长效人生长激素缀合物的液体制剂
阅读：327发布：2020-05-16
专利汇可以提供长效人生长激素缀合物的液体制剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且公开了不含 白蛋白 的长效人生长 激素 (hGH)缀合物之液体制剂，其可确保所述长效hGH缀合物在长期贮存时的 稳定性 ，其中所述长效人生长激素缀合物包含与免疫球蛋白Fc区相连接的人生长激素并且与天然形式相比具有延长的体内稳定性。包含pH5.0～6.0的缓冲剂、糖醇、盐和非离子 表面活性剂 的hGH缀合物之液体制剂不含人血清白蛋白和其他潜在受病毒污染的危险因子，并且可提供为由hGH多肽和免疫球蛋白Fc区构成之长效hGH缀合物定制的极佳的贮存稳定性，所述缀合物与所述天然形式相比具有更高的分子量和体内持久性。，下面是长效人生长激素缀合物的液体制剂专利的具体信息内容。
1.长效人生长激素缀合物之液体制剂，其包含药物有效量的所述长效人生长激素缀合物和不含白蛋白的稳定剂，在所述长效人生长激素缀合物中，人生长激素经由聚乙二醇连接的与免疫球蛋白Fc区相连接，所述稳定剂基本上由以下组成：pH 5.2或更高但小于5.5的缓冲剂、糖醇、非离子表面活性剂和盐，其中所述非离子表面活性剂是聚山梨醇酯80并且以基于所述制剂的总体积的0.001％至0.05％(w/v)的量使用，以及其中所述盐是氯化钠。
2.根据权利要求1所述的长效人生长激素缀合物之液体制剂，其中所述糖醇选自：甘露醇、山梨醇及其组合。
3.根据权利要求1所述的长效人生长激素缀合物之液体制剂，其中所述糖醇以基于所述制剂的总体积的1％至10％(w/v)的量使用。
4.根据权利要求1所述的长效人生长激素缀合物之液体制剂，其中所述缓冲剂是柠檬酸盐或磷酸盐缓冲剂。
5.根据权利要求1所述的长效人生长激素缀合物之液体制剂，其中所述盐以5mM至
200mM的浓度使用。
6.根据权利要求1所述的长效人生长激素缀合物之液体制剂，其中所述稳定剂还包含一种或更多种选自糖、多元醇和氨基酸的成分。
7.根据权利要求1所述的长效人生长激素缀合物之液体制剂，其中所述长效人生长激素缀合物包含经由聚乙二醇连接的人生长激素和免疫球蛋白Fc区，并且所述稳定剂包含pH
5.2或更高但小于5.5的柠檬酸盐缓冲剂、1～10％(w/v)甘露醇、0.001～0.05％聚山梨醇酯
80和5～200mM NaCl。
8.根据权利要求1所述的长效人生长激素缀合物之液体制剂，其中所述人生长激素具有与天然人生长激素相同的氨基酸序列。
9.根据权利要求1所述的长效人生长激素缀合物之液体制剂，其中所述免疫球蛋白Fc区衍生自IgG、IgA、IgD、IgE或IgM。
10.根据权利要求9所述的长效人生长激素缀合物之液体制剂，其中所述免疫球蛋白Fc区是免疫球蛋白之不同结构域的杂合Fc区，所述免疫球蛋白选自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM。
11.根据权利要求9所述的长效人生长激素缀合物之液体制剂，其中所述免疫球蛋白Fc区是具有相同来源之结构域的单链免疫球蛋白的二聚体或多聚体。
12.根据权利要求9所述的长效人生长激素缀合物之液体制剂，其中所述免疫球蛋白Fc区是IgG4Fc区。
13.根据权利要求12所述的长效人生长激素缀合物之液体制剂，其中所述免疫球蛋白Fc区是无糖基化的人IgG4Fc区。
14.用于生产如权利要求1至13中任一项所述的长效人生长激素缀合物之液体制剂的方法，其包括：
a)制备长效人生长激素缀合物；和
b)将所述长效人生长激素缀合物与稳定剂组合，所述稳定剂基本上由以下组成：pH
5.2或更高但小于5.5的缓冲剂、糖醇、非离子表面活性剂和盐，其中所述非离子表面活性剂是聚山梨醇酯80并且以基于所述制剂的总体积的0.001％至0.05％(w/v)的量使用，以及其中所述盐是氯化钠。
长效人生长激素缀合物的液体制剂
技术领域
[0001] 本发明涉及不含白蛋白的长效人生长激素缀合物的液体制剂，其在长期贮存时可确保所述长效人生长激素缀合物的稳定性，其中所述长效人生长激素缀合物包含与免疫球蛋白Fc区相连接的人生长激素，并且与天然形式相比具有延长的体内稳定性。
背景技术
[0002] 人生长激素(下文中称为“hGH”)是由垂体前叶腺(anterior pituitarygland)分泌的无糖基化的(aglycosylated)肽激素，并且与在多种组织的细胞表面上的特异性受体相互作用，从而刺激分泌其他生长因子，以负责增加身体多个部分的尺寸。自从发现来自人垂体腺的生长激素是垂体性侏儒症(pituitary dwarfism)的有效治疗剂以来，对hGH的需求出现了爆发性地增长。然而，可从人垂体腺提取的hGH的供应十分有限。另外，在接受尸体来源之hGH的儿童中发生了退行性神经病(degenerative neurological disorder)克-雅病(Creutzfeldt-Jacob disease)之后，美国FDA已经禁止使用从尸体垂体腺提取的hGH，这是基于假设引起疾病的传染性朊病毒(prion)随尸体来源的hGH而传播(Roger，L.，Science234：22，1986)。目前，使用基因重组技术通过E.coli生产的生物合成的人生长激素已经被FDA批准市售。
[0003] 多肽(例如hGH)由于其低稳定性而易于退变(degenerate)，并且容易被血清蛋白酶降解并且被肾或肝移除。因此，包含多肽作为药物活性成分的药物必须频繁地向患者施用以维持其血清水平和效价。然而，通过频繁施用(在大多数情况下是以注射的形式)蛋白质药物来维持活性多肽的高血清水平对患者来说是痛苦的。
[0004] 为了解决这些问题，已尝试通过提高蛋白质药物的血清稳定性并且长期维持蛋白质药物的高血清水平来使药效最大化。因此，需要在患者中具有提高的稳定性以及维持在足够高水平的活性(而不引起免疫应答)的蛋白质药物的制剂。
[0005] 为了稳定蛋白质并防止与蛋白酶相接触和肾损失，常规地将高度可溶性聚合物(例如聚乙二醇(PEG))化学添加至蛋白质药物的表面。非特异性缀合至目标蛋白质的某些或多个位置后，PEG可提高目标蛋白质的溶解度，使蛋白质稳定并防止其降解，而不会引起显著的副作用(Sada等，J.Fermentation Bioengineering，1991，71：137-139)。PEG缀合可有助于蛋白质的稳定，但是会显著地降低其活性。较高分子量的PEG具有降低的与蛋白质的反应性，因此降低产量。
[0006] 用于提高生理活性蛋白质的体内稳定性的一种替代性策略是通过使用基因重组将目标蛋白质与具有高血清稳定性的蛋白质相融合，这是将编码蛋白质的各基因彼此相连接并且培养用融合基因转化之动物细胞的方法。例如，已经报道了融合蛋白质，其中已知提高蛋白质稳定性的白蛋白或其片段通过基因重组与目标蛋白质相融合(国际专利公开No.WO93/15199和No.WO93/15200，欧洲专利公开No.EP413,622)。
[0007] 美国专利No.5,045,312公开了使用交联剂与牛血清白蛋白或鼠免疫球蛋白缀合的hGH具有与未修饰的生长激素相比增强的活性。在该专利中提及的唯一交联剂是低分子量化合物(例如，碳二亚胺或戊二醛)。然而，这样的低分子量交联剂由于其非特异性连接而不会确保均一的组成并且可能具有体内毒性。另外，该专利仅揭示了通过化学偶联提高生长激素的活性，但是没有显示出化学偶联对于针对其他多肽药物之活性的作用，并且没有理解与蛋白质之稳定性(例如，持久性和血清半衰期的提高)的相关性。
[0008] 最近，引入了生理活性多肽与免疫球蛋白Fc区和非肽聚合物之间形成的缀合物作为长效制剂，其使得蛋白质药物具有最小限度降低的活性和提高的稳定性这二者，如韩国专利No.10-0567902(Physiologically Active Polypeptide Conjugate Having Improved In Vivo Durability)和韩国专利No.10-0725315(Protein Complex Using An Immunoglobulin FragmentAnd Method For The Preparation Thereof)中所述。
[0009] 根据这些方法，hGH可用作生理活性多肽从而可制备长效hGH缀合物。对于这些待用作药物的长效hGH缀合物，必须维持其在体内的药效，同时抑制其发生物理化学变化，例如光、热或添加剂中的杂质引起的变性、聚集、吸附或水解。与hGH相比，长效hGH缀合物在尺寸和分子量上更大，因此更加难以使其稳定。
[0010] 通常，蛋白质具有非常短的半衰期，并且当暴露于不适当的温度、水-空气界面、高压、物理或机械应力、有机溶剂、微生物污染等后表现出变性，例如单体聚集、聚集沉淀以及吸附在容器表面上。一旦变性，蛋白质失去其固有的物理化学性质和生理活性。由于在大部分情况下蛋白质变性是不可逆的，所以对于已经变性的蛋白质，恢复其固有的性质几乎是不可能的。
[0011] 被吸收的蛋白质因其变性而易于聚集。聚集的蛋白质当注射到身体中时可充当抗原性物质，因此必须施用足够稳定的蛋白质。已经研究了防止蛋白质变性的多种方法(John Geigert，J.Parenteral Sci.Tech.，43，No5，220-224，1989，David Wong，Pharm.Tech.October，34-48，1997，WeiWang.，Int.J.Pharm.，185，129-188，1999，Willem Norde，Adv.ColloidInterface Sci.，25，267-340，1986，Michelle等，Int.J.Pharm.120，179-188，1995)。
[0012] 一些蛋白质药物采用冻干工艺以避免稳定性问题。然而，冻干产品不方便溶于注射用溶剂中。另外，冻干法需要大规模冷冻干燥机，这在蛋白质药物的生产中提高了投资成本。还提议了用喷雾干燥机使蛋白质粉末化以维持蛋白质的稳定性，但是由于低产量而在经济上无益。此外，暴露于喷雾干燥的高温对蛋白质本身产生负面的副作用。
[0013] 已经研究了作为克服这些限制的替代方法而出现的稳定剂，这是因为当将其添加至蛋白质药物溶液时，能够抑制蛋白质药物的物理化学变化并且确保体内药效，甚至在长期贮存后也是如此。已经将人血清白蛋白广泛用作多种蛋白质药物的稳定剂，并且其性能已经得到了证明(Edward Tarelli等，Biologicals(1998)26，331-346)。
[0014] 当与人血清白蛋白一起施用时，患者冒着暴露于生物污染物或病原体(例如，支原体、朊病毒、细菌和病毒)的风险，这是因为尽管用于纯化白蛋白的工艺包括灭活、筛选或检查此类生物污染物或病原体，但是这些可能无法被完全被消除或灭活。例如，筛选工艺包括针对某些病毒检查供体血清，但是该检查不总是可靠的。尤其是，非常少量的某些病毒(如果存在的话)可能无法检出。
[0015] 由于不同蛋白质的化学差异，它们可在贮存期间在不同的条件下以不同的速率逐渐失活。也就是说，通过稳定剂延长贮存期对于不同的蛋白质而言是不同的。为此，根据所述目标蛋白质的物理化学性质，待使用的稳定剂与目标蛋白质在比例、浓度和类型上有所不同，。出人意料地是，当组合使用时，由于稳定剂之间的竞争和相互作用，可引起负面影响。此外，由于目标蛋白质的性质或浓度可在贮存期间变化，所以所使用的稳定剂可提供与预期不同的作用。因此，需要大量的努力和预防措施以稳定溶液中的蛋白质。
[0016] 特别地，通过将生理活性肽hGH与免疫球蛋白Fc区相连接以提高hGH体内耐久性和稳定性而制备的长效hGH缀合物需要特定的组成用于稳定蛋白质，这是因为它们在分子量和尺寸上与典型的hGH十分不同。
[0017] 国际专利公开No.W093/19776公开了包含pH6.0～7.0的缓冲剂、氨基酸、甘露醇和任选的防腐剂(例如苯甲醇)的稳定的hGH之液体制剂。国际专利公开No.WO94/03198公开了含有hGH、pH6.0的缓冲剂、非离子表面活性剂、防腐剂和任选的中性盐或甘露醇的稳定的液体制剂。美国专利No.6,448,225公开了含有hGH、pH6.0的缓冲剂、非离子表面活性剂和任选的中性盐或甘露醇(但不需要甘氨酸)的稳定的可药用液体制剂。韩国专利No.10-0537260公开了含有PEG(代替非离子表面活性剂和防腐剂)、缓冲剂和等渗剂作为活性成分的稳定化hGH之液体制剂，这是由于非离子表面活性剂和防腐剂引起hGH显著地脱氨基。
[0018] 然而，尽管hGH和免疫球蛋白Fc区二者都是肽或蛋白质，但是它们具有不同的物理化学性质，并且二者需要同时被稳定化。如上所述，不同的蛋白质因其化学差异在贮存期间在不同的条件下以不同的速率逐渐失活。与预期相反的是，使用适合用于在组合中稳定肽或蛋白质的稳定剂可因它们之间的竞争和相互作用而产生负面影响。因此，对于长效hGH缀合物，其稳定制剂的组合物不同于用于单独稳定hGH之制剂的那些。事实上，很难发现用于稳定hGH和免疫球蛋白Fc区二者的制剂。
[0019] 通过以下产生了本发明：由本发明的发明人对长期安全贮存长效hGH-免疫球蛋白Fc缀合物进行的深入和彻底的研究，导致发现包含pH5.0～6.0的缓冲剂、非离子表面活性剂、糖醇和盐的稳定剂组合物可提供具有长效hGH缀合物的经济上有益的液体制剂，该制剂在长期贮存阶段可极大地促进提高长效hGH缀合物的稳定性而不必担忧病毒污染。
[0020] 发明的公开内容
[0021] 技术问题
[0022] 因此，本发明的一个目的是提供一种提高贮存稳定性的包含长效hGH缀合物、pH5.0～6.0的缓冲剂、糖醇、盐和非离子表面活性剂的长效hGH缀合物之液体制剂。
[0023] 技术方案
[0024] 根据其的一个方面，本发明提供了包含药物有效量的长效hGH缀合物、pH5.0～6.0的缓冲剂、糖醇、盐和非离子表面活性剂的长效hGH缀合物之液体制剂。
[0025] 本文中使用的术语“长效hGH缀合物”意指这样的缀合物，其中将生理活性肽人生长激素与免疫球蛋白Fc区相连接并且其生理活性与天然hGH相比持续时间更长。
[0026] 本文中使用的术语“长效”意指生理活性具有比天然hGH更长的持续时间。
[0027] 可用于本发明的hGH具有野生型的氨基酸序列或具有与野生型类似活性的密切相关类似物的氨基酸序列。本发明中可使用任何hGH(无论是天然的或重组的)。优选使用E.coli作为宿主制备的重组hGH。本领域中可使用通过氨基酸残基的替换、缺失或插入而衍生自天然hGH的任何突变体，只要其生物活性没有显著改变即可。
[0028] 至于可用于本发明的免疫球蛋白Fc，其可以是人免疫球蛋白Fc或与其密切相关的类似物或者可来源于动物(例如，牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠、豚鼠等)。免疫球蛋白Fc区可衍生自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM或者其组合或杂合体。免疫球蛋白Fc区可以是选自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的免疫球蛋白的不同结构域的杂合Fc区，或者可以是具有相同来源之结构域的单链免疫球蛋白的二聚体或多聚体。优选已知提高配体结合蛋白之血清半衰期的衍生自IgG或IgM(其在人血液中最丰富)的Fc区，并且最优选衍生自IgG的Fc区。可通过用某些蛋白酶处理天然IgG获得免疫球蛋白Fc或者使用基因重组技术由经转化细胞产生免疫球蛋白Fc。优选地，所述免疫球蛋白Fc是在E.coli中产生的重组人免疫球蛋白Fc。
[0029] IgG分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型，并且本发明可包括其组合或杂合体。优选IgG2和IgG4亚型，并且最优选很少具有效应器功能(例如，CDC(补体依赖性细胞毒性(Complement Dependent Cytotoxicity)))的IgG4的Fc区。也就是说，最适合作为本发明药物载体的免疫球蛋白Fc区是人IgG4来源的无糖基化的Fc区。人来源的Fc区比非人来源的Fc区更优选，所述非人来源的Fc区可在人体中充当抗原并且引起不期望的免疫应答，例如产生针对抗原的新抗体。
[0030] 可通过将hGH与由上述方法生产的免疫球蛋白Fc区相连接来制备用于本发明的长效hGH缀合物。该连接方法可通过经由非肽基聚合物将hGH与免疫球蛋白Fc相交联或者通过产生融合蛋白质(其中使用基因重组将hGH与免疫球蛋白Fc区相融合)来实现。优选hGH与免疫球蛋白Fc区之间经由非肽基聚合物连接。
[0031] 可用于所述交联的非肽基聚合物可选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇与丙二醇的共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙基醚、可生物降解的聚合物(例如，PLA(聚(乳酸))和PLGA(聚(乳酸-羟基乙酸)))、脂质聚合物、甲壳素类(chitins)、透明质酸及其组合。最优选聚乙二醇。其在本领域中公知的衍生物和可使用本领域已知方法很容易制备的衍生物也在本发明的范围内。
[0032] 对于制备长效hGH缀合物，可参照韩国专利No.0725315，其公开内容通过引用整体并于本文。本领域技术人员可参照所述文献生产本发明的长效hGH缀合物。
[0033] 本发明的长效hGH缀合物之液体制剂包含药物有效量的长效hGH缀合物。通常，hGH的药物有效量对应于单次使用的小瓶中的约1～3mg。用于本发明的长效hGH缀合物的浓度范围为1mg/mL至55mg/mL，优选15mg/mL至25mg/mL。
[0034] 本文中使用的术语“稳定剂”意指允许长效hGH缀合物稳定贮存的物质。术语“稳定”意为损失低于活性成分的某一百分比，通常低于10％，优选低于5％。当在10±3℃下贮存2年、在25±2℃下贮存6个月或在40±2℃下贮存一至两周后与最初活性相比长效hGH缀合物的活性保持90％或更高的水平(优选约92～95％的水平)，那么认为制剂是稳定的。对于蛋白质(例如长效hGH缀合物)，其贮存稳定性在抑制潜在地产生其抗原形式以及确保其准确剂量上是非常重要的。
[0035] 尽管通过本发明的长效hGH缀合物保持在一起，生理活性肽hGH和免疫球蛋白Fc区的物理化学性质彼此不同并且必须被同时稳定化。它们之间的物理化学差异可引起不同的肽或蛋白质在贮存期间在不同条件下以各自的速率逐渐失活。出人意料的是，在组合中使用适于活性肽或蛋白质的稳定剂可因它们彼此竞争或相互作用而产生负面影响。
[0036] 设计用于同时稳定生理活性肽hGH和免疫球蛋白Fc区二者，使得长效hGH缀合物的活性可长时间维持期望的水平，本发明的稳定剂包含特定的缓冲剂、糖醇、盐和非离子表面活性剂。
[0037] 缓冲剂的作用在于将溶液的pH维持在预定的范围内以防止可导致长效hGH失活的急剧pH变化。本发明中可使用任何缓冲剂，只要是本领域中已知的可药用pH缓冲剂即可。可用于本发明的缓冲剂包括碱性盐(alkaline salt)(磷酸钠或磷酸钾或者其氢盐或二氢盐)、柠檬酸钠/柠檬酸、醋酸钠/醋酸及其组合。优选柠檬酸盐缓冲剂和磷酸盐缓冲剂，更优选柠檬酸盐缓冲剂。可用于本发明的柠檬酸盐缓冲剂可包含优选5mM至100mM量的并且更优选10mM至50mM浓度的柠檬酸盐。
[0038] 由于溶液内的反应可根据溶液中缓冲剂的pH而改变，所以稳定剂的pH非常重要。反应发生时的pH以及其对溶解度的影响因蛋白质不同而不同。因此，很难以维持高溶解度和准确的三维结构而不产生变性杂质的方式稳定蛋白质。常规hGH制剂通常使用pH6.0～
7.0或更高的缓冲剂以降低杂质的产生并且提高蛋白质的溶解度。
7.0或更高的缓冲剂以降低杂质的产生并且提高蛋白质的溶解度。
[0039] 本发明的稳定剂包含pH5.0～6.0、优选pH5.2～6.0并且更优选pH5.2～5.5的缓冲剂。在本发明的一个实施方案中，在贮存3个月后测量的#6和#7杂质(对应hGH的脱氨基杂质)含量在低pH(例如，pH5.2)下尤其地降低(图1)。这些数据表明，因为由hGH和免疫球蛋白Fc区构成的长效hGH缀合物在性质上与单独的hGH不同，所以设计用于稳定长效hGH缀合物和提高长效hGH缀合物之溶解度二者的液体制剂必须在pH上不同于常规的hGH之液体制剂。
[0040] 此外，糖醇的作用在于提高长效hGH缀合物的稳定性。在本发明中，基于所述制剂的总体积，糖醇优选以1至10％(w/v)的量并且更优选以5％(w/v)的量使用。可用于本发明的糖醇的实例包括但不限于甘露醇、山梨醇及其组合。如从表4的数据中所理解的，将0.5％L-Arg-HCl添加至甘露醇对长效hGH缀合物的稳定性没有影响。
[0042] 在制剂中，盐可优选以5至200mM的量并且更优选以150mM的量存在，并且其含量可根据成分的类型和量进行调整，从而使制剂等渗。
[0043] 在本发明的一个实施方案中，在盐存在或不存在下，对包含pH5.0～6.0的缓冲剂、糖醇和非离子表面活性剂之制剂中长效hGH缀合物的稳定性进行评价。结果，与不存在NaCl下的相比，在NaCl(尤其是150mMNaCl)存在下在含有5％的甘露醇的制剂中在25℃下贮存4周时，长效hGH缀合物的稳定性维持在显著更高的水平(表2)。与常规hGH相比，根据本发明的长效hGH缀合物可在含有1～10％(w/v)糖醇和5～200mM NaCl的制剂中稳定化并且还可在含有pH5.0～6.0的缓冲剂、糖醇、非离子表面活性剂和盐的制剂中稳定化。
[0044] 非离子表面活性剂降低了蛋白质溶液的表面张力，以防止蛋白质在疏水性表面上的吸收或聚集。可用于本发明的非离子表面活性剂的实例包括聚山梨醇酯(polysorbate)、泊洛沙姆(poloxamer)及其组合，优选聚山梨醇酯。其中聚山梨醇酯的非离子表面活性剂是聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60和聚山梨醇酯80。优选聚山梨醇酯80。
[0045] 根据本发明的一个实施方案，观察到了长效hGH缀合物的稳定性在聚山梨醇酯80存在下有所提高(表8)。当用聚山梨醇酯20替代聚山梨醇酯80时，直到两周之后，长效缀合物的稳定性相同，但是在贮存4周后，尽管表面活性剂彼此类似，长效缀合物之间的稳定性有显著性差异。
[0046] 在本发明的液体制剂中，优选以0.1％(w/v)或更少的量、更优选以0.001至0.05％(w/v)的量并且远远更优选以0.005％(w/v)的量包含非离子表面活性剂。Norditropin(购自Nordisk的hGH液体制剂)使用3mg/mL泊洛沙姆188作为表面活性剂(表9)。根据本发明的一个实施方案，观察到在含有3mg/mL泊洛沙姆188的制剂中的长效hGH缀合物在25℃下贮存两周后发生聚集(表8)。这些数据表明，表面活性剂(充当蛋白质药物的稳定剂)的类型和浓度必须是药物特异性的。
[0047] 在本发明的一个实施方案中，发现除pH5.2的缓冲剂和非离子表面活性剂之外还含有1～10％(w/v)糖醇和5～200mM NaCl的制剂显著地提高了长效hGH缀合物的贮存稳定性，表明pH5.2的缓冲剂、非离子表面活性剂、糖醇和盐的组合显示了对长效hGH缀合物之稳定性的协同作用。
[0048] 优选地，本发明的稳定剂不含白蛋白。因为其产自人血清，所以总是有以下的可能性：可用作蛋白质稳定剂的人血清白蛋白可受到人来源的病原性病毒的污染。在一些患者中，明胶或牛血清白蛋白可引起疾病或可易于产生变态反应。没有异源性蛋白质(例如人或动物来源的血清白蛋白或经纯化的凝胶)，本发明的稳定剂没有引起病毒污染的可能性。
[0049] 除pH5.0～6.0的缓冲剂、盐、糖醇和非离子表面活性剂之外，本发明的液体制剂可还包含本领域公知的成分或材料(除非它们降低本发明的作用)。例如，本发明的制剂可还包含糖、多元醇或中性氨基酸。
[0050] 还可包含于制剂中以提高长效缀合物之贮存稳定性的糖的优选实例包括单糖(例如，甘露糖、葡萄糖、岩藻糖和木糖)和多糖(例如，乳糖、蔗糖、棉籽糖(raffinose)和葡聚糖)。还可用于本发明的多元醇有丙二醇、低分子量聚乙二醇、甘油、低分子量聚丙二醇及其组合。基于制剂的总体积，糖和多元醇各自可以以1至10％(w/v)的量并且优选以5％(w/v)的量使用。
[0051] 根据其中一个优选的实施方案，本发明提供包含20mM柠檬酸钠缓冲剂(pH5.2～6.0)、5～200mM NaCl、1～10％(w/v)甘露醇和0.001～0.05％聚山梨醇酯80的液体制剂。在本发明的一个实施方案中，将包含柠檬酸钠缓冲剂(pH5.2)、5％(w/v)甘露醇、150mM NaCl和0.005％(w/v)聚山梨醇酯80的长效hGH缀合物之液体制剂与购自Nordisk的hGH制剂Norditropin相比较。本发明的长效hGH缀合物之液体制剂表现出与Norditropin一样高或比其更高的贮存稳定性(表10)。在根据另一个实施方案的长期贮存稳定性的测试中，发现本发明的长效hGH缀合物之液体制剂使长效hGH缀合物的活性在高水平上维持6个月(表
11)。
11)。
[0052] 由于没有相伴的病毒污染危险以及简单且具有极佳的贮存稳定性，本发明的不含白蛋白的长效hGH缀合物之液体制剂(设计用于提供长效hGH缀合物的稳定性)与其他稳定剂或冷冻干燥剂相比具有经济效益。
[0053] 此外，由于本发明的液体制剂包含与天然形式相比具有更高的体内持久性的长效hGH缀合物，与典型的hGH制剂相比本发明的液体制剂允许蛋白质的活性长时间维持在高水平，因此可用作有效的药物制剂。
[0054] 本发明的有益效果
[0055] 根据本发明的包含pH5.0～6.0的缓冲剂、糖醇、盐和非离子表面活性剂的hGH缀合物之液体制剂不含人血清白蛋白和其他潜在受病毒污染的危险因素，并且可提供为由hGH多肽和免疫球蛋白Fc区构成的与天然相比具有更大分子量和体内持久性的长效hGH缀合物定制的极佳的贮存稳定性。
[0057] 通过以下结合附图的细节描述将更清楚地理解本发明的上述和其他目的、特征以及其他优势，其中：
[0058] 图1是如实施例4所述在长效hGH缀合物在多种pH值的缓冲剂中在4℃下贮存三个月期间通过IE-HPLC分析所述缀合物稳定性之后所获得的代表性IE-HPLC色谱图；和[0059] 图2是如实施例7所述在长效hGH缀合物在pH5.2的缓冲剂中在4℃下贮存六个月期间采用IE-HPLC分析所述缀合物稳定性之后所获得的图。
具体实施方式
[0060] 通过以下用于举例说明的实施例可获得对本发明更好的理解，但是这些实施例不被解释为限制本发明。
[0061] [实施例1]长效hGH缀合物的制备
[0062] 将ALD-PEG-ALD(IDB)(3.4kDa聚乙二醇，并且在每个末端具有醛基)与hGH(Mw 22 kDa)相缀合，之后与人IgG4来源的无糖基化Fc区(Mw 50 kDa)的N端相连接，然后纯化以提供hGH-PEG-Fc缀合物。
[0063] [实施例2]在盐存在或不存在下测定长效hGH缀合物的稳定性
[0064] 为了评价在盐存在或不存在下在包含缓冲剂、糖醇和非离子表面活性剂的制剂中的长效hGH缀合物的稳定性，将长效hGH缀合物在下表1的制剂中在25℃下贮存4周，之后使用离子交换色谱法(ion exchange chromatography，IEC)和尺寸排阻色谱法(size exclusion chromatography，SEC)分析其稳定性。在所述制剂中，将柠檬酸盐缓冲剂用作缓冲剂，甘露醇用作糖醇，以及聚山梨醇酯80用作非离子表面活性剂。在表2中，IE-HPLC(％)和SE-HPLC(％)表示为(面积％/初始面积％)，表明长效hGH缀合物与初始纯度相比的残余纯度(residual purity)。
[0065] 表1
[0066] [表1]
[0067]
[0068] 表2
[0069] [表2]
[0070]
[0071] 如从数据中理解的，与在不存在NaCl下的相比，当长效hGH缀合物在存在NaCl(尤其是150mM NaCl)下的含有5％甘露醇的制剂中在25℃下贮存4周的稳定性维持在显著较高水平。
[0072] [实施例3]针对糖醇测定长效hGH缀合物的稳定性
[0073] 长效hGH在包含作为稳定剂的缓冲剂、作为等渗剂的NaCl、非离子表面活性剂和糖醇的制剂中贮存期间检测糖醇对长效hGH之稳定性的影响。
[0074] 在所述制剂中，将柠檬酸缓冲剂(柠檬酸钠，pH5.2)用作缓冲剂、甘露醇或山梨醇用作糖醇，并且聚山梨醇酯80用作非离子表面活性剂。
[0075] 将长效hGH缀合物在下表3的制剂中在25℃下贮存4周，之后使用离子交换色谱法(IEC)和尺寸排阻色谱法(SEC)分析其稳定性。在表4中，IE-HPLC(％)和SE-HPLC(％)表示为(面积％/初始面积％)，表明长效hGH缀合物与初始纯度相比的残余纯度。
[0076] 表3
[0077] [表3]
[0078]
[0079] 表4
[0080] [表4]
[0081]
[0082] 如上表中可见的，糖醇甘露醇和山梨醇的稳定性类似。另外，将0.5％L-Arg-HCl添加至甘露醇对长效hGH缀合物之稳定性无影响。
[0083] [实施例4]针对缓冲剂的pH测定长效hGH缀合物的稳定性
[0084] 在多种pH值的缓冲剂中评价长效hGH的稳定性。在该情况中，将长效hGH缀合物在下表5的制剂中在4℃下贮存三个月，之后使用离子交换色谱法(IEC)分析其稳定性。在表6中，IE-HPLC(％)表示为(面积％/初始面积％)，表明长效hGH缀合物和杂质分别与作为主峰和杂质峰的初始纯度相比的残余纯度(图1)。
[0085] 表5
[0086] [表5]
[0087]
[0088] 表6
[0089] [表6]
[0090]
[0091] 贮存三个月之后，#6和#7杂质的含量在pH5.2下与在pH5.5和pH6.0下相比有所降低，说明长效hGH缀合物在pH5.2的缓冲剂中的稳定性有所改进(图1)。通过肽作图(peptide mapping)分析杂质，然后通过LC-MS/MS确定分子量。确定#6和#7杂质是脱氨基杂质。
[0092] [实施例5]针对非离子表面活性剂测定长效hGH缀合物的稳定性
[0093] 在包含非离子表面活性剂聚山梨醇酯80或20或者泊洛沙姆188作为稳定剂的制剂中在25℃下贮存4周后，使用SEC和IEC测定长效hGH缀合物的稳定性。在如见于表7的制剂中，将pH5.2的柠檬酸缓冲剂和甘露醇分别用作缓冲剂和糖醇。在表8中，IE-HPLC(％)和SE-HPLC(％)揭示了长效hGH缀合物与初始纯度相比的残余纯度。
[0094] 表7
[0095] [表7]
[0096]
[0097] ＊0.05mg/mL聚山梨醇酯80对应0.005％聚山梨醇酯80
[0098] 表8
[0099] [表8]
[0100]
[0101] A由于聚集沉淀，所以数据不可用
[0102] 如从数据中理解的，观察到在存在聚山梨醇酯80下长效hGH缀合物的稳定性有所提高。在聚山梨醇酯20的情况下，直到两周在长效缀合物的稳定性上未检出与聚山梨醇酯80的差异，但是在贮存4周后，它们之间的稳定性上有显著性差异(尽管聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80彼此非常类似)。另外，长效hGH缀合物在含有2mg/mL泊洛沙姆188的制剂中在25℃下贮存两周后发生聚集。
[0103] [实施例6]液体长效hGH缀合物与市售药物Norditropin之间稳定性的比较[0104] 通过与市售液体hGH制剂Norditropin(Novo Nordisk)相比较对由柠檬酸盐缓冲剂(pH5.2)、NaCl、甘露醇和聚山梨醇酯80(通过实施例2至5的稳定性测定而最终选定)构成的制剂的稳定化能力进行评价。Norditropin的浓度为10mg/mL并且其成分在下表9中给出。将它们在25℃下贮存4周。为了确认变化的多样性，使用如欧洲药典中描述的毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)和SEC测定Norditropin。另一方面，使用IEC和SEC分析本发明的长效hGH缀合物(原理上与CE测定类似)。结果在下表10中给出。CE(％)，或IE-HPLC(％)和SE-HPLC(％)表示长效hGH缀合物与初始纯度相比的残余纯度。
[0105] 表9
[0106] [表9]
[0107]
[0108] 表10
[0109] [表10]
[0110]
[0111] 如可见的，本发明的制剂确保hGH以与市售hGH制剂Norditropin一样高的水平或比其更高的水平进行稳定化。这些结果证明，本发明的长效hGH之液体制剂可为hGH提供极佳的贮存稳定性。
[0112] [实施例7]测定液体长效hGH缀合物的长期贮存稳定性
[0113] 为了评价由柠檬酸盐缓冲剂(pH5.2)、NaCl、甘露醇和聚山梨醇酯80构成的液体制剂的长期贮存稳定性，在所述制剂中在4℃下贮存六个月之后分析样品。结果在图2和表11中给出。IE-HPLC(％)、SE-HPLC(％)和蛋白质含量(％)揭示了长效hGH缀合物与初始纯度相比的残余纯度。
[0114] 表11
[0115] [表11]
[0116]
[0117] 观察到本发明的长效hGH缀合物在液体制剂中稳定超过6个月。
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