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基于树枝状大分子的组合物及其使用方法

阅读：1009发布：2020-07-29

专利汇可以提供基于树枝状大分子的组合物及其使用方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及新的 治疗 和诊断用树枝状大分子。特别地，本发明涉及基于树枝状大分子的用于 疾病 诊断和疗法的多功能组合物和系统(例如癌症诊断和疗法)。这些组合物和系统包含一种或多种用于靶向、成像、传感和/或提供治疗或诊断物质并且监测细胞或组织(例如 肿瘤 )对疗法的反应的组分。，下面是基于树枝状大分子的组合物及其使用方法专利的具体信息内容。

1.组合物，包含树枝状大分子，所述的树枝状大分子包含部分乙 酰化的第5代(G5)聚酰胺型胺(PAMAM)、聚丙胺(POPAM)或PAMAM-POPAM 树枝状大分子，所述的树枝状大分子包含用于缀合官能团的两个或更多 个反应位置。
2.权利要求1所述的组合物，其中所述的树枝状大分子包含两个 或更多个官能团，其中所述的官能团选自治疗剂、靶向剂、成像剂和生 物监测剂组成的组。
3.权利要求2所述的组合物，其中所述官能团中的至少一种与所 述的树枝状大分子通过酯键缀合。
4.权利要求2所述的组合物，其中所述的治疗剂包含甲氨蝶呤。
5.权利要求2所述的组合物，其中所述的靶向剂包含叶酸。
6.权利要求2所述的组合物，其中所述的靶向剂包含RGD肽。
7.权利要求2所述的组合物，其中所述的成像剂包含荧光剂。
8.权利要求7所述的组合物，其中所述的荧光剂包含异硫氰酸荧 光素。
9.权利要求7所述的组合物，其中所述的荧光剂包含6-TAMARA。
10.权利要求4所述的组合物，其中所述的甲氨蝶呤与所述的树枝 状大分子通过酯键缀合。
11.权利要求1所述的组合物，其中所述的树枝状大分子包含2- 20个反应位置。
12.权利要求2所述的组合物，其中所述的树枝状大分子与所述的 官能团缀合。
13.权利要求12所述的组合物，其中所述的缀合包含共价键、离 子键、金属键、氢键、范德瓦耳斯键、酯键或酰胺键。
14.权利要求2所述的组合物，其中所述的治疗剂包含化疗剂、抗 -致肿瘤剂、抗血管化剂、肿瘤抑制剂、抗微生物剂或包含编码治疗蛋 白的核酸的表达构建体。
15.权利要求14所述的组合物，其中所述的治疗剂被保护基保护。
16.权利要求15所述的组合物，其中所述的保护基选自对光不稳 定的保护基、对辐射不稳定的保护基和对酶不稳定的保护基组成的组。
17.权利要求1所述的组合物，其中所述的树枝状大分子包含被保 护的核心二胺。
18.权利要求1所述的组合物，其中所述的反应位置包含伯胺基。
19.组合物，包含树枝状大分子，所述的树枝状大分子包含部分乙 酰化的G5PAMAM、POPAM或PAMAM-POPAM树枝状大分子，所述的树枝状 大分子进一步包含一种或多种官能团，所述的一种或多种官能团选自治 疗剂、靶向剂和成像剂组成的组。
20.权利要求19所述的组合物，其中所述的治疗剂包含抗-致肿瘤 剂。
21.权利要求19所述的组合物，其中所述的治疗剂包含化疗剂。
22.权利要求19所述的组合物，其中所述的治疗剂包含甲氨蝶呤。
23.权利要求19所述的组合物，其中所述的治疗剂包含氚。
24.权利要求19所述的组合物，其中所述的靶向剂包含叶酸。
25.权利要求19所述的组合物，其中所述的靶向剂包含RGD肽。
26.权利要求19所述的组合物，其中所述的成像剂包含荧光剂。
27.权利要求26所述的组合物，其中所述的荧光剂包含异硫氰酸 荧光素。
28.权利要求26所述的组合物，其中所述的荧光剂包含6-TAMARA。
29.权利要求22所述的组合物，其中所述的甲氨蝶呤与所述的树 枝状大分子通过酯键缀合。
30.权利要求19所述的组合物，其中所述的治疗剂选自化疗剂、 抗-致肿瘤剂、抗血管化剂、肿瘤抑制剂、抗微生物剂和包含编码治疗 蛋白的核酸的表达构建体组成的组。
31.权利要求19所述的组合物，其中所述的治疗剂被保护基保护。
32.权利要求31所述的组合物，其中所述的保护基选自对光不稳 定的保护基、对辐射不稳定的保护基和对酶不稳定的保护基组成的组。
33.权利要求21所述的组合物，其中所述的化疗剂选自铂复合物、 维拉帕米、鬼臼毒素、卡铂、丙卡巴肼、氮芥、环磷酰胺、喜树碱、异 环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安(bisulfan)、亚硝基脲 (nitrosurea)、阿霉素、放线菌素D、柔红霉素、多柔比星、博来霉 素、普卡霉素(plicomycin)、丝裂霉素、博来霉素、依托泊苷、他莫 昔芬、紫杉醇、泰素、transplatinum、5-氟尿嘧啶、长春花新碱、长 春碱和甲氨蝶呤组成的组。
34.权利要求20所述的组合物，其中所述的抗-致肿瘤剂包含反义 核酸。
35.权利要求34所述的组合物，其中所述的反义核酸包含与癌基 因的RNA互补的序列。
36.权利要求35所述的组合物，其中所述的癌基因选自abl、 Bcl-2、Bcl-xL、erb、fms、gsp、hst、jun、myc、neu、raf、ras、ret、 src和trk组成的组。
37.权利要求30所述的组合物，其中所述的核酸编码选自肿瘤抑 制蛋白、细胞因子、受体、细胞凋亡诱导物和分化剂组成的组的蛋白质。
38.权利要求37所述的组合物，其中所述的肿瘤抑制蛋白选自 BRCA1、BRCA2、C-CAM、p16、p21、p53、p73、Rb和p27组成的组。
39.权利要求37所述的组合物，其中所述的细胞因子选自GMCSF、 IL-I、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、 IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IFN-β、IFN-γ和TNF组成的 组。
40.权利要求37所述的组合物，其中所述的受体选自CFTR、EGFR、 雌激素受体、IL-2受体和VEGFR组成的组。
41.权利要求37所述的组合物，其中所述的细胞凋亡诱导物选自 AdElB、Bad、Bak、Bax、Bid、Bik、Bim、Harakid和ICE-CED3蛋白酶 组成的组。
42.权利要求19所述的组合物，其中所述的治疗剂包含短半衰期 的放射性同位素。
43.权利要求19所述的组合物，其中所述的成像剂包含选自14C、 36Cl、57Co、58Co、51Cr、125I、131I、111Ln、152Eu、59Fe、67Ga、32P、186Re、35S、 75Se、Tc-99m和175Yb组成的组的放射性标记。
44.权利要求19所述的组合物，其中所述的靶向剂选自抗体、受 体配体、激素、维生素和抗原组成的组。
45.权利要求44所述的组合物，其中所述的抗体对疾病特异性抗 原具有特异性。
46.权利要求45所述的组合物，其中所述的疾病特异性抗原包含 肿瘤特异性抗原。
47.权利要求44所述的组合物，其中所述的受体配体选自CFTR配 体、FGFR配体、雌激素受体配体、FGR2配体、叶酸受体配体、IL-2受 体配体、糖蛋白、EGFR配体和VEGFR配体组成的组。
48.权利要求44所述的组合物，其中所述的受体配体为叶酸。
49.权利要求44所述的组合物，其中所述的受体配体为RGD肽。
50.治疗疾病的方法，包含给予患有或易感所述疾病的受试者治疗 有效量的权利要求19所述的组合物。
51.权利要求50所述的方法，其中所述的疾病为肿瘤性疾病。
52.权利要求51所述的方法，其中所述的肿瘤性疾病选自白血病、 急性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、成髓细胞 白血病、前髓细胞性白血病、粒-单核细胞型白血病、单核细胞性白血 病、红白血病、慢性白血病、慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性淋 巴细胞性白血病、真性红细胞增多、淋巴瘤、何杰金病、非何杰金病、 多发性骨髓瘤、特发性巨球蛋白血症、重链病、实体瘤、肉瘤和癌、纤 维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉 瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因 瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前 列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状 癌、乳头腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、 绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、维尔姆斯肿瘤、子宫颈癌、子宫癌、 睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细 胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞 瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、硬脑膜肉瘤、黑素瘤和神经母细胞瘤 视网膜成神经细胞瘤组成的组。
53.改变受试者肿瘤生长的方法，包含：
a)提供包含树枝状大分子的组合物，所述的树枝状大分子包含部 分乙酰化的G5 PAMAM、POPAM或PAMAM-POPAM树枝状大分子，所述的树 枝状大分子进一步包含一种或多种官能团，所述的一种或多种官能团选 自治疗剂、靶向剂和成像剂组成的组；和
b)在使所述的肿瘤生长改变的条件下给予所述的受试者所述的组 合物。
54.权利要求53所述的方法，其中所述的改变包含抑制所述的受 试者中的肿瘤生长。
55.权利要求53所述的方法，其中所述的改变包含减小所述受试 者中的所述肿瘤大小。
56.权利要求53所述的方法，其中将所述的包含树枝状大分子的 组合物与化疗剂或抗-致肿瘤剂共同给药。
57.权利要求53所述的方法，其中所述的改变肿瘤生长使所述的 肿瘤对化疗或抗-致癌疗法敏感。
58.权利要求53所述的方法，其中所述的治疗剂包含抗-致肿瘤 剂。
59.权利要求53所述的方法，其中所述的治疗剂包含化疗剂。
60.权利要求53所述的方法，其中所述的治疗剂包含甲氨蝶呤。
61.权利要求53所述的方法，其中所述的治疗剂包含氚。
62.权利要求53所述的方法，其中所述的靶向剂包含叶酸。
63.权利要求53所述的方法，其中所述的靶向剂包含RGD肽。
64.权利要求53所述的方法，其中所述的成像剂包含荧光剂。
65.权利要求53所述的方法，其中所述的荧光剂包含异硫氰酸荧 光素。
66.权利要求53所述的方法，其中所述的荧光剂包含6-TAMARA。
67.权利要求53所述的方法，其中所述的甲氨蝶呤与所述的树枝 状大分子通过酯键缀合。
68.权利要求53所述的方法，其中所述的治疗剂选自化疗剂、抗- 致癌剂、抗血管化剂、肿瘤抑制剂、抗微生物剂和包含编码治疗蛋白的 核酸的表达构建体组成的组。
69.权利要求53所述的方法，其中所述的治疗剂被保护基保护。
70.权利要求69所述的方法，其中所述的保护基选自对光不稳定 的保护基、对辐射不稳定的保护基和对酶不稳定的保护基组成的组。
71.权利要求59所述的方法，其中所述的化疗剂选自铂复合物、 维拉帕米、鬼臼毒素、卡铂、丙卡巴肼、氮介、环磷酰胺、喜树碱、异 环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安(bisulfan)、亚硝基脲 (nitrosurea)、阿霉素、放线菌素D、柔红霉素、多柔比星、博来霉 素、普卡霉素(plicomycin)、丝裂霉素、博来霉素、依托泊苷、他莫 昔芬、紫杉醇、泰素、transplatinum、5-氟尿嘧啶、长春新碱、长春 碱和甲氨蝶呤组成的组。
72.权利要求58所述的方法，其中所述的抗-致肿瘤剂包含反义核 酸。
73.权利要求72所述的方法，其中所述的反义核酸包含与癌基因 的RNA互补的序列。
74.权利要求73所述的方法，其中所述的癌基因选自abl、Bcl-2、 Bcl-xL、erb、fms、gsp、hst、jun、myc、neu、raf、ras、ret、src 和trk组成的组。
75.权利要求68所述的方法，其中所述的核酸编码选自肿瘤抑制 蛋白、细胞因子、受体、细胞凋亡诱导物和分化剂组成的组的蛋白质。
76.权利要求75所述的方法，其中所述的肿瘤抑制蛋白选自 BRCA1、BRCA2、C-CAM、p16、p21、p53、p73、Rb和p27组成的组。
77.权利要求75所述的方法，其中所述的细胞因子选自GMCSF、 IL-I、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、 IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IFN-β、IFN-γ和TNF组成的 组。
78.权利要求75所述的方法，其中所述的受体选自CFTR、EGFR、 雌激素受体、IL-2受体和VEGFR组成的组。
79.权利要求75所述的方法，其中所述的细胞凋亡诱导物选自 AdElB、Bad、Bak、Bax、Bid、Bik、Bim、Harakid和ICE-CED3蛋白酶 组成的组。
80.权利要求53所述的方法，其中所述的治疗剂包含短半衰期的 放射性同位素。
81.权利要求53所述的方法，其中所述的成像剂包含选自14C、36Cl、 57Co、58Co、51Cr、125I、131I、111Ln、152Eu、59Fe、67Ga、32P、186Re、35S、75Se、 Tc-99m和175Yb组成的组的放射性标记。
82.权利要求53所述的方法，其中所述的靶向剂选自抗体、受体 配体、激素、维生素和抗原组成的组。
83.权利要求82所述的方法，其中所述的抗体对疾病特异性抗原 具有特异性。
84.权利要求83所述的方法，其中所述的疾病特异性抗原包含肿 瘤特异性抗原。
85.权利要求82所述的方法，其中所述的受体配体选自CFTR配体、 FGFR配体、雌激素受体配体、FGR2配体、叶酸受体配体、IL-2受体配 体、糖蛋白、EGFR配体和VEGFR配体组成的组。
86.权利要求82所述的方法，其中所述的受体配体为叶酸。
87.权利要求82所述的方法，其中所述的受体配体为RGD肽。
88.权利要求53所述的方法，其中所述的肿瘤与肿瘤性疾病相关。
89.权利要求88所述的方法，其中所述的肿瘤性疾病选自白血病、 急性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、成髓细胞 白血病、前髓细胞性白血病、粒-单核细胞型白血病、单核细胞性白血 病、红白血病、慢性白血病、慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性淋 巴细胞性白血病、真性红细胞增多、淋巴瘤、何杰金病、非何杰金病、 多发性骨髓瘤、特发性巨球蛋白血症、重链病、实体瘤、肉瘤和癌、纤 维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉 瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因 瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前 列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状 癌、乳头腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、 绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、维尔姆斯肿瘤、子宫颈癌、子宫癌、 睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细 胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞 瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、硬脑膜肉瘤、黑素瘤和神经母细胞瘤 视网膜成神经细胞瘤组成的组。

说明书全文

发明领域

本发明涉及新的治疗和诊断用树枝状大分子(dendrimers)。特 别地，本发明涉及基于树枝状大分子的用于疾病诊断和疗法的多功能 组合物和系统(例如癌症诊断和疗法)。这些组合物和系统包含一种或 多种用于靶向、成像、传感和/或提供治疗或诊断物质并且监测细胞或 组织(例如肿瘤)对疗法的反应的组分。

发明背景

癌症在美国是第二位的主要死亡原因，使得每4个死亡病例中就 有1个癌症。在1997年，据估计的新的肺癌、乳腺癌、前列腺癌、结 肠直肠癌和卵巢癌的诊断总数约为2百万。由于在美国老龄化人群始 终在增加，所以合理的预计是癌症的发病率会持续增长。
目前使用各种方式治疗癌症，包括手术、放疗和化疗。治疗方式 的选择取决于癌症的类型、位置和散布。例如，许多常见的肿瘤，诸 如结肠癌对可利用的疗法难以起反应。
就对目前方法起反应的肿瘤类型而言，仅部分癌症对疗法的反应 充分。此外，尽管对许多癌症的疗法得到改善，但是最新使用的活性 剂存在严重的副作用。这些副作用通常限制了化疗剂的应用并且导致 大部分癌症没有任何治疗选择。其它类型的治疗尝试，诸如基因疗法 或免疫疗法可以证实为更具有特异性的并且比化疗的副作用少。然而， 尽管在几个临床试验中表现出了一定的进展，但是这些手段的实际应 用在目前仍然有限。
尽管现存疗法的成功有限，但是对肿瘤细胞的基础生物学的理解 已经得到发展。目前鉴定了涉及瘤性转化的细胞性活动和改变的细胞 生长并且已经记录了几种人体肿瘤的癌发生中的多个步骤(例如，参见 Isaacs，Cancer 70：1810(1992))。已经鉴定了导致无法调节的细胞 生长的癌基因并且将其表征为遗传来源和功能。已经详细表征了调节 细胞复制周期的特异性途径并且已经克隆和表征了这种调节中涉及的 蛋白质。此外，已经详细阐明了介导细胞凋亡反向调节细胞生长的分 子(Kerr等，Cancer 73：2013(1994))。目前已经证实操纵这些细胞调 节途径能够终止肿瘤细胞中生长并且诱导其中的细胞凋亡(例如，参见 Cohen和Tohoku，Exp.Med.，168：351(1992)；和Fujiwara等J.Natl. Cancer Inst.，86：458(1994))。控制肿瘤细胞中的细胞生长和复制 是重要的治疗靶标。
尽管已经取得了令人注目的成就，但是在这些疗法可以应用于体 内治疗癌细胞前，仍然存在许多阻碍。例如，这些疗法需要鉴定个体 特定肿瘤细胞的特异性病理生理学改变。这就要求对肿瘤的机械性侵 害(活组织检查)和一般通过体外细胞培养和测试进行诊断。然后在可 以选择和执行疗法前必须分析肿瘤表型。这类步骤是耗时、复杂和昂 贵的。
对与正常细胞相比，对肿瘤细胞具有选择性的治疗方法存在需求。 目前的疗法仅对治疗细胞具有相对特异性。尽管肿瘤靶向解决了这一 选择性问题，但是它仍然是不足的，因为肿瘤不具有独特的抗原。此 外，理想的是疗法应具有平行起作用以防止选择抗性肿瘤的几种不同 作用机制，并且在验证肿瘤位置和类型后可以由临床医师解除。最后， 理想的是，疗法应能够使临床医师在治疗前后即刻鉴定残留或最低程 度的疾病，并且监测对疗法的反应。这是关键的，因为几个残留的细 胞就可能导致再生长，或恶化，产生对疗法产生抗性的肿瘤。鉴定疗 法结束时残留的疾病(即非肿瘤再生长后)可以有利于根除少许剩余的 肿瘤细胞。
因此，理想的疗法应具有靶向肿瘤，使肿瘤的程度(即肿瘤转移) 成像和鉴定在肿瘤细胞中存在治疗剂的能力。因此，需要使临床医师 能够基于肿瘤细胞中的病理生理学异常选择治疗分子的疗法，以便在 在异常细胞中激活治疗剂，记录对疗法的反应，并且鉴定残留的疾病。
发明概述
本发明涉及新的治疗和诊断用树枝状大分子。特别地，本发明涉 及基于树枝状大分子的用于疾病诊断和疗法(例如癌症诊断和疗法)的 多功能组合物和系统。这些组合物和系统包含一种或多种靶向、成像、 传感和/或提供治疗或诊断物质并且监测细胞或组织(例如肿瘤)对疗 法的反应的组分。
因此，在某些实施方案中，本发明提供了包含树枝状大分子的组 合物，所述的树枝状大分子包含部分乙酰化的第五代5(G5)树枝状大 分子(例如聚酰胺型胺(polyamideamine)(PAMAM)、聚丙胺(POPAM) 或PAMAM-POPAM树枝状大分子)，该树枝状大分子进一步包含一种或多 种官能团。本发明并不限于G5树枝状大分子的应用。在某些实施方案 中，一种或多种官能团包括治疗剂、靶向剂和/或成像剂。在某些实施 方案中，官能团中的至少一种通过酯键与树枝状大分子缀合。在优选 的实施方案中，治疗剂包括化疗化合物(例如甲氨蝶呤)。在某些优选 的实施方案中，化疗化合物通过酯键与树枝状大分子缀合。在某些优 选的实施方案中，靶向剂包括叶酸。在其它优选的实施方案中，成像 剂包括异硫氰酸荧光素或其它可检测标记。在某些实施方案中，官能 团为治疗剂、靶向剂或生物监测剂之一。在某些实施方案中，G5树枝 状大分子与官能团缀合。在某些实施方案中，缀合包含共价键、离子 键、金属键、氢键、范德瓦耳斯键、酯键或酰胺键。
在本发明的某些实施方案中，治疗剂包括但不限于化疗剂、抗- 致肿瘤剂、抗血管化剂、肿瘤抑制剂、抗微生物剂或包含编码治疗蛋 白的核酸的表达构建体，尽管本发明并不受限于治疗剂的性质。在其 它实施方案中，用选自对光不稳定的保护基、对放射不稳定的保护基 和对酶不稳定的保护基的保护基保护治疗剂。在某些实施方案中，化 疗剂选自铂复合物、维拉帕米、鬼臼毒素、卡铂、丙卡巴肼、 mechloroethamine、环磷酰胺、喜树碱、异环磷酰胺、美法仑、苯丁 酸氮芥、白消安(bisulfan)、亚硝基脲(nitrosurea)、阿霉素、 放线菌素D、柔红霉素、多柔比星、博来霉素、普卡霉素(plicomycin)、 丝裂霉素、博来霉素、依托泊苷、他莫昔芬、紫杉醇、泰素、 transplatinum、5-氟尿嘧啶、长春花新碱、长春碱和甲氨蝶呤组成的 组，但不限于它们。在某些实施方案中，抗-致肿瘤剂包含反义核酸(例 如RNA分子)。在某些实施方案中，反义核酸包含与癌基因的RNA互补 的序列。在优选的实施方案中，癌基因包括但不限于：abl、Bcl-2、 Bcl-xL、erb、fms、gsp、hst、jun、myc、neu、raf；ras、ret、src 或trk。在某些实施方案中，编码治疗蛋白的核酸编码因子，包括但 不限于肿瘤抑制蛋白、细胞因子、受体、细胞凋亡诱导物和分化剂。 在优选的实施方案中，肿瘤抑制蛋白包括但不限于BRCA1、BRCA2、 C-CAM、p16、p21、p53、p73、Rb和p27。在优选的实施方案中，细胞 因子包括但不限于GMCSF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、 IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、 β-干扰素、γ-干扰素和TNF。在优选的实施方案中，受体包括但不限 于CFTR、EGFR、雌激素受体、IL-2受体和VEGFR。在优选的实施方案 中，细胞凋亡诱导物包括但不限于AdE1B、Bad、Bak、Bax、Bid、Bik、 Bim、Harakid和ICE-CED3蛋白酶。在某些实施方案中，治疗剂包含 短半衰期的放射性同位素。
本发明并不限于所用抗癌剂或化疗剂的类型(例如与本发明的树 枝状大分子缀合)。实际上，预期可用于本发明的各种抗癌剂和化疗剂 包括但不限于：阿西维辛；阿柔比星；盐酸阿考达唑；阿克罗宁；阿 多来新；多柔比星；阿地白介素；阿利维A酸；别嘌醇钠；六甲蜜胺； 安波霉素；醋酸阿美蒽醌；氨鲁米特；安吖啶；阿那曲唑；Annonaceous Acetogenins；氨茴霉素；Asimicin；门冬酰胺酶；曲林菌素；阿扎胞 苷；阿扎替派；阿佐霉素；巴马司他；苯佐替派；贝沙罗汀；比卡鲁 胺；盐酸比生群；二甲磺酸双奈法德；比折来新；硫酸博来霉素；布 喹那钠；溴匹立明；Bullatacin；白消安；卡麦角林；放线菌素C； 卡普睾酮；卡醋胺；卡醋胺；卡铂；卡莫司汀；盐酸卡柔比星；卡折 来新；Cedefingol；塞来考昔；苯丁酸氮芥；西罗霉素；顺铂；克拉 屈滨；甲磺酸克立那托；环磷酰胺；阿糖胞苷；达卡巴嗪；DACA(N-[2-(二 甲基-氨基)乙基]吖啶-4-甲酰胺)；放线菌素D；盐酸柔红霉素；柔红 霉素；地西他滨；地尼白介素-毒素连接物；右奥马铂；地扎胍宁；甲 磺酸地扎胍宁；地吖醌；多西他赛；多柔比星；盐酸多柔比星；屈洛 昔芬；柠檬酸屈洛昔芬；丙酸甲雄烷酮；达佐霉素；依达曲沙；盐酸 依氟鸟氨酸；依沙芦星；恩洛铂；恩普氨酯；依匹哌啶；盐酸表柔比 星；厄布洛唑；盐酸依索比星；雌莫司汀；雌二醇氮芥磷酸钠；依他 硝唑；乙碘油I 131；依托泊苷；磷酸依托泊苷；氯苯乙嘧胺；盐酸 法罗唑啉；法扎拉滨；芬维A胺；氟脲嘧啶脱氧核苷；磷酸氟达拉滨； 氟尿嘧啶；5-FdUMP；氟西他滨；磷喹酮；福司曲星钠；FK-317；FK-973； FR-66979；FR-900482；吉西他滨；盐酸吉西他滨(Geimcitabine Hydrochloride)；吉姆单抗奥佐米星(Gemtuzumab Ozogamicin)； Gold Au 198；醋酸戈舍瑞林；Guanacone；羟基脲；盐酸伊达比星； 异环磷酰胺；伊莫福新；干扰素α-2a；干扰素α-2b；干扰素α-n1；干 扰素α-n3；干扰素β-Ia；干扰素γ-Ib；异丙铂；盐酸依立替康； 醋酸兰瑞肽；来曲唑；醋酸亮丙瑞林；盐酸利阿唑；洛美曲索钠；洛 莫司汀；盐酸洛索蒽醌；马索罗酚；美登素；盐酸氮芥；醋酸甲地孕 酮；醋酸美仑孕酮；美法仑；美诺立尔；巯嘌呤；甲氨蝶呤；甲氨蝶 呤钠；甲氧沙林；氯苯氨啶；美妥替哌；米丁度胺；Mitocarcin；丝 裂红素；米托洁林；米托马星；丝裂霉素；丝裂霉素C；米托司培； 米托坦；盐酸米托蒽醌；麦考酚酸；诺考达唑；诺拉霉素；奥普瑞白 介素；奥马铂；奥昔舒仑；紫杉醇；帕米膦酸二钠；培门冬酶；培利 霉素；溴新斯的明；硫酸培来霉素；培磷酰胺；哌泊溴烷；哌泊舒凡； 盐酸吡罗蒽醌；普卡霉素；普洛美坦；卟吩姆钠；泊非霉素；泼尼莫 司汀；盐酸甲基苄肼；嘌罗霉素；盐酸嘌呤霉素；吡唑呋喃菌素；利 波腺苷；美罗华；罗谷亚胺；Rolliniastatin；沙芬戈；盐酸沙芬戈； 钐/Lexidronam；司莫司汀；辛曲秦；磷乙酰天冬氨酸钠；司帕霉素； 盐酸螺旋锗；螺莫司汀；螺铂；Squamocin；Squamotacin；链黑霉素； 链佐星；氯化锶Sr 89；磺氯苯脲；他利霉素；紫杉烷(Taxane)； 紫杉烷(Taxoid)；替可加兰钠；替加氟；盐酸替洛蒽醌；替莫泊芬； 替尼泊苷；替罗昔隆；睾内酪；硫咪嘌呤；硫鸟嘌呤；塞替派；Thymitaq； 噻唑呋林；替拉扎明；雷替曲噻；TOP-53；盐酸拓扑替康；枸橼酸托 瑞米芬；曲妥单抗；醋酸7-甲诺酮；磷酸曲西立滨；三甲曲沙；葡萄 糖醛酸三甲曲沙；曲普瑞林；盐酸妥布氯唑；乌拉莫司汀；乌瑞替派； 戊柔比星；伐普肽；维替泊芬；长春碱；硫酸长春碱；长春新碱；硫 酸长春新碱；长春地辛；硫酸长春地辛；硫酸长春匹定；硫酸长春甘 酯；硫酸环氧长春碱；酒石酸长春瑞滨；硫酸异长春碱；硫酸长春利 定；伏氯唑；折尼铂；净司他丁；盐酸佐柔比星；2-氯脱氧腺苷；2′- 脱氧间型霉素；9-氨基喜树碱；雷替曲塞；N-炔丙基-5，8-二脱氮杂叶 酸(dideazafolic ac d)；2-氯-2′-阿拉伯糖(arabino)-氟-2′- 脱氧腺苷；2-氯-2′-脱氧腺苷；茴香霉素；曲古抑菌素A；hPRL-G129R； CEP-751；利诺胺；芥子气；氮芥(nitrogen mustard)(氮芥 (mechlorethamine))；环磷酰胺；美法仑；苯丁酸氮芥；异环磷酰 胺；白消安；N-甲基-N-亚硝基脲(MNU)；N，N′-双(2-氯乙基)-N-亚硝 基脲(BCNU)；N-(2-氯乙基)-N′-环己基-N-亚硝基脲(CCNU)；N-(2-氯 乙基)-N′-(反式-4-甲基环己基-N-亚硝基脲(MeCCNU)；N-(2-氯乙 基)-N′-(二乙基)乙基膦酸-N-亚硝基脲(福莫司汀)；链脲菌素；达卡 巴嗪(diacarbazine)(DTIC)；米托唑胺；替莫唑胺；塞替派；丝裂 霉素C；AZQ；阿多来新；顺铂；卡铂；奥马铂；奥沙利铂；C1-973； DWA 2114R；JM216；JM335；双(铂)；拓优得；阿扎胞苷；阿糖胞苷； 吉西他滨；6-巯嘌呤；6-硫鸟嘌呤；次黄嘌呤；替尼泊苷；9-氨基喜 树碱；托泊替康；CPT-11；多柔比星；柔红霉素；表柔比星；依达比 星；米托蒽醌；洛索蒽醌；放线菌素D(Dactinomycin)(放线菌素D (Actinomycin D))；安吖啶；吡唑啉吖啶；全反式视黄醇；14-羟基 -反视黄醇；全反式维甲酸；N-(4-羟苯基)retinamide；13-顺式维A 酸；3-甲基TTNEB；9-顺式维A酸；氟达拉滨(2-F-ara-AMP)；和2- 氯脱氧腺苷(2-Cda)。
其它抗癌剂和化疗剂包括抗增殖药(例如异硫代硫酸吡曲克辛)、 抗前列腺肥大药(例如西托糖苷)、良性前列腺增治疗剂(例如盐酸坦洛 新)、前列腺生长抑制剂(例如喷托孟)和放射性试剂。
其它抗癌剂和化疗剂可以包含抗癌补充强化剂，包括三环抗抑郁 药(例如丙米嗪、地昔帕明、阿米替林、氯米帕明、曲米帕明、多塞平、 去甲替林、普罗替林、阿莫沙平和马普替林)；非-三环抗抑郁药(例如 舍曲林、曲唑酮和西酞普兰)；Ca++拮抗剂(例如维拉帕米、硝苯地平、 尼群地平和卡罗维林)；钙调素抑制剂(例如普尼拉明、三氟拉嗪和氯 米帕明)；两性霉素B；曲帕拉醇类似物(例如他莫昔芬)；抗心律失常 药(例如奎尼丁)；抗高血压药(例如利舍平)；thiol depleters(例如 buthionine和sulfoximine)和多重抗药性缓解剂，诸如Cremaphor EL。
其它抗癌剂和化疗剂为那些选自下列组成的组的抗癌剂和化疗 剂：annonaceous acetogenins；asimicin；rolliniastatin； guanacone、squamocin、bullatacin；squamotacin；紫杉烷类；紫 杉醇；吉西他滨；甲氨蝶呤FR-900482；FK-973；FR-66979；FK-317； 5-FU；FUDR；FdUMP；羟基脲；多西他赛；discodermolide；埃坡霉 素；长春新碱；长春碱；长春瑞滨；meta-pac；伊立替康；SN-38；10-OH campto；托泊替康；依托泊苷；多柔比星；flavopiridol；Cis-Pt； carbo-Pt；博来霉素；丝裂霉素C；普卡霉素；卡培他滨；阿糖胞苷； 2-C1-2′脱氧腺苷；氟达拉滨-PO.sub.4；米托蒽醌；米托唑胺；喷司 他丁；和雷替曲塞。
其它抗癌剂和化疗剂包含紫杉烷类(例如紫杉醇和多西他赛)。在 某些实施方案中，抗癌剂和化疗剂包含他莫昔芬或芳香酶抑制剂瑞宁 得(例如阿那曲唑)。
在本发明的某些实施方案中，生物监测剂包含测定治疗剂作用的 试剂(例如直接或间接测定细胞因子或治疗剂诱导的反应)，然而，本 发明并不受限于生物监测剂的性质。在某些实施方案中，所述的监测 剂能够测定治疗剂的量或检测由治疗剂引起的细胞凋亡。
在本发明的某些实施方案中，成像剂包含放射性标记，包括但不 限于14C、36Cl、57Co、58Co、51Cr、125I、131I、111Ln、152Eu、59Fe、67Ga、32P、 186Re、35S、75Se、Tc-99m和175Yb。在某些实施方案中，成像剂包含荧 光本体。在一个优选的实施方案中，成像剂为异硫氰酸荧光素或 6-TAMARA。
在本发明的某些实施方案中，靶向剂包括但不限于抗体、受体配 体、激素、维生素和抗原，不过，本发明并不受限于靶向剂的性质。 在某些实施方案中，抗体对疾病特异性抗原具有特异性。在某些优选 的实施方案中，疾病特异性抗原包含肿瘤特异性抗原。在某些实施方 案中，受体配体包括但不限于CFTR、FGFR、雌激素受体、FGR2、叶酸 受体、IL-2受体、糖蛋白和VEGFR的配体。在一个优选的实施方案中， 受体配体为叶酸。可用于本发明的其它实施方案描述在美国专利US 6,471,968和WO 01/87348中，将这些文献各自完整地引入本文作为 参考。
在某些实施方案中，本发明的树枝状大分子(例如G5PAMAM树枝 状大分子)含有表面上的2-250，10-200或100-150个反应位置(例如 参见实施例13)。在优选的实施方案中，反应位置包含伯胺基。在某 些实施方案中，树枝状大分子含有50-250个反应位置。在某些实施方 案中，树枝状大分子包含150-400个反应位置。在优选的实施方案中， 反应位置与官能团缀合，所述的官能团包括但不限于治疗剂(例如甲氨 蝶呤)、靶向剂(例如叶酸)、成像剂(例如FITC)和生物监测剂。
在某些实施方案中，在单一树枝状大分子上可以形成多个拷贝的 官能团中的任意一种(例如治疗剂)。因此，在某些实施方案中，单一 树枝状大分子包含2-100个拷贝的单一官能团(例如治疗剂，诸如甲氨 蝶呤)。在某些实施方案中，树枝状大分子包含2-5，5-10，10-20或 20-50个拷贝的单一官能团。在某些实施方案中，树枝状大分子包含 5-20个拷贝。在某些实施方案中，树枝状大分子包含50-100或100-200 个拷贝的官能团(例如治疗剂、靶向剂或成像剂)。在某些实施方案中， 树枝状大分子包含200个以上拷贝的官能团。本发明进一步提供了包 含两种或多种不同官能团的多个拷贝的树枝状大分子。在某些实施方 案中，本发明提供了包含一种类型的官能团(例如治疗剂，诸如甲氨蝶 呤，或本文所讨论的其它靶向剂中的任意一种)的多个拷贝(例如 2-10，5-10，10-15，15-50，50-100，100-200或200个以上拷贝) 和第二中类型的官能团(例如靶向剂，诸如叶酸或本文所述的其它靶向 剂中的任意一种)的多个拷贝(例如2-10，15-50，50-100，100-200 或200个以上拷贝)的树枝状大分子。在某些实施方案中，树枝状大分 子包含2-10种不同官能团的多个拷贝。例如，在某些实施方案中，基 于本发明研发过程中产生的数据(例如表示树枝状大分子可以含有 100-150个不同位置(例如反应位置，诸如伯胺基)，缀合官能团(例如 参见实施例13)的数据，树枝状大分子可以含有2-100个拷贝的治疗 剂(例如甲氨蝶呤)，2-100个拷贝的靶向剂(例如叶酸)和2-100个拷 贝的成像剂(例如FITC或6-TAMARA)。
本发明还提供了制备树枝状大分子的方法，该方法包含一个或多 个步骤(以任意顺序)：乙酰化G5树枝状大分子而生成部分乙酰化的树 枝状大分子；使成像剂(例如异硫氰酸荧光素)与部分乙酰化的树枝状 大分子缀合而生成单官能树枝状大分子；使靶向剂(例如叶酸)与部分 乙酰化的单官能树枝状大分子缀合以便生成双官能树枝状大分子；使 缩水甘油与部分乙酰化的双官能树枝状大分子缀合；并且使治疗剂(例 如甲氨蝶呤)与部分乙酰化的双官能缩水甘油化(glycidylated)双官 能树枝状大分子缀合。在优选的实施方案中，按照下列步骤产生G5 树枝状大分子：(a)获得引发剂核心脂族二胺；(b)进行与Michael 接受体的Michael反应；(c)与单保护的二胺 NH2-(CH2)n-NHPG(n＝1-10)缩合；和(d)重复步骤(a)-(c)；其中在每 代的酰胺形成过程中使用单保护的二胺。本发明并不受限于选择的引 发剂核心脂族二胺的性质。在某些实施方案中，引发剂核心脂族二胺 选自包括下列物质的组，但不限于它们：NH2-(CH2)n-NH2(n＝1-10)； NH2-(CH2)n-NHPG，(n＝1-10)；NH2-((CH2)nNH2)3(n＝1-10)；或未被取代 或取代的1，2-；1，3-；或1，4-亚苯基二-正-烷基胺。在一个优选的实 施方案中，Michael接受体为丙烯酸甲酯。在某些实施方案中，所用 的保护基(PG)选自包括下列物质的组，但不限于它们：叔丁氧基氨基 甲酸酯(N-t-Boc)、烯丙氧基氨基甲酸酯(N-Alloc)、苄基氨基甲酸酯 (N-Cbz)、9-芴基甲基氨基甲酸酯(FMOC)或邻苯二甲酰亚胺(Phth)。
本发明还提供了包含树枝状大分子的组合物，所述的树枝状大分 子包含被保护的核心二胺。在某些实施方案中，树枝状大分子包含聚 酰胺型胺(PAMAM)、聚丙胺(POPAM)或PAMAM-POPAM树枝状大分子。在 特别优选的实施方案中，核心二胺为单保护的。在某些实施方案中， 核心二胺为NH2-(CH2)n-NHPG(n＝1-10)。在优选的实施方案中，被保 护的核心二胺为NH2-CH2-CH2-NHPG。在某些实施方案中，被保护的核 心二胺包含保护基(PG)，保护基选自包括下列的组，但不限于它们： 叔丁氧基氨基甲酸酯(N-t-Boc)、烯丙氧基氨基甲酸酯(N-Alloc)、苄 基氨基甲酸酯(N-Cbz)、9-芴基甲基氨基甲酸酯(FMOC)或邻苯二甲酰亚 胺(Phth)。在优选的实施方案中，树枝状大分子为部分乙酰化的。在 特别优选的实施方案中，树枝状大分子与官能团缀合。
本发明还提供了制备包含被保护的核心二胺的树枝状大分子的方 法，该方法包含下列步骤：a)使用单保护的引发剂核心脂族二胺 NH2-(CH2)n-NHPG，(n＝1-10)；b)进行与Michael接受体的Michael反 应；(c)与单保护的二胺的等效物缩合；和(d)重复步骤(a)-(c)； 其中在每代的酰胺形成过程中使用单保护的引发剂核心脂族二胺。在 一个优选的实施方案中，Michael受体为丙烯酸甲酯。在某些实施方 案中，每次重复产生新的一代(G＝1-10)的带有表面氨基的重复单元 的共价结合的放射状外壳。在某些实施方案中，保护基(PG)包含叔丁 氧基氨基甲酸酯(N-t-Boc)、烯丙氧基氨基甲酸酯(N-Alloc)、苄基氨 基甲酸酯(N-Cbz)、9-芴基甲基氨基甲酸酯(FMOC)或邻苯二甲酰亚胺 (Phth)。
本发明还提供了制备包含树枝状大分子的组合物的方法，该方法 包含下列步骤：a)使用单保护的引发剂核心脂族二胺；b)进行与 Michael接受体的Michael反应；(c)与单保护的二胺 NH2-(CH2)n-NHPG，(n＝1-10)缩合；和(d)重复步骤(a)-(c)；其中在每 代的酰胺形成过程中使用单保护的二胺。本发明并不受限于选择的引 发剂核心二胺的性质。在某些实施方案中，引发剂核心脂族二胺选自 包括下列物质的组，但不限于它们：NH2-(CH2)n-NH2(n＝1-10)， NH2-((CH2)nNH2)3(n＝1-10)；或未被取代或取代的1，2-；1，3-；或1，4- 亚苯基二-正-烷基胺。在一个优选的实施方案中，Michael接受体为 丙烯酸甲酯。在某些实施方案中，每次重复产生新的一代(G＝1-10) 的带有表面氨基的重复单元的共价结合的放射状外壳。在某些实施方 案中，保护基(PG)包含叔丁氧基氨基甲酸酯(N-t-Boc)、烯丙氧基氨基 甲酸酯(N-Alloc)、苄基氨基甲酸酯(N-Cbz)、9-芴基甲基氨基甲酸酯 (FMOC)或邻苯二甲酰亚胺(Phth)。
本发明还提供了治疗疾病(例如癌症或感染性疾病)的方法，包含 给予患有或易感疾病的受试者治疗有效量的包含本发明树枝状大分子 的组合物。在优选的实施方案中，配置本发明的树枝状大分子，使得 它们易于从受试者中清除(例如以便在有效剂量下极少至几乎不可检 测出毒性)。在某些实施方案中，所述的疾病为肿瘤性疾病，其选自但 不限于白血病、急性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性 白血病、成髓细胞白血病、前髓细胞性白血病、粒-单核细胞型白血病、 单核细胞性白血病、红白血病、慢性白血病、慢性髓细胞性(粒细胞性) 白血病、慢性淋巴细胞性白血病、真性红细胞增多、淋巴瘤、何杰金 病、非何杰金病、多发性骨髓瘤、特发性巨球蛋白血症、重链病、实 体瘤、肉瘤和癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、骨源性 肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、 滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺 癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、 汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管 癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、维 尔姆斯肿瘤、子宫颈癌、子宫癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀 胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管 瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质 瘤、硬脑膜肉瘤、黑素瘤和神经母细胞瘤视网膜成神经细胞瘤 (neuroblastomaretinoblastoma)。在某些实施方案中，所述的疾 病为炎性疾病，其选自下列疾病组成的组，但不限于它们：湿疹、炎 性肠病、类风湿性关节炎、哮喘、牛皮癣、局部缺血/再灌注损伤、溃 疡性结肠炎和急性呼吸窘迫综合征。在某些实施方案中，所述的疾病 为病毒性疾病，其选自下列疾病组成的组，但不限于它们：由下列病 毒导致的病毒性疾病：乙型肝炎病毒；丙型肝炎病毒；轮状病毒；人 免疫缺陷症病毒I型(HIV-I)；人免疫缺陷症病毒II型(HIV-II)；人 嗜T淋巴细胞病毒I型(HTLV-I)；人嗜T淋巴细胞病毒II型(HTLV-II)； AIDS；DNA病毒，诸如乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒；细小病毒，诸 如腺伴随病毒和巨细胞病毒；乳多空病毒，诸如乳头瘤病毒、多瘤病 毒和SV40；腺病毒；疱疹病毒，诸如单纯疱疹I型(HSV-I)、单纯疱 疹II型(HSV-II)和EB病毒；痘病毒，诸如天花(天花)和痘苗病毒； 和RNA病毒，诸如人免疫缺陷症病毒I型(HIV-I)、人免疫缺陷症病毒 II型(HIV-II)、人嗜T淋巴细胞病毒I型(HTLV-I)、人嗜T淋巴细胞 病毒II型(HTLV-II)、流感病毒、麻疹病毒、狂犬病毒、仙台(Sendai) 病毒、小核糖核酸病毒，诸如细小核糖核酸病毒、柯萨奇病毒、鼻病 毒、呼肠孤病毒、披膜病毒类，诸如德国麻疹病毒(德国麻疹)和塞姆 利基森林病毒、虫传病毒和甲型肝炎病毒。
本发明还提供了治疗疾病的方法，包含给予患有或易感疾病的受 试者治疗有效量的包含本发明树枝状大分子的组合物，所述的树枝状 大分子包含部分乙酰化的G5PAMAM、POPAM或PAMAM-POPAM树枝状 大分子，该树枝状大分子进一步包含一种或多种官能团，所述的一种 或多种官能团选自治疗剂、靶向剂和成像剂组成的组。在某些实施方 案中，所述的疾病为肿瘤性疾病。在某些实施方案中，所述的肿瘤性 疾病选自白血病、急性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞 性白血病、成髓细胞白血病、前髓细胞性白血病、粒-单核细胞型白血 病、单核细胞性白血病、红白血病、慢性白血病、慢性髓细胞性(粒细 胞性)白血病、慢性淋巴细胞性白血病、真性红细胞增多、淋巴瘤、何 杰金病、非何杰金病、多发性骨髓瘤、特发性巨球蛋白血症、重链病、 实体瘤、肉瘤和癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、骨源 性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉 瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、 胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺 癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头腺癌、囊腺癌、髓样癌、支 气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、 维尔姆斯肿瘤、子宫颈癌、子宫癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、 膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽 管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶 质瘤、硬脑膜肉瘤、黑素瘤和神经母细胞瘤视网膜成神经细胞瘤组成 的组。
本发明还提供了改变受试者肿瘤生长的方法，包含提供包含树枝 状大分子的组合物，所述的树枝状大分子包含部分乙酰化的树枝状大 分子，该树枝状大分子进一步包含一种或多种官能团，所述的一种或 多种官能团选自治疗剂、靶向剂和成像剂组成的组；并且在使得肿瘤 生长得到改变的条件下给予受试者所述的组合物。在某些实施方案中， 改变包含抑制受试者肿瘤生长。在某些实施方案中，改变包含减小受 试者中的肿瘤大小。在某些实施方案中，将包含树枝状大分子的组合 物与化疗剂或抗癌剂共同给药。在某些实施方案中，改变肿瘤生长使 肿瘤对化疗或抗-致肿瘤治疗敏感。
附图描述
附图1描绘了用于合成PAPAM树枝状大分子的(A)传统方法与(B) 本发明某些实施方案中的方法的比较。
附图2描绘了被保护的核心结构域的优选保护基(PG)。
附图3描绘了当核心二案为苯二胺N-((CH2)n-NH2)3(n＝1-10)时的 核心二胺。
附图4描绘了附图3的苯二胺，但带有取代基，其中R和R1独立 地选自氢、C1-C6直链或支链烷基、C3-C6环烷基、未被取代或被C1-C6 烷基、C1-C6烷氧基、1，3-二氧戊环基、三卤代烷基、羧基、C1-C6 二烷氨基、C1-C6 sulfanatoalkyl、C1-C6氨磺酰烷基或C1-C6 phosphanatoalkyl取代的C5-C10芳基。
附图5描绘了通过对商购亚苯基双乙腈的催化还原合成苯二胺 类。
附图6描绘了用于生成多官能G5PAMAM树枝状大分子的合成方 案。
附图7描绘了G5PAMAM树枝状大分子的电位滴定曲线。
附图8描绘了部分乙酰化载体和终产物的凝胶渗透色谱洗脱图 (eluograms)，其中在90°重叠的是RI信号和激光散射信号。
附图9描绘了G5PAMAM树枝状大分子的理论和缺损的化学结构。
附图10描绘了G5-Ac2树枝状大分子的(A)H1-NMR光谱和(B) HPLC洗脱图。
附图11描绘了异硫氰酸荧光素、叶酸和甲氨蝶呤的化学结构，其 中用于缀合的基团被星号标记。
附图12描绘了异硫氰酸荧光素、叶酸和甲氨蝶呤的质子NMR成像。
附图13描绘了在305nm处(A)G5-Ac2-FITC-OH-MTXe和(B) G5-Ac3-FITC-OH-MTXe的HPLC洗脱图。
附图14描绘了G5-Ac2-FITC-FA-OH-MTXe的H1-NMR光谱。
附图15描绘了在305nm处的G5-Ac-FITC-FA-OH-MTXe的HPLC洗 脱图。
附图16描绘了游离异硫氰酸荧光素、叶酸和甲氨蝶呤的UV光谱。
附图17描绘了G5-Ac、G5-Ac3-FITC、G5-Ac3-FITC-FA和 G5-Ac3-FITC-FA-MTXe的UV光谱。
附图18描绘了G5-FITC-FA-MTX在KB细胞中剂量依赖性结合的(A) 粗的和(B)标准化荧光。
附图19描绘了游离FA在表达高和低FA受体的KB细胞中对 G5-FITC-FA和G5-FITC-FA-MTX的摄取的作用。
附图20描绘了用树枝状大分子处理的KB细胞的共聚焦显微术。
附图21描绘了使用树枝状大分子对细胞生长的(A)时程和(B)剂 量依赖性抑制。
附图22描绘了通过XTT试验测定的树枝状大分子对KB细胞的生 长抑制。
附图23描绘了使用G5-FITC-FA-MTX和等摩尔浓度的MTX与游离 FA的混合物的细胞生长抑制比较。
附图24描绘了G5-FA-MTX-诱导的由游离FA产生的细胞生长抑制 的逆转。
附图25描绘了树枝状大分子在细胞培养基中的稳定性。
附图26描绘了树枝状大分子的细胞毒性。
附图27表示放射性标记的(A)非靶向的和(B)靶向的缀合物在带 有KB异种移植物肿瘤的nu/nu小鼠中的生物分布，表示为每克器官中 回收的注射剂量的树枝状大分子的百分比。
附图28表示对来自SCID小鼠的冷冻切片的肿瘤样品的共聚焦显 微术分析，其中给所述的小鼠注射了：10nmol(A)非靶向的G5-6-TAMRA 或(B)靶向的G5-FA-6-TAMRA缀合物(B)15小时或(D)4天，此后分 离肿瘤。G5-FA-6-TAMRA与G5-6-TAMRA比较的肿瘤细胞特异性摄取如 (C)中所示。
附图29描绘了在用G5-FI-FA-MTX缀合和游离甲氨蝶呤(MTX)处理 过程中带有KB异种移植物的SCID小鼠的肿瘤生长。
附图30描绘了带有KB肿瘤的SCID小鼠的存活率。
附图31描绘了G5-Ac-AF-RGD的合成方案。
附图32表示G5-Ac-AF-RGD与HUVEC细胞的结合。
附图33表示G5-Ac-AF-RGD与不同细胞系的结合。
附图34表示通过共聚焦显微术测定的G5-Ac-AF-RGD与HUVEC细 胞的剂量依赖性结合。
附图35表示添加游离肽对HUVEC细胞摄取G5-Ac-AF-RGD的抑制。
定义
为了有利于理解本发明，下文定义了大量术语和措词：
本文所用的术语″活性剂″意旨具有生物相关活性或性质的组合 物。生物相关活性为与能够检测、监测或表征生物反应或活动的生物 反应或活动相关的活性。生物相关活性包括但不限于治疗活性(例如改 善生物健康或预防与不需要的生物情况相关的持续变性的能力)、靶向 活性(例如结合或连接生物分子或复合物的能力)、监测活性(例如监测 生物活动进展或监测生物组成改变的能力)、成像活性(例如观察，乃 至监测生物组成或反应的能力)和标记鉴定活性(例如识别某些细胞组 成或条件并且产生表示该组成或条件存在的可检测到的反应)。本发明 的活性剂并不限于这些特定的解释性实例。实际上，可以使用任意的 有用的活性剂，包括递送或破坏生物物质、化妆品试剂等的活性剂。 在本发明优选的实施方案中，活性剂或多种活性剂与至少一种树枝状 大分子结合(例如引入树枝状大分子，表面暴露在树枝状大分子上等)。 在本发明的某些实施方案中，一种树枝状大分子与两种或多种为″彼此 不同的活性剂结合(例如与靶向剂和治疗剂有关的一种树枝状大分 子)。″彼此不同″意旨在化学组成和/或官能团方面彼此不同的活性剂。
本文所用的术语″纳米装置″意旨含有或结合一种或多种″活性剂″ 的小(例如人肉眼不可见)组合物。在其最简单的形式中，纳米装置由 结合了至少一种提供生物官能团(例如治疗剂)的活性剂的物理组合物 (例如树枝状大分子)组成。然而，纳米装置还可以包含额外的成分(例 如额外的树枝状大分子和/或活性剂)。在本发明优选的实施方案中， 纳米装置的物理组合物包含至少一种树枝状大分子并且生物官能团由 至少一种结合树枝状大分子的活性剂提供。
本文所用的术语″生物活性″意旨具有天然存在分子的结构、调节 或生化功能的蛋白质或其它生物活性分子(例如催化RNA或小分子)。
本文所用的术语″激动剂″意旨一种分子，它在与生物活性分子发 生相互作用时，导致生物活性组分改变(例如促进)，调节生物分子活 性。激动剂可以包括蛋白质、核酸、碳水化合物或任意其它结合生物 活性分子或与之发生相互作用的分子。例如，激动剂可以通过直接与 RNA聚合酶发生相互作用或通过转录因子改变基因转录活性。
本文所用的术语″拮抗剂″或″抑制剂″意旨一种分子，但它与生物 活性分子发生相互作用时，阻断或调节生物活性分子的生物活性。拮 抗剂和抑制剂可以包括蛋白质、核酸、碳水化合物或任意其它结合生 物活性分子或与之发生相互作用的分子。抑制剂和拮抗剂可以影响完 整细胞、器官或生物体的生物学特性(例如减缓肿瘤生长的抑制剂)。
本文所用的术语″调节″意旨生物活性分子的生物活性改变。调节 可以为活性的增加或降低，结合特性改变，或活生物性分子的任意其 它生物学、功能或免疫特性的改变。
术语″基因″意旨包含产生多肽或前体所必需的编码序列的核酸 (例如DNA)序列。多肽可以被全长编码序列或被该编码序列的任意部 分编码，只要全长或片段的所需活性或功能特性(例如酶促活性、配体 结合、信号传导等)得以保留。该术语还包括结构基因的编码区并且包 括的序列位于与5′和3′端上的编码区相邻的位置，距每端约1kb或 1kb以上，使得该基因相当于全长mRNA的长度。位于编码区的5′并 且存在于mRNA上的序列称作5′未-翻译序列。位于编码区3′或下游并 且存在于mRNA上的序列称作3′未-翻译序列。术语″基因″包括基因的 cDNA和基因组形式。基因的基因组形式或克隆含有称作″内含子″或″ 间插区″或″间插序列″的被非-编码序列打断的编码区。内含子为转录 成核RNA(hnRNA)的基因片段；内含子可以含有调节元件，诸如增强子。 从核或原始转录物中除去或″剪接掉″内含子；内含子由此不存在于信 使RNA(mRNA)转录物中。mRNA在翻译过程中起指定新生多肽中的序列 或氨基酸顺序的作用。
本文所用的术语″核酸分子编码″、″DNA序列编码″和″DNA编码″ 意旨沿脱氧核糖核酸链的脱氧核糖核苷酸的顺序或序列。这些脱氧核 糖核苷酸的顺序决定了沿多肽(蛋白质)链的氨基酸顺序。DNA序列由 此编码氨基酸序列。
本文所用的术语″抗原决定簇″意旨接触特定抗体的抗原部分(例 如表位)。当蛋白质或蛋白质片段用于赋予宿主动物免疫性时，蛋白质 的众多区可以诱导产生特异性结合蛋白质上的指定区或三维结构的抗 体；这些区或结构称作抗原决定簇。抗原决定簇可以与完整抗原(例如 用于引起免疫应答的″免疫原″)竞争结合抗体。
术语″特异性结合(specific binding)″或″特异性结合 (specifically binding)″在用于指抗体和蛋白质或肽的相互作用时 意旨这种相互作用依赖于蛋白质上存在的特定结构(例如抗原决定簇 或表位)；换句话说，抗体识别并且结合特异性蛋白质结构而不是一般 性地结合蛋白质。例如，如果抗体对表位″A″具有特异性，那么在含有 标记的″A″和抗体的反应体系中含有表位A(或游离的未标记的A)的蛋 白质的存在会减少与抗体结合的标记的A的量。
本文所用的术语″转基因″意旨外源基因，例如通过将该外源基因 导入新受精卵或早期胚胎而将其置于生物体内。术语″外源基因″意旨 通过实验操纵导入动物基因组并且可以包括在该动物中发现的基因序 列的任意核酸(例如基因序列)，只要导入的基因不存在于与天然存在 基因相同的位置上。
本文所用的术语″载体″用于指将DNA片段从一种细胞转移至另一 种细胞的核酸分子。术语″载体(vehicle)″有时与″载体(vector)″ 可互换使用。载体通常来源于质粒、噬菌体或植物或动物病毒。
本文所用的术语″表达载体″意旨重组DNA分子，其含有所需编码 序列和表达特定宿主生物体内可操作连接的编码序列所必需的适宜核 酸序列。原核细胞中表达所必需的核酸序列通常包括启动子、操纵子 (任选)和核糖体结合位点，通常与其它序列一起。已知真核细胞利用 启动子、增强子并终止和聚腺苷酸化信号。
本文所用的术语″基因转移系统″意旨将包含核酸序列的组合物递 送至细胞或组织的任意工具。例如，基因转移系统包括但不限于载体 (例如逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒和其它基于核酸的递送系统)、 裸核酸的显微注射和基于聚合物的递送系统(例如基于脂质体和基于 金属颗粒的系统)。本文所用的术语″病毒基因转移系统″意旨包含有利 于将样品递送至所需细胞或组织的病毒元件的基因转移系统(例如完 整病毒和修饰的病毒)。本文所用的术语″腺病毒基因转移系统″意旨包 含属于腺病毒科的完整或改变的病毒的基因转移系统。
本文所用的术语″转染″意旨将外源性DNA导入真核细胞。可以通 过各种本领域中公知的方式进行转染，包括磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE- 葡聚糖-介导的转染、1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物- 介导的转染、电穿孔、显微注射、脂质体融合、脂转染、原生质体融 合、逆转录病毒感染和生物射弹(biolistics)。
本文所用的术语″细胞培养物″意旨细胞的任意体外培养物。该术 语中包括连续的细胞系(例如含有无限增殖化表型)、原代细胞培养物、 有限细胞系(例如未-转化细胞)和维持在体外的任意其它细胞群。
本文所用的术语″体外″意旨人工环境和出现在人工环境内的过程 或反应。体外环境可以由试管和细胞培养物组成，但不限于它们。术 语″体内″意旨天然环境(例如动物或细胞)和出现在天然环境中的过程 或反应。
术语″测试化合物″意旨可以用于治疗或预防疾病(disease)、疾 病(illness)、疾病(sickness)或身体功能障碍的任意化学本体、 药、药物等。测试化合物包括已知和潜在的治疗化合物。可以通过使 用本发明的筛选方法进行筛选将测试化合物确定为治疗剂。″已知的治 疗化合物″意旨已经证实(例如通过动物试验或在先对人体给药的经验) 为在这类治疗或预防中有效的治疗化合物。
本文所用的术语″样品″以其最广泛的含义使用并且包括环境和生 物样品。环境样品包括来自诸如土壤和水这类环境的材料。生物样品 可以为动物，包括人类、流体(例如血液、血浆和血清)、固体(例如粪 便)、组织、液体食物(例如牛奶)和固体食物(例如蔬菜)。
本文所用的术语″光敏剂″和″光动力学染料″意旨在接触光量子时 进行转化而达到激发态的物质。光敏剂和光动力学染料的实例包括但 不限于光卟啉2、苯并卟啉、间-四羟基苯基二氢卟酚、本红紫素锡(tin etiopurpurin)、苯并二氢卟酚铜和其它卟啉类。
发明详述
本发明提供了用于治疗、分析和监测疾病(例如癌症)的新的系统 和组合物。例如，本发明提供了系统和组合物，其靶向、成像和传感 病理生理缺陷，基于患病状态提供合适的治疗剂，监测对递送的治疗 剂的反应并且鉴定残留的疾病。在本发明优选的实施方案中，组合物 足够小以易于进入患者或受试者细胞和从体内清除，而在治疗剂量下 几乎没有毒性。
在优选的实施方案中，本发明的系统和组合物用于在癌症疗法过 程中的治疗和/或监测。然而，本发明的系统和组合物应用于治疗和监 测各种疾病状态或其它生理情况，并且本发明并不限于用于任何具体 的疾病状态或情况。具体应用于本发明的其它疾病状态包括但不限于 心血管疾病、病毒性疾病、炎性疾病和其它增殖性病症。
在优选的实施方案中，本发明提供了部分乙酰化的第5代(G5)聚 酰胺型胺(PAMAM)、树枝状大分子(例如，参见实施例1)。在其它优选 的实施方案中，本发明提供了制备多官能G5树枝状大分子(例如，参 见实施例2)的方法和制备包含被保护的核心二胺的树枝状大分子的 方法(例如，参见附图1-5)。
本发明的优选实施方案提供了包含与一种或多种官能团缀合的树 枝状大分子的组合物，所述的官能团包括但不限于治疗剂、生物监测 成分、生物成像成分、靶向成分和鉴定细胞异常的特异性标记的成分。 照此，治疗纳米装置由各树枝状大分子制成，它们各自带有特别地与 树枝状大分子缀合或共价结合的一种或多种官能团(例如，参见实施例 2和6)。在优选的实施方案中，官能团中的至少一种通过酯键与树枝 状大分子缀合(例如，参见实施例7)。
下文的讨论描述了树枝状大分子的各成分部分和在本发明某些实 施方案中制备和使用它们的方法。为了解释本发明系统和组合物的设 计和应用，讨论部分集中在组合物在治疗和监测乳腺癌和结肠腺癌中 的应用的具体实施方案。这些具体的实施方案仅用于解释本发明的某 些优选实施方案，但并不用来限制其范围(例如本发明的组合物和方法 应用于鉴定和治疗前列腺癌和病毒感染的细胞和组织)。在某些实施方 案中，本发明的树枝状大分子通过细胞表面部分靶向肿瘤性细胞并且 例如通过受体介导的胞吞由肿瘤细胞吸收(例如，参见实施例9，附图 20)。在优选的实施方案中，成像成分(例如与本发明的树枝状大分子 缀合)使肿瘤成像(例如通过使用MRI)。
在某些实施方案中，通过使治疗成分与不稳定保护基结合，诸如， 例如使顺铂与不耐光的保护基结合有利于治疗剂的释放，其中所述的 不耐光的保护基由定向于发射如上所述活化的荧光颜色的那些细胞 (例如发射红色的细胞)的激光释放。任选治疗装置(例如包含本发明树 枝状大分子的组合物)还可以带有监测靶细胞或组织(例如肿瘤)对疗 法的反应的成分。例如，如果与本发明的树枝状大分子缀合的化疗剂 (例如甲氨蝶呤)诱导靶向的细胞细胞凋亡，靶向的细胞的天冬氨酸特 异性半胱氨酸蛋白酶活性可以用于激活绿色荧光。这使得凋亡性细胞 变为橙色(红色与绿色的结合)，而残留细胞仍保持红色。诱导侧枝中 发生细胞凋亡的任何正常细胞均可以伴随损害绿色荧光。
正如从上述实例中清楚看出的，本发明组合物的应用有利于在癌 症和其它疾病和情况中的非侵害性传感、信号传导和介入。由于使用 这项技术鉴定癌细胞中分子改变的具体方案，所以实现了树枝状大分 子的非侵害性传感且然后可以对各种肿瘤表型进行自动化应用。
I.树枝状大分子
在优选的实施方案中，本发明的组合物包含树枝状大分子(例如， 参见附图1-5和实施例2)。已经广泛描述了树枝状聚合物(参见， Tomalia，Advanced Materials 6：529(1994)；Angew，Chem.Int.Ed. Engl.，29：138(1990)；将这些文献完整地引入本文作为参考)。可以 将树枝状聚合物合成为一般直径在1-20纳米的确定的球状结构。显 示了制备带有被保护核心的G5PAMAM树枝状大分子的方法(附图 1-5)。在某些实施方案中，被保护的核心二胺为NH2-CH2-CH2-NHPG。 分子量和端基数量作为聚合物的代(层数量)的函数呈指数增加(例如， 参见附图9)。可以基于启动聚合过程的核心结构合成不同类型的树枝 状大分子(例如，参见附图1-5)。
树枝状大分子的核心结构描述了分子的几种特征，诸如总体形状、 密度和表面官能度(Tomalia等Chem.Int.Ed.Engl.， 29：5305(1990))。球形树枝状大分子可以带有氨作为三价引发剂核心 或乙二胺(EDA)作为三价引发剂核心(例如，参见附图9)。目前描述的 棒状树枝状大分子(Yin等J.Am.Chem.Soc.，120：2678(1998))使 用不同长度的聚乙烯亚胺线性核心(例如核心越长，则棒状物越长)。 树枝状大分子为按千克量计的商购的并且在用于生物技术应用的目前 良好的制备方法(GMP)中产生。
可以通过许多技术来表征树枝状大分子，包括但不限于电喷射离 子化质谱、13C核磁共振光谱法、1H核磁共振光谱法(例如，参见实施 例5，附图10(A)和实施例7，附图14)、高效液相色谱法(例如，参见 实施例5，附图10(B)；和实施例6，附图13)、使用多角度激光散射 的大小排阻色谱法(例如，参见实施例4，附图8)、紫外分光光度法(例 如，参见实施例8，附图17)、毛细管电泳和凝胶电泳。这些试验确保 了聚合物群的均匀性并且对监测用于GMP应用和体内应用的树枝状大 分子制备的质量控制而言是重要的。
众多美国专利中描述了用于生产树枝状大分子的方法和组合物。 下面给出了这些专利中的某些的实施例，以便提供对可以用于本发明 的某些树枝状大分子组合物的描述，不过，应理解这些仅为解释性实 施例并且众多其它类似的树枝状大分子组合物可以用于本发明。
美国专利US4,507,466、美国专利US4,558,120、美国专利 US4,568,737和美国专利US4,587,329中各自描述了制备具有大于常 规星形聚合物的末端密度的致密星形聚合物的方法。这些聚合物具有 大于/高于常规的星形聚合物的均匀反应性，即第3代致密星形聚合 物。这些专利中进一步描述了酰氨基胺树枝状大分子的性质 (amidoamine)和该树枝状大分子的3-维分子直径。
美国专利US4,631,337中描述了水解稳定的聚合物。美国专利 US4,694,064中描述了棒形树枝状大分子。美国专利US4,713,975中 描述了致密的星形聚合物及其在表征病毒、细菌和蛋白质包括酶的表 面中的应用。桥连的致密星形聚合物描述在美国专利US4,737,550中。 美国专利US4,857,599和美国专利US4,871,779中描述了作为离子交 换树脂、螯合型树脂使用的固定化核心上的致敏星形聚合物和这类聚 合物的制备方法。
美国专利US5,338,532涉及结合了至少一种携带的农业、药物或 其它物质的单元的树枝状大分子的星形爆裂状(starburst)缀合物。 该专利描述了每单位聚合物、受控递送、靶向递送和/或多种类中高浓 度携带物质的递送装置，所述的多种类诸如，例如药物抗生素、一般 和具体的毒素、金属离子、放射性核素、信号发生器、抗体、白细胞 介素、激素、干扰素、病毒、病毒片段、杀虫剂和抗微生物剂。
美国专利US6,471,968中描述了包含共价连接的第一种和第二种 树枝状大分子的树枝状大分子复合物，其中第一种树枝状大分子包含 第一种活性剂，并且第二种树枝状大分子包含第二种活性剂，其中第 一种树枝状大分子不同于第二种树枝状大分子，并且其中第一种活性 剂不同于第二种活性剂。
其它有用的树枝状大分子类组合物描述在美国专利 US5,387,617、美国专利US5,393,797和美国专利US5,393,795中， 其中通过用能够提供疏水外壳的疏水性基团封端修饰致密的星形聚合 物。美国专利US5,527,524中披露了氨基封端的树枝状大分子在抗体 缀合物中的应用。
树枝状大分子作为金属离子载体的应用描述在美国专利 US5,560,929中。美国专利US5,773,527中披露了梳形爆裂状结构的 非交联多分支聚合物及其制备方法。美国专利US5,631,329中描述了 生成高分子量多分支聚合物的方法，通过下列步骤进行：由分支形成 第一组支化聚合物；与核心接枝；使第一组支化聚合物脱保护，然后 形成第二组因分支而被保护的支化聚合物并且与具有第一组支化聚合 物的核心接枝等。
美国专利US5,902,863中描述了含有亲脂性有机硅氧烷和亲水性 polyanicloamine nanscopic domains的树枝状大分子网状构造。该 网状构造由具有PAMAM(亲水性)或聚丙烯亚胺内部和有机硅外层的共 聚树枝状大分子前体制备。这些树枝状大分子具有可控的大小、形状 和空间分布。它们为具有可以用于专用膜、保护涂层、含有有机金属 或无机添加剂的复合物，皮肤贴剂递送，吸收剂，层析个人护理产品 和农产品的带有有机硅外层的疏水性树枝状大分子。
美国专利US5,795,582中描述了树枝状大分子作为流感抗原的佐 剂的应用。树枝状大分子的应用产生了带有降低的抗原剂量的抗体滴 度水平。美国专利US5,898,005和美国专利US5,861,319中描述了用 于测定分析物浓度的特异性免疫结合试验。美国专利US5,661,025中 提供了包含树枝状大分子聚阳离子的自我装配的多核苷酸递送系统以 便有助于将核苷酸递送至靶位点的详细描述。该专利提供了在体外将 多核苷酸导入真核细胞的方法，包含使细胞接触一种组合物，该组合 物包含多核苷酸和与该多核苷酸非共价偶联的树枝状大分子 polyeation。
预先已经证实了树枝状大分子-抗体缀合物在体外诊断应用 (Singh等Clin.Chem.，40：1845(1994))、在生产树枝状大分子-螯 合剂-抗体构建体和在研发硼化树枝状大分子-抗体缀合物(用于中子 俘获疗法)中的应用；后面这些化合物中的每一种可以用作癌症治疗剂 (Wu等Bioorg.Med.Chem.Lett.，4：449(1994)；Wiener等Magn. Reson.Med.31：1(1994)；Barth等Bio缀合物Chem.5：58(1994)； 和Barth等)。
在肿瘤的磁共振成像中也使用了这些缀合物中的一些(Wu等 (1994)和Wiener等(1994)，文献同上)。从这项工作中获得的结构记录 了当进行体内给药时，抗体可以使树枝状大分子-结合的治疗剂定向于 具有抗原的肿瘤。还证实树枝状大分子抗原特异性地进入细胞并且携 带化疗剂或遗传治疗剂。特别地，研究表明包囊在树枝状大分子聚合 物中的顺铂增加了功效并且毒性低于提供其它方式递送的顺铂 (Duncan和Malik，Control Rel.Bioact.Mater.23：105(1996))。
树枝状大分子还可以与荧光染料或分子指示标缀合经证实可进入 细胞。然后可以按照与评价细胞内生理改变的传感仪器相容的方式在 细胞内检测它们(Baker等Anal.Chem.69：990(1997))。最终，将树 枝状大分构建为差别化嵌段共聚物，其中可以用酶或光诱导的催化消 化分子的外部分(Urdea和Hom，Science 261：534(1993))。这能够控 制聚合物的降解以便在疾病部位释放治疗剂并且可以为释放治疗剂的 外部触发器提供机理。
在某些实施方案中，本发明提供了树枝状大分子，其中单一树枝 状大分子中形成有各自带有具体官能度的一种或多种官能团(例如，参 见实施例7和8，附图14和15)。例如，本发明优选的组合物包含部 分乙酰化的第5代(G5)PAMAM树枝状大分子，该树枝状大分子进一步 包含治疗剂、靶向剂和成像剂，其中治疗剂包括甲氨蝶呤，靶向剂包 括叶酸，且成像剂包括异硫氰酸荧光素(例如，参见实施例7和8)。 由此，本发明提供了单一的多官能树枝状大分子。在某些实施方案中， 在单一树枝状大分子上形成了多个拷贝的上述官能团中的任意一种 (例如治疗剂)。例如，在某些实施方案中，单一树枝状大分子包含 2-100个拷贝的单一官能团(例如治疗剂，诸如甲氨蝶呤)。在其它优 选的实施方案中，本发明提供了部分乙酰化的第5代(G5)PAMAM树枝 状大分子，该树枝状大分子进一步包含治疗剂、靶向剂和成像剂，其 中靶向剂包含RGD肽(例如，参见实施例14)。在某些实施方案中，本 发明提供了部分乙酰化的第5代(G5)PAMAM树枝状大分子，该树枝状 大分子包含治疗剂、靶向剂和成像剂，其中治疗剂包含氚(例如，参见 实施例13)。
II.治疗剂
各种治疗剂应用于本发明。因此，本发明并不限于可以与本发明 树枝状大分子缀合的治疗剂的类型。可以使用本发明的方法、系统和 组合物递送结合树枝状大分子的任意治疗剂。为了解释治疗剂的递送， 下文的讨论主要集中在甲氨蝶呤、顺铂和泰素在治疗癌症中的递送。 还讨论了各种光动力疗法化合物和各种抗微生物化合物。
i.甲氨蝶呤、顺铂和泰素
甲氨蝶呤的细胞毒性取决于维持阈值胞内水平的持续时间 (Levasseur等Cancer Res 58，5749(1998)；Goldman & Matherly， Pharmacol Ther 28，77(1985))。细胞含有高浓度的DHFR，并且完全 中断了DHFR活性，需要高于DHFR的Ki 6个数量级的抗叶酸盐剂水平 (Sierrra & Goldman，Seminars in Oncology 26，11(1999))。此外， 低于5％的酶活性对完整的细胞酶促功能而言是足够的(White & Goldman，Biol Chem 256，5722(1981))。顺铂和泰素具有充分确定 的在肿瘤细胞中诱导细胞凋亡的作用(例如，参见Lanni等Proc.Natl. Acad.Sci.，94：9679(1997)；Tortora等Cancer Research 57：5107(1997)；和Zaffaroni等Brit.J.Cancer 77：1378(1998))。 然而，使用这些和其它化疗剂治疗难以在没有招致的明显毒性的情况 下进行。目前应用的这些活性剂一般难溶于水，毒性明显并且在影响 正常细胞和患病细胞的剂量下给予。例如，发现的最理想的抗癌化合 物之一紫杉醇(泰素)难溶于水。
紫杉醇已经在各种肿瘤模型中显示出极佳的抗肿瘤活性，诸如 B16黑素瘤、L1210白血病、MX-1乳房肿瘤和CS-1结肠肿瘤异种移植 物。然而，紫杉醇在水溶性差对人体给药提出了一个难题。因此，目 前使用的紫杉醇制剂需要cremaphor增溶药物。人体临床剂量范围在 200-500mg。将该剂量溶于1∶1的乙醇∶cremaphor溶液并且稀释成经 静脉内给予的1升流体。目前使用的cremaphor为聚乙氧基化蓖麻油。 通过溶于cremaphor混合物并且用大体积的含水媒介物稀释来将其通 过输注给予。直接给药(例如皮下)产生局部毒性和低水平的活性。因 此，对这些化疗剂而言，对更有效和有效递送系统存在需求。
本发明通过提供用于具体递药的方法和组合物而克服了这些难 题。本发明还提供了给予活性剂的组合(例如两种或多种不同治疗剂) 以产生累加效应的能力。多种活性剂的应用可以用于抵抗疾病对任何 单一活性剂产生的耐药性。例如，已经报导了某些癌症对单一药物(泰 素)的耐药性(Yu等Molecular Cell.2：581(1998))。在本发明研发 过程中进行的实验已经证实与树枝状大分子缀合的甲氨蝶呤能够有效 杀伤癌细胞(参见实施例10、附图21和22以及实施例12、附图26)。
本发明还提供了监测在将甲氨蝶呤和/或顺铂和/或泰素递送给受 试者后的治疗成功的机会。例如，将测定这些药物体外诱导细胞凋亡 的能力报导为体内功效的标志(Gibb，Gynecologic Oncology 65：13(1997))。因此，除这些药物(或其它治疗剂)之一、其中两种或 所有的靶向递送以提供有效抗肿瘤疗法并且降低毒性外，还可以通过 本发明监测细胞凋亡诱导的技术评估疗法的有效性。重要的是，这些 疗法对广泛肿瘤类型具有活性，包括但不限于乳腺癌和结肠癌(Akutsu 等Eur.J.Cancer 31A：2341(1995))。
尽管上述讨论描述了三种特异性活性剂，但是常规用于癌症疗法 内容的任意活性剂(例如药物)均可应用于本发明。在按照本发明治疗 癌症的过程中，树枝状大分子的治疗成分可以包含化合物，包括但不 限于阿霉素、5-氟尿嘧啶、依托泊苷、喜树碱、放线菌素D、丝裂霉 素C，更优选顺铂。可以制备该活性剂并且通过将其如本文所述与免 疫治疗剂合并作为合并的治疗组合物或试剂盒等使用。
在本发明的某些实施方案中，预期树枝状大分子包含一种或多种 活性剂，它们直接交叉连接核酸(例如DNA)以便有利于DNA损害，从 而产生本发明的具有协同作用的抗肿瘤药。可以使用诸如顺铂这类活 性剂和其它DNA烷化剂。顺铂已经广泛应用于治疗癌症，其中用于临 床施用的有效性剂量为20mg/M2，持续5天，每3周进行1次，总计 3个疗程。可以通过任意合适的方法递送树枝状大分子，包括但不限 于静脉内、皮下、肿瘤内、腹膜内或局部(例如递送至粘膜表面)。
损害DNA的活性剂还包括干扰DNA复制、有丝分裂和染色体分离 的化合物。这类化疗化合物包括：阿霉素，也称作多柔比星；依托泊 苷；维拉帕米；鬼臼毒素等。通过静脉内快速浓注给予在治疗肿瘤的 临床背景中广泛使用的这些化合物，就阿霉素而言，剂量范围为25-75 Mg/M2，间隔21天，就依托泊苷而言，静脉内或静脉内口服双重剂量 为35-50Mg/M2。
破坏核酸前体和亚单位合成和精确度的活性剂也导致DNA损害并 且用作本发明中的化疗剂。已经研发了大量核酸前体。特别有用的为 已经进行广泛测试并且用于获得的活性剂。照此，诸如5-氟尿嘧啶 (5-FU)这类活性剂优先被肿瘤性组织利用，使得该活性剂特别用于靶 向肿瘤性细胞。递送的剂量可以在3-15mg/kg/天的范围，不过，其 它剂量可以根据不同因素明显改变，包括疾病的阶段、细胞对疗法的 依从性、对活性剂耐受的量等。
应用于本发明的抗癌治疗剂为那些易于引入树枝状大分子结构， 或否则就与树枝状大分子结构结合的治疗剂，使得它们可以被递送入 受试者、组织或细胞，而其抗癌作用的精确度不会丧失。为了更详细 描述癌症治疗剂，诸如铂复合物、维拉帕米、鬼臼毒素、卡铂、丙卡 巴肼、氮芥、环磷酰胺、喜树碱、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、 白消安(bisulfan)、亚硝基脲(nitrosurea)、阿霉素、放线菌素 D、柔红霉素、多柔比星、博来霉素、plicomycin、博来霉素、依托泊 苷(VP16)、他莫昔芬、泰素、transplatinum、5-氟尿嘧啶、新长春碱、 长春碱和甲氨蝶呤和其它类似抗癌药，本领域技术人员查阅了许多说 明性手册，包括但不限于Physician′s Desk reference和Goodman 和Gilman的″Pharmaceutical Basis of Therapeutics″ninth edition，Eds.Hardman等1996。
在某些实施方案中，优选使用光可裂解的连接基使药物与树枝状 大分子结合。例如，应用于本发明的几种异双官能光可裂解连接基由 Ottl等描述(Ottl等Bio缀合物Chem.，9：143(1998))。这些连接基 可以为水或有机可溶性的。它们含有活化的酯，该酯可以与可与巯基 反应的胺类或醇类和环氧化物反应。在两种基团之间为3，4-二甲氧基 6-硝基苯基光致异构化基团，该基团在接触近紫外光(365nm)时，释 放完整形式的胺或醇。因此，在使用这类连接基与本发明组合物连接 时，通过使靶区接触近紫外光，治疗剂可以以生物活性或可活化的形 式被释放。
在一个优选的实施方案中，甲氨蝶呤通过酯键与树枝状大分子缀 合(参见例如实施例7)。在一个典型的实施方案中，泰素的醇基与有 机可溶性连接基的活化酯反应。该产物由此与合适的树枝状大分子的 部分硫醇化表面反应(树枝状大分子的伯胺类可以通过与亚化学计算 量的2-iminothiolano反应而被部分转化成含硫氢基的基团)。就顺铂 而言，药物的氨基与连接基的水溶性形式反应。如果氨基反应不完全， 那么可以使用顺铂的含伯氨基的活性类似物，诸如Pt(II)磺胺嘧啶二 氯化物(Pasani等Inorg.Chim.Acta 80：99(1983)和Abel等，Eur. J.Cancer 9：4(1973))。因此，缀合的药物无活性并且不会损害正常 细胞。当缀合物位于肿瘤细胞中时，它接触适当近-UV波长的激光， 从而导致活性药物被释放入细胞。
类似地，在本发明的其它实施方案中，使顺铂(或其类似物)的氨 基与极具疏水性的光可裂解保护基、诸如2-硝基苄氧羰基连接 (Pillai，V.N.R.Synthesis：1-26(1980))。由于连接了这一疏水性 基团，所以药物被加载入PAMAM树枝状大分子的疏水腔并且极为优先 地被其保留(例如，参见Esfand等Pharm.Sci.，2：157(1996))，与 水环境隔离。当接触近-LV光(约365nm)时，疏水性基团被裂解，释 放完整药物。由于药物自身为亲水性的，所以它从树枝状大分子中扩 散出来并且进入肿瘤细胞，在那里它可以启动细胞凋亡。
作为光可连接的连接基的备选物为酶可裂解连接基。已经证实大 量可裂解连接基为有效的抗肿瘤缀合物并且可以通过使癌症治疗剂， 诸如多柔比星与带有适当短的肽连接基的水溶性聚合物结合制备(例 如，参见Vasey等Clin.Cancer Res.，5：83(1999))。连接基在细胞 外部为稳定的，但一旦在细胞内就被巯基蛋白酶裂解。在一个优选的 实施方案中，使用PK1。作为光可裂解连接基策略的备选，可以使用 酶可降解的连接基，诸如Gly-Phe-Leu-Gly。
本发明并不限于治疗技术的性质。例如，应用于本发明的其它缀 合物包括但不限于使用用于BNCT的缀合的硼撒粉器(Capala等Bio缀 合物Chem.，7：7(1996))，使用放射性同位素和诸如蓖麻毒素这类毒 素与纳米装置结合。
ii.光动力疗法
光动力疗法治疗剂也可以用作本发明中的治疗剂。在某些实施方 案中，照射本发明含有光动力化合物的树枝状大分子组合物，导致单 线态氧和自由基产生，它们从无纤维放射效应物中扩散出来而对生物 靶标(例如肿瘤细胞或细菌细胞)起作用。某些优选的光动力化合物包 括但不限于那些参与II型光化学反应的化合物：
         →
PS+hv         PS*(1)
         →
PS*(1)       PS*(3)
              →
PS*(3)+O2         PS+*O2
        →
*O2+T       细胞毒性
其中PS＝光致敏剂，PS*(1)＝激发的PS的单线态，PS*(3)＝激发的 PS的三线态，hv＝光量子，*O2＝激发的氧的单线态，且T＝生物靶标。 用于本发明的其它光动力化合物包括那些通过非单线态氧产生的不同 机制产生细胞毒性的化合物(例如copper benzochlorin，Selman，等 Photochem.Photobiol.，57：681-85(1993)，引入本文作为参考)。 应用于本发明的光动力化合物的实例包括但不限于光敏素2、酞菁 (phtalocyanins)(例如，参见Brasseur等Photochem.Photobiol.， 47：705-11(1988))、苯并卟啉、四羟基苯基卟啉类、 naphtalocyanines(例如，参见Firey和Rodgers，Photochem. Photobiol.，45：535-38(1987))、sapphyrins(Sessler等Proc.SPIE， 1426：318-29(1991))、卟吩酮类(porphinones)(Chang等Proc.SPIE， 1203：281-86(1990))、本红紫素锡(tin etiopurpurin)、醚取代的 卟啉类(Pandey等Photochem.Photobiol.，53：65-72(1991))和阳离 子染剂，诸如吩嗪类(例如，参见Cincotta等SPIE Proc.， 1203：202-10(1990))。
iii.抗微生物治疗剂
本发明的抗微生物治疗剂也可以用作本发明中的治疗剂。可以使 用可杀伤、抑制，或否则就是减弱微生物生物体功能的任意活性剂， 以及关注具有这类活性的任意活性剂。抗微生物剂包括但不限于天然 和合成的抗生素、抗体、抑制蛋白、反义核酸、膜破坏剂等，可以将 它们单独或联合使用。实际上，可以使用任意类型的抗生素，包括但 不限于抗菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂等。
III.标记鉴定剂
在某些实施方案中，本发明的纳米装置含有一种或多种由标记成 分(″标记″)活化或能够与之发生相互作用的标记鉴定剂。在优选的实 施方案中，标记鉴定剂为特异性结合标记的抗体，优选单克隆抗体(例 如对靶向的细胞具有特异性的细胞特异性分子)。
在本发明的某些实施方案中，鉴定了肿瘤细胞。肿瘤细胞具有各 种标记，包括确定表达的癌特异性抗原，诸如乳腺癌中的Muc1、HER-2 和突变的p53。它们作为癌症的特异性标记起作用，在乳腺癌中的存 在量为30％(HER-2)-70％(突变的p53)。在一个优选的实施方案中，本 发明的树枝状大分子包含特异性结合存在于乳腺癌中的p53突变形式 的单克隆抗体。
在本发明的某些实施方案中，鉴定了表达易患基因的癌细胞。例 如，在某些实施方案中，存在两种用作乳腺癌特异性标记的乳腺癌易 患基因：染色体17上的BRCA1和染色体13上的BRCA2。当个体携带 BRCA1或BRCA2中的突变时，他们被诊断为处于在生命中的某些点时 乳腺或卵巢癌的风险度增加中。这些基因参与修复双链DNA中放射诱 导的断裂。认为BRCA1或BRCA2中的突变可能使这一机制丧失，导致 DNA修复中的错误更多并且最终导致癌生长。
此外，大量不同细胞表面受体的表达用作纳米装置结合和吸收的 靶标。这类受体包括但不限于EGF受体、叶酸受体、FGR受体2等。
在本发明的某些实施方案中，与染色体异常(abborations)相关 的基因表达改变为标记成分。例如，伯基特淋巴瘤因涉及Myc基因的 染色体易位导致。染色体易位意旨染色体断裂，使得它与其它染色体 的部分连接。伯基特淋巴瘤中的传统伯基特淋巴瘤涉及染色体8，即 Myc基因的位点。这种Myc表达模式的改变，由此破坏其在控制细胞 生长和增殖的常用功能。
在其它实施方案中，将与接触癌相关的基因表达鉴定为标记成分。 已知两种关键基因涉及结肠癌：染色体2上的MSH2和染色体3上的 MLH1。一般而言，这些基因的蛋白质产物有助于修复DNA复制中形成 的错误。如果MSH2和MLH1蛋白质突变，那么复制中的错误仍然无法 修复，从而产生受损的DNA和结肠癌。几年来已知涉及多发性内分泌 腺瘤综合征的MEN1基因在染色体11上发现，在1997年对其更为精细 地进行了作图，并且用作这类癌症的标记。在本发明的优选实施方案 中，使对检测的改变的蛋白质或表达的基因具有特异性的抗体与本发 明的纳米装置复合。
在另一个实施方案中，结肠腺癌已经确定了CEA和突变的p53的 表达，这两者均为充分证实的肿瘤标记。在这些细胞的某些中的p53 突变与在某些乳腺癌细胞中观察到的突变相似，并且能够共有用于这 些癌症各自的两种纳米装置之间的p53传感成分(即在装配纳米装置 中，包含相同标记鉴定剂的树枝状大分子可以用于每种癌症类型)。可 以使用在裸鼠中产生肿瘤的细胞系可靠地研究结肠和乳腺癌细胞，以 便在动物中的优化和表征。
从上述讨论中可以清楚地看出，存在许多不同的应用于本发明的 肿瘤标记，其中的某些对特定类型的癌症具有特异性，而其它属于其 来源方面偶然(promiscuous)的。本发明并不限于任何特定肿瘤标记 或任意其它疾病特异性标记。例如，用作本发明的标记的肿瘤阻抑物 包括但不限于p53、Mucl、CEA、p16、p21、p27、CCAM、RB、APC、DCC、 NF-1、NF-2、WT-1、MEN-1、MEN-II、p73、VHL、FCC和MCC。
IV.生物学成像成分
在本发明的某些实施方案中，纳米装置包含至少一种基于树枝状 大分子的易于成像的nanoscopic构造单元。本发明并不受限于使用成 像成分的性质。在本发明的某些实施方案中，成像组件包含量子点的 表面修饰(例如，参见Chan和Nie，Science 281：2016(1998))，诸如 与生物分子偶联的硫化锌-封端的硒化镉(Sooklal，Adv.Mater.， 10：1083(1998))。
然而，在优选的实施方案中，成像组件包含按照″纳米复合物″概 念的生产的树枝状大分子(Balogh等Proc.of ACS PMSE 77：118(1997) 和Balogh和Tomalia，J.Am.Che.Soc.，120：7355(1998))。在这 些实施方案中，通过反应性包囊生产树枝状大分子，其中反应剂由树 枝状大分子模板预构造且随后被第二种反应剂固定在聚合物分子内/ 上。测定这些纳米粒的大小、形状、大小分布和表面官能度并且由树 枝状大分子控制。这些材料具有宿主的溶解性和相容性并且具有包嵌 分子(guest molecule)(即允许成像的分子)的光学或生理特性。尽 管树枝状大分子宿主可以根据介质的不同而改变，但是能够给树枝状 大分子宿主加载不同的化合物和不同的客体浓度水平。复合物和组合 物可以涉及各种金属或其它无机材料的应用。这些物质的高电子密度 明显简化了通过电子显微镜术和相关散射技术的成像。此外，无机原 子的特性引入了在存在或不存在干扰性生物材料下用于成像的新的和 可测定的特性。在本发明的某些实施方案中，将包囊的金、银、钴、 铁原子/分子和/或无机染料分子，诸如荧光素包囊入树枝状大分子以 便用作nanoscopic复合物标记/示踪物，不过，可以使用有利于成像 或检测的任意材料。在一个优选的实施方案中，成像剂为异硫氰酸荧 光素。
在本发明的某些实施方案中，成像基于对研究的复杂物质的选择 的物理特性中密度的局部差异的被动或主动观察结果。这些差异可能 是因不同形状(例如通过原子力显微镜检查检测的质量密度)、改变的 组成(例如通过X射线检测的射线不透性)、不同的光发射(例如通过分 光光度法检测的荧色物)、不同的衍射(例如通过TEM检测的电子束)、 对比的吸收(例如通过光学方法检测的光)或专用的辐射发射(例如同 位素方法)等所致。因此，成像的质量和灵敏度取决于观察到的特性和 使用的技术。癌细胞的成像技术必须提供对观察小的局部浓度的选择 细胞的足够水平的灵敏度。最初的癌标记鉴定需要高度选择性(即通过 适当靶向提供的高度特异性识别)和最高可能的灵敏度。
A.磁共振成像
一旦靶向的纳米装置结合(或已经摄入)肿瘤细胞，则该装置上的 一种或多种组件用于使其位置成像。树枝状大分子已经用作生物医学 成像剂，对磁共振成像(MRI)而言，这可能是最值得注意的(例如，参 见Wiener等Mag.Reson.Med.31：1(1994)；使用PAMAM树枝状大分 子的实例)。这些试剂一般通过使螯合的顺磁性离子，诸如Gd(III)- 二亚乙基三胺五乙酸(Gd(III)-DTPA)与水溶性树枝状大分子缀合构 成。本发明上下文中可以使用的其它顺磁性离子包括但不限于钆、锰、 铜、铬、铁、钴、铒、镍、铕、锝、铟、钐、镝、钌、镱、钇和钬粒 子及其组合。在本发明的某些实施方案中，树枝状大分子还与靶向基 团、诸如表皮生长因子(EGF)缀合，以便形成特异性结合所需细胞类型 的缀合物(例如就表达EGF、EGFR的肿瘤细胞而言)。在本发明的一个 优选的实施方案中，如Wiener所述，DTPA通过DTPA的异硫氰酸酯与 树枝状大分子结合(Wiener等Mag.Reson.Med.31：1(1994))。
树枝状大分子MRI试剂因树枝状大分子的多价性、大小和结构而 特别有效，产生具有大质子驰豫强化、高分子反应性(relaxivity) 和在靶部位上的高顺磁性离子浓度的分子。树枝状大分子钆造影剂甚 至已经用于使用动态MRI用来区分良性与恶性乳腺肿瘤，基于后一种 类型的肿瘤图像的脉管系统更为致密(Adam等Ivest.Rad. 31：26(1996))。因此，MRI提供了本发明特别有用的成像系统。
B.显微镜成像
传统上在患者体外进行癌细胞和组织的静态结构显微镜成像。组 织活组织检查的传统组织学提供了精细的例证性实例，并且已经证实 为癌诊断和治疗的有力辅助。取出后，由病理学者将样本切成薄片(例 如小于40微米)，染色，固定并且检查。如果获得图像，那么它们最 常见的是2-D传送明视野投射影像。专用的染料用于提供选择性对比， 而在未染色的组织不几乎不存在，并且还提供对异常细胞成分的鉴定。 诸如在核倍性测定中使用计算机辅助的分析对亚细胞结构特征进行定 量通常因组织学背景缺失而易混淆，这归因于样本和所有3-D信息缺 乏。尽管存在静态成像手段的局限，但是能够鉴定活组织检查组织中 的瘤形成是非常重要的。此外，其应用通常为决定进行侵害性和危险 性的化疗、手术操作和放疗组合中的关键因素，而化疗、手术操作和 放疗通常伴随严重的附带组织损害、并发症和甚至患者死亡。
本发明的纳米装置能够进行肿瘤的功能性显微镜成像并且为成像 提供改善的方法。这些方法应用于体内、体外和离体。例如，在本发 明的一个实施方案中，设计本发明的树枝状大分子以便在接触光时发 射光或其它可检测信号。尽管标记的树枝状大分子在外形上小于显微 镜检查技术的光学分辨率极限，但是它们在被激发时变成自我发光并 且易于使用光学技术观察到和可测定。在本发明的某些实施方案中， 显微镜中的传感荧光生物传感器包括使用可调谐的激发和发射过滤器 和微波源(Farkas等SPEI 2678：200(1997))。在成像剂存在于较深的 组织中的实施方案中，使用近红外(NMR)中较长的波长(例如，参见 Lester等Cel Mol.Biol.44：29(1998))。已经使用树枝状大分子 生物传感触角样结构证实了近-IR中的树枝状大分子的生物传感 (Shortreed等J.Phys.Chem.，101：6318(1997))。用于本发明的生 物传感器包括但不限于荧光染料和分子指示标。
在本发明的某些实施方案中，使用功能性成像技术进行体内成像。 功能性成像为与静态结构成像互补性的并且可能为比静态结构成像更 有效力的技术。已知功能性成像最好应用于在宏观水平上，其中实例 包括磁共振机能成像(fMRI)和正电子发射断层摄影术(PET)。然而，也 进行功能性显微镜成像并应用于活组织的体内和离体分析。功能性显 微镜成像为3-D成像、3-D空间多谱体积排布和临时取样的有效组合： 简言之，为一种3-D光谱显微镜影片循环类型。有意义的是，细胞和 组织自发荧光。当被几种波长激发时，提供众多基本3-D结构需要在 无特异性标记的情况下表征几种细胞成分(例如核)。斜光照射也用于 采集结构信息并且通常使用。与结构光谱的缩微成像(microimaging) 相反，可以将光谱缩微成像用于使生理信号在细胞或组织内定位作用 的生物传感器。例如，在本发明的某些实施方案中，包含生物传感器 的本发明树枝状大分子用于使增量调节的受体家族成像，诸如叶酸盐 或EGF类。在这类实施方案中，功能性生物传感由此涉及检测与癌发 生或恶性肿瘤、甚至在其早期阶段相关的生理异常。可以使用本发明 的组合物和方法使许多生理条件成像，包括但不限于检测nanoscopic 树枝状大分子生物传感器的pH、氧浓度、Ca2+浓度和其它生理相关分 析物。
V.生物学监测成分
本发明纳米装置的生物检测或传感成分为可以监测由活性剂(例 如通过纳米装置中的治疗成分提供的治疗剂)诱导的肿瘤细胞中的特 定应答的成分。尽管本发明并不限于任何特定的监测系统，但是本发 明通过用于监测癌症肿瘤的方法和组合物来解释。在本发明优选的实 施方案中，试剂诱导细胞中的细胞凋亡并且监测涉及检测细胞凋亡。 在具体的实施方案中，监测成分为在细胞凋亡发生时在特定波长下发 荧光的试剂。例如，在一个优选的实施方案中，天冬氨酸特异性半胱 氨酸蛋白酶活性活化监测成分中的绿色荧光。已经转变成红色作为由 具有红色标记的特定标记靶向的结果的细胞凋亡性癌细胞变橙色，而 残留的癌细胞仍然为红色。如果存在，那么被诱导进行细胞凋亡的正 常细胞(例如通过附带损害)会发绿色荧光。
在这些实施方案中，荧光基团，诸如荧光素用于监测成分。荧光 素易于通过获自Molecular Probes，Inc.的异硫氰酸酯衍生物与树枝 状大分子表面结合。这允许通过共聚焦显微镜，使用细胞使纳米装置 成像。优选通过使用荧光肽酶底物对纳米装置的的效力进行传感。例 如，由治疗剂诱导的细胞凋亡导致肽酶天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白 酶-1(ICE)产生。Calbiochem销售了大量用于这种酶的释放荧光部分 的肽底物。用于本发明的特别有用的肽为：
MCA-Tyr-Glu-Val-Asp-Gly-Trp-Lys-(DNP)-NH2(SEQ ID NO：1)
其中MCA为(7-甲氧基香豆素-4-基)乙酰基，并且DNP为2，4-二 硝基苯基(Talanian等J.Biol.Chem.，272：9677(1997))。在这种 肽中，MCA基团具有显著减弱的荧光，这是因荧光共振能转移(FRET) 至DNP基团所致。当酶裂解天冬氨酸与甘氨酸残基之间的肽时，MCA 和DNP得以分离，并且MCA基团强烈发出绿色荧光(在325nm处为最 大激发并且在392nm处为最大发射)。
在本发明优选的实施方案中，肽的赖氨酸末端与纳米装置连接， 使得MCA基团在被裂解时释放入胞质溶胶。肽的赖氨酸末端为缀合的 有用的合成柄(handle)，因为，例如它可以与双官能连接基，诸如 Mal-PEG-Osu的活化酯基反应。因此，使用这些方法产生的靶细胞中 绿色荧光的出现提供了一种清晰的指示，即细胞凋亡已经开始(如果细 胞已经因存在聚集的量子点而具有红色，那么细胞从合并的颜色变成 橙色)。
应用于本发明的额外的荧光染料包括但不限于报导为对细胞凋亡 性细胞中DNA改变敏感的吖啶橙(Abrams等Development 117：29(1993))和伴随细胞凋亡的脂质过氧化敏感的顺式-十八碳四烯 酸(Hockenbery等Cell 75：241(1993))。应注意所述的肽和荧光染料 仅为举例性的。预期有效起作为细胞凋亡结果产生的天冬氨酸特异性 半胱氨酸蛋白酶底物的作用的任意肽可应用于本发明。
VI.靶向成分
如上所述，本发明的另一个组成部分在于纳米装置组合物能够特 异性靶向特定的细胞类型(例如肿瘤细胞)。尽管理解机理不一定能够 实施本发明并且本发明并不限于任何特定的作用机理，但是在某些实 施方案中，纳米装置通过细胞表面部分靶向细胞(例如肿瘤性细胞)并 且通过受体介导的胞吞被摄入细胞。
已知位于靶细胞(例如肿瘤细胞)表面上的任意部分可以应用于本 发明。例如，定向于这类部分的抗体使本发明的组合物靶向至含有该 部分的细胞表面。或者，靶向部分可以为定向于存在于细胞表面上的 受体的配体，或反之亦然。在本发明的一个优选的实施方案中，靶向 部分为叶酸受体。在某些实施方案中，靶向部分为RGD肽受体(例如 αVβ3整联蛋白)。类似地，维生素也用于使本发明的治疗剂靶向至特 定的细胞。
在本发明的某些实施方案中，靶向部分还可以作为标记成分起作 用。例如，肿瘤特异性抗原应用于本发明，包括但不限于癌胚抗原、 前列腺特异性抗原、酪氨酸酶、ras、唾液路易丝抗原(sialyly lewis 抗原)、erb、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、MN、gp100、gp75、p97、蛋 白酶3、粘蛋白、CD81、CID9、CD63；CD53、CD38、CO-029、CA125、 GD2、GM2和O-乙酰基GD3、M-TAA、M-胎儿或M-泌尿。或者，靶向部 分可以为肿瘤抑制蛋白、细胞因子、趋化因子、，肿瘤特异性受体配体、 受体、细胞凋亡诱导物或分化剂。
预期用于靶向的肿瘤抑制蛋白包括但不限于p16、p21、p27、p53、 p73、Rb、Wilns肿瘤(WT-1)、DCC、1型神经纤维瘤病(NF-1)、希-林 (VHL)病肿瘤抑制蛋白、Maspin、Brush-1、BRCA-1、BRCA-2、多种肿 瘤抑制蛋白(MTS)、人黑素瘤gp95/p97抗原、肾细胞癌-相关G250抗 原、KS 1/4泛癌抗原、卵巢癌抗原(CA125)、前列腺特异性抗原、黑 素瘤抗原gp75、CD9、CD63、CD53、CD37、R2、CD81、CO029、TI-1、 L6和SAS。当然，这些仅为典型的肿瘤抑制蛋白并且预计本发明抗原 可与任意其它为或成为本领域技术人员公知作为肿瘤阻抑制蛋白的活 性剂联用。
在本发明优选的实施方案中，靶向定向于由癌基因表达的因子。 它们包括但不限于酪氨酸激酶，既可以为膜-结合的，也可以为胞质形 式的，诸如Src家族成员；丝氨酸/苏氨酸激酶，诸如Mos；生长因子 和受体，诸如血小板衍生的生长因子(PDDG)；SMALL GTPases(G蛋白)， 包括ras家族、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(cdk)、myc家族成员中 的成员，包括c-myc、N-myc和L-myc以及bcl-2和家族成员。
本发明可以靶向的细胞因子包括但不限于IL-1、IL-2、IL-3、 IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、ILA 1、IL-12、IL-13、 IL-14、IL-15、TNF、GMCSF、β-干扰素和γ-干扰素。可以使用的趋化 因子包括但不限于M1P1α、M1P1β和RANTES。
本发明可以靶向的酶包括但不限于胞嘧啶脱氨酶、次黄嘌呤鸟嘌 呤磷酸核糖转移酶、1-磷酸半乳糖尿苷酸转移酶、苯丙氨酸羟化酶、 葡糖脑苷脂酶(glucocerbrosidase)、鞘磷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸 酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、HSV胸苷激酶和人胸苷激酶。
应用于本发明上下文中的受体及其相关配体包括但不限于叶酸受 体、肾上腺素能受体、生长激素受体、黄体生成素受体、雌激素受体、 表皮生长因子受体、成纤维细胞生长因子受体等。
应用于本发明靶向部分的激素及其受体包括但不限于生长激素、 催乳素、胎盘催乳素、黄体生成素、促卵泡激素(foilicle-stimulating hormone)、绒毛膜促性腺激素、促甲状腺激素、瘦蛋白、促肾上腺皮 质激素(ACTH)、血管紧张素I、血管紧张素II、β-内啡肽、β-促黑 激素(β-MSH)、缩胆囊素、内皮素I、促生长激素神经肽、抑胃肽(GIP)、 胰高血糖素、胰岛素、支链淀粉、促脂解素、GLP-1(7-37)神经垂体激 素运载蛋白和生长抑素。
此外，本发明预期置于纳米装置靶向成分中的维生素(脂溶性和非 -脂溶性维生素)可以用于靶向具有这些维生素的受体，或否则就是吸 收这些维生素的细胞。在这方面特别优选的是脂溶性维生素，诸如维 生素D及其类似物、维生素E、维生素A等或水溶性维生素，诸如维 生素C等。
在本发明的某些实施方案中，任意数量的癌细胞靶向基团与树枝 状大分子结合。靶向树枝状大分子依次与核心树枝状大分子缀合。因 此，本发明的纳米装置使得它对靶向癌细胞具有特异性(即更不用说结 合癌细胞且不与健康细胞结合)。此外，多价树枝状大分子能够结合聚 乙二醇(PEG)或聚乙基唑啉(PEOX)链以便有助于增加血液循环时间 并且减少缀合物的免疫原性。
在本发明优选的实施方案中，靶向基团与具有短(例如直接偶联)、 中(例如使用小-分子双官能连接基，诸如SPDP，由Pierce Chemical Company销售)或长(例如PEG双官能连接基，由Shearwater Polymers 销售)键的树枝状大分子缀合。因为树枝状大分子具有大量官能团，所 以一种以上靶向基团可以与每一树枝状大分子结合。作为结果，在树 枝状大分子与靶细胞之间存在多种结合情况。在这些实施方案中，树 枝状大分子通过″协同结合″或多价相互作用效应对其靶细胞具有极高 的亲和力。
由于空间原因，所以配体越小，那么可以结合树枝状大分子表面 的越多。近来，Wiener报导了具有结合的叶酸的树枝状大分子特别可 以蓄积在表达高亲和力叶酸受体(hFR)的肿瘤细胞表面和内部(Wiener 等Invest.Radiol.，32：748(1997))。hFR受体在上皮细胞瘤上得到 表达或增量调节，包括乳腺癌。缺乏hFR的对照细胞未表现出叶酸盐- 衍生的树枝状大分子的显著蓄积。叶酸可以与所有代的PAMAM树枝状 大分子通过碳化二亚胺偶联反应结合。叶酸为良好的树枝状大分子的 靶向候选物，因为其具有较小的大小和简单的缀合操作步骤。
较大的、而仍然属于相对小的配体为表皮生长因子(EGF)，即带有 53个氨基酸残基的单链。已经证实通过连接基SPDP与EGF缀合的 PAMAM树枝状大分子结合至人神经胶质瘤细胞的表面并被胞吞 (endocytosed)，从而蓄积在溶酶体中(Casale等Bio缀合物Chem.， 7：7(1996))。由于EGF受体密度在脑肿瘤细胞上达到高于正常细胞上 100倍，所以EGF提供了用于这些类型肿瘤的有用的靶向剂。因为EGF 受体还在乳腺和结肠癌中超表达，所以EGF也可以用作这些细胞的靶 向剂。类似地，成纤维细胞生长因子受体(EGER)也结合相对小的多肽 类(FGF)，并且已知它们中的许多以高水平在乳腺肿瘤细胞系中得到表 达(特别是附图1、2和4)(Penault-Llorca等Int.J.Cancer 61：170(1995))。
在本发明优选的实施方案中，靶向部分为抗体或抗体的抗原结合 片段(例如Fab单位)。例如，在许多癌(包括乳腺HER2肿瘤)表面上发 现的得到充分研究的抗原为糖蛋白p185，它仅在恶性细胞中得到表达 (Press等Oncogene 5：953(1990))。甚至已经证实重组人源化抗-HER2 单克隆抗体(rhuMabHER2)可抑制超表达HER2的乳腺癌细胞生长，并且 在用于肿瘤晚期乳腺癌的III期临床试验中得到了评价(与常规化疗 剂结合)(Pegram等Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.，14：106(1995))。 Park和Papahadjopoulos已经将rhuMabHER2的Fab片段与小单层脂 质体进行了结合，然后可以给其加载化疗剂多柔比星(dox)并且靶向至 超表达HER2的肿瘤异种移植物(Park等Cancer Lett.，118：153(1997) 和Kirpotin等Biochem.，36：66(1997))。这些加载了dox的″免疫脂 质体″与相应的未靶向的加载dox的脂质体或游离dox相比，表现出对 肿瘤增加的细胞毒性以及比游离dox降低的全身毒性。
可以产生抗体以便能够靶向各种生物靶标(例如病原体、肿瘤细 胞、正常组织)上的抗原或免疫原(例如肿瘤、组织或病原体特异性抗 原)。这类抗体包括但不限于多克隆、单克隆、嵌合、单链、Fab片段 和Fab表达文库。
在某些优选的实施方案中，所述的抗体识别肿瘤特异性表位(例如 TAG-72(Kjeldsen等Cancer Res.48：2214-2220(1988)；美国专利 US5,892,020；5,892,019；和US5,512,443)；人癌抗原(美国专利 US 5,693,763；US5,545,530；和US5,808,005)；来自骨瘤细胞的TP1 和TP3抗原(美国专利US5,855,866)；来自腺癌细胞的 Thomsen-Friedenreich(TF)抗原(美国专利US5,110,911)；来自人前 列腺腺癌的″KC-4抗原″(美国专利US 4,708,930和US 4,743,543)； 人结肠直肠癌抗原(美国专利US4,921,789)；来自膀胱腺癌的CA125 抗原(美国专利US4,921,790)；来自人乳腺癌的DF3抗原(美国专利US 4,963,484和US 5,053,489)；人乳腺肿瘤抗原(美国专利 US4,939,240)；人黑素瘤p97抗原(美国专利US4,918,164)；癌或血 清类粘蛋白-相关抗原(CORA)(美国专利US4,914,021)；与人鳞状细胞 肺癌反应但不与人小细胞肺癌反应的人肺癌抗原(美国专利 US4,892,935)；人乳腺癌糖蛋白中的T和Tn半抗原(Springer等 Carbohydr.Res.178：271-292(1988))；命名的MSA乳腺癌糖蛋白 (Tjandra等Br.J.Surg.75：811-817(1988))；MFGM乳腺癌抗原 (Ishida等Tumor Biol.10：12-22(1989))；DU-PAN-2胰腺癌抗原(Lan 等Cancer Res.45：305-310(1985))；CA125卵巢癌抗原(Hanisch等 Carbohydr.Res.178：29-47(1988))；YH206肺癌抗原(Hinoda等(1988) Cancer J.42：653-658(1988))。特别将上述各参考文献引入本文作 为参考。
在其它优选的实施方案中，所述的抗体识别特异性病原体(例如侵 肺军团菌(Legionella peomophilia)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、流感嗜血杆 菌(Hemophilus influenzae)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、苍白密螺旋体(Treponema pallidum)、炭疽芽孢杆 菌(Bacillus anthracis)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、布氏疏螺 旋体(Borrelia burgdorferi)、白喉棒杆菌(Cornebacterium diphtheria)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、人乳 头状瘤病毒、人免疫缺陷症病毒、德国麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒等)。
本领域中公知的各种操作步骤可用于生产多克隆抗体。为了生产 抗体，可以通过注射相应于所需表位的肽对各种宿主动物进行免疫接 种，包括但不限于家兔、小鼠、大鼠、绵羊、山羊等。在一个优选的 实施方案中，使所述的肽与免疫原性载体缀合(例如白喉类毒素、牛血 清白蛋白(BSA)或钥孔血蓝蛋白(KLH))。各种佐剂用于根据宿主种类 的不同增加免疫应答，包括弗氏(完全和不完全)佐剂；矿物凝胶，诸 如氢氧化铝；表面活性物质，诸如溶血卵磷脂；普卢兰尼克多元醇类； 聚阴离子；肽类；油乳剂；钥孔血蓝蛋白；二硝基苯酚；和潜在有 用的人佐剂，诸如BCG(卡介苗)和小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。
为了制备单克隆抗体，可以使用提供由培养物中的连续细胞系产 生抗体分子的技术(例如，参见Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)。它们包括但不限于：Kohler和Milstein研 发的杂交瘤技术(Kohler和Milstein，Nature 256：495-497(1975))； 以及三源杂交瘤技术；人B-细胞杂交瘤技术(例如，参见Kozbor等 Immunol.Today 4：72(1983))和产生人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术 (Cole等在Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R. Liss，Inc.，pp.77-96(1985)中所述)。
在本发明一个额外的实施方案中，可以使用最新技术在无菌动物 中产生单克隆抗体(例如，参见PCT/US90/02545)。按照本发明，可以 使用人抗体并且可以使用人杂交瘤(Cote等Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.80：2026-2030(1983))或通过在体外用EBV病毒转化人细胞 B(Cole等在Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R. Liss，pp.77-96(1985)中所述)获得该抗体。
按照本发明，为生产单链抗体描述的技术(美国专利 US4,946,778；引入本文作为参考)可以适合于生产特异性单链抗体。 本发明额外的实施方案使用了为构建Fab表达文库描述的技术(Huse 等Science 246：1275-1281(1989))以便能够快速和方便地鉴定具有所 需特异性的单克隆Fab片段。
可以通过公知技术产生含有抗体分子的独特型(抗原结合区)的抗 体片段。例如，这类片段包括但不限于：可以通过抗体分子的胃蛋白 酶消化产生的F(ab′)2片段；可以通过还原F(ab′)2片段的二硫键产 生的Fab′片段；和可以通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子产生 的Fab片段。
在生产抗体的过程中，可以通过本领域公知的技术进行所需抗体 的筛选(例如放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、″夹心式″免 疫测定、免疫放射测定、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、原位 免疫测定(例如，使用胶态金、酶或放射性同位素)、蛋白质印迹、沉 淀反应、聚集测定(例如凝胶聚集测定、血细胞凝集测定等)、补体结 合测定、蛋白质A测定和免疫电泳测定等)。
本发明的树枝状大分子系统具有超过脂质体的许多优点，诸如其 更大的稳定性、对大小和多分散性的更好控制，以及一般更低的毒性 和免疫原性(例如，参见Duncan等Polymer Preprints 39：180(1998))。 因此，在本发明的某些实施方案中，抗-HER2抗体片段以及其它靶向 抗体与树枝状大分子缀合，作为本发明纳米装置的靶向剂。
在某些实施方案中，就癌症(例如乳腺癌)而言，用针对肿瘤相关 抗原原MUC1、cMet受体和CD56(NCAM)的叶酸、EGF、FGF和抗体(或抗 体片段)靶向细胞表面。一旦被摄入细胞，纳米装置就结合(通过缀合 的抗体)HER2、MUC1或突变的p53。
双官能连接基SPDP和SMCC和较长的Mal-PEG-OSu连接基特别用 于抗体-树枝状大分子缀合。此外，许多肿瘤细胞含有结合寡糖类的表 面凝集素，其中特异性识别主要归因于后者的末端碳水化合物残基 (Sharon和Lis，Science 246：227(1989))。合适的单糖类与非糖基 化蛋白质、诸如BSA的结合提供了比游离单糖更紧密结合肿瘤凝集素 的缀合物(Monsigny等Biochemie 70：1633(1988))。
甘露糖基化PAMAM树枝状大分子结合甘露糖苷-结合凝集素比单 体甘露糖苷结合甘露糖苷-结合凝集素更为紧密达400倍以上(Page和 Roy，生物缀合物Chem.，8：714(1997))。唾液酸化树枝状大分子和 其它树枝状聚合物在体外和体内结合和抑制各种唾液酸盐-结合病毒。 通过使多单糖残基(例如用于结合半乳糖的细胞的α-半乳糖苷)与树 枝状大分子缀合，产生对相应类型肿瘤细胞具有高度亲和力的多价缀 合物。所述附着反应易于通过末端胺类与商购α-半乳糖基-苯基异硫 氰酸酯反应来进行。碳水化合物的小尺寸允许高浓度存在于树枝状大 分子表面上。
鉴定和选择合适的肽靶向基团的极为灵活的方法为噬菌体展示技 术(例如，参见Cortese等Curr.Opin.Biotechol.，6：73(1995))， 其可以使用商购试剂盒便利地进行。噬菌体展示方法产生附着于噬菌 体表面的肽类的大而不同的组合文库，筛选针对固定化表面受体的肽 类用于紧密结合。在紧密结合后，分离病毒构建体并且测序以便鉴定 肽序列。使用最佳肽类作为用于下一个肽文库的起点重复该循环。最 终鉴定了合适的高亲和力肽类且然后对其筛选生物相容性和靶特异 性。在这种方式中，能够产生可以缀合树枝状大分子的肽类，从而产 生具有对靶细胞受体(例如肿瘤细胞受体)或其它所需靶标具有高度特 异性和亲和力的多价缀合物。
涉及上述靶向手段的为″预靶向″手段(例如，参见Goodwin和 Meares，Cancer(suppl.)80：2675(1997))。该策略的实例包括开始 用肿瘤特异性单克隆抗体和链霉抗生物素蛋白缀合物治疗患者。使用 合适的生物素化清除剂从血流中除去剩余的可溶性缀合物。当定位于 肿瘤的缀合物均保留时，导入生物素化剂，由此通过强力和特异性生 物素-链霉抗生物素蛋白相互作用定位于肿瘤部位。因此，以与癌细胞 接近的剂量使放射性剂量最大化并且将它在可能损害健康细胞的剩余 部分身体中的量减少到最低限度。
已经证实，如果首先用生物素化树枝状大分子处理结合聚苯乙烯 的链霉抗生物素蛋白分子且然后引入放射性标记的链霉抗生物素蛋 白，那么每个聚苯乙烯-结合的链霉抗生物素蛋白中有达4个标记的链 霉抗生物素蛋白分子(Wilbur等Bio缀合物Chem.，9：813(1998))。 因此，生物素化树枝状大分子可以用于本发明的方法中，从而作为用 于体内放射性标记的多价受体起作用，其中对所得的每次结合的抗体 缀合物中的放射性剂量进行扩大。在本发明优选的实施方案中，簇状 树枝状大分子上的一种或多种多-生物素化组件提供了放射性标记或 硼酸化(Barth等Cancer Investigation 14：534(1996))抗生物素蛋 白或链霉抗生物素蛋白的多价靶标，从而再次产生用于肿瘤细胞的扩 大的放射剂量。
树枝状大分子还可以用作清除剂，例如，通过使具有多价半乳糖 或甘露糖表面的树枝状大分子部分生物素化来进行。然后缀合物-清除 剂复合物可以对相应的肝细胞受体具有极强的亲和力。
在本发明其它的实施方案中，增强的渗透性和保留(EPR)方法用于 靶向。增强的渗透性和保留(EPR)效应为更″被动的″靶向肿瘤方式(参 见Duncan和Sat，Ann.Oncol.，9：39(1998))。EPR效应为由肿瘤的 超渗透性脉管系统和极弱的淋巴管引流导致的大分子和小颗粒在肿瘤 微环境中的选择性集中。本发明的树枝状大分子组合物为此应用提供 了理想的聚合物，即它们相对较硬，多分散性有限，大小和表面化学 受控以及具有可以携带且然后释放抗肿瘤药物的内部″负荷″空间。实 际上，已经证实PAMAM树枝状大分子-铂酸盐可蓄积在实体瘤内(Pt水 平高于使用顺铂获得的Pt水平约50倍)，并且具有顺铂对其不具有作 用的实体瘤模型中的体内活性(Malik等Proc.Int′l.Symp.Control. Rel.Bioact.Mater.，24：107(1997)和Duncan等Polymer Preprints 39：180(1998))。
本发明的靶向部分可以识别生物靶标(例如病原体上)上的各种其 它表位。在某些实施方案中，引入分子识别元件以便识别、靶向或检 测各种病原生物体，包括但不限于：靶向HIV(Wies等Nature 333： 426(1988))、流感(White等Cell 56：725(1989))、衣原体属 (Chlamydia)(Infect.Imm.57：2378(1989))、脑膜炎萘瑟氏球菌 (Neisseria meningitidis)、猪链球菌(Streptococcus suis)、 沙门氏菌属(Salmonella)、腮腺炎、新城疫和各种病毒的唾液酸， 所述的病毒包括呼肠病毒、仙台病毒和粘液病毒；和靶向冠形病毒、 脑脊髓炎病毒和轮状病毒的9-OAC唾液酸；检测巨细胞病毒(Virology 176：337(1990))和麻疹病毒(Virology 172：386(1989))的非-唾液 酸糖蛋白；靶向HIV的CD4(Khatzman等Nature 312：763(1985))、 肠道血管活性肽(Sacerdote等J.of Neuroscience Research 18： 102(1987))和肽T(Ruff等FEBS Letters 211：17(1987))；靶向牛痘 的表皮生长因子(Epstein等Nature 318：663(1985))；靶向狂犬病 的乙酰胆碱受体(Lentz等Science 215：182(1982))；靶向EB病毒 的Cd3补体受体(Carel等J.Biol.Chem.265：12293(1990))；靶 向呼肠病毒的β-肾上腺素能受体(Co等Proc.Natl.Acad.Sci.82： 1494(1985))；靶向鼻病毒的ICAM-1(Marlin等Nature 344： 70(1990))、N-CAM和髓磷脂-相关糖蛋白MAb(Shephey等Proc.Natl. Acad.Sci.85：7743(1988))；靶向脊髓灰质炎病毒的脊髓灰质炎病 毒受体(Mendelsohn等Cell 56：855(1989))；靶向疱疹病毒的成纤 维细胞生长因子受体(Kaner等Science 248：1410(1990))；靶向大 肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)的寡甘露糖；靶向脑膜炎萘瑟氏 球菌(Neissetia meningitidis)的神经节苷脂G.sub.M1；和检测广 泛各种病原体的抗体(例如淋病奈瑟氏球菌(Neissetia gonorrhoeae)、创伤弧菌(V.vulnificus)、副溶血弧菌(V. parahaemolyticus)、霍乱弧菌(V.cholerae)和解藻朊酸弧菌(V. alginolyticus))。
在本发明的某些实施方案中，靶向部分优选为核酸(例如RNA或 DNA)。在某些实施方案中，设计核酸的靶向部分以便通过碱基配对与 特定核酸(例如染色体DNA，mRNA或核糖体RNA)杂交。在其它实施方 案中，核酸结合配体或生物靶标。已经鉴定了结合下列蛋白质的核酸： HIV的逆转录酶、Rev和Tat蛋白(Tuerk等Gene 137(1)：33-9(1993))； 人神经生长因子(Binkley等Nuc.Acids Res. 23(16)：3198-205(1995))；和血管内皮生长因子(Jellinek等Biochem. 83(34)：10450-6(1994))。优选通过SELEX操作步骤鉴定结合配体的核 酸(例如，参见美国专利US5,475,096；US5,270,163；和US5,475,096； 和在PCT公开号WO 97/38134、WO 98/33941和WO 99/07724，将所有 这些文献引入本文作为参考)，不过许多方法为本领域中公知的。
VII.合成和缀合
本发明提供了纳米装置中的各组分(即含有上述成分中的一种或 多种的各树枝状大分子)合成和形成以及这类组分与树枝状大分子缀 合的描述。
在本发明优选的实施方案中，按照典型分支(由引发剂核构成大分 子)合成制备PAMAM树枝状大分子。它包括两步生长顺序，由氨基与丙 烯酸甲酯(MA)的双键的Michael加成，随后用乙二胺(EDA)使所得末端 甲酯基--(CO2CH3)酰胺化组成。
在该方法的第一步中，使氨在47℃下和惰性氮气环境中与MA(摩 尔比：1∶4.25)反应48小时。所得化合物称作第0代星形-支化PAMAM 三-酯。下一步包括使三-酯与过量的EDA反应而产生星形-支化的 PAMAM三-胺(G＝O)。在惰性气体(氮气)环境和甲醇中进行该反应并且 需要在0℃下48小时完成。重复此Michael加成和酰胺化顺序产生第 1代。
这种三-胺的制备完成了PAMAM树枝状大分子的分支合成的第一 个完整循环。重复该反应顺序导致合成较高代的(G＝1-5)树枝状大分子 (即分别为酯-和胺-封端的分子)。例如，第二次重复这一顺序产生分 别带有六-酯和六-胺表面的第1代。按照与所有随后1-9代相同的方 式进行相同的反应，从而构成了产生核心-外壳结构的分支单元层，该 结构如上所示具有精确的分子量和端基数量。可以通过水解-酯封端的 PAMAM树枝状大分子或使琥珀酸酐与以胺为表面的树枝状大分子(例 如全代PAMAM、POPAM或POPAM-PAMAM杂交树枝状大分子)反应产生以 羧酸酯为表面的树枝状大分子。
可以基于启动聚合过程的核心结构合成各种树枝状大分子。这些 核心结构指定了树枝状大分子的结构重要特征，诸如总体形状、密度 和表面官能度(Tomalia等Angew.Chem.Int.Ed.Engl.， 29：5305(1990))。来源于氨的球形树枝状大分子具有三价引发剂核心， 而EDA为四-价引发剂核心。近来，已经报导了棒形树枝状大分子基于 不同长度的线性聚(乙烯亚胺)核心，核心越长，则棒越长(Yin等J.Am. Chem.Soc.，120：2678(1998))。
在优选的实施方案中，本发明的树枝状大分子包含被保护的核心 二胺。在特别优选的实施方案中，被保护的引发剂核心二胺为 NH2-(CH2)n-NHPG(n＝1-10)。在其它优选的实施方案中，引发剂核心选 自下组，包括但不限于NH2-(CH2)n-NH2(n＝1-10)、 NH2-((CH2)nNH2)3(n＝1-10)或未取代或取代的1，2-；1，3-；或1，4-亚 苯基二-正-烷基胺，其中在每代酰胺形成过程中使用单被保护的二胺 (例如NH2-(CH2)n-NHPG)。在这些手段中，被保护的二胺能够大规模产 生树枝状大分子，而不产生不均匀的可能使表征和分析产生困难的纳 米结构。通过将二胺的反应性仅限于一个末端，二聚体/聚合物形成和 分子内反应的机会就会被消除而无需使用大量过量的二胺。易于纯化 末端单被保护的中间体，因为保护基为通过传统技术、如结晶和/或色 谱进行生产纯化提供合适的处理。
可以在脱保护步骤中使被保护的中间体脱保护，并且使所得代的 树枝状大分子进行接下来的反复化学反应而无需纯化，本发明并不限 于特定的保护基。实际上，关注各种保护基，包括但不限于叔丁氧基 氨基甲酸酯(N-t-Boc)、烯丙氧基氨基甲酸酯(N-Alloc)、苄基氨基甲 酸酯(N-Cbz)、9-芴基甲基氨基甲酸酯(FMOC)或邻苯二甲酰亚胺 (Phth)。在本发明优选的实施方案中，保护基为苄基氨基甲酸酯 (N-Cbz)。N-Cbz对本发明而言是理想的，因为它易于在″中性″条件下 通过催化氢化(Pd/C)被裂解，而无需采取强酸或碱条件除去F-MOC。 被保护的单体特别应用于高流通量生产过程，因为可以使用较低量的 单体，从而降低了生产成本。
可以通过任意合适的分析技术表征树枝状大分子的大小和均匀 性。它们包括但不限于原子力显微镜检查法(AFM)、电喷射离子化质谱、 MALDI-TOF质谱、13C核磁共振分光光度法、高效液相色谱法(HPLC)、 大小排阻色谱法(SEC)(安装了多角度激光散射、双重UV和折射指数检 测器)、毛细管电泳和凝胶(get)电泳。这些分析方法可以确保树枝 状大分子群体的均匀性并且在树枝状大分子生产的质量控制方面是重 要的，以便最终在体内施用中的应用。最重要的是，已经使用树枝状 大分子进行了广泛工作，当通过静脉内给予时，未显示出毒性证据 (Roberts等J.Biomed.Mater.Res.，30：53(1996)和Boume等J. Magnetic Resonance Imaging，6：305(1996))。
VIII.纳米装置抗肿瘤功效和毒性的评价
可以使用本发明的纳米装置评价不同治疗剂对癌细胞系和原代细 胞培养物的抗肿瘤作用。例如，在优选的实施方案中，使用建立的肿 瘤细胞系模型或原代培养细胞(参见例如实施例10-12)在体外进行试 验，或者，可以使用动物模型在体内进行试验(参见例如实施例13)。
A.体外人肿瘤细胞细胞凋亡诱导的定量
在本发明的一个典型实施方案中，本发明的纳米装置用于检测体 外人肿瘤细胞的细胞凋亡。对细胞中细胞凋亡的测试确定了治疗剂的 功效。可以且应测定细胞凋亡的多个方面。这些方面包括那些如上所 述的方面以及如下方面，包括但不限于对磷脂酰丝氨酸(PS)从质膜内 易位到外表面的测定；DNA片段化的测定；细胞凋亡相关蛋白质的检 测；和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3活性的测定。
B.体外毒理学
在本发明的某些实施方案中，为了获得对特定纳米装置平台或该 系统组分的安全性的一般性洞察，进行毒性测试。毒理学信息可以来 源于许多来源，包括但不限于历史数据库、体外测试和体内动物研究。
近年来体外毒理学方法已经得到了普及，这是因对动物实验的选 择需要的增加和可能的伦理、经济和科学价值的感知的增加所致。体 外毒性测试系统具有许多优势，包括改善的功效、降低的成本和实验 之间的变异性降低。这些系统还减少了动物的使用、消除了混乱的全 身作用(例如免疫性)并且控制了环境条件。
尽管任何体外测试系统可以用于本发明，但是用于体外实验的最 常用手段为使用培养的细胞模型。这些系统包括新鲜分离的细胞、原 代细胞或转化的细胞培养物。作为研究体外毒理学的细胞培养物因快 速筛选多种培养物而是有利的，从而在细胞、亚细胞或分子水平上鉴 定和评价毒性作用是有用的。体外细胞培养方法通常通过测定膜的完 整性、代谢活性和亚细胞干扰而显示出基本的细胞毒性。常用的膜完 整性指示剂包括细胞存活率(细胞计数)、克隆扩充试验、锥虫蓝排除、 胞内酶释放(例如乳酸脱氢酶)、小离子(K1、Ca2+)的膜渗透性和小分子 (例如51Cr、琥珀酸盐)的胞内Ala蓄积。亚细胞干扰包括例如通过MTT 试验监测线粒体酶活性水平、测定细胞三磷酸腺苷(ATP)水平、中性红 摄入溶酶体和对总蛋白质合成定量。代谢活性指示剂包括谷胱甘肽含 量、脂质过氧化(peroxiidation)和乳酸盐/丙酮酸盐比例。
C.MTT测定法
MTT试验为快速、精确和可靠的获得细胞存活率测定值的方法。 MTT测定法首先由Mosmann(Mosmann，J.Immunol.Meth.， 65：55(1983))研发。它是一种许多实验室已经用于获得毒性结果的简 单的比色测定法(例如，参见Kuhlmann等Arch.Toxicol.， 72：536(1998))。简言之，线粒体产生ATP以便为细胞提供足够的能量。 为了达到这一目的，线粒体代谢丙酮酸盐而产生乙酰CoA。在线粒体 内，乙酰CoA与不同的酶在三羧酸循环中反应，得到随后产生的ATP。 特别用于MTT测定的酶为琥珀酸脱氢酶。MTT(溴化3-(4，5-二甲基噻 唑-2-基)-2二苯基四唑盐)为一种通过琥珀酸脱氢酶裂解而形成紫色 甲产物的黄色底物。色素改变鉴定了线粒体功能的改变。不存活的 细胞胞内不能产生甲，且由此直接产生的量与存活细胞的量相关。 540nm处的吸收度用于测定甲产物的量。
将体外试验结果与体内毒性试验比较以便推断得到活的动物条件 (例如参见实施例13)。一般而言，评价单剂量物质的急性毒性。在14 天内监测动物的任何毒性征兆(体温增加、呼吸困难、死亡等)。按照 传统，急性毒性标准为半数致死量(LD50)，其为致半数治疗群体死亡时 的预测剂量。测定该剂量通过使测试动物在受控条件下接触几何学系 列的剂量来进行。其它试验包括亚急性毒性测试，它测定动物对重复 剂量的纳米装置不超过14天的反应。亚慢性毒性测试包括将重复剂量 测试90天。慢性毒性测试与亚慢性测试相似，但是可以持续90-天期 限以上。还可以进行体内测试以便测定某些组织方面的毒性。例如， 在本发明的某些实施方案中，测定了肿瘤毒性(即本发明组合物对肿瘤 组织存活的作用)(例如通过检测肿瘤组织大小和/或生长的改变)。
IX.基因疗法载体
在本发明的具体实施方案中，树枝状大分子组合物包含用于在体 外、离体或体内递送至靶细胞或组织并且用于表达的转基因。在这类 实施方案中，树枝状大分子复合物包含表达载体构建体而不含实际的 蛋白质，所述的表达载体构建体例如含有编码所关注基因的异源DNA 和有利于所关注的特定蛋白质在靶细胞中产生的各种调节元件。
在某些实施方案中，基因为用于治疗癌症、取代缺陷基因的治疗 基因或用于选择或监测目的的标记或报道基因。就基因疗法载体而言， 基因可以为DNA的异源片段。异源DNA可以来源于一种以上来源(即多 基因构建体或融合蛋白)。此外，异源DNA可以包括来源于一种来源的 调节序列和来源于不同来源的基因。
组织-特异性启动子可以用于影响特定组织或细胞中的转录以便 降低对非靶向组织的潜在的毒性或不需要的作用。例如，诸如PSA、 probasin、前列腺酸性磷酸酶或前列腺-特异性腺激肽释放酶(hK2)这 类启动子可以用于靶向前列腺中的基因表达。类似地，启动子可以用 于靶向其它组织中的基因表达(例如胰岛素、弹性蛋白淀粉酶pdr-1、 pdx-1和葡萄糖激酶启动子靶向至胰腺；白蛋白PEPCK、HBV增强子、 α胎儿球蛋白载脂蛋白C、α-1抗胰蛋白酶、卵黄原蛋白、NF-AB和运 甲状腺素蛋白启动子靶向至肝；肌球蛋白H链、肌酸激酶、营养障碍 基因、钙蛋白酶p94、骨骼α-肌动蛋白、快肌钙蛋白1启动子靶向至 骨骼肌；角蛋白启动子靶向皮肤；sm22α；SM-.α.-肌动蛋白启动子 靶向平滑肌；CFTR；人细胞角蛋白18(K18)；肺表面活性蛋白A、B和 Q CC-10；P1启动子靶向肺组织；内皮素-1；E-选择蛋白；冯维勒布 兰德因子；KDR/flk-1靶向内皮；酪氨酸酶靶向黑素细胞)。
核酸可以为cDNA或基因组DNA。核酸可以编码任意合适的治疗蛋 白。优选核酸编码肿瘤抑制蛋白、细胞因子、受体、细胞凋亡诱导物 或分化剂。核酸可以为反义核酸。在这类实施方案中，可以将反义核 酸引入表达载体环境外部的本发明的纳米装置。
在优选的实施方案中，核酸编码肿瘤抑制蛋白、细胞因子、受体 或细胞凋亡诱导物。合适的肿瘤抑制蛋白包括BRCA1、BRCA2、C-CAM、 p16、p211、p53、p73或Rb。合适的细胞因子包括GMCSF、IL-1、IL-2、 IL-3、IL-4、IL-5、IL6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、 IL-13、IL-14、IL-15、β-干扰素、γ-干扰素或TNF。合适的受体包括 CFTR、EGFR、雌激素受体、IL-2受体或VEGFR。合适的细胞凋亡诱导 物包括AdE1B、Bad、Bak、Bax、Bid、Bik、Bim、Harakiri或ICE-CED3 蛋白酶。
X.联合疗法的方法
耐受DNA损伤剂的肿瘤细胞代表了临床肿瘤学中的主要问题。本 发明的纳米装置通过有效给予联合疗法手段提供改善这一难题的方 式。然而，应注意传统的联合疗法可以与本发明的纳米装置联用。例 如，在本发明的某些实施方案中，可以在传统疗法之前、之后或与传 统疗法联合使用纳米装置。
为了在联合疗法中使用本发明的方法和组合物杀伤细胞，抑制细 胞生长或转移或血管发生，乃至使肿瘤细胞的恶性表型逆转或减少， 使″靶″细胞接触本文所述纳米装置组合物和至少一种其它活性剂。以 有效杀伤或抑制细胞组织的联合用量提供这些组合物。该方法可以包 括使细胞同时接触所述的免疫治疗剂和所述的活性剂或因子。可以通 过使细胞接触包括两种活性剂的单一组合物或药物制剂，或通过使细 胞同时接触两种不同组合物或制剂来实现这一目的，其中一种组合物 包括：例如表达构建体，而另一种组合物包括治疗剂。
或者，纳米装置肿瘤可以在间隔几分钟到几周在另一种活性剂治 疗之前或之后进行。在另一种活性剂和免疫疗法单独应用于细胞的实 施方案中，一般可以确保显著的时间期限不会在每次递送时间之间中 断，使得活性剂和纳米装置仍然能够对细胞发挥有利的联合作用。在 这类情况中，预期使细胞在约12-24小时内，并且更优选在约6-12 小时内彼此接触两种这两种形式(modality)，最优选仅约12小时的 延迟时间。然而，在某些情况中，需要为治疗显著延长时间期限，其 中在相应的给药之间存在几天(2-7)到几周(1-8)的推移。
在某些实施方案中，使用一种以上本发明免疫治疗组合物或其它 活性剂的给药。可以使用各种组合，其中树枝状大分子为″A″，而另一 种活性剂为″B″，以如下为典型：
A/B/A，B/A/B，B/B/A，A/A/B，B/A/A，A/B/B，B/B/B/A， B/B/A/B，A/A/B/B，A/B/A/B，A/B/B/A，B/B/A/A，B/A/B/A，B/A/A/B， B/B/B/A，A/A/A/B，B/A/A/A，A/B/A/A，A/A/B/A，A/B/B/B，B/A/B/B， B/B/A/B。
也预期其它组合。此外，为了实现杀伤细胞，以有效杀伤或使细 胞失去活力的联合用量将两种活性剂递送至细胞。
可以用于与本发明纳米装置的联合疗法的其它因素包括但不限于 产生DNA损害的因素，诸如.γ.-射线、X-射线和/或放射性同位素至 肿瘤细胞的定向递送。还关注其它形式的DNA损害因素，诸如微波和 UV-照射。X-射线的剂量范围在50-200伦琴的每日剂量，持续延长的 时间期限(3-4周)，到2000-6000伦琴的单剂量。放射性同位素的 剂量范围可以广泛改变，并且取决于同位素的半衰期、发射的射线的 强度和类型以及被肿瘤性细胞的摄入量。本领域技术人员参照 ″Remington′s Pharmaceutical Sciences″15th Edition，chapter 33， 特别是624-652页。剂量上的某些变化当然取决于所治疗的受试者的 病情。负责给药的人在任何情况下均可以决定对个体受试者的合适剂 量。此外，对人体给药而言，制剂应满足如FDA Office of Biologics 标准所要求的无菌性、热原性、全身安全性和纯度标准。
在本发明优选的实施方案中，将纳米装置对患有癌症的患者的局 部递送用于使递送活性剂的治疗有效性最大化。类似地，可以使包含 一种或多种官能团的纳米装置(例如治疗剂，诸如化疗剂或放疗剂)定 向于受试者身体特定的受侵害区域。或者，在某些情况中，全身递送 纳米装置(nanodevide)(例如包含治疗剂、靶向剂和/或成像剂的树 枝状大分子)是合适的，例如，其中已经发生广泛转移或怀疑发生转移。
除合并纳米装置与化疗和放疗外，还关注使用传统的基因疗法。 例如，靶向p53或p16突变与纳米装置的治疗可以提供改善的抗癌治 疗。本发明关注与其它治疗相关基因的共同治疗，包括但不限于p21、 Rb、APC、DCC、NF-I、NF-2、BCRA2、p16、FHIT、WT-I、MEN-I、MEN-II、 BRCA1、VHL、FCC、MCC、ras、myc、neu、raf erb、src、fms、jun、 trk、ret、gsp、hst、bcl和abl。
使用为用于特定受试者的特定构建体的基因递送而研发的合适的 方法施用体内和离体治疗。例如，就病毒载体而言，一般将1×104， 1×105，1×106，1×107，1×108，1×109，1×1010，1×1011 或1×1012感染颗粒递送至患者。可以通过比较相应的摄取效率对脂 质体或其它非病毒制剂推定类似的数据。
本发明有吸引力的特征在于可以通过医用装置将治疗组合物递送 至患者的局部位置。适用于本发明的医用装置包括已知用于治疗剂局 部递送的装置。这类装置包括但不限于：导管，诸如注射导管、球形 导液管、双球形导液管、微孔性球形导液管、通道球形导液管、输注 导管、灌流导管等，例如，给它们涂敷治疗剂或通过它们给予活性剂； 针状注射装置，诸如皮下注射针和针状注射导管：；针状注射装置，诸 如喷射注射器；涂敷的支架、分叉的支架、血管移植物等；和涂敷的 血管-咬合装置，诸如金属线圈。
典型的装置描述在美国专利US5,935,114；US5,908,413； US5,792,105；US5,693,014；US5,674,192；US5,876,445； US5,913,894；US5,868,719；US5,851,228；US5,843,089； US5,800,519；US5,800,508；US5,800,391；US5,354,308； US5,755,722；US5,733,303；US5,866,561；US5,857,998； US5,843,003；和US5,933,145；将这些文献的全部内容引入本文作为 参考。商购和可以用于本发明的典型支架包括RADIUS(Scimed Life Systems，Inc.)、SYMPHONY(Boston Scientific Corporation)、 Wallstent(Schneider Inc.)、PRECEDENT II(Boston Scientific Corporation)和NIR(Medinol Inc.)。通过公知技术将这类装置递送 至和/或植入体内的靶位置。
XI.光动力疗法
在某些实施方案中，本发明的治疗复合物包含对患者给予的光动 力化合物和靶向剂。在某些实施方案中，然后使靶向剂与″靶″细胞结 合一定时间期限(例如约1分钟-24小时)，从而形成靶细胞-靶向剂 复合物。在某些实施方案中，然后照射包含靶向剂和光动力化合物的 治疗复合物(例如用红光激光器、白炽灯、X-射线或滤过的日光)。在 某些实施方案中，使光定向于颈静脉或某些其它表浅血管或淋巴管。 在某些实施方案中，单线态氧和自由基从光动力化合物扩散至靶细胞 (例如癌细胞或病原体)，从而导致其破坏。
XII.药物制剂
在本发明的某些实施方案中，如果关注临床应用，那么制备纳米 装置作为适合于指定应用的形式药物组合物的组成部分。一般而言， 这要求制备基本上不含热原和其它可能对人或动物有害的杂质的组合 物。然而，在本发明的某些实施方案中，使用本文所述途径中的一种 或多种给予直链树枝状大分子制剂。
在优选的实施方案中，将纳米装置与合适的盐和缓冲液联用以便 以稳定的形式递送组合物，从而能够被靶细胞摄取。当将纳米装置导 入患者时，还可以使用缓冲液。含水组合物包含对分散于药学上可接 受的载体或含水介质中的细胞而言有效量的纳米装置。这类组合物也 称作接种物。术语″药学上可接受的或药理学上可接受的″意旨在对动 物或人给予时不产生不利、过敏性或其它不良反应的分子本体和组合 物。本文所用的术语″药学上可接受的载体″包括任意和所有的溶剂、 分散介质、包衣材料、抗菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延缓剂等。除 与本发明载体或细胞不相容的任何常用介质或试剂外，各种它们在治 疗组合物中的应用。还可以将补充的活性组分掺入组合物。
在本发明的某些实施方案中，活性组合物包括传统的药物制剂。 本发明这些组合物的给药通过任意常用的途径进行，只要靶组织可通 过该途径得到。这种途径包括口服、鼻部、口含、直肠、阴道或局部。 或者，给药可以通过常位、真皮内、皮下、肌内、腹膜内或静脉内注 射进行。
还可以通过非肠道或腹膜内或肿瘤内给予活性纳米装置。制备作 为游离碱或药理学可接受的盐的活性化合物在适当混合有表面活性 剂，诸如羟丙基纤维素的水中的溶液。还可以制备在甘油、液体聚乙 二醇及其混合物和油中的分散体。在常规的储存和使用条件下，这些 制剂含有防止微生物生长的防腐剂。
在某些实施方案中，本发明提供了包含树枝状大分子的组合物， 所述的树枝状大分子包含靶向剂、治疗剂和成像剂。在优选的实施方 案中，将树枝状大分子在体内递送治疗剂(例如甲氨蝶呤)至肿瘤细胞 (参见例如实施例13，附图27)。在某些实施方案中，使治疗剂通过酸 敏感性连接基与树枝状大分子缀合。因此，在某些实施方案中，在靶 细胞内(例如内含体内)治疗剂从树枝状大分子上释放。关注这种类型 的胞内释放(例如酸敏感性连接基的内体(endosomal)破坏)以便提供 对本发明组合物和方法额外的特异性。在优选的实施方案中，本发明 的树枝状大分子(例如G5PAMAM树枝状大分子)在表面上含有100-150 个伯胺类(例如，参见实施例13)。因此，本发明提供了具有缀合官能 团的多个反应位点(例如100-150个)的树枝状大分子，所述的官能团 包括但不限于治疗基、靶向剂、成像剂和生物监测剂。
无论本发明的树枝状大分子组合物是否包含荧光素(例如FITC) 成像剂，预期本发明的组合物和方法是同样有效的(例如，参见实施例 13)。因此，存在于树枝状大分子组合物上的各官能团能够与其它官能 团独立地起作用。因此，本发明提供了可以包含多种靶向、治疗、成 像和生物监测官能团的组合的树枝状大分子。
本发明还提供了将分子(例如治疗和成像官能团)递送至靶细胞 (例如癌细胞)内部的极为有效和特异性的方法。因此，在某些实施方 案中，本发明提供了包含或需要将分子递送入细胞以便起作用的疗法 (例如递送遗传物质，siRNAs)。
在某些实施方案中，适合于注射应用的药物剂型包括无菌水溶液 或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。载体 可以为含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇 等)、其合适的混合物和植物油的溶剂或分散介质。例如，可以通过使 用包衣材料，诸如卵磷脂，就分散液而言通过维持所需颗粒大小并且 通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可以用各种抗菌剂、抗真 菌剂，例如对羟基苯甲酸酯类、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞 等产生预防微生物的作用。在许多情况中，优选包括等渗剂，例如糖 类或氯化钠。可以通过在组合物中使用延缓吸收的试剂，例如单硬脂 酸铝和明胶延长可注射组合物的吸收。
通过将所需量的活性化合物掺入含有上述各种其它组分的合适的 溶剂制备无菌可注射溶液，如果需要，随后进行无菌过滤来制备无菌 可注射溶液。一般而言，通过将各种无菌活性组分掺入含有碱性分散 介质和来自上述那些的所需其它组分的无菌媒介物中制备分散液。就 用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末而言，优选的制备方法为真空干 燥和冷冻干燥技术，它们可由上述无菌过滤溶液产生活性组分与任意 额外所需的组分的粉末。
在配制时，以与剂型相容的方式和诸如治疗上有效的这类用量给 予树枝状大分子组合物。易于以各种剂型，诸如可注射溶液、药物释 放胶囊等给予制剂。例如，就以水溶液进行非肠道给药而言，如果必 要，将该溶液适当缓冲，并且液体稀释剂首先使与足够的盐水或葡萄 糖等渗。这些特定的水溶液尤其适合于静脉内、肌内、皮下和腹膜内 给药。例如，可以将一种剂量溶于1ml等渗NaCl溶液并且加入到1000 ml皮下输液中或在指定的输注部位注射(例如，参见″Remington′s Pharmaceutical Sciences″15th Edition，1035-1038和1570-1580 页)。在本发明的某些实施方案中，在治疗混合物中活性颗粒或活性剂 的配制量约占0.0001-1.0毫克，或约0.001-0.1毫克或约0.1- 1.0，乃至约10毫克/剂量等。可以给予多剂量。
适合于其它给药方式的额外制剂包括阴道栓剂和阴道栓。还可以 使用直肠阴道栓或栓剂。栓剂为不同重量和形状的通常含药的固体剂 型，它用于插入直肠、阴道或尿道。插入后，栓剂软化、熔化或溶于 腔液。一般就栓剂而言，传统粘合剂和载体可以包括：例如聚亚烷基 二醇或甘油三酯类；这类栓剂可以由含有0.5％-10％，优选1％-2％的活 性组分的混合物形成。阴道栓剂或阴道栓通常为球形的或卵形的并且 各自重约5g。阴道用药物以各种物理形式获得，例如霜剂、凝胶或 液体，它们已经脱离了传统的栓剂概念。此外，栓剂可以用于结肠癌。 还可以将纳米装置配制成用于治疗肺癌等的吸入剂。
XIII.治疗或预防癌症和病原性疾病的方法
在本发明具体的实施方案中，提供了在癌症疗法中治疗肿瘤的方 法和组合物(例如，参见实施例13)。预期本发明的疗法可以用于治疗 已经鉴定了特异性标记或可以靶向的任意癌症。各种可用本发明方法 治疗的细胞增殖性障碍或癌症包括但不限于：人肉瘤和癌，包括但不 限于纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血 管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、尤因瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、 间皮瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢 癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、 乳头状癌、乳头腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、 胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、睾 丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细 胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细 胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、硬脑膜肉瘤、黑素瘤、神经母细 胞瘤、视网膜成神经细胞瘤；白血病、急性淋巴细胞性白血病和急性 髓细胞性白血病(成髓细胞白血病、前髓细胞性白血病、粒-单核细胞 型白血病、单核细胞性白血病和红白血病)；慢性白血病(慢性髓细胞 性(粒细胞性)白血病和慢性淋巴细胞性白血病)；和真性红细胞增多、 淋巴瘤(何杰金病和非-何杰金病)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球 蛋白血症和重链病。
各种本发明的疗法可以用于治疗已经鉴定了特异性标记或可以对 指定病原体靶向的任意病原性疾病。可用本发明方法治疗的病原体的 实例包括但不限于：侵肺军团菌、结核分枝杆菌、破伤风梭菌、流感 嗜血杆菌、淋病奈瑟氏球菌、苍白密螺旋体、炭疽芽孢杆菌、霍乱弧 菌、布氏疏螺旋体、白喉棒杆菌、金黄色葡萄球菌、人乳头状瘤病毒、 人免疫缺陷症病毒、德国麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒等。
实验
提供下列实施例是为了例证和进一步解释本发明的某些优选实施 方案和方面，但并不用来限定本发明的范围。
在下文的实验公开内容中，使用如下的缩写：g(克)；l或L(升)； μg(微克)；μl(微升)；μm(微米)；μM(微摩尔)；μmol(微摩尔)；mg(毫 克)；ml(毫升)；mm(毫米)；mM(毫摩尔)；mmol(毫摩尔)；M(摩尔)； mol(摩尔)；ng(纳克)；nm(纳米)；nmol(纳摩尔)；N(标准)；pmol(皮 摩尔)；Aldrich(Sigma/Aldrich，Milwaukee，WI)；Sigma(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)；Fisher Scientific(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)；Millipore(Millipore，Billerica， MA)；Mettler Toledo Mettler Toledo(Columbus，OH)；Waters(Waters Corporation，Milford，Massachusetts)；Wyatt Technology(Wyatt Technology Corp.，Santa Barbara，CA)；TosoHaas(TosoHaas Corp.， Montgomeryville，PA)；Perkin Elmer(Perkin Elmer，Wellesley， MA)；Beckman Coulter(Beckman Coulter Corp.，Fullerton，CA)； Phenomenex(Phenomenex，Torrance，CA)；GiboBRL(GibcoBRL/Life Technologies，Gaithersburg，MD.)；Pierce(Pierce Chemical Company，Rockford，IL.)；Roche(F.Hoffmann-La Roche Ltd，Basel， Switzerland)。
                      实施例1
                     材料和方法
在Center for Biologic Nanotechnology，University of Michigan合成和表征G5PAMAM树枝状大分子。MeOH(HPLC级)、乙酸 酐(99％)、三乙胺(99.5％)、DMSO(99.9％)、异硫氰酸荧光素(98％)、缩 水甘油(外消旋形式，96％)、DMF(99.8％)、1-(3-(二甲氨基)-丙基)-3- 乙基碳化二亚胺HCl(EDC，98％)、柠檬酸(99.5％)、叠氮化钠(99.99％)、 D2O、NaCl和用于电位滴定的滴定液(0.1M HCl和0.1M NaOH)均购自 Aldrich并且作为标准的使用。甲氨蝶呤(99+％)和叶酸(98％)来自 Sigma，Spectra/Por透析膜(MWCO 3,500)、Millipor Centricon超 滤性膜YM-10和磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH＝7.4)来自Fisher Scientific。
电位滴定法。使用Mettler Toledo MP230 pH Meter和MicroComb pH电极在室温23±1℃下进行手工滴定。将10mL 0.1M NaCl溶液 加入到精确称量的100mg PAMAM树枝状大分子中以防止胺基相互作 用。使用0.1028N HCl进行滴定并且将0.1009N NaOH用于反向滴定。 根据反向滴定数据确定伯胺类和叔胺类的数量。
凝胶渗透色谱法(GPC)。使用安装了2487双波长UV吸收检测器 (Waters)、Wyatt DawnDSP激光分光计、Optilab DSP干涉测量折光 计(Wyatt Technology)的Alliance Waters 2690 Separation Module 并且使用TosoHaas TSK-GelGuard PHW 06762(75×7.5mm，12μm)， G 2000 PW 05761(300×7.5mm，10μm)，G 3000 PW 05762(300×7.5mm， 10μm)，和G 4000 PW(300×7.5mm，17μm)柱进行GPC实验。用Waters Temperature Control Module将柱温维持在25±0.1℃。等度流动 相为0.1M柠檬酸和0.025w％叠氮化钠，pH 2.74，流速1ml/分钟。 样品浓度为10mg/5ml，且注射体积为100μL。使用Astra 4.7软 件(Wyatt Technology)测定PAMAM树枝状大分子及其缀合物的分子量 和分子量分布。
核磁共振光谱法：在D2O中取1H和13C NMR光谱并且用于提供积 分值，以便通过Bruker AVANCE DRX 500仪进行结构分析。
UV分光光度法。使用Perkin Elmer UV/VIS分光计λ20和λ20 软件记录在PBS中的UV光谱。
反相高效液相色谱法。反相离子配对高效液相色谱(RP-HPLC)系统 由System GOLDTM 126溶剂组件、安装了100μl环的Model 507自动 采样器和Model 166 UV检测器(Beckman Coulter)组成。将基于 Phenomenex Jupiter C5二氧化硅的HPLC柱(250×4.6mm，300) 用于分离分析物。另外将两个Phenomenex Widepore C5保护柱(4×3mm) 装在HPLC柱的上游。用于洗脱PAMAM树枝状大分子的流动相为以1ml/ 分钟流速从90∶10水/乙腈(ACN)开始，并且在30分钟后达到50∶50 的线性梯度。将在水中以及在ACN中的浓度为0.14w％的三氟乙酸(TFA) 用作抗衡离子以使树枝状大分子-缀合物表面为疏水性的。将所述的缀 合物溶于流动相(90∶10水/ACN)。在每种情况中的注射体积为50μl， 样品浓度约为1mg/ml且在210或242或280nm对洗脱的样品进行检 测。使用Beckman’s System GOLDTM Nouveau软件进行分析。已经通过 使用UV、HPLC、NMR和GPC对每种装置和所有中间体进行了表征。
KB细胞获自ATCC(CLL17；Rockville，MD)。胰蛋白酶-EDTA、 Dulbecco磷酸-缓冲盐水(PBS)、胎牛血清、细胞培养抗生素和RPMI 培养基获自Gibco/BRL。所有其它试剂均来自Sigma。将树枝状大分子 -缀合物的合成和表征报导为单独的信息。在本研究中使用的所有树枝 状大分子制品均在我们的中心合成，并且已经通过对游离表面氨基进 行乙酰化对其表面进行了中和。
细胞培养和处理。将KB细胞维持在不含叶酸的含有10％血清(例 如，参见Quintana等Pharm.Res.19，1310(2002))的培养基中以便 提供与在人血清中发现的类似的胞外FA。将细胞在12-孔平板中铺板 以便进行摄取研究，在24-孔平板中进行铺板以便进行细胞生长分析， 并且在96-孔平板中铺板以便进行XTT测定。用不含FA的含有透析的 血清的培养基冲洗细胞并且在37℃下与树枝状大分子-药物缀合物一 起孵育指定的时间期限和浓度。另外将KB细胞维持在含有2μM FA 的RPMI培养基中以便获得表达低FAR的细胞。
流式细胞计量术和共聚焦显微镜术。使用Beckman荧光分光光度 计对树枝状大分子溶液的标准荧光进行定量。为了对靶向的聚合物摄 取进行流式细胞检测分析，将细胞胰蛋白酶化并且悬浮于含有0.1％牛 血清白蛋白(PBSB)的PBS中，并且使用Becton Dickinson FACScan 分析器进行分析。测定10,000个细胞的FL1-荧光并且对门控的存活 细胞荧光平均值进行定量。使用Carl Ziess共焦显微镜对在玻璃盖玻 片上铺板的细胞进行共焦显微镜分析。使用氩激光器，应用用于FITC 的合适的过滤器同时采集荧光和鉴别干涉对比(DIC)图象。
树枝状大分子细胞毒性的评价。通过使用双金鸡纳酸试剂(PIERCE) 检测处理细胞裂解物中的总蛋白质来确定细胞生长并且通过使用来自 Roche的试剂盒进行XTT测定。
                      实施例2
                  树枝状大分子的合成
按照下列方法合成树枝状大分子(例如，参见附图6)：
1.G5载体                       7.G5-Ac1(82)-FITC-FA-MTXa
2.G5-Ac3(82)                  8.G5-Ac3(82)-FITC-FA-OH
3.G5-Ac3(82)-FITC             9.G5-Ac3(82)-FITC-FA-OH-MTXe
4.G5-Ac3(82)-FITC-OH          10.G5-Ac2(82)-FA
5.G5-Ac3(82)-FITC-OH-MTXe    11.G5-Ac2(82)-FA-OH
6.G5-Ac3(82)-FITC-FA          12.G5-Ac2(82)-FA-OH-MTXe
(注意：Ac1、Ac2、Ac3中所示的上标用于区分不同组的乙酰化反应)。
1.G5载体。在Biologic Nanotechnology，University of Michigan合成和表征PAMAM G5树枝状大分子。PAMAM树枝状大分子 由乙二胺(EDA)引发剂核心与4个放射状树枝状臂组成，并且使用由丙 烯酸甲酯(MA)的彻底Michael加成和所得酯与大量过量的EDA缩合(酰 胺化)而产生依次的各代组成的重复反应序列合成。连续的反应由此各 自在理论上使表面氨基的数量加倍，可以使它们活化以便官能化。已 经分析了合成的树枝状大分子并且通过GPC测定分子量为26,380 g/mol，且通过电位滴定法已将伯氨基的数量测定为110。
2.G5-Ac3(82)。使2.38696g(8.997*10-5mol)的在160ml abs. MeOH中的G5PAMAM树枝状大分子(通过GPC测定MW＝26,380g/mol， 通过电位滴定法测定伯胺类的数量＝110)与679.1μl(7.198*10-3mol) 乙酸酐在有1.254ml(8.997*10-3mol，25％摩尔过量)三乙胺存在下反 应。在充分透析并且冻干后，得到2.51147g(93.4％)G5-Ac3(82)产 物。已经基于1H NMR校准测定了乙酰基的平均数(82)(Majoros，I.J.， Keszler，B.，Woehler，S.，Bull，T.，和Baker，J.R.，Jr.(2003))。
3.G5-Ac3(82)-FITC。使1.16106g(3.884*10-5mol)的在110ml abs.DMSO中的G5-Ac3(82)部分乙酰化的PAMAM(通过GPC测定MW＝ 29,880g/mol)与0.08394g(90％纯)(1.94*10-4mol)的FITC在氮气环 境中反应过夜。在充分透析、冻干后，得到1.10781g(89.58％)的 G5-Ac3(82)-FITC产物。通过膜过滤进行进一步纯化。
4.G5-Ac3(82)-FITC-OH。使0.20882g(6.51*10-6mol)的G5-Ac3(82) -FITC与19.9μl(2.99*10-4mol)的缩水甘油(外消旋)在150ml DI 水中反应。对每个剩余的伯氨基计算两个缩水甘油分子。将该反应混 合物在室温下剧烈搅拌3小时。在充分透析2天并且冻干后， G5-Ac3(82)-FITC-OH的产率为0.18666g(84.85％)。
5.G5-Ac3(82)-FITC-OH-MTXe。使0.02354g MTX(5.18*10-5mol) 与0.13269g(6.92*10-4mol)EDC在室温下于27ml DMF和9ml DMSO 中反应反应1小时，同时剧烈搅拌。将该溶液滴加到含有0.09112 g(2.72*10-6mol)G5-Ac3(82)-FITC-OH的150ml DI水溶液中。将该 反应体系在室温下剧烈搅拌3天。在充分透析并且冻干后，靶向的分 子G5-Ac3(82)-FITC-OH-MTXe的产率为0.08268g(73.5％)。
6.G5-Ac3(82)-FITC-FA。使0.03756g(8.51*10-5mol)FA(MW＝ 441.4g/mol)与0.23394g(1.22*10-3mol)的EDC(1-(3-(二甲氨基)- 丙基)-3-乙基碳化二亚胺HCl；MW＝191.71g/mol)在27ml干燥DMF 和9ml干燥DMSO混合物中和氮气环境下反应1小时。然后将该有机 反应混合物中滴加到0.49597g(1.55*10-5mol；MW＝32,150g/mol) G5-Ac3(82)-FITC的DI水溶液(100ml)中。将该反应混合物剧烈搅拌 2天。在透析并且冻干后，G5-Ac3(82)-FITC-FA重量为0.5202 g(98.1％)。通过膜过滤进行进一步纯化。
7.G5-Ac1(82)-FITC-FA-MTXa。使2.1763*10-5mol(0.00989g)的 MTX(MW＝454.45g/mol)与3.0948*10-4mol(0.05933g)的EDC在66ml 干燥DMF和22ml干燥DMSO混合物中和氮气环境下反应1小时。将该 有机反应混合物滴加到0.09254g(2.7051*10-6mol；通过GPC测定MW ＝34,710g/mol)G5-Ac1(82)-FITC-FA-NH2的DI水溶液(260ml)中。 将该溶液剧烈搅拌2天。在透析并且冻干后，G5-Ac1(82)-FITC-FA-MTXa 重量为0.09503g(96.5％)。在分析前通过膜过滤进行进一步纯化。将 三官能装置用作体外细胞毒性研究中药物裂解的对照化合物。
8.G5-Ac3(82)-FITC-FA-OH。使在200ml DI水中的0.29597 g(8.63*10-6mol)的G5-Ac3(82)-FITC-FA部分乙酰化的PAMAM树枝状 大分子缀合物(通过GPC测定MW＝34,710g/mol)与20.6μl(3.1*10-4 mol，25％摩尔过量)的缩水甘油(MW＝74.08g/mol)反应3小时。在 充分透析、冻干和反复膜过滤后，得到0.27787g(90.35％)完全缩水 甘油化的G5-Ac3(82)-FITC-FA-OH产物。在体外研究中未观察到非特 异性摄取(参见用于摄取研究的此研究的第II部分(24)。
9.G5-Ac3(82)-FITC-FA-OH-MTXe。使0.03848g(8.4674*10-5mol) 的MTX(MW＝454.45g/mol)与0.22547g(1.176*10-3mol)的EDC在 54ml干燥DMF和18ml干燥DMSO混合物中和氮气环境下反应1小时。 将该有机反应混合物滴加到0.16393g(4.6339*10-6mol；MW＝36,820 g/mol)G5-Ac3(82)-FITC-FA-OH的DI水溶液(240ml)中。将该溶液 剧烈搅拌3天。在透析、反复膜过滤和冻干后，G5-Ac3(82)-FITC-FA- MTXe重量为0.18205g(90.88％)。
10.G5-Ac2(82)-FA。使FA在两步连续的反应中与G5-Ac2(82)结 合。使0.03278g(7.426*10-5mol)FA与14-倍过量的EDC 0.19979 g(1.042*10-3mol)在24ml DMF、8ml DMSO溶剂混合物中和室温下反 应，然后将该FA-活性酯溶液滴加到部分乙酰化的产物 G5-Ac2(82)(0.40366g，1.347*10-5mol)在90ml水中的水溶液中。 在透析和冻干后，产物重量为0.41791g(96.7％)。通过UV光谱法测 定FA分子的数量。作为额外的表征，通过安装了UV检测器的GPC或 通过琼脂糖凝胶未观察到游离的FA。
11.G5-Ac2(82)-FA-OH。使0.21174g(6.60*10-6mol)的单-官能 树枝状装置G5-Ac2(82)-FA与20.1μl(3.04*10-4mol)缩水甘油在154 ml DI水中和剧烈搅拌下反应3小时。在透析和冻干后，在表面上带 有羟基的缩水甘油化的单-官能装置(产率：0.20302g，91.05％)参与 与甲氨蝶呤的缀合反应。
12.G5-Ac2(82)-FA-OH-MTXe。在7ml DMF和9ml DMSO的溶剂 混合物中，使0.02459g(5.41*10-5mol)的MTX和0.14315g(7.46*10-4 mol)的1-(3-(二甲氨基)-丙基)-3-乙基碳化二亚胺(EDC)在室温下和 氮气环境中反应1小时。剧烈搅拌该反应混合物。将MTX-活性酯溶液 滴加到在150ml DI水中的在表面上带有羟基的0.09975g(2.95*10-6 mol)单-官能树枝状装置中，并且将该反应混合物在室温下搅拌3天。 在透析和冻干后，用组合和生物物质测试这一双官能装置 G5-Ac2(82)-FA-OH-MTXe(产率：0.11544g，93.9％)。
                     实施例3
分析G5PAPAM树枝状大分子的末端伯氨基的电位滴定曲线
进行电位滴定以便测定伯和叔氨基的数量。在理论上，G5PAMAM 树枝状大分子在其表面上带有128个伯氨基和126个叔胺基。可以通 过使用数学模型测定这些值。电位滴定揭示出在G5PAMAM树枝状大分 子载体表面上存在110个伯胺类(例如，参见附图7，它表示通过用0.1 M HCl滴定液直接滴定和使用0.1M NaOH滴定液反向滴定得到的滴定 曲线)。使用应用0.1M NaOH滴定液获得的反向滴定数据计算伯氨基的 平均数。
测定各缀合物结构的分子量也是必要的，以便产生充分定义的多 官能树枝状大分子。将安装了多角度激光散射的GPC和作为浓度检测 器的RI检测器用于该目的(例如，参见表1，它代表具有各自指定的分 子量和分子量分布的PAMAM树枝状大分子载体及其单-、双-和三-官能 缀合物。上标数字2和3(ex.-G5-Ac2和G5-Ac3)表示它们为两种独 立的乙酰化反应)。
表1

                       实施例4
      通过凝胶渗透色谱法进行的树枝状大分子表征
测定的26,380g/mol的G5树枝状大分子的分子量稍低于理论值 (28,826g/mol)。这些结果表明了离子理论结构的偏差。使用个缀合 物的GPC数据计算表1中的值(例如，参见附图8)并且计算以便衍生 与所述载体结合的各官能团的精确数量。可以通过从含有官能分子的 缀合物的 值中扣除不含所述官能分子的缀合物的 值并且除以功 能分子的分子量计算每个官能分子的平均数。可以提供G5-Ac2、 G5-Ac2(82)-FA-OH-MTXe、G5-Ac3(82)-FITC-OH-MTXe和G5-Ac2(82) -FITC-FA-OH-MTXe的GPC洗脱图(eluograms)，其中RI信号和激光 散射信号在90°处重叠(例如，参见附图8)。
基于GPC分析，可以测定缀合的FITC、FA、MTX和缩水甘油分子 的数量(例如，参见附图8：FITC：5.8，FA：5.7，MTXe：5-6，OH： 28-30)。如通过GPC测定的缀合分子的数量稍高于推定值；这一结果 最大的可能性是因洗脱液中柠檬酸的作用所致，它根据所述装置的不 同具有可变的作用。将这些值与通过NMR和UV光谱分析获得的值联合 应用于精确测定与树枝状大分子结合的各缀合分子的数量。
提供了G5PAMAM树枝状大分子的理论和有缺陷的化学结构(例如， 参见附图9)。副反应、诸如桥连，以及每代产生少于理论预计值的 臂有助于产生与G5PAMAM树枝状大分子的理论值代表稍不同的结构。 G5PAMAM树枝状大分子的有缺陷的化学结构表现出从每代中失去臂， 这可能成为问题，因为它们破坏了树枝状大分子的球形，由此影响了 可能结合的官能分子的数量并且降低了每个官能分子可能在靶向的细 胞中具有的效应。
                      实施例5
              树枝状大分子官能团的表征
树枝状大分子的乙酰化。乙酰化为合成树枝状大分子中首要必须 的步骤。将部分乙酰化用于中和来自另一反应或生物系统内分子间相 互作用的树枝状大分子表面的部分，由此防止非特异性相互作用在合 成过程和药物递送过程中发生。离开未乙酰化的表面胺类的部分能够 结合官能团。使剩余的氨基乙酰化导致水溶性增加(在FITC缀合后)， 使得树枝状大分子更自由地分散在具有靶向特异性增加的含水介质 内，从而使得它与许多常用介质相比更能够用作靶向递送系统 (Quintana等Pharm.Res.19，1310(2002))。
彻底透析、冻干和使用PBS和DI水反复膜过滤用于产生纯化的部 分乙酰化的G5-Ac2(82)和G5-Ac3(82)PAMAM树枝状大分子(例如，参 见Majoros等Macromolec 36，5526(2003))。在异硫氰酸荧光素(FITC) 和(FITC-FA)缀合后，按照与(Wang等，.Blood.15，3529(2000))中发 现的相同的反应顺序再使树枝状大分子完全乙酰化以便用于体外摄取 研究。进行彻底透析、冻干和反复膜过滤，得到完全乙酰化的 G5-Ac1(82)-FITC和G5-Ac1(82)-FITC-FA PAMAM。
当乙酰化程度增加时，树枝状大分子的直径减小，从而表明了乙 酰化程度与树枝状大分子直径之间的反相关性(例如，参见Majoros 等Macromolec 36，5526(2003))。用于质子化的较低数量的伯胺类(与 较低程度相比，在较高乙酰化程度下)导致结构受到电荷-电荷相互作 用的影响程度较低，由此使得结构更致密。然而，分子量与乙酰化程 度具有平行相关性，分子量随乙酰化程度的增加而增加。
通过监测在210nm处检测UV洗脱的级分而用H1-NMR和HPLC进 一步表征PAMAM树枝状大分子(例如，分别参见附图10(A)和(B))。 G5-Ac的H1-NMR光谱展示如下：在4.71ppm出现的峰为D2O的代表， 而在3.67ppm的峰为外标二烷的代表，且在1.89ppm的峰代表乙酰 胺的甲基质子。峰2.34ppm、2.55ppm、2.74ppm、3.04ppm、3.21ppm 和3.39ppm为存在于乙酰化树枝状大分子中的质子的代表。
官能团的结构。提供具有与用星号标记树枝状大分子结合的基团 的FITC、FA和MTX的结构(例如，参见附图11，其中在FA和MTX分 子上标记了α-和γ-羧基)。当FA上的γ-羧基用于与树枝状大分子缀 合时，FA保持了对其受体的强亲和力，使得FA能够保持其起靶向剂 作用的能力。另外，γ-羧基在碳化二亚胺(carboiimide)为介体的 与氨基偶联的过程中具有高于α-羧基的反应性(例如，参见Quintana， 等Pharm.Res.19，1310(2002))。
官能团的H1-NMR。为了最终测定与树枝状大分子结合的各类官能 团的数量，必须比较官能团自身的H-NMR和与官能团缀合的树枝状大 分子的H1-NMR。官能团的H1-NMR(参见，例如附图12)：FITC H1-NMR- 芳香族化合物峰：7.9ppm，7.68ppm，7.23ppm，6.6ppm，6.65ppm， 6.75ppm；FA H1-NMR-芳香族化合物峰：8.73ppm，6.75ppm，7.65ppm， 在4.85ppm的D2O，在3.3ppm的CH3OD，在如下的脂肪族化合物峰： 2.15ppm，2.2ppm，2.4ppm；和MTX H1-NMR-芳香族化合物峰：8.65ppm， 8.75ppm，7.85ppm，在4.8ppm的D2O，在3.35ppm的CH3OD，在如下的 脂肪族化合物峰：2.05ppm，2.25ppm，2.45ppm。
                     实施例6
          官能团与乙酰化树枝状大分子的缀合
异硫氰酸荧光素与乙酰化树枝状大分子的缀合。部分乙酰化的 G5-Ac3(82)PAMAM树枝状大分子用于缀合异硫氰酸荧光素(FITC)。使 部分乙酰化的树枝状大分子与异硫氰酸荧光素反应，并且在充分透析、 冻干和反复膜过滤后，得到G5-Ac3(82)-FITC产物。形成的硫脲键在 装置的研究过程中是稳定的。
叶酸与乙酰化的单-官能树枝状大分子的缀合。通过叶酸的γ-羧基 与树枝状大分子的伯氨基之间的缩合进行叶酸与部分乙酰化的单-官 能树枝状装置的缀合。将该反应混合物滴加到含有G5-Ac3(82)-FITC 的DI水溶液中并且剧烈搅拌2天(在氮气环境中)以使FA与 G5-Ac3(82)-FITC完全缀合。显然α羧基参与了缩合反应，但其反应 性在与γ羧基比较时更低。NMR也用于证实与树枝状大分子结合的FA 分子的数量。就存在于样品中的游离FA而言，尖峰可以在光谱中出现。 取游离FA的1H NMR光谱(参见，例如附图12)和G5-Ac3(82)-FITC-FA。 G5-Ac3(82)-FITC-FA光谱中芳香族化合物质子峰的增宽表明FA与树 枝状大分子之间存在共价键。基于乙酰胺基中的甲基质子和FA中芳族 化合物质子的积分值，将结合的FA分子的数量计算为4.5。通过UV 光谱法，使用游离FA浓度校准曲线测定FA分子的数量(4.8)。
MTX与乙酰化双-官能树枝状大分子的缀合(通过酰胺键)。由 G5-Ac3(82)-FITC-FA合成对照品MTX三官能缀合物。常用抗癌药MTX 与FA在结构上的相似性允许其与G5-Ac3(82)-FITC-FA通过用于使FA 与伯氨基结合相同的缩合反应结合。从反应剂的摩尔比预计每个树枝 状大分子中可以结合5个药物分子。取三官能装置的1H NMR光谱。芳 香族化合物质子峰的增宽表明甲氨蝶呤与树枝状大分子之间存在共价 键。基于乙酰胺基中的甲基质子和缀合分子中芳族化合物质子的积分 值，将结合的甲氨蝶呤分子的数量计算为5。MTX通过酰胺键的缀合用 作用于比较MTX通过酯键缀合的对照装置。与MTX通过酰胺键与树枝 状大分子连接相比，甲氨蝶呤通过酯键结合能够相对更易于将药物裂 解并释放进入系统。
缩水甘油与乙酰化双官能树枝状大分子的缀合。缩水甘油与乙酰 化双官能装置的缀合为重要的前序步骤，以便通过酯键结合MTX和消 除剩余的NH2，从而避免生物系统内任何不需要的非特异性靶向。缩水 甘油与G5-Ac3(82)-FITC-FA的缀合将所有剩余的伯氨基转化成醇基， 从而产生G5-Ac3(82)-FITC-FA-OH。为了表征的目的，MTX与含有FA 或FITC的缩水甘油化树枝状装置的缀合产生G5-Ac2-FA-OH-MTXe1*和 G5-Ac3-FITC-OH-MTXe2*(例如，参见附图13(A)和(B)，分别为各样品 的HPLC洗脱图)。
                        实施例7
MTX与乙酰化和缩水甘油化双官能树枝状大分子通过酯键缀合的
                         表征
显示了G5-Ac2-FA-OH-MTXe的H1-NMR(例如参见，附图14)。缀合 装置中芳香族化合物的质子的峰代表无法与在游离FA和MTX的H1-NMR 中发现的芳香族化合物的峰相区别。芳香族质子在6.59ppm、7.53ppm 呈双峰出现，而在8.37ppm呈单峰出现。将游离FA和游离MTX的H1-NMR 与缀合装置的H1-NMR进行比较显示芳族化合物区几乎同样地重叠，由 此不能测定芳族化合物质子的位置。FA和MTX的结合分子的数量也影 响峰的分布。在4.70ppm出现的峰代表了溶剂D2O，在3.67ppm出现的 峰为外标二烷的代表，并且在1.89ppm出现的峰为乙酰胺基的甲基 质子的代表。峰2.31ppm、2.52ppm、2.71ppm和3.26ppm为树枝状大 分子质子的代表。
                   实施例8
              树枝状大分子的UV光谱表征
测试通过酯键的MTX缀合与通过酰胺键与树枝状大分子缀合比较 在裂解方面的改善。通过使用EDC化学结合MTX。显示了在305nm的 G5-Ac-FITC-FA-OH-MTXe的HPLC洗脱图(例如，参见附图15)。可以将 游离FA、MTX和FITC的合并UV光谱与G5-Ac(82)、单-、双-和三-官 能树枝状大分子的UV光谱进行比较(例如，分别参见附图中的附图16 和17)。UV光谱提供了精确地在281nm和349nm的FA确定峰，对于 MTX依次在258nm、304nm和374nm，且对FITC在493nm。FA、FITC 和MTX可见的差别峰(例如，参见附图16)依赖于各分子与树枝状大分 子的缀合。通过比较游离物质和树枝状大分子-缀合的物质的UV光谱 对每种装置的表征用于确定已经结合树枝状大分子的功能。
                      实施例9
                树枝状大分子的细胞摄取
使用荧光分光光度计测定缀合物G5-FI、G5-FITC-FA和 G5-FITC-FA-MTX的标准溶液的荧光。在10-1000nM观察到了树枝状 大分子浓度与荧光之间的线性关系。G5-FITC、G5-FITC-FA和 G5-FITC-FA-MTX的100nM溶液的荧光分别为0.57、0.23和0.11个 荧光分光光度测定单位。这些荧光上的差别可以指示因树枝状大分子 上存在FA和MTX而猝灭。
测定表达高细胞表面FA受体(FAR)的KB细胞中树枝状大分子的细 胞摄取。FA-缀合的树枝状大分子以剂量依赖性方式与细胞结合，其中 对G5-FITC-FA和G5-FITC-FA-MTX的结合率在10-15nM下为50％，而 在KB细胞中未检测到对照树枝状大分子G5-FITC(例如，参见附图 18A)。当将获得的荧光对在树枝状大分子标准溶液中观察到的猝灭校 准时，对G5-FITC-FA和G5-FITC-FA-MTX获得了相同的结合曲线(例如， 参见附图18B)。对G5-FITC-FA-MTX(100nM)的结合动力学分析显示在 30分钟内获得了最大结合率，这一结果与对游离叶酸(folate)结合 率报告的结果相似。
测试了表达高和低FAR的KB细胞中游离FA对树枝状大分子摄取 的作用。对G5-FITC-FA和G5-FITC-FA-MTX而言，缀合物与表达低FAR 的KB细胞的结合为表达高FAR的细胞的结合的30％(例如，参见附图 19，左侧组)。50μM FA完全阻断了靶向的树枝状大分子(30nM)在表 达低-和高-FAR的细胞中的摄取(例如，参见附图19，左侧组)。通过 共聚焦显微镜术评价树枝状大分子与KB细胞的结合和细胞内摄作用。 将KB细胞与250nM所指定的树枝状大分子一起孵育24小时并且取共 焦图像。含有靶分子FA的缀合物在24小时内摄入KB细胞(例如，参 见附图20)。与用对照缀合物处理的细胞相比，接触G5-FITC-FA-MTX 的细胞较不粘着并且聚集，表明了由药物-缀合物诱导的细胞毒性。
                     实施例10
         官能团缀合的树枝状大分子抑制细胞生长
由于缀合物与KB细胞结合在1小时内达到最大摄取值(Quintana 等2002.Pharmaceutical Research 19：1310-1316.)，开始通过将 细胞与缀合物一起孵育1小时测试G5-FI-FA-MTX对细胞生长的作用， 随后在不含药物的培养基中孵育5天。在这类条件下，缀合物在KB 细胞中不能表现出任何生长抑制作用。当将细胞与树枝状大分子一起 孵育4小时时，如通过XTT试验测定的，存在约10％的细胞生长适度 减少。由此通过与树枝状大分子一起孵育最少24小时进行细胞毒性测 定，这一时间期限为显示出诱导明显的细胞毒性的预孵育时间期限。
细胞生长的时程和剂量依赖性抑制。上述研究已经证实，如果培 养基中完全丧失了FA，那么在体外可检测到MTX-诱导的细胞毒性(例 如，参见Sobrero & Bertino，Int.J.Cell Cloning 4，51(1986))。 测试在FA-不足的培养基中孵育的细胞中三官能树枝状大分子对细胞 生长的作用。用300nM缀合物(相当于1500nM MTX)或1500nM游 离MTX将细胞处理1-4天并且通过估计细胞蛋白质含量测定细胞增殖。 用不同浓度的缀合物或游离MTX将细胞处理2天(将缀合物浓度指定为 MTX当量，其中每个树枝状大分子中有5个MTX)。将表达高和低FAR 的KB细胞与30nM的树枝状大分子一起在37℃下孵育1小时，冲洗 并且通过流式细胞检测分析测定细胞荧光(例如，参见附图21，左侧 组)。与50μM游离FA一起预孵育30分钟完全防止了细胞结合和摄取 聚合物缀合物(例如，参见附图21，左侧组)。
还通过基于经活细胞的活性线粒体将XTT转化成甲的XTT试验 测试了对缀合物诱导的细胞生长的抑制(例如，参见Roehm等J Immunol Methods 142，257(1991))。G5-FITC或G5-FITC-FA在1、2 或3天时对细胞无生长抑制作用，而G5-FITC-FA-MTX和游离MTX表现 出时间依赖性细胞毒性(例如，参见附图22)。因此，G5-FITC-FA-MTX 和游离MTX以时间-和剂量依赖性方式抑制细胞生长，而对照树枝状大 分子不能抑制细胞生长(例如，参见附图21和22)。
                      实施例11
         叶酸拯救细胞不发生甲氨蝶呤诱导的细胞毒性 
当游离MTX诱导的生长抑制高于使用等摩尔浓度的在低于1μM 的G5-FITC-FA-MTX中的MTX诱导的生长抑制时(例如，参见附图21)， 测试G5-FITC-FA-MTX中的FA部分是否可以拯救细胞不发生MTX-诱导 的细胞毒性。G5-FITC-FA-MTX制品含有等摩尔浓度的MTX和FA，测定 相似浓度的游离MTX和游离FA对细胞生长抑制的作用。在等摩尔浓度 的游离FA和MTX下，FA逆转了MTX诱导的细胞生长抑制(例如，参见 附图23)。用150或500nM MTX在有或没有等摩尔浓度的游离FA将 KB细胞处理24小时。还用30和100nM G5-FI-FA-MTX(相当于150 和500nM MTX)平行处理细胞。冲洗细胞以便除去药物并且与新鲜的 培养基一起再孵育6天，且测定总细胞蛋白质。存在的150nM FA几 乎完全逆转了由150nM MTX导致的生长停滞。此外，由G5-FITC-FA-MTX 诱导的细胞毒性(例如，参见附图23，实心正方形符号)和等摩尔的 FA和MTX组合(例如，参见附图23，实心圆圈符号)相似。
当游离FA阻断树枝状大分子摄取并且拯救细胞不发生MTX-诱导 的细胞毒性时，测试了将细胞与过量的FA预孵育对G5-FITC-FA-MTX 的抗增殖的作用。使KB细胞在没有或有50μM FA存在下接触不同浓 度的缀合物或游离MTX 24小时。除去孵育培养基，冲洗细胞并且在没 有药物存在下与新鲜培养基一起再孵育5天，且进行XTT试验(例如， 参见附图24，□，■，代表用MTX处理的细胞；△，▲，代表用 G5-FITC-FA-MTX处理的细胞)。过量的游离FA不仅阻断了生长抑制， 而且增加的细胞生长高于对照组细胞20％(例如，参见附图24)。
                       实施例12
                 树枝状大分子的稳定性
在细胞培养基中测试树枝状大分子的稳定性，以便检查在进入细 胞前，MTX是否从树枝状大分子中释放。将G5-FITC-FA-MTX与细胞培 养基一起温育1、2、4和24小时，并且使用10,000-MW截止的超滤装 置过滤温育培养基。测试截留物和滤液对KB细胞生长的作用。将 G5-FITC-FA-MTX与2μM浓度的培养基一起孵育24小时。通过10K-MW 截止的滤膜过滤温育培养基。将截留物(调整至预过滤体积)和滤液与 KB细胞(在200nM缀合物下，如根据预过滤样品浓度测定的)一起孵 育2天并且进行XTT试验。对获自已经与树枝状大分子预温育1、2 和4小时的培养基的截留物和滤液获得了相似的结果。在24小时温育 时间期限过程中，截留物为细胞毒性的，而滤液未表现出任何细胞毒 性(例如，参见附图25)，表明游离MTX无法从缀合物中释放。24小时 后MTX缓慢释放，在1周内达到40-50％释放的最大值。
将MTX-缀合物的抗增殖作用与缺乏FA或FITC分子的缀合物进行 比较。将KB细胞与30nM的缀合物(＝150nM有效MTX浓度)一起孵 育24小时并且除去孵育培养基。冲洗细胞并且在没有药物存在下的新 鲜培养基中再孵育5天，且进行XTT试验。缺乏FA的MTX-缀合的树 枝状大分子不能诱导细胞毒性，而靶向的树枝状大分子在没有或有染 料分子FITC存在下诱导细胞毒性(例如，参见附图26)。
                       实施例13
           树枝状大分子在体内靶向肿瘤中的应用
本发明的组合物(例如多官能树枝状大分子)和方法用于测定癌 症动物模型(例如人上皮细胞癌)中的治疗反应。
材料和试剂。所有试剂均获自商品来源。叶酸、青霉素/链霉素、 胎牛血清、IV型胶原酶、TX100、双-苯甲亚胺(benzimide)、FITC、 甲氨蝶呤、过氧化氢、乙酸酐、乙二胺、甲醇、二甲基甲酰胺和DMSO 购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。胰蛋白酶-EDTA、Dulbecco’s PBS 和RPMI 1640(有或没有叶酸)来自Invitrogen(Gaithersburg，MD)。 “可溶的”溶液和hionic荧光体来自Packard Bioscience(Downers Grove，IL)。OCT包埋培养基来自Electron Microscopy Sciences(Fort Washington，PA)，2-甲基丁烷来自Fisher Scientific(Pittsburgh， PA)，且6-羧基四甲基若丹明(6-TAMRA)和Prolong来自Molecular Probes，Inc.(Eugene，OR)。氚-标记的乙酸酐(CH3CO)2O[3H](100mCi， 3.7GBq)购自ICN Biomedicals(Irvine，CA)。注射用甲氨蝶呤来自 Bedford Laboratories(Bedford，OH)。将叶酸溶于盐水，用1N NaOH 调整至pH 7.0并且进行无菌过滤以便注射。
PAMAM树枝状大分子缀合物的合成和表征。合成G5PAMAM树枝状大 分子并且从低摩尔质量污染物和高摩尔质量二聚体或寡聚体中纯化 (例如，参见Majoros等Macromolecules 36，5529(2003))。通过大小 排阻色谱法，使用多角度激光散射、UV和屈光指数检测器将树枝状大 分子的数均摩尔质量测定为26,530g/mol。使用电位滴定与摩尔质量 将树枝状大分子中的表面伯胺基的平均数量测定为110。对理想的单分 散性样品定义为重均摩尔质量与数均摩尔质量之比的多分散性指数等 于1.0。将G5树枝状大分子的多分散性指数计算为1.032，表明在平均 值周围有极窄的分布并且证实为高纯度的G5树枝状大分子。使用乙酸 酐将G5PAMAM树枝状大分子表面胺类乙酰化以便减少树枝状大分子的 非特异性结合。选择乙酸酐与树枝状大分子之比以便获得50-80和100 个伯胺类的不同乙酰化水平。在纯化后，使乙酰化的树枝状大分子与 成像剂(例如FITC或6-TAMRA)缀合以便检测和成像。然后使成像-缀合 的(例如染料-缀合的)树枝状大分子与靶向剂(例如叶酸)的活化酯反 应，并且通过1H核磁共振(NMR)分析该反应纯化的产物，以便测定缀合 的靶向剂(例如叶酸分子)的数量。随后通过酯键缀合治疗剂(例如甲氨 蝶呤)(例如，参见Quintana等Pharm Res 19，1310(2002))。
使用氚化的乙酸酐(Ac-3H)由G5-(Ac)50-(FA)6或G5-(Ac)50合成放 射性标记的化合物(例如，参见Malik等J Control Release 65， 133(2000)；Nigavekar等Pharm Res 21，476(2004)；Wilbur等 Bioconjug Chem 9，813(1998))。使氚化的缀合物、G5-3H-FA和G5-3H 完全乙酰化。G5-NHCOC-3H和G5-FA-NHCOC-3H缀合物的特异性活性分别 为10.27和38.63mCi/g。残余的游离氚＜0.3％的总活性。
使用PAGE、1H NMR、13C NMR和质谱法测试PAMAM树枝状大分子缀合 物的质量。将毛细管电泳用于证实终产物的纯度和均匀性。
叶酸-靶向的缀合物特别含有下列分子：G5-(Ac)82-(FITC)5- (FA)5，G5-(Ac)82-(6-TAMRA)3-(FA)4，G5-(Ac)82-(FITC)5-(FA)5-MTX5 和G5-(Ac)50-(Ac-3H)54-(FA)6，分别使用首字母缩略词G5-FI-FA、 G5-6T-FA、G5-FI-FA-MTX和G5-3H-FA鉴定它们。非靶向的对照品含有 下列分子：G5-(Ac)82-(FITC)5，G5-(Ac)82-(6-TAMRA)3，G5-(Ac)82- (FITC)5-MTX5和G5-(Ac)50-(Ac-3H)54，分别使用首字母缩略词G5-FI、 G5-6T、G5-FI-MTX和G5-3H鉴定它们。
受体动物和肿瘤模型。免疫缺陷型6-至8-周龄无胸腺雌性裸鼠 [Sim：(NCr)nu/nu fisol]购自Simonsen Laboratories，Inc.(Gilroy， CA)。5-至6-周龄Fox Chase严重的联合型免疫缺陷病(SCID； CB-17/1crCrl-scidBR)雌性小鼠购自Charles River Laboratories(Wilmington，MA)，并且按照University’s Committee on the Use and Care of Animals的条例以及联邦政府的指导原则， 包括Principles of Laboratory Animal Care使它们寄居在 University of Michigan Medical Center的不含特定病原体的动物 实验室内。动物在可以随意摄取Laboratory Autoclavable Rodent Diet 5010(PMI Nutrition International，St.Louis，MO)。在注 射肿瘤细胞前3周，将食物改变为叶酸-缺乏的膳食(TestDiet， Richmond，IN)。为了采集尿和粪便，使动物寄居在可代谢的啮齿动物 笼(Nalgene，Rochester，NY)中。
肿瘤细胞系。超表达叶酸受体的KB人细胞系(例如，参见Turek等J Cell Sci 106，423(1993))购自American Type Tissue Collection(Manassas，VA)并且将它们维持在体外37℃，5％CO2下和 叶酸盐-缺乏的补充了青霉素(100单位/mL)、链霉素(100μg/mL)和10％ 热灭活胎牛血清的RPMI 1640中。在注入小鼠前，使用胰蛋白酶-EDTA 溶液收集细胞，洗涤并且重新悬浮于PBS中。30-号计量注射针将细胞 混悬液(在0.2mL中5×106个细胞)经皮下注入每只小鼠的胁腹。在生 物分布研究中，使肿瘤生长2周，直到达到～0.9cm3的体积。选择计 算肿瘤体积的公式针对的是椭圆体的标准体积，其中V＝4/3π(1/2长 ×1/2宽×1/2深度)。由于推定宽等于深度且k等于3，所以使用的公 式为V＝1/2×长×宽2。在植入KB细胞后第4天使开始使用缀合物注 射进行靶向的递药。
氚化树枝状大分子的生物分布和排泄。通过侧尾静脉给动物注射 含有174μg G5-NHCOC-3H(1.8ACi)或200μg G5-FA-NHCOC-3H(7.7μCi) 的0.5mL PBS溶液。以等摩尔浓度的修饰的树枝状大分子递送两种氚 化的氚标记的缀合物。在注射后5分钟、2小时、1天、4天和7天时，对 动物实施安乐死，并且取肿瘤、心、肺、肝、脾、胰腺、肾和脑的样 品。第3组小鼠在注射200μg G5-3H-FA5分钟前接受80μg游离快速浓 注。这一181nmol浓度的游离叶酸在血液中产生～150μmol/L浓度， 而与之相比，放射性标记的靶向的树枝状大分子(G5-3H-FA)在血液中 产生～5μmol/L浓度，并且基于1.2mL 20g小鼠的血量。在注射后5 分钟、1天和4天时对动物实施安乐死5，并且如上所述采集组织。通过 心脏穿刺在每一时间点采血。每组包括3-5只小鼠。在2、4、8和12 小时和1、2、3和4天时采集尿和粪便样品。
如Nigavekar等在Pharm Res 21，476(2004)中所述制备放射性 组织样品。使用液体闪烁计数器(LS 6500，Beckman Coulter， Fullerton，CA)测定氚含量。调整测定的放射性值以便统计仪器的效 率且用于导出放射性(1μCi＝2.22×106dpm)/样品。然后用组织重 量校准这些值并且将缀合物的特异性放射性报导为注射剂量的百分比 (％ID/g)。将通过尿和粪便排泄的放射性(树枝状大分子)报导为注射 剂量的百分比(％ID)。
荧光树枝状大分子缀合物的生物分布。通过侧尾静脉给小鼠注射 含有0.2mg G5-6T或G5-6T-FA缀合物的0.5mL盐水。在注射后15小 时和达4天时，对动物实施安乐死并且取肿瘤样品且立即冷冻以便切片 和成像。使用分离自肿瘤的单细胞混悬液实施流式细胞计量术。切碎 肿瘤，通过70μm尼龙过滤筛(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ) 过滤细胞混悬液并且用PBS洗涤。使用EPICS XL流式细胞测定器 (Coulter，Miami，FL)分析样品。正如通过预先碘化丙锭染色测定的， 为进行分析仅门控活细胞。将数据报导为细胞群的通道荧光平均值。
为了进行共焦显微镜成像，剖离组织，包埋在OCT中并且在干冰浴 中冷冻在2-甲基-丁烷中。在恒冷切片机上切片(15μm)，在载玻片上 融化固定并且储存在-80℃下，直到染色为止。在染色后，将载玻片固 定在4％低聚甲醛中，用磷酸盐缓冲液(0.1mol/L；pH 7.2)冲洗，并且 固定在Prolong中。使用安装了带有校正环的x40 Plan-Apo 1.2数值孔 径(水浸装置)物镜的Zeiss 510金属激光扫描共焦显微镜获取图像。将 共焦图像记录为512×512×48像素，其具有的标度为每个像素0.45× 0.45×0.37μm。将每个图像的立方通过光学手段切割成48个切片， 并且提供通过细胞核和细胞质切割的切片。
靶向的纳米颗粒治疗剂的递送。从肿瘤植入后第4天开始，每周2 次经皮下给予KB异种移植物的SCID小鼠通过尾静脉注射接受靶向的或 非靶向的含有甲氨蝶呤的缀合物、不含甲氨蝶呤的缀合物、游离甲氨 蝶呤或作为对照品的盐水。以0.2mL体积盐水/20g小鼠递送化合物。 每次递送的甲氨蝶呤的单剂量等于0.33mg/kg。还测试了较高剂量的 1.67和3.33mg/kg游离甲氨蝶呤。以基于存在于纳米粒中的甲氨蝶呤 的数量计算的等摩尔浓度的甲氨蝶呤递送缀合物。以等摩尔浓度的树 枝状大分子递送不含甲氨蝶呤的缀合物。在最初的试验中，每组仅有5 只小鼠的6组小鼠接受达15次注射。在随后的试验中，根据其存活情况 的不同，小鼠接受达28次注射。在整个实验过程中监测小鼠体重，作 为药物不良反应的指征。在每次试验终止时进行多器官组织病理学测 定，并且每次因毒性作用或肿瘤负荷对小鼠实施安乐死。分析来自肺、 心、肝、胰腺、脾、肾和肿瘤的组织。另外，从肿瘤中分离细胞，用 靶向的荧光素-标记的缀合物染色，并且使用流式细胞测定器测试叶酸 受体的存在。
统计学方法。计算数据的平均值、SD和SE。使用Student’ s-Newman-Keuls’检验来检验实验组与对照组之间的差异，并且将Ps ＜0.05考虑为具有显著性。
氚化树枝状大分子的生物分布。实现检验氚化G5-3H-FA的生物分 布和消除以便测试其靶向在免疫缺陷裸鼠中建立的叶酸受体-阳性人 KB肿瘤异种移植物的能力。在实验期限中对小鼠维持叶酸-缺乏膳食， 以便将叶酸的循环水平降至最低限度(例如，参见Mathias等J Nucl Med 29，1579(1998))。在实验接近人血清水平前在小鼠血清中获得游离叶 酸水平(参见Belz等Anal Biochem 265，157(1998)；Nelson等Anal Biochem 325，41(2004))。在静脉内给予缀合物后不同的时间点(5分 钟-7天)评价小鼠。2组小鼠接受非靶向的氚化G5-3H树枝状大分子对 照品或靶向的氚化G5-3H-FA缀合物(附图27A和B)。在注射后第1天中 缀合物通过肾从血液中快速清除，其中G5-3H从在5分钟时的23.4％ID/g 组织下降至24小时时的1.8％ID/g(附图27A)。G5-3H-FA的血药浓度从 在5分钟时的29.1％ID/g下降至24小时时的0.2％ID/g(附图27B)。在 几个器官，诸如肺中，组织分布显示了与G5-3H从在5分钟时的9.7％ID/g 下降至24小时时的1.6％ID/g和G5-3H-FA从在5分钟时的9.6％ID/g下降 至24小时时的1.7％ID/g的血药浓度相似的趋势。由于肺的多血管性， 在每一时间点测定的缀合物水平能够反映出血药浓度。对心、胰腺和 脾观察到了类似的清除模式。已知这些器官不表达叶酸受体(folate receptor)并且在非靶向与靶向的树枝状大分子之间未显示出显著性 差异。G5-3H和G5-3H-FA在脑中的浓度在所有时间点处均低，提示所述 的聚合物缀合物不通过血脑屏障(附图27A和B)。尽管肾为这些树枝状 大分子的主要清除器官，但是已知它还表达在其小管上的高水平的叶 酸受体。非靶向的G5-3H在肾中的水平快速下降并且在接下来的几天内 维持在适度水平(附图27A)。相反，G5-3H-FA水平在前24小时内稍微增 加并且最可能的原因在于肾小管上存在叶酸受体。此后在接下来的几 天内下降，因为化合物通过肾脏清除(附图27B)。
G5-3H和G5-3H-FA在注射后24小时内主要通过肾快速排泄。两种化 合物排泄增加看起来与缀合物的肾保留完全一致(附图27A和B)。尽管 靶向和非靶向的缀合物也出现在粪便中，但是其量仍然极低。任何物 质是否实际在粪便中排泄因粪便中的尿污染而难以测定。靶向的 G5-3H-FA在前4天内的累积清除率低于G5-3H的累积清除率，这反映出 G5-3H-FA在表达叶酸受体的组织内保留。已知肝和KB肿瘤细胞表达高 水平的叶酸受体。在这些组织中，非靶向的G5-3H的浓度随树枝状大分 子从血液中的清除而快速下降；浓度在剩余的研究组织的天数内维持 在低水平(附图27A)。相反，在肝和肿瘤内，靶向的G5-3H-FA含量在前 4天内增加(附图27B)。当放射性缀合物血药浓度低时，发生这一情况， 提示了与通过脉管系统单纯截留树枝状大分子的情况相反，在这些组 织中针对浓度梯度的树枝状大分子的特异性摄取。
在注射G5-3H-FA前接受181nmol游离叶酸的小鼠组中进一步找到 了靶向药物递送的特异性(附图27C)。在注射后4天时，在不具有排泄 树枝状大分子能力的肿瘤组织中观察到了与用游离叶酸阻断叶酸受体 相关的放射性显著减弱(附图27C)。这提示靶向与非靶向的聚合物缀合 物之间的肿瘤浓度差异是因这些分子通过在肿瘤中超表达的叶酸受体 的特异性摄取所致。在注射靶向的缀合物前通过递送游离叶酸未显著 改变在所有其它组织中的生物分布。
荧光树枝状大分子缀合物的靶向和摄入。为了进一步证实和定位 肿瘤组织内的树枝状大分子纳米粒，使用与6-TAMRA缀合的树枝状大分 子。在静脉内注射靶向的G5-6T-FA和非靶向的G5-6T缀合物后15小时时 从肿瘤样品中获得共焦显微镜图像(附图28)。与使用非靶向的树枝状 大分子相比(附图28A)，使用靶向的染料-缀合的树枝状大分子 G5-6T-FA的肿瘤组织显示出大量荧光细胞(附图28B)。对分离自相同肿 瘤的单细胞混悬液的流式细胞计量分析显示了来自接受G5-6T-FA的小 鼠的肿瘤细胞的较高通道荧光(附图28C)。
共焦显微镜还显示缀合物存在于肿瘤中，与许多肿瘤细胞结合并 且被其摄入(附图28D)。从顶部经中间到基底部的组织载玻片中取光学 重叠部分。本文提供的肿瘤细胞中间切片在整个胞质溶胶中显示出来 自缀合物6T的荧光，其中细胞和细胞核边界清晰可见(附图28D)。
树枝状大分子缀合物的毒性。在研究期限中观察所有小鼠脱水、 不能饮食或饮水、虚弱或活动水平改变的征兆。在达99天时未观察到 急性或慢性存在严重毒性，与树枝状大分子缀合物是否含有甲氨蝶呤 无关。在整个实验过程中监测体重并且未观察到体重减轻；实际上， 动物的体重增加。在每一时间点时，对肝、脾、肾、肺和心进行总体 检查和组织病理学检查。在组织病理学检查时未观察到形态异常。在 注射树枝状大分子后的任意动物组中未注意到体内毒性。
靶向的药物通过叶酸受体递送至肿瘤细胞。测试不同剂量的缀合 物对具有皮下人KB异种移植物的SCID CB-17小鼠的功效并且与等剂量 和较高剂量的游离甲氨蝶呤相比。对小鼠维持叶酸-缺乏膳食3周，此 后注射KB肿瘤细胞以便获得接近人血清中并且预防肿瘤异种移植物上 叶酸受体减量调节的叶酸循环水平(参见Mathias等J Nucl Med 29， 1579(1998))。给每组中有5只小鼠的6组SCID小鼠的一侧胁腹经皮下注 射在0.2mL PBS中的5×106KB细胞混悬液。所用的G5-FI-FA-MTX治 疗剂的最高总剂量等于55.0mg/kg并且相当于5.0mg/kg游离甲氨蝶呤 的总蓄积剂量(附图29)。将缀合物的治疗剂量与相当于蓄积在基于小 鼠存活率的10-15次注射中的33.3、21.7和5.0mg/kg的游离甲氨蝶呤 的三种蓄积剂量进行比较。将盐水和不含甲氨蝶呤的缀合物(G5-FI-FA) 用作对照品。
在整个实验过程中监测小鼠体重，作为药物不良反应的指征，并 且体重改变显示在最高和次最高蓄积剂量的游离甲氨蝶呤下的急性和 慢性毒性分别等于33.3和21.7mg/kg。尽管两种剂量的游离药物均影 响肿瘤生长，但是它们在截止到本试验的第32-36天时变成致死性的 (附图29)。剩余的实验组具有极为均匀的体重波动，在与使用盐水或 不含甲氨蝶呤的缀合物的对照组相比时，未表现出毒性。就所用的最 高蓄积剂量的游离甲氨蝶呤而言，对肝的组织病理学分析揭示出晚期 肝损伤，炎症细胞聚集和门静脉周炎症。相反，相当于5.0mg/kg游 离甲氨蝶呤的治疗缀合物的总蓄积剂量和相同剂量下的游离甲氨蝶呤 均无毒性(附图29)。重要的是，等于所用游离甲氨蝶呤的最低剂量的 缀合物治疗剂量与次最高剂量的游离甲氨蝶呤(21.7mg/kg，13次注射) 具有等同的有效性。而在该浓度下的游离药物对肿瘤生长没有作用(附 图29)，不含甲氨蝶呤的缀合物(G5-FI-FA)在与注射盐水的对照组相比 时无治疗作用(附图29)。来自接受缀合物(G5-FI-FA-MTX)的小鼠的肝 载玻片显示偶见门静脉周淋巴细胞，指示非不同于注射盐水的对照组 动物的炎症和单细胞坏死。
在第二个99-天试验过程中，用G5-FI-FA-MTX或G5-FA-MTX缀合物 而不用FITC治疗的肿瘤比那些用非靶向的G5-FI-MTX缀合物、游离甲氨 蝶呤或盐水治疗的肿瘤在生长得缓慢方面存在统计学显著性(P＜ 0.05)。使用两种靶向的缀合物递送至存活小鼠的甲氨蝶呤的等效剂量 高于游离甲氨蝶呤的剂量，因为所有接受游离甲氨蝶呤的小鼠在本试 验的第66天时死亡(附图30)。接受G5-FI-FA-MTX或G5-FA-MTX缀合物 的组中的小鼠存活率表明，基于终点时的4cm3体积的肿瘤生长可以被 延迟至少30天(附图30)。这一数值表明了缀合物的抗肿瘤有效性，因 为它模拟了临床终点并且需要在整个疾病进展过程中观察小鼠。此外， 在本试验的第39天时，在1只使用G5-FA-MTX缀合物治疗的小鼠中获得 了完全治愈。在该小鼠中的肿瘤在随后的20天，直到本试验的第60天 时不可触及。在本试验终止时，接受G5-FA-MTX的有3只(8只中)存活者， 而接受G5-FI-FA-MTX的有2个存活者(8只中)。在接受游离甲氨蝶呤的 组或任意其它对照组中没有小鼠存活。因此，在某些实施方案中，本 发明提供了包含树枝状大分子的组合物，所述的树枝状大分子包含靶 向剂、治疗剂和成像剂。在优选的实施方案中，将树枝状大分子以靶 向特异性方式用于在体内将治疗剂递送(例如甲氨蝶呤)至肿瘤细胞。
基于进行的体重改变和组织病理学检查发现缀合物的有效剂量无 毒性。在两种试验终止时，组织病理学检查未显示出心脏毒性征兆并 且未发生肌病。在这些动物中未观察到肾中的急性肾小管坏死。对肿 瘤载玻片的分析显示对照组和注射盐水的动物中存活的肿瘤仅有轻度 的坏死，而治疗缀合物与等剂量的游离甲氨蝶呤相比在肿瘤中导致重 度到显著性坏死。在本试验终止时，与KB细胞相比评价肿瘤细胞因小 鼠长期叶酸-缺乏膳食而在肿瘤中叶酸受体可能的增量调节。对用靶向 的荧光素-标记的缀合物染色后的肿瘤细胞的流式细胞计量分析揭示 出细胞保持了叶酸受体阳性，但低于原始KB细胞系2-5倍。
                     实施例14
       PAMAM-树枝状大分子-RGD4C肽缀合物的合成
药物靶向对有效的癌症化疗而言是关键。靶向递送可提高化疗作 用并且使正常组织免受这些剧烈药物的毒性副作用。抗血管发生疗法 通过抑制内皮细胞增殖、迁移和分化预防新生血管形成(例如，参见 Los和Voest，Semin.Oncol.，2001，28，93)。可以区分新的由其 成熟配对物形成的毛细血管的分子标记的鉴定提供了将细胞毒性剂靶 向递送至肿瘤脉管系统的方式(例如，参见Baillie等Br.J.Cancer， 1995，72，257；Ruoslahti，Nat.Rev.Cancer，2002，2，83；Arap 等Science，1998，279，377)。αVβ3整联蛋白为这些独特标记中最 具有特异性的一种标记。
仅在血管发生过程中的内皮细胞腔表面上发现了αVβ3整联蛋白。 该标记可以由在血管发生过程中限于血管空间的靶向剂识别(参见例 如Brooks等Science，1994，264，569；Cleaver和Melton，Nat.Med，. 2003，9，661)。已经通过噬菌体展示研究鉴定了αVβ3选择性配体 Arg-Gly-Asp(RGD)的高度亲和力(Pasqualini等Nat.Biotech.，1997， 15，542)。双重环化的肽(RGD4C，含有通过4个半胱氨酸残基的2个 二硫键)和构象束缚的RGD比具有单一二硫桥的肽类或线性肽类更易 于结合αVβ3。对合成用于基因递送(例如，参见Kunath等J.Gene. Med.，2003，5，588-599)、肿瘤靶向(例如，参见Mitra等J. Controlled Release，2005，102，191)和成像应用(例如，参见Chen 等J.Nucl.Med.，2004，45，1776)的聚合物(poymer)-RGD缀合 物的关注已经在增长。
在某些实施方案中，本发明提供了与荧光标记的第5代树枝状大 分子缀合的RGD4C的合成。另外，本发明提供了这些缀合物的结合特 性和细胞摄取。
据报导胺终止的树枝状大分子以归因于表面正电荷的非特异性方 式与细胞结合。为了改善靶向功效和减少非特异性相互作用，使用乙 酸酐(75％×摩尔过量)在有三乙胺作为碱存在下对胺终止的G5树枝状 大分子进行部分表面修饰(例如，参见Majoros等Macromolecules， 2003，36，5526.4)。最初通过对PBS缓冲液且然后对水透析纯化缀 合物。75摩尔过量的乙酸酐的应用使某些胺基脱离以便进一步修饰并 且防止因聚集、分子间相互作用和降低的溶解度产生的问题。
可以使用1H NMR光谱法监测乙酰化G5树枝状大分子(G5-Ac)的乙 酰化程度和纯度。为了通过流式细胞计量术或共焦显微镜术检测缀合 物，可以使用可检测探针(例如荧光探针)。例如，可以将Alexa Fluor 488(AF)用作荧光标记。使部分乙酰化的树枝状大分子与5摩尔过量的 Alexafluor-NHS酯如制造商所述的方案进行反应，而得到荧光标记的 缀合物(G5-Ac-AF)。通过凝胶过滤和随后透析纯化该缀合物。通过1H NMR和UV-vis光谱法，按照制造商所述的方案(Molecular Probes)， 将染料分子的数量估计为每个树枝状大分子中～3个。
用于本发明某些实施方案的RGD肽(RGD4C)具有以高亲和力特异 性结合αVβ3的构象束缚的RGD序列。杂二聚化αVβ3整联蛋白中的RGD 结合位点位于两个亚单位之间的断裂处。为了保持接触靶位点的肽的 结合部分，将ε-Aca(酰基己酸)间隔基用于使肽与树枝状大分子缀合。 由此，RGD-4C肽的质子化NH2末端对生物活性而言并非必不可少的。 因此，在某些实施方案中，用乙酰基给NH2末端封端(例如，参见de Groot等Mol.Cancer Therap.，2002，1，901)。
通过使用DMF/DMSO溶剂混合物中的EDC，在有HOBt存在下制备 所述肽的活性酯，且然后将其滴加到G5-Ac-AF的水溶液中。反应时间 分别为2小时和3天。酰胺化主要发生在酰基己酸连接部分的羧酸酯 基上(例如与1.1eq.在DMSO中的烯丙基胺的A模型反应得到单酰胺 化的产物，纯度为67％(HPLC)。ESI-MS m/z 1282[M+H]+)。通过膜过 滤和透析纯化与AlexaFluor和RGD肽G5-Ac-AF-RGD缀合的部分乙酰 化的PAMAM树枝状大分子。缀合物的1H NMR显示在AlexaFluor和肽 的苯环的芳香族化合物区中的重叠信号远离对树枝状大分子预计的脂 肪族化合物信号。基于MALDI-TOF质谱将肽类的数量计算为每个树枝 状大分子中有2-3个肽。
MALDI-TOF MS已经成为广泛应用于表征不均匀官能化的树枝状大 分子的表面官能化的技术(例如，参见Woller等J.Am.Chem.Soc.， 2003，125，8820-8826)。
使用Waters TOfspec-2E记录质谱，使用高质量PAD检测器以延 迟提取模式运行并且使用在芥子酸中的BSA校准。为了测定含有肽的 树枝状大分子的官能化，从产物的(m/z 32770[M+H]+)中扣除原料的 (m/z 29650[M+H]+)。
描述上述合成G5-Ac-AF-RGD的方案如附图31中所示。
                     实施例15
PAMAM-树枝状大分子-RGD4C肽缀合物的体外靶向功效
测定表达高细胞表面αVβ3受体的人脐静脉细胞(HUVEC)中树枝状 大分子-RGD4C缀合物的细胞摄取。简言之，在补充了内皮细胞生长因 子的RPMI培养基中培养HUVEC细胞。用不同浓度的G5-Ac-AF-RGD缀 合物处理细胞并且通过流式细胞计量术监测摄取。正如附图32中所 示，流式细胞检测分析显示了与HUVEC细胞的剂量-依赖性和可饱和结 合。
还使用流式细胞计量术测试了该缀合物与具有不同整联蛋白受体 表达水平的几种不同细胞系的结合(参见附图33)。该缀合物表现出与 不同细胞系的不同结合亲和力，其中HUVEC细胞最有效地结合缀合物， 其后是Jurkat细胞。已经预先报导了人淋巴细胞系Jurkat具有大量 整联蛋白受体并且能够结合RGD 4C肽(例如，参见Assa-Munt等 Biochemistry，2001，40，2373)。L1210小鼠淋巴细胞系不能结合缀 合物，而KB细胞仅表现出中度结合。
显而易见，本发明的缀合物对具有不同细胞表面整联蛋白受体表 达水平的细胞系表现出可变的特异性。通过共焦显微镜分析证实了通 过流式细胞计量术观察到的结合。洗涤用G5-AF-RGD4C(0，30，60，100 nm)浓度处理的HUVEC细胞并且用多聚甲醛(p-formaldehyde)固定， 用DAPI对细胞核进行复染。从附图34中共焦显微镜图像的有关表现 中显而易见，摄取随缀合物浓度的增加而增加。添加游离肽抑制HUVEC 细胞摄取缀合物达到显著性水平，表明受体介导的缀合物摄取(参见附 图35)。
为了确定多价相互作用在与单价相互作用比较时是否表现出更强 的结合，使用BIAcore instrument(BIAcore AB，Uppsala，Sweden) 对人整联蛋白αvβ3纯化的蛋白质(Chemicon International，Inc. Temecula，CA)监测G5-Ac-AF-RGD4C缀合物和RGD4C肽的结合亲和 力。通过使用BIAevaluation 3.2软件BIAcore AB)对二价结合模型 进行总体拟合来分析对两种分析物获得的数据。根据解离和结合速率 常数之比(koff/kon)计算平衡解离常数(KD)。游离RGD4C肽与人整联蛋 白αvβ3的结合极为快速地达到10RU的最大结合值。相反，结合 G5-Ac-AF-RGD4C缀合物速度较慢地达到约1500RU的最大结合值。两 种分析物表现出不同的解离速率(off-rates)。游离RGD4C肽在使用 试验缓冲液洗涤过程中从配体中快速解离。纳米装置的解离比游离肽 慢约522倍。因此，本发明提供了多功能树枝状大分子，其中在单一 树枝状大分子上的多种肽的缀合结果对结合功效发挥协同作用。
因此，本发明提供了PAMAM-树枝状大分子RGD4C肽缀合物。在某些 实施方案中，树枝状大分子被表达αVβ3受体的细胞摄取。因此，在某 些优选的实施方案中，树枝状大分子缀合物用于使成像剂和/或化疗剂 定向于血管发生的肿瘤脉管系统。
将上述说明书中提及的所有公开文献和专利引入本文作为参考。 在不脱离本发明实质和范围的情况下对本发明所述的方法和系统的各 种变型和变化对本领域技术人员而言显而易见。尽管结合具体的优选 实施方案描述了本发明，但是应理解请求保护的本发明不应过度限于 这类具体的实施方案。实际上，对相关领域技术人员显而易见的用于 实施本发明所述方式的变型属于本发明的范围。
本发明要求2004年8月25日提交的美国临时专利申请流水号 US60/604,321和2005年6月15日提交的美国临时专利申请流水号 US60/690,652的优先权，将这些文献完整地引入本文作为参考。
本发明部分受到NIH Contract NO1-CO-97111和NCI Contract NOl-CM-97065-32的资助。政府可以拥有本发明中的某些权利。
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