本发明涉及将胰高血糖素样多肽(GLP-1)化合物用于治疗胃轻 瘫。胃轻瘫，即胃动力不足，是胃肠道(GI)系统发生的一种麻痹。这 是引起自主神经系统功能丧失或异常的一类神经障碍，导致摄入食 物后胃排空的延迟。胃由两部分组成。上端称为胃近端或者基底部， 是容纳吞下的食物和液体的部位。下端称为胃远端或者胃窦，是食 物来回进行搅拌直至成为小碎片的部位，而后胃由此将食物排入十 二指肠，即小肠的起始部分。固相食物的排空是由胃窦有力的环形 收缩完成的。正常人进食固体食物会导致胃的收缩，即胃窦部开始 出现一种贯穿胃窦部的协调的波浪状运动，频率约为每分钟三次。 在胃轻瘫患者中，这种电波运动减弱且胃收缩频率降低，有时收缩 力的减弱会导致食物滞留在胃中。

胃轻瘫可能使患者表现得非常虚弱。胃轻瘫的症状包括恶心，呕 吐，进食早期的饱腹感，腹部胀气，上腹痛，或出现烧心，厌食。 胃轻瘫出现在非糖尿病患者身上，但在1型和2型糖尿病患者中也 非常常见。大约75％的糖尿病患者会出现不同类型的轻度胃肠功能 异常，约有25％到35％的糖尿病患者患有胃轻瘫。糖尿病患者中此 病的易患率如此之高的原因尚不清楚；但是因高血糖症导致胃排空 延迟及其伴随症状出现恶化时，血糖的控制显得至关重要。

目前的治疗方法并不完全有效，且常出现不良副作用。例如，可 以给患者服用促运动的和止吐药治疗胃排空延迟。McCallum，R.等 Diabetic and nondiabetic gastroparesis：current treatment options 1 Gastroenterology 1-7(1998)。对于因患重症或者有其他原因不能口服 用药的患者通常可以静脉注射红霉素进行治疗。然而红霉素会导致 胃肠道毒性，耳毒性和假膜性结肠炎，并会诱发产生耐药的细菌菌 株。对于可以口服用药的患者而言用西沙比得(cisapride)治疗可能 最为有效。西沙比得的副作用包括腹部不适和肠道蠕动频率增加。 此外，严重的药物相互作用可以导致心律失常；因此这种药在美国 的应用受到了严格的限制。很明显有关这种病的治疗还远未能满足 医疗的需求。

如果对糖尿病患者进行严格的胰岛素治疗使他们的血糖得到良 好的控制，那么胃轻瘫的严重程度和其伴随症状也会得到一定程度 的改善。但是，胃轻瘫及相应的胃排空的延迟增加了用胰岛素或口 服降糖药治疗糖尿病患者出现低血糖和高血糖的风险。当因胃轻瘫 导致食物不能顺利被运送到小肠时会增加低血糖的风险。正常的餐 后血糖升高出现延迟，这使得当血糖水平仍很低时，餐前使用的胰 岛素却已达到血浓度的峰值。最终血糖水平在数小时后升高；而这 时的胰岛素浓度已经开始下降，这样便没有足够的胰岛素来中和高 血糖了。因此，对于伴有中到重度胃轻瘫的糖尿病患者而言，由于 不能预测餐后血糖水平的升高时间，要有效地控制其血糖几乎是不 可能的。

应用GLP-1化合物治疗胃轻瘫解决了与应用无效的和有严重副 作用的药物有关的很多问题。此外，GLP-1具有促胰岛素活性，但 不会导致低血糖症：因此，GLP-1不仅可以治疗糖尿病患者的胃轻 瘫，而且可以解决很多这类患者在使用胰岛素或者口服药剂治疗时 血糖控制不佳的问题。

开发GLP-1的类似物和衍生物主要是用来治疗2型糖尿病。除 了已在文献中记录的GLP-1的胰岛素活化作用，这种多肽还有其他 一些有趣的生理学作用，包括可以导致大鼠胃排空延迟并抑制小肠 的运动。[Imeryuz，N.等Glucagon-like peptide-1 inhibits gastric emptying via vagal afferent-mediated central mechanisms，273 Am.J. Physiol.，G920-G927(1997)；Willms，B.等Gastric emptying，glucose responses，and insulin secretion after a liquid test meal：Effects of exogenous glucagons-like peptide-1(GLP-1)-(7-36)Amide in type 2 (noninsulin dependent)diabetic patients，81 J.Clin.Endocrinology， 327-332(1996)；Wettergren，A.等The inhibitory effect of glucagons- like peptide-l(GLP-1)7-36 amide on gastric acid secretion in humans depends on an intact vagal innervation，40 Gut 597-601(1997)； Tolessa，T.等Inhibitory effect of glucagons-like peptide-1 on small bowel motility.102 J.Clin，Invest.，764-774(1998)。另外，GLP-1已 被用于治疗肠易激惹综合征(IBS)和功能性腹泻。参见美国专利 6,348,447 B1。

肠易激惹综合征(IBS)和一些类型的功能性消化不良与胃轻瘫 有明显的不同。功能性消化不良通常表现为慢性的或者反复发作的 腹部中间部位的疼痛。肠易激惹综合征(IBS)会出现结肠的异常收 缩，从而影响粪便的推进，并促进与水的混合和吸收。也可出现小 肠的运动过强，这种运动导致的小肠间歇性的痉挛是疼痛的主要原 因。尽管胃肠运动功能涉及复杂的内部相互作用，这其中的很多机 制尚未完全理解，但是显然IBS和一些类型的功能性消化不良与下 胃肠道的问题有关，而由胃排空延迟所导致的胃轻瘫则与上胃肠道 的问题有关。鉴于已表明GLP-1确实可以导致胃排空延迟和平滑肌 收缩抑制，那么这种多肽可以用于治疗因肌肉收缩减弱和胃排空延 迟所致的胃轻瘫就令人感到惊讶了。有一项令人兴奋的发现，即 GLP-1的促胰岛素活性是葡萄糖依赖性的。与使用胰岛素不同，使 用GLP-1没有导致低血糖的风险。因此，包括GLP-1类似物，GLP-1 衍生物，和GLP-1受体激动剂在内的GLP-1化合物，均可用于使糖 尿病患者血糖正常，同样也可以用于治疗非糖尿病患者的胃轻瘫。

本发明包括对胃轻瘫患者进行治疗的方法和应用GLP-1制备治 疗胃轻瘫的药物，上述方法包括：将有效量的GLP-1施用于患者。 胃轻瘫患者可以为非糖尿病患者或糖尿病患者。GLP-1化合物可由 本领域技术人员通过任何已知的方法给药。优选GLP-1化合物通过 皮下注射，口服，或者通过颊部粘膜吸收给药。

图1：图中显示在给予2型糖尿病患者安慰剂(基线)和Val8- GLP-1(7-37)OH一次日用药量为2.5mg(组1)，和3.5mg(组2)之 后的平均(+/-SEM)血糖浓度曲线。

图2：图中显示在给予2型糖尿病患者安慰剂(基线)和Val8- GLP-1(7-37)OH一次日用药量为4.5mg(组3和4)之后的平均(+/- SEM)血糖浓度曲线。

GLP-1化合物的用药方法和成分对于治疗胃轻瘫是有效的。胃 轻瘫与胃排空缺陷有关，是由于胃和幽门收缩不协调所致。GLP-1 化合物可以调节胃和/或幽门收缩来减轻或消除胃排空延迟。

有40％的胃轻瘫患者病因不明。但是有大约25％到35％的糖尿 病患者患有这种疾病，一项研究发现这种疾病的易患率高达59％。 [Soykan，I.等Demography，clinical characteristics，psychological and abuse profile，treatment and long term follow-up of patients with gastroparesis.11 Dig.Dis.Sci.2398-2404(1998)；Hiba，R.，Is there a difference in the prevalence of gaslrointeslinal symptoms between type1 and type 2 diabetics？4 Gastroenterology A79(1999)].

胃轻瘫的症状包括恶心，呕吐，餐后胀气，上腹痛，厌食症，和 早期胞腹感。在更加严重的病例中，患者可以出现在餐后数小时呕 吐未消化的食物，并且伴发体重减轻，脱水，和营养不良体征同时 可以表现为震水音阳性。胃轻瘫的系统性原因可以通过检查患者是 否患有糖尿病，甲状腺功能减退症，皮质醇缺乏症，高钙血症和妊 娠等情况进行评估。钡餐检查，内窥镜，和上消化道系列检查可以 排除消化道溃疡性疾病和胃流出道梗阻。钡从胃中排空不良即提示 胃排空减慢。然而胃闪烁扫描摄影术才是正确诊断胃轻瘫的最终标 准。在这项检查中，患者需要服用99-M锝(TC)标记的含硫胶体或其 他有放射性标记配体的食物。然后使用一种γ-照像机测量胃所在区 域的放射性。因为液体的食物不能反应实际的胃排空情况，所以患 者在检查时要服用固体食物。食物排空50％的时间或者特定时间间 隔排空食物的百分比即为报告的检测结果。[Thomforde，G.M.等， Evaluation of an inexpensive screening scintigraphic test of gastric emptying，36 J.Nucl.Med.93(1995)].用C13标记的食物进行呼气试 验也可检测胃排空。C13会在到达小肠时被吸收，在呼出的气体中检 测到的C13可以显示胃的排空情况。[Ghoos，Y.S.等，104 Gastroenterology 1640-1647(1993)]。胃电描记法(EGG)与心电图类 似，是通过皮肤电极测量生物电活性，这种检查也可用于诊断胃轻 瘫。[Stem，R.N.等EGG；Common issues in validation and methodology， 24 Psychophysiology 55-64(1987)].

在胃功能正常的情况下，当固体食物到达胃时，胃底部松弛以容 纳摄入的食物。胃的收缩可以混合并研磨胃窦中的食物。胃窦的收 缩可以混合并搅拌食物颗粒，直至食物的大小小于3mm，这一过程 需要30到40分钟(滞留阶段)。幽门收缩与胃窦收缩相协调，推 进食物颗粒进入十二指肠。这种协调过程的复杂顺序是由来自脑和 脊髓的外来神经所构成的位于胃壁和肠壁上的复杂的神经网络控制 的，这些神经网络在局部释放诸如胺和多肽这样的神经递质，并通 过它们改变胃平滑肌细胞的兴奋性。这些神经网络的任何部分出现 异常都会导致胃排空障碍和胃轻瘫。

因为过去所给出的多数文献证明给人服用天然的GLP-1时会出 现胃排空延迟，所以GLP-1化合物治疗胃轻瘫的功能是令人惊讶 的。[参见Willms，B.，等Gastric emptying，glucose responses，and insulin secretion after a liquid test meal：effects of exogenous glucagons-likepeptide(GLP-1)-(7-36)amide in type 2(noninsulin dependent)diabetic patients，81 J.Clin.Endocrinology Metabolism， 327-332(1996)]。图1和图2中所描述的研究表明，与安慰剂组相 比，给没有胃轻瘫症状的2型糖尿病患者服用GLP-1化合物不会导 致胃排空延迟。每个实验组和对照组在进食固体食物后血糖到达峰 值的时间是相同的。GLP-1化合物不会使胃排空延迟，相反可使胃 排空正常化，这样患者便不再会出现与胃轻瘫相关的一种或多种症 状。

现已有观点认为一氧化氮(NO)是一种神经递质，其也会影响胃 和幽门的功能。进一步的动物实验表明，在伴有胃肠道疾患的糖尿 病患者体内，负责生成一氧化氮的神经元一氧化氮合成酶(nNOS)的 调控失衡。[Watkins等Insulin restores neuronal nitric oxide synthase expression and function that is lost in diabetic gastropalhy，106 J. Clin.Invest.373-384(2000)]。神经元一氧化氮合成酶(nNOS)的分子 机制尚未被阐明。但在治疗胃轻瘫时，GLP-1化合物间接调节了一 氧化氮(NO)的合成。此外，在迷走神经切断术后的患者中GLP-1对 胃肠道的一些影响消失了，因此认为GLP-1是通过神经通路发挥作 用的。这种通路包括与迷走神经传入神经，中枢神经部分或在迷走 神经传出神经内传导相关的GLP-1受体。另外，已证实胃肠道中有 GLP-1受体，主要存在于胃和小肠。

尽管可以使用GLP-1化合物治疗没有糖尿病的胃轻瘫患者，但 是这种化合物更适合治疗伴有糖尿病的胃轻瘫患者。GLP-1化合物 可以通过增加胰岛素的分泌并增强机体对胰岛素的敏感性调节血糖 的水平，且不会导致低血糖。因此，GLP-1化合物能够更有效地使 伴有胃轻瘫的糖尿病患者的血糖水平正常化，因为这种化合物不仅 能够调节这些患者的胃排空，还可以调节任何与胃轻瘫有关的不可 预知的胃排空延迟，同时还不会增加患者出现低血糖的风险，因为 这种化合物不会导致低血糖。

适用于本发明的GLP-1化合物包括天然GLP-1，GLP-1类似物， GLP-1衍生物，Exendin-4，Exendin-4类似物，Exendin-4衍生物和 其他GLP-1受体的激动剂。

本发明中所涵盖的GLP-1的类似物与GLP-1(7-37)OH或GLP- 1(7-37)OH的片段高度同源，因此这类化合物完全可以与GLP-1受 体相结合，并起始信号传导通路，最终使与胃轻瘫相关的一种或多 种症状得以改善。我们可以用一种体外信号检测法确定GLP-1化合 物是否适用于本发明的方法。实例3给出了一个表格，列出了一些 GLP-1类似物在体外通过检测GLP-1受体信号分析显示出的活性。 可以明确的是，如果GLP-1化合物与GLP-1受体有效结合，便会激 活第二信使cAMP。被诱导产生的cAMP水平的范围可以用能够激 发一种诸如荧光素酶或β-内酰胺酶这样的报告基因表达的cAMP反 应元件进行测定。

可以用这种分析方法测定EC50的药效，即在一次单独的剂量反 应试验中GLP-1化合物在发挥50％活性时的有效浓度。这种检测方 法使用的是HEK-293 Aurora CRE-BLAM细胞，其可以稳定地表达 人的GLP-1受体。这些HEK-293细胞已被稳定地整合入一种含有能 激发β-内酰胺酶(BLAM)基因表达的cAMP反应元件(CRE)的DNA 载体中。GLP-1类似物与GLP-1受体的相互作用会激发一种信号， 这种信号会激活cAMP反应元件，而后促使β-内酰胺酶表达。将经 β-内酰胺酶裂解而发出荧光的β-内酰胺酶(Aurora生物科学公司) 的CCF2/AM底物加入到已暴露于一定剂量GLP-1激动剂的细胞 中，由此测量GLP-1激动剂的效力。Ziokamik等人对该方法做进一 步地描述。Ziokamik，等(1998)Science 279：84-88(也可参见实例3)。

优选本发明的GLP-1化合物的体外活性仅比Val8-GLP-1(7- 37)OH的体外活性最多低十倍，优选GLP-1化合物的体外活性仅比 Val8-GLP-1(7-37)OH体外活性最多低五倍，更优选GLP-1化合物的 体外活性仅比Val8-GLP-1(7-37)OH体外活性最多低三倍。最优选 GLP-1化合物的体外活性不比Val8-GLP-1(7-37)OH的体外活性低。

天然GLP-1的生物活性形式是由两个截短肽段GLP-1(7-37)OH 和GLP-1(7-36)酰胺组成。通式1列出了这两个自然存在的截短的 GLP-1肽段，SEQ ID NO：1：

7   8   9   10  11  12  13  14  15  16  17

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-

18  19  20  21  22  23  24  25  26  27  28

Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-

29  30  31  32  33  34  35  36  37

Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Xaa

通式1，SEQ ID NO：1，其中：

37位的Xaa是Gly，或-NH2。

优选的GLP-1化合物的氨基酸序列与SEQ ID NO：1中的序列相 同，或其中的一，二，三，四或五个氨基酸与序列1不同。

本领域已知的GLP-1化合物1，如GLP-1(7-34)和GLP-1(7-35)， GLP-1(7-36)，Gln9-GLP-1(7-37)，D-Gln9-GLP-1(7-37)，Thr16-Lys18- GLP-1(7-37)和Lys18-GLP-1(7-37)。像GLP-1(7-34)和GLP-1(7-35)这 样的GLP-1化合物已在美国专利5,118,666号中公开。其他已知有生 物活性的GLP-1类似物已在美国专利第5,977,071；5,545,618； 5,705,483；5,977,071；6,133,235号中公开。Adelhorst，等，J.Biol. Chem.269：6275(1994)；和Xiao，Q.，等(2001)，Biochemistry 40：2860-2869。

GLP-1化合物也包括在GLP-1(7-37)OH，N末端和/或C末端添 加一个或多个氨基酸所形成的多肽或其片段或类似物。优选是在 GLP-1(7-37)OH的C末端加一个至八个氨基酸。优选这种类型的 GLP-1化合物可以有约39个氨基酸。“经延伸的”GLP-1化合物中 与GLP-1(7-37)OH相对应的氨基酸用相同的编号指示出来。例如通 过向GLP-1(7-37)OH的N末端增加两个氨基酸得来的GLP-1化合 物的N末端氨基酸是第5位；通过向GLP-1(7-37)OH的C末端增加 一个氨基酸得来的GLP-1化合物的C末端氨基酸是第38位。延伸 的GLP-1化合物的38-45位氨基酸与Exendin-3或Exendin-4相应位 置的氨基酸相同或仅为保守替换。Exendin-3或Exendin-4的氨基酸 序列列于通式II中，SEQ ID NO：2。

SEQ ID NO：2

7   8   9   10  11  12  13  14  15  16  17

His-Xaa-Xaa-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-

18  19  20  21  22  23  24  25  26  27  28

Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-

29  30  31  32  33  34  35  36  37  38  39

Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-

40  41  42  43  44  45

Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser

其中：

第8位的Xaa为Ser或Gly；且

第9位的Xaa为Asp或Glu；

第45位的Ser为Ser或Ser-NH2。

Exendin-3的第八位为Ser，第九位为Asp。Exendin-4的第八位 为Gly，第九位为Glu。

最优选的GLP-1化合物包括GLP-1的类似物，其类似物或片段 的主链的第八位(第八位类似物)都有一个非丙氨酸的氨基酸。第 八位优选的氨基酸为甘氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，丝氨酸， 苏氨酸或甲硫氨酸，其中更优选缬氨酸或甘氨酸。

另外的优选的GLP-1化合物是除了第八位和第二十二位以外与 GLP-1(7-37)OH序列相同的GLP-1类似物，其中第八位优选为甘氨 酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，丝氨酸，苏氨酸或甲硫氨酸，其 中更优选甘氨酸或缬氨酸，第二十二位为谷氨酸，赖氨酸，天冬氨 酸或精氨酸，其中更优选谷氨酸或赖氨酸。

其它优选的GLP-1化合物是除了第八位和第三十位以外与 GLP-1(7-37)OH序列相同的GLP-1类似物，其中第八位优选为甘氨 酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，丝氨酸，苏氨酸或甲硫氨酸，其 中更优选缬氨酸或甘氨酸，第三十位为谷氨酸，天冬氨酸，丝氨酸 或组氨酸，其中更优选谷氨酸。

其它优选的GLP-1化合物是除了第八位和第三十七位以外与 GLP-1(7-37)OH序列相同的GLP-1类似物，其中第八位优选为甘氨 酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，丝氨酸，苏氨酸或甲硫氨酸，其 中更优选的为缬氨酸或甘氨酸，第三十七位为组氨酸，赖氨酸，精 氨酸，苏氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸， 其中更优选的为组氨酸。

其它优选的GLP-1化合物是除了第八位，第二十二位和第二十 七位以外与GLP-1(7-37)OH序列相同的GLP-1类似物，其中第八位 优选为甘氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，丝氨酸，苏氨酸或甲 硫氨酸，其中更优选缬氨酸或甘氨酸，第二十二位为谷氨酸，赖氨 酸或精氨酸，其中更优选为谷氨酸或赖氨酸，第二十七位为丙氨酸， 赖氨酸，精氨酸，色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸或组氨酸，其中更优 选为丙氨酸。

在用于描述GLP-1化合物的命名方法中，我们在化合物的母药 物名称前面注明了取代氨基酸及其位置。例如Val8-GLP-1(7-37)OH 就是指GLP-1(7-37)OH(通式I，SEQ ID NO：1)中正常的第八位的 丙氨酸被缬氨酸所取代的一种GLP-1化合物。

其他适合的GLP-1化合物包括：

                                       Val8-GLP-1(7-37)OH， Gly8-GLP- 1(7-37)OH，Glu22-GLP-1(7-37)OH，Asp22-GLP-1(7-37)OH，Arg22-GLP-1(7-37)OH， Lys22-GLP-1(7-37)OH，Cys22-GLP-1(7-37)OH，Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH，Val8- Asp22-GLP-1(7-37)OH，Val8-Arg22-GLP-1(7-37)OH，Val8-Lys22-GLP-1(7-37)OH， Val8-Cys22-GLP-1(7-37)OH，Gly8-GIu22-GLP-1(7-37)OH，Gly8-Asp22-GLP-1(7- 37)OH，Gly8-Arg22-GLP-1(7-37)OH，Gly8-Lys22-GLP-1(7-37)OH，Gly8-Cya22-GLP- 1(7-37)OH，Glu22-GLP-1(7-36)NH2，Asp22-GLP-1(7-36)NH2，Arg22-GLP-1(7-36)NH2， Lys22-GLP-1(7-36)NH2，Cys22-GLP-1(7-36)NH2，Val8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2，Val8- Asp22-GLP-1(7-36)NH2，Val8-Arg22-GLP-1(7-36)NH2，Val8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2， Val8-Cys22-GLP-1(7-36)NH2，Gly8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2，Gly8-Asp22-GLP-1(7- 36)NH2，Gly8-Arg22-GLP-1(7-36)NH2，Gly8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2，Gly8-Cys22- GLP-1(7-36)NH2，Lys23-GLP-1(7-37)OH，Val8-Lys23-GLP-1(7-37)OH，Gly8-Lys23- GLP-1(7-37)OH，His24-GLP-1(7-37)OH，Val8-His24-GLP-1(7-37)OH，Gly8-His24- GLP-1(7-37)OH，Lys24-GLP-1(7-37)OH，Val8-Lys24-GLP-1(7-37)OH，Gly8-Lys24- GLP-1(7-37)OH，Glu30-GLP-1(7-37)OH，Val8-Glu30-GLP-1(7-37)OH，Gly8-Glu30- GLP-1(7-37)OH，Asp30-GLP-1(7-37)OH，Val8-Asp30-GLP-1(7-37)OH，Gly8-Asp30- GLP-1(7-37)OH，Gln30-GLP-1(7-37)OH，Val8-Gln30-GLP-1(7-37)OH，Gly8-Gln30- GLP-1(7-37)OH，Tyr30-GLP-1(7-37)OH，Val8-Tyr30-GLP-1(7-37)OH，Gly8-Tyr30- GLP-1(7-37)OH，Ser30-GLP-1(7-37)OH，Val8-Ser30-GLP-1(7-37)OH，Gly8-Ser30- GLP-1(7-37)OH，His30-GLP-1(7-37)OH，Val8-His30-GLP-1(7-37)OH，Gly8-His30- GLP-1(7-37)OH，Glu34-GLP-1(7-37)OH，Va18-Glu34-GLP-1(7-37)O-H，Gly8-Glu34- GLP-1(7-37)OH，Ala34-GLP-1(7-37)OH，Val8-Ala34-GLP-1(7-37)OH，Gly8-Ala34- GLP-1(7-37)OH，Gly34-GLP-1(7-37)OH，Val8-Gly34-GLP-1(7-37)OH，Gly8-Gly34- GLP-1(7-37)OH，Ala35-GLP-1(7-37)OH，Val8-Ala35-GLP-1(7-37)OH，Gly8-Ala35- GLP-(7-37)OH，Lys35-GLP-1(7-37)OH，Val8-Lys35-GLP-1(7-37)OH，Gly8-Lys35- GLP-1(7-37)OH，His35-GLP-1(7-37)OH，Val8-His35-GLP-1(7-37)OH，Gly8-His35- GLP-1(7-37)OH，Pro35-GLP-1(7-37)OH，Val8-Pro35-GLP-1(7-37)OH，Gly8-Pro35- GLP-1(7-37)OH，Glu35-GLP-1(7-37)OH，Val8-Glu35-GLP-1(7-37)OH，Gly8-Glu35- GLP-1(7-37)OH，Val8-Ala27-GLP-1(7-37)OH，Val8-His37-GLP-1(7-37)OH，Val8- Glu22-Lys23-GLP-1(7-37)OH, Val8-Glu22-Glu23-GLP-1(7-37)OH，Val8-Glu22-Ala27- GLP-1(7-37)OH，Val8-Gly34-Lys35-GLP-1(7-37)OH，Val8-His37-GLP-1(7-37)OH，and Gly8-His37-GLP-1(7-37)OH.

更优选的GLP-1化合物为：

                                     Val8-GLP-1(7-37)OH，Gly8-GLP-1(7- 37)OH，Glu22-GLP-1(7-37)OH，Lys22-GLP-1(7-37)OH，Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH， Val8-Lys22-GLP-1(7-37)OH，Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)OH，Gly8-Lys22-GLP-1(7- 37)OH，Glu22-GLP-1(7-36)NH2，Lys22-GLP-1(7-36)NH2，Val8-Glu22-GLP-1(7- 36)NH2，Val8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2，Gly8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2，Gly8-Lys22-GLP- 1(7-36)NH2，Val8-His37-GLP-1(7-37)OH，Gly8-His37-GLP-1(7-37)OH，Arg34-GLP- 1(7-36)NH2，and Arg34-GLP-1(7-37)OH.

其他优选的GLP-1化合物包括：

                                      Val8-Tyr12-GLP-1(7-37)OH，Val8- Tyr12-GLP-1(7-36)NH2，Val8-Trp12-GLP-1(7-37)OH，Val8-Leu16-GLP-1(7-37)OH， Val8-Tyr16-GLP-1(7-37)OH，Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)OH，Val8-Leu25-GLP-1(7-37)OH， Val8-Glu30-GLP-1(7-37)OH，Val8-His37-GLP-1(7-37)OH，Val8-Tyr12-Tyr16-GLP-1(7- 37)OH，Val8-Trp12-Glu22-GLP-l(7-37)OH，Val8-Tyr12-Glu22-GLP-1(7-37)OH，Val8- Tyr16-Phe19-GLP-1(7-37)OH，Val8-Tyr16-Glu22-GLP-1(7-37)OH，Val8-Trp16-Glu22-GLP- 1(7-37)OH，Val8-Leu16-Glu22-GLP-1(7-37)OH，Val8-Ile16-Glu22-GLP-1(7-37)OH，Val8- Phe16-Glu22-GLP-1(7-37)OH，Val8-Trp18-Glu22-GLP-1(7-37)OH，Val8-Tyr18-Glu22-GLP- 1(7-37)OH，Val8-Phe18-Glu22-GLP-1(7-37)OH，Val8-Ile18-Glu22-GLP-1(7-37)OH，Val8- Lys18-Glu22-GLP-1(7-37)OH，Val8-Trp19-Glu22-GLP-1(7-37)OH，Val8-Phe19-Glu22-GLP- 1(7-37)OH，Val8-Phe20-Glu22-GLP-1(7-37)OH，Val8-Glu22-Leu25-GLP-1(7-37)OH，Val8- Glu22-Ile25-GLP-1(7-37)OH，Val8-Glu22-Val25-GLP-1(7-37)OH，Val8-Glu22-Ile27-GLP- 1(7-37)OH，Val8-Glu22-Ala27-GLP-1(7-37)OH，Val8-Glu22-Ile33-GLP-1(7-37)OH，Val8- Glu22-His37-GLP-1(7-37)OH，Val8-Asp9-Ile33-Tyr16-Glu22-GLP-1(7-37)OH，Val8-Tyr16- Trp19-Glu22-GLP-1(7-37)OH，Val8-Trp16-Glu22-Val25-Ile33-GLP-1(7-37)OH，Val8-Trp16- Glu22-Ile33-GLP-1(7-37)OH，Val8-Glu22-Val25-Ile33-GLP-1(7-37)OH，and Val8-Trp16- Glu22-Val25-GLP-1(7-37)OH.

GLP-1化合物也包括“GLP-1衍生物”，即在天然的GLP-1， Exendin-4，或GLP-1或Exendin-4类似物的氨基酸分子的基础上有 一个或多个氨基酸侧链，α-碳原子，氨基末端基团，羧基末端基团 中有化学修饰的化合物。这种化学修饰包括但不限于增加化学成 分，生成新键以及减少化学成分。

在氨基酸侧链基团的修饰包括但不限于赖氨酸ε氨基的乙酰 化，精氨酸，组氨酸或赖氨酸N端的烷基化，谷氨酸或天冬氨酸羧 基端的烷基化，谷氨酰胺或天冬酰胺的脱酰胺化，但不仅限于此。

末端氨基基团的修饰包括但不限于去氨基，N末端低碳烷基化， N末端双低碳烷基化和N末端的酰基化修饰。末端羧基基团的修饰 包括但不限于酰胺、低级烷基酰胺，双烷基酰胺和低级烷基脂修饰。 此外，一个或多个侧链基团或末端基团可以由普通的蛋白质化学领 域的普通技术人员所了解的保护基团保护起来。氨基酸的α-碳原子 可以是单或双甲基化的。

优选的GLP-1衍生物是通过酰化作用合成的。利用脂肪酸的衍 生原理，通过促进与血和外周组织中白蛋白上脂肪酸残基结合部位 的相互作用所致的GLP-1与血浆白蛋白的结合，延长GLP-1的作用 时间。优选的GLP-1衍生物为Arg34-Lys36-(N-ε-(γ-Glu(N-α-十六 烷酰基)))-GLP-1(7-37)。GLP-1衍生物和制备这类GLP-1衍生物的 方法已由Knudsen等公开(Knudsen等(2000)J.Med.Chem. 43：1664-1669)。另外，在很多已公开的申请中都描述了GLP-1的衍 生物，GLP-1类似物，Exendin-4和Exendin-4的类似物。参见美国 专利第5,512,540号，第6,268,343，WO96/29342，WO98/08871， WO99/43341，WO99/43708，WO99/43707，WO99/43706和 WO99/43705号专利。

受保护不被内源性的二肽基肽酶IV(DPP-IV)降解的GLP-1化合 物是最优选的。DPP-IV在天然截短的GLP-1N末端的组氨酸残基后 剪切，使GLP-1分子失活。由于DPP-IV快速的致失活作用，天然 GLP-1的半衰期约为5-10分钟。将GLP-1化合物在人血浆中孵育可 以使GLP-1化合物抵抗DPP-IV的降解作用。例如将人血浆与 300pmol的GLP-1化合物溶液在37℃孵育六小时。之后按照Deacon 等人Deacon等807.CVi′n.Endocrinol.Metab.952-957(1995)的做 法，将该溶液进行反相HPLC和放射免疫学测定。第八位GLP-1类 似物对DPP-IV的活性有抵抗作用，GLP衍生物如酰基化GLP-1类 似物，由于其有大量的酰基基团，可以保护这些类似物的N末端不 与DPP-IV发生结合。

许多已知的方法均可生产GLP-1化合物，例如固相合成化学 法，从天然原材料中纯化GLP-1分子，重组DNA技术，或将这些方 法结合起来。例如，在美国专利第5,118,666；5,120,712；5,512,549； 5,977,071和第6,191,102号专利中所描述的制备GLP-1化合物的方 法。

本发明的GLP-1化合物可以制备成药学上可接受的组合物。“药 学上可接受的”表示这种成份可施用于人。一种药学上可接受的制 剂不包含毒性元素，不利的污染等，且不对其中活性物质的活性作 用发生干扰。本发明中药学上可接受的成分可制成多种形式，例如 粉末，颗粒，片剂，糖衣片，胶囊，糖浆，栓剂，可注射用的溶液， 吸入用的制剂，鼻饲用制剂或口腔用的制剂。根据包括GLP-1化合 物的组合物的药学上可接受的形式，其可通过多种途径用药，例如 口服，鼻饲，吸入或胃肠道外给药。胃肠道外用药包括全身用药， 例如肌肉内注射，静脉内注射，皮下注射或腹膜内注射。[参见 Gutniak等GLP-1 tablet in type 2 diabetes in fasting and postprandial conditions，20 Diabetes Care 1874-1879(1997)；Gutniak，等Potential therapeutic levels of glucagon-like peptide 1 achieved in humans by a buccal tablet，19 Diabetes Care 843-848(1996)]。

药学上可接受的药物产品可以包括GLP-1化合物和与药学上可 接受的缓冲液结合，该缓冲液的pH值应适用于胃肠道外用药，并调 整溶液的稳定性和溶解度的特性。也可向其中添加药学上可接受的 抗微生物制剂。间甲酚和酚都是优选的抗微生物制剂。也可向溶液 中添加一种或多种药学上可接受的盐，以调整溶液的离子强度或渗 透压。还可以添加一种或多种赋形剂，以进一步调整配方的等渗性。 甘油就是一种能调整等渗性的赋形剂。

GLP-1化合物的使用可以分为基本用药或长期用药。基本用药 是指短期的或按需用药。例如在不伴有糖尿病的胃轻瘫患者中更优 选用药方法是相对短期地在餐前或餐后立即使用GLP-1化合物以减 轻或缓解与胃轻瘫相关的症状。另外，胃轻瘫及其相关症状可以在 特定的几天中加重，或者疾病的严重程度和相关症状会日复一日， 周复一周，月复一月地变化。因此，患者可以根据需要服用GLP-1 化合物，例如仅在感觉有不适症状时服用。

对伴有胃轻瘫的糖尿病患者，则优选长期服用GLP-1化合物。 “长期”通常是指在较长的一个时期内规律用药，每天不超过四次， 优选每天不超过两至三次，最优选每天不超过一次。而这里所使用 的长期用药的方法可以包括除每天用药之外的其他用药方法。例 如，长期用药可采用持续用药模式，这样可以在一个规律药物浓度 基础上提供足够的治疗血浆浓度。这样的治疗方式还包括每周用药 一次，每月用药一次，甚至是更低频率的用药。

对长期用药而言，更优选的方法是衍生或构建GLP-1化合物以 延长GLP-1化合物的作用时间。例如，第8位有改变的GLP-1类似 物可以抵抗DPP-IV的裂解作用，从而可以延长药物的作用持续时 间。另外，酰基化的GLP-1衍生物有与白蛋白结合的特性，其可以 表现出一种延长作用时间的作用模式。GLP-1类似物可以与锌和/或 鱼精蛋白相结合，从而可以达到悬浮状态，使药物作用时间延长。 例如，参见第WO99/30731，其中有关于GLP-1化合物结晶状态的 描述。

GLP-1化合物的“有效量”是在给用药主体服药后能够产生预期 疗效，而不会导致无法预期的副作用的剂量。预期的疗效包括与胃 轻瘫有关的症状的改善。特别是胃排空变得规律，胃轻瘫缓解。对 长期用药而言，要在副作用最小的同时达到预期的疗效，在一个疗 程期间，一旦GLP-1化合物的血浆浓度达到一个稳定的状态后便不 会明显地波动。如果在一个疗程的治疗中，用药剂量能够维持在本 申请中所描述的稳定的范围内，那么药物的血浆浓度不会出现明显 的波动。GLP-1化合物在疗效上接近Val8-GLP-1(7-37)OH的两倍以 内是优选，此时的血浆浓度约维持在30皮摩尔至200皮摩尔之间， 在疗程中血药浓度一旦达到稳定的状态，则血浆浓度优选维持在60 皮摩尔至150皮摩尔之间。

Val8-GLP-1(7-37)OH和与之药效相似的GLP-1化合物的最佳血 药浓度范围也同样适用于其他有着不同药效的GLP-1化合物，包括 Exendin-3和Exendin-4。有着相似药效的GLP-1化合物包括用实例 3中所描述的体外检测方法测定的药物活性达到Val8-GLP-1(7- 37)OH两倍的之内的药物。

Exendin-4的药效约比Val8-GLP-1(7-37)OH高五倍；因此 Exendin-4理想的血浆浓度比理想的Val8-GLP-1(7-37)OH的浓度水 平低五倍，这两种化合物具有相近的疗效。这与约6皮摩尔至约40 皮摩尔之间的血浆浓度范围是相对应的，这个范围优选是约12皮摩 尔至约30皮摩尔之间。另一个GLP-1化合物药效较强的实例是 Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH，其药效比Val8-GLP-1(7-37)OH高约三 倍。因此，其理想的血浆浓度水平约比已被确定的Val8-GLP-1(7- 37)OH浓度低三倍左右。

这项发明还包括人用药物制品，其包括一个装药用的存储容器； 包括一定量GLP-1化合物，如GLP-1类似物或衍生物的剂量形式和 一个写有能够减轻与胃轻瘫相关的症状或起到治疗胃轻瘫效果的相 应用药剂量的包装插页。

“容器”是指任何密闭的，适用于存储，运输，配制和/或处理 药物产品的容器。

“包装”是指一种对用户有亲和力的，使用药更方便的设备和/ 或方便于运输，教育和/或用药的辅助策略。包装可以促进患者服用 GLP-1化合物，减少或改善针对患者的教育指导时间，并提供了一 个健康经济实用的学习平台，和/或限制了发行渠道的工作负荷。同 时，包装可以包括纸包装，但不仅限于此，热缩塑料包顶部透明包 装，试验用的赠品，教育性的资料，辅助的补给和/或运输设备。

“包装插页”是指产品的伴随信息，其能向医生，药剂师和患者 提供如何用药以及用药的安全性和有效性数据等有关产品的使用信 息，和/或患者教育信息。包装插页通常被认为是要用产品的“标签”。

本发明还包括人用药物制品，包括一个包装插页和一个容器，其 中所述包装插页描述了治疗胃轻瘫的用药方法和用药剂量。对胃轻 瘫的有效治疗包括缓解或消除一种或几种与胃轻瘫有关的症状或者 消除所有与胃轻瘫有关的症状。对胃轻瘫的有效治疗还包括胃功能 的正常化，包括进食后胃正常排空。

本发明的药物制品中所用的容器就是制药产业中常规应用的。通 常所用的容器是一个玻璃制的有盖的密封小药瓶或药筒，还包括有 垫圈，隔膜和/或其他适合患者和药剂师使用的配件。另外，容器可 以是装有干燥剂的试剂盒的一部分，在吸入注射器之前要进行适当 的稀释。其他可选择的容器包括由两个腔室构成的能够将稀释液和 干燥的粉末分别装起来的药筒，需要的时候再将其重新混合。在重 新混合的时候，有两个腔的药筒可以使稀释液流入装有干燥的粉末 的腔室中。优选地容器容积为0.1至100mL，更优选0.5至25mL，更 优选5至10mL，最优选容积为1.5至3mL。容器还可以是泡罩包装， 胶囊，或泡罩板。其他可供选择的容器包括皮肤用的药膏包装，可植 入体内的装置，微球载体和其它储存运输体系包装。

插页可以向医师提供几种剂量选择，不同的剂量产生不同的 GLP-1化合物血浆浓度。这里描述了较好的血浆浓度范围。插页最 好向医师说明一个用药剂量，患者在以这个剂量服用时GLP-1化合 物的血浆浓度就在这里所描述的浓度范围之内。

包装插页给出了一份如何给患者服用一种药品产品的说明，并说 明了必要的安全性和有效性信息，使医师，药剂师和患者能够了解 有关药品使用的情况。包装插页通常被看作是药物产品的标签。

包装插页可以提供下列适应症或标示说明的部分或所有信息：a) 该药适用于胃轻瘫的患者；b)该药适用于伴有糖尿病的胃轻瘫患者； c)该药可改善伴有胃轻瘫的糖尿病患者的血糖控制情况；且d)在缓 解或减轻与胃轻瘫相关的一种或多种症状的严重程度的同时不会导 致有症状的低血糖。

实例1-在2型糖尿病患者中进行的临床研究：

共有四个实验组，每组有八名2型糖尿病患者长期服用Val8- GLP-1(7-37)OH治疗。前三组患者的用药剂量分别为2.5或3.5或4.5 mg，每天皮下注射一次，共注射六天。第四组患者接受的用药剂量 为4.5mg，每天皮下注射一次，共注射二十一天。在研究开始前一 天，每一位患者都要注射生理盐水作为安慰剂对照。注射药物后要 监测血糖13个小时。在研究期间患者所有的用餐都要严格标准化。 患者都是门诊病人，仅在第6天和第21天因要进行评估而在医院停 留超过24小时。在第1天注射之后，要在四个小时中采集用于检测 血糖和Val8-GLP-1(7-37)OH血浆水平的血样。患者都是在每天早晨 用药。在用药的第6天(第四组则为第21天)要在用药后26小时采 集用于检测血糖和测定Val8-GLP-1(7-37)OH血浆浓度的血样。图1 和图2显示了血糖的水平。

实例2-Val8-GLP-1(7-37)OH血浆水平的鉴定：：

由于血中会出现内源性的天然GLP-1多肽，和像GLP-1(9- 37)OH这类的DPP-TV降解产品，因此可以用酶联免疫吸附试验 (ELISA)测定准确的Val8-GLP-1(7-37)OH浓度该方法中未被降解的 全长Val8-GLP-1(7-37)OH会被特异性地识别。由于Val8-GLP-1(7- 37)OH有免疫反应特性，因此可以被血浆中抗Val8-GLP-1(7-37)OH N末端的特异性抗血清俘获，并固定在微量滴定板上。这种抗血清对 Val8-GLP-1(7-37)OH的N末端高度特异。一种与碱性磷酸酶偶联的 抗体能够与GLP-1的C末端特异结合，三者结合可形成一个完整的 “三明治”式的结合。可以用一种叫做pNPP的碱性磷酸酶显色底物 完成检测。所产生的颜色的深浅直接与存在于样本中免疫反应性的 Val8-GLP-1(7-37)OH的浓度成正比。人血浆中Val8-GLP-1(7-37)OH 量的数值可以从以Val8-GLP-1(7-37)OH作参考标准的标准曲线中 读取。通过计算机程序，用加权的4参数逻辑运算对数据进行分析。 检测样本中免疫反应性的Val8-GLP-1(7-37)OH的浓度使用标准曲线 确定。

实例3-体外药效测定：

将能表达人的GLP-1受体的HEK-293 Aurora CRE-BLAM细胞 接种于黑色亮底96孔平板中，密度为20,000至40,000个细胞/孔/100 微升。接种之后，将培养基换为无血清的培养基。在接种后的第三 天，将20ul含有不同浓度GLP-1激动剂的无血清培养基加入不同的 孔中，从而绘制一条剂量反应曲线。通常，含有3纳摩尔至30纳摩 尔GLP-1化合物的14倍稀释用于绘制剂量反应曲线，由此来确定 EC50。在与GLP-1化合物共同孵育5小时之后，向孵育体系中加入 20ul β-内酰胺酶底物(CCF2-AM-Aurora生物科技公司-产品 编号100012)，并继续孵育1小时，然后用细胞荧光检测仪测定荧光 强度。

表1     化合物 与Val8-GLP-1(7-37)OH   相比较得出的EC50值  Val8-GLP-1(7-37)OH     1.0  Gly8-GLP-1(7-37)OH     1.7  Val8-Tyr12-GLP-1(7-37)OH     1.7  Val8-Tyr12-GLP-1(7-36)NH2     1.1  Val8Trp12-GLP-1(7-37)OH     1.1  Val8-Leu16-GLP-1(7-37)OH     1.1  Val8-Tyr16-GLP-1(7-37)OH     2.5  Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)OH     2.2  Val8-Leu25-GLP-1(7-37)OH     0.5  Val8-Glu30-GLP-1(7-37)OH     0.7  Val8-His37-GLP-1(7-37)OH     1.2  Val8-Tyr12-Tyr16-GLP-1(7-37)OH     1.5  Val8-Trp12-Glu22-GLP-1(7-37)OH     1.7  Val8-Tyr12-Glu22-GLP-1(7-37)OH     2.7  Val8-Tyr16-Phe19-GLP-1(7-37)OH     2.8  Val8-Tyr16-Glu22-GLP-1(7-37)OH     3.6，3.8  Val8-Trp16-Glu22-GLP-1(7-37)OH     4.9，4.6  Val8-Leu16-Glu22-GLP-1(7-37)OH     4.3  Val8-Ile16-Glu22-GLP-1(7-37)OH     3.3  Val8-Phe16-Glu22-GLP-1(7-37)OH     2.3  Val8-Trp18-Glu22-GLP-1(7-37)OH     3.2，6.6  Val8-Tyr18-Glu22-GLP-1(7-37)OH     5.1，5.9  Val8-Phe18-Glu22-GLP-1(7-37)OH     2.0  Val8-Ile18-Glu22-GLP-1(7-37)OH     4.0  Val8-Lys18-Glu22-GLP-1(7-37)OH     2.5  Val8-Trp19-Glu22-GLP-1(7-37)OH     3.2  Val8-Phe19-Glu22-GLP-1(7-37)OH     1.5  Val8-Phe20-Glu22-GLP-1(7-37)OH     2.7  Val8-Glu22-Leu25-GLP-1(7-37)OH     2.8  Val8-Glu22-Ile25-GLP-1(7-37)OH     3.1  Val8-Glu22-Val25-GLP-1(7-37)OH     4.7，2.9  Val8-Glu22-Ile27-GLP-1(7-37)OH     2.0  Val8-Glu22-Ala27-GLP-1(7-37)OH     2.2  Val8-Glu22-Ile33-GLP-1(7-37)OH     4.7，3.8，3.4  Val8-Glu22-His37-GLP-1(7-37)OH     4.7  Val8-Asp9-Ile11-Tyr16-Glu22-GLP-1(7-37)OH     4.3  Val8-Tyr16-Trp19-Glu22-GLP-1(7-37)OH     3.5  Val8-Trp16-Glu22-Val25-Ile33-GLP-1(7-37)OH     5.O  Val8-Trp16-Glu22-Ile33-GLP-1(7-37)OH     4.1  Val8-Glu22-Val25-Ile33-GLP-1(7-37)OH     4.9，5.8，6.7  Val8-Trp16-Glu22-Val25-GLP-1(7-37)OH     4.4

序列表

<110>礼来公司

<120>胃轻瘫的治疗

<130>X-15632

<150>P15632

<151>2002-04-10

<160>2

<170>专利版本3.1

<210>1

<211>31

<212>PRT

<213>人类

<220>

<221>多种多样的特征

<222>(30)..(30)

<223>当在31位的Xaa不存在或是为Arg时，在30位的Xaa是Arg-NH2

<220>

<221>多种多样的特征

<222>(31)..(31)

<223>当在30位的Xaa是Arg时，在31位的Xaa不存在或是为Gly

<400>1

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Va1 Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1               5                   10                  15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Xaa Xaa

            20                  25                  30

<210>2

<211>39

<212>PRT

<213>毒蜥sp.

<220>

<221>多种多样的特征

<222>(2)..(2)

<223>第2位的Xaa是Ser或Gly

<220>

<221>多种多样的特征

<222>(39)..(39)

<223>第39位的Xaa是Ser或Ser NH2

<220>

<221>多种多样的特征

<222>(3)..(3)

<223>第3位的Xaa是Asp或Glu

<400>2

His Xaa Xaa Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu

1               5                   10                  15

Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser

            20                  25                  30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Xaa

        35