围产期组织衍生的间充质干细胞：其制备方法和用途
阅读：960发布：2020-06-26
专利汇可以提供围产期组织衍生的间充质干细胞：其制备方法和用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了胎盘组织衍生的CD106高CD151+巢蛋白+间充质干细胞(MSC)的制备方法。在第一方面，本发明涉及以工业规模制备这些细胞的特定方法和由此产生的细胞群。在第二方面，本发明涉及通过所述特定方法获得的细胞培养物，其含有表达血管细胞粘附分子1(VCAM-1)标记物的胎盘CD106高CD151+巢蛋白+MSC。本 申请 显示所述胎盘CD106高CD151+巢蛋白+MSC能够在体外和体内诱导血管生成。本文呈现的结果还显示，将所述胎盘CD106高CD151+巢蛋白+MSC施用至患有缺血性 疾病 或循环系统病症的个体，导致所述疾病或病症的一种或多种症状可检测的改善。因此，在第三方面，本发明涉及胎盘CD106高CD151+巢蛋白+MSC，其用作 治疗 患有缺血性疾病、循环系统病症、免疫疾病、器官损伤或器官功能衰竭的受试者的药物。，下面是围产期组织衍生的间充质干细胞：其制备方法和用途专利的具体信息内容。
1.一种制备CD106高CD151+巢蛋白+间充质干细胞(MSC)的方法，所述方法包括在包含至少两种促炎生长因子的培养基中培养未分化的MSC群。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述促炎生长因子选自TNFα、IL1、IL4、IL12、IL18和IFNγ，优选选自IL1、IL4、IL12和IL18。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述促炎生长因子是IL1和IL4的混合物，优选IL1β和IL4的混合物。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述未分化的MSC源自生物组织或来自生物流体，所述生物组织选自胎盘、脐带或胎盘膜(绒毛膜、羊膜)或其组分，所述生物流体例如脐带血、胎盘血或羊水。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中通过从外植体组织中分离细胞而获得所述未分化的MSC。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述未分化的MSC源自脐带，优选通过从脐带片段的外植体中分离细胞。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述未分化的MSC源自胎盘，优选通过从胎盘组织片段中分离细胞。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述培养基含有1至100ng/ml的白细胞介素1，优选白细胞介素1β。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述培养基含有1至100ng/ml的白细胞介素4。
10.一种增强未分化的MSC中CD106表达水平的方法，所述方法包括在包含至少两种促炎生长因子的培养基中培养未分化的MSC群。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述促炎生长因子选自TNFα、IL1、IL4、IL12、IL18和IFNγ，优选选自IL1、IL4、IL12和IL18。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述促炎生长因子是IL1和IL4的混合物，优选IL1β和IL4的混合物。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的方法，其中所述未分化的MSC源自生物组织或源自生物流体，所述生物组织选自胎盘、脐带或胎盘膜(绒毛膜、羊膜)或其组分，所述生物流体例如脐带血、胎盘血或羊水。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的方法，其中通过从外植体组织中分离细胞而获得所述未分化的MSC。
15.根据权利要求10至14中任一项所述的方法，其中所述未分化的MSC源自脐带，优选通过从脐带片段的外植体中分离细胞。
16.根据权利要求10至15中任一项所述的方法，其中所述未分化的MSC源自胎盘，优选通过从胎盘组织片段中分离细胞。
17.根据权利要求10至16中任一项所述的方法，其中所述培养基含有1至100ng/ml的白细胞介素1，优选白细胞介素1β。
18.根据权利要求10至17中任一项所述的方法，其中所述培养基含有1至100ng/ml的白细胞介素4。
19.一种细胞培养物，其含有通过权利要求1至18所述方法获得的CD106高CD151+巢蛋白+间充质干细胞(MSC)。
20.根据权利要求19所述的细胞培养物，其含有：
-超过60％的以可检测水平表达CD106的细胞，
-超过98％的以可检测水平表达CD151的细胞，
-超过98％的以可检测水平表达Nestin的细胞，
-超过95％的以可检测水平表达标记物CD73、CD90、CD105和CD166的细胞，和-少于2％的以可检测水平表达标记物CD45、CD34和HLA-DR的细胞。
21.根据权利要求19或20所述的细胞培养物，特征在于其含有超过98％的不表达可检测水平标记物CD11b、CD14、CD15、CD16、CD31、CD34、CD45、CD49f、CD102、CD104和CD133的MSC。
22.根据权利要求19至21中任一项所述的细胞培养物，其用于治疗患有缺血性疾病、循环系统病症、免疫疾病、器官损伤或病症或器官功能衰竭的受试者。
23.根据权利要求22所述的细胞培养物，其中所述疾病或病症选自：1型糖尿病、II型糖尿病、GVHD、再生障碍性贫血、多发性硬化、杜氏肌营养不良、类风湿性关节炎、脑中风、特发性肺纤维化、扩张型心肌病、骨关节炎、肝硬化、肝衰竭、肾衰竭、外周动脉闭塞性疾病、严重肢体缺血、外周血管疾病、心力衰竭、糖尿病性溃疡、纤维化病症、粘连和子宫内膜病。
24.根据权利要求22所述的用于用途的细胞培养物，其中所述疾病或病症是皮肤或粘膜疾病或病症，优选糖尿病性溃疡、溃疡、创伤、烧伤、烫伤、伤口或伤口愈合问题、褥疮溃疡、疣、粘连、子宫内膜病或胃肠道纤维化病症，如肛瘘。
25.一种药物或兽医组合物，其含有权利要求19至21中任一项所限定的细胞培养物。
26.根据权利要求25所述的药物或兽医组合物，还包含水凝胶或其它生物相容性材料。
27.一种局部制剂，其含有权利要求19至21中任一项所限定的细胞培养物。
28.根据权利要求25或26所述的药物组合物或权利要求27所述的局部制剂，其用于治疗患有缺血性疾病、循环系统病症、免疫疾病、纤维化病症、器官损伤或器官功能衰竭的受试者。
29.根据权利要求25或26所述的药物组合物或权利要求27所述的局部制剂，其用于治疗患有选自以下疾病或病症的受试者：1型糖尿病、II型糖尿病、GVHD、再生障碍性贫血、多发性硬化、杜氏肌营养不良、类风湿性关节炎、脑中风、特发性肺纤维化、扩张型心肌病、骨关节炎、肝硬化、肝衰竭、肾衰竭、外周动脉闭塞性疾病、严重肢体缺血、外周血管疾病、心力衰竭、糖尿病性溃疡、纤维化病症、粘连和子宫内膜病。
30.一种皮肤病学或美容组合物，其含有权利要求19至21中任一项所限定的细胞培养物。
31.权利要求30的皮肤病学或美容组合物用于再生皮肤或粘膜细胞、改善皮肤或粘膜方面、或用于矫正皮肤或粘膜缺陷，例如暗斑、斑点、痤疮、皱纹、干燥的用途。
32.权利要求30的皮肤病学或美容组合物用于治疗皮肤损伤或病症，例如烧伤、疤、血管瘤、痣或疣的用途。
33.一种医疗装置，其含有权利要求19至21中任一项所限定的细胞培养物。
34.根据权利要求33所述的医疗装置，其中所述医疗装置是绷带、贴片、支架、内窥镜或注射器。
35.一种递送系统，其含有权利要求19至21中任一项所限定的细胞培养物。
36.根据权利要求35所述的递送系统，其中所述递送系统是生物聚合物的微囊泡或纳米囊泡、脂质、或纳米颗粒。
围产期组织衍生的间充质干细胞：其制备方法和用途
背景技术
[0001] 已知间充质干细胞(MSC)可用于再生医学和组织工程。在成人中，骨髓、脂肪组织、牙髓和经血是MSC的主要来源。它们也可以通过在补充FCS的DMEM中将胎盘细胞或脐带细胞培养3-4周来获得([12]、[13]、[14])。
[0002] MSC具有中胚层、外胚层和内胚层分化潜能。MSC还具有免疫抑制特性。MSC抑制或阻止树突细胞的成熟和T细胞、B细胞和NK细胞的增殖。它们的免疫调节作用由它们分泌的细胞因子和趋化因子介导。几个小组已经证明胎盘组织内的MSC在体外和体内显示出多谱系发育可塑性。胎盘组织(包括脐带、脐带血、胎盘、绒毛膜、羊膜和羊膜液)衍生的MSC显示出CD29、CD44、CD73、CD90和CD105的阳性表达，造血表面标记物CD11b、CD19、CD34和CD45的阴性表达，以及内皮表面标记物CD31的阴性表达。此外，胎盘组织衍生的MSC能够在适当的条件下(例如，一个完整的培养基中)转分化为所有三个胚层的细胞。
[0003] 围产期组织衍生的MSC也被证明具有广泛的免疫调节能力，能够影响适应性和先天性免疫应答。这些MSC以非MHC限制性方式在体外和体内抑制免疫细胞增殖和成熟并抑制免疫反应。因此，这些MSC被认为是低免疫原性的，显示低表达水平的I类HLA，没有II类HLA表达，并且没有共刺激分子(包括CD40、CD80和CD86)的表达。基本上，这些MSC可以对先天性免疫系统和适应性免疫系统的细胞发挥广泛的免疫调节作用。离体扩增的胎盘MSC也被证明可以抑制广泛的免疫细胞的活性，包括T细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、树突细胞(DC)、B细胞、中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞等。
[0004] 根据许多临床试验报告，人围产期组织衍生的MSC也是安全的。评估了输注脐带衍生的MSC(UC-MSC)对乙型肝炎病毒(HBV)感染相关的慢加急性肝衰竭(ACLF)患者的安全性和初始有效性。这些结果表明MSC输注在临床上是安全的，并且可以作为HBV相关ACLF患者的新型治疗方法[1]。还评估了人UC-MSC在治疗类风湿性关节炎(RA)中的安全性和有效性。这些结果表明在输注期间或之后没有观察到严重的副作用。此外，根据28个关节的疾病活动度评分[2]，MSC的治疗诱导了疾病的显著缓解。科学家们评估了短期和5年随访期间急性心肌梗死(AMI)后不久9例患者心肌内注射MSC的安全性和可行性[3]。这些结果表明，AMI后不久患者心肌内注射MSC是可行的，并且可以安全地进行为期5年的随访。一项确定MSC在严重肢体缺血患者中的安全性的前瞻性双盲随机安慰剂对照多中心研究显示，当肌内注射
200万细胞/kg体重的剂量时，MSC也是安全的[4]。在任何MSC植入部位均未检测到赘生性并发症。Hongye Fan等人([15])表明在DSS诱导的小鼠结肠炎中，移植IL1β引发的MSC具有增强的治疗有效性，这取决于它们增加的免疫抑制能力和增强的迁移能力。WO2014/093948也公开了纯化的MSC的治疗价值。
200万细胞/kg体重的剂量时，MSC也是安全的[4]。在任何MSC植入部位均未检测到赘生性并发症。Hongye Fan等人([15])表明在DSS诱导的小鼠结肠炎中，移植IL1β引发的MSC具有增强的治疗有效性，这取决于它们增加的免疫抑制能力和增强的迁移能力。WO2014/093948也公开了纯化的MSC的治疗价值。
[0005] 然而，MSC的定义一直存在争议，因为没有特定或独特的细胞表面标记物明确地识别它们。迄今为止，已经通过使用细胞表面表型蛋白标记物、塑料粘附成纤维细胞样生长和功能特性的组合来定义MSC。然而，根据这些细胞表面标记物存在几种不同的亚群，并且这些不同的亚群显示出不同的生物学特征、生物学功能并且在治疗方案中并非全部有效。例如，一些MSC群被IL1β刺激([12])，而其它群体则不被IL1β刺激([15]中的CD106阳性MSC)。此外，IL4抑制一些MSC群的增殖([12])，然而在这种细胞因子存在下诱导其它群体增殖([13])。因此迫切需要鉴定具有临床有效性并使其制备过程标准化的功能性MSC群。建立一个可以互换地用于每个胎盘和胚胎外组织的方案也很重要。更确切地说，找到一种从胎盘组织或脐带片段而产生治疗有效性MSC群的制备方法是很重要的。
[0006] 同时，目前对人MSC的许多治疗应用有很高的需求，但市场上的供应不足。因此需要一种工业规模的方法，其产生高产量的功能性MSC。还需要一种有效的培养系统，其以可承受的成本提供最佳产量，从而减少从所有胎盘和胚胎外组织获得MSC的供需缺口。
[0007] 通过提出用于产生和纯化不同来源(来自胎盘组织或来自脐带)的MSC亚群的最佳方法，并最终以尽可能少的传代和最少的群体倍增数来扩增所述亚群，本申请满足所有这些需求和其它需求。该方法导致从胎盘和脐带组织中回收具有多谱系分化能力的高效MSC。该方法可重复地提供相当数量的适合临床应用的MSC细胞。
发明内容
发明内容
[0008] 实施例1(见下文)公开了一种用于以工业规模产生人胎盘组织衍生的CD106高CD151+巢蛋白+间充质干细胞(MSC)的制备方法，使得能够在GMP兼容设施中制备获得至少15 2 高 +
×10 细胞/cm MSC的产量，并适合同种异体使用。所述胎盘组织衍生的CD106 CD151巢蛋白+间充质干细胞(MSC)包含超过95％的表达阳性标记物CD73、CD90、CD105和CD166的细胞，以及少于2％的表达阴性标记物CD45、CD34和HLA-DR的细胞。
×10 细胞/cm MSC的产量，并适合同种异体使用。所述胎盘组织衍生的CD106 CD151巢蛋白+间充质干细胞(MSC)包含超过95％的表达阳性标记物CD73、CD90、CD105和CD166的细胞，以及少于2％的表达阴性标记物CD45、CD34和HLA-DR的细胞。
[0009] 该方法可用于产生可用于人受试者或动物移植试验的细胞。
[0010] 它包括以下两个一般步骤：
[0012] 和
[0014] 在第一方面，本发明涉及以工业规模制备CD106高CD151+巢蛋白+间充质干细胞(MSC)的体外方法，所述方法包括在包含促炎生长因子或炎症介质的培养基中培养未分化的MSC群。
[0015] 可以通过收集存在于生物组织或流体中的单核细胞并在第一培养基中培养它们来获得所述“未分化的MSC群”。这些单核细胞可以通过任何常规方法获得，例如通过酶消化或围产期组织块的外植体培养[10]或从生物流体中分离[11]。
[0016] 如下文实施例3中所公开的，外植体培养是从脐带获得MSC的特别优选的方法。
[0017] 通常，该方法需要从运输溶液中取出样品，将其切成片(大约2-3cm长)，经过冲洗后，用抗菌剂和抗真菌剂对它们进行消毒，回收上皮膜并处理所述膜的碎片，在烧瓶中使其贴壁(优选在室温下没有培养基)，之后在贴壁的外植体上小心地加入完全培养基并在37℃下孵育数天。最终用合适的工具收集迁移的细胞，并在适当的第一培养基中保持培养(见下文)直至它们达到目标汇合。
[0018] 所述“第一培养基”可以是通常用于促进活的原代细胞生长的任何经典培养基。优选地，它不含任何生长因子或任何分化因子。
[0019] 技术人员很清楚什么样的培养基可以用作“第一培养基”。它们是例如DMEM、DMEM/F12、MEM、alpha-MEM(α-MEM)、IMDM或RPMI。优选地，所述第一培养基是DMEM(杜氏改良Eagle's培养基)或DMEM/F12(杜氏改良Eagle's培养基：营养混合物F-12)。
[0020] 更优选地，所述第一培养基含有2-20％或2-10％的胎牛血清。或者，所述第一培养基可含有1-5％的血小板裂解物。最优选的培养基含有2-20％或2-10％的胎牛血清和1-5％的血小板裂解物。
[0021] 还可以使用不含血清或血小板裂解物的培养基作为第一培养基，条件是其含有有利于原代活细胞生长的其它适当的试剂。
[0022] 在优选的实施方案中，所述“生物组织”是胎盘组织或脐带的任何部分。特别地，它可以包括或包含胎盘小叶、胎盘的羊膜或绒毛膜。此外，它可以是在脐带中发现的华通胶。它可以包括静脉和/或动脉、或不含静脉和/或动脉。
[0024] 所述未分化的MSC群优选是接种在塑料表面上的间充质干细胞群，其已经在没有任何生长因子的所述第一培养基中培养，直到细胞达到85-90％的汇合。
[0025] 通常，通过FACS或任何常规手段对细胞进行表型表征，以检测表面标记物CD73、CD90、CD105、CD166、CD45、CD34和HLA-DR的水平。
[0026] 当95％的细胞表达阳性表面标记物CD73、CD90、CD105和CD166，并且小于2％表达阴性表面标记物CD45、CD34和HLA-DR时，用胰蛋白酶消化细胞并再次以较低密度接种至第二培养基，例如密度为1000至5000MSC/cm2。
[0027] 优选地，所述“第二培养基”是通常用于促进活的原代细胞生长的任何经典培养基。它可以是与“第一培养基”相同的培养基，或者可以是其它培养基，例如选自：DMEM、DMEM/F12、MEM、alpha-MEM(α-MEM)、IMDM或RPMI。更优选地，所述第二培养基是DMEM(杜氏改良Eagle's培养基)或DMEM/F12(杜氏改良Eagle's培养基：营养混合物F-12)。
[0028] 甚至更优选地，所述第二培养基含有血清或血小板裂解物，例如2-20％的胎牛血清和/或1-5％血小板裂解物。最优选的第二培养基是含有2-20％胎牛血清和1-5％血小板裂解物的DMEM。还可以使用不含血清或血小板裂解物的培养基作为第二培养基，条件是其含有有利于原代活细胞生长的其它适当的试剂。
[0029] 当细胞达到40-50％汇合时，将促炎生长因子或炎症介质添加到第二培养基中，并将细胞在所述培养基中培养直至它们达到90-95％汇合。
[0030] 所述“促炎生长因子”通常是已知具有促炎作用的白细胞介素或趋化因子。可以在第二培养基中添加的白细胞介素的实例包括TNFα、IL1、IL4、IL12、IL18和IFNγ。可以在第二培养基中添加的趋化因子的实例包括CXCL8、CXCL10、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CCL2和CCL5。可以使用其它炎症介质(例如抗炎剂)。
[0031] 在优选的实施方案中，如上定义，第二培养基中加入至少两种促炎生长因子。这些至少两种促炎生长因子选自：TNFα、IL1、IL4、IL12、IL18和IFNγ。在更优选的实施方案中，所述促炎生长因子选自IL1、IL4、IL12、IL18。甚至更优选地，它们是IL1和IL4。
[0032] 可加入MSC的生长因子的典型浓度为1-200ng/mL，优选1-100ng/mL，更优选10-80ng/mL。优选地，MSC与生长因子的培养步骤持续至少一天，更优选持续两天。
[0033] 术语“IL1”在本文中表示白细胞介素1的任何同种型，特别是IL1α和IL1β。根据预期的应用，IL1同种型可以具有多种来源。例如，动物IL1可用于兽医应用。优选地，在本发明的第二培养基中仅加入IL1β。在该具体实施方案中，添加的白细胞介素1β的浓度可以在1-100ng/mL之间，优选在1-50ng/mL之间，更优选在10-40ng/mL之间。
[0034] 以登录号NP_000567.1(SEQ ID NO：6，269个氨基酸)引用人IL1β(IL1β)。重组蛋白可在GMP条件下商购获得(RnD systems，Thermofisher，Cellgenix，Peprotech)。
[0035] 术语“IL4”在本文中表示白细胞介素4的任何同种型。根据预期的应用，IL4可以具有多种来源。例如，动物IL4可用于兽医应用。
[0036] 以登录号AAA59149(SEQ ID NO：7，153个氨基酸)引用人IL4。重组蛋白可在GMP条件下商购获得(RnD systems，Thermofisher，Cellgenix，Peprotech)。
[0037] 不同促炎生长因子的任何混合物都可用于本发明的第二培养基中。特别地，优选的实施方案使用IL1和IL4的混合物，更确切地说，使用IL1β和IL4的混合物，如下面的实验部分所公开的。
[0038] 在该具体实施方案中，添加的白细胞介素1β的浓度为1-100ng/mL，优选1-50ng/mL，更优选10-40ng/mL。在第二培养基中，添加的IL4的浓度为1-100ng/mL，优选1-50ng/mL，更优选10-40ng/mL。优选地，用白细胞介素1β和IL的培养步骤持续至少一天，更优选持续两天。
[0039] 在最后的步骤中，通过任何常规手段表型表征细胞，以检测表面标记物CD73、CD90、CD105、CD166、CD45、CD34和HLA-DR的水平。这些标记物在本领域中是众所周知的。用于检测这些标记物表达水平的抗体都是可商购的。
[0040] 这些细胞表面标记物的表达特别是可以使用众所周知的技术进行评估，例如使用生物素化或其它等效技术的细胞膜染色，然后用特异性抗体进行免疫沉淀、流式细胞术、蛋白印迹、ELISA或ELISPOT、抗体微阵列或组织微阵列偶联免疫组化。其它合适的技术包括FRET或BRET，使用单个或多个激发波长并应用任何适当的光学方法的单细胞显微镜或组织化学方法，例如电化学方法(伏安法和电流测定法)、原子力显微镜和射频方法，例如多极共振光谱、共焦和非共聚的荧光检测、发光、化学发光、吸光度、反射率、透射率和双折射或折光率(例如，表面等离子体共振、椭圆光度法、共振镜法、光栅耦合器波导法或干涉法)、细胞ELISA、放射性同位素、磁共振成像、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析；HPLC-质谱；液相色谱/质谱/质谱(LC-MS/MS)。
[0041] 优选地，通过FACS评估细胞表面标记物的水平。换句话说，本发明的方法通常需要：
[0042] a)收集围产期生物组织或流体中含有的单核细胞，
[0043] b)允许所述单核细胞在第一培养基中生长，直至它们达到85-90％汇合，优选在塑料表面上，
[0044] c)当95％的细胞表达阳性标记物CD73、CD90、CD105和CD166，并且少于2％表达阴性标记物CD45、CD34和HLA-DR时，以1000至5000MSC每cm2的密度将细胞接种在第二培养基中，
[0045] d)当细胞达到40-50％汇合，加入1-100ng/mL的炎症介质或促炎生长因子，[0046] e)当细胞达到90-95％汇合时收集细胞。
[0047] 然后可以通过FACS或任何常规手段对收集的细胞进行表型表征，以检测表面标记物CD73、CD90、CD105、CD166、CD45、CD34和HLA-DR的水平。上面已经描述了所述第一和第二培养基。
[0048] 在所述方法的步骤d)中，添加的生长因子的典型浓度为1-200ng/mL，优选1-100ng/mL，更优选10-80ng/mL。优选地，用生长因子的培养步骤持续至少一天，更优选持续两天。
[0049] 在本发明的一个具体实施方案中，加入的白细胞介素1β或IL4的浓度可以在1-100ng/mL之间，优选在1-50ng/mL之间，更优选在10-40ng/mL之间。优选地，用白细胞介素1β和IL4的培养步骤持续至少一天，更优选持续两天。
[0050] 最终收集的细胞是“本发明的细胞培养物”，或“本发明的CD106高CD151+巢蛋白+MSC”或“本发明的MSC”。该细胞培养物通常包含超过60％，优选60至70％，优选超过70％，优选超过80％，更优选超过90％，甚至更优选超过95％的细胞表达CD106。此外，它包含超过98％，优选超过99％的细胞表达CD151。此外，它包含超过98％，优选超过99％的细胞表达巢蛋白，最后，它包含超过95％，优选超过96％，优选超过97％，优选超过98％的细胞表达阳性标记物CD73、CD90，CD105和CD166，包含少于2％的细胞表达阴性标记物CD45、CD34和HLA-DR。
[0051] 已知CD106(也称为“血管细胞粘附蛋白1”的VCAM-1)具有三种同种型。NP_001069.1(本文称为SEQ ID NO：1，739个氨基酸)、NP_542413.1(本文称为SEQ ID NO：2，647个氨基酸)和NP_001186763.1(本文称为SEQ ID NO：3，677个氨基酸)分别是同种型a、b和c的序列。用于检测该特定生物标记物表达水平的抗体是可商购的(例如通过Thermofisher、Abcam、OriGen等)。该标记物在本发明细胞表面的表达是非常重要的，因为它触发了对其治疗用途必不可少的促血管生成活性。
[0052] 在人类中以编号NP_006608.1引用巢蛋白生物标记物(本文称为SEQ ID NO：4，1621个氨基酸)。用于检测该特定生物标记物表达水平的抗体是可商购的(例如通过Thermofisher、Abcam等)。
[0053] 在人类中以编号NP_620599引用CD151生物标记物(本文称为SEQ ID NO 5，253个氨基酸)。用于检测该特定生物标记物表达水平的抗体是可商购的(例如通过Invitrogen、Sigma-Aldrich、Abcam等)。
[0054] 在优选的实施方案中，培养步骤(或生长步骤)在塑料表面上进行。
[0055] 更具体地，本发明的方法可以包括以下步骤：
[0056] a)任选地分别收集来自多个供体的胎盘组织；
[0057] b)任选地使用1×PBS洗涤胎盘组织三次，切成1mm3的块，并再次洗涤组织块，以从组织中除去大部分血液。
[0058] c)任选地用胶原酶分别消化每个供体的胎盘组织，离心消化的组织并收集单核细胞，
[0059] d)将收集的单核细胞接种到培养基中；
[0060] e)当细胞达到85-90％汇合时，胰蛋白酶消化并使细胞传代；
[0061] f)基于表达阳性标记物CD73、CD90、CD105和CD166以及阴性标记物CD45、CD34和HLA-DR的细胞百分比表征细胞；
[0062] g)当包含至少95％的阳性标记物和最多2％的阴性标记物时，以1000至5000MSC/cm2的接种密度，将细胞接种于含有90％杜氏改良Eagle's培养基/F12-Knockout(DMEM/F12-KO)和10％FBS和生长因子的培养基中，
[0063] h)当它们为40-50％汇合时，加入1-100ng/mL白细胞介素1β和任选1-100ng/mL IL4；
[0064] i)当它们达到90-95％汇合时，胰蛋白酶消化并收集细胞；和
[0065] j)任选地，基于表达阳性标记物CD73、CD90、CD105和CD166以及阴性标记物CD45、CD34和HLA-DR的细胞百分比表征细胞。
[0066] 下面公开的结果表明，通过本发明方法从脐带或胎盘获得的MSC表面CD106的表达大大增强。该表达对于由此产生的细胞的治疗用途非常重要(见下文)。
[0067] 因此，本申请还涉及增强未分化MSC的CD106表达水平的方法，所述方法包括在上面充分披露的特定条件下培养未分化的MSC群，所有详细的实施方案经过必要的修正后应用。
[0068] 在另一方面，本发明涉及通过上述方法获得的细胞培养物。该细胞培养物通常含有分离的CD106高CD151+巢蛋白+MSC，相较于在制备过程中没有接触任何生长因子的衍生自成人骨髓、脂肪组织、脐带或胎盘的间充质干细胞，所述分离的CD106高CD151+巢蛋白+MSC以更高的可检测水平表达血管细胞粘附分子1(VCAM-1)标记物。
[0069] 在优选的实施方案中，本发明的细胞培养物的特征在于：
[0070] (i)超过60％，优选超过70％，更优选超过80％，甚至更优选超过90％的细胞以可检测的水平表达CD106，和
[0071] (ii)超过98％，优选超过99％的细胞以可检测的水平表达CD151，和
[0072] (iii)超过90％，优选超过92％，更优选超过95％的细胞以可检测的水平表达巢蛋白，和
[0073] (iv)超过95％，优选超过96％，优选超过97％，优选超过98％的细胞以可检测的水平表达阳性标记物CD73、CD90、CD105和CD166。
[0074] 在一个更优选的实施方案中，所述细胞培养物的特征在于其含有超过98％的MSC不表达可检测水平的标记物CD11b、CD14、CD15、CD16、CD31、CD34、CD45、CD49f、CD102、CD104和CD133。这些标记物是本领域公知的，并且检测它们的抗体是可商购的。
[0075] 在优选的实施方案中，本发明的细胞培养物包含：
[0076] -超过60％，优选超过70％，更优选超过80％，甚至更优选超过90％的细胞以可检测的水平表达CD106，和
[0077] -超过98％，优选超过99％的细胞以可检测的水平表达CD151，和
[0078] -超过98％，优选超过99％的细胞以可检测的水平表达巢蛋白，和
[0079] -超过95％，优选超过96％，优选超过97％，优选超过98％的细胞以可检测的水平表达标记物CD73、CD90、CD105和CD166，和
[0080] -少于2％的细胞以可检测的水平表达标记物CD45、CD34和HLA-DR。
[0081] 根据本发明，如果所述标记物在细胞表面上以显著水平存在，即如果针对所述细胞测量的与所述表面标记物染色相关的信号(通常用识别所述标记物的抗体获得，所述抗体例如与荧光染料偶联)超过一种已知不表达所述标记物的细胞染色所对应的信号，则细胞“以可检测的水平表达标记物”。技术人员非常清楚如何识别所述细胞/标记物，因此这里不需要详述这些方案。
[0082] 在本申请的实验部分中公开的结果表明，通过本发明方法获得的细胞培养物能够在体外和体内诱导血管生成。此外，这些结果表明，将所述细胞施用至患有缺血性疾病或循环系统病症的个体(人或动物受试者)导致所述疾病或病症的一种或多种症状可检测的改善。
[0083] 下面公开的结果还表明，本发明的方法能够产生表达高水平CD106/VCAM1膜蛋白的细胞。重要的是，这种蛋白最近与促血管生成细胞因子的表达有关。因此，选择CD106+MSC用于其促血管生成的功效，并提出作为后肢缺血的治疗([16]、[17])。
[0084] 因此，在第三方面，本发明涉及所述细胞作为药物的用途，药物用于治疗患有缺血性疾病或循环系统病症的个体。换句话说，本发明涉及所述细胞用于制备药物的用途，所述药物旨在用于治疗患有缺血性疾病或循环系统病症的受试者。本发明的药物还可以应用于皮肤血管毛细血管网络，并且可以包括皮肤病学和美容应用。
[0085] 可以通过本发明的细胞治疗任何哺乳动物。所述哺乳动物可以是宠物(狗、猫、马等)或家畜动物(绵羊、山羊、牛等)。对于技术人员显而易见的是，当根据本发明的方法治疗动物时，初始未分化的MSC将从来自相同动物物种(同种异体移植物)或来自相似物种(异源移植物)的生物样品中获得，并且在第二培养基中使用的生长因子将对应于相同动物物种的生长因子。例如，如果要治疗猫，那么初始MSC将从猫的围产期组织或生物流体中获得，并且将猫IL1β(重组或非重组)，任选地与猫IL4一起，添加到第二培养基中。
[0086] 在优选的实施方案中，所述哺乳动物是人。在这种情况下，初始MSC将从女性获得的围产期组织或生物流体获得，并且人IL1β(重组或非重组，例如SEQ IDNO：6)任选地与人IL4(例如，SEQ ID NO：7)一起添加到第二培养基中。
[0087] 在该目的中，可以通过任何常规手段将本发明的细胞培养物移植或局部施用于所述受试者。在这种情况下，本发明涉及治疗患有缺血性疾病、循环系统病症、免疫疾病、器官损伤或器官功能衰竭的受试者的方法，所述方法包括将上述细胞培养物移植于所述受试者的步骤。这种移植可以通过使用植入的储库或通过在肌肉中原位注射细胞，或通过静脉内注射或通过任何适当的递送系统来进行。通过将细胞与皮肤或粘膜直接接触，或通过装置将细胞应用于皮肤或任何粘膜上，或通过任何适当的递送系统将细胞递送至皮肤或粘膜，还可以局部进行该应用。
[0088] 优选地，所述疾病或病症选自：1型糖尿病、II型糖尿病、GVHD、再生障碍性贫血、多发性硬化、杜氏肌营养不良、类风湿性关节炎、脑中风、特发性肺纤维化、扩张型心肌病、骨关节炎、肝硬化、肝衰竭、肾衰竭、外周动脉闭塞性疾病、严重肢体缺血、外周血管疾病、心力衰竭、糖尿病性溃疡、或任何退行性疾病、粘连、子宫内膜病或胃肠道纤维化病症，如肛瘘。更优选地，所述疾病或病症是外周动脉闭塞性疾病、严重肢体缺血、外周血管疾病或糖尿病性溃疡。在一个具体实施方案中，所述疾病或病症是皮肤或粘膜疾病，包括(但不限于)糖尿病性溃疡、溃疡、创伤、烧伤、烫伤、伤口或伤口愈合问题、褥疮溃疡、疣等。
[0089] 本发明的细胞培养物可以更精确地用于皮肤病学制剂，其目的是治疗皮肤病理，例如烧伤、伤口、溃疡、疤、疣或其它疾病，例如胃肠道的粘连或纤维化病症(例如肛瘘)。
[0090] 在另一个特定实施方案中，所述疾病或病症是肛瘘或子宫内膜损伤。
[0092] 为了增强本发明药物的有效性并促进施用，本发明的细胞培养物可以与任何药剂、药剂组合物或其它生物相容材料或装置混合。本发明的细胞培养物也可以包封或包含在任何合适的递送系统或生物相容性材料中。例如，细胞或含有细胞的制剂可以通过医疗装置进行应用，例如内窥镜、支架或注射器。它也可以通过使细胞与皮肤或粘膜接触而局部施用。
[0093] 本发明还针对含有本发明细胞培养物的医疗装置。“医疗装置”在本文中包括用于施用治疗组合物的任何仪器、设备、器具、机器、器械、植入物、试剂。在本发明的上下文中，例如所述医疗装置是贴片、支架、内窥镜或注射器。
[0094] 本发明还靶向含有本发明细胞培养物的递送系统。“递送系统”在本文中涵盖用于向患者施用药物产品的任何系统(介质或载体)。它可以是口服递送或控释系统。在本发明的上下文中，例如所述递送系统是脂质体、前脂质体、微球、生物聚合物的微囊泡或纳米囊泡、脂质、或纳米颗粒。
[0095] 在本发明的一个优选实施方案中，本发明的细胞包含在水凝胶或其它生物相容性材料或赋形剂中。所述水凝胶可特别包含藻酸钠水凝胶、透明质酸水凝胶、壳聚糖水凝胶、胶原水凝胶、HPMC水凝胶、聚-L-赖氨酸水凝胶、聚-L-谷氨酸水凝胶、聚乙烯醇(PVA)水凝胶、聚丙烯酸水凝胶、聚甲基丙烯酸水凝胶、聚丙烯酰胺(PAM)水凝胶和聚N丙烯酰胺(PNAM)水凝胶。
[0096] 本发明还涉及含有本发明MSC和可能的其它生物相容性材料或赋形剂的水凝胶。本文优选藻酸盐水凝胶，例如CN106538515中描述的藻酸盐水凝胶。
[0097] 在本发明的上下文中，“生物相容性材料”是生物医学应用中经常使用的那些。例如它们是金属(例如不锈钢、钴合金、钛合金)、陶瓷(氧化铝、氧化锆、磷酸钙)、聚合物(硅酮、聚(乙烯)、聚(氯乙烯)、聚氨酯、聚交酯)或天然的聚合物(海藻酸盐、胶原蛋白、明胶、弹性蛋白等)。这些材料可以是合成的或天然的。生物相容性赋形剂在本领域中是众所周知的，因此不需要详述。
[0098] 该水凝胶可用于美容或治疗目的。
[0099] 本发明还涉及含有本发明细胞培养物的药物或兽医组合物，以及其用于治疗上述疾病和病症的用途。它还涉及含有本发明细胞培养物的皮肤病学或美容组合物。
[0100] 该药物、兽医或美容组合物可进一步含有如上所述的其它生物相容性试剂(例如，水凝胶)。
[0102] 为了使本公开易于理解并付诸实践，现在将参考示例性实施方案和图示的图。附图以及下面的详细描述用于进一步说明实施方案并解释根据本公开的各种原理和优点。
[0103] 图1公开了显示如何制备本发明的CD106高CD151+巢蛋白+MSC亚群的图。
[0104] 图2显示了根据实施例1的附着于培养瓶的胎盘MSC的形态。
[0105] 图3显示了CD106高CD151+巢蛋白+MSC的脂肪形成和成骨细胞分化。结果表明CD106高CD151+巢蛋白+MSC亚群能够在适当的培养基中产生脂肪形成和成骨分化。白色箭头突出显示脂滴和强矿化区。
[0106] 图4显示了血管造影的病理检查：术后第21天获得的代表性血管造影。
[0107] 图5显示了LDPI的病理检查：术后第0天和第21天获得的代表性LDPI图像。在上图中，该区域在移植后3周仍受影响，如白色箭头所示。在下图中，黑色箭头突出显示移植后3周的灌注区域。
[0108] 图6显示了对于患有糖尿病的患者输注胎盘衍生的MSC的结果。共有15例糖尿病患者(11例男性和4例女性)被纳入该临床试验。(A)显示本组15例患者中，用围产期组织衍生高 + +的CD106 CD151 巢蛋白 MSC治疗3次后平均胰岛素需求的降低，均有统计学显著性(P<
0.001)。(B)显示围产期衍生的CD106高CD151+巢蛋白+MSC的治疗也显著改善糖尿病患者糖化血红蛋白水平(P<0.001)。这些结果表明，围产期衍生的CD106高CD151+巢蛋白+MSC可能是糖尿病患者的良好选择。
0.001)。(B)显示围产期衍生的CD106高CD151+巢蛋白+MSC的治疗也显著改善糖尿病患者糖化血红蛋白水平(P<0.001)。这些结果表明，围产期衍生的CD106高CD151+巢蛋白+MSC可能是糖尿病患者的良好选择。
[0109] 图7(A)显示在患有失代偿性肝硬化的患者中输注CD106高CD151+巢蛋白+MSC之前使用超声检查的腹水水平。并且(B)显示在施用CD106高CD151+巢蛋白+MSC一个月后使用超声检查的腹水水平。(C)显示所述患者的肝功能显著改善。CA125表达降至正常水平。此外，血清中的总蛋白、白蛋白、球蛋白也显著增加。
[0110] 图8显示动脉结扎和注射各种剂量的本发明脐带MSC、或盐水溶液或VEGF后，NOD/SCID小鼠后肢缺血模型中灌注率的评估。
具体实施方式
[0111] 实施例
[0112] 为了简化和说明的目的，通过参考本发明的示例性实施方案来描述本发明。然而，对于本领域普通技术人员显而易见的是，可以在不限于这些具体细节的情况下实施本发明。在其它实例中，没有详细描述公知的方法，以免不必要地使本发明费解。
[0113] 1.从胎盘组织获得本发明MSC的方法
[0114] 通过以下方式实现了本发明的方法：
[0115] a)分别从多个母体供体中收集人胎盘组织；
[0116] b)使用1×PBS洗涤胎盘组织三次，切成1mm3的块，并再次洗涤组织块以从组织中除去大部分血液。
[0117] c)用胶原酶分别消化每个供体的胎盘组织，离心消化的组织并收集单核细胞，[0118] d)将单核细胞接种到培养基中；
[0119] e)当细胞达到85-90％汇合时，胰蛋白酶消化并使细胞传代；
[0120] f)基于表达阳性标记物CD73、CD90、CD105和CD166以及阴性标记物CD45、CD34和HLA-DR的细胞百分比表征细胞；
[0121] g)当包含至少95％的阳性标记物和最多2％的阴性标记物时，以1000至5000MSC每cm2的接种密度，将细胞接种于含有90％杜氏改良Eagle's培养基/F12-Knockout(DMEM/F12-KO)和10％FBS和生长因子的培养基中，
[0122] h)获得CD106高CD151+巢蛋白+MSC，其包含超过80％表达CD106的细胞，对于CD151是98％，对于巢蛋白是98％，95％的细胞表达阳性标记物CD73、CD90、CD105和CD166，和小于
2％的细胞表达阴性标记物CD45、CD34和HLA-DR(用于移植)，并且当它们40-50％汇合时，添加20ng/mL的IL1β(由Peprotech提供)和20ng/mL的IL4(由Peprotech提供)；
2％的细胞表达阴性标记物CD45、CD34和HLA-DR(用于移植)，并且当它们40-50％汇合时，添加20ng/mL的IL1β(由Peprotech提供)和20ng/mL的IL4(由Peprotech提供)；
[0123] i)当细胞达到90-95％汇合时，用胰蛋白酶消化并收集细胞；
[0124] j)基于表达阳性标记物CD73、CD90、CD105和CD166以及阴性标记物CD45、CD34和HLA-DR的细胞百分比表征细胞。
[0125] 该方法能够产生胎盘衍生的MSC亚群，其产量为至少1×105个细胞/cm2MSC(在T75cm2烧瓶中，当它们90％汇合时，为5×106MSC)，其可用于同种异体施用。这些细胞培养物包含超过95％表达阳性标记物CD73、CD90、CD105和CD166的细胞，以及少于2％表达阴性标记物CD45、CD34和HLA-DR的细胞。
[0126] 人围产期组织衍生的CD106高CD151+巢蛋白+MSC是成纤维细胞样的并且在塑料瓶上生长得非常好(参见图2)。
[0127] 已经进行了三次独立实验(实验1、实验2和实验3)。当细胞40-50％汇合时，加入20ng/mL的白细胞介素1(β)和4(参见图1)。此时，MSC包含超过95％表达阳性标记物CD73、CD90、CD105和CD166的细胞，以及少于2％表达阴性标记物CD45、CD34和HLA-DR的细胞。此后，MSC实际上在约2天内保持生长直至90％细胞汇合(见下表1和2)。
[0128] 值得注意的是，加入白细胞介素1和4后，MSC细胞表面蛋白CD106、CD151和巢蛋白的表达显著增加。
[0129] 表1显示在加入白细胞介素1和4之前，胎盘实施例1、2和3中获得的胎盘组织衍生的MSC上CD11b、CD19、CD29、CD31、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105、CD106、CD151、巢蛋白和HLA-DR的表达。这些结果表明，胎盘衍生的MSC具有经典的细胞表面标记物，就像骨髓和脂肪组织衍生的MSC一样。
[0130] 表1
[0131]表面标记物 实验1 实验2 实验3
IgG-PE 0.4％ 0.9％ 0.1％
IgG-FITC 0.5％ 0.1％ 0.4％
CD11b-PE 0.2％ 1.4％ 0.3％
CD19-FITC 0.7％ 0.2％ 0.6％
CD34-FITC 0.9％ 0.1％ 0.3％
CD45-PE 0.2％ 1.1％ 0.3％
CD31-FITC 0.3％ 0.1％ 0.4％
CD73-PE 99.2％ 99.1％ 99.8％
CD90-PE 99.7％ 100％ 98.9％
CD105-FITC 96.7％ 98.1％ 98.8％
CD106-PE 31.5％ 23.2％ 30.6％
CD151-PE 95.6％ 96.1％ 93.8％
CD29-PE 99.4％ 100％ 99.9％
CD44-FITC 99.6％ 99.4％ 99.2％
巢蛋白-PE 82.5％ 78.7％ 84.1％
HLA-DR-PE 0.0％ 0.9％ 0.0％
IgG-PE 0.4％ 0.9％ 0.1％
IgG-FITC 0.5％ 0.1％ 0.4％
CD11b-PE 0.2％ 1.4％ 0.3％
CD19-FITC 0.7％ 0.2％ 0.6％
CD34-FITC 0.9％ 0.1％ 0.3％
CD45-PE 0.2％ 1.1％ 0.3％
CD31-FITC 0.3％ 0.1％ 0.4％
CD73-PE 99.2％ 99.1％ 99.8％
CD90-PE 99.7％ 100％ 98.9％
CD105-FITC 96.7％ 98.1％ 98.8％
CD106-PE 31.5％ 23.2％ 30.6％
CD151-PE 95.6％ 96.1％ 93.8％
CD29-PE 99.4％ 100％ 99.9％
CD44-FITC 99.6％ 99.4％ 99.2％
巢蛋白-PE 82.5％ 78.7％ 84.1％
HLA-DR-PE 0.0％ 0.9％ 0.0％
[0132] 表2显示在实验1、2和3中，加入白细胞介素1和4后，胎盘组织衍生的MSC上CD11b、CD19、CD29、CD31、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105、CD106、CD151、巢蛋白和HLA-DR的表达。结果表明，CD106和巢蛋白蛋白标记物在完全培养基中加入IL-1和IL-4后48小时显著增加。同高 + +时，CD106 CD151巢蛋白 细胞仍然具有经典的MSC细胞表面表型标记物。
[0133] 表2
[0134]
[0135]
[0136] 这些亚群可以分泌更多的细胞生长因子、细胞因子、免疫调节因子和炎症因子(见表3)。因此，这些CD106高CD151+巢蛋白+MSC具有更好的免疫调节和血管生成能力。
[0137] 表3显示通过q-PCR在用过的培养基中分泌的生长因子的相关表达水平。结果显示，在完全培养基中加入IL-1和IL-4后48小时，胎盘组织衍生的MSC具有更多的IL-6、IL-8、IL-10、HGF、ANG、MMP2、VEGF-A和TGF-β蛋白表达或分泌。
[0138] 表3
[0139]生长因子 IL-1和IL-4之前 IL-1和IL-4之后 T检验
IL-6 1.03±0.29 15.06±3.24 P＜0.05
IL-8 1.07±0.31 13.74±4.51 P＜0.05
IL-10 0.82±0.31 7.84±2.32 P＜0.05
HGF 0.85±0.42 4.19±1.63 P＜0.05
ANG 1.13±0.28 3.58±1.25 P＜0.05
MMP 2 0.95±0.42 3.92±1.29 P＜0.05
VEGF-A 1.18±0.24 2.83±0.76 P＜0.05
TGF-β 0.96±0.29 2.07±0.37 P＜0.05
bFGF 1.05±0.35 1.47±0.44 P＞0.05
SDF 1.13±0.27 1.92±0.66 P＞0.05
IL-6 1.03±0.29 15.06±3.24 P＜0.05
IL-8 1.07±0.31 13.74±4.51 P＜0.05
IL-10 0.82±0.31 7.84±2.32 P＜0.05
HGF 0.85±0.42 4.19±1.63 P＜0.05
ANG 1.13±0.28 3.58±1.25 P＜0.05
MMP 2 0.95±0.42 3.92±1.29 P＜0.05
VEGF-A 1.18±0.24 2.83±0.76 P＜0.05
TGF-β 0.96±0.29 2.07±0.37 P＜0.05
bFGF 1.05±0.35 1.47±0.44 P＞0.05
SDF 1.13±0.27 1.92±0.66 P＞0.05
[0140] 2.从脐带组织获得本发明MSC的方法
[0141] 以下试剂已用于本实施例中：
[0142]
[0143]
[0144] 2.1通过外植体方法分离细胞
[0145] 从运输溶液中取出脐带并切成2-3cm长的切片。为了避免粘附血细胞的污染，含有不能除去的血凝块的各脐带段将被丢弃。然后在室温(RT)下将切片在抗菌剂和抗真菌剂浴中消毒30分钟，所述抗菌剂和抗真菌剂浴由αMEM+1g/L万古霉素+1g/L阿莫西林+500mg/L阿米卡星+50mg/L两性霉素B组成。将抗菌剂临时溶解在无菌注射用水中。
[0146] 从浴中取出脐带切片，并在室温下在1×PBS中快速冲洗。上皮膜进行轻轻切割，而不接触血管。然后将每个切片细致切为0.5cm厚的切片，并将其放置在带盖的150cm2塑料烧瓶的底部。每个烧瓶放置6至10个切片，每个切片周围具有至少1cm半径的环自由空间，并且在室温下无需培养基使其贴壁15分钟。
[0147] 贴壁后，小心加入完全培养基(αMEM+5％CPL+2U/mL肝素)，以使外植体贴壁在烧瓶底部。然后将烧瓶在37℃，90％湿度和5％CO2下孵育。
[0148] 5至7天后更换培养基。
[0150] 从该步骤开始，每隔一天目测检查细胞的汇合，并且如果需要，在第17天进行培养基更换。
[0151] 当细胞达到70-90％汇合或在第20天时，除去培养基，并用每烧瓶30mL的1×PBS洗涤细胞。然后用 除去细胞并用旧培养基收集细胞，并以2500rpm离心10分钟。弃去上清液，然后将细胞悬浮在由αMEM+100mg/mL HSA+10％DMSO组成的冷冻保存溶液中并冷冻保存。
[0152] 2.2通过酶法分离细胞
[0153] 从运输溶液中取出脐带并切成2-3cm长的切片。为了避免粘附血细胞的污染，含有不能除去的血凝块的各脐带段将被丢弃。然后在室温(RT)下将切片在抗菌剂和抗真菌剂浴中消毒30分钟，所述抗菌剂和抗真菌剂浴由αMEM+1g/L万古霉素+1g/L阿莫西林+500mg/L阿米卡星+50mg/L两性霉素B组成。将抗菌剂临时溶解在无菌注射用水中。
[0154] 然后将脐带切成小块并浸入含有2.7mg/mL I型胶原酶和0.7mg/mL透明质酸酶的酶混合物中，在37℃温和搅拌下孵育3小时，然后加入2.5％胰蛋白酶并进一步孵育30分钟。
[0155] 将消化的悬浮液用培养基按1：2稀释，以降低悬浮液的粘度，并通过尼龙网以获得单一悬浮液。将细胞以300×g离心20分钟，并以10,000细胞/cm2用新鲜培养基接种。
[0156] 在5至7天后更换培养基，之后每7天更换一次。
[0157] 当细胞达到70-90％汇合或在第20天时，除去培养基，并用每烧瓶30mL的1×PBS洗涤细胞。然后用 移除细胞并用旧培养基收集细胞，并以2500rpm离心10分钟。弃去上清液，然后将细胞悬浮在由αMEM+100mg/mL HSA+10％DMSO组成的冷冻保存溶液中并冷冻保存。
[0158] 2.3细胞解冻和培养
[0159] 按照经典方案解冻细胞。简而言之，从液氮中取出冷冻管并快速投入37℃水浴中。一旦管中没有冰存在，将细胞在预热的(37℃)完全培养基(αMEM+0.5％(v/v)环丙沙星+2U/mL肝素+5％(v/v)LP)中稀释并快速离心(300g，室温，5分钟)。
[0160] 离心后，将细胞悬浮在预热的完全培养基中，并评估其数量和活力(台盼蓝/Mallassez血细胞计数器)。
[0161] 将细胞接种于两个75cm2塑料培养瓶的完全培养基中进行孵育(90％湿度，5％CO2，37℃)。
[0162] 2.4细胞刺激
[0163] 在扩增几天后，检查细胞的汇合。当汇合达到30％至50％时，丢弃旧培养基并用新鲜的完全培养基代替未刺激的条件，或者用补充有(completed)10ng/mL的IL-1β和10ng/mL的IL 4的新鲜培养基。
[0164] 然后在流式细胞实验至少2天之前孵育细胞。
[0165] 2.5收获细胞和流式细胞术分析
[0166] 在扩增/刺激2至3天后，检查细胞的汇合。如果汇合高达80％，则收获细胞。简而言之，丢弃旧培养基，并用1×DPBS洗涤细胞。加入胰蛋白酶EDTA并将细胞在37℃孵育5分钟。用至少2×体积的培养基中和胰蛋白酶，收获细胞悬浮液，并评估其数量和活力。
[0167] 流式细胞实验需要1×106个细胞，将其离心并重悬于1×DPBS+0.4％HSA中。
[0168] 根据以下方案，针对CD73、CD90、CD105、CD106、CD151和CD31、CD34、CD45、HLA-DR对细胞进行标记：
[0169] 1.评估细胞的活力和数量。
[0170] 2.将获得20000个细胞/标记管所需体积的悬浮液置于15mL丙烯塑料管中。
[0171] 3.将管在300g和4℃下离心5分钟。
[0172] 4.将细胞用1×DPBS+0.4％HSA(在1×DPBS中按10×稀释4mg/mL HSA)重悬浮。每个标记管所需的体积为500μL。
[0173] 根据FACS制造商和抗体提供者的推荐，对CD106和CD151标记物进行细胞外染色。对巢蛋白进行细胞内染色。对于细胞内染色，使用称为“BDCytofix/Cytoperm试剂盒”的固定/透化溶液。
[0174] 如果在染色后不立即分析细胞，则通过使细胞与1×DPBS 0.5％甲醛溶液接触进行固定步骤。
[0175] 标记后，用1×DPBS+0.4％HSA洗涤细胞，并透化以进行巢蛋白标记。
[0177] 2.6结果
[0178] 在上述第2.4点中披露的条件下，通过培养上文公开的外植体方法(2.1)分离的脐带MSC，已经获得了几批脐带衍生的MSC(HB-COR001至COR005-MSC)。对于脐带3和5(COR003和COR005)，通过以单独的方式重复本发明的步骤，同时获得了两个MSC群(MSC1和MSC2)。
[0179] 通过流式细胞术测量所述细胞表面的CD106表达。
[0180] 所有测试的MSC批次在CD106表达水平中显示出显著增加(>60％)(参见表4)。
[0181] 表4：用IL1β和IL4刺激后脐带衍生的MSC的CD106表达
[0182]
[0183] 3.分离方案对脐带衍生的MSC的CD106表达的影响
[0184] 使用上面披露的两种不同方法从脐带中分离出间充质干细胞(见2.1和2.2)：通过外植体分离和酶消化。
[0185] 所有细胞在相同的培养基中培养(αMEM+5％血小板裂解物(LP))，根据本发明的方法在第3代刺激，并在刺激后2天收集。测量细胞活力并计数细胞。
[0186] 然后通过流式细胞术测量几种表型标记物的表达，包括CD106。
[0187] 无论分离方法或刺激条件如何，所有MSC均以经典方式表达表型标记物：CD73、CD90、CD105阳性率超过95％，而CD31、CD34、CD45和HLA-DR均为阴性。
[0188] CD151+和巢蛋白也均超过95％阳性，与刺激或分离方法无关。
[0189] 在没有刺激的情况下，相较于外植体方法分离的MSC(20％)，通过酶消化分离的MSC在刺激前表达高水平的CD106(53％)。然而，它们对炎性混合物的刺激不太敏感：已观察到CD106的增加较小(增加+4％相对于增加+60％)。
[0190] 因此，外植体方法是本发明用于脐带衍生的MSC的优选方法。
[0191] 表5：在2.1和2.2中披露的两个实验方案后获得的MSC的活力和细胞计数。
[0192]
[0193] 表6：在2.1和2.2中披露的两个实验条件获得的脐带衍生的MSC的分子标记物。
[0194]
[0195] 4.相对于IL1或IL4单独刺激，IL1-IL4组合刺激对脐带间充质干细胞CD106水平的影响
[0196] 通过外植体分离从两个脐带分离间充质干细胞(见2.1)。
[0197] 所有细胞在相同的培养基中培养(αMEM+5％血小板裂解物(LP))，根据本发明的方法，使用10ng/mL的IL-1b和10ng/mL的IL-4的混合物、或各白细胞介素分别(各10ng/mL)，在第4代进行刺激，并在刺激后2天收集。测量细胞活力并计数细胞。
[0198] 然后通过流式细胞术测量几种表型标记物的表达，包括CD106。
[0199] 无论刺激条件如何，所有MSC均以经典方式表达表型标记物：CD73、CD90、CD105阳性率超过95％，而CD31、CD34、CD45和HLA-DR均为阴性。CD151+也超过95％阳性，与刺激无关。
[0200] 关于CD106标记物，相较于用单一白细胞介素刺激所观察到的表达增加，用IL1和IL4的组合刺激观察到的表达增加高3至5倍(参见表7)。
[0201] 表7：用IL1-IL4的组合或单一IL刺激MSC后获得的CD106表达水平。
[0202]
[0203] 5.胎盘衍生的CD106高CD151+巢蛋白+MSC在糖尿病大鼠中的血管新生作用[0204] 该实施例关注胎盘衍生的CD106高CD151+巢蛋白+MSC的治疗性血管新生作用。这为它们作为基于细胞的疗法和胰岛素注射联合用于治疗糖尿病严重后肢缺血的临床应用能力，提供了见解。我们的结果显示，胎盘衍生的CD106高CD151+巢蛋白+MSC参与血管生成和治疗性血管新生，以通过直接分化成血管细胞来改善缺血和恢复血流灌注。此外，胎盘衍生的CD106高CD151+巢蛋白+MSC改善了糖尿病大鼠的缺血损伤和功能恢复。
[0205] 6周龄的免疫缺陷雄性裸鼠购自Vital River Laboratories(Charles River Laboratories的中国供应商)。在过夜禁食后，通过单次腹膜内注射链脲佐菌素(在柠檬酸盐缓冲溶液中70mg/kg，仅在注射前立即制备)诱导糖尿病。每周测量空腹血糖水平，血糖在11mM和15mM之间的大鼠被认为是糖尿病。接受腹膜内柠檬酸盐缓冲液注射的年龄和体重匹配的裸鼠用作非糖尿病对照(血糖在5.5和8mM之间)。
[0206] 两周后，将糖尿病裸鼠麻醉(腹膜内注射60mg/kg戊巴比妥)，并用3-0丝进行结扎来闭塞左股动脉。隐静脉和腘动脉的分叉处近端0.5cm处进行结扎。使用Lipiodol(1.5ml/kg)在血管内诱导栓塞。将假结扎应用于左股动脉，左后肢保持非缺血。
[0207] 建立缺血模型后，手术肢缺陷明显，因为肢体不再支撑任何重量，爪子肿胀发红。随着时间的推移，所有组的缺血性损伤均有不同程度的改善。CD106高CD151+巢蛋白+MSC亚群中肢体功能的恢复显著提高(图4)。
[0208] 更确切地说，图4的组织学数据显示，与PBS组相比，细胞移植组的毛细血管密度增高 + +加。此外，与PBS组相比，在糖尿病大鼠和非糖尿病大鼠的CD106 CD151巢蛋白 MSC亚群细胞移植组中观察到更多的毛细血管数。
[0209] 图5显示使用血管形成LDPI的缺血诱导的变化的功能证据。该图像显示在手术日左侧后肢的血流完全被阻塞；这由深颜色表示。三周后，在所有组中血流灌注恢复到一定程度，但在PBS组中没有恢复正常，其中缺血/非缺血灌注比仅达到52％。细胞移植组的灌注恢复显著更高。在现有技术的P-MSC组中比率为81％(与PBS组相比P<0.05)，对于CD106高CD151+巢蛋白+MSC亚群组，比率为86％(与PBS组相比P<0.01)。
[0210] 两种MSC亚群中的灌注恢复显著更高。因此，结果显示MSC改善血流灌注并且本发明的MSC在这样做时更有效。事实上，本发明的MSC在糖尿病和非糖尿病大鼠中显示出血流恢复的显著改善。
[0211] 结果显示，本发明的MSC比现有技术的MSC更有效地改善血流灌注。该实施例表明，施用本发明的MSC是糖尿病性严重肢体缺血的有希望的新方法。
[0212] 6.本发明的胎盘衍生的CD106高CD151+巢蛋白+MSC对糖尿病患者的治疗效果[0213] 该实施例关注本发明的胎盘衍生的CD106高CD151+巢蛋白+MSC对患有糖尿病的患者的治疗效果。这为它们作为基于细胞的治疗糖尿病的临床应用的能力提供了的见解。
[0214] 该临床试验共纳入15例糖尿病患者(11例男性和4例女性)。
[0215] 纳入标准是2013年11月至2014年11月在天津总医院诊断出的2型糖尿病患者。患者年龄在30至85岁之间，糖尿病病程≥3年，需要胰岛素进行最佳血糖控制，剂量≥0.7U/kg/天持续至少1.5年，胰岛素功能障碍，以胰岛素为基础的治疗对血糖波动控制不佳，并愿意参与研究。这15例患者年龄在42至67岁之间，中位年龄为59岁；糖尿病病程为3年至17年，中位数为8年；每日胰岛素需求量从38个单位到90个单位，其中平均58.7个单位。每三个月同时检查糖耐量试验、胰岛素释放试验、C肽刺激试验和糖化血红蛋白的测定。进行心脏、肝脏和肾脏功能测试。治疗期间观察到不良事件和副作用。如果治疗后每日胰岛素需要量减少≥50％并且持续超过3个月，则被认为是有效的。
[0216] 患者接受三次本发明胎盘衍生的MSC(P-MSC)的静脉输注，输注间隔一个月。每位6 6
患者施用的P-MSC总数为(1.0-1.5)×10/kg，平均为1.25×10/kg。同时，患者继续使用胰岛素，并根据血糖水平调整胰岛素剂量。对于并发症，维持原始的一般治疗。所有患者在治疗后随访至少6个月。
患者施用的P-MSC总数为(1.0-1.5)×10/kg，平均为1.25×10/kg。同时，患者继续使用胰岛素，并根据血糖水平调整胰岛素剂量。对于并发症，维持原始的一般治疗。所有患者在治疗后随访至少6个月。
[0217] 该临床试验表明，在该组15例患者中施用3次本发明的胎盘衍生的MSC后平均胰岛素需求减少，这是统计学上显著的(P<0.001)。在施用本发明的胎盘衍生的MSC后，糖尿病患者的胰岛素注射剂量几乎减少一半(与MSC施用前6个月期间的平均胰岛素剂量相比)(图6A)。
[0218] 该临床试验表明，用本发明的胎盘衍生的MSC进行治疗显著降低了糖尿病患者的糖化血红蛋白水平(P<0.001)(图6B)。
[0219] 这些数据支持本发明的MSC可用于治疗糖尿病患者。
[0220] 7.本发明的胎盘衍生的MSC对再生障碍性贫血患者的治疗效果
[0221] 该实施例关注本发明的胎盘衍生的MSC对再生障碍性贫血患者的治疗效果，并提供了它们作为再生障碍性贫血的基于细胞的疗法的临床应用能力的见解。
[0222] 再生障碍性贫血主要被认为是免疫介导的骨髓(BM)衰竭综合征，其特征在于发育不全和全血细胞减少伴脂肪BM和血管生成减少。先前的研究表明，获得性再生障碍性贫血表现为HSC/HPC和造血微环境异常。大量证据表明，再生障碍性贫血可能是以干/祖细胞病症为特征的综合征，包括HSC/HPC和MSC。MSC支持造血功能并调节几乎整体免疫细胞功能，以维持造血和免疫稳态。MSC可以调节主要免疫细胞的功能，包括T细胞、B细胞、单核细胞、DC、NKT和中性粒细胞[5]。MSC对Th1、Th17和CTL具有显著的免疫抑制特性。MSC抑制T细胞增殖、Th1细胞的IFN-γ和TNF-α分泌，同时促进Th2细胞产生IL-10和Treg细胞的扩增。然而，最近的研究表明，再生障碍性贫血患者的MSC增殖不良，MLR、PHA诱导的T细胞活化和IFN-γ释放的免疫抑制不足[6、7]。我们最近的研究表明，来自再生障碍性贫血患者的MSC在抑制CD4+T细胞增殖和克隆形成能力以及促进Treg细胞扩增方面降低。还发现MSC在抑制CD4+细胞产生TNF-α和IFN-γ方面存在缺陷。然而，在调节IL-4、IL-10和IL-17的产生方面没有显著差异[8]。此外，我们的研究还表明，与健康对照的BM-MSC相比，再生障碍性贫血患者的MSC表现出异常形态、增殖和克隆形成能力下降、细胞凋亡增加。来自再生障碍性贫血患者的MSC易于被诱导分化成脂肪细胞，但更难以分化成成骨细胞。与异常的生物学特征一致，大量涉及细胞周期、细胞分裂、增殖、趋化性和造血细胞谱系的基因在这些再生障碍性贫血患者的MSC中表达显著降低。相反，更多与细胞凋亡、脂肪生成和免疫应答有关的基因在再生障碍性贫血患者的MSC中显示出表达增加。MSC的基因表达谱进一步证实了异常的生物学特性，为再生障碍性贫血中BM微环境破坏的可能机制提供了重要证据[9]。
[0223] 由于以下两个重要事实，MSC是治疗再生障碍性贫血的有希望的治疗候选：
[0224] i)MSC普遍(in general)的造血支持和有效的免疫抑制能力，和
[0225] ii)源自再生障碍性贫血患者的MSC中观察到的生物学特征差异和功能缺陷。
[0226] 在一项临床试验中，一例患有间歇性发热持续一个月以上的6岁女孩接受了MSC治疗。在两次骨髓活检后显示低细胞性，证实为再生障碍性贫血。环孢菌素和康力龙治疗近6个月后外周血表型无明显改善。造血干细胞移植不是一个好选择，因为很难找到匹配的供体。因此，通过静脉内输注向患者施用1×107本发明的胎盘衍生的MSC。第一次MSC移植后外周血表型改善显著。然而，患者仍然依赖血液制品输血，包括红细胞和血小板输注。6个月7
后，患者第二次接受1×10静脉内注射本发明的MSC。外周血表型改善显著，并在第二次注射后12个月达到几乎正常水平。此外，患者在第二次注射后12个月完全不依赖血液制品输血(表8)。这些数据支持本发明的胎盘衍生的MSC可用于再生障碍性贫血患者的临床治疗。
后，患者第二次接受1×10静脉内注射本发明的MSC。外周血表型改善显著，并在第二次注射后12个月达到几乎正常水平。此外，患者在第二次注射后12个月完全不依赖血液制品输血(表8)。这些数据支持本发明的胎盘衍生的MSC可用于再生障碍性贫血患者的临床治疗。
[0227] 表8 胎盘衍生的MSC治疗期间外周血的表型。
[0228]
[0229] 8.本发明的胎盘衍生的MSC对患有肝病的患者的治疗效果
[0230] 该实施例关注根据本发明的方法(即，用IL1和IL4治疗)获得的胎盘衍生的MSC对患有肝病的患者施用的治疗效果。这为它们作为基于细胞的疗法用于肝病的临床应用的能力提供了见解。
[0231] 在这项临床试验中，一例40岁的男子被证实患有超过十年的酒精性肝炎。尽管他接受了常规治疗，两年前患者确诊为失代偿性肝硬化。因为对失代偿性肝硬化的治疗没有好的选择，患者自愿接受静脉注射4×107本发明的MSC。
[0232] 在该临床试验中，超声检查结果显示在施用MSC之前腹水水平为9.7cm(参见图7A)。然而，MSC施用后一个月腹水水平降至3.6cm(图7B)。此外，结果表明MSC施用后失代偿性肝硬化患者的肝功能改善显著。此外，根据临床参考文献，血清中CA125的表达降至正常水平。
[0233] 这些结果证明，用本发明的MSC治疗的失代偿性肝硬化患者的优异临床反应。
[0234] 此外，根据临床参考文献，血清中的总蛋白、白蛋白、球蛋白也显著增加，达到正常水平(图7C)。这些结果表明，静脉注射MSC后一个月患者的肝脏合成和代谢功能得到改善。
[0235] 因此，本发明的胎盘衍生的MSC是肝病非常好的细胞治疗选择。
[0236] 9.从脐带获得的本发明细胞的血管生成能力
[0237] 已经在后肢缺血鼠模型中进一步测试了本发明MSC的促血管生成能力。
[0238] 材料和方法
[0239] 用氯胺酮(ketamin)和甲苯噻嗪(xylazine)的混合物麻醉12只8周龄的NOD/SCID小鼠(Laboratoire Janvier)。然后结扎左腿股动脉的左近端和远端部分(6.0丝缝线，Ethicon，Issy-Les-Moulineaux，法国)，并切除结扎之间的部分。手术后显示超过80％缺血的小鼠，在缺血肢体的腓肠肌中肌肉内注射2个剂量的根据上述2.4中公开方案获得的本发明MSC(第2组每只动物0.5×106个细胞，第3组中每只动物0.05 106个细胞)。在对照组1中使用盐水溶液注射。在对照组4中还注射20ng/mL剂量的VEGF/小鼠。
[0240] 根据细胞的预期临床应用制定注射方案以及剂量，动物的施用剂量是人类I/II期临床试验的提议剂量的>10倍(人中约25×106细胞/kg，这意味着约0.5×106个细胞/小鼠(平均小鼠体重＝20克))。
[0241] 使用扫描仪-激光多普勒(Laser Doppler Perfusion系统，Perimed PeriScan PIM III)测量后肢血流量。在缺血之前和之后确定缺血性和非缺血性肢体的平均灌注，并且缺血后每7天一次直至第21天。使用不同颜色的像素对激光频率的血流依赖性变化进行成像。通过使用血液灌注分析软件(LPDIwin)分析图像以量化血流量。灌注百分比表示为缺血性相对于非缺血性后肢的比率。
[0242] 后肢肌肉切片的苏木精-伊红染色
[0243] 在实验结束时对小鼠实施安乐死(D21)。解剖后肢腓肠肌并染色以显现肌纤维中细胞核的分布。将从缺血性后肢分离的肌肉固定在石蜡中并用苏木精/伊红染色。
[0244] 结果
[0245] 图8显示了用不同注射剂治疗的小鼠后肢缺血后的平均再灌注率：NaCl 0.9％(阴性对照-n＝8)、VEGF 20ng/ml(阳性对照-n＝6)、50 103MS细胞(n＝9)和500 103MS细胞(n＝7)。
[0246] 这些结果表明，与单独施用VEGF的载体(NaCl)相比，在结扎股动脉后在小鼠中施用高剂量的本发明MSC导致更高的灌注率。早在细胞注射后7天，对于接受最高剂量细胞(0.5×106个细胞)的小鼠，观察到100％的灌注率。与其它组有统计学上的显著差异。
[0247] 此外，剂量反应效应可能是因为在该初步实验中，最高剂量的细胞(0.5×106个细胞)似乎实现比10倍低剂量更好的灌注率。
[0248] 这些结果证实了本发明的MSC在该CLI小鼠模型中改善血液灌注的实际血管生成效力。
[0249] 在苏木精-伊红染色中观察到的结果(数据未显示)：
[0250] 在正常的非缺血性肌肉中，细胞核分布在肌纤维的外周。
[0251] 在缺血诱导后21天，来自第1组(NaCl 0.9％)和第4组(VEGF 20ng/mL)的小鼠的缺血性肌肉中，细胞在肌纤维的外周表现出非常少的细胞核，因为它们仍在再生。
[0252] 在缺血诱导后21天，在第3组小鼠的缺血性肌肉中(0.05 106的MSC细胞或50k)，50％的肌纤维再生，并在纤维的外周表现出细胞核。再生比第1组和第4组发生得更快。
[0253] 缺血诱导后21天，在第2组小鼠的缺血性肌肉(0.5×106MSC细胞或500k)中，100％的肌纤维再生，并在纤维的外周表现出细胞核。肌肉的染色图谱与正常的非缺血性肌肉相同。在该实验中，500k细胞剂量允许肌肉的完全再生。
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