专利汇可以提供将人羊膜间充质细胞诱导分化成骨或软骨细胞的方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 涉及了一种将人羊膜间充质细胞诱导分 化成 骨或软骨细胞的方法,它包括:从胎盘中分离出人羊膜组织;清洗上述人羊膜组织;消化清洗后的人羊膜组织;将上述人羊膜组织分离成单个人羊膜间充质细胞;将人羊膜间充质细胞扩增到所需的数目后,将上述人羊膜间充质细胞悬液中加入到含有5%FBS、10ng/mlTGF-β1、10ng/mlIGF、0.1μM地塞米松和50ng/ml 抗坏血酸 的高糖DMEM培养基进行诱导培养,每隔24小时更换上述培养基一次,诱导21天后,得到骨或软骨细胞;利用上述方法得到的骨或软骨细胞可以用于修复人体内的骨或软骨组织以 治疗 骨缺损。,下面是将人羊膜间充质细胞诱导分化成骨或软骨细胞的方法专利的具体信息内容。
1.一种将人羊膜间充质细胞诱导分化成骨或软骨细胞的方法,它包括:
(1)在无菌条件下,从健康胎盘组织中分离出人羊膜组织,放入生理盐水中浸泡;
(2)清洗上述人羊膜组织;
(3)消化清洗后的人羊膜组织;
(4)将上述人羊膜组织分离成单个人羊膜间充质细胞;
(5)将人羊膜间充质细胞扩增到所需的数目后,加入DMEM/F12得到含有人羊膜间充质
6 6
细胞的悬浊液,使人羊膜间充质细胞的个数为1×10 个/ml-2×10 个/ml;
其特征在于:
(6)将上述人羊膜间充质细胞悬液用含有20%FBS的α-MEM的培养基调整到人羊膜
5
间充质细胞的个数为1×10 个/ml,然后将其接种到24孔板中,待8-12小时细胞贴壁后,加入含有诱导液的高糖DMEM培养基进行诱导培养,诱导液含有:5%FBS、10ng/mlTGF-β1、
10ng/mlIGF、0.1μM地塞米松和50ng/ml抗坏血酸,每隔24小时更换上述培养基一次,诱导21天后,得到骨或软骨细胞,然后种植到24孔板中,贴壁后可用于甲苯胺蓝染色鉴定或胶原免疫组化检测;
(7)取出一部分从步骤(6)中得到的细胞进行甲苯胺蓝染色鉴定或胶原免疫组化检测,检测得到的细胞是否为骨或软骨细胞。
2.如权利要求1所述的将人羊膜间充质细胞诱导分化成骨或软骨细胞的方法,其特征在于:所述的步骤(1)是从正常足月剖腹产胎儿的胎盘的脐带面,钝性分离出的人羊膜组织。
3.如权利要求2所述的将人羊膜间充质细胞诱导分化成骨或软骨细胞的方法,其特征在于:所述的步骤(2)为倒掉步骤(1)的生理盐水,用温度为4℃的含有100IU/ml青霉素和100ug/ml链霉素混合液的生理盐水对上述人羊膜组织进行清洗,直至人羊膜组织无任何杂质和血渍后,在温度为20~25℃的无菌间,用含100IU/ml青霉素和100ug/ml链霉素的D-hank’s冲洗上述人羊膜组织3-5遍后,放置在含100IU/ml青霉素和100ug/ml链霉素D-hank’s液中浸泡2小时;2小时后用不含抗生素的D-hank’s液清洗3-5遍。
4.如权利要求3所述的将人羊膜间充质细胞诱导分化成骨或软骨细胞的方法,其特征在于:所述的步骤(3)是将清洗后的人羊膜组织加入等体积的0.25%胰蛋白酶的消化液,放入37℃水浴锅中消化,分两次共消化45分钟,倒掉上述消化液,加入3ml的含10%FBS的DMEM/F12液终止消化,将消化后的羊膜组织用D-hank’s液消洗直至清洗液澄清为止。
5.如权利要求4所述的将人羊膜间充质细胞诱导分化成骨或软骨细胞的方法,其特征在于:所述分两次共消化45分钟是将清洗后的人羊膜组织加入等体积的0.25%胰蛋白酶消化液,放入37℃水浴锅中消化15分钟后,倒掉上述消化液,然后再加入等体积的新
0.25%胰蛋白酶消化液,放入37℃水浴锅中消化30分钟后,倒掉上述消化液,在消化时每隔5分钟晃动一次,使人羊膜组织被充分地消化。
6.如权利要求5所述的将人羊膜间充质细胞诱导分化成骨或软骨细胞的方法,其特征在于:所述的步骤(4)中的将上述人羊膜组织分离出单个人羊膜间充质细胞是采取以下步骤:
(I)将消化后的人羊膜组织用剪刀剪成浆状后放入烧杯中,加入等体积的0.2%胶原蛋白酶V,然后放入温度为37℃的水浴锅中消化20~30分钟;
(II)将消化后的羊膜浆状液分别用60目细胞筛和200目细胞筛进行过滤,得到间充质细胞悬浊液;
(III)用无血清DMEM/F12按1∶1的比例稀释上述过滤后细胞悬浊液,然后在室温下将其放入离心机内以2500r/min转速离心10分钟,10分钟后将上述溶液中的上清液倒掉,然后再加入DMEM/F12,用吸管将细胞吹打均匀后,再将其放入离心机内以1500r/min转速离心5分钟,5分钟后将上述溶液中的上清液倒掉,再加入10%FBS和DMEM/F12培养液后,
6 6
用吸管将细胞吹打均匀后,使人羊膜间充质细胞个数为1×10 个/ml-2×10 个/ml。
7.如权利要求6所述的将人羊膜间充质细胞诱导分化成骨或软骨细胞的方法,其特征在于:所述的步骤(5)是将步骤(4)得到人羊膜间充质细胞和含10%FBS的DMEM/F12培养液放置在培养瓶中,培养瓶在温度为36.5-37.5℃、饱和湿度、体积分数为4.5%的CO2培养箱中培养,每2-3天更换全部培养液,培养5-7天,观察培养瓶中人羊膜间充质细胞融合达到85%以上时,去掉培养液,用D-hank’s液清洗两遍后,再加2ml 0.25%的胰蛋白酶消化液进行消化,在消化过程中,用显微镜下观察细胞的消化情况,当70%的细胞变化成圆形时,立即加入2ml含10%FBS的DMEM/F12培养液终止消化,然后用力吹打培养瓶的壁,将贴壁的细胞吹打下来;将回收的间充质细胞放入离心机内以1500r/min转速每次离心5分
6
钟,共计两次,然后倒掉上清液,并计算细胞的个数;将上述回收的间充质细胞1×10 个/
6
ml-2×10 个/ml的密度重复上述操作进行传代接种培养,直至达到所需细胞数量。
8.如权利要求7所述的将人羊膜间充质细胞诱导分化成骨或软骨细胞的方法,其特征在于:所述的步骤(7)中的甲苯胺蓝染色鉴定是采用以下步骤:取一个生长接近融合状态的诱导后人羊膜间充质细胞的24孔板,用PBS液漂洗24孔板,在24孔板中加入1%的甲苯胺蓝染色24小时后,用蒸馏水将未染色部分的颜色冲掉,用中性树脂封住孔板后,在显微镜下进行观察,若发现诱导后的人羊膜间充质细胞呈现均一异染,说明诱导后的人羊膜间充质细胞分化为骨或软骨细胞,否则,说明诱导后的人羊膜间充质细胞未分化成骨或软骨细胞。
9.如权利要求7所述的将人羊膜间充质细胞诱导分化成骨或软骨细胞的方法,其特征在于:所述的步骤(7)中的胶原免疫组化检测是采用以下步骤:取两个生长接近融合状态的诱导后人羊膜间充质细胞的24孔板,分别加入I型或II型胶原抗体,在温度为4℃下放置8-12小时后,再分别加入生物素化二抗和DAB显色,用苏木精衬染后,用流水冲洗使之蓝化,在显微镜下进行观察,若发现诱导后的人羊膜间充质细胞和I型或II胶原免疫细胞的染色呈现阳性,说明诱导后的人羊膜间充质细胞分化为软骨或骨细胞,否则,说明诱导后的人羊膜间充质细胞未分化成软骨或骨细胞。
标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
---|---|---|
一种hAECs-DED组织工程皮肤增殖分化活力的检测方法 | 2020-05-21 | 634 |
一种角膜损伤无瘢痕修复装置的制造方法和储存方法 | 2020-05-15 | 465 |
一种简单高效的干细胞贴片制备方法 | 2020-05-22 | 504 |
自体骨髓间充质干细胞人羊膜角膜贴片的制备及应用 | 2020-05-15 | 369 |
一种构建组织工程角膜内皮的方法 | 2020-05-23 | 725 |
制备隐形眼镜状的羊膜敷料的方法 | 2020-05-12 | 944 |
一种羊膜囊刺穿手术器械 | 2020-05-14 | 720 |
用于组织表面的羊膜覆盖物与利于膜固定的装置 | 2020-05-20 | 656 |
干燥活性羊膜的制备方法 | 2020-05-14 | 687 |
干燥活性羊膜的制备方法 | 2020-05-13 | 881 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台,是提供专利分析,专利查询,专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据,免费查、免费专利分析。
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析,涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度,系统通过AI智能系统对图表进行解读,只需1分钟,一键生成行业专利分析报告。