清液，用含有体积分数为20%冻存保护剂的间充质干细胞无血清培养基重悬细胞，重悬混匀后，将重悬溶液置于冻存管中；
步骤（8），冻存细胞缓慢降温：将步骤（7）得到的冻存管置于含有异丙醇的冻存盒中，-
80℃冰箱过夜放置，第二天转入-196℃液氮罐中长期储存；
步骤（9），冻存细胞的复苏：从步骤（8）的液氮罐中取出冻存管后，置于37℃水浴锅中迅速融化，1200-1800rpm离心5min，去除含有冻存保护剂的间充质干细胞无血清培养基，加间充质干细胞无血清培养基重悬细胞并将重悬溶液移至细胞培养瓶中，于5%CO2、37℃细胞培养箱静置培养，第二天显微镜下观察细胞贴壁情况，若细胞已经贴壁说明细胞复苏成功，然后更换新的间充质干细胞无血清培养基，于5%CO2、37℃细胞培养箱继续培养。
2.根据权利要求1所述的人绒毛膜间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤（1）所述的暂存于2-8℃环境中的时间不能超过24h。
3.根据权利要求1所述的人绒毛膜间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤（7）所述的冻存保护剂为DMSO和右旋糖酐细胞冻存混合液。
4.根据权利要求1所述的人绒毛膜间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤（7）所述的将重悬溶液置于冻存管中时，采用规格为2ml的冻存管，每个冻存管中加入重悬溶液1.5-1.8ml。
5.根据权利要求1所述的人绒毛膜间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤（6）和步骤（7）中用重组细胞胰酶溶液消化细胞前，先用PBS清洗细胞以除去培养基。
一种人绒毛膜间充质干细胞的分离培养方法
技术领域
背景技术
[0002] 间充质干细胞(MSC)是一类具有自我更新能力且在适合微环境下具有多系分化潜能的原始细胞。它首先在骨髓中发现，随后分别在脂肪、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺以及在脐带、脐带血、胎盘组织中分离出来。由于其具有强大的增殖能力，较强的分化能力，低免疫原性和免疫调节功能，其在临床上的应用价值越来越受人们关注。
[0003] 作为要应用于临床细胞治疗的细胞产品，应当具有组织取材方便，来源广泛，不受伦理限制，分离过程简单等特点。而骨髓来源的MSC取材难，细胞增殖和分化能力受供体年龄限制，异体移植存在免疫排斥强等缺点，所以寻求一种来源丰富，干细胞含量高，取材方便，无创性并且不受伦理学限制的MSCs来源已然成为如今的研究热点。最近有研究发现，人绒毛膜间充质干细胞具有自我更新和多向分化潜能，有低免疫原性，用于同种异体、异种异体移植后，不会发生免疫排斥反应，无致瘤性，这为各种疾病的细胞替代治疗提供了新的选择。
[0004] 绒毛膜来源于孕妇产后的胎盘组织，具有一定的弹性，易于从胎盘组织中剥离，因此绒毛膜被公认为是间充质干细胞来源之一。
[0005] 现有技术中，制备绒毛膜间充质干细胞的方法存在的不足之处：目前，绒毛膜间充质干细胞的分离方法有组织块培养法和酶消化法两种，应用较多的分离方法是酶消化法，酶消化法具有分离培养周期短等优点，但酶消化法所利用的酶种类繁多，多数利用胰酶和胶原酶分步处理的消化方法，耗时长，步骤繁琐，消化过程中还会对细胞造成较大伤害，使细胞活力减弱，而且分离过程中使用了多种酶和血清，引入了多种外源物质，对间充质干细胞应用于临床造成阻碍。组织块培养法获得的间充质干细胞具有细胞纯度高，细胞活力强等优点，但分离成功率低，培养周期长，而且培养中加入胎牛血清等动物源性成分，增加了培养成本，也引入了外源动物蛋白，使培养的细胞不利于临床应用。
在绒毛膜剥离过程中不会去除附着在绒毛膜上的毛细血管，使得分离获得的细胞种类复杂，参杂了许多内皮细胞和血细胞，影响间充质干细胞的正常生长过程。胎盘采集及绒毛膜分离的现有技术还缺少有效减少污染的措施，防污染措施作用有限，原代培养污染率高，缺少从源头开始减少污染的方法，目前在培养环节添加抗生素只能在培养过程中抑制污染菌繁殖，不能有效减少污染；培养体系中一直添加抗生素，不利于绒毛膜干细胞的临床应用。
因此如何克服现有技术的不足是目前生物医药技术领域亟需解决的问题。
在绒毛膜剥离过程中不会去除附着在绒毛膜上的毛细血管，使得分离获得的细胞种类复杂，参杂了许多内皮细胞和血细胞，影响间充质干细胞的正常生长过程。胎盘采集及绒毛膜分离的现有技术还缺少有效减少污染的措施，防污染措施作用有限，原代培养污染率高，缺少从源头开始减少污染的方法，目前在培养环节添加抗生素只能在培养过程中抑制污染菌繁殖，不能有效减少污染；培养体系中一直添加抗生素，不利于绒毛膜干细胞的临床应用。
因此如何克服现有技术的不足是目前生物医药技术领域亟需解决的问题。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于提供一种细胞均一、稳定、细胞活性好、培养周期短、可应用于临床的人绒毛膜间充质干细胞的分离培养方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种人绒毛膜间充质干细胞的分离培养方法，包括以下步骤：
步骤（1），人胎盘组织的采集：人胎盘组织娩出后，用生理盐水对胎盘组织进行清洗以除去胎盘组织周围的血液和胎粪防止污染，然后将胎盘组织浸在胎盘保护液中，暂存于2-8℃环境中，使胎盘组织处于一个低渗、低温的缓冲环境中，保持组织中间充质干细胞的活性；
所述的胎盘保护液为含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的1640培养基；
步骤（2），绒毛膜组织的剥离：在无菌环境下，将步骤（1）得到的浸在胎盘保护液中的胎盘组织的靠近胎儿一侧的胎盘面朝上，然后剥离羊膜并暴露出羊膜下层的绒毛膜层，接着剪取脐带周围的绒毛膜层，并将剪取得到的绒毛膜组织置于0.9%氯化钠注射液中；
步骤（3），绒毛膜组织的洗涤与消毒：先用0.9%氯化钠注射液漂洗步骤（2）得到的绒毛膜组织以去除血液，并用镊子剥去毛细血管，接着依次用含有100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的0.9%氯化钠注射液和甲硝唑注射液浸泡绒毛膜组织，浸泡时间均为5-10分钟，最后再用0.9%氯化钠注射液清洗绒毛膜以去除残留的青霉素、链霉素和甲硝唑注射液，达到即有效防止污染又清除抗生素的残留；
步骤（4），绒毛膜组织的剪碎：将经步骤（3）清洗得到的绒毛膜组织放入无菌容器内，并加入间充质干细胞无血清培养基，使间充质干细胞处于温和的环境中，按照每10g绒毛膜组织加入1-2ml间充质干细胞无血清培养基，然后用无菌剪刀将绒毛膜剪成1mm3大小的组织块；
步骤（5），人绒毛膜间充质干细胞原代培养：将步骤（4）得到的绒毛膜组织块均匀的平铺于细胞培养瓶中，然后置于细胞培养箱内静置30-60min，使组织块牢固的贴于培养瓶底部，之后向细胞培养瓶中添加间充质干细胞无血清培养基，使培养基刚好没过绒毛膜组织块，接着于5%CO2、37℃的细胞培养箱中静止培养，6-8天后，可见组织块周围有细胞长出，即人绒毛膜间充质干细胞；
步骤（6），人绒毛膜间充质干细胞传代培养：待长出细胞汇合率达50-60%时对人绒毛膜间充质干细胞进行传代培养，弃培养基，加入重组细胞胰酶溶液消化细胞，待细胞消化完全后，加入是本步骤所用重组细胞胰酶溶液体积5倍的间充质干细胞无血清培养基（即本步骤所用重组细胞胰酶溶液体积与的间充质干细胞无血清培养基的体积比是1：5），以终止重组细胞胰酶作用，然后离心去除上清液，之后加入间充质干细胞无血清培养基重悬细胞，并移至新的培养瓶中置于5%CO2、37℃的细胞培养箱中培养；
培养过程中注意观察细胞生长状态，培养基营养不够或PH值不符时应及时进行补充或更换新的上述无血清培养基；
步骤（7），人绒毛膜间充质干细胞的冻存：当步骤（6）培养的细胞汇合率达90%后进行细胞冻存，先用重组细胞胰酶溶液将细胞消化成单个细胞后，再加入是本步骤所用重组细胞胰酶溶液体积5倍的间充质干细胞无血清培养基终止重组细胞胰酶溶液作用（即本步骤所用重组细胞胰酶溶液体积与的间充质干细胞无血清培养基的体积比是1：5），离心去除上清液，用含有体积分数为20%冻存保护剂的间充质干细胞无血清培养基重悬细胞，重悬混匀后，将重悬溶液置于冻存管中；
步骤（8），冻存细胞缓慢降温：将步骤（7）得到的冻存管置于含有异丙醇的冻存盒中，-
80℃冰箱过夜放置，第二天转入-196℃液氮罐中长期储存；
步骤（9），冻存细胞的复苏：从步骤（8）的液氮罐中取出冻存管后，置于37℃水浴锅中迅速融化，1200-1800rpm离心5min，去除含有冻存保护剂的间充质干细胞无血清培养基，加间充质干细胞无血清培养基重悬细胞并将重悬溶液移至细胞培养瓶中，于5%CO2、37℃细胞培养箱静置培养，第二天显微镜下观察细胞贴壁情况，若细胞已经贴壁说明细胞复苏成功，然后更换新的间充质干细胞无血清培养基，于5%CO2、37℃细胞培养箱继续培养。
步骤（1），人胎盘组织的采集：人胎盘组织娩出后，用生理盐水对胎盘组织进行清洗以除去胎盘组织周围的血液和胎粪防止污染，然后将胎盘组织浸在胎盘保护液中，暂存于2-8℃环境中，使胎盘组织处于一个低渗、低温的缓冲环境中，保持组织中间充质干细胞的活性；
所述的胎盘保护液为含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的1640培养基；
步骤（2），绒毛膜组织的剥离：在无菌环境下，将步骤（1）得到的浸在胎盘保护液中的胎盘组织的靠近胎儿一侧的胎盘面朝上，然后剥离羊膜并暴露出羊膜下层的绒毛膜层，接着剪取脐带周围的绒毛膜层，并将剪取得到的绒毛膜组织置于0.9%氯化钠注射液中；
步骤（3），绒毛膜组织的洗涤与消毒：先用0.9%氯化钠注射液漂洗步骤（2）得到的绒毛膜组织以去除血液，并用镊子剥去毛细血管，接着依次用含有100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的0.9%氯化钠注射液和甲硝唑注射液浸泡绒毛膜组织，浸泡时间均为5-10分钟，最后再用0.9%氯化钠注射液清洗绒毛膜以去除残留的青霉素、链霉素和甲硝唑注射液，达到即有效防止污染又清除抗生素的残留；
步骤（4），绒毛膜组织的剪碎：将经步骤（3）清洗得到的绒毛膜组织放入无菌容器内，并加入间充质干细胞无血清培养基，使间充质干细胞处于温和的环境中，按照每10g绒毛膜组织加入1-2ml间充质干细胞无血清培养基，然后用无菌剪刀将绒毛膜剪成1mm3大小的组织块；
步骤（5），人绒毛膜间充质干细胞原代培养：将步骤（4）得到的绒毛膜组织块均匀的平铺于细胞培养瓶中，然后置于细胞培养箱内静置30-60min，使组织块牢固的贴于培养瓶底部，之后向细胞培养瓶中添加间充质干细胞无血清培养基，使培养基刚好没过绒毛膜组织块，接着于5%CO2、37℃的细胞培养箱中静止培养，6-8天后，可见组织块周围有细胞长出，即人绒毛膜间充质干细胞；
步骤（6），人绒毛膜间充质干细胞传代培养：待长出细胞汇合率达50-60%时对人绒毛膜间充质干细胞进行传代培养，弃培养基，加入重组细胞胰酶溶液消化细胞，待细胞消化完全后，加入是本步骤所用重组细胞胰酶溶液体积5倍的间充质干细胞无血清培养基（即本步骤所用重组细胞胰酶溶液体积与的间充质干细胞无血清培养基的体积比是1：5），以终止重组细胞胰酶作用，然后离心去除上清液，之后加入间充质干细胞无血清培养基重悬细胞，并移至新的培养瓶中置于5%CO2、37℃的细胞培养箱中培养；
培养过程中注意观察细胞生长状态，培养基营养不够或PH值不符时应及时进行补充或更换新的上述无血清培养基；
步骤（7），人绒毛膜间充质干细胞的冻存：当步骤（6）培养的细胞汇合率达90%后进行细胞冻存，先用重组细胞胰酶溶液将细胞消化成单个细胞后，再加入是本步骤所用重组细胞胰酶溶液体积5倍的间充质干细胞无血清培养基终止重组细胞胰酶溶液作用（即本步骤所用重组细胞胰酶溶液体积与的间充质干细胞无血清培养基的体积比是1：5），离心去除上清液，用含有体积分数为20%冻存保护剂的间充质干细胞无血清培养基重悬细胞，重悬混匀后，将重悬溶液置于冻存管中；
步骤（8），冻存细胞缓慢降温：将步骤（7）得到的冻存管置于含有异丙醇的冻存盒中，-
80℃冰箱过夜放置，第二天转入-196℃液氮罐中长期储存；
步骤（9），冻存细胞的复苏：从步骤（8）的液氮罐中取出冻存管后，置于37℃水浴锅中迅速融化，1200-1800rpm离心5min，去除含有冻存保护剂的间充质干细胞无血清培养基，加间充质干细胞无血清培养基重悬细胞并将重悬溶液移至细胞培养瓶中，于5%CO2、37℃细胞培养箱静置培养，第二天显微镜下观察细胞贴壁情况，若细胞已经贴壁说明细胞复苏成功，然后更换新的间充质干细胞无血清培养基，于5%CO2、37℃细胞培养箱继续培养。
[0008] 作为本发明进一步的方案 ：步骤（1）所述的暂存于2-8℃环境中的时间不能超过24h。
[0009] 作为本发明进一步的方案 ：步骤（7）所述的冻存保护剂为DMSO和右旋糖酐细胞冻存混合液。
[0010] 作为本发明进一步的方案 ：步骤（7）所述的将重悬溶液置于冻存管中时，采用规格为2ml的冻存管，每个冻存管中加入重悬溶液1.5-1.8ml。
[0011] 作为本发明进一步的方案：步骤（6）和步骤（7）中用重组细胞胰酶溶液消化细胞前，先用PBS清洗细胞以除去培养基。
[0012] 本发明所有的培养过程中，应注意观察细胞生长状态，培养基营养不够或PH值不符时应及时进行补充或更换新的上述无血清培养基。
[0014] 本发明加入培养基重悬细胞时，培养基的加入量没有具体限制，只要能重悬细胞即可，具体可根据实际情况中细胞的数量及培养瓶的大小来确定。
[0015] 本发明中用含有体积分数为20%冻存保护剂的间充质干细胞无血清培养基也可自行配制，将间充质干细胞无血清培养基、二甲基亚砜和右旋糖酐按体积比为8:1:1，混匀，即得。
[0016] 本发明绒毛膜清洗采用了青霉素、链霉素、甲硝唑注射液，对分娩过程中带有霉菌、细菌的绒毛膜处理非常有效，可大大减少因霉菌、细菌污染造成的间充质干细胞分离培养不合格的几率。
[0017] 本发明采用组织块培养法，不使用血清，未引入外源动物蛋白，使培养的细胞更利于临床应用。
[0018] 本发明的制备绒毛膜间充质干细胞的方法，具有如下优势：1)避免污染，从采集到分离层层把关有效减少霉菌、细菌的污染几率；
2)明确绒毛膜取材要求：剪取脐带周围附近的绒毛膜层，并彻底去除绒毛膜下层的毛细血管，获得活性较好、种类单一的间充质干细胞；
3)采用组织贴壁法：分离过程中不使用胰酶和胶原酶进行消化，对间充质干细胞无损伤，细胞活性较好，操作过程中节约了酶消化时间，耗时短、操作流程简单，相比于酶消化法，每次分离可节约50%的时间；
4)使用间充质干细胞无血清培养基培养减少动物源成分使用，细胞可按此方法从P0代传至P20代维持性能稳定，主要包括细胞形态、增殖能力、MSC 表面标记物表达，此方法还可维持绒毛膜间充质干细胞在体外长期培养过程；
5)本方法中所采用的试剂均为人工合成试剂，无外源物质，成分明确，并进行相关临床检测符合标准；
6）冻存复苏后细胞状态良好，能够稳定保持细胞干性和细胞活力，对细胞无伤害。
附图说明
2)明确绒毛膜取材要求：剪取脐带周围附近的绒毛膜层，并彻底去除绒毛膜下层的毛细血管，获得活性较好、种类单一的间充质干细胞；
3)采用组织贴壁法：分离过程中不使用胰酶和胶原酶进行消化，对间充质干细胞无损伤，细胞活性较好，操作过程中节约了酶消化时间，耗时短、操作流程简单，相比于酶消化法，每次分离可节约50%的时间；
4)使用间充质干细胞无血清培养基培养减少动物源成分使用，细胞可按此方法从P0代传至P20代维持性能稳定，主要包括细胞形态、增殖能力、MSC 表面标记物表达，此方法还可维持绒毛膜间充质干细胞在体外长期培养过程；
5)本方法中所采用的试剂均为人工合成试剂，无外源物质，成分明确，并进行相关临床检测符合标准；
6）冻存复苏后细胞状态良好，能够稳定保持细胞干性和细胞活力，对细胞无伤害。
附图说明
[0019] 图1是分离获得的原代人绒毛膜间充质干细胞和传代后人绒毛膜间充干细胞形态图；其中，A为分离获得的原代间充质干细胞；B为第1代间充质干细胞；C为第5代间充质干细胞；D为第10代间充质干细胞；E为第15代间充质干细胞；F为第20代间充质干细胞；图2是流式检测获得的人绒毛膜间充干细胞表面抗原表达情况一维结果图：其中，A为收集细胞位置；B为获取的数据，共收集10000，其中R1门中有9050个细胞，R2门中有9050个细胞，R3门中有8990个细胞，R4门中有8989个细胞，R5门中有8982个细胞；C为CD90阳性峰图；D为CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR阴性峰图；E为CD105阳性峰图；F为CD73阳性峰图。
[0020] 图3是流式检测获得的人绒毛膜间充干细胞表面抗原表达情况二维结果图；其中，A为收集细胞位置；B为获取的数据，共收集10000，其中R1门中有9027个细胞，R2门中有8933个细胞，R3门中有8461个细胞；C为CD90阳性，CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR阴性细胞团位置；D为R2细胞团中CD105阳性、CD73阳性细胞团位置。
[0021] 图4是酶消化法获得的人绒毛膜间充质干细胞与本专利方法获得人绒毛膜间充质干细胞形态的比较图；其中，A为酶消化法获得的间充质干细胞；B为酶消化法获得的间充质干细胞进行传代后；C为本专利法获得的间充质干细胞；D为本专利法获得的间充质干细胞进行传代后。
具体实施方式
[0022] 下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
[0023] 本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
[0024] 本发明所述的胎盘保护液为自己配制，为含有100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的1640培养基，1640培养基购自BI，货号为01-100-1ACS。
[0025] 本发明所用的间充质干细胞无血清培养基购自BI，货号为05-200-1A。
[0026] 本发明所用的重组细胞胰酶溶液购自BI，货号为03-079-1B。
[0027] DMSO和右旋糖酐细胞冻存混合液，购自WAK-Chemie Medical GmbH，货号为WAK-DEX40-50-5。
[0028] 实施例1人胎盘绒毛膜的剥离
操作前首先用体积浓度为75%酒精擦 拭采集容器进行消毒后拿入生物安全柜，无菌环境下打开胎盘采集容器，用体积浓度为75%酒精浸泡过的纱布擦拭容器口周围的血液，避免滴落在操作台面造成污染，用14cm灭菌的镊子翻转胎盘，将靠近胎儿一侧的胎盘面朝上，换用10cm灭菌镊子轻轻剥离羊膜暴露出羊膜下层的绒毛膜层，用灭菌眼科剪沿着脐带断面剪取脐带周围的绒毛膜层，剪取过程中应尽量沿着绒毛膜剪，去除连接在绒毛膜下的绒毛和毛细血管，将获得的组织置于0.9%氯化钠注射液中清洗去除血液，用镊子剥去毛细血管，清洗结束后将绒毛膜组织依次用含有100U/ml青霉素100U/ml链霉素的0.9%氯化钠注射液和甲硝唑注射液浸泡绒毛膜组织，浸泡时间均为10分钟，浸泡过程中要用镊子晃动组织，使绒毛膜组织充分与消毒液接触，达到除菌的效果，最后再用0.9%氯化钠注射液清洗绒毛膜一次，去除残留的青霉素、链霉素和甲硝唑注射液，即达到有效防止污染又清除抗生素的残留。清洗完成后的绒毛膜组织放入无菌培养皿中，并加入间充质干细胞无血清培养基，按照每10g绒毛膜组织加入1-2ml间充质干细胞无血清培养基，然后用无菌剪刀将绒毛膜剪成
1mm3大小的组织块。
操作前首先用体积浓度为75%酒精擦 拭采集容器进行消毒后拿入生物安全柜，无菌环境下打开胎盘采集容器，用体积浓度为75%酒精浸泡过的纱布擦拭容器口周围的血液，避免滴落在操作台面造成污染，用14cm灭菌的镊子翻转胎盘，将靠近胎儿一侧的胎盘面朝上，换用10cm灭菌镊子轻轻剥离羊膜暴露出羊膜下层的绒毛膜层，用灭菌眼科剪沿着脐带断面剪取脐带周围的绒毛膜层，剪取过程中应尽量沿着绒毛膜剪，去除连接在绒毛膜下的绒毛和毛细血管，将获得的组织置于0.9%氯化钠注射液中清洗去除血液，用镊子剥去毛细血管，清洗结束后将绒毛膜组织依次用含有100U/ml青霉素100U/ml链霉素的0.9%氯化钠注射液和甲硝唑注射液浸泡绒毛膜组织，浸泡时间均为10分钟，浸泡过程中要用镊子晃动组织，使绒毛膜组织充分与消毒液接触，达到除菌的效果，最后再用0.9%氯化钠注射液清洗绒毛膜一次，去除残留的青霉素、链霉素和甲硝唑注射液，即达到有效防止污染又清除抗生素的残留。清洗完成后的绒毛膜组织放入无菌培养皿中，并加入间充质干细胞无血清培养基，按照每10g绒毛膜组织加入1-2ml间充质干细胞无血清培养基，然后用无菌剪刀将绒毛膜剪成
1mm3大小的组织块。
[0029] 实施例2人绒毛膜间充质干细胞原代培养
取消毒、清洗、剪碎后的组织2ml于T-75细胞培养瓶中，用巴氏吸管将组织平铺于细胞培养瓶底部，应保证组织与组织之间存有空隙，给从组织中爬出的细胞一定的生长空间，将细胞培养瓶倒置于5%CO2、37℃细胞培养箱中，放置30min使组织牢固的贴于细胞培养瓶底部，静止结束后取出细胞培养瓶添加间充质干细胞无血清培养基，用移液管吸取7ml培养基，沿瓶壁缓慢加入培养瓶中无组织粘附的部位，盖好盖子后翻转细胞培养瓶并轻轻晃动，使培养基均匀的铺于组织之间，将细胞培养瓶置于5%CO2、37℃细胞培养箱静止培养，5天后更换新的间充质干细胞无血清培养基，培养7天后与显微镜下观察，可见组织周围开始有细胞长出，之后每2-3天观察一次细胞生长情况，如图1中的A图和图4中的C图均为分离获得的原代间充质干细胞。当细胞汇合度达60%时可进行细胞传代。
取消毒、清洗、剪碎后的组织2ml于T-75细胞培养瓶中，用巴氏吸管将组织平铺于细胞培养瓶底部，应保证组织与组织之间存有空隙，给从组织中爬出的细胞一定的生长空间，将细胞培养瓶倒置于5%CO2、37℃细胞培养箱中，放置30min使组织牢固的贴于细胞培养瓶底部，静止结束后取出细胞培养瓶添加间充质干细胞无血清培养基，用移液管吸取7ml培养基，沿瓶壁缓慢加入培养瓶中无组织粘附的部位，盖好盖子后翻转细胞培养瓶并轻轻晃动，使培养基均匀的铺于组织之间，将细胞培养瓶置于5%CO2、37℃细胞培养箱静止培养，5天后更换新的间充质干细胞无血清培养基，培养7天后与显微镜下观察，可见组织周围开始有细胞长出，之后每2-3天观察一次细胞生长情况，如图1中的A图和图4中的C图均为分离获得的原代间充质干细胞。当细胞汇合度达60%时可进行细胞传代。
[0030] 实施例3人绒毛膜间充质干细胞传代
将T-75培养瓶中的培养基完全移出，加入15mlPBS清洗细胞一次（采用PBS清洗细胞不为必须操作，可根据实际情况来定），移除PBS，加入重组细胞胰酶溶液3ml，放入37℃培养箱消化约2分钟，在此过程中需在倒置显微镜下观察到贴壁细胞收缩情况，待细胞全部脱离瓶底后，用手掌拍打培养瓶侧壁，显微镜观察细胞是否已消化为单个细胞，加入15ml的间充质干细胞无血清培养基稀释重组细胞胰酶溶液终止胰酶作用，然后将细胞悬液转移至50ml离心管中，取200ul细胞悬液用苔盼蓝染色计活细胞数。然后将离心管离心，1200rpm/min，离心3min，弃上清，加入10ml间充质干细胞无血清培养基，用巴氏管轻轻吹悬沉淀在离心管底部的细胞，再根据4000-6000个细胞数/cm2 接种到新的细胞培养瓶中，并做好标记，培养瓶中补加间充质干细胞无血清培养基至15ml，于37℃、饱和湿度、5%的CO2培养箱中培养，一般
2-3天细胞汇合度可达90%，此时可进行再次传代，若细胞生长缓慢应每3天更换一次培养基。通过全量换液可去除未贴壁细胞和细胞碎片，细胞汇合度达80%时可进行再次传代，通过以上步骤可完成间充质干细胞的传代培养，根据需要重复上述操作进行P2、P3、P4……传代，如图1-B、C、D、E、F分别为传至第1代、第5代、第10代、第15代、第20代的间充质干细胞，随着传代次数的增加细胞形态会有所改变，特别是从第10代开始，细胞生长速度开始减慢，细胞开始变得细长，成衰老的发展趋势，如图1所示。
将T-75培养瓶中的培养基完全移出，加入15mlPBS清洗细胞一次（采用PBS清洗细胞不为必须操作，可根据实际情况来定），移除PBS，加入重组细胞胰酶溶液3ml，放入37℃培养箱消化约2分钟，在此过程中需在倒置显微镜下观察到贴壁细胞收缩情况，待细胞全部脱离瓶底后，用手掌拍打培养瓶侧壁，显微镜观察细胞是否已消化为单个细胞，加入15ml的间充质干细胞无血清培养基稀释重组细胞胰酶溶液终止胰酶作用，然后将细胞悬液转移至50ml离心管中，取200ul细胞悬液用苔盼蓝染色计活细胞数。然后将离心管离心，1200rpm/min，离心3min，弃上清，加入10ml间充质干细胞无血清培养基，用巴氏管轻轻吹悬沉淀在离心管底部的细胞，再根据4000-6000个细胞数/cm2 接种到新的细胞培养瓶中，并做好标记，培养瓶中补加间充质干细胞无血清培养基至15ml，于37℃、饱和湿度、5%的CO2培养箱中培养，一般
2-3天细胞汇合度可达90%，此时可进行再次传代，若细胞生长缓慢应每3天更换一次培养基。通过全量换液可去除未贴壁细胞和细胞碎片，细胞汇合度达80%时可进行再次传代，通过以上步骤可完成间充质干细胞的传代培养，根据需要重复上述操作进行P2、P3、P4……传代，如图1-B、C、D、E、F分别为传至第1代、第5代、第10代、第15代、第20代的间充质干细胞，随着传代次数的增加细胞形态会有所改变，特别是从第10代开始，细胞生长速度开始减慢，细胞开始变得细长，成衰老的发展趋势，如图1所示。
[0031] 实施例4人绒毛膜间充质干细胞冻存
T-75细胞瓶中的细胞汇合度达90%时可进行间充质干细胞的冻存，首先配制含有体积分数为20%冻存保护剂的间充质干细胞无血清培养基，用移液枪吸取间充质干细胞无血清培养基4ml，加入500ul的二甲基亚砜（DMSO）和500ul的右旋糖酐，充分混匀备用；移除T-75细胞培养瓶中的培养基，加入15ml的PBS清洗细胞一次（采用PBS清洗细胞不为必须操作，可根据实际情况来定），移除PBS溶液，加入3ml重组细胞胰酶溶液，左右晃动细胞培养瓶，是胰酶溶液均匀的平铺于培养瓶底部，将细胞培养瓶置于37℃培养箱静置2min，显微镜下观察细胞细胞收缩情况，若所有细胞开始收缩并脱离平底，用手轻轻拍打培养瓶侧壁，使细胞成为单个细胞悬液，此时加入加入15ml的间充质干细胞无血清培养基稀释重组细胞胰酶溶液终止胰酶作用，并用移液器轻轻吹打细胞悬液3-4次，将细胞悬液移至50ml离心管，
1200rpm，离心5分钟，去除上清液，加入事先配制好的含有体积分数为20%冻存保护剂的间充质干细胞无血清培养基5ml重悬细胞，移液器反复吹打3次，将细胞吹散充分接触冻存保护剂，取1.6ml细胞悬液移至2ml冻存管中，共分为3只，拧紧冻存管的盖子，防止低温环境下冻存管盖子变松，导致细胞污染，将冻存管置于含有异丙醇的冻存盒中，迅速将冻存盒置于-80℃冰箱过夜，第二天取出冻存盒将细胞冻存管移至-196℃液氮罐中保存。
T-75细胞瓶中的细胞汇合度达90%时可进行间充质干细胞的冻存，首先配制含有体积分数为20%冻存保护剂的间充质干细胞无血清培养基，用移液枪吸取间充质干细胞无血清培养基4ml，加入500ul的二甲基亚砜（DMSO）和500ul的右旋糖酐，充分混匀备用；移除T-75细胞培养瓶中的培养基，加入15ml的PBS清洗细胞一次（采用PBS清洗细胞不为必须操作，可根据实际情况来定），移除PBS溶液，加入3ml重组细胞胰酶溶液，左右晃动细胞培养瓶，是胰酶溶液均匀的平铺于培养瓶底部，将细胞培养瓶置于37℃培养箱静置2min，显微镜下观察细胞细胞收缩情况，若所有细胞开始收缩并脱离平底，用手轻轻拍打培养瓶侧壁，使细胞成为单个细胞悬液，此时加入加入15ml的间充质干细胞无血清培养基稀释重组细胞胰酶溶液终止胰酶作用，并用移液器轻轻吹打细胞悬液3-4次，将细胞悬液移至50ml离心管，
1200rpm，离心5分钟，去除上清液，加入事先配制好的含有体积分数为20%冻存保护剂的间充质干细胞无血清培养基5ml重悬细胞，移液器反复吹打3次，将细胞吹散充分接触冻存保护剂，取1.6ml细胞悬液移至2ml冻存管中，共分为3只，拧紧冻存管的盖子，防止低温环境下冻存管盖子变松，导致细胞污染，将冻存管置于含有异丙醇的冻存盒中，迅速将冻存盒置于-80℃冰箱过夜，第二天取出冻存盒将细胞冻存管移至-196℃液氮罐中保存。
[0032] 实施例5人绒毛膜间充质干细胞的复苏
取一个保温饭盒装入适量37℃温水，用镊子从液氮罐中取出之前冻存的细胞冻存管，迅速置于37℃温水中并不断晃动细胞冻存管，使冻存管中的液体迅速融化，待液体完全融化后1200rpm，离心5min，去除上清液，用移液枪加入1ml间充质干细胞无血清培养基并吹打
3-4次，吸出溶液移至T-25细胞培养瓶中，补充3ml间充质干细胞无血清培养基，混匀后置于
5%CO2、37℃细胞培养箱培养，第二天显微镜下观察细胞贴壁情况，并更换新的培养基继续培养，根据细胞生长密度进行传代。
取一个保温饭盒装入适量37℃温水，用镊子从液氮罐中取出之前冻存的细胞冻存管，迅速置于37℃温水中并不断晃动细胞冻存管，使冻存管中的液体迅速融化，待液体完全融化后1200rpm，离心5min，去除上清液，用移液枪加入1ml间充质干细胞无血清培养基并吹打
3-4次，吸出溶液移至T-25细胞培养瓶中，补充3ml间充质干细胞无血清培养基，混匀后置于
5%CO2、37℃细胞培养箱培养，第二天显微镜下观察细胞贴壁情况，并更换新的培养基继续培养，根据细胞生长密度进行传代。
[0033] 将得到的间充质干细胞进行流式细胞检测（图2和图3），方法如下：实验原理：利用流式细胞技术检测间充质干细胞特异性表面抗体表达情况。根据抗原抗体结合原理，选用BD公司人类间充质干细胞检测试剂盒，用特定荧光素标记的抗体对已知携有相应抗原的细胞进行染色。经荧光素标记抗体染色的细胞可以被流式细胞仪识别，并根据已知细胞所携带的荧光素的强度，对标记抗体进行定性，定量分析。检测试剂盒配备了国际通用的MSC的五阴（CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR）三阳（CD73、CD90、CD105）检测抗体和对应的对照抗体。
[0034] 检测步骤：（1）取7根流式管，分别为
①空白对照
②FITC-CD90 单染管
③PE 单染管
④PerCP-CD105单染管
⑤APC-CD73单染管
⑥Positive antibody isotype（阳性混合抗体的对照抗体） + Negative antibody isotype（阴性混合抗体的对照抗体）
⑦Positive antibody cocktail（阳性混合抗体）（CD73、CD90、CD105）+ Negative antibody cocktail（阴性混合抗体）（CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR）
（2）各流式管分别加入相同量的传代细胞（有核细胞数2-5×105个），不可粘到管壁。
①空白对照
②FITC-CD90 单染管
③PE 单染管
④PerCP-CD105单染管
⑤APC-CD73单染管
⑥Positive antibody isotype（阳性混合抗体的对照抗体） + Negative antibody isotype（阴性混合抗体的对照抗体）
⑦Positive antibody cocktail（阳性混合抗体）（CD73、CD90、CD105）+ Negative antibody cocktail（阴性混合抗体）（CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR）
（2）各流式管分别加入相同量的传代细胞（有核细胞数2-5×105个），不可粘到管壁。
[0035] （3）各流式管加入对应抗体①不加任何抗体
②加入CD90-FITC 5ul
③加入PE-Negative cocktail 5μl
④加入CD105-Per CP 5ul
⑤加入CD73-APC 5ul
⑥加入阳性混合抗体的对照抗体（Positive antibody isotype）和阴性混合抗体的对照抗体（Negative antibody isotype）
⑦加入阳性混合抗体（Positive antibody cocktail）和阴性混合抗体（Negative antibody cocktail）
（4）涡旋振荡器混匀各检测管后，室温避光放置30min，加入1mL PBS/管，涡旋混匀后，
1200rpm/min，离心5min。
②加入CD90-FITC 5ul
③加入PE-Negative cocktail 5μl
④加入CD105-Per CP 5ul
⑤加入CD73-APC 5ul
⑥加入阳性混合抗体的对照抗体（Positive antibody isotype）和阴性混合抗体的对照抗体（Negative antibody isotype）
⑦加入阳性混合抗体（Positive antibody cocktail）和阴性混合抗体（Negative antibody cocktail）
（4）涡旋振荡器混匀各检测管后，室温避光放置30min，加入1mL PBS/管，涡旋混匀后，
1200rpm/min，离心5min。
[0037] （6）上机分析结果得：共收集10000个细胞，其中CD90阳性细胞占100%，CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR阴性细胞占99.3%，CD105阳性细胞占99.3%，CD73阳性细胞占99.2%，所以CD73、CD90、CD105表达率在99%以上，为阳性；CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR表达率小于1%，为阴性；另外CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR阴性细胞中CD73、CD90、CD105共阳性细胞占93.7%。
[0038] 上述说明：按照实施例中的方法分离培养得到的人绒毛膜间充质干细胞，满足CD73、CD90、CD105 大于95%，为阳性；CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR小于2%，为阴性的结果，经鉴定为间充质干细胞。
[0039] 酶消化法和本方法获得的绒毛膜间充干细胞形态的比较（图4），方法及结果如下：酶消化法中绒毛膜的剥离与本发明专利申请方法一致，剥离获得组织用剪刀剪成5mm3大小后，加入终浓度为2mg/ml的1型胶原酶37℃消化60min，加入等体积培养基中和胶原酶作用，用100um滤网过滤去除较大的组织块，滤液离心去除上清，用培养基重悬沉淀获得单细胞悬液，加入培养瓶中于37℃培养箱培养，48h即可观察到贴壁生长的细胞。
[0040] 结果说明：酶消化法获得的人绒毛膜间充质干细胞生长分散（图4-A），形态不一致，细胞在生长过程中会产生杂质影响细胞生长状态，传代后细胞拉丝，互相交织在一起（图4-B），本发明专利所用的方法分离获得的人绒毛膜间充质干细胞（图4-C）形态均一，呈涡旋状生长，符合间充质干细胞生长特性，传代后（图4-D）也能较好保持这些特性。
[0041] 以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
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