miRNA在胎盘组织中的表达
阅读：944发布：2020-07-20
专利汇可以提供miRNA在胎盘组织中的表达专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了用于免疫调节的与在妊娠期间产生免疫耐受性相关的人类miRNA以及其 片段 、衍 生物 和变体。所述miRNA可以用于诊断和 治疗 与免疫反应失调相关的病症、自身免疫病症、妊娠相关 疾病 、胎盘形成障碍或问题和由同种异体移植引起的并发症。另外，描述了用于诊断和治疗所述病症的新的药物组合物和诊断组合物。，下面是miRNA在胎盘组织中的表达专利的具体信息内容。
1.一种用于免疫调节的miRNA，其中所述miRNA是选自由C19MC簇或miR-371-373簇中所包含的转录单元中的任一个所编码的miRNA。
2.如权利要求1所述的miRNA，其中所述miRNA是选自：具有SEQ ID No: 1-66的hsa-miR-498、hsa-miR-512-3p、hsa-miR-512-5p、hsa-miR-515-3p、hsa-miR-515-5p、hsa-miR-516a-3p、hsa-miR-516a-5p、hsa-miR-516b-3p、hsa-miR-516b-5p、hsa-miR-517-5p、hsa-miR-517a-3p、hsa-miR-517b-3p、hsa-miR-517c-3p、hsa-miR-518a-3p、hsa-miR-518a-5p、hsa-miR-518b、hsa-miR-518c-3p、hsa-miR-518c-5p、hsa-miR-518d-3p、hsa-miR-518d-5p、hsa-miR-518e-3p、hsa-miR-518e-5p、hsa-miR-518f-3p、hsa-miR-518f-5p、hsa-miR-519a-3p、hsa-miR-519a-5p、hsa-miR-519b-3p、hsa-miR-519b-5p、hsa-miR-519c-3p、hsa-miR-519c-5p、hsa-miR-519d、hsa-miR-519e-3p、hsa-miR-519e-5p、hsa-miR-520a-3p、hsa-miR-520a-5p、hsa-miR-520b、hsa-miR-520c-3p、hsa-miR-520c-5p、hsa-miR-520d-3p、hsa-miR-520d-5p、hsa-miR-520e、hsa-miR-520f、hsa-miR-520g、hsa-miR-520h、hsa-miR-521、hsa-miR-522-3p、hsa-miR-522-5p、hsa-miR-523-3p、hsa-miR-523-5p、hsa-miR-524-3p、hsa-miR-524-5p、hsa-miR-525-3p、hsa-miR-525-5p、hsa-miR-526a、hsa-miR-526b-3p、hsa-miR-526b-5p、hsa-miR-527、hsa-miR-1283、hsa-miR-1323、hsa-miR-371a-3p、hsa-miR-371a-5p、hsa-miR-371b-3p、hsa-miR-371b-5p、hsa-miR-372、hsa-miR-373-3p、hsa-miR-373-5p。
3.如权利要求1或2所述的miRNA，所述miRNA与由C19MC簇或miR-371-373簇所编码的miRNA具有共同种子序列，其中所述miRNA：
a.) 是 选 自：具 有SEQ ID No: 67-78的 hsa-miR-302a-3p、hsa-miR-302a-5p、hsa-miR-302b-3p、hsa-miR-302b-5p、hsa-miR-302c-3p、hsa-miR-302c-5p、hsa-miR-302d-3p、hsa-miR-302d-5p；和/或
b.) 以一致种子序列AAGTGC为特征。
4.一种用于免疫调节的miRNA前体，其包含如权利要求1到3中任一项所述的miRNA的核酸序列。
5.一种用于免疫调节的结合分子，所述结合分子能够干扰如权利要求1到4中任一项所述的miRNA分子的标靶基因的基因表达，其中所述结合分子是选自用于免疫调节的包含合成miRNA模拟物、RNA分子、抗体、适体、镜像异构体的分子群组。
6.一种双链核酸，其包含如权利要求1到4中任一项所述的miRNA或miRNA前体或如权利要求5所述的结合分子的核酸序列。
7.一种载体，其包含如权利要求6所述的双链核酸。
8.一种宿主细胞，其包含如权利要求7所述的载体。
9.如权利要求8所述的宿主细胞，其中所述细胞是人类细胞，优选其中所述细胞是选自患者的自体细胞的群组。
10.一种药物组合物或诊断剂，其包含至少一种根据权利要求1到3中任一项所述的miRNA、如权利要求4所述的miRNA前体、如权利要求5所述的结合分子、如权利要求6所述的双链核酸、如权利要求7所述的载体和/或如权利要求8或9所述的宿主细胞作为药剂。
11.如权利要求10所述的药物组合物或诊断剂，其中所述活性剂被包埋在人造外来体中。
12.如权利要求1到3中任一项所述的miRNA、如权利要求4所述的miRNA前体、如权利要求5所述的结合分子或如权利要求10或11所述的药物组合物，其用于治疗自身免疫疾病。
13.根据权利要求12所述的用途，其中所述自身免疫疾病是选自包括以下的疾病群组：急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、斑秃、强直性脊椎炎、抗磷脂综合征(APS)、自身免疫性心肌病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病、自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)、自身免疫性周围神经病变、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性多内分泌腺病综合征、自身免疫性孕酮性皮炎、自身免疫性血小板减少性紫癜、自身免疫性荨麻疹、自身免疫性葡萄膜炎、乳糜泻、冷凝集素病、克罗恩病、皮肤肌炎、1型糖尿病、子宫内膜异位症、嗜酸性筋膜炎、胃肠道类天疱疮、古德帕斯彻氏综合征、格雷夫斯氏病、格林-巴利综合征(GBS)、桥本氏脑病、桥本氏甲状腺炎、特发性血小板减少性紫癜(自身免疫性血小板减少性紫癜)、红斑狼疮、米勒费雪综合征(格林-巴利综合征)、混合结缔组织病、重症肌无力、寻常天疱疮、恶性贫血、多肌炎、原发性胆汁性肝硬化、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、复发性多软骨炎、类风湿性关节炎、斯耶格伦氏综合征、颞动脉炎(“巨细胞性动脉炎”)、横贯性脊髓炎、溃疡性结肠炎、未分化结缔组织病(混合结缔组织病)、血管炎、韦格纳氏肉芽肿病。
14.如权利要求1到3中任一项所述的miRNA、如权利要求4所述的miRNA前体、如权利要求5所述的结合分子、如权利要求10或11所述的药物组合物或如权利要求10或11所述的诊断剂，其用于治疗或诊断妊娠相关疾病。
15.如权利要求1到3中任一项所述的miRNA、如权利要求4所述的miRNA前体、如权利要求5所述的结合分子、如权利要求10或11所述的药物组合物或如权利要求10或11根据权利要求14所述的诊断剂，其中所述妊娠相关疾病是选自由子痫、先兆子痫、HELLP综合征和胎盘形成或植入障碍或问题组成的疾病群组。
16.如权利要求1到3中任一项所述的miRNA、如权利要求4所述的miRNA前体、如权利要求5所述的结合分子、如权利要求10或11所述的药物组合物，其用于预防或治疗同种异体移植物的排斥反应。
17.如权利要求1到3中任一项所述的miRNA、如权利要求4所述的miRNA前体、如权利要求5所述的结合分子、如权利要求10或11所述的药物组合物，其用于预防或治疗移植物对抗宿主的反应。
18.如权利要求1到3中任一项所述的miRNA、如权利要求4所述的miRNA前体、如权利要求5所述的结合分子、如权利要求10或11所述的药物组合物或如权利要求10所述的诊断剂，其被设计用于局部施用。
19.如权利要求1到3中任一项所述的miRNA、如权利要求4所述的miRNA前体、如权利要求5所述的结合分子、如权利要求10或11所述的药物组合物或如权利要求10所述的诊断剂，其被设计用于全身施用。
20.如权利要求1到3中任一项所述的miRNA、如权利要求4所述的miRNA前体、如权利要求5所述的结合分子、如权利要求7所述的载体、如权利要求10或11所述的药物组合物或如权利要求10或11所述的诊断剂，其用于离体和/或体内处理同种异体移植物。
21.如权利要求1到3中任一项所述的miRNA、如权利要求4所述的miRNA前体、如权利要求5所述的结合分子、如权利要求7所述的载体、如权利要求10或11所述的药物组合物药剂或如权利要求10或11所述的诊断剂，其用于离体和/或体内处理自体细胞或组织。
22.如权利要求1到3中任一项所述的miRNA、如权利要求4所述的miRNA前体、如权利要求5所述的结合分子、如权利要求7所述的载体、如权利要求10或11所述的药物组合物药剂或如权利要求10或11所述的诊断剂，其用于离体和/或体内处理被自身免疫疾病侵袭的细胞或组织。
23.一种针对如权利要求1到3中任一项所述的miRNA和/或针对如权利要求4所述的miRNA前体的拮抗剂，所述拮抗剂选自用于治疗良性和恶性肿瘤的包含合成miRNA模拟物、RNA分子、抗体、适体、镜像异构体和小分子的分子群组，所述良性和恶性肿瘤选自包括甲状腺肿瘤、乳腺癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌、生殖细胞肿瘤、肝细胞癌、白血病和淋巴瘤的群组。
24.一种获得用于免疫调节的外来体的方法，其包括分离和纯化来自表达如权利要求
1到3中任一项所述的C19MC、miR-371-373和/或miR302-367簇的miRNA的胚胎或胎儿细胞的细胞培养物的上清液的外来体。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述细胞培养物是选自包括来自脐带、羊膜、胎盘和绒毛膜的细胞的细胞群组。
26.一种从生物样品获得用于免疫调节的外来体的方法，其包括以下步骤：由所述生物样品建立细胞培养物，收集所述细胞培养物的上清液，以及分离和纯化其外来体。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述生物样品包含自体细胞、组织样品或吸出物。
28.如权利要求26所述的方法，其中所述生物样品包含同种异体细胞、组织样品或吸出物。
29.一种用于体外产生包含根据权利要求1到3、5和6中任一项所述的miRNA、结合分子和/或双链核酸的外来体和根据权利要求24到28中任一项所获得的外来体的方法，其用于免疫调节。
30.一种根据权利要求24到29中任一项所述的方法获得的外来体，其用于治疗自身免疫疾病。
31.一种根据权利要求24到29中任一项所述的方法获得的外来体，其通过局部施用而用于治疗自身免疫疾病。
32.如权利要求31所述的外来体，其中所述外来体是使用关节注射，优选关节内注射或鼻内施加来施用。
33.一种根据权利要求24到29中任一项所述的方法获得的外来体，其通过全身施用而用于治疗自身免疫疾病。
34.一种氮胞苷或其它DNA去甲基化剂的用途，其在如权利要求24到28中任一项所述的方法中用于处理细胞培养物以增强所述细胞分泌外来体的能力。
35.一种氮胞苷或其它DNA去甲基化剂，其用于体内处理组织以增强其分泌关于如权利要求1到3中任一项所述的C19MC、miR-371-373和/或miR302-367簇的miRNA有所增多的外来体的能力。
36.一种诊断胚胎植入或精液样品授精的能力的方法，其包括分别在胚泡或胚胎的细胞培养基中或在精液中鉴别如权利要求1到3中任一项所述的C19MC簇和/或miR-371-373簇的至少一种miRNA。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述C19MC簇和/或所述miR-371-373簇的所述至少一种miRNA的水平与对照样品相比相当或有所增加指示所述胚胎植入或精液样品授精的能力正常或有所增强，且所述至少一种miRNA的水平与对照样品相比有所降低指示所述胚胎植入或精液样品授精的能力降低。
38.如权利要求36所述的方法，其中所述C19MC簇和/或所述miR-371-373簇的所述至少一种miRNA的存在指示所述胚胎植入或精液样品授精的能力正常或有所增强，且所述簇的所述至少一种miRNA的不存在指示所述胚胎植入或精液样品授精的能力降低。
miRNA在胎盘组织中的表达
技术领域
[0001] 本发明总体上涉及可用于免疫调节的结合分子，特别是与调节免疫系统相关或可用于调节免疫系统的人类miRNA以及其前体、衍生物、变体和模拟物。另外，本发明涉及包含所述结合分子、其前体和模拟物的药物和诊断组合物，所述组合物不仅在作为诊断工具用于鉴别与妊娠期间母体免疫系统的调节有关的转录单元的突变方面，而且在如妊娠相关疾病、胎盘形成障碍或问题、自身免疫疾病等与免疫系统误调节或过度活跃相关的病症的治疗策略中或在预防或治疗移植物对抗宿主的反应方面是有价值的。
背景技术
[0002] 为了成功怀孕，必需调节母体的免疫系统。已知胎盘的胚胎/胎儿部分，且确切地说是它的滋养层，能够产生可以通过与母体免疫系统局部地(即，在蜕膜内以及在外围)发生相互作用来预防胚胎排斥反应的因子。然而，免疫调节必须在早期妊娠期间就已经有效地发挥作用。在妊娠的前三个月，不少于30％到40％的蜕膜由母体免疫细胞组成，其中大部分(约70％)是NK细胞，但已知巨噬细胞和T细胞也以相当大的百分比存在(Warning等,2011)。
[0003] 尽管这些介导免疫调节的因子中有一些是已知的，但其它的仍然有待于鉴别。调节母体免疫系统的能力并不限于滋养层，胎儿基质细胞也能够与母体免疫系统的细胞进行有效的交谈(Roelen等,2009)。旨在鉴别负责母体免疫系统的调节的机制的实验似乎指示可溶性因子以及粒子在这个过程中起重要作用。其中后者是可以由多种细胞类型释放的外来体，即，小膜囊，且含有由蛋白质、脂质以及mRNA和miRNA组成的多样性货物蛋白(cargo)(Valadi等,2007)。在妊娠期间，滋养层的细胞可以分泌似乎会抑制母体免疫系统的外来体(Southcombe等,2011)。然而，不知道这种抑制实际上是如何实现的和其中究竟涉及哪些因子。这些因子的鉴别将为妊娠相关病症或妊娠期间的并发症领域内的治疗和诊断策略提供新的手段，并且可能也可用于治疗若干种与免疫系统失调或过度活跃相关的疾病。
发明内容
[0005] 本文中所提供的数据令人惊讶地突出了C19MC miRNA在早期妊娠和胎盘基质细胞中的早期功能。这个数据暗示C19MC以及miR-371-3簇的miRNA是重要的免疫调节剂。已经指定编码这两个簇的基因在染色体19的长臂上紧邻彼此(图1)。就本文中所提供的数
据而言，本发明总体上涉及提供用于免疫调节的C19MC以及miR-371-3簇的miRNA、其前体。
就此而言，也提供了共有共同种子序列AAGTGC的其它miRNA和能够干扰这些miRNA分子的
靶基因的基因表达的结合分子。此外，本发明提供了包含如上文和下文所定义的miRNA分子的核酸序列的核酸、载体和宿主细胞，其中所述核酸序列可操作地连接到调节序列，例如启动子、增强子，所述调节序列用于诱导和控制本发明的上述miRNA分子、其前体或其它结合分子在宿主细胞和/或患者中的表达。就此而言，本发明还提供了可用于治疗或诊断总体上与免疫系统失调有关联的病症(如同在自身免疫疾病、妊娠相关疾病、胎盘形成或植入障碍或问题的情况下)和治疗或预防同种异体移植物(植入物)的排斥反应或由于移植
物对抗宿主的反应所致的病症的药物组合物和诊断组合物。此外，本发明还提供了可用于处理被自身免疫疾病侵袭的细胞或者预防或处理例如自身免疫疾病情况下的自体组织破
坏现象的药剂。本发明所提供的和上述组合物中所使用的药剂是被设计用于不同的施用形式，如局部或全身施用。
附图说明
据而言，本发明总体上涉及提供用于免疫调节的C19MC以及miR-371-3簇的miRNA、其前体。
就此而言，也提供了共有共同种子序列AAGTGC的其它miRNA和能够干扰这些miRNA分子的
靶基因的基因表达的结合分子。此外，本发明提供了包含如上文和下文所定义的miRNA分子的核酸序列的核酸、载体和宿主细胞，其中所述核酸序列可操作地连接到调节序列，例如启动子、增强子，所述调节序列用于诱导和控制本发明的上述miRNA分子、其前体或其它结合分子在宿主细胞和/或患者中的表达。就此而言，本发明还提供了可用于治疗或诊断总体上与免疫系统失调有关联的病症(如同在自身免疫疾病、妊娠相关疾病、胎盘形成或植入障碍或问题的情况下)和治疗或预防同种异体移植物(植入物)的排斥反应或由于移植
物对抗宿主的反应所致的病症的药物组合物和诊断组合物。此外，本发明还提供了可用于处理被自身免疫疾病侵袭的细胞或者预防或处理例如自身免疫疾病情况下的自体组织破
坏现象的药剂。本发明所提供的和上述组合物中所使用的药剂是被设计用于不同的施用形式，如局部或全身施用。
附图说明
[0006] 图1：具有两个miRNA簇，即C19MC和miR-371-3的染色体区19q13的图解
[0007] 图2：52个胎盘组织中的miRNA miR-520c-3p的相对表达相对于妊娠周数的关系图。
[0008] 图3：绒膜绒毛的显微解剖图。首先从绒膜绒毛(A)切除基质核心(B)，然后切除滋养层(C)。
[0009] 图4：以下miRNA在基质和滋养层细胞中的相对表达：miR-371-3p、miR-372、miR-373和miR-520c-3p。
[0010] 图5：miR-520c-3p和miR-517a-3p在蜕膜和滋养层细胞中的相对表达。
[0011] 图6：说明靶向基因转录物的miRNA充当Fas-FasL诱导的细胞凋亡的抑制剂的的图解。已经根据miRBase(18发行版)鉴别了标靶。
[0012] 图7：分别在96小时和120小时利用BrdU测定在与JEG-3细胞和bAMC共培养的PBMC中所测量的细胞增殖。
[0013] 图8：分别在96小时和120小时利用BrdU测定在处于混合淋巴细胞反应中且用Con A刺激的单独PBMC中所测量的细胞增殖。
[0014] 图9：BC280723的基因组位置。
[0015] 图10：miR-517a-3p在经编码C19MC的BAC载体转染的牛羊膜源性细胞中在转染后24小时、48小时和6天时与模拟转染(mock transfected)细胞相比的相对表达。对于
24小时和6天，进行重复转染。
24小时和6天，进行重复转染。
[0016] 图11：(A)miR-520c-3p在HCT-116和JEG-3细胞中的相对表达(关于定量RT-PCR的描述，参见实施例1)。(B)分别经JEG-3细胞和HCT-116细胞的上清液处理的Jurkat细
胞中的c-FLIP的相对表达。
胞中的c-FLIP的相对表达。
具体实施方式
[0017] miR-371-373(371-3)簇仅含有7个miRNA，而C19MC是目前已知的最大的人类miRNA簇，总共有大约60种不同的miRNA(表1)。已经报告了C19MC的成员大量地表达
于胎盘的滋养层而不是基质部分中，且在妊娠期间的表达有所增加(Luo等,2009)。关于
miR371-373簇在胎盘中的表达，对其细节还是未知。
于胎盘的滋养层而不是基质部分中，且在妊娠期间的表达有所增加(Luo等,2009)。关于
miR371-373簇在胎盘中的表达，对其细节还是未知。
[0018] 然而，尚未将两个簇的miRNA作为可以调节母体免疫系统的候选物加以论述。反对它们与母体免疫调节有关的有力论据来自于现有文献。首先，C19MC簇成员的表达似乎限于滋养层(Luo等,2009)，但胎盘基质细胞已被描述为也具有免疫抑制功能(Roelen
等,2009)。其次，由C19MC簇的miRNA成员的表达增加(Luo等,2009)得出的结论是这些
miRNA的功能与妊娠晚期有相当大的关系。
等,2009)。其次，由C19MC簇的miRNA成员的表达增加(Luo等,2009)得出的结论是这些
miRNA的功能与妊娠晚期有相当大的关系。
[0019] 然而，与上文相反，本发明内所提供的数据突出了C19MCmiRNA在早期妊娠和胎盘基质细胞中的早期功能(参见实施例1到4)。就下文更详细描述的这些实验结果而言，与此同时提供了C19MC以及miR-371-3簇的miRNA作为母体免疫系统的重要调节剂。
[0020] 由于单一miRNA能够与超过一个标靶相互作用以及由于miR-371-3和C19MC簇(后者在甚至更大的程度上)中存在多种不同的miRNA，故miRNA的免疫调节功能可能基于
多种机制。仅作为一个实例，不希望受理论束缚，实施例8中已经描绘了促细胞凋亡功能，该实施例显示C19MC簇的成员与拮抗Fas-FasL诱导的细胞凋亡的不同mRNA相互作用。然
而，其它相关机制，包括诱导细胞衰老以及可逆细胞周期停滞和无反应性，可能也受miRNA影响。因此，关于这些发现的治疗意义，在本发明的一个实施方案中，使用本文中所描述的两个簇的单一miRNA、每单个簇的miRNA以及其不同的组合来满足所预期的治疗目的。
多种机制。仅作为一个实例，不希望受理论束缚，实施例8中已经描绘了促细胞凋亡功能，该实施例显示C19MC簇的成员与拮抗Fas-FasL诱导的细胞凋亡的不同mRNA相互作用。然
而，其它相关机制，包括诱导细胞衰老以及可逆细胞周期停滞和无反应性，可能也受miRNA影响。因此，关于这些发现的治疗意义，在本发明的一个实施方案中，使用本文中所描述的两个簇的单一miRNA、每单个簇的miRNA以及其不同的组合来满足所预期的治疗目的。
[0021] 表1：针对染色体带19q13指定的C19MC和miR371-3簇的miRNA(参考图1)。ID号依据miRBase18发行版(2011年11月)的条目；也参见Bentwich等,Nat
Genet.37(2005),766-770和Landgraf等,Cell129(2007),1401-1414。表中所列的miRNA
前体的序列可以获自相应miRNA的miRBase条目。
Genet.37(2005),766-770和Landgraf等,Cell129(2007),1401-1414。表中所列的miRNA
前体的序列可以获自相应miRNA的miRBase条目。
[0022]
[0023]
[0024]
[0025] 基于这个实验数据，本发明总体上涉及用于免疫调节的miRNA，其中所述miRNA是选自由如以上表1中所列的C19MC簇或miR-371-373簇中所包含的转录单元中的任一者编码的miRNA。
[0026] 在一个实施方案，本发明的上述miRNA是选自：具有SEQ ID Nos.:1到66的hsa-miR-498、hsa-miR-512-3p、hsa-miR-512-5p、hsa-miR-515-3p、hsa-miR-515-5p、hsa-miR-516a-3p、hsa-miR-516a-5p、hsa-miR-516b-3p、hsa-miR-516b-5p、
hsa-miR-517-5p、hsa-miR-517a-3p、hsa-miR-517b-3p、hsa-miR-517c-3p、
hsa-miR-518a-3p、hsa-miR-518a-5p、hsa-miR-518b、hsa-miR-518c-3p、hsa-miR-518c-5p、hsa-miR-518d-3p、hsa-miR-518d-5p、hsa-miR-518e-3p、hsa-miR-518e-5p、
hsa-miR-518f-3p、hsa-miR-518f-5p、hsa-miR-519a-3p、hsa-miR-519a-5p、
hsa-miR-519b-3p、hsa-miR-519b-5p、hsa-miR-519c-3p、hsa-miR-519c-5p、hsa-miR-519d、hsa-miR-519e-3p、hsa-miR-519e-5p、hsa-miR-520a-3p、hsa-miR-520a-5p、hsa-miR-520b、hsa-miR-520c-3p、hsa-miR-520c-5p、hsa-miR-520d-3p、hsa-miR-520d-5p、hsa-miR-520e、hsa-miR-520f、hsa-miR-520g、hsa-miR-520h、hsa-miR-521、hsa-miR-522-3p、
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hsa-miR-517-5p、hsa-miR-517a-3p、hsa-miR-517b-3p、hsa-miR-517c-3p、
hsa-miR-518a-3p、hsa-miR-518a-5p、hsa-miR-518b、hsa-miR-518c-3p、hsa-miR-518c-5p、hsa-miR-518d-3p、hsa-miR-518d-5p、hsa-miR-518e-3p、hsa-miR-518e-5p、
hsa-miR-518f-3p、hsa-miR-518f-5p、hsa-miR-519a-3p、hsa-miR-519a-5p、
hsa-miR-519b-3p、hsa-miR-519b-5p、hsa-miR-519c-3p、hsa-miR-519c-5p、hsa-miR-519d、hsa-miR-519e-3p、hsa-miR-519e-5p、hsa-miR-520a-3p、hsa-miR-520a-5p、hsa-miR-520b、hsa-miR-520c-3p、hsa-miR-520c-5p、hsa-miR-520d-3p、hsa-miR-520d-5p、hsa-miR-520e、hsa-miR-520f、hsa-miR-520g、hsa-miR-520h、hsa-miR-521、hsa-miR-522-3p、
hsa-miR-522-5p、hsa-miR-523-3p、hsa-miR-523-5p、hsa-miR-524-3p、hsa-miR-524-5p、hsa-miR-525-3p、hsa-miR-525-5p、hsa-miR-526a、hsa-miR-526b-3p、hsa-miR-526b-5p、hsa-miR-527、hsa-miR-1283、hsa-miR-1323、hsa-miR-371a-3p、hsa-miR-371a-5p、
hsa-miR-371b-3p、hsa-miR-371b-5p、hsa-miR-372、hsa-miR-373-3p、hsa-miR-373-5p。
[0027] 种子序列对于miRNA与mRNA的结合是必需的。如本发明中所提到的“种子序列”或“种子区”是主要位于miRNA5'端位置2-7处的保守七聚序列。纵使miRNA和其标靶mRNA的碱基配对不完全匹配，“种子序列”也必须完全互补。因此，本发明还涉及与由簇C19MC或miR-371-3所编码的miRNA具有共同种子序列的miRNA，其中所述miRNA：
[0028] a.)是选自具有SEQ ID No:67到78的hsa-miR-302a-3p、hsa-miR-302a-5p、hsa-miR-302b-3p、hsa-miR-302b-5p、hsa-miR-302c-3p、hsa-miR-302c-5p、
hsa-miR-302d-3p、hsa-miR-302d-5p；和/或
hsa-miR-302d-3p、hsa-miR-302d-5p；和/或
[0029] b.)以一致种子序列AAGTGC为特征。
[0030] 由 hsa-miR-302a-3p、hsa-miR-302a-5p、hsa-miR-302b-3p、hsa-miR-302b-5p、hsa-miR-302c-3p、hsa-miR-302c-5p、hsa-miR-302d-3p、hsa-miR-302d-5p组成的上述群组的miRNA和其前体是由簇miR302-367编码，其序列和登录号列于以下表2中。
[0031] 表2：具有与 由簇C19MC或miR-371-3所 编码 的miRNA的种 子序列 相同 的 种 子 序 列 AAGTGC的 簇miR302-367 的miRNA和 其 前 体；也 参 见 Landgraf等,Cell129(2007),1401-1414和Suh等,Dev Biol.270(2004),488-498
[0032]
[0033]
[0034] 如下文更详细说明，在细胞中由可能包含若干个成熟miRNA的序列的较长初级转录产物、前体RNA分子产生miRNA(Kim,Nature Rev.Mol.Cell Biol.6(2005),376-385)。因此，在一个实施方案中，本发明提供了包含如上文所定义的用于免疫调节的miRNA的核酸序列的miRNA前体。如果本文中未指示，则表1和表2中所指示的miRNA的相应miRNA前体的序列可以获自miRBase中的相应条目。
[0035] miRNA通过结合标靶基因的mRNA来调节基因表达。本领域中已知也可以利用其它结合分子靶向此区域，以实现正常情况下由miRNA诱导的调节作用。因此，在一个实施方案中，本发明涉及一种用于免疫调节的能够干扰如上文所定义的miRNA分子的标靶基因的基因表达的结合分子，其中所述结合分子是选自用于免疫调节的包含合成miRNA模拟物、RNA分子、抗体、适体、镜像异构体的分子群组。
[0036] 在一个实施方案中，本发明还提供了一种包含如上文所定义的miRNA或miRNA前体或结合分子的核酸序列的双链核酸。
[0037] 此外，在一个实施方案中，本发明提供一种或多种具有如上文所定义的序列的上文所定义的双链核酸，其中本发明的miRNA、前体miRNA和/或其它结合分子的编码核苷酸序列可操作地连接到至少一个表达控制序列。所述表达控制序列的实例为启动子、操纵子、增强子、沉默子序列、转录终止子、多聚腺苷酸化位点和本领域中已知的可用于表达本发明的miRNA、前体miRNA和/或其它结合分子的其它核酸序列。
[0038] 所述表达控制序列可以增强或下调可操作地连接的miRNA编码核苷酸序列的表达水平。取决于用于表达本发明的miRNA、前体miRNA和/或其它结合分子的编码核苷酸序列的细胞类型(例如原核生物或真核生物)或生物体，一个或若干个表达控制序列可以彼
此组合和/或与如本发明中所定义的编码双链核酸(核苷酸序列)的本发明的miRNA、前
体miRNA和/或其它结合分子中的一者或多者组合使用。也可以考虑到时间(即，发育阶
段)、细胞类型和/或总体情形来选择表达调节序列，例如一种或多种特定物质的存在和/或不存在，其中由如上文所定义的核苷酸序列所编码的miRNA和/或miRNA前体分子在可
操作地连接到多肽和/或肽编码核苷酸序列的所述调节序列允许其表达时因为满足了所
述条件中的一个或多个而得以表达，或在不满足允许表达的情形时未得以表达。
此组合和/或与如本发明中所定义的编码双链核酸(核苷酸序列)的本发明的miRNA、前
体miRNA和/或其它结合分子中的一者或多者组合使用。也可以考虑到时间(即，发育阶
段)、细胞类型和/或总体情形来选择表达调节序列，例如一种或多种特定物质的存在和/或不存在，其中由如上文所定义的核苷酸序列所编码的miRNA和/或miRNA前体分子在可
操作地连接到多肽和/或肽编码核苷酸序列的所述调节序列允许其表达时因为满足了所
述条件中的一个或多个而得以表达，或在不满足允许表达的情形时未得以表达。
[0039] 所使用的表达控制序列可以与如上文所定义的本发明的miRNA、前体miRNA和/或其它结合分子的本发明的编码核苷酸序列来源于同一生物体，或它们可以是外来的，即，在不同的分类学或系统发生学的意义上来源于另一种生物体。在一个实施方案中，本发明提供了一种包含多肽和/或肽编码核苷酸序列的核酸分子，其中至少一个表达控制序列相对于所述多肽和/或肽编码核苷酸序列是外来的。
[0040] 如根据本发明所采用的且编码本发明的上述miRNA、前体miRNA和/或其它结合分子的聚核苷酸可以是例如包含那些聚核苷酸中的单独任一者或其组合的DNA、cDNA、RNA或合成产生的DNA或RNA或重组产生的嵌合核酸分子。优选地，所述聚核苷酸可操作地连接于表达控制序列，从而允许在原核或真核细胞中表达。所述聚核苷酸的表达包括所述聚核苷酸转录成可翻译mRNA。将在本说明书下文中进一步描述说明本发明的聚核苷酸的表达的细节。
[0041] 就此而言，本发明在一个实施方案中提供了一种包含如上文所定义的双链核酸的载体。此外，在本发明的一个实施方案中，提供了包含所述载体的宿主细胞。在本发明的一个实施方案中，如上文和下文所定义的宿主细胞是人类细胞，优选其中所述细胞是选自患者自体细胞的群组。
[0042] 在另一个实施方案中，本发明涉及一种药物组合物或诊断剂，其包含至少一种如上文和下文所定义的miRNA、miRNA前体、结合分子、双链核酸、载体和/或宿主细胞作为药剂。
[0043] 在药物组合物或诊断剂的一个实施方案中，所述活性剂被包埋在人造外来体中(也参见实施例4)。
[0044] 在一个实施方案中，本发明提供了如上文所定义的miRNA、miRNA前体、结合分子或药物组合物，其用于治疗自身免疫疾病。
[0045] 在一个实施方案中，本发明涉及如上文所定义的用途，其中所述自身免疫疾病是选自包括以下的疾病群组：急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、斑秃、强直性脊椎炎、抗磷脂综合征(APS)、自身免疫性心肌病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病、自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)、自身免疫性周围神经病变、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性多内分泌腺病综合征、自身免疫性孕酮性皮炎、自身免疫性血小板减少性紫癜、自身免疫性荨麻疹、自身免疫性葡萄膜炎、乳糜泻、冷凝集素病、克罗恩病、皮肤肌炎、1型糖尿病、子宫内膜异位症、嗜酸性筋膜炎、胃肠道类天疱疮、古德帕斯彻氏综合征、格雷夫斯氏病、格林-巴利综合征(GBS)、桥本氏脑病、桥本氏甲状腺炎、特发性血小板减少性紫癜(自身免疫性血小板减少性紫癜)、红斑狼疮、米勒费雪综合征(格林-巴利综合征)、混合结缔组织病、重症肌无力、寻常天疱疮、恶性贫血、多肌炎、原发性胆汁性肝硬化、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、复发性多软骨炎、类风湿性关节炎、斯耶格伦氏综合征、颞动脉炎(“巨细胞性动脉炎”)、横贯性脊髓炎、溃疡性结肠炎、未分化结缔组织病(混合结缔组织病)、血管炎、韦格纳氏肉芽肿病。
[0046] 在另一个实施方案中，本发明提供了如上文所定义的miRNA、miRNA前体、结合分子、药物组合物或诊断剂，其用于治疗或诊断妊娠相关疾病。
[0047] 在用于治疗或诊断如上文所定义的妊娠相关疾病的一个实施方案中，所述妊娠相关疾病是选自由子痫、先兆子痫、HELLP综合征和胎盘形成或植入障碍或问题组成的疾病群组。子痫、先兆子痫和HELLP综合征都是本领域中已知与胎盘功能障碍相关的；参见例如Benedetto等,Adv Clin Chem53(2011),85-104。
[0048] “同种异体移植”在本文中定义为将来自于一个个体的器官、组织或细胞移植到属于同一物种的具有不同基因型的另一个个体。在所述移植的情况下，由于宿主免疫系统将移植物识别为外来物且针对该移植物发动免疫反应而经常会观察到排斥反应。因此，在移植同种异体移植物后需要进行免疫抑制治疗以减轻急性排斥反应。就此而言，在一个实施方案中，本发明提供了如上文所定义的miRNA、miRNA前体、结合分子、药物组合物以用于预防或治疗同种异体移植的排斥反应。由于同种异体移植物的排斥反应的预防和/或治疗都可以使用本发明的分子或组合物来进行，故可以在实际移植之前和/或之后，或考虑活生物体(例如人类患者)内部以及外部的治疗位置来使用这些分子/组合物以便避免和/或减轻同种异体移植的排斥反应。因此，在一个实施方案中，本发明提供如上文和下文所定义的miRNA、miRNA前体、结合分子、载体、药物组合物或诊断剂以用于离体和/或体内处理同种异体移植物。
[0049] 当在具有不同基因型的患者之间移植免疫感受态细胞时，例如在骨髓、干细胞移植或输血的情况下，发生排斥反应的一个具体形式，即“移植物对抗宿主的反应”。如果宿主具有供体移植物中缺乏的重要同种异体抗原，则所述宿主对于所述移植物呈现为外来的，且因此可能对其产生抗原性刺激。因此，在一个实施方案中，本发明还提供了如上文所定义的miRNA、miRNA前体、结合分子、药物组合物以用于预防或治疗移植物对抗宿主的反应。
[0050] 在另一个实施方案中，本发明提供如上文和下文所定义的miRNA、miRNA前体、结合分子、载体、药物组合物或诊断剂以用于离体和/或体内处理被自身免疫疾病侵袭的细胞或组织。此外，在一个实施方案中，本发明还提供了如上文和下文所定义的miRNA、miRNA前体、结合分子、载体、药物组合物或诊断剂以用于离体和/或体内处理自体细胞或组织。
[0051] 本发明还涉及可用于通过增加生物体对确定的细胞和/或组织的免疫反应和/或降低其免疫耐受性来调节免疫系统的方法、分子和组合物。确切地说，本发明还涉及用于癌症治疗的新方法、分子和组合物。对肿瘤抗原的遗传学和生物化学表征已经导致发现了大部分癌症患者对正在形成的赘生物发动某种形式的免疫反应。然而，临床上明显的疾病的形成和进展暗示内源性反应典型地不起作用。肿瘤细胞生物学的若干个特征促成了相对较弱的抗肿瘤反应。首先，因为肿瘤细胞来源于正常的非外来细胞，所以免疫系统可能不会将肿瘤细胞识别为危险的或外来的。其次，肿瘤细胞倾向于表达较少的身体活化免疫反应所依赖的受体和分子的补体。本发明涉及第三机制，即，癌细胞使用特定的miRNA来保护它们自身。
[0052] 有若干种刺激和强化抗肿瘤免疫力的方法，如针对特定肿瘤细胞抗原或全部肿瘤细胞的癌症疫苗、单克隆抗体、重组细胞因子和适应性细胞输注(Pandolfi等,2011)，然而,仍然需要这方面的新方法。本发明内所提供的数据突出了如上文所定义的特定miRNA和miRNA前体分子在调节免疫系统方面的重要作用，指示其也可能作为肿瘤疗法中的标靶。
[0053] 因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种针对如上文所定义的miRNA和/或miRNA前体的拮抗剂，所述拮抗剂是选自包含合成miRNA模拟物、RNA分子、抗体、适体、镜像异构体和小分子的分子群组，且用于治疗选自包括甲状腺肿瘤、乳腺癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌、生殖细胞肿瘤、肝细胞癌、白血病和淋巴瘤的群组的良性和恶性肿瘤。
[0054] 如上文所定义的miRNA、miRNA前体、结合分子、药物组合物或诊断剂可以以如本领域中已知的不同形式应用，且可以设计成不同的施用形式。在本发明的一个实施方案中，如上文所定义的miRNA、miRNA前体、结合分子、药物组合物或诊断剂被设计用于局部施用。然而，在另一个实施方案中，它们被设计用于全身施用。
[0055] 本发明还涉及用于从如细胞、组织、血液、吸出物、羊水和例如细胞或细胞培养物的上清液等生物样品中获得、产生、分离和/或纯化外来体的新颖方法和材料。用于分离和纯化外来体和其内含物(如miRNA)的一般方法在本领域中是已知的。另外，类似于或代替以下部分“外来体”中进一步提到的和WO99/03499、WO00/44389和WO97/05900中所
描述的方法，例如，可以利用超速离心法从生物样品分离外来体，且可以利用TRIZOL试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)根据由制造商提供的方案来纯化其内含物，即miRNA，并且在反转录成cDNA之后利用PCR使用特定miRNA引物进行鉴别，如Gallo等,(2012),PLoS
One.；7(3):e30679第4页到第5页上的子部分“外来体分离”和“RNA提取和反转录”中
所描述，所述文献的公开内容以引用的方式并入在此。可以如Gallo等,(2012)第5页上
的子部分“miRNA定量”中所描述进行miRNA定量，所述文献的公开内容以引用的方式并入在此。或者，可以利用如Norgen Biotek Corp(Thorold，CANADA)等若干个制造商提供的外来体RNA分离试剂盒来分离miRNA，例如用于从尿液和组织培养基分离和富集外来体的
Norgen尿液外来体RNA分离试剂盒(Norgen；目录号47200)，或用于根据供应商手册从血
浆、血清和腹水分离和富集外来体RNA的血浆/血清外来体RNA分离试剂盒(Norgen；目录
TM
号49200)。此外，可以使用如得自于Gentaur(Kampenhout，Belgium)的ExoQuick-TC 等
其它试剂盒代替超速离心法，根据供应商手册来分离外来体。
描述的方法，例如，可以利用超速离心法从生物样品分离外来体，且可以利用TRIZOL试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)根据由制造商提供的方案来纯化其内含物，即miRNA，并且在反转录成cDNA之后利用PCR使用特定miRNA引物进行鉴别，如Gallo等,(2012),PLoS
One.；7(3):e30679第4页到第5页上的子部分“外来体分离”和“RNA提取和反转录”中
所描述，所述文献的公开内容以引用的方式并入在此。可以如Gallo等,(2012)第5页上
的子部分“miRNA定量”中所描述进行miRNA定量，所述文献的公开内容以引用的方式并入在此。或者，可以利用如Norgen Biotek Corp(Thorold，CANADA)等若干个制造商提供的外来体RNA分离试剂盒来分离miRNA，例如用于从尿液和组织培养基分离和富集外来体的
Norgen尿液外来体RNA分离试剂盒(Norgen；目录号47200)，或用于根据供应商手册从血
浆、血清和腹水分离和富集外来体RNA的血浆/血清外来体RNA分离试剂盒(Norgen；目录
TM
号49200)。此外，可以使用如得自于Gentaur(Kampenhout，Belgium)的ExoQuick-TC 等
其它试剂盒代替超速离心法，根据供应商手册来分离外来体。
[0056] 这些经过富集的样品可以用于确定存在或不存在特定类型的外来体或确定哺乳动物(例如人类)内所存在的特定类型的外来体的量。特定类型的独特表达产物(如包
含外来体的样品内的miRNA)的存在或量可能指示所述哺乳动物患有特定疾病或病症。如
上文所指示，为了成功怀孕，必需调节母体免疫系统。下文进一步详细描述的实验结果指示特定的miRNA，如C19MC以及miR-371-3簇的miRNA，就是这种重要的母体免疫系统调节
剂。因而，如果外来体是从胚泡或胚胎的细胞培养基的上清液中分离的，则包含外来体的样品内的特定类型的这些miRNA的存在或量可以用于估计胚胎植入或精液样品授精的能
力。因此，本发明还涉及一种获得用于免疫调节的外来体的方法，包括从表达如上文和下文所定义的和如以上表1和表2中所列的C19MC簇、miR-371-373簇和/或miR302-367簇的
miRNA的胚胎或胎儿细胞的细胞培养物的上清液分离和纯化外来体。
含外来体的样品内的miRNA)的存在或量可能指示所述哺乳动物患有特定疾病或病症。如
上文所指示，为了成功怀孕，必需调节母体免疫系统。下文进一步详细描述的实验结果指示特定的miRNA，如C19MC以及miR-371-3簇的miRNA，就是这种重要的母体免疫系统调节
剂。因而，如果外来体是从胚泡或胚胎的细胞培养基的上清液中分离的，则包含外来体的样品内的特定类型的这些miRNA的存在或量可以用于估计胚胎植入或精液样品授精的能
力。因此，本发明还涉及一种获得用于免疫调节的外来体的方法，包括从表达如上文和下文所定义的和如以上表1和表2中所列的C19MC簇、miR-371-373簇和/或miR302-367簇的
miRNA的胚胎或胎儿细胞的细胞培养物的上清液分离和纯化外来体。
[0057] 利用本发明的方法，可以从不同细胞类型的细胞培养物分离外来体，包括与胚胎植入和发育相关的细胞类型。从生物样品分离、纯化和培养脐带、羊膜、胎盘和绒膜细胞的方法在本领域中是已知的，且描述于例如国际申请WO2005/001081、WO2000/073421、WO2002/046373和WO2003/042405中，所述国际申请的公开内容以引用的方式并入本文中，且可用于获得相关细胞培养物以便分离外来体。在本发明的一个实施方案中，提供了用于获得外来体的上述方法，其中所述细胞培养物是选自包括来自脐带、羊膜、胎盘和绒毛膜的细胞的细胞群组。
[0058] 此外，本发明涉及一种从生物样品中获得用于免疫调节的外来体的方法，包括以下步骤：由所述生物样品建立细胞培养物，收集所述细胞培养物的上清液，以及分离和纯化其外来体。
[0059] 用于获得外来体的生物样品可以从与具有所获得的外来体或其内含物的设想用于免疫调节治疗的那些具有相同基因背景的细胞、细胞培养物、组织、动物或人类患者，或从与设想用于治疗的那些具有不同基因背景的细胞、细胞培养物、组织、生物体、动物或人类患者分离。就此而言，在一个实施方案中，提供了从生物样品获得用于免疫调节的外来体的方法，其中所述生物样品包含自体细胞、组织样品或吸出物。在另一个实施方案中，提供了从生物样品获得用于免疫调节的外来体的方法，其中所述生物样品包含同种异体细胞、组织样品或吸出物。
[0060] 本发明还涉及一种用于体外产生包含如上文和下文所定义的miRNA、结合分子和/或双链核酸的外来体和根据上述方法获得的用于免疫调节的外来体的方法。用于产生人造外来体的方法在本领域中也是已知的。所述人造外来体可以来源于如De La 等,J.Immunol.Methods.344(2009),121-132中所描述的经涂布的脂质体。
[0061] 根据本发明的方法获得的外来体可用于对罹患若干种疾病和疾病类型的患者进行免疫调节。在本发明的一个实施方案中，提供了根据上述方法获得的外来体以用于治疗自身免疫疾病。
[0062] 关于特定疾病的治疗，可以对独特施用途径施用本发明的外来体，取决于效果是局部(“局部”施用)或是全身(“肠内”或“肠胃外”施用)的意图，且可以根据特定施用途径要求进行配制。因此，在本发明的一个实施方案中，提供了根据上述方法获得的准备通过局部施用而用于治疗自身免疫疾病的外来体。在本发明的另一个实施方案中，准备用于治疗自身免疫疾病的外来体是使用关节注射，优选关节内注射或鼻内施加进行施用。在本发明的另一个实施方案中，制备了根据上述方法获得的外来体以便通过全身施用而用于治疗自身免疫疾病。
[0063] 在分离外来体之前，从中分离外来体的细胞、组织、器官或动物可以经过基因工程改造以表达或过度表达特定的miRNA，如上述miRNA，和/或可能暴露于一种或多种药剂，如氮胞苷(5-氮杂-2'-脱氧胞苷)或其它DNA去甲基化剂，所述药剂还能够增强细
胞分泌外来体的能力(参见例如Xiao等,(2010)“Effect of5-aza-2'-deoxycytidine
on immune-associated proteins in exosomes from hepatoma”.World J
Gastroenterol.16,2371-2377)。暴露于所述药剂可以如Xiao等,(2010)第2372页上的
“材料和方法”部分的“细胞培养”子部分中关于氮胞苷所描述来进行，所述文献的公开内容以引用的方式并入在此。
胞分泌外来体的能力(参见例如Xiao等,(2010)“Effect of5-aza-2'-deoxycytidine
on immune-associated proteins in exosomes from hepatoma”.World J
Gastroenterol.16,2371-2377)。暴露于所述药剂可以如Xiao等,(2010)第2372页上的
“材料和方法”部分的“细胞培养”子部分中关于氮胞苷所描述来进行，所述文献的公开内容以引用的方式并入在此。
[0064] 因此，本发明还涉及氮胞苷或其它DNA去甲基化剂在获得或产生外来体的上述方法中用于处理细胞培养物以增强细胞分泌外来体的能力的用途。
[0065] 此外，本发明还涉及氮胞苷或其它DNA去甲基化剂，所述氮胞苷或其它DNA去甲基化剂是用于体内处理组织以增强其分泌关于如上文和下文所定义的以及表1和表2中所列的C19MC、miR-371-373和/或miR302-367簇的miRNA有所增多的外来体的能力。
[0066] 如上文所指示，包含外来体的样品内的特定类型的这些miRNA的存在或量可以用于估计胚胎的植入能力。就此而言，例如，可以分离相应细胞培养基的上清液并分析如以上表1中所定义的miR-371-3和C19MC簇的miRNA的存在和量。然后，这项分析的结果可以用于估计胚胎的植入概率。
[0067] 因此，本发明还涉及一种诊断胚胎植入或精液样品授精的能力的方法，所述方法包括分别在胚泡或胚胎的细胞培养基中或在精液中鉴别如上文和下文所定义的以及表1中所列的C19MC簇和/或miR-371-373簇的至少一种miRNA。
[0068] 在本发明的一个实施方案中，提供了如上文所定义的诊断方法，其中如本文中所定义的和表1中所列的C19MC簇和/或miR-371-373簇的至少一种miRNA的水平与对照样品相比相当或有所增加指示所述胚胎植入或精液样品授精的能力正常或有所增强，且所述至少一种miRNA的水平与对照样品相比有所降低指示所述胚胎植入或精液样品授精的能
力降低。
力降低。
[0069] 如上文所定义的诊断方法，其中如本文所定义的和表1中所列的C19MC簇和/或所述miR-371-373簇的至少一种miRNA的存在指示所述胚胎植入或精液样品授精的能力正
常或有所增强，且所述簇的至少一种miRNA的不存在指示所述胚胎植入或精液样品授精的能力降低。
常或有所增强，且所述簇的至少一种miRNA的不存在指示所述胚胎植入或精液样品授精的能力降低。
[0070] 定义和实施方案：
[0071] 应注意，术语“一个”或“一种”实体是指一个或多个所述实体；举例来说，“一种多肽”应理解为表示一种或多种多肽。因而，术语“一个”(或“一种”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可以互换使用。
[0072] 除非另外说明，否则术语“病症”和“疾病”在本文中可互换使用。
[0073] “受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”意指需要诊断、预后、预防或治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者，例如人类患者。
[0074] 如本发明中所使用的术语“miRNA”(miRNA)涉及非蛋白质编码RNA，如同大部分天然存在的miRNA，其可以包含13-35、18-25或21-24个核苷酸，总体上介于约19到约25个核苷酸之间，优选为约22个核苷酸，所述miRNA指导标靶转录物在转运中裂解，从而负调节各种调节和发育路径所涉及的基因的表达(Bartel DP.,Cell116(2004),281-297；
He 和 Hannon,Nat.Rev.Genet.5(2004),522-531 ；Lagos-Quintana
等,Science294(2001),853-858；Ambros V.,Cell,113(2003),673-676)。成熟miRNA的碱基2-8在本文中定义为“miRNA种子序列”。标靶RNA序列与miRNA种子序列之间的6到8
个bp的完全互补性是miRNA标靶识别的主要决定因素。Younger和Corey,Nucleic Acids
Res.39(2011),5682-5691。举例来说，Lewis等,Cell115(2003),787-798；John等,PLoS Biol2(11):e363(2004)中论述了对结合识别位点的成熟miRNA的序列要求和用于预测与
给定序列结合的miRNA的方法
He 和 Hannon,Nat.Rev.Genet.5(2004),522-531 ；Lagos-Quintana
等,Science294(2001),853-858；Ambros V.,Cell,113(2003),673-676)。成熟miRNA的碱基2-8在本文中定义为“miRNA种子序列”。标靶RNA序列与miRNA种子序列之间的6到8
个bp的完全互补性是miRNA标靶识别的主要决定因素。Younger和Corey,Nucleic Acids
Res.39(2011),5682-5691。举例来说，Lewis等,Cell115(2003),787-798；John等,PLoS Biol2(11):e363(2004)中论述了对结合识别位点的成熟miRNA的序列要求和用于预测与
给定序列结合的miRNA的方法
[0075] 已经鉴别了一些miRNA基因(MIR基因)，且公众可以在数据库中获得(“miRBase”，可在microrna.sanger.ac.uk/sequences在线获得)。其它MIR基因和成
熟miRNA也描述于美国专利申请公布2005/0120415中。已经报告了MIR基因存在于基
因内区域中，呈经分离形式和基因组中的簇形式，但也可以完全或部分位于其它基因(蛋白质编码基因和非蛋白质编码基因)的内含子内(Saini等,Proc Natl Acad Sci U S
A104(2007),17719-17724)。关于miRNA生物合成的最近回顾，参见Kim VN.,Nature Rev.Mol.Cell Biol.6(2005),376-385。至少在一些情况下，MIR基因的转录可以受MIR基因
自身的启动子促进性控制。然后，转录或许总体上由RNA聚合酶II介导(Lee等,Embo
J23(2004),4051-4060)。初级转录物(它可以是多顺反子)称为“pri-miRNA”，即可
能相当大(数千个碱基)的miRNA前体分子，且含有一个或多个局部双链或“发夹”区
域以及mRNA的常用5'“帽”和多聚腺苷酸化尾。参见例如Kim,Nature Rev.Mol.Cell
Biol.6(2005),376-385中的图1。相信这种pri-miRNA被核RNase III Drosha“截短”以
产生称为“pre-miRNA”的较短(约70个核苷酸)的miRNA前体分子。在利用Drosha进行
核处理之后，将pre-miRNA输出到核中，其中酶Dicer产生较短的成熟miRNA。参见例如Lee等,EMBO Journal21(2002),4663-4670；Reinhart等,Genes&Dev.,16(2002):1616-1626；
Lund 等 ,Science303(2004),95-98； 以 及 Millar 和 Waterhouse,Funct.Integr
Genomics5(2005),129-135。因而，可以从RNA(例如成熟miRNA或miRNA前体RNA分子的
RNA序列)的角度或从DNA(例如对应于成熟miRNA的DNA序列、RNA序列或编码MIR基因
或MIR基因片段或miRNA前体的DNA序列)的角度描述miRNA。
熟miRNA也描述于美国专利申请公布2005/0120415中。已经报告了MIR基因存在于基
因内区域中，呈经分离形式和基因组中的簇形式，但也可以完全或部分位于其它基因(蛋白质编码基因和非蛋白质编码基因)的内含子内(Saini等,Proc Natl Acad Sci U S
A104(2007),17719-17724)。关于miRNA生物合成的最近回顾，参见Kim VN.,Nature Rev.Mol.Cell Biol.6(2005),376-385。至少在一些情况下，MIR基因的转录可以受MIR基因
自身的启动子促进性控制。然后，转录或许总体上由RNA聚合酶II介导(Lee等,Embo
J23(2004),4051-4060)。初级转录物(它可以是多顺反子)称为“pri-miRNA”，即可
能相当大(数千个碱基)的miRNA前体分子，且含有一个或多个局部双链或“发夹”区
域以及mRNA的常用5'“帽”和多聚腺苷酸化尾。参见例如Kim,Nature Rev.Mol.Cell
Biol.6(2005),376-385中的图1。相信这种pri-miRNA被核RNase III Drosha“截短”以
产生称为“pre-miRNA”的较短(约70个核苷酸)的miRNA前体分子。在利用Drosha进行
核处理之后，将pre-miRNA输出到核中，其中酶Dicer产生较短的成熟miRNA。参见例如Lee等,EMBO Journal21(2002),4663-4670；Reinhart等,Genes&Dev.,16(2002):1616-1626；
Lund 等 ,Science303(2004),95-98； 以 及 Millar 和 Waterhouse,Funct.Integr
Genomics5(2005),129-135。因而，可以从RNA(例如成熟miRNA或miRNA前体RNA分子的
RNA序列)的角度或从DNA(例如对应于成熟miRNA的DNA序列、RNA序列或编码MIR基因
或MIR基因片段或miRNA前体的DNA序列)的角度描述miRNA。
[0076] MIR基因家族似乎大量存在，估计占至少一些基因组的1％且能够影响或调节所有基因中约三分之一的表达(参见例如Tomari等,Cu rr.Biol.,15(2005),R61-64；
Tang G.,Trends Biochem.Sci.,30(2005),106-14；Kim Nature Rev.Mol.Cell
Biol.,6(2005),376-385)。miRNA涉及例如细胞分化、增殖和凋亡的调节，且或许涉及
至少一些疾病的病理学，包括癌症，其中miRNA可能不同地充当致癌基因或肿瘤抑制
剂。 参 见 例 如O'Donnell等,Nature435(2005),839-843；C ai等,Proc.Natl.Acad.
Sci.USA,102(2005),5570-5575；Morris 和 McManus(2005)Sci.STKE,pe41( 可 在 stke.sciencemag.org/cgi/r eprint/sigtrans；2005/297/pe41.pdf在线获得)。miRNA(MIR)
基因具有鉴别特征，包括植物物种间保守性、稳定回折结构和利用类Dicer酶处理特
定miRNA/miRNA*双螺旋(Ambros等,(2003)RNA,9:277-279)。这些特征已经通过利用
可鉴别进化保存型miRNA基因的系统计算方法补充分子克隆，通过检索后生动物miRNA
发夹前体特有的序列模式和二级结构保守性而用于鉴别miRNA和其对应基因(Ambros
等 ,Curr.Biol.,13(2003),807-818；Grad 等 ,Mol.Cell11(2003),1253-1263；Lai
等,Curr.Biol.13(2003),R925-R936；Lim等,Scie nce299(2003),1540和Lim等,Genes
Dev.,17(2003),991-1008)。公众可获得的miRNA基因被录入miRBase(Griffiths-Jones
等,(2003)Nucleic Acids Res.,31:439-441)。根据本发明，术语“miRNA前体”可互换地指成熟miRNA的所有前体形式，即，pri-miRNA和pre-miRNA。
Tang G.,Trends Biochem.Sci.,30(2005),106-14；Kim Nature Rev.Mol.Cell
Biol.,6(2005),376-385)。miRNA涉及例如细胞分化、增殖和凋亡的调节，且或许涉及
至少一些疾病的病理学，包括癌症，其中miRNA可能不同地充当致癌基因或肿瘤抑制
剂。 参 见 例 如O'Donnell等,Nature435(2005),839-843；C ai等,Proc.Natl.Acad.
Sci.USA,102(2005),5570-5575；Morris 和 McManus(2005)Sci.STKE,pe41( 可 在 stke.sciencemag.org/cgi/r eprint/sigtrans；2005/297/pe41.pdf在线获得)。miRNA(MIR)
基因具有鉴别特征，包括植物物种间保守性、稳定回折结构和利用类Dicer酶处理特
定miRNA/miRNA*双螺旋(Ambros等,(2003)RNA,9:277-279)。这些特征已经通过利用
可鉴别进化保存型miRNA基因的系统计算方法补充分子克隆，通过检索后生动物miRNA
发夹前体特有的序列模式和二级结构保守性而用于鉴别miRNA和其对应基因(Ambros
等 ,Curr.Biol.,13(2003),807-818；Grad 等 ,Mol.Cell11(2003),1253-1263；Lai
等,Curr.Biol.13(2003),R925-R936；Lim等,Scie nce299(2003),1540和Lim等,Genes
Dev.,17(2003),991-1008)。公众可获得的miRNA基因被录入miRBase(Griffiths-Jones
等,(2003)Nucleic Acids Res.,31:439-441)。根据本发明，术语“miRNA前体”可互换地指成熟miRNA的所有前体形式，即，pri-miRNA和pre-miRNA。
[0077] 已经确认了mRNA的所有区域，包括5'非翻译区、编码区和3'非翻译区中的miRNA识别位点，表明miRNA靶位点相对于编码序列的位置可能未必影响抑制(参见例
如 Rhoades 等 ,(2002)Cell,110:513-520；Yekta 等 ,Science304(2004), 第 594-596页；Davis 等 ,Curr.Biol.,15(2005),743-749；Lewis 等 ,Cell115(2003),787-798；
Lewis 等 ,Cell120(2005),15-20；Baek 等 ,Nature455(2008),64-71； 和 Selbach
等,Nature455(2008),58-63)。
如 Rhoades 等 ,(2002)Cell,110:513-520；Yekta 等 ,Science304(2004), 第 594-596页；Davis 等 ,Curr.Biol.,15(2005),743-749；Lewis 等 ,Cell115(2003),787-798；
Lewis 等 ,Cell120(2005),15-20；Baek 等 ,Nature455(2008),64-71； 和 Selbach
等,Nature455(2008),58-63)。
[0078] mRNA与miRNA之间的结合不必是完美的，已经观察到一些错配对miRNA效能无任何影响。就此而言，实验验证的miRNA靶位点指示miRNA的5'端倾向于具有
比其3'端更多的与标靶互补的碱基(Moss等,Cell88(1997),637-646；Johnston和
Hobert,Nature426(2003),845-849；John等,PLoS Biol2(11):e363(2004))。因此，作为本发明的miRNA，可能提到由与SEQ ID.NO1到66和68、69、71、72、74、75、77和78中的任一者的核苷酸序列具有80％或更大同一性的核苷酸序列组成的miRNA，优选由具有90％或更大同一性、更优选具有95％或更大同一性的核苷酸序列组成的miRNA，且称为其变体。
比其3'端更多的与标靶互补的碱基(Moss等,Cell88(1997),637-646；Johnston和
Hobert,Nature426(2003),845-849；John等,PLoS Biol2(11):e363(2004))。因此，作为本发明的miRNA，可能提到由与SEQ ID.NO1到66和68、69、71、72、74、75、77和78中的任一者的核苷酸序列具有80％或更大同一性的核苷酸序列组成的miRNA，优选由具有90％或更大同一性、更优选具有95％或更大同一性的核苷酸序列组成的miRNA，且称为其变体。
[0079] 作为本发明的前体miRNA，可能提到由与具有表1中所指示的本发明的相应miRNA分子条目内如miRBase中所指示的SEQ ID.NO1到66和SEQ ID No:67、70、73或76的任一前体miRNA的核苷酸序列具有80％或更大同一性的核苷酸序列组成的前体miRNA，优选由
具有90％或更大同一性、更优选具有95％或更大同一性的核苷酸序列组成的miRNA，且称为其变体。
具有90％或更大同一性、更优选具有95％或更大同一性的核苷酸序列组成的miRNA，且称为其变体。
[0080] 所述变体还可以是在严格条件下与参考核苷酸序列、其互补序列或基本上与其同一的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。如本领域技术人员应了解，对单链的描绘也定义了互补链的序列。因而，核酸也涵盖所描绘的单链的互补链。如本领域技术人员应了解，核酸的许多变体可以用于与给定核酸相同的目的。因而，核酸也涵盖基本上同一的核酸和其互补序列。如本领域技术人员还应了解，单链提供针对可能在严格杂交条件下与标靶序列杂交的探针的探针。因而，核酸也涵盖可在严格杂交条件下杂交的探针。
[0081] 如本文中所使用的“探针”可能意指能够经由一种或多种类型的化学键，通常经由互补碱基配对，通常经由氢键形成结合互补序列的标靶核酸的寡核苷酸。取决于杂交条件的严格度，探针可以结合与探针序列缺乏完全互补性的标靶序列。可能有许多碱基对错配，所述碱基对错配将干扰标靶序列与本发明的单链核酸之间的杂交。然而，如果突变数目过大以致于即使在最低严格度杂交条件下也不发生杂交，则所述序列不是互补的标靶序列。
[0082] 本文中所使用的“严格杂交条件”可以意指第一核酸序列(例如探针)将与第二核酸序列(例如标靶)(如呈复杂核酸混合物形式)杂交，但不与其它序列杂交的条件。严
格条件是序列依赖性的且在不同的情形下将不同。总体上，严格条件选择为比特定序列在所定义的离子强度pH值下的热熔点(Tm)低约5℃到10℃.。Tm可以是50％的与标靶互补
的探针在平衡状态下与标靶序列杂交(在标靶序列过量存在时，在Tm下，50％的探针在平衡状态下被占据)的温度(在所定义的离子强度、pH值和核酸浓度下)。严格条件可以是
在pH7.0到8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子，典型地为约0.01到1.0M钠离子浓度(或其
它盐)，且温度是至少约30℃(对于短探针，例如约10到50个核苷酸)和至少约60℃(对
于长探针，例如大于约50个核苷酸)的条件。严格条件还可以在加入如甲酰胺等去稳定剂的情况下实现。对于选择性或特异性杂交，正信号可以是背景杂交的至少2到10倍。示范性严格杂交条件包括以下：50％甲酰胺，5×SSC和1％SDS，在42℃下孵育；或5×SSC，1％SDS，在65℃下孵育，在0.2×SSC和0.1％SDS中在65℃下洗涤。
格条件是序列依赖性的且在不同的情形下将不同。总体上，严格条件选择为比特定序列在所定义的离子强度pH值下的热熔点(Tm)低约5℃到10℃.。Tm可以是50％的与标靶互补
的探针在平衡状态下与标靶序列杂交(在标靶序列过量存在时，在Tm下，50％的探针在平衡状态下被占据)的温度(在所定义的离子强度、pH值和核酸浓度下)。严格条件可以是
在pH7.0到8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子，典型地为约0.01到1.0M钠离子浓度(或其
它盐)，且温度是至少约30℃(对于短探针，例如约10到50个核苷酸)和至少约60℃(对
于长探针，例如大于约50个核苷酸)的条件。严格条件还可以在加入如甲酰胺等去稳定剂的情况下实现。对于选择性或特异性杂交，正信号可以是背景杂交的至少2到10倍。示范性严格杂交条件包括以下：50％甲酰胺，5×SSC和1％SDS，在42℃下孵育；或5×SSC，1％SDS，在65℃下孵育，在0.2×SSC和0.1％SDS中在65℃下洗涤。
[0083] 本文中所使用的“基本上互补”可以意指第一序列与第二序列的互补序列在具有8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50或更多个核苷酸的区域上具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性，或两个序列可在严格杂交条件下杂交。
[0084] 本文中所使用的“基本上同一”可以意指第一序列与第二序列在具有8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50或更多个核苷酸或氨基酸的区域上具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性，或就核酸而言，意指所述第一序列与所述第二序列的互补序列基本上互补。
[0085] 如本文中所使用，术语“结合分子”是指特异性结合相关标靶的任何试剂(例如肽、蛋白质、核酸聚合物、适体、镜像异构体或小分子)。在一个特定的优选实施方案中，术语“结合分子”在本发明的意义上包含合成miRNA模拟物、RNA分子、抗体、适体、镜像异构体和siRNA、miRNA或其变体的经修饰变体。所述变体可以化学合成，且对于RNA沉默相关过程而言可能具有许多优点。这些修饰中的一些可以帮助防止miRNA相关分子降解，如
2'-o-甲基、2'-o-烯丙基、2'-脱氧-氟尿苷修饰或硫代磷酸酯。其它修饰还可以帮助增加miRNA相关分子对其标靶的亲和力或减少其脱靶效应，如锁核酸修饰，其中亚甲桥连接核糖环的2'-氧与4'-碳。其它修饰可以增强siRNA或miRNA的正确链在AGO复合物中的负载
(Hammell CM.,RNA Biol.5(2008),123-127)，如通过向双链miRNA/miRNA*复合物的一个链加入5'磷酸酯或甲基(miRNA*是由所述前体中的对侧臂产生的miRNA配体链)。
2'-o-甲基、2'-o-烯丙基、2'-脱氧-氟尿苷修饰或硫代磷酸酯。其它修饰还可以帮助增加miRNA相关分子对其标靶的亲和力或减少其脱靶效应，如锁核酸修饰，其中亚甲桥连接核糖环的2'-氧与4'-碳。其它修饰可以增强siRNA或miRNA的正确链在AGO复合物中的负载
(Hammell CM.,RNA Biol.5(2008),123-127)，如通过向双链miRNA/miRNA*复合物的一个链加入5'磷酸酯或甲基(miRNA*是由所述前体中的对侧臂产生的miRNA配体链)。
[0086] 相关标靶在本文中定义为如上文所定义的本发明miRNA分子的识别位点，优选在核酸内，最优选为pre-mRNA或mRNA分子。所述干扰标靶核酸的功能的总体作用是特异性调节所述基因的表达。在本发明的上下文中，“调节”意指增加(刺激)或减少(抑制)基
因的表达。在本发明的上下文中，特别是关于“免疫调节”时，抑制是调节基因表达的优选形式。因为具有与miRNA5'末端侧上的核苷酸2到8(种子序列)互补的核苷酸序列的mRNA
的翻译受miRNA抑制(Current Biology,15,R458-R460(2005))，所以可以提出与本发明的miRNA的种子序列互补的核苷酸序列作为本发明的miRNA或结合分子的标靶核苷酸序列。
因的表达。在本发明的上下文中，特别是关于“免疫调节”时，抑制是调节基因表达的优选形式。因为具有与miRNA5'末端侧上的核苷酸2到8(种子序列)互补的核苷酸序列的mRNA
的翻译受miRNA抑制(Current Biology,15,R458-R460(2005))，所以可以提出与本发明的miRNA的种子序列互补的核苷酸序列作为本发明的miRNA或结合分子的标靶核苷酸序列。
[0087] “miRNA模拟物”是非天然双链miRNA样的RNA片段。它们经过设计以具有携带与标靶基因所独有的3'UTR中的所选序列部分互补的基元的5'端。引入到细胞中
后，miRNA模拟物就可以特异性结合其标靶基因且产生所述基因的转录后抑制，更具体
地说，产生翻译抑制。不同于可以一次靶向若干个基因的内源性miRNA，miR模拟物以基
因特异性方式起作用(Wang,Methods Mol Biol.676(2011),211-223；Xiao等,J Cell
Physiol212(2007),285-292)。
后，miRNA模拟物就可以特异性结合其标靶基因且产生所述基因的转录后抑制，更具体
地说，产生翻译抑制。不同于可以一次靶向若干个基因的内源性miRNA，miR模拟物以基
因特异性方式起作用(Wang,Methods Mol Biol.676(2011),211-223；Xiao等,J Cell
Physiol212(2007),285-292)。
[0088] 如本文中所使用，术语“适体”是指基于与具有高亲和力特异性(基于与标靶分子的非沃森-克里克相互作用)的其它分子结合的能力选自随机池的DNA或RNA分子(参见例如Cox和Ellington,Bioorg.Med.Chem.9(2001),2525-2531；Lee等,Nuc.Acids
Res.32(2004),D95-D100)。可以选择结合核酸、蛋白质、小有机化合物、维生素、无机化合物、细胞和甚至整个生物体的适体。
Res.32(2004),D95-D100)。可以选择结合核酸、蛋白质、小有机化合物、维生素、无机化合物、细胞和甚至整个生物体的适体。
[0089] 本发明的肽和适体是利用任何合适的方法来合成。举例来说，本发明的靶向肽和适体可以利用固相肽合成法化学合成。举例来说，以下文献描述了用于固相合成的技
术：Barany 和 Merrifield(1979)Solid-Phase Peptide Synthesis；The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology,(Gross.和Meinehofer编),Academic,New York,第2卷,第
1-284 页 ,Special Methods in Peptide Synthesis,Part A.；Merrifield,J.Am.Chem.Soc,85(1963),2149-2154；以及Stewart和Young(1984)Solid Phase Peptide Synthesis,第2版,Pierce Chem.Co.,Rockford,Illinois。
术：Barany 和 Merrifield(1979)Solid-Phase Peptide Synthesis；The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology,(Gross.和Meinehofer编),Academic,New York,第2卷,第
1-284 页 ,Special Methods in Peptide Synthesis,Part A.；Merrifield,J.Am.Chem.Soc,85(1963),2149-2154；以及Stewart和Young(1984)Solid Phase Peptide Synthesis,第2版,Pierce Chem.Co.,Rockford,Illinois。
[0090] 镜像异构体是对标靶或其部分显示结合活性的包含许多L-核苷酸的核酸。产生镜像异构体的基本方法以国际专利申请WO1998/008856为准，所述国际专利申请的公开内容以引用的方式并入本文中。大体上，这种方法依赖于如例如US5,475,096中所描述的所谓的SELEX技术。所述方法使用包括随机化延伸物的组合DNA或RNA库，所述随机化延伸
物具有通过5'和3'端的两个引物结合区侧接的约10到约100个核苷酸。所述组合库的
产生描述于例如Conrad等,Methods Enzymol.,267(1996),336-367中。这种化学合成的
单链DNA库可以经由聚合酶链反应转变成双链库。
物具有通过5'和3'端的两个引物结合区侧接的约10到约100个核苷酸。所述组合库的
产生描述于例如Conrad等,Methods Enzymol.,267(1996),336-367中。这种化学合成的
单链DNA库可以经由聚合酶链反应转变成双链库。
[0091] 这种库可能已经用于选择目的。发生选择，使得典型地为单链的库与标靶分子接触，然后扩增所述库的结合元件。通过将这些步骤重复若干次，可以产生对所使用的标靶具有显著结合活性的寡核苷酸分子。
[0092] 利用现有技术程序产生“抗体”，例如，如Tijssen(Tijssen,P.,Practice and theory of enzyme immunoassays,11,Elsevier Science Publishers B.V.,Amsterdam，全书，尤其是第43-78页)所描述。除完整抗体以外，本发明的抗体还可以以多种形式存在；包括例如F(ab')片段、F(ab)片段和F(ab')2片段或任何其它抗原结合片段以及单链；参
见例如国际申请WO88/09344、WO2005/003169、WO2005/003170和WO2005/003171。
见例如国际申请WO88/09344、WO2005/003169、WO2005/003170和WO2005/003171。
[0093] 可以根据本发明使用的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，含有特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。本发明的免疫球蛋白分子可以属于免疫球蛋白分子的任何类别(例如IgG、IgE、IgM、IgD或IgA)或子类。
[0094] 聚核苷酸：
[0095] 术语“聚核苷酸”打算涵盖单个核酸以及多个核酸，并且是指分离的核酸分子或构筑体，例如信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。聚核苷酸可以包含常规磷酸二酯键或非常规键(例如酰胺键，如肽核酸(PNA)中发现的酰胺键)。术语“核酸”或“双链核酸”是指聚核苷酸中所存在的任何一个或多个核酸链段，例如DNA或RNA片段，其优选地包含编码本发明的至少一种miRNA分子的序列。“分离”的核酸或聚核苷酸打算为已经从其天然环境中去除的核酸分子、DNA或RNA。举例来说，考虑分离载体中所含有的编码至少一种miRNA或抗体的重组聚核苷酸以用于本发明的目的。分离的聚核苷酸的其它实例包括维持于溶液中的异源性宿主细胞或经纯化(部分或基本上)聚核苷酸中的重组聚核苷酸。分离的RNA分子包括本发明聚核苷酸的体内或体外RNA转录物。根据本发明的分离的聚核苷酸或核酸还包括合成产生的所述分子。另外，聚核苷酸或核酸可以是或可以包括调节元件，如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。
[0096] 如本文中所使用，“编码区”是由翻译成氨基酸或包含功能RNA(如tRNA、rRNA、催化RNA、miRNA分子前体、miRNA、siRNA和反义RNA)的序列的密码子组成的核酸的一部分。尽管“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)未翻译成氨基酸，但可以被视为编码区的一部分，但任何侧接序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子等等，不是编码区的一部分。此区别当然不是指从这种序列中的原始基因座中提取的编码miRNA的序列，例如，蛋白质编码基因的内含子序列，而是指本发明的聚核苷酸构筑体中的序列的功能。编码区还可以是对应于任选地包含与其连接的5'或3'未翻译序列的编码区的mRNA或cDNA(例如外
显子和miRNA)。编码区还可以是体外产生的经扩增核酸分子，其包含全部或一部分编码区和/或与其连接的5'或3'未翻译序列。
显子和miRNA)。编码区还可以是体外产生的经扩增核酸分子，其包含全部或一部分编码区和/或与其连接的5'或3'未翻译序列。
[0097] 本发明的两个或更多个编码区可以存在于单一聚核苷酸构筑体中，例如存在于单一载体上或存在于单独的聚核苷酸构筑体中，例如存在于单独的(不同的)载体上。此外，任何载体可以含有单一编码区，或可以包含两个或更多个编码区，例如单一载体可以单独地编码免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区。另外，本发明的载体、聚核苷酸或核酸可以编码异源性编码区，所述编码区融合或未融合到编码结合分子的核酸、抗体或其片段、变体或衍生物。异源性编码区包括而不限于特化元件或基元，如分泌信号肽或异源性功能域。
[0098] 在某些实施方案中，聚核苷酸或核酸是DNA。在DNA的情况下，包含在正常情况下编码miRNA或多肽的核酸的聚核苷酸可以包括可操作地与一个或多个编码区缔合的启动子和/或其它转录或翻译控制元件。当基因产物(例如多肽)的编码区与一个或多个调
节序列以在调节序列的影响或控制下安置基因产物的表达的方式缔合时，存在可操作的缔合。如果诱导启动子功能导致编码所希望的基因产物的mRNA的转录，且如果两个DNA片段之间的键合的性质不干扰表达调节序列引导基因产物表达的能力或不干扰DNA模板转录
的能力，则两个DNA片段(如miRNA/多肽编码区和与其缔合的启动子)是“可操作地缔合”或“可操作地连接”。因而，如果启动子能够实现该核酸的转录，则启动子区将可操作地与编码miRNA/多肽的核酸缔合。启动子可以是仅引导预定细胞中的DNA的实质性转录的细胞
特异性启动子。除了启动子以外，其它转录控制元件，例如增强子、操纵子、阻遏子和转录终止信号，也可以可操作地与聚核苷酸缔合以引导细胞特异性转录。本文中公开了合适的启动子和其它转录控制区。
节序列以在调节序列的影响或控制下安置基因产物的表达的方式缔合时，存在可操作的缔合。如果诱导启动子功能导致编码所希望的基因产物的mRNA的转录，且如果两个DNA片段之间的键合的性质不干扰表达调节序列引导基因产物表达的能力或不干扰DNA模板转录
的能力，则两个DNA片段(如miRNA/多肽编码区和与其缔合的启动子)是“可操作地缔合”或“可操作地连接”。因而，如果启动子能够实现该核酸的转录，则启动子区将可操作地与编码miRNA/多肽的核酸缔合。启动子可以是仅引导预定细胞中的DNA的实质性转录的细胞
特异性启动子。除了启动子以外，其它转录控制元件，例如增强子、操纵子、阻遏子和转录终止信号，也可以可操作地与聚核苷酸缔合以引导细胞特异性转录。本文中公开了合适的启动子和其它转录控制区。
[0099] 本领域技术人员已知多种转录控制区。这些转录控制区包括而不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，如但不限于来自于巨细胞病毒(立即早期启动子，连同内含子A)、猿猴病毒40(早期启动子)和反向病毒(如劳氏肉瘤病毒)的启动子和增强子链段。其它转录控制区包括来源于脊椎动物基因的转录控制区，如肌动蛋白、热激蛋白、牛生长激素和兔β-球蛋白，以及真核细胞中能够控制基因表达的其它序列。其它合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及淋巴因子可诱导性启动子(例如干扰素或白介素
可诱导性启动子)。
可诱导性启动子)。
[0100] 类似地，本领域技术人员已知多种翻译控制元件。这些翻译控制元件包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子以及来源于小核糖核酸病毒的元件(特别是内部核糖体进入位点或IRES，也称为CITE序列)。
[0101] 在一个特别优选的实施方案中，本发明的聚核苷酸是RNA，例如呈信使RNA(mRNA)、miRNA(miRNA)、miRNA前体、小发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)或任何其它RNA产物形式。
[0102] 分子的相似性和/或同一性的测定：
[0103] 两种肽之间的“相似性”是通过比较一种肽的氨基酸序列与第二肽的序列来确定。如果它是同一的或是保守氨基酸取代，则一种肽的氨基酸类似于第二肽的对
应氨基酸。保守取代包括Dayhoff,M.O.编,The Atlas of Protein Sequence and
Structure5,National Biomedic al Research Foundation,Washington,D.C.(1978) 和
Argos,EMBO J.8(1989),779-785中所描述的保守取代。举例来说，属于以下群组之一的氨基酸表示保守变化或取代：-Ala、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Thr；-Cys、Ser、Tyr、Thr；-Val、Ile、Leu、Met、Ala、Phe；-Lys、Arg、His；-Phe、Tyr、Trp、His；和-Asp、Glu。
应氨基酸。保守取代包括Dayhoff,M.O.编,The Atlas of Protein Sequence and
Structure5,National Biomedic al Research Foundation,Washington,D.C.(1978) 和
Argos,EMBO J.8(1989),779-785中所描述的保守取代。举例来说，属于以下群组之一的氨基酸表示保守变化或取代：-Ala、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Thr；-Cys、Ser、Tyr、Thr；-Val、Ile、Leu、Met、Ala、Phe；-Lys、Arg、His；-Phe、Tyr、Trp、His；和-Asp、Glu。
[0104] 两个序列之间的同一性或相似性百分比的确定优选使用Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA90:5873-5877的数学算法来实现。将这种算
法并入可在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cge)获得的Altschul
等,(1990)J.Mol.Biol.215:403-410的BLASTn和BLASTp程序中。
法并入可在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cge)获得的Altschul
等,(1990)J.Mol.Biol.215:403-410的BLASTn和BLASTp程序中。
[0105] 同一性或相似性百分比的确定是利用如NCBI网页上和“BLAST ProgramSelection Guide”中关于特定长度和组成的序列所推荐的BLASTn和BLASTp程序标准参数来进行。
[0106] 利用BLASTn程序进行BLAST聚核苷酸检索。
[0107] 关于一般参数，如NCBI网页上关于短序列(少于20个碱基)所推荐，“Max Target Sequences”框可以设定为100，“Short queries”框可以打勾，“Expect threshold”框可以设定为1000，且“Word Size”框可以设定为7。对于较长序列，“Expect threshold”框可以设定为10且“Word Size”框可以设定为11。关于评分参数，“Match/mismatch Scores”可以设定为1,-2，且“Gap Costs”框可以设定为线性。对于筛选程序和屏蔽参数，“Low complexity regions”框不可以打勾，“Species-specific repeats”框不可以打勾，“Mask for lookup table only”框可以打勾，“DUST Filter Settings”可以打勾且“Mask lower case letters”框不可以打勾。总体上，在这方面可以使用“Search for short nearly exact matches”，由此提供大部分上文所指示的设定。这方面的其它信息可以在NCBI网页上公布的“BLAST Program Selection Guide”中获得。
[0108] 利用BLASTp程序进行BLAST蛋白质检索。对于一般参数，“Max TargetSequences”框可以设定为100，“Short queries”框可以打勾，“Expect threshold”框可以设定为10，且“Word Size”框可以设定为“3”。关于评分参数，“Matrix”框可以设定为“BLOSUM62”，“Gap Costs”框可以设定为“Existence:11Extension:1”，“Compositional adjustments”框可以设定为“Conditional compositional score matrix adjustment”。
关于筛选程序和屏蔽参数，“Low complexity regions”框不可以打勾，“Mask for lookup table only”框不可以打勾，且“Mask lower case letters”框不可以打勾。
关于筛选程序和屏蔽参数，“Low complexity regions”框不可以打勾，“Mask for lookup table only”框不可以打勾，且“Mask lower case letters”框不可以打勾。
[0110] 疾病和病症：
[0111] 除非另外说明，否则术语“病症”和“疾病”在本文中可互换使用。
[0112] 如本文中所使用的术语“自身免疫病症”是由个体自身的组织或器官或其共分离或表现引起的且针对个体自身的组织或器官或其共分离或表现的疾病或病症或由此引起的病状。自身免疫疾病主要由适应性免疫反应的失调引起，且形成针对自身结构的自身抗体或自身反应性T细胞。几乎所有的自身免疫疾病也具有发炎性要素。自身发炎性疾病主要是发炎性的，且一些经典的自身发炎性疾病是由固有发炎性路径中的遗传缺陷引起。在自身发炎性疾病中，未发现自身反应性T细胞或自身抗体。在许多的这些自身免疫和自身发炎性病症中，可能存在许多临床和实验室标记物，包括但不限于高丙种球蛋白血症、高水平的自身抗体、组织中的抗原抗体复合物沉积物、来自于皮质类固醇或免疫抑制治疗的益处和受影响组织中的淋巴样细胞聚集物。不受关于B细胞介导的自身免疫病症的理论束
缚，人们相信B细胞在人类自身免疫疾病中经由众多机制路径显示病原性作用，包括自身抗体产生、抗原抗体复合物形成、树状细胞和T细胞活化、细胞因子合成、直接趋化因子释放以及为异位新淋巴生成提供孳生地。这些路径各自可以不同程度地参与自身免疫疾病的病理学。
缚，人们相信B细胞在人类自身免疫疾病中经由众多机制路径显示病原性作用，包括自身抗体产生、抗原抗体复合物形成、树状细胞和T细胞活化、细胞因子合成、直接趋化因子释放以及为异位新淋巴生成提供孳生地。这些路径各自可以不同程度地参与自身免疫疾病的病理学。
[0113] 如本文中所使用，“自身免疫病症”可以是器官特异性疾病(即，免疫反应特异性针对如内分泌系统、造血系统、皮肤、心肺系统、胃肠和肝脏系统、肾系统、甲状腺、耳、神经肌肉系统、中枢神经系统等器官系统)或可能影响多个器官系统的全身疾病(例如全身性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎、多肌炎、自身免疫多腺病综合征等)。优选所述疾病包括急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、斑秃、强直性脊椎炎、抗磷脂综合征(APS)、自身免疫性心肌病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病、自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)、自身免疫性周围神经病变、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性多内分泌腺病综合征、自身免疫性孕酮性皮炎、自身免疫性血小板减少性紫癜、自身免疫性荨麻疹、自身免疫性葡萄膜炎、乳糜泻、冷凝集素病、克罗恩病、皮肤肌炎、1型糖尿病、子宫内膜异位症、嗜酸性筋膜炎、胃肠道类天疱疮、古德帕斯彻氏综合征、格雷夫斯氏病、格林-巴利综合征(GBS)、桥本氏脑病、桥本氏甲状腺炎、特发性血小板减少性紫癜(自身免疫性血小板减少性紫癜)、红斑狼疮、米勒费雪综合征(格林-巴利综合征)、混合结缔组织病、重症肌无力、寻常天疱疮、恶性贫血、多肌炎、原发性胆汁性肝硬化、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、复发性多软骨炎、类风湿性关节炎、斯耶格伦氏综合征、颞动脉炎(“巨细胞性动脉炎”)、横贯性脊髓炎、溃疡性结肠炎、未分化结缔组织病(混合结缔组织病)、血管炎、韦格纳氏肉芽肿病。
[0114] 治疗和药物：
[0115] 如本文中所使用，术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防治性措施，其中目标在于防止或减缓(减轻)不希望的生理变化或病症，如自身免疫性和/或自身发炎性疾病的发展。有益的或所希望的临床结果包括但不限于症状减轻、疾病程度减小、病况稳定(即，不恶化)、疾病进展延迟或减缓、病况改善或减轻和症状缓解(不论是部分或是完全)，不论是可检测的还是不可检测的。“治疗”还可能意指与未接受治疗的情况下所预期的存活时间相比延长存活时间。需要治疗的包括已经患有所述病状或病症的，以及倾向于患有所述病状或病症的，或预防所述病状或病症体现的。
[0116] 如果未另外陈述，则术语“药物”、“医药”或“药剂”在本文中可互换使用，且将包括但不限于所有以下各项：(A)打算用于诊断、治愈、缓解、治疗或预防人或其它动物的疾病的内用或外用物品、医药和制剂以及任何物质或物质混合物；和(B)打算影响人或其它动物的身体结构或任何功能的物品、医药和制剂(食物除外)；和(C)打算用作条款(A)和(B)中所规定的任何物品的组分的物品。术语“药物”、“医药”或“药剂”应包括打算用于人或其它动物的制剂的完整配方，其含有一种或多种“试剂”、“化合物”、“物质”或“(化学)组合物”且在一些其它情形下还含有其它药学上非活性的赋形剂，如填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、粘合剂，或确保所述“药物”、“医药”或“药剂”在人或其它动物体内的预定标靶位置上(例如皮肤上、胃或肠中)容易运输、崩解、解聚、溶解和生物可用性。术语“试剂”、“化合物”或“物质”在本文中可互换使用，且在更特定的情形下，应包括但不限于所有药理学活性剂，即，可诱导所希望的生物学或药理学作用的药剂，且利用本发明的方法研究或测试诱导所述可能的药理学作用的能力。
[0117] 如根据本发明所使用的术语“免疫调节”是指通过增强(免疫增强)或降低(免疫抑制)免疫系统产生抗体或致敏细胞的能力来改变免疫反应，所述抗体或致敏细胞可识别引发其产生的抗原且与该抗原反应。本领域中已知若干种适用于免疫调节的物质，例如皮质类固醇、细胞毒性剂、胸腺素和免疫球蛋白。
[0118] 药物载剂：
[0119] 药学上可接受的载剂和施用途径可以由本领域技术人员已知的相应文献中获得。本发明的药物组合物可以根据本领域中众所周知的方法进行配制；参见例如
Remington:The Science and Practice of Pharmacy(2000),University of Sciences
in Philadelphia,ISBN0-683-306472,Vaccine Protocols.第2版,Robinson等,Humana
Press,Totowa,New Jersey,USA,2003；Banga,Therapeutic Peptides and Protein
s:Formulation,Processing,and Delivery Systems. 第 2 版 ,Taylor 和 Francis.
(2006),ISBN:0-8493-1630-8。合适的药物载剂的实例在本领域中众所周知，且包括磷酸盐缓冲生理盐水溶液、水、乳液(如油/水乳液)、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。可以利用众所周知的常规方法配制包含所述载剂的组合物。这些药物组合物可以以合适的剂
量施用于受试者。可以利用不同的方式实现合适的组合物的施用。实例包括经由口服、鼻内、直肠、局部、腹膜内、静脉内、肌肉内、皮下、真皮下、经真皮、鞘内和颅内方法施用含有药学上可接受的载剂的组合物。如鼻喷雾制剂等气雾剂制剂包括含防腐剂和等渗剂的经纯
化的活性剂水溶液或其它溶液。优选将所述制剂调节到与鼻粘膜相容的pH值和等渗状
TM
态。本发明中也设想了用于口服施用的药物组合物，如单域抗体分子(例如“纳米抗体 ”)等。所述口服制剂可以呈片剂、胶囊剂、粉剂、液体或半固体形式。片剂可以包含固体载剂，如明胶或佐剂。用于直肠或阴道施用的制剂可以呈具有合适的载剂的栓剂形式；也参见
O'Hagan等,Nature Reviews,Drug Discovery2(9)(2003),727-735。关于适合各种施用类型的制剂的进一步指导可以在Remington's Pharmaceutical Sciences,Mace Publishing Company,Philadelphia,PA,第17版(1985)和相应的更新中获得。关于药物递送方法的简
单回顾，参见Langer,Science249(1990),1527-1533。
Remington:The Science and Practice of Pharmacy(2000),University of Sciences
in Philadelphia,ISBN0-683-306472,Vaccine Protocols.第2版,Robinson等,Humana
Press,Totowa,New Jersey,USA,2003；Banga,Therapeutic Peptides and Protein
s:Formulation,Processing,and Delivery Systems. 第 2 版 ,Taylor 和 Francis.
(2006),ISBN:0-8493-1630-8。合适的药物载剂的实例在本领域中众所周知，且包括磷酸盐缓冲生理盐水溶液、水、乳液(如油/水乳液)、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。可以利用众所周知的常规方法配制包含所述载剂的组合物。这些药物组合物可以以合适的剂
量施用于受试者。可以利用不同的方式实现合适的组合物的施用。实例包括经由口服、鼻内、直肠、局部、腹膜内、静脉内、肌肉内、皮下、真皮下、经真皮、鞘内和颅内方法施用含有药学上可接受的载剂的组合物。如鼻喷雾制剂等气雾剂制剂包括含防腐剂和等渗剂的经纯
化的活性剂水溶液或其它溶液。优选将所述制剂调节到与鼻粘膜相容的pH值和等渗状
TM
态。本发明中也设想了用于口服施用的药物组合物，如单域抗体分子(例如“纳米抗体 ”)等。所述口服制剂可以呈片剂、胶囊剂、粉剂、液体或半固体形式。片剂可以包含固体载剂，如明胶或佐剂。用于直肠或阴道施用的制剂可以呈具有合适的载剂的栓剂形式；也参见
O'Hagan等,Nature Reviews,Drug Discovery2(9)(2003),727-735。关于适合各种施用类型的制剂的进一步指导可以在Remington's Pharmaceutical Sciences,Mace Publishing Company,Philadelphia,PA,第17版(1985)和相应的更新中获得。关于药物递送方法的简
单回顾，参见Langer,Science249(1990),1527-1533。
[0120] 报告了未经修饰的裸反义分子被细胞不良地内在化，不论它们是否带负电(Grey等,Biochem.Pharmacol.53(1997).1465-1476；Stein等 ,Biochemistry32(1993),4855-4861；Bennet等,Mol.Pharmacol.41(1992),1023-1033)。因此，寡核苷酸可以经其它试剂修饰或与其它试剂一起用于组合物中，所述其它试剂为如脂质载剂(Fattal等,Adv.Drug Deliv.Rev.56(2004),931-946)、微粒(Khan等,J.Drug Target12(2004),393-404)、如外来体等囊泡(参见实施例4)，或通过与细胞穿透肽(CPP)共价结合从而允许反义分子位移
通过细胞膜；关于综述，参见Lysik和Wu-Pong,J.Pharm.Sci.92(2003),1559-1573。
通过细胞膜；关于综述，参见Lysik和Wu-Pong,J.Pharm.Sci.92(2003),1559-1573。
[0121] 外来体：
[0122] 在这方面也可以使用囊泡或外来体。“外来体”是在晚期核内体多囊泡体与质膜融合之后细胞外环境中所分泌的来源于核内体的约30-100nm的囊泡(Garin
等,J Cell Biol152(2001),165-180)。来自于各种组织类型的细胞已经显示可分泌
外来体，例如树状细胞、B淋巴细胞、肿瘤细胞和肥大细胞。来自于不同起源的外来体
展现蛋白质和脂质部分的离散集(J Thery等,Cell Biol147(1999),599-610；Thery
等,J Immunol166(2001),7309-7318)。它们显著地含有涉及抗原呈递和免疫调节的
蛋白质，表明外来体在细胞-细胞通讯中起作用(Simons和Raposo,Curr.Opin.Cell
Biol.21(2009),575-581；Thery等,Nat.Rev.Immunol.9(2009),581-593)，从而调节免疫反应。举例来说，WO99/03499、WO00/44389和WO97/05900中已经描述了产生、纯化或使用外来体用于治疗目的或作为研究工具的方法，所述国际公布的公开内容以引用的方式并入本文中。此外，用于产生人造外来体的方法在本领域中也是已知的。所述人造核内体可以来源于如De La 等,J Immunol Methods.344(2009),121-132中所描述的经涂布的脂
质体。
等,J Cell Biol152(2001),165-180)。来自于各种组织类型的细胞已经显示可分泌
外来体，例如树状细胞、B淋巴细胞、肿瘤细胞和肥大细胞。来自于不同起源的外来体
展现蛋白质和脂质部分的离散集(J Thery等,Cell Biol147(1999),599-610；Thery
等,J Immunol166(2001),7309-7318)。它们显著地含有涉及抗原呈递和免疫调节的
蛋白质，表明外来体在细胞-细胞通讯中起作用(Simons和Raposo,Curr.Opin.Cell
Biol.21(2009),575-581；Thery等,Nat.Rev.Immunol.9(2009),581-593)，从而调节免疫反应。举例来说，WO99/03499、WO00/44389和WO97/05900中已经描述了产生、纯化或使用外来体用于治疗目的或作为研究工具的方法，所述国际公布的公开内容以引用的方式并入本文中。此外，用于产生人造外来体的方法在本领域中也是已知的。所述人造核内体可以来源于如De La 等,J Immunol Methods.344(2009),121-132中所描述的经涂布的脂
质体。
[0123] 考虑到它们的免疫原性和治疗性，将特别可用于能够修饰外来体的内含物以便改变它们的性质。在这方面，本领域中已经描述了重组外来体，所述重组外来体来源
于经编码重组蛋白质的质粒转染的细胞。所述重组外来体含有质粒编码的重组蛋白质
(WO00/28001)。
于经编码重组蛋白质的质粒转染的细胞。所述重组外来体含有质粒编码的重组蛋白质
(WO00/28001)。
[0124] 表达：
[0125] 如本文中所使用的术语“表达”是指基因产生生物化学物质(例如RNA、miRNA或多肽)的过程。所述过程包括基因的功能存在在细胞内的任何体现，包括而不限于基因敲落以及瞬时表达和稳定表达。它包括而不限于基因转录成信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、小发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)或任何其它RNA产物，和所述mRNA翻译成多肽。如果所希望的最终产物是生物化学物质，则表达包括产生该生物化学物质和任何前体。基因的表达产生“基因产物”。如本文中所使用，基因产物可以是核酸，例如miRNA(miRNA)、通过基因转录产生的信使RNA或由转录物翻译的多肽。本文中所描述的基因产物还包括具有转录后修饰(例如多聚腺苷酸化)的核酸，或具有翻译后修饰(例如甲基化、糖基化、加入脂质、与其它蛋白质亚单位缔合、蛋白水解裂解等等)的多肽。
[0126] 可以利用多种表达载体/宿主系统来含有和表达聚核苷酸序列。这些系统包括但不限于微生物，如经重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化的细菌；经酵母表达载体转化的酵母；经病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；经病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病毒TMV)或经细菌表达载体(例如Ti或pBR322质粒)
转化的植物细胞系统；动物或人类细胞系统。
转化的植物细胞系统；动物或人类细胞系统。
[0127] 为了在宿主细胞中表达miRNA、肽、多肽或融合蛋白(下文中称为“产物”)，可以使用如以下程序等程序。可以将含有编码所述产物的DNA序列的限制片段克隆到含有在宿主细胞中起作用的复制起点和适当可选标记物的适当重组质粒中。所述质粒可以包括
用于产物的可诱导表达的启动子(例如pTrc(Amann等,Gene69(1988),301315)和pETl
Id(Studier 等 ,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology185,Academic
Press,San Diego,Calif.(1990),6089)。可以通过例如电穿孔将所述重组质粒引入到宿主细胞中，且可以通过选择所述质粒上的标记物来鉴别含有所述重组质粒的细胞。可以使用产物特异性测定在宿主细胞中诱导和检测所述产物的表达。
用于产物的可诱导表达的启动子(例如pTrc(Amann等,Gene69(1988),301315)和pETl
Id(Studier 等 ,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology185,Academic
Press,San Diego,Calif.(1990),6089)。可以通过例如电穿孔将所述重组质粒引入到宿主细胞中，且可以通过选择所述质粒上的标记物来鉴别含有所述重组质粒的细胞。可以使用产物特异性测定在宿主细胞中诱导和检测所述产物的表达。
[0128] 在一些实施方案中，可以优化编码所述产物/miRNA/多肽的DNA以便在宿主细胞中表达。举例来说，所述DNA可以包括针对一个或多个氨基酸的密码子，所述密码子在宿主细胞中相对于针对相同氨基酸的其它密码子占优势。
[0129] 可诱导启动子的一个实例是最小启动子的组合，如无上游增强子序列(来自于原始CMV启动子的从+75到-53的序列；参见Gossen和Bujard,Proc Natl Acad Sci U SA.89(1992),5547-5551)的CMV启动子与抗四环素性操纵子序列启动子，所述启动子在不
同的四环素/多西环素浓度存在下显示浓度依赖性活性。未经修饰的CMV启动子可以用于
组成性表达。
同的四环素/多西环素浓度存在下显示浓度依赖性活性。未经修饰的CMV启动子可以用于
组成性表达。
[0130] 使用可诱导启动子可以降低RNA累积或过饱和在表达miRNA的细胞中的细胞毒性。或者，根据本发明，可以使用能够一致地表达预定miRNA效应因子持续一定时间段的组成性表达系统。优选地，利用CMV启动子驱动miRNA或其类似物的表达，所述CMV启动子经常在约一个月活化之后由于DNA甲基化而在人类细胞中沉默。所述一个月活化机制可能因防止经处理的细胞中的RNA累积或过饱和而为有益的。
[0131] 在人类细胞中表达核酸组合物的miRNA的递送可以使用选自以下群组的非转基因方法或转基因方法来实现：脂质体/聚核糖体/化学转染、DNA重组、电穿孔、基因枪穿透、转座子/反转座子插入、跳跃基因整合、微量注射、病毒感染、逆转录病毒/慢病毒感染和其组合。为了防止随机转基因插入和细胞突变的风险，可以使用脂质体或聚核糖体转染将包含miRNA序列的载体递送到所靶向的人类细胞(例如患者的自体细胞)中。在一个特
别优选的实施方案中，可以使用人造外来体；在这方面参见实施例4。所选至少一种miRNA、其前体、变体或类似物的表达取决于所选启动子，且可以是例如组成性的、可诱导的或暂时性的。
别优选的实施方案中，可以使用人造外来体；在这方面参见实施例4。所选至少一种miRNA、其前体、变体或类似物的表达取决于所选启动子，且可以是例如组成性的、可诱导的或暂时性的。
[0132] 本发明还涉及包含本发明的核酸与任何或所有以下各项的试剂盒：测定试剂、缓冲液、探针和/或引物，和无菌生理盐水或另一种药学上可接受的载剂。另外，所述试剂盒可以包括含有用于实施本发明方法的指导(例如方案)的说明材料。
[0133] 本发明的描述和实施例公开且涵盖了这些和其它实施方案。关于根据本发明采用的材料、方法、用途和化合物中的任一者的其它文献可以使用例如电子装置从公众图书馆和数据库中检索。举例来说，可以利用公众数据库“Medline”，该数据库由国家卫生研究所的国家生物技术信息中心和/或国家医学图书馆主办。本领域技术人员已知其它数据库和网址，如作为欧洲分子生物学实验室(EMBL)的一部分的欧洲生物信息研究所(EBI)，并且还可以使用国际互联网检索引擎获得。Berks,TIBTECH12(1994),352-364中给出了生物技术专利信息的概述以及可用于回溯检索和最新情报通报的相关专利信息来源的纵览。
[0134] 以上公开内容总体上描述了本发明。除非另外说明，否则对如本文中所使用的术语给予如Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology,Oxford
University Press,1997,2000年修订和2003年再版,ISBN0198506732中所提供的定义。在本说明书全文中引用了若干个文献。可以在说明书结尾、紧靠权利要求书之前发现完整的书目引用。所有引用参考文献的内容(包括如本申请全文中引用的参考文献书目、已颁布专利、公布的专利申请和制造商技术规范、说明书等)明确以引用的方式并入在此；然而，不承认所引用的任何文献实际上为本发明的现有技术。
University Press,1997,2000年修订和2003年再版,ISBN0198506732中所提供的定义。在本说明书全文中引用了若干个文献。可以在说明书结尾、紧靠权利要求书之前发现完整的书目引用。所有引用参考文献的内容(包括如本申请全文中引用的参考文献书目、已颁布专利、公布的专利申请和制造商技术规范、说明书等)明确以引用的方式并入在此；然而，不承认所引用的任何文献实际上为本发明的现有技术。
[0135] 可以参考本文中仅出于说明目的而提供且不打算限制本发明的范围的以下具体实施例来获得更全面的理解。
[0136] 实施例
[0137] 以下实施例进一步说明本发明，但不应被视为以任何方式限制本发明的范围。关于miRNA基因簇、如胎盘样品中所鉴别的个别miRNA基因和这些miRNA、其前体、变体和类似物用于治疗和诊断若干种与免疫反应失调(例如在妊娠期间)相关的疾病的新用途说明和描述实施例1到12中的以下实验；在这方面也参见图和表1到3。
[0138] 实施例1：miR-520c-3p在胎盘组织中相对于妊娠周数的关系相对表达
[0139] 材料和方法
[0140] RNA分离
[0141] 从52份用福尔马林固定并用石蜡包埋(FFPE)的来自于在妊娠第7周和第33周之间发生的自发性流产和人工流产的胎盘组织中分离总RNA。使用innuPREP Micro RNA试剂盒(Analytik Jena AG，Jena，Germany)根据制造商说明书进行RNA分离，对FFPE组织进行以下修饰：通过在得自于innuPREP DNA Micro试剂盒(Analytik Jena)的TLS溶解溶液
和蛋白酶K中将石蜡切片在60℃下孵育1小时且在80℃下孵育15分钟来溶解所述切片。
和蛋白酶K中将石蜡切片在60℃下孵育1小时且在80℃下孵育15分钟来溶解所述切片。
[0142] 反转录和实时PCR
[0143] 利用得自于TaqMan microRNA Assays(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)的TaqMan microRNA反转录试剂盒和RT引物，根据制造商说明书，使用200ng总RNA来产生miR-520c和RNU6B特异性cDNA(其充当相对定量的内部对照；CGCAAGGATGACACGC
AAATTCGTGAAGCGTTCCATATTTTT SEQ ID NO79)。将反应物在热循环仪中在16℃下孵育30
分钟，在42℃下孵育30分钟，且在85℃下孵育5分钟。使用TaqMan microRNA Assays和
TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)中所包括的miRNA特异性探针和引物建立实时PCR反应。将反应物在96孔板中在95℃下孵育
10分钟，随后在95℃下孵育15秒×40个循环，且在60℃下孵育1分钟。所有反应都在
Applied Biosystems7300快速实时PCR系统上重复运作三次。使用ΔΔCt方法(Livak
und Schmittgen,2001)计算相对定量(RQ)。RNU6B充当标准化的内源性对照。
AAATTCGTGAAGCGTTCCATATTTTT SEQ ID NO79)。将反应物在热循环仪中在16℃下孵育30
分钟，在42℃下孵育30分钟，且在85℃下孵育5分钟。使用TaqMan microRNA Assays和
TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)中所包括的miRNA特异性探针和引物建立实时PCR反应。将反应物在96孔板中在95℃下孵育
10分钟，随后在95℃下孵育15秒×40个循环，且在60℃下孵育1分钟。所有反应都在
Applied Biosystems7300快速实时PCR系统上重复运作三次。使用ΔΔCt方法(Livak
und Schmittgen,2001)计算相对定量(RQ)。RNU6B充当标准化的内源性对照。
[0144] 结果
[0145] 绘制miR-520c-3p的相对表达相对于妊娠周数的关系图(图2)。数据指示miR-520c-3p的表达随着妊娠进展稍微减少，这与阐述染色体19miRNA的表达随着妊娠进
展而增加的Luo等(2009)所述相反。
展而增加的Luo等(2009)所述相反。
[0146] 参考文献
[0147] Livak,K.J. 和 T.D.Schmittgen(2001).“Analysis of relative geneexpression data using real-time quantitative PCR and the2(-Delta Delta C(T))
Method”.Methods25(4):402-408。
Method”.Methods25(4):402-408。
[0148] Luo,S.S.,O.Ishibashi等,(2009).“Human villous trophoblasts express and secrete placenta-specific microRNAs into maternal circulation via exosomes”.Biol Reprod81(4):717-729。
[0149] 实施例2：miR-371-3p、miR-372和miR-373的相对表达与胎盘组织中的miR-520c-3p的关系
[0150] 材料和方法
[0151] RNA分离
[0152] 从52份用福尔马林固定并用石蜡包埋的(FFPE)的得自于自发性流产和人工流产的胎盘组织中分离总RNA。使用innuPREP Micro RNA试剂盒(Analytik Jena AG，Jena，
Germany)根据制造商说明书进行RNA分离，对FFPE组织进行以下修饰：通过在得自于
innuPREP DNA Micro试剂盒(Analytik Jena)的TLS溶解溶液和蛋白酶K中将石蜡切片在
60℃下孵育1小时且在80℃下孵育15分钟来溶解所述切片。
Germany)根据制造商说明书进行RNA分离，对FFPE组织进行以下修饰：通过在得自于
innuPREP DNA Micro试剂盒(Analytik Jena)的TLS溶解溶液和蛋白酶K中将石蜡切片在
60℃下孵育1小时且在80℃下孵育15分钟来溶解所述切片。
[0153] 反转录和实时PCR
[0154] 利用得自于TaqMan microRNA Assays(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)的TaqMan microRNA反转录试剂盒和RT引物，根据制造商说明书，使用200ng总RNA来产生miR-520c、miR-371-3p、miR-372、miR-373和RNU6B特异性cDNA(其充当相对定量
的内部对照)。将反应物在热循环仪中在16℃下孵育30分钟，在42℃下孵育30分钟，且
在85℃下孵育5分钟。使用TaqMan microRNA Assays和TaqMan Universal PCR Master
Mix(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)中所包括的miRNA特异性探针和引物
建立实时PCR反应。将反应物在96孔板中在95℃下孵育10分钟，随后在95℃下孵育15
秒×40个循环，且在60℃下孵育1分钟。所有反应都在Applied Biosystems7300快速实
时PCR系统上重复运作三次。使用ΔΔCt方法(Livak和Schmittgen,2001)计算相对定
量(RQ)。RNU6B充当标准化的内源性对照。
的内部对照)。将反应物在热循环仪中在16℃下孵育30分钟，在42℃下孵育30分钟，且
在85℃下孵育5分钟。使用TaqMan microRNA Assays和TaqMan Universal PCR Master
Mix(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)中所包括的miRNA特异性探针和引物
建立实时PCR反应。将反应物在96孔板中在95℃下孵育10分钟，随后在95℃下孵育15
秒×40个循环，且在60℃下孵育1分钟。所有反应都在Applied Biosystems7300快速实
时PCR系统上重复运作三次。使用ΔΔCt方法(Livak和Schmittgen,2001)计算相对定
量(RQ)。RNU6B充当标准化的内源性对照。
[0155] 统计分析
[0156] 使用线性回归t检验进行表达数据的回归分析。
[0157] 结果
[0158] 回归分析结果概括于表3中。miR-371-3p、miR-372和miR-373的相对表达分别与miR-520c-3p的表达具有高度显著的相关性。这一相关性指示这些miRNA的协同表达，
且因而表明它们共有类似功能。
且因而表明它们共有类似功能。
[0159] 表3：miR-371-3p、miR-372和miR-373与miR-520c-3p的表达之间的高度显著的相关性
[0160]miR-520c-3p
miR-371-3p p<0.001
miR-372 p<0.001
miR-373 p<0.001
miR-371-3p p<0.001
miR-372 p<0.001
miR-373 p<0.001
[0161] 参考文献
[0162] Livak,K.J. 和 T.D.Schmittgen(2001).“Analysis of relative geneexpression data using real-time quantitative PCR and the2(-Delta Delta C(T))
Method”.Methods25(4):402-408。
Method”.Methods25(4):402-408。
[0163] 实施例3：基质与滋养层细胞中的miR-371-3p、miR-372、miR-373和miR-520c-3p的相对表达的比较
[0164] 材料和方法
[0165] 显微解剖
[0166] 将一个外观正常的前三个月胎盘(妊娠第8周)的用福尔马林固定并用石蜡包埋的样品用于单独分析基质和滋养层隔室。
[0167] 使 用 如 制 造 商 所 描 述 的 激 光 显 微 解 剖 标 准 程 序 (http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/laser-microdissection/details/product/leica-lmd7000/downloads/，2011年11月17
日存取)分离基质核心和滋养层(图3)。在这方面，也可以如Grundemann等,Nucleic
Acids Res36(2008),e38中所描述，确切地说，如部分“UV-Laser-microdissection and cDNA synthesis of microdissected cells”的第3页所描述来进行激光显微解剖，所述文献的公开内容以引用的方式并入本文中。
日存取)分离基质核心和滋养层(图3)。在这方面，也可以如Grundemann等,Nucleic
Acids Res36(2008),e38中所描述，确切地说，如部分“UV-Laser-microdissection and cDNA synthesis of microdissected cells”的第3页所描述来进行激光显微解剖，所述文献的公开内容以引用的方式并入本文中。
[0168] RNA分离
[0169] 使用QIAGEN miRNEasy微型试剂盒(QIAGEN，Hilden，Germany)，根据制造商说明书从基质和滋养层细胞中分离总RNA。
[0170] 反转录和实时PCR
[0171] 利用得自于TaqMan microRNA Assays(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)的TaqMan microRNA反转录试剂盒和RT引物，根据制造商说明书，使用10ng总RNA来产生miR-520c、miR-371-3p、miR-372、miR-373和RNU6B特异性cDNA(其充当相对定量
的内部对照)。将反应物在热循环仪中在16℃下孵育30分钟，在42℃下孵育30分钟，且
在85℃下孵育5分钟。使用TaqMan microRNA Assays和TaqMan Universal PCR Master
Mix(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)中所包括的miRNA特异性探针和引物
建立实时PCR反应。将反应物在96孔板中在95℃下孵育10分钟，随后在95℃下孵育15
秒×40个循环，且在60℃下孵育1分钟。所有反应都在Applied Biosystems7300快速实
时PCR系统上重复运作三次。使用ΔΔCt方法(Livak和Schmittgen,2001)计算相对定
量(RQ)。RNU6B充当标准化的内源性对照。
的内部对照)。将反应物在热循环仪中在16℃下孵育30分钟，在42℃下孵育30分钟，且
在85℃下孵育5分钟。使用TaqMan microRNA Assays和TaqMan Universal PCR Master
Mix(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)中所包括的miRNA特异性探针和引物
建立实时PCR反应。将反应物在96孔板中在95℃下孵育10分钟，随后在95℃下孵育15
秒×40个循环，且在60℃下孵育1分钟。所有反应都在Applied Biosystems7300快速实
时PCR系统上重复运作三次。使用ΔΔCt方法(Livak和Schmittgen,2001)计算相对定
量(RQ)。RNU6B充当标准化的内源性对照。
[0172] 结果
[0173] 与由仅检测滋养层细胞而非基质细胞中的C19MC miRNA的Luo等,(2009)先前获得的结果相反，本文中所提供的结果显示，基质细胞中miR-520c-3p的表达与滋养层细胞中同样高。对于miR-371-3p和miR-372的表达水平同样成立。miR-373在基质细胞中的表
达甚至高于滋养层细胞中(图4)。
达甚至高于滋养层细胞中(图4)。
[0174] 实施例4：测试本发明的miRNA和结合分子的免疫调节性质。
[0175] 通过用miRNA转染间质干细胞或滋养层细胞，且分离由这些细胞释放的外来体来测试如上文中所定义的本发明的miRNA或结合分子抑制免疫系统的能力以用于旨在对
这些外来体的标靶细胞进行免疫调节的实验。用于提取外来体的方法在本领域中是已知
的，且如例如Hedlund等(2009)的Materials and Methods部分中所描述，确切地说，如
部分“Isolation of exosomes from supernatants of placental explant cultures”中的第342到343页所描述，或如Taylor等(2006)的部分“Isolation of circulating
exosomes”中第1535页所描述加以使用，两个文献的公开内容都以引用的方式并入本文
中。或者，类似于HeLa细胞和成纤维细胞，按照如例如Marasa等(2010)在部分“Cell
culture,transfections and b-galactosidase staining”中的第340页所概述的常规方法将miRNA直接用于转染标靶细胞，所述标靶细胞可以是例如淋巴细胞或树状细胞，所述文献的公开内容以引用的方式并入本文中。有若干种方式测试miRNA对受体细胞水平的免疫调节能力。相关标靶细胞、转染方法和用于评估miRNA抑制免疫系统的潜能的参数在本领域中是已知的，且如例如以下文献所描述，确切地说，如相应的Materials and Methods部分中所描述加以使用：Sabapatha等,2006；Taylor等,2006；Hegmans等,2008；Hedlund等,2009；Ren等,2011；Zhang等,2011，所述文献的公开内容以引用的方式并入本文中。
这些外来体的标靶细胞进行免疫调节的实验。用于提取外来体的方法在本领域中是已知
的，且如例如Hedlund等(2009)的Materials and Methods部分中所描述，确切地说，如
部分“Isolation of exosomes from supernatants of placental explant cultures”中的第342到343页所描述，或如Taylor等(2006)的部分“Isolation of circulating
exosomes”中第1535页所描述加以使用，两个文献的公开内容都以引用的方式并入本文
中。或者，类似于HeLa细胞和成纤维细胞，按照如例如Marasa等(2010)在部分“Cell
culture,transfections and b-galactosidase staining”中的第340页所概述的常规方法将miRNA直接用于转染标靶细胞，所述标靶细胞可以是例如淋巴细胞或树状细胞，所述文献的公开内容以引用的方式并入本文中。有若干种方式测试miRNA对受体细胞水平的免疫调节能力。相关标靶细胞、转染方法和用于评估miRNA抑制免疫系统的潜能的参数在本领域中是已知的，且如例如以下文献所描述，确切地说，如相应的Materials and Methods部分中所描述加以使用：Sabapatha等,2006；Taylor等,2006；Hegmans等,2008；Hedlund等,2009；Ren等,2011；Zhang等,2011，所述文献的公开内容以引用的方式并入本文中。
[0176] 实施例5：使用miRNA模拟物抑制T细胞活性
[0177] 使用电穿孔，利用C19MC的miRNA的模拟物(Qiagen，Hilden，Germany)以适当浓度转染T细胞和T细胞源性细胞系，以测试其增殖能力和细胞因子表达。使用零乱的
siRNA(Qiagen)作为阴性对照。使用AllStars Hs Cell Death siRNA(Qiagen)测试转染效率。
siRNA(Qiagen)作为阴性对照。使用AllStars Hs Cell Death siRNA(Qiagen)测试转染效率。
[0178] 实施例6：足月胎盘和羊膜组织中的miR-517a-3p、miR-519a-3p和miR-520c-3p的相对表达
[0179] 来自于羊膜的间质细胞似乎具有强免疫调节性质，例如，通过主动抑制由同种异体抗原诱导的T细胞增殖来显现(Wolbank等,2007)。因而，测量足月羊膜中的
miR-517a-3p、miR-519a-3p和miR-520c-3p的表达，且与相应胎盘组织的表达水平相比较。
miR-517a-3p、miR-519a-3p和miR-520c-3p的表达，且与相应胎盘组织的表达水平相比较。
[0180] 材料和方法
[0181] RNA分离
[0182] 从用福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的在分娩后不久获得的足月胎盘组织和相邻羊膜组织中分离总RNA。使用innuPREP Micro RNA试剂盒(Analytik Jena AG，Jena，
Germany)根据制造商说明书进行RNA分离，对FFPE组织进行以下修饰：通过在得自于
innuPREP DNA Micro试剂盒(Analytik Jena)的TLS溶解溶液和蛋白酶K中将石蜡切片在
60℃下孵育1小时且在80℃下孵育15分钟来溶解所述切片。
Germany)根据制造商说明书进行RNA分离，对FFPE组织进行以下修饰：通过在得自于
innuPREP DNA Micro试剂盒(Analytik Jena)的TLS溶解溶液和蛋白酶K中将石蜡切片在
60℃下孵育1小时且在80℃下孵育15分钟来溶解所述切片。
[0183] 反转录和实时PCR
[0184] 利用得自于TaqMan microRNA Assays(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)的TaqMan microRNA反转录试剂盒和RT引物，根据制造商说明书，使用200ng总RNA来产生miR-571a-3p、miR-519a-3p、miR-520a-3p和RNU6B特异性cDNA(其充当相对定量
的内部对照)。将反应物在热循环仪中在16℃下孵育30分钟，在42℃下孵育30分钟，且
在85℃下孵育5分钟。使用TaqMan microRNA Assays和TaqMan Universal PCR Master
Mix(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)中所包括的miRNA特异性探针和引物
建立实时PCR反应。将反应物在96孔板中在95℃下孵育10分钟，随后在95℃下孵育15
秒×40个循环，且在60℃下孵育1分钟。所有反应都在Applied Biosystems7300快速实
时PCR系统上重复运作三次。使用ΔΔCt方法(Livak和Schmittgen,2001)计算相对定
量(RQ)。RNU6B充当标准化的内源性对照。
的内部对照)。将反应物在热循环仪中在16℃下孵育30分钟，在42℃下孵育30分钟，且
在85℃下孵育5分钟。使用TaqMan microRNA Assays和TaqMan Universal PCR Master
Mix(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)中所包括的miRNA特异性探针和引物
建立实时PCR反应。将反应物在96孔板中在95℃下孵育10分钟，随后在95℃下孵育15
秒×40个循环，且在60℃下孵育1分钟。所有反应都在Applied Biosystems7300快速实
时PCR系统上重复运作三次。使用ΔΔCt方法(Livak和Schmittgen,2001)计算相对定
量(RQ)。RNU6B充当标准化的内源性对照。
[0185] 结果
[0186] 测量足月羊膜组织中的miR-517a-3p、miR-519a-3p和miR-520c-3p的相对表达且与相应的胎盘组织相比较。所获得的RQ(相对定量)值在以下表4中给出。
[0187] 表4：胎盘和羊膜组织中所获得的miR-517a-3p、miR-519a-3p和miR-520c-3p的相对定量(RQ)值.
[0188]
[0189] 这些数据显示，羊膜中miR-517a-3p、miR-519a-3p和miR-520c-3p的表达与胎盘组织中同样高。
[0190] 参考文献：
[0191] Hedlund,M.,A.C.Stenqvist 等 ,(2009).“Human placenta expresses andsecretes NKG2D ligands via exosomes that down-modulate the cognate receptor
expression:evidence for immunosuppressive function”.J Immunol183(1):340-351。
expression:evidence for immunosuppressive function”.J Immunol183(1):340-351。
[0192] Hegmans,J.P.,P.J.Gerber 等 ,(2008).“Exosomes”.Methods MolBiol484:97-109。
[0193] Livak,K.J. 和 T.D.Schmittgen(2001).“Analysis of relative geneexpression data using real-time quantitative PCR and the2(-Delta Delta C(T))
Method”.Methods25(4):402-408。
Method”.Methods25(4):402-408。
[0194] Marasa,B.S.,S.Srikantan等,(2010).“MicroRNA profiling in human diploid fibroblasts uncovers miR-519role in replicative senescence”.Aging(AlbanyNY)2(6):333-343。
[0195] Ren,Y.,J.Yang等,(2011).“Exosomal-like vesicles with immune-modulatory features are present in human plasma and can induce CD4+T-cell apoptosis invitro”.Transfusion51(5):1002-1011。
[0196] Sabapatha,A.,C.Gercel-Taylor 等 ,(2006).“Specific isolation ofplacenta-derived exosomes from the circulation of pregnant women and their
immunoregulatory consequences”.Am J Reprod Immunol56(5-6):345-355。
immunoregulatory consequences”.Am J Reprod Immunol56(5-6):345-355。
[0197] Taylor,D.D.,S.Akyol等,(2006).“Pregnancy-associated exosomes and their modulation of T cell signaling”.J Immunol176(3):1534-1542。
[0198] Wolbank,S.,A.Peterbauer 等 ,(2007).“Dose-dependent immunomodulatory effect of human stem cells from amniotic membrane:a comparison with humanmesenchymal stem cells from adipose tissue”.Tissue Engineering13(6):1173-1183。
[0199] Zhang,H.,Y.Xie 等 ,(2011).“CD4(+)T cell-released exosomes inhibitCD8(+)cytotoxic T-lymphocyte responses and antitumor immunity”.Cell Mol
Immunol8(1):23-30。
Immunol8(1):23-30。
[0200] 实施例7：蜕膜和滋养层细胞中的miR-520c-3p和miR-517a-3p的相对表达的比较
[0201] 材料和方法
[0202] 显微解剖
[0203] 将外观正常的前三个月胎盘(妊娠第9周)的用福尔马林固定并用石蜡包埋的样品用于单独分析滋养层和蜕膜。
[0204] 使 用 如 制 造 商 所 描 述 的 激 光 显 微 解 剖 标 准 程 序 (http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/laser-microdissection/details/product/leica-lmd7000/downloads/，2011年11月17
日存取；或Asztalos等,(2010)第303页上左栏中的“Materials and methods”部分、
子部分“Laser microdissection”，其公开内容以引用的方式并入本文中)分离滋养层和蜕膜组织。分离基质核心和滋养层(图3)。在这方面，也可以如Grundemann等,Nucleic
Acids Res36(2008),e38中所描述，确切地说，如部分“UV-Laser-microdissection and cDNA synthesis of microdissected cells”的第3页所描述来进行激光显微解剖，所述文献的公开内容以引用的方式并入本文中。
日存取；或Asztalos等,(2010)第303页上左栏中的“Materials and methods”部分、
子部分“Laser microdissection”，其公开内容以引用的方式并入本文中)分离滋养层和蜕膜组织。分离基质核心和滋养层(图3)。在这方面，也可以如Grundemann等,Nucleic
Acids Res36(2008),e38中所描述，确切地说，如部分“UV-Laser-microdissection and cDNA synthesis of microdissected cells”的第3页所描述来进行激光显微解剖，所述文献的公开内容以引用的方式并入本文中。
[0205] RNA分离
[0206] 使用QIAGEN miRNEasy微型试剂盒(QIAGEN，Hilden，Germany)，根据制造商说明书从蜕膜和滋养层细胞中分离总RNA。
[0207] 反转录和实时PCR
[0208] 利用得自于TaqMan microRNA Assays(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)的TaqMan microRNA反转录试剂盒和RT引物，根据制造商说明书，使用10ng总RNA来产生miR-520c-3p、miR-517a-3p和RNU6B特异性cDNA(其充当相对定量的内部对照)。
将反应物在热循环仪中在16℃下孵育30分钟，在42℃下孵育30分钟，且在85℃下孵育
5分钟。使用TaqMan microRNA Assays和TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied
Biosystems，Foster City，CA，USA)中所包括的miRNA特异性探针和引物建立实时PCR反应。将反应物在96孔板中在95℃下孵育10分钟，随后在95℃下孵育15秒×40个循环，
且在60℃下孵育1分钟。所有反应都在Applied Biosystems7300快速实时PCR系统上重
复运作三次。使用ΔΔCt方法(Livak和Schmittgen,2001)计算相对定量(RQ)。RNU6B
充当标准化的内源性对照。将表达与以较低水平表达miR-520c-3p和miR-517a-3p的甲状
腺肿瘤相比较。
将反应物在热循环仪中在16℃下孵育30分钟，在42℃下孵育30分钟，且在85℃下孵育
5分钟。使用TaqMan microRNA Assays和TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied
Biosystems，Foster City，CA，USA)中所包括的miRNA特异性探针和引物建立实时PCR反应。将反应物在96孔板中在95℃下孵育10分钟，随后在95℃下孵育15秒×40个循环，
且在60℃下孵育1分钟。所有反应都在Applied Biosystems7300快速实时PCR系统上重
复运作三次。使用ΔΔCt方法(Livak和Schmittgen,2001)计算相对定量(RQ)。RNU6B
充当标准化的内源性对照。将表达与以较低水平表达miR-520c-3p和miR-517a-3p的甲状
腺肿瘤相比较。
[0209] 结果
[0210] 本文中所提供的结果显示，miR-520c-3p和miR-517a-3p不仅存在于滋养层细胞中，而且存在于蜕膜细胞中(图5)。蜕膜由不表达C19MC miRNA的具有母体甲基化模
式的母体细胞组成。因此，本文中所提供的数据显示，这个组织中存在miR-517a-3p和
miR-520c-3p细胞是由于miRNA(最初由胎盘细胞经由外来体释放)被蜕膜细胞或更具体地
说，被蜕膜免疫细胞吸收所致。
式的母体细胞组成。因此，本文中所提供的数据显示，这个组织中存在miR-517a-3p和
miR-520c-3p细胞是由于miRNA(最初由胎盘细胞经由外来体释放)被蜕膜细胞或更具体地
说，被蜕膜免疫细胞吸收所致。
[0211] 实施例8：C19MC miRNA、其经验证的标靶和在免疫调节方面的潜在作用的计算机分析
[0212] 材料和方法
[0213] 在miRNA登记miRBase(http://www.mirbase.org/)中检索C19MC miRNA的已验证的标靶。然后在相关文献中检索这些已验证的标靶的已知功能。
[0214] 结果
[0215] 本文中所提供的结果显示，C19MC标靶基因的miRNA的高比例与细胞凋亡和免疫调节相关。作为一个实例，存在充当Fas-FasL诱导的细胞凋亡的抑制剂的已验证标靶。这些标靶和C19MC簇的相应miRNA示意性地示于图6中。
[0216] 参考文献
[0217] “miRBase(18发行版)”.http://www.mirbase.org。
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Issue):D152-D157
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[0224] Landgraf P,Rusu M,Sheridan R,Sewer A,Iovino N,Aravin A,Pfeffer S,Rice A,Kamphorst AO,Landthaler M,Lin C,Socci ND,Hermida L,Fulci V,Chiaretti S,Foa R,Schliwka J,Fuchs U,Novosel A,Muller RU,Schermer B,Bissels U,Inman J,PhanQ,Chien M(2007).“A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA
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Reproduction141(6):715-724。
Reproduction141(6):715-724。
[0232] 实施例9：得自于牛羊膜的细胞未能抑制混合淋巴细胞反应
[0233] 已知人类羊膜细胞诱导对混合淋巴细胞反应(MLR)的抑制作用(Magatti等,2008)。本发明内所提供的实验显示这些细胞也大量地表达C19MC miRNA(参见实施例
6)。不表达C19MC miRNA的牛羊膜细胞(bAMC)将不发挥抑制作用或发挥不太明显的抑制
作用。因而，在存在bAMC的情况下进行MLR，且利用BrdU测定来测量PBMC(周围血液单核
细胞)的增殖。
6)。不表达C19MC miRNA的牛羊膜细胞(bAMC)将不发挥抑制作用或发挥不太明显的抑制
作用。因而，在存在bAMC的情况下进行MLR，且利用BrdU测定来测量PBMC(周围血液单核
细胞)的增殖。
[0234] 材料和方法
[0235] 细胞培养物
[0236] 在RPMI完全培养基中将牛羊膜源性细胞(bAMC)与以下任一者一起共培养
[0237] ·来自于一个供体(供体A)的PBMC
[0238] ·来自于另一个供体(供体B)的PBMC
[0239] ·来自于两个供体(供体A+供体B)的PBMC(混合淋巴细胞反应(MLR))
[0240] ·来自于供体A的PBMC+T细胞刺激性conA(伴刀豆凝集素A)；或
[0241] ·来自于供体B的PBMC+T细胞刺激性conA
[0242] 作为阳性对照，用JEG-3细胞代替bAMC进行相同的实验方案。绒毛膜癌源性细胞系JEG-3大量地表达C19MC miRNA(Morales-Prieto等,2012)。此外，已知这个细胞系对T细胞发挥抑制作用(Hammer等,2002)。细胞系S40.2来源于甲状腺腺瘤且已知过度表达簇
C19MC和miR-371-373的miRNA(Rippe等,2010)。
C19MC和miR-371-373的miRNA(Rippe等,2010)。
[0243] 用3000Gy照射JEG-3和bAMC以确保所观察的增殖可以归于淋巴细胞。为了控制PBMC的刺激潜能，使用得自于两种不同的供体A和B的PBMC在未加入bAMC或JEG-3细胞
的情况下建立混合淋巴细胞反应(MLR)。所有实验都进行96小时和120小时，且所有培养
都重复进行三次。
的情况下建立混合淋巴细胞反应(MLR)。所有实验都进行96小时和120小时，且所有培养
都重复进行三次。
[0244] BrdU测定
[0245] 在实验结束前24小时，将BrdU加入到细胞培养物中。分别在96小时和72小时之后，收集上清液(含有PBMC，呈悬浮液形式)且利用BrdU测定(Roche Applied Science，
Mannheim，Germany)来测量PBMC的增殖。
Mannheim，Germany)来测量PBMC的增殖。
[0246] 结果
[0247] bAMC未能诱导对MLR或PBMC(经Con A刺激)的抑制作用，而JEG-3细胞有效地抑制了PBMC活化(图7)。在MLR中且通过用Con A刺激来充分活化本发明内所使用的
PBMC(图8)。同样，可以使用甲状腺腺瘤细胞系S40.2的细胞代替JEG-3细胞以显示其抑
制混合淋巴细胞反应的能力。
PBMC(图8)。同样，可以使用甲状腺腺瘤细胞系S40.2的细胞代替JEG-3细胞以显示其抑
制混合淋巴细胞反应的能力。
[0248] 参考文献：
[0249] Hammer,A.,M.Hartmann等,(2002).“Expression of functional Fas ligand in choriocarcinoma”.American Journal of Reproductive Immunology48(4):226-234。
[0250] Magatti,M.,S.De Munari 等 ,(2008).“Human amnion mesenchyme harborscells with allogeneic T-cell suppression and stimulation capabilities”.Stem Cells26(1):182-192。
[0251] Morales-Prieto,D.M.,W.Chaiwangyen 等 ,(2012).“MicroRNA expressionprofiles of trophoblastic cells”.Placenta。
[0252] Rippe,V.,L.Dittberner 等 ,(2010).“The two stem cell microRNA geneclusters C19MC and miR-371-3are activated by specific chromosomal rearrangements in a subgroup of thyroid adenomas”.PLoS One5(3):e9485。
[0253] 实施例10：含有簇C19MC的BAC克隆
[0254] BAC克隆BC280723(GenBank登录号Ac011453)跨越C19MC的整个染色体区，包括相邻的CpG岛，即，其假定启动子区(BC280723)(图9)。将这个序列插入到pBACe3.6载体
中。
中。
[0255] 实施例11：来自于转染到来自于牛羊膜的细胞中的含有整个C19MC簇的BAC克隆的C19MC miRNA的表达
[0256] 材料和方法
[0257] 转染
[0258] 用含有簇C19MC作为插入序列的BAC载体转染使用标准细胞培养技术/程序得自于牛羊膜的细胞培养物(参见以上实施例10)。使用QIAGEN(Hilden，Germany)的
Attractene转染试剂，根据制造商说明书进行转染。
Attractene转染试剂，根据制造商说明书进行转染。
[0259] 作为阴性对照，用不含BAC载体DNA的转染复合物模拟转染细胞。在转染后24小时、48小时和6天(144小时)收获细胞。
[0260] 反转录和实时PCR
[0261] 利用得自于TaqMan microRNA Assays(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)的TaqMan microRNA反转录试剂盒和RT引物，根据制造商说明书，使用200ng总RNA来产生miR-517a-3p和RNU6B特异性cDNA(其充当相对定量的内部对照)。将反应物在
热循环仪中在16℃下孵育30分钟，在42℃下孵育30分钟，且在85℃下孵育5分钟。使用
TaqMan microRNA Assays和TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems，
Foster City，CA，USA)中所包括的miRNA特异性探针和引物建立实时PCR反应。将反应物在96孔板中在95℃下孵育10分钟，随后在95℃下孵育15秒×40个循环，且在60℃下孵
育1分钟。所有反应都在Applied Biosystems7300快速实时PCR系统上重复运作三次。使
用ΔΔCt方法(Livak和Schmittgen,2001)计算相对定量(RQ)。RNU6B充当标准化的内
源性对照。
热循环仪中在16℃下孵育30分钟，在42℃下孵育30分钟，且在85℃下孵育5分钟。使用
TaqMan microRNA Assays和TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems，
Foster City，CA，USA)中所包括的miRNA特异性探针和引物建立实时PCR反应。将反应物在96孔板中在95℃下孵育10分钟，随后在95℃下孵育15秒×40个循环，且在60℃下孵
育1分钟。所有反应都在Applied Biosystems7300快速实时PCR系统上重复运作三次。使
用ΔΔCt方法(Livak和Schmittgen,2001)计算相对定量(RQ)。RNU6B充当标准化的内
源性对照。
[0262] 结果
[0263] 由于miRNA簇C19MC是灵长类动物特有的，所以它不表达于牛细胞中。用BAC载体转染牛羊膜源性细胞导致miR-517a-3p的表达与经模拟转染的细胞相比较高，至少持续多达六天；也参见图10。
[0264] 这些结果指示，C19MC miRNA的表达可以在不表达这些miRNA的细胞中实现，且可用的BAC载体是适合于这一目的的载体的一个实例。
[0265] 实施例12：与得自于JEG-3细胞培养物的上清液一起孵育的Jurkat细胞中的cFLIP mRNA的下调
[0266] 许多C19MC miRNA似乎靶向与Fas-FasL诱导的细胞凋亡有关的抗细胞凋亡基因(参见以上实施例8)。所述标靶之一是c-FLIP(CFLAR)。经常将C19MC miRNA装入细胞所
分泌的外来体中。在细胞培养时，这些外来体在培养基中积聚。
分泌的外来体中。在细胞培养时，这些外来体在培养基中积聚。
[0267] 材料和方法
[0268] 细胞培养
[0269] JEG-3是高度表达C19MC miRNA的绒毛膜癌源性细胞系。HCT-116是不显著表达C19MC miRNA的结肠癌源性细胞系(参见图11A)。Jurkat是也不显著表达C19MC miRNA的
T细胞白血病源性细胞系。所使用的所有三个细胞系都可以商购。使所有细胞系在补充有
10％胎牛血清和抗生素(青霉素/链霉素)的RPMI中生长。
T细胞白血病源性细胞系。所使用的所有三个细胞系都可以商购。使所有细胞系在补充有
10％胎牛血清和抗生素(青霉素/链霉素)的RPMI中生长。
[0270] 在培养三天后收集JEG-3和HCT-116细胞的细胞培养物的上清液。然后将4ml所收集的JEG-3上清液加入到在3ml培养基中生长的Jurkat细胞中。与HCT-116细胞的上
清液一起孵育的Jurkat细胞培养物充当对照。在加入所述上清液之后24小时收获两次制
备的Jurkat细胞。
清液一起孵育的Jurkat细胞培养物充当对照。在加入所述上清液之后24小时收获两次制
备的Jurkat细胞。
[0271] RNA分离
[0272] 使用QIAGEN miRNeasy微型试剂盒(QIAGEN，Hilden，Germany)，根据制造商说明书从Jurkat细胞中分离总RNA。
[0273] 反转录和实时PCR
[0274] 使用M-MLV反转录酶(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)与150ng随机六聚物和TM
RNaseOUT 重组核糖核酸酶抑制剂，根据制造商说明书，用250ng总RNA进行反转录。
RNaseOUT 重组核糖核酸酶抑制剂，根据制造商说明书，用250ng总RNA进行反转录。
[0275] 使 用 TaqMan Gene Expression Assays CFLAR(Hs00153439_m1)(LifeTechnologies，Darmstadt，Germany；目录号4331182)和TaqMan Universal PCR Master Mix(Life Technologies，Darmstadt，Germany)，根据制造商说明书对c-FLIP(CFLAR)进行实时PCR。将反应物在96孔板中在95℃下孵育10分钟，随后在95℃下孵育15秒×40个
循环，且在60℃下孵育1分钟。所有反应都在Applied Biosystems7300快速实时PCR系统
上重复运作三次。使用ΔΔCt方法计算相对定量(RQ)(Livak和Schmittgen2001)。HPRT
充当标准化的内源性对照。
循环，且在60℃下孵育1分钟。所有反应都在Applied Biosystems7300快速实时PCR系统
上重复运作三次。使用ΔΔCt方法计算相对定量(RQ)(Livak和Schmittgen2001)。HPRT
充当标准化的内源性对照。
[0276] 结果
[0277] 经JEG-3细胞的上清液处理的Jurkat细胞显示c-FLIP的表达与经HCT-116上清液处理的Jurkat细胞相比有所减少(图11B)。JEG-3细胞过度表达C19MC miRNA，且所述
上清液含有含这些miRNA的外来体，所述miRNA在本发明的实施例中被递送到Jurkat细胞
中。因此，c-FLIP mRNA被下调。
上清液含有含这些miRNA的外来体，所述miRNA在本发明的实施例中被递送到Jurkat细胞
中。因此，c-FLIP mRNA被下调。
[0278] 参考文献：
[0279] Livak,K.J. 和 T.D.Schmittgen(2001).“Analysis of relative geneexpression data using real-time quantitative PCR and the2(-Delta Delta C(T))
Method”.Methods25(4):402-408。
Method”.Methods25(4):402-408。
[0280] Wolbank,S.,A.Peterbauer 等 ,(2007).“Dose-dependent immunomodulatory effect of human stem cells from amniotic membrane:a comparison with humanmesenchymal stem cells from adipose tissue”.Tissue Engineering13(6):1173-1183。
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