技术领域

本发明涉及具有SEQ ID NO：1至43的核酸序列的诱饵寡核苷酸 (decoy-oligonucleotide)和反义寡核苷酸(antisense-oligonucleotide)以及这 些寡核苷酸作为药物的用途。

现有技术

人类基因组解密的一项主要目标在于分别鉴定出致病基因(由于其 产物之作用方式所致)与此类基因所具结构的致病性变化(多形现象)，并 将其归类到一种疾病模式。所以，对于大部份的疾病，若其被认定为由 一经确定数目的基因产物表达得太强、太弱或缺陷所引起时，就会达到 由原因所决定的治疗法。事实上，对于一组遗传疾病(例如囊性纤维化) 就已经知道通常为单一基因缺陷(单基因性疾病)，而对于其他疾病(例如 高血压)则显得明显更为复杂。后者显然地不是单一而是多重基因缺陷 的结果(多基因性疾病)，预先确定了罹患者会发展出与某些环境因素吻 合的疾病。尽管此事实会限制对于在一或多重基因的表达中的目标导向 性介入，却也为一种基于原因而非仅仅基于症状的治疗法提供了一个契 机。

转录因子为DNA-结合蛋白质，其会结合到在细胞核内部一或多重 基因的启动子区，由此调节基因的表达，亦即这些基因所编码的蛋白质 的产生。除了控制人体内发育和分化的过程的重要生理作用之外，转录 因子也显示出高度的诱发疾病之潜在性，特别是其会在错误的时间点活 化基因表达。此外(可能为相同的)转录因子可能阻断具有保护功能的基 因而有使疾病易于形成。于此范围内，在下面所述抗-转录因子治疗法 的原理中，其目标系在致病性基因的抑制与相对的保护性基因之活化。

炎症为生物体和其组织对抗损伤性刺激的一种防卫反应，其目标在 于该损伤的纠正或至少将其限制在局部，并消除掉损伤的诱因(例如入 侵的细菌或外来物质)。炎症的诱发物可能为微生物(细菌、病毒、真菌 或寄生虫)，外来物质(花粉、石棉或硅酸盐结晶)，机械性损伤、化学有 害因子和物理影响所致组织破坏，以及来自身体本身的诱发物(崩溃性 肿瘤细胞、血管外血液、自身免疫性反应)或体内沉淀物质的结晶(尿 酸、草酸钙和磷酸钙、胆固醇)。

肥大细胞(组织内部者)或血液内的嗜碱性粒细胞等的快速活化即为 触发非常强的急性炎症反应的一个例子，且为免疫学的速发型过敏反应 (I型体液变态反应(humoral allergy type I)的特征。若生物体已经在事先 接触到抗原(或于过敏性的情况中接触到过敏原)，则B-淋巴细胞会被致 敏作为对此的反应。B-淋巴细胞会与事先致敏的CD4-阳性2型T-辅助 细胞(Th2细胞)配合而转换成为浆细胞(plasmocyte)，且开始产生对抗抗 原的IgE-型抗体。于此分化过程中，由表达出相应配体(CD154)的Th2 细胞通过CD40-受体产生的B-淋巴细胞之共刺激具有关键重要性。当携 带着抗原的IgE-抗体结合到肥大细胞上面的相应受体(Fcε型)时，这些细 胞即开始释放不同的炎症介质，特别是组织胺、白介素-8、白三烯类、 和肿瘤坏死因子-α(TNFα)。其结果为吸引专职的炎性细胞特别是嗜酸 性(eosinophile)和嗜中性(neutrophile)粒细胞和单核细胞以及现场的T-淋 巴细胞(趋化学性)。同时会发生组织胺依赖性血管扩张及覆盖血管内壁 的内皮细胞的通透性之增加。由于血管扩张，流动速度的减低有助于在 受吸引的白细胞与内皮细胞之间建立物理接触。暴露于细胞因子(例如 TNFα)且由此被活化的这些内皮细胞会显示出选择蛋白(selectin)(例如 E-选择蛋白)在其血管腔表面上的强化表达，促成白细胞沿着内皮细胞滚 动且由此使其他粘附分子(整联蛋白(integrin)；例如细胞间粘附分子-1 (intercellular adhesion molecule-1)[ICAM-1]或血管细胞粘附分子-1 (vascular cell adhesion molecule-1)[VCAM-1])活化。至此白细胞可粘附到 血管壁(边缘化(margination))且组织胺-相关联的通透性之增加(内皮细胞 联结的松散)有利于其移动到血管外空间之内(血球渗出)。于此同时，增 加量的富蛋白质流体(炎性渗出液)达到间质空间而形成水肿。周遭的神 经末端会被组织内增加的压力与炎性细胞产生的其他介质所刺激并触动 疼痛而意识到组织的损伤。

已经移动到炎症部位的粒细胞与已经再分化成巨噬细胞的单核细胞 都尝试分别通过吞噬作用和胞溶作用消除掉炎症诱发因素，由此触发蛋 白水解酶和氧自由基等的释放，而这也可能损伤周遭组织的。特别是巨 噬细胞的活化可能从许多方面(例如进一步释放细胞因子如白介素-1β和 白介素-6)促成使得整个生物体参与了最初为局部的炎症反应，这就是所 谓的急性时相反应(acute phase reaction)。急性时相反应的代表性特性为 疲劳、无精打采和发热，白细胞从骨髓的释放增加(白细胞增多)，在血 液内检测到急性时相蛋白质(例如C-反应性蛋白质)，免疫系统的刺激以 及因为改变后的新陈代谢状态所致体重减低。

若炎症的诱因可以消除时，伤口愈合的过程会与破坏组织的修复同 步。最佳者为此过程会达到完整的再建立(完全恢复(restitutio ad integrum))，而更大的损伤或结缔组织(尤其是胶原蛋白)的过度产生会导 致瘢痕的形成，其可能伴随着取决于受害组织的相当程度的功能障碍。 若诱因(外来物质或伤口感染)不能一次消除掉，则伤口愈合会延缓，同 时增加吞噬细胞的迁移和活性，造成组织的毁灭(坏死)到甚至于腔洞的 形成(脓肿)。其结果几乎总是有瘢痕的组织重建伴随着相应的功能损 失。若不能成功地将来源于诱因的炎症限制在局部，则该炎症会透过淋 巴系统散布到整个生物体。其结果是可能有致命危险的败血症(感染性 休克)。

若炎症和痊愈过程呈平衡情况，伤口痊愈也会受到干扰。其结果为 慢性炎症，可能到制纤维化(过多胶原蛋白合成)或肉芽肿性(炎性细胞组 织化成为肉芽组织)且时常会分别带来受害组织的连续性破坏与其所具 功能的逐步受限。

除了所述可能慢性进展的一般炎症反应之外，炎性疾病还会针对根 本的发病机理展现出一般表现与不同的差异。两种这些类型的疾病为例 如心脏手术介入之后的并发症与免疫不相容性反应，因其具有巨大的临 床相关性而在本说明书中给予较多的篇幅。

以基于球囊插管的机械扩张(经皮血管成形术)与利用静脉搭桥的动 脉粥样硬化性狭窄化动脉搭桥术仍然分别构成患有冠状动脉疾病与周围 循环疾病的患者之首选治疗法以分别提供对抗即将发生的梗塞或器官衰 竭之保护。不过经过机械扩张与(在大部分情况中)使用金属血管支撑器 (支架(stent))处理的动脉之再堵塞(再狭窄)率显然高得不可接受，于6个 月内达20-50％。此外，分别针对有关手术的风险背景与手术后的风险 而论，主动脉冠状动脉和周围静脉搭桥于5年之后50-70％的再堵塞率 对于接受治疗的患者则不仅是令人不满而已。也许是因为血管壁的损伤 (此处受影响者包括内皮细胞和平滑肌细胞)之故，血管成形术之后的再 狭窄在早期阶段别会显示出一种明显的炎症反应成分，其特征为，与其 他一起者，血管壁被专职炎性细胞所侵润(主要为单核细胞和T-淋巴细 胞)。在主动脉冠状动脉与周围静脉搭桥之内的纤维增生性狭窄形成(血 管内膜增殖(intimal hyperplasia))似乎也分别基于炎症反应，特别是由机 械和物理病因所引起者。长久以来就已经知道在外科介入或器官移植范 畴中的所谓缺血/再注入-相关性损伤会伴随着以炎症为基础的组织损 伤，其中在内皮细胞与专职炎性细胞(主要为粒细胞不过也包括单核细 胞和T-淋巴细胞)之间的相互作用以及组织损伤性物质(氧自由基，细胞 因子)的释放起着十分关键性作用。

关于所提及的心血管并发症，重要的是要有保护机制，最重要的是 在血管壁的内皮细胞和平滑肌细胞之内。其有助于限制炎症反应的程度 与随后的组织之适应性重建。对此方面，举例而言，有属于在内皮细胞 内的由NO-合成酶进行的一氧化氮(NO)之合成。NO，可能起着氧自由 基超氧化物的内源性拮抗剂之作用，因此，与其他一起者，会抑制促炎 性细胞因子(例如，单核细胞趋化性蛋白质-1(monocyte chemoattractant protein-1)(MCP-1)与粘附分子(例如ICAM-1)在内皮细胞内的表达，生长 因子受体(例如内皮素B-受体)在平滑肌细胞内的表达以及生长因子从白 细胞的释放。如此，可以容易地了解者，机械性损伤就如内皮的功能性 损伤(例如在这些细胞内由细胞因子诱发的NO-合成酶表达之减低)会抵 消形成所提及的心血管并发症的基础之炎症过程与随后的纤维增生性血 管壁重建。

要在血管成形术之后以药物方式验证再狭窄的所有先前尝试都不能 在大部分患者体内达到合意的效应。目前，有两种局部治疗原理是较有 利者：已经认可过的血管内近距放射线治疗法(vascular brachytherapy)， 即通过对扩张血管段施以短时间放射照射以检查细胞生长之方法，以及 仍然处于临床试验中的药物洗脱支架(drug-eluting stent)。此方法包括用 “饱含(impregnated)”生长抑制性药物(细胞生长抑制剂和免疫抑制剂) 的聚合物涂覆支架，并于数周期间将该等药物慢慢地释放出。大部分最 近的临床研究证明虽然有令人鼓舞的初始结果，但是这两种治疗做法都 不能免于某些程度的严重问题(例如引发梗塞危险的支架内血栓形成(in- stent-thrombosis))。

除了已经描述过的I型免疫不相容性反应之外，原则上还有四种在 免疫调节上分别为变应性和障碍的其他形式。I型反应本身在致敏化 (allergisation)完成之后主要可分为两个阶段：血管活性炎性介质从结合 了IgE的肥大细胞快速释放出和再生，以及由被吸引的嗜酸性粒细胞和 嗜中性粒细胞所介导的晚期反应。完整的I型反应可能依据对过敏原的 暴露而局部性或系统性发生。呼吸空气中的过敏原会诱发呼吸道中的反 应，典型地会并发粘膜水肿和过度分泌(变应性鼻病，枯草热)以及支气 管痉挛(哮喘)，而营养物中的过敏原则诱发胃肠道症状如恶心、呕吐和 腹泻。皮肤对过敏原的反应为发痒与荨麻疹以及异位性皮炎(atopic dermatitis)(神经性皮炎)。不过，假使过敏原直接进入到血流之内(例如 血液制品的注入，药物)或假若对过敏原的暴露特别地强，会导致全身 立即出现反应，可能招致威胁生命的血压降低(过敏性休克)。

于II型反应的情况中，是由具有抗原活性的细胞(例如外来的血细 胞)或细胞外蛋白质(例如在体内天然存在的细胞表面上被药物诱导的变 化)起中心作用。于致敏化之后，再次接触导致IgG-和IgM-型过敏原特 异性抗体的产生，这些可大量地结合到过敏原性细胞(调理作用 (opsonisation))。由此将补体系统(膜作用性复合物之形成)和一特别的淋 巴细胞亚群，天然杀手细胞(NK-细胞)等予以活化。其结果为过敏原性 细胞通过细胞溶解作用(cytolysis)而破坏。当自身抗体作用到身体内天然 产生的结构例如肾血管球微血管的基底膜时，也会诱发类似的反应且由 此诱发伴有急性肾功能不全之急进型肾小球肾炎。除了1型T-辅助细胞 (Th1-细胞，参看下文)之外，经活化的NK-细胞为干扰素-γ的主要产生 者，干扰素-γ为一种细胞因子，可大幅地强化炎症反应，特别是通过 将巨噬细胞活化的炎症反应。

III型反应的特征在于免疫复合物(抗原-抗体复合物)的形成和沉积， 随后活化补体系统与吞噬细胞(粒细胞，巨噬细胞)。这些细胞会在血液 中循环且继而主要沉积于肾血管球的微血管之内，不过也会沉积在关节 内或皮肤内。由此诱发出的炎症反应可能带来(免疫复合物性)肾小球肾 炎，关节内疼痛以及荨麻疹。若免疫系统不能消除掉诱因剂(例如链球 菌)之时，感染也可能诱发系统性III型反应。代表性局部III型反应为免 疫接种之后皮肤内的所谓Arthus反应或于抗原-抗体复合物在肺部中沉 积的情况中发生的外源性过敏性肺胞炎(例如养鸟人肺(bird-breeder lung))。系统性红斑狼疮也是一种III型反应不过因为有自身抗体之形成 而归属于自身免疫性疾病。

与前面所提及的过敏性反应不同，IV型反应不是体液性而是细胞性 且经常要到数天之后才会达到其最高点(迟发型反应或迟发型过敏反 应)。诱发剂主要为蛋白质、侵入的外来生物体(细菌、病毒、真菌和寄 生体)，其他外来蛋白质(例如于乳糜泻情况中的小麦衍生之麦胶蛋白 (gliadin))以及半抗原(haptens)(药物、金属[例如接触性皮肤炎情况中的 镍]，化妆品与植物成分)。移植器官的原发性排异也是一种IV型反应。 抗原会被(组织)巨噬细胞所吞噬、处理与呈递给纯真T-辅助细胞(CD4- 阳性)；T-辅助细胞的致敏化需要花数天之久。以此种方式第二次接触时 T-辅助细胞会变更成为Th1-细胞；其中CD-154介导的抗原呈递细胞(此 细胞系表达CD40-受体)之共刺激扮有重要角色，因为此种信号途径可 触发白介素-12从巨噬细胞被释放出来。白介素-12可起始T-辅助细胞的 分化与增生。Th1-细胞本身则通过某些生长因子(例如GM-CSF)而激发 骨髓中的单核细胞形成，利用某些细胞因子(例如MIF)使之得到补充， 并通过释放IFNγ使之活化。如此所得非常强烈的炎症反应可能大规模 破坏身体内正常的组织(例如结核病)或移植的组织。再者，CD8-阳性细 胞毒性T-细胞参与了移植物排异(细胞溶解)，该CD8-阳性细胞毒性T- 细胞能够辨识其目标(外来细胞表面)，且相应地仅通过像CD4-阳性Th1 细胞一般以事先的抗原呈递将其“武装”起来。

类似于IV型反应的免疫调节障碍可形成例如类风湿性关节炎或多 发性硬化(自身反应性Th1-细胞)以及糖尿病(自身反应性细胞毒性T-细 胞)的基础。除了细菌超抗原(例如TBC诱因剂)和相应的遗传倾向(例如 MHC-蛋白，Th1/Th2平衡缺失)之外，经针对一些诱因剂(例如链球菌) 之特定抗原的、与自身抗原(在身体内产生，分子模拟)交叉反应的T-细 胞也可能对这些自身免疫疾病起著作用。不同的是，第V型反应可能通 过，与其他一起者，活化或阻断激素受体的自体抗体(例如于Basedow’s 病中的促甲状腺激素(thyrotropin))或神经递质受体(例如在重症肌无力 (myasthenia gravis)中的乙酰胆碱)而引发。

与移植物排异可相比-但相反义者-为移植物抗宿主病(graft versus host disease)(GVHD)，其出现于约40％受者的异体骨髓转植(遗传学上 不相同的诸个体之间)的过程中。于持续长达三个月的急性期中，已经 与干细胞一同输注的供体的T-细胞会攻击宿主生物体。所造成的可能为 严重的炎症反应会优先显示在皮肤、胃肠道和肝脏。

为了治疗有关的诱因引起的急性炎病，经常是分别利用非甾体类消 炎药(NSAID，与其他一起，抑制前列腺素之合成)及/或抗感染药物(杀 灭细菌、真菌或寄生虫)和抗病毒化疗药物，偶然也会采用临时局部施 用糖皮质激素(基因表达的通用抑制剂)。于严重或慢性复发性炎性疾病 的情况中，可进行全身方式施用糖皮质激素或免疫抑制剂(抑制T-细胞 活化)或细胞生长抑制剂例如氨甲喋呤(methotrexate)。此亦分别用于器官 和骨髓的移植。虽然其具有无可置疑的治疗效用，不过所提及的药物的 全身性施用仍然可能引发严重的副作用，尤其是在长期施用之时。例 如，服用氨甲喋呤2或更多年的患者之中有多达25％会发展出严重的肝 硬化。更近的特别是用于慢性复发性炎性疾病之活性药物可阻断TNFα 的促炎症效应(proinflammatory effect)：分别针对细胞因子本身及其受体 的抗体，受体的低分子量拮抗剂以及会捕捉细胞因子的经重组产生的可 溶性受体蛋白质。不过在使用受体蛋白质治疗的过程中，有越来越多的 迹象显示感染性疾病(与其他一起者结核病)的发生率有增加，且有约 40％的患者似乎对于治疗根本没有反应(无反应者)。此外，对于经认可 的人源化TNFα-抗体，在起始治疗2-4年之后，也有关于会引起感染乃 至发生败血症的相应的警告。再者，此两种活性药物在紧急事件中都是 禁忌使用者。此外，经认可者还有主要用于治疗哮喘的、白三烯类受体 的低分子量拮抗剂，以及环加氧酶-2(cyclooxygenase-2)的抑制剂，一种 新颖的，具有比传统NSAID显著减低的胃肠副作用的非甾体类消炎药 (NSAID)。再者，有一系列其他——通常为经人源化的——抗体或反义 寡核苷酸为基础的方法分别用以对抗白细胞与内皮细胞的粘附分子、T- 辅助细胞的细胞因子受体或IgE-抗体，这些正处于不同的临床试验阶段 之中。为了避免使用糖皮质激素和抗感染剂一类的药物，必须一致地将 所提及的药物特异地导向于与治疗有相关性的目标分子。

综上所述，本发明以下述问题为基础：针对受患病人的罹病率和死 亡率提供物质用以预防或治疗过度的炎症反应及与此伴随的并发症。

该问题系由本专利权利要求书所界定的主题予以解决。

附图说明

本发明要用下面诸图式予以更详细地说明。

图1显示出在经培养的人类内皮细胞中利用相应的顺式作用元件诱 饵(cis-element-decoy)(SEQ ID NO：33)中和转录因子STAT-1以抑制经细 胞因子刺激的CD40(a、b、d和e)、E-选择蛋白和MCP-1之表达(a)以 及经CD40配体诱导的白介素-12p40表达。(a)在经与STAT-1顺式作用 元件诱饵(SEQ ID NO：33)或NF-κB顺式作用元件诱饵(10μM)预孵育4 小时且随后与100U/毫升肿瘤坏死因子-α和1000U/毫升干扰素-γ孵育 9小时的内皮细胞内进行的E-选择蛋白、MCP-1和CD40mRNA-表达之 代表性RT-PCR-分析(此外将光密度计分析(“强度”)表为经刺激的对照 样品之％且相对于内标准样品rp132进行参比)。(b)在经与STAT-1顺式 作用元件诱饵(10μM；SEQ ID NO：33)预孵育4小时且随后与约670000 个P3xTB.A7-细胞/毫升(这些小鼠骨髓瘤细胞会稳定地表达人类CD40- 配体CD154)和1000U/毫升干扰素-γ孵育12小时的内皮细胞内进行的 白介素-12p40mRNA-表达之代表性RT-PCR-分析(此外将光密度计分析 (“强度”)表为经刺激的对照样品之％且相对于内标准样品rp132进行参 比)。(c)在经与STAT-1顺式作用元件诱饵(SEQ ID NO：33)或相应的对照 寡核苷酸(STAT-1-25mut)预孵育4小时(浓度10μM)且随后与100U/毫 升肿瘤坏死因子-α和1000U/毫升干扰素-γ孵育12小时的内皮细胞内 进行的CD40mRNA-表达之代表性RT-PCR-分析(此外将光密度计分析 (“强度”)表为经刺激的对照样品之％且相对于内标准样品EF-1进行参 比)。(d)对于STAT-1顺式作用元件诱饵(SEQ ID NO：33)对在经培养的内 皮细胞中所进行的经细胞因子刺激的CD40mRNA-表达的影响所做的5 个独立实验之统计学分析小结(*p＜0.05相对于经刺激的对照细胞)。(e) 对于STAT-1顺式作用元件诱饵(SEQ ID NO：33)对在经培养的内皮细胞 中所进行的经细胞因子刺激的CD40蛋白质-表达24小时之后的影响之 代表性Western印迹分析与光密度分析(“强度”表示为经刺激的对照样品 之％且相对于内标准样品β-肌动蛋白(β-actin)进行参比)。于其他实验 中也得到可相比较之结果。

图2显示出在经培养的人类内皮细胞中通过基于反义寡核苷酸的转 录因子STAT-1的表达的下调抑制经细胞因子刺激的CD40基因表达。 (a)CD40-蛋白质和STAT-1-蛋白质分别在静止条件下以及在将细胞与 100U/毫升肿瘤坏死因子-α和1000U/毫升干扰素-γ孵育14小时之后 的表达。图中左格显示出使用不同批次细胞进行的2-4次实验之统计学 分析小结，图中右格显示出代表性Western印迹分析与光密度分析(“强 度”表示为未经刺激的对照样品之％且相对于内标准样品β-肌动蛋白(β- actin)进行参比)(*p＜0.05相对于未经刺激的对照细胞)。(b)在使用 STAT-1-反义寡核苷酸(1μM；SEQ ID NO：33)预处理24小时的经刺激 的内皮细胞中，CD40-蛋白质和STAT-1-蛋白质的表达之可相比较的抑 制。2次实验的结果的小结(图中左格；*p＜0.05相对于经刺激的对照细 胞)与代表性Western印迹分析(图中右格)。

图3显示出转录因子IRF-1在单核细胞系THP-1中的表达(a)以及 NO-合成酶的诱导型异构体(inducible isoform)在经培养的人类平滑肌细 胞中的表达利用相应的顺式作用元件诱饵(SEQ ID NO：33)中和转录因子 STAT-1之抑制作用。(a)代表性Western印迹分析与光密度分析(“强度” 表示为经刺激的对照样品之％且相对于内标准样品β-肌动蛋白。经培养 的THP-1-细胞系与顺式作用元件诱饵(10μM)预孵育4小时且随后与 100U/毫升肿瘤坏死因子-α和1000U/毫升干扰素-γ孵育3小时。(b) 图中左格：使用与STAT-1顺式作用元件诱饵(SEQ ID NO：33)、NF-κB 顺式作用元件诱饵或GATA-2顺式作用元件诱饵(10μM)预孵育4小时 且随后与1000U/毫升干扰素-γ，60U/毫升白介素-1β，100U/毫升肿 瘤坏死因子-α和1微克/毫升细菌脂多糖孵育9小时的不同批次经培养 的人类平滑肌细胞所进行的3个实验之统计学分析小结。NO-合成酶的 诱导型异构体mRNA-表达之RT-PCR-分析(*p＜0.05相对于经刺激的细 胞＝100％)。图中右格：使用不同批次细胞进行的3个实验之统计学分 析小结及通过分别与STAT-1顺式作用元件诱饵(SEQ ID NO：33)和NF- κB顺式作用元件诱饵预孵育以对NO-合成酶蛋白质的经细胞因子刺激 的表达(暴露20小时之后)产生抑制之代表性Western印迹分析(*p＜0.05 相对于经刺激的细胞＝100％)。

图4显示出使用不同的顺式作用元件诱饵(SFQ ID NO：17、25、 29、31、33、35、37、39和突变的对照寡核苷酸STAT-1-19mut和 STAT-1-25mut)对单核细胞系THP1的细胞核提取物中所含内源性 STAT-1的中和。代表性EMSA分析。经培养的THP-1细胞系与100U/ 毫升肿瘤坏死因子-α和1000U/毫升干扰素-γ孵育3小时且随后即用来 制备细胞核提取物。将细胞核提取物分别与[32p]-标记的双链SIE-寡核苷 酸(Santa Cruz Biotochnologie，Heidelberg，Germany)及相应的顺式作用元 件诱饵和对照寡核苷酸在室温下共孵育20分钟且随后施以电泳移动偏 移分析。

图5显示出所选出的STAT-1顺式作用元件诱饵(SEQ ID NO：17、 31、35、37)对于E-选择蛋白和MCP-1mRNA在得自胸腺静脉的人类平 滑肌细胞中的表达之影响。培养细胞(第2道)与相应的顺式作用元件诱 饵(10μM)预孵育4小时且随后与100U/毫升肿瘤坏死因子-α和1000U/ 毫升干扰素-γ孵育9小时。代表性RT-PCR-分析，于其他实验中得到 可相比较的结果。

图6以基因图谱示意地显示出STAT-1-反义表达载体pCI/Statl AS 的结构。

图7显示出使用不同的顺式作用元件诱饵(SEQ ID NO：17、19、 27、33和39)对于经培养的内皮细胞中所含STAT-1进行中和的结果。 代表性EMSA-分析，与光密度分析(“强度”)。经培养的内皮细胞系与诱 饵寡核苷酸(10微摩尔/升)孵育4小时且随后用100U/毫升肿瘤坏死因 子-α和1000U/毫升干扰素-γ刺激30分钟。对于EMSA-分析，使用经 刺激的细胞的细胞核提取物和[32p]-标记的双链SIE-寡核苷酸(Santa Cruz Biotochnologie，Heidelberg，Germany)。

图8显示出STAT-1顺式作用元件诱饵(STAT-1 cons，10nmol， SEQ ID NO：19)而非突变的对照寡核苷酸(STAT-1mut，10nmol，SEQ ID NO：61)对于在雄豚鼠体内经DNCB-诱导的接触性皮肤炎的影响的组织 学分析(原始x400，总共17只受检豚鼠的典型结果)。

本发明人已经鉴定出参与在人类内皮细胞和平滑肌细胞中以及在单 核细胞中细胞因子介导的促炎性基因产物(CD40、E-选择蛋白、NO-合 成酶的诱导型异构体、白介素-12[p40]、MCP-1)表达的增加中的转录因 子。由此可以证明，在经培养的内皮细胞中使用TNFα和CD154分别与 IFNγ组合进行刺激的情况中，于转录因子核因子κB(nuclear factor κB， NF-κB)与转录信号转导子与活化子-1(signal transducer and activator of transcription-1，STAT-1)之间存在着协同作用(synergism)。相同的情形 也分别发生于经培养的平滑肌细胞和单核细胞。

IFNγ单独地能够增加CD40在人类内皮细胞内的表达，而E-选择蛋 白或白介素-12则不能。对于很难且非组成型地在内皮细胞内分别表达 的此两种基因产物之表达，有必要分别与TNFα(E-选择蛋白)和 CD154(白介素-12)同时刺激细胞。再者，另一转录因子，干扰素调节因 子-1(IRF-1)的重新(de novo)表达为IFNγ-介导的CD40而不是E-选择蛋 白在内皮细胞和单核细胞内的表达之增加所必需。于这些分析的范围之 内，可以证明IRF-1-蛋白质表达在使用IFNγ且特别是使用TNFα单独刺 激细胞的情况中比在两种细胞因子都存在的情况中显著地较为弱。根据 此点，转录因子NF-κB和STAT-1在IRF-1基因的转录情况中也会协同 地作用(Ohmore等，J.Biol.Chem.，(1977)，272，14899)。

STAT-1(分别为GenBank Accession Number NM007315和 XM010893及http://transfac.gbf.de/cgi-bin/qt/getEntry.pl？t0149)系属于一 组包括至少6种成员的转录因子。STAT-1基因产物系由大部分细胞所 组成型地表达，不过通常系以非活性单体型蛋白质之形式(91kDa)存在 于细胞质之内。此种p91-亚单位(subunit)的酪氨酸-磷酸化与后续的两个 这种p91-亚单位(称为STAT-1α)的结合(二聚体化)可促成从此时起成为 活性的转录因子运载到细胞核之内。也可以进行与STAT-1β所含p84- 亚单位(相同基因的不同剪切产物)的异二聚体化(hetero-dimerisation)。以 组成方式存在的亚单位之磷酸化是通过细胞质janus激酶(janus-kinases) 依赖刺激而发生的。所以，两种janus激酶(Jak1和Jak2)都会受IFNα所 刺激(更好地回复到干扰素受体)；与此相反，就(病理)生理学而言，作 为STAT-1活化的最重要的刺激，IFNγ，则只刺激Jak2。不同的生长因 子和肽类激素(例如血管紧张素II)也会活化STAT-1；除了固有的(生长 因子)受体酪氨酸激酶之外，还有一种有丝分裂原活化的蛋白激酶(MAP- 激酶)也对此具有作用。与STAT-1α不同，STAT-1β不具有反式激活活 性(transactivating activity)，亦即基因表达刺激活性。

STAT-1参与在白细胞、内皮细胞和平滑肌细胞中的一系列潜在促 炎性基因产物的表达之中，其中转录因子的活化经常以IFNγ-依赖性方 式发生。一项例外为，白介素-6在血管紧张素II-刺激血管平滑肌细胞内 的STAT-1-依赖性表达(Schieffer等，Circ.Res.(2000)，87，1195)。蛋白 质，也包括STAT-1，可经使用非常不同的方式来抑制其活性。如此， 可以使用，例如，抗STAT-1抗体以及天然或合成的物质来减低STAT- 1与DNA的相互作用，亦即，降低转录活性。再者，也可以抑制导致 STAT-1活化的信号途径(Jak1、Jak2、受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine- kinases)、MAP-激酶)。要将STAT-1的活性特异性地抑制所用的优选的 方法为：

1.使用诱饵寡核苷酸中和(抑制(squelching))活化的转录因子，

2.利用反义寡核苷酸抑制STAT-1-蛋白质表达，与

3.利用反义表达载体抑制STAT-1-蛋白质表达。

本文中所使用的术语“诱饵寡核苷酸”或“顺式作用元件诱饵”分 别指称双链DNA分子和双链DNA寡核苷酸。两条DNA链均具有一互 补序列。于本发明中，顺式作用元件诱饵具有的序列与基因组内的天然 STAT-1核心结合序列一致或类似，且其可被细胞内部的转录因子 STAT-1所结合。如此，顺式作用元件诱饵可作为STAT-1竞争抑制(优 选的为中和作用)中所用的分子。

本发明的一方面提供了能够以序列特异性方式结合转录因子STAT- 1的双链DNA寡核核苷酸，该双链DNA寡核核苷酸具有下列序列之 一，虽然此处只示出每一种此类双链DNA寡核核苷酸所含的一条链， 不过其互补链也包括在本发明之内：

5′-NTTNCBGDAAN-3′(SEQ ID NO：1)，

5′-ATTACCGGAAG-3′(SEQ ID NO：3)，

5′-ATTCCGGTAAG-3′(SEQ ID NO：5)，

5′-ATTCCTGGAAG-3′(SEQ ID NO：7)，

5′-ATTCCTGTAAG-3′(SEQ ID NO：9)，

5′-GTTCCAGGAAC-3′(SEQ ID NO：11)，

5′-GTTCCCGGAAG-3′(SEQ ID NO：13)，

5′-GTTCCGGGAAC-3′(SEQ ID NO：15)，

5′-TGTGAATTACCGGAAGTGAGA-3′(SEQ ID NO：17)，

5′-TGTGAATTACCGGAAGTG-3′(SEQ ID NO：19)，

5′-AGTCAGTTCCAGGAACTGACT-3′(SEQ ID NO：21)，

5′-ATGTGAGTTCCCGGAAGTGAACT-3′(SEQ ID NO：23)，

5′-ACAGTTCCGGGAACTGTC-3′(SEQ ID NO：25)，

5′-GACAGTTCCGGGAACTGTC-3′(SEQ ID NO：27)，

5′-GTGTATTCCGGTAAGTGA-3′(SEQ ID NO：29)，

5′-TTATGTGAATTCCTGGAAGTG-3′(SEQ ID NO：31)，

5′-CATGTTATGCATATTCCTGTAAGTG-3′(SEQ ID NO：33)，

5′-TGTGAATTCCTGTAAGTGAGA-3′(SEQ ID NO：35)，

5′-TGCATATTCCTGTAAGTG-3′(SEQ ID NO：37)，

5′-ATATTCCTGTAAGTG-3′(SEQ ID NO：39)。

若在人类内皮细胞内使用根据本发明针对STAT-1的诱饵寡核苷酸 而不是个别对照寡核苷酸，则细胞因子诱导的CD40表达(包括用IFNγ 进行单一刺激及与IFNγ和TNFα组合刺激两种情况)会被显著地抑制超 过50％。假若细胞的刺激是用IFNγ与TNFα和CD154分别进行，此种 情况也分别发生于E-选择蛋白及MCP-1和白介素-12(p40)的表达之中。 根据此点，将STAT-1活性消除掉会带来一组促炎性基因产物在人类内 皮细胞内的表达之高度明显的抑制。如此即可在此种治疗措施的情况中 于炎性疾病范围之内构思出使内皮-白细胞相互作用(E-选择蛋白，MCP- 1)的明显减低，而且也可使抗原呈递细胞(例如巨噬细胞和B-淋巴细胞) 与T-淋巴细胞(CD40、白介素-12)的相互作用明显减低。类似地，此种 情形也发生于已经证明的在THP-1单核细胞内的细胞因子诱发的IRF-1 表达的减低(且由此将IRF-1依赖性基因的表达下调)之中，以及细胞因 子诱导的包括诱导型NO-合成酶在内的所述基因产物在人类平滑肌细胞 中的表达减低之中。

因此，STAT-1活性的特异性抑制所用的一种优选的方法为使用根 据本发明的含有STAT-1的结合位点的双链DNA寡核核苷酸，也称为 顺式作用元件诱饵或诱饵寡核苷酸。从外部给细胞提供大量的转录因子 结合位点，特别是远大于基因组内所含数目的转录因子结合位点会产生 一种状况，其中有大部分的某一种转录因子会特异地结合到相应的顺式 作用元件诱饵而不会结合到其内源性靶结合位点。对转录因子与其内源 性结合位点的结合予以抑制所用的这些方法也称为抑制(squelching)。使 用顺式作用元件诱饵对转录因子的抑制(也叫做中和)可以成功地用来抑 制细胞的生长。于此使用了含有对转录因子E2F的特异性转录因子结合 位点之DNA片段(Morishita等，PNAS(1995)92，5855)。

防止转录因子STAT-1结合所用的核酸序列为例如在细胞内部可与 STAT-1自然结合之序列。STAT-1可特异地结合到具有下述序列的基序 (motive)5’-NNNSAN TTC CG GG AANTGNSN-3’，其中的符号为：N＝ A、T、C或G且S＝C或G。具有下划线的碱基的严格共有序列 (consensus)以及这些碱基间的距离对于STAT-1的有效结合都是极为重 要的。所以，根据本发明的顺式作用元件诱饵可能具有下述11体(11- mer)共有核心结合序列：5’-NTTNCBGDAAN-3’(SEQ ID NO：1)，其中 的符号为：B＝C、G或T，D＝A、G或T且N＝A、T、C或G。再 者，该顺式作用元件诱饵可以大于该11体核心结合序列，且可在5’-端 及/或3’-端延长。在该核心结合序列区内的相应突变会导致STAT-1对 诱饵寡核苷酸之结合的妨害。

由于该顺式作用元件诱饵为一种双链核酸，因此根据本发明的 DNA寡核核苷酸不仅包括有义或正向序列，而且也包括互补的反义或 反向序列。本发明的优选的DNA寡核苷酸具有如涵盖在SEQ ID NO：3 至SEQ ID NO：16之内的STAT-1的11体核心结合序列。

不过该顺式作用元件诱饵也可以具有不同于前述序列且比11体更 长的序列。特别优选的为诸如涵盖在SEQ ID NO：17至SEQ ID NO：40 之内的序列。这些顺式作用元件诱饵含有2个分别针对STAT-1的结合 位点。

“2个结合位点”于此涉及有义链和反义链。此优选的序列名单不 具限制性。对于本领域人员是显而易知的，有众多序列可以用为STAT- 1的抑制剂，只要其具有先前提及的11体共有核心结合序列与对STAT- 1的亲和力之条件即可。

核酸序列对STAT-1的结合亲和力可通过使用电泳迁移率变动分析 (EMSA)予以评定(Sambrook等(1989)，Molecular Cloning.Cold Spring Harbor Laboratory Press；Krezesz等(1999)，FEBS Lett.453，191)。此种检 验系统适合用于预期用在本发明方法中的核酸的质量控制，或用来测定 结合位点的最佳长度。其亦适合用来鉴定会被STAT-1结合之其他序 列。对于EMSA，打算用来分离新的结合位点时，最适当者为经纯化或 经重组表达的STAT-1形式，其可以用于数个更迭回合的PCR-扩增 (PCR-amplification)并以EMSA进行选择(Thiesen and Bach(1990)， Nucleic Acids Res.18，3203)。

已知在启动子(promoter)区或增强子(enhancer)区含有STAT-1结合 位点之基因中，或STAT-1对其表达具重要性的功能迹象且因而成为以 本发明方法予以特异性抑制的可能的靶基因中，除了CD40-基因、E-选 择蛋白基因、可诱导型NO-合成酶基因、白介素-12(p40)-基因、和 MCP-1-基因之外，还有其他促炎性基因，例如IFNγ本身，细胞因子白 介素-6，粘附分子ICAM-1，PECAM-1(血小板内皮细胞粘附分子- 1(platelet endothelial cell adhesion molecule-1))，RANTES(活化调节，正 常T-细胞表达，可能分泌(regulated upon activation，normal T-cell expressed，presumed scrected)；由T-淋巴细胞可溶性分泌)和VCAM-1， 趋化因子白介素-8、IP-10(干扰素-诱导型蛋白质-10)与Mig(γ-干扰素诱 导出的单核因子(monokine))以及MHC-蛋白质I和II。于此，不论这些 基因的表达是否由STAT-1直接地或间接地调节都没有关系(例如通过 IRF-1的STAT-1-依赖性表达)。

本发明方法可调控一基因或多基因的转录，其方式为使得该基因或 该多基因，例如E-选择蛋白，不表达或较低地表达。在本发明范围之 内，经减低或经抑制的表达意指相对于没有使用根据本发明的双链 DNA寡核核苷酸处理过的细胞比较之下转录速率较为减低。此种减低 可以使用，例如Northern-blot印迹分析(Sambrook等，1989)或RT-PCR (Sambrook等，1989)予以测定。通常这些减低至少为2倍，特别者至少 为5倍，更特别者至少10倍的减低。活化的丧失可能通过例如若 STAT-1以转录激活子形式作用于某一基因且因此激活子的抑制导致该 靶基因的表达的缺失而达到。

此外，本发明方法有助于基因表达的抑制之解除，条件是将该表达 的阻断的原因是通过一具有组成型活性或(在重复细胞刺激之后)用一活 化的转录因子。对此的一个例子为，前内皮素原-1基因(prepro- endothelin-1-gene)在兔颈静脉(V.jugularis)天然内皮细胞内的表达之抑 制，可以通过以针对转录因子CCAAT/增强子结合性蛋白质的顺式作用 元件诱饵予以解除(Lauth等，J.Mol.Med.(2000)，78，441)。对此，意指基 因表达的抑制可经解除使其产物发挥出保护性效用，例如对抗炎性疾 病。如此，例如NO-合成酶的内皮细胞的异构体，其产物NO对于内皮 细胞内的促炎性粘附分子和细胞因子的表达之抑制起着关键性作用，可 用IFNγ予以下调(Rosenkranz-Weiss等(1994)，J.Clin.Invest.93，1875)。 对抗STAT-1的顺式作用元件诱饵可通过抑制STAT-1对内皮NO-合成 酶基因所含启动子中的相应结合位点之结合而逆转此非合意的效应。

寡核苷酸通常会被核酸内切酶和核酸外切酶所快速降解，尤其是被 DNase和RNase在细胞内所降解。所以，DNA寡核核苷酸可经修饰以 稳定化而对抗降解，由此在细胞内可以长时期地维持住一高浓度的寡核 苷酸。通常此种稳定化可通过导入一或多种经修饰的核苷酸间连键而得 到。

经成功地稳定化的DNA寡核核苷酸不一定在每一核苷酸间连键都 含有一修饰。优选的是将在顺式作用元件诱饵的两寡核苷酸之相应末端 的核苷酸间连键予以修饰。其中可以将最后的六、五、四、三、二个或 最后一个或在最后六个核苷酸间连键中的一或多个核苷酸间连键予以修 饰。另外，在核酸中可以插入经不同修饰的核苷酸间连键且由此产生的 双链DNA寡核核苷酸可通过使用常规EMSA-检验系统分析与STAT-1 的序列特异性结合。此检验系统可以用来测定顺式作用元件诱饵的结合 常数及因而测定其亲和力是否因该修饰而改变。可以选择仍然显示出充 足的结合作用之经修饰顺式作用元件诱饵，其中充分的结合意指为未修 饰核酸的结合之至少约50％或至少约75％，且特别优选的为约100％。

仍然显示出充足的结合作用之具有经修饰的核苷酸间连键的顺式作 用元件诱饵可以测试其在细胞内是否比未修饰顺式作用元件诱饵较为稳 定。对使用根据本发明的顺式作用元件诱饵“转染”的细胞测试在不同 的时间点仍然可利用的顺式作用元件诱饵的量。其中，优选的为使用经 荧光染料(例如得克萨斯红(Texas-red))标记的顺式作用元件诱饵或经放 射性(例如32P)标记的顺式作用元件诱饵，随后分别施以数字荧光显微 术和放射自显术或闪烁扫描法(scintigraphy)。经成功修饰的顺式作用元 件诱饵在细胞内具有比未经修饰的顺式作用元件诱饵更为长的半寿期， 优选的至少约48小时，更优选的至少约4天，且最优选的至少约7 天。

适当的修饰核苷酸间连键经摘列于Uhlmann和Peyman((1990) Chem.Rev.90，544)之中。可以用于本发明的方法之中的在核酸内的经 修饰的核苷酸间磷酸残基及/或非磷桥联(non phosphorus-bridge)包括例如 甲基膦酸酯(methylphosphonate)、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷 酸酯、磷酸酯，而非磷核苷酸间类似物包括例如硅氧烷桥联、碳酸酯桥 联、羧甲基酯桥联(carboxymethylester-bridges)、乙酰胺酸酯桥联 (acetamidate-bridges)、及/或硫醚桥联。在使用经硫代磷酸酯修饰的核苷 酸间连键的情况中，其优选的不要位于胞嘧啶碱基与鸟嘌呤碱基间，因 为若是如此，其可能导致顺式作用元件诱饵的靶细胞的活化。

本发明另一具体实施方式为通过在核酸中插入结构特定性所得核酸 之稳定化，此举可以增长该核酸的半寿期。含有发夹型和钟型DNA的 这些结构经揭示于US5,683,985之中。同时，可以将经修饰的核苷酸 间-磷酸-残基及/或非磷-桥联与所述的结构一起导入。接着可以对如是所 得的核酸在上文所述检验系统中测试结合作用与稳定性。

核心结合序列不仅可以存在于顺式作用元件诱饵之中而且可以存在 于载体(vector)之中。在一个优选的具体实施方式之中，该载体为一质粒 载体(plasmid vector)且特别是一种能够自体复制以增加所导入的双链核 酸所具稳定性之质粒载体。

本发明的顺式作用元件诱饵可以迅速地被摄取到细胞之内。足够的 摄取之特征在于一或多种会受STAT-1所控制的基因的表达之调控现 象。本发明的顺式作用元件诱饵优选的为在与细胞接触约4小时之后， 更佳者在约2小时之后，在约1小时之后，约30分钟之后且最佳者在 约10分钟之后调控一基因或多基因的转录。在这些实验中使用的典型 混合物含有10微摩尔/升的该顺式作用元件诱饵。

另外，本发明涉及根据本发明的顺式作用元件诱饵在药物制造中的 用途。进一步地，本发明涉及根据本发明的顺式作用元件诱饵在一药物 的制造中之用途，该药物用以预防或治疗心血管并发症(例如，在经皮 血管成形术之后的再狭窄，静脉搭桥术的狭窄)，移植物排异，移植物 抗宿主病(graft versus host disease)(GVHD)，在外科介入范畴中的缺血/ 再注入相关性损伤，免疫过敏性反应(I型至第V型)，自身免疫性疾病 (例如，糖尿病、多发性硬化症、类风湿性关节炎)以及所有形式的急 性、亚急性和慢性炎性疾病，特别是累及关节处者(例如，关节炎)，累 及呼吸器官者(例如，支气管哮喘(bronchial asthma)、慢性支气管炎)，累 及皮肤者(例如，牛皮癣(psoriasis)、神经性皮炎(neurodermitis))以及累及 胃肠道者(例如，溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)、克隆氏病(Chron’s disease))，包括感染性休克(septic shock)。

此外，本发明也涉及一种在细胞内，特别是在内皮细胞、表皮细 胞、白细胞、平滑肌细胞、角质细胞或纤维母细胞之内调控至少一种基 因的转录的方法，包括下述步骤：将所述的细胞与一混合物接触，该混 合物含有一或多种能够以序列特异性方式结合到转录因子STAT-1的一 或多种根据本发明的双链核酸。一优选的方法为，例如，对含有T-淋巴 细胞的骨髓捐赠者在将其导入受者身体内之前给予离体处理(ex vivo treatment)。

另外，根据本发明的顺式作用元件诱饵也可以置于一组合物中给患 者施用或用于根据本发明的方法之中。含有根据本发明的顺式作用元件 诱饵之组合物(于后文中称为混合物)即可与靶细胞(例如，内皮细胞、表 皮细胞、白细胞、平滑肌细胞、角质细胞或纤维母细胞)接触。此接触 的目的为将结合STAT-1的顺式作用元件诱饵转移到该靶细胞(亦即， 以STAT-1依赖性方式表达出促炎性基因产物之细胞)之内。所以，已 知可以改善膜的穿透之核酸修饰及/或添加剂或辅助物质都可以用于本发 明的范围之内(Uhlmann and Peyman(1990)，Chem.Rev.90，544)。

于一优选的具体实施方式中，根据本发明的混合物只含有核酸和缓 冲液。适当的顺式作用元件诱饵之浓度在至少0.1至100μM的范围之 内，优选的者10μM，于其中加入一或多种适当的缓冲液。这些缓冲液 的一个例子为林格溶液(Ringer’s solution)，其中含有145毫摩尔/升的 Na+、5毫摩尔/升的K+、156毫摩尔/升的Cl-、2毫摩尔/升的Ca2+、1毫 摩尔/升的Mg2+、10毫摩尔/升的HEPES、10毫摩尔/升的D-葡萄糖、 pH7.4。

于本发明另一具体实施方式中，该混合物另外含有至少一种添加剂 及/或辅助物质。诸如脂质、阳离子脂质、聚合物、脂质体、纳米粒子、 核酸-适合体(nucleic acid-aptameres)、结合了DNA的肽和蛋白质等或合 成的肽-DNA-分子等之添加剂及/或辅助物质都为预期使用者，以期(i)增 加，例如，核酸导入到细胞之内，以期(ii)仅将混合物导向一细胞亚群， 以期(iii)在细胞内抑制核酸的降解，以期(iv)在其使用之前帮助核酸混合 物的贮存。肽类和蛋白质或合成的肽-DNA-分子的例子有例如抗体、抗 体片段、配体、粘附分子等，其全部都可经修饰或可以不经修饰。

可以将顺式作用元件诱饵稳定化在细胞内部的添加剂为例如核酸- 浓缩物质(nucleic acid-condensing substance)诸如阳离子聚合物、聚-L-赖 氨酸或聚乙亚胺。

本发明方法中所使用的混合物优选的是通过注射、插管、栓剂、气 雾剂(分别经鼻和经口喷入，吸入)、套管针、投射(projectile)、Pluronic 凝胶、可将药物持续释放的聚合物、或有助于局部进入的任何其他装置 等进行局部施用。将本发明方法中所使用的混合物进行离体使用(ex vivo use)也可以促成局部进入。

不过，STAT-1活性的抑制可以不仅是在前述方法中于蛋白质层次 上予以抑制，而且可以在转录因子蛋白质的转译之前或之中就予以完 成。该抑制可以用所谓的反义寡核苷酸予以实施。反义寡核苷酸可以在 三个不同的层次上抑制靶基因的合成，亦即，在转录之过程中(防止 hnRNA-合成)，于hnRNA的处理(剪切)导致mRNA之过程中及在在核 糖体上面mRNA转译成蛋白质之过程中。利用反义寡核苷酸来抑制基 因表达所用的方法系一种现有技术且为本领域人员所熟知。本发明另一 方面为可特异地抑制STAT-1表达且具有下列序列中之一的反义寡核苷 酸：

5′-TACCACTGAGACATCCTGCCAC-3′(SEQ ID NO：41)，

5′-AACATCATTGGCACGCAG-3′(SEQ ID NO：42)，

5′-GTGAACCTGCTCCAG-3′(SEQ ID NO：43)。

该反义寡核苷酸可为单链DNA分子，RNA分子或为单链DNA- RNA杂合分子。该反义寡核苷酸更可具有一或多个经修饰的核苷酸间连 键，例如前面对顺式作用元件诱饵所述及者。在通过硫代磷酸-修饰核 苷酸间连键予以稳定化的反义寡核苷酸的情况中，特别要考虑到在胞嘧 啶碱基与鸟嘌呤碱基间不要插入硫代磷酸-修饰核苷酸间连键，因为如 此可能导致——特别是——具有免疫活性的细胞(例如内皮细胞)的类似 被IFNγ活化且因而会，至少部分地，阻碍产生合意的治疗效果。

该反义寡核苷酸不仅可以用单链核酸分子之形式施用，而且可以用 包含在一载体内的形式施用。在一优选的具体实施方式中，该载体为一 质粒载体且特别是一种能够自体复制由此可增加所导入的单链核酸所具 稳定性的质粒载体。

本发明的另一方面因而为一种反义寡核苷酸载体，于转染之后其本 身要在靶细胞内部表达且会特异地抑制STAT-1的表达。于此，可以考 虑根据现有技术可得到的任何真核生物表达载体。优选的考虑Promega 公司的pCI-质粒(目录编号No.E1731，GenBank Accession Number U47119)，其中将包括STAT-1基因节段(segment)的2350bp(-121至 +2229，GenBank Accession Number XM010893)以相反方向(3’→5’)克 隆。此STAT-1基因节段的侧翼接着两个EcoRI限制位点且含有一个 XhoI限制位点。其表达受到CMV-启动子的控制。整个质粒(称为 pCI/Statl AS)包括6365bp。

以反义寡核苷酸为基础的STAT-1蛋白质表达之调控也可以在人类 内皮细胞中抑制经细胞因子诱导的CD40-表达，达到与用诱饵寡核苷酸 者相同的程度。

此外，本发明涉及本发明的反义寡核苷酸在药物制造中的用途。进 一步地，本发明涉及根据本发明的反义寡核苷酸在一种药物的制造中的 用途，该药物用以预防或治疗心血管并发症(例如，在经皮血管成形术 之后的再狭窄，静脉搭桥术的狭窄)，移植物排异，移植物抗宿主病 (graft versus host disease)(GVHD)，在外科介入范畴中的缺血/再注入相 关性损伤，免疫过敏性反应(第I至V型)，自身免疫性疾病(例如，糖尿 病、多发性硬化症、类风湿性关节炎)以及所有形式的急性、亚急性和 慢性炎性疾病，特别是累及关节处者(例如，关节炎)，累及呼吸器官者 (例如，支气管哮喘(bronchial asthma)、慢性支气管炎)，累及皮肤者(例 如，牛皮癣(psoriasis)、神经性皮炎(neurodermitis))以及累及胃肠道者(例 如，溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)、克隆氏病(Chron’s disease))，包括 感染性休克(septic shock)。

另外，根据本发明的反义寡核苷酸也可以置于一组合物中给患者施 用。该组合物可包括稳定化性添加剂或辅助物质以帮助，例如，将该反 义寡核苷酸导入到细胞内，将组合物仅导向到一细胞亚群，防止例如该 反义寡核苷酸在细胞内部的降解，或帮助例如在使用之前该反义寡核苷 酸的贮存。

下面的图式和实施例仅用来示范说明用而不是要用来以任何形式限 制本发明的范围。

实施例

1.细胞培养

通过用1.6U/毫升的溶于HEPES-修饰Tyrode溶液的分散酶(dispase) 在37℃下处理30分钟而从脐带静脉分离出人类内皮细胞，且置于经明 胶包被(2毫克/毫升明胶/0.1N HCl，在室温下30分钟)的6-孔组织培养 皿上，于1.5毫升M199培养基(Gibco Life Technologies，Karlsruhe， Germany)中培养，其中含有20％胎牛血清，50U/毫升青霉素，50微克/ 毫升链霉素，10U/毫升制霉菌素(nystatin)，5mM HEPES和5mM TES，1微克/毫升肝素和40微克/毫升内皮生长因子。这些细胞以其典 型的铺路石型态，对von Willebrandt-因子(vWF)的阳性免疫染色及用荧 光计检测(FACS)PECAM-1(CD31)，以及对平滑肌α-肌动蛋白(α-actin) 的阴性免疫染色予以鉴定(Krzesz等(1999)，FEBS Lett.453，191)。人类 单核细胞系THP-1(ATCC TIB 202)以RPMI 1640培养基(Life Technologies)培养，该培养基含有10％胎牛血清，50U/毫升青霉素，50 微克/毫升链霉素，和10U/毫升制霉菌素。人类平滑肌细胞从切下的胸 腺静脉利用外植体技术(the explant-technology)分离(Krzesz等(1999)， FEBS Lett.453，191)，且置于经明胶包被(参阅上文)的6-孔组织培养皿 上，于1.5毫升Dulbecco’s改良的Eagle培养基中培养，其中含有15％ 胎牛血清，50U/毫升青霉素，50微克/毫升链霉素，和10U/毫升制霉菌 素。该细胞以对平滑肌α-肌动蛋白的阳性免疫染色予以鉴定。

2.RT-PCR分析

内皮细胞总RNA使用Qiagen RNeasy试剂盒(Qiagen，Hilden， Germany)分离，且接着进行DNA合成，其中根据制造商的实验程序使 用最大量3微克RNA和200U SuperscriptTM II逆转录酶(reverse transcriptase)(Life Technologies)，总体积为20微升。为了调整cDNA装 载率，于50微升总体积中使用5微升(约75毫微克cDNA)所得的 cDNA溶液和延长因子-1(the elongation factor 1)(EF-1)的引物对(primer pair)(Gibco)，及1U Taq DNA聚合酶(Gibco)进行PCR。EF-1作为PCR 的内标准。在含有0.1％溴乙锭(ethidium bromide)的1.5％琼脂糖凝胶上 分离PCR产物并使用一CCD摄影系统与Scanalytics的One-Dscan凝胶 分析软件(Billerica，MA，USA)，通过光密度法测定条带的强度以调整随 后的PCR分析中的cDNA的体积。

所有PCR反应都是在Hybaid OmnE Thermocycler(AWG；Heidelberg， Germany)中针对每一引物对分别地实施。针对得自脐带静脉的人类内皮 细胞的cDNA，所用的特殊的PCR条件为：CD40(产物大小381bp，25 循环，退火温度(annealing temperature)60℃，(正向引物) 5’-CAGAGTTCACTGAAACGGAATGCC-3’(SEQ ID NO：44)，(反向引 物)5’-TGCCTGCCTGTTGCACAACC-3’(SEQ ID NO：45))；E-选择蛋白 (产物大小304bp，33循环，退火温度60℃，(正向引物)5’- AGCAAGGCATGATGTTAACC-3’(SEQ ID NO：46)，(反向引物)5’- GCATTCCTCTCTTCCAGAGC-3’(SEQ ID NO：47))；EF-1(产物大小220 bp，22循环，退火温度55℃，(正向引物) 5’-TCTTAATCAGTGGTGGAAG-3’(SEQ ID NO：48)，(反向引物) 5’-TTTGGTCAAGTTGTTTCC-3’(SEQ ID NO：49))；IL-12p40(产物大小 281bp，30循环，退火温度62℃，(正向引物)5’- GTACTCCACATTCCTACTTCTC-3’(SEQ ID NO：50)，(反向引物)5’- TTTGGGTCTATTCCGTTGTGTC-3’(SEQ ID NO：51))；rp132(产物大小 368bp，20循环，退火温度60℃，(正向引物)5’- GTTCATCCGGCACCAGTCAG-3’(SEQ ID NO：52)，(反向引物) 5’-ACGTGCACATGAGCTGCCTAC-3’(SEQ ID NO：53)；MCP-1(产物大 小330bp，22循环，退火温度63℃，(正向引物) 5’-GCGGATCCCCTCCAGCATGAAAGTCTCT-3’(SEQ ID NO：54)，(反 向引物)5’-ACGAATTCTTCTTGGGTTGTGGAGTGAG-3’(SEQ ID NO：55)。

3.电泳迁移率变动分析(EMSA)

按照Krzesz等(1999)，FEBS Lett.453，191中所述，进行细胞核提取 物，并进行[32p]-标记的双链共有寡核苷酸(Santa Cruz Biotechnologie， Heidelberg，Germany)的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，放射自显术和超级 迁移率变动试验(supershift-analysis)。于此使用具有以下所示单链序列 (核心结合序列以下划线标出)的双链DNA寡核核苷酸：SIE，5’- GTGCAT TTCCCGTAAATCTTGTC-3‘(SEQ ID NO：56)。为分析使用各 种顺式作用元件诱饵对经细胞因子刺激的THP-1细胞(前单核细胞人类 细胞系(pre-monocytous human cell line)的细胞核提取物中所含内源性 STAT-1之挤出作用(extrusion)，在EMSA结合方法中选用30∶1(STAT-1 顺式作用元件诱饵：[32p]-标记的SIE的寡聚核苷酸(11fmol))的比例。

4.诱饵寡核苷酸技术

按照Krzesz等(1999)，FEBS Lett.453，191中所述，使用互补的单链 硫代磷酸连接的寡核苷酸(Eurogentec，Kln，Germany)产生双链诱饵寡核 苷酸。将培养的人类内皮细胞与浓度为10μM的相应的诱饵寡核苷酸预 孵育4小时。此为事先根据EMSA和RT-PCR分析予以最优化的条件。 于此之后，通常将含有诱饵寡核苷酸的培养基用新鲜培养基予以更换。 该寡核苷酸的单链序列如下(下划线的字母代表经硫代磷酸连接的碱 基，序列都是按5’→3’之方向显示)：

GATA-2， CACTTGATAACAGAAAGTGATAA CTCT(SEQ ID NO：57)；

NF-κB， AGTTGAGGGGACTTTCCC AGGC(SEQ ID NO：58)；

STAT-1， CATGTTATGCATATTCCTGTA AGTG(SEQ ID NO：33)；

STAT-1-19mut， GACAGTGCAGTGAAC TGTC(SEQ ID NO：59)；

STAT-1-25mut， CATGTTATGCAGACCGTAGTA AGTG(SEQ ID NO：60)。

5.反义寡核苷酸(ODN)技术

对于反义方法，于100毫升OPTI-MEMI培养基中定加15微升脂 质转染试剂(Lipofectin)(Gibco Life Technologie，Karlsruhe，Germany)，且 在室温(RT)下孵育45分钟(溶液A)。随后在100微升OPTI-MEMI培养 基中添加反义ODN(Eurogentec，Kln，Germany)到终浓度为0.5μM(溶 液B)。在将溶液A和溶液B混合之后，于室温下再度孵育15分钟。于 实验起始之时，在装有脂质转染试剂-反义ODN复合物的Eppendorf管 内添加0.8毫升内皮细胞培养的常规细胞培养基(不含肝素和内皮生长因 子)，并将内皮细胞培养的细胞培养基更换为反义-脂质转染试剂培养 基。于4小时之后取出反义-脂质转染试剂培养基并用新鲜细胞培养基 (含有肝素和内皮生长因子)予以更换。STAT-1反义ODN的序列为5’- T*A*CCA*C*T*G*A*G*A*C*A*T*CC*T*GCC*A*C-3’(*硫代磷酸修饰 的碱基；SEQ ID NO：41)。

6.Western印迹分析

将得自脐带静脉的人类内皮细胞与得自胸腺静脉的平滑肌细胞通过 接续在液态氮中冷冻与在37℃(电热组，Kleinfelden，Germany)下5分钟 的解冻予以碎裂。按照Hecker等(1994)，Biochem J.299，247中所述制备 蛋白质提取物。采用标准实验程序利用10％聚丙烯酰胺凝胶电泳在变性 条件下于SDS存在中分离出20-30微克蛋白质且予以转移到BioTraceTM 聚偏二氟乙烯转移膜之上(polyvinylidene fluoride transfer membrane)(Pall Corporation，Roβdorf，Germany)。使用下面的原抗体进行免疫蛋白质检 测：CD40(多克隆，1∶2000稀释，Research Diagnostics Inc.，Flanders NJ，USA)，STAT-1蛋白质(单克隆，1∶5000稀释，BD Transduction Laboratories，Heidelberg，Germany)，IRF-1蛋白质(多克隆，1∶2000稀 释，Santa Cruz Biotechnology，Heidelberg，Germany)，iNOS蛋白质(多克 隆，1∶3000稀释，BD Transduction Laboratories，Heidelberg， Germany)。于分别添加过氧化物酶缀合的抗-兔-IgG与——在使用单克 隆抗体的情况中——添加相应的抗-小鼠-IgG(1∶3000，Sigma，Deisenhofen， Germany)之后，利用化学发光法(chemiluminescence method) (SuperSignal Chemiluminescent Substrate；Pierce Chemical，Rockford，IL， USA)和随后的放射自显影术(HyperfilmTM MP，Amersham Pharmacia， Biotech，Buckinghamshire，England)检测蛋白质条带。于“洗涤”转移膜 (5分钟，0.2N NaOH，接着用H2O洗涤3×10分钟)之后，通过用单克 隆抗体和过氧化物酶缀合的抗-小鼠-IgG(两者皆得自Sigma-Aldrich，1∶ 3000稀释)检测β-肌动蛋白的等量蛋白质条带，而显示出等量蛋白质的 装载率和转移。

7.统计学分析

若没有给予不同的说明，附图和文中的所有数据都表为n个实验的 平均值±SEM。采用Student’s t-检验对未配对的数据进行统计学分析， 以p＜0.05视为具有统计学意义。

8.通过动物实验检测诱饵寡核苷酸的影响

8.1小鼠

为了检测本申请所开发出的以诱饵寡核苷酸为基础的治疗法的功 效，对每组8-10只动物的小鼠针对抗原诱发的关节炎进行“概念验证研 究(proof-of-concept-study)”(有关所用模型可参阅Henzgen等，Exp. Toxicol.Pathol.(1996)，48，255)。将单份0.25纳摩尔的STAT-1-诱饵寡 核苷酸(SEQ ID NO：33)直接施加到关节(关节内注射)，可以在3-14天期 间内高度明显地减低关节的抗原诱发的肿胀(减低35％)、炎症反应的强 度(减低70％)、关节破坏(减低80％)、总关节炎评分(减低70％)、以及血 清中的促炎性细胞因子的浓度(例如白介素-6，减低80％)。与此不同， 相应的对照寡核苷酸都没有治疗功效。

此外，于此研究中值得注意的是，在关节炎诱发14天之后，于皮 肤中引发的接触性皮炎(IV型反应)——其由将抗原再度经皮注射到动物 体内一次产生——也在经诱饵寡核苷酸处理的小鼠体内获得高度明显的 抑制(减低35％)。

8.2豚鼠

于7天中将豚鼠(Hartley，雄鼠，体重350克)致敏化两次(于第一天 在一侧耳朵中，于第二天在另一侧耳朵中，每次都使用50微升的10％ DNCB(溶于50％丙酮/50％橄榄油的溶液)；于第七天，使用15微升的 2％DNCB(溶于95％丙酮/5％橄榄油的溶液)在颈部皮肤中加强)之后，通 过在第13天于动物刮过毛的背部一或多个大小约1平方厘米的部位上 分别再施用2，4-二硝基氯苯(DNCB；10微升0.5％DNCB，溶于95％丙 酮/5％橄榄油的溶液)，并于24小时之后以肉眼和组织学方式评估。以 此种方式诱发的接触性皮炎的组织学特征(Giemsa染色)在于，在表皮部 位明显形成浮肿和海绵层水肿(spongiosis)，凋亡细胞的增加以及白细胞 大量侵润(图8)。于末次DNCB暴露1小时之前，皮内施用STAT-1-诱 饵寡核苷酸(SEQ ID NO：19)而非经突变的对照寡核苷酸(5’- TGTGGACCGTAGGAAGTG-3’，SEQ ID NO：61)，可导致所述的组织学 参数之明显减低，即总的说来达到了炎症反应的明显减弱。

序列表

<110>亚文塔克有限公司

<120>STAT-1-依赖性基因的表达调控

<130>HEC-003PCT/nat.

<140>未知

<141>2004-04-04

<150>DE10148828.9

<151>2001-10-04

<160>61

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>11

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>顺式作用元件诱饵

<220>

<221>其它特征

<222>(1)..(1)

<223>g，a，cort

<220>

<221>其它特征

<222>(4)..(4)

<223>g，a，cort

<220>

<221>其它特征

<222>(11)..(11)

<223>g，a，cort

<400>1

nttncbgdaa n                                                           11

<210>2

<211>11

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>顺式作用元件诱饵

<220>

<221>其它特征

<222>(1)..(1)

<223>g，a，cort

<220>

<221>其它特征

<222>(8)..(8)

<223>g，a，cort

<220>

<221>其它特征

<222>(11)..(11)

<223>g，a，cor

<400>2

ntthcvgnaa n                                                           11

<210>3

<211>11

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>顺式作用元件诱饵

<400>3

attaccggaa g                                                           11

<210>4

<211>11

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>顺式作用元件诱饵

<400>4

cttccggtaa t                                                           11

<210>5

<211>11

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>顺式作用元件诱饵

<400>5

attccggtaa g                                                           11

<210>6

<211>11

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>顺式作用元件诱饵

<400>6

cttaccggaa t                                                           11

<210>7

<211>11

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>顺式作用元件诱饵

<400>7

attcctggaa g                                                           11

<210>8

<211>11

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>顺式作用元件诱饵

<400>8

cttccaggaa t                                                           11

<210>9

<211>11

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>顺式作用元件诱饵

<400>9

attcctgtaa g                                                           11

<210>10

<211>11

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>顺式作用元件诱饵

<400>10

cttacaggaa t                                                           11

<210>11

<211>11

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>顺式作用元件诱饵

<400>11

gttccaggaa c                                                           11

<210>12

<211>11

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>顺式作用元件诱饵

<400>12

gttcctggaa c                                                           11

<210>13

<211>11

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>顺式作用元件诱饵

<400>13

gttcccggaa g                                                           11

<210>14

<211>11

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>顺式作用元件诱饵

<400>14

cttccgggaa c                                                           11

<210>15

<211>11

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>顺式作用元件诱饵

<400>15

gttccgggaa c                                                           11

<210>16

<211>11

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>顺式作用元件诱饵

<400>16

gttcccggaa c                                                           11

<210>17

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>顺式作用元件诱饵

<400>17

tgtgaattac cggaagtgag a                                                21

<210>18

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>顺式作用元件诱饵

<400>18

tctcacttcc ggtaattcac a                                                21

<210>19

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>顺式作用元件诱饵

<400>19

tgtgaattac cggaagtg                                                    18

<210>20

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>顺式作用元件诱饵

<400>20

cacttccggt aattcaca                                                    18

<210>21

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>顺式作用元件诱饵

<400>21

agtcagttcc aggaactgac t                                                21

<210>22

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>顺式作用元件诱饵

<400>22

agtcagttcc tggaactgac t                                                21

<210>23

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>顺式作用元件诱饵

<400>23

atgtgagttc ccggaagtga act                                              23

<210>24

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>顺式作用元件诱饵

<400>24

agttcacttc cgggaactca cat                                              23

<210>25

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>顺式作用元件诱饵

<400>25

acagttccgg gaactgtc                                                    18

<210>26

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>顺式作用元件诱饵

<400>26

gacagttccc ggaactga                                                    18

<210>27

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>顺式作用元件诱饵

<400>27

gacagttccg ggaactgtc                                                   19

<210>28

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>顺式作用元件诱饵

<400>28

gacagttccc ggaactgtc                                                   19

<210>29

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>顺式作用元件诱饵

<400>29

gtgtattccg gtaagtga                                                    18

<210>30

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>顺式作用元件诱饵

<400>30

tcacttaccg gaatacac                                                    18

<210>31

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>顺式作用元件诱饵

<400>31

ttatgtgaat tcctggaagt g                                                21

<210>32

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>顺式作用元件诱饵

<400>32

cacttccagg aattcacata a                                                21

<210>33

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>顺式作用元件诱饵

<400>33

catgttatgc atattcctgt aagtg                                            25

<210>34

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>顺式作用元件诱饵

<400>34

cacttacagg aatatgcata acatg                                            25

<210>35

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>顺式作用元件诱饵

<400>35

tgtgaattcc tgtaagtgag a                                                21

<210>36

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>顺式作用元件诱饵

<400>36

tctcacttac aggaattcac a                                                21

<210>37

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>顺式作用元件诱饵

<400>37

tgcatattcc tgtaagtg                                                    18

<210>38

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>顺式作用元件诱饵

<400>38

cacttacagg aatatgca                                                    18

<210>39

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>顺式作用元件诱饵

<400>39

atattcctgt aagtg                                                       15

<210>40

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>顺式作用元件诱饵

<400>40

cacttacagg aatat                                                       15

<210>41

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反义寡核苷酸

<400>41

taccactgag acatcctgcc ac                                               22

<210>42

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反义寡核苷酸

<400>42

aacatcattg gcacgcag                                                    18

<210>43

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反义寡核苷酸

<400>43

gtgaacctgc tccag                                                       15

<210>44

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>44

cagagttcac tgaaacggaa tgcc                                             24

<210>45

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>45

tgcctgcctg ttgcacaacc                                                  20

<210>46

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>46

agcaaggcat gatgttaacc                                                  20

<210>47

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>47

gcattcctct cttccagagc                                                  20

<210>48

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>48

tcttaatcag tggtggaag                                                   19

<210>49

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>49

tttggtcaag ttgtttcc                                                    18

<210>50

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>50

gtactccaca ttcctacttc tc                                               22

<210>51

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>51

tttgggtcta ttccgttgtg tc                                               22

<210>52

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>52

gttcatccgg caccagtcag                                                  20

<210>53

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>53

acgtgcacat gagctgccta c                                                21

<210>54

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>54

gcggatcccc tccagcatga aagtctct                                         28

<210>55

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>55

acgaattctt cttgggttgt ggagtgag                                         28

<210>56

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>56

gtgcatttcc cgtaaatctt gtc                                              23

<210>57

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>顺式作用元件诱饵

<400>57

cacttgataa cagaaagtga taactct                                          27

<210>58

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>顺式作用元件诱饵

<400>58

agttgagggg actttcccag gc                                               22

<210>59

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>顺式作用元件诱饵

<400>59

gacagtgcag tgaactgtc                                                   19

<210>60

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>顺式作用元件诱饵

<400>60

catgttatgc agaccgtagt aagtg                                            25

<210>61

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>顺式作用元件诱饵

<400>61

tgtggaccgt aggaagtg                                                    18