长效胰岛素和促胰岛素肽的液体制剂
阅读：504发布：2020-05-13
专利汇可以提供长效胰岛素和促胰岛素肽的液体制剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及长效胰岛素和促胰岛素肽组合的液体制剂，其包括作为生理活性肽的胰岛素、促胰岛素肽和无 白蛋白 稳定剂，其中稳定剂包括缓冲剂、糖醇、非离子 表面活性剂 和等渗剂；和制备该液体制剂的方法。本发明的液体制剂不包含人血清白蛋白和对 机体 的潜在毒性因子，因此其在高浓度下对于胰岛素缀合物和促胰岛素肽缀合物具有优异的储存 稳定性 ，而没有病毒污染的 风 险。，下面是长效胰岛素和促胰岛素肽的液体制剂专利的具体信息内容。
1.长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合物的组合的液体制剂，其包括药学有效量的所述长效胰岛素缀合物；药学有效量的所述长效促胰岛素肽缀合物；和无白蛋白稳定剂，其中所述稳定剂包括缓冲剂、糖醇、非离子表面活性剂和等渗剂；
其中所述长效胰岛素缀合物是胰岛素连接至免疫球蛋白Fc区的形式；
其中所述长效促胰岛素肽缀合物是促胰岛素肽连接至免疫球蛋白Fc区的形式；并且其中所述缓冲剂的pH在5.0至7.0范围内。
2.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述胰岛素具有与天然胰岛素相同的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述胰岛素是通过天然胰岛素的氨基酸的氨基酸置换、缺失或插入生成的胰岛素衍生物。
4.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述促胰岛素肽选自胰高血糖素样肽-1(GLP-
1)、GLP-2、毒蜥外泌肽-3、毒蜥外泌肽-4和其衍生物，
所述促胰岛素肽的所述衍生物是选自下列的一种：
脱氨基组氨酰基衍生物，其中所述促胰岛素肽的N-末端氨基或胺基被删除；
β-羟基咪唑并丙酰基衍生物，其中所述促胰岛素肽的氨基被羟基取代；
二甲基组氨酰基衍生物，其中所述促胰岛素肽的氨基被两个甲基修饰；
β-羧基咪唑并丙酰基衍生物，其中所述促胰岛素肽的N-末端氨基酸被羧基取代；和咪唑并乙酰基衍生物，其中所述促胰岛素肽的N-末端组氨酸残基的α-碳被删除。
5.根据权利要求4所述的液体制剂，其中所述促胰岛素肽的衍生物为咪唑乙酰基毒蜥外泌肽-4。
6.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述免疫球蛋白Fc区是来自IgG、IgA、IgD、IgE或IgM的Fc区。
7.根据权利要求6所述的液体制剂，其中所述免疫球蛋白Fc区是来自不同免疫球蛋白的结构域的杂合体，所述免疫球蛋白选自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM。
8.根据权利要求6所述的液体制剂，其中所述免疫球蛋白Fc区是由单链免疫球蛋白组成的二聚体或多聚体，所述单链免疫球蛋白由具有相同起源的结构域组成。
9.根据权利要求6所述的液体制剂，其中所述免疫球蛋白Fc区是IgG4Fc区。
10.根据权利要求9所述的液体制剂，其中所述免疫球蛋白Fc区是人无糖基化的IgG4Fc区。
11.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述缀合物通过使用非肽基聚合物或重组技术连接。
12.根据权利要求11所述的液体制剂，其中所述非肽基聚合物是聚乙二醇。
13.根据权利要求11所述的液体制剂，其中所述非肽基聚合物选自生物可降解聚合物，如聚丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、聚乳酸和聚乳酸-乙醇酸；脂质聚合物；壳多糖；透明质酸；及其组合。
14.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述药学有效量的长效胰岛素缀合物的浓度为10mg/ml至200mg/ml，并且所述长效促胰岛素肽缀合物的浓度为0.5mg/ml至150mg/ml。
15.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述糖醇是选自甘露醇和山梨糖醇的一种或多种。
16.根据权利要求15所述的液体制剂，其中所述糖醇的浓度基于制剂的总体积为1％(w/v)至15％(w/v)。
17.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述缓冲剂为柠檬酸盐缓冲剂、醋酸盐缓冲剂或磷酸盐缓冲剂。
18.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述缓冲剂的浓度基于制剂的总体积为5至
50mM。
19.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述缓冲剂的pH范围为从5.5到7.0。
20.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述等渗剂选自氯化钠、硫酸钠和柠檬酸钠。
21.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述等渗剂的浓度为0.5mg/ml至30mg/ml。
22.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述非离子表面活性剂为聚山梨醇酯或泊洛沙姆。
23.根据权利要求22所述的液体制剂，其中所述所述非离子表面活性剂的浓度为
0.001％(w/v)至0.05％(w/v)。
24.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述稳定剂进一步包括甲硫氨酸。
25.根据权利要求24所述的液体制剂，其中所述甲硫氨酸的浓度基于制剂的总体积为
0.005％(w/v)至0.1％(w/v)。
26.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述稳定剂进一步包括选自糖、多元醇和氨基酸的一种或多种物质。
27.根据权利要求1所述的液体制剂，其包括长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合物，其中所述胰岛素和促胰岛素肽通过聚乙二醇均连接至免疫球蛋白片段，以及无白蛋白稳定剂，其中所述稳定剂包括醋酸缓冲剂、甘露醇、聚山梨醇酯20和氯化钠。
28.根据权利要求1所述的液体制剂，进一步包括甲硫氨酸。
29.制备权利要求1所述的液体制剂的方法，其包括将长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合物与稳定剂混合，所述稳定剂包括缓冲剂、糖醇、非离子表面活性剂和等渗剂，其中所述长效胰岛素缀合物是其中胰岛素连接至免疫球蛋白Fc区的形式，并且其中所述长效促胰岛素肽缀合物是其中所述促胰岛素肽连接至所述免疫球蛋白Fc区的形式，并且
其中所述缓冲剂的pH在5.0至7.0的范围内。
30.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述促胰岛素肽选自脱氨基组氨酰基-毒蜥外泌肽-4；β-羟基咪唑丙酰基-毒蜥外泌肽-4；β-羧基咪唑并丙酰基-毒蜥外泌肽-4；二甲基-组氨酰基-毒蜥外泌肽-4；和咪唑并乙酰基-毒蜥外泌肽-4。
长效胰岛素和促胰岛素肽的液体制剂
技术领域
[0002] 本发明涉及长效胰岛素和促胰岛素肽组合的液体制剂，其包括作为生理活性 肽的胰岛素和促胰岛素肽以及无白蛋白稳定剂，其中稳定剂包括缓冲剂、糖醇、 非离子表面活性剂和等渗剂；和制备液体制剂的方法。
背景技术
[0003] 胰岛素是由胰腺β细胞分泌的肽，并且在控制机体中的血糖方面起关键作用。 如果分泌的胰岛素的量不足或者分泌的胰岛素在机体中无法正常起作用，则血糖 水平将升高，造成称为糖尿病的代谢性疾病。当机体中胰岛素分泌不正常或者在 机体中无法正常起作用时，血糖水平无规律的增加，并且这种类型的糖尿病被称 为II型糖尿病。当胰腺不产生足够的胰岛素以调节血糖的增加时导致I型糖尿病。 通常通过经口服施用主要由化学化合物组成的降血糖药剂来治疗II型糖尿病，并 且有时可将胰岛素施用给一些患者。另一方面，为了治疗I型糖尿病，施用胰岛素 是必要的。
[0004] 广泛使用的胰岛素治疗是在餐前和餐后注射胰岛素。目前，在用于胃肠道外 注射的制剂中胰岛素是可获得的，并且在原则上为皮下施用，并且根据治疗的持 续时间，施用方法是不同的。与口服药物相比，在降低血糖水平方面通过注射施 用胰岛素更加有效，并且在无法使用口服药物的情况下其可以被安全地使用。此 外，胰岛素的胃肠道外注射没有剂量的限制，然而，由于必须一天三次连续施用， 所以存在缺点，如由于长期施用胰岛素而导致对针的厌恶、施用方法的困难、低 血糖症状和体重增加症状。尤其是，体重增加提高了发展心血管疾病的风险并且 可能破坏机体对于血糖水平的调节功能。同时，已经有许多尝试在将药物施用到 机体中后，通过长时间维持血液中高的药物水平以使胰岛素肽药物的治疗作用最 大化。结果，长效胰岛素已经被开发、制造并且商业化。此类长效药物的例子包 括兰德仕(Lantus)(甘精胰岛素(insulin glargine)；Sanofi Aventis)和诺和平 (Levemir)(地特胰岛素(insulin detemir)；Novo Nordisk)。不像中效低精蛋白胰 岛素(NPH)，在睡眠状态期间长效药物具有较低的低血糖的风险。特别是，诺和 平减轻体重增加的症状。然而，涉及每天注射一次或两次的施用方法仍然留下缺 点。
[0005] 同时，作为促胰岛素肽类型的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是由回肠和大肠的 L-细胞分泌的肠降血糖素激素。GLP-1的主要作用是为了确立机体中葡萄糖依赖性 胰岛素分泌而增加胰岛素的分泌，从而防止低血糖。由于这种作用，GLP-1可以 用于治疗II型糖尿病。然而，由于GLP-1的血清半衰期短到小于2分钟，所以对 于开发为药物有很高的限制。因此，称为毒蜥外泌肽(exendin)-4的新GLP-1激动 剂已经被开发和制造。毒蜥外泌肽-4是在吉拉巨蜥(Glia monster lizard)的唾液腺 中产生的GLP-1激动剂。此外，毒蜥外泌肽-4对二肽基肽酶-4(DPP-IV)抵抗并 且比GLP-1具有更高的生理活性。因此，毒蜥外泌肽-4在机体内有2至4小时长 的半衰期，比GLP-1的半衰期更长(美国专利登记号5,424,286)。然而，仅通过 增加对DPPIV的抗性无法达到药物生理活性的充足持续时间。例如，目前可利用 的毒蜥外泌肽-4(艾塞那肽(exenatide))需要通过注射对患者施用一天两次，并 且其仍然具有引起呕吐和恶心的缺点。
[0006] 因此，为了解决上述问题，作为维持蛋白质药物的活性并同时改善其在机体 中的稳定性的方法，本发明人已经预先提出了长效蛋白缀合物的开发，其通过使 用作为连接体的非肽基聚合物将已知的生理活性多肽和免疫球蛋白Fc区经共价结 合而连接(韩国专利登记号10-0725315)。特别是，先前确定长效胰岛素缀合物和 长效毒蜥外泌肽-4缀合物中的每一个均在体内具有显著增加的耐久性(韩国专利 登记号10-1058290和公开号10-2011-0134210)。然而，如果为了维持稳定的血糖 水平而施用治疗有效量的胰岛素或者毒蜥外泌肽-4；则这可能引起体重增加或者呕 吐和恶心的症状。因此，存在着开发可以减少药物剂量和频率同时对糖尿病提供 优异疗效的治疗方法的巨大需求。
发明内容
[0007] 技术问题
[0008] 考虑到此背景，为了提供长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合物组合的稳 定液体制剂，其可以长时间储存两种缀合物的组合而没有病毒污染的风险，本发 明人已经通过使用稳定剂增强了两种缀合物的组合的稳定性，所述稳定剂包括缓 冲剂、糖醇、作为等渗剂的氯化钠和非离子表面活性剂，并且发展了成本节约和 稳定的液体制剂，从而完成本发明。
[0009] 解决问题的方案
[0010] 本发明的一个目的是提供长效胰岛素和促胰岛素肽组合的液体制剂，其包括作 为生理活性肽的胰岛素和促胰岛素肽以及无白蛋白稳定剂，其中稳定剂包括缓冲 剂、糖醇、非离子表面活性剂和等渗剂。
[0011] 本发明的另一个目的是提供制备液体制剂的方法。
[0012] 本发明的另一个目的是提供用于预防或者治疗糖尿病的药物组合物，其包括胰 岛素和促胰岛素肽。
[0013] 本发明的另一个目的是提供用于治疗糖尿病的方法，其包括对患有糖尿病的对 象施用组合物。
[0014] 发明的有利效果
[0015] 本发明的长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合物的组合显示了对于治疗 糖尿病的显著治疗效果。此外，本发明的长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀 合物组合的液体制剂包括稳定剂，所述稳定剂包括缓冲剂、糖醇、等渗剂和非离 子表面活性剂，但不包含人血清白蛋白和其它对身体的潜在毒性因子，因而没有 病毒污染的风险。另外，液体制剂提供了对于具有大分子量的长效胰岛素缀合物 和长效促胰岛素肽缀合物的良好储存稳定性，并且相对于天然形式增加了在体内 的耐久性，通过由胰岛素或者促胰岛素肽和免疫球蛋白Fc区组成。特别是，本发 明提供了用于长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合物组合的稳定液体制剂。 本发明的此类液体制剂是提供良好储存稳定性的简单制剂，因此相对于其它的稳 定剂或者冻干制剂其是更加成本节约的。另外，相比于其它胰岛素和促胰岛素肽 的常规制剂，本液体制剂可以长时间维持体内蛋白质活性，因此其可用作有效的 药物制剂。附图说明
[0016] 图1显示了对以表3中的组分制备的长效促胰岛素肽缀合物的制剂于40℃监 测1周的沉淀生成结果。
[0017] 图2显示了对长效胰岛素缀合物和促胰岛素肽缀合物的IE-HPLC分析结果， 所述长效胰岛素缀合物和促胰岛素肽缀合物以表4中组分制备并且于40℃储存4 周。
[0018] 图3显示了对长效胰岛素缀合物和促胰岛素肽缀合物的RP-HPLC分析结果， 所述长效胰岛素缀合物和促胰岛素肽缀合物以表4中组分制备并且于40℃储存4 周。
[0019] 图4显示了相比于单一制剂，对具有不同组分的组合制剂中的每一种的沉淀 生成的监测结果。
具体实施方式
[0020] 本发明的一个方面提供了长效胰岛素和促胰岛素肽组合的液体制剂，其包括 作为生理活性肽的胰岛素和促胰岛素肽以及无白蛋白稳定剂，其中稳定剂包括缓 冲剂、糖醇、非离子表面活性剂和等渗剂。本发明的液体制剂特征在于胰岛素和 促胰岛素肽被共同施用。
[0021] 胰岛素可以药学有效量的长效胰岛素缀合物的形式包含在液体制剂中，其中 胰岛素连接至免疫球蛋白Fc区。促胰岛素肽可以以药学有效量的长效胰岛素肽缀 合物的形式的包含在液体制剂中，其中促胰岛素肽连接至免疫球蛋白Fc区。
[0022] 本文所使用的“长效胰岛素缀合物”是指这样的缀合物，其中包括衍生物、 变体、前体和片段的生理活性胰岛素与免疫球蛋白Fc区连接，并且其可以是指与 天然胰岛素相比具有增加的体内生理活性持续时间的缀合物。本文所使用的长效 胰岛素缀合物是指通过非肽基连接体或者肽基连接体与免疫球蛋白Fc区连接的胰 岛素。本文所使用的“长效促胰岛素肽缀合物”是指这样的缀合物，其中包括衍 生物、变体、前体和片段的生理活性促胰岛素肽与免疫球蛋白Fc区连接，并且其 可以是指与天然促胰岛素肽相比具有增加的体内生理活性持续时间的缀合物。
[0023] 本文所使用的长效促胰岛素肽缀合物是指通过非肽基连接体或者肽连接体连 接至免疫球蛋白Fc区的促胰岛素肽。
[0024] 本文所使用的术语“长效”是指与天然肽的生理活性持续时间相比增加的持 续时间。术语“缀合物”是指肽的形式，其中胰岛素或者促胰岛素肽与免疫球蛋 白Fc区连接。
[0025] 本发明的长效胰岛素缀合物或促胰岛素肽缀合物与天然胰岛素或者天然促胰 岛素肽相比具有加强的耐久性作用。长效胰岛素缀合物或者促胰岛素肽缀合物的 类型包括通过对天然胰岛素或者天然促胰岛素肽中氨基酸的修饰、置换、添加或 者缺失而生成的胰岛素或者促胰岛素肽的形式；这样的缀合物，其中胰岛素或者 促胰岛素肽与生物可降解的聚合物(如PEG)连接；这样的缀合物，其中胰岛素 或者促胰岛素肽与具有高耐久性的蛋白质(如白蛋白或者免疫球蛋白)连接；这 样的缀合物，其中胰岛素或者促胰岛素肽与在体内与白蛋白具有结合亲和性的脂 肪酸连接；或者包含在生物可降解纳米颗粒中的胰岛素或者促胰岛素肽的形式， 但不限于此。
[0026] 本发明中使用的长效胰岛素或者促胰岛素肽缀合物通过将合成的胰岛素或者 促胰岛素肽与免疫球蛋白Fc区连接而制备。将两个连接的方法可由非肽基聚合物 将胰岛素或者促胰岛素肽与免疫球蛋白Fc区交联，或者通过产生融合蛋白，其中 胰岛素或者促胰岛素肽和免疫球蛋白Fc区通过基因重组连接。
[0027] 本发明使用的“胰岛素”是指由胰腺应答于机体中升高的血糖水平而分泌的 肽，以吸收肝脏、肌肉或者脂肪组织中的葡萄糖并将其转变为糖原，并且停止利 用脂肪作为能量来源，从而起控制血糖的作用。该肽包括天然胰岛素、基础胰岛 素和其激动剂、前体、衍生物、片段及变体。
[0028] 本发明使用的“天然胰岛素”是由胰腺分泌以促进葡萄糖吸收而抑制细胞中 脂肪分解的激素，从而起控制血糖水平的作用。胰岛素通过处理其不具有调节血 糖水平的功能的前体、胰岛素原而产生。胰岛素的氨基酸序列如下：
[0029] α链：
[0030] Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr- Cys-Asn(SEQ ID NO.1)
[0031] β链：
[0032] Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-C ys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr(SEQ ID NO.2)
[0033] 本发明使用的“基础胰岛素”是指调节每天中正常血糖水平变化的肽，并且 此类肽的例子包括诺和平(levemir)、兰德仕(lantus)和德谷(degludec)。本发 明使用的“胰岛素激动剂”是指连接至胰岛素内部受体的化合物，其显示出与胰岛素 相同的生物活性，而不论与胰岛素的结构差异如何。本发明使用的“胰岛素变体” 是指具有一个或者多个与天然胰岛素的不同的氨基酸序列的肽，其具有调节机体 中血糖水平的功能。胰岛素衍生物可通过对来自天然胰岛素的某些氨基酸的置换、 添加、缺失和修饰的其中一种或其组合而制备。本发明使用的“胰岛素衍生物” 是指与天然胰岛素具有至少80％氨基酸序列同源的肽，其可对在氨基酸残基上的 某些基团进行化学取代(如，α-甲基化、α-羟基化)、缺失(如，脱氨基)或者修 饰(如，N-甲基化)，并且具有调节机体中血糖水平的功能。本发明使用的“胰岛 素片段”是指在天然胰岛素的N-末端或者C-末端添加或缺失的一个或者多个氨基 酸的片段，其中可以添加非天然存在的氨基酸(如，D型氨基酸)。胰岛素片段具 有调节机体中血糖水平的功能。
[0034] 胰岛素的激动剂、衍生物、片段和变体的每种制备方法可以单独使用或者组 合使用。例如，本发明的范围包括具有与那些天然肽不同的一个或者多个氨基酸 序列并且具有脱氨基的N-末端氨基酸残基，同时具备调节机体中血糖水平的功能 的肽。
[0035] 本发明所使用的胰岛素可以通过重组技术生成或者通过固相合成方法而合 成。另外，本发明所使用的胰岛素可以与非肽基聚合物连接。此类非肽基聚合物 可以用作本发明中的连接体。通过将胰岛素与作为连接体的非肽基聚合物连接， 可以改进胰岛素的稳定性同时维持其活性。通过使用基因重组技术肽可以用作连 接体。
[0036] 本发明使用的“非肽基聚合物”是指由一个或者多个重复单元组成的生物相 容性聚合物，其中重复单元通过除肽键以外的任意共价键类型彼此连接。本发明 中，“非肽基聚合物”能够与“非肽基连接体”互换使用。
[0037] 可用于本发明的非肽基聚合物选自生物可降解聚合物，如聚乙二醇、聚丙二 醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、 聚乙烯基乙醚、聚乳酸(PLA)和聚乳酸-乙醇酸(PLGA)；脂质聚合物；甲壳素； 透明质酸及其组合。优选地，聚乙二醇用作非肽基聚合物。本发明的范围还包括 本领域熟知的衍生物和可以通过使用本领域中可利用的技术而易于制备的衍生 物。
[0038] 用于通过常规的框内融合方法而制备的融合蛋白的肽基连接体具有以下限 制：其在机体中容易被蛋白酶切割，因此不能像使用载体时那样充分增加活性药 物的血清半衰期。然而，本发明中，通过使用对蛋白酶有抗性的聚合物，肽的血 清半衰期可以维持在与使用载体时相似的水平。因此，本发明中所使用的非肽基 聚合物包括任意类型的非肽基聚合物，只要其具有上述功能，即对蛋白酶有抗性。 非肽基聚合物具有1至100kDa的分子量为，并且优选1至20kDa。另外，本发 明的连接至免疫球蛋白Fc区的非肽基聚合物可以是单一类型的聚合物或者不同类 型的聚合物的组合。
[0039] 本发明中所使用的非肽基聚合物可具有能够连接至免疫球蛋白Fc区和蛋白质 药物的官能团。在两端的非肽基聚合物的官能团优选选自反应性醛基、丙醛基、 丁醛基，马来酰亚胺基和琥珀酰亚胺衍生物。琥珀酰亚胺衍生物可以是琥珀酰亚 胺基丙酸酯、羟基琥珀酰亚胺基、琥珀酰亚胺基羧甲基或者琥珀酰亚胺基碳酸酯。 特别是，当非肽基聚合物在两端都具有反应性醛基时，则这可以使非特异性结合 减到最小并且可以使非肽基聚合物在各端与生理活性多肽和免疫球蛋白有效连 接。通过形成醛键的还原性烷基化而生产的最终产物比通过酰胺键连接的要稳定 的多。醛官能团在低pH下选择性地连接至N-末端，并且在高pH下(如在pH为 9.0下)与赖氨酸残基形成共价键。
[0040] 非肽基聚合物在两端上的官能团可以是相同或不同的。例如，非肽基聚合物 可以在一端具有马来酰亚胺基团，并且在另一个端具有醛基、丙醛基或者丁醛基。 当在两端上都具有羟基的聚乙二醇用作非肽基聚合物时，可以通过已知的化学反 应将羟基活化为多种官能团，或者可以使用具有修饰的官能团的可商业购买的聚 乙二醇，以制备本发明的长效胰岛素缀合物。
[0041] 优选地，非肽基聚合物可以连接至胰岛素的β链的N-末端。
[0042] 本发明的胰岛素可以用非肽基聚合物进行修饰。
[0043] 当通过使用免疫球蛋白片段开发长效胰岛素缀合物时，如果为了增加药物的 耐久性而不引起低血糖用PEG修饰生理活性多肽，这可能降低效价。然而，效价 的降低成为了长效胰岛素缀合物的优势，因此用PEG修饰的胰岛素可以通过非肽 基聚合物与免疫球蛋白Fc区组合。可用于胰岛素修饰的非肽基聚合物的类型与上 述相同，并且优选聚乙二醇(PEG)。在PEG-修饰的胰岛素中，PEG选择性地连 接至胰岛素的α链的N-末端或者连接至β链的特定赖氨酸残基。修饰胰岛素的PEG 优选地包括在末端上的醛基或者琥珀酰基基团，并且更优选琥珀酰基基团。
[0044] 本发明的长效胰岛素缀合物的制备方法和作用公开在韩国专利公开号 10-2011-0134210、10-2011-0134209和10-2011-0111267中。本领域技术人员可以 参考这些参考文献制备出本发明所使用的长效胰岛素缀合物。另外，本发明人此 前已经发现这样的方法：
通过免疫球蛋白Fc区的N-末端的单PEG化而制备长效 胰岛素缀合物，并将其粘附至胰岛素的β链的第一个苯丙氨酸。
通过免疫球蛋白Fc区的N-末端的单PEG化而制备长效 胰岛素缀合物，并将其粘附至胰岛素的β链的第一个苯丙氨酸。
[0045] 本发明使用的“促胰岛素肽”是指具有分泌胰岛素功能的肽，并且其可以刺 激胰岛素在胰腺β细胞中的合成或者表达。促胰岛素肽优选胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)、GLP-2、毒蜥外泌肽-3或者毒蜥外泌肽-4，但并不限于此。促胰岛素肽 包括天然促胰岛素肽，和其前体、激动剂、衍生物、片段及变体。
[0046] 本发明的促胰岛素肽的衍生物可以是指通过删除促胰岛素肽的N-末端氨基 (或者胺基)而生成的衍生物(如，脱氨基组氨酰基衍生物)；促胰岛素肽的氨基 被羟基取代而生成的衍生物(如，β-羟基咪唑并丙酰基衍生物)；通过用两个甲基 修饰促胰岛素肽的氨基而生成的衍生物(如，二甲基组氨酰基衍生物)；通过促胰 岛素肽的N-末端氨基酸被羧基取代而生成的衍生物(如，β-羧基咪唑并丙酰基衍 生物)；或者通过移除促胰岛素肽的氨基的正电荷、去除N-末端组氨酸残基的α- 碳、仅仅保留咪唑并乙酰基而生成的衍生物(咪唑并乙酰基衍生物)。此外，本发 明的范围包括N-末端氨基修饰的衍生物的其它形式。
[0047] 在本发明中，促胰岛素肽衍生物优选是通过毒蜥外泌肽-4的N-末端氨基或者 氨基酸残基的化学修饰而生成的衍生物，并且更优选这样的毒蜥外泌肽-4衍生物， 存在于组氨酸残基的α-碳中的α-氨基或者α-碳——其是毒蜥外泌肽-4的N-末端的 第一个氨基酸——被取代或者删除。甚至更优选地，促胰岛素肽衍生物是通过删 除毒蜥外泌肽-4的N-末端氨基而生成的脱氨基组氨酰基-毒蜥外泌肽-4(DA-毒蜥 外泌肽-4)；通过羟基或者羧基取代毒蜥外泌肽-4而生成的β-羟基咪唑丙酰基-毒蜥 外泌肽-4(HY-毒蜥外泌肽-4)；β-羧基咪唑并丙酰基-毒蜥外泌肽-4(CX-毒蜥外泌 肽-4)；通过用两个甲基修饰毒蜥外泌肽-4而生成的二甲基-组氨酰基-毒蜥外泌肽-4 (DM-毒蜥外泌肽-4)；或者通过删除N-末端组氨酸残基的α-碳的咪唑并乙酰基- 毒蜥外泌肽-4(CA-毒蜥外泌肽-4)。
[0048] GLP-1是由小肠分泌的激素，并且通常起作用来促进胰岛素的生物合成和分 泌、抑制胰高血糖素分泌并且促进葡萄糖吸入到细胞中。在小肠中胰高血糖素前 体分解为三种肽，它们是胰高血糖素、GLP-1和GLP-2。在此，GLP-1是指不具有 分泌胰岛素功能的GLP-1(1-37)，但当其被加工为GLP-1(7-37)的形式时，则变成 有活性的。GLP-1(7-37)的氨基酸序列如下：
[0049] GLP-1(7-37)：
[0050] HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK EFIAW LVKGR G(SEQ ID No.3)
[0051] 本发明使用的“GLP-1衍生物”是指与天然GLP-1具有至少80％序列同源性 的肽，并且可以是化学修饰的形式，同时表现出至少相同的或者改善的胰岛素分 泌活性。本发明使用的“GLP-1片段”是指在天然GLP-1的N-末端或者C-末端处 添加或者缺失一个或者多个氨基酸的肽的形式，其中添加的氨基酸可以是非天然 存在的氨基酸(如，D-型氨基酸)。本发明使用的术语，长效促胰岛素肽缀合物是 指与天然促胰岛素肽相比具有增强的耐久性作用的肽。长效促胰岛素肽缀合物可 以是天然促胰岛素肽的氨基酸被修饰、置换、添加或者删除的形式；其中胰岛素 连接至生物可降解的聚合物，如PEG的缀合物形式；其中胰岛素连接至具有高耐 久性的蛋白质，如白蛋白、免疫球蛋白，及其片段的缀合物形式；其中促胰岛素 肽连接至脂肪酸的缀合物形式，所述脂肪酸在机体中与白蛋白有结合亲和力；或 者包含在生物可降解纳米颗粒中的促胰岛素肽的形式，但长效促胰岛素肽缀合物 的类型不限于本发明。
[0052] 本发明使用的“GLP-1变体”是指具有一个或者多个与天然GLP-1不同的氨 基酸序列并且具有分泌胰岛素功能的肽。
[0053] 毒蜥外泌肽-3和毒蜥外泌肽-4是由39个氨基酸组成的促胰岛素肽，其与 GLP-1具有53％氨基酸序列同源性。毒蜥外泌肽-3和毒蜥外泌肽-4的氨基酸序列 如下：
[0054] 毒蜥外泌肽-3：
[0055] HSDGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGG PSSGA PPPS(SEQ ID No.4)
[0056] 毒蜥外泌肽-4：
[0057] HGEGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGG PSSGA PPPS(SEQ ID No.5)
[0058] 毒蜥外泌肽激动剂是指与毒蜥外泌肽具有相同的体内结合毒蜥外泌肽受体的 生物活性的物质，无论其结构是否与毒蜥外泌肽相似。毒蜥外泌肽衍生物是指显 示出与天然毒蜥外泌肽具有至少80％序列同源性的肽，并且其可具有一些被化学 取代(如，α-甲基化和α-羟基化)、缺失(如，脱氨基)或者修饰(如，N-甲基化) 的氨基酸残基的基团，并且此类毒蜥外泌肽衍生物具有分泌胰岛素的功能。
[0059] 毒蜥外泌肽片段是指在天然毒蜥外泌肽的N-末端或者C-末端处添加或者缺失 的一个或者多个氨基酸的肽的形式，其中可以添加非天然存在的氨基酸(如，D- 型氨基酸)，并且此类毒蜥外泌肽片段具有分泌胰岛素的功能。
[0060] 毒蜥外泌肽变体是具有与天然毒蜥外泌肽不同的一个或者多个氨基酸序列且 具有分泌胰岛素功能的肽。毒蜥外泌肽变体包括通过用丝氨酸或者精氨酸置换毒 蜥外泌肽-4的第12个氨基酸而产生的肽。毒蜥外泌肽激动剂、衍生物、片段和变 体的每一种制备方法都可以单独或者组合使用。例如，促胰岛素肽的范围包括具 有一个或者多个与天然肽不同的氨基酸序列和N-末端氨基酸残基被脱氨基的促胰 岛素肽。本发明中使用的天然促胰岛素肽和修饰的促胰岛素肽可以通过固相合成 法合成。另外，包括天然促胰岛素肽的大多数天然肽可以通过重组方法产生。
[0061] 在本发明中使用的长效促胰岛素肽缀合物具有与免疫球蛋白片段连接的(如 通过使用基因重组技术经非肽基连接体或肽基连接体与免疫球蛋白Fc连接的)促 胰岛素肽的形式。非肽基连接体与上述相同。长效促胰岛素肽缀合物通过使用如 在长效胰岛素缀合物中的免疫球蛋白片段而制备。长效促胰岛素肽缀合物维持了 已有促胰岛素肽的生理活性，如促进胰岛素合成和分泌、抑制食欲、诱导体重减 轻、增加β-细胞对血清中葡萄糖的敏感性、促进β细胞增值、延缓胃排空和抑制 胰高血糖素，并且由于促胰岛素肽的增加的血清半衰期，其在体内还具有增强的 耐久性作用。因此，长效促胰岛素肽缀合物在糖尿病和肥胖症的治疗中是有效的。
[0062] 对于本发明中使用的长效促胰岛素肽缀合物的制备可以参考下列参考文献： 韩国专利登记号10-0725315，韩国专利公开号10-2009-0008151，和韩国专利登记 号10-1058290。本领域技术人员可以根据上述参考文献制备出本发明中使用的长 效促胰岛素肽缀合物。
[0063] 此外，本发明人已经先前开发了通过首先将PEG粘附至咪唑并乙酰基毒蜥外 泌肽-4(CA毒蜥外泌肽-4)的赖氨酸(Lys)残基，并将PEG修饰的毒蜥外泌肽-4连 接至免疫球蛋白Fc来制备长效毒蜥外泌肽-4缀合物的方法。
[0065] 本发明的长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合物中的每一个通过非肽基 连接体而具有连接至免疫球蛋白Fc区的胰岛素或者促胰岛素肽，其具有耐久性和 稳定性。在本发明中，免疫球蛋白可以与免疫球蛋白片段交换使用。
[0066] 此外，由于免疫球蛋白Fc区与整个免疫球蛋白分子相比具有相对低的分子量， 对于制备和纯化缀合物以及获得高产率而言，其用途可以是有益的。此外，免疫 球蛋白Fc区不包含Fab片段，根据抗体亚类，因为不同的氨基酸序列，Fab片段 是高度不均一性的，因此可以期望免疫球蛋白Fc区具有增加的均一性和低的抗原 性。
[0067] 本发明使用的“免疫球蛋白Fc区”是指含有免疫球蛋白的重链恒定区2(CH2) 和重链恒定区3(CH3)，不包括重链和轻链的可变区、免疫球蛋白的重链恒定区1 (CH1)和轻链恒定区1(CL1)的蛋白质。其还可以包括在重链恒定区处的铰链区。 此外，本发明的免疫球蛋白Fc区可以含有包括重链恒定区1(CH1)和/或轻链恒定 区1(CL1)的Fc区的一部分或者所有，除了重链和轻链的可变区，只要其具有与 天然蛋白质基本相似或者更好的生理功能。另外，其可以是具有在CH2和/或CH3 的氨基酸序列的相对长的部分缺失的片段。即，本发明的免疫球蛋白Fc区可以包 括(1)CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域，(2)CH1结构域和 CH2结构域，(3)CH1结构域和CH3结构域，(4)CH2结构域和CH3结构域，(5) 一个或者多个结构域与免疫球蛋白铰链区(或者铰链区的一部分)的组合，和(6) 重链恒定区和轻链恒定区的各个结构域的二聚体。
[0068] 此外，本发明的免疫球蛋白Fc区包括天然氨基酸序列及其序列衍生物(突变 体)。由于一个或者多个氨基酸残基的缺失、插入、非保守或者保守置换或其组合， 氨基酸序列衍生物具有与天然氨基酸序列不同的序列。例如，在IgG Fc中，在位 置214至238、297至
299、318至322或者327至331处，已知的在结合中重要 的氨基酸残基可以用作修饰的合适靶点。
299、318至322或者327至331处，已知的在结合中重要 的氨基酸残基可以用作修饰的合适靶点。
[0069] 此外，其它多种衍生物是可能的，包括具有能够形成二硫键的区域缺失、在 天然Fc形式的N-末端处数个氨基酸残基缺失，或者向天然Fc形式的N-末端添加 甲硫氨酸残基的衍生物。此外，为了去除效应子功能，缺失可以发生在补体结合 位点，如C1q-结合位点和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)位点。制备 免疫球蛋白Fc区的此类序列衍生物的技术公开在WO97/34631和WO96/32478中。
[0070] 在蛋白和肽中的氨基酸交换在本领域中是已知的，其通常不改变分子活性 (H.Neurath,R.L.Hill,The Proteins,Academic Press,New York,1979)。最常发生的 交换为双向的Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、 Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu 和Asp/Gly。如果需要，Fc区可以通过磷酸化、硫酸化、丙烯酸脂化、糖基化、甲 基化、法尼基化、乙酰化、酰胺化等进行修饰。
[0071] 上述Fc衍生物是具有与本发明的Fc区相同的生物活性或者改善的结构稳定 性(例如，针对热、pH等)的衍生物。
[0072] 此外，这些Fc区从分离自人和包括牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠和 豚鼠的其它动物的天然形式中获得，或者可以是转化的动物细胞或微生物中获得 的重组体或其衍生物。在本文中，它们可以通过将完整的免疫球蛋白从人或者动 物组织分离并用蛋白酶处理它们而从天然免疫球蛋白中获得。木瓜蛋白酶将天然 免疫球蛋白消化为Fab区和Fc区，并且胃蛋白酶处理导致产生pF’c片段和F(ab)2 片段。例如，可以对这些片段进行尺寸排阻层析以分离Fc或者pF’c。优选地，人 衍生的Fc区是从微生物中获得的重组免疫球蛋白Fc区。
[0073] 此外，本发明的免疫球蛋白Fc区可以是具有天然糖链的形式，与天然形式相 比具有增加的糖链形式或者与天然形式相比具有减少的糖链形式，或者可以是去 糖基化形式。免疫球蛋白Fc糖链的增加、减少或者去除可以通过本领域中公知的 方法而实现，如化学法、酶促法和使用微生物的基因工程法。从Fc区去除糖链导 致与补体(c1q)的结合亲和力急剧下降，和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性或者 补体依赖性细胞毒性的减少或丧失，从而不在体内诱导不必要的免疫应答。在这 方面，去糖基化或者非糖基化形式的免疫球蛋白Fc区可能更适合于本发明的作为 药物载体的目的。
[0074] 本发明使用的术语“去糖基化”意指从Fc区中酶促地去除糖部分，和术语 “非糖基化”意指以无糖基化形式由原核生物生产Fc区，优选大肠杆菌(E.coli)。
[0075] 同时，免疫球蛋白Fc区可以源自人和动物，如牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓 鼠、大鼠、豚鼠，并且优选人。
[0076] 此外，免疫球蛋白Fc区可以是源自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的Fc区，或 者通过其组合或杂合体而制造的Fc区。优选地，其源自IgG或者IgM，两者是人 血液中最丰富的蛋白质，并且最优选源自IgG，其已知增加配体结合蛋白质的半衰 期。
[0077] 本发明使用的术语“组合”意指编码相同来源的单链免疫球蛋白Fc区的多肽 连接至不同来源的单链多肽以形成二聚体或者多聚体。即，二聚体或者多聚体可 以由选自IgG Fc、IgA Fc、IgM Fc、IgD Fc和IgE Fc片段的两个或者多个片段形 成。
[0078] 本发明使用的术语“杂合体”意指编码不同来源的两个或者多个免疫球蛋白 Fc区的序列存在于单链免疫球蛋白Fc区中。本发明中，多种类型的杂合体是可能 的。即，结构域杂合体可以由选自IgG Fc、、IgM Fc、IgA Fc、IgE Fc和IgD Fc的 CH1、CH2、CH3和CH4的一个至四个结构域组成，并且可以包含铰链区。
[0079] 另一方面，IgG分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚类，并且本发明包括其组 合或者杂合体。优选为IgG2和IgG4亚类，并且最优选为IgG4的Fc区，其几乎 不具有效应子功能，如补体依赖性细胞毒性(CDC)。
[0080] 作为本发明的药物载体，最优选的免疫球蛋白Fc区是人IgG4衍生的非糖基 化Fc区。人衍生的Fc区比非人衍生的Fc区更优选，非人衍生的Fc区可能作为 人体中的抗原并且可能引起不期望的免疫应答，如产生针对抗原的新抗体。
[0081] 本发明的长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合物组合的液体制剂包括治 疗有效量的长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合物。本发明中使用的长效胰 岛素缀合物的浓度为0.1㎎/ml至200㎎/ml，并且优选为10㎎/ml至200㎎/ml。本 发明中使用的长效促胰岛素肽缀合物的浓度为0.1㎎/ml至200㎎/ml，并且优选为 0.5㎎/ml至150㎎/ml。与低浓度下的现有液体制剂相比，在高浓度下的本发明的 长效胰岛素缀合物和促胰岛素肽缀合物的液体制剂包括每剂高浓度下的胰岛素缀 合物和促胰岛素肽缀合物。因此，可以给机体稳定地提供胰岛素，其允许在高浓 度下共同施用胰岛素缀合物和促胰岛素肽缀合物并且稳定地储存它们而没有沉 淀，不像现有的液体制剂。
[0082] 本发明使用的术语“稳定剂”是指允许稳定储存长效胰岛素缀合物和长效促 胰岛素肽的物质。术语“稳定”是指在一定时期和在特定储存条件下，活性成分 的损失小于一定量，通常小于10％。于5±3℃储存2年、25±2℃储存6个月或者于 40±2℃储存1至2周之后，当其中的长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽的剩余 纯度为90％或者更高，并且更优选为92至95％时，制剂被认为是稳定的制剂。至 于蛋白样长效胰岛素缀合物或者长效促胰岛素肽，对于提供精确的剂量以及抑制 针对长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽的抗原性物质的潜在形成来说，储存稳 定性是重要的。在储存过程中，对于大量施用长效胰岛素缀合物或者长效促胰岛 素肽的10％损失是可接受的，除非造成组合物中聚集体或者片段的形成而导致抗 原性化合物的形成。
[0083] 本发明的稳定剂优选地包括缓冲剂、糖醇、作为等渗剂的氯化钠和非离子表 面活性剂用于稳定长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合物的组合，并且还可 以包括甲硫氨酸。
[0084] 缓冲剂起作用来维持溶液的pH以防止用于稳定长效胰岛素缀合物和长效促 胰岛素肽缀合物组合的液体制剂中的pH急剧变化。缓冲剂可以包括碱性盐(磷酸 钠或者磷酸钾或者其氢或二氢盐)、柠檬酸钠/柠檬酸、醋酸钠/醋酸和任何其它本 领域已知的药学上可接受的pH缓冲剂及其组合。此类缓冲剂优选的实例包括柠 檬酸盐缓冲剂、醋酸缓冲剂和磷酸盐缓冲剂。在它们之中，优选醋酸钠缓冲剂或 者柠檬酸钠缓冲剂。组成醋酸钠缓冲液的醋酸的浓度优选为溶液总体积的5 mM至 100mM，并且更优选5mM至50mM。缓冲剂的pH优选于4.0至8.0，更优选为 5.0至7.0，并且甚至更优选为5.0至6.5。
[0085] 糖醇起增加长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合物的组合的稳定性的作 用。在本发明中，糖醇的浓度优选为制剂总体积的1至20％(w/v)，并且更优选为 制剂总体积的1至15％(w/v)。在本发明中有用的糖醇的例子包括甘露醇和山梨糖 醇，并且优选的例子为甘露醇。
[0086] 当溶液中的长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合物的组合被注射到机体 中时，等渗剂具有维持适当渗透压的作用。此外，等渗剂还具有稳定溶液中组合 的作用。等渗剂通常为水溶性无机盐，其包括氯化钠、硫酸钠、柠檬酸钠，并且 优选氯化钠。可以根据包含在制剂中的成分的类型和量来调整等渗剂的含量，以 便包括所有混合物的液体制剂可以为等渗溶液。此类等渗剂的浓度可以为溶液总 体积的0.5㎎/ml至30㎎/ml，但不限于此。
[0087] 非离子表面活性剂降低蛋白质溶液的表面张力以防止在疏水性表面上的蛋白 质的吸收或者聚合。在本发明中有用的非离子表面活性剂的例子包括聚山梨醇酯、 泊洛沙姆及其组合，优选聚山梨醇酯。聚山梨醇酯的非离子表面活性剂为聚山梨 醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60和聚山梨醇酯80。最优选的非离子表面 活性剂为聚山梨醇酯20。
[0088] 不适合在高浓度下液体制剂中使用非离子表面活性剂，这是因为当通过分析 方法(如UV-光谱术或等电聚焦)测量蛋白质浓度和确定蛋白质稳定性时，在高 浓度下的非离子表面活性剂引起干扰效应，从而导致精确地检测蛋白质稳定性的 困难。因此，本发明的液体制剂包括非离子表面活性剂，优选地在低浓度下小于 0.2％(w/v)，更优选于0.001％至0.05％(w/v)。
[0089] 包含在本发明的稳定剂中的甲硫氨酸通过抑制杂质的形成还具有稳定靶蛋白 的作用，其因为溶液中蛋白质的氧化而可以发生。甲硫氨酸的浓度为溶液总体积 的0.005％至0.1％(w/v)，并且优选为溶液总体积的0.01％至0.1％(w/v)。
[0090] 根据本发明的一个实施例，证明了在缓冲剂、糖醇和非离子表面活性剂的存 在下当氯化钠被添加作为等渗剂时，长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合物 的组合的储存稳定性会显著增加。这表明作为等渗剂的氯化钠与缓冲剂、糖醇和 非离子表面活性剂的同时使用引起协同作用，从而对长效胰岛素缀合物和长效促 胰岛素肽缀合物的组合提供高稳定性。
[0091] 优选的是，本发明的稳定剂不含白蛋白。由于作为蛋白质稳定剂的人血清白 蛋白是由人血清产生的，所以总有可能被人类起源的病原病毒感染。明胶或牛血 清白蛋白可以引起疾病，或者可以易于在一些患者中引发过敏性反应。没有外源 蛋白，如人或者动物起源的血清白蛋白或者纯化的明胶，本发明的稳定剂不具有 导致病毒污染的可能性。
[0092] 此外，本发明的稳定剂还可以包括糖、多元醇或者天然氨基酸。糖的优选例 子——其可以进一步被添加以增加长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合物的 组合的储存稳定性——包括单糖诸如甘露糖、葡萄糖、海藻糖和木糖，和多糖诸 如乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖和葡聚糖。多元醇的优选例子包括丙二醇、低分 子量聚乙二醇、丙三醇、低分子量聚丙二醇及其组合。
[0093] 除了上述缓冲剂、等渗剂、糖醇和非离子表面活性剂以外，本发明的液体制 剂还可以选择性地包括本领域已知的其它物质和材料，只要不影响本发明的效果。
[0094] 本发明的在高浓度下的组合的无白蛋白液体制剂——其为长效胰岛素缀合物 和促胰岛素肽缀合物的组合提供了稳定性——不具有病毒污染的风险，同时为简 单制剂提供了良好的储存稳定性，因此与其它稳定剂或者冻干制剂相比，本制剂 可以更加成本-有效地提供。
[0095] 此外，由于本发明的液体制剂包括长效胰岛素缀合物和促胰岛素肽缀合物， 其与天然肽相比具有提升的生理活性持续时间，所以与常规的胰岛素和促胰岛素 肽制剂相比，通过长时间保留体内蛋白质活性其可以用作有效药物制剂。此外， 本液体制剂提供了在高浓度下存储长效胰岛素缀合物和促胰岛素肽缀合物的组合 的优异稳定性。
[0096] 优选地，本发明的液体制剂可以包括长效胰岛素缀合物，其中胰岛素和促胰 岛素肽通过聚乙二醇连接至免疫球蛋白片段；长效促胰岛素肽；和无白蛋白稳定 剂，其中所述稳定剂包括醋酸缓冲剂、甘露醇、聚山梨醇酯20和氯化钠。此外， 液体制剂还可以包括甲硫氨酸。
[0097] 另一方面，本发明提供了制备本发明的液体制剂的方法。
[0098] 长效胰岛素缀合物和促胰岛素肽缀合物的组合的稳定液体制剂可以通过生成 长效胰岛素和促胰岛素肽缀合物，并且将生成的长效胰岛素和促胰岛素缀合物与 包括缓冲剂、糖醇、非离子表面活性剂和等渗剂的稳定剂混合而制备。
[0099] 另一方面，本发明提供了用于预防或者治疗糖尿病的组合物，其包括胰岛素 缀合物和促胰岛素肽缀合物。
[0100] 本发明的组合物特征在于其允许长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合物 的共同施用。
[0101] 当共同施用长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合物时，长效胰岛素缀合 物充当胰岛素受体，并且同时长效促胰岛素肽缀合物充当胰高血糖素-样肽-1受体。 因此，相比于两种缀合物的单一施用，两种缀合物的共同施用可以更有效地降低 血糖水平而显示稳定的变化。此外，当共同施用缀合物时，减少了可能在胰岛素 的单独施用中显示的低血糖的风险，减少了体重并且由于包括促胰岛素肽还减少 了胰岛素的总剂量。此外，可以减少促胰岛素肽(如毒蜥外泌肽-4)的剂量，因而 共同施用具有的优点为减少当单独施用毒蜥外泌肽-4时可以看见的副作用，如恶 心和呕吐。长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合物的使用可以显著增加药物 的半衰期和体内耐久性，因此，通过减少对需要每天施用的慢性患者的施用频率， 从而改善了患者的生活质量，其对于治疗糖尿病是非常有益的。此外，本发明的 药物组合物具有优异的体内耐久性和效价，并且通过使用共同施用方法，其用途 可以显著减少剂量。
[0102] 长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合物可以同时、依次或者逆序施用。 另外，它们可以以有效量的两者组合同时施用。优选地，长效胰岛素缀合物和长 效促胰岛素肽缀合物可以放入单一容器中，并且随后同时施用。
[0103] 此外，用于本发明的长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合物共同施用的 组合物可以是以在单一容器中制备的用于糖尿病治疗的试剂盒形式。此类试剂盒 可以包括药学上可接受的载体和使用试剂盒的说明书手册。
[0104] 链脲霉素(STZ)诱发的高血糖小鼠用长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀 合物共同施用，并监测血糖水平的变化。结果，当共同施用缀合物时，血糖水平 变化比单独施用缀合物时更稳定。在其它实验中，一周一次用长效胰岛素缀合物 和长效促胰岛素肽缀合物共同施用II型糖尿病模型小鼠，然后比较施用前后的和 空腹血糖水平的差异。结果，相比于两种缀合物的单一施用，共同施用显示出调 节血糖水平的高效，并且没有观察到在胰岛素施用后的体重增加，从而确定共同 施用可以减少由于胰岛素引起的体重增加的副作用。
[0105] 本发明使用的“糖尿病”是指代谢性疾病，其中胰岛素的分泌不足或者胰岛 素无法正常运作。通过对对象共同施用本发明的组合物，糖尿病通过调节血糖水 平而被治疗。
[0106] 本发明使用的术语“预防”是指通过共同施用本发明的组合物而阻止或者延 期糖尿病发作的所有行为。术语“治疗”是指通过共同施用本发明的组合物可以 使糖尿病的症状减缓或者有利地改变的所有行为。糖尿病治疗可以应用于可能发 展糖尿病的任何哺乳动物，并且这种哺乳动物的例子包括人和灵长类以及家畜， 如牛、猪、羊、狗和猫，而没有限制，并且优选人。
[0107] 本发明使用的术语“施用”是指通过特定的合适方法将预定量的物质引入患 者中。可以通过任意常规途径施用组合物，只要其能够到达靶组织。施用的途径 包括腹膜内、静脉内、肌肉内、皮下、皮内、经口、局部、鼻内、肺内和直肠内 施用，但并不限于此。然而，由于在经口服施用时肽被消化，所以用于口服施用 的组合物的活性成分需要被包被或者配制为在胃中免于降解。优选地，缀合物可 以以可注射形式施用。此外，可以使用能够将活性成分转运至靶细胞的某一装置 来施用组合物。
[0108] 此外，本发明的药物组合物可以由数个因素确定，包括待治疗疾病的类型、 施用途径、患者的年龄、性别和体重及疾病的严重性，以及药物中活性成分的类 型。
[0109] 此外，本发明的药物组合物可以包括药学上可接受的载体。本发明使用的“药 学上可接受的载体”是指不会中断被施用的化合物的生理活性和性质而不刺激对 象的载体或者稀释剂。对于口服施用，药学上可接受的载体可以包括粘合剂、润 滑剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、助悬剂、着色剂和芳香剂。 对于可注射的制剂，药学上可接受的载体可以包括缓冲剂、防腐剂、止痛剂、增 溶剂、等渗剂和稳定剂。对于局部施用的制剂，药学上可接受的载体可以包括基 底、赋形剂、润滑剂和防腐剂。可以通过添加药学上可接受的载体将本发明的药 物组合物配制成多种形式。例如，对于口服施用，可以将药物组合物配制成片剂、 锭剂、胶囊剂、酏剂、悬浮剂、糖浆或者干胶片。对于可注射的制剂，可以将药 物组合物配制成单剂量安瓿或者多剂量容器。还可以将药物组合物配制成溶液、 悬浮液、片剂、丸剂、胶囊剂和缓释制剂。
[0110] 另一方面，本发明提供了预防或者治疗糖尿病的方法，包括向可能发展糖尿 病或者已经患有糖尿病的对象施用包括长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合 物的组合物。
[0111] 在施用步骤中，可以共同施用长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合物， 其中同时组合并施用合适有效量的缀合物。
[0112] 即使减少施用频率，本发明的包括长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合 物两者的组合物可以有效地减少血糖水平，并且不引起副作用，如体重增加，因 此可以有效用于预防或者治疗糖尿病。
[0113] 发明方式
[0114] 下文中，将通过参照实施例更加详细地说明本发明。然而，这些实施例仅用 于说明性目的，并且本发明不意在被这些实施例所限制。
[0115] 实施例1：长效胰岛素缀合物的稳定性的评估
[0116] 作为增加药物的血清半衰期和预防机体中低血糖的策略开发了长效胰岛素缀 合物。因此，通过共价键由免疫球蛋白Fc区、非肽基聚合物和胰岛素的位点特异 性缀合而生成的胰岛素缀合物具有显著增加的血清半衰期并且减少了低血糖的风 险。
[0117] 为了评估此类长效胰岛素缀合物的稳定性，以表1中的组分制备制剂并且于 40℃储存2周，并通过离子交换层析法(IE-HPLC)分析其中肽的稳定性。
[0118] 此时，有助于肽的稳定性的主要因素被设置为pH、缓冲剂的类型和浓度、等 渗剂的类型、由甘露醇组成的糖醇的浓度、表面活性剂的类型、由聚山梨醇酯20 组成的表面活性剂的浓度、有无其它添加剂和甲硫氨酸和氯化钠的共同添加。在 每个成分中的长效胰岛素缀合物的浓度为61.1mg/ml，并且这些制剂用于实验。
[0119] 表1的IE-HPLC(％)表示出面积％/开始面积％的数值，其显示了与初始纯度相 比的长效胰岛素缀合物的剩余纯度。
[0120] 【表1】
[0121]
[0122]
[0123] 【表2】
[0124]
[0125] 如表2所示，在pH为5.6或6.0下，长效胰岛素缀合物在包括由醋酸钠组成 的缓冲剂、由氯化钠组成的等渗剂、由甘露醇组成的糖醇和由聚山梨醇酯20组成 的表面活性剂的液体制剂中是最稳定的。
[0126] 实施例2：长效促胰岛素肽缀合物的稳定性的评估
[0127] 为了确定在多种pH下和根据稳定剂的存在的长效促胰岛素肽缀合物的溶解 性，以表3中所示的下列组分制备长效促胰岛素肽缀合物的不同液体制剂并于 40℃储存1周。然后，通过肉眼监测蛋白质沉淀来比较缀合物的稳定性。在每个 组分中，长效促胰岛素肽缀合物的浓度为10mg/ml，并且使用这些制剂进行实验。
[0128] 【表3】
[0129]
[0130] 图1中无蛋白质沉淀的持续时间(天数)表示于40℃储存制剂之后蛋白质沉 淀没有发生的时间。如上所示，用醋酸钠、pH 5.0至5.4(#1、#2和#3)或者用 5％(w/v)甘露醇(#5)，蛋白质沉淀在40℃储存4天内发生。然而，当pH为5.6 并且10％(w/v)甘露醇被添加到制剂中时，溶解性增加并且7天不发生沉淀(图1)。
[0131] 实施例3：长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合物的组合的稳定性的评估[0132] 在单一液体制剂的基础上，比较长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合物 的组合的稳定性。此外，确定氯化钠和甲硫氨酸的添加——分别对于稳定长效胰 岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合物来说是重要的——如何影响长效胰岛素缀合 物和长效促胰岛素肽缀合物的组合的稳定性。
[0133] 以表4中所示的下列组分制备长效胰岛素缀合物、长效促胰岛素肽缀合物或 者两种的组合的液体制剂并于40℃储存4周。然后，通过监测蛋白质沉淀并通过 使用离子交换层析法(IE-HPLC)、尺寸排除色谱法(SE-HPLC)和反相高效液相 色谱法(RP-HPLC)，与单一缀合物的制剂相比对两种缀合物组合的制剂进行稳定 性测试。
[0134] 在每个液体制剂中的长效促胰岛素肽缀合物(对照-1，#1至#4)和长效胰岛 素缀合物(对照-2，#1至#4)的浓度分别为10mg/ml和61.1mg/ml。
[0135] 【表4】
[0136]
[0137]
[0138] 在图2至图3中，IE-HPLC和RP-HPLC分析显示出面积％/开始面积％的值， 代表与初始纯度相比长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合物的剩余纯度。它 们之中，图2显示了对长效胰岛素缀合物的IE-HPLC和RP-HPLC分析结果，同 时图3显示了对长效促胰岛素肽缀合物的IE-HPLC和RP-HPLC分析结果。
[0139] 如上所示，当长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合物的组合的稳定性与 长效胰岛素缀合物或者长效促胰岛素肽缀合物的稳定性进行比较时，发现长效胰 岛素缀合物在组合制剂(制剂#3和#4)和独立制剂中具有相似的纯度和稳定性(图 2)。
[0140] 然而，当0.01％(w/v)甲硫氨酸包含在包括10mM醋酸钠、pH 6.0、10mg/ml氯 化钠、10％(w/v)甘露醇和0.02％(w/v)聚山梨醇酯20的液体制剂(如，制剂#4) 中时，长效促胰岛素肽缀合物的稳定性与缺少甲硫氨酸的制剂相比得到了改进(图 3)。这可能是因为甲硫氨酸起到阻止长效促胰岛素肽缀合物氧化的作用的事实。 由于沉淀过量，无法进行长效促胰岛素肽缀合物的独立制剂的比较。
[0141] 如图4所示，长效促胰岛素肽缀合物的独立制剂在2周内有蛋白质沉淀，而 长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合物组合的制剂(制剂#3和#4)具有增加 的溶解性并且其中的沉淀被抑制相对较长时间直至4周。
[0142] 这些结果支持，本发明的液体制剂的组合物可以在高浓度下维持促胰岛素肽 缀合物和胰岛素缀合物的组合的高稳定性。
[0143] 实施例4：根据等渗剂和糖醇的浓度，长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合物的组合的稳定性的评估
[0144] 在包括4.8至6.7mg/ml作为等渗剂的氯化钠、1至2％(w/v)作为糖醇的甘露醇 和甘露醇的液体制剂中的缀合物组合及在实施例2确定的液体制剂(10mM醋酸 钠、pH6.0、10mg/ml氯化钠、10％(w/v)甘露醇、0.02％(w/v)聚山梨醇酯20、0.01％(w/v) 甲硫氨酸)中的组合之间，比较长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合物的组 合的稳定性。
[0145] 以表5中所示的下列成分制备长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合物组 合的液体制剂并于25℃储存4周。然后，通过IE-HPLC、SE-HPLC和RP-HPLC 检测缀合物的稳定性。
[0146] 表6和表7的IE-HPLC(％)和RP-HPLC(％)代表面积％/开始面积％的值，表示 与初始纯度相比长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合物组合的剩余纯度。它 们之中，表6显示了对长效胰岛素缀合物的IE-HPLC和RP-HPLC分析结果，同 时表7显示了对长效促胰岛素肽缀合物的IE-HPLC和RP-HPLC分析结果。
[0147] 【表5】
[0148]
[0149] 【表6】
[0150]
[0151]
[0152] 【表7】
[0153]
[0154] 如上所示，相比于实施例3中确定的液体制剂(10mM醋酸钠、pH 6.0、10 ㎎/ml氯化钠、10％(w/v)甘露醇、0.02％(w/v)聚山梨醇酯20、0.01％(w/v)甲硫氨酸)， 当氯化钠的浓度减少到4.8㎎/ml并且甘露醇的浓度减少到1至2％(w/v)(制剂#1 和#2)时，和当氯化钠的浓度减少到6.7㎎/ml并且甘露醇的浓度减少到1至2％(w/v) (制剂#3和#4)时，所有四种被检测的制剂均显示出与实施例3中确定的液体制 剂相似的高稳定性。
[0155] 这些结果支持，如果本发明的液体制剂的组合物包括作为等渗剂的氯化钠和 作为糖醇的甘露醇，则即使当作为等渗剂的氯化钠的浓度和作为糖醇的甘露醇的 浓度都低时，其可以给胰岛素缀合物和促胰岛素肽缀合物的组合提供相同程度的 稳定性。
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