作为5－HT4受体激动剂的氨基甲酸酯化合物
阅读：220发布：2020-10-05
专利汇可以提供作为5－HT4受体激动剂的氨基甲酸酯化合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供式(I)的新颖苯并咪唑 酮 －羧酰胺衍生的 氨 基 甲酸 酯5－HT4受体激动剂化合物：其中R1、R2、R3、R4、a和b在揭示内容中定义。本发明也提供包含所述化合物的医药组合物、使用所述化合物 治疗 与5－HT4受体活性相关的 疾病 的方法、和用于制备所述化合物的方法和中间体。，下面是作为5－HT4受体激动剂的氨基甲酸酯化合物专利的具体信息内容。
1.一种式(I)化合物：
或其医药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体，
其中：
R1为卤基或C1-3烷基，其中C1-3烷基视情况经羟基或卤基取代；
R2为氢或C1-3烷基，其中C1-3烷基视情况经羟基取代；
R3为C1-3烷基或氢；
R4为-(CH2)1-3C(O)NRaRb、
或R3和R4连同与其连接的氮原子形成选自下列的部分：
(i)式(a)的部分：
(ii)式(b)的部分：
(iii)式(c)的部分：
其中：
R5为-OC(O)NRaRb、-C(O)NRaRb、-NRdS(O)2C1-3烷基、-NRdC(O)Rc、 -NRdS(O)2NRaRb或-NRdC(O)ORe；
R6为-C(O)Rf、-(CH2)2ORg、-S(O)2NRaRb、-S(O)2C1-3烷基或-S(O)2(CH2)1-3S(O)2C1-3 烷基；
Ra、Rb和Rc独立地为氢或C1-3烷基；
Rd为氢或C1-3烷基，其中C1-3烷基视情况经羟基取代；
Re为C1-3烷基；
Rf为氢、C1-3烷基、四氢呋喃基或-NRaRb；
Rg为氢或C1-3烷基；
a为0、1或2；
b为0、1、2或3；
c为0、1或2；
d为1或2；且
e为1或2；
其限制条件为当c为0时，则d为2，且R5为-C(O)NRaRb；且当c为2时，则d 为1。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中a为0。
3.根据权利要求1所述的化合物，其中R2为乙基或异丙基。
4.根据权利要求1所述的化合物，其中b为1。
5.根据权利要求1所述的化合物，其中R3和R4连同与其连接的氮原子形成式(b) 的部分。
6.根据权利要求1所述的化合物，其中R3和R4连同与其连接的氮原子形成式(c) 的部分。
7.根据权利要求1所述的化合物，其中：
R2为乙基或异丙基；
R3为C1-3烷基；且
R4为-(CH2)1-3C(O)NRaRb或
或R3和R4连同与其连接的氮原子形成选自式(a)的部分、式(b)的部分和式 (c)的部分的部分；
其中R5为-OC(O)NRaRb或-C(O)NRaRb；
R6为-C(O)Rf、-(CH2)2ORg或-S(O)2NRaRb；
Ra、Rb和Rg独立地为氢或甲基；
Rf为甲基、四氢呋喃基或-NRaRb；
a为0；
b为1；
c为1或2；
d为1；且
e为1。
8.根据权利要求7所述的化合物，其中R3和R4连同与其连接的氮原子形成式(b) 的部分，其中R6为-C(O)Rf。
9.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物选自：
4-(四氢呋喃-2-羰基)哌嗪-1-甲酸3-{(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯 并咪唑-1-羰基)氨基]-8-氮杂双环-[3.2.1]辛-8-基}丙酯；
4-(2-羟乙基)哌嗪-1-甲酸3-{(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯并咪唑-1- 羰基)氨基]-8-氮杂双环-[3.2.1]辛-8-基}丙酯；
4-乙酰基-哌嗪-1-甲酸3-{(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢-苯并咪唑-1- 羰基)氨基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-8-基}丙酯；
4-二甲基氨甲酰基氧基哌啶-1-甲酸3-{(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢 苯并咪唑-1-羰基)氨基]-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-8-基}丙酯；
3-氨甲酰基哌啶-1-甲酸3-{(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢-苯并咪唑-1- 羰基)氨基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-8-基}丙酯；
1，1-二氧代-1λ6-硫代吗啉-4-甲酸3-{(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯 并咪唑-1-羰基)氨基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-8-基}丙酯；
(1，1-二氧代四氢-1λ6-噻吩-3-基)甲基氨基甲酸3-{(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代 -2，3-二氢苯并咪唑-1-羰基)氨基]-8-氮杂双环-[3.2.1]辛-8-基}丙酯；
(R)-2-氨甲酰基吡咯烷-1-甲酸3-{(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯并咪 唑-1-羰基)氨基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-8-基}丙酯；
4-乙酰基-[1，4]二氮杂环庚烷-1-甲酸3-{(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢- 苯并咪唑-1-羰基)氨基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-8-基}丙酯；
二甲基氨甲酰基甲基-甲基氨基甲酸3-{(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢 苯并咪唑-1-羰基)氨基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-8-基}丙酯；
4-二甲基氨甲酰基哌嗪-1-甲酸3-{(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯并 咪唑-1-羰基)氨基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-8-基}丙酯；
4-二甲基胺磺酰基哌嗪-1-甲酸3-{(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯并 咪唑-1-羰基)氨基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-8-基}丙酯；和
其医药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体。
10.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物为1，1-二氧代-1λ6-硫代吗啉-4-甲酸 3-{(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯并咪唑-1-羰基)氨基]-8-氮杂双环 [3.2.1]辛-8-基}丙酯或其医药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体。
11.一种医药组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求1至10中任一权利要求所述 的化合物和医药学上可接受的载剂。
12.根据权利要求1至10中任一权利要求所述的化合物，其用于治疗。
13.一种根据权利要求1至10中任一权利要求所述的化合物的用途，其用于制造供治 疗哺乳动物与5-HT4受体活性相关的医学病况的药剂。
14.根据权利要求13所述的用途，其中所述医学病况为胃肠道活动性降低的病症。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述活动性降低的病症为慢性便秘、便秘型肠 易激综合征、糖尿病性和自发性胃轻瘫或功能性消化不良。
16.一种用于制备式(I)化合物、或其盐或溶剂合物或立体异构体的方法：
其中R1、R2、R3、R4、a和b如权利要求1中所定义，所述方法包含：
(a)使式(III)化合物：
与式(IV)化合物反应：
其中L1为离去基团；或
(b)使式(V)化合物：
其中A为离去基团；
与式(VI)化合物反应：
以提供式(I)化合物或其盐或溶剂合物或立体异构体。
17.一种产物，其是根据权利要求16所述的方法制备。
18.一种治疗患有与5-HT4受体活性相关的医学病况的哺乳动物的方法，所述方法包括 投与所述哺乳动物治疗有效量的包含医药学上可接受的载剂和根据权利要求1至 10中任一权利要求所述的化合物的医药组合物。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述医学病况为肠易激综合征、慢性便秘、功 能性消化不良、胃排空延迟、胃食管反流病、胃轻瘫、手术后肠梗阻、肠假性阻塞 或药物诱发性延迟传输。
20.一种治疗哺乳动物胃肠道活动性降低的病症的方法，所述方法包括投与所述哺乳动 物治疗有效量的包含医药学上可接受的载剂和根据权利要求1至10中任一权利要 求所述的化合物的医药组合物。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述活动性降低的病症为慢性便秘、便秘型肠 易激综合征、糖尿病性和自发性胃轻瘫或功能性消化不良。
22.一种研究包含5-HT4受体的生物系统或样品的方法，所述方法包含：
(a)使所述生物系统或样品与根据权利要求1至10中任一权利要求所述的化合 物接触；和
(b)测定由所述化合物对所述生物系统或样品引起的效应。
技术领域
本发明涉及用作5-HT4受体激动剂的苯并咪唑酮-羧酰胺衍生的氨基甲酸酯化合物。 本发明也涉及包含所述化合物的医药组合物、使用所述化合物用于治疗或防止由5-HT4 受体活性介导的医学病况的方法，和用于制备所述化合物的方法和中间体。
背景技术
血清素(5-羟基色胺，5-HT)为广泛分布在整个身体(同时在中枢神经系统和周边 系统两者中)的神经传递素。已识别至少七种血清素受体的亚型，且血清素与这些不同 受体的相互作用与多种生理功能相关联。因此，实质上关注于开发靶向特异性5-HT受 体亚型的治疗剂。
具体来说，5-HT4受体的表征和与其相互作用的药剂的识别已成为重大新近活动的 焦点。(例如参看Langlois和Fischmeister的综述，药物化学杂志(J.Med.Chem.)2003， 46，319-344。)5-HT4受体激动剂用于治疗胃肠道活动性降低的病症。所述病症包括肠 易激综合征(IBS)、慢性便秘、功能性消化不良、胃排空延迟、胃食管反流病(GERD)、 胃轻瘫、手术后肠梗阻、肠假性阻塞和药物诱发性延迟传输。另外，建议某些5-HT4受 体激动剂化合物可用于治疗包括认知病症、行为病症、情感病症和自主功能控制病症的 中枢神经系统病症。
尽管调节5-HT4受体活性的药剂有广泛效用，但目前仅少数5-HT4受体激动剂化合 物用于临床用途中。
因此，需要以最小副作用达到其所要效应的新颖5-HT4受体激动剂。优选药剂可拥 有(除其它特性以外)改良的选择性、效能、药物动力学特性和/或作用持续时间。
具体来说，5-HT4受体的表征和与其相互作用的药剂的识别已成为重大新近活动的 焦点。(例如参看Langlois和Fischmeister的综述，药物化学杂志(J.Med.Chem.)2003， 46，319-344。)5-HT4受体激动剂用于治疗胃肠道活动性降低的病症。所述病症包括肠 易激综合征(IBS)、慢性便秘、功能性消化不良、胃排空延迟、胃食管反流病(GERD)、 胃轻瘫、手术后肠梗阻、肠假性阻塞和药物诱发性延迟传输。另外，建议某些5-HT4受 体激动剂化合物可用于治疗包括认知病症、行为病症、情感病症和自主功能控制病症的 中枢神经系统病症。
尽管调节5-HT4受体活性的药剂有广泛效用，但目前仅少数5-HT4受体激动剂化合 物用于临床用途中。
因此，需要以最小副作用达到其所要效应的新颖5-HT4受体激动剂。优选药剂可拥 有(除其它特性以外)改良的选择性、效能、药物动力学特性和/或作用持续时间。
发明内容
本发明提供一种新颖化合物，其具有5-HT4受体激动剂活性。除其它特性以外，已 发现本发明的化合物为有效和选择性5-HT4受体激动剂。另外，发现本发明的化合物展 现在口服投药后预期具有良好生物可用性的有利药物动力学特性。
因此，本发明提供一种式(I)化合物：
或其医药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体，
其中：
R1为卤基或C1-3烷基，其中C1-3烷基视情况经羟基或卤基取代；
R2为氢或C1-3烷基，其中C1-3烷基视情况经羟基取代；
R3为C1-3烷基或氢；
R4为-(CH2)1-3C(O)NRaRb，
或R3和R4连同与其连接的氮原子形成一部分，所述部分选自：
(i)式(a)的部分：
(ii)式(b)的部分：
(iii)式(c)的部分：
其中：
R5为-OC(O)NRaRb、-C(O)NRaRb、-NRdS(O)2C1-3烷基、-NRdC(O)Rc、-NRdS(O)2NRaRb 或-NRdC(O)ORe；
R6为-C(O)Rf、-(CH2)2ORg、-S(O)2NRaRb、-S(O)2C1-3烷基或-S(O)2(CH2)1-3S(O)2C1-3 烷基；
Ra、Rb和Rc独立地为氢或C1-3烷基；
Rd为氢或C1-3烷基，其中C1-3烷基视情况经羟基取代；
Re为C1-3烷基；
Rf为氢、C1-3烷基、四氢呋喃基或-NRaRb；
Rg为氢或C1-3烷基；
a为0、1或2；
b为0、1、2或3；
c为0、1或2；
d为1或2；且
e为1或2；
其限制条件为当c为0时，则d为2，且R5为-C(O)NRaRb；且当c为2时，则d为 1。
本发明也提供一种包含本发明的化合物和医药学上可接受的载剂的医药组合物。
此外，本发明提供一种治疗与5-HT4受体活性相关的疾病或病况(例如，胃肠道活 动性降低的病症)的方法，所述方法包含投与哺乳动物治疗有效量的化合物或本发明的 医药组合物。
本发明的化合物也可用作研究工具(也就是用以研究生物系统或样品或用于研究其 它化合物的活性)。因此，在其方法方面的另一者中，本发明提供一种使用式(I)化合 物或其医药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体作为用于研究生物系统或样品或 用于发现新颖5-HT4受体激动剂的研究工具的方法，所述方法包含使生物系统或样品与 本发明的化合物接触且测定由所述化合物对于生物系统或样品引起的效应。
在独立和不同方面中，本发明也提供用于制备本发明的化合物的本文所述的合成方 法和中间体。
本发明也提供一种如本文所述用于药物治疗中的本发明的化合物，以及本发明的化 合物在制造供治疗哺乳动物与5-HT4受体活性相关的疾病或病况(例如，胃肠道活动性 降低的病症)的调配物或药剂中的用途。
附图说明
无
因此，本发明提供一种式(I)化合物：
或其医药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体，
其中：
R1为卤基或C1-3烷基，其中C1-3烷基视情况经羟基或卤基取代；
R2为氢或C1-3烷基，其中C1-3烷基视情况经羟基取代；
R3为C1-3烷基或氢；
R4为-(CH2)1-3C(O)NRaRb，
或R3和R4连同与其连接的氮原子形成一部分，所述部分选自：
(i)式(a)的部分：
(ii)式(b)的部分：
(iii)式(c)的部分：
其中：
R5为-OC(O)NRaRb、-C(O)NRaRb、-NRdS(O)2C1-3烷基、-NRdC(O)Rc、-NRdS(O)2NRaRb 或-NRdC(O)ORe；
R6为-C(O)Rf、-(CH2)2ORg、-S(O)2NRaRb、-S(O)2C1-3烷基或-S(O)2(CH2)1-3S(O)2C1-3 烷基；
Ra、Rb和Rc独立地为氢或C1-3烷基；
Rd为氢或C1-3烷基，其中C1-3烷基视情况经羟基取代；
Re为C1-3烷基；
Rf为氢、C1-3烷基、四氢呋喃基或-NRaRb；
Rg为氢或C1-3烷基；
a为0、1或2；
b为0、1、2或3；
c为0、1或2；
d为1或2；且
e为1或2；
其限制条件为当c为0时，则d为2，且R5为-C(O)NRaRb；且当c为2时，则d为 1。
本发明也提供一种包含本发明的化合物和医药学上可接受的载剂的医药组合物。
此外，本发明提供一种治疗与5-HT4受体活性相关的疾病或病况(例如，胃肠道活 动性降低的病症)的方法，所述方法包含投与哺乳动物治疗有效量的化合物或本发明的 医药组合物。
本发明的化合物也可用作研究工具(也就是用以研究生物系统或样品或用于研究其 它化合物的活性)。因此，在其方法方面的另一者中，本发明提供一种使用式(I)化合 物或其医药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体作为用于研究生物系统或样品或 用于发现新颖5-HT4受体激动剂的研究工具的方法，所述方法包含使生物系统或样品与 本发明的化合物接触且测定由所述化合物对于生物系统或样品引起的效应。
在独立和不同方面中，本发明也提供用于制备本发明的化合物的本文所述的合成方 法和中间体。
本发明也提供一种如本文所述用于药物治疗中的本发明的化合物，以及本发明的化 合物在制造供治疗哺乳动物与5-HT4受体活性相关的疾病或病况(例如，胃肠道活动性 降低的病症)的调配物或药剂中的用途。
附图说明
无
具体实施方式
本发明提供一种式(I)的新颖苯并咪唑酮-羧酰胺衍生的氨基甲酸酯5-HT4受体激 动剂，或其医药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体。以下取代基和值意欲提供本 发明的多个方面的代表性实例。这些代表值意欲进一步定义所述方面，且不欲排除其它 值或限制本发明的范畴。
在本发明的特定方面中，R1为卤基或C1-3烷基；或R1为氟基、氯基、溴基或甲基。
在一特定方面中，R2为氢。
在另一特定方面中，R2为C1-3烷基，其中C1-3烷基视情况经羟基取代。
在又一特定方面中，R2为氢或C1-3烷基。
在本发明的其它特定方面中，R2为甲基、乙基、丙基或异丙基；R2为乙基或异丙基； 或R2为异丙基。
在特定方面中，R3为C1-3烷基；R3为甲基或乙基；或R3为甲基。
在一特定方面中，R4为-(CH2)1-3C(O)NRaRb。
在另一特定方面中，R4为
在另一特定方面中，R4为-(CH2)1-3C(O)NRaRb或
在本发明的一特定方面中，R3和R4连同与其连接的氮原子形成选自式(a)的部分、 式(b)的部分和式(c)的部分的部分。
在一特定方面中，R3和R4连同与其连接的氮原子形成式(a)的部分。在另一特定 方面中，R3和R4连同与其连接的氮原子形成式(a)的部分，其中R5为-OC(O)NRaRb 或-C(O)NRaRb。
在一特定方面中，R3和R4连同与其连接的氮原子形成式(b)的部分。在其它特定 方面中，R3和R4连同与其连接的氮原子形成式(b)的部分，其中R6为-C(O)Rf、-(CH2)2ORg 或-S(O)2NRaRb；或R6为-C(O)Rf，且e为1。
在本发明的又一方面中，R3和R4连同与其连接的氮原子形成式(c)的部分。
在特定方面中，Ra、Rb、Rc、Rd和Rg独立地为氢、甲基或乙基；或Ra、Rb、Rc、 Rd和Rg独立地为氢或甲基。
在特定方面中，Re为甲基或乙基：或Re为甲基。
在特定方面中，Rf为C1-3烷基、四氢呋喃基或-NRaRb或Rf为甲基、四氢呋喃基或 -NRaRb。
在另一特定方面中，Rf为四氢呋喃基。
在其它特定方面中，Rf为C1-3烷基或Rf为甲基。
在又一特定方面中，Rf为-NRaRb，其中Ra和Rb如本文所定义。
在特定方面中，a为0或1；或a为0或2。在另一特定方面中，a为0。
在特定方面中，b为0、1或2；或b为1或2。在另一特定方面中，b为1。
在一特定方面中，c为1或2。在另一特定方面中，c为1。
在一特定方面中，d为1。
在一特定方面中，e为1。
在一方面中，本发明提供一种式(I)化合物，其中c为1或2；d为1；且e为1。
在另一方面中，本发明提供一种式(I)化合物，其中：
R3为C1-3烷基；且
R4为-(CH2)1-3C(O)NRaRb或
或R3和R4连同与其连接的氮原子形成一选自式(a)的部分、式(b)的部分和式 (c)的部分的部分；
其中：
R5为-OC(O)NRaRb或-C(O)NRaRb；且
R6为-C(O)Rf、-(CH2)2ORg或-S(O)2NRaRb。
在又一方面中，本发明提供一种式(I)化合物，其中R3和R4连同与其连接的氮原 子形成选自式(a)的部分、式(b)的部分和式(c)的部分的部分；其中：
R5为-OC(O)NRaRb或-C(O)NRaRb；
R6为-C(O)Rf、-(CH2)2ORg或-S(O)2NRaRb；
Ra、Rb和Rg独立地为氢或甲基；
Rf为甲基、四氢呋喃基或-NRaRb；
c为1或2；d为1；且e为1。
在又一方面中，本发明提供一种式(I)化合物，其中：
R2为乙基或异丙基；
R3为C1-3烷基；且
R4为-(CH2)1-3C(O)NRaRb或
或R3和R4连同与其连接的氮原子形成选自式(a)的部分、式(b)的部分和式(c) 的部分的部分；其中：
R5为-OC(O)NRaRb或-C(O)NRaRb；
R6为-C(O)Rf、-(CH2)2ORg或-S(O)2NRaRb；
Ra、Rb和Rg独立地为氢或甲基；
Rf为甲基、四氢呋喃基或-NRaRb；
a为0；c为1或2；d为1；且e为1。
说明本文所用的化学命名惯例用于实例1的化合物：
根据由MDL信息系统(MDL Information Systems)，GmbH(德国法兰克福)所提 供的AutoNom软件，将其命名为4-(四氢呋喃-2-羰基)哌嗪-1-甲酸3-{(1S，3R，5R)-3-[(3- 异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯并咪唑-1-羰基)氨基]-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-8-基}丙酯。符号 (1S，3R，5R)描述与双环系统相关的键的相对方位，所述键描绘成为实心和虚线楔形。在 上述本发明的所有化合物中，苯并咪唑酮-羧酰胺相对氮杂双环辛烷基为内向。
可特别提及以下化合物：
4-(四氢呋喃-2-羰基)哌嗪-1-甲酸3-{(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯并咪 唑-1-羰基)氨基]-8-氮杂双环-[3.2.1]辛-8-基}丙酯；
4-(2-羟乙基)哌嗪-1-甲酸3-{(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯并咪唑-1-羰 基)氨基]-8-氮杂双环-[3.2.1]辛-8-基}丙酯；
4-乙酰基-哌嗪-1-甲酸3-{(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢-苯并咪唑-1-羰基) 氨基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-8-基}丙酯；
4-二甲基氨甲酰基氧基哌啶-1-甲酸3-{(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯并 咪唑-1-羰基)氨基]-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-8-基}丙酯；
3-氨甲酰基哌啶-1-甲酸3-{(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢-苯并咪唑-1-羰 基)氨基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-8-基}丙酯；
1，1-二氧代-1λ6-硫代吗啉-4-甲酸3-{(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯并咪 唑-1-羰基)氨基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-8-基}丙酯；
(1，1-二氧代四氢-1λ6-噻吩-3-基)甲基氨基甲酸3-{(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代 -2，3-二氢苯并咪唑-1-羰基)氨基]-8-氮杂双环-[3.2.1]辛-8-基}丙酯；
(R)-2-氨甲酰基吡咯烷-1-甲酸3-{(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯并咪唑 -1-羰基)氨基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-8-基}丙酯；
4-乙酰基-[1，4]二氮杂环庚烷-1-甲酸3-{(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢-苯 并咪唑-1-羰基)氨基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-8-基}丙酯；
二甲基氨甲酰基甲基-甲基氨基甲酸3-{(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯 并咪唑-1-羰基)氨基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-8-基}丙酯；
4-二甲基氨甲酰基哌嗪-1-甲酸3-{(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯并咪唑 -1-羰基)氨基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-8-基}丙酯；和
4-二甲基胺磺酰基哌嗪-1-甲酸3-{(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯并咪唑 -1-羰基)氨基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-8-基}丙酯。
如由上述列出的特定化合物所示范，本发明的化合物可含有一个或一个以上手性中 心。因此，除非另外指出，否则本发明包括外消旋混合物、纯立体异构体和所述异构体 的立体异构体富集的混合物。当展示特定立体异构体时，所属领域的技术人员应了解， 除非另外指出，否则较小量的其它立体异构体可存在于本发明的组合物中，其限制条件 为组合物作为整体的任何效用并未由所述其它异构体的存在消除。
定义
当描述本发明的化合物、组合物和方法时，除非另外指出，否则以下术语具有以下 含义。
术语“烷基”意思是单价饱和烃基，其可为直链或分枝链或其组合。代表性烷基包 括(例如)甲基、乙基、正丙基(n-Pr)、异丙基(i-Pr)、正丁基(n-Bu)、仲丁基、异 丁基、叔丁基等等。
术语“卤基”意思是氟基、氯基、溴基或碘基。
术语“化合物”意思是合成制备或以任何其它方法(诸如通过代谢作用)产生的 化合物。
术语“治疗有效量”意思是当投与需要治疗的患者时足以实现治疗的量。
如本文所用的术语“治疗”意思是治疗诸如哺乳动物(尤其为人类)的患者的疾病、 病症或医学病况，其包括：
(a)防止疾病、病症或医学病况发生，也就是患者的预防治疗；
(b)改善疾病、病症或医学病况，也就是消除或引起患者的疾病、病症或医学病 况的消退；
(c)抑制疾病、病症或医学病况，也就是减慢或阻止患者的疾病、病症或医学病 况的发展；或
(d)减轻患者的疾病、病症或医学病况的症状。
术语“医药学上可接受的盐”意思是由酸或碱制备的可接受用于给患者(诸如哺乳 动物)投药的盐。所述盐可衍生自医药学上可接受的无机或有机酸和来源于医药学上可 接受的碱。通常，本发明化合物的医药学上可接受的盐由酸制备。
衍生自医药学上可接受的酸的盐包括(但不限于)乙酸、己二酸、苯磺酸、苯甲酸、 樟脑磺酸、柠檬酸、乙磺酸、反丁烯二酸、葡萄糖酸、谷氨酸、氢溴酸、盐酸、乳酸、 顺丁烯二酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、粘酸、硝酸、泛酸、磷酸、丁二酸、硫酸、酒 石酸、对甲苯磺酸、羟-2-萘甲酸(xinafoic)(1-羟基-2-萘甲酸)、萘-1，5-二磺酸等等。
术语“溶剂合物”意思是由溶质(也就是本发明的化合物或其医药学上可接受的盐) 的一个或一个以上分子和溶剂的一个或一个以上分子形成的络合物或聚集体。所述溶剂 合物通常为具有实质上固定的溶质与溶剂摩尔比的结晶固体。代表性溶剂包括例如水、 甲醇、乙醇、异丙醇、乙酸等等。当溶剂为水时，形成的溶剂合物为水合物。
应了解术语“或其医药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体”意欲包括盐、溶 剂合物和立体异构体的所有排列组合，诸如式(I)化合物的立体异构体的医药学上可接 受盐的溶剂合物。
术语“离去基团”意思是在诸如亲核取代反应的取代反应中可由另一官能团或原子 置换的官能团或原子。例如，代表性离去基团包括氯基、溴基和碘基；诸如甲磺酸酯基、 甲苯磺酸酯基、溴苯磺酸酯基、硝基苯磺酸酯基等等的磺酸酯基；诸如乙酰氧基、三氟 乙酰氧基等等的酰氧基。术语“离去基团”进一步包括诸如-OC6F5、-CCl3、对-OC6H4NO2 和咪唑基的基团。
术语“其经保护的衍生物”意思是指定化合物的衍生物，其中化合物的一个或一个 以上官能团经保护基或阻隔基保护免于不需要的反应。可被保护的官能团包括(例如) 羧酸基、氨基、羟基、硫醇基、羰基等等。羧酸的代表性保护基包括酯类(诸如对甲氧 基苯甲酯)、酰胺类和酰肼类；氨基的代表性保护基包括氨基甲酸酯类(诸如叔丁氧基 羰基)和酰胺类；羟基的代表性保护基包括醚类和酯类；硫醇基的代表性保护基包括硫 醚类和硫酯类；羰基的代表性保护基包括缩醛类和缩酮类；等等。所属领域的技术人员 熟知所述保护基，且描述于(例如)T.W.Greene和G.M.Wuts有机合成中的保护基 (Protecting Groups in Organic Synthesis)，第三版，Wiley，纽约(New York)，1999和其 中引用的文献中。
术语“氨基保护基”意思是适合于防止氨基氮上的不想要的反应的保护基。代表性 氨基保护基包括(但不限于)甲酰基；例如烷酰基的酰基，诸如乙酰基；烷氧羰基，诸 如叔丁氧基羰基(Boc)；芳基甲氧基羰基，诸如苯甲氧基羰基(Cbz)和9-芴基甲氧基 羰基(Fmoc)；芳甲基，诸如苯甲基(Bn)、三苯甲基(Tr)和1，1-二-(4′-甲氧基苯基) 甲基；硅烷基，诸如三甲基硅烷基(TMS)和叔丁基二甲基硅烷基(TBDMS)；等等。
通用合成程序
本发明的化合物可使用以下通用方法和程序由易得的起始物质来制备。尽管本发明 的特定方面于以下流程中说明，但所属领域的技术人员会认可本发明的所有方面可使用 本文所述的方法制备或通过使用所属领域的技术人员已知的其它方法、试剂和起始物质 来制备。也应了解在给定典型或优选方法条件(也就是反应温度、时间、试剂的摩尔比、 溶剂、压力等)的情况下，除非另外规定否则也可使用其它方法条件。最佳反应条件可 随所用的特殊试剂或溶剂而变化，但所属领域的技术人员可由路线最优化程序来确定所 述条件。
另外，如所属领域的技术人员可显而易见，常规保护基必需防止某些官能团经历不 需要的反应。在此项技术中用于特定官能团的适合保护基的选择，和用于保护和去保护 的适合条件已为我们所熟知。举例来说，多数保护基和其引入和去除描述于T.W.Greene 和G.M.Wuts，有机合成中的保护基，第三版，Wiley，纽约，1999和其中引用的文献中。
除非另外指出，否则在以下流程中所示的取代基和变量具有本文所提供的定义。
在一个合成方法中，式(I)化合物可如流程A中所说明来制备。
流程A
使苯并咪唑酮-羧酰胺莨菪烷中间体(III)与式(IV)化合物(其中L1为离去基团) 反应以提供式(I)化合物。通常，L1为SN2-有利的离去基团，诸如氯基、碘基或溴基。 在惰性稀释剂中，式(IV)化合物与介于约0.25与约1.5当量之间的苯并咪唑酮-羧酰 胺莨菪烷(III)在诸如N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)的碱和诸如碘化钠的催化剂存在下 接触。适合的惰性稀释剂包括二甲基甲酰胺、乙腈、四氢呋喃、N-甲基-2-吡咯烷酮等等。 适合的碱也包括(例如)三乙胺、1，8-二氮杂双环-[5.4.0]十一-7-烯(DBU)和碳酸钾。 适合的催化剂也包括(例如)碘化钾和四丁基碘化铵。这个反应通常在约40℃至约100℃ 的温度下进行，历时介于约2与约24小时之间或直到反应大体上完全。
通过常规程序分离且提纯式(I)的产物。举例来说，所述产物可减压浓缩直到干燥， 在弱酸水溶液中溶解且通过高效液相色谱法(HPLC)提纯。
应了解在使用式(III)化合物的本文所述的流程A的方法和其它方法中，如所属领 域的技术人员所知式(III)化合物可以游离碱的形式或以盐的形式提供，其中(若必要) 适当调节反应条件。
式(III)化合物可如以下流程B中所示来制备。
流程B
在流程B中，使中间体(a)(视情况经取代的1，3-二氢苯并-咪唑-2-酮)与中间体 (b)反应以提供式(V)化合物，其中W为离去基团(诸如卤基，也就是氟基、氯基或 溴基)且A为选定之离去基团使得其在不同于W的条件下反应(诸如-OC6F5、-CCl3、 对-OC6H4NO2或咪唑-1-基)；或W和A各为咪唑-1-基，，使式(V)化合物与中间体(c) (其中P1表示诸如Boc的氨基保护基)反应以提供中间体(d)。通过标准程序将保护基 P1从中间体(d)去除以提供式(III)化合物。
虽然最佳反应条件可视所用的特定反应物或溶剂而变化，但所属领域的技术人员可 易于由路线最优化程序来确定所述条件。
举例来说，在使用氯甲酸4-硝基苯酯作为中间体(b)的示范性方法中，使苯并咪 唑酮中间体(a)在惰性气氛下在强碱(诸如氢化钠、二异丙基胺锂和正丁基锂)存在 下溶解于诸如四氢呋喃、乙醚、DMF或其组合的惰性稀释剂中，且使其与介于约1与约 1.3当量之间的氯甲酸4-硝基苯酯接触。在约0℃至约40℃下搅拌混合物，历时介于约 12与约24小时之间或直到反应大体上完全，以形成活化酯(式(V)化合物)。分离且 提纯式(V)化合物，或使其与经保护的氨基-莨菪烷(中间体(c))在惰性稀释剂(诸 如四氢呋喃)存在下在约30℃至约90℃的温度下原位反应，历时介于约10与约24小 时之间以提供经保护的中间体(d)。
使用常规方法，将氨基保护基P1从中间体(d)去除以提供式(III)的苯并咪唑酮- 羧酰胺莨菪烷化合物。使用氯甲酸4-硝基苯酯作为中间体(b)来制备中间体(III)的 上述方法的变化描述于以下实例13中。
或者，式(I)化合物可如以下流程C中所示来制备。
流程C
使苯并咪唑酮-羧酰胺中间体(V)与式(VI)的莨菪烷-伸烷基-羧酰胺化合物反应 以提供式(I)化合物。分离且提纯式(V)化合物(其合成描述于流程B中)，或使其 与式(VI)化合物在约30℃至约90℃的温度范围下在诸如四氢呋喃的惰性稀释剂存在 下原位反应，历时介于约10与约24小时之间，或直到反应完全，以提供式(I)化合物。
苯并咪唑酮中间体(a)可如以下流程D中所示来制备。
流程D
在流程D中，使视情况经取代的2-氟硝基苯与伯胺(中间体(e))反应以提供中间 体(f)，所述中间体(f)被还原成二氨基苯(中间体(g))。使二氨基苯与羰基二咪唑 在诸如四氢呋喃的惰性稀释剂存在下，在约20℃至约40℃的温度下反应，历时介于约 12与约30小时之间，以提供苯并咪唑酮中间体(a)。
中间体(a)的化合物的代表性合成于以下制备1中描述。中间体(a)的经取代化 合物也易于由类似于文献中所述的彼等程序来制备。例如参看化学研究杂志(The Journal of Chemical Research)(1)，21-22(2005)；杂原子化学(Heteroatom Chemistry)， 5(5/6)：437-40(1994)和德国专利(Ger.Offen.)，3839743，1990年5月31日。
经保护的氨基莨菪烷(在本申请案中所述的反应中使用的中间体(c))由易可得的 起始物质制备。举例来说，当氨基保护基P1为Boc时，经保护的氨基莨菪烷可如以下 流程E中所示制备。
流程E
如以下制备2中详细描述，使2，5-二甲氧基四氢呋喃与介于约1与2当量之间的苯 甲胺和稍微过量(例如约1.1当量)的1，3-丙酮二甲酸在酸性水溶液中在诸如磷酸氢二 钠的缓冲剂存在下接触以制备经Boc-保护的中间体(c′)。将反应混合物加热到介于约 60℃与约100℃之间以确保产物(8-苯甲基-8-氮杂双环-[3.2.1]辛-3-酮，通常为N-苯甲基 莨菪酮)中任何羧化中间体的脱羧基作用。
通常使N-苯甲基莨菪酮中间体与稍微过量(例如约1.1当量)的二碳酸二叔丁酯(通 常为(Boc)2O)在氢气氛下在过渡金属催化剂存在下反应以提供3-氧代-8-氮杂双环[3.2.1] 辛烷-8-甲酸叔丁酯。反应通常在环境温度下进行约12至约72小时。最终，使3-氧代-8- 氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯与过量较多(例如至少约25当量)的甲酸铵在诸如甲 醇的惰性稀释剂中，在过渡金属催化剂存在下接触，以提供在具有较高立体特异性的内 向构型(例如内外比＞99∶1)产物(中间体(c))。反应通常在环境温度下进行约12至约 72小时或直到反应大体上完全的。有利地逐份添加甲酸铵试剂。举例来说，使3-氧代-8- 氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯与初始约15至约25当量的一部分甲酸铵接触。在约 12至约36小时的间隔后，又添加一部分的约5至约10当量的甲酸铵其他。在类似间隔 后可重复后续添加。产物(中间体(c))可通过诸如碱萃取的常规程序提纯。
如以下在流程F中所述，式(IV)化合物可易于通过标准程序由一般起始物质来制 备。
流程F
在流程F中，使中间体(h)(其中L1和L2为离去基团)与仲胺(i)反应以提供式 (IV)化合物。使仲胺(i)溶解于诸如二氯甲烷的惰性稀释剂中，且在诸如N，N-二异丙 基乙胺的碱存在下在约0℃至约40℃的温度范围下添加中间体(h)，历时约30分钟至 约4小时。产物(式(IV)化合物)可通过诸如HPLC的常规程序提纯。
通常，L1和L2为卤基离去基团，诸如氯基、碘基、溴基；甲磺酸酯也可用作离去 基团L1。适合的碱可包括(例如)三乙胺、DBU和碳酸钾。适合的惰性稀释剂可包括 乙腈、四氢呋喃和N，N-二甲基甲酰胺。
式(h)和(i)的中间体化合物为一可购得的或可由易可得的起始物质合成。多种 仲胺(也就是可用于流程F中的式(I)的中间体化合物)的合成在本文的实例部分中 描述。
式(VI)化合物可如流程G中所示来制备。
流程G
在流程G中，中间体(j)(其中P2为氨基保护基)与式(IV)化合物反应以提供经 保护的中间体(k)，接着所述中间体(k)经去保护以提供式(VI)化合物。流程G的 反应通常在用于流程A的反应的上述胺偶合条件下进行。
通过以氨基保护基P2保护经保护的氨基莨菪烷中间体(c)的氨基氮，且接着从氮 杂双环辛烷基的氮去除P1可制备式(j)的化合物。选择保护基P1和P2以使其可在不同 条件下加以去除。举例来说，当选择P1为Boc时，则Cbz可用作P2。保护基Boc通常 通过用诸如三氟乙酸的酸的处理来去除以提供中间体的酸式盐。中间体的酸式盐(若需 要)可通过碱的常规处理转化为游离碱。保护基Cbz可通过经由诸如碳载钯的适合金属 催化剂氢解便利地去除。关于特定反应条件和制备本发明的代表性化合物或其中间体的 其它程序的更多细节在以下实例中描述。
因此，在一方法方面中，本发明提供一种制备式(I)化合物或其盐或溶剂合物或立 体异构体的方法，其中R1、R2、R3、R4、a和b如本文所定义，所述方法包含：
(a)使式(III)化合物：
与式(IV)化合物：
(其中L1为离去基团)反应；或
(b)使式(V)化合物：
(其中A为离去基团)；
与式(VI)化合物：
以提供式(I)化合物，或其盐或溶剂合物或立体异构体。
在另外的实施例中，本发明涉及本文所述的其它方法，且涉及通过本文所述的任何 方法制备的产物。
医药组合物
本发明的苯并咪唑酮羧酰胺衍生的氨基甲酸酯化合物通常以医药组合物的形式投 药给患者。所述医药组合物可由投药的任何可接受途径投与患者，所述途径包括(但不 限于)口服、直肠、阴道、鼻、吸入、局部(包括经皮)和肠道外模式的投药。
因此，在其组合物方面的一者中，本发明涉及一种医药组合物，其包含医药学上可 接受的载剂或赋形剂和治疗有效量的式(I)化合物或其医药学上可接受的盐。若需要， 则所述医药组合物视情况可含有其它治疗剂和/或调配剂。
本发明的医药组合物通常含有治疗有效量的本发明的化合物或其医药学上可接受 的盐。通常，所述医药组合物可含有约0.1至约95重量％的活性剂；优选为约5至约70 重量％；且更优选为约10至约60重量％的活性剂。任何常规的载剂或赋形剂可用于本 发明的医药组合物中。特定载剂或赋形剂的选择，或载剂或赋形剂的组合，可取决于用 于治疗特定患者的投药模式或医学病况或疾病状态的类型。在这点上，用于特定模式投 药的适合医药组合物的制备正好在熟习医药技术者的范畴内。另外，用于所述组合物的 成份可购自(例如)Sigma、P.O.Box 14508、St.Louis、MO 63178。为进一步说明，常 规调配技术描述于雷明登氏药学的理论与实践(Remington：The Science and Practice of Pharmacy)，第20版，Lippincott Williams&White，Baltimore，Maryland(2000)和H.C. Ansel等人，医药剂型和药物传递系统(Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems)，第7版，Lippincott Williams&White，Baltimore，Maryland(1999)中。
可用作医药学上可接受的载剂的材料的代表性实例包括(但不限于)下列：(1)糖， 诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素，诸如 微晶纤维素和其衍生物(诸如羧甲基纤维素钠盐、乙基纤维素和乙酸纤维素)；(4)粉 末黄耆胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石粉；(8)赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；(9) 油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇类， 诸如丙二醇；(11)多元醇，诸如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；(12)酯，诸 如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；(15) 褐藻酸；(16)无热原质水；(17)生理盐水；(18)林格氏液；(19)乙醇；(20)磷酸 盐缓冲溶液；和(21)其它用于医药组合物中的无毒相容性物质。
通常通过使本发明的化合物与医药学上可接受的载剂和一种或一种以上视情况可 选的成份充分且密切地混合或掺合来制备本发明的医药组合物。若必要或需要，接着使 用常规程序和设备将所得的均匀经掺合混合物加工成形或装入片剂、胶囊、药丸等等内。
本发明的医药组合物优选以单位剂型封装。术语“单位剂型”意思是适合于对患者 给药的物理上离散单元，也就是每一单元含有经计算从而单独或与一个或一个以上其他 单元组合产生所要治疗效应的预定量的活性剂。举例来说，所述单位剂型可为胶囊、片 剂、药丸等等。
在一优选实施例中，本发明的医药组合物适合于口服投药。用于口服投药的适合医 药组合物可为胶囊、片剂、药丸、锭剂、扁囊剂(cachets)、糖衣药丸、散剂、颗粒剂 的形式；或为水性或非水性液体中的溶液或悬浮液形式；或为水包油或油包水型液体乳 液形式；或为酏剂或糖浆形式；等等；每一者均含有预定量的本发明化合物作为活性成 份。
当意欲以固体剂型(也就是以胶囊、片剂、药丸等等形式)口服投药时，本发明的 医药组合物通常可包含作为活性成份的本发明化合物和一种或一种以上诸如柠檬酸钠 或磷酸二钙的医药学上可接受的载剂。视情况或另一选择为，所述固体剂型也可包含： (1)填充剂或增量剂，诸如淀粉、微晶纤维素、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和/或硅 酸；(2)粘合剂，诸如羧甲基纤维素、褐藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿 拉伯胶；(3)保湿剂，诸如甘油；(4)崩解剂，诸如琼脂、碳酸钙、马铃薯或树薯淀粉、 褐藻酸、某些硅酸盐和/或碳酸钠；(5)溶液阻滞剂，诸如石蜡；(6)吸收促进剂，诸如 季铵化合物；(7)湿润剂，诸如十六碳醇和/或单硬脂酸甘油酯；(8)吸附剂，诸如高岭 土和/或膨润土；(9)润滑剂，诸如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂 基硫酸钠和/或其混合物；(10)着色剂；和(11)缓冲剂。
脱模剂、湿润剂、涂布剂、甜味剂、调味剂和香化剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在 于本发明的医药组合物中。医药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化 剂，诸如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等等；(2)油 溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯 (BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等等；和(3)金属螯合剂，诸如柠檬酸、 乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等等。用于片剂、胶囊、药丸等等的 涂布剂包括可用于肠溶衣的那些涂布剂，诸如邻苯二甲酸乙酸纤维素(CAP)、聚乙酸 乙烯酯邻苯二甲酸酯(PVAP)、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、甲基丙烯酸-甲基丙烯 酸酯共聚物、乙酸纤维素偏苯三酸酯(CAT)、羧甲基乙基纤维素(CMEC)、丁二酸乙 酸羟丙基甲基纤维素(HPMCAS)等等。
若需要，则也可使用(例如)以不同比例的羟丙基甲基纤维素或其它聚合物基质、 脂质体和/或微球体来调配本发明的医药组合物以提供活性成份的缓慢或受控释放。
另外，本发明的医药组合物可视情况含有乳浊剂，且可经调配以便其仅释放活性成 份，或视情况以延时方式优先在胃肠道的特定部分释放。可使用的嵌入组合物的实例包 括聚合物质和蜡。活性成份也可以微囊形式存在，若适当，则具有一种或一种以上上述 赋形剂。
用于口服投药的适合液态剂型包括(例如)医药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、 悬浮液、糖浆和酏剂。所述液态剂型通常包含活性成份和惰性稀释剂(诸如水或其它溶 剂)、增溶剂和乳化剂(诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯 甲酯、丙二醇、1，3-丁二醇)、油(诸如棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖 麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯和其混合物。 除活性成份以外，悬浮液可含有悬浮剂，诸如乙氧基化异硬脂醇、聚氧化乙烯山梨糖醇 和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄耆胶和其混合物。
或者，本发明的医药组合物经调配得以由吸入投药。用于由吸入投药的适合医药组 合物通常可以喷雾或粉末的形式存在。所述组合物通常使用熟知的传递装置(诸如定剂 量吸入器、干粉吸入器、喷雾器或类似传递装置)加以投药。
当使用加压容器由吸入投药时，本发明的医药组合物通常可包含活性成份和诸如二 氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适合气体的适合推进剂。
另外，医药组合物可以胶囊或滤筒(由(例如)明胶制成)的形式存在，所述胶囊 或滤筒包含本发明的化合物和适用于粉末吸入器的粉末。适合的粉末基质包括(例如) 乳糖或淀粉。
本发明的化合物也可使用已知的经皮传递系统和赋形剂经皮投药。举例来说，使本 发明的化合物与诸如丙二醇、单月桂酸聚乙二醇酯、氮杂环烷-2-酮等等的渗透增强剂混 合，且并入贴片(patch)或类似传递系统。若需要，则包括胶凝剂、乳化剂和缓冲剂的 其他赋形剂可用于所述经皮的组合物中。
下列调配物说明本发明的代表性医药组合物：
调配物实例A
如下制备用于口服投药的硬明胶胶囊：
成份 量
本发明的化合物 50mg
乳糖(喷雾干燥) 200mg
硬脂酸镁 10mg
代表性程序：充分地掺合成份且接着装入硬明胶胶囊内(每胶囊260mg组合物)。
调配物实例B
如下制备用于口服投药的硬明胶胶囊：
成份 量
本发明的化合物 20mg
淀粉 89mg
微晶纤维素 89mg
硬脂酸镁 2mg
代表性程序：充分地掺合成份且接着通过第45号筛目美国筛，且装入硬明胶胶囊 内(每胶囊200mg组合物)。
调配物实例C
如下制备用于口服投药的胶囊：
成份 量
本发明的化合物 10mg
聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯 50mg
淀粉粉末 250mg
代表性程序：充分地掺合成份且接着装入明胶胶囊内(每胶囊310mg组合物)。
调配物实例D
如下制备用于口服投药的片剂：
成份 量
本发明的化合物 5mg
淀粉 50mg
微晶纤维素 35mg
聚乙烯吡咯烷酮(在水中10重量％) 4mg
羧甲基淀粉钠 4.5mg
硬脂酸镁 0.5mg
滑石粉 1mg
代表性程序：使活性成份、淀粉和纤维素通过第45号筛目美国筛且充分地混合。 将聚乙烯吡咯烷酮的溶液与所得的粉末混合，且接着使混合物通过第14号筛目美国筛。 在50-60℃下干燥如此制得的颗粒，且通过第18号筛目美国筛。接着将羧甲基淀粉钠、 硬脂酸镁和滑石粉(先前已通过第60号筛目美国筛)添加到所述颗粒中。混合后，在 压片机上压制混合物以提供重100mg的片剂。
调配物实例E
如下制备用于口服投药的片剂：
成份 量
本发明的化合物 25mg
微晶纤维素 400mg
烟雾状二氧化硅 10mg
硬脂酸 5mg
代表性程序：将成份充分地掺合且接着压制以形成片剂(每片剂440mg组合物)。
调配物实例F
如下制备用于口服投药的单刻痕(Single-scored)片剂：
成份 量
本发明的化合物 15mg
玉米淀粉 50mg
交联羧甲基纤维素钠 25mg
乳糖 120mg
硬脂酸镁 5mg
代表性程序：将成份充分地掺合且压制以形成单刻痕片剂(每片剂215mg组合物)。
调配物实例G
如下制备用于口服投药的悬浮液：
成份 量
本发明的化合物 0.1g
反丁烯二酸 0.5g
氯化钠 2.0g
对羟基苯甲酸甲酯 0.15g
对羟基苯甲酸丙酯 0.05g
砂糖 25.5g
山梨糖醇(70％溶液) 12.85g
Veegum k(Vanderbilt Co.) 1.0g
调味剂 0.035mL
着色剂 0.5mg
蒸馏水 适量至100mL
代表性程序：混合成份以形成每10mL悬浮液含有10mg活性成份的悬浮液。
调配物实例H
如下制备用于通过吸入投药的干粉：
成份 量
本发明的化合物 1.0mg
乳糖 25mg
代表性程序：使活性成份微粉化，且接着与乳糖掺合。接着将此掺合混合物装入明 胶吸入滤筒。使用粉末吸入器投与滤筒的内容物。
调配物实例I
如下在定剂量吸入器中制备用于通过吸入投药的干粉：
代表性程序：通过使10g活性化合物作为具有平均尺寸小于10μm的微粉化颗粒分 散于由0.2g卵磷脂溶解于200mL脱矿质水中形成的溶液中来制备含有5重量％本发明 的化合物和0.1重量％卵磷脂的悬浮液。所述悬浮液经喷雾干燥且所得物质为经微粉化 为平均直径小于1.5μm的颗粒。将所述颗粒装入具有加压1，1，1，2-四氟乙烷的滤筒内。
调配物实例J
如下制备可注射的调配物：
成份 量
本发明的化合物 0.2g
乙酸钠缓冲溶液(0.4M) 40mL
HCl(0.5N)或NaOH(0.5N) 适量至pH4
水(经蒸馏，无菌) 适量至20mL
代表性程序：掺合上述成份且使用0.5N HCl或0.5N NaOH调节pH值至4±0.5。
调配物实例K
如下制备用于口服投药的胶囊：
成份 量
本发明的化合物 4.05mg
微晶纤维素(Avicel PH 103) 259.2mg
硬脂酸镁 0.75mg
代表性程序：充分地掺合成份且接着装入明胶胶囊(尺寸#1，白色，不透明)(每 胶囊264mg组合物)。
调配物实例L
如下制备用于口服投药的胶囊：
成份 量
本发明的化合物 8.2mg
微晶纤维素(Avicel PH 103) 139.05mg
硬脂酸镁 0.75mg
代表性程序：充分地掺合成份且接着装入明胶胶囊(尺寸#1，白色，不透明)(每 胶囊148mg组合物)。
应了解适用于特定模式投药的任何形式的本发明的化合物(也就是游离碱、医药盐 或溶剂合物)可用于如上所述的医药组合物中。
效用
本发明的苯并咪唑酮-羧酰胺衍生的氨基甲酸酯化合物为5-HT4受体激动剂，且因此 预期用于治疗由5-HT4受体介导或与5-HT4受体活性相关的医学病况，也就是可通过 5-HT4受体激动剂治疗得到改善的医学病况。所述医学病况包括(但不限于)肠易激综 合征(IBS)、慢性便秘、功能性消化不良、胃排空延迟、胃食管反流病(GERD)、胃轻 瘫、手术后肠梗阻、肠假性阻塞和药物诱发性延迟传输。另外，建议某些5-HT4受体激 动剂化合物可用于治疗中枢神经系统病症，包括认知病症、行为病症、情感病症和自主 功能控制病症。
具体来说，本发明的化合物能增加胃肠(GI)道的活动性，且因此预期用于治疗包 括人类的哺乳动物中由活动性降低引起的GI道病症。所述GI活动性病症包括(例如) 慢性便秘、便秘型肠易激综合征(C-IBS)、糖尿病性和自发性胃轻瘫和功能性消化不良。
因此，在一方面中本发明提供一种增加哺乳动物胃肠道活动性的方法，所述方法包 含投与哺乳动物治疗有效量的包含医药学上可接受的载剂和本发明化合物的医药组合 物。
当用于治疗GI道活动性降低的病症或其它由5-HT4受体介导的病况时，本发明的 组合物通常可以每日单剂量或多倍剂量口服投药，但也可使用其它投药形式。每一剂量 投与的活性剂的量或每天投与的总量通常由医师根据相关情况加以确定，所述情况包括 被治疗的病况、选择的投药途径、投与的实际化合物和其相对活性、个别患者的年龄、 体重和反应、患者症状严重性和其类似情况。
用于治疗GI道活动性降低的病症或其它由5-HT4受体介导的病症的适合剂量可在 约0.0007至约20mg/kg/天的活性剂范围内，其包括约0.0007至约1mg/kg/天。对于平 均70kg的人来说，这将相当于每天约0.05至约70mg的活性剂量。
在本发明的一方面中，本发明的化合物用于治疗慢性便秘。当用于治疗慢性便秘时， 本发明的化合物通常以每日单剂量或多倍剂量口服投药。优选地，用于治疗慢性便秘的 剂量在每天约0.05至约70mg的范围内。
在本发明的另一方面中，本发明的化合物用于治疗肠易激综合征。当用于治疗便秘 型肠易激综合征时，本发明的化合物通常可以每日单剂量或多倍剂量口服投药。优选地， 用于治疗便秘型肠易激综合征的剂量可在每天约0.05至约70mg的范围内。
在本发明的又一方面中，本发明的化合物用于治疗糖尿病性胃轻瘫。当用于治疗糖 尿病性胃轻瘫时，本发明的化合物通常可以每日单剂量或多倍剂量口服投药。优选地， 用于治疗糖尿病性胃轻瘫的剂量可在每天约0.05至约70mg的范围内。
在本发明的又一方面中，本发明的化合物用于治疗功能性消化不良。当用于治疗功 能性消化不良时，本发明的化合物通常可以每日单剂量或多倍剂量口服投药。优选地， 用于治疗功能性消化不良的剂量可在每天约0.05至约70mg的范围内。
本发明也提供一种治疗哺乳动物与5-HT4受体活性相关的疾病或病况的方法，所述 方法包含投与哺乳动物治疗有效量的本发明的化合物或治疗有效量的包含本发明的化 合物的医药组合物。
因为本发明的化合物为5-HT4受体激动剂，所以所述化合物也用作用于调查或研究 具有5-HT4受体的生物系统或样品，或用于发现新颖5-HT4受体激动剂的研究工具。此 外，因为与结合至其它5-HT亚型的受体(尤其5-HT3受体)相比较，本发明的化合物 展现对于5-HT4受体的结合选择性，所以所述化合物尤其用于研究生物系统或样品中 5-HT4受体的选择性促效作用的效应。任何具有5-HT4受体的适合生物系统或样品可用 于可在活体外或活体内进行的每一研究中。适合于所述研究的代表性生物系统或样品包 括(但不限于)细胞、细胞提取物、质膜、组织样品、哺乳动物(诸如小鼠、大鼠、豚 鼠、兔子、狗、猪等)等等。
在本发明的此方面中，使包含5-HT4受体的生物系统或样品与5-HT4受体促效量的 本发明的化合物接触。接着使用诸如放射性配体结合分析和功能分析的常规程序和设备 来测定促进5-HT4受体的效应。所述功能分析包括细胞内环单磷酸腺苷(cAMP)的配 体介导性变化、酶腺苷酸环化酶(其合成cAMP)的活性的配体介导性变化、鸟苷三磷 酸(GTP)的类似物(诸如[35S]GTPγS(鸟苷5′-O-(γ-硫基)三磷酸)或GTP-Eu)经由 受体催化的GTP类似物与GDP类似物的交换并入隔离膜内方面的配体介导性变化、游 离的细胞内钙离子的配体介导性变化(用(例如)荧光联结成像平板阅读器或来自 Molecular Devices，Inc.的测量)和促细胞分裂剂活化蛋白激酶(MAPK)活化作 用的测量。在以上所列的任何功能分析或类似性质的分析中，本发明的化合物可使促进 或增加5-HT4受体活化。本发明化合物的5-HT4受体促效量通常是在约1纳摩尔浓度 (nM)至约500纳摩尔浓度范围内。
另外，本发明的化合物可用作用于发现新颖5-HT4受体激动剂的研究工具。在这个 实施例中，比较一个测试化合物或一组测试化合物的5-HT4受体结合或功能数据与本发 明化合物的5-HT4受体结合或功能数据，若有的话用于识别具有优良结合或功能活性的 测试化合物。本发明的此方面包括(作为独立实施例)比较数据的产生(使用适当分析) 和测试数据的分析两者，以识别所关注的测试化合物。
除其它特性以外，已发现本发明的化合物为5-HT4受体的有效激动剂，且在放射性 配体结合分析中对5-HT4受体亚型展现优于5-HT3受体亚型的实质选择性。此外，本发 明的代表性化合物在大鼠模型中展现优良的药物动力学特性。因此，预期本发明的化合 物当口服投药时展现良好的生物可用度。此外，在使用表现hERG心脏钾离子通道的分 离全细胞的活体外电压钳模型中测试的本发明的代表性化合物经证实并未展现不可接 受水平的钾离子流的抑制。电压钳分析为经接受的临床前方法，其分析药剂改变与心律 失常相关的心脏复极化模式(尤其引起所谓的QT延长)的潜能。(Cavero等人，药物 治疗意见(Opinion on Pharmacotherapy)，2000，1，947-73，Fermini等人，药物发现自然 评论(Nature Reviews Drug Discovery)，2003，2，439-447)因此，预期包含本发明的化 合物的医药组合物具有可接受的心脏概况(cardiac profile)。
可使用多种所属领域的技术人员熟知的活体外和活体内分析证明本发明化合物的 这些特性以及效用。代表性分析在以下实例中更详尽地描述。
实例
提供以下合成和生物学实例以说明本发明，且不以任何限制本发明的范畴的方法来 解释。在以下实例中，除非另外指出，否则以下缩写具有以下含义。以下未定义的缩写 具有其一般接受的含义。
Boc＝叔丁氧基羰基
(Boc)2O＝二碳酸二叔丁酯
DCM＝二氯甲烷
DMF＝N，N-二甲基甲酰胺
DMSO＝二甲亚砜
EtOAc＝乙酸乙酯
mCPBA＝间氯过苯甲酸
MeCN＝乙腈
MTBE＝叔丁基甲基醚
PyBop＝六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷膦
Rf＝保留因子
RT＝室温
TFA＝三氟乙酸
THF＝四氢呋喃
试剂(包括仲胺)和溶剂均购自商业供应(Aldrich、Fluka、Sigma等)，且未经进 一步提纯即使用。除非另外规定，否则反应在氮气氛下进行。反应混合物的进程由薄层 色谱法(TLC)、分析高效液相色谱法(分析HPLC)和质谱法来监测，所述方法的细节 在以下和分别在反应的特定实例中给出。反应混合物如在每一反应中明确地描述而处 理；通常其通过萃取和其它诸如温度和溶剂依赖性结晶和沉淀的提纯方法进行提纯。另 外，反应混合物通常由制备HPLC提纯：下文描述通用方法。反应产物的特征化通常由 质谱法和1H-NMR光谱测定法进行。对于NMR测量来说，将样品溶解于氘化溶剂 (CD3OD、CDCl3或DMSO-d6)中，且1H-NMR光谱在标准观测条件下由Varian Gemini 2000仪器(300MHz)获得。除非另外指出，否则化合物的质谱鉴别由用Applied Biosystems(Foster City，CA)模式API 150EX仪器或Agilent(Palo Alto，CA)模式1100 LC/MSD仪器的电喷雾电离法(ESMS)进行。
一种分析HPLC的通用方案：使每一粗制化合物以0.5-1.0mg/mL的浓度溶解于50％ MeCN/H2O(含有0.1％TFA)中，且通过使用分析HPLC来分析：1)反相分析柱：Zorbax Bonus-RP(3.5μm粒度，2.1×50mm)；2)流速：0.5mL/min；3)含0.1％TFA的5％ MeCN/H2O(等强度；0-0.5min)；含0.1％TFA的5％MeCN/H2O至含0.1％TFA的75％ MeCN/H2O(线性梯度；0.5-4min)；4)检测波：214、254和280nm。必要时指出其 它所用条件。
一种制备HPLC的通用方案：使粗制化合物以50-100mg/mL的浓度溶解于水中的 50％乙酸中，过滤且使用制备HPLC分馏：1)管柱：YMC Pack-Pro C18(50a×20mm； ID＝5μm)；2)线性梯度：10％A/90％B至50％A/50％B，经30min；3)流速：40mL/min； 4)检测波：214nm。
仲胺的制备
以下描述在式(I)化合物的合成中用作中间体的多种仲胺的制备。
通过与个别磺酰氯(iPr2NEt，CH2Cl2，0℃)反应且除去N-Boc基的保护(CF3CO2H， CH2Cl2)由N-Boc哌嗪制备哌嗪的N-磺酰基衍生物。1-甲烷磺酰基哌嗪：1H-NMR(CDCl3； 中性)：δ(ppm)3.1(t，4H)，2.9(t，4H)，2.7(s，3H)。甲烷磺酰基哌嗪也通过使甲烷磺酰氯与 过量哌嗪(＞2当量)在水中反应来制备。
通过使哌嗪分别与二甲氨基氯甲酸酯或二甲氨基胺磺酰氯反应制备哌嗪的N-衍生 物，诸如1-(二甲氨基羰基)哌嗪和1-二甲氨基磺酰基)哌嗪。
通过用乙酰氯(iPr2NEt，CH2Cl2，0℃)处理N1-Boc-3-氨基吡咯烷(外消旋物，3R 或3S)且除去N-Boc基的保护(CF3CO2H，CH2Cl2)来制备外消旋或单一手性异构体 形式的3-乙酰基氨基吡咯烷。3-(乙酰氨基)吡咯烷：1H-NMR(DMSO-d6；TFA盐)：δ(ppm) 4.2(五重峰，1H)，3.3-3.1(m，3H)，2.9(m，1H)，2.0(m，1H)，1.8(br s，4H)。
通过用丙酰基磺酰氯或环己基甲基磺酰氯(iPr2NEt，CH2Cl2，0℃)处理N1-Boc-(3R)- 氨基吡咯烷且除去N-Boc基的保护(CF3CO2H，CH2Cl2)来获得(3R)-氨基吡咯烷的N3- 烷磺酰基衍生物。
根据Loev，B.有机化学杂志(J.Org.Chem.)1961，26，4394-9的方案通过使3-环 丁烯砜与必需的甲醇中的伯胺(cat.KOH，rt)反应来制备四氢-3-噻吩胺-1，1-二氧化物的 衍生物。N-甲基-3-四氢噻吩胺1，1-二氧化物(TFA盐)：1H-NMR(DMSO-d6)：δ(ppm)9.4 (br s，2H)，4.0-3.8(五重峰，1H)，3.6-3.5(dd，1H)，3.4-3.3(m，1H)，3.2-3.1(m，2H)，2.5(s， 3H)，2.4(m，1H)，2.1(m，1H)。
如下制备(S)-1，1-二氧代-四氢-1λ6-噻吩-3-基胺：
1)通过在室温下用甲醇中的(Boc)2O处理约12h以进行(S)-3-四氢噻吩胺(Dehmlow， E.V.；Westerheide，R.合成法(Synthesis)1992，10，947-9)的N-Boc保护；2)在0℃下通 过用二氯甲烷中的mCPBA处理以氧化成经N-Boc保护的(S)-1，1-二氧代-四氢-1λ6-噻吩 -3-基胺，历时约5h；和3)用二氯甲烷中的TFA在室温下使砜衍生物除去N-Boc的保 护成为视作TFA盐分离的游离胺，历时1h。使用相同方法来制备(R)-1，1-二氧代-四氢-1λ6- 噻吩-3-基胺，但用(R)-3-四氢噻吩胺来替代(S)-3-四氢噻吩胺。
由四氢-4H-噻喃-4-酮制备N-甲基-四氢-2H-噻喃-4-胺-1，1-二氧化物：i)MeNH2， NaBH4；ii)(Boc)2O，MeOH；iii)mCPBA，CH2Cl2，0℃；iv)CF3CO2H，CH2Cl2。(m/z)： [M+H]+C6H13NO2S的计算值：164.07；实验值：164.9。1H-NMR(CD3OD；TFA盐)：δ(ppm) 3.4-3.1(m，5H)，2.7(s，3H)，2.4(br d，2H)，2.1(br m，2H)。
脯氨酸二甲基酰胺、异六氢烟碱酰胺(哌啶-4-羧酰胺)和1-(四氢-2-呋喃甲酰基) 哌嗪可于市面购得，且购自商业来源。
通过使氨基氯甲酸二甲酯与经N-Boc保护的4-哌啶醇反应来制备氨基甲酸4-哌啶醇 -二甲酯。
制备1
1-异丙基-1，3-二氢-2H-苯并咪唑-2-酮的制备
a.N-异丙基-N-(2-硝基苯)胺的制备
向在冰浴中冷却的乙醇(300mL)中的2-氟基-硝基苯(31.8g，0.225mol)的冷溶 液添加异丙基胺(54.0mL，0.634mol)，随后添加水(120mL)中的碳酸钾(31.1g， 0.225mol)溶液。在0℃下搅拌混合物1h，接着回流6h。通过将混合物冷却到环境温 度来终止反应，且将其减压蒸发而得橙色残余物。使残余物在乙醚(800mL)和盐水溶 液(300mL)之间分溶。干燥且过滤有机层以提供呈橙色液体的标题中间体(39g)。 1H-NMR(CDCl3，300MHz)：δ(ppm)8.06(d，1H)，7.30(t，1H)，6.74(d，1H)，6.48(t，1H)， 3.73(七重峰，1H)，1.20(d，6H)。
b.N-(2-氨基苯基)-N-异丙基胺的制备
向在冰浴中冷却的乙醇(600mL)和2M氢氧化钠溶液(320mL)的混合物缓慢 添加锌粉(59.5g)。在搅拌锌浆体的同时，添加溶解于乙醇(50mL)中的N-异丙基-N-(2- 硝基苯基)胺(41g，0.228mol)。在0℃下搅拌混合物30min，接着加热到85℃。将混 合物在85℃下搅拌约12h直到混合物的回流溶液变成无色溶液。接着使混合物冷却到 0℃且过滤。用EtOAc(200mL)清洗收集的固体。合并滤液和清洗的溶液，且在真空中蒸 发以去除过量的挥发性溶剂。在浓缩期间，混合物变成淡棕色/黄色。用EtOAc(800mL) 萃取水性浓缩物。将有机溶液浓缩直到干燥，以提供呈粉棕色油的标题中间体(33g)， 其未经进一步处理即用于下一步骤中。1H-NMR(CDCl3，300MHz)：δ(ppm)6.73-6.5(m， 4H)，3.58-3.55(七重峰，1H)，1.2(d，6H)。
c.1-异丙基-1，3-二氢-2H-苯并咪唑-2-酮的制备
向四氢呋喃(500mL)中的步骤(b)的产物(N-(2-氨基苯基)-N-异丙基胺(34g，0.226 mol))的溶液中添加固体形式的羰基二咪唑(36.7g，0.226mol)。混合物在环境温度于 氮气的气氛下搅拌约24h。在真空中浓缩混合物，且所得的深褐色残余物在EtOAc(700 mL)和盐水溶液(300mL)之间分配。接着用1M磷酸多次(约3×300mL)洗涤有机 层直到有机层的颜色由茶褐色转变为浅黄色。蒸发有机溶液至干燥以提供静置时缓慢凝 固的呈浅黄色油的标题中间体(34g)。通过表明无可检测到的杂质的1H-NMR来评估 材料的纯度：1H-NMR(CD3OD，300MHz)：δ(ppm)7.2(m，1H)，7.0(m，3H)，4.6(七重峰， 1H)，1.46(d，6H)。(m/z)：[M+H]+C10H12N2O的计算值：177.09；实验值：177.2。
分析HPLC：保留时间＝2.7min(纯度为99％)：1)管柱：Zorbax，Bonus-RP，3.5μm 粒度，2.1×50mm；2)流速：0.5mL/min；3)等强度条件(10％溶剂B/90％溶剂A)， 历时0至0.5min；接着线性梯度至50％溶剂B/50％溶剂A(溶剂A＝98％水/2％ MeCN/0.1％TFA；溶剂B＝90％MeCN/10％水/0.1％TFA)，经5min。TLC分析(硅胶板)： Rf＝0.5(CH2Cl2)。液相色谱质谱分析法(LCMS)(m/z)：[M+H]+C10H12N2O的计算值： 177.09；实验值：177.3。
制备2
(1S，3R，5R)-3-氨基-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的制备
a.8-苯甲基-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-酮的制备
在搅拌下将浓盐酸(30mL)添加到水(170mL)中的2，5-二甲氧基四氢呋喃(82.2 g，0.622mol)的非匀质溶液。在冷却到0℃(冰浴)的单独烧瓶中，将浓盐酸(92mL) 缓慢添加到水(350mL)中的苯甲胺(100g，0.933mol)溶液。搅拌2，5-二甲氧基四氢 呋喃溶液大约20min，用水(250mL)稀释且接着添加苯甲胺溶液，随后添加水(400mL) 中的1，3-丙酮二甲酸(100g，0.684mol)溶液且接着添加水(200mL)中的磷酸氢二钠 (44g，0.31mol)。使用40％NaOH调节pH值为pH 1至pH约4.5。过夜搅拌所得溶液。 接着使用50％盐酸使溶液从pH 7.5酸化成pH 3，加热到85℃且搅拌2小时。溶液冷却 到室温，使用40％NaOH碱化到pH 12且用DCM(3×500mL)萃取。用盐水洗涤混合的 有机层，干燥、过滤且减压浓缩以产生呈粘性棕色油的粗制标题中间体(52g)。
在0℃向甲醇(1000mL)中的粗制中间体溶液添加二碳酸二叔丁酯(74.6g，0.342 mol)。使溶液变温暖到室温且过夜搅拌。在减压下去除甲醇且使所得的油溶解于二氯甲 烷(1000mL)中。中间体于1M H3PO4(1000mL)内萃取且用二氯甲烷(3×250mL) 洗涤。使用NaOH水溶液将水层碱化为pH 12，且用二氯甲烷(3×500mL)萃取。混合 的有机层经干燥、过滤且减压浓缩以提供呈粘性、浅棕色油的标题中间体。1H-NMR (CDCl3)δ(ppm)7.5-7.2(m，5H，C6H5)，3.7(s，2H，CH2Ph)，3.45(宽峰s，2H，CH-NBn)， 2.7-2.6(dd，2H，CH2CO)，2.2-2.1(dd，2H，CH2CO)，2.1-2.0(m，2H，CH2CH2)，1.6(m，2H， CH2CH2)。(m/z)：[M+H]+C14H17NO的计算值：216.14；实验值：216.0。
b.3-氧代-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的制备
向EtOAc(300mL)中的8-苯甲基-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-酮(75g，0.348mol)溶液添 加EtOAc(300mL)中的二碳酸二叔丁酯(83.6g，0.383mol，1.1当量)溶液。在氮气流 下将所得溶液和清洗液(100mL EtOAc)添加到含有23g氢氧化钯(20重量％碳载钯， 干基，水湿约50％；例如，Pearlman催化剂)的1L帕氏(Parr)氢化容器中。使反应 容器脱气(使真空和N2交替五次)且加压到60psi的H2气。反应溶液搅拌两天且如需 要则再充入H2以保持H2压力在60psi直到如由二氧化硅薄层色谱法监控反应完全。接 着通过的衬垫过滤且减压浓缩黑色溶液以提供呈粘性、黄色至橙色的油的标题中 间体。其未经进一步处理即用于下一步骤中。1H NMR(CDCl3)δ(ppm)4.5(宽峰，2H， CH-NBoc)，2.7(宽峰，2H，CH2CO)，2.4-2.3(dd，2H，CH2CH2)，2.1(宽峰m，2H，CH2CO)， 1.7-1.6(dd，2H，CH2CH2)，1.5(s，9H，(CH3)3COCON))。
c.(1S，3R，5R)-3-氨基-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的制备
在经由机械搅拌器搅拌下，在N2流下向甲醇(1L)中的先前步骤的产物(75.4g， 0.335mol)的溶液添加甲酸铵(422.5g，6.7mol)、水(115mL)和65g碳载钯(10％ 在干基上，水湿约50％；Degussa型E101NE/W)。在24和48小时后，每次添加甲酸铵 (132g，2.1mol)的其他部分。一旦反应进程终止(如由分析HPLC所监测)，则添加 (＞500g)且过滤所得的稠密悬浮液，且接着用甲醇(约500mL)清洗所收集的固 体。合并滤液且减压浓缩。接着用1M磷酸稀释所得混浊、两相溶液成pH 2的约1.5至 2.0L的最终体积且用二氯甲烷(3×700mL)洗涤。使用40％水性NaOH将水层碱化为 pH 12，且用二氯甲烷(3×700mL)萃取。混合有机层经干燥、过滤且由旋转蒸发浓缩， 接着高真空以提供呈白色至浅黄色固体的标题中间体(52g)(通常为N-Boc-内-3-氨基 莨菪烷)。基于1H-NMR分析，产物的内胺与外胺的异构体比率为＞99∶1(分析HPLC纯 度＞96％)。1H NMR(CDCl3)δ(ppm)4.2-4.0(宽峰d，2H，CHNBoc)，3.25(t，1H，CHNH2)， 2.1-2.05(m，4H)，1.9(m，2H)，1.4(s，9H，(CH3)3OCON)，1.2-1.1(宽峰，2H)。(m/z)：[M+H]+ C12H22N2O2的计算值：227.18；实验值：227.2。分析HPLC(等强度方法；2∶98(A∶B)至90∶10 (A∶B)经5min)：保留时间＝3.68min。
实例1
4-(四氢呋喃-2-羰基)哌嗪-1-甲酸3-{(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯并咪 唑-1-羰基)氨基]-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-8-基}丙酯的合成
a.(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯并咪唑-1-羰基)氨基]-8-氮杂双环[3.2.1] 辛烷-8-甲酸叔丁酯的制备
在氮气氛下向在冰浴中的无水THF(1000L)中的氢化钠(9.25g；231.4mmol；60％ 分散在矿物油中)的冷悬浮液添加THF(50mL)中的制备1的产物，1-异丙基-1，3-二氢-2H- 苯并咪唑-2-酮(27.2g，154.2mmol)。混合物在约0-5℃下搅拌30min，接着添加THF(50 mL)中的氯甲酸4-硝基苯酯(34.2g，170mmol)。在使混合物逐渐变温暖到环境温度同 时搅拌混合物过夜。接着向形成的活化酯添加THF(50mL)中的(1S，3R，5R)-3-氨基 -8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(36.7g，162mmol)。混合物在环境温度下搅拌约 12h且在约75℃下搅拌约3h，此时反应样品的LCMS指示偶合反应完成。混合物在真 空中浓缩，溶解于二氯甲烷(1L)中且首先用1M H3PO4和接着用饱和NaHCO3溶液洗 涤。干燥后，蒸发有机溶液以提供呈淡黄色残余物的标题中间体，其未经进一步处理即 用于下一步骤中。
b.三氟乙酸盐形式的N-[(1S，3R，5R)-3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯并咪唑-1-甲酸(8- 氮杂双环[3.2.1]辛-3-基)酰胺的制备
向在冰浴中的二氯甲烷(200mL)中的(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢 苯并-咪唑-1-羰基)氨基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(先前步骤的产物)添加三 氟乙酸(200mL)。混合物在约5℃下搅拌30min，且在室温下搅拌约1h。在混合物的 蒸发后，将乙醚(约500mL)添加到含油残余物，以引起残余物的凝固。收集沉淀，用 大量乙醚清洗且在真空中干燥以提供呈TFA盐的标题中间体(47g)。所述标题中间体 通常也称作内-N-(8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基)-3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯并咪唑-1-羧酰 胺。
c.N-[(1S，3R，5R)-3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯并咪唑-1-甲酸(8-氮杂双环[3.2.1]辛-3- 基)酰胺(游离碱)的制备
向二氯甲烷(500mL)中的先前步骤的产物(15g，33.9mmol)的悬浮液添加水(500 mL)。将N，N-二异丙基乙胺(约20mL)添加到反应混合物以使得水层pH为8-9。分离 所述层，保留有机层。用二氯甲烷(100mL)第二次萃取水层。合并所得萃取液，且接 着用盐水洗涤。在经Na2SO4干燥和过滤、溶剂去除后产出呈游离碱的黄色粉末的标题 化合物(9.7g)。1H NMR(DMSO-d6)：1.48(d，6H)，1.40-2.00(m，8H)，3.53(m，2H)，4.07(m， 1H)，4.69(七重峰，1H)，7.21(m，2H)，7.45(d，1H)，8.08(d，1H)，9.31(d，1H)。(m/z)： [M+H]+C18H24N4O2的计算值：329.20；实验值：329.2。分析HPLC：(2-50％MeCN/H2O 经6min)保留时间＝3.67min。
d.3-氯丙基-4-(四氢呋喃-2-基-羰基)哌嗪-1-甲酸盐的制备
向二氯甲烷(5mL)中的1-(四氢呋喃-2-基-羰基)哌嗪(202mg，1.1mmol)的0℃ 溶液中添加氯甲酸3-氯丙基酯(133μL，1.1mmol)，随后添加N，N-二异丙基乙胺(192 μL，1.1mmol)。使反应经2h达室温，此时反应经蒸发产出呈小麦色油状的标题化合物， 其未经进一步提纯即使用。
e.4-(四氢呋喃-2-羰基)哌嗪-1-甲酸3-{(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯并 咪唑-1-羰基)氨基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-8-基}丙酯的合成
使3-氯丙基-4-(四氢呋喃-2-基-羰基)哌嗪-1-甲酸盐(335mg，1.1mmol)溶解于二 甲基甲酰胺(5.0mL)，且添加到步骤(c)的固体游离碱产物(118mg，0.36mmol)和 NaI(164mg，0.72mmol)中。添加N，N-二异丙基乙胺(64μL，0.36mmol)且在90℃ 下过夜搅拌混合物。去除挥发物且经由制备HPLC(反相)经50min的15-45％梯度、 流速20mL/min完成提纯以提供呈白色固体的TFA盐形式的标题化合物(45mg)。(m/z)： [M+H]+C31H44N6O6的计算值：597.33；实验值：597.1。分析HPLC：(5-65％MeCN/H2O 经4min)保留时间＝2.58。
实例2
4-(2-羟乙基)哌嗪-1-甲酸3-{(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯并咪唑-1-羰 基)氨基]-8-氮杂双环-[3.2.1]辛-8-基}丙酯的合成
除步骤(d)中用2-哌嗪-1-基乙醇代替1-(四氢呋喃-2-基羰基)哌嗪以外，使用实例 1中所述的方法制备呈TFA盐形式的标题化合物(13.8mg)。(m/z)：[M+H]+C28H42N6O5 的计算值：543.32；实验值：543.5。
实例3-12
除在步骤(d)中用适当试剂代替1-(四氢呋喃-2-基-羰基)哌嗪以外，使用实例1中 所述的方法制备下列实例3-12的化合物。
实例13
1，1-二氧代-1λ6-硫代吗啉-4-甲酸3-{(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯并咪 唑-1-羰基)氨基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-8-基}丙酯的替代性合成
a.(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯并咪唑-1-羰基)氨基]-8-氮杂双环[3.2.1] 辛烷-8-甲酸叔丁酯的制备
在氮气氛下向含有1-异丙基-1，3-二氢-2H-苯并咪唑-2-酮(17.6g，100mmol)和氯 甲酸4-硝基苯酯(20.2g，100mmol)的500mL反应烧瓶添加二氯甲烷(350ml)，且 接着缓慢添加三乙胺(30.5mL，220mmol)。搅拌溶液15min且接着添加(1S，3R，5R) -3-氨基-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(22.6g，100mmol)。使反应在室温下搅拌 过夜。用饱和碳酸氢钠水溶液(2×200mL)洗涤反应混合物。通过蒸馏去除二氯甲烷 且添加MTBE(350ml)。用1N磷酸(2×200mL)、饱和碳酸氢钠(200mL)和水(200 mL)洗涤MTBE溶液。有机层经无水硫酸钠(40g)干燥且过滤，且接着通过蒸馏去除 溶剂以产出呈浅棕色固体的标题中间体(35.7g，83％产量)。
b.N-[(1S，3R，5R)-3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯并咪唑-1-甲酸(8-氮杂双环[3.2.1]辛-3- 基)酰胺三氟乙酸盐的制备
在500ml烧瓶中，使(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯并咪唑-1-羰基)氨 基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(21.4g，50mmol)溶解于二氯甲烷(200ml) 中。添加三氟乙酸(37mL，500mmol)且使反应混合物在室温下搅拌3h。用水(2×100 mL)洗涤反应混合物。通过蒸馏去除有机层中的溶剂且通过添加MTBE(200mL)湿 磨粗制产物残余物。在室温下搅拌1h后，固体经过滤分离，用MTBE(2×25mL)洗 涤且在真空下干燥以提供标题中间体(21.0g，97％产量)。
c.1，1-二氢代-1λ 6 -硫代吗啉-4-甲酸3-氯丙酯的制备
在500ml烧瓶中，使二氧化硫代吗啉(13.5g，100mmol)在室温下溶解于二氯甲 烷(150mL)中且添加N，N-二异丙基乙胺(19.2mL，110mmol)。在室温下搅拌10min 后，在冰浴中将反应混合物冷却到大约5℃。经由加料漏斗以维持反应温度低于10℃的 速率向反应混合物添加1-氯-3-氯甲氧基丙烷(11.8mL，100mmol)。当添加完全时，使 反应混合物变温暖到室温。用水(2×100mL)洗涤反应混合物，且经无水硫酸钠(25g) 干燥有机相。在过滤后，通过蒸馏去除溶剂以产出静置时凝固的呈油状固体的标题化合 物(24.0g，94％产量)。
e.1，1-二氧代-1λ 6 -硫代吗啉-4-甲酸3-{(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯并 咪唑-1-羰基)氨基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-8-基}丙酯的合成
向二氯甲烷(100ml)中的N-[(1S，3R，5R)-3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯并咪唑-1-甲 酸(8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基)酰胺三氟乙酸盐(8.8g，20mmol)的溶液添加水(100ml)。 调节水层的pH值到约12以提供盐的游离碱。分离有机层，经硫酸钠干燥且通过蒸馏去 除溶剂。使游离碱溶解于N-甲基-2-吡咯烷酮(100mL)中且将溶液转移到含有1，1-二 氧代-1λ6-硫代吗啉-4-甲酸3-氯丙酯(7.2g，28mmol)和NaI(3.0g，20mmol)的250ml 烧瓶。添加N，N-二异丙基乙胺(4.2mL，24mmol)且将反应混合物加热到50℃历时18h。 通过蒸馏去除溶剂。使粗制产物残余物溶解于EtOAc(200mL)中，用水(2×50mL) 洗涤且经硫酸钠(10g)干燥。通过蒸馏去除溶剂以获得粗制产物残余物(约12g)。
粗制产物残余物经2″管柱上的制备HPLC提纯；填料：碱钝化的硅胶(BDS)，流 速：200mL/min；洗脱剂A：水中的0.1％TFA；洗脱剂B：水中的90％乙腈/10％0.1％TFA； 梯度(时间，％B)：(0，5)；(25，30)；(35，80)；(45，80)；(50，5)；(60，5)。产物通过纯洗脱分 的冻干而分离以提供标题化合物(3.4g，26％产量)。1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)：9.35(d， 1H)，8.07(d，1H)，7.46(d，1H)，7.22(t，1H)，7.16(t，1H)，4.69(七重峰，1H)，4.20-4.00(m， 3H)，4.12(t，2H)，3.90-3.70(m，4H)，3.70(t，2H)，3.25-3.05(m，4H)，2.5-2.0(m，8H)，2.15 (dt，2H)，1.49(d，6H)。(m/z)：[M+H]+C26H37N5O6S的计算值：548.2；实验值：548.4。
分析1：对于5-HT4(c)人类受体的放射性配体结合分析
a.膜制备5-HT 4(c)
使经人类5-HT4(c)受体cDNA(Bmax＝约6.0pmol/mg蛋白质，如使用[3H]-GR113808 膜放射性配体结合分析所确定)稳定转染的HEK-293(人类胚胎肾脏)细胞生长于含有 4,500mg/L D-葡萄糖和盐酸吡哆醇(GIBCO-Invitrogen Corp.，Carlsbad CA：目录号 11965)的达尔伯克(Dulbecco′s)改良伊格尔(Eagles)培养基(DMEM)中的T-225 烧瓶中，其中在37℃下、5％CO2、湿润恒温箱中补充10％胎牛血清(FBS) (GIBCO-Invitrogen Corp.：目录号10437)、2mM L-谷胺酰胺和(100单位)盘尼西林-(100 μg)链霉素/ml(GIBCO-Invitrogen Corp.：目录号15140)。细胞在连续选择压力下通过向 培养基添加800μg/mL遗传霉素(GIBCO-Invitrogen Corp.：目录号10131)来生长。
细胞可培养成大约60-80％融合(＜35继代培养)。在收集之前的20-22小时，用无 血清DMEM两次洗涤细胞且喂养。膜制备的所有步骤均在冰上进行。通过平缓的机械 搅拌和25mL吸量管的研磨提升细胞单层。通过1000rpm的离心(5min)收集细胞。
对于膜制备来说，细胞小球在冰冷的pH 7.4的50mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸 (HEPES)(膜制备缓冲液)(来自30-40个T225烧瓶的40mL/总细胞产量)中再悬浮， 且在冰上使用均匀化破碎仪(设置为19,2×10s)均匀化。生成的匀浆以1200g在4℃ 离心5min。弃去小球且在40,000g(20min)下离心上清液。通过膜制备缓冲液的再悬浮 和在40,000g(20min)下离心洗涤小球一次。最终小球在pH 7.4的50mM HEPES(分析 缓冲液)(1当量T225烧瓶/1mL)中再悬浮。膜悬浮液的蛋白质浓度由布莱德福 (Bradford)方法(Bradford，1976)测定。在-80℃将膜等分冷冻存储。
b.放射性配体结合分析
放射性配体结合分析以pH 7.4的50mM HEPES(含有0.025％的牛血清蛋白(BSA)) 中含有2μg膜蛋白质的400μL总分析体积在1.1mL 96深孔聚丙烯分析板(Axygen) 中进行。使用[3H]-GR113808(Amersham Inc.，Bucks，UK：目录号TRK944；特异性活性为 约82Ci/mmol)以在0.001nM-5.0nM范围内的8-12种不同浓度进行用于测定放射性配 体的Kd值的饱和结合研究。用[3H]-GR113808以0.15nM和在10nM-100μM范围内的 化合物的11种不同浓度进行用于确定化合物的pKi值的置换分析。
测试化合物以DMSO中的10mM储备溶液形式接收且在25℃于pH 7.4的50mM HEPES(含有0.1％BSA)内稀释到400μM，且接着在相同缓冲液中完成连续(1∶5)稀 释。在1μM未标记的GR113808存在下测定非特异性结合。将分析物在室温下培养60 min，且接着通过经0.3％聚乙烯亚胺中预浸泡的96孔GF/B玻璃纤维滤板(Packard BioScience Co.，Meriden，CT)的快速过滤来终止结合反应。滤板用过滤缓冲液(冰冷的 pH7.4的50mM HEPES)洗涤三次以去除未结合的放射性活性。板经干燥，向每一孔添 加35μL Microscint-20液体闪烁流体(Packard BioScience Co.，Meriden，CT)且所述板以 Packard Topcount液体闪烁计数器(Packard BioScience Co.，Meriden，CT)来计数。
使用用于单-位点竞争的3参数模型通过GraphPad Prism软件包(GraphPad Software， Inc.，San Diego，CA)的非线性回归分析来分析结合数据。如在1μM GR113808存在下 所确定，BOTTOM(曲线最小值)固定为非特异性结合的值。用Prism由最佳拟合IC50 值计算测试化合物的Ki值，且使用Cheng-Prusoff方程式(Cheng和Prusoff，生化药理 学(Biochemical Pharmacology)，1973，22，3099-108)：Ki＝IC50/(1+[L]/Kd)(其中[L]＝ 浓度[3H]-GR113808)来计算放射性配体的Kd值。结果以Ki值的负的以十为底的对数 (pKi)表示。
在这个分析中具有较高pKi值的测试化合物具有对于5-HT4受体的较高结合亲和力。 在这个分析中测试的本发明的化合物具有在约7.0至约9.0范围内的pKi值，通常在约 7.5至约8.5范围内。举例来说，在这个分析中实例1的化合物展现7.9的pKi值。
分析2：对于5-HT3A人类受体的放射性结合分析：受体亚型选择性的确定
a.膜制备5-HT 3A
从Dr.Michael Bruess(University of Bonn，GDR)(Bmax＝约9.0pmol/mg蛋白质，如使 用[3H]-GR65630膜放射性配体结合分析所确定)获得经人类5-HT3A受体cDNA稳定转染 的HEK-293(人类胚胎肾脏)细胞。细胞于50％达尔伯克改良伊格尔培养基 (DMEM)(GIBCO-Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA：目录号11965)和50％Ham′s F12(GIBCO-Invitrogen Corp.：目录号11765)中在T-225烧瓶或细胞工厂中生长，其中在 37℃下5％CO2、湿润恒温箱中补充10％热非活化胎牛血清(FBS)(Hyclone，Logan，UT： 目录号SH30070.03)和(50单位)盘尼西林-(50g)链霉素/ml(GIBCO-Invitrogen Corp.：目 录号15140)。
细胞生长到大约70-80％融合(＜35继代培养)。膜制备的所有步骤均在冰上进行。 为收集细胞，抽出培养基且用不含Ca2+、Mg2+的达尔伯克磷酸盐缓冲生理盐水(dPBS) 清洗。通过缓慢机械搅拌提升细胞单层。通过以1000rpm(5min)的离心收集细胞。 膜制备的后续步骤遵循用于表示5-HT4(c)受体的膜的上述方案。
b.放射性配体结合分析
在96孔聚丙烯分析板中以pH 7.4的50mM HEPES(含有0.025％BSA分析缓冲液) 中含有1.5-2μg膜蛋白质的200μL总分析体积进行放射性配体结合分析。使用 [3H]-GR65630(PerkinElmer Life Sciences Inc.，Boston，MA：目录号NET1011，特异性活 性为约85Ci/mmol)以0.005nM至20nM范围内的12种不同浓度来进行用于测定放射 性配体的Kd值的饱和结合研究。使用[3H]-GR65630以10pM至100μM范围内的化合 物的11种不同浓度来进行用于测定化合物的pKi值的置换分析。化合物以DMSO中的 10mM储备溶液形式接收(见3.1部分)，在25℃下于pH 7.4的50mM HEPES(含有 0.1％BSA)内稀释到400μM，且接着在相同缓冲液中完成连续(1∶5)稀释。在10μM 未标记MDL72222存在下测定非特异性结合。将分析物在室温下培养60min，接着通过 经0.3％聚乙烯亚胺中预浸泡的96孔GF/B玻璃纤维滤板(Packard BioScience Co.， Meriden，CT)快速过滤来终止结合反应。用过滤缓冲液(冰冷的pH7.4的50mM HEPES) 清洗滤板三次以去除非结合放射活性。板经干燥，向每一孔添加35μL Microscint-20液 体闪烁流体(Packard BioScience Co.，Meriden，CT)且以Packard Topcount液体闪烁计数 器(Packard BioScience Co.，Meriden，CT)来计数。
使用上述非线性回归程序来分析结合数据以测定Ki值。使BOTTOM(曲线最小值) 固定为非特异性结合的值，如在10μM MDL72222存在下所确定。Cheng-Prusoff方程式 中量[L]定义为浓度[3H]-GR65630。
关于5-HT3受体亚型的5-HT4受体亚型的选择性以比率Ki(5-HT3A)/Ki(5-HT4(c))来计 算。在这个分析中测试的本发明的化合物具有在约10至约950范围内(通常在约50至 约500范围内)的5-HT4/5-HT3受体亚型选择性。举例来说，实例1展现160的亚型选 择性。
分析3：利用表现人类5-HT4(c)受体的HEK-293细胞的全细胞cAMP积累闪烁板分 析
在这个分析中，通过测量表现5-HT4受体的HEK-293细胞与不同浓度的测试化合物 接触时所产生的环AMP的量来确定测试化合物的功能效能。
a.细胞培养物
将经克隆人类5-HT4(c)受体cDNA稳定转染的表现受体的HEK-293(人类胚胎肾脏) 细胞以两种不同密度来制备：(1)如使用[3H]-GR113808膜放射配体结合分析所确定， 以约0.5-0.6pmol/mg蛋白质的密度，和(2)以约6.0pmol/mg蛋白质的密度。细胞生长 于含有4,500mg/L D-葡萄糖(GIBCO-Invitrogen Corp.：目录号11965)的达尔伯克改良 伊格尔培养基(DMEM)(GIBCO-Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA：目录号11965)中的 T-225烧瓶中，其中在37℃下5％CO2、湿润恒温箱中补充10％胎牛血清(FBS) (GIBCO-Invitrogen Corp.：目录号10437)和(100单位)盘尼西林-(100μg)链霉素 /ml(GIBCO-Invitrogen Corp.：目录号15140)。细胞在连续选择压力下通过向培养基添加遗 传霉素(800μg/mL：GIBCO-Invitrogen Corp.：目录号10131)来生长。
b.细胞制备
细胞生长到大约60-80％融合。在分析之前的20至22小时，用含有4,500mg/L D- 葡萄糖(GIBCO-Invitrogen Corp.：目录号11965)的不含血清DMEM洗涤细胞两次且喂 养。为收集细胞，抽出培养基且向每一T-225烧瓶添加10mL Versene(GIBCO-Invitrogen Corp.：目录号15040)。细胞在RT培养5min且接着通过机械搅拌从烧瓶移去。将细胞 悬浮液转移到含有等体积的预温(37℃)dPBS的离心管，且以1000rpm离心5min。 弃去上清液且使小球在预温(37℃)荧光放射增强缓冲液(每2-3个T-225烧瓶10mL 当量)中预悬浮。记录这个时间且标记为时间零点。用Coulter计数器来计数细胞(8μm 以上计数，烧瓶产量为1-2×107细胞/烧瓶)。细胞在预温(37℃)荧光放射增强缓冲液 中(如闪烁板试剂盒中所提供)以5×105细胞/ml的浓度预悬浮且在37℃预培养10min。
根据制造厂家的说明，以放射性免疫分析格式使用具有125I-cAMP(SMP004B， PerkinElmer Life Sciences Inc.，Boston，MA)的闪烁板腺苷酸环化酶活化分析系统来进行 cAMP分析。
细胞如上所述生长且制备。在分析中最终细胞浓度为25×103细胞/孔且最终分析体 积为100μL。测试化合物以DMSO中的10mM储备溶液接收，在25℃pH 7.4的50mM HEPES(含有0.1％BSA)内稀释到400μM且接着在相同缓冲液中完成连续(1∶5)稀 释。用在10pM至100μM(最终分析浓度)范围内的化合物的不同浓度进行环AMP积 累分析。在每一板上包括5-HT浓度反应曲线(10pM至100μM)。在37℃下震荡15min 来培养细胞，且通过向每一孔添加100μl冰冷的检测缓冲液(如在闪烁板试剂盒中所提 供)来终止反应。密封所述板且在4℃培养过夜。通过使用Topcount(Packard BioScience Co.，Meriden，CT)的亲近闪烁光谱法量化结合放射性。
根据制造厂家的使用者手册中所提供的说明，将每mL反应所产生的cAMP量从 cAMP标准曲线外推。使用3-参数S型剂量-反应模式(使斜率限制为统一)通过具有 GraphPad Prism软件包的非线性回归分析来分析数据。效能数据报道为pEC50值(EC50 值的负的以十为底的对数)，其中EC50为对于50％最大反应来说的有效浓度。
在这个分析中展现较高pEC50值的测试化合物具有促进5-HT4受体的较高效能。在 这个分析中使用具有约0.5-0.6pmol/mg蛋白质密度的细胞系(1)测试的本发明化合物 具有在约7.5至约9.0范围内的pEC50值，通常在约8.0至约9.0的范围内。举例来说， 实例1的化合物具有8.4的pEC50值。
分析4：表现hERG心脏钾离子通道的全细胞中的抑制钾离子流的活体外电压钳分 析
经hERG cDNA稳定转染的CHO-K1细胞由University of Wisconsin的Gail Robertson 获得。细胞保持在低温存储器中直到需要。细胞在用10％胎牛血清和200μg/mL遗传霉 素补充的达尔伯克改良伊格尔培养基/F12中扩展且继代。细胞在涂布聚-D-赖氨酸(100 μg/mL)的玻璃盖片上、在35mm2皿(含有2ml培养基)中以能够使分离的细胞经选 择用于全细胞电压钳研究的密度接种。所述皿在37℃下于湿润、5％CO2环境中维持。
细胞外溶液至少每7天制备且不用时则在4℃下存储。细胞外溶液含有(mM)： NaCl(137)、KCl(4)、CaCl2(1.8)、MgCl2(1)、葡萄糖(10)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸 (HEPES)(10)(经NaOH调pH为7.4)。在测试化合物不存在或存在下，细胞外溶液包含在 储集器中，其由储集器以大约0.5mL/min流入记录槽内。制备、等分且在-20℃存储细 胞内溶液直到使用日。细胞内溶液含有(mM)：KCl(130)、MgCl2(1)、乙二醇-双(β-氨基 乙基醚)N，N，N′，N′-四乙酸盐(EGTA)(5)、MgATP(5)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸 (HEPES)(10)(经KOH调节pH值为7.2)。所有试验均在室温(20-22℃)下进行。
将细胞在其上接种的盖片转移到记录槽且连续灌注。在细胞与贴片电极之间形成千 兆欧姆密封部分。一旦获得稳定贴片，则记录以电压钳模式开始，其中最初的保持电位 在-80mV。在达到稳定全细胞电流之后，细胞暴露于测试化合物。标准电压方法为：从 -80mV到+20mV的保持电位的步骤历时4.8sec，复极化至-50mV历时5sec且接着回 到原始保持电位(-80mV)。这个电压方案每15sec(0.067Hz)运行一次。在复极化阶段 期间使用pClamp软件来确定峰值电流振幅。以3μM浓度的测试化合物经细胞灌注5 分钟，随后在不存在化合物下冲洗5分钟。最终向灌注液添加阳性对照(西沙必利 (cisapride)，20nM)以测试细胞的功能。从-80mV到+20mV的步骤激活hERG通道， 导致外向电流。回到-50mV的步骤导致外向尾电流，同时通道由失活和钝化而恢复。
使用pCLAMP软件来确定在复极化阶段期间的峰值电流振幅。将对照和测试物品 数据输出到(OriginLab Corp.，Northampton MA)，其中个别电流振幅在不存在化 合物时正规化为最初电流振幅。计算经正规化的电流均值和每一条件的标准误差且与试 验的时程相比较而绘图。
在暴露于测试物品或媒剂对照(通常为0.3％DMSO)5分钟后，在观测到的K+电 流抑制作用之间作出比较。使用两个群体的独立t检验(Microcal Origin v.6.0)进行试 验组之间的统计比较。差异在p＜0.05时考虑为显著的。
在这个分析中钾离子流的抑制百分率越小，则当用作治疗剂时测试化合物改变心脏 复极化模式的潜力越小。在这个分析中以3μM浓度测试的本发明的化合物通常展现小 于约40％的钾离子流抑制，更通常为小于约25％。举例来说，实例1的化合物在这个分 析中展现约9％的抑制。
分析5：口服生物可用性的活体外模式：Caco-2渗透分析
进行Caco-2渗透分析以示范测试化合物在口服投药后通过肠且进入血流的能力。 测定溶解状态的测试化合物渗透经设计以模拟人类小肠单层的紧密接合的细胞单层的 速率。Caco-2(结肠、腺癌；人类)细胞由ATCC(美国典型微生物菌种保藏中心(American Type Culture Collection)；Rockville，MD)获得。为进行渗透研究，将细胞在预润湿的 transwells聚碳酸酯过滤器(Costar；Cambridge，MA)上以63,000个细胞/cm2的密度接种。 细胞单层在21天后形成于培养物中。细胞在transwell板中培养后，含有细胞单层的膜 从transwell板分离且插入扩散盒(Costar；Cambridge，MA)内。将扩散盒插入加热块中， 所述加热块装备有外部循环、恒温调节37℃的水以用于温度控制。气体歧管将95％ O2/5％CO2传递至每半个扩散盒且产生跨越细胞单层的层流模式，所述模式有效减少未 被搅拌的边界层。
用以100μM的测试化合物浓度和14C-甘露糖醇进行渗透研究以监测单层的完整性。 所有试验均在37℃进行60min。样品从扩散盒的供体和接受者两端在0、30和60min 取得。通过HPLC或液体闪烁计数测试化合物和甘露糖醇浓度分析样品。计算以cm/sec 计之渗透系数(Kp)。
在这个分析中，大于约10×10-6cm/sec的Kp值被认为表现出有利的生物可用性。 在这个分析中测试的本发明的化合物通常展现介于约20×10-6cm/sec与约60×10-6 cm/sec之间的Kp值，更通常介于约30×10-6cm/sec与约60×10-6cm/sec之间。举例来 说，实例1的化合物展现约60×10-6cm/sec的Kp值。
分析6：大鼠的药物动力学研究
以介于约5与约6之间的pH值在0.1％乳酸中制备测试化合物的水溶液调配物。通 过以2.5mg/kg剂量静脉内投药(IV)或通过以5mg/kg剂量口服管饲(PO)给雄性 Sprague-Dawley大鼠(CD系，查尔斯河室验室(Charles River Laboratories)，Wilmington， MA)服用测试化合物。对于IV投药的给药量为1mL/kg且对PO投药的给药量为2 mL/kg。从给药前的动物和给药后2(仅IV)、5、15和30min和1、2、4、8和24小时 的动物收集连续血液样品。通过具有1ng/mL的量下限的液相色谱-质谱法分析 (LC-MS/MS)(MDS SCIEX，API 4000，Applied Biosystems，Foster City，CA)来确定血浆中 测试化合物的浓度。
使用WinNonlin(第4.0.1版，Pharsight，Mountain View，CA)的非隔室分析(对于IV 为Model 201和对于PO为Model 200)来评估标准药物动力学参数。在血浆中的测试化 合物浓度相对时间曲线中的最大值表示为Cmax。通过线性梯形法则来计算在从给药时间 到最后可测量浓度(AUC(0-t))的浓度相对时间曲线下的面积。口服生物可用性(F(％)) (也就是，PO投药的AUC(0-t)相对于IV投药的AUC(0-t)的剂量正规化比率)可如下计 算：
F(％)＝AUCPO/AUCIV×剂量IV/剂量PO×100％
在这个分析中展现参数Cmax、AUC(0-t)和F(％)较大值的测试化合物当口服投药时预 期具有更大生物可用性。在这个分析中测试的本发明化合物具有介于约0.15与约0.35 μg/mL之间的Cmax值和介于0.5与约1.1μg·hr/mL之间的AUC(0-t)值。具体来说，实例 1的化合物具有以下值：0.32μg/mL的Cmax、0.97μg·hr/mL的AUC(0-t)和55％的口服生 物可用性F(％)。
虽然本发明已参考其特定实施例描述，但所属领域的技术人员应了解不悖离本发明 的真实精神和范畴可做出多种改变且可取代等效物。另外，可做出多种修改以使得特殊 情况、材料、物质的组合、方法、方法步骤或步骤适应本发明的目的、精神和范畴。所 有所述修改均意欲在此所附的权利要求书的范畴内。此外，所有在本文所引用的公开案、 专利和专利文件均以全文引用的方式并入，如同个别引用一般并入。
在本发明的特定方面中，R1为卤基或C1-3烷基；或R1为氟基、氯基、溴基或甲基。
在一特定方面中，R2为氢。
在另一特定方面中，R2为C1-3烷基，其中C1-3烷基视情况经羟基取代。
在又一特定方面中，R2为氢或C1-3烷基。
在本发明的其它特定方面中，R2为甲基、乙基、丙基或异丙基；R2为乙基或异丙基； 或R2为异丙基。
在特定方面中，R3为C1-3烷基；R3为甲基或乙基；或R3为甲基。
在一特定方面中，R4为-(CH2)1-3C(O)NRaRb。
在另一特定方面中，R4为
在另一特定方面中，R4为-(CH2)1-3C(O)NRaRb或
在本发明的一特定方面中，R3和R4连同与其连接的氮原子形成选自式(a)的部分、 式(b)的部分和式(c)的部分的部分。
在一特定方面中，R3和R4连同与其连接的氮原子形成式(a)的部分。在另一特定 方面中，R3和R4连同与其连接的氮原子形成式(a)的部分，其中R5为-OC(O)NRaRb 或-C(O)NRaRb。
在一特定方面中，R3和R4连同与其连接的氮原子形成式(b)的部分。在其它特定 方面中，R3和R4连同与其连接的氮原子形成式(b)的部分，其中R6为-C(O)Rf、-(CH2)2ORg 或-S(O)2NRaRb；或R6为-C(O)Rf，且e为1。
在本发明的又一方面中，R3和R4连同与其连接的氮原子形成式(c)的部分。
在特定方面中，Ra、Rb、Rc、Rd和Rg独立地为氢、甲基或乙基；或Ra、Rb、Rc、 Rd和Rg独立地为氢或甲基。
在特定方面中，Re为甲基或乙基：或Re为甲基。
在特定方面中，Rf为C1-3烷基、四氢呋喃基或-NRaRb或Rf为甲基、四氢呋喃基或 -NRaRb。
在另一特定方面中，Rf为四氢呋喃基。
在其它特定方面中，Rf为C1-3烷基或Rf为甲基。
在又一特定方面中，Rf为-NRaRb，其中Ra和Rb如本文所定义。
在特定方面中，a为0或1；或a为0或2。在另一特定方面中，a为0。
在特定方面中，b为0、1或2；或b为1或2。在另一特定方面中，b为1。
在一特定方面中，c为1或2。在另一特定方面中，c为1。
在一特定方面中，d为1。
在一特定方面中，e为1。
在一方面中，本发明提供一种式(I)化合物，其中c为1或2；d为1；且e为1。
在另一方面中，本发明提供一种式(I)化合物，其中：
R3为C1-3烷基；且
R4为-(CH2)1-3C(O)NRaRb或
或R3和R4连同与其连接的氮原子形成一选自式(a)的部分、式(b)的部分和式 (c)的部分的部分；
其中：
R5为-OC(O)NRaRb或-C(O)NRaRb；且
R6为-C(O)Rf、-(CH2)2ORg或-S(O)2NRaRb。
在又一方面中，本发明提供一种式(I)化合物，其中R3和R4连同与其连接的氮原 子形成选自式(a)的部分、式(b)的部分和式(c)的部分的部分；其中：
R5为-OC(O)NRaRb或-C(O)NRaRb；
R6为-C(O)Rf、-(CH2)2ORg或-S(O)2NRaRb；
Ra、Rb和Rg独立地为氢或甲基；
Rf为甲基、四氢呋喃基或-NRaRb；
c为1或2；d为1；且e为1。
在又一方面中，本发明提供一种式(I)化合物，其中：
R2为乙基或异丙基；
R3为C1-3烷基；且
R4为-(CH2)1-3C(O)NRaRb或
或R3和R4连同与其连接的氮原子形成选自式(a)的部分、式(b)的部分和式(c) 的部分的部分；其中：
R5为-OC(O)NRaRb或-C(O)NRaRb；
R6为-C(O)Rf、-(CH2)2ORg或-S(O)2NRaRb；
Ra、Rb和Rg独立地为氢或甲基；
Rf为甲基、四氢呋喃基或-NRaRb；
a为0；c为1或2；d为1；且e为1。
说明本文所用的化学命名惯例用于实例1的化合物：
根据由MDL信息系统(MDL Information Systems)，GmbH(德国法兰克福)所提 供的AutoNom软件，将其命名为4-(四氢呋喃-2-羰基)哌嗪-1-甲酸3-{(1S，3R，5R)-3-[(3- 异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯并咪唑-1-羰基)氨基]-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-8-基}丙酯。符号 (1S，3R，5R)描述与双环系统相关的键的相对方位，所述键描绘成为实心和虚线楔形。在 上述本发明的所有化合物中，苯并咪唑酮-羧酰胺相对氮杂双环辛烷基为内向。
可特别提及以下化合物：
4-(四氢呋喃-2-羰基)哌嗪-1-甲酸3-{(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯并咪 唑-1-羰基)氨基]-8-氮杂双环-[3.2.1]辛-8-基}丙酯；
4-(2-羟乙基)哌嗪-1-甲酸3-{(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯并咪唑-1-羰 基)氨基]-8-氮杂双环-[3.2.1]辛-8-基}丙酯；
4-乙酰基-哌嗪-1-甲酸3-{(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢-苯并咪唑-1-羰基) 氨基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-8-基}丙酯；
4-二甲基氨甲酰基氧基哌啶-1-甲酸3-{(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯并 咪唑-1-羰基)氨基]-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-8-基}丙酯；
3-氨甲酰基哌啶-1-甲酸3-{(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢-苯并咪唑-1-羰 基)氨基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-8-基}丙酯；
1，1-二氧代-1λ6-硫代吗啉-4-甲酸3-{(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯并咪 唑-1-羰基)氨基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-8-基}丙酯；
(1，1-二氧代四氢-1λ6-噻吩-3-基)甲基氨基甲酸3-{(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代 -2，3-二氢苯并咪唑-1-羰基)氨基]-8-氮杂双环-[3.2.1]辛-8-基}丙酯；
(R)-2-氨甲酰基吡咯烷-1-甲酸3-{(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯并咪唑 -1-羰基)氨基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-8-基}丙酯；
4-乙酰基-[1，4]二氮杂环庚烷-1-甲酸3-{(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢-苯 并咪唑-1-羰基)氨基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-8-基}丙酯；
二甲基氨甲酰基甲基-甲基氨基甲酸3-{(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯 并咪唑-1-羰基)氨基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-8-基}丙酯；
4-二甲基氨甲酰基哌嗪-1-甲酸3-{(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯并咪唑 -1-羰基)氨基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-8-基}丙酯；和
4-二甲基胺磺酰基哌嗪-1-甲酸3-{(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯并咪唑 -1-羰基)氨基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-8-基}丙酯。
如由上述列出的特定化合物所示范，本发明的化合物可含有一个或一个以上手性中 心。因此，除非另外指出，否则本发明包括外消旋混合物、纯立体异构体和所述异构体 的立体异构体富集的混合物。当展示特定立体异构体时，所属领域的技术人员应了解， 除非另外指出，否则较小量的其它立体异构体可存在于本发明的组合物中，其限制条件 为组合物作为整体的任何效用并未由所述其它异构体的存在消除。
定义
当描述本发明的化合物、组合物和方法时，除非另外指出，否则以下术语具有以下 含义。
术语“烷基”意思是单价饱和烃基，其可为直链或分枝链或其组合。代表性烷基包 括(例如)甲基、乙基、正丙基(n-Pr)、异丙基(i-Pr)、正丁基(n-Bu)、仲丁基、异 丁基、叔丁基等等。
术语“卤基”意思是氟基、氯基、溴基或碘基。
术语“化合物”意思是合成制备或以任何其它方法(诸如通过代谢作用)产生的 化合物。
术语“治疗有效量”意思是当投与需要治疗的患者时足以实现治疗的量。
如本文所用的术语“治疗”意思是治疗诸如哺乳动物(尤其为人类)的患者的疾病、 病症或医学病况，其包括：
(a)防止疾病、病症或医学病况发生，也就是患者的预防治疗；
(b)改善疾病、病症或医学病况，也就是消除或引起患者的疾病、病症或医学病 况的消退；
(c)抑制疾病、病症或医学病况，也就是减慢或阻止患者的疾病、病症或医学病 况的发展；或
(d)减轻患者的疾病、病症或医学病况的症状。
术语“医药学上可接受的盐”意思是由酸或碱制备的可接受用于给患者(诸如哺乳 动物)投药的盐。所述盐可衍生自医药学上可接受的无机或有机酸和来源于医药学上可 接受的碱。通常，本发明化合物的医药学上可接受的盐由酸制备。
衍生自医药学上可接受的酸的盐包括(但不限于)乙酸、己二酸、苯磺酸、苯甲酸、 樟脑磺酸、柠檬酸、乙磺酸、反丁烯二酸、葡萄糖酸、谷氨酸、氢溴酸、盐酸、乳酸、 顺丁烯二酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、粘酸、硝酸、泛酸、磷酸、丁二酸、硫酸、酒 石酸、对甲苯磺酸、羟-2-萘甲酸(xinafoic)(1-羟基-2-萘甲酸)、萘-1，5-二磺酸等等。
术语“溶剂合物”意思是由溶质(也就是本发明的化合物或其医药学上可接受的盐) 的一个或一个以上分子和溶剂的一个或一个以上分子形成的络合物或聚集体。所述溶剂 合物通常为具有实质上固定的溶质与溶剂摩尔比的结晶固体。代表性溶剂包括例如水、 甲醇、乙醇、异丙醇、乙酸等等。当溶剂为水时，形成的溶剂合物为水合物。
应了解术语“或其医药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体”意欲包括盐、溶 剂合物和立体异构体的所有排列组合，诸如式(I)化合物的立体异构体的医药学上可接 受盐的溶剂合物。
术语“离去基团”意思是在诸如亲核取代反应的取代反应中可由另一官能团或原子 置换的官能团或原子。例如，代表性离去基团包括氯基、溴基和碘基；诸如甲磺酸酯基、 甲苯磺酸酯基、溴苯磺酸酯基、硝基苯磺酸酯基等等的磺酸酯基；诸如乙酰氧基、三氟 乙酰氧基等等的酰氧基。术语“离去基团”进一步包括诸如-OC6F5、-CCl3、对-OC6H4NO2 和咪唑基的基团。
术语“其经保护的衍生物”意思是指定化合物的衍生物，其中化合物的一个或一个 以上官能团经保护基或阻隔基保护免于不需要的反应。可被保护的官能团包括(例如) 羧酸基、氨基、羟基、硫醇基、羰基等等。羧酸的代表性保护基包括酯类(诸如对甲氧 基苯甲酯)、酰胺类和酰肼类；氨基的代表性保护基包括氨基甲酸酯类(诸如叔丁氧基 羰基)和酰胺类；羟基的代表性保护基包括醚类和酯类；硫醇基的代表性保护基包括硫 醚类和硫酯类；羰基的代表性保护基包括缩醛类和缩酮类；等等。所属领域的技术人员 熟知所述保护基，且描述于(例如)T.W.Greene和G.M.Wuts有机合成中的保护基 (Protecting Groups in Organic Synthesis)，第三版，Wiley，纽约(New York)，1999和其 中引用的文献中。
术语“氨基保护基”意思是适合于防止氨基氮上的不想要的反应的保护基。代表性 氨基保护基包括(但不限于)甲酰基；例如烷酰基的酰基，诸如乙酰基；烷氧羰基，诸 如叔丁氧基羰基(Boc)；芳基甲氧基羰基，诸如苯甲氧基羰基(Cbz)和9-芴基甲氧基 羰基(Fmoc)；芳甲基，诸如苯甲基(Bn)、三苯甲基(Tr)和1，1-二-(4′-甲氧基苯基) 甲基；硅烷基，诸如三甲基硅烷基(TMS)和叔丁基二甲基硅烷基(TBDMS)；等等。
通用合成程序
本发明的化合物可使用以下通用方法和程序由易得的起始物质来制备。尽管本发明 的特定方面于以下流程中说明，但所属领域的技术人员会认可本发明的所有方面可使用 本文所述的方法制备或通过使用所属领域的技术人员已知的其它方法、试剂和起始物质 来制备。也应了解在给定典型或优选方法条件(也就是反应温度、时间、试剂的摩尔比、 溶剂、压力等)的情况下，除非另外规定否则也可使用其它方法条件。最佳反应条件可 随所用的特殊试剂或溶剂而变化，但所属领域的技术人员可由路线最优化程序来确定所 述条件。
另外，如所属领域的技术人员可显而易见，常规保护基必需防止某些官能团经历不 需要的反应。在此项技术中用于特定官能团的适合保护基的选择，和用于保护和去保护 的适合条件已为我们所熟知。举例来说，多数保护基和其引入和去除描述于T.W.Greene 和G.M.Wuts，有机合成中的保护基，第三版，Wiley，纽约，1999和其中引用的文献中。
除非另外指出，否则在以下流程中所示的取代基和变量具有本文所提供的定义。
在一个合成方法中，式(I)化合物可如流程A中所说明来制备。
流程A
使苯并咪唑酮-羧酰胺莨菪烷中间体(III)与式(IV)化合物(其中L1为离去基团) 反应以提供式(I)化合物。通常，L1为SN2-有利的离去基团，诸如氯基、碘基或溴基。 在惰性稀释剂中，式(IV)化合物与介于约0.25与约1.5当量之间的苯并咪唑酮-羧酰 胺莨菪烷(III)在诸如N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)的碱和诸如碘化钠的催化剂存在下 接触。适合的惰性稀释剂包括二甲基甲酰胺、乙腈、四氢呋喃、N-甲基-2-吡咯烷酮等等。 适合的碱也包括(例如)三乙胺、1，8-二氮杂双环-[5.4.0]十一-7-烯(DBU)和碳酸钾。 适合的催化剂也包括(例如)碘化钾和四丁基碘化铵。这个反应通常在约40℃至约100℃ 的温度下进行，历时介于约2与约24小时之间或直到反应大体上完全。
通过常规程序分离且提纯式(I)的产物。举例来说，所述产物可减压浓缩直到干燥， 在弱酸水溶液中溶解且通过高效液相色谱法(HPLC)提纯。
应了解在使用式(III)化合物的本文所述的流程A的方法和其它方法中，如所属领 域的技术人员所知式(III)化合物可以游离碱的形式或以盐的形式提供，其中(若必要) 适当调节反应条件。
式(III)化合物可如以下流程B中所示来制备。
流程B
在流程B中，使中间体(a)(视情况经取代的1，3-二氢苯并-咪唑-2-酮)与中间体 (b)反应以提供式(V)化合物，其中W为离去基团(诸如卤基，也就是氟基、氯基或 溴基)且A为选定之离去基团使得其在不同于W的条件下反应(诸如-OC6F5、-CCl3、 对-OC6H4NO2或咪唑-1-基)；或W和A各为咪唑-1-基，，使式(V)化合物与中间体(c) (其中P1表示诸如Boc的氨基保护基)反应以提供中间体(d)。通过标准程序将保护基 P1从中间体(d)去除以提供式(III)化合物。
虽然最佳反应条件可视所用的特定反应物或溶剂而变化，但所属领域的技术人员可 易于由路线最优化程序来确定所述条件。
举例来说，在使用氯甲酸4-硝基苯酯作为中间体(b)的示范性方法中，使苯并咪 唑酮中间体(a)在惰性气氛下在强碱(诸如氢化钠、二异丙基胺锂和正丁基锂)存在 下溶解于诸如四氢呋喃、乙醚、DMF或其组合的惰性稀释剂中，且使其与介于约1与约 1.3当量之间的氯甲酸4-硝基苯酯接触。在约0℃至约40℃下搅拌混合物，历时介于约 12与约24小时之间或直到反应大体上完全，以形成活化酯(式(V)化合物)。分离且 提纯式(V)化合物，或使其与经保护的氨基-莨菪烷(中间体(c))在惰性稀释剂(诸 如四氢呋喃)存在下在约30℃至约90℃的温度下原位反应，历时介于约10与约24小 时之间以提供经保护的中间体(d)。
使用常规方法，将氨基保护基P1从中间体(d)去除以提供式(III)的苯并咪唑酮- 羧酰胺莨菪烷化合物。使用氯甲酸4-硝基苯酯作为中间体(b)来制备中间体(III)的 上述方法的变化描述于以下实例13中。
或者，式(I)化合物可如以下流程C中所示来制备。
流程C
使苯并咪唑酮-羧酰胺中间体(V)与式(VI)的莨菪烷-伸烷基-羧酰胺化合物反应 以提供式(I)化合物。分离且提纯式(V)化合物(其合成描述于流程B中)，或使其 与式(VI)化合物在约30℃至约90℃的温度范围下在诸如四氢呋喃的惰性稀释剂存在 下原位反应，历时介于约10与约24小时之间，或直到反应完全，以提供式(I)化合物。
苯并咪唑酮中间体(a)可如以下流程D中所示来制备。
流程D
在流程D中，使视情况经取代的2-氟硝基苯与伯胺(中间体(e))反应以提供中间 体(f)，所述中间体(f)被还原成二氨基苯(中间体(g))。使二氨基苯与羰基二咪唑 在诸如四氢呋喃的惰性稀释剂存在下，在约20℃至约40℃的温度下反应，历时介于约 12与约30小时之间，以提供苯并咪唑酮中间体(a)。
中间体(a)的化合物的代表性合成于以下制备1中描述。中间体(a)的经取代化 合物也易于由类似于文献中所述的彼等程序来制备。例如参看化学研究杂志(The Journal of Chemical Research)(1)，21-22(2005)；杂原子化学(Heteroatom Chemistry)， 5(5/6)：437-40(1994)和德国专利(Ger.Offen.)，3839743，1990年5月31日。
经保护的氨基莨菪烷(在本申请案中所述的反应中使用的中间体(c))由易可得的 起始物质制备。举例来说，当氨基保护基P1为Boc时，经保护的氨基莨菪烷可如以下 流程E中所示制备。
流程E
如以下制备2中详细描述，使2，5-二甲氧基四氢呋喃与介于约1与2当量之间的苯 甲胺和稍微过量(例如约1.1当量)的1，3-丙酮二甲酸在酸性水溶液中在诸如磷酸氢二 钠的缓冲剂存在下接触以制备经Boc-保护的中间体(c′)。将反应混合物加热到介于约 60℃与约100℃之间以确保产物(8-苯甲基-8-氮杂双环-[3.2.1]辛-3-酮，通常为N-苯甲基 莨菪酮)中任何羧化中间体的脱羧基作用。
通常使N-苯甲基莨菪酮中间体与稍微过量(例如约1.1当量)的二碳酸二叔丁酯(通 常为(Boc)2O)在氢气氛下在过渡金属催化剂存在下反应以提供3-氧代-8-氮杂双环[3.2.1] 辛烷-8-甲酸叔丁酯。反应通常在环境温度下进行约12至约72小时。最终，使3-氧代-8- 氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯与过量较多(例如至少约25当量)的甲酸铵在诸如甲 醇的惰性稀释剂中，在过渡金属催化剂存在下接触，以提供在具有较高立体特异性的内 向构型(例如内外比＞99∶1)产物(中间体(c))。反应通常在环境温度下进行约12至约 72小时或直到反应大体上完全的。有利地逐份添加甲酸铵试剂。举例来说，使3-氧代-8- 氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯与初始约15至约25当量的一部分甲酸铵接触。在约 12至约36小时的间隔后，又添加一部分的约5至约10当量的甲酸铵其他。在类似间隔 后可重复后续添加。产物(中间体(c))可通过诸如碱萃取的常规程序提纯。
如以下在流程F中所述，式(IV)化合物可易于通过标准程序由一般起始物质来制 备。
流程F
在流程F中，使中间体(h)(其中L1和L2为离去基团)与仲胺(i)反应以提供式 (IV)化合物。使仲胺(i)溶解于诸如二氯甲烷的惰性稀释剂中，且在诸如N，N-二异丙 基乙胺的碱存在下在约0℃至约40℃的温度范围下添加中间体(h)，历时约30分钟至 约4小时。产物(式(IV)化合物)可通过诸如HPLC的常规程序提纯。
通常，L1和L2为卤基离去基团，诸如氯基、碘基、溴基；甲磺酸酯也可用作离去 基团L1。适合的碱可包括(例如)三乙胺、DBU和碳酸钾。适合的惰性稀释剂可包括 乙腈、四氢呋喃和N，N-二甲基甲酰胺。
式(h)和(i)的中间体化合物为一可购得的或可由易可得的起始物质合成。多种 仲胺(也就是可用于流程F中的式(I)的中间体化合物)的合成在本文的实例部分中 描述。
式(VI)化合物可如流程G中所示来制备。
流程G
在流程G中，中间体(j)(其中P2为氨基保护基)与式(IV)化合物反应以提供经 保护的中间体(k)，接着所述中间体(k)经去保护以提供式(VI)化合物。流程G的 反应通常在用于流程A的反应的上述胺偶合条件下进行。
通过以氨基保护基P2保护经保护的氨基莨菪烷中间体(c)的氨基氮，且接着从氮 杂双环辛烷基的氮去除P1可制备式(j)的化合物。选择保护基P1和P2以使其可在不同 条件下加以去除。举例来说，当选择P1为Boc时，则Cbz可用作P2。保护基Boc通常 通过用诸如三氟乙酸的酸的处理来去除以提供中间体的酸式盐。中间体的酸式盐(若需 要)可通过碱的常规处理转化为游离碱。保护基Cbz可通过经由诸如碳载钯的适合金属 催化剂氢解便利地去除。关于特定反应条件和制备本发明的代表性化合物或其中间体的 其它程序的更多细节在以下实例中描述。
因此，在一方法方面中，本发明提供一种制备式(I)化合物或其盐或溶剂合物或立 体异构体的方法，其中R1、R2、R3、R4、a和b如本文所定义，所述方法包含：
(a)使式(III)化合物：
与式(IV)化合物：
(其中L1为离去基团)反应；或
(b)使式(V)化合物：
(其中A为离去基团)；
与式(VI)化合物：
以提供式(I)化合物，或其盐或溶剂合物或立体异构体。
在另外的实施例中，本发明涉及本文所述的其它方法，且涉及通过本文所述的任何 方法制备的产物。
医药组合物
本发明的苯并咪唑酮羧酰胺衍生的氨基甲酸酯化合物通常以医药组合物的形式投 药给患者。所述医药组合物可由投药的任何可接受途径投与患者，所述途径包括(但不 限于)口服、直肠、阴道、鼻、吸入、局部(包括经皮)和肠道外模式的投药。
因此，在其组合物方面的一者中，本发明涉及一种医药组合物，其包含医药学上可 接受的载剂或赋形剂和治疗有效量的式(I)化合物或其医药学上可接受的盐。若需要， 则所述医药组合物视情况可含有其它治疗剂和/或调配剂。
本发明的医药组合物通常含有治疗有效量的本发明的化合物或其医药学上可接受 的盐。通常，所述医药组合物可含有约0.1至约95重量％的活性剂；优选为约5至约70 重量％；且更优选为约10至约60重量％的活性剂。任何常规的载剂或赋形剂可用于本 发明的医药组合物中。特定载剂或赋形剂的选择，或载剂或赋形剂的组合，可取决于用 于治疗特定患者的投药模式或医学病况或疾病状态的类型。在这点上，用于特定模式投 药的适合医药组合物的制备正好在熟习医药技术者的范畴内。另外，用于所述组合物的 成份可购自(例如)Sigma、P.O.Box 14508、St.Louis、MO 63178。为进一步说明，常 规调配技术描述于雷明登氏药学的理论与实践(Remington：The Science and Practice of Pharmacy)，第20版，Lippincott Williams&White，Baltimore，Maryland(2000)和H.C. Ansel等人，医药剂型和药物传递系统(Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems)，第7版，Lippincott Williams&White，Baltimore，Maryland(1999)中。
可用作医药学上可接受的载剂的材料的代表性实例包括(但不限于)下列：(1)糖， 诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素，诸如 微晶纤维素和其衍生物(诸如羧甲基纤维素钠盐、乙基纤维素和乙酸纤维素)；(4)粉 末黄耆胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石粉；(8)赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；(9) 油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇类， 诸如丙二醇；(11)多元醇，诸如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；(12)酯，诸 如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；(15) 褐藻酸；(16)无热原质水；(17)生理盐水；(18)林格氏液；(19)乙醇；(20)磷酸 盐缓冲溶液；和(21)其它用于医药组合物中的无毒相容性物质。
通常通过使本发明的化合物与医药学上可接受的载剂和一种或一种以上视情况可 选的成份充分且密切地混合或掺合来制备本发明的医药组合物。若必要或需要，接着使 用常规程序和设备将所得的均匀经掺合混合物加工成形或装入片剂、胶囊、药丸等等内。
本发明的医药组合物优选以单位剂型封装。术语“单位剂型”意思是适合于对患者 给药的物理上离散单元，也就是每一单元含有经计算从而单独或与一个或一个以上其他 单元组合产生所要治疗效应的预定量的活性剂。举例来说，所述单位剂型可为胶囊、片 剂、药丸等等。
在一优选实施例中，本发明的医药组合物适合于口服投药。用于口服投药的适合医 药组合物可为胶囊、片剂、药丸、锭剂、扁囊剂(cachets)、糖衣药丸、散剂、颗粒剂 的形式；或为水性或非水性液体中的溶液或悬浮液形式；或为水包油或油包水型液体乳 液形式；或为酏剂或糖浆形式；等等；每一者均含有预定量的本发明化合物作为活性成 份。
当意欲以固体剂型(也就是以胶囊、片剂、药丸等等形式)口服投药时，本发明的 医药组合物通常可包含作为活性成份的本发明化合物和一种或一种以上诸如柠檬酸钠 或磷酸二钙的医药学上可接受的载剂。视情况或另一选择为，所述固体剂型也可包含： (1)填充剂或增量剂，诸如淀粉、微晶纤维素、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和/或硅 酸；(2)粘合剂，诸如羧甲基纤维素、褐藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿 拉伯胶；(3)保湿剂，诸如甘油；(4)崩解剂，诸如琼脂、碳酸钙、马铃薯或树薯淀粉、 褐藻酸、某些硅酸盐和/或碳酸钠；(5)溶液阻滞剂，诸如石蜡；(6)吸收促进剂，诸如 季铵化合物；(7)湿润剂，诸如十六碳醇和/或单硬脂酸甘油酯；(8)吸附剂，诸如高岭 土和/或膨润土；(9)润滑剂，诸如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂 基硫酸钠和/或其混合物；(10)着色剂；和(11)缓冲剂。
脱模剂、湿润剂、涂布剂、甜味剂、调味剂和香化剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在 于本发明的医药组合物中。医药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化 剂，诸如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等等；(2)油 溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯 (BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等等；和(3)金属螯合剂，诸如柠檬酸、 乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等等。用于片剂、胶囊、药丸等等的 涂布剂包括可用于肠溶衣的那些涂布剂，诸如邻苯二甲酸乙酸纤维素(CAP)、聚乙酸 乙烯酯邻苯二甲酸酯(PVAP)、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、甲基丙烯酸-甲基丙烯 酸酯共聚物、乙酸纤维素偏苯三酸酯(CAT)、羧甲基乙基纤维素(CMEC)、丁二酸乙 酸羟丙基甲基纤维素(HPMCAS)等等。
若需要，则也可使用(例如)以不同比例的羟丙基甲基纤维素或其它聚合物基质、 脂质体和/或微球体来调配本发明的医药组合物以提供活性成份的缓慢或受控释放。
另外，本发明的医药组合物可视情况含有乳浊剂，且可经调配以便其仅释放活性成 份，或视情况以延时方式优先在胃肠道的特定部分释放。可使用的嵌入组合物的实例包 括聚合物质和蜡。活性成份也可以微囊形式存在，若适当，则具有一种或一种以上上述 赋形剂。
用于口服投药的适合液态剂型包括(例如)医药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、 悬浮液、糖浆和酏剂。所述液态剂型通常包含活性成份和惰性稀释剂(诸如水或其它溶 剂)、增溶剂和乳化剂(诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯 甲酯、丙二醇、1，3-丁二醇)、油(诸如棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖 麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯和其混合物。 除活性成份以外，悬浮液可含有悬浮剂，诸如乙氧基化异硬脂醇、聚氧化乙烯山梨糖醇 和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄耆胶和其混合物。
或者，本发明的医药组合物经调配得以由吸入投药。用于由吸入投药的适合医药组 合物通常可以喷雾或粉末的形式存在。所述组合物通常使用熟知的传递装置(诸如定剂 量吸入器、干粉吸入器、喷雾器或类似传递装置)加以投药。
当使用加压容器由吸入投药时，本发明的医药组合物通常可包含活性成份和诸如二 氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适合气体的适合推进剂。
另外，医药组合物可以胶囊或滤筒(由(例如)明胶制成)的形式存在，所述胶囊 或滤筒包含本发明的化合物和适用于粉末吸入器的粉末。适合的粉末基质包括(例如) 乳糖或淀粉。
本发明的化合物也可使用已知的经皮传递系统和赋形剂经皮投药。举例来说，使本 发明的化合物与诸如丙二醇、单月桂酸聚乙二醇酯、氮杂环烷-2-酮等等的渗透增强剂混 合，且并入贴片(patch)或类似传递系统。若需要，则包括胶凝剂、乳化剂和缓冲剂的 其他赋形剂可用于所述经皮的组合物中。
下列调配物说明本发明的代表性医药组合物：
调配物实例A
如下制备用于口服投药的硬明胶胶囊：
成份 量
本发明的化合物 50mg
乳糖(喷雾干燥) 200mg
硬脂酸镁 10mg
代表性程序：充分地掺合成份且接着装入硬明胶胶囊内(每胶囊260mg组合物)。
调配物实例B
如下制备用于口服投药的硬明胶胶囊：
成份 量
本发明的化合物 20mg
淀粉 89mg
微晶纤维素 89mg
硬脂酸镁 2mg
代表性程序：充分地掺合成份且接着通过第45号筛目美国筛，且装入硬明胶胶囊 内(每胶囊200mg组合物)。
调配物实例C
如下制备用于口服投药的胶囊：
成份 量
本发明的化合物 10mg
聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯 50mg
淀粉粉末 250mg
代表性程序：充分地掺合成份且接着装入明胶胶囊内(每胶囊310mg组合物)。
调配物实例D
如下制备用于口服投药的片剂：
成份 量
本发明的化合物 5mg
淀粉 50mg
微晶纤维素 35mg
聚乙烯吡咯烷酮(在水中10重量％) 4mg
羧甲基淀粉钠 4.5mg
硬脂酸镁 0.5mg
滑石粉 1mg
代表性程序：使活性成份、淀粉和纤维素通过第45号筛目美国筛且充分地混合。 将聚乙烯吡咯烷酮的溶液与所得的粉末混合，且接着使混合物通过第14号筛目美国筛。 在50-60℃下干燥如此制得的颗粒，且通过第18号筛目美国筛。接着将羧甲基淀粉钠、 硬脂酸镁和滑石粉(先前已通过第60号筛目美国筛)添加到所述颗粒中。混合后，在 压片机上压制混合物以提供重100mg的片剂。
调配物实例E
如下制备用于口服投药的片剂：
成份 量
本发明的化合物 25mg
微晶纤维素 400mg
烟雾状二氧化硅 10mg
硬脂酸 5mg
代表性程序：将成份充分地掺合且接着压制以形成片剂(每片剂440mg组合物)。
调配物实例F
如下制备用于口服投药的单刻痕(Single-scored)片剂：
成份 量
本发明的化合物 15mg
玉米淀粉 50mg
交联羧甲基纤维素钠 25mg
乳糖 120mg
硬脂酸镁 5mg
代表性程序：将成份充分地掺合且压制以形成单刻痕片剂(每片剂215mg组合物)。
调配物实例G
如下制备用于口服投药的悬浮液：
成份 量
本发明的化合物 0.1g
反丁烯二酸 0.5g
氯化钠 2.0g
对羟基苯甲酸甲酯 0.15g
对羟基苯甲酸丙酯 0.05g
砂糖 25.5g
山梨糖醇(70％溶液) 12.85g
Veegum k(Vanderbilt Co.) 1.0g
调味剂 0.035mL
着色剂 0.5mg
蒸馏水 适量至100mL
代表性程序：混合成份以形成每10mL悬浮液含有10mg活性成份的悬浮液。
调配物实例H
如下制备用于通过吸入投药的干粉：
成份 量
本发明的化合物 1.0mg
乳糖 25mg
代表性程序：使活性成份微粉化，且接着与乳糖掺合。接着将此掺合混合物装入明 胶吸入滤筒。使用粉末吸入器投与滤筒的内容物。
调配物实例I
如下在定剂量吸入器中制备用于通过吸入投药的干粉：
代表性程序：通过使10g活性化合物作为具有平均尺寸小于10μm的微粉化颗粒分 散于由0.2g卵磷脂溶解于200mL脱矿质水中形成的溶液中来制备含有5重量％本发明 的化合物和0.1重量％卵磷脂的悬浮液。所述悬浮液经喷雾干燥且所得物质为经微粉化 为平均直径小于1.5μm的颗粒。将所述颗粒装入具有加压1，1，1，2-四氟乙烷的滤筒内。
调配物实例J
如下制备可注射的调配物：
成份 量
本发明的化合物 0.2g
乙酸钠缓冲溶液(0.4M) 40mL
HCl(0.5N)或NaOH(0.5N) 适量至pH4
水(经蒸馏，无菌) 适量至20mL
代表性程序：掺合上述成份且使用0.5N HCl或0.5N NaOH调节pH值至4±0.5。
调配物实例K
如下制备用于口服投药的胶囊：
成份 量
本发明的化合物 4.05mg
微晶纤维素(Avicel PH 103) 259.2mg
硬脂酸镁 0.75mg
代表性程序：充分地掺合成份且接着装入明胶胶囊(尺寸#1，白色，不透明)(每 胶囊264mg组合物)。
调配物实例L
如下制备用于口服投药的胶囊：
成份 量
本发明的化合物 8.2mg
微晶纤维素(Avicel PH 103) 139.05mg
硬脂酸镁 0.75mg
代表性程序：充分地掺合成份且接着装入明胶胶囊(尺寸#1，白色，不透明)(每 胶囊148mg组合物)。
应了解适用于特定模式投药的任何形式的本发明的化合物(也就是游离碱、医药盐 或溶剂合物)可用于如上所述的医药组合物中。
效用
本发明的苯并咪唑酮-羧酰胺衍生的氨基甲酸酯化合物为5-HT4受体激动剂，且因此 预期用于治疗由5-HT4受体介导或与5-HT4受体活性相关的医学病况，也就是可通过 5-HT4受体激动剂治疗得到改善的医学病况。所述医学病况包括(但不限于)肠易激综 合征(IBS)、慢性便秘、功能性消化不良、胃排空延迟、胃食管反流病(GERD)、胃轻 瘫、手术后肠梗阻、肠假性阻塞和药物诱发性延迟传输。另外，建议某些5-HT4受体激 动剂化合物可用于治疗中枢神经系统病症，包括认知病症、行为病症、情感病症和自主 功能控制病症。
具体来说，本发明的化合物能增加胃肠(GI)道的活动性，且因此预期用于治疗包 括人类的哺乳动物中由活动性降低引起的GI道病症。所述GI活动性病症包括(例如) 慢性便秘、便秘型肠易激综合征(C-IBS)、糖尿病性和自发性胃轻瘫和功能性消化不良。
因此，在一方面中本发明提供一种增加哺乳动物胃肠道活动性的方法，所述方法包 含投与哺乳动物治疗有效量的包含医药学上可接受的载剂和本发明化合物的医药组合 物。
当用于治疗GI道活动性降低的病症或其它由5-HT4受体介导的病况时，本发明的 组合物通常可以每日单剂量或多倍剂量口服投药，但也可使用其它投药形式。每一剂量 投与的活性剂的量或每天投与的总量通常由医师根据相关情况加以确定，所述情况包括 被治疗的病况、选择的投药途径、投与的实际化合物和其相对活性、个别患者的年龄、 体重和反应、患者症状严重性和其类似情况。
用于治疗GI道活动性降低的病症或其它由5-HT4受体介导的病症的适合剂量可在 约0.0007至约20mg/kg/天的活性剂范围内，其包括约0.0007至约1mg/kg/天。对于平 均70kg的人来说，这将相当于每天约0.05至约70mg的活性剂量。
在本发明的一方面中，本发明的化合物用于治疗慢性便秘。当用于治疗慢性便秘时， 本发明的化合物通常以每日单剂量或多倍剂量口服投药。优选地，用于治疗慢性便秘的 剂量在每天约0.05至约70mg的范围内。
在本发明的另一方面中，本发明的化合物用于治疗肠易激综合征。当用于治疗便秘 型肠易激综合征时，本发明的化合物通常可以每日单剂量或多倍剂量口服投药。优选地， 用于治疗便秘型肠易激综合征的剂量可在每天约0.05至约70mg的范围内。
在本发明的又一方面中，本发明的化合物用于治疗糖尿病性胃轻瘫。当用于治疗糖 尿病性胃轻瘫时，本发明的化合物通常可以每日单剂量或多倍剂量口服投药。优选地， 用于治疗糖尿病性胃轻瘫的剂量可在每天约0.05至约70mg的范围内。
在本发明的又一方面中，本发明的化合物用于治疗功能性消化不良。当用于治疗功 能性消化不良时，本发明的化合物通常可以每日单剂量或多倍剂量口服投药。优选地， 用于治疗功能性消化不良的剂量可在每天约0.05至约70mg的范围内。
本发明也提供一种治疗哺乳动物与5-HT4受体活性相关的疾病或病况的方法，所述 方法包含投与哺乳动物治疗有效量的本发明的化合物或治疗有效量的包含本发明的化 合物的医药组合物。
因为本发明的化合物为5-HT4受体激动剂，所以所述化合物也用作用于调查或研究 具有5-HT4受体的生物系统或样品，或用于发现新颖5-HT4受体激动剂的研究工具。此 外，因为与结合至其它5-HT亚型的受体(尤其5-HT3受体)相比较，本发明的化合物 展现对于5-HT4受体的结合选择性，所以所述化合物尤其用于研究生物系统或样品中 5-HT4受体的选择性促效作用的效应。任何具有5-HT4受体的适合生物系统或样品可用 于可在活体外或活体内进行的每一研究中。适合于所述研究的代表性生物系统或样品包 括(但不限于)细胞、细胞提取物、质膜、组织样品、哺乳动物(诸如小鼠、大鼠、豚 鼠、兔子、狗、猪等)等等。
在本发明的此方面中，使包含5-HT4受体的生物系统或样品与5-HT4受体促效量的 本发明的化合物接触。接着使用诸如放射性配体结合分析和功能分析的常规程序和设备 来测定促进5-HT4受体的效应。所述功能分析包括细胞内环单磷酸腺苷(cAMP)的配 体介导性变化、酶腺苷酸环化酶(其合成cAMP)的活性的配体介导性变化、鸟苷三磷 酸(GTP)的类似物(诸如[35S]GTPγS(鸟苷5′-O-(γ-硫基)三磷酸)或GTP-Eu)经由 受体催化的GTP类似物与GDP类似物的交换并入隔离膜内方面的配体介导性变化、游 离的细胞内钙离子的配体介导性变化(用(例如)荧光联结成像平板阅读器或来自 Molecular Devices，Inc.的测量)和促细胞分裂剂活化蛋白激酶(MAPK)活化作 用的测量。在以上所列的任何功能分析或类似性质的分析中，本发明的化合物可使促进 或增加5-HT4受体活化。本发明化合物的5-HT4受体促效量通常是在约1纳摩尔浓度 (nM)至约500纳摩尔浓度范围内。
另外，本发明的化合物可用作用于发现新颖5-HT4受体激动剂的研究工具。在这个 实施例中，比较一个测试化合物或一组测试化合物的5-HT4受体结合或功能数据与本发 明化合物的5-HT4受体结合或功能数据，若有的话用于识别具有优良结合或功能活性的 测试化合物。本发明的此方面包括(作为独立实施例)比较数据的产生(使用适当分析) 和测试数据的分析两者，以识别所关注的测试化合物。
除其它特性以外，已发现本发明的化合物为5-HT4受体的有效激动剂，且在放射性 配体结合分析中对5-HT4受体亚型展现优于5-HT3受体亚型的实质选择性。此外，本发 明的代表性化合物在大鼠模型中展现优良的药物动力学特性。因此，预期本发明的化合 物当口服投药时展现良好的生物可用度。此外，在使用表现hERG心脏钾离子通道的分 离全细胞的活体外电压钳模型中测试的本发明的代表性化合物经证实并未展现不可接 受水平的钾离子流的抑制。电压钳分析为经接受的临床前方法，其分析药剂改变与心律 失常相关的心脏复极化模式(尤其引起所谓的QT延长)的潜能。(Cavero等人，药物 治疗意见(Opinion on Pharmacotherapy)，2000，1，947-73，Fermini等人，药物发现自然 评论(Nature Reviews Drug Discovery)，2003，2，439-447)因此，预期包含本发明的化 合物的医药组合物具有可接受的心脏概况(cardiac profile)。
可使用多种所属领域的技术人员熟知的活体外和活体内分析证明本发明化合物的 这些特性以及效用。代表性分析在以下实例中更详尽地描述。
实例
提供以下合成和生物学实例以说明本发明，且不以任何限制本发明的范畴的方法来 解释。在以下实例中，除非另外指出，否则以下缩写具有以下含义。以下未定义的缩写 具有其一般接受的含义。
Boc＝叔丁氧基羰基
(Boc)2O＝二碳酸二叔丁酯
DCM＝二氯甲烷
DMF＝N，N-二甲基甲酰胺
DMSO＝二甲亚砜
EtOAc＝乙酸乙酯
mCPBA＝间氯过苯甲酸
MeCN＝乙腈
MTBE＝叔丁基甲基醚
PyBop＝六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷膦
Rf＝保留因子
RT＝室温
TFA＝三氟乙酸
THF＝四氢呋喃
试剂(包括仲胺)和溶剂均购自商业供应(Aldrich、Fluka、Sigma等)，且未经进 一步提纯即使用。除非另外规定，否则反应在氮气氛下进行。反应混合物的进程由薄层 色谱法(TLC)、分析高效液相色谱法(分析HPLC)和质谱法来监测，所述方法的细节 在以下和分别在反应的特定实例中给出。反应混合物如在每一反应中明确地描述而处 理；通常其通过萃取和其它诸如温度和溶剂依赖性结晶和沉淀的提纯方法进行提纯。另 外，反应混合物通常由制备HPLC提纯：下文描述通用方法。反应产物的特征化通常由 质谱法和1H-NMR光谱测定法进行。对于NMR测量来说，将样品溶解于氘化溶剂 (CD3OD、CDCl3或DMSO-d6)中，且1H-NMR光谱在标准观测条件下由Varian Gemini 2000仪器(300MHz)获得。除非另外指出，否则化合物的质谱鉴别由用Applied Biosystems(Foster City，CA)模式API 150EX仪器或Agilent(Palo Alto，CA)模式1100 LC/MSD仪器的电喷雾电离法(ESMS)进行。
一种分析HPLC的通用方案：使每一粗制化合物以0.5-1.0mg/mL的浓度溶解于50％ MeCN/H2O(含有0.1％TFA)中，且通过使用分析HPLC来分析：1)反相分析柱：Zorbax Bonus-RP(3.5μm粒度，2.1×50mm)；2)流速：0.5mL/min；3)含0.1％TFA的5％ MeCN/H2O(等强度；0-0.5min)；含0.1％TFA的5％MeCN/H2O至含0.1％TFA的75％ MeCN/H2O(线性梯度；0.5-4min)；4)检测波：214、254和280nm。必要时指出其 它所用条件。
一种制备HPLC的通用方案：使粗制化合物以50-100mg/mL的浓度溶解于水中的 50％乙酸中，过滤且使用制备HPLC分馏：1)管柱：YMC Pack-Pro C18(50a×20mm； ID＝5μm)；2)线性梯度：10％A/90％B至50％A/50％B，经30min；3)流速：40mL/min； 4)检测波：214nm。
仲胺的制备
以下描述在式(I)化合物的合成中用作中间体的多种仲胺的制备。
通过与个别磺酰氯(iPr2NEt，CH2Cl2，0℃)反应且除去N-Boc基的保护(CF3CO2H， CH2Cl2)由N-Boc哌嗪制备哌嗪的N-磺酰基衍生物。1-甲烷磺酰基哌嗪：1H-NMR(CDCl3； 中性)：δ(ppm)3.1(t，4H)，2.9(t，4H)，2.7(s，3H)。甲烷磺酰基哌嗪也通过使甲烷磺酰氯与 过量哌嗪(＞2当量)在水中反应来制备。
通过使哌嗪分别与二甲氨基氯甲酸酯或二甲氨基胺磺酰氯反应制备哌嗪的N-衍生 物，诸如1-(二甲氨基羰基)哌嗪和1-二甲氨基磺酰基)哌嗪。
通过用乙酰氯(iPr2NEt，CH2Cl2，0℃)处理N1-Boc-3-氨基吡咯烷(外消旋物，3R 或3S)且除去N-Boc基的保护(CF3CO2H，CH2Cl2)来制备外消旋或单一手性异构体 形式的3-乙酰基氨基吡咯烷。3-(乙酰氨基)吡咯烷：1H-NMR(DMSO-d6；TFA盐)：δ(ppm) 4.2(五重峰，1H)，3.3-3.1(m，3H)，2.9(m，1H)，2.0(m，1H)，1.8(br s，4H)。
通过用丙酰基磺酰氯或环己基甲基磺酰氯(iPr2NEt，CH2Cl2，0℃)处理N1-Boc-(3R)- 氨基吡咯烷且除去N-Boc基的保护(CF3CO2H，CH2Cl2)来获得(3R)-氨基吡咯烷的N3- 烷磺酰基衍生物。
根据Loev，B.有机化学杂志(J.Org.Chem.)1961，26，4394-9的方案通过使3-环 丁烯砜与必需的甲醇中的伯胺(cat.KOH，rt)反应来制备四氢-3-噻吩胺-1，1-二氧化物的 衍生物。N-甲基-3-四氢噻吩胺1，1-二氧化物(TFA盐)：1H-NMR(DMSO-d6)：δ(ppm)9.4 (br s，2H)，4.0-3.8(五重峰，1H)，3.6-3.5(dd，1H)，3.4-3.3(m，1H)，3.2-3.1(m，2H)，2.5(s， 3H)，2.4(m，1H)，2.1(m，1H)。
如下制备(S)-1，1-二氧代-四氢-1λ6-噻吩-3-基胺：
1)通过在室温下用甲醇中的(Boc)2O处理约12h以进行(S)-3-四氢噻吩胺(Dehmlow， E.V.；Westerheide，R.合成法(Synthesis)1992，10，947-9)的N-Boc保护；2)在0℃下通 过用二氯甲烷中的mCPBA处理以氧化成经N-Boc保护的(S)-1，1-二氧代-四氢-1λ6-噻吩 -3-基胺，历时约5h；和3)用二氯甲烷中的TFA在室温下使砜衍生物除去N-Boc的保 护成为视作TFA盐分离的游离胺，历时1h。使用相同方法来制备(R)-1，1-二氧代-四氢-1λ6- 噻吩-3-基胺，但用(R)-3-四氢噻吩胺来替代(S)-3-四氢噻吩胺。
由四氢-4H-噻喃-4-酮制备N-甲基-四氢-2H-噻喃-4-胺-1，1-二氧化物：i)MeNH2， NaBH4；ii)(Boc)2O，MeOH；iii)mCPBA，CH2Cl2，0℃；iv)CF3CO2H，CH2Cl2。(m/z)： [M+H]+C6H13NO2S的计算值：164.07；实验值：164.9。1H-NMR(CD3OD；TFA盐)：δ(ppm) 3.4-3.1(m，5H)，2.7(s，3H)，2.4(br d，2H)，2.1(br m，2H)。
脯氨酸二甲基酰胺、异六氢烟碱酰胺(哌啶-4-羧酰胺)和1-(四氢-2-呋喃甲酰基) 哌嗪可于市面购得，且购自商业来源。
通过使氨基氯甲酸二甲酯与经N-Boc保护的4-哌啶醇反应来制备氨基甲酸4-哌啶醇 -二甲酯。
制备1
1-异丙基-1，3-二氢-2H-苯并咪唑-2-酮的制备
a.N-异丙基-N-(2-硝基苯)胺的制备
向在冰浴中冷却的乙醇(300mL)中的2-氟基-硝基苯(31.8g，0.225mol)的冷溶 液添加异丙基胺(54.0mL，0.634mol)，随后添加水(120mL)中的碳酸钾(31.1g， 0.225mol)溶液。在0℃下搅拌混合物1h，接着回流6h。通过将混合物冷却到环境温 度来终止反应，且将其减压蒸发而得橙色残余物。使残余物在乙醚(800mL)和盐水溶 液(300mL)之间分溶。干燥且过滤有机层以提供呈橙色液体的标题中间体(39g)。 1H-NMR(CDCl3，300MHz)：δ(ppm)8.06(d，1H)，7.30(t，1H)，6.74(d，1H)，6.48(t，1H)， 3.73(七重峰，1H)，1.20(d，6H)。
b.N-(2-氨基苯基)-N-异丙基胺的制备
向在冰浴中冷却的乙醇(600mL)和2M氢氧化钠溶液(320mL)的混合物缓慢 添加锌粉(59.5g)。在搅拌锌浆体的同时，添加溶解于乙醇(50mL)中的N-异丙基-N-(2- 硝基苯基)胺(41g，0.228mol)。在0℃下搅拌混合物30min，接着加热到85℃。将混 合物在85℃下搅拌约12h直到混合物的回流溶液变成无色溶液。接着使混合物冷却到 0℃且过滤。用EtOAc(200mL)清洗收集的固体。合并滤液和清洗的溶液，且在真空中蒸 发以去除过量的挥发性溶剂。在浓缩期间，混合物变成淡棕色/黄色。用EtOAc(800mL) 萃取水性浓缩物。将有机溶液浓缩直到干燥，以提供呈粉棕色油的标题中间体(33g)， 其未经进一步处理即用于下一步骤中。1H-NMR(CDCl3，300MHz)：δ(ppm)6.73-6.5(m， 4H)，3.58-3.55(七重峰，1H)，1.2(d，6H)。
c.1-异丙基-1，3-二氢-2H-苯并咪唑-2-酮的制备
向四氢呋喃(500mL)中的步骤(b)的产物(N-(2-氨基苯基)-N-异丙基胺(34g，0.226 mol))的溶液中添加固体形式的羰基二咪唑(36.7g，0.226mol)。混合物在环境温度于 氮气的气氛下搅拌约24h。在真空中浓缩混合物，且所得的深褐色残余物在EtOAc(700 mL)和盐水溶液(300mL)之间分配。接着用1M磷酸多次(约3×300mL)洗涤有机 层直到有机层的颜色由茶褐色转变为浅黄色。蒸发有机溶液至干燥以提供静置时缓慢凝 固的呈浅黄色油的标题中间体(34g)。通过表明无可检测到的杂质的1H-NMR来评估 材料的纯度：1H-NMR(CD3OD，300MHz)：δ(ppm)7.2(m，1H)，7.0(m，3H)，4.6(七重峰， 1H)，1.46(d，6H)。(m/z)：[M+H]+C10H12N2O的计算值：177.09；实验值：177.2。
分析HPLC：保留时间＝2.7min(纯度为99％)：1)管柱：Zorbax，Bonus-RP，3.5μm 粒度，2.1×50mm；2)流速：0.5mL/min；3)等强度条件(10％溶剂B/90％溶剂A)， 历时0至0.5min；接着线性梯度至50％溶剂B/50％溶剂A(溶剂A＝98％水/2％ MeCN/0.1％TFA；溶剂B＝90％MeCN/10％水/0.1％TFA)，经5min。TLC分析(硅胶板)： Rf＝0.5(CH2Cl2)。液相色谱质谱分析法(LCMS)(m/z)：[M+H]+C10H12N2O的计算值： 177.09；实验值：177.3。
制备2
(1S，3R，5R)-3-氨基-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的制备
a.8-苯甲基-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-酮的制备
在搅拌下将浓盐酸(30mL)添加到水(170mL)中的2，5-二甲氧基四氢呋喃(82.2 g，0.622mol)的非匀质溶液。在冷却到0℃(冰浴)的单独烧瓶中，将浓盐酸(92mL) 缓慢添加到水(350mL)中的苯甲胺(100g，0.933mol)溶液。搅拌2，5-二甲氧基四氢 呋喃溶液大约20min，用水(250mL)稀释且接着添加苯甲胺溶液，随后添加水(400mL) 中的1，3-丙酮二甲酸(100g，0.684mol)溶液且接着添加水(200mL)中的磷酸氢二钠 (44g，0.31mol)。使用40％NaOH调节pH值为pH 1至pH约4.5。过夜搅拌所得溶液。 接着使用50％盐酸使溶液从pH 7.5酸化成pH 3，加热到85℃且搅拌2小时。溶液冷却 到室温，使用40％NaOH碱化到pH 12且用DCM(3×500mL)萃取。用盐水洗涤混合的 有机层，干燥、过滤且减压浓缩以产生呈粘性棕色油的粗制标题中间体(52g)。
在0℃向甲醇(1000mL)中的粗制中间体溶液添加二碳酸二叔丁酯(74.6g，0.342 mol)。使溶液变温暖到室温且过夜搅拌。在减压下去除甲醇且使所得的油溶解于二氯甲 烷(1000mL)中。中间体于1M H3PO4(1000mL)内萃取且用二氯甲烷(3×250mL) 洗涤。使用NaOH水溶液将水层碱化为pH 12，且用二氯甲烷(3×500mL)萃取。混合 的有机层经干燥、过滤且减压浓缩以提供呈粘性、浅棕色油的标题中间体。1H-NMR (CDCl3)δ(ppm)7.5-7.2(m，5H，C6H5)，3.7(s，2H，CH2Ph)，3.45(宽峰s，2H，CH-NBn)， 2.7-2.6(dd，2H，CH2CO)，2.2-2.1(dd，2H，CH2CO)，2.1-2.0(m，2H，CH2CH2)，1.6(m，2H， CH2CH2)。(m/z)：[M+H]+C14H17NO的计算值：216.14；实验值：216.0。
b.3-氧代-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的制备
向EtOAc(300mL)中的8-苯甲基-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-酮(75g，0.348mol)溶液添 加EtOAc(300mL)中的二碳酸二叔丁酯(83.6g，0.383mol，1.1当量)溶液。在氮气流 下将所得溶液和清洗液(100mL EtOAc)添加到含有23g氢氧化钯(20重量％碳载钯， 干基，水湿约50％；例如，Pearlman催化剂)的1L帕氏(Parr)氢化容器中。使反应 容器脱气(使真空和N2交替五次)且加压到60psi的H2气。反应溶液搅拌两天且如需 要则再充入H2以保持H2压力在60psi直到如由二氧化硅薄层色谱法监控反应完全。接 着通过的衬垫过滤且减压浓缩黑色溶液以提供呈粘性、黄色至橙色的油的标题中 间体。其未经进一步处理即用于下一步骤中。1H NMR(CDCl3)δ(ppm)4.5(宽峰，2H， CH-NBoc)，2.7(宽峰，2H，CH2CO)，2.4-2.3(dd，2H，CH2CH2)，2.1(宽峰m，2H，CH2CO)， 1.7-1.6(dd，2H，CH2CH2)，1.5(s，9H，(CH3)3COCON))。
c.(1S，3R，5R)-3-氨基-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的制备
在经由机械搅拌器搅拌下，在N2流下向甲醇(1L)中的先前步骤的产物(75.4g， 0.335mol)的溶液添加甲酸铵(422.5g，6.7mol)、水(115mL)和65g碳载钯(10％ 在干基上，水湿约50％；Degussa型E101NE/W)。在24和48小时后，每次添加甲酸铵 (132g，2.1mol)的其他部分。一旦反应进程终止(如由分析HPLC所监测)，则添加 (＞500g)且过滤所得的稠密悬浮液，且接着用甲醇(约500mL)清洗所收集的固 体。合并滤液且减压浓缩。接着用1M磷酸稀释所得混浊、两相溶液成pH 2的约1.5至 2.0L的最终体积且用二氯甲烷(3×700mL)洗涤。使用40％水性NaOH将水层碱化为 pH 12，且用二氯甲烷(3×700mL)萃取。混合有机层经干燥、过滤且由旋转蒸发浓缩， 接着高真空以提供呈白色至浅黄色固体的标题中间体(52g)(通常为N-Boc-内-3-氨基 莨菪烷)。基于1H-NMR分析，产物的内胺与外胺的异构体比率为＞99∶1(分析HPLC纯 度＞96％)。1H NMR(CDCl3)δ(ppm)4.2-4.0(宽峰d，2H，CHNBoc)，3.25(t，1H，CHNH2)， 2.1-2.05(m，4H)，1.9(m，2H)，1.4(s，9H，(CH3)3OCON)，1.2-1.1(宽峰，2H)。(m/z)：[M+H]+ C12H22N2O2的计算值：227.18；实验值：227.2。分析HPLC(等强度方法；2∶98(A∶B)至90∶10 (A∶B)经5min)：保留时间＝3.68min。
实例1
4-(四氢呋喃-2-羰基)哌嗪-1-甲酸3-{(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯并咪 唑-1-羰基)氨基]-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-8-基}丙酯的合成
a.(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯并咪唑-1-羰基)氨基]-8-氮杂双环[3.2.1] 辛烷-8-甲酸叔丁酯的制备
在氮气氛下向在冰浴中的无水THF(1000L)中的氢化钠(9.25g；231.4mmol；60％ 分散在矿物油中)的冷悬浮液添加THF(50mL)中的制备1的产物，1-异丙基-1，3-二氢-2H- 苯并咪唑-2-酮(27.2g，154.2mmol)。混合物在约0-5℃下搅拌30min，接着添加THF(50 mL)中的氯甲酸4-硝基苯酯(34.2g，170mmol)。在使混合物逐渐变温暖到环境温度同 时搅拌混合物过夜。接着向形成的活化酯添加THF(50mL)中的(1S，3R，5R)-3-氨基 -8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(36.7g，162mmol)。混合物在环境温度下搅拌约 12h且在约75℃下搅拌约3h，此时反应样品的LCMS指示偶合反应完成。混合物在真 空中浓缩，溶解于二氯甲烷(1L)中且首先用1M H3PO4和接着用饱和NaHCO3溶液洗 涤。干燥后，蒸发有机溶液以提供呈淡黄色残余物的标题中间体，其未经进一步处理即 用于下一步骤中。
b.三氟乙酸盐形式的N-[(1S，3R，5R)-3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯并咪唑-1-甲酸(8- 氮杂双环[3.2.1]辛-3-基)酰胺的制备
向在冰浴中的二氯甲烷(200mL)中的(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢 苯并-咪唑-1-羰基)氨基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(先前步骤的产物)添加三 氟乙酸(200mL)。混合物在约5℃下搅拌30min，且在室温下搅拌约1h。在混合物的 蒸发后，将乙醚(约500mL)添加到含油残余物，以引起残余物的凝固。收集沉淀，用 大量乙醚清洗且在真空中干燥以提供呈TFA盐的标题中间体(47g)。所述标题中间体 通常也称作内-N-(8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基)-3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯并咪唑-1-羧酰 胺。
c.N-[(1S，3R，5R)-3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯并咪唑-1-甲酸(8-氮杂双环[3.2.1]辛-3- 基)酰胺(游离碱)的制备
向二氯甲烷(500mL)中的先前步骤的产物(15g，33.9mmol)的悬浮液添加水(500 mL)。将N，N-二异丙基乙胺(约20mL)添加到反应混合物以使得水层pH为8-9。分离 所述层，保留有机层。用二氯甲烷(100mL)第二次萃取水层。合并所得萃取液，且接 着用盐水洗涤。在经Na2SO4干燥和过滤、溶剂去除后产出呈游离碱的黄色粉末的标题 化合物(9.7g)。1H NMR(DMSO-d6)：1.48(d，6H)，1.40-2.00(m，8H)，3.53(m，2H)，4.07(m， 1H)，4.69(七重峰，1H)，7.21(m，2H)，7.45(d，1H)，8.08(d，1H)，9.31(d，1H)。(m/z)： [M+H]+C18H24N4O2的计算值：329.20；实验值：329.2。分析HPLC：(2-50％MeCN/H2O 经6min)保留时间＝3.67min。
d.3-氯丙基-4-(四氢呋喃-2-基-羰基)哌嗪-1-甲酸盐的制备
向二氯甲烷(5mL)中的1-(四氢呋喃-2-基-羰基)哌嗪(202mg，1.1mmol)的0℃ 溶液中添加氯甲酸3-氯丙基酯(133μL，1.1mmol)，随后添加N，N-二异丙基乙胺(192 μL，1.1mmol)。使反应经2h达室温，此时反应经蒸发产出呈小麦色油状的标题化合物， 其未经进一步提纯即使用。
e.4-(四氢呋喃-2-羰基)哌嗪-1-甲酸3-{(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯并 咪唑-1-羰基)氨基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-8-基}丙酯的合成
使3-氯丙基-4-(四氢呋喃-2-基-羰基)哌嗪-1-甲酸盐(335mg，1.1mmol)溶解于二 甲基甲酰胺(5.0mL)，且添加到步骤(c)的固体游离碱产物(118mg，0.36mmol)和 NaI(164mg，0.72mmol)中。添加N，N-二异丙基乙胺(64μL，0.36mmol)且在90℃ 下过夜搅拌混合物。去除挥发物且经由制备HPLC(反相)经50min的15-45％梯度、 流速20mL/min完成提纯以提供呈白色固体的TFA盐形式的标题化合物(45mg)。(m/z)： [M+H]+C31H44N6O6的计算值：597.33；实验值：597.1。分析HPLC：(5-65％MeCN/H2O 经4min)保留时间＝2.58。
实例2
4-(2-羟乙基)哌嗪-1-甲酸3-{(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯并咪唑-1-羰 基)氨基]-8-氮杂双环-[3.2.1]辛-8-基}丙酯的合成
除步骤(d)中用2-哌嗪-1-基乙醇代替1-(四氢呋喃-2-基羰基)哌嗪以外，使用实例 1中所述的方法制备呈TFA盐形式的标题化合物(13.8mg)。(m/z)：[M+H]+C28H42N6O5 的计算值：543.32；实验值：543.5。
实例3-12
除在步骤(d)中用适当试剂代替1-(四氢呋喃-2-基-羰基)哌嗪以外，使用实例1中 所述的方法制备下列实例3-12的化合物。
实例13
1，1-二氧代-1λ6-硫代吗啉-4-甲酸3-{(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯并咪 唑-1-羰基)氨基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-8-基}丙酯的替代性合成
a.(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯并咪唑-1-羰基)氨基]-8-氮杂双环[3.2.1] 辛烷-8-甲酸叔丁酯的制备
在氮气氛下向含有1-异丙基-1，3-二氢-2H-苯并咪唑-2-酮(17.6g，100mmol)和氯 甲酸4-硝基苯酯(20.2g，100mmol)的500mL反应烧瓶添加二氯甲烷(350ml)，且 接着缓慢添加三乙胺(30.5mL，220mmol)。搅拌溶液15min且接着添加(1S，3R，5R) -3-氨基-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(22.6g，100mmol)。使反应在室温下搅拌 过夜。用饱和碳酸氢钠水溶液(2×200mL)洗涤反应混合物。通过蒸馏去除二氯甲烷 且添加MTBE(350ml)。用1N磷酸(2×200mL)、饱和碳酸氢钠(200mL)和水(200 mL)洗涤MTBE溶液。有机层经无水硫酸钠(40g)干燥且过滤，且接着通过蒸馏去除 溶剂以产出呈浅棕色固体的标题中间体(35.7g，83％产量)。
b.N-[(1S，3R，5R)-3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯并咪唑-1-甲酸(8-氮杂双环[3.2.1]辛-3- 基)酰胺三氟乙酸盐的制备
在500ml烧瓶中，使(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯并咪唑-1-羰基)氨 基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(21.4g，50mmol)溶解于二氯甲烷(200ml) 中。添加三氟乙酸(37mL，500mmol)且使反应混合物在室温下搅拌3h。用水(2×100 mL)洗涤反应混合物。通过蒸馏去除有机层中的溶剂且通过添加MTBE(200mL)湿 磨粗制产物残余物。在室温下搅拌1h后，固体经过滤分离，用MTBE(2×25mL)洗 涤且在真空下干燥以提供标题中间体(21.0g，97％产量)。
c.1，1-二氢代-1λ 6 -硫代吗啉-4-甲酸3-氯丙酯的制备
在500ml烧瓶中，使二氧化硫代吗啉(13.5g，100mmol)在室温下溶解于二氯甲 烷(150mL)中且添加N，N-二异丙基乙胺(19.2mL，110mmol)。在室温下搅拌10min 后，在冰浴中将反应混合物冷却到大约5℃。经由加料漏斗以维持反应温度低于10℃的 速率向反应混合物添加1-氯-3-氯甲氧基丙烷(11.8mL，100mmol)。当添加完全时，使 反应混合物变温暖到室温。用水(2×100mL)洗涤反应混合物，且经无水硫酸钠(25g) 干燥有机相。在过滤后，通过蒸馏去除溶剂以产出静置时凝固的呈油状固体的标题化合 物(24.0g，94％产量)。
e.1，1-二氧代-1λ 6 -硫代吗啉-4-甲酸3-{(1S，3R，5R)-3-[(3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯并 咪唑-1-羰基)氨基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-8-基}丙酯的合成
向二氯甲烷(100ml)中的N-[(1S，3R，5R)-3-异丙基-2-氧代-2，3-二氢苯并咪唑-1-甲 酸(8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基)酰胺三氟乙酸盐(8.8g，20mmol)的溶液添加水(100ml)。 调节水层的pH值到约12以提供盐的游离碱。分离有机层，经硫酸钠干燥且通过蒸馏去 除溶剂。使游离碱溶解于N-甲基-2-吡咯烷酮(100mL)中且将溶液转移到含有1，1-二 氧代-1λ6-硫代吗啉-4-甲酸3-氯丙酯(7.2g，28mmol)和NaI(3.0g，20mmol)的250ml 烧瓶。添加N，N-二异丙基乙胺(4.2mL，24mmol)且将反应混合物加热到50℃历时18h。 通过蒸馏去除溶剂。使粗制产物残余物溶解于EtOAc(200mL)中，用水(2×50mL) 洗涤且经硫酸钠(10g)干燥。通过蒸馏去除溶剂以获得粗制产物残余物(约12g)。
粗制产物残余物经2″管柱上的制备HPLC提纯；填料：碱钝化的硅胶(BDS)，流 速：200mL/min；洗脱剂A：水中的0.1％TFA；洗脱剂B：水中的90％乙腈/10％0.1％TFA； 梯度(时间，％B)：(0，5)；(25，30)；(35，80)；(45，80)；(50，5)；(60，5)。产物通过纯洗脱分 的冻干而分离以提供标题化合物(3.4g，26％产量)。1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)：9.35(d， 1H)，8.07(d，1H)，7.46(d，1H)，7.22(t，1H)，7.16(t，1H)，4.69(七重峰，1H)，4.20-4.00(m， 3H)，4.12(t，2H)，3.90-3.70(m，4H)，3.70(t，2H)，3.25-3.05(m，4H)，2.5-2.0(m，8H)，2.15 (dt，2H)，1.49(d，6H)。(m/z)：[M+H]+C26H37N5O6S的计算值：548.2；实验值：548.4。
分析1：对于5-HT4(c)人类受体的放射性配体结合分析
a.膜制备5-HT 4(c)
使经人类5-HT4(c)受体cDNA(Bmax＝约6.0pmol/mg蛋白质，如使用[3H]-GR113808 膜放射性配体结合分析所确定)稳定转染的HEK-293(人类胚胎肾脏)细胞生长于含有 4,500mg/L D-葡萄糖和盐酸吡哆醇(GIBCO-Invitrogen Corp.，Carlsbad CA：目录号 11965)的达尔伯克(Dulbecco′s)改良伊格尔(Eagles)培养基(DMEM)中的T-225 烧瓶中，其中在37℃下、5％CO2、湿润恒温箱中补充10％胎牛血清(FBS) (GIBCO-Invitrogen Corp.：目录号10437)、2mM L-谷胺酰胺和(100单位)盘尼西林-(100 μg)链霉素/ml(GIBCO-Invitrogen Corp.：目录号15140)。细胞在连续选择压力下通过向 培养基添加800μg/mL遗传霉素(GIBCO-Invitrogen Corp.：目录号10131)来生长。
细胞可培养成大约60-80％融合(＜35继代培养)。在收集之前的20-22小时，用无 血清DMEM两次洗涤细胞且喂养。膜制备的所有步骤均在冰上进行。通过平缓的机械 搅拌和25mL吸量管的研磨提升细胞单层。通过1000rpm的离心(5min)收集细胞。
对于膜制备来说，细胞小球在冰冷的pH 7.4的50mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸 (HEPES)(膜制备缓冲液)(来自30-40个T225烧瓶的40mL/总细胞产量)中再悬浮， 且在冰上使用均匀化破碎仪(设置为19,2×10s)均匀化。生成的匀浆以1200g在4℃ 离心5min。弃去小球且在40,000g(20min)下离心上清液。通过膜制备缓冲液的再悬浮 和在40,000g(20min)下离心洗涤小球一次。最终小球在pH 7.4的50mM HEPES(分析 缓冲液)(1当量T225烧瓶/1mL)中再悬浮。膜悬浮液的蛋白质浓度由布莱德福 (Bradford)方法(Bradford，1976)测定。在-80℃将膜等分冷冻存储。
b.放射性配体结合分析
放射性配体结合分析以pH 7.4的50mM HEPES(含有0.025％的牛血清蛋白(BSA)) 中含有2μg膜蛋白质的400μL总分析体积在1.1mL 96深孔聚丙烯分析板(Axygen) 中进行。使用[3H]-GR113808(Amersham Inc.，Bucks，UK：目录号TRK944；特异性活性为 约82Ci/mmol)以在0.001nM-5.0nM范围内的8-12种不同浓度进行用于测定放射性配 体的Kd值的饱和结合研究。用[3H]-GR113808以0.15nM和在10nM-100μM范围内的 化合物的11种不同浓度进行用于确定化合物的pKi值的置换分析。
测试化合物以DMSO中的10mM储备溶液形式接收且在25℃于pH 7.4的50mM HEPES(含有0.1％BSA)内稀释到400μM，且接着在相同缓冲液中完成连续(1∶5)稀 释。在1μM未标记的GR113808存在下测定非特异性结合。将分析物在室温下培养60 min，且接着通过经0.3％聚乙烯亚胺中预浸泡的96孔GF/B玻璃纤维滤板(Packard BioScience Co.，Meriden，CT)的快速过滤来终止结合反应。滤板用过滤缓冲液(冰冷的 pH7.4的50mM HEPES)洗涤三次以去除未结合的放射性活性。板经干燥，向每一孔添 加35μL Microscint-20液体闪烁流体(Packard BioScience Co.，Meriden，CT)且所述板以 Packard Topcount液体闪烁计数器(Packard BioScience Co.，Meriden，CT)来计数。
使用用于单-位点竞争的3参数模型通过GraphPad Prism软件包(GraphPad Software， Inc.，San Diego，CA)的非线性回归分析来分析结合数据。如在1μM GR113808存在下 所确定，BOTTOM(曲线最小值)固定为非特异性结合的值。用Prism由最佳拟合IC50 值计算测试化合物的Ki值，且使用Cheng-Prusoff方程式(Cheng和Prusoff，生化药理 学(Biochemical Pharmacology)，1973，22，3099-108)：Ki＝IC50/(1+[L]/Kd)(其中[L]＝ 浓度[3H]-GR113808)来计算放射性配体的Kd值。结果以Ki值的负的以十为底的对数 (pKi)表示。
在这个分析中具有较高pKi值的测试化合物具有对于5-HT4受体的较高结合亲和力。 在这个分析中测试的本发明的化合物具有在约7.0至约9.0范围内的pKi值，通常在约 7.5至约8.5范围内。举例来说，在这个分析中实例1的化合物展现7.9的pKi值。
分析2：对于5-HT3A人类受体的放射性结合分析：受体亚型选择性的确定
a.膜制备5-HT 3A
从Dr.Michael Bruess(University of Bonn，GDR)(Bmax＝约9.0pmol/mg蛋白质，如使 用[3H]-GR65630膜放射性配体结合分析所确定)获得经人类5-HT3A受体cDNA稳定转染 的HEK-293(人类胚胎肾脏)细胞。细胞于50％达尔伯克改良伊格尔培养基 (DMEM)(GIBCO-Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA：目录号11965)和50％Ham′s F12(GIBCO-Invitrogen Corp.：目录号11765)中在T-225烧瓶或细胞工厂中生长，其中在 37℃下5％CO2、湿润恒温箱中补充10％热非活化胎牛血清(FBS)(Hyclone，Logan，UT： 目录号SH30070.03)和(50单位)盘尼西林-(50g)链霉素/ml(GIBCO-Invitrogen Corp.：目 录号15140)。
细胞生长到大约70-80％融合(＜35继代培养)。膜制备的所有步骤均在冰上进行。 为收集细胞，抽出培养基且用不含Ca2+、Mg2+的达尔伯克磷酸盐缓冲生理盐水(dPBS) 清洗。通过缓慢机械搅拌提升细胞单层。通过以1000rpm(5min)的离心收集细胞。 膜制备的后续步骤遵循用于表示5-HT4(c)受体的膜的上述方案。
b.放射性配体结合分析
在96孔聚丙烯分析板中以pH 7.4的50mM HEPES(含有0.025％BSA分析缓冲液) 中含有1.5-2μg膜蛋白质的200μL总分析体积进行放射性配体结合分析。使用 [3H]-GR65630(PerkinElmer Life Sciences Inc.，Boston，MA：目录号NET1011，特异性活 性为约85Ci/mmol)以0.005nM至20nM范围内的12种不同浓度来进行用于测定放射 性配体的Kd值的饱和结合研究。使用[3H]-GR65630以10pM至100μM范围内的化合 物的11种不同浓度来进行用于测定化合物的pKi值的置换分析。化合物以DMSO中的 10mM储备溶液形式接收(见3.1部分)，在25℃下于pH 7.4的50mM HEPES(含有 0.1％BSA)内稀释到400μM，且接着在相同缓冲液中完成连续(1∶5)稀释。在10μM 未标记MDL72222存在下测定非特异性结合。将分析物在室温下培养60min，接着通过 经0.3％聚乙烯亚胺中预浸泡的96孔GF/B玻璃纤维滤板(Packard BioScience Co.， Meriden，CT)快速过滤来终止结合反应。用过滤缓冲液(冰冷的pH7.4的50mM HEPES) 清洗滤板三次以去除非结合放射活性。板经干燥，向每一孔添加35μL Microscint-20液 体闪烁流体(Packard BioScience Co.，Meriden，CT)且以Packard Topcount液体闪烁计数 器(Packard BioScience Co.，Meriden，CT)来计数。
使用上述非线性回归程序来分析结合数据以测定Ki值。使BOTTOM(曲线最小值) 固定为非特异性结合的值，如在10μM MDL72222存在下所确定。Cheng-Prusoff方程式 中量[L]定义为浓度[3H]-GR65630。
关于5-HT3受体亚型的5-HT4受体亚型的选择性以比率Ki(5-HT3A)/Ki(5-HT4(c))来计 算。在这个分析中测试的本发明的化合物具有在约10至约950范围内(通常在约50至 约500范围内)的5-HT4/5-HT3受体亚型选择性。举例来说，实例1展现160的亚型选 择性。
分析3：利用表现人类5-HT4(c)受体的HEK-293细胞的全细胞cAMP积累闪烁板分 析
在这个分析中，通过测量表现5-HT4受体的HEK-293细胞与不同浓度的测试化合物 接触时所产生的环AMP的量来确定测试化合物的功能效能。
a.细胞培养物
将经克隆人类5-HT4(c)受体cDNA稳定转染的表现受体的HEK-293(人类胚胎肾脏) 细胞以两种不同密度来制备：(1)如使用[3H]-GR113808膜放射配体结合分析所确定， 以约0.5-0.6pmol/mg蛋白质的密度，和(2)以约6.0pmol/mg蛋白质的密度。细胞生长 于含有4,500mg/L D-葡萄糖(GIBCO-Invitrogen Corp.：目录号11965)的达尔伯克改良 伊格尔培养基(DMEM)(GIBCO-Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA：目录号11965)中的 T-225烧瓶中，其中在37℃下5％CO2、湿润恒温箱中补充10％胎牛血清(FBS) (GIBCO-Invitrogen Corp.：目录号10437)和(100单位)盘尼西林-(100μg)链霉素 /ml(GIBCO-Invitrogen Corp.：目录号15140)。细胞在连续选择压力下通过向培养基添加遗 传霉素(800μg/mL：GIBCO-Invitrogen Corp.：目录号10131)来生长。
b.细胞制备
细胞生长到大约60-80％融合。在分析之前的20至22小时，用含有4,500mg/L D- 葡萄糖(GIBCO-Invitrogen Corp.：目录号11965)的不含血清DMEM洗涤细胞两次且喂 养。为收集细胞，抽出培养基且向每一T-225烧瓶添加10mL Versene(GIBCO-Invitrogen Corp.：目录号15040)。细胞在RT培养5min且接着通过机械搅拌从烧瓶移去。将细胞 悬浮液转移到含有等体积的预温(37℃)dPBS的离心管，且以1000rpm离心5min。 弃去上清液且使小球在预温(37℃)荧光放射增强缓冲液(每2-3个T-225烧瓶10mL 当量)中预悬浮。记录这个时间且标记为时间零点。用Coulter计数器来计数细胞(8μm 以上计数，烧瓶产量为1-2×107细胞/烧瓶)。细胞在预温(37℃)荧光放射增强缓冲液 中(如闪烁板试剂盒中所提供)以5×105细胞/ml的浓度预悬浮且在37℃预培养10min。
根据制造厂家的说明，以放射性免疫分析格式使用具有125I-cAMP(SMP004B， PerkinElmer Life Sciences Inc.，Boston，MA)的闪烁板腺苷酸环化酶活化分析系统来进行 cAMP分析。
细胞如上所述生长且制备。在分析中最终细胞浓度为25×103细胞/孔且最终分析体 积为100μL。测试化合物以DMSO中的10mM储备溶液接收，在25℃pH 7.4的50mM HEPES(含有0.1％BSA)内稀释到400μM且接着在相同缓冲液中完成连续(1∶5)稀 释。用在10pM至100μM(最终分析浓度)范围内的化合物的不同浓度进行环AMP积 累分析。在每一板上包括5-HT浓度反应曲线(10pM至100μM)。在37℃下震荡15min 来培养细胞，且通过向每一孔添加100μl冰冷的检测缓冲液(如在闪烁板试剂盒中所提 供)来终止反应。密封所述板且在4℃培养过夜。通过使用Topcount(Packard BioScience Co.，Meriden，CT)的亲近闪烁光谱法量化结合放射性。
根据制造厂家的使用者手册中所提供的说明，将每mL反应所产生的cAMP量从 cAMP标准曲线外推。使用3-参数S型剂量-反应模式(使斜率限制为统一)通过具有 GraphPad Prism软件包的非线性回归分析来分析数据。效能数据报道为pEC50值(EC50 值的负的以十为底的对数)，其中EC50为对于50％最大反应来说的有效浓度。
在这个分析中展现较高pEC50值的测试化合物具有促进5-HT4受体的较高效能。在 这个分析中使用具有约0.5-0.6pmol/mg蛋白质密度的细胞系(1)测试的本发明化合物 具有在约7.5至约9.0范围内的pEC50值，通常在约8.0至约9.0的范围内。举例来说， 实例1的化合物具有8.4的pEC50值。
分析4：表现hERG心脏钾离子通道的全细胞中的抑制钾离子流的活体外电压钳分 析
经hERG cDNA稳定转染的CHO-K1细胞由University of Wisconsin的Gail Robertson 获得。细胞保持在低温存储器中直到需要。细胞在用10％胎牛血清和200μg/mL遗传霉 素补充的达尔伯克改良伊格尔培养基/F12中扩展且继代。细胞在涂布聚-D-赖氨酸(100 μg/mL)的玻璃盖片上、在35mm2皿(含有2ml培养基)中以能够使分离的细胞经选 择用于全细胞电压钳研究的密度接种。所述皿在37℃下于湿润、5％CO2环境中维持。
细胞外溶液至少每7天制备且不用时则在4℃下存储。细胞外溶液含有(mM)： NaCl(137)、KCl(4)、CaCl2(1.8)、MgCl2(1)、葡萄糖(10)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸 (HEPES)(10)(经NaOH调pH为7.4)。在测试化合物不存在或存在下，细胞外溶液包含在 储集器中，其由储集器以大约0.5mL/min流入记录槽内。制备、等分且在-20℃存储细 胞内溶液直到使用日。细胞内溶液含有(mM)：KCl(130)、MgCl2(1)、乙二醇-双(β-氨基 乙基醚)N，N，N′，N′-四乙酸盐(EGTA)(5)、MgATP(5)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸 (HEPES)(10)(经KOH调节pH值为7.2)。所有试验均在室温(20-22℃)下进行。
将细胞在其上接种的盖片转移到记录槽且连续灌注。在细胞与贴片电极之间形成千 兆欧姆密封部分。一旦获得稳定贴片，则记录以电压钳模式开始，其中最初的保持电位 在-80mV。在达到稳定全细胞电流之后，细胞暴露于测试化合物。标准电压方法为：从 -80mV到+20mV的保持电位的步骤历时4.8sec，复极化至-50mV历时5sec且接着回 到原始保持电位(-80mV)。这个电压方案每15sec(0.067Hz)运行一次。在复极化阶段 期间使用pClamp软件来确定峰值电流振幅。以3μM浓度的测试化合物经细胞灌注5 分钟，随后在不存在化合物下冲洗5分钟。最终向灌注液添加阳性对照(西沙必利 (cisapride)，20nM)以测试细胞的功能。从-80mV到+20mV的步骤激活hERG通道， 导致外向电流。回到-50mV的步骤导致外向尾电流，同时通道由失活和钝化而恢复。
使用pCLAMP软件来确定在复极化阶段期间的峰值电流振幅。将对照和测试物品 数据输出到(OriginLab Corp.，Northampton MA)，其中个别电流振幅在不存在化 合物时正规化为最初电流振幅。计算经正规化的电流均值和每一条件的标准误差且与试 验的时程相比较而绘图。
在暴露于测试物品或媒剂对照(通常为0.3％DMSO)5分钟后，在观测到的K+电 流抑制作用之间作出比较。使用两个群体的独立t检验(Microcal Origin v.6.0)进行试 验组之间的统计比较。差异在p＜0.05时考虑为显著的。
在这个分析中钾离子流的抑制百分率越小，则当用作治疗剂时测试化合物改变心脏 复极化模式的潜力越小。在这个分析中以3μM浓度测试的本发明的化合物通常展现小 于约40％的钾离子流抑制，更通常为小于约25％。举例来说，实例1的化合物在这个分 析中展现约9％的抑制。
分析5：口服生物可用性的活体外模式：Caco-2渗透分析
进行Caco-2渗透分析以示范测试化合物在口服投药后通过肠且进入血流的能力。 测定溶解状态的测试化合物渗透经设计以模拟人类小肠单层的紧密接合的细胞单层的 速率。Caco-2(结肠、腺癌；人类)细胞由ATCC(美国典型微生物菌种保藏中心(American Type Culture Collection)；Rockville，MD)获得。为进行渗透研究，将细胞在预润湿的 transwells聚碳酸酯过滤器(Costar；Cambridge，MA)上以63,000个细胞/cm2的密度接种。 细胞单层在21天后形成于培养物中。细胞在transwell板中培养后，含有细胞单层的膜 从transwell板分离且插入扩散盒(Costar；Cambridge，MA)内。将扩散盒插入加热块中， 所述加热块装备有外部循环、恒温调节37℃的水以用于温度控制。气体歧管将95％ O2/5％CO2传递至每半个扩散盒且产生跨越细胞单层的层流模式，所述模式有效减少未 被搅拌的边界层。
用以100μM的测试化合物浓度和14C-甘露糖醇进行渗透研究以监测单层的完整性。 所有试验均在37℃进行60min。样品从扩散盒的供体和接受者两端在0、30和60min 取得。通过HPLC或液体闪烁计数测试化合物和甘露糖醇浓度分析样品。计算以cm/sec 计之渗透系数(Kp)。
在这个分析中，大于约10×10-6cm/sec的Kp值被认为表现出有利的生物可用性。 在这个分析中测试的本发明的化合物通常展现介于约20×10-6cm/sec与约60×10-6 cm/sec之间的Kp值，更通常介于约30×10-6cm/sec与约60×10-6cm/sec之间。举例来 说，实例1的化合物展现约60×10-6cm/sec的Kp值。
分析6：大鼠的药物动力学研究
以介于约5与约6之间的pH值在0.1％乳酸中制备测试化合物的水溶液调配物。通 过以2.5mg/kg剂量静脉内投药(IV)或通过以5mg/kg剂量口服管饲(PO)给雄性 Sprague-Dawley大鼠(CD系，查尔斯河室验室(Charles River Laboratories)，Wilmington， MA)服用测试化合物。对于IV投药的给药量为1mL/kg且对PO投药的给药量为2 mL/kg。从给药前的动物和给药后2(仅IV)、5、15和30min和1、2、4、8和24小时 的动物收集连续血液样品。通过具有1ng/mL的量下限的液相色谱-质谱法分析 (LC-MS/MS)(MDS SCIEX，API 4000，Applied Biosystems，Foster City，CA)来确定血浆中 测试化合物的浓度。
使用WinNonlin(第4.0.1版，Pharsight，Mountain View，CA)的非隔室分析(对于IV 为Model 201和对于PO为Model 200)来评估标准药物动力学参数。在血浆中的测试化 合物浓度相对时间曲线中的最大值表示为Cmax。通过线性梯形法则来计算在从给药时间 到最后可测量浓度(AUC(0-t))的浓度相对时间曲线下的面积。口服生物可用性(F(％)) (也就是，PO投药的AUC(0-t)相对于IV投药的AUC(0-t)的剂量正规化比率)可如下计 算：
F(％)＝AUCPO/AUCIV×剂量IV/剂量PO×100％
在这个分析中展现参数Cmax、AUC(0-t)和F(％)较大值的测试化合物当口服投药时预 期具有更大生物可用性。在这个分析中测试的本发明化合物具有介于约0.15与约0.35 μg/mL之间的Cmax值和介于0.5与约1.1μg·hr/mL之间的AUC(0-t)值。具体来说，实例 1的化合物具有以下值：0.32μg/mL的Cmax、0.97μg·hr/mL的AUC(0-t)和55％的口服生 物可用性F(％)。
虽然本发明已参考其特定实施例描述，但所属领域的技术人员应了解不悖离本发明 的真实精神和范畴可做出多种改变且可取代等效物。另外，可做出多种修改以使得特殊 情况、材料、物质的组合、方法、方法步骤或步骤适应本发明的目的、精神和范畴。所 有所述修改均意欲在此所附的权利要求书的范畴内。此外，所有在本文所引用的公开案、 专利和专利文件均以全文引用的方式并入，如同个别引用一般并入。
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