将人羊膜间充质细胞诱导分化成血管内皮样细胞的方法
专利汇可以提供将人羊膜间充质细胞诱导分化成血管内皮样细胞的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及了一种将人羊膜间充质细胞诱导分 化成 血管内皮样细胞的方法，它包括：从胎盘中分离出人羊膜组织；清洗上述人羊膜组织；消化清洗后的人羊膜组织；将上述人羊膜组织分离成单个人羊膜间充质细胞；将人羊膜间充质细胞扩增到所需的数目后，将上述人羊膜间充质细胞悬液中加入到含有10％FBS、1×10 5 IU/L青- 链霉素 、10μg/L VEGF和2μg/LbFGF的M-199内皮细胞诱导培养基中诱导14天后，得到血管内皮样细胞；利用上述方法得到的血管内皮样细胞可以用于重建和修复人体内的血管，激活移植到人体内的组织，使该组织进行正常的新陈代谢。，下面是将人羊膜间充质细胞诱导分化成血管内皮样细胞的方法专利的具体信息内容。
1.一种将人羊膜间充质细胞诱导分化成血管内皮样细胞的方法，它包括：
(1)在无菌条件下，从一个胎盘中分离出人羊膜组织，放入生理盐水中浸泡；
(2)清洗上述人羊膜组织；
(3)消化清洗后的人羊膜组织；
(4)将上述人羊膜组织分离成单个人羊膜间充质细胞；
(5)将人羊膜间充质细胞扩增到所需的数目后，加入DMEM/F12得到含有人羊膜间充 质细胞的悬浊液，使人羊膜间充质细胞的个数为1×106个/ml-2×106个/ml；
其特征在于：
(6)将上述人羊膜间充质细胞悬液中加入含有10％FBS、1×105IU/L青-链霉素、10μg/L VEGF和2μg/L bFGF的M-199内皮细胞诱导培养基，使人羊膜间充质细胞的个数为1×105个 /ml，然后将其接种到至少一个24孔板中，每两天更换上述培养基一次，诱导14天后，得到 血管内皮样细胞；
(7)取出一部分从步骤(6)中得到的细胞进行免疫荧光染色或透射电镜鉴定，检测得 到的细胞是否为血管内皮样细胞。
2.如权利要求1所述的将人羊膜间充质细胞诱导分化成血管内皮样细胞的方法，其特征 在于：所述的步骤(1)是从正常足月剖腹产胎儿的胎盘的脐带面，钝性分离出的人羊膜组织。
3.如权利要求2所述的将人羊膜间充质细胞诱导分化成血管内皮样细胞的方法，其特征 在于：所述的步骤(2)为倒掉步骤(1)的生理盐水，用温度为4℃的含有100IU/ml青霉素 和100ug/ml链霉素混合液的生理盐水对上述人羊膜组织进行清洗，直至人羊膜组织无任何杂 质和血渍后，在温度为20～25℃的无菌间，用含100IU/ml青霉素和100ug/ml链霉素的 D-hank’s冲洗上述人羊膜组织3-5遍后，放置在含100IU/ml青霉素和100ug/ml链霉素 D-hank’s液中浸泡2小时；2小时后用D-hank’s液清洗3-5遍。
4.如权利要求3所述的将人羊膜间充质细胞诱导分化成血管内皮样细胞的方法，其特征 在于：所述的步骤(3)是将清洗后的人羊膜组织加入等体积的0.25％胰蛋白酶的消化液，放 入37℃水浴锅中分两次共消化45分钟后，倒掉上述消化液，加入3ml的含10％FBS的 DMEM/F12液终止消化，将消化后的羊膜组织用D-hank’s液清洗直至清洗液澄清为止。
5.如权利要求4所述的将人羊膜间充质细胞诱导分化成血管内皮样细胞的方法，其特征 在于：所述分两次共消化45分钟是将清洗后的人羊膜组织加入等体积的0.25％胰蛋白酶消化 液，放入37℃水浴锅中消化15分钟后，倒掉上述消化液，然后再加入等体积的新0.25％胰蛋 白酶消化液，放入37℃水浴锅中消化30分钟后，倒掉上述消化液，在消化时每隔5分钟晃 动一次，使人羊膜组织被充分地消化。
6.如权利要求5所述的将人羊膜间充质细胞诱导分化成血管内皮样细胞的方法，其特征 在于：所述的步骤(4)中的将上述人羊膜组织分离成单个人羊膜间充质细胞是采取以下步骤：
(I)将消化后的人羊膜组织用剪刀剪成浆状后放入烧杯中，加入等体积的0.2％胶原蛋 白酶V，然后放入温度为37℃的水浴锅中消化20～30分钟；
(II)将消化后的羊膜浆状液分别用60目细胞筛和200目细胞筛进行过滤，得到细胞悬浊 液；
(III)用无血清DMEM/F12按1∶1的比例稀释上述过滤后细胞悬浊液，然后在室温下将其 放入离心机内以2500r/min转速离心10分钟，10分钟后将上述溶液中的上清液倒掉，然后再 加入DMEM/F12，用吸管将细胞吹打均匀后，再将其放入离心机内以1500r/min转速离心5 分钟，5分钟后将上述溶液中的上清液倒掉，再加入10％FBS和DMEM/F12培养液后，用吸 管将细胞吹打均匀后，使人羊膜间充质细胞个数为1×106个/ml-2×106个/ml。
7.如权利要求6所述的将人羊膜间充质细胞诱导分化成血管内皮样细胞的方法，其特征 在于：所述的步骤(5)是将步骤(4)得到人羊膜间充质细胞和含10％FBS的DMEM/F12 培养液放置在培养瓶中，培养瓶在温度为36.5-37.5℃、饱和湿度、体积分数为4.5％的CO2 培养箱中培养，每2-3天更换全部培养液，培养5-7天，观察培养瓶中人羊膜间充质细胞 融合达到85％以上时，去掉培养液，用D-hank’s液清洗两遍后，再加2ml 0.25％的胰蛋白酶 消化液进行消化，在消化过程中，用显微镜下观察细胞的消化情况，当70％的细胞变化成圆 形时，立即加入2ml含10％FBS的DMEM/F12培养液终止消化，然后用力吹打培养瓶的壁， 将贴壁的细胞吹打下来；将回收的间充质细胞放入离心机内以1500r/min转速每次离心5分 钟，共计两次，然后倒掉上清液，并计算细胞的个数；将上述回收的间充质细胞1×106个/ml -2×106个/ml的密度重复上述操作进行传代接种培养，直至达到所需细胞数量。
8.如权利要求7所述的将人羊膜间充质细胞诱导分化成血管内皮样细胞的方法，其特征 在于：所述的步骤(7)中的免疫荧光染色鉴定是采用以下步骤：取一个生长接近融合状态的 诱导后人羊膜间充质细胞的24孔板，用PBS冲洗三次，每次5分钟，然后在室温下，用4％ 多聚甲醛将诱导后的人羊膜间充质细胞的状态固定，15分钟后细胞面朝上，再用PBS冲洗3 次，每次5分钟；之后用0.3％Triton作用10分钟，然后用PBS冲洗3次，每次5分钟；将 处理后的24孔板分为两组，分别加入鼠抗人单克隆抗体和PBS后，放入温度为4℃湿盒内孵 育30分钟。30分钟后，取出孔板，用PBS洗3次，然后分别加入兔抗鼠FITC二抗，放入 温度为4℃湿盒内孵育30分钟，30分钟后，取出孔板，用PBS洗3次后封片，在荧光显微 镜下观察和比较上述两个孔板的诱导后人羊膜间充质细胞的荧光染色，其中若加入PBS对照 组诱导后人羊膜间充质细胞免疫荧光染色表达为阴性，同时加入鼠抗人单克隆抗体的诱导后 人羊膜间充质细胞免疫荧光染色呈阳性，说明步骤(6)得到的细胞是血管内皮样细胞；若加 入PBS对照组诱导后人羊膜间充质细胞免疫荧光染色表达为阴性，同时加入鼠抗人单克隆抗 体的诱导后人羊膜间充质细胞免疫荧光染色呈阴性，说明步骤(6)得到的细胞不是血管内皮 样细胞；若加入PBS对照组诱导后人羊膜间充质细胞免疫荧光染色表达为阳性，同时加入鼠 抗人单克隆抗体的诱导后人羊膜间充质细胞免疫荧光染色呈阴性或阳性，则步骤(6)得到的 细胞不确定是血管内皮样细胞。
技术领域
由于人羊膜间充质细胞(human Amnion mesenchymal cells，hAMCs)具有增殖活性和多 分化潜能等干细胞生物学特点，本发明涉及了一种将人羊膜间充质细胞诱导分化成血管内皮 样细胞的方法。
背景技术
而人羊膜间充质细胞作为一种多潜能细胞，由于微环境中的细胞因子、生长因子等各种 调控物质不同，可促进间充质细胞向不同的谱系细胞分化。来源于绒毛膜、羊膜和绒毛间质 的间充质细胞在体外可以自发分化形成血管内皮细胞，加入血管内皮生长因子(VEGF)可以 促进这一过程，人羊膜组织表达VEGF受体-1和2，经VEGF刺激后表达的内皮特异性标志 FLT-1、KDR和ICAM增加，并且出现CD34(+)血管源性假血友病因子阳性细胞，研究报 道，人羊膜间充质细胞移植可以治疗心肌梗塞动物模型，改善心肌缺血状况。
发明内容
为了完成本发明目的，本发明采用以下技术方案：
本发明将人羊膜间充质细胞诱导分化成血管内皮样细胞的方法，它包括：
(1)在无菌条件下，从一个胎盘中分离出人羊膜组织，放入生理盐水中浸泡；
(2)清洗上述人羊膜组织；
(3)消化清洗后的人羊膜组织；
(4)将上述人羊膜组织分离成单个人羊膜间充质细胞；
(5)将人羊膜间充质细胞扩增到所需的数目后，加入DMEM/F12得到含有人羊膜间充 质细胞的悬浊液，使人羊膜间充质细胞的个数为1×106个/ml-2×106个/ml；
其中：
(6)将上述人羊膜间充质细胞悬液中加入含有10％FBS、1×105IU/L青-链霉素、10μg/L VEGF和2μg/L bFGF的M-199内皮细胞诱导培养基，使人羊膜间充质细胞的个数为1×105个 /ml，然后将其接种至24孔板中，每两天更换上述培养基一次，诱导14天后，得到血管内皮 样细胞；
(7)取出一部分从步骤(6)中得到的细胞进行免疫荧光染色鉴定，检测得到的细胞是 否为血管内皮样细胞；
本发明将人羊膜间充质细胞诱导分化成血管内皮样细胞的方法，其中：所述的步骤(1) 是从正常足月剖腹产胎儿的胎盘的脐带面，钝性分离出的人羊膜组织；
本发明将人羊膜间充质细胞诱导分化成血管内皮样细胞的方法，其中：所述的步骤(2) 为倒掉步骤(1)的生理盐水，用温度为4℃的含有100IU/ml青霉素和100ug/ml链霉素混合 液的生理盐水对上述人羊膜组织进行清洗，直至人羊膜组织无任何杂质和血渍后，在温度为 20～25℃的无菌间，用含100IU/ml青霉素和100ug/ml链霉素的D-hank’s冲洗上述人羊膜组 织3-5遍后，放置在含100IU/ml青霉素和100ug/ml链霉素D-hank’s液中浸泡2小时；2 小时后用D-hank’s液清洗3-5遍；
本发明将人羊膜间充质细胞诱导分化成血管内皮样细胞的方法，其中：所述的步骤(3) 是将清洗后的人羊膜组织加入等体积的0.25％胰蛋白酶的消化液，放入37℃水浴锅中分两次 共消化45分钟后，倒掉上述消化液，加入3ml的含10％FBS和的DMEM/F12液终止消化，将 消化后的羊膜组织用D-hank’s液清洗直至清洗液澄清为止；
本发明将人羊膜间充质细胞诱导分化成血管内皮样细胞的方法，其中：所述分两次共消 化45分钟是将清洗后的人羊膜组织加入等体积的0.25％胰蛋白酶消化液，放入37℃水浴锅中 消化15分钟后，倒掉上述消化液，然后再加入等体积的新0.25％胰蛋白酶消化液，放入37 ℃水浴锅中消化30分钟后，倒掉上述消化液，在消化时每隔5分钟晃动一次，使人羊膜组织 被充分地消化；
本发明将人羊膜间充质细胞诱导分化成血管内皮样细胞的方法，其中：所述的步骤(4) 中的将上述人羊膜组织分离成单个人羊膜间充质细胞是采取以下步骤：
(I)将消化后的人羊膜组织用剪刀剪成浆状后放入烧杯中，加入等体积的0.2％胶原蛋 白酶V，然后放入温度为37℃的水浴锅中消化20～30分钟；
(II)将消化后的羊膜浆状液分别用60目细胞筛和200目细胞筛进行过滤，得到细胞悬浊 液；
(III)用无血清DMEM/F12按1∶1的比例稀释上述过滤后细胞悬浊液，然后在室温下将其 放入离心机内以2500r/min转速离心10分钟，10分钟后将上述溶液中的上清液倒掉，然后再 加入DMEM/F12，用吸管将细胞吹打均匀后，再将其放入离心机内以1500r/min转速离心5 分钟，5分钟后将上述溶液中的上清液倒掉，再加入含10％FBS的DMEM/F12培养液后，用 吸管将细胞吹打均匀后，使人羊膜间充质细胞个数为1×106个/ml-2×106个/ml；
本发明将人羊膜间充质细胞诱导分化成血管内皮样细胞的方法，其中：所述的步骤(5) 是将步骤(4)得到人羊膜间充质细胞和含10％FBS的DMEM/F12培养液放置在培养瓶中， 培养瓶在温度为36.5-37.5℃、饱和湿度、体积分数为4.5％的CO2培养箱中培养，每2-3 天更换全部培养液，培养5-7天，观察培养瓶中人羊膜间充质细胞融合达到85％以上时， 去掉培养液，用D-hank’s液清洗两遍后，再加2ml 0.25％的胰蛋白酶消化液进行消化，在消 化过程中，用显微镜下观察细胞的消化情况，当70％的细胞变化成圆形时，立即加入2ml DMEM/F12和10％FBS培养液终止消化，然后用力吹打培养瓶的壁，将贴壁的细胞吹打下来； 将回收的间充质细胞放入离心机内以1500r/min转速每次离心5分钟，共计两次，然后倒掉 上清液，并计算细胞的个数；将上述回收的间充质细胞1×106个/ml-2×106个/ml的密度重 复上述操作进行传代接种培养，直至达到所需细胞数量；
本发明将人羊膜间充质细胞诱导分化成血管内皮样细胞的方法，其中：所述的步骤(7) 中的免疫荧光染色鉴定是采用以下步骤：取一个生长接近融合状态的诱导后人羊膜间充质细 胞的24孔板，用PBS冲洗三次，每次5分钟，然后在室温下，用4％多聚甲醛将诱导后的人 羊膜间充质细胞的状态固定，15分钟后细胞面朝上，再用PBS冲洗3次，每次5分钟；之后 用0.3％Triton作用10分钟，然后用PBS冲洗3次，每次5分钟；将处理后的24孔板分为两 组，分别加入鼠抗人单克隆抗体和PBS后，放入温度为4℃湿盒内孵育30分钟。30分钟后， 取出孔板，用PBS洗3次，然后分别加入兔抗鼠FITC二抗，放入温度为4℃湿盒内孵育30 分钟，30分钟后，取出孔板，用PBS洗3次后封片，在荧光显微镜下观察和比较上述两个 孔板的诱导后人羊膜间充质细胞的荧光染色，其中若加入PBS对照组诱导后人羊膜间充质细 胞免疫荧光染色表达为阴性，同时加入鼠抗人单克隆抗体的诱导后人羊膜间充质细胞免疫荧 光染色呈阳性，说明步骤(6)得到的细胞是血管内皮样细胞；若加入PBS对照组诱导后人 羊膜间充质细胞免疫荧光染色表达为阴性，同时加入鼠抗人单克隆抗体的诱导后人羊膜间充 质细胞免疫荧光染色呈阴性，说明步骤(6)得到的细胞不是血管内皮样细胞；若加入PBS 对照组诱导后人羊膜间充质细胞免疫荧光染色表达为阳性，同时加入鼠抗人单克隆抗体的诱 导后人羊膜间充质细胞免疫荧光染色呈阴性或阳性，则步骤(6)得到的细胞不确定是血管内 皮样细胞。
在成年机体中，间充质细胞存在于多种组织中，如骨髓、脂肪组织，但提取相当困难。 目前间充质细胞的主要来源为成人骨髓，但成人骨髓间充质细胞(bone marrow-MCs， BM-MCs)细胞数量极少，Pittenger等发现仅0.001％～0.01％的经过密度梯度分离的单核细胞 产生可塑性的贴壁细胞克隆，并且增殖分化潜能随年龄的增大而下降，病毒感染率较高，供 者间充质细胞的采集须行骨髓穿刺术，使来源受到限制。而人类羊膜作为胚胎发育的早期产 物，无论从解剖结构还是在发育行为上，都包含有较为幼稚的胚胎干细胞及趋于成熟的成体 干细胞成分；羊膜组织在胎儿娩出后即完成使命，对其研究不会涉及伦理道德问题；由于羊 膜MCs是来源于胎儿的产物，暴露于母体免疫系统监视下，间充质细胞表面人类白细胞抗原 I(human leucocyte antigen，HLA)-A、B、C不表达，人类白细胞抗原HLA-DR低表达， 从羊膜分离出间充质细胞样细胞，经体外扩增后成功植入新生大鼠和猪体内。上述优势使人 羊膜间充质细胞有望成为人类组织工程和细胞治疗的理想种子细胞。
利用上述方法得到的血管内皮样细胞可以用于重建和修复人体内的血管，激活移植到人 体内的组织，使该组织进行正常的新陈代谢。
附图说明
图1为用本发明方法所得到的血管内皮样细胞在免疫荧光染色后得到的结果；
图2为将用本发明方法所得到的血管内皮样细胞移植治疗骨缺损后，移植区内产生大量 新生小血管和毛细血管；
图3为将用本发明方法所得到的血管内皮样细胞移植后，用抗VIII因子抗原染色，在移 植区内沿新生血管壁可见大量抗VIII因子抗原染色阳性的血管内皮细胞。
具体实施方式
(1)在无菌条件下，从一个从正常足月剖腹产胎儿的胎盘的脐带面，钝性分离出的人羊 膜组织，放入生理盐水中浸泡；
(2)倒掉步骤(1)的生理盐水，用温度为4℃的含有100IU/ml青霉素和100ug/ml链霉 素混合液的生理盐水对上述人羊膜组织进行清洗，直至人羊膜组织无任何杂质和血渍后，在 温度为20～25℃的无菌间，用含100IU/ml青霉素和100ug/ml链霉素的D-hank’s冲洗上述人 羊膜组织3-5遍后，放置在含100IU/ml青霉素和100ug/ml链霉素D-hank’s液中浸泡2小 时；2小时后用D-hank’s液清洗3-5遍；
(3)将清洗后的人羊膜组织加入等体积的0.25％胰蛋白酶消化液，放入37℃水浴锅中消 化15分钟后，倒掉上述消化液，然后再加入等体积的新0.25％胰蛋白酶消化液，放入37℃水 浴锅中消化30分钟后，倒掉上述消化液，在消化时每隔5分钟晃动一次，使人羊膜组织被充 分地消化，加入3ml的含10％FBS的DMEM/F12终止消化，将消化后的羊膜组织用D-hank’s 液清洗直至清洗液澄清为止；
(4)将上述人羊膜组织分离成单个人羊膜间充质细胞；其中采用以下步骤：
(I)将消化后的人羊膜组织用剪刀剪成浆状后放入烧杯中，加入等体积的0.2％胶原蛋 白酶V，然后放入温度为37℃的水浴锅中消化20～30分钟；
(II)将消化后的羊膜浆状液分别用60目细胞筛和200目细胞筛进行过滤，得到细胞悬浊 液；
(III)用无血清DMEM/F12按1∶1的比例稀释上述过滤后细胞悬浊液，然后在室温下将其 放入离心机内以2500r/min转速离心10分钟，10分钟后将上述溶液中的上清液倒掉，然后再 加入DMEM/F12，用吸管将细胞吹打均匀后，再将其放入离心机内以1500r/min转速离心5 分钟，5分钟后将上述溶液中的上清液倒掉，再加入10％FBS和DMEM/F12培养液后，用吸 管将细胞吹打均匀后，使人羊膜间充质细胞个数为1×106个/ml-2×106个/ml；
(5)将得到人羊膜间充质细胞和含10％FBS的DMEM/F12培养液放置培养瓶中，培养 瓶在温度为36.5-37.5℃、饱和湿度、体积分数为4.5％的CO2培养箱中培养，每2-3天更 换全部培养液，培养5-7天，观察培养瓶中人羊膜间充质细胞融合达到85％以上时，去掉 培养液，用D-hank’s液清洗两遍后，再加2ml 0.25％的胰蛋白酶消化液进行消化，在消化过 程中，用显微镜下观察细胞的消化情况，当70％的细胞变化成圆形时，立即加入2ml含 10％FBS的DMEM/F12培养液终止消化，然后用力吹打培养瓶的壁，将贴壁的细胞吹打下来； 将回收的间充质细胞放入离心机内以1500r/min转速每次离心5分钟，共计两次，然后倒掉 上清液，并计算细胞的个数；将上述回收的间充质细胞1×106个/ml-2×106个/ml的密度重 复上述操作进行传代接种培养，直至达到所需细胞数量；
(6)将上述人羊膜间充质细胞悬液中加入含有10％FBS、1×105IU/L青-链霉素、10μg/L VEGF和2μg/L bFGF的M-199内皮细胞诱导培养基，使人羊膜间充质细胞的个数为1×105个 /ml，然后将其接种至24孔板中，每两天更换上述培养基一次，诱导14天后，得到血管内皮 样细胞；
(7)取出一部分从步骤(6)中得到的细胞进行免疫荧光染色或透射电镜鉴定，检测得 到的细胞是否为血管内皮样细胞。其中免疫荧光染色鉴定是采用以下步骤：取一个生长接近 融合状态的诱导后人羊膜间充质细胞的24孔板，用PBS冲洗三次，每次5分钟，然后在室 温下，用4％多聚甲醛将诱导后的人羊膜间充质细胞的状态固定，15分钟后细胞面朝上，再 用PBS冲洗3次，每次5分钟；之后用0.3％Triton作用10分钟，然后用PBS冲洗3次，每 次5分钟；将处理后的24孔板分为两组，分别加入鼠抗人单克隆抗体和PBS后，放入温度 为4℃湿盒内孵育30分钟。30分钟后，取出孔板，用PBS洗3次，然后分别加入兔抗鼠FITC 二抗，放入温度为4℃湿盒内孵育30分钟，30分钟后，取出孔板，用PBS洗3次后封片， 在荧光显微镜下观察和比较上述两个孔板的诱导后人羊膜间充质细胞的荧光染色，其中若加 入PBS对照组诱导后人羊膜间充质细胞免疫荧光染色表达为阴性，同时加入鼠抗人单克隆抗 体的诱导后人羊膜间充质细胞免疫荧光染色呈阳性，说明步骤(6)得到的细胞是血管内皮样 细胞；若加入PBS对照组诱导后人羊膜间充质细胞免疫荧光染色表达为阴性，同时加入鼠抗 人单克隆抗体的诱导后人羊膜间充质细胞免疫荧光染色呈阴性，说明步骤(6)得到的细胞不 是血管内皮样细胞；若加入PBS对照组诱导后人羊膜间充质细胞免疫荧光染色表达为阳性， 同时加入鼠抗人单克隆抗体的诱导后人羊膜间充质细胞免疫荧光染色呈阴性或阳性，则步骤 (6)得到的细胞不确定是血管内皮样细胞。
图1为用本发明方法所得到的血管内皮样细胞在免疫荧光染色后得到的结果，显示体外 培养人羊膜间充质细胞表达血管内皮生长因子受体；
图2为将用本发明方法所得到的血管内皮样细胞移植治疗骨缺损后，移植区内产生大量 新生小血管和毛细血管，实验证实了体内成血管潜能。
图3为用本发明方法所得到的血管内皮样细胞移植后，用抗VIII因子抗原染色，在移植 区内沿新生血管壁可见大量抗VIII因子抗原染色阳性的血管内皮细胞，提示血管生成活跃。
从上述三个图中进一步的证实：用本发明方法所得到细胞为血管内皮样细胞。
以上方法只是对本发明的解释，不是对发明的限定，本发明所限定的范围参见权利要求， 在不违背本发明的精神的情况下，本发明可以作任何形式的修改。
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