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人CD34阴性祖细胞保护血管内皮细胞层避免免疫介导的细胞毒性反应

阅读：110发布：2020-07-14

专利汇可以提供人CD34阴性祖细胞保护血管内皮细胞层避免免疫介导的细胞毒性反应专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供了CD34阴性祖细胞，用于保护处在血管炎症疾病风险或患有血管炎症疾病的受试者的血管内皮细胞避免免疫介导的细胞毒性反应。也提供了人CD34阴性祖细胞的制造方法，和测定CD34阴性祖细胞保护血管内皮细胞避免免疫介导的细胞毒性反应的能力的方法。，下面是人CD34阴性祖细胞保护血管内皮细胞层避免免疫介导的细胞毒性反应专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种用于保护处在血管炎性疾病风险或患有血管炎性疾病的受试者的血管内皮细胞层避免免疫介导的细胞毒性反应的用途的人CD34阴性祖细胞。
2.根据权利要求1所述的用于所述用途的人CD34阴性祖细胞，其中所述血管炎性疾病包括CD8+细胞毒性T淋巴细胞造成的血管内皮细胞层特异性细胞裂解。
3.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的人CD34阴性祖细胞，其中所述CD8+细胞毒性T淋巴细胞包括CD27阴性和CD28阴性的内皮细胞层特异性细胞毒性T淋巴细胞。
4.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的人CD34阴性祖细胞，其中血管炎性疾病包括针对相对于受试者是同种异体的实体器官移植的血管内皮细胞层的同种异体反应。
5.根据权利要求1～3中任一项所述的用于所述用途的人CD34阴性祖细胞，其中所述血管炎性疾病包括同种异体造血干细胞移植之后移植相关的并发症。
6.根据前述权利要求所述的用于所述用途的人CD34阴性祖细胞，其中所述移植相关的并发症包括移植物抗宿主病(GvHD)。
7.根据权利要求5所述的用于所述用途的人CD34阴性祖细胞，其中所述移植相关的并发症包括微血管疾病。
8.根据权利要求1～3中任一项所述的用于所述用途的人CD34阴性祖细胞，其中所述血管炎性疾病包括由于自体免疫应答引起的急性、炎症或过敏性血管炎。
9.根据前述权利要求所述的用于所述用途的人CD34阴性祖细胞，其中所述急性、炎症或过敏性血管炎包括过敏性肉芽肿病、巨细胞动脉炎、韦格纳肉芽肿病、大动脉炎、川崎疾病、血栓闭塞性脉管炎(Buerger疾病)、结节性多动脉炎、Churg-Strauss-综合症、显微镜下多血管炎、冷球蛋白性脉管炎、荨麻疹性血管炎、眼-口-生殖器三联综合征、肺出血肾炎综合征、感染后血管炎或药物诱导的血管炎。
10.根据权利要求1～3中任一项所述的用于所述用途的人CD34阴性祖细胞，其中所述血管炎性疾病包括血管内皮细胞层的慢性炎症。
11.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的人CD34阴性祖细胞，其中所述CD34阴性祖细胞包括CD34阴性间充质干细胞/基质细胞。
12.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的人CD34阴性祖细胞，其中所述CD34阴性祖细胞选自下述组，所述组包括骨髓、脐带、胎盘和脂肪组织CD34阴性祖细胞，或它们的组合。
13.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的人CD34阴性祖细胞，其中所述CD34阴性祖细胞的特征在于表达CD105、CD73和CD90，并且不表达CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79a或CD19。
14.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的人CD34阴性祖细胞，其中所述CD34阴性祖细胞是骨髓CD34阴性间充质干细胞/基质细胞。
15.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的人CD34阴性祖细胞，其中所述CD34阴性祖细胞结合至少一种另外的药理学活性组分使用。
16.根据前述权利要求所述的用于所述用途的人CD34阴性祖细胞，其中所述至少一种另外的药理学活性组分具有选自下述组的药理学活性，所述组包括抗炎症活性、抗缺血性活性、抗血栓形成活性、和它们的组合。
17.一种用于前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的人CD34阴性祖细胞的制造方法，所述方法包括下述步骤：
a)分离CD34阴性祖细胞；
b)在细胞生长培养基中扩增所述CD34阴性祖细胞至少12天；
c)收获所述CD34阴性祖细胞。
18.根据前述权利要求所述的方法，其中在方法步骤a)中，所述CD34阴性祖细胞分离自下述组的组织，所述组包括骨髓、脐带、羊膜和脂肪组织，或它们的组合。
19.根据权利要求17或18所述的方法，其中方法步骤b)的所述细胞生长培养基包括包含下述物质的培养基：
-人血小板裂解物，不含直径大于0.22μm的固体物质，其中裂解物占所述细胞生长培养基总体积的2％至15％，
-人新鲜冷冻的血浆(FFP)滤液，不含直径大于0.22μm的固体物质，其中FFP滤液占所述细胞生长培养基总体积的1％至10％，
-肝素，在所述细胞生长培养基中的浓度为0U/ml至10U/ml，
-L-谷氨酰胺，浓度为0.5mM至10mM，和
-适于哺乳细胞生长的无血清、低葡萄糖培养基，其中无血清、低葡萄糖培养基占所述细胞生长培养基总体积的75％至97％。
20.一种测定CD34阴性祖细胞保护血管内皮细胞层避免免疫介导的细胞毒性反应的能力的方法，其通过制备包含内皮靶细胞、细胞毒性CD8+T淋巴细胞和CD34阴性祖细胞的样品和包含内皮靶细胞和细胞毒性CD8+T淋巴细胞而没有CD34阴性祖细胞的参考样品，并比较所述样品和所述参考样品中的内皮靶细胞的裂解来进行测定。
21.根据权利要求20所述的方法，其中在用内皮靶细胞和所述CD8+T淋巴细胞制备样品和参考样品之前，所述CD8+T淋巴细胞与同种异体内皮细胞在存在白介素-2的情况下共培养。
22.根据权利要求20或21所述的方法，其中至少一种另外的药理学活性组分被添加至所述样品和/或所述参考样品。

说明书全文

人CD34阴性祖细胞保护血管内皮细胞层避免免疫介导的

细胞毒性反应

技术领域

[0001] 本发明涉及人CD34阴性祖细胞，其用于临床病况治疗中的医学用途。

背景技术

[0002] 成人CD34阴性祖细胞是多能细胞，具有能够自我更新并且多谱系分化成造血、内皮和间充质种类的各种组织的能力。CD34阴性祖细胞已经与免疫调节和再生潜能相关，这让人期待它们在用作治疗人疾病的细胞治疗剂的效果。

[0003] 例如，国际专利申请WO 2008/150368Al公开了非基因修饰的CD34阴性干细胞在治疗下述病症中的医学用途：胃肠不适、糖尿病、肌营养不良和外科手术或身体创伤中的急性创伤愈合。Singer和Caplan描述了人间充质干细胞在炎症中作用的推测机制 (N.G.Singer 和 A.I.Caplan：“Mesenchymal Stem Cells：Mechanisms of Inflammation”(间充质干细胞：炎症的机理)，Annual Review of Pathology：Mechanisms of Disease(病理学年度回顾：疾病的机理)，2011，457-478)。Tolar等回顾了关于MSC生物学的争议和最近的观点、临床前模型中MSC对同种异体反应的调节、以及MSC注射的临床经历(J.Tolar，K.Le Blanc，A.Keating，B.R.Blazar：“Concise Review：Hitting the Right Spot with Mesenchymal Stromal Cells”(简明回顾：以间充质干细胞碰撞正确位点)，Stem Cells 2010(干细胞2010)，28，1446-1455)。Roemeling-van Rhijn等提供了来自实体器官移植中临床前和临床MSC研究的结果(M.Roemeling-van Rhijn，W.Weimar，M.J.Hoogduijn：“Mesenchymal Stem Cells：Application for Solid Organ Transplantation”(间充质干细胞：实体器官移植的应用)，Current Opinion in Organ Transplantation(器官移植的最新观点)，2012，17，55-62)。类似地，Hoogduijn等评估了间充质干细胞疗法在临床器官移植中的进展(M.J.Hoogduijn，F.C.Popp，A.Grohnert，M.J.Crop，M.van Rhijn，A.T.Rowshani，E.Eggenhofer，P.Renner，M.E.Reinders，T.J.Rabelink，L.J.van der Laan，F.J.Dor，J.N.Ijzermans，P.G.Genever，C.Lange，A.Durrbach，J.H.Houtgraaf，B.Christ，M.Seifert，M.Shagidulin，V.Donckier，R.Deans，O.Ringden，N.Perico，G.Remuzzi，A.Bartholomew，H.J.Schlitt，W.Weimar，C.C.Baan，M.H.Dahlke,和MISOT研究小组：“Advancement of Mesenchymal Stem Cell in Solid Organ Transplantation(MISOT)”(间充质干细胞在实体器官移植中的优势)，Transplantation(移植)，90，2010，124-126)。LeBlanc和同事研究了间充质干细胞是否可减轻造血干细胞移植之后的移植物抗宿主病(GvHD)(K.Le Blanc，F.Frassoni，L.Ball，F.Locatelli，H.Roelofs，I.Lewis，E.Lanino，B.Sundberg，M.E.Bernardo，M.Remberger，G.Dini，R.M.Egeler，A.Bacigalupo，W.Fibbe，O.Ringden，Developmental Committee of the European Group for Blood and Marrow Transplantation(欧洲血液和骨髓移植发展委员会)：“Mesenchymal Stem Cells for Treatment of Steroid Resistant，severe，acute Graft-versus-Host-Disease：A phase Two Study”(用于治疗抗类固醇的严重急性移植物抗宿主病的间充质干细胞：第二阶段研究)，Lancet，2008，371，1579-86)。Pati和同事提示MSC可通过出血性休克诱发的肺中局部和全身性作用靶向治疗血管通透性和炎症(S.Pati，M.H.Gerber，T.D.Menge，K.A.Wataha，Y.Zhao，J.A.Baumgartner，J.Zhao，P.A.Letourneau，M.P.Huby，L.A.Baer，J.R.Salsbury，R.A.Kozar，C.A.Wade，P.A.Walker，P.K.Dash，C.S.Cox Jr，M.F.Doursout，J.B.Holcomb：“Bone marrow derived mesenchymal stem cells inhibit inflammation and preserve vasculare endothelial integrity in the lungs after hemorrhagic shock”(源自间充质干细胞的骨髓抑制炎症并保护在失血性休克后肺中的血管内皮细胞层的完整性)，PLoS One，2011，6，e25171)。Charbord综述了骨髓间充质干细胞的多种特征包括基质和免疫调节能力，其可负责受伤组织修复机制的多功能性(P.Charbord：“Bone marrow mesenchymal stem cells：historical overview and concepts”(骨髓间充质干细胞：历史概述和概念)，Human Gene therapy(人类基因治疗)，2010，21，1045-56)。

[0004] 随着强烈需要更好地理解CD34阴性祖细胞的治疗潜能和这些多功能细胞更有层次的医学用途，人们对于CD34阴性祖细胞的临床兴趣也随之增加。

发明内容

[0005] 本发明提供了一种人CD34阴性祖细胞，其用于保护具有血管炎性疾病风险或患有血管炎性疾病的受试者的血管内皮细胞层避免免疫介导的细胞毒性反应。

[0006] 本发明也提供了用于上述用途的人CD34阴性祖细胞的制造方法，该方法包括下述步骤：

[0007] a)分离CD34阴性祖细胞，

[0008] b)在细胞生长培养基中扩增CD34阴性祖细胞至少12天，

[0009] c)收获CD34阴性祖细胞。

[0010] 本发明进一步提供一种测定方法，该方法测定CD34阴性祖细胞保护血管内皮细胞层避免免疫介导的细胞毒性反应的能力，其通过制备包含内皮靶细胞、细胞毒性CD8+T淋巴细胞和CD34阴性祖细胞的样品和包含内皮靶细胞和细胞毒性CD8+T淋巴细胞而没有CD34阴性祖细胞的参考样品，并比较样品和参考样品中的内皮靶细胞的裂解来进行测定。附图说明

[0011] 图1是显示测定CD34阴性祖细胞保护血管内皮细胞层避免免疫介导的细胞毒性反应的能力的方法的代表性实验设计的方块图。

[0012] 图2显示通过使用来自不同供体的骨髓间充质干细胞/基质细胞的CD34阴性祖细胞来保护内皮细胞避免同种异体CD8+细胞毒性T淋巴细胞引起的特异性裂解的结果。

[0013] 图3显示内皮细胞被同种异体CD8+CTL的裂解是I型MHC限制性的并且不依赖于天然杀伤细胞细胞或淋巴因子-激活的杀伤细胞活性。

[0014] 图4显示骨髓MSC(BM-MSC)特异性地保护内皮细胞避免同种异体CD8+细胞毒性T淋巴细胞引起的裂解，而尺寸匹配的对照细胞不体现保护作用。

[0015] 图5显示通过使用源自各种组织的间充质干细胞/基质细胞的CD34阴性祖细胞来保护内皮细胞的水平的比较结果。

[0016] 术语和定义

[0017] 在本申请中，使用的某些术语都具有如下阐释的含义。

[0018] 如本文所使用，如果细胞或其任何前体细胞来自相同物种的另一受试者，就该受试者而言，细胞是“同种异体”的。

[0019] 如本文所使用，“CD34阴性祖细胞”是指在其表面上没有CD34的干细胞。CD34阴性祖细胞本身可也产生或分化成CD34阴性干细胞/基质细胞。CD34阴性祖细胞可包括造血性的、内皮的和/或间质的后裔。在某些优选的实施方式中，“CD34阴性祖细胞”是指CD34阴性间充质干细胞/基质细胞(MSC)；而造血祖细胞和内皮祖细胞最终在成熟期间开始表达CD34和其他同时存在的标志物。

[0020] 如本文所使用，“血管内皮细胞层”应包括但不限于排列在血管的内部表面的细胞。特别是，血管内皮细胞层包括直接接触血液的内皮细胞。

[0021] 如本文所使用，“免疫介导的细胞毒性反应”是指但不限于细胞介导的免疫应答，该细胞介导的免疫应答导致靶细胞的损伤或死亡，其中免疫应答直接作用于该靶细胞。在某些实施方式中，免疫介导的细胞毒性反应包括MHC介导的细胞免疫。

[0022] 如本文所使用，“CD34阴性间充质干细胞/基质细胞”是指满足国际细胞治疗协会建议的三个最低标准的干细胞：(1)当使用组织培养瓶保持在标准培养条件下时的塑料-附着；(2)通过流式细胞仪测量时，表达CD105、CD73和CD90，并且，不表达CD45、CD34、CD14或CDllb、CD79a或CD19；(3)在标准体外分化条件下分化为成骨细胞、成熟脂肪细胞和成软骨细胞的能力(M.Dominici，K.Le Blanc，I.Mueller，I.Slaper-Cortenbach，F.Marini，D.Krause，R.Deans，A.Keating，Dj.Prockop，E.Horwitz："Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells(定义多潜能间充质干细胞的最低标准).The International Society for Cellular Therapy position statement(国际细胞治疗协会的立场声明)"，Cytotherapy(细胞疗法)，2006，8，315-7)。

[0023] 在某些实施方式中，“CD34阴性间充质干细胞/基质细胞”另外是指用γ-IFN刺激之后表达B7-H1 的MSC(PD-L1)(M.Najar，G.Raicevic，H.F.Kazan，C.De Bruyn，D.Bron，M.Toungouz，L.Lagneaux：“Immune-related antigens，surface molecules and regulatory factors in human-derived mesenchymal stromal cells：the expression and impact of inflammatory priming(来源于人的间充质干细胞中的免疫相关抗原、表面分子和调节因子：炎症启动的表达和影响)”Stem Cell Rev.2012，8，1188-98；S.Tipnis，C.Viswanathan，A.S.Majumdar“Immunosuppressive properties of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells：role of B7-H1 and IDO(来源于人脐带的间充质干细胞的免疫抑制特性)”，Immunol Cell Biol(免疫细胞生物学).，2010，88，795-806；P.Fiorina，M.Jurewicz，A.Augello，A.Vergani，S.Dada，S.La Rosa，M.Selig，J.Godwin，K.Law，C.Placidi，R.N.Smith，C.Capella，S.Rodig，C.N.Adra，M.Atkinson，M.H.Sayegh，R.Abdi：“Immunomodulatory function of bone marrow-derived mesenchymal stem cells in experimental autoimmune type 1diabetes(来源于骨髓的间充质干细胞在实验性自动免疫I型糖尿病中的免疫调节功能)”，J Immunol.2009，183，993-1004；C.J.Chang，M.L.Yen，Y.C.Chen，C.C.Chien，H.I.Huang，C.H.Bai，B.L.Yen：“Placenta-derived multipotent cells exhibit immunosuppressive properties that are enhanced in the presence of interferon-gamma(来源于胎盘的多能干细胞在γ干扰素存在下免疫抑制性增强)”，Stem Cells(干细胞)，2006，24，2466-77)。

[0024] 只要没有其他说明，“血管炎性疾病“是指但不限于引起血管组织炎症的免疫应答，所述血管组织包括大动脉和小动脉、静脉和淋巴管。

[0025] 如本文所使用，“受试者”是指任何动物，比如人、非人灵长类、小鼠、大鼠、豚鼠或兔子。优选地，受试者是人。

[0026] 如本文所使用，“保护血管内皮细胞层”是指减缓、停止或逆转针对任何血管组织的免疫介导的细胞毒性反应的发展。

[0027] 发明详述

[0028] 血管内皮细胞层是各种血管炎症疾病的主要对象。本发明的发明人从风险适应、个性化预防和/或治疗性介入的角度考虑，认识到内皮细胞层的特异性保护具有巨大的临床和健康经济价值。

[0029] 发明人针对血管内皮细胞层的活化状态和活力进行了细致研究，并且，发现CD34阴性祖细胞能够以药理学用途和剂量依赖性方式抑制内皮细胞层特异性细胞毒性反应。

[0030] 所以，在第一方面中，本发明提供一种人CD34阴性祖细胞，用于保护处在血管炎性疾病风险或患有血管炎性疾病的受试者的血管内皮细胞层避免免疫介导的细胞毒性反应。

[0031] 在本发明的一种实施方式中，血管炎性疾病包括CD8+细胞毒性T淋巴细胞造成的血管内皮细胞层特异性细胞裂解。发明人阐释了在血管炎性疾病的某些情况下，内皮细胞层是CD8+细胞毒性T淋巴细胞的直接靶。CD34阴性祖细胞的治疗性用途在干扰CD8+细胞毒性T淋巴细胞介导细胞毒性反应中特别有效。

[0032] 在本发明的具体实施方式中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞包括内皮细胞层特异性细胞毒性T淋巴细胞，其是CD27阴性和CD28阴性。发明人惊讶地发现了存在CD27阴性和CD28阴性且不识别造血靶的内皮细胞层特异性细胞毒性T淋巴细胞的证据。这些细胞展示出表型和功能上的显著特点。例如，它们的裂解活性被CD4+/CD25+/FoxP3+调节T淋巴细胞(TRegs)增强。当施用CD34阴性祖细胞时，发明人对通过该具体类型的CTL引起的内皮细胞裂解实现了明显抑制。

[0033] 本发明所以提供了CD34阴性祖细胞的分层治疗性用途，确保用CD34阴性祖细胞的风险适应的、个性化的预防和/或疗法。相应地，根据本发明的CD34阴性祖细胞的有利医学用途包括下面限定的临床病况。

[0034] 在本发明的一种实施方式中，血管炎性疾病包括针对相对于受试者是同种异体的实体器官移植的血管内皮细胞层的同种异体反应。

[0035] 在另一实施方式中，血管炎性疾病包括同种异体造血干细胞移植之后移植相关并发症。

[0036] 例如，移植相关并发症包括移植物抗宿主病(GvHD)。尤其是，移植物抗宿主病的特征可在于胃肠道、肝脏、包括粘膜的皮肤、肺系统和其组合的主要选择性损伤。在本发明的某些实施方式中，移植物抗宿主病包括类固醇难治愈的急性或慢性GvHD。

[0037] 移植相关并发症的另一例子是微血管疾病，比如，作为一个例子有肝静脉闭塞疾病(VOD)。

[0038] 人CD34阴性祖细胞也可用于保护血管炎性疾病中的血管内皮细胞层，所述血管炎性疾病包括由于自体免疫应答引起的急性、炎症或过敏性血管炎。该用途包括但不限于过敏性肉芽肿病、巨细胞动脉炎、韦格纳肉芽肿病、大动脉炎、川崎疾病、血栓闭塞性脉管炎(Buerger疾病)、结节性多动脉炎、Churg-Strauss-综合症、显微镜下多血管炎、冷球蛋白性脉管炎、荨麻疹性血管炎、眼-口-生殖器三联综合征、肺出血肾炎综合征、感染后血管炎和药物诱导的血管炎。

[0039] 在另一实施方式中，血管炎性疾病包括血管内皮细胞层的慢性炎症。举例而言，慢性炎症可包括动脉粥样硬化。慢性炎症也可包括与类风湿性疾病相关的血管炎。

[0040] 在本发明优选的实施方式中，CD34阴性祖细胞包括CD34阴性间充质干细胞/基质细胞。CD34阴性祖细胞可选自例如骨髓、脐带、胎盘和脂肪组织CD34阴性祖细胞和它们的组合。在本发明优选的实施方式中，CD34阴性祖细胞是骨髓CD34阴性祖细胞。尤其优选的是骨髓CD34阴性间充质干细胞/基质细胞。

[0041] 优选地，相比不受CD34阴性祖细胞保护的内皮细胞，CD34阴性祖细胞能够将针对血管内皮细胞的免疫介导细胞毒性反应减少至少50％。下面进一步详述，根据本发明减少免疫介导细胞毒性反应的适当的测定方法。

[0042] 人CD34阴性祖细胞是优选的但不是仅适于注射至受试者的血流，例如通过将这样的细胞经注射引入受试者的静脉或动脉之一。例如，这样的给药也可进行一次或多次和/或在一个或多个延长的时间段内实施。单次注射是优选的，但是在一些情况下，随着时间推移的重复的注射可能是必要的。优选地，CD34阴性祖细胞与药学上可接受的载体混合。药学上可接受的载体是本领域技术人员熟知的，并且包括但不限于0.01摩尔至0.1摩尔、优选为0.05摩尔的磷酸缓冲液或0.8％的生理盐水。而且，这样的药学上可接受的载体可以是水性或非水性溶液、悬浮液、和乳液，非水性溶剂的例子是丙烯、乙二醇、聚乙二醇、植物油比如橄榄油和可注射的有机酯比如油酸乙酯。水性载体包括水、含酒精溶液/水溶液，乳液和悬浮液包括生理盐水和缓冲液媒介。肠胃外媒介包括氟化钠溶液、林格右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸化的林格和不挥发油。静脉内媒介包括流体和养分补充剂、电解质补充剂比如林格右旋糖，基于林格右旋糖的物质等。通常用于静脉内给药的流体参见例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy(药学的科学与实践)，第20版，808页，Lippincott，Williams和Wilkins(2000)。

[0043] 可使用不同的施用方案。优选地，人CD34阴性祖细胞适于以治疗上有效的量注2 8
射至受试者的血流。治疗上有效的量例如可包括下述范围：l×l0至约l×l0 细胞每千克
3 7 4 6
体重、约l×l0至约l0×l0 细胞每千克体重、约l×l0 至约l×l0 细胞每千克体重、约
4 5 5 6 4
l×l0至约l×l0 细胞每千克体重、约l×l0 至约l×l0 细胞每千克体重、约5×l0 至约
5 3 4 4
0.5×l0细胞每千克体重、约l×l0 细胞每千克体重、约l×l0 细胞每千克体重、约5×l0
5 5 6
细胞每千克体重、约l×l0细胞每千克体重、约5×l0 细胞每千克体重、约l×l0 细胞每
7
千克体重和约l×l0细胞每千克体重。发现CD34阴性祖细胞的这些数值对于移植在治疗上是尤其有效的。

[0044] 在本发明的变型例中，预防性使用CD34阴性祖细胞，用于保护处于血管炎性疾病风险中受试者的血管内皮细胞层。如本文所使用，预防性使用应包括但不限于将细胞施用至打算接受相对于该受试者是同种异体的实体器官移植的受试者。在另一例子中，预防性使用包括将CD34阴性祖细胞施用至打算接受同种异体造血干细胞移植的受试者。预防性使用的进一步的例子包括将CD34阴性祖细胞施用至已经接受同种异体移植但是还未发展内皮并发症的受试者。血管炎性疾病的风险也可包括例如遗传病、自身免疫性疾病、癌症、吸烟、酗酒和它们的组合。从风险适应、个性化预防角度考虑，发明人认识到血管内皮细胞层的靶向保护具有重要的临床和健康经济价值。

[0045] 这样的风险分层用途例如可包括但不限于处在移植后内皮并发症发展风险下的患者预防性地即事先接受CD34阴性祖细胞。例如，CD34阴性祖细胞可就在介入例如同种异体细胞或器官移植之前、期间和/或达约六周之前和/或之后施用至受试者。CD34阴性祖细胞的施用也可扩展至介入之后内皮并发症的急性阶段和/或慢性阶段多达约100天。另外，当发展或当前发展内皮并发症和/或其症状特征时，CD34阴性祖细胞可治疗性地施用至受试者。

[0046] CD34阴性祖细胞相对于受试者可以是同种异体的。CD34阴性祖细胞相对于受试者也可以是自体的。可选地，可使用同种异体和自体CD34阴性祖细胞的组合。

[0047] 在一个实施例中，CD34阴性祖细胞相对于实体器官移植是自体的且相对于受试者是同种异体的。在另一实施例中，CD34阴性祖细胞相对于造血干细胞移植是同种异体的且相对于受试者是自体的。也包括其中CD34阴性祖细胞相对于受试者和实体器官移植或造血干细胞移植是同种异体的情况。

[0048] 在一种实施方式中，CD34阴性祖细胞结合至少一种另外的活性组分使用。例如，所述至少一种另外的活性组分可具有选自下述的药理学活性：抗炎症活性、抗缺血性活性、抗血栓形成活性和它们的组合。另外或可选地，所述至少一种另外的活性组分可具有保护内皮细胞避免同种异体识别和/或裂解的能力。在某些例子中，至少一种另外的活性组分包括脱氧核糖核酸衍生物，例如去纤维蛋白多核苷酸。

[0049] 在第二方面中，本发明提供了用于上述任一用途的人CD34阴性祖细胞的制造方法，该方法包括下述步骤：a)分离CD34阴性祖细胞；b)在细胞生长培养基中扩增CD34阴性祖细胞至少12天；c)收获CD34阴性祖细胞。

[0050] 在一种实施方式中，在方法步骤a)中，CD34阴性祖细胞分离自包括下述的组织：骨髓、脐带、胎盘和脂肪组织，或它们的组合。发明人发现来自这些组织来源的祖细胞尤其适于保护血管炎性疾病中的血管内皮细胞层。优选地，CD34阴性祖细胞是CD34阴性间充质干细胞/基质细胞。最优选的是来自骨髓的CD34阴性间充质干细胞/基质细胞。

[0051] 根据该方法的进一步实施方式，方法步骤b)的细胞生长培养基包括包含下述的培养基：

[0052] -人血小板裂解物，不含直径大于0.22μm的固体物质，其中裂解物占细胞生长培养基总体积的2％至15％，

[0053] -人新鲜冷冻的血浆(FFP)滤液，不含直径大于0.22μm的固体物质，其中FFP滤液占细胞生长培养基总体积的1％至10％，

[0054] -肝素，在细胞生长培养基中的浓度为0U/ml至10U/ml，

[0055] -L-谷氨酰胺，浓度为0.5mM至10mM，和

[0056] -适于哺乳细胞生长的无血清、低葡萄糖培养基，其中无血清、低葡萄糖培养基占细胞生长培养基总体积的75％至97％。

[0057] 此处，人新鲜冷冻的血浆指已经被离心、分离并且在-18℃或更冷时在收集的数小时内冷冻成固体的人血液的液体部分。发明人在该培养基中完成CD34阴性祖细胞的扩增，其特别有力地保护血管内皮细胞层避免免疫介导的细胞毒性反应。下面，该培养基被称为“Bio-1”培养基。

[0058] 在优选的实施方式中，在方法步骤c)中收获CD34阴性祖细胞，其主要在接触细胞培养基的表面，比如细胞培养皿或细胞培养容器的壁上附着生长。

[0059] 优选地，在良好生产规范(GMP)和/或现行良好生产规范(cGMP)下进行方法步骤a)至c)。

[0060] 利用这些方法，发明人完成了具有非常高的血管内皮细胞层保护效能的更好限定、高度可移植的细胞的体外扩增和正向选择，反之，常规方法通常产生CD34阴性祖细胞中不同亚群的异源混合物。

[0061] 在第三方面中，本发明提供了测定CD34阴性祖细胞保护血管内皮细胞层避免免疫介导细胞毒性反应的能力的方法，其通过制备包含内皮靶细胞、细胞毒性CD8+T淋巴细胞和CD34阴性祖细胞的样品和包含内皮靶细胞和CD8+细胞毒性T淋巴细胞而没有CD34阴性祖细胞的参考样品，并且比较样品和参考样品中的内皮靶细胞的裂解来进行测定。

[0062] 在一种实施方式中，内皮靶细胞和/或CD34阴性祖细胞相对于CD8+T淋巴细胞是同种异体的。

[0063] 在另一实施方式中，在用内皮靶细胞和所述CD8+T淋巴细胞制备样品和参考样品之前，将CD8+T淋巴细胞与同种异体内皮细胞在存在白介素-2(IL-2)的情况下共同培养。共同培养例如可维持至少一天，优选为至少3天，更优选为至少5天，最优选为至少7天。

[0064] 在另一实施方式中，至少一种另外的活性组分添加至所述样品和/或所述参考样品中。例如，所述至少一种另外的活性组分可具有选自下述的药理学活性：抗炎症活性、抗缺血性活性、抗血栓形成活性和它们的组合。另外或可选地，所述至少一种另外的活性组分可具有保护内皮细胞避免同种异体识别和/或裂解的能力。在某些例子中，所述至少一种另外的活性组分包括脱氧核糖核酸衍生物，例如去纤维蛋白多核苷酸。

[0065] 利用该方法，发明人完成了用于评估来自不同来源的CD34阴性祖细胞保护血管内皮细胞层的能力的效力试验。而且，实现了用于正向预测CD34阴性祖细胞在体内的疗效的体外测试。

[0066] 所述方法可也用于分析受试者的血液，用于接受移植物和/或发展内皮并发症之前、期间和/或之后内皮-细胞毒性CD8+T淋巴细胞的存在和/或病理生理活性。

[0067] 例如，在相对于受试者是同种异体的实体器官移植的情况下，内皮靶细胞可包括源自实体器官供体的细胞。在相对于受试者是同种异体的实体器官移植的另一情况下，CD34阴性祖细胞可包括源自实体器官供体的细胞。在实体器官移植物相对于受试者是同种异体的某些情况下，内皮靶细胞和CD34阴性祖细胞可包括源自实体器官供体的细胞。另外或可选地，CD34阴性祖细胞也可包括源自至少一个不是受试者或实体器官供体的第三方供体的细胞。

[0068] 在同种异体造血干细胞移植的情况下，内皮靶细胞可包括源自受试者，即移植物接受者的细胞。在同种异体造血干细胞移植的另一情况下，CD34阴性祖细胞可包括源自移植物接受者的细胞。在同种异体造血干细胞移植的某些情况下，内皮靶细胞和CD34阴性祖细胞可包括源自移植物接受者的细胞。另外或可选地，CD34阴性祖细胞也可包括源自至少一个不是移植物接受者或造血干细胞供体的第三方供体的细胞。

[0069] 这样，所述方法不仅能够用于确定受试者的对于发展免疫介导细胞毒性反应的感受性，其基于使用源自受试者血液的细胞毒性CD8+T淋巴细胞的个体结合上面鉴定的、情况特异性内皮靶细胞，而且也可选择展示特别有力保护内皮靶细胞的CD34阴性祖细胞。

[0070] 结果，患者例如可根据他们血管炎性疾病的风险而分层。而且，可设计个性化预防和/或疗法。

具体实施方式

[0071] 在下述实施例中，参考图和实验数据更详细阐释本发明的某些实施方式。实施例和附图并不是要对本发明做出限制。

[0072] 实施例1：实验设计细胞毒性试验

[0073] 下述实施例描述发明人设计的实验设置，用于评估CD34阴性祖细胞就保护血管内皮细胞层避免免疫介导的细胞毒性反应的效力。

[0074] 图1是图解本发明细胞毒性试验的一个代表性实施方式的方块图。外周血的单核细胞(PBMC，10)可用作细胞毒性细胞的来源。PBMC例如可源自健康的第三方供体。可选地，可使用待治疗受试者的PBMC。

[0075] 接下来，可进一步选择PBMC用于CD8+T淋巴细胞(11)。用于CD8+T淋巴细胞的选择例如可包括通过免疫分离从PBMC来富集CD8+T淋巴细胞。免疫分离例如可包括通过去除非CD8+T淋巴细胞来反向选择CD8+T淋巴细胞。用于富集CD8+T淋巴细胞的适当的方法是例如利用免疫磁性微粒的非接触选择。不需要的细胞例如可被作为目标，通过可识别CD4、CD14、CD16、CD19、CD20、CD36、CD56、CD66B、CD123、TCRy/δ、血型糖蛋白A和包被葡聚糖的磁性颗粒的抗体复合物去除。其后，可通过例如流式细胞仪确认选择的细胞的表型纯度。优选地，大部分选择的细胞是CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL，12)。

[0076] 在下一阶段，可保持CD8+CTL与相对于CD8+CTL同种异体的内皮刺激细胞(13)共培养(14)。优选地，内皮刺激细胞不能进行有丝分裂。适当的细胞系例如是SV40大T抗原转化的微脉管内皮细胞系CDC/EU.HMEC-1(HMEC)。内皮刺激细胞和CD8+CTL的共培养例如可保持约七天。优选地，共培养进一步包括用白介素-2刺激CD8+CTL。

[0077] 内皮靶细胞(17)的制备可经受标记步骤(18)，其中它们用第一标签标记，使得内皮靶细胞与其他非靶细胞区分开。例如，这样的标签可包括荧光性化合物，其存在于细胞的质膜中时相较于存在于质膜的外侧时，具有不同的发射特征。适当的化合物例如是3,3'双十八烷基氧杂羰花青高氯酸盐(DIOC183)。靶细胞例如可以是来自移植组织的内皮细胞。靶细胞可以是内皮细胞系，例如微脉管内皮系CDC/EU.HMEC-1。

[0078] 在下一阶段，通过结合第一部分标记的靶细胞(20)、第一部分效应细胞(16)和CD34阴性祖细胞(21)制备样品(22)。CD34阴性祖细胞例如可以是相对于内皮靶细胞和效应细胞同种异体的。内皮靶细胞和CD34阴性祖细胞的比例例如可以是5:1。效应细胞对内皮靶细胞的比例例如可以是20:1、10:1或5:1。通过结合第二部分标记的靶细胞(20')和第二部分没有CD34阴性祖细胞的效应细胞(16')，以如上述样品中相同的比例制备参考样品(22')。保持样品和参考样品的温育(23，23')。温育例如可保持约四小时。

[0079] 其后，测定样品和参考样品中裂解的内皮靶细胞的量(24，24')。为了该目的，可用第二标签标记裂解的内皮靶细胞，使得裂解靶细胞与非裂解的靶细胞区分开。这样的第二标签例如可以是适于阳性染色死细胞的染色。例如，可使用荧光染色比如碘化丙啶。测定裂解的内皮靶细胞的适当的方法例如可以是流式细胞术。例如，可通过流式细胞仪测定携带第一标签例如DIOCI83的细胞的总群体中携带第一和第二标签例如DIOCI83和PI的细胞的量来测定裂解的细胞的百分数。

[0080] 另外，由效应细胞特异性裂解的靶细胞的百分数可通过减去随机裂解的细胞的百分数来校正。为了该目的，制备第三部分(25)标记的靶细胞(19)，其不包含效应细胞也不包含CD34阴性祖细胞。以与样品和参考样品相同的方式进一步处理第三部分(25)，其后如上述那样测定第三部分(26)中的随机裂解内皮靶细胞的量。

[0081] 实施例2：第三方CD34阴性祖细胞保护内皮细胞避免同种异体CD8+CTL引起的裂解

[0082] 实施例1中描述的细胞毒性试验用于评估内皮靶细胞(HMEC)被具有和没有源自第三方CD34阴性祖细胞的同种异体细胞毒性T淋巴细胞导致的裂解。在该情况下，使用分离自骨髓的CD34阴性间充质干细胞/基质细胞。在Bio-1培养基中扩增BM-MSC，其产生有利的细胞群体用于从保持干细胞特征、细胞活力和保护血管内皮细胞层避免免疫介导的细胞毒性反应的效力角度的治疗性用途。

[0083] 制备20:1、10:1和5:1的不同比例的效应细胞和靶细胞。对于每个比例，制备没有骨髓MSC的六个个体样品和有骨髓MSC(BM-MSC)的六个个体样品。就后者而言，在添加效应细胞之前，用单个供体的BM-MSC温育靶细胞24小时。

[0084] 实验的结果显示在图2中。该图显示没有BM-MSC(菱形标记物)和有BM-MSC(方形标记物)的样品中，关于各自的效应细胞与靶细胞比例，以百分数计靶细胞的特异性裂解。数据表示六个个体实验的平均值和标准偏差。发现BM-MSC在所有测试的E/T比例下以高显著性抑制因CD8+CTL引起的同种异体内皮细胞的裂解(*，**，***：p<0.001)。通过添加CD34阴性骨髓间充质干细胞/基质细胞，同种异体内皮靶细胞的特异性裂解平均下降约65％，即28.3±5.8％至9.7±8.3％。

[0085] 实施例3：CD34阴性祖细胞的免疫调节作用是内皮细胞层特异性的

[0086] 作为对照，如实施例2中描述那样进行实验，不同之处是CD34阴性BM-MSC不添加至内皮细胞，而是用效应细胞预先温育并且之后将其去除。在该情况下，相比没有用BM-MSC预先温育的效应细胞，当效应细胞用BM-MSC预先温育时，没有观察到内皮靶细胞的特异性裂解的下降。所以可得出结论，BM-MSC的免疫调节活性涉及BM-MSC与内皮靶细胞的特异性相互作用。

[0087] 实施例4：同种异体CD8+CTL引起的内皮靶细胞裂解是I型MHC限制性的并且不依赖于天然杀伤细胞或淋巴因子激活杀伤细胞活性

[0088] 作为进一步的对照，通过限于同种异体抗原的I型MHC提呈，研究了同种异体CD8+细胞毒性T淋巴细胞效应细胞的裂解活性是否是抗原特异性的。为了该目的，内皮靶细胞经受如实施例2中的CD8+效应细胞，但是是在存在中和I型MHC抗体的情况下(W6/32)。另外，显示效应细胞不具备相当于天然杀伤细胞或非特异性淋巴因子激活杀伤细胞的活性。通过进行如实施例2的实验完成该对照，但是其中，对于天然杀伤细胞(K562)而言，内皮靶细胞替换成对照靶细胞系。

[0089] 这些对照实验的结果总结在图3中。列表示每个具有四个个体BM-MSC供体的四个独立实验中20的效应细胞/靶比例的靶细胞的特异性裂解的算数平均数和标准偏差。结果显示中和抗I型MHC抗体的存在明显降低靶细胞的特异性裂解(*，**：p<0.001)，确认效应细胞的裂解活性是同种异体抗原特异性的。此外，对照靶K562的裂解显著降低(***：
p<0.002)，表明细胞毒性T淋巴细胞效应细胞不具备对应天然杀伤细胞或非特异性淋巴因子激活杀伤细胞的活性。

[0090] 实施例5：保护内皮靶细胞避免因CD8+CTL效应细胞引起的裂解对于CD34阴性祖细胞而言是特异性的

[0091] CD34阴性祖细胞比如源自骨髓的CD34阴性间充质干细胞/基质细胞是比较大的细胞。所以，评估BM-MSC对内皮靶细胞的保护是否是基于来自通过BM-MSC接近内皮细胞的CD8+T淋巴细胞效应细胞的空间抑制而不是基于BM-MSC的免疫调节能力。该实验设计与实施例2类似，但是其中来自人心脏组织的成纤维细胞样细胞而不是BM-MSC被添加至内皮靶细胞。成纤维细胞样细胞的尺寸与BM-MSC匹配。

[0092] 结果显示在图4中。列表示每个具有三个不同BM-MSC供体的三个独立实验的内皮靶细胞的特异性裂解的算数平均数和标准偏差，以百分数计归一化至没有保护的内皮细胞的裂解。从添加尺寸匹配的对照细胞没有观察到对内皮靶细胞的保护作用(**：没有显著性)，表明内皮靶细胞通过BM-MSC的保护是免疫相关的而不是由于空间抑制。

[0093] 实施例6：CD34阴性干细胞是免疫性低下的(immunologically naive)[0094] CD34阴性祖细胞本身不是免疫原性的，这是重要的。由于该原因，研究了骨髓CD34阴性间充质干细胞/基质细胞的免疫原性。如前述实施例2那样进行实验，但是其中不是内皮细胞而是骨髓间充质干细胞/基质细胞在没有内皮细胞的情况下用作靶细胞。当BM-MSC作为靶提呈时，没有观察到同种异体CD8+细胞毒性T淋巴细胞效应细胞的裂解活性。该发现尤其与CD34阴性祖细胞和间充质干细胞/基质细胞的免疫性低下一致。

[0095] 实施例7：来自不同来源的CD34-祖细胞的内皮保护能力

[0096] 比较源自不同组织来源的CD34阴性祖细胞保护内皮靶细胞避免CD8+CTL介导的裂解的效力。如实施例2那样进行实验，其中CD34-祖细胞(21)是源自骨髓的MSC(BM-MSC，9个单独的样品)，或源自脐带的MSC(UC-MSC，4个单独的样品)，或源自羊膜的MSC(AMC-MSC，3个单独的样品)。这些实验的结果总结在图5中。每个列对显示取决于MSC来源的以百分数计没有MSC保护(实心列)和有MSC保护(阴影列)的具体内皮靶细胞裂解的算数平均数和标准偏差。所有测试的MSC能够保护内皮靶细胞避免CD8+CTL介导的裂解。用BM-MSC观察到最有力的保护，其中相比没有MSC保护的内皮细胞裂解平均下降72.3％。AMC-MSC平均降低内皮细胞裂解约53.2％，UC-MSC仍平均降低内皮细胞裂解约39.5％。该实施例也突出了本方法的如下重要性：测定CD34阴性祖细胞保护血管内皮细胞层避免免疫介导的细胞毒性反应的能力，以便评估来自不同来源的细胞的保护效力，和积极预测CD34阴性祖细胞体内的作用。

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