在对肠中营养物的存在和吸收反应中，肠胃道粘膜释放出降低血糖水平的许多激 素。这些激素包括胃泌素、促胰液素、葡萄糖依赖型促胰岛素多肽(GIP)和胰高血糖素 样肽-1(GLP-1)。已知最有效的物质是GLP-1(Qrskov，1992，Diabetologia 35：701-711)。 胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是前胰高血糖素(180氨基酸的肽)的产物(Drucker，1998， Diabetes 47：159-169)。前胰高血糖素的整个序列含有胰高血糖素的29氨基酸序列、 GLP-1的36或37氨基酸序列、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)(一种亲小肠(intestinotrophic) 肽)的34氨基酸序列。GLP-1具有许多功能。它是增强正常人对胰岛素分泌的效应的 生理激素，因此它是一种肠降血糖素激素。另外，GLP-1还降低胰高血糖素浓度，减 缓胃排空，刺激(前)胰岛素生物合成，增强胰岛素的敏感性(Nauck，1997，Horm.Metab. res.47：1253-1258)。该肽还增强葡萄糖耐受性受损个体中β细胞对葡萄糖感受和应答的 能力(Byme，1998，Eur.J.clin.Invest.28：72-78)。GLP-1在人体中的促胰岛素效应加快 葡萄糖消失的速度，一部分是因为胰岛素水平提高，一部分是因为胰岛素敏感性增强 (D′Alessio，1994，Eur.J.Clin.Invest.28：72-78)。这使得GLP-1成为治疗II型糖尿病的 有前途的药物。已经发现GLP-1的活性片段是GLP-1(7-36)和GLP-1(7-37)。然而，天 然GLP-1的主要的药理学问题是其半衰期很短。在人和大鼠中，GLP-1被二肽基肽酶 -IV(DPP-IV)(起内源性GLP-1受体拮抗剂作用)迅速降解成GLP-1(9-36)酰胺(Deacon， 1998，Diabetologia 41：271-278)。已经提出了解决该问题的几个策略，一些是采用 DPP-IV的抑制剂，其它策略是采用GLP-1(7-36)酰胺的DPP-IV抗性类似物(Deacon， 1998，Diabetologia 41：271-278；Deacon等人，1998，Diabetes 47：764-769；Ritzel，1998，J. Endocrinol.159：93-102；美国专利5,545,618；Pederson，1998，Diabetes 47：1253-1258)。
另一类降低血糖水平的肽，外端素(exendin)，与GLP-1[7-36]NH2有一些序列相 似性(53％)(Goke等人，1993，J.Biol.Chem.268：19650-55)。外端素发现于 Helodermatidae或珠纹蜥蜴(beaded lizard)的毒液中(Raufman，1996，Reg.Peptieds 61：1- 18)。外端素-3存在于Helodermo horridum(墨西哥珠纹蜥蜴)的毒液中，外端素-4存在 于Heloderma suspectum(毒蜥)的毒液中。外端素-4只在第2和3位与外端素-3不同。 编码外端素-4前体蛋白(一个与外端素-4氨基端融合的47氨基酸的肽)的cDNA已被 克隆和测序(Pohl等人，1998，J.Biol.Chem.273：9778-9784和WO98/35033)。外端素-3 和外端素-4均通过与外端素受体相互作用来刺激豚鼠胰腺腺泡细胞的细胞cAMP产生 的增加(Raufman，1996，Reg.Peptides 61：1-18)。外端素-3使细胞cAMP产生有双相增 加，但引起胰腺腺泡细胞淀粉酶释放单相增加。相反，外端素-4使cAMP产生单相增 加，且不改变淀粉酶释放。
在分离的大鼠胰岛瘤细胞上，外端素-4是强的GLP-1受体激动剂(Goke等人， 1993，J.Biol.Chem.268：19650-55)。估计DPP-IV所识别的GLP-1中的(His Ala)结构域 不存在于外端素-4中(Goke等人，1993，J.Biol.Chem.268：19650-55)。[125I]GLP-1与孤 束胞核的结合被未标记的GLP-1和[Tyr39]外端素-4以依赖于浓度的方式抑制，Ki值 分别为3.5和9.4nM，而且，在细胞系中发现有相似的值(Goke等人，1995，Eur.J. Neurosci.7：2294-2300和Goke等人，1993，J.Biol.Chem.268：19650-55)。另外，全身给 予外端素-4使患糖尿病db/db小鼠的血糖水平降低40％(WO99/07404)。最近，Grieg等 人(1999，Diabetologia 42：45-50)已经证明，每日给糖尿病ob/ob小鼠腹膜内注射外端 素-4一次有长期持续的降低血糖的效果。美国专利No.5,424,286公开说，为了保留促 胰岛素活性，大部分的N端序列(外端素-4(1-31和Y31-外端素-4(1-31))是必需的，而N 端截短的外端素(外端素-4(9-39)具有抑制性。
已经提出用外端素-3、外端素-4和外端素激动剂来治疗糖尿病、减少胃运动、延 迟胃排空和防止高血糖(美国专利No.5,424,286，WO98/05351)，以及减少摄食 (WO98/30231)。已提出通过修饰天然外端素序列来获得新的化合物。一种方法是将亲 脂性物质与该分子相连，例如WO99/43708所述，该申请公开了含一种与C端氨基酸 残基相连接的亲脂性取代基外端素衍生物。
设计外端素类似物的一种主要方法其特征是对天然的外端素-4序列进行氨基酸 取代和/或C端截短。该方法例如有WO99/07404，WO99/25727和WO99/25728的化合 物。
WO99/07404公开了具有通式I的外端素激动剂，其定义为39个氨基酸残基的肽 序列上4-5位是Gly Thr，11-13位是Ser Lys Gln，15-21位是Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu，26-30位是Leu Lys Asn Gly Gly，32-35位是Ser Ser Gly Ala，其中其余位置可被 衍生型外端素氨基酸残基占据，或可被指定的氨基酸取代占据。式I没有覆盖本文所 述具有指定氨基酸缺失的外端素激动剂或类似物和/或偶联物，如新的化合物脱Pro36- 外端素-4(1-39)，外端素-4(1-39)-K6或脱Pro36-外端素-4(1-39)-k6。
WO99/25727公开了具有通式I的外端素激动剂，它确定了28-38个氨基酸残基 的肽序列，其中4位是Gly，Ala位是18，其余位置可被衍生型外端素氨基酸残基占 据，或可被指定的氨基酸取代占据。式I不包含具有Ser作为C端氨基酸的肽序列以 及本文所述的具有特定氨基酸缺失的外端素激动剂或类似物和/或是偶联物，如新的化 合物脱Pro36-外端素-4(1-39)，外端素-4(1-39)-K6或脱Pro36-外端素-4(1-39)-k6。另外， WO99/25727的式II确定了与式I相似的肽序列，但是其包括27或28位赖氨酸上有 C(1-10)烷酰基或环烷基烷酰基取代的外端素衍生物。
当治疗不合理的餐后血糖水平时，可频繁地给予该化合物，例如每日一次、两次 或三次。
WO99/25728公开了具有通式I的外端素激动剂，其确定了一个28-39个氨基酸 残基的肽序列，其中18位是固定的Ala，其余位置可被野生型外端素氨基酸残基占据， 或可被指定的氨基酸取代占据。所述外端素激动剂均对应于具有不同程度氨基酸取代 的截短的外端素。34-38个氨基酸残基的肽序列的C端不是Ser。39个氨基酸残基的 肽序列的C端可以是Ser或Tyr，但不是其它残基。本文所述的本发明具有特定氨基 酸缺失的外端素激动剂或类似物和/或偶联物没有包含在式I中。另外，式II确定了与 式I相似的肽序列，但包括27或28位赖氨酸上有C(1-10)烷酰基或环烷基烷酰基取代 的外端素衍生物。
WO99/46283(1999年9月16日出版)公开了肽偶联物，它包含药理活性的肽X以 及与X共价结合的4-20个氨基酸残基的稳定化肽序列Z，其中所述偶联物的特征在 于，与X的半衰期相比，所述偶联物的半衰期增加，X可以是外端素-4或外端素-3。
发明目的
需要有能够降低哺乳动物血糖水平的稳定有效的化合物。因此，本发明的目的是 提供能降低哺乳动物血糖水平的新化合物。理想的是，这些化合物在口服给药时是有 效的。本发明的另一目的是提供具有GLP-1活性和/或外端素-4活性的新的肽激动剂。 本发明还有一个目的是提供半衰期增加和/或清除减少的具有GLP-1活性和/或外端素 -4活性的新的肽激动剂。
发明概述
本发明涉及一种包含肽X和Z的肽偶联物，肽X选自：
(a)与外端素-4至少90％同源的外端素；
(b)所述外端素的变体，其中所述变体含有选自34-39位有1-5个缺失的修饰，并 且在40位有具有亲脂性取代基的Lys；或
(c)GLP-1(7-36)或GLP-1(7-37)，它具有选自下列的至少一个修饰：
(i)用D-丙氨酸、甘氨酸或α-氨基异丁酸代替8位的丙氨酸
(ii)亲脂性取代基，
Z是一与所述变体共价结合的4-20个氨基酸单元的肽序列，其中所述肽序列Z 中的每个氨基酸单元选自Ala，Leu，Ser，Thr，Tyr，Asn，Gln，Asp，Glu，Lys，Arg，His，Met， Orn和具有通式I的氨基酸单元
               -NH-C(R1)(R2)-C(＝O)-     (I) 其中R1和R2选自氢、C1-6-烷基、苯基和苯基-甲基，其中C1-6-烷基被选自卤素、羟基、 氨基、氰基、硝基、磺基(sulfono)、羧基的1-3个取代基任选地取代，苯基和苯基-甲 基被选自C1-6-烷基、C2-6-链烯基、卤素、羟基、氨基、氰基、硝基、磺基和羧基的1-3 个取代基任选地取代，或R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成环戊基、环己基、 环庚基环，例如2，4-二氨基丁酸和2，3-二氨基丙酸，条件是X不是外端素-4或外端素 -3。
肽X的进一步特征是能有效地提高糖尿病哺乳动物的葡萄糖耐受性。
另外，本发明涉及亲代外端素的一种新变体，其中所述所述亲代外端素与外端素 -4的氨基酸序列具有至少90％的同源性，且其中所述变体能降低哺乳动物的血糖水 平，与GLP-1受体结合并具有至少一种选自下列的修饰：(a)34-38位的1-5个缺失， 和(b)40位有具有亲脂性取代基的Lys，该取代基与所述赖氨酸的ε氨基相连。
附图简述
图1显示了化合物1(SEQ ID NO：101)(脱Pro36-外端素-4(1-39)-NH2)对小鼠血糖水 平的影响。参见实施例25。
图2显示了化合物2(SEQ ID NO：93)(脱Pro36-外端素-4(1-39)-Lys6-NH2)对小鼠血 糖水平的影响。参见实施例25。
图3显示了化合物5(SEQ ID NO：89)(Gly8，Lys37(棕榈酰基)-GLP1-(7-36)(人)- (Lys)7-NH2)对小鼠血糖水平的影响。参见实施例25。
图4显示静脉注射1微摩尔/千克化合物4和化合物(iii)后家兔体内降解动力学。 参见实施例27。
图5是化合物2、14-16、18和19在口服葡萄糖耐受性测试(OGTT)中的AUC(曲 线下面积)值(平均值±SEM)的图线。参见实施例28。
图6显示了用于在酵母中异源表达化合物2所构建的合成性cDNA。该新构建物 命名为pYES0010。参见实施例20。
图7是根据化合物2和化合物(I)的相对的AUC0-240分钟值(平均值±SEM)在db/db 小鼠中对GTT的剂量反应曲线。参见实施例29。
图8显示了在OGTT前最多24小时给予最大剂量(即100毫微摩尔/千克)的化合 物2对于口服葡萄糖耐受性测试(OGTT)的影响。
发明详述
本发明化合物包括亲代外端素的迄今未知的缺失变体。与外端素-4(1-39)的已知 的取代和/或截短型变体不同，认为该新的化合物表现出稳定的α螺旋结构，具有优秀 的稳定性，结合性能没有减少或有所增加。另外，该新的变体修饰的GLP-1(7-36)-NH2 和修饰的GLP-1(7-37)与特定的短肽序列(Z)的偶联赋予了这些化合物稳定性，而且没 有丧失药理特性。这些偶联物为该肽分子提供了体内稳定性和亲水性。Z由氨基酸残 基组成，它单独没有α螺旋构型的结构特征。然而，根据采用圆二色性和核磁共振(NMR) 谱的研究，Z的加入大大改变了某些肽的结构特征，这可从肽中α螺旋构型数量增加 看出。例如，圆二色性显示，Z修饰的(Gly8)-GLP-1具有比(Gly8)-GLP-1多得多的α螺 旋构型。结合药理学结果，结构分析提示Z修饰了肽的构型，从而产生了更高的酶稳 定性而不丧失活性。另外，Z修饰也会大大改变肽的物理和化学性质，从而对药物配 制策略产生影响。
外端素变体
本发明的外端素变体是亲代外端素肽的变体，其与外端素-4具有至少大约90％、 最佳有至少约95％的同源性，它具有外端素的活性，例如降低哺乳动物血糖水平，并 结合GLP-1受体。在较佳实施方案中，亲代外端素肽的氨基酸序列与外端素-4(1-39) 的氨基酸序列有5个氨基酸不同，较佳的有4个氨基酸不同，更佳的有3个氨基酸不 同，还要佳的有2个氨基酸不同，还要佳的有1个氨基酸不同。
在一个实施方案中，该外端素变体在34-38位有1-5个缺失。较佳的，该变体在 34-38位有1-4个缺失，更佳的在36-38位有1-3个缺失。亲代外端素宜为外端素-4， 作为本文肽偶联物中肽X的较佳变体具有这样的氨基酸序列：其中外端素-4的氨基酸 序列中缺失，较佳的是从外端素-4(1-39)的氨基酸序列中缺失了36、37和38位的1、 2或3个Pro残基。
本文Z序列与X肽的偶联被认为能增加这些化合物的稳定性。脯氨酸是刚性氨 基酸，它可能会干扰Z使X肽结构稳定的作用。因此，包含亲代外端素变体的本发明 肽偶联物中外端素主链36、37和38位的一个、两个或所有脯氨酸氨基酸宜缺失，只 要在例如糖尿病db/db小鼠口服葡萄糖耐受性测试(OGTT)中测得的所述偶联物的效 果没有受到不利的影响。
在另一实施方案中，变体在40位有另一残基赖氨酸残基，该赖氨酸残基具有一 个亲脂性取代基，该取代基通过酰胺键与赖氨酸的ε氨基相连。亲脂性取代基可以是 直链或支链脂肪酸或直链或支链链烷α，ω-二羧酸的酰基。该酰基可以有化学式 CH3(CH2)nCO-，其中n是4-38的整数，较佳为4-24。在具体的实施方案中，该酰基 选自CH3(CH2)6CO-、CH3(CH2)8CO-、CH3(CH2)10CO-、CH3(CH2)12CO-、CH3(CH2)14CO-、 CH3(CH2)16CO-、CH3(CH2)18CO-、CH3(CH2)20CO-和CH3(CH2)22CO-。酰基可以具有化 学式HOOC(CH2)mCO-，其中m为4-38的整数，较佳为4-24。在具体的实施方案中， 酰基选自HOOC(CH2)14CO-、HOOC(CH2)16CO-、HOOC(CH2)18CO-、HOOC(CH2)20CO-和HOOC(CH2)22CO-。在更具体的实施方案中，亲脂性取代基选自十四酰基、ω-羧基 十九酰基、7-脱氧胆酰基(choloyl)、胆酰基、棕榈酰基和石胆酰基。在更具体的实施 方案中，亲脂性取代基是棕榈酰基。
另外，亲脂性取代基可以有NH基团。具体实施方案包括但不局限于化学式 CH3(CH2)a((CH2)bCOOH)CHNHCO(CH2)2CO-，其中a和b是整数，a+b是8-33的整数， 较佳的为12-28；CH3(CH2)cCONHCH(COOH)(CH2)2CO-，其中c是10-24的整数； CH3(CH2)dCONHCH(CH2)2(COOH)CO-，其中d是8-24的整数；COOH(CH2)eCO-，其 中e是8-24的整数；-NHCH(COOH)CH2)4NHCO(CH2)fCH3，其中f是8-18的整数； -NHCH(COOH)(CH2)4NHCOCH(CH2)2COOH)NHCO(CH2)gCH3，其中g是10-16的整 数；和-NHCH(COOH)(CH2)4NHCO(CH2)2CH(COOH)NHCO(CH2)hCH3，其中h是整数 0或1-22，较佳为10-16。
具有40位携带亲脂性取代基的赖氨酸残基的外端素变体任选地还包含34-39位 (较佳的为34-38位)的1-5个缺失(较佳的1-3个缺失)，例如[脱Ser39，Lys40(棕榈酰) 外端素-4-(1-39)，[脱Pro36，Lys40(棕榈酰)]外端素-4-(1-39)和[脱Pro36，Lys40(棕榈酰)] 外端素-4-(1-40)。
在最具体的实施方案中，变体选自下列：
化合物1：脱Pro36-外端素-4(1-39)-NH2(SEQ ID NO：101)，
脱Pro36-外端素-4(1-40)-NH2。
化合物14：脱Pro36，Pro37，Pro38-外端素-4(1-39)-NH2，脱Pro36，Pro37，Pro38-外端素 -4(1-40)-NH2，脱Pro36，Pro37-外端素-4(1-39)-NH2，脱Ala35-外端素-4(1-39)-NH2(SEQ ID  NO：105)，脱Gly34-外端素-4(1-39)-NH2(SEQ ID NO：106)，脱Ser39-(Lys40(棕榈酰基)) 外端素-4(1-39)-NH2(SEQ ID NO：107)，脱Gly34-(Lys40(棕榈酰基))外端素-4(1-39)- NH2(SEQ ID NO：108)，脱Ala35-(Lys40(棕榈酰基))外端素-4(1-39)-NH2(SEQ ID NO： 109)，脱Pro36-(Lys40(棕榈酰基))外端素-4(1-39)-NH2(SEQ ID NO：110)及其游离酸和药 学上可接受的盐。
修饰的GLP-1
本文肽偶联物中作为肽X的较佳的修饰的GLP-1包括具有第8位丙氨酸被甘氨 酸取代的GLP-1(7-37)或GLP-1(7-36)-NH2的氨基酸序列。或者，较佳修饰的GLP-1 具有第8位丙氨酸被甘氨酸取代、且26、34或37位的一个赖氨酸上有亲脂性取代基 (较佳为棕榈酰基)的GLP-1(7-37)或GLP-1(7-36)的氨基酸序列。亲脂性取代基宜与所 述赖氨酸的ε氨基相连，其包括上述外端素变体的具体实施方案。在本发明偶联物中 用作X的经修饰的GLP-1(7-36)或GLP-1(7-37)可以是包含亲脂性取代基的 WO99/43707和WO98/08871中公开的那些，或更佳的是8位有甘氨酸取代的那些 GLP-1类似物。较佳的肽X是：
Gly8-GLP-1(7-36)，Gly8-GLP-1(7-37)和Gly8-GLP-1(7-36)-Lys37(棕榈酰基)。
具有亲脂性取代基的本发明化合物具有比亲代肽更延迟的作用方式，如 WO98/08871中GLP-1衍生物所显示的那样。
肽偶联物
肽序列Z可以与肽序列X的C端或N端相连，或两个肽序列可以各自与X的C 端和N端连接。当天然肽X具有游离的C端羧酸时，肽序列Z可以与肽X的C端或 X端相连，或X的C端和N端均与每个独立的肽序列Z相连。或者，Z可以和肽序 列X中任何位的赖氨酸、组氨酸或精氨酸侧链上的氮原子或谷氨酸或天冬氨酸侧链上 的羰基官能团相连。在一个实施方案中，Z可以连接在X的序列中，以及与X的N 端和/或C端相连。该序列应当与肽序列的C端、N端、或两端相连，或在肽序列X 内部相连，这取决于具体的肽X，而且是本领域技术人员容易确定的。较佳的，X通 过肽键与Z相连，较佳的连接在X的C端。
本发明一方面涉及一种减少哺乳动物血糖水平的包含肽X和Z的肽偶联物，其 中肽X是：(a)与外端素-4至少90％同源的外端素；(b)所述外端素的变体，其中所述 变体具有选自34-39位有1-5个缺失的修饰，并且在40位有具有亲脂性取代基的Lys； 或(c)GLP-1(7-36)或GLP-1(7-37)，它具有选自下列的至少一个修饰：(i)用D-丙氨酸、 甘氨酸或α-氨基异丁酸(Alb)代替8位的丙氨酸和(ii)亲脂性取代基；肽Z是与肽X共 价结合的4-20个氨基酸单元的肽序列，其中所述肽序列Z中的每个氨基酸单元选自 Ala，Leu，Ser，Thr，Tyr，Asn，Gln，Asp，Glu，Lys，Arg，His，Met，Orn和具有通式I的氨基 酸单元
                -NH-C(R1)(R2)-C(＝O)-    (I) 其中R1和R2选自氢、C1-6-烷基、苯基和苯基-甲基，其中C1-6-烷基被选自卤素、羟基、 氨基、氰基、硝基、磺基、羧基的1-3个取代基任选地取代，苯基和苯基-甲基被选自 C1-6-烷基、C2-6-链烯基、卤素、羟基、氨基、氰基、硝基、磺基和羧基的1-3个取代 基任选地取代，或R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成环戊基、环己基、环庚基 环，例如2，4-二氨基丁酸和2，3-二氨基丙酸。较佳的是，X与GLP-1受体结合且不包 括外端素-4或外端素-3。
Z通常是具有4-20个氨基酸残基(例如在4-15范围内，更佳的在4-10范围内， 特别佳的在4-7个氨基酸残基范围内，例如4、5、6、7、8或10个氨基酸残基)的肽 序列，其中6个氨基酸残基是较佳的。较佳的，Z含有至少一个Lys残基。在本发明 的较佳实施方案中，肽序列Z中的每个氨基酸残基独立选自Ala，Leu，Ser，Thr，Tyr，Asn， Gln，Asp，Glu，Lys，Arg，His，Met，Orn，二氨基丁酸和二氨基丙酸。较佳的氨基酸残基 选自Glu，Lys和Met，尤其选自Lys，或氨基酸残基选自Asn，Glu和Lys。上述氨基酸 可以具有D-或L-构型，但是上述氨基酸宜具有L-构型。在本发明的较佳实施方案中， Z含有至少一个赖氨酸残基，或当Z通过肽键与所述肽X的N端相连时，Z具有选自 Asn-(Glu)n的氨基酸序列，其中n是整数3-7。
因此，肽序列Z的描述性实施例是：
Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：1)，Xaa-Lys-Lys-Lys，Lys-Xaa-Lys-Lys，Lys-Lys-Xaa- Lys，Lys-Lys-Lys-Xaa，Xaa-Xaa-Lys-Lys，Xaa-Lys-Xaa-Lys，Xaa-Lys-Lys-Xaa，Lys-Xaa- Xaa-Lys，Lys-Xaa-Lys-Xaa，Lys-Lys-Xaa-Xaa，Xaa-Xaa-Xaa-Lys，Xaa-Xaa-Lys-Xaa，Xaa- Lys-Xaa-Xaa，Lys-Xaa-Xaa-Xaa，Xaa-Xaa-Xaa-Xaa(SEQ ID NO：2)，Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO：3)，Xaa-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：4)，Lys-Xaa-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：5)，Lys-Lys-Xaa-Lys-Lys(SEQ ID NO：6)，Lys-Lys-Lys-Xaa-Lys(SEQ ID NO：7)，Lys- Lys-Lys-Lys-Xaa，Xaa-Xaa-Lys-Lys-Lys，Xaa-Lys-Xaa-Lys-Lys，Xaa-Lys-Lys-Xaa-Lys， Xaa-Lys-Lys-Lys-Xaa，Lys-Xaa-Xaa-Lys-Lys，Lys-Xaa-Lys-Xaa-Lys，Lys-Xaa-Lys-Lys- Xaa，Lys-Lys-Xaa-Xaa-Lys，Lys-Lys-Xaa-Lys-Xaa，Lys-Lys-Lys-Xaa-Xaa，Lys-Lys-Xaa- Xaa-Xaa，Lys-Xaa-Lys-Xaa-Xaa，Lys-Xaa-Xaa-Lys-Xaa，Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Lys，Xaa-Lys- Lys-Xaa-Xaa，Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Lys，Xaa-Xaa-Lys-Lys-Xaa，Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Lys，Xaa- Xaa-Xaa-Lys-Lys，Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa，Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Xaa，Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Xaa， Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Xaa，Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Lys，Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa(SEQ ID NO：8)， Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：9)，Xaa-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：10)， Lys-Xaa-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：11)，Lys-Lys-Xaa-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：12)， Lys-Lys-Lys-Xaa-Lys-Lys(SEQ ID NO：13)，Lys-Lys-Lys-Lys-Xaa-Lys(SEQ ID NO：14)， Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Xaa(SEQ ID NO：15)，Xaa-Xaa-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：16)， Xaa-Lys-Xaa-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：17)，Xaa-Lys-Lys-Xaa-Lys-Lys(SEQ ID NO：18)， Xaa-Lys-Lys-Lys-Xaa-Lys(SEQ ID NO：19)，Xaa-Lys-Lys-Lys-Lys-Xaa(SEQ ID NO：20)， Lys-Xaa-Xaa-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：21)，Lys-Xaa-Lys-Xaa-Lys-Lys(SEQ ID NO：22)， Lys-Xaa-Lys-Lys-Xaa-Lys(SEQ ID NO：23)，Lys-Xaa-Lys-Lys-Lys-Xaa(SEQ ID NO：24)， Lys-Lys-Xaa-Xaa-Lys-Lys(SEQ ID NO：25)，Lys-Lys-Xaa-Lys-Xaa-Lys(SEQ ID NO：26)， Lys-Lys-Xaa-Lys-Lys-Xaa(SEQ ID NO：27)，Lys-Lys-Lys-Xaa-Xaa-Lys(SEQ ID NO：28)， Lys-Lys-Lys-Xaa-Lys-Xaa(SEQ ID NO：29)， Lys-Lys-Lys-Lys-Xaa-Xaa，Xaa-Xaa-Xaa- Lys-Lys- Lys，Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Lys-Lys，Xaa-Xaa-Lys-Lys-Xaa-Lys，Xaa-Xaa-Lys-Lys- Lys-Xaa，Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Lys-Lys，Xaa-Lys-Xaa-Lys-Xaa-Lys，Xaa-Lys-Xaa-Lys-Lys- Xaa，Xaa-Lys-Lys-Xaa-Xaa-Lys，Xaa-Lys-Lys-Xaa-Lys-Xaa，Xaa-Lys-Lys-Lys-Xaa-Xaa， Lys-Lys-Lys-Xaa-Xaa-Xaa，Lys-Lys-Xaa-Lys-Xaa-Xaa，Lys-Lys-Xaa-Xaa-Lys-Xaa，Lys- Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Lys，Lys-Xaa-Lys-Lys-Xaa-Xaa，Lys-Xaa-Lys-Xaa-Lys-Xaa，Lys-Xaa- Lys-Xaa-Xaa-Lys，Lys-Xaa-Xaa-Lys-Lys-Xaa，Lys-Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Lys，Lys-Xaa-Xaa- Xaa-Lys-Lys，Lys-Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa，Lys-Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Xaa，Lys-Xaa-Xaa-Lys- Xaa-Xaa-Lys，Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Lys，Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Lys，Xaa-Lys- Lys-Xaa-Xaa-Xaa，Xaa-Lys-Xaa-Lys-Xaa-Xaa，Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Lys-Xaa，Xaa-Lys-Xaa- Xaa-Xaa-Lys，Xaa-Xaa-Lys-Lys-Xaa-Xaa，Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Lys-Xaa，Xaa-Xaa-Lys-Xaa- Xaa-Lys，Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Lys-Xaa，Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Lys，Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Lys- Lys，Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa，Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa，Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Xaa， Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Xaa，Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Xaa，Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Lys， Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa，Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：30)，Xaa-Lys- Lys-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：31)，Lys-Xaa-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：32)， Lys-Lys-Xaa-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：33)，Lys-Lys-Lys-Xaa-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：34)，Lys-Lys-Lys-Lys-Xaa-Lys-Lys(SEQ ID NO：35)，Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Xaa-Lys (SEQ ID NO：36)，Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Xaa(SEQ ID NO：37)，Xaa-Xaa-Lys-Lys-Lys- Lys-Lys(SEQ ID NO：38)，Xaa-Lys-Xaa-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：39)，Xaa-Lys-Lys- Xaa-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：40)，Xaa-Lys-Lys-Lys-Xaa-Lys-Lys(SEQ ID NO：41)，Xaa- Lys-Lys-Lys-Lys-Xaa-Lys(SEQ ID NO：42)，Lys-Xaa-Xaa-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：43)，Lys-Xaa-Lys-Xaa-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：44)，Lys-Xaa-Lys-Lys-Xaa-Lys-Lys (SEQ ID NO：45)，Lys-Xaa-Lys-Lys-Lys-Xaa-Lys(SEQ ID NO：46)，Lys-Lys-Xaa-Xaa-Lys- Lys-Lys(SEQ ID NO：47)，Lys-Lys-Xaa-Lys-Xaa-Lys-Lys(SEQ ID NO：48)，Lys-Lys-Xaa- Lys-Lys-Xaa-Lys(SEQ ID NO：49)，Lys-Lys-Lys-Xaa-Xaa-Lys-Lys(SEQ ID NO：50)，Lys- Lys-Lys-Xaa-Lys-Xaa-Lys(SEQ ID NO：51)，Lys-Lys-Lys-Lys-Xaa-Xaa-Lys(SEQ ID NO：52)，Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：53)，Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO：54)，Xaa-Xaa-Lys-Lys-Xaa-Lys-Lys(SEQ ID NO：55)，Xaa-Xaa-Lys-Lys-Lys- Xaa-Lys(SEQ ID NO：56)，Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：57)， Xaa-Lys-Xaa- Lys-Xaa-Lys-Lys(SEQ ID NO：58)，Xaa-Lys-Xaa-Lys-Lys-Xaa-Lys(SEQ ID NO：59)，Xaa- Lys-Lys-Xaa-Xaa-Lys-Lys(SEQ ID NO：60)，Xaa-Lys-Lys-Xaa-Lys-Xaa-Lys(SEQ ID NO：61)，Xaa-Lys-Lys-Lys-Xaa-Lys-Xaa(SEQ ID NO：62)，Xaa-Lys-Lys-Xaa-Lys-Lys-Xaa (SEQ ID NO：63)，Xaa-Lys-Xaa-Lys-Lys-Lys-Xaa(SEQ ID NO：64)，Xaa-Lys-Lys-Lys-Xaa- Xaa-Lys(SEQ ID NO：65)，Lys-Xaa-Lys-Lys-Lys-Xaa-Xaa(SEQ ID NO：66)，Xaa-Lys-Lys- Lys-Lys-Xaa-Xaa(SEQ ID NO：67)，Xaa-Lys-Lys-Lys-Xaa-Lys-Xaa(SEQ ID NO：68)，Xaa- Lys-Lys-Lys-Xaa-Xaa-Lys(SEQ ID NO：69)，Lys-Lys-Lys-Lys-Xaa-Xaa-Xaa(SEQ ID NO：70)，Lys-Lys-Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Lys(SEQ ID NO：71)，Lys-Lys-Lys-Xaa-Lys-Xaa-Xaa (SEQ ID NO：72)，Lys-Lys-Xaa-Lys-Lys-Xaa-Xaa(SEQ ID NO：73)，Lys-Lys-Xaa-Xaa-Lys- Xaa-Lys(SEQ ID NO：74)，Lys-Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Lys(SEQ ID NO：75)，Lys-Lys-Xaa- Lys-Lys-Xaa-Xaa(SEQ ID NO：76)，Lys-Xaa-Lys-Lys-Xaa-Xaa-Lys(SEQ ID NO：77)，Lys- Xaa-Lys-Xaa-Lys-Xaa-Lys(SEQ ID NO：78)，Lys-Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Lys-Lys(SEQ ID NO：79)，Lys-Xaa-Xaa-Lys-Lys-Xaa-Lys(SEQ ID NO：80)，Lys-Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Lys-Lys (SEQ ID NO：81)，Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：82)，Lys-Lys-Xaa-Xaa- Xaa-Xaa-Lys，Lys-Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Lys，Lys-Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Lys，Lys-Xaa- Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Lys，Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Lys，Xaa-Lys-Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Lys， Xaa-Lys-Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Lys，Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Lys，Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Xaa- Lys-Lys，Xaa-Xaa-Lys-Lys-Xaa-Xaa-Lys，Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Lys-Xaa-Lys，Xaa-Xaa-Lys- Xaa-Xaa-Lys-Lys，Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Lys-Xaa-Lys，Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Lys-Lys，Xaa- Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Lys-Lys，Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Lys，Xaa-LYs-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa- Lys，Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Lys，Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Lys，Xaa-Xaa-Xaa-Xaa- Lys-Xaa-Lys，Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Lys，Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Lys，Lys-Xaa- Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa，Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Xaa，Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa， Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Xaa，Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Xaa，Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa， 其中每个Xaa独立选自Ala，Leu，Ser，Thr，Tyr，Asn，Gln，Asp，Glu，Arg，His，Met，Orn和 本文式I的氨基酸，如Dbu或Dpr。
如上所述，Z的氨基酸残基当然可以全部相同或不同。然而，在本发明的所感兴 趣的实施方案中，Z中的氨基酸残基选自两种或三种不同的氨基酸，或是相同的氨基 酸。Z中氨基酸残基相同的合适肽序列例子是例如(Lys)n，其中n是4-15的整数，较 佳的在4-10范围内，例如在4-8范围内，例如在大约4-7范围内，例如Lys4(SEQ ID NO： 1)、Lys5(SEQ ID NO：2)、Lys6(SEQ ID NO：8)、Lys7(SEQ ID NO：30)。较佳的是(Lys)6 通过肽键与X的C端连接。
Z中氨基酸残基选自两种不同氨基酸的合适肽序列的例子是例如(Lys-Xaa)m或 (Xaa-Lys)m，其中m是2-7的整数，较佳在2-5范围内，例如在2-4范围内，例如为3， Xaa独立选自Ser，Thr，Tyr，Asn，Gln，Asp，Glu，Arg，His，Orn，2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨 基丙酸和Met。更佳的，这些肽序列例如是(Lys-Xaa)3或(Xaa-Lys)3，其中Xaa如上定 义，例如(Lys-Glu)3(SEQ ID NO：83)或(Glu-Lys)3(SEQ ID NO：84)。Z中氨基酸残基选 自大约两种氨基酸残基的其它合适的肽序列例子是例如Lysp-Xaaq或Xaap-Lysq，其中p 和q是1-14范围内的整数，条件是p+q在4-15范围内，较佳在4-10范围内，例如在 4-8范围内，例如在4-6范围内，例如是4、5或6，Xaa独立选自Ser，Thr，Tyr，Asn，Gln， Asp，Glu，Arg，His和Met。更佳的，这些肽序列例如是Lys3-Xaa3；或Xaa3-Lys3，其中 Xaa如上定义，如Lys3-Glu3(SEQ ID NO：85)或Glu3-Lys3(SEQ ID NO：86)。更佳的Z 序列由选自Asn和Gln以及4-7个选自Glu和Asp的氨基酸残基的序列组成，例如是 Asn-(Glu)5，Asn-(Glu)6，Gln-(Glu)5，Asn-(Asp)5和Gln-(Asp)5，它是本发明肽偶联物 的N端部分。
Z中氨基酸残基选自三种不同氨基酸的合适肽序列例子是，例如，Xaa1-(Lys)x- (Xaa2)v，Xaa1-(Xaa2)x-(Lys)y，(Lys)x-(Xaa2)y-Xaa1，(Xaa1)x-(Lys)y-Xaa2，(Lys)x-Xaa1-(Xaa2)y， (Xaa1)x-Xaa2-(Lys)y，Xaa1-Lys-Xaa2-Lys，Xaa1-Lys-Xaa2-Lys-Xaa2，Xaa1-Lys-Xaa2-Lys- Xaa2-Lys，Xaa1-Xaa2-Lys-Xaa2，Xaa1-Xaa2-Lys-Xaa2-Lys，Xaa1-Xaa1-Lys-Xaa2-Lys-Xaa2， Lys-Xaa2-Lys-Xaa1，Lys-Xaa2-Lys-Xaa2-Xaa1，Lys-Xaa2-Lys-Xaa2-Lys-Xaa1，Xaa2-Lys- Xaa2-Xaa1，Xaa2-Lys-Xaa2-Lys-Xaa1，Xaa2-Lys-Xaa1-Lys-Xaa2-Xaa1等，其中x和y是1- 5范围内的整数，条件是x+y最大为6，Xaa1和Xaa2独立选自Ala，Leu，Ser，Thr，Tyr，Asn， Gln，Asp，Glu，Arg，His，Met，Orn，2，3-二氨基丙酸，2，4-二氨基丁酸和本文式I定义的氨 基酸。
在本发明的较佳实施方案中，所述肽偶联物的最低有效口服剂量与肽X的最低 有效剂量之比为至少1∶5。
本发明的最佳实施方案涉及一种新的肽偶联物，该偶联物包含作为具有GLP-1 和/或外端素-4活性的激动剂的肽X，该肽X选自
脱Pro36-外端素-4(1-39)-NH2(SEQ ID NO：101)，
脱Pro36-外端素-4(1-40)-NH2，
脱Pro36-脱Pro37-外端素-4(1-39)-NH2，
脱Pro36-脱Pro37-脱Pro38-外端素-4(1-39)-NH2，
脱Pro36-脱Pro37-脱Pro38-外端素-4(1-40)-NH2，
脱Ala35-外端素-4(1-39)-NH2(SEQ ID NO：105)，
脱Gly34-外端素-4(1-39)-NH2(SEQ ID NO：106)，
脱Gly34-(Lys40(棕榈酰))外端素-4(1-39)-NH2(SEQ ID NO：108)，
脱Ala35-(Lys40(棕榈酰))外端素-4(1-39)-NH2(SEQ ID NO：109)，
脱Pro36-(Lys40(棕榈酰))外端素-4(1-39)-NH2(SEQ ID NO：110)，
化合物(iii)Gly8-GLP-1(7-36)-NH2，Gly8-GLP-1(7-37)，和
Gly8-GLP-1(7-36)-Lys37(棕榈酰)-NH2，该肽C端通过肽键与选自(Lys)n的肽序列 Z结合，其中n是4-8的整数，较佳n为6。
应当理解，本发明的肽偶联物可能也可以是较佳的酰胺(NH2)或游离酸(OH)或其 盐形式。典型的本发明肽偶联物是
Gly8-GLP-1(7-36)-Lys6-NH2(SEQ ID NO：88)，
(Gly8，Lys37(棕榈酰)-GLP-1(7-36)(人)-Lys7-NH2(SEQ ID NO：89)，
脱Set49-外端素-4(1-39)-(Lys)6-NH2(SEQ ID NO：91)，
外端素-4(1-39)-Lys6-NH2(SEQ ID NO：92)，
脱Pro36-外端素-4(1-39)-Lys6-NH2(SEQ ID NO：93)，
脱Ala35-外端素-4(1-39)-Lys6-NH2(SEQ ID NO：94)，
脱Gly34-外端素-4(1-39)-Lys6-NH2(SEQ ID NO：95)，
脱Ser39-(Lys40(棕榈酰))外端素-4(1-39)-Lys7-NH2(SEQ ID NO：96)，
脱Gly34-(Lys40(棕榈酰))外端素-4(1-39)-Lys7-NH2(SEQ ID NO：97)，
脱Ala35-(Lys40(棕榈酰))外端素-4(1-39)-Lys7-NH2(SEQ ID NO：98)，
脱Pro36-(Lys40(棕榈酰))外端素-4(1-39)-Lys7-NH2(SEQ ID NO：99)，
Lys40(棕榈酰)外端素-4(1-39)-Lys7-NH2(SEQ ID NO：100)，
脱Pro36，Pro37-外端素-4(1-39)-Lys6-NH2，
Lys6-脱Pro36，Pro37，Pro38-外端素-4(1-39)-NH2
Asn(Glu)5-脱Pro36，Pro37，Pro38-外端素-4(1-39)-NH2，
Lys6-脱Pro36，Pro37，Pro38-外端素-4(1-39)-Lys6-NH2，
Asn(Glu)5-脱Pro36，Pro37，Pro38-外端素-4(1-39)-Lys6-NH2，
脱Pro36，Pro37，Pro38-外端素-4(1-39)-Lys6-NH2，
Ser8-GLP-1(7-36)-Lys6-NH2，
Aib8-GLP-1(7-36)-Lys6-NH2，
Lys6-Gly8-GLP-1(7-36)-Lys6-NH2，
Lys6-Gly8-GLP-1(7-36)-NH2，
(Gly8，Lys26(棕榈酰)-GLP-1(7-36)(人)-Lys6-NH2，
(Gly8，Lys34(棕榈酰)-GLP-1(7-36)(人)-Lys6-NH2，
Gly8-GLP-1(7-36)-Lys8-NH2，
Gly8-GLP-1(7-36)-Lys10-NH2，
Gly8-GLP-1(7-37)-Lys6-NH2，
及其游离酸和药学上可接受的盐。
较佳的偶联物是
脱Pro36-外端素-4(1-39)-Lys6-NH2(SEQ ID NO：93)，
Gly8-GLP-1(7-36)-Lys6-NH2(SEQ ID NO：88)，
脱Pro36，Pro37，Pro38-外端素-4(1-39)-Lys6-NH2，和
本文定义的它们的盐。
在最佳的实例中，偶联物选自Gly8-GLP-1-(7-36)(人)-NH2，Gly8-GLP-1-(7- 36)(人)-Lys6-NH2，Gly8Lys37(棕榈酰)-GLP-1-(7-36)(人)-Lys7-NH2，Gly8Lys34(棕榈 酰)-GLP-1-(7-36)(人)-Lys6-NH2，脱Ser39-外端素-4(1-39)-Lys6-NH2，外端素-4(1-39)- Lys6-NH2，脱Pro36-外端素-4(1-39)-Lys6-NH2，脱Ala35-外端素-4(1-39)-Lys6-NH2，脱 Gly34-外端素-4(1-39)-Lys6-NH2，脱Ser39-(Lys40(棕榈酰))外端素-4(1-39)-Lys7-NH2，脱 Gly34-(Lys40(棕榈酰))外端素-4(1-39)-Lys7-NH2，脱Ala35-(Lys40(棕榈酰))外端素-4(1- 39)-Lys7-NH2，脱Pro36-(Lys40(棕榈酰))外端素-4(1-39)-Lys7-NH2和Lys40(棕榈酰)外端 素-4(1-39)-Lys7-NH2。
本发明的肽偶联物的提供使得降低血糖的肽(如GLP-1和外端素及其活性类似物) 能口服给药。对本文的较佳末端肽片段Z加以选择，从而诱导肽X产生α螺旋结构而 不显著影响X的所需活性。所述螺旋结构使肽链稳定，例如耐降解(如该偶联肽的半 衰期是未偶联肽的2-3倍所示，参见下表5)。肽序列Z是肽偶联物的一部分，它负责 将某种结构导入该分子，从而使最低有效剂量降低至少5倍。较佳的，最低有效剂量 降低至少10倍、更佳为25倍、还要佳为40倍、最佳为50倍。因此，本发明还涉及 用来制备上述肽偶联物的上述肽序列(Z)的用途。
因此，本发明还涉及一种新的肽偶联物，它包含本文定义的肽X，其中X能减 少哺乳动物血糖水平，所述肽偶联物的最低有效口服剂量与肽X的最低有效口服剂量 之比至少为1∶5。
具体地说，本发明涉及一种刺激哺乳动物胰岛素释放的方法，该方法包括给予促 胰岛素有效量的本发明的肽偶联物；一种降低哺乳动物血糖水平的方法，该方法包括 给予有效量的本发明的肽偶联物来降低所述哺乳动物血糖水平；一种减少哺乳动物胃 运动的方法，该方法是给予减少胃运动有效量的本发明的肽偶联物；一种延迟哺乳动 物胃排空的方法，该方法是给予延迟胃排空有效量的本发明的肽偶联物；一种抑制哺 乳动物摄食的方法，该方法是给予抑制摄食有效量的本发明的肽偶联物；以及一种降 低哺乳动物血浆脂质水平的方法，该方法包括给予有效量的本发明的肽偶联物来降低 所述哺乳动物的血浆脂质水平。具体地说，本发明的肽偶联物可用于治疗1型或2型 糖尿病、肥胖、饮食失调、高血糖、代谢失调、胃疾病和耐胰岛素综合征。
本发明还涉及用重组DNA技术来制备所述肽偶联物的方法，该方法包括下列步 骤：(a)将编码所述偶联物的核酸序列导入宿主细胞，(b)培育所述宿主细胞，(c)从培 养物中分离出所述偶联物；或(a)在允许所述偶联物产生的条件下培养含有编码所述偶 联物的核酸序列的重组宿主细胞，和(b)从培养物中分离出所述偶联物。
方法还涉及制备所述肽偶联物的方法，其中肽X是通过重组DNA方法和分离所 述肽来获得的。然后将X与连接于固体载体的或已经用固相合成方法制得的Z偶联。 另外，本发明涉及用肽合成方法制备本发明的肽偶联物。另外，本发明还涉及用肽合 成方法制备本发明的肽偶联物。
本发明的偶联物含有33-39(较佳为36-38)个氨基酸残基的N端序列(该序列与天 然外端素-4的N端序列显著同源，被认为是受体结合所必需的(促胰岛素活性))和C 端序列Z，该偶联物与天然外端素以及外端素的C端截短形式相比还具有稳定性提高 的优点。同样，GLP-1肽偶联化合物4显示出稳定性比未偶联的化合物(iii)有所提高。
组合物
本发明还涉及一种组合物，它包含本发明的外端素变体或肽偶联物以及生理上可 接受的载体。该组合物的形式适合口服、肠胃外(包括皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌内 (i.m.)、硬膜外、直接脑内和腹膜内(i.p.))、直肠、气管内、鼻内、真皮、阴道内、经 颊、经眼或经肺给药，较佳的是适合皮下或口服给药的形式，这些组合物可用本领域 技术人员熟知的方法制得，例如在《雷明顿药物科学》第17版，Alfonso R.Gennaro(编 辑)Mark Publishing Company，Easton，PA，USA及其更新版以及Marcel Dekker的专题 论文系列“药物和药物科学”中有所揭示。组合物可以常规形式存在，例如胶囊剂、 片剂、喷雾剂、外用形式、液体或半液体形式如溶液、悬浮液、分散液、乳液、微团 或脂质体。液体组合物宜适合皮下给药。在较佳实施方案中，本发明组合物皮下给药。 在另一个较佳实施方案中，本发明组合物以口服给药，在这些情况下，较佳的给药形 式是片剂或胶囊剂。
所用药物(运)载体或稀释剂可以是常规的固体或液体载体。固体载体的例子是乳 糖、石膏粉、蔗糖、环糊精、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁、硬脂 酸或纤维素的低级烷基醚。液体载体例子是糖浆、花生油、橄榄油、磷脂、甾醇、脂 肪酸、脂肪酸胺、聚氧乙烯、等渗缓冲液和水。同样，载体或稀释剂可包括本领域已 知的任何缓释物质，例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯单独或与蜡混合。如果用 固体载体来口服给药，制剂可以压片，以粉末或颗粒形式加入硬明胶胶囊，或可以是 锭剂。固体载体的用量可有很大不同，但是通常在大约25毫克至大约1克。
可用常规压片技术制得的典型片剂可含有：
·芯：活性化合物(本发明的游离化合物或其盐)100毫克；胶态二氧化硅 (Aerosil)1.5毫克；微晶纤维素(Avicel)70毫克；修饰的纤维素胶(Ac-Di-Sol)7.5毫克： 硬脂酸镁
·包衣：HPMC约9毫克：*Mywacett 9-40T约0.9毫克；*酰基化甘油一酯，用作 膜包衣增塑剂。
如果用液体载体，制剂形式可以是糖浆、乳液、软明胶胶囊或无菌可注射液体如 水性或非水性液体悬浮液或溶液。
对于鼻内给药，制剂可含有溶解或悬浮在液体载体(尤其是用于施加喷雾剂的水 性载体)中的本发明化合物(宜为偶联物)。载体可含有添加剂如增溶剂如丙二醇、表面 活性剂如胆汁酸盐或聚氧乙烯高级醇醚、吸收增强剂如卵磷脂(磷脂酰胆碱)或环糊精， 或防腐剂如对羟基苯甲酸。
组合物也可以是适合局部或全身注射或灌输的形式，因此可用无菌水或等渗盐水 或葡萄糖液配制。组合物可用本领域熟知的常规灭菌技术来灭菌。所得水溶液可包装 待用或在无菌条件下过滤并冻干，冻干制剂在给药前与无菌水溶液混合。用来静脉内、 皮下和口服给药的制剂宜是缓冲液配的活性化合物溶液。制剂可在使用前即刻从活性 药物和无菌缓冲液制得。一种较佳的灭菌方法是在使用前对制得的溶液进行无菌过 滤。组合物可含有接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，如缓冲剂、张力调 节剂等，例如乙酸钠、乳酸纳、氯化钠、氯化钾、氯化钙等。
本发明化合物具有有价值的药物性能，例如对蛋白水解酶稳定。在选定的蛋白水 解酶存在下本发明肽和肽偶联物的体外稳定性研究显示，新的肽的半衰期比现有的肽 增加。因此，与GLP-1和其它GLP-1激动剂相比，本发明的化合物表现出体内作用 时间显著延长。另外，本发明化合物刺激cAMP形成。该效果可在例如WO 98/08871 中描述的cAMP试验中得到证实。
本发明的肽化合物是具有GLP-1活性和/或外端素-4活性的激动剂，它能改善糖 尿病哺乳动物的血糖耐受性，这可用本领域已知的针对特定肽的试验来测定。这种试 验的例子在本文有所描述。因此，本发明还涉及上述定义的外端素变体和肽偶联物在 治疗中的用途，以及上述肽偶联物用来生产用于治疗(例如治疗1型或2型糖尿病、肥 胖、饮食失调和耐胰岛素综合征)的药物组合物的用途。
在具体实施方案中，本发明的外端素变体和肽偶联物可用来刺激脊椎动物或哺乳 动物的胰岛素释放、降低血糖水平、减少胃运动、延迟胃排空、抑制摄食(例如抑制食 欲)、或降低血浆脂质水平。本发明的新化合物还可用来治疗伴有高血糖危险的糖尿病， 即胰岛素敏感度随应激、心肌感染、中风和传染而降低，或在怀孕期间的胰岛素耐受 性情况下。该新化合物还可用来治疗其它类型的糖尿病，例如糖尿病是其它内分泌疾 病(如肢端肥大、Cushing综合征、嗜铬细胞瘤、胰高血糖素瘤、抑生长素瘤、原发性 醛甾酮过多症)的继发性疾病，或是某些激素给药引起高血糖的继发性疾病，或是某些 药物(抗高血压药、噻嗪类利尿药、含有雌激素的制剂、精神药物、拟交感神经药)的 继发性疾病。另外，本发明的新化合物通常可用来治疗伴有低血糖危险的疾病和情况， 即在摄入酒精后内源性葡萄糖产生减少的情况，或垂体功能减退或原发性肾上腺皮质 功能减退患者对胰岛素敏感度增加的情况，或由于渐进性肾功能不全胰岛素清除减少 的情况。
其它具体的治疗用途在下列文献中有所描述：WO99/40788(涉及外端素和GLP-1 的肌收缩力和利尿效应)、WO98/39022(涉及一种使中枢或外周神经系统活性增加的哺 乳动物对象镇静的方法，该方法包括将外端素或GLP-1或外端素或GLP-1的激动剂 给予该对象，以对其产生镇静或缓解焦虑的效果)、WO93/18786(涉及用GLP-1(7-37) 或GLP-1(7-36)酰胺来治疗糖尿病，该疗法中还包括用产生强协同效果的口服降血糖 药(如磺酰脲)进行治疗)、WO98/19698(涉及GLP-1类似物调节肥胖的用途)、 WO98/08531(涉及GLP-1或其类似物在降低心肌梗塞后死亡率和发病率的方法中的用 途)、WO98/08873(涉及GLP-1或其类似物在减弱手术后代谢变化和对应力的激素反应 的方法中的用途)。另外，本发明化合物适合与其它抗糖尿病药物(如胰岛素、二甲双 胍、磺酰脲和噻唑烷二酮)组合治疗，或与其它抗肥胖药(如leptin、dexphen fluramine、 苯丙胺等)组合治疗。
定义
本文所用的“肽”是一个氨基酸的羧基和另一氨基酸的氨基之间形成酰胺而产生 的化合物。肽中的酰胺键称为肽键。术语“肽”通常指一个氨基酸的C-1和另一氨基 酸的N-2形成酰胺键(有时称为真肽键(eupeptide bond))的化合物，但是它包括由其它 酰胺键(有时称为异肽键(isopeptide bond))连接的残基的化合物。少于10-20个残基的 肽也称为寡肽；具有更多残基的称为多肽。具有50个以上残基的特定序列的多肽通 常称为蛋白质。本文所用的术语“天然的多肽序列”指多肽序列由天然的L-氨基酸组 成，且可由重组宿主细胞表达。本文的X化合物均是具有40个或更少氨基酸残基的 肽序列。
“GLP-1”在此包括GLP-1(7-37)-OH、GLP-1(7-37)-NH2、GLP-1(7-36)-OH和 GLP-1(7-36)-NH2。
“激动剂”指能与受体相互作用并引发该受体生理或药理反应特征(收缩、松弛、 分泌、酶激活等)的内源性物质或药物。
“拮抗剂”指与另一活性剂生理效果相反的药物或化合物。在受体水平下，它是 对抗另一生物活性剂正常诱导的受体相关反应的化学物质。
“部分激动剂”指无论施加多少量都不能诱导最大的受体群激活的激动剂。在给 定组织中，“部分激动剂”可称为“具有中等内在效果的激动剂”。另外，部分激动剂 可对抗作用于同一受体上的完全激动剂的作用。
“受体”指细胞内或细胞上能特异性识别并结合起分子信使作用的化合物(神经 传递介质、激素、淋巴因子、外源凝集素、药物等)的分子或聚合物结构。
本发明的“外端素变体”理解为与外端素-4有至少约90％同源性(最佳与外端素 -4(1-39)有至少约95％同源性)的亲代外端素的变体，该变体具有外端素活性，例如能 降低哺乳动物血糖水平并结合GLP-1受体。本文所用的“外端素-4”指外端素-4(1- 39)(其氨基酸序列公开在美国专利5,424,286中(SEQ ID NO：2))和外端素-4(1-40)(公开 在Chen&Drucher的The Journal of Biological Chemistry，272卷，No.7，4108-15页)， 两种不同仅仅是C端氨基酸残基40位为甘氨酸。亲代外端素的同源性通过两个蛋白 质序列之间的相同性程度(表明第一序列从第二序列衍生获得)来确定。同源性可用本 领域已知的计算机程序来合适测定，该计算机程序例如是GCG程序包(Program Manual for the Wisconsin Package，第8版，1994年8月，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.， (1970).J.Mol.Biol.48：443-453)中提供的GAP。多肽序列比较可采用下列设置：GAP 罚分为3.0，GAP延伸罚分为0.1。
“盐”包括药学上可接受的盐，例如酸式加成盐和碱式盐。酸式加成盐的例子是 盐酸盐、钠盐、氢溴酸盐等。碱式盐例子是阳离子选自下列的盐：碱金属如钠和钾、 碱土金属如钙、铵离子-N(R3)3(R4)，其中R3和R4独立为任选取代的C1-6-烷基、任选 取代的C2-6-链烯基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基。药学上可接受的盐的其它 例子是：例如，《雷明顿药物科学》第17版，Alfonso R.Gennaro(编辑)Mark Publishing Company，Easton，PA，USA，1985及其更新版和《药物技术百科全书》中描述的那些。
变体和偶联物的制备
本发明的外端素变体和肽偶联物可用本领域已知的方法制得。因此，变体以及肽 序列X和Z可用标准的肽制备技术如溶液合成或Merrifield型固相合成制得。据信， Boc(叔丁氧羰基)和Fmoc(9-芴基甲基氧羰基)策略是适用的。
在一个可能的合成策略中，本发明的肽偶联物可用固相合成制得，首先用熟知的 标准的保护、偶联和去保护程序构建肽序列Z，然后以类似于构建Z的方式依次将肽 序列X偶联到Z上，最后将整个肽偶联物从载体上切下。该策略产生了一种肽偶联物， 其中肽序列Z与肽X的C端羰基官能团结合。然而，如果所需的肽偶联物是其中两个 稳定化序列Z各自与肽X的C端和N端共价结合的肽偶联物，那么上述策略也是适 用的，只是如本领域技术人员所理解的那样，在将C端连接的肽偶联物从固体载体上 切下之前，需要用类似于上述的步骤将第二个肽序列Z依次偶联到X的N端上。该 策略也可用来将Z连接到Glu或Asp侧链的羰基官能团上。肽序列Z与N端氮原子 共价结合或与X的Lys、Arg或His侧链上的氮原子共价结合的肽偶联物的制备的可 行策略类似于上述方法，即所述肽偶联物可用固相合成方法制得，首先用熟知的标准 的保护、偶联和去保护程序构建肽序列X，然后用类似于构建X的方法依次将肽序列 Z偶联到X上，最后将整个肽偶联物从载体上切下。另一种可行的策略是用溶液合成、 固相合成、重组技术或酶合成分开制备两个序列X和Z(或其部分)之一或两者，然后 用熟知的片段缩合程序在溶液中或用固相技术或两种技术的组合来偶联这两个序列。 在一个实施方案中，X可用重组DNA方法制得，Z可用固相合成方法制得。X和Z 的偶联可用化学连接来进行。该技术允许以高度特异性方式装配整个未保护的肽片段 (Liu等人，1996，J.Am.Chem.Soc.118：307-312和Dawson等人，1996，226：776)。偶联 也可通过蛋白酶催化肽键形成来进行，这是一种通过肽键将整个未保护的肽片段组合 起来的高度特异性的技术(W.Kullmann，1987，Enzymatic Peptide Synthesis.CRC Press. Boca Raton，Florida.41-59)。
用肽序列Z对Lys，Arg，His，Trp，Ser，Thr，Cys，Tyr，Asp和Glu的侧链衍生可采用 传统的汇集肽合成方法，采用本领域已知的正位(orthogonal)保护方案，或是采用同样 熟知的固相方法和合适的正位可除去链保护。
另外，当将含有电子等排键(如还原性肽键)的肽X修饰得到的肽序列与肽序列Z 偶联时，预计上述策略的组合可能特别适用。在这种情况下，宜通过连续偶联氨基酸 来制备Z的固定化片段，然后使完整的肽序列X(在溶液中制备或完全或部分采用固 相技术或利用重组技术制得)与该片段偶联。
合适的固体载体材料(SSM)的例子是，例如官能化的树脂如聚苯乙烯、聚丙烯酰 胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚乙二醇、纤维素、聚乙烯、接枝在聚苯乙烯上的聚乙二醇、 乳胶、动力珠(dynabead)等。应当理解，可能需要或希望肽序列Z的C端氨基酸或肽 X的C端氨基酸通过常用接头与固体载体材料相连接，该接头例如是2，4-二甲氧基-4′- 羟基-苯甲酮、4-(4-羟基-甲基-3-甲氧基苯氧基)-丁酸、4-羟基-甲基苯甲酸、4-羟甲基- 苯氧基乙酸、3-(4-羟甲基苯氧基)丙酸和对-[(R，S)-a[1-9H-芴-9-基)甲氧基甲酰氨基]- 2，4-二甲氧基苄基]-苯氧基-乙酸。
本发明的变体和肽偶联物可用酸从固体载体材料上切下，该酸例如是三氟乙酸、 三氟甲磺酸、溴化氢、氯化氢、氟化氢等，它可任选地与一种或多种适合此目的的清 除剂(如乙二硫醇、三异丙基硅烷、苯酚、苯硫基甲烷等)合用。或者，本发明肽偶联 物可用碱(如氨、肼、醇盐如乙醇钠、氢氧化物如氢氧化钠等)来从固体载体上切下。
因此，本发明还涉及一种制备具有药物活性的Z与X共价结合(较佳的是通过肽 键)的肽偶联物的方法。制备式I(X-Z)肽偶联物的方法包括下列步骤：
a)将激活形式的具有合适保护基团(包括N-α-保护基团)的氨基酸或二肽偶联到固 定化肽序列H-Z-SSM上，从而形成固定化的N-α-保护的肽片段，
b)除去所述N-α-保护基团，形成具有未保护N端的固定化保护的肽片段，
c)将羧基活化形式的具有合适保护基团(包括N-α-保护基团)的另一氨基酸或二肽 连接到固定化肽片段的N端上，重复步骤b)和c)的除去/偶联步骤，直至获得所需的 肽序列X，然后
d)将该肽偶联物从固体载体材料上切下。
一种制备式II(Z-X)的肽偶联物的方法，该方法包括下列步骤：
a)将具有合适保护基团(包括N-α-保护基团)的氨基酸或二肽以活化形式偶联到固 体载体材料(SSM)上，从而形成固定化的受保护的氨基酸或二肽，
b)除去所述N-α-保护基团，形成具有未保护N端的固定化的氨基酸或肽片段，
c)将具有合适保护基团(包括N-α-保护基团)的额外的氨基酸或二肽以羧基活化形 式偶联到固定化氨基酸或肽片段的N端上，重复步骤b)和c)的除去/偶联步骤，直至 获得所需的肽序列X，
d)将具有合适保护基团(包括N-α-保护基团)的另一氨基酸或二肽以羧基活化形式 偶联到固定化肽片段的N端上，重复步骤b)和d)的除去/偶联步骤，直至获得所需的 肽序列Z，然后
e)将该肽偶联物从固体载体材料上切下。
另外，一种制备式III(Z-X-Z)肽偶联物的方法包括下列步骤：
a)将具有合适保护基团(包括N-α-保护基团)的氨基酸或二肽以羧基活化形式偶联 到固定化肽序列H-Z-SSM上，从而形成固定化的N-α-保护的肽片段，
b)除去所述N-α-保护基团，形成具有未保护N端的固定化的肽片段，
c)将具有合适保护基团(包括N-α-保护基团)的另一氨基酸或二肽以羧基活化形式 偶联到固定化肽片段的N端上，重复步骤b)和c)的除去/偶联步骤，直至获得所需的 肽序列X，
d)将具有合适保护基团(包括N-α-保护基团)的另一氨基酸或二肽以羧基活化形式 偶联到固定化肽片段的N端上，重复步骤b)和d)的除去/偶联步骤，直至获得所需的 肽序列Z，然后
e)将该肽偶联物从固体载体材料上切下。
偶联、除去和切割步骤可用本领域技术人员已知的方法结合考虑保护策略以及所 选的固相材料来进行。然而，通常认为Boc(叔丁氧羰基)和Fmoc(9-芴基甲基氧羰基) 保护策略是适用的，肽键可用本领域技术人员已知的各种活化程序来形成，例如，肽 化学领域技术人员知道，可使合适氨基酸或肽的C端活化衍生物(酰基卤、酸酐、活 化的酯如HOBt-酯等)与有关氨基酸或肽的氨基反应。另外，当采用携带了在现有条件 下具有反应性的官能团的氨基酸残基时，可能需要或希望引入侧链保护基团。所需的 保护方案是本领域技术人员已知的(例如参见M.Bodanszky和A.Bodanszky，“肽合成 实践”第2版，Springer-Verlag.1994，J.Jones，″肽的化学合成″Clarendon Press，1991， 和Dryland等人1986，J.Chem.Soc.，Perkin Trans.1：125-137)。
本发明的肽和肽偶联物也可通过重组DNA技术用本领域技术人员已知的常用方 法和原理来制得。可用建立的标准方法来合成制得编码该肽和肽偶联物的核酸序列， 例如S.L.Beaucage和M.H.Caruthers.Tetrahedron Letters 22，1981，1859-1869中描述的 磷酰胺化(phosphoamidite)方法，或Matthes等人EMBO Journal 3，1984，801-805页所 描述的方法。按照磷酰胺化方法寡核苷酸例如可在自动化DNA合成仪上合成，然后 纯化、退火、连接并克隆到合适载体中。用来分离或克隆编码肽X的核酸序列的技术 是本领域已知的，其包括从基因组DNA中分离，从cDNA制备，或其组合方法。从 这些基因组DNA克隆本发明的核酸序列可以这样来实现，例如，采用熟知的聚合酶 链反应(PCR)，或对表达文库作抗体筛选以检测具有共同结构特征的克隆的DNA片 段。例如参见Innis等人，1990.《方法和应用指南》Academic Press.New York。也可 采用其它核酸扩增程序，例如连接酶链反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于核酸序 列的扩增(NASBA)。然后可将其与编码Z的核酸序列相连。
然后，将编码该肽和肽偶联物的核酸序列插入重组表达载体中，该载体可以是宜 进行重组DNA操作的任何载体。载体的选择通常取决于其要导入的宿主细胞。因此， 载体可以是自主复制载体，即以染色体外物质形式存在、其复制不依赖于染色体复制 的载体(如质粒)。或者，载体可以是这样一种载体，当将其导入宿主细胞后，它整合 到宿主细胞基因组中并与其所整合入的染色体一起复制。
在该载体中，编码本发明肽和肽偶联物的核酸序列应当与合适的启动子序列操作 性相连。该启动子可以是在所选宿主细胞中表现出转录活性的任何核酸序列，它可从 编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因衍生获得。指导编码所述肽和肽偶联物的 核酸序列在哺乳动物细胞中转录的合适启动子例子是SV 40启动子(Subramani等人， Mol.Cell.Biol.1.1981，854-864页)、MT-1(金属硫蛋白基因)启动子(Palmiter等人， Science，222，1983，809-814页)或腺病毒2主要晚期启动子、Rous肉瘤病毒(RSV)启动 子、巨细胞病毒(CMV)启动子(Boshart等人，1981，Cell 41：521-530)和牛乳头瘤病毒 (BPV)启动子。用于昆虫细胞的合适启动子是多角体蛋白启动子(Vasuvedan等人， FEBS Lett.311.1992，7-11页)。
用来指导编码肽和肽偶联物的核酸序列转录(尤其在细菌宿主细胞中)的合适启动 子例子从大肠杆菌lac操纵子获得的启动子、天蓝色链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)、枯 草杆菌左聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢 杆菌麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌 青霉素酶基因(pepP)、枯草杆菌xylA和xylB基因以及原核细胞β-内酰胺酶基因 (Villa-Kamaroff等人，1978.Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75：3727-3731)以及tac启动子(DeBoer等人，1983，Proceedings ofthe National Academy of Sciences USA 80：21 25)。其它启动子在“重组细菌的有用蛋白质”Scientific American， 1980，242：74-94；Sambrook等人，1989(同上)中有所描述。指导编码肽和肽偶联物的核 酸序列在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子例子是从编码米曲霉TAKA淀粉酶、 Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定的α-淀粉酶、 黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、Rhizomucor miehei脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、 米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(美国专利 4,288,627中公开，纳入本文作为参考)的基因及其杂合物所得的启动子。用于丝状真 菌宿主细胞的特别佳的启动子是TAKA淀粉酶、NA2-tpi(编码黑曲霉中性淀粉酶和米 曲霉丙糖磷酸异构酶的基因的启动子杂合物)和glaA启动子。在酵母宿主中，有用的 启动子从酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)基因、酿酒酵母半乳糖激酶基因(GAL1)、酿酒酵母 醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(ADH2/GAP)和酿酒酵母3-磷酸甘油酯激酶基因。 其它可用于酵母宿主细胞的启动子在Romanos等人，1992，Yeast 8：423-488中有所描 述。
编码所述肽和肽偶联物的核酸序列还可与合适的终止子操作性相连，该终止子例 如是人生长激素终止子(Palmiter等人，同上)。用于丝状真菌宿主细胞的较佳终止子从 编码米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸酯合成酶、黑 曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶的基因获得。用于酵母宿主细胞的较佳终 止子从编码酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)或酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱 氢酶的基因获得。其它可用于酵母宿主细胞的终止子在Romanos等人，1992(同上)中 有所描述。
载体还可进一步包含诸如聚腺苷酸化信号(例如来自SV 40或腺病毒5 Elb区)、 转录增强子序列(例如SV 40增强子)和翻译增强子序列(例如编码腺病毒VA RNA的序 列)等元件。另外，对于丝状真菌宿主细胞的较佳的聚腺苷酸化序列可从编码米曲霉 TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸酯合成酶和黑曲霉α-葡糖 苷酶的基因获得。用于酵母宿主细胞的有用的聚腺苷酸化序列在Guo和 Sherman，1995，Molecular Cellular Biology 15：5983-5990中有所描述。
重组表达载体还可包括使该载体在所关心的宿主细胞中复制的DNA序列。该序 列的例子是(当宿主细胞是哺乳动物细胞时)SV 40或多形瘤的复制起点。细菌复制起 点例子是质粒pBR322，pUC19，pACYC117，pACYC183，pUB110，pE194，pTA1060和 pAMβ1的复制起点。用于酵母宿主细胞的复制起点例子是2微米(micron)复制起点， CEN6和ARS4的组合，以及CEN3和ARS1的组合。复制起点可以有一个突变，以 使其功能在宿主细胞中成温度敏感性(例如参见，Ehrlich，1978，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 75：1433)。
载体还可包含可选择的标记物，例如其产物能补充宿主细胞缺陷的基因，例如编 码二氢叶酸还原酶(DHFR)的基因，或其产物赋予药物(如新霉素、遗传霉素、氨苄青 霉素或潮霉素)抗性的基因。用于酵母宿主细胞的合适标记物是ADE2、HIS3、LEU2、 LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的可选择标记物可选自，但不 局限于，amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨基甲酰转移酶)、bar(膦丝菌素乙酰转移酶)、 hygB(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(鸟氨酸-5′-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸 腺苷转移酶)、trpC(氨基苯甲酸酯合成酶)和β-硫代葡萄糖苷酶抗性标记物，以及其它 种类的等价物。宜用于曲霉细胞的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG标记物以及吸 水链霉菌的bar标记物。另外，选择可通过如WO91/17243中描述的共转化来实现， 其中可选择标记物在分开的载体上。
用来分别连接编码肽和肽偶联物的核酸序列、启动子和终止子并将它们插入含有 复制所需信息的合适载体中的程序是本领域技术人员所熟知的(例如参见Sambrook等 人，同上)。
其中导入表达载体的宿主细胞可以是能产生该肽和肽偶联物的任何细胞，它可以 是真核细胞，如无脊椎动物(昆虫)细胞或脊椎动物细胞，例如Xenopus laevis卵母细胞 或哺乳动物细胞，尤其是昆虫细胞和哺乳动物细胞。合适的哺乳动物细胞系例子是 COS(例如ATCC CRL 165)、BHK(例如ATCC CRL 1632、ATCC CCL10)或CHO(例如 ATCC CCL61)细胞系。
转染哺乳动物细胞并使导入细胞的DNA序列表达的方法在例如下列文献中有所 描述：Kaufman和Sharp，1982，J.Mol.Biol.159：601-621；Southern和Berg，1982， J.Mol.Appl.Genet.1：327-341；Loyter等人，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：422- 426；Wigler等人，1978 Cell 14：725；Corsaro和Rearson，1981，Somatic Cell Genetics 7：603，Graham和Van der Eb.1973.Virology 52：456；Fraley等人，1980，JBC 225：10431； Capecchi，1980.Cell 22：479；Wiberg等人，1983，NAR 11：7287；和Neumann等人，1982 EMBO J.1：841-845。宿主细胞也可以是单细胞病原体(如原核细胞)或非单细胞病原体 (如真核细胞)。有用的单细胞细胞是细菌细胞，例如革兰阳性菌，包括但不局限于， 芽孢杆菌属细胞，如嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、 凝结芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热 脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌，或链霉菌属细胞，例如浅青紫链霉 菌或鼠灰链霉菌，或革兰阴性菌，如大肠杆菌和假单胞菌属。在较佳的实施方案中， 细菌宿主细胞是迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细 胞。细菌宿主细胞的转化可通过以下方法来实现，例如，原生质体转化(例如参见Chang 和Cohen，1979，Molecular General Genetics 168：111-115)、感受态细胞(例如参见Young 和Spizizin，1961，Journal of Bacteriology 81：823-829，或Dubnar和Davidoff Abelson， 1971，Journal of Molecular Biology 56：209-221)、电穿孔(参见Shigekawa和Dower，1988， Biotech 6：742-751)、偶联(例如参见Koehler和Thorne，1987，Journal of Bacteriology 169：5771-5278)。宿主细胞可以是真菌细胞。真菌宿主细胞还可以是酵母细胞。本文 的“酵母菌”包括子囊孢子酵母(内孢霉)、担孢子酵母和属于半知菌类(芽生菌)的酵母 菌。
用来培养细胞的培养基可以是适合哺乳动物细胞生长的任何常规培养基，例如是 含有血清或不含血清的含合适添加物的培养基，或是使昆虫、酵母或真菌细胞生长的 合适培养基。合适的培养基可市售购得，或可根据公开的配方(例如见美国典型培养物 保藏中心的目录)配制。
因此，本发明还涉及一种生产本发明的具有天然多肽序列的外端素变体和肽偶联 物的方法，该方法包括
a)将包含在核酸构建物或载体中的编码含本发明外端素变体或肽偶联物肽序列 的多肽序列的核酸序列以及可选择标记物导入宿主细胞中，获得重组的宿主细胞；
b)选出所述重组宿主细胞；
c)在允许所述多肽序列产生的条件下培育所述重组宿主细胞；
d)从培养物中分离出所述多肽序列；和
e)任选地用合适的蛋白酶切下所述多肽序列，获得所述肽偶联物。
然后，可用常规程序从培养基中回收由该细胞产生的具有天然多肽序列的本发明 变体和肽偶联物，程序包括用离心或过滤从培养基中分离宿主细胞，用盐(如硫酸铵) 使上清液或滤液中的蛋白组分沉淀，用各种层析步骤(如离子交换层析、亲和层析等) 纯化。可用本领域已知的步骤将亲脂性取代基连接到本发明肽上。在一个实施方案中， 亲脂性取代基可通过掺入已经在标准合成方法中连接有亲脂性取代基的氨基酸来连 接(例如参见实施例部分化合物7的合成)。或者，可如WO98/08871所述那样在合成 和分离肽之后连接取代基。
通过下列实施例进一步描述本发明。
实施例
肽合成，通用程序
·装置和合成策略
在装有过滤用聚丙烯滤膜的聚乙烯容器中，用9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)作为N- α-氨基保护基团和侧链官能团的合适的常见保护基团，分批合成肽(Dryland等人， 1986，J.Chem.Soc.，Perkin Trans.1：125-137)。
·溶剂
使溶剂DMF(N，N-二甲基甲酰胺，Riedel dc-Haen，Germany)通过装有强阳离子交 换树脂(Lewatit S 100 MB/H强酸，Bayer AG Leverkusen，Germany)的柱进行纯化，在 使用前通过加入3，4-二氢-3-羟基-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪(Dhbt-OH)来分析游离胺，如果 有游离的胺，产生黄色(Dhbt-O-阴离子)。溶剂DCM(二氯甲烷，分析级，Riedel de-Haen， Germany)直接使用而不作纯化。THF(四氢呋喃，分析级，Riedel de-Haen，Germany) 直接使用而不作纯化。
·氨基酸
Fmoc-保护的氨基酸以合适的侧链保护形式购自MilliGen(UK)和PerSeptive Biosystems GmbH Hamburg，Germany。FmocLys(棕榈酰)-OH购自 Bachem(Switzerland)。
·接头
利用DIC将购自Novabiochem，Switzerland的(4-羟甲基苯氧基)乙酸(HMPA)偶联 到预制的或原位产生的1-羟基苯并三唑(HObt)酯的树脂上。
·偶联剂
偶联剂二异丙基碳化二亚胺(DIC)购自Riedel de-Haen，Germany，在使用前蒸馏。 二环己基碳化二亚胺(DCC)购自Merck-Schuchardt，Munchen，Germany，蒸馏纯化。
·固体载体
用含0.05M或更高浓度的Fmoc保护的活化氨基酸(DMF配)在下列类型的固体载 体上合成根据Fmoc策略合成的肽。TentaGel S树脂0.22-0.31毫摩尔/克(TentaGel S- Ram，TentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc；Rapp polymere，Germany)。
·催化剂和其它试剂
二异丙基乙胺(DIEA)购自Aldrich，Germany，乙二胺购自Fluka，哌啶和吡啶购自 Riedel-de Haen，Frankfurt，Germany，4-(N，N-二-甲基氨基)吡啶(DMAP)购自Fluka， Switzerland，用作涉及对称酸酐的偶联反应的催化剂。乙二硫醇购自Riedel-de Haen， Frankfurt，Germany。3，4-二氢-3-羟基-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪(Dhbt-OH)和1-羟基苯并三 唑(HObt)购自Fluka，Switzerland。
·偶联步骤
以DMF配的对称酸酐形式偶联第一氨基酸，该对称酸酐借助DIC或DCC从合 适的N-α-保护的氨基酸产生。下列氨基酸以预制的HObt酯形式偶联，该HObt酯借 助DMF配的DIC从合适的N-α-保护的氨基酸和HObt制得。80℃下进行水合茚三酮 试验检查酰化，以防Fmoc在测试期间去保护(Larsen，B.D.和Holm，A.，1994.Int.J. Peptide Protein Res.43：1-9)。
·以HObt酯形式偶联
方法a.将3当量的N-α-氨基保护的氨基酸和3当量HObt、3当量DIC一起溶解 在DMF中。使该溶液在室温下静置10分钟，然后加到树脂上，树脂在加入预活化氨 基酸之前已用含0.2％Dhbt-OH的DMF溶液洗涤。
方法b.在使用前，将3当量的N-α-氨基保护的氨基酸和3当量HObt、3当量 DIC一起溶解在DMF中。将最终溶液加入树脂中。
·预制的对称酸酐
将6当量N-α-保护的氨基酸溶解在DCM中，冷却至0℃。加入DCC或DIC(3 当量)，继续反应10分钟。真空除去溶剂，将残余物溶解在DMF中。在用DCC的情 况下，过滤DMF溶液，然后立即加入树脂，再加入0.1当量DMAP。
·N-α-氨基Fmoc保护基团的去保护
用20％哌啶的DMF溶液处理(1×5和1×10分钟)进行Fmoc基团的去保护，然 后用DMF洗涤，直至将Dhbt-OH加入排出的DMF后不能检测到黄色(Dhbt-O-)。
·用酸使肽从树脂上断裂下来
方法a.用95％三氟乙酸(TFA，Riedel-de Haen，Frankfurt，Germany)-水(v/v)或95 ％TFA和5％乙二硫醇(v/v)在室温下处理2小时，将肽从树脂切下。用95％TFA-水洗 涤过滤的树脂，滤液和洗液通过加入10％乙酸来稀释。所得混合物用乙醚萃取3次， 最后冷冻干燥。粗制的冷冻干燥的产物用高效液相层析(HPLC)分析，用质谱(MS)鉴定。
·TentaGel S-RAM上的分批肽合成
将TentaGel S-RAM树脂(100-1000毫克，0.22-0.31毫摩尔/克)置于装有过滤用聚 丙烯滤膜的聚乙烯容器中。树脂DMF(5-10毫升)中溶胀，根据上述程序除去Fmoc基 团。如上所述记住DIC依次偶联原位产生的Fmoc-保护的HObt酯(3当量)形式的以后 的氨基酸。偶联持续3小时，除非另有特指。抽干树脂，用DMF(4×5-10毫升，每次 2分钟)洗涤，以便除去过量试剂。利用80℃水合茚三酮试验检查是否所有都酰化。合 成完成后，肽树脂用DMF(3×5-10毫升，每次5分钟)、DCM(3×5-10毫升，每次1 分钟)洗涤，最后用二乙醚(3×5-10毫升，每次1分钟)洗涤，真空干燥。
·HPLC条件
在Shmadzu系统上进行无梯度HPLC分析，该系统由LA-6A泵、MERCK HITACIII L-4000 UV检测器(在215纳米下运行)和Rheodyne 7125注射阀(具有20微 升环)组成。用于无梯度分析的柱是Spherisorb ODS-2(100×3毫米；5-微米颗 粒)(MicroLab，Aarbus，Denmark)。采用梯度的HPLC分析在MERCK HITACHI L-6200 Intelligent泵、MERCK HITACHI L-4000 UV检测器(在215纳米下运行)和Rheodyne 7125注射阀(具有20微升环)上进行，或在装有Waters 996光电二极管阵列检测器的 Waters 600E仪器上进行。所用柱是RescoreTM RPC 1毫升(Waters)或LiChroCART 125-4 LiChrospher 100 RP-18(5微米)(Merck)。
缓冲液A是含0.1％(体积)TFA的水，缓冲液B是90％(体积)乙腈、9.9％(体积) 水和0.1％(体积)TFA。将缓冲液以1.3-1.5毫升/分钟的流速泵送通过柱，采用下列梯 度之一进行肽分析：1)0％-100％B的线性梯度(30分钟)或2)0％B(2分钟)，0-50％B 的线性梯度(23分钟)，50-100％B的线性梯度(5分钟)。
对于制备性HPLC，纯化在装有Waters 996光电二极管阵列检测器的Waters 600E 仪器上进行。所用柱是Waters Delta-Pak C-18 15微米，100埃，25×100毫米。梯度 2)采用流速9毫升/分钟。
·质谱法
在装有电喷雾(ESI)探针(ES-MS)的Finnigan Mat LCQ仪器和TofSpec E.Fisons仪 器(MALDI-TOF)(采用β-氰基-对-羟基肉桂酸作为矩阵)上获得质谱。或者，从 Micromass LCT仪器获得质谱。
现有技术肽的肽合成
(i)化合物(i)H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu- Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala- Pro-Pro-Pro-Ser-NH2，(外端素-4(1-39)-NH2)(SEQ ID NO：102)在TentaGel S-RAM上的 肽合成
将干的TentaGel S-RAM树脂(0.25毫摩尔/克，1000毫克)置于装有过滤用聚丙烯 滤膜的聚乙烯容器中，使其在DMF(5毫升)中溶胀2小时。根据上述程序除去Fmoc 基团，按照“TentaGel S-RAM树脂上的分批肽合成”所述那样依次装配肽。合成完成 后，肽-树脂用DMF(3×5毫升，每次1分钟)、DCM(3×5毫升，每次1分钟)和二乙 醚(3×5毫升，每次1分钟)洗涤，真空干燥。根据上述方法a从树脂上切下肽，从乙 酸中冷冻干燥。根据上述程序用制备性HPLC纯化粗肽。发现所纯化的产物是均一的， 其纯度高于90％。用ES-MS确认此肽的身份。得率为17％。
(ii)化合物(ii)，H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu- Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala- Pro-Pro-Pro-NH2，(脱Ser39外端素-4(1-39)-NH2)在TentaGel S-RAM上的肽合成
将干的TentaGel S-RAM树脂(0.25毫摩尔/克，1000毫克)置于装有过滤用聚丙烯 滤膜的聚乙烯容器中，使其在DMF(5毫升)中溶胀2小时。根据上述程序除去Fmoc 基团，按照“TentaGel S-RAM树脂上的分批肽合成”所述那样依次装配肽。合成完成 后，肽-树脂用DMF(3×5毫升，每次1分钟)、DCM(3×5毫升，每次1分钟)和二乙 醚(3×5毫升，每次1分钟)洗涤，真空干燥。根据上述方法a从树脂上切下肽，从乙 酸中冷冻干燥。根据上述程序用制备性HPLC纯化粗肽。发现所纯化的产物是均一的， 其纯度高于97％。用ES-MS确认此肽的身份。得率为22％。
(iii)化合物(iii)H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu- Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2，(Gly8-GLP1-(7- 36)(人)-NH2)(SEQ ID NO：87)在TentaGel S-RAM上的肽合成
将干的TentaGel S-RAM树脂(0.25毫摩尔/克，1000毫克)置于装有过滤用聚丙烯 滤膜的聚乙烯容器中，使其在DMF(5毫升)中溶胀2小时。根据上述程序除去Fmoc 基团，按照“TentaGel S-RAM树脂上的分批肽合成”所述那样依次装配肽。合成完成 后，肽-树脂用DMF(3×5毫升，每次1分钟)、DCM(3×5毫升，每次1分钟)和二乙 醚(3×5毫升，每次1分钟)洗涤，真空干燥。根据上述方法a从树脂上切下肽，从乙 酸中冷冻干燥。根据上述程序用制备性HPLC纯化粗肽。发现所纯化的产物是均一的， 其纯度高于95％。用ES-MS确认此肽的身份。得率为9％。
本发明肽序列的合成
1.化合物1，H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu- Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala- Pro-Pro-Ser-NH2，(脱Pro36-外端素-4(1-39)-NH2)(SEQ ID NO：101)在TentaGel S-RAM 上的肽合成
将干的TentaGel S-RAM树脂(0.25毫摩尔/克，1500毫克)置于装有过滤用聚丙烯 滤膜的聚乙烯容器中，使其在DMF(5毫升)中溶胀2小时。根据上述程序除去Fmoc 基团，按照“TentaGel S-RAM树脂上的分批肽合成”所述那样依次装配肽。合成完成 后，肽-树脂用DMF(3×5毫升，每次1分钟)、DCM(3×5毫升，每次1分钟)和二乙 醚(3×5毫升，每次1分钟)洗涤，真空干燥。根据上述方法a从树脂上切下肽，从乙 酸中冷冻干燥。根据上述程序用制备性HPLC纯化粗肽。发现所纯化的产物是均一的， 其纯度高于95％。用ES-MS确认此肽的身份。得率为18.3％。
2.化合物2，H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu- Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala- Pro-Pro-Ser-(Lys)6-NH2，(脱-Pro36-外端素-4(1-39)-Lys6-NH2)(SEQ ID NO：93)在 TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc上的肽合成
将干的TentaGel S-RAM-Lys(Boc)树脂(0.22毫摩尔/克，1500毫克)置于装有过滤 用聚丙烯滤膜的聚乙烯容器中，使其在DMF(5毫升)中溶胀2小时。根据上述程序除 去第一个赖氨酸上的Fmoc基团，按照“TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc上的分批肽 合成”所述那样继续合成，直至肽序列结束。合成完成后，肽-树脂用DMF(3×5毫升， 每次1分钟)、DCM(3×5毫升，每次1分钟)和二乙醚(3×5毫升，每次1分钟)洗涤， 真空干燥。根据上述方法a从树脂上切下肽，从乙酸中冷冻干燥。根据上述程序用制 备性HPLC纯化经冷冻干燥的粗产物。发现经纯化的产物是均一的，其纯度高于95 ％。用ES-MS确认此肽的身份。得率为22.1％。
3.化合物3，H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu- Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala- Pro-Pro-Pro-Ser-(Lys)6-NH2，(外端素-4(1-39)-Lys6-NH2)(SEQ ID NO：92)在TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc上的肽合成
将干的TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc树脂(0.22毫摩尔/克，1000毫克)置于装有 过滤用聚丙烯滤膜的聚乙烯容器中，使其在DMF(5毫升)中溶胀2小时。根据上述程 序除去第一个赖氨酸上的Fmoc基团，按照“TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc上的分 批肽合成”所述那样继续合成，直至肽序列结束。合成完成后，肽-树脂用DMF(3×5 毫升，每次1分钟)、DCM(3×5毫升，每次1分钟)和二乙醚(3×5毫升，每次1分钟) 洗涤，真空干燥。根据上述方法a从树脂上切下肽，从乙酸中冷冻干燥。根据上述程 序用制备性HPLC纯化经冷冻干燥的粗产物。发现经纯化的产物是均一的，其纯度高 于90％。用ES-MS确认此肽的身份。得率为20.5％。
4.化合物4，H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu- Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-(Lys)6-NH2，(Gly8- GLP1-(7-36)(人)-Lys6-NH2)(SEQ ID NO：88)在TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc上的肽 合成
将干的TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc树脂(0.22毫摩尔/克，1000毫克)置于装有 过滤用聚丙烯滤膜的聚乙烯容器中，使其在DMF(5毫升)中溶胀2小时。如上所述除 去第一个赖氨酸上的Fmoc基团，按照“TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc上的分批肽 合成”所述那样继续合成，直至肽序列结束。合成完成后，肽-树脂用DMF(3×5毫升， 每次1分钟)、DCM(3×5毫升，每次1分钟)和二乙醚(3×5毫升，每次1分钟)洗涤， 真空干燥。根据上述方法a从树脂上切下肽，从乙酸中冷冻干燥。根据上述程序用制 备性HPLC纯化经冷冻干燥的粗产物。发现经纯化的产物是均一的，其纯度高于95 ％。用ES-MS确认此肽的身份。得率为11.7％。
4a.化合物4，H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu- Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys- Lys-NH2，([Gly8]hGLP-1(7-36)-(Lys)6-NH2)(SEQ ID NO：88)在TentaGel S-RAM- Lys(Boc)Fmoc上的肽合成
将干的TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc树脂(0.22毫摩尔/克，2013毫克)置于装有 过滤用聚丙烯滤膜的聚乙烯容器中，使其在DMF(5毫升)中溶胀2小时。如上所述除 去第一个赖氨酸上的Fmoc基团，按照“TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc上的分批肽 合成”所述那样继续合成，直至肽序列结束。合成完成后，肽-树脂用DMF(3×5毫升， 每次1分钟)、DCM(3×5毫升，每次1分钟)和二乙醚(3×5毫升，每次1分钟)洗涤， 真空干燥。根据上述方法a从树脂上切下肽，从乙酸中冷冻干燥。根据上述程序用制 备性HPLC纯化经冷冻干燥的粗产物。发现经纯化的产物是均一的，其纯度高于90 ％。用ES-MS确认此肽的身份。得率为13％。
5.化合物5，H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu- Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys(棕榈酰)-(Lys)6- NH2，([Gly8，Lys37(棕榈酰)]GLP1-(7-36)(人)-(Lys)7-NH2)(SEQ ID NO：89)在TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc上的肽合成
将于的TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc树脂(0.22毫摩尔/克，1000毫克)置于装有 过滤用聚丙烯滤膜的聚乙烯容器中，使其在DMF(5毫升)中溶胀2小时。如上所述除 去第一个赖氨酸上的Fmoc基团，按照“TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc上的分批肽 合成”所述那样继续合成，直至肽序列结束。试剂Fmoc-Lys(棕榈酰)-OH以稍稍修饰 的方式偶联，因为其在DMF中的溶解度差。将大约400毫克Fmoc-Lys(棕榈酰)-OH 溶解在大约6毫升THF(而不是DMF)中。合成完成后，肽-树脂用DMF(3×5毫升， 每次1分钟)、DCM(3×5毫升，每次1分钟)和二乙醚(3×5毫升，每次1分钟)洗涤， 真空干燥。根据上述方法b从树脂上切下肽，从乙酸中冷冻干燥。根据上述程序用制 备性HPLC纯化经冷冻干燥的粗产物。发现经纯化的产物是均一的，其纯度高于95 ％。用ES-MS确认此肽的身份。得率为9.3％。
6.化合物6，H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu- Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys(棕榈酰)-Gly-Arg-(Lys)6-NH2， ([Gly8，Lys34(棕榈酰)]GLP1-(7-36)(人)-(Lys)6-NH2)(SEQ ID NO：90)在TentaGel S-RAM- Lys(Boc)Fmoc上的肽合成
将干的TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc树脂(0.22毫摩尔/克，1000毫克)置于装有 过滤用聚丙烯滤膜的聚乙烯容器中，使其在DMF(5毫升)中溶胀2小时。如上所述除 去第一个赖氨酸上的Fmoc基团，按照“TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc上的分批肽 合成”所述那样继续合成，直至肽序列结束。试剂Fmoc-Lys(棕榈酰)-OH以稍稍修饰 的方式偶联，因为其在DMF中的溶解度差。将大约400毫克Fmoc-Lys(棕榈酰)-OH 溶解在大约6毫升THF(而不是DMF)中。合成完成后，肽-树脂用DMF(3×5毫升， 每次1分钟)、DCM(3×5毫升，每次1分钟)和二乙醚(3×5毫升，每次1分钟)洗涤， 真空干燥。根据上述方法a从树脂上切下肽，从乙酸中冷冻干燥。根据上述程序用制 备性HPLC纯化经冷冻干燥的粗产物。发现经纯化的产物是均一的，其纯度高于90 ％。用ES-MS确认此肽的身份。得率为4.2％。
7.化合物7，H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu- Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(棕榈酰)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-(Lys)6-NH2， ([Gly8，Lys26(棕榈酰)]GLP1-(7-36)(人)-(Lys)6-NH2)(SEQ ID NO：103)在TentaGel S- RAM-Lys(Boc)Fmoc上的肽合成
将干的TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc树脂(0.22毫摩尔/克，1000毫克)置于装有 过滤用聚丙烯滤膜的聚乙烯容器中，使其在DMF(5毫升)中溶胀2小时。如上所述除 去第一个赖氨酸上的Fmoc基团，按照“TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc上的分批肽 合成”所述那样继续合成，直至肽序列结束。试剂Fmoc-Lys(棕榈酰)-OH以稍稍修饰 的方式偶联，因为其在DMF中的溶解度差。将大约400毫克Fmoc-Lys(棕榈酰)-OH 溶解在大约6毫升THF(而不是DMF)中。合成完成后，肽-树脂用DMF(3×5毫升， 每次1分钟)、DCM(3×5毫升，每次1分钟)和二乙醚(3×5毫升，每次1分钟)洗涤， 真空干燥。根据上述方法a从树脂上切下肽，从乙酸中冷冻干燥。根据上述程序用制 备性HPLC纯化经冷冻干燥的粗产物。发现经纯化的产物是均一的，其纯度高于90 ％。用ES-MS确认此肽的身份。得率为2.2％。
8.化合物8，H-Lys-Lys-Lys-Lys-lys-Lys-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp- Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly- Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-NH2，(H-(Lys)6-脱Pro36外端素-4(1-39)-NH2)在 TentaGel S-RAM-Fmoc上的肽合成
将干的TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc树脂(0.22毫摩尔/克，1000毫克)置于装有 过滤用聚丙烯滤膜的聚乙烯容器中，使其在DMF(5毫升)中溶胀2小时。如上所述除 去第一个赖氨酸上的Fmoc基团，按照“TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc上的分批肽 合成”所述那样继续合成，直至肽序列结束。合成完成后，肽-树脂用DMF(3×5毫升， 每次1分钟)、DCM(3×5毫升，每次1分钟)和二乙醚(3×5毫升，每次1分钟)洗涤， 真空干燥。根据上述方法a从树脂上切下肽，从乙酸中冷冻干燥。根据上述程序用制 备性HPLC纯化经冷冻干燥的粗产物。发现经纯化的产物是均一的，其纯度高于95 ％。用ES-MS确认此肽的身份。得率为2.6％。
9.化合物9，H-Lys6-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln- Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser- Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-(Lys)6-NH2，(H-Lys6-脱Pro36外端素-4(1-39)-Lys6-NH2)在 TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc上的肽合成
将干的TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc树脂(0.22毫摩尔/克，1000毫克)置于装有 过滤用聚丙烯滤膜的聚乙烯容器中，使其在DMF(5毫升)中溶胀2小时。如上所述除 去第一个赖氨酸上的Fmoc基团，按照“TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc上的分批肽 合成”所述那样继续合成，直至肽序列结束。合成完成后，肽-树脂用DMF(3×5毫升， 每次1分钟)、DCM(3×5毫升，每次1分钟)和二乙醚(3×5毫升，每次1分钟)洗涤， 真空干燥。根据上述方法a从树脂上切下肽，从乙酸中冷冻干燥。根据上述程序用制 备性HPLC纯化经冷冻干燥的粗产物。发现经纯化的产物是均一的，其纯度高于90 ％。用ES-MS确认此肽的身份。得率为32％。
10.化合物10，H-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser- Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys- Gly-Arg-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2，(H-(Lys)6-([Gly8]hGLP-1(7-36)-(Lys)6-NH2)在 TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc上的肽合成
将干的TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc树脂(0.22毫摩尔/克，1000毫克)置于装有 过滤用聚丙烯滤膜的聚乙烯容器中，使其在DMF(5毫升)中溶胀2小时。如上所述除 去第一个赖氨酸上的Fmoc基团，按照“TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc上的分批肽 合成”所述那样继续合成，直至肽序列结束。合成完成后，肽-树脂用DMF(3×5毫升， 每次1分钟)、DCM(3×5毫升，每次1分钟)和二乙醚(3×5毫升，每次1分钟)洗涤， 真空干燥。根据上述方法a从树脂上切下肽，从乙酸中冷冻干燥。根据上述程序用制 备性HPLC纯化经冷冻干燥的粗产物。发现经纯化的产物是均一的，其纯度高于90 ％。用ES-MS确认此肽的身份。得率为18％。
11.化合物11，H-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser- Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys- Gly-Arg-NH2，(H-(Lys)6-[Gly8]hGLP-1(7-36)-NH2)在TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc 上的肽合成
将干的TentaGel S-RAM-Fmoc树脂(0.23毫摩尔/克，1000毫克)置于装有过滤用 聚丙烯滤膜的聚乙烯容器中，使其在DMF(5毫升)中溶胀2小时。如上所述除去树脂 上的Fmoc基团，按照“TentaGel S-RAM-Fmoc上的分批肽合成”所述那样继续合成， 直至肽序列结束。合成完成后，肽-树脂用DMF(3×5毫升，每次1分钟)、DCM(3×5 毫升，每次1分钟)和二乙醚(3×5毫升，每次1分钟)洗涤，真空干燥。根据上述方法 a从树脂上切下肽，从乙酸中冷冻干燥。根据上述程序用制备性HPLC纯化经冷冻干 燥的粗产物。发现经纯化的产物是均一的，其纯度高于98％。用ES-MS确认此肽的 身份。得率为15％。
12.化合物12，H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu- Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys-Lys-Lys-Lys- Lys-Lys-Lys-Lys-NH2，([Gly8]hGLP-1(7-36)-(Lys)8-NH2)在TentaGel S-RAM- Lys(Boc)Fmoc上的肽合成
将干的TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc树脂(0.22毫摩尔/克，1000毫克)置于装有 过滤用聚丙烯滤膜的聚乙烯容器中，使其在DMF(5毫升)中溶胀2小时。如上所述除 去第一个赖氨酸上的Fmoc基团，按照“TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc上的分批肽 合成”所述那样继续合成，直至肽序列结束。合成完成后，肽-树脂用DMF(3×5毫升， 每次1分钟)、DCM(3×5毫升，每次1分钟)和二乙醚(3×5毫升，每次1分钟)洗涤， 真空干燥。根据上述方法a从树脂上切下肽，从乙酸中冷冻干燥。根据上述程序用制 备性HPLC纯化经冷冻干燥的粗产物。发现经纯化的产物是均一的，其纯度高于98 ％。用ES-MS确认此肽的身份。得率为4.2％。
l3.化合物13，H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu- Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys-Lys-Lys-Lys- Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2，([Gly8]hGLP-1(7-36)-(Lys)10-NH2)在TentaGel S-RAM- Lys(Boc)Fmoc上的肽合成
将干的TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc树脂(0.22毫摩尔/克，1000毫克)置于装有 过滤用聚丙烯滤膜的聚乙烯容器中，使其在DMF(5毫升)中溶胀2小时。如上所述除 去第一个赖氨酸上的Fmoc基团，按照“TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc上的分批肽 合成”所述那样继续合成，直至肽序列结束。合成完成后，肽-树脂用DMF(3×5毫升， 每次1分钟)、DCM(3×5毫升，每次1分钟)和二乙醚(3×5毫升，每次1分钟)洗涤， 真空干燥。根据上述方法a从树脂上切下肽，从乙酸中冷冻干燥。根据上述程序用制 备性HPLC纯化经冷冻干燥的粗产物。发现经纯化的产物是均一的，其纯度高于95 ％。用ES-MS确认此肽的身份。得率为2％。
14.化合物14，H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met- Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly- Ala-Ser-NH2，(H-脱Pro36，Pro37，Pro38外端素-4(1-39)-NH2)在TentaGel S-RAM-Fmoc上 的肽合成
将干的TentaGel S-RAM-Fmoc树脂(0.23毫摩尔/克，1000毫克)置于装有过滤用 聚丙烯滤膜的聚乙烯容器中，使其在DMF(5毫升)中溶胀2小时。如上所述除去树脂 上的Fmoc基团，按照“TentaGel S-RAM-Fmoc上的分批肽合成”所述那样继续合成， 直至肽序列结束。合成完成后，肽-树脂用DMF(3×5毫升，每次1分钟)、DCM(3×5 毫升，每次1分钟)和二乙醚(3×5毫升，每次1分钟)洗涤，真空干燥。根据上述方法 a从树脂上切下肽，从乙酸中冷冻干燥。根据上述程序用制备性HPLC纯化经冷冻干 燥的粗产物。发现经纯化的产物是均一的，其纯度高于95％。用ES-MS确认此肽的 身份。得率为11％。
15.化合物15，H-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser- Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn- Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-NH2，(H-(Lys)6-脱Pro36，Pro37，Pro38外端素-4(1-39)- NH2)在TentaGel S-RAM-Fmoc上的肽合成
将干的TentaGel S-RAM-Fmoc树脂(0.23毫摩尔/克，1000毫克)置于装有过滤用 聚丙烯滤膜的聚乙烯容器中，使其在DMF(5毫升)中溶胀2小时。如上所述除去树脂 上的Fmoc基团，按照“TentaGel S-RAM-Fmoc上的分批肽合成”所述那样继续合成， 直至肽序列结束。合成完成后，肽-树脂用DMF(3×5毫升，每次1分钟)、DCM(3×5 毫升，每次1分钟)和二乙醚(3×5毫升，每次1分钟)洗涤，真空干燥。根据上述方法 a从树脂上切下肽，从乙酸中冷冻干燥。根据上述程序用制备性HPLC纯化经冷冻干 燥的粗产物。发现经纯化的产物是均一的，其纯度高于94％。用ES-MS确认此肽的 身份。得率为17％。
16.化合物16，H-Asn-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser- Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn- Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-NH2，(H-Asn-(Glu)5-脱Pro36，Pro37，Pro38外端素-4(1- 39)-NH2)在TentaGel S-RAM-Fmoc上的肽合成
将干的TentaGel S-RAM-Fmoc树脂(0.23毫摩尔/克，1000毫克)置于装有过滤用 聚丙烯滤膜的聚乙烯容器中，使其在DMF(5毫升)中溶胀2小时。如上所述除去树脂 上的Fmoc基团，按照“TentaGel S-RAM-Fmoc上的分批肽合成”所述那样继续合成， 直至肽序列结束。合成完成后，肽-树脂用DMF(3×5毫升，每次1分钟)、DCM(3×5 毫升，每次1分钟)和二乙醚(3×5毫升，每次1分钟)洗涤，真空干燥。根据上述方法 a从树脂上切下肽，从乙酸中冷冻干燥。根据上述程序用制备性HPLC纯化经冷冻干 燥的粗产物。发现经纯化的产物是均一的，其纯度高于90％。用ES-MS确认此肽的 身份。得率为9％。
17.化合物17，化合物3，H-(Lys)6-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu- Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly- Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-(Lys)6-NH2，(H-(Lys)6-脱Pro36，Pro37，Pro38外端素-4(1-39)- (Lys)6-NH2)在TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc上的肽合成
将干的TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc树脂(0.22毫摩尔/克，1000毫克)置于装有 过滤用聚丙烯滤膜的聚乙烯容器中，使其在DMF(5毫升)中溶胀2小时。如上所述除 去第一个赖氨酸上的Fmoc基团，按照“TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc上的分批肽 合成”所述那样继续合成，直至肽序列结束。合成完成后，肽-树脂用DMF(3×5毫升， 每次1分钟)、DCM(3×5毫升，每次1分钟)和二乙醚(3×5毫升，每次1分钟)洗涤， 真空干燥。根据上述方法a从树脂上切下肽，从乙酸中冷冻干燥。根据上述程序用制 备性HPLC纯化经冷冻干燥的粗产物。发现经纯化的产物是均一的，其纯度高于90 ％。用ES-MS确认此肽的身份。得率为10％。
18.化合物18，H-Asn-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser- Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn- Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-(Lys)6-NH2，(H-Asn-(Glu)5-脱Pro36，Pro37，Pro38外端素 -4(1-39)-(Lys)6-NH2)在TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc上的肽合成
将干的TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc树脂(0.22毫摩尔/克，1000毫克)置于装有 过滤用聚丙烯滤膜的聚乙烯容器中，使其在DMF(5毫升)中溶胀2小时。如上所述除 去第一个赖氨酸上的Fmoc基团，按照“TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc上的分批肽 合成”所述那样继续合成，直至肽序列结束。合成完成后，肽-树脂用DMF(3×5毫升， 每次1分钟)、DCM(3×5毫升，每次1分钟)和二乙醚(3×5毫升，每次1分钟)洗涤， 真空干燥。根据上述方法a从树脂上切下肽，从乙酸中冷冻干燥。根据上述程序用制 备性HPLC纯化经冷冻干燥的粗产物。发现经纯化的产物是均一的，其纯度高于92 ％。用ES-MS确认此肽的身份。得率为14％。
19.化合物19，H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met- Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly- Ala-Ser-(Lys)6-NH2，(脱Pro36，Pro37，Pro38外端素-4(1-39)-(Lys)6-NH2)在TentaGel S- RAM-Lys(Boc)Fmoc上的肽合成
将干的TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc树脂(0.22毫摩尔/克，1000毫克)置于装有 过滤用聚丙烯滤膜的聚乙烯容器中，使其在DMF(5毫升)中溶胀2小时。如上所述除 去第一个赖氨酸上的Fmoc基团，按照“TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc上的分批肽 合成”所述那样继续合成，直至肽序列结束。合成完成后，肽-树脂用DMF(3×5毫升， 每次1分钟)、DCM(3×5毫升，每次1分钟)和二乙醚(3×5毫升，每次1分钟)洗涤， 真空干燥。根据上述方法a从树脂上切下肽，从乙酸中冷冻干燥。根据上述程序用制 备性HPLC纯化经冷冻干燥的粗产物。发现经纯化的产物是均一的，其纯度高于97 ％。用ES-MS确认此肽的身份。得率为19％。
20.化合物2的重组制备
pYES0010表达载体的构建
构建合成的cDNA在酵母中进行异源表达。用酿酒酵母密码子使用表(酵母基因 组数据库)对编码化合物2的蛋白质序列进行反翻译。
为了能使合成的cDNA翻译，在5′端加入一个ATG起始密码子，在3′端加入一 个TAA终止密码子。将该构建物插入含有氨苄青霉素抗性基因的pYES2穿梭载体的 HindIII和EcoRI位点内，新构建物命名为pYES0010。例如参见图6。随后将pYES0010 转化入大肠杆菌，作氨苄青霉素筛选。选出阳性克隆并测序。
转化酵母
为了将pYES0010转化入酵母单倍体INVSc1：MATa his3δleu2 trp1-289 ura3-52， 使酵母在YPD培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖和0.004％腺嘌呤硫酸 盐)中30℃长至饱和。收获1毫升培养物用于转化。加入2微升10毫克/毫升载体DNA， 加入1微克pYES0010，混合。加入0.5毫升(45％ PEG 4000，1M LiOAc，0.5M EDTA 和1M Tris-HCl(pH7.5))并混合。最后，加入20微升1M DTT，室温下培育混合物16 小时。培育后，细胞42℃热休克10分钟，接种到选择性平板(6.7％酵母氮基，2％葡 萄糖，20微克/毫升腺嘌呤，20微克/毫升精氨酸，29微克/毫升异亮氨酸，20微克/ 毫升组氨酸，60微克/毫升亮氨酸，20微克/毫升赖氨酸，20微克/毫升色氨酸，20微 克/毫升甲硫氨酸，50微克/毫升苯丙氨酸，150微克/毫升缬氨酸，30微克/毫升酪氨 酸和2.5％琼脂)。平板30℃培育3-5天直至转化子出现。
化合物2的表达和纯化
转化子在选择性培养基(6.7％酵母氮基，2％葡萄糖，20微克/毫升腺嘌呤，20微 克/毫升精氨酸，29微克/毫升异亮氨酸，20微克/毫升组氨酸，60微克/毫升亮氨酸， 20微克/毫升赖氨酸，20微克/毫升色氨酸，20微克/毫升甲硫氨酸，50微克/毫升苯丙 氨酸，150微克/毫升缬氨酸，30微克/毫升酪氨酸)中培育1.5天。收获细胞，在半乳 糖诱导培养基(6.7％酵母氮基，4％半乳糖，20微克/毫升腺嘌呤，20微克/毫升精氨酸， 29微克/毫升异亮氨酸，20微克/毫升组氨酸，60微克/毫升亮氨酸，20微克/毫升赖氨 酸，20微克/毫升色氨酸，20微克/毫升甲硫氨酸，50微克/毫升苯丙氨酸，150微克/ 毫升缬氨酸，30微克/毫升酪氨酸)中重悬1天。收获细胞，在含有蛋白酶抑制剂(Roche) 的10mM Tris-HCl pH7.5中匀浆。使裂解液20000Xg澄清化离心30分钟。将上清液 加到经10mM Tris-HCl pH7.5平衡的Superdex 12 HR 10/30柱(Amersham Pharmacia Biotech)上。柱用50Mm碳酸氢铵缓冲液(pH8.0)洗脱。合并含有重组化合物2的样品。 用甲硫氨酸氨基肽酶除去N端甲硫氨酸，样品在HPLC柱上进一步纯化。
化合物2纯化用的HPLC设置
HPLC柱：Kromasil RP C8；K 100-10-C8 nr.CER 2230化合物
温度：22℃
流速：35毫升/分钟
HPLC溶剂：
A：含0.10％三氟乙酸的水
B：含0.10％三氟乙酸的乙腈∶水(90∶10)
用含0.10％三氟乙酸的20％-80％的乙腈将化合物2从HPLC柱上洗脱40分钟。
21.肽的注射配方
如下制备静脉内注射用肽的固定剂量配方，将肽溶解在无菌等渗盐水中，在无菌 条件下将所得溶液保藏在充满惰性气体的玻璃安瓿中。如下制备静脉内注射用肽的多 剂配方，将肽溶解在无菌等渗盐水中，将所得溶液保藏在有盖瓶中，如果需要加入防 腐剂(例如0.1％对羟基苯甲酸酯，1％苄醇或0.1％氯甲酚)。
多剂肽配方的例子：
化合物2                     12.25毫克
磷酸二氢钠                  1.380克
对羟基苯甲酸酯              0.1克
注射用水溶液                100毫升
22.稳定性实验
采用在所选蛋白水解酶存在下本发明肽和肽偶联物的稳定性体外研究作为评价 所述肽对抗体内蛋白水解保护性能的工具。进行实验的目的是测定和比较化合物4、5、 6和7与现有技术化合物(化合物(iii)H-(Gly8)-hGLP-1(7-36)-NH2和hGLP-1(7-36)-NH2) 在37℃、在具有亮氨酸氨基肽酶、羧基肽酶A和二肽基氨基肽酶之一种或多种的溶 液中的体外稳定性。
体外稳定性研究所用的材料和装置
所用水是Milli-Q水处理系统(Millipore，Bedford，MA，USA)获得的最高质量的水。 乙腈(ACN)是购自Labscan Ltd.(Dublin，Ireland)的超级梯度质量级。三氟乙酸(TFA)为 99.9％纯，所用的磷酸二氢钠(NaH2PO4)、氢氧化钠(NaOH)和所有其它化学物质是分 析级。亮氨酸氨基肽酶(EC 3.4.11.1)、羧基肽酶(EC 3.4.17.1)和二肽基肽酶(二肽基氨基 肽酶IV.EC 3.4.14.5)均购自Sigma(St.Louis，Mo，USA)。HPLC梯度分析采用Hewlett Packard HP 1100 HPLC系统来进行，该系统包括HP 1100 Binary泵，HP 1100自动取 样仪，HP 1100恒温柱和HP 1100可变波长检测器。用Hewlett Packard Chemstation for LC软件(Rev.A.06.01)来控制仪器和获得数据。该仪器使用装有5微米C18,300埃颗 粒的Vydac 238TP54(150×4.6毫米内径)柱。在稳定性实验期间，用Stuart Scientific 的SHT200D分块加热器加热肽/酶溶液。在37℃、含有亮氨酸氨基肽酶(25单位/毫升)、 或羧基肽酶A(1单位/毫升)的50mM磷酸缓冲液(pH7.4)或含有二肽基氨基肽酶IV(0.5 单位/毫升)的100mM碳酸氢铵缓冲液(pH8.0)中研究测试化合物的降解。将等量(100 微升)含肽原液(1毫克/毫升)的水加入Eppendorf微管的900微升预热酶溶液中，使肽 初始浓度为0.1毫克/毫升(约1.7×10-5至1.8×10-5M)，开始进行实验。将肽/酶溶液置 于37℃，间隔合适时间从肽/酶溶液中取出100微升样品，与20微升含25％TFA的乙 腈充分混合，以使酶促降解过程停止。将灭活的样品转移到自动取样仪管内，如下所 述用HPLC分析完整测试化合物的含量。用下式从残余浓度(即HPLC峰高度)的自然 对数对时间的曲线来计算酶溶液中测试化合物的半衰期(t1/2)：
t1/2＝1/kobs·ln(2)，其中kobs是所见降解的表观一级速率常数。
HPLC分析
用梯度HPLC分析上述进行的稳定性实验样品，HPLC采用上述仪器和下述实验 条件。
柱温：30℃
注射体积：10微升
移动相A：含0.1％TFA的水
移动相B：含0.085％TFA的乙腈(ACN)
梯度：32-52％B，21分钟内
检测：215纳米UV
各稳定性实验获得的实验结果显示在下表1中。从该表可以看出，本发明化合物 在所有测试酶溶液中的半衰期显著延长。
表1             测试化合物        酶溶液   半衰期    (t) 化合物编号 名称   酶     浓度 化合物5 H-(Gly8)-hGLP-1(7-36)- Lys(棕榈酰)-Lys6-NH2   LAP   CPA   DPP IV   25单位/毫升   1单位/毫升   0.5单位/毫升   ＞3天   ＞2天   440分钟 化合物7 H-(Gly8，Lys26(棕榈酰))- hGLP-1(7-36)-Lys6-NH2   LAP   CPA   DPP IV   25单位/毫升   1单位/毫升   0.5单位/毫升   1150分钟   1058分钟   526分钟 化合物6 H-(Gly8，Lys34(棕榈酰))- hGLP-1(7-36)-Lys6-NH2   LAP   CPA   DPP IV   25单位/毫升   1单位/毫升   0.5单位/毫升   ～1.5天   ＞1天   177分钟 GLP-1 H-hGLP-1(7-36)-NH2   LAP   CPA   DPP IV   25单位/毫升   1单位/毫升   0.5单位/毫升   152分钟   48分钟   2.0分钟 化合物4 H-(Gly8)-hGLP-1(7-36)- Lys6-NH2   LAP   CPA   DPP IV   25单位/毫升   1单位/毫升   0.5单位/毫升   ～1.5天   145分钟   292分钟 化合物(iii) H-(Gly8)-hGLP-1(7-36)- NH2   LAP   CPA   DPP IV   25单位/毫升   1单位/毫升   0.5单位/毫升   693分钟   127分钟   56分钟
LAP：亮氨酸氨基肽酶，CPA：羧基肽酶A，DPP IV：二肽基氨基肽酶IV
23.化合物(iii)和化合物4在大鼠血浆中的体外稳定性研究
利用固相抽提和LC-MS相联合，跟踪两种测试化合物在肝素稳定化的大鼠 (Sprague-Dawley)血浆中的降解。跟踪血浆中的降解720分钟。发现化合物(iii)在大鼠 血浆中的半衰期为238分钟。与之相比，发现化合物4在大鼠血浆中的半衰期为466 分钟。
材料和方法
从Harlan Sera Lab Ltd.(Loughborough，UK)获得含肝素钠(5000单位/毫升)的空白 大鼠血浆。测试物和溶液。研究中所用测试物列在下表中。对于体外实验，采用100 微克/毫升milli-Q水的原液(对应于26.0μM化合物(iii)H-(Gly8)-GLP-1-NH2或17.8μM 化合物4)。
物质名称       批号         平均分子量    肽含量
化合物(iii)    ZP7，73-1F   3284克/摩尔   85％
化合物4        ZP7.69-1C    4053克/摩尔   72％
LC-MS分析在HP 1100仪器上进行，该仪器由在线脱气器、四梯度泵、自动取 样仪和柱烘箱(Hewlett Packard，wilmington，DE，USA)和Quattro Ultima质谱仪(购自 Micromass，Altrincham，UK)组成。LC和MS均用MassLynx 3.3软件控制。在MS检 测之前，先在Vydac 218MS52(2.1×250毫米)柱(Hesperia，CA，USA)上进行LC分离。 血浆初始体积为1000微升(37℃)。从初始血浆体积中转移出100微升到0.75毫升HPLC 管中(用作空白)，与560微升抽提液(MeCN：0.18M碳酸铵pH9.5(6∶94v/v)，4C)混合， 用ASPEC XL4 Robot进行固相抽提。将100微升母液加入其余900微升血浆中，充 分混合，37℃培育(对应于初始浓度为10微克测试化合物/毫升)。在各时间点(分别为 0.2、60、120、180、240、360、480、662和720分钟)，收集100微升含药物血浆， 与560微升冰冷的抽提液混合，立即如上所述用SPE抽提。抽提出的血浆样品用 LC-MS分析。LC-MS分析在HP 1100系列LC联合Quattro Ultima II三联四极MS仪 器上进行。在注射10微升前，样品置于18℃自动取样仪托盘内。分离在30℃ Vydac 218MS52(2.1×250毫米)LC柱上进行，采用14分钟内15％至50％B的线性梯度和250 微升/分钟的流速。用含0.1％甲酸的水作为移动相A，含0.1％甲酸的MeCN作为移 动相B。通过单离子记录(SIR)，分别采用6H+(m/z＝676.7)和4H+(m/z＝822.1)离子类型 检测化合物4和化合物(iii)。分析化合物(iii)和化合物4的锥形电压分别设定为100和 70V。用LC-MS研究在大鼠血浆中化合物(iii)和化合物4的体外稳定性。跟踪两种化 合物在720分钟内的降解，结果绘成峰面积的自然对数对时间的曲线。以线性回归后 的斜度作为化合物的降解速率(kobs)，ln2/kobs作为半衰期(T1/2)。实验结果如下所示。
大鼠血浆中720分钟内的降解研究
化合物           T1/2(分钟)  kobs(分钟-1) r2
化合物(iii)      238.4       0.0029         0.9785
化合物4          466.1       0.0015         0.8596
因此，实验结论是将Lys6肽C端与(Gly8)hGLP-1(7-36)序列偶联使得其在大鼠血 浆中的稳定性增加2倍。
24.口服和肠胃外给予单剂化合物5对于糖尿病ob/ob小鼠血糖水平的影响
本发明化合物具有降低血糖的特性。这可用化合物5检测，测试其腹膜内(i.p.) 和口服(p.o.)给药后对ob/ob突变型小鼠中血糖(BG)水平的影响。腹膜内给药时，化合 物5在110微克/小鼠的剂量下降低了糖尿病小鼠的血糖水平。同样，口服时，以1100 微克/小鼠的剂量给予化合物5后，使血糖水平有类似的降低，但在更低剂量下则不行。
实验
在控制的环境条件(12：12小时日光：黑暗循环，喂以标准的Altromin №1324 饮食，自由饮水)下，饲养40只雌性糖尿病ob/ob小鼠(Umea品系，Bomholtgaard)(3 只小鼠/笼)，这些小鼠由于显性突变型leptin而肥胖(Tomita，T.，Doull，V.，Pollock，H.G.， 和Krizsan，D.1992，“肥胖的高血糖小鼠(ob/ob)的胰岛”，Pancreas 7：367-75)。小鼠购 得时为8周龄。在开始实验前，使小鼠适应环境2周。在实验时，小鼠为13周龄， 体重为41.8±3.2克(平均值±SD；n＝42)。实验前抚摸小鼠1-3天，以减少应力引起的 血糖偏移。在实验当天，打开灯光2-3小时后从尾尖取血。将一滴血(＜5微升)滴在葡 萄糖试条上，用Elite自动分析仪(Bayer，Denmark)分析测定。总血糖(BG)浓度用固定 化葡萄糖氧化酶方法分析。血糖正常和严重高血糖的血糖水平之间有差异(范围3.6- 15.6mM；平均值±SD：9.4±3.3mM；n＝42)。BG＜5.8mM的6只动物排除在研究外(总 数为36)。其余动物根据其BG水平分级，以确保组内的BG平均值相似。在首次对 照血液取样后1小时，给予药物，测定60分钟、120分钟、240分钟和480分钟时的 BG。
肽和其它物质
化合物5(批号ZP 3.12组分1-2。纯化)由Department of Chemistry，Zealand Pharmaceuticals合成。将该肽溶解在无菌等渗NaCl中，然后立即以0.2毫升的剂量给 药。用相同溶液腹膜内给药和口服给药。对于每只动物，在每次取血样时填写数据记 录单。
药物给药
将化合物5给予动物，最大剂量为1100微克/小鼠，最小剂量为1.1微克/小鼠。 口服给予盐水作为阴性对照，腹膜内给予110微克/小鼠的测试化合物作为阳性对照。
在控制条件期间，所有组中未禁食ob/ob小鼠的BG水平相似(单组数据没有显 示)，但组内BG水平有很大差别(所有动物的BG范围为5.8-15.6mM)。因此，为了纠 正不同程度的高血糖，结果表示成与基线的相对差别(％对照)。
腹膜内给予110微克化合物5使BG持久下降，在给予此化合物1-2小时后达到 最低点。盐水处理的小鼠中未见变化。在大多数组(5/6)中，BG在给药后4-8小时之 间升高。当腹膜内给予糖尿病ob/ob小鼠时，化合物5在110微克/小鼠的剂量下使 BG水平降低。在给予此化合物后60分钟发现抗糖尿病效果，在2-4小时后达到最大。 另外，长期持续的效果(大于8小时)提示化合物5的作用时间比作用时间显著较短的 天然GLP-1长(Bailey，C.J.&Flat，P.R.1987.“肥胖的高血糖(ob/ob)小鼠中的胰高血糖 素样肽-1和肠胰岛轴”Life Sci，40，521-5)。1100微克/小鼠的口服剂量引起了类似于 110微克腹膜内处理动物所见的BG降低。
我们已经指出，腹膜内给予110微克/小鼠的化合物5能有效地降低糖尿病ob/ob 小鼠的血糖水平。当通过口服途径给予1100微克/小鼠的化合物5后，见到了类似的 效果。这提示该化合物从肠胃道吸收。
25.下列化合物的体内研究
化合物1(脱Pro36-外端素-4(1-39)-NH2(SEQ ID NO：101))，
化合物2(脱Pro36-外端素-4(1-39)-Lys6-NH2(SEQ ID NO：93))，
化合物(iii)(Gly8-GLP1-(7-36)(人)-NH2(SEQ ID NO：87))，
化合物4(Gly8-GLP1-(7-36)(人)-Lys6-NH2(SEQ ID NO：88))，和
化合物5(Gly8Lys37(棕榈酰)-GLP1-(7-36)(人)-Lys7-NH2(SEQ ID NO：89))
通过口服和腹膜内给予ob/ob小鼠不同浓度的各种肽，以确定这些化合物是否影 响血糖水平。所用实验条件与实施例24所述相同。
肽和其它物质
用上述方法合成脱Pro36-外端素-4(1-39)-NH2(化合物1，SEQ ID NO：101))、C端 连有额外序列Lys6的相同肽脱Pro36-外端素-4(1-39)-Lys6-NH2(化合物2，SEQ ID NO： 93)、Gly8-GLP1-(7-36)(人)-NH2(化合物(ii)，SEQ ID NO：87))、C端连有额外序列Lys6 的相同肽(Gly8-GLP1-(7-36)(人)-Lys6-NH2(化合物4，SEQ ID NO：88)和Gly8Lys37(棕榈 酰)-GLP1-(7-36)(人)-Lys7-NH2(化合物5，SEQ ID NO：89)。溶液在动物给药之前的给药 日早晨制备。相同溶液用于口服和腹膜内给药。所有肽溶解在无菌等渗NaCl中，以 0.2毫升的体积给予。所有实验在相同的小鼠上进行，以比较肽的活性剂量(如表2所 示)。如上所述进行取血，将表3所示剂量给予动物。口服给予盐水作为阴性对照。结 果显示在表4中。
表2 编号 化合物 化合物1 脱Pro36-外端素-4(1-39)-NH2(SEQ ID NO：101) 化合物2 脱Pro36-外端素-4(1-39)-Lys6-NH2(SEQ ID NO：93) 化合物(ii) Gly8-GLP1-(7-36)(人)-NH2(SEQ ID NO：87) 化合物4 Gly8-GLP1-(7-36)(人)-Lys6-NH2(SEQ ID NO：88) 化合物5 Gly8Lys37(棕榈酰)-GLP1-(7-36)(人)-Lys7-NH2(SEQ ID NO：89)
表3 化合物  组1  口服  微克/小鼠  组2  口服  微克/小鼠  组3  口服  微克/小鼠  组4  口服  微克/小鼠  组5  口服  微升/小鼠等渗盐水 组6 腹膜内给药 微克/小鼠 化合物1  400  40  4  0.4  200微升 40 化合物2  1000  100  10  1  200微升 100 化合物(ii)  1000  100  10  1  200微升 100 化合物4  1000  100  10  1  200微升 100 化合物5  1000  100  10  1  200微升 100
组数据归纳为每处理组中的各个结果的平均值±SEM。为了分析化合物的效果， 计算每一时间点的绝对和相对(t＝0的％)差别。
表4 0 1小时 2小时 4小时 化合物1-盐水 100  103  107  92 化合物1-400微克 口服 100  93  88  93 化合物1-40微克 口服 100  89  89  91 化合物1-4微克 口服 100  105  88  91 化合物1-0.4微克 口服 100  106  103  100 化合物1-40微克 腹膜内 100  68  69  74 化合物2-盐水 100  100  112  114 化合物2-1000微克 口服 100  67  69  64 化合物2 100微克 口服 100  78  71  72 化合物2 10微克 口服 100  86  72  72 化合物2  1微克 口服 100  112  101  96 化合物2 100微克 腹膜内 100  75  67  63 化合物(ii)-盐水 100  95  87  100 化合物(ii)-1000微克 口服 100  87  105  94 化合物(ii)-100微克 口服 100  118  111  92 化合物(ii)-10微克 口服 100  101  94  104 化合物(ii)-1微克 口服 100  94  89  96 化合物(ii)-100微克 腹膜内 100  70  60  81 化合物4-盐水 100  102  94  79 化合物4-1000微克 口服 100  128  72  78 化合物4-100微克 口服 100  72  70  58 化合物4-10微克 口服 100  98  95  81 化合物4-1微克 口服 100  99  89  84 化合物4 100微克 腹膜内 100  83  58  56 化合物5-盐水 100  90  86  103 化合物5-1000微克 口服 100  73  75  67 化合物5-100微克 口服 100  97  140  107 化合物5-10微克 口服 100  90  120  126 化合物5-1微克 口服 100  111  133  114 化合物5-100微克 腹膜内 100  63  50  52
所得结果显示在表4和图1-3中。
这些结果表明，所有测试的化合物具有降低血糖水平的效果。当化合物1以腹膜 内给予时，效果最显著，而口服1000微克化合物2的效果与腹膜内给予100微克化 合物2的效果相当。化合物1(脱Pro36-外端素-4(1-39)-NH2，SEQ ID NO：101)和化合物 2(脱Pro36-外端素-4(1-39)-Lys6-NH2，SEQ ID NO：93)腹膜内给药的效果显示与外端素 -4(1-39)-NH2(化合物(i)本身，数据未显示)以同样方式给药的效果非常相似。
对于化合物1(脱Pro36-外端素-4(1-39)-NH2(SEQ ID NO：101))，当该化合物口服给 药时，高达400微克/小鼠的剂量不能有效降低血糖水平，而对于同一化合物加入Lys6 片段后，在10微克/小鼠的剂量时就可看到活性。这表明脱Pro36-外端素-4(1-39)- Lys6-NH2(SEQ ID NO：93)的最低有效口服剂量比脱Pro36-外端素-4(1-39)-NH2(SEQ ID NO：101)低至少40倍。
这些结果表明，序列Z的连接对于腹膜内给予时各种肽的效果没有显著影响，但 显著增强了口服给药的化合物的效果。
26.肠胃道输送后化合物4和化合物(iii)在清醒大鼠十二指肠中的生物利用率
已开发出肠胃外用的基于GLP-1类似物的各种肽，但是这些物质没有一种在口 服给药后是药理学上有效的[Holst，J.J.：“肠高血糖素”Annu Rev Physiol.59：257-271， 1997]。决定检查清醒大鼠十二指肠对测试化合物的吸收。用化合物(iii)(Gly8)hGLP- 1(7-36)-NH2作为对照。
化学物质和试剂
含肝素钠(5000单位/毫升)的空白大鼠血浆获自Harlan Sera Lab Ltd. (Loughborough，UK)。OASISTM HLB固相萃取柱(1cc，30毫克吸收剂)购自Waters (Milford，MA，USA)，ISOLUTE C18(EC)，1cc，SPE柱购自IST(Mid Glamorgan，U.K.)。 LC/MS分析在HP 1100仪器上进行，该仪器由在线脱气器、双梯度泵、自动取样仪和 柱烘箱(Hewlett Packard，wilmington，DE，USA)和Quattro Ultima质谱仪(购自 Micromass，Altrincham，UK)组成。LC和MS均用MassLynx 3.3软件控制。在MS检 测之前，先在Vydac 218MS52(2.1×250毫米)柱(Hesperia，CA，USA)上进行LC分离。
药物和剂量水平：
用Fmoc策略内部合成化合物4(批号ZP7.97-5-F，4053克/摩尔)和化合物(iii)(批号 ZP 7.73-2-G，3854克/摩尔)。用质谱进行鉴定，两批料用RP-HPLC测得测试化合物的 纯度分别为97和99.7％。ZP7.97-5-F和ZP 7.73-2-G批料的肽含量分别为72％和80 ％。将肽溶解在无热原等渗盐水中，通过十二指肠内导管给予体积为100微升的1.000 或10.000毫微摩尔/千克的剂量。
动物：
14只Sprague-Dawley大鼠(重250-350克)用于实验。大鼠用Hypnorm- Dormicum皮下麻醉，将导管插入股动脉进行动脉取血。通过室中的切开将另一导管 插入十二指肠。在实验开始前，使大鼠在手术后恢复一周。在实验当天，手术过的大 鼠是清醒的。为了确认十二指肠内导管是否位于十二指肠内，在实验后立即进行解剖。
样品处理：
在-5、5、10、15、20、40和60分钟收集血样。将血液收集到含EDTA的冰冷管 内，立即4℃离心5分钟(4000xg)。将血浆(250微升)转移到含有250微升抽提液 (MeCN：0.18M碳酸铵，pH9.5，10∶90v/v)的冰冷的0.75毫升PLC管内。血浆样品- 20℃保藏直至进行SPE和LC/MS分析。
固相抽提
将含有药物的血浆样品(400微升)加到固相抽提柱上，该柱预先用950微升 MeCN、然后是950微升水调节。柱用950微升含2％TFA的水洗涤，然后用等体积 含2％TFA的MeCN∶水(20∶78v/v)洗涤。分析物用500微升2％TFA的MeCN∶水(60∶ 38v/v)洗脱，用LC/MS分析。
LC/MS
将样品置于18℃自动取样托盘上，然后注射20-50微升到LC柱(Vydac 218MS52(2.1×250毫米))中。用250微升/分钟的流速和表1的梯度于30℃进行分离。 测试化合物和参照药物均通过单离子记录(SIR)检测，分别采用m/z＝676.7和 m/z＝1095.2和821.8的离子类型。所有仪器条件用MassLynx Software 3.3版软件控制。 化合物 梯度 化合物4 初始：15％B，0-14分钟；15-50％B，14-15分钟；50-15％B，和15-20 分钟15％B。 化合物(iii) 初始：25％B，1-1.5分钟；25-30％B，1.5-10分钟；30-40％B，10-10.5 分钟；40-90％B，11.5-12分钟；90-25％B，和12-17分钟25％B。
分析测试化合物所用的梯度采用含0.1％甲酸的水或MeCN分别作为移动相A或 B。
如材料和方法部分所述，分析血浆样品。以1.000(n＝4)和10.000(n＝5)毫微摩尔/ 千克的剂量检查化合物4的生物利用率，而化合物(iii)仅研究10.000(n＝5)毫微摩尔/ 千克的剂量。
在所有研究时间点，化合物(iii)的浓度低于检测极限(约0.5nM)，因此不能估计确 切的生物利用率。相反，在十二指肠内给予1.000毫微摩尔/千克后，4只大鼠中有两 只的血浆样品中检测到化合物4。而给予10.000毫微摩尔/千克后5只大鼠中有4只检 测到化合物4。
27.化合物1、化合物2、化合物4和化合物(iii)在静脉内给予家兔和猪后的体内 药物动力学
我们已经揭示了GLP-1激动剂化合物4与参照药物化合物(iii)相比在大鼠血浆中 的体外稳定性有所增加。为了确定该效果是否能在体内持续，检查这两种化合物在家 兔中的药物动力学参数。我们还用相同的实验条件测定了化合物1和2在家兔和猪中 的这些参数。
化学物质和试剂
含肝素钠(5000单位/毫升)的空白大鼠血浆获自Harlan Sera Lab Ltd. (Loughborough，UK)。OASISTM HLB固相萃取柱(1cc，30毫克吸收剂)购自Waters (Milford，MA，USA)，ISOLUTE C18(EC)，1cc，SPE柱购自IST(Mid Glamorgan，U.K.)。 LC/MS分析在HP 1100仪器上进行，该仪器由在线脱气器、双梯度泵、自动取样仪和 柱烘箱(Hewlett Packard，wilmington，DE，USA)和Quattro Ultima质谱仪(购自 Micromass，Altrincham，UK)组成。LC和MS均用MassLynx 3.3软件控制。在MS检 测之前，先在Vydac 218MS52(2.1×250毫米)柱(Hesperia，CA，USA)上进行LC分离。
药物和给药水平：
用Fmoc策略内部合成化合物4(批号ZP7.97-5-F，4053克/摩尔)和化合物(iii)(批号 ZP 7.73-2-G，3854克/摩尔)。用质谱进行鉴定，两批料用RP-HPLC测得测试化合物的 纯度分别为97和99.7％。ZP7.97-5-F和ZP 7.73-2-G批料的肽含量分别为72％和80 ％。将肽溶解在无热原等渗盐水中，两种肽采用1000毫微摩尔/千克的剂量静脉内给 予家兔和大鼠。
家兔：
15只新西兰白兔(重2.5-3.0千克)用于实验。在实验当天，家兔用Hypnorm肌内 麻醉，然后用Dormicum静脉内麻醉。将导管插入股静脉和动脉用于静脉内给药和 动脉取血。家兔在实验期间保持昏迷。    
样品处理：
在1、3、5、10、15、20、30、40、60、90、120、150、180和240分钟收集血 样。将血液收集到含EDTA的冰冷管内，立即4℃离心5分钟(20000xg)。将血浆(250 微升)转移到含有250微升抽提液(MeCN：0.18M碳酸铵，pH9.5，10∶90v/v)的冰冷的 0.75毫升PLC管内。血浆样品-20℃保藏直至进行SPE和LC/MS分析。
固相抽提
将含有药物的血浆样品(400微升)加到OASISTM HLB(化合物4)或ISOLUTETM(化 合物(iii))固相抽提柱上，该柱预先用950微升MeCN、然后是950微升水调节。柱用 950微升含2％TFA的水洗涤，然后用等体积含2％TFA的MeCN∶水(20∶78v/v)洗涤。 分析物用500微升2％TFA的MeCN∶水(60∶38v/v)洗脱，用LC/MS分析。
LC/MS
将样品置于18℃自动取样托盘上，然后注射20-50微升到LC柱(Vydac 218MS52(2.1×250毫米))中。用250微升/分钟的流速和下表的梯度于30℃进行分离。 测试化合物和参照药物均用单离子记录(SIR)检测，分别采用m/z＝676.7和m/z＝1095.2 和821.8的离子类型。所有仪器条件用MassLynx Software 3.3版软件控制。 化合物 梯度 化合物4 初始：15％B，0-14分钟；15-50％B，14-15分钟；50-15％B，和15-20 分钟15％B。 化合物(iii) 初始：25％B，1-1.5分钟；25-30％B，1.5-10分钟；30-40％B，10-10.5 分钟；40-90％B，11.5-12分钟；90-25％B，和12-17分钟25％B。
分析测试化合物所用的梯度采用含0.1％甲酸的水或MeCN分别作为移动相A或 B。
如材料和方法部分所述，分析血浆样品，将血浆浓度(Cpl)对时间绘制成半对数图。 跟踪家兔中血浆浓度3小时，而大鼠的有限血液体积将该种动物中的取血局限于1小 时。用WinNonlin 3.1(Pharsight Corp.(Mountain View，CA))中的1/y2加权最小二乘方将 各家兔的Cpl对时间曲线与两隔开开放模型(two-compartment open model)拟合(数据未 显示)。数据分析获得的药物动力学常数列于表5，家兔静脉内注射1微摩尔/千克化 合物4和化合物(iii)后的降解动力学分别显示在图4中。
表5家兔和猪中的体内动力学** 参数 化合物(iii) (n＝7)平均值 化合物4 (n＝8)平均值 化合物1 (n＝5)平均值 化合物2 (n＝5)平均值 化合物2** (n＝2)平均值 T1/2，α分钟 2.3 6.8 4.4 11 16 T1/2，β分钟 10.8 28.0 23 69 252
表5：在算术拟合Cpl对时间曲线后，获得家兔药物动力学常数。以1000毫微摩 尔/千克的浓度给予化合物。以分钟(min)给出α和β相的T1/2数值。统计学：双尾t检 验假设不等方差的样品显示所有测定参数的p＜0.001。结论是，化合物4的T1/2数值 约为参照化合物(iii)的3倍，同样，化合物2的T1/2数值约为代表未偶联等价物的化 合物1所计算出数值的3倍。
28.化合物2、14-16、18和19与化合物(i)相比的葡萄糖耐受性试验
采用雄性糖尿病db/db小鼠(M&B，Bomholdtgaard，L1，Skensved，Denmark)。已有 充分描述的该小鼠模型具有先天性葡萄糖代谢功能紊乱(由于leptin受体突变)。与具 有非控制的非胰岛素需求型糖尿病(NIDDM)的人患者一样，纯合的db/db小鼠在生命 的前3个月期间经历烦渴、多尿和糖尿以及体重增加，尽管它们出于高血糖阶段。然 而，在该模型中，高血糖伴有进行性胰岛萎缩，在6-8月龄可能有酮病和死亡。因此， 应当注意它们的疾病状况的进展和状态。因此，GLP-1类似物的药物测试宜采用仅仅 小于16周龄的db/db小鼠。
所有动物适应环境至少一周，在第一次口服葡萄糖耐受性试验(OGTT)前每日抚 摸，抚摸两天。另外，为了减少应力诱导的葡萄糖偏移，在实验前应对动物进行至少 一次下述的没有化合物的OGTT。由于糖尿病小鼠之间的葡萄糖耐受性差异很大，因 此在第一次用之前以OGTT对动物进行分类。
肽
将肽溶解在含有0.1％牛白蛋白的0.1M磷酸缓冲盐水(PBS)中，加入5M NaOH调节pH至7.4。所有溶液在实验之前当天早晨新鲜制得。载体处理的动物给予只含 0.1％白蛋白的PBS。
葡萄糖耐受性试验和给药
在口服葡萄糖耐受性试验之前，使动物禁食17小时(从下午4点到第二天早晨9 点)。从早上9点开始从尾尖取血(t＝-15分钟)，测定血糖。用一滴血(＜5微升，Elite 自动分析仪(Bayer，Denmark))按照生产商说明书通过固定化葡萄糖氧化酶方法分析总 血糖浓度(mM)。糖尿病严重的(＞10mM)的动物排除在外。首次取血样后，立即给动物 腹膜内(i.p.)注射载体或一剂抗糖尿病化合物。所有组中的注射体积为200微升/50克 体重。腹膜内给予药物并口服1克/千克葡萄糖(Sigma，St.Louis，溶解在水中(200微 升/50克体重))后15分钟，让动物返回笼子(t＝0)。在t＝30分钟、t＝60分钟、t＝120分 钟和t＝240分钟时测定血糖水平。观察期间动物禁食。在每次取血样时，填写每只动 物的数据日志表。
计算和统计
为了分析化合物的效果，计算每一时间点的与基线(t＝0)的绝对和相对差别。用梯 形方法测定整个实验的曲线下的面积(AUC 0-240分钟)。在分组当天，使小鼠分布成 所有组的葡萄糖耐受性是相似的。然而，为了校正随时间的糖尿病进展，在实验每一 天测试载体处理的对照组，将对药物的反应表示成相对于载体处理的时间对照动物中 所见的反应。
绘制每个药物的剂量反应曲线，参见图5，用ANCOVA分析(协方差)分析用载体 处理期间获得的药物相对于反应的效果。认为处理(药物或载体)是独立变量，AUC 0-240分钟(表示成在载体处理的时间对照小鼠中的反应百分数)是应变量，药物剂量定 义为协变量。用Fisher最小有效检验进行Post-hoc分析。在0.05水平，认为差别是显 著的。用Statistica 5.5 Windows NT版(StatSoft，Tulsa，Oklahoma，USA)进行统计学分析。 图5所示剂量反应曲线清楚地表明，所有测试化合物表现出与参照药物相当的降低葡 萄糖的效果。
29.化合物2和化合物(i)对db/db小鼠OGGT的效果
图7是用实施例28所述的相同实验条件进行的OGTT中化合物2和化合物(i)的 AUC曲线。该图显示化合物2的降血糖效果与现有技术化合物(iii)的效果相同。
30.口服葡萄糖耐受性试验(OGTT)前24小时腹膜内给予100毫微摩尔/千克化合 物2对OGTT的长期效果
该实验在db/db小鼠中采用100毫微摩尔/千克的最大剂量，采用了实施例28中 描述的相同的实验条件。结果显示在图8中，该实验的结论是化合物2在db/db小鼠 中的作用时间高达18小时。
本文描述和要求保护的发明不局限于本文公开的具体实施方案，因为这些实施方 案只描述了本发明的几个方面。任何等价的实施方案均在本发明范围内。实际上，除 了本文揭示和描述的以外，本领域技术人员还可根据前文的描述对本发明作各种改 动。这些改动也在所附权利要求的范围内。本文引述了各篇文献，这些文献均全部纳 入本文作为参考。