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用于组合疗法的药物组合物

阅读：722发布：2020-09-11

专利汇可以提供用于组合疗法的药物组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本申请涉及一种药物组合物，该药物组合物包含FXR激动剂和降低血液中的葡萄糖水平、刺激胰岛素分泌、和/或提高胰岛素敏感度的至少一种另外的治疗剂的组合。本申请涉及该药物组合物用于治疗或预防 FXR介导的疾病或病症，诸如NAFLD和NASH，与血液中葡萄糖水平升高、胰岛素分泌减少、和/或胰岛素敏感度降低相关的疾病或病症，诸如高血糖症、糖尿病、肥胖症、以及胰岛素耐受性，或者用于降低血液中葡萄糖水平、刺激胰岛素分泌、和/或提高胰岛素敏感度的用途。，下面是用于组合疗法的药物组合物专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种药物组合物，该药物组合物包含FXR激动剂、至少一种另外的治疗剂、以及任选地一种或多种药学上可接受的载体，其中该至少一种另外的治疗剂降低血液中的葡萄糖水平、刺激胰岛素分泌、和/或提高胰岛素敏感度。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其中该至少一种另外的治疗剂降低葡萄糖水平。
3.如权利要求1所述的药物组合物，其中该至少一种另外的治疗剂刺激胰岛素分泌。
4.如权利要求1所述的药物组合物，其中该至少一种另外的治疗剂提高胰岛素敏感度。
5.如权利要求1所述的药物组合物，其中该至少一种另外的治疗剂是胰岛素或胰岛素类似物。
6.如权利要求1所述的药物组合物，其中该至少一种另外的治疗剂是在胰腺β细胞中对ATP敏感的K+通道的抑制剂。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其中该至少一种另外的治疗剂是磺酰脲。
8.如权利要求6所述的药物组合物，其中该至少一种另外的治疗剂选自美格列奈、瑞格列奈、纳格列奈、米格列奈、以及利诺格列。
9.如权利要求1所述的药物组合物，其中该至少一种另外的治疗剂是肠降血糖素模拟物。
10.如权利要求9所述的药物组合物，其中该至少一种另外的治疗剂是GLP-1或其GLP-1受体激动剂。
11.如权利要求9所述的药物组合物，其中该至少一种另外的治疗剂是GIP或其类似物。
12.如权利要求1所述的药物组合物，其中该至少一种另外的治疗剂是二肽基肽酶-4的抑制剂。
13.如权利要求1所述的药物组合物，其中该至少一种另外的治疗剂是双胍。
14.如权利要求1所述的药物组合物，其中该至少一种另外的治疗剂是胆汁酸螯合剂。
15.如权利要求1所述的药物组合物，其中该至少一种另外的治疗剂是促进葡萄糖代谢的药剂。
16.如权利要求15所述的药物组合物，其中该至少一种另外的治疗剂是葡糖激酶活化剂。
17.如权利要求1所述的药物组合物，其中该至少一种另外的治疗剂是阻断葡萄糖的肾脏再吸收的药剂。
18.如权利要求17所述的药物组合物，其中该至少一种另外的治疗剂是SGLT-2抑制剂。
19.如权利要求1所述的药物组合物，其中该至少一种另外的治疗剂是减少肠内葡萄糖吸收的药剂。
20.如权利要求19所述的药物组合物，其中该至少一种另外的治疗剂是α-葡萄糖苷酶抑制剂。
21.如权利要求1所述的药物组合物，其中该至少一种另外的治疗剂是减缓胃排空的药剂。
22.如权利要求21所述的药物组合物，其中该至少一种另外的治疗剂是糊精或其类似物。
23.如权利要求1所述的药物组合物，其中该至少一种另外的治疗剂是微粒体甘油三酯转运蛋白抑制剂。
24.如权利要求1所述的药物组合物，其中该至少一种另外的治疗剂选自溴麦角环肽、苯氟雷司、和托瑞司他。
25.如权利要求1所述的药物组合物，其中该至少一种另外的治疗剂是降低糖皮质激素浓度的药剂。
26.如权利要求25所述的药物组合物，其中该至少一种另外的治疗剂是11β-HSD1抑制剂。
27.如权利要求1所述的药物组合物，其中该FXR激动剂是具有化学式I的化合物：
或其药学上可接受的盐或氨基酸缀合物，其中：
R1是氢或未经取代的C1-C6烷基；
R2是氢或α-羟基；
R4是羟基或氢；并且
R7是羟基或氢。
28.如权利要求27所述的药物组合物，其中R1是未经取代的C1-C6烷基。
29.如权利要求28所述的药物组合物，其中R1是甲基、乙基、或丙基。
30.如权利要求29所述的药物组合物，其中R1是乙基。
31.如权利要求27所述的药物组合物，其中R4是羟基并且R7是氢。
32.一种药物组合物，该药物组合物包含化合物1：
或其药学上可接受的盐或氨基酸缀合物、至少一种另外的治疗剂、以及任选地一种或多种药学上可接受的载体，其中该至少一种另外的治疗剂降低血液中的葡萄糖水平、刺激胰岛素分泌、和/或提高胰岛素敏感度。
33.如权利要求32所述的药物组合物，其中该至少一种另外的治疗剂降低葡萄糖水平。
34.如权利要求32所述的药物组合物，其中该至少一种另外的治疗剂刺激胰岛素分泌。
35.如权利要求32所述的药物组合物，其中该至少一种另外的治疗剂提高胰岛素敏感度。
36.如权利要求32所述的药物组合物，其中该至少一种另外的治疗剂是胰岛素或胰岛素类似物。
37.如权利要求32所述的药物组合物，其中该至少一种另外的治疗剂是在胰腺β细胞中对ATP敏感的K+通道的抑制剂。
38.如权利要求37所述的药物组合物，其中该至少一种另外的治疗剂是磺酰脲。
39.如权利要求37所述的药物组合物，其中该至少一种另外的治疗剂选自美格列奈、瑞格列奈、纳格列奈、米格列奈、以及利诺格列。
40.如权利要求32所述的药物组合物，其中该至少一种另外的治疗剂是肠降血糖素模拟物。
41.如权利要求40所述的药物组合物，其中该至少一种另外的治疗剂是GLP-1或其GLP-
1受体激动剂。
42.如权利要求40所述的药物组合物，其中该至少一种另外的治疗剂是GIP或其类似物。
43.如权利要求32所述的药物组合物，其中该至少一种另外的治疗剂是二肽基肽酶-4的抑制剂。
44.如权利要求32所述的药物组合物，其中该至少一种另外的治疗剂是双胍。
45.如权利要求32所述的药物组合物，其中该至少一种另外的治疗剂是胆汁酸螯合剂。
46.如权利要求32所述的药物组合物，其中该至少一种另外的治疗剂是促进葡萄糖代谢的药剂。
47.如权利要求46所述的药物组合物，其中该至少一种另外的治疗剂是葡糖激酶活化剂。
48.如权利要求32所述的药物组合物，其中该至少一种另外的治疗剂是阻断葡萄糖的肾脏再吸收的药剂。
49.如权利要求48所述的药物组合物，其中该至少一种另外的治疗剂是SGLT-2抑制剂。
50.如权利要求32所述的药物组合物，其中该至少一种另外的治疗剂是减少肠内葡萄糖吸收的药剂。
51.如权利要求50所述的药物组合物，其中该至少一种另外的治疗剂是α-葡萄糖苷酶抑制剂。
52.如权利要求32所述的药物组合物，其中该至少一种另外的治疗剂是减缓胃排空的药剂。
53.如权利要求52所述的药物组合物，其中该至少一种另外的治疗剂是糊精或其类似物。
54.如权利要求32所述的药物组合物，其中该至少一种另外的治疗剂是微粒体甘油三酯转运蛋白抑制剂。
55.如权利要求32所述的药物组合物，其中该至少一种另外的治疗剂选自溴麦角环肽、苯氟雷司、和托瑞司他。
56.如权利要求32所述的药物组合物，其中该至少一种另外的治疗剂是降低糖皮质激素浓度的药剂。
57.如权利要求56所述的药物组合物，其中该至少一种另外的治疗剂是11β-HSD1抑制剂。
58.一种治疗或预防非酒精性脂肪肝病(NAFLD)或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的方法，该方法包括向对其有需要的受试者给予如权利要求1或权利要求32所述的药物组合物。
59.如权利要求58所述的方法，其中该NAFLD或NASH与血液中葡萄糖水平升高、胰岛素分泌减少、和/或胰岛素敏感度降低相关。
60.一种治疗或预防与血液中葡萄糖水平升高、胰岛素分泌减少、和/或胰岛素敏感度降低相关的疾病或病症的方法，该方法包括向对其有需要的受试者给予如权利要求1或权利要求32所述的药物组合物。
61.如权利要求60所述的方法，其中该疾病或病症选自NAFLD、NASH、高血糖症、糖尿病、肥胖症、以及胰岛素耐受性。
62.一种降低血液中葡萄糖水平、刺激胰岛素分泌、和/或提高胰岛素敏感度的方法，该方法包括向对其有需要的受试者给予治疗有效量的如权利要求1或权利要求32所述的药物组合物。

说明书全文

用于组合疗法的药物组合物

背景技术

[0001] 代谢紊乱(包括糖尿病和胰岛素耐受性综合征)由多种代谢风险标志物的异常，诸如高胰岛素血症、葡萄糖代谢受损、甘油三酯血浆水平升高、高密度脂蛋白胆固醇水平降低、血压升高、以及肥胖表征。血液中葡萄糖浓度升高、胰岛素分泌减少和/或胰岛素耐受性增加可能涉及多种病症，包括原发性胆汁性肝硬化(PBC)、原发性硬化性胆管炎(PSC)、不同的慢性肝炎状态(乙型肝炎和丙型肝炎)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、以及非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。当前的治疗目标是胰岛素耐受性(例如，二甲双胍、噻唑烷二酮(“TZD”))或来自β细胞的胰岛素释放(例如，磺酰脲、艾塞那肽)。然而，这些治疗存在不同缺陷，包括副作用、有限的功效、以及不期望的长期效应。

[0002] 胆汁酸参与不同代谢过程的调节，并且不仅调节自身的合成和肠肝循环，而且还调节甘油三酯、胆固醇、葡萄糖、以及能量稳态。胆汁酸还可通过调节能量消耗而在调节肠降血糖素释放和代谢调节中起另外的作用。此外，胆汁酸螯合剂(BAS)已经在治疗不同肝病(诸如NAFLD和NASH)、血糖代谢障碍、以及II型糖尿病中发挥了其作用。

[0003] 胆汁酸与参与胆汁酸稳态的核受体FXR结合。已经提出的是，糖尿病与FXR表达的调节异常相关。FXR似乎不仅起到改变餐后和空腹肝葡萄糖利用过程中的碳水化合物诱导的基因表达以及在肝葡萄糖产生中的作用，而且还参与通过维持餐后肝葡萄糖产生和糖原储存来调节预防空腹低血糖所必需的一系列复杂的糖异生基因。此外，在餐后状态下，FXR活化抑制诸如L-型丙酮酸激酶(L-PK)的葡萄糖反应性基因的诱导。

[0004] 因此，对于包含FXR激动剂以及降低血糖水平、刺激胰岛素分泌、和/或提高胰岛素敏感度的至少一种另外的治疗剂的药物组合物存在未满足的需求，用于治疗或预防与血液中葡萄糖水平升高、胰岛素分泌减少、和/或胰岛素敏感度降低相关的不同疾病或病症。本申请解决了此类需要。附图说明

[0005] 图1A是示出低剂量奥贝胆酸(OCA)和利拉鲁肽(LIRA)单独和组合地对总NAS的影响的条形图。*p<0.05对于对照，并且$p<0.05对于OCA。图1B是示出高剂量OCA和LIRA单独和组合地对总NAS的影响的条形图。*p<0.05对于对照。

[0006] 图2A是示出低剂量OCA和LIRA单独和组合地对NAS的脂肪变性组分的影响的条形图。*p<0.05对于对照，并且$p<0.05对于OCA。图2B是示出高剂量OCA和LIRA单独和组合地对NAS的脂肪变性组分的影响的条形图。*p<0.05对于对照，$p<0.05对于OCA，并且^p<0.05对于LIRA。

[0007] 图3A是示出低剂量OCA和LIRA单独和组合地对总肝甘油三酯含量的影响的条形图。###p<0.001对于LEAN-CHOW运载体，***p<0.001对于DIO-NASH运载体；并且Δp<0.05对于DIO-NASH OCA(10mg/kg)。图3B是示出高剂量OCA和LIRA单独和组合地对总肝甘油三酯含量###的影响的条形图。 p<0.001对于LEAN-CHOW运载体，**p<0.05和***p<0.001对于DIO-NASH运载体。

[0008] 图4A是示出低剂量OCA和LIRA单独和组合地对总肝胆固醇含量的影响的条形图。###p<0.001对于LEAN-CHOW运载体；*p<0.05和***p<0.001对于DIO-NASH运载体。图4B是示出高剂量OCA和LIRA单独和组合地对总肝胆固醇含量的影响的条形图。###p<0.001对于LEAN-CHOW运载体；**p<0.01和***p<0.001对于DIO-NASH运载体。

[0009] 图5是示出低剂量OCA和LIRA单独和组合地对研究期间体重的影响的图。

[0010] 图6A是示出低剂量OCA和LIRA单独和组合地对脂肪组织质量相对于体重变化的影响的条形图。图6B是示出高剂量OCA和LIRA单独和组合地对脂肪组织质量相对于体重变化的影响的条形图。

[0011] 图7A-7E描述了对由低剂量OCA和LIRA单独和组合地独特地调节的基因的影响。*p<0.005对于运载体对照。图7A是示出对诱导细胞死亡的DFFA样效应子C的表达水平的影响的条形图。图7B是示出对含有死亡效应结构域DNS结合蛋白的表达水平的影响的条形图。图7C是示出对2-羟基酰基-CoA-裂解酶的表达水平的影响的条形图。图7D是示出对凝集素半乳糖结合蛋白的表达水平的影响的条形图。图7E是示出对氧甾酮结合蛋白样3受体的表达水平的影响的条形图。

[0012] 图8A-8D描述了对由高剂量OCA和LIRA单独和组合地独特地调节的基因的表达水平的影响。*p<0.005对于运载体对照，并且#p<0.05对于运载体对照。图8A是示出对雌激素受体1的表达水平的影响的条形图。图8B是示出对胰岛素诱导基因2的表达水平的影响的条形图。图8C是示出对脂质1的表达水平的影响的条形图。图8D是示出对泛醇-细胞色素C还原酶铰链蛋白的表达水平的影响的条形图。

[0013] 图9A是示出高剂量OCA和二甲双胍(MET)单独和组合地对总NAS的影响的条形图。*p<0.005对于运载体对照。图9B是示出高剂量OCA和MET单独和组合地对NAS的脂肪变性组分的影响的条形图。

[0014] 图10A是示出低剂量OCA和MET单独和组合地对在第4周使用OGTT降低血糖的影响的图。##p<0.001对于LEAN-CHOW运载体，**p<0.01和***p<0.001对于DIO-NASH运载体，ΔΔΔp<0.05对于DIO-NASH OCA(10mg/kg)，并且↑↑p<0.05对于DIO-NASH MET(50mg/kg)。图10B是示出低剂量OCA和MET单独和组合地对在第4周使用OGTT降低血糖的影响的图。##p<0.001对于LEAN-CHOW运载体，*p<0.05、***p<0.001对于DIO-NASH运载体；并且Δp<0.005、ΔΔp<0.01、ΔΔΔp<0.001对于DIO-NASH OCA(30mg/kg)。

[0015] 图11是示出由低剂量和高剂量OCA和MET单独和组合地调节的基因数量的条形图。

[0016] 图12A是示出低剂量OCA和二甲双胍单独和组合地对基因表达的影响的维恩图。图12B是示出高剂量OCA和MET单独和组合地对基因表达的影响的维恩图。图12C是比较由低剂量和高剂量OCA和MET调节的基因数量的维恩图。

[0017] 图13A是示出低剂量OCA和MET单独和组合地对6a2型胶原的mRNA表达的影响的条形图。图13B是示出低剂量OCA和MET单独和组合地对4a2型胶原的mRNA表达的影响的条形图。图13C是示出低剂量OCA和MET单独和组合地对5a1型胶原的mRNA表达的影响的条形图。

[0018] 图14A-14F描述了对由低剂量OCA和MET单独和组合地独特地调节的某些基因的表达水平的影响。*p<0.005对于运载体对照。图14A是示出低剂量OCA和MET单独和组合地对核心蛋白聚糖的mRNA表达的影响的条形图。图14B是示出低剂量OCA和MET单独和组合地对层粘连蛋白亚基1的mRNA表达的影响的条形图。图14C是示出低剂量OCA和MET单独和组合地对单核细胞至巨噬细胞分化因子2的mRNA表达的影响的条形图。图14D是示出低剂量OCA和MET单独和组合地对转化生长因子B1转录物的mRNA表达的影响的条形图。图14E是示出高剂量OCA和MET单独和组合地对肿瘤坏死因子受体超家族的成员11b的mRNA表达的影响的条形图。图14F是示出低剂量OCA和MET单独和组合地对肿瘤坏死因子受体超家族的成员19的mRNA表达的影响的条形图。

[0019] 图15A-15C描述了对由高剂量OCA和MET单独和组合地调节的某些胶原的表达水平的影响。*p<0.005对于运载体对照。图15A是示出高剂量OCA和MET单独和组合地对14a1型胶原的mRNA表达的影响的条形图。图15B是示出高剂量OCA和MET单独和组合地对6a1型胶原的mRNA表达的影响的条形图。图15C是示出高剂量OCA和MET单独和组合地对6a2型胶原的mRNA表达的影响的条形图。

[0020] 图16A-16E描述了对由高剂量OCA和MET单独和组合地独特地调节的某些基因的表达水平的影响。*p<0.005对于运载体对照。图16A是示出低剂量OCA和MET单独和组合地对血小板源性生长因子受体β的mRNA表达的影响的条形图。图16B是示出低剂量OCA和MET单独和组合地对核心蛋白聚糖的mRNA表达的影响的条形图。图16C是示出低剂量OCA和MET单独和组合地对胶原凝集素(colectin)亚家族成员10的mRNA表达的影响的条形图。图16D是示出低剂量OCA和MET单独和组合地对转化生长因子III型β受体的mRNA表达的影响的条形图。图16E是示出低剂量OCA和MET单独和组合地对β诱导的转化生长因子的mRNA表达的影响的条形图。
发明内容

[0021] 本申请涉及一种药物组合物，该药物组合物包含(i)第一化合物，(ii)至少一种另外的治疗剂，以及(iii)任选地一种或多种药学上可接受的载体，其中该第一化合物是FXR激动剂，并且该至少一种另外的治疗剂降低血液中的葡萄糖水平、刺激胰岛素分泌、和/或提高胰岛素敏感度。

[0022] 本申请还涉及本申请的药物组合物的治疗用途。

[0023] 在一个实施例中，该第一化合物是具有化学式I的化合物：

[0024]

[0025] 或其药学上可接受的盐或氨基酸缀合物，其中R1、R2、R4、以及R7是如在此所定义的。

[0026] 本申请还涉及用于治疗或预防FXR介导的疾病或病症和/或与血液中葡萄糖水平升高、胰岛素分泌减少、和/或胰岛素敏感度降低相关的疾病或病症的方法，这些方法包括向对其有需要的受试者给予治疗有效量的本申请的药物组合物。在一个实施例中，FXR介导的疾病或病症通过FXR活化治疗。

[0027] 本申请还涉及用于治疗或预防非酒精性脂肪肝病(NAFLD)或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的方法，这些方法包括向对其有需要的受试者给予治疗有效量的本申请的药物组合物。

[0028] 本申请还涉及用于降低血液中葡萄糖水平、刺激胰岛素分泌、和/或提高胰岛素敏感度的方法，这些方法包括向对其有需要的受试者给予治疗有效量的本申请的药物组合物。

[0029] 本申请还涉及用于治疗或预防高血糖症、糖尿病或肥胖症的方法，这些方法包括向对其有需要的受试者给予治疗有效量的本申请的药物组合物。

[0030] 本申请还涉及本申请的药物组合物用于降低血液中葡萄糖水平，刺激胰岛素分泌，提高胰岛素敏感度，治疗或预防FXR介导的疾病或病症和/或与血液中葡萄糖水平升高、胰岛素分泌减少、和/或胰岛素敏感度降低相关的疾病或病症，并且/或者治疗或预防NAFLD、NASH、高血糖症、糖尿病、或肥胖症的用途。在一个实施例中，该疾病或病症通过FXR活化治疗。

[0031] 本申请还涉及本申请的药物组合物在制造用于降低血液中葡萄糖水平，刺激胰岛素分泌，提高胰岛素敏感度，治疗或预防FXR介导的疾病或病症和/或与血液中葡萄糖水平升高、胰岛素分泌减少、和/或胰岛素敏感度降低相关的疾病或病症，并且/或者治疗或预防NAFLD、NASH、高血糖症、糖尿病、或肥胖症的药物中的用途。在一个实施例中，该疾病或病症通过FXR活化治疗。

[0032] 本申请的组合物和方法解决了在治疗或预防其中涉及血液中葡萄糖浓度升高、胰岛素分泌减少、和/或胰岛素敏感度降低的疾病或障碍中未满足的需求。

具体实施方式

[0033] 本申请涉及一种药物组合物，该药物组合物包含(i)第一化合物，(ii)至少一种另外的治疗剂，以及(iii)任选地一种或多种药学上可接受的载体，其中该第一化合物是FXR激动剂，并且该至少一种另外的治疗剂降低血液中的葡萄糖水平、刺激胰岛素分泌、和/或提高胰岛素敏感度。

[0034] 在一个实例中，该至少一种另外的治疗剂是增加胰岛素分泌的药剂。在另一个实例中，该至少一种另外的治疗剂是增加目标细胞、组织或器官对胰岛素的敏感度的药剂。在另一个实例中，该至少一种另外的治疗剂是降低血液中葡萄糖水平的药剂。

[0035] 在一个实例中，该至少一种另外的治疗剂是胰岛素或胰岛素类似物。在另一个实例中，该胰岛素或胰岛素类似物选自 R、赖脯胰岛素门冬胰岛素格鲁辛胰岛素速效胰岛素锌甘精胰岛素
地特胰岛素低精蛋白胰岛素、胰岛素锌长效胰岛
素锌德谷胰岛素、以及

[0036] 在一个实例中，该至少一种另外的治疗剂是在胰腺β细胞中对ATP敏感的K+通道的抑制剂。在另一个实例中，该至少一种另外的治疗剂是磺酰脲。在另一个实例中，该磺酰脲选自甲苯磺丁脲醋酸己脲妥拉磺脲氯磺丙脲氨磺丁脲美他己脲、格列吡嗪优降糖或
格列本脲格列吡脲、格列喹酮(Glurenorm)、格列齐特(Uni Diamicron)、
格列波脲、格列派特、格列美脲以及JB253(布罗伊希哈根(Broichhagen)等
人，自然通讯(Nature Comm.)5，文章编号5116(2014))。在另一个实例中，该至少一种另外的治疗剂选自美格列奈、瑞格列奈纳格列奈米格列奈、以及利诺
格列。

[0037] 在一个实例中，该至少一种另外的治疗剂是FFA1/GPR40(游离脂肪酸受体1)的激动剂。在另一个实例中，该FFA1/GPR40激动剂是fasiglifam。

[0038] 在一个实例中，该至少一种另外的治疗剂是肠降血糖素模拟物。在另一个实例中，该肠降血糖素模拟物是胰高血糖素样肽-1(GLP-1)或其GLP-1受体的激动剂。在另一个实例中，该GLP-1受体激动剂选自艾塞那肽/毒蜥外泌肽-4、利拉鲁肽、利拉鲁肽、利西拉肽、阿必鲁肽、杜拉鲁肽、索马鲁肽、BRX-0585(Pfizer/Biorexis)、以及CJC-1134-PC(缀合至人血白蛋白的毒蜥外泌肽-4)。在另一个实例中，该肠降血糖素模拟物是胃抑制肽(GIP)或GIP类似物。

[0039] 在一个实例中，该至少一种另外的治疗剂是二肽基肽酶-4(DPP-4，在本领域也称为DPP-IV)的抑制剂。在另一个实例中，该DPP-4抑制剂选自维格列汀西格列汀沙格列汀利拉利汀阿格列汀、西他列汀、阿
拉格列汀、吉格列汀、特力利汀、卡格列汀、戈塞列汀、度格列汀、黄连素、以及羽扇豆醇。

[0040] 在一个实例中，该至少一种另外的治疗剂是人过氧化物酶体增殖物活化受体(PPAR)γ激动剂。在另一个实例中，该PPARγ激动剂选自噻唑烷二酮类和格列酮类，例如，罗格列酮、曲格列酮、吡格列酮、恩格列酮、巴格列酮、利格列酮、环格列酮、洛贝格列酮、以及萘格列酮。

[0041] 在一个实例中，该至少一种另外的治疗剂是双胍。在另一个实例中，该双胍选自二甲双胍、丁双胍、和苯乙双胍。

[0042] 在一个实例中，该至少一种另外的治疗剂是胆汁酸螯合剂。在另一个实例中，该胆汁酸螯合剂选自阴离子交换树脂、季胺类(例如，考来烯胺或考来替泊)、以及回肠胆汁酸转运蛋白抑制剂。

[0043] 在一个实例中，该至少一种另外的治疗剂是促进葡萄糖代谢(例如，葡萄糖的磷酸化)的药剂。在一个实例中，该至少一种另外的治疗剂是葡糖激酶活化剂。在另一个实例中，该葡糖激酶活化剂是如WO2000/058293中所述的化合物。

[0044] 在一个实例中，该至少一种另外的治疗剂是阻断葡萄糖的肾脏再吸收的药剂。在一个实例中，该至少一种另外的治疗剂是SGLT-2抑制剂。在另一个实例中，该SGLT-2抑制剂选自坎格列净、达格列净、恩格列净、瑞格列净、舍格列净、托格列净、伊格列净、以及埃格列净。

[0045] 在一个实例中，该至少一种另外的治疗剂是减少肠内葡萄糖吸收的药剂。在一个实例中，该至少一种另外的治疗剂是α-葡萄糖苷酶抑制剂。在另一个实例中，该α-葡萄糖苷酶抑制剂选自米格列醇阿卡波糖和伏格列波糖。

[0046] 在一个实例中，该至少一种另外的治疗剂是减缓胃排空和/或抑制胰高血糖素的药剂。在一个实例中，该至少一种另外的治疗剂是糊精或糊精类似物。在另一个实例中，该糊精类似物是普兰林肽。

[0047] 在一个实例中，该至少一种另外的治疗剂是微粒体甘油三酯转运蛋白(MTP)抑制剂。在另一个实例中，该MTP抑制剂选自咪格列唑、伊格列哚、德格列哚、咪唑克生、依法克生、以及氟洛克生。

[0048] 在一个实例中，该至少一种另外的治疗剂选自溴麦角环肽、苯氟雷司、和托瑞司他。

[0049] 在一个实例中，该至少一种另外的治疗剂是降低糖皮质激素浓度的药剂。在一个实例中，该至少一种另外的治疗剂是11β-HSD1抑制剂。在另一个实例中，该11β-HSD1抑制剂选自甘草酸、甘草亭酸(甘草次酸)、甘珀酸、松香酸、类黄酮柚皮素(naringenine)、蒽醌大黄素、金刚烷基[1,2,4]三唑并[4,3-a]吖庚因、BVT-2733、BVT-116429、BVT-3498/AMG-311、AMG-221、PF-915275、HSD-016、INCB-13739、INCB-20817、MK-0916、MK-0736、AZD-4017、AZD-8329、RG-4929、RG-7234、BMS-816336、以及JTT-654，

[0050]

[0051] 以及选自下表的化合物：

[0052]

[0053]

[0054] 在一个实例中，该药物组合物的第一化合物是具有化学式I的化合物：

[0055]

[0056] 或其药学上可接受的盐或氨基酸缀合物，其中：

[0057] R1是氢或未经取代的C1-C6烷基；

[0058] R2是氢或α-羟基；

[0059] R4是羟基或氢；并且

[0060] R7是羟基或氢。

[0061] 在一个实例中，R1是未经取代的C1-C6烷基。在另一个实例中，R1是未经取代的C1-C3烷基。在另一个实例中，R1是甲基、乙基、或丙基。在另一个实例中，R1是乙基。

[0062] 在一个实例中，R2是氢。在另一个实例中，R2是α-羟基。

[0063] 在一个实例中，R4是羟基并且R7是氢。在另一个实例中，R4是氢并且R7是羟基。

[0064] 在另一个实例中，R1选自甲基、乙基和丙基，R4是羟基，R7是氢，并且R2是氢。在另一个实例中，R1是乙基。

[0065] 在另一个实例中，R1选自甲基、乙基和丙基，R4是氢，R7是羟基，并且R2是氢。在另一个实例中，R1是乙基。

[0066] 在另一个实例中，R1选自甲基、乙基和丙基，R4是羟基，R7是氢，并且R2是α-羟基。在另一个实例中，R1是乙基。

[0067] 在另一个实例中，R1选自甲基、乙基和丙基，R4是氢，R7是羟基，并且R2是α-羟基。在另一个实例中，R1是乙基。

[0068] 在一个实例中，该氨基酸缀合物是甘氨酸缀合物。在一个实例中，该氨基酸缀合物是牛磺酸缀合物。

[0069] 在另一个实例中，该化合物是

[0070]

[0071] 或其药学上可接受的盐或氨基酸缀合物。

[0072] 待本申请解决的问题之一是鉴别用于治疗或预防与血液中葡萄糖浓度升高相关的病症，诸如FXR介导的疾病(例如，NAFLD和NASH)、高血糖症和糖尿病，以及降低血液中的葡萄糖水平，增加胰岛素分泌以及提高胰岛素敏感度的组合疗法。例如，本申请通过降低血液中的葡萄糖水平和/或增加胰岛素分泌和/或胰岛素敏感度来鉴别用于治疗或预防FXR介导的疾病(例如，NAFLD和NASH)的组合疗法。在一个实施例中，该疾病或病症通过FXR活化治疗。尽管用于与葡萄糖水平升高相关的病症的药物是可获得的，但这些药物经常出于各种原因而不适合用于许多患者。例如，许多药物具有不良反应，诸如恶心、呕吐、腹泻、头晕、头痛、以及乏力等。当单独给予时，一些药物对于治疗而言可能是不足的。例如，在一些情况下，单独的一种胰岛素分泌刺激剂不足以控制许多患者(例如，患有NAFLD或NASH的患者)中存在的严重的高血糖水平。一些药物由于广泛代谢成无活性或效力更低的代谢物而可能需要高剂量的给予或更频繁的给予。包括利拉鲁肽的几类治疗剂经由注射给予。口服共同给予第二治疗剂的优点可使得注射的次数和/或频率减少。通过减少次数和/或频率，该治疗剂量方案可允许更大的患者依从性，特别是对于可能不习惯于注射的NASH患者。在此所述的组合疗法能够解决上述问题并且可以具有一种或多种以下优点：例如，协同作用，在无药物损失功效的情况下减少每日剂量的次数，在患者中降低血糖，改进的效力、选择性、组织渗透性、半衰期、和/或代谢稳定性。

[0073] 在本申请的组合物、包装或试剂盒、方法、以及用途中，该第一化合物可以是游离酸或者第一化合物可以是药学上可接受的盐或氨基酸缀合物(例如，甘氨酸或牛磺酸缀合物)。在一个实例中，该第一化合物是任何FXR激动剂。在一个方面，该第一化合物是具有化学式I的化合物。在一个方面，该第一化合物是奥贝胆酸(化合物1)。在一个实例中，该第一化合物是具有化学式I的化合物的游离酸。在一个实例中，该第一化合物是具有化学式I的化合物的甘氨酸缀合物。在一个实例中，该第一化合物是具有化学式I的化合物的牛磺酸缀合物。

[0074] 在本申请的组合物、包装或试剂盒、方法以及用途中，该至少一种另外的治疗剂可以是在此所述的任何药剂。在一个实例中，该至少一种另外的治疗剂是增加胰岛素分泌的药剂。在另一个实例中，该至少一种另外的治疗剂是增加目标细胞、组织或器官对胰岛素的敏感度的药剂。在另一个实例中，该至少一种另外的治疗剂是降低血液中葡萄糖水平的药剂。

[0075] 本申请的化合物还包含同位素标记的第一化合物或其药学上可接受的盐或氨基酸缀合物，该同位素标记的第一化合物或其药学上可接受的盐或氨基酸缀合物具有与本申请的第一化合物(例如，具有化学式I的化合物)的结构相同的结构，但事实是一个或多个原子被具有与最常在自然中发现的原子质量或质量数不同的原子质量或质量数的原子置换。可以掺入该第一化合物或其药学上可接受的盐或氨基酸缀合物中的同位素的实例包括氢、碳、氮、氟的同位素，如3H、11C、14C和18F。

[0076] 包含上述同位素和/或其他原子的其他同位素的第一化合物或其药学上可接受的盐或氨基酸缀合物在本申请的范围之内。同位素标记的第一化合物或其药学上可接受的盐或氨基酸缀合物，例如掺入放射性同位素如3H和/或14C的第一化合物可用于药物和/或底物组织分布测定中。氚化的(即3H)和碳-14(即14C)同位素因其容易制备和可检测性而被使用。另外，用较重的同位素如氘(即2H)取代可以提供由更大的代谢稳定性引起的某些治疗优点，例如增加的体内半衰期和减少的剂量需求，并且因此可以在一些情况下被使用。同位素标记的第一化合物或其药学上可接受的盐或氨基酸缀合物总体上可以通过执行在本申请的方案和/或实例中披露的程序、通过用容易获得的同位素标记的试剂取代非同位素标记的试剂来制备。在一个实例中，奥贝胆酸或其药学上可接受的盐或氨基酸缀合物未进行同位素标记。

[0077] 本申请还提供一种用于治疗或预防一种疾病或病症的方法，该方法包括向对其有需要的受试者给予治疗有效量的本申请的药物组合物。

[0078] 在一个实例中，该疾病或病症是FXR介导的疾病或病症。FXR介导的疾病或病症的实例包括但不限于肝病，诸如胆汁淤积性或非胆汁淤积性疾病或病症。在一个实施例中，FXR介导的疾病或病症涉及FXR活化。胆汁淤积性肝病包括但不限于原发性胆汁性肝硬化(PBC)、原发性硬化性胆管炎(PSC)、门静脉高压、胆道闭锁、胆汁酸性腹泻、由于进行性纤维化引起的肝损伤、肝纤维化、以及慢性肝病。非胆汁淤积性肝病或病症包括但不限于：非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、丙型肝炎感染、酒精性肝病、由于进行性纤维化引起的肝损伤，诸如肝细胞癌、胆管癌、结肠直肠癌、胃癌、以及肾癌的肝脏、胃肠道和胆管癌，肝纤维化，由甲氨蝶呤、异烟肼、酚丁、甲基多巴、冬眠灵、甲苯磺丁脲、或胺碘酮诱导的肝病；自身免疫性肝炎；结节病、威尔森氏病、血色素沉着病、戈谢病，III、IV、VI、IX和X型糖原贮积病，α1-抗胰蛋白酶缺乏、脑肝肾综合征；酪氨酸血症、果糖血症、半乳糖血症，与巴德-吉亚利综合征、静脉闭塞性疾病、或门静脉血栓形成相关的血管紊乱；以及先天性肝纤维化。通过FXR活化治疗的疾病或病症的实例还包括高血糖症、糖尿病、肥胖症、胰岛素耐受性、高血脂症、高LDL-胆固醇、高HDL-胆固醇、高甘油三酯、以及心血管疾病。

[0079] NAFLD由肝脏中的脂肪堆积(被称为脂肪浸润)的医学病症表征。NAFLD是慢性肝病的最常见病因之一，并且涵盖与肝细胞中的脂质沉积相关的一系列病症。它在从脂肪变性(单纯性脂肪肝)至非酒精性脂肪性肝炎(NASH)至晚期纤维化和肝硬化的范围内。该疾病通常是沉默的并且经常是通过偶然升高的肝酶水平而发现的。NAFLD与肥胖症和胰岛素耐受性密切相关并且目前被许多人认为是代谢综合征的肝组分。

[0080] 非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是造成肝中的炎症以及脂肪和纤维(瘢痕)组织积累的一种病症。血液中的肝酶水平可能比在非酒精性脂肪肝(NAFL)情况下观察到的轻微升高更高。虽然类似的病症可以在酗酒的人中发生，但NASH在很少喝酒至不喝酒的那些人中发生。NASH影响2％至5％的美国人，并且最频繁发现于具有一种或多种以下病症的人中：肥胖症、糖尿病、高血脂症、胰岛素耐受性、某些药剂的使用、以及暴露于毒素。NASH是世界范围内慢性肝病的越来越常见的病因，并且与增加的肝相关死亡率和肝细胞癌相关(即使在不存在肝硬化的情况下)。NASH在15％–20％的受影响的个体中进展至肝硬化并且现在是美国的肝移植的主要适应症之一。目前，不存在用于NASH的经批准的疗法。

[0081] 本申请还提供了一种用于治疗或预防NAFLD或NASH的方法。在一个实例中，本申请提供了一种用于治疗或预防与血液中葡萄糖水平升高、胰岛素分泌减少、和/或胰岛素敏感度降低相关的NAFLD或NASH的方法。在一个实例中，本申请提供了一种用于至少部分通过降低血液中的葡萄糖水平和/或增加胰岛素分泌和/或胰岛素敏感度来治疗或预防NAFLD或NASH的方法。在一个实例中，本申请提供了一种用于治疗或预防NASH的方法。在一个实例中，本申请提供了一种用于治疗或预防与血液中葡萄糖水平升高、胰岛素分泌减少、和/或胰岛素敏感度降低相关的NASH的方法。在一个实例中，本申请提供了一种用于至少部分通过降低血液中的葡萄糖水平和/或增加胰岛素分泌和/或胰岛素敏感度来治疗或预防或NASH的方法。

[0082] 在一个实例中，该疾病或病症与血液中葡萄糖水平升高、胰岛素分泌减少、和/或胰岛素敏感度降低相关。该疾病或病症的实例包括但不限于FXR介导的疾病(例如，NAFLD和NASH)、高血糖症、糖尿病、肥胖症、以及胰岛素耐受性。

[0083] 在一个实例中，该疾病或病症是FXR介导的疾病。在一个实例中，该疾病或病症是NAFLD或NASH。在一个实例中，该疾病或病症是NASH。

[0084] 在一个实例中，该疾病或病症是高血糖症、糖尿病、肥胖症、或胰岛素耐受性。在一个实例中，该疾病或病症是高血糖症。在一个实例中，该疾病或病症是糖尿病。在另一个实例中，这些糖尿病是I型糖尿病。在另一个实例中，这些糖尿病是II型糖尿病。在一个实例中，该疾病或病症是肥胖症。在一个实例中，该疾病或病症是胰岛素耐受性。

[0085] 本申请还提供一种用于治疗或预防高血糖症、糖尿病、肥胖症、或胰岛素耐受性的方法，该方法包括向对其有需要的受试者给予治疗有效量的本申请的药物组合物。在一个实例中，该受试者不患有胆汁淤积性病症。在另一个实例中，该受试者患有胆汁淤积性病症。在一个实例中，该受试者不患有肝病。在另一个实例中，该受试者患有肝病。在另一个实例中，该肝病选自胆汁淤积性肝病(诸如PBC、PSC)、门静脉高压、胆汁酸性腹泻、由于进行性纤维化引起的肝损伤、肝纤维化、以及慢性肝病。在另一个实例中，该受试者患有PBC、NAFLD、或NASH。在另一个实例中，该受试者患有纤维化。在另一个实例中，该受试者患有非胆汁淤积性肝病或病症，诸如非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、丙型肝炎感染、酒精性肝病、由于进行性纤维化引起的肝损伤，诸如肝细胞癌、胆管癌、结肠直肠癌、胃癌、以及肾癌的肝脏、胃肠道和胆管癌，肝纤维化，由甲氨蝶呤、异烟肼、酚丁、甲基多巴、冬眠灵、甲苯磺丁脲、或胺碘酮诱导的肝病；自身免疫性肝炎；结节病、威尔森氏病、血色素沉着病、戈谢病，III、IV、VI、IX和X型糖原贮积病，α1-抗胰蛋白酶缺乏、脑肝肾综合征；酪氨酸血症、果糖血症、半乳糖血症，与巴德-吉亚利综合征、静脉闭塞性疾病、或门静脉血栓形成相关的血管紊乱；以及先天性肝纤维化。

[0086] 本申请还提供一种用于降低血液中葡萄糖水平、刺激胰岛素分泌、和/或提高胰岛素敏感度的方法，该方法包括向对其有需要的受试者给予治疗有效量的本申请的药物组合物。在一个实例中，该受试者不患有胆汁淤积性病症。在另一个实例中，该受试者患有胆汁淤积性病症。在一个实例中，该受试者不患有肝病。在另一个实例中，该受试者患有肝病。在另一个实例中，该肝病选自胆汁淤积性肝病(诸如PBC、PSC)、门静脉高压、胆汁酸性腹泻、慢性肝病、NAFLD、NASH、丙型肝炎、酒精性肝病、由于进行性纤维化引起的肝损伤、肝纤维化、以及慢性肝病。在另一个实例中，该受试者患有PBC、NAFLD、或NASH。在另一个实例中，该受试者患有纤维化。在另一个实例中，该受试者患有非胆汁淤积性肝病或病症，诸如非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、丙型肝炎感染、酒精性肝病、由于进行性纤维化引起的肝损伤，诸如肝细胞癌、胆管癌、结肠直肠癌、胃癌、以及肾癌的肝脏、胃肠道和胆管癌，肝纤维化，由甲氨蝶呤、异烟肼、酚丁、甲基多巴、冬眠灵、甲苯磺丁脲、或胺碘酮诱导的肝病；自身免疫性肝炎；结节病、威尔森氏病、血色素沉着病、戈谢病，III、IV、VI、IX和X型糖原贮积病，α1-抗胰蛋白酶缺乏、脑肝肾综合征；酪氨酸血症、果糖血症、半乳糖血症，与巴德-吉亚利综合征、静脉闭塞性疾病、或门静脉血栓形成相关的血管紊乱；和先天性肝纤维化。

[0087] 本申请还提供了一种用于抑制或逆转纤维化的方法，该方法包括向对其有需要的受试者给予治疗有效量的本申请的药物组合物。在一个实例中，该受试者不患有胆汁淤积性病症。在另一个实例中，该受试者患有胆汁淤积性病症。

[0088] 在一个实例中，被给予治疗有效量的本申请的药物组合物的受试者不患有与选自下组的疾病或病症相关的胆汁淤积性病症，该组由以下各项组成：原发性肝癌和胆管癌(诸如肝细胞癌)、结肠直肠癌、和胆管癌、转移性癌症、败血症、慢性肠胃外全面营养、囊胞性纤维症、以及肉芽肿性肝病。在一个实例中，待抑制或逆转的纤维化发生在表达FXR的器官中。

[0089] 在一个实例中，胆汁淤积性病症被定义为具有碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转肽酶(GGT)、和/或5’核苷酸酶的异常升高的血清水平。在另一个实例中，胆汁淤积性病症被进一步定义为呈现至少一种临床症状。在一个实例中，该症状是发痒(瘙痒)。在另一个实例中，胆汁淤积性病症选自下组，该组由以下各项组成：原发性胆汁性肝硬化(PBC)、原发性硬化性胆管炎(PSC)、药物诱导性胆汁淤积、遗传性胆汁淤积、以及妊娠肝内胆汁淤积症。

[0090] 在一个实例中，该纤维化选自下组，该组由以下各项组成：肝纤维化、肾纤维化、和肠纤维化。

[0091] 在一个实例中，被给予治疗有效量的本申请的药物组合物的受试者患有与选自下组的疾病相关的肝纤维化，该组由以下各项组成：乙型肝炎；丙型肝炎；寄生虫肝病；移植后细菌、病毒和真菌感染；酒精性肝病(ALD)；非酒精性脂肪肝病(NAFLD)；非酒精性脂肪性肝炎(NASH)；由甲氨蝶呤、异烟肼、酚丁、甲基多巴、冬眠灵、甲苯磺丁脲、或胺碘酮诱导的肝病；自身免疫性肝炎；结节病；威尔森氏病；血色沉着病；戈谢病；III、IV、VI、IX和X型糖原贮积病α1-抗胰蛋白酶缺乏；脑肝肾综合征；酪氨酸血症；果糖血症；半乳糖血症；与巴德-吉亚利综合征、静脉闭塞性疾病、或门静脉血栓形成有关的血管紊乱；以及先天性肝纤维化。

[0092] 在另一个实例中，该受试者患有与选自下组的疾病相关的肠纤维化，该组由以下各项组成：克罗恩病、溃疡性结肠炎、放疗后结肠炎、以及微观结肠炎。

[0093] 在另一个实例中，该患者患有与选自下组的疾病相关的肾纤维化，该组由以下各项组成：糖尿病肾病、高血压性肾硬化、慢性肾小球肾炎、慢性移植肾小球病、慢性间质性肾炎、以及多囊肾病。

[0094] 在另一个实例中，被给予治疗有效量的本申请的药物组合物的受试者患有与选自下组的疾病相关的肠纤维化，该组由以下各项组成：克罗恩病、溃疡性结肠炎，放疗后结肠炎、以及微观结肠炎。

[0095] 在另一个实例中，被给予治疗有效量的本申请的药物组合物的受试者患有与选自下组的疾病相关的肾纤维化，该组由以下各项组成：糖尿病肾病、高血压性肾硬化、慢性肾小球肾炎、慢性移植肾小球病、慢性间质性肾炎、以及多囊肾病。

[0096] 本申请还提供了一种用于减少血清胆红素和/或一种或多种肝酶的量的方法，该方法包括向对其有需要的受试者给予治疗有效量的本申请的药物组合物。

[0097] 在一个实例中，相比于对照受试者(例如，未给予本申请的组合物的受试者)，本申请的方法使血清胆红素的量降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％。在一个实例中，相比于健康受试者(例如，没有疾病或病症(诸如在此所述的那些)的个体)，该受试者具有升高的胆红素水平。在一个实例中，本申请的方法使胆红素的水平降低到一个正常水平(例如，类似于没有疾病或病症(如在此所述的那些)的个体中的胆红素的水平)。在另一个实例中，本申请的方法使胆红素的水平降低到10mg/L、9mg/L、8mg/L、
7mg/L、6mg/L、5mg/L、4mg/L、3mg/L、2mg/L、1.5mg/L、1.2mg/L、或1mg/L以下。在另一个实例中，本申请的方法使胆红素的水平降低到2mg/L、1.5mg/L、1.2mg/L、或1mg/L以下。

[0098] 在一个实例中，肝酶选自下组，该组由以下各项组成：碱性磷酸酶(ALP、AP或Alk Phos)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、γ-谷氨酰转肽酶(GGT)、乳酸脱氢酶(LDH)、以及5’核苷酸酶。在一个实例中，相比于对照受试者(例如，未给予本申请的组合物的受试者)，本申请的方法使一种或多种肝酶的量减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％。在一个实例中，相比于健康受试者(例如，没有疾病或病症(诸如在此所述的那些)的个体)，该受试者具有升高的一种或多种肝酶水平。在一个实例中，本申请的方法使一种或多种肝酶(例如，ALP、ALT、AST、GGT、LDH、以及5’核苷酸酶)的水平降低到正常水平(例如，类似于没有疾病或病症(如在此所述的那些)的个体中的肝酶的水平)。

[0099] 在另一个实例中，本申请的方法使ALP的血清水平降低到500IU/L(国际单位/升)、400IU/L、300IU/L、200IU/L、180IU/L、160IU/L、或150IU/L以下。在另一个实例中，本申请的方法使ALP的水平降低到从约40IU/L至约150IU/L。

[0100] 在另一个实例中，本申请的方法使ALT的水平降低到200IU/L(国际单位/升)、150IU/L、100IU/L、80IU/L、60IU/L、或50IU/L以下。在另一个实例中，本申请的方法使ALT的水平降低到从约5IU/L至约50IU/L。

[0101] 在另一个实例中，本申请的方法使AST的水平降低到200IU/L(国际单位/升)、150IU/L、100IU/L、80IU/L、60IU/L、50IU/L、或40IU/L以下。在另一个实例中，本申请的方法使AST的水平降低到从约10IU/L至约50IU/L。

[0102] 在另一个实例中，本申请的方法使GGT的水平降低到200IU/L(国际单位/升)、150IU/L、100IU/L、90IU/L、80IU/L、70IU/L、或60IU/L以下。在另一个实例中，本申请的方法使GGT的水平降低到从约15IU/L至约50IU/L或从约5IU/L至约30IU/L。

[0103] 在另一个实例中，本申请的方法使LDH的水平降低到500IU/L(国际单位/升)、400IU/L、300IU/L、200IU/L、180IU/L、160IU/L、150IU/L、140IU/L、或130IU/L以下。在另一个实例中，本申请的方法使LDH的水平降低到从约120IU/L至约220IU/L。

[0104] 在另一个实例中，本申请的方法使5’核苷酸酶的水平降低到50IU/L(国际单位/升)、40IU/L、30IU/L、20IU/L、18IU/L、17IU/L、16IU/L、15IU/L、14IU/L、13IU/L、12IU/L、11IU/L、10IU/L、9IU/L、8IU/L、7IU/L、6IU/L、或5IU/L以下。在另一个实例中，本申请的方法使5’核苷酸酶的水平降低到从约2IU/L至约15IU/L。

[0105] 本申请还提供了一种用于降低诸如血液中的葡萄糖水平(即葡萄糖的量)的方法，该方法包括向对其有需要的受试者给予治疗有效量的本申请的药物组合物。在一个实例中，相比于对照受试者(例如，未给予本申请的组合物的受试者)，该方法使餐后葡萄糖水平降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％。在一个实例中，相比于健康受试者(例如，没有疾病或病症(诸如在此所述的那些)的个体)，该受试者具有升高的餐后葡萄糖水平。在一个实例中，本申请的方法使餐后葡萄糖水平降低到正常水平(例如，类似于没有疾病或病症(如在此所述的那些)的个体中的葡萄糖水平)。在一个实例中，相比于对照受试者(例如，未给予本申请的组合物的受试者)，该方法使空腹葡萄糖水平降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％。在一个实例中，相比于健康受试者(例如，没有疾病或病症(诸如在此所述的那些)的个体)，该受试者具有升高的空腹葡萄糖水平。在一个实例中，本申请的方法使空腹葡萄糖水平降低到正常水平(例如，类似于没有疾病或病症(如在此所述的那些)的个体中的葡萄糖水平)。

[0106] 在一个实例中，相比于健康受试者(例如，没有疾病或病症(诸如在此所述的那些)的个体)，该受试者具有升高的葡萄糖水平。在一个实例中，本申请的方法使餐后葡萄糖水平降低到800mg/L、700mg/L、600mg/L、500mg/L、400mg/L、350mg/L、300mg/L、250mg/L、240mg/L、230mg/L、220mg/L、210mg/L、200mg/L、190mg/L、180mg/L、170mg/L、160mg/L、或
150mg/L以下。在一个实例中，本申请的方法使餐后葡萄糖水平降低到200mg/L、190mg/L、
180mg/L、170mg/L、160mg/L、或150mg/L以下。在一个实例中，本申请的方法使空腹葡萄糖水平降低到70-800mg/L、70-700mg/L、70-600mg/L、70-500mg/L、70-400mg/L、70-350mg/L、70-
300mg/L、70-250mg/L、70-240mg/L、70-230mg/L、70-220mg/L、70-210mg/L、70-200mg/L、70-
190mg/L、70-180mg/L、70-170mg/L、70-160mg/L、70-150mg/L、70-140mg/L、70-130mg/L、70-
120mg/L、70-110mg/L、70-100mg/L、90-130mg/L、90-120mg/L、90-110mg/L、或90-100mg/L。
在一个实例中，本申请的方法使餐后葡萄糖水平降低到70-200mg/L、70-190mg/L、70-
180mg/L、70-170mg/L、70-160mg/L、70-150mg/L、70-140mg/L、70-130mg/L、70-120mg/L、70-
110mg/L、70-100mg/L、90-130mg/L、90-120mg/L、90-110mg/L、或90-100mg/L。

[0107] 本申请还提供了一种用于降低诸如血液中的血红蛋白A1c(HbA1c)水平(即HbA1c的量)的方法，该方法包括向对其有需要的受试者给予治疗有效量的本申请的药物组合物。在一个实例中，相比于对照受试者(例如，未给予本申请的组合物的受试者)，该方法使HbA1c水平降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％。在一个实例中，相比于健康受试者(例如，没有疾病或病症(诸如在此所述的那些)的个体)，该受试者具有升高的HbA1c水平。在一个实例中，本申请的方法使HbA1c水平降低到正常水平(例如，类似于没有疾病或病症(如在此所述的那些)的个体中的HbA1c水平)。

[0108] 在一个实例中，相比于健康受试者(例如，没有疾病或病症(诸如在此所述的那些)的个体)，该受试者具有升高的HbA1c水平。在一个实例中，本申请的方法使HbA1c水平降低到10％、9.5％、9.0％、8.5％、8.0％、7.5％、7.0％、6.5％、6.4％、6.3％、6.2％、6.1％、6.0％、5.9％、5.8％、或5.7％以下。在一个实例中，本申请的方法使HbA1c水平降低到
8.0％、7.9％、7.8％、7.7％、7.6％、7.5％、7.4％、7.3％、7.2％、7.1％、7.0％、6.9％、
6.8％、6.7％、6.6％、6.5％、6.4％、6.3％、6.2％、6.1％、6.0％、5.9％、5.8％、或5.7％以下。在一个实例中，本申请的方法使HbA1c水平降低到6.5％、6.4％、6.3％、6.2％、6.1％、
6.0％、5.9％、5.8％、或5.7％以下。

[0109] 本申请还提供一种用于增加胰岛素分泌(即，胰岛素的量)的方法，该方法包括向对其有需要的受试者给予治疗有效量的本申请的药物组合物。在一个实例中，相比于对照受试者(例如，未给予本申请的组合物的受试者)，本申请的方法使胰岛素分泌增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％。在一个实例中，相比于健康受试者(例如，没有疾病或病症(诸如在此所述的那些)的个体)，该受试者具有减少的胰岛素分泌。
在一个实例中，本申请的方法增加胰岛素分泌，使得胰岛素水平为2-9.0mIU/mL、2-8.9mIU/mL、2-8.8mIU/mL、2-8.7mIU/mL、2-8.6mIU/mL、2-8.5mIU/mL、2-8.4mIU/mL、2-8.3mIU/mL、2-
8.2mIU/mL、2-8.1mIU/mL、2-8.0mIU/mL、2-7.9mIU/mL、2-7.8mIU/mL、2-7.7mIU/mL、2-
7.6mIU/mL、2-7.5mIU/mL、2-7.4mIU/mL、2-7.3mIU/mL、2-7.2mIU/mL、2-7.1mIU/mL、2-
7.0mIU/mL、2-6.9mIU/mL、2-6.8mIU/mL、2-6.7mIU/mL、2-6.6mIU/mL、2-6.5mIU/mL、2-
6.4mIU/mL、2-6.3mIU/mL、2-6.2mIU/mL、2-6.1mIU/mL、2-6.0mIU/mL、3-9.0mIU/mL、3-
8.9mIU/mL、3-8.8mIU/mL、3-8.7mIU/mL、3-8.6mIU/mL、3-8.5mIU/mL、3-8.4mIU/mL、3-
8.3mIU/mL、3-8.2mIU/mL、3-8.1mIU/mL、3-8.0mIU/mL、3-7.9mIU/mL、3-7.8mIU/mL、3-
7.7mIU/mL、3-7.6mIU/mL、3-7.5mIU/mL、3-7.4mIU/mL、3-7.3mIU/mL、3-7.2mIU/mL、3-
7.1mIU/mL、3-7.0mIU/mL、3-6.9mIU/mL、3-6.8mIU/mL、3-6.7mIU/mL、3-6.6mIU/mL、3-
6.5mIU/mL、3-6.4mIU/mL、3-6.3mIU/mL、3-6.2mIU/mL、3-6.1mIU/mL、3-6.0mIU/mL、4-
9.0mIU/mL、4-8.9mIU/mL、4-8.8mIU/mL、4-8.7mIU/mL、4-8.6mIU/mL、4-8.5mIU/mL、4-
8.4mIU/mL、4-8.3mIU/mL、4-8.2mIU/mL、4-8.1mIU/mL、4-8.0mIU/mL、4-7.9mIU/mL、4-
7.8mIU/mL、4-7.7mIU/mL、4-7.6mIU/mL、4-7.5mIU/mL、4-7.4mIU/mL、4-7.3mIU/mL、4-
7.2mIU/mL、4-7.1mIU/mL、4-7.0mIU/mL、4-6.9mIU/mL、4-6.8mIU/mL、4-6.7mIU/mL、4-
6.6mIU/mL、4-6.5mIU/mL、4-6.4mIU/mL、4-6.3mIU/mL、4-6.2mIU/mL、4-6.1mIU/mL、4-
6.0mIU/mL、5-9.0mIU/mL、5-8.9mIU/mL、5-8.8mIU/mL、5-8.7mIU/mL、5-8.6mIU/mL、5-
8.5mIU/mL、5-8.4mIU/mL、5-8.3mIU/mL、5-8.2mIU/mL、5-8.1mIU/mL、5-8.0mIU/mL、5-
7.9mIU/mL、5-7.8mIU/mL、5-7.7mIU/mL、5-7.6mIU/mL、5-7.5mIU/mL、5-7.4mIU/mL、5-
7.3mIU/mL、5-7.2mIU/mL、5-7.1mIU/mL、5-7.0mIU/mL、5-6.9mIU/mL、5-6.8mIU/mL、5-
6.7mIU/mL、5-6.6mIU/mL、5-6.5mIU/mL、5-6.4mIU/mL、5-6.3mIU/mL、5-6.2mIU/mL、5-
6.1mIU/mL、或5-6.0mIU/mL。

[0110] 本申请还提供一种用于提高胰岛素敏感度(即，减少胰岛素耐受性)的方法，该方法包括向对其有需要的受试者给予治疗有效量的本申请的药物组合物。在一个实例中，相比于对照受试者(例如，未给予本申请的组合物的受试者)，本申请的方法使胰岛素敏感度提高(即，减少胰岛素耐受性)至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％。在一个实例中，相比于健康受试者(例如，没有疾病或病症(诸如在此所述的那些)的个体)，该受试者具有降低的胰岛素敏感度(即，增加的胰岛素耐受性)。

[0111] 胰岛素敏感度是指身体对胰岛素的影响有多敏感。被说成胰岛素敏感的个体将需要与具有低敏感度的人相比更少量的胰岛素来降低血糖水平。

[0112] 胰岛素耐受性(IR)是其中细胞、组织、或器官不能响应于胰岛素的正常行为的生理条件。因此，身体中的细胞组织、或器官变得对胰岛素具有耐受性，并且不能像正常细胞、组织、或器官(例如，健康受试者的细胞、组织、或器官)那样有效地使用胰岛素。

[0113] 在一个实例中，该受试者是哺乳动物。在一个实例中，该哺乳动物是人。

[0114] 在一个实例中，第一化合物和一种另外的治疗剂(例如，在此所述的另外的治疗剂)以双向组合给予。在另一个实例中，第一化合物和两种或更多种另外的治疗剂(例如，在此所述的另外的治疗剂)以双向组合给予。

[0115] 第一化合物与至少一种另外的治疗剂(例如，在此所述的另外的治疗剂)一起可以实现协同效应，诸如可能对单独疗法具有耐受性的葡萄糖水平、HbA1c水平、和/或胰岛素耐受性的协同降低。因此，第一化合物和至少一种另外的治疗剂(例如，在此所述的另外的治疗剂)的组合是有利的。该第一化合物和该至少一种另外的治疗剂(例如，在此所述的另外的治疗剂)的组合提供在被设计为提高依从性且因此提高有效性的具有药学上可接受的载体的单一药物组合物(诸如呈单一胶囊形式)中可以是特别有利的。因此，本申请进一步提供了一种药物组合物，该药物组合物包含有效量的第一化合物和有效量的至少一种另外的治疗剂(例如，在此所述的另外的治疗剂)，连同一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂、佐剂或赋形剂。

[0116] 在一个实例中，第一化合物和至少一种另外的治疗剂(例如，在此所述的另外的治疗剂)同时给予。例如，第一化合物和至少一种另外的治疗剂(例如，在此所述的另外的治疗剂)在具有药学上可接受的载体的单一药物组合物中一起给予。在另一个实例中，第一化合物和至少一种另外的治疗剂(例如，在此所述的另外的治疗剂)顺序地给予。例如，第一化合物在至少一种另外的治疗剂(例如，在此所述的另外的治疗剂)之前或之后给予。

[0117] 在一个实例中，以第一剂量给予该第一化合物持续第一时间段，接着以第二剂量给予该第一化合物持续第二时间段。在一个实例中，以从0.1-1500mg、0.2-1200mg、0.3-1000mg、0.4-800mg、0.5-600mg、0.6-500mg、0.7-400mg、0.8-300mg、1-200mg、1-100mg、1-
50mg、1-30mg、4-26mg、或5-25mg的每日总量给予第一化合物或其药学上可接受的盐或氨基酸缀合物持续第一时间段，接着以从0.1-1500mg、0.2-1200mg、0.3-1000mg、0.4-800mg、
0.5-600mg、0.6-500mg、0.7-400mg、0.8-300mg、1-200mg、1-100mg、1-50mg、1-30mg、4-26mg、或5-25mg的每日总量给予第二化合物。在一个实例中，该总量是每日一次口服给予的。在一个实例中，第一剂量与第二剂量不同。在另一个实例中，第一剂量低于第二剂量。在另一个实例中，第一剂量高于第二剂量。在一个实例中，第一剂量是约5mg(例如，从4.8mg至
5.2mg)，并且第二剂量是约10mg(例如，从9.8mg至10.2mg)。在一个实例中，第一时间段是约
6个月。在一个实例中，第二时间段是约6个月。

[0118] 在一个实例中，该药物组合物是口服、胃肠外或局部给予的。在另一个实例中，该药物组合物是口服给予的。

[0119] 根据本申请的组合物典型地将含有足够的第一化合物或其药学上可接受的盐或氨基酸缀合物、至少一种另外的治疗剂(例如，在此所述的另外的治疗剂)，以允许各自的所希望的每日剂量以单一单位剂型(诸如片剂或胶囊)或以同时或在一天过程中的间隔时间给予的两个或更多个单位剂型给予至对其有需要的受试者。

[0120] 在本申请的方法中，活性物质可以按单次每日剂量或按每日两个、三个、四个或更多个相同或不同的分次剂量给予，并且这些剂量可以同时或在一天过程中的不同时间给予。通常，这些活性物质将同时给予，更通常以单一组合剂型给予。

[0121] 在一个方面，将第一化合物和至少一种另外的治疗剂(例如，在此所述的另外的治疗剂)以与其在各自单一疗法中给予的剂量基本上相同的剂量给予。在一个方面，将该第一化合物以小于(例如，小于90％、小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、或小于10％)其单一疗法剂量的剂量给予。在一个方面，将该至少一种另外的治疗剂(例如，在此所述的另外的治疗剂)以小于(例如，小于90％、小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、或小于10％)其单一疗法剂量的剂量给予。在一个方面，将第一化合物和该至少一种另外的治疗剂(例如，在此所述的另外的治疗剂)两者以小于(例如，小于90％、小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、或小于10％)其各自的单一疗法剂量的剂量给予。

[0122] 本申请的药物组合物可以呈用于口服给予的任何方便的形式，诸如片剂、胶囊剂、散剂、锭剂、丸剂、糖锭、酏剂、冻干粉、溶液、颗粒剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、或酊剂。还可以制备缓释或延迟释放形式，例如呈包衣颗粒剂、多层片剂、胶囊内胶囊剂、胶囊内片剂、或微粒剂的形式。

[0123] 用于口服给予的固体形式可以含有药学上可接受的粘合剂、甜味剂、崩解剂、稀释剂、调味剂、包衣剂、防腐剂、润滑剂和/或延时剂。适合的粘合剂包括阿拉伯胶、明胶、玉米淀粉、黄蓍胶、海藻酸钠、羧甲基纤维素或聚乙二醇。适合的甜味剂包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、阿斯巴甜或糖精。适合的崩解剂包括玉米淀粉、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、黄原胶、膨润土、海藻酸或琼脂。适合的稀释剂包括乳糖、山梨醇、甘露醇、右旋糖、高岭土、纤维素、碳酸钙、硅酸钙或磷酸二钙。适合的调味剂包括薄荷油、冬青油、樱桃、橙子或覆盆子调味剂。适合的包衣剂包括丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或其酯的聚合物或共聚物、蜡、脂肪醇、玉米蛋白、虫胶或谷蛋白。适合的防腐剂包括苯甲酸钠、维生素E、α-生育酚、抗坏血酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯或亚硫酸氢钠。适合的润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸、油酸钠、氯化钠或滑石。适合的延时剂包括单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。

[0124] 除了上述药剂以外，用于口服给予的液体形式还可以含有液体载体。适合的液体载体包括水、油类如橄榄油、花生油、芝麻油、葵花油、红花油、落花生油、椰子油、液体石蜡、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、乙醇、丙醇、异丙醇、甘油、脂肪醇、甘油三酯或其混合物。

[0125] 用于口服给予的混悬剂可以进一步包括分散剂和/或悬浮剂。适合的悬浮剂包括羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸钠或鲸蜡醇。适合的分散剂包括卵磷脂；脂肪酸如硬脂酸的聚氧乙烯酯；聚氧乙烯山梨醇单-或二-油酸酯、-硬脂酸酯或-月桂酸酯；聚氧乙烯脱水山梨醇单-或二-油酸酯、-硬脂酸酯或-月桂酸酯等。

[0126] 用于口服给予的乳剂可以进一步包括一种或多种乳化剂。适合的乳化剂包括如上文例示的分散剂或天然树胶，如阿拉伯胶或黄蓍胶。

[0127] 本申请的药物组合物可以通过掺混、研磨、均质化、悬浮、溶解、乳化、分散和/或混合该第一化合物或其药学上可接受的盐或氨基酸缀合物、以及至少一种另外的治疗剂，连同选定的一种或多种赋形剂、一种或多种载体、一种或多种佐剂和/或一种或多种稀释剂来制备。本申请的呈片剂或胶囊剂形式的一种类型的药物组合物可以通过以下方式来制备：(a)制备第一片剂，该第一片剂包含选自该第一化合物或其药学上可接受的盐或氨基酸缀合物的活性物质中的至少一种、以及至少一种另外的治疗剂、连同任何所希望的一种或多种赋形剂、一种或多种载体、一种或多种佐剂和/或一种或多种稀释剂；并且(b)制备第二片剂或胶囊剂，其中该第二片剂或该胶囊剂包含剩余的一种或多种活性物质和该第一片剂。
本申请的呈胶囊剂形式的一种类型的药物组合物可以通过以下方式来制备：(a)制备第一胶囊剂，该第一胶囊剂包含选自该第一化合物或其药学上可接受的盐或氨基酸缀合物的活性物质中的至少一种、以及一种或多种另外的治疗剂、连同任何所希望的一种或多种赋形剂、一种或多种载体、一种或多种佐剂和/或一种或多种稀释剂；并且(b)制备第二胶囊剂，其中该第二胶囊剂包含剩余的一种或多种活性物质和该第一胶囊剂。本申请的呈片剂形式的另外的类型的药物组合物可以通过以下方式来制备：(a)制备一种胶囊剂，该胶囊剂包含选自第一化合物或其药学上可接受的盐或氨基酸缀合物的活性物质中的至少一种、以及至少一种另外的治疗剂、连同任何所希望的一种或多种赋形剂、一种或多种载体、一种或多种佐剂和/或一种或多种稀释剂；并且(b)制备一种片剂，其中该片剂包含剩余的一种或多种活性物质和该胶囊剂。

[0128] 在实例中，至少一种另外的治疗剂(例如，在此所述的另外的治疗剂)被用作立即释放片剂或持续释放片剂。当提供在持续释放片剂中时它是特别有效的。不同的另外的治疗剂的持续释放片剂是可商购获得的。片剂呈持续释放形式的延长作用是优选的。

[0129] 在另一个实例中，本申请的药物组合物包含在含有第一化合物或其药学上可接受的盐或氨基酸缀合物的胶囊中含有至少一种另外的治疗剂(例如，在此所述的另外的治疗剂)的胶囊。典型地以这种形式，至少一种另外的治疗剂(例如，在此所述的另外的治疗剂)以立即释放形式呈现。在该事件中，通常每日给予该组合物三次。另一种给予方式是每日两次提供如上所述呈持续释放形式或非持续释放形式的含有至少一种另外的治疗剂(例如，在此所述的另外的治疗剂)的组合物，其中所给予的该组合物的每日量包含足够量的活性物质以向患者提供所希望的每日剂量。

[0130] 在一个实例中，本申请的药物组合物是以从0.1-1500mg、0.2-1200mg、0.3-1000mg、0.4-800mg、0.5-600mg、0.6-500mg、0.7-400mg、0.8-300mg、1-200mg、1-100mg、1-
50mg、1-30mg、4-26mg、或5-25mg的每日总量的包含第一化合物或其药学上可接受的盐或氨基酸缀合物的剂型。

[0131] 本申请的药物组合物可以由患者终身使用并且延长生存期。血液中葡萄糖的降低、胰岛素分泌的增加、和/或胰岛素耐受性的减少确保相关疾病(诸如糖尿病和肥胖症)的发展减少。第一化合物和至少一种另外的治疗剂(例如，在此所述的另外的治疗剂)的组合可能是用于具有高血糖症的原发性胆汁性肝硬化(PBC)和用于抵抗原发性胆汁性肝硬化(PBC)的选择的疗法。由于由本申请提供的简化给药，本申请的组合疗法可能取决于患者的体重和临床反应以增加的剂量使用。

[0132] 在此披露的第一化合物可以通过常规方法(例如，在美国公开号2009/0062526、美国专利号7,138,390和WO 2006/122977中描述的那些)，如通过6步骤合成、接着一个纯化步骤来制备，以产生高度纯的化合物1(奥贝胆酸或OCA)，如以下方案1中所示。

[0133] 方案1

[0134]

[0135] 以上方法描述于WO 2013/192097中，该专利的内容通过引用以其全文结合在此。该方法是6步骤合成、接着一个纯化步骤。步骤1是在酸性催化和加热存在下，使用甲醇酯化
7-酮基石胆酸(KLCA)的C-24 羧酸，以产生甲基酯化合物a。步骤2是使用强碱从化合物1形成硅烯醇醚，接着用氯硅烷处理以产生化合物c。步骤3是硅烯醇醚化合物c和乙醛的醛醇缩合反应，以产生化合物d。步骤4是化合物d的C-24甲酯皂化，以产生化合物e。步骤5是化合物e的6-亚乙基部分氢化，以产生化合物f。步骤6是化合物f的7-酮基基团选择性还原成7α-羟基基团，以产生结晶化合物1。步骤7是结晶化合物转化为化合物1(奥贝胆酸形式1或OCA形式1)。

[0136] 本申请的药物组合物的生物和/或治疗活性可以通过本领域已知的常规方法测量。在不限制本申请的披露的情况下，在此提供了一些适合的方法。

[0137] 肝细胞的分离

[0138] 可以使用两步骤原位胶原酶灌注方法来分离肝细胞。从适合的动物(例如，小鼠、大鼠、兔、猪)分离肝细胞。在适当灌注之后，将肝解剖并且转移至灌注缓冲液中。将所得细胞悬浮液过滤并且收集。分离肝细胞(例如，通过使用Percoll密度离心技术)。

[0139] 肝细胞的夹层培养

[0140] 将分离的肝细胞在涂覆胶原的组织培养板上培养，并且维持在补充有血清、青霉素、链霉素、表皮生长因子、胰岛素、胰高血糖素、以及氢化可的松的培养基中。对于夹层系统，将一种另外的胶原凝胶溶液分布在这些细胞上。将这些培养板在37℃下孵育以便允许该第二凝胶层的凝胶化和附着。每日更换培养基并且储存在-20℃下用于进一步分析。将本申请的药物组合物应用于肝细胞，并且随后测量对细胞的作用。

[0141] 肝细胞悬浮培养物

[0142] 在分离后立即将肝细胞洗涤并且再悬浮。在不存在或存在本申请的药物组合物的情况下培养悬浮的细胞。可以包括阳性对照(例如，在葡萄糖存在下培养的细胞)。

[0143] 在孵育期之后，将测定释放到培养基中的葡萄糖(例如，用使用Trinder测定试剂盒(西格马公司(Sigma))的葡萄糖-氧化酶法)。

[0144] 此外，在[5-3H]-葡萄糖存在下，在肝细胞孵育之后，可以将葡萄糖利用测定为氚化水的产生(对于脂肪酸氧化实验)。在使用或不使用胰岛素的情况下测定2-[3H]-脱氧葡萄糖的摄取(佩尔多莫(Perdomo)等人，生物化学期刊(J.Biol.Chem.)279,27177(2004))。可以在不存在或存在胰岛素的情况下测定D-[14C]-葡萄糖到糖原中的结合(佩尔多莫等人
2004)。HepG2细胞培养

[0145] 如所述地将人肝胚细胞瘤细胞(HepG2)在培养基中生长(王(Wang)等人，分子内分泌学(Mol.Endocrinol.)22,1622(2008))。第二天，用本申请的药物组合物处理细胞。在处理之后，用TPA、LPS或TNF-α处理细胞，并且然后收集用于RNA分离。

[0146] 将进行HepG2细胞的瞬时转染(例如，通过使用Lipofectamine 2000公司(英杰公司(Invitrogen)，卡尔斯巴德(Carlsbad)，加利福尼亚州)。在转染之后24小时，用本申请的药物组合物预处理细胞。随后用或不用LPS或TPA处理细胞。然后收获细胞，并且将使用双重荧光素酶报告基因测定系统来测定荧光素酶活性。

[0147] 小鼠模型

[0148] 在标准12:12小时光照/黑暗循环下，将小鼠(例如，野生型或FXR-/-)维持在无病原体的动物设施中。随意饲喂小鼠标准的啮齿动物食物和水。将小鼠禁食过夜，并且然后腹膜内注射单剂量的LPS或磷酸盐缓冲盐水(PBS)或本申请的药物组合物，接着随意饲喂水。在注射之后，将小鼠杀死，并且取出血液和肝脏用于进一步分析。所有程序均遵循国家卫生研究院关于实验动物护理和使用的指导方针。

[0149] MetS兔模型

[0150] 如前所述地获得HFD诱导的MetS兔模型(菲利皮(Filippi)等人，性医学杂志(J.Sexual Med.)6,3274(2009))。将雄性新西兰白兔随机编号并且分配至两个不同的组：饲喂对照饮食(CON)的未处理组，或饲喂HFD(例如，0.5％胆固醇和4％花生油)的处理组，持续12周。用本申请的药物组合物治疗HFD兔的亚组。

[0151] 在基线处和第12周获得血液样品。在处理12周之后，将兔子杀死，并且将肝、VAT(积累在肠环与肠系膜之间)、和胆囊的标本切除、称重、收集并且处理用于后续分析。还处理来自所有兔组的VAT样品用于分离前脂肪细胞。如前所述地进行生物化学和激素血清分析(菲利皮等人2009，莫雷利(Morelli)等人，类固醇生物化学和分子生物学杂志(J.Steroid Biochem.Mol.Biol.)132,80(2012)，维尼奥茨伊(Vignozzi)等人，内分泌学杂志(J.Endocrinology)212,71(2012))。

[0152] 为了评估MetS的影响，设计一种算法，该算法考虑了作为虚拟变量存在以下因素中的一个或多个：高血糖、高甘油三酯水平、高胆固醇水平、血压升高、以及内脏脂肪积累。如在CON兔中测量的，由分析参数的平均值±2S.D.导出每个因素的截断值。三个或更多个因素的正性表示MetS。

[0153] VAT的组织形态学分析

[0154] 如前所述，通过苏木精和伊红染色分析VAT标本以测量脂肪细胞直径(马内斯基(Maneschi)等人2012)。

[0155] 缺氧检测和免疫组织化学

[0156] 如前所述，在杀死之前使用腹膜内注射的生物还原药物盐酸哌莫硝唑来分析VAT氧合(马内斯基等人2012，莫雷利等人2012,2013，维尼奥茨伊等人2012)。

[0157] 总级分和膜/胞质级分的制备

[0158] 为了从VAT样品的蛋白质提取，将冷冻的组织在液氮中研磨，并且分为两个等分试样：一个用于总蛋白质提取，并且另一个用于膜/胞质制剂。制备膜和胞质级分。用BCA试剂(皮尔斯公司(Pierce)，罗克福德(Rockford)，美国伊利诺伊州)来定量蛋白质提取物，并且通过SDS-PAGE解析。如前所述地进行蛋白质印迹分析(马内斯基等人2012)。

[0159] 肝组织学

[0160] 通过肝切片的油红O染色评估肝脂肪变性。将冷冻切片在低温恒温器中切割并固定并且用油红O染色。在油红O染色之后，将切片洗涤，并且用苏木精和伊红染色以突出肝细胞核。最后，对这些切片进行拍照，并且在使用Adobe Photoshop 软件进行背景扣除之后，进行油红O正性的计算机辅助定量。

[0161] 肝切片中的炎症标志物的免疫组织化学

[0162] 将肝切片与抗不同炎症标志物(例如，TNFα、Cd68、Il-6、Il-1b、以及Il-12)的第一抗体孵育。将切片冲洗并且与生物素酰化的第二抗体孵育，并且然后与链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物一起孵育。用3',3'-二氨基联苯胺四盐酸盐作为色原体(西格玛-艾尔德里奇公司(Sigma–Aldrich))使反应产物显影。通过省略第一抗体进行对照实验。在使用Adobe Photoshop软件进行背景扣除之后，进行针对炎症标志物的染色的计算机辅助定量。

[0163] 兔内脏脂肪前脂肪细胞的分离、表征、和分化

[0164] 如前所述地进行从VAT中分离兔前脂肪细胞(rPAD)(马内斯基等人2012)。将细胞在完整的培养基中培养。使用P1培养物。如前所述，通过使用不同单克隆抗体(例如，CD34-PE、CD45-FITC、CD31-FITC、CD14-PE、CD90-PE、CD106-FITC、以及CD105-PE)的流式细胞术来表征rPAD(马内斯基等人2012)。在融合之后2天，通过将rPAD暴露于分化混合物(DIM)(例如，5％气提的FBS补充的DMEM中的含有5mg/ml胰岛素、1mM地塞米松、和0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)的混合物)来诱导它们的分化。

[0165] 葡萄糖摄取

[0166] 如前所述地测量rPAD的葡萄糖摄取(马内斯基等人2012)。将暴露于DIM的rPAD在无血清培养基中培养24小时，接着在浓度增加的胰岛素中孵育以评估胰岛素依赖性刺激。在孵育期结束时，将rPAD进一步与3H-2-脱氧-D-葡萄糖一起孵育。通过使用闪烁光谱法来测量合并的放射性。

[0167] 实验动物和饮食

[0168] 将动物在22℃下在12:12-小时光照-黑暗循环中单独圈养在标准笼子中。可以购买小鼠(例如，从杰克逊实验室(Jackson Laboratory)(巴港(Bar Harbour)，缅因州)。雄性GLP-1受体缺陷型(GLP-1RKO)小鼠来源于杂合配对(斯科洛奇(Scrocchi)等人，自然医学(Nat.Med.)2,1254(1996))。为了诱导NASH，测试了由高脂肪、高果糖、和高胆固醇构成的两种饮食，其中脂肪的来源将是反式脂肪或猪油。使用不含果糖或胆固醇的低脂肪饮食作为对照饮食。

[0169] 研究和药物给予

[0170] 为了表征NASH的发展，使Lepob/Lepob或B6小鼠维持低脂肪饮食(LFD)，高反式脂肪、高果糖、高胆固醇(HTF)饮食或高猪油脂肪、高果糖、高胆固醇饮食(HLF)饮食(例如，持续8或12周)。将小鼠皮下植入输送运载体(例如，无菌水中的50％DMSO)或本申请的药物组合物的单个渗透微型泵。另外地或可替代地，小鼠可具有经由口服管饲法每日一次给予的运载体或本申请的药物组合物。

[0171] 为了评估体重减轻对肝脏终点的影响，可以重复如上所述进行LFD或HTF饮食的Lepob/Lepob小鼠中的起始研究。在进行LFD或HTF饮食8周之后，将所有小鼠植入输送运载体或本申请的药物组合物的渗透微型泵。另外地或可替代地，小鼠可具有经由其他给予途径(诸如，口服管饲法)每日一次给予的运载体或本申请的药物组合物。将HTF组的一个亚组植入含有运载体的微型泵，并且限制卡路里以引起与在药物处理的小鼠中观察到的相似程度的体重减轻。

[0172] 肝组织的组织学和生物化学分析

[0173] 在终止时，将肝组织切除并且固定(例如，在10％中性缓冲福尔马林中)。将肝组织用石蜡包埋、切片并装载并且用苏木精和伊红染色。为了使纤维化可视化，用马森三色染液将另一组切片染色。将切片首先用魏格特氏铁苏木精染色，接着用比布里希猩红、磷钨酸/磷钼酸、以及苯胺蓝处理。使用靶向巨噬细胞标志物Mac-2的抗体来免疫染色第二组切片。由对处理条件不知情的病理学家进行所有组织学分析。

[0174] 血浆激素和代谢物分析

[0175] 测量血浆葡萄糖、甘油三酯、总胆固醇、ALT、以及天冬氨酸转氨酶(AST)水平(例如，通过使用Olympus AU400e生物分析仪(奥林巴斯美国诊断公司(Olympus America Diagnostics)，中心谷(Center Valley)，宾夕法尼亚州))。用PBS将血浆样品1:10稀释，用于检测标准曲线范围内的ALT和AST。测量总血浆脂联素(例如，根据制造商的说明书(密理博公司(Millipore)，比尔里卡(Billerica)，马萨诸塞州)使用可商购获得的ELISA)。

[0176] 定义

[0177] 为了方便起见，在此收集了在说明书、实例和所附权利要求书中使用的某些术语。

[0178] 如在此所用，术语“FXR激动剂”是指活化FXR的任何化合物。在一个方面，FXR激动剂相对于CDCA实现FXR的至少50％活化，这些测定方法中的适当的阳性对照描述于WO 2000/037077中。在另一个方面，FXR激动剂在如WO2000/037077中所述的闪烁迫近分析法或HTRF测定中实现FXR的100％活化。FXR激动剂的实例包括但不限于以下各项中所述的那些：
U.S.7,138,390；7,932,244；20120283234；20120232116；20120053163；20110105475；
20100210660；20100184809；20100172870；20100152166；20100069367；20100063018；
20100022498；20090270460；20090215748；20090163474；20090093524；20080300235；
20080299118；20080182832；20080039435；20070142340；20060069070；20050080064；
20040176426；20030130296；20030109467；20030003520；20020132223；以及20020120137。

[0179] 如在此所用，术语“奥贝胆酸”或“OCA”是指具有以下化学结构的化合物：

[0180]

[0181] 奥贝胆酸还被称为奥贝胆酸形式1、INT-747、3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷-24-酸、6α-乙基-鹅脱氧胆酸、6-乙基-CDCA、6ECDCA、胆烷-24-酸、6-乙基-3,7-二羟基-(3α,
5β,6α,7α)，并且可以通过在美国公开号2009/0062526 A1、美国专利号7,138,390、以及WO2006/122977中描述的方法来制备。奥贝胆酸的CAS登记号是459789-99-2。

[0182] 如在此所用，术语“结晶奥贝胆酸”是指具有以下化学结构的一种化合物的任何结晶形式：

[0183]

[0184] 结晶奥贝胆酸意指该化合物在三个空间维度中结晶成一种特定晶体堆积排列或该化合物具有外表面平面。奥贝胆酸的固体形式可以结晶成不同的晶体包装排列，其全部都具有奥贝胆酸的相同元素组成。不同晶体形式通常具有不同的X-射线衍射图案、红外光谱、熔点、密度硬度、晶体形状、光学和电学性质、稳定性、以及溶解度。重结晶溶剂、结晶速率、储存温度、以及其他因素可能造成一种晶体形式占优势。可以通过在不同条件(例如不同溶剂、温度等)下的结晶来制备奥贝胆酸的晶体。OCA结晶形式的实例在共同未决的美国公布号20130345188中有所描述。

[0185] 术语“第一化合物”意指具有化学式I的化合物或化合物1、或其药学上可接受的盐或氨基酸缀合物。每当该术语在本申请的上下文中使用时，应当理解的是提及游离碱、同位素标记的化合物、结晶化合物、或其相应药学上可接受的盐或氨基酸缀合物，条件是在这些情况下这样是可能的和/或适当的。

[0186] 如在此所用，术语“氨基酸缀合物”是指本申请的第一化合物(例如，具有化学式I的化合物)与任何适合的氨基酸的缀合物。例如，具有化学式I的化合物的这样的适合的氨基酸缀合物将具有在胆汁或肠液中完整性增强的附加优点。适合的氨基酸包括但不限于甘氨酸、肌氨酸、和牛磺酸。因此，本申请涵盖本申请的第一化合物(例如，化合物1)的甘氨酸、肌氨酸、和牛磺酸缀合物。

[0187] “治疗”包括导致疾患、疾病、障碍等的改善的任何效应，例如减轻、减少、调节、或消除。疾病状态的“治疗(Treating或treatment)”包括：抑制疾病状态，即阻止疾病状态或其临床症状的发展；或减轻疾病状态，即引起疾病状态或其临床症状的暂时或永久消退。

[0188] “预防”疾病状态包括使疾病状态的临床症状在可能暴露于或易患该疾病状态、但尚未经历或显示该疾病状态的症状的受试者中不发展。

[0189] 如在此所用的术语“抑制(inhibiting或inhibition)”是指对疾病或病症的发展或进展的任何可检测的积极效果。这样一种积极作用可以包括疾病或病症的至少一种症状或体征的发作的延迟或预防，该一种或多种症状或一种或多种体征的减轻或逆转，以及该一种或多种症状或一种或多种体征的进一步恶化的减慢或预防。

[0190] “疾病状态”意指任何疾病、障碍、病症、症状、或适应症。

[0191] 如在此所用的术语“有效量”或“治疗有效量”是指在适当剂量给予(单独或组合)后产生急性或慢性治疗效果的第一化合物(例如，FXR活化配体)或至少一种另外的治疗剂(例如，在此所述的另外的治疗剂)的量。在一个实例中，有效量或治疗有效量的第一化合物(例如，FXR活化配体)在与至少一种另外的治疗剂(例如，在此所述的另外的治疗剂)组合适当剂量给予后产生急性或慢性治疗效果。该作用包括疾病/病症(例如，肝、肾或肠的纤维化)以及达到任何可检测程度的相关并发症的症状、体征和潜在病理的预防、矫正、抑制、或逆转。“有效量”或“治疗有效量”将取决于第一化合物、另外的治疗剂(例如，在此所述的另外的治疗剂)、疾病及其严重程度、以及待治疗受试者的年龄、体重等而变化。

[0192] 治疗有效量的第一化合物可以与一种或多种另外的治疗剂(例如，在此所述的另外的治疗剂)、以及任选地一种或多种药学上可接受的载体一起配制用于给予至人或非人动物。因此，本申请的药物组合物可以例如经由口服、胃肠外或局部途径给予以提供有效量的第一化合物和另外的治疗剂(例如，在此所述的另外的治疗剂)。在替代性实例中，本申请的组合物可以用于涂覆或浸渍医疗装置，例如支架。

[0193] 如在此所用的“药理作用”涵盖了在实现疗法的预期目的的受试者中产生的作用。在一个实例中，药理作用意指预防、缓解、或减少被治疗的受试者的主要适应症。例如，药理作用将是产生所治疗的受试者中的主要适应症的预防、缓解或减少的一种药理作用。在另一个实例中，药理作用意指预防、缓解、或减少被治疗的受试者的主要适应症的障碍或症状。例如，药理作用将是产生所治疗的受试者的障碍或症状的预防、缓解或减少的一种药理作用。

[0194] 应当理解，除非另外说明，由不对称碳原子产生的异构体(例如，所有的对映异构体和非对映异构体)包括在本申请的范围内。可以通过经典分离技术和通过立体化学控制合成获得呈基本上纯的形式的此类异构体。

[0195] “药物组合物”是呈适合给予至受试者的形式的、含有治疗剂(诸如第一化合物和至少一种另外的治疗剂(例如，在此所述的另外的治疗剂))的配制品。在一个实例中，该药物组合物是处于散装形式或单位剂型。以易于给予和实现剂量均匀性的剂量单位形式配制组合物可以是有利的。如在此使用的单位剂型是指作为针对待治疗的受试者的单一剂量适合的物理上离散单位；每个单位均含有与需要的药物载体结合的经计算产生期望的治疗效果的预定量的活性药剂。本申请的剂量单位形式的规格由如下决定并且直接依赖于：活性试剂的独特特征和待实现的具体治疗效果，和本领域中配制用于治疗个体的这种活性剂的固有局限性。

[0196] 术语“单位剂型”是指适于作为用于人和其他哺乳动物的单位剂量的物理离散单位，每个单位含有预定量的经计算结合如在此所述的一种适合的药物赋形剂可产生所希望的治疗作用的活性材料。

[0197] 单位剂型是多种形式中的任一种，包括例如胶囊、IV袋、片剂、气雾剂吸入器上的单个泵、或小瓶。第一化合物或其药学上可接受的盐或氨基酸缀合物在组合物的单位剂量中的量是有效量，并且根据所涉及的特定治疗和/或用于该治疗的一种或多种另外的治疗剂而变化。本领域的技术人员应理解，有时有必要依据患者的年龄和病症对剂量进行常规改变。剂量还将取决于给予途径。考虑了各种途径，包括口服、肺部、直肠、肠胃外、透皮、皮下、静脉内、肌内、腹膜内、吸入、颊部、舌下、胸膜内、鞘内、鼻内等。用于局部或经皮给予本申请的化合物的剂型包括散剂、喷雾剂、软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、溶液、贴剂以及吸入剂。在一个实例中，第一化合物和/或至少一种另外的治疗剂在无菌条件下与药学上可接受的载体、以及与所需要的任何防腐剂、缓冲剂或推进剂一起混合。

[0198] 如在此所用，“PO”或“经口”是指口服给予；“SQ”是指皮下给予；并且“QD”是指每日一次给予。

[0199] 术语“闪释剂量”是指处于快速分散剂型的配制品。

[0200] 术语“立即释放”被定义为治疗剂(诸如第一化合物或至少一种另外的治疗剂)在相对较短的时间段(通常至多约60分钟)中从剂型的释放。术语“改良释放”被定义为包括延迟释放、延长释放和脉冲释放。术语“脉冲释放”被定义为药物从剂型的一系列释放。术语“持续释放”或“延长释放”被定义为治疗剂在延长的时间段内从剂型的连续释放。

[0201] “受试者”包括哺乳动物，例如，人、伴侣动物(例如，狗、猫、鸟等)、农场动物(例如，牛、绵羊、猪、马、家禽等)、以及实验室动物(例如，大鼠、小鼠、豚鼠、鸟等)。在一个实例中，该受试者是人。在一个方面，该受试者是雌性。在一个方面，该受试者是雄性。

[0202] 如在此所用，短语“药学上可接受”是指在正确医学判断的范围内适用于与人类和动物的组织接触而无过多毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理益处/风险比相称的那些化合物、材料、组合物、载体和/或剂型。

[0203] “药学上可接受的载体或赋形剂”意指总体上安全、无毒，并且在生物学上以及其他方面并非不合需要的适用于制备药物组合物的载体或赋形剂，并且包括可为兽医使用以及人药物使用接受的赋形剂。如在本说明书和权利要求书中使用的“药学上可接受的赋形剂”包括一种和多于一种这样的赋形剂。

[0204] 虽然有可能在无任何配制品的情况下直接给予第一化合物，但第一化合物可以呈包含药学上可接受的赋形剂的药物配制品的形式给予。这样的配制品可以通过各种途径给予，这些途径包括口服、经颊、直肠、鼻内、经皮、皮下、静脉内、肌内和鼻内。

[0205] 在一个实例中，第一化合物和/或至少一种另外的治疗剂(例如，在此所述的另外的治疗剂)可以经皮给予。为了经皮给予，需要经皮递送装置(“贴剂”)。此类经皮贴剂可用于以可控量进行本申请的化合物的连续或间断输注。用于药学试剂递送的经皮贴剂的构造和使用是本领域中熟知的。参见，例如美国专利号5,023,252。此类贴剂可以被制成连续的、脉冲的或者按需递送的药学试剂。

[0206] 在一个实例中，本申请的药物组合物适合于经颊和/或舌下或经鼻给予。该实例提供了以避免胃并发症(诸如通过胃系统和/或通过肝脏的首过代谢)的方式给予第一化合物。这种给予途径还可以减少吸附时间，从而提供治疗益处的更快起效。

[0207] 第一化合物可以在宽剂量范围内给予。例如，每日剂量通常在约0.0001至约30mg/kg体重的范围内。在成人的治疗中，使用呈单次或分次剂量的约0.1至约15mg/kg/天的范围。在一个实例中，该配制品包含约0.1mg至约1500mg的第一化合物。在另一个实例中，该配制品包含约1mg至约100mg的第一化合物。在另一个实例中，该配制品包含约1mg至约50mg的第一化合物。在另一个实例中，该配制品包含约1mg至约30mg的第一化合物。在另一个实例中，该配制品包含约4mg至约26mg的第一化合物。在另一个实例中，该配制品包含约5mg至约25mg的第一化合物。在另一个实例中，该配制品包含约5mg、约10mg、约15mg、约20mg、约
25mg、约30mg、约35mg、约40mg、约45mg、或约50mg的第一化合物。然而，应当了解，实际给予的第一化合物的量将由医师根据相关情况(包括待治疗的病症、所选择的给予途径、所给予的第一化合物的形式、所给予的一种或多种另外的治疗剂、个体患者的年龄、体重和反应、以及患者症状的严重程度等)来确定。因此，以上剂量范围不旨在以任何方式限制本申请的范围。在一些情况下，低于上述范围下限的剂量水平可能是足够的，而在其他情况下可能使用不引起任何有害副作用的仍然更大的剂量，条件是将这类更大的剂量首先分成数个小剂量以用于全天给予。

[0208] “纤维化”是指在组织或器官中涉及过度纤维结缔组织(例如，瘢痕组织)的发展的病症。瘢痕组织的这种产生可以响应于由于疾病、外伤、化学毒性等所致的器官的感染、炎症或损伤而发生。纤维化可以在各种不同的组织和器官(包括肝、肾、肠、肺、心脏等)中发展。

[0209] 如在此所用，“胆汁淤积性病症”是指来自肝的胆汁排泄受损或被阻断的任何疾病或病症，该疾病或病症可以在肝抑或在胆管中发生。肝内胆汁淤积和肝外淤积是两种类型的胆汁淤积性病症。肝内胆汁淤积(其在肝内部发生)最常见于原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、败血症(全身感染)、急性酒精性肝炎、药物中毒、胃肠外全面营养(静脉内供给)、恶性肿瘤、囊性纤维化、以及妊娠中。肝外胆汁淤积(其在肝外部发生)可以由胆管肿瘤、狭窄、囊肿、憩室、胆总管中的结石形成、胰腺炎、胰腺肿瘤或假性囊肿、以及由于附近器官中的团块或肿瘤所致的压缩引起。

[0210] 胆汁淤积性病症的临床症状和体征包括：发痒(瘙痒)、疲劳、黄疸皮肤或眼睛、不能消化某些食物、恶心、呕吐、白便、小便黄赤、以及右上腹疼痛。患有胆汁淤积性病症的患者可以基于一组标准临床实验室测试进行诊断和临床跟踪，这些测试包括患者血清中的碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转肽酶(GGT)、5’核苷酸酶、胆红素、胆汁酸、以及胆固醇水平的测量。通常，如果所有三种诊断标志物(碱性磷酸酶、GGT、和5’核苷酸酶)的血清水平都被认为异常升高，则患者被诊断为患有胆汁淤积性病症。这些标志物的正常血清水平可能取决于测试方案，因实验室和程序而异在一定程度上变化。因此，医师将能够基于具体的实验室和测试程序确定对于这些标志物中的每一种异常升高的血液水平怎么样。例如，患有胆汁淤积性病症的患者通常在血液中具有大于约125IU/L的碱性磷酸酶、大于约65IU/L的GGT、和大于约17NIL的5’核苷酸酶。由于血清标志物的水平的变化性，除了上述症状中的至少一种(如发痒(瘙痒))之外，胆汁淤积性病症可以基于这三种标志物的异常水平进行诊断。

[0211] 术语“原发性胆汁性肝硬化”与术语“原发性胆汁性胆管炎”互换使用，并且通常缩写为PBC。PBC是以肝的小胆管的缓慢进行性破坏为特点的肝脏自身免疫性疾病，其中小叶内导管(赫林管)在疾病早期受到影响。当这些导管被损伤时，胆汁在肝中积聚(胆汁淤积)并且随时间推移损伤该组织。这可能会导致瘢痕形成、纤维化和肝硬化。原发性胆汁性肝硬化由小叶间胆管破坏表征。原发性胆汁性肝硬化的组织病理学发现包括：胆管炎症，其由上皮内淋巴细胞和管周上皮样肉芽肿表征。PBC有4个阶段。

[0212] 阶段1—门户阶段：正常大小的三联体；门静脉炎症，微小胆管损伤。通常在此阶段中检测到肉芽肿。

[0213] 阶段2—门静脉周阶段：扩大的三联体；门静脉周纤维化和/或炎症。典型地，这个阶段通过发现小胆管的增生表征。

[0214] 阶段3—中隔阶段：主动和/或被动纤维间隔。

[0215] 阶段4—胆汁性肝硬化：结节存在；加兰(garland)

[0216] 术语“原发性硬化性胆管炎”(PSC)是在肝内(肝内部)和肝外(肝外部)水平下引起胆管的炎症和随后阻塞的胆管疾病。炎症阻碍胆汁到肠道的流动，这最终可能导致肝的肝硬化、肝衰竭和肝癌。

[0217] 术语“非酒精性脂肪性肝炎(NASH)”是由脂肪在肝中的积聚引起的肝炎症。在一些人中，脂肪的积累引起肝的炎症。由于炎症，肝不能如其本来那样良好地起作用。NASH可能变得更严重并且引起肝的瘢痕形成，这导致肝硬化。NASH类似于由长期大量饮酒引起的肝病种类。但NASH在不酗酒的人中发生。

[0218] 术语“器官”是指由细胞和组织组成且执行生物体的一些特定功能的分化的结构(如在心脏、肺、肾、肝等中)。该术语还涵盖执行功能或在活动中协作的身体部分(例如，构成视觉器官的眼睛和相关结构)。术语“器官”进一步涵盖分化的细胞和组织的能够潜在发育成完整结构的任何部分结构(例如，肝的叶或部分)。

[0219] 本文引用的全部公开和专利文献通过引用并入本文，如同每一份这样的公开或文献都被具体地且分别地指出已通过引用并入本文。公开和专利文献的引用并无意承认任何公开和专利文献是相关的现有技术，也未构成对其内容或日期的任何承认。现已通过书面说明描述了本申请，本领域的技术人员应认识到，可在各种实施例中实践本申请的组合物和方法，并且在此提供的描述和实例是出于说明的目的，并不限制所附权利要求书。

[0220] 在本说明书中，除非上下文另外明确规定，否则单数形式也包括复数。除非另外定义，否则在此所用的所有技术性和科学性术语具有与本领域中技术人员通常所理解的相同意思。在冲突的情况下，以本说明书为准。除非另外指出，否则在此使用的所有百分比和比率都是按重量计。

[0221] 实例

[0222] 实例1：C57BL/6j小鼠中饮食诱导的肥胖NASH

[0223] 进行研究以评估奥贝胆酸(OCA)和降低血糖水平、刺激胰岛素分泌和/或提高胰岛素敏感度的治疗剂单独或组合地对饮食诱导的肥胖NASH小鼠中的代谢参数、肝病理学、和NAS活动评分的影响。在实例2、3和4中使用的治疗剂分别是利拉鲁肽(LIRA)、二甲双胍(MET)、或西他列汀(SIT)。在一项研究中，抗血糖剂是恩格列净(EMP)。另外地，进行肝基因表达谱分析和随后的途径分析以确定该组合是否调节未由任一单一疗法治疗调节的新颖基因和/或更强烈地调节也受单一疗法影响的基因。

[0224] 研究概述

[0225]

[0226] 动物、圈养和饮食

[0227] 在5周龄时，从法国JanVier购买雄性C57BL/6小鼠，并且转移到测试畜舍。在驯化和高脂肪饮食诱导期过程中，将小鼠在12:12光照-黑暗循环下(在从3AM-3PM光照)在受控的温度条件(22±1℃；50％±10％相对湿度)下每笼五只分组圈养在定做橱柜中。在整个饮食诱导和研究期间，小鼠随意获取高脂肪饮食(n＝110，DIO-NASH)(D09100301，研究饮食公司(Research Diet)，美国)(40％脂肪(18％反式脂肪)、40％糖类(20％果糖)和2％胆固醇)或常规啮齿动物食物(n＝10，LEAN-CHOW)(Altromin 1324，Brogaarden公司，丹麦)和自来水。在实验之前将动物保持饮食持续28周，并且在整个研究期间维持饮食。在术后恢复期间，并且在整个研究期间，将所有动物单独圈养。

[0228] 分配到研究中、分层随机化和基线监测

[0229] 在饮食诱导27周之后，获得肝活组织检查切片用于通过组织学评估脂肪变性的肝脏进展。在给药之前的第2周(SIT组合)或第1周(LIRA和MET组合)，根据脂肪变性评分和体重进行分层随机化为处理组。使用EchoMRI(EchoMRI公司，美国)扫描动物以确定身体组成分析。EchoMRI扫描测量脂肪和无脂肪的组织质量。在非空腹和意识状态下从面颊(下颌下)收集血液样品，用于ALT、AST、TG和TC水平的基线血浆分析。

[0230] 预活组织检查程序

[0231] 在手术程序当天，将小鼠用100％氧气中的异氟烷(2％-3％)麻醉。在中线进行小的剖腹术并且暴露肝的左侧叶。将肝组织的锥形楔(约100mg)从该叶的远端部分切除，称重，并固定在4％多聚甲醛(PFA)中以用于组织学。使用双极电凝(ERBE VIO 100手术电刀)将肝的切割表面立即电凝。将肝返回腹腔并且将腹壁缝合且用缝合器闭合皮肤。对于术后恢复，在手术程序当天和术后第1天和第2天将小鼠皮下给予卡洛芬(5mg/ml-0.01ml/10g)和恩诺沙星(5mg/ml-1ml/kg)。

[0232] 用于组织学评估的肝活组织检查切片制备：在4％PFA中过夜储存之后，将肝活组织检查切片过夜浸润在自动Miles Scientific Tissue-TEK VIP-TEK组织处理器中的石蜡中并且随后包埋在石蜡块中。将来自五只不同动物的活组织检查切片包埋在一个块上。然后，对这些块进行修整并且在Microm HM340E超薄切片机(赛默科技公司(Thermo Scientific))上切割两个3μm切片(用于H&E染色)。两个块被放置在一个载玻片上，从而得到每个载玻片代表10只不同动物的总计10个活组织检查切片。将切片静置干燥过夜。如由克莱纳(Kleiner)等人(2005)所概述由对处理条件不知情的病理学家进行分层且随机化为处理组的脂肪变性程度的评估。

[0233] 血液和血浆分析

[0234] 将血液样品收集到10μL肝素化的玻璃毛细管中。将样品立即悬浮在缓冲液(0.5ml葡萄糖/乳酸盐系统溶液(EKF-诊断公司(EKF-diagnostics)，德国)中，并且使用BIOSEN c-Line葡萄糖计(EKF-诊断公司，德国)在测试当天分析葡萄糖。对于甘油三酯和胆固醇含量，将100μl血液收集到锂-肝素管中。分离血浆，并且在分析之前将样品在4℃下储存一天。

[0235] 口服葡萄糖耐量测试(OGTT)

[0236] 在处理的第4周(LIRA和MET组合)或第6周(SIT组合)中，在有意识的自由移动的动物中进行OGTT。最近的药物剂量在OGTT之前约18小时给予并且动物在测试之前不接受药物给药。在测试开始之前将动物禁食4小时(从6AM至10AM移走食物)。在t＝0时，通过口服管饲法(10ml/kg)，使小鼠接受口服大剂量的葡萄糖(2g/kg)(200mg/ml；费森尤斯卡比公司(Fresenius Kabi)，瑞典)。从尾静脉(通过剪切)收集血液样品，并且在口服给予葡萄糖之后0、15、30、60以及120分钟的时间点测量血糖。在血液采样之后重新饲喂小鼠，并且按照常规剂量给药。

[0237] 终止和尸体剖检

[0238] 在第8周(处理的第56天)在一种非禁食状态下终止动物。最近的药物剂量在终止之前约18小时给予并且动物在终止之前不接受药物给药。将动物通过CO2/O2诱导并且在麻醉(异氟烷)过程中，打开腹腔并且获得心脏血液用于收集终末血浆。在尸体剖检时，收集全肝并称重。将左侧叶分为片状，并且在液氮中快速冷冻用于基因表达分析，并且在4％PFA中快速冷冻用于组织学和生物化学分析。将一片肝在液氮中快速冷冻用于生物化学分析。

[0239] 肝组织处理

[0240] 终末肝组织：在处理8周之后，收集全肝，称重并且从左侧叶切除肝活组织检查切片且立即置于4％PFA(约150-200mg)中并且快速冷冻(约50mg)。在FastPrep管中收集肝片(约100mg)，并且在液氮中快速冷冻。

[0241] 用于组织学的固定、包埋和切片：在4％PFA中过夜固定之后，将肝活组织检查切片过夜浸润在自动Miles Scientific Tissue-TEK VIP-TEK组织处理器中的石蜡中并且随后包埋在石蜡块中。将来自五只不同动物的活组织检查切片包埋在一个块中。对这些块进行修整并且在Microm HM340E超薄切片机(赛默科技公司)上切割两个3μm切片/块。

[0242] 用于肝甘油三酯和胆固醇分析的组织匀浆：将1mL 5％NH-40/ddH2O溶液(ab142227，艾博抗公司(Abcam))添加到快速FastPrep管中。将管置于FastPrep匀浆器中并且摇动2×60秒。在匀浆化之后，将样品在加热块中缓慢加热至80℃-100℃持续3分钟。在冷却至室温之后，重复加热步骤。使用微量离心机以最大速度将样品离心2分钟以除去任何不溶物质。将上清液储存在-80℃下直至使用。根据制造商的说明书使用自动分析仪Cobas C-111与商业试剂盒(罗氏诊断公司(Roche Diagnostics)，德国)在单次测定中测量肝匀浆中的甘油三酯和胆固醇含量。

[0243] 用于RNAseq的RNA纯化：使用MP FastPrep系统进行组织的裂解。简言之，按照供应商的推荐，将30-50mg肝活组织检查切片均质化并且用于在NucleoSpin Plus RNA柱(Macherey-Nagel)上进行RNA提取。使用NanoDrop 2000分光光度计(赛默科技公司)来评估RNA的量。

[0244] 肝脂肪变性评估

[0245] 为了评估肝脂肪变性，用H&E将肝切片染色，接着用Visiomorph软件(Visiopharm公司，哥本哈根，丹麦)进行分析。使用为特定目的设计的方案将脂肪变性的终末肝定量评估描述为总面积的百分比。HE染色：将石蜡包埋切片在二甲苯中脱蜡，并且在一系列分级乙醇中再水合。然后将切片在迈耶尔苏木精(目录号S3309，Dako公司)中孵育5分钟，在流动的自来水中洗涤5分钟，并且然后在伊红Y溶液(目录号HT1102802.5L，西格玛-艾尔德里奇公司)中染色15秒。将载玻片水合，用Pertex装载，并且在扫描之前使其干燥。

[0246] 总NAFLD(NAS)活动评分

[0247] NAFLD活动评分(NAS)为最有可能患有NASH的患者提供一个数值，并且是脂肪变性(0-3)、小叶炎症(0-3)和肝细胞气球样变(0-3)的独立评分的总和。患有NASH的大多数患者具有≥5的NAS评分。在这些实验中，收集来自左侧叶的终末肝组织用于通过使用由Kleiner及其同事概述的临床标准进行NAS(非酒精性脂肪肝病的组织学评分系统的设计和验证(Design and validation of a histological scoring system for nonalcoholic fatty liver disease)，克莱纳等人，肝脏病学(Hepatology)41；2005)。用于确定NAS的标准提供于下表1中。

[0248] 表1.

[0249]

[0250] RNA-seq：肝终末基因表达和生物信息学分析

[0251] 使用Spliced Transcripts Alignment to a Reference(STAR)软件将测序数据与从Ensembl数据库获得的小鼠基因组比对。将HTSeq程序包中可用的python脚本HTSeq-count用于计算映射到带注释区域的读取次数。将所有下游分析步骤均作为R的脚本实施。对于生物信息学分析，使用标准RNA-seq质量控制参数来评估数据的质量。为了评估组间和组内变异性，进行主要组分分析和分级聚类。为了鉴定差异表达基因，使用R程序包edgeR。
将差异表达基因的列表与关于已建立的NASH生物标志物的信息交叉引用。进行途径分析以鉴定组之间差异扰动的途径。

[0252] 实例2.C57BL/6j小鼠中饮食诱导的肥胖NASH：奥贝胆酸(OCA)±利拉鲁肽(LIRA)[0253] 用于本研究的方案和分析提供于实例1中。

[0254] 处理组

[0255] 组1：运载体(PO)+运载体(SQ)

[0256] 从第0至第8周向小鼠(n＝12)给予运载体。

[0257] 组2：OCA(PO)+运载体(SQ)

[0258] 从第0至第8周，以10mg/kg剂量向小鼠(n＝12)给予OCA。

[0259] 组3：LIRA(SQ)+运载体(PO)

[0260] 从第0至第8周，以0.1mg/kg剂量向小鼠(n＝12)给予LIRA。

[0261] 组4：OCA(PO)+运载体(SQ)

[0262] 从第0至第8周，以30mg/kg剂量向小鼠(n＝12)给予OCA。

[0263] 组5：LIRA(SQ)+运载体(PO)

[0264] 从第0至第8周，以0.4mg/kg剂量向小鼠(n＝12)给予LIRA。

[0265] 组6：OCA(PO)+LIRA(SQ)

[0266] 从第0至第8周，以10mg/kg剂量向小鼠(n＝12)给予OCA并且以0.1mg/kg剂量给予LIRA。

[0267] 组7：OCA(PO)+LIRA(PO)

[0268] 从第0至第8周，以30mg/kg剂量向小鼠(n＝12)给予OCA并且以0.4mg/kg剂量给予LIRA。

[0269] 组8：贫食物(Lean Chow)对照组

[0270] 从第0至第8周给小鼠(n＝9)饲喂贫食物。

[0271] 化合物和剂量

[0272] 所有小鼠每日一次接受PO(OCA)或SQ(LIRA)给药。第0天是给药的第一天，而第55天是最后一天。因此，从第0天直到并且包括第55天，每日一次向小鼠给药。小鼠总共接受112次剂量的单独的治疗剂或运载体。在2:00-4:00PM之间处理动物。将OCA溶解于1mg/ml和
3mg/ml的最终储存浓度分别用于10mg/kg和30mg/kg的最终剂量浓度。用于OCA的运载体是
0.5％羧甲基纤维素钠(CMC)。

[0273] 结果和讨论

[0274] NAS评分

[0275] 通过在肝活组织检查切片上存在的脂肪变性、炎症、和肝细胞气球样变的特征模式来建立非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的诊断。NAFLD活动评分(NAS)为最有可能患有NASH的患者提供一个数值，其中大多数NASH患者具有≥5的NAS值。单独和组合地评估了OCA(10和30mg/kg，PO)和LIRA(0.1和0.4mg/kg，SQ)对DIO-NASH小鼠的总NAS和个体组分NAS值的影响。如实例1A所用，低剂量组合是指OCA(10mg/kg)/LIRA(0.1mg/kg)，而高剂量是指OCA(30mg/kg)/LIRA(0.4mg/kg)。

[0276] 图1A和图1B分别描述了在处理8周之后OCA和LIRA的低剂量组合和高剂量组合的NAS评分的降低。数据表明，低剂量组合和高剂量组合两者相对于对照均减少了总NAS。具体地，OCA和LIRA的低剂量组合的效果对于运载体组以及单独的低剂量OCA具有统计学上显著的意义。NAS的最大的改善是约三分。高剂量组合的改善将NAS值从4.6降低至1.6(p<0.05对于OCA单一疗法)。这些分中的大约两分是由于减少脂肪变性组分。低剂量和高剂量的OCA和LIRA组合对脂肪变性组分的影响分别显示在图2A和图2B中。两种剂量组合均以统计学上显著的方式改善了脂肪变性(p<0.05对于OCA或LIRA单一疗法)。

[0277] 肝甘油三酯和胆固醇

[0278] 由于脂肪肝由包括甘油三酯和胆固醇的脂质的积累表征，因此检查了OCA和LIRA的低剂量组合和高剂量组合的作用。在处理8周之后，组合以如图3A和图3B所示的统计学上显著的方式降低了肝甘油三酯。两种剂量组合均降低了肝甘油三酯和胆固醇的水平，而低剂量组合给出了协同效应。关于胆固醇，高剂量组合以如图4A和图4B所示的统计学上显著的方式降低了肝中的胆固醇水平。

[0279] 体重和组成

[0280] 在美国LIRA被指示为肥胖个体中的慢性体重管理的生活方式的助剂。然而，由于与LIRA相关的潜在风险，包括甲状腺髓样癌和急性胰腺炎(包括坏死性胰腺炎)的风险，因此REMS(风险评估和缓解策略)是FDA所需要的。因此，高度期望使用较低剂量的LIRA，同时维持其最大的体重减轻效果。低剂量组合对体重的影响提供于图5中。如图5所示，OCA和LIRA的低剂量组合相对于单独的单一疗法协同地将体重降低了约13％。关于身体组成，图6A和图6B显示，低剂量组合和高剂量组合相对于体重减少了肥胖(或脂肪组织质量)。具体地，OCA和LIRA的高剂量组合协同减少了小鼠的肥胖。

[0281] 转录组学分析

[0282] 对来自研究小鼠的肝mRNA样品进行RNA测序，以了解通过组合疗法改善总NAS的潜在机制和途径。检查以下基因：诱导细胞死亡的DFFA样效应子C；含有死亡效应结构域的DNA结合蛋白2；2-羟酰基-CoA裂解酶1，半乳糖结合凝集素；氧固醇结合蛋白样3；雌激素受体；胰岛素诱导基因，脂质1；以及泛醇-细胞色素C还原酶铰链蛋白。比较在低剂量组合、高剂量组合、对照、以及每个分别的单一疗法之间差异调节的基因。来自该研究的使小鼠维持高脂肪饮食的作用说明了其中显著上调和下调的基因依据单一或组合疗法治疗而改变的这些过程。由低剂量组合相对于单一疗法影响的表达水平的定量值提供于图7A-7E中。表2描述了参与纤维化发展的基因的预测功能和定性调节。该组合相对于运载体组以统计学上显著的方式调节了基因表达。

[0283] 表2.

[0284]

[0285] 受高剂量组合影响的表达水平的比较提供于图8A-8D中。表3描述了每个基因在NASH发展中的预测作用或功能。

[0286] 表3.

[0287]

[0288] 实例3.C57BL/6j小鼠中饮食诱导的肥胖NASH：奥贝胆酸(OCA)±二甲双胍(MET)[0289] 用于本研究的方案和分析提供于实例1中。

[0290] 处理组

[0291] 组1：运载体(PO)

[0292] 从第0至第8周向小鼠(n＝11)给予运载体(0.5％CMC)。

[0293] 组2：OCA(PO)+运载体(PO)

[0294] 从第0至第8周，以10mg/kg剂量向小鼠(n＝11)给予OCA。

[0295] 组3：MET(PO)+运载体(PO)

[0296] 从第0至第8周，以50mg/kg剂量向小鼠(n＝12)给予MET。

[0297] 组4：OCA(PO)+运载体(PO)

[0298] 从第0至第8周，以30mg/kg剂量向小鼠(n＝11)给予OCA。

[0299] 组5：MET(PO)+运载体(PO)

[0300] 从第0至第8周，以150mg/kg剂量向小鼠(n＝12)给予MET。

[0301] 组6：OCA(PO)+MET(PO)

[0302] 从第0至第8周，以10mg/kg剂量向小鼠(n＝12)给予OCA并且以50mg/kg剂量给予MET。

[0303] 组7：OCA(PO)+MET(PO)

[0304] 从第0至第8周，以30mg/kg剂量向小鼠(n＝10)给予OCA并且以150mg/kg剂量给予MET。

[0305] 组8：贫食物(Lean Chow)对照组

[0306] 从第0至第8周给小鼠(n＝10)饲喂贫食物。

[0307] 化合物和剂量

[0308] 所有小鼠每日一次接受PO给药。第0天是给药的第一天，而第55天是最后一天。因此，从第0天直到并且包括第55天，每日一次向小鼠给药。小鼠总共接受56次给药。动物在2:00-4:00PM之间经受处理。将OCA溶解于1mg/ml和3mg/ml的最终储存浓度分别用于10mg/kg和30mg/kg的最终剂量浓度。给药量是10mL/kg。将MET制备成5mg/ml和15mg/ml的最终储存浓度分别用于50mg/kg和150mg/kg的最终剂量浓度。给药量是10mL/kg。用于OCA和MET的运载体是0.5％羧甲基纤维素钠(CMC)。

[0309] 结果

[0310] NAS评分

[0311] 通过在肝活组织检查切片上存在的脂肪变性、炎症、和肝细胞气球样变的特征模式来建立非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的诊断。NAFLD活动评分(NAS)为最有可能患有NASH的患者提供一个数值，其中大多数NASH患者具有≥5的NAS评分。单独和组合地检查了OCA(10和30mg/kg，PO)和MET(50和150mg/kg，PO)对DIO-NASH小鼠的总NAS和个体组分NAS的影响。如在实例1B中，低剂量组合是指OCA(10mg/kg)/MET(50mg/kg)，而高剂量组合是指OCA(30mg/kg)/MET(150mg/kg)。

[0312] 图9A描述了OCA和MET的高剂量组合对总NAS的影响。在研究结束时，OCA和MET的高剂量组合以统计学上显著的方式降低了NAS(p<0.05对于OCA对照)。关于个体组分，OCA和MET的高剂量组合对脂肪变性组分的影响显示在图9B中。

[0313] 血糖水平

[0314] 口服葡萄糖耐量测试(OGTT)是其中口服给予葡萄糖，并且随后取血液样品以确定葡萄糖从血液中清除的时间的医学测试。进行该测定以检验糖尿病、胰岛素耐受性、和β细胞功能受损。在该研究的第4周，口服给予一定剂量的葡萄糖，并且在4小时后分析血液水平。图10A和图10B显示，与DIO-NASH运载体组相比，OCA和MET的低剂量组合和高剂量组合降低了在处理的第4周时的血糖。表4提供了如在OGTT中测量的低剂量组合和高剂量组合的血糖水平(AUC)。

[0315] 表4.

[0316]

[0317] AUC是指曲线下面积；**P<0.01对于组1；并且++P<0.01对于组6差别基因表达分析[0318] 对来自研究小鼠的肝mRNA样品进行RNA测序，以了解通过组合疗法改善总NAS的潜在机制和途径。在从单独和组合地用OCA和MET处理的动物收集的终末肝样品上进行差别基因表达分析。比较了在低剂量组合与每个分别的单一疗法之间差异调节的基因。图11和表5中的数据披露了单独和组合地由OCA和MET调节的基因的数量。通常，虽然单一疗法相对于运载体组没有改变基因，但在组合中许多基因相对于运载体组基于协同效应被独特地调节从而改善NASH。图12A-12C的维恩图提供了受调节基因数量的简单比较。结果表明，在组合中独特的纤维化相关基因相对于单一疗法组基于协同效应被调节从而改善NASH。

[0319] 表5.

[0320]

[0321] 对于低剂量组合，胶原受体家族中的以下基因是独特地调节的：14a1型胶原、6a1型胶原、和6a2型胶原。分别参见图13A-13C。受调节的其他感兴趣的基因是核心蛋白聚糖受体、胶原凝集素亚族成员10，转化生长因子β受体III、以及β-诱导的转化生长因子。参见图14A-14F。

[0322] 对于高剂量组合，胶原受体家族中的差异调节的基因是14a1型胶原、6a1型胶原、和6a2型胶原。分别参见图15A-15C。检查其他感兴趣的基因，诸如血小板源性生长因子受体β、核心蛋白聚糖、胶原凝集素亚族成员10、转化生长因子β受体III、以及β诱导的转化生长因子(图16A-16E)。

[0323] 关于纤维化因子基因，胶原受体家族是特别令人感兴趣的。胶原出现在身体的许多地方。然而，超过90％的人体胶原是I型的。动物组织中存在29种基因不同的胶原。I、II、III、V以及XI型胶原自组装成D周期交叉条纹原纤维。这里D是大约67nm，并且存在胶原的特征轴向周期性。这些在脊椎动物中形成最丰富的胶原。

[0324] 层粘连蛋白1受体参与膜重塑(实现较低的层粘连蛋白水平是治疗纤维化所期望的)。胶原凝集素编码C-凝集素家族的成员，具有胶原样序列和碳水化合物识别结构域的蛋白质。此家族的其他成员是分泌性蛋白，并且与微生物上的糖抗原结合，从而促进其识别和去除。核心蛋白聚糖在胶原原纤维组装中发挥作用。这种蛋白与多种细胞表面受体的结合介导其在肿瘤抑制中的作用，包括对自噬和炎症的刺激作用以及对血管生成和肿瘤发生的抑制作用。肿瘤坏死因子受体超家族和转化生长因子参与炎症/纤维化进展。

[0325] 实例4.C57BL/6j小鼠中饮食诱导的肥胖NASH：奥贝胆酸(OCA)±西格列汀(SIT)[0326] 用于本研究的方案和分析提供于实例1中。

[0327] 处理组

[0328] 组1：运载体(PO)+运载体(PO)

[0329] 从第0至第8周向小鼠(n＝11)给予运载体(0.5％CMC)。

[0330] 组2：OCA(PO)+运载体(SQ)

[0331] 从第0至第8周，以10mg/kg剂量向小鼠(n＝11)给予OCA。

[0332] 组3：SIT(PO)+运载体(PO)

[0333] 从第0至第8周，以10mg/kg剂量向小鼠(n＝12)给予SIT。

[0334] 组4：OCA(PO)+运载体(SQ)

[0335] 从第0至第8周，以30mg/kg剂量向小鼠(n＝11)给予OCA。

[0336] 组5：SIT(PO)+运载体(PO)

[0337] 从第0至第8周，以30mg/kg剂量向小鼠(n＝12)给予SIT。

[0338] 组6：OCA(PO)+SIT(PO)

[0339] 从第0至第8周，以10mg/kg剂量向小鼠(n＝12)给予OCA并且以10mg/kg剂量给予SIT。

[0340] 组7：OCA(PO)+SIT(PO)

[0341] 从第0至第8周，以30mg/kg剂量向小鼠(n＝10)给予OCA并且以30mg/kg剂量给予SIT。

[0342] 组8：贫食物(Lean Chow)对照组

[0343] 从第0至第8周给小鼠(n＝10)饲喂贫食物。

[0344] 化合物和剂量

[0345] 所有小鼠每日一次接受PO给药。第0天是给药的第一天，而第55天是最后一天。因此，从第0天直到并且包括第55天，每日一次向小鼠给药。小鼠总共接受56次给药。动物在2:00-4:00PM之间经受处理。将OCA溶解于1mg/ml和3mg/ml的最终储存浓度分别用于10mg/kg和30mg/kg的最终剂量浓度。给药量是10mL/kg。将SIT制备成5mg/ml和15mg/ml的最终储存浓度分别用于10mg/kg和30mg/kg的最终剂量浓度。给药量是10mL/kg。用于OCA和SIT的运载体是0.5％羧甲基纤维素钠(CMC)。

[0346] 结果

[0347] DPP-IV活性

[0348] 在处理的第2周，单独以及与SIT(10和30mg/kg，PO)组合地检查OCA(10和30mg/kg，PO)对DIO-NASH小鼠的血浆DPP-IV活性的影响。低剂量组合是指OCA(10mg/kg)/SIT(10mg/kg)，而高剂量组合是指OCA(30mg/kg)/SIT(30mg/kg)。OCA和SIT的低剂量组合以统计学上显著的方式降低了DPP-IV活性(p<0.01对于DIO-NASH运载体)。此外，OCA和SIT的高剂量组合以统计学上显著的方式降低了DPP-IV活性(p<0.01对于DIO-NASH运载体)。药理学结果表明，治疗剂产生了预期效果，即DPP-IV抑制。

[0349] 实例5.奥贝胆酸(OCA)±恩格列净(EMP)

[0350] 处理组

[0351] 组1：运载体(PO)

[0352] 从第0至第8周向小鼠给予运载体(0.5％CMC)。

[0353] 组2：OCA(PO)+运载体(PO)

[0354] 从第0至第8周，以10mg/kg剂量向小鼠给予OCA。

[0355] 组3：EMP(PO)+运载体(PO)

[0356] 从第0至第8周，以3mg/kg剂量向小鼠给予EMP。

[0357] 组4：OCA(PO)+运载体(PO)

[0358] 从第0至第8周，以30mg/kg剂量向小鼠给予OCA。

[0359] 组5：EMP(PO)+运载体(PO)

[0360] 从第0至第8周，以10mg/kg剂量向小鼠给予EMP。

[0361] 组6：OCA(PO)+EMP(PO)

[0362] 从第0至第8周，以10mg/kg剂量向小鼠给予OCA并且以3mg/kg剂量给予EMP。

[0363] 组7：OCA(PO)+EMP(PO)

[0364] 从第0至第8周，以30mg/kg剂量向小鼠给予OCA并且以10mg/kg剂量给予EMP。

[0365] 组8：贫食物(Lean Chow)对照组

[0366] 从第0至第8周给小鼠(n＝10)饲喂贫食物。

[0367] 化合物和剂量

[0368] 所有小鼠每日一次接受PO给药。第0天是给药的第一天，而第55天是最后一天。因此，从第0天直到并且包括第55天，每日一次向小鼠给药。小鼠总共将接受56次给药。动物在2:00-4:00PM之间经受处理。将OCA溶解于1mg/ml和3mg/ml的最终储存浓度分别用于10mg/kg和30mg/kg的最终剂量浓度。给药量是10mL/kg。将EMP制备成5mg/ml和15mg/ml的最终储存浓度分别用于3mg/kg和10mg/kg的最终剂量浓度。给药量是10mL/kg。用于OCA和EMP的运载体是0.5％羧甲基纤维素钠(CMC)。

[0369] 本田等人，“选择性SGLT2抑制剂伊格列净对小鼠中的非酒精性脂肪性肝炎具有治疗作用(The Selective SGLT2Inhibitor Ipragliflozin Has a Therapeutic Effect on Nonalcoholic Steatohepatitis in Mice)”，PloS，2016描述了钠葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂(诸如恩格列净)已经被调研了其在DIO-NASH小鼠中的作用。

[0370] 实例6：肝细胞的夹层培养

[0371] 试剂和溶液

[0372] 适合的细胞培养基包括的维莫斯氏(Waymouth's)MB-752/1、汉姆氏(Ham's)F12、RPMI 1640、杜氏改良的伊格尔氏培养基、威廉姆斯氏(Williams')培养基E、莱博维茨氏(Leibovitz's)L15、以及改良的徐氏(Chee's)培养基。IV型胶原酶、I型胶原、珀可、培养基、以及补充剂可以添加至培养基(例如，血清、抗生素、氨基酸、激素如DEX、胰岛素和生长因子)，灌注缓冲液和其他溶液是可商购的或由可商购的材料制成。其他类型的胶原(II-IV型)、层粘连蛋白、纤连蛋白、以及硫酸肝素蛋白聚糖可以用于夹层肝细胞培养中。然而，已经表明，I型和IV型胶原在细胞培养中优于纤连蛋白和层粘连蛋白。

[0373] 肝细胞的分离

[0374] 使用两步骤原位胶原酶灌注方法来分离肝细胞。简言之，从雌性路易斯大鼠分离肝细胞。将动物麻醉。首先用灌注缓冲液通过门静脉原位灌注肝。灌注液在进入肝之前进行平衡。随后用灌注缓冲液中的胶原酶灌注肝。然后将肝解剖并且转移至冰冷的灌注缓冲液中。将肝包膜挑开，并且过滤所得细胞悬浮液。通过离心收集细胞沉淀并且将这些细胞再悬浮。将珀可添加至悬浮液，并且使用一种珀可密度离心技术分离肝细胞。将混合物离心，并且将细胞沉淀用培养基洗涤两次。通过台盼蓝排除法测定肝细胞活力。可替代地，使用冷冻保存的肝细胞来代替新鲜分离的肝细胞。

[0375] 肝细胞的夹层培养

[0376] 将分离的肝细胞在涂覆胶原的组织培养板上培养，并且维持在补充有血清、青霉素、链霉素、表皮生长因子、胰岛素、胰高血糖素、以及氢化可的松的培养基中。通过将I型胶原溶液与培养基进行混合来制备胶原胶凝溶液。将组织培养板涂覆该胶凝溶液并且在37℃下孵育以促进凝胶形成。以适当的密度接种肝细胞，并且维持在37℃下。每24小时更换一次培养基。

[0377] 对于夹层系统，在培养1天之后将一种另外的胶原凝胶溶液分布在这些细胞上。将培养基小心地去除，以便确保胶原凝胶的第二层均匀地散布在整个板上。将这些培养板在37℃下孵育以便允许在更换培养基之前该第二凝胶层的凝胶化和附着。每日更换一次培养基。将培养基样品储存在-20℃下用于进一步分析。

[0378] 在凝胶胶原的多个层之间培养的肝细胞维持三维立方体形状和类似于在体内所观察到的细胞骨架蛋白的分布。

[0379] 胆小管网络形成的最优化

[0380] 为了优化牛磺胆酸盐积聚和胆汁排泄，特定培养基如威廉姆斯氏培养基E和杜氏改良的伊格尔氏培养基可以用于夹层肝细胞培养。

[0381] 测试样品

[0382] 旨在用于研究的FXR激动剂是奥贝胆酸，还称为“OCA”和6-乙基鹅去氧胆酸(6-ECDCA)。

[0383] 实例7：评估测试品对肝细胞释放葡萄糖的影响

[0384] 肝细胞分离

[0385] 在禁食12小时之后，从6个月大的雌猪获得肝。从动物收获组织。基于由舍雷尔(Seglen)描述的程序，通过两步原位胶原酶灌注方法的修饰来分离肝细胞(舍雷尔，细胞生物学方法(Methods in Cell Biol.)13,29(1976))。在动物被杀死的15分钟内，取出肝右叶，并且然后用肝灌注介质在37℃下灌注15-20分钟，接着用肝消化介质灌注20-30分钟。通过在悬浮介质[26.5mM NaHCO3、8.99mM Na-HEPES、0.2％(重量/体积)BSA级分V、2.22mM D-果糖，在具有5.5mM葡萄糖和1mM丙酮酸钠的DMEM中]中温和破碎消化的肝来分离肝细胞，并且通过200-μm筛网过滤。将所得细胞悬浮液以500rpm离心，弃去上清液，并且将细胞沉淀再悬浮于预热(37℃)的悬浮介质中。细胞活力使用台盼蓝排除法(生命技术公司(Life Technologies)，格兰德岛(Grand Island)，纽约州)来评估，并且一直高于85％。一式三份地进行细胞计数，并且获得平均值。悬浮培养物

[0386] 在分离之后立即用不含葡萄糖或丙酮酸的无血清DMEM将肝细胞洗涤三次，并且然后以30×106/ml的细胞密度再悬浮于50ml锥形管中的600μl相同介质中。将管单独或与浓度增加的本申请化合物(例如，OCA)，连同至少一种另外的治疗剂本文(例如，在此所述的那些)在37℃下在连续摇动下孵育10分钟、20分钟、和40分钟。在每个实验中，将由100nM胰高血糖素刺激之后的葡萄糖输出用作阳性对照。

[0387] 在孵育期之后，使用Trinder测定试剂盒(西格玛公司)，用葡萄糖-氧化酶法测定释放到介质中的葡萄糖，并且将使用Bio-Rad蛋白质测定试剂盒测定的所有重复的结果对蛋白质含量归一化。

[0388] 实例8：评估测试品对肝细胞中的葡萄糖代谢的影响

[0389] 细胞培养

[0390] 如前所述，通过胶原酶灌注肝来分离雄性Sprague-Dawley大鼠(200-250g)的肝细胞(布朗(Brown)等人，生物化学杂志(Biochem.J.)262,425(1989))。通过台盼蓝排除法评估的生存力通常超过90％。用2mL含有10％(体积/体积)胎牛血清的杜氏改良的伊格尔氏培养基使涂覆胶原的6孔板每孔装填106个活细胞。在1小时之后，在此期间仅活细胞附着在该板上，抽吸培养基(连同未附着的死细胞)并且用新鲜培养基代替。将细胞维持长达48小时(其中在24小时至少一次更换培养基)。动物程序符合国家科学院人文关怀标准。

[0391] 葡萄糖代谢

[0392] 在不存在或存在本申请的化合物(例如，OCA)的情况下，与至少一种另外的治疗剂(例如，在此所述的那些)一起孵育18小时之后，测量肝细胞葡萄糖代谢的参数。在[5-3H]-葡萄糖(6.5μCi/mL)存在下，在肝细胞孵育2小时之后，将葡萄糖利用测定为氚化水的产生(对于脂肪酸氧化实验)。在每个周期期间，在用或不用100nmol/L胰岛素进行预孵育30分钟之后，在5分钟内测定2-[3H]-脱氧葡萄糖(DOG；10μmol/L，0.5μCi/mL)的摄取(佩尔多莫等人，生物化学期刊279,27177(2004))。在不存在或存在胰岛素的情况下，在1小时内测定D-[14C]-葡萄糖(2μCi/mL)到糖原中的结合(佩尔多莫等人2004)。

[0393] 实例9：评估测试品对肝细胞和小鼠中的葡萄糖代谢的影响

[0394] 细胞培养和瞬时转染

[0395] 如所述地将人肝胚细胞瘤细胞(HepG2)接种到6孔板(1×106个细胞/孔)中，并且在完全培养基[提供有10％(体积/体积)灭活的胎牛血清和1％(体积/体积)抗生素-抗真菌剂的高葡萄糖杜氏改良的伊格尔氏培养基(具有L-谷氨酰胺)]中生长(王等人，分子内分泌学22,1622(2008))。第二天，用本申请的化合物(例如，OCA)，连同至少一种另外的治疗剂(例如，在此所述的那些)处理细胞。在处理18小时之后，用TPA(50nM)、LPS(1μg/mL)、或TNF-α(10ng/mL)处理细胞，并且然后在孵育6小时之后收集用于RNA分离。

[0396] 使用Lipofectamine 2000(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)进行HepG2细胞的瞬时转染。除非另有说明，否则用本申请的化合物(例如，OCA)，连同至少一种另外的治疗剂(例如，在此所述的那些)预处理细胞18小时。用或不用LPS或TPA处理细胞。在孵育6小时之后，收获细胞，并且根据制造商的说明书(普洛麦格公司(Promega)，麦迪逊(Madison)，威斯康星州)，使用双重荧光素酶报告基因测定系统来测定荧光素酶活性。荧光素酶活性经由对照胸苷激酶驱动的海肾(Renilla)荧光素酶质粒phRL-TK的共转染归一化。数据被表示为非刺激组数据的相对活化倍数。

[0397] 原代小鼠肝细胞培养

[0398] 如所述地制备来自8周龄小鼠的原代肝细胞(黄(Huang)等人，分子内分泌学18,2402(2004)，黄等人，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)113,137(2004)，乔(Qiao)等人，细胞分子生物学(Mol.Biol.Cell)12,2629(2001))。用本申请的化合物(例如，OCA)，连同至少一种另外的治疗剂(例如，在此所述的那些)处理细胞。在处理18小时之后，用LPS(20μg/mL)、TPA(150nM)、或TNF-α(10ng/mL)处理细胞，并且然后在孵育6小时之后收集用于RNA分离。

[0399] RNA分离和定量实时聚合酶链反应

[0400] 如所述地进行HepG2细胞、原代小鼠肝细胞、和小鼠肝的总RNA分离和定量实时聚合酶链反应(PCR)(杨(Yang)等人，癌症研究(Cancer Res.)67,863(2007))。将β-肌动蛋白的扩增用作内标准。

[0401] 动物

[0402] 除非另有说明，否则使用8周龄的小鼠。在标准12:12小时光照/黑暗循环下，将野-/-生型小鼠和FXR 小鼠维持在无病原体的动物设施中。随意饲喂小鼠标准的啮齿动物食物和水。将8周龄的雌性野生型和FXR-/-小鼠禁食过夜，并且然后腹膜内注射单剂量的LPS(20mg/kg)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)、或者本申请的化合物(例如，OCA)，连同至少一种另外的治疗剂(例如，在此所述的那些)，接着随意饲喂水。在注射6小时之后，将小鼠杀死，并且取出血液和肝脏用于进一步分析。所有程序均遵循国家卫生研究院关于实验动物护理和使用的指导方针。

[0403] 实例10：评估测试品在动物模型中的影响

[0404] 胰岛素耐受性是将脂肪组织(AT)功能障碍与代谢综合征(MetS)中的肝炎症和脂肪变性联系起来的推定的关键潜在机制。已经证明，OCA在高脂肪饮食(HFD)诱导的MetS兔模型中以显著降低内脏AT(VAT)的量改善胰岛素耐受性和代谢特征。通过免疫组织化学、蛋白质印迹、和RT-PCR进行的VAT和肝的分析已显示，体内OCA给药使得相比于对照饮食的兔在从HFD兔分离的VAT中显著增加的脂肪细胞大小、缺氧、以及围脂滴蛋白和胞质胰岛素调节的葡萄糖转运蛋白GLUT4(SLC2A4)的表达正常化。体内OCA给药还使得HFD兔中的脂肪变性和炎症标志物的表达正常化。

[0405] MetS兔模型

[0406] 如前所述地获得HFD诱导的MetS兔模型(菲利皮等人，性医学杂志6,3274(2009))。将重量约3kg的雄性新西兰白兔随机编号并且分配至两个不同的组：饲喂对照饮食(CON)的未处理组，或饲喂HFD(0.5％胆固醇和4％花生油)的处理组，持续12周。用本申请的化合物(例如，OCA)，连同至少一种另外的治疗剂(例如，在此所述的那些)处理HFD兔的亚组。可基于在啮齿动物中进行的功效和药代动力学分析来选择使用的OCA的剂量(佩利恰里(Pellicciari)等人，药物化学(J.Med.Chem.)45,3569(2002))。还可基于如文献中公开的动物(例如，小鼠、大鼠、兔、猪)中的功效和药代动力学分析来选择另外的治疗剂(诸如在此所述的那些)的剂量。

[0407] 在基线和第12周在所有组中从耳缘静脉获得血液样品。如前所述，在杀死之前进行平均动脉压测量和口服葡萄糖耐量测试(菲利皮等人2009)。在处理12周之后，使用致死剂量的戊巴比妥(100mg/kg)将兔子杀死，并且将肝脏、VAT(积累在肠环与肠系膜之间)、和胆囊的标本仔细切除、称重、收集并且处理用于后续分析。处理来自所有兔组的VAT样品用于分离前脂肪细胞。如前所述地进行生物化学和激素血清分析(菲利皮等人2009，莫雷利等人，类固醇生物化学和分子生物学杂志132,80(2012)，维尼奥茨伊等人，内分泌学杂志212,71(2012))。

[0408] 为了评估MetS的影响，设计一种算法，该算法考虑了作为虚拟变量存在以下因素中的一个或多个：高血糖、高甘油三酯水平、高胆固醇水平、血压升高、以及内脏脂肪积累。如在CON兔中测量的，由分析参数的平均值±2S.D.导出每个因素的截断值。三个或更多个因素的正性表示MetS。

[0409] 样本量

[0410] 假设在CON组中发生MetS的概率为2.5％，并且HFD组中的概率为60％(菲利皮等人2009，维尼奥茨伊等人，性医学杂志8,57(2011)，维尼奥茨伊等人2012，马内斯基等人，内分泌学杂志215,347(2012)，莫雷利等人2012，莫雷利等人，前列腺(Prostate)73,428(2013))，则使用组之间分配比为1:1的74只兔子将允许在区分两个处理组之间MetS发展速率的差异的能力接近100％。假设在饲喂HFD的组中发生MetS的概率等于60％，并且在饲喂HFD和本申请的化合物(例如，OCA)连同至少一种另外的治疗剂(例如，在此所述的那些)的组中的概率为10％(维尼奥茨伊等人2011，莫雷利等人2012)，则使用分配比为2:1的54只兔子将允许在区分两个处理组之间MetS发生速率的差异的能力为约95％。

[0411] VAT的组织形态学分析

[0412] 如前所述，使用装有免费软件程序ImageJ(NIH，贝塞斯达(Bethesda)，美国马里兰州)的Nikon Microphot-FXA 显微镜(尼康公司(Nikon)，东京(Tokyo)，日本)，通过苏木精和伊红染色分析VAT标本以测量脂肪细胞直径(马内斯基等人2012)，考虑脂肪细胞是规则的球形。

[0413] 缺氧检测和免疫组织化学

[0414] 如前所述，在杀死之前1小时使用腹膜内注射的生物还原药物盐酸哌莫硝唑(缺氧探针-1，60mg/kg)来分析VAT氧合(马内斯基等人2012，莫雷利等人2012,2013，维尼奥茨伊等人2012)。

[0415] 用于蛋白质印迹分析的总级分和膜/胞质级分的制备

[0416] 为了从VAT样品的蛋白质提取，将冷冻的组织在液氮中研磨，并且分为两个等分试样：一个用于总蛋白质提取，并且另一个用于膜/胞质制剂。根据制造商的说明书，使用ProteoExtract亚细胞蛋白质组提取试剂盒(默克Calbiochem公司(Calbiochem-Merck KGaA)，达姆施塔特(Darmstadt)，德国)来制备膜和胞质级分。用BCA试剂(皮尔斯公司，罗克福德，美国伊利诺伊州)来定量蛋白质提取物，并且通过10％SDS-PAGE解析15mg每个样品。如前所述地使用4型抗葡萄糖转运蛋白(GLUT4)抗体(北部生物技术公司(Upstate Biotechnology)，普莱西德湖(Lake Placid)，美国纽约州)和抗围脂滴蛋白抗体(圣克鲁斯生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology,Inc.))进行蛋白质印迹分析(马内斯基等人
2012)。通过用抗肌动蛋白抗体(圣克鲁斯生物技术公司)再探测膜来验证相等的蛋白质负载。使用Adobe Photoshop软件进行谱带强度的光密度分析。

[0417] 肝组织学

[0418] 通过肝切片的油红O染色评估肝脂肪变性。将冷冻切片在低温恒温器中切割，并且在室温(RT)下在4％多聚甲醛中固定20分钟。然后，将切片用异丙醇处理2-5分钟，并且用油红O染色20分钟。通过用水(3:2)稀释储备溶液(100ml异丙醇中的0.3g油红O)接着过滤来制备油红O。在油红O染色之后，将切片在水中洗涤数次，并且用苏木精和伊红染色以突出肝细胞核。最后，对这些切片进行拍照，并且在使用Adobe Photoshop软件进行背景扣除之后，进行油红O正性的计算机辅助定量。

[0419] 肝切片中的炎症标志物的免疫组织化学

[0420] 将肝切片与抗不同炎症标志物(例如，TNFα、Cd68、Il-6、Il-1b、以及Il-12)的第一抗体在48℃下孵育过夜。将切片在PBS中冲洗并且与生物素酰化的第二抗体孵育，并且然后与链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(Ultravision大容量检测系统anti-polyvalent，视觉实验公司(Lab Vision)，弗里蒙特(Fremont)，美国加利福尼亚州)一起孵育。用3',3'-二氨基联苯胺四盐酸盐作为色原体(西格玛-艾尔德里奇公司)使反应产物显影。通过省略第一抗体进行对照实验。使用Nikon Microphot-FXA显微镜对载玻片进行评估和拍照。在使用Adobe Photoshop软件进行背景扣除之后，进行针对炎症标志物的染色的计算机辅助定量。

[0421] 兔内脏脂肪前脂肪细胞的分离、表征、和分化

[0422] 如前所述地进行从VAT中分离兔前脂肪细胞(rPAD)(马内斯基等人2012)。简言之，将VAT样品用1mg/ml 2型胶原酶(西格玛-艾尔德里奇公司)消化1小时，用红细胞裂解缓冲液(155mM NH4Cl、10mM KHCO3、和0.1mM EDTA；在室温下10分钟)处理，然后在室温下以2000g离心10分钟，再悬浮于完全培养基(含有10％胎牛血清(FBS)、100mg/ml链霉素，100U/ml青霉素、2mM L-谷氨酰胺、以及1mg/ml两性霉素-B的DMEM；西格玛-艾尔德里奇公司)中，并且通过150mm筛网过滤以除去碎屑。最后，将细胞在95％空气-5％CO2的潮湿气氛中，在37℃下的完全培养基中培养。在培养4-5天之后，获得第0代(P0)的亚汇合(90％的细胞培养皿)和均质化的成纤维样细胞群。将亚汇合的细胞胰蛋白酶化并且铺在细胞培养皿(P1)中。对于所有实验，仅使用P1培养物，并且对每个实验组使用至少三种不同的rPAD制剂重复实验。如前所述，通过使用以下缀合单克隆抗体的流式细胞术表征rPAD：CD34-PE、CD45-FITC、CD31-FITC、CD14-PE、CD90-PE、CD106-FITC(BD Pharmingen公司，圣地亚哥(San Diego)，美国加利福尼亚州)、以及CD105-PE(安思尔公司(Ancell)，贝波特(Bayport)，美国明尼苏达州)(马内斯基等人2012)。在融合之后2天(时间0)，通过将rPAD暴露于5％气提的FBS补充的DMEM中的含有5mg/ml胰岛素、1mM地塞米松、和0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)的分化混合物(DIM)持续8天来诱导它们的分化。每48小时更换培养基，并且然后将细胞移入含有5mg/ml胰岛素的培养基中48小时。

[0423] 葡萄糖摄取

[0424] 如前所述地测量rPAD的葡萄糖摄取(马内斯基等人2012)。将暴露于DIM的rPAD在无血清培养基中培养24小时，接着在无葡萄糖的克雷伯磷酸盐缓冲液(2.5mmol Ca2C和1mg/ml BSA)中稀释的增加浓度的胰岛素(1、5、10、以及50nM)中孵育，以评估胰岛素依赖性刺激。在孵育期结束时，将rPAD进一步与3H-2-脱氧-D-葡萄糖(16mM(1mCi/ml)；ICN制药公司(ICN Pharmaceuticals)，科斯塔梅萨(Costa Mesa)，美国加利福尼亚州)一起孵育5分钟。用PBS洗涤细胞并且用0.5M NaOH裂解，并且通过使用β计数器(珀金埃尔默公司(Perkin-Elmer))的闪烁光谱法测量合并的放射性。将数据对蛋白质含量归一化。

[0425] 统计学分析

[0426] 对于如规定的n个实验，结果表示为平均值±S.E.M.。用一种单向ANOVA测试接着用图克-克拉默(Tukey-Kramer)事后分析来进行统计分析，以便评估各组之间的差异，并且将p<0.05视为显著。使用斯皮尔曼法(Spearman's method)评估相关性，并且用社会科学统计包(SPSS公司)关于Windows 15.0进行统计分析。在适当的时候，将逐步倍增线性回归应用于多变量分析。使用计算机程序ALLFIT计算半数最大响应有效浓度(EC50)值和最大效应(Ema)值。

[0427] 实例11：评估测试品在动物模型中的影响

[0428] 实验动物和饮食

[0429] 将动物在22℃下在12:12-小时光照-黑暗循环中单独圈养在标准笼子中。年龄约7周的雄性C57BL6(B6)或Lepob/Lepob小鼠购自杰克逊实验室(巴港，缅因州)。试验饮食来自Research Diets公司(新布朗斯维克(New Brunswick)，新泽西州)。为了诱导NASH，测试由高脂肪(40％千卡)和高果糖(22重量％)组成的饮食，其中脂肪的来源是反式脂肪(Primex部分氢化植物油起酥油，目录号D09100301)。将无果糖或胆固醇的低脂肪饮食(10％千卡/脂肪)用作对照饮食(目录号D09100304)。HTF饮食在诱导NASH时被认为是优越的，并且用于随后的研究。

[0430] 研究和药物给予

[0431] 为了表征在这些饮食上的Lepob/Lepob或B6小鼠的NASH发展，分别维持低脂肪饮食(LFD)，高反式脂肪、高果糖、高胆固醇(HTF)饮食或高猪油脂肪、高果糖、高胆固醇饮食(HLF)饮食8或12周。将小鼠皮下植入输送运载体(无菌水中的50％DMSO)或本申请的化合物(例如，OCA)，连同至少一种另外的治疗剂(例如，在此所述的那些)的单一渗透微型泵(型号2004；Alzet公司，丘珀蒂诺(Cupertino)，加利福尼亚州)。另外地或可替代地，小鼠可具有经由口服管饲法每日一次给予的运载体或本申请的药物组合物。每周测量体重。在基线(在泵植入的前一天)和终止时通过NMR(Echo Medical系统，休斯敦(Houston)，得克萨斯州)测量身体组成。

[0432] 为了评估体重减轻对肝脏终点的影响，重复如上所述进行LFD或HTF饮食的Lepob/Lepob小鼠中的起始研究。在LFD或HTF饮食上8周之后，将所有小鼠口服给予本申请的化合物(例如，OCA)，连同至少一种另外的治疗剂(例如，在此所述的那些)持续8或12周。

[0433] 在终止时，切除肝组织并且在10％中性缓冲福尔马林中固定(在室温下至少7天)。然后将肝组织用石蜡包埋、切片并装载并且用苏木精和伊红染色。为了使纤维化可视化，用天狼星红(西格玛-艾尔德里奇公司，圣路易斯(St Louis)，密苏里州)将另一组切片染色。
将切片首先用魏格特氏铁苏木精染色，接着用比布里希猩红、磷钨酸/磷钼酸、以及苯胺蓝处理。根据标准方案，使用靶向巨噬细胞标志物Mac-2的抗体(Cedarlane实验室，伯灵顿(Burlington)，北卡罗来纳州))来免疫染色第二组切片。由对处理条件不知情的病理学家进行所有组织学分析。

[0434] 使用改编自Folch等人的试验方案从肝中提取总肝脂质(生物化学期刊226,497(1957))。将大约0.5g冷冻的肝组织在10ml的2:1氯仿/甲醇溶液中均质化。使用无脂纸过滤匀浆，并且集中到预先称重的15-ml玻璃离心管中。接下来，添加另外的5ml的2:1氯仿/甲醇溶液，接着添加2.5ml的0.9％NaCl。随后将过滤的提取物混合并且以2,000rpm，10℃离心5分钟。弃去水层，并且用氮气冲洗管直到脂质沉淀干燥。将含有脂质沉淀的管重新称重，并且计算每克起始肝所提取的总脂质。

[0435] 为了进行蛋白质印迹分析，将切除的肝组织称重，然后在液氮中快速冷冻并且储存在-80℃下直至加工。如下从每个肝的碎片分离蛋白质。将冷冻的肝组织在干冰上压碎，并且然后在具有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液(目录号05892791001；Roche Complete Tablets；和0.6mM PMSF)中均质化。用BCA蛋白质测定试剂盒(皮尔斯公司，罗克福德，伊利诺伊州)测量澄清的上清液的蛋白质浓度。根据制造商的方案(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)，将肝组织裂解物(50μg)在减少的Nupage凝胶上分离并且转移到PVDF膜。在50-kDa和60-kDa标志物之间切割膜，并且用5％Blotto阻断；上半部分用1型抗胶原(1:350；目录号NBP1-30054；罗福斯生物制剂公司(Novus Biologicals)，利特尔顿(Littleton)，科罗拉多州)探查，下半部分用抗GAPDH(1:10,000；辣根过氧化物酶缀合的；目录号3683；细胞信号转导技术公司(Cell Signaling Technologies)，丹弗斯(Danvers)，马萨诸塞州)探查，以用于归一化。在与辣根过氧化物酶抗兔抗体孵育后，用增强的化学发光(皮尔斯公司)检测蛋白质表达，并且使用FluorChem系统(细胞生物科学公司(Cell Biosciences)，圣克拉拉(Santa Clara)，加利福利亚州)进行光密度测定。组织基因表达

[0436] 在终止时将肝切除、称重、在液氮中快速冷冻并且储存(-80℃)。使用TRI试剂(Ambion公司，奧斯汀(Austin)，德克萨斯州)与RNeasy柱(凯杰公司(Qiagen)，查茨沃斯(Chatsworth)，加利福尼亚州)提取总RNA，并且使用RETROscript RT-PCR逆转录系统(Ambion公司)产生cDNA。将定量实时PCR(ABI PRISM 7900序列检测系统；应用生物系统公司(Applied Biosystems)；福斯特城(Foster City)，加利福尼亚州)用于参与NASH病理学的基因(例如，参与脂肪变性、炎症和纤维化的基因)。可以使用Taqman基因表达assays-on-demand和Universal PCR主混合物(应用生物系统公司)进行测定。

[0437] 血浆激素和代谢物分析

[0438] 使用Olympus AU400e生物分析仪(奥林巴斯美国诊断公司，中心谷，宾夕法尼亚州)测量血浆葡萄糖、甘油三酯、总胆固醇、ALT、以及天冬氨酸转氨酶(AST)水平。用PBS将血浆样品1:10稀释，用于检测标准曲线范围内的ALT和AST。根据制造商的说明书(密理博公司，比尔里卡，马萨诸塞州)使用可商购获得的ELISA来测量总血浆脂联素。

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