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用于分离靶细胞的方法

阅读：1016发布：2020-07-09

专利汇可以提供用于分离靶细胞的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一种用于样品中的靶细胞的富集和/或分离的方法，所述样品包括红血球和/或血小板，所述方法包括：(a)通过具有孔径或目径在0.5μm和5μm之间的滤器元件过滤所述样品；(b)使被步骤(a)中的所述滤器元件保留的细胞与分离表面接触，其中所述分离表面包括选择性结合至所述靶细胞的亲和分子；(c)在允许所述亲和分子至所述靶细胞的结合的条件下，孵育所述细胞和所述分离表面；以及(d)将所述分离表面与任何未结合的细胞和材料分离。，下面是用于分离靶细胞的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种用于样品中的肿瘤细胞的富集和/或分离的方法，所述样品是包括红血球和/或血小板的样品，所述方法包括：
(a)通过具有尺寸在0.5μm和5μm之间的孔的滤器元件过滤所述样品；
(b)使被步骤(a)中的所述滤器元件保留的细胞与分离表面接触，其中所述分离表面是在支撑材料上的水凝胶包衣，其中，所述水凝胶包衣包括聚羧酸盐聚合物或由聚羧酸盐聚合物组成，且其中，所述分离表面包括选择性结合至所述肿瘤细胞的亲和分子，且其中，所述亲和分子被固定至所述水凝胶包衣；
(c)在允许所述亲和分子与所述肿瘤细胞结合的条件下，孵育所述细胞和所述分离表面；以及
(d)将所述分离表面与任何未结合的细胞和材料分离。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述滤器元件的孔径在1μm和2μm之间。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述滤器元件是织物。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述样品选自全血、尿液、胸腔积液、腹水、支气管肺泡灌洗液、女性乳房腺体的乳头抽吸液或骨髓样品。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中支撑材料是载片、珠子或层析树脂。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述亲和分子是抗体、抗体的抗原结合片段、配体、凝集素或受体或适体。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述亲和分子是从由抗-EpCAM的抗体、抗-EGFR的抗体、抗-CD19的抗体、抗-CK20的抗体、抗-MUC1的抗体、抗-MUC2的抗体，或它们的抗原结合片段所组成的组中选择的抗体。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其中在将所述样品施加至所述滤器元件之前或在将所述样品施加至所述滤器元件的同时，使用适当的缓冲液稀释所述样品。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤(c)中的所述孵育包括所述分离表面的摇动。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤(d)包括用洗涤缓冲液洗涤所述分离表面。

说明书全文

用于分离靶细胞的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种用于样品中靶细胞的富集和/或分离的方法，所述样品包括红血球和/或血小板；所述方法包括：(a)通过具有在0.5μm和5μm之间的孔或目径的滤器元件过滤样品；(b)使在步骤(a)中被滤器元件保留下来的细胞与分离表面接触，其中所述分离表面包括选择性结合至靶细胞的亲和分子；(c)在允许亲和分子与靶分子结合的条件下孵育上述细胞和分离表面；及(d)把分离表面与任何没有结合的细胞和材料分离。

背景技术

[0002] 已在临床研究中示出了播散的肿瘤细胞(DTC)(即在癌症患者的外周血或骨髓中可检测的肿瘤细胞)在癌症患者的诊断及治疗结果的评价方面提供信息价值。除此之外，在很多情况中这些细胞具有在疾病的早期指示肿瘤发生的能力。

[0003] 例如，对乳腺癌患者的研究显示患者血液中的播散的肿瘤细胞的检测与无进展的存活和完全存活的降低显著相关(Gaforio等(2003)Int.J.Cancer,107(6):984-90；Stathopoulou等(2002)J.Clin.Oncol.,20(16):3404-12)。在其它类型癌症中进行的研究中获得了类似的结果(Koch等(2005)Ann.Surg.,241(2):199-205；Kinele等(2003)Ann.Surg.,238(3):324-30)。因此，在癌症患者的血液或骨髓中存在的播散的肿瘤细胞的准确监控提供了用于治疗优化和预测病程的有用的参数。

[0004] 另外，从原发肿瘤的肿瘤细胞的血源性扩散也被认为在转移灶的发展中起作用(Eccles S.A.&Welch D.R.(2007),Lancet,369,1742-1757)。转移灶的形成(而不是原发肿瘤本身的进展)是导致肿瘤疾病中的死亡的主要原因。因此，用于转移灶形成的早期标志的检测对应用至癌症患者的治疗方案极其重要。

[0005] 目前，通过使用包括结合至肿瘤细胞的确定的表面抗原的抗体的磁珠常规地进行播散的肿瘤细胞的检测和分离。这些修饰的珠子与个体的血液样品孵育以特异性结合样品中存在的肿瘤细胞。但是，目前可用的技术与非特异的细胞吸附至珠子的高程度，以及肿瘤细胞的低检测率相联系。已知由于样品中的非靶细胞(尤其是红血球细胞)的数量很大，因此不能确保在常规使用的方法中样品中的每个肿瘤细胞均与珠子的抗体呈现表面相互作用足够长的时间，以便发生固定的抗体和靶细胞之间的结合。相反，样品中有效数量的肿瘤细胞将不用它们对应的捕获分子接触。

[0006] 因为该原因，现有技术中做了尝试以移除红血球，以便富集样品中的肿瘤细胞。例如，使用了使用特异的密度梯度介质(诸如Ficoll、Nycodens、Nycoprep等)的密度梯度离心。为了该目的所采用的介质具有在红血球和有核细胞的密度之间的密度。通过离心，红血球和有核细胞变得富集在介质的不同的相中，且可通过移液管彼此分离。这种方法具有特定的缺点，即该方法是劳动密集型的且需要高度熟练的人员来进行分离。而且，播散的肿瘤细胞可能显示宽密度范围，这意味着这些细胞的一部分可能不可用于随后的亲和结合步骤。密度梯度离心的使用还需要肿瘤细胞的多次清洗步骤，这与若干不利影响诸如剪切应力和细胞非特异性吸附至反应管壁相关，其中剪切应力和细胞非特异性吸附至反应管壁可导致靶细胞的丢失。已证实通过密度梯度离心的肿瘤细胞的富集通常导致样品中存在的肿瘤细胞几乎三分之二的丢失(Choesmel等(2004),101,693-703)。进一步地，密度梯度离心不能进行更大样品体积的处理，这在当考虑播散的肿瘤细胞以极低的浓度存在于血液或骨髓中时是明显的不利因素。

[0007] 在目前使用的可选择的方法中，通过向血液样品中加入裂解缓冲液诸如氯化铵来裂解红血球。通过加入裂解缓冲液，红血球的膜破裂从而导致细胞死亡和细胞内组分的释放。但是，已证实裂解缓冲液的使用还常常使样品中存在的播散的肿瘤细胞的很大部分破裂。进一步地，可假设这些缓冲液的使用将有害地影响靶细胞的新陈代谢，这对进一步的处理步骤(例如培养分离的细胞)是不利的。

发明内容

[0008] 根据上述问题，本发明的一个目的是提供一种用于富集和/或分离靶细胞的改进的方法，该靶细胞与红血球和/或血小板一起存在于生物样品中；所述方法具有高回收率且同时包含对靶细胞的温和处理，以便在处理过程中仅使少量的靶细胞破裂。尤其，该方法将不会对靶细胞施加大量的机械或化学应力。本发明的另一目的是提供一种允许血液样品中的靶细胞高度特异性的结合至分离表面的方法，该方法的特征在于非靶细胞诸如红血球与所述表面的非特异性附着减少。通过所附权利要求中定义的方法达到这些目标和其它优点。

[0009] 本发明已发现：通过具有特别小孔径的滤器元件过滤包含红血球和/或血小板的样品(诸如全血样品)且随后经由与靶细胞特异性结合的分离表面分离残留物中的靶细胞的组合方法产生非常高的回收率。在本发明的实施例中，可回收几乎100％的进行本发明方法的标记的靶细胞。通过初始的过滤步骤大大减少了可干扰亲和结合步骤的红血球、血小板或白细胞对分离表面的非特异性吸附。此外，已发现当与参照样品(其中通过密度梯度离心去除红血球)中的白细胞相比，已通过根据本发明的过滤步骤分离的白细胞显示出对分离表面低2级的非特异性结合亲和性(factor 2lower non-specific binding affinity)(见图2)。因此，通过分离表面的靶细胞的回收率(也被称为淘金法(panning))比通过现有技术中的方法实现的靶细胞的回收率高很多。

[0010] 因此，在第一方面，本发明公布了一种用于样品中靶细胞的富集和/或分离的方法，其中，其中所述样品包括红血球和/或血小板，所述方法包括：

[0011] (a)通过具有尺寸在0.5μm和5μm之间的孔、洞或缝隙的滤器元件过滤所述样品；

[0012] (b)使被步骤(a)中的所述滤器元件保留的细胞与分离表面接触，其中所述分离表面包括选择性结合至所述靶细胞的亲和分子；

[0013] (c)在允许所述亲和分子与所述靶细胞结合的条件下孵育所述细胞和所述分离表面；以及

[0014] (d)从任何未结合的细胞和材料中分离所述分离表面。

[0015] 本发明的方法可应用于包括红血球和/或血小板的任何样品。优选地，所述样品包括来自个体的体液或组织提取液。优选地，样品来源的个体为脊椎动物，且更优选地为哺乳动物。在特别优选的实施方式中，上述样品来源于人。样品通常为细胞悬浮液。上述样品可包括以下物质或由以下物质组成：血液(例如全血)或血液组分、尿液、胸腔积液、腹水、支气管肺泡灌洗液、女性乳房腺体的乳头抽吸液或骨髓。在优选方面，包括靶细胞的样品分别为血液或骨髓样品，例如来自人类个体的包括血液或骨髓或主要由血液或骨髓组成的样品。可通过现有技术中任何已知的方法获取样品。例如，如果样品为人的血液样品，则可通过静脉穿刺获取样品。用于获得骨髓(例如人的骨髓)的方法在本领域中也是公知的。例如，可通过通常经由微创外科手术的介入治疗从髂骨或从胸骨的隆起部位获取混合有血液的红骨髓。可选择地，生物样品可为腹水(即腹腔液体)、胸腔积液、来自女性乳头的抽吸液、尿液或其它体液。

[0016] 当要在根据本发明的方法中使用的样品具有特别高的粘度时，可能有利地是在将样品施加在滤器元件之前或同时稀释该样品。为了该目的，可使用任何生理上可接受的缓冲液，该缓冲液不会干扰靶细胞至亲和分离表面的后续结合。用于样品稀释的适合的缓冲液为在生理pH内进行缓冲的等渗缓冲液，例如磷酸盐缓冲液(PBS)、汉克(Hank’s)平衡盐溶液、Tris缓冲盐水、HEPES缓冲盐水、MES缓冲液等。生理缓冲液的pH值优选在大约pH 6.0至大约pH 9.0的范围内，更优选在大约pH 6.5至大约pH 8.0之间，且最优选在大约pH 7.0至大约pH 7.5之间(例如pH 7.4)。

[0017] 本发明的方法的一个特别的优点是可处理相当大体积的样品。可将至少5ml或更多(例如8ml、10ml、15ml、20ml、25ml、30ml、35ml、40ml、45ml、50ml、60ml、70ml、80ml、90ml或甚至100ml、150ml、200ml、500ml、1000ml或更多)的样品体积进行过滤步骤，然后使残留物与分离表面接触。以这种方式，可适用过滤步骤以浓缩残留物，从而减少样品处理时间，且增强本方法的整体性能。相反，目前可用的方法依赖于磁珠的使用，其中磁珠被加入怀疑包括靶细胞的样品中。在这些方法中，仅有2～5ml之间的小体积的样品流体可与磁珠孵育，因为否则靶细胞和颗粒表面上的抗体的接触的可能性显著降低，从而导致低回收率。根据本发明，初始的过滤步骤富集靶细胞，且同时去除大量的红血球和/或血小板，否则红血球和/或血小板会干扰后续的靶细胞和分离表面上的亲和分子的结合。

[0018] 在本发明的第一步骤中，通过具有尺寸在0.5μm和5μm之间的孔、洞或缝隙的滤器元件过滤样品。通过使用滤器元件可从样品中去除红血球和/或血小板，否则红血球和/或血小板会干扰靶细胞(例如播散的肿瘤细胞)和分离表面上的靶细胞对应的亲和分子的结合。红血球(红细胞)是负责在血液中运输氧的具有平均直径为5～8μm的无核血细胞。已发现由于这些细胞高度的可变形性，具有小至0.5μm孔径的滤器元件可有效用于去除这些细胞的绝大多数。红血球具有扁平的形状且可形成管状结构，能够穿过具有尺寸显著小于红血球在它们的放松、扁平状态下的平均直径的缝隙。

[0019] 类似地，血小板是没有细胞核的细胞，常常具有在1～2μm之间的平均直径且具有某种程度的可变形性，这意味着血小板也能够穿过具有上述孔径的滤器元件的孔。相反，有核细胞诸如白细胞或肿瘤细胞通常大于5μm，且具有有限的变形能力。因此有核细胞被滤器元件保留，从而被计划用于本发明的方法中。如下面实施例6所示，通过选择适当的滤器元件能容易地从人全血样品中的大部分红血球和血小板中分离肿瘤细胞和白细胞，而不会产生肿瘤细胞任何相当大的丢失。

[0020] 上面方法的步骤(a)中的过滤去除样品中存在的相当大部分的红血球。优选地，过滤步骤去除样品中存在的红细胞的大约30％、大约40％、大约50％、大约60％、大约70％、大约80％、大约90％、大约95％或甚至多达大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或更多。同样地步骤(a)中的过滤步骤适于去除样品中存在的相当大部分的血小板。优选地，过滤步骤去除样品中存在的血小板的大约30％、大约40％、大约50％、大约60％、大约70％、大约
80％、大约90％、大约95％或甚至多达大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或更多。有核细胞诸如白细胞或肿瘤细胞被滤器元件保留，这样可使用过滤以相对于红血球或血小板分别富集这些细胞部分。

[0021] 如本文所用的术语“滤器元件”指包括有规律或不规则分布的孔的介质或材料，所述孔允许小于某一临界尺寸或直径的细胞或化合物穿过该滤器元件，同时保留具有超过所述临界尺寸或直径的尺寸或直径的其它细胞、聚集物或化合物。在实施本发明中使用的滤器元件可包括所有类型的常用滤器介质或材料，且具有任何形状或尺寸。例如，优选为薄片状的本发明的滤器元件可由以下物质组成或包括以下物质：一种或多种织物或无纺织物，一个或多个穿孔的薄片，一个或多个筛网或网状结构，一种或多种微多孔材料，一个或多个膜，或这些材料的两种或更多种的组合。如通常在过滤技术中所使用的，术语“孔”表示在所有上述材料中设置的洞、开口和缝隙。因此，例如在金属丝网或织物结构的情况中，孔为单个的网眼或网眼缝隙，同时孔径为目径；且在筛网的情况中，孔为单个的筛网缝隙。优选地，滤器元件包括这些材料中的一种的单层或由这些材料中的一种的单层组成，或者滤器元件包括这些材料的至少两层或由这些材料的至少两层组成。例如，滤器元件可包括一个或多个膜或膜滤器，或由一个或多个膜或膜滤器组成，诸如通常用于从液体或气态流体中过滤微粒物质的那些膜或膜滤器。

[0022] 根据本发明，在任何情况中，滤器元件的孔径在0.5μm和5μm之间，例如0.5、1、2、3、4或5μm。优选地，滤器元件的孔径在1μm和2μm之间。在这个方面，特定的孔径被理解为横过该孔的最小直径。换而言之，本文所使用的孔径与仍能够穿过孔的最大球体的直径相同。

[0023] 上述滤器元件尤其可包括织物或无纺织物或由织物或无纺织物组成。如本文所使用的术语“无纺织物”指类网状结构，其中随机定向的纤维、细线或细丝以非对齐或随机的方式被夹在中间。无纺织物滤器可包括不会实质干扰从靶细胞分离红血球和血小板的目标的任何材料。滤器的材料尤其不应出现红血球或血小板的任何实质的粘附，这样会防止红血球或血小板有效穿过滤器元件。类似地，滤器的材料还不应允许靶细胞例如播散的肿瘤细胞与滤器材料的任何实质的非特异性粘附，这样会妨碍随后靶细胞至分离表面的转移。允许细胞分离的由无纺织物制成的滤器元件在本领域是公知的，且该滤器元件可由各种材料诸如纤维素或纤维素衍生物组成，包括醋酸纤维素、硝酸纤维素、羟丙基纤维素(HPC)、羟乙基纤维素(HEC)、羟丁基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素。无纺织物滤器的其它常用材料包括聚碳酸酯、羟乙基淀粉、聚砜、聚醚砜,聚酰胺、聚醚酮、聚醚酰亚胺、聚亚芳烃(polyarylene)、聚苯醚、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚四氟乙烯(PTFE)等，以及玻璃。可通过各种已知方法制作无纺织物滤器材料，例如熔喷(meltblowing)、网状结合(spunbonding)、气流成网(air-laying)、湿法成形(wet-forming)和粘合的梳理成网(bonded carded web)方法。在例如美国专利号4,340,563和3,849,241中描述了无纺织物的生产。还可从多家不同的供应商，例如从Carl Roth(卡尔斯鲁厄，德国)、Schleicher&Schuell(达瑟尔，德国)和Satorius(哥廷根，德国)获得适合的无纺织物滤器。

[0024] 在特别优选的实施方式中，在本发明的方法中使用的滤器元件包括织物或由织物组成。如本文所使用的，“织物”指已通过编织工艺，即通过经纤维和纬纤维、经细线和纬细线，或经纱和经纱的交织制备的材料。经纤维和纬纤维、经细线和纬细线，或经纱和纬纱优选以基本直角依次彼此上下交叉。这优选产生具有正方形或矩形网孔的纺织品，其中网孔具有确定的目径，可用于分离具有确定尺寸的颗粒。根据本发明，织物滤器元件的孔径或目径在0.5μm和5μm之间，例如为1μm、2μm、3μm、4μm或5μm，其中本文中特定的网孔或缝隙的尺寸应理解为横过该网孔或缝隙的最小直径。换而言之，本文所使用的网孔或缝隙尺寸与仍能够穿过该网孔或缝隙的最大球体的直径。适于在本发明中使用的织物包括筛选织物(screening fabrics)，如通常在丝印法(silk screen method)或胶印法(offset printing method)中使用的那些筛选织物。在本发明中使用的织物结构可具体包括以下物质或由以下物质组成：聚酰胺、芳族聚酰胺、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、多氟烃、聚丙烯腈、聚氨酯、聚丙烯酸酯、尼龙、聚苯硫醚、聚四氟乙烯、聚苯并咪唑等。可从不同的供应商买到适合的织物滤器，例如从Schwegmann Filtrations-Technik GmbH(盖尔斯多夫，德国)买到单丝纺织品polyamid 6.6单丝；从Franz-Eckert GmbH(瓦德奇，德国)买到PA1/1–PA 5/1；从Sefar AG(海登，瑞士)买到Sefar Nitex 03-1/1或Sefar Nitex03-5/1或Sefar Petex 07-5/1。

[0025] 织物或无纺织物滤器元件可额外地包被有生物惰性层，该生物惰性层抑制与样品中存在的细胞的任何相互作用。这些生物惰性层可包括例如适合的封闭蛋白(诸如BSA或酪蛋白)，或亲水性包衣(诸如水凝胶)，或可通过有机滤器元件的(等离子)氧化制备的亲水性氧化层。

[0026] 可在本发明的方法中使用的进一步优选的滤器元件包括通过蚀刻基于硅片的材料(诸如氮化硅)制造的微筛网。通过先进的半导体方法制备上述筛网，该筛网提供非常薄的分离层和均匀尺寸的孔。通过使用这种技术，可制备具有0.35μm直径的孔和缝隙。可例如通过fluXXion B.V.(埃因霍温，荷兰)或通过Aquamarijn Micro Filtration B.V.(聚特芬，荷兰)买到商标名为的适合的滤器元件。

[0027] 其它适合的滤器元件包括通过相分离成型工艺制备的聚合物结构。这种技术使用在溶剂/非溶剂系统中的聚合物的混合物以在模具上形成三维结构。通过选择聚合物和溶剂/非溶剂的合适的混合物，可生产具有孔径在0.5μm至1μm范围内的微孔结构。基于这种技术成型的滤器元件包括Aquamarijn Micro Filtration B.V.(聚特芬，荷兰)提供的那些滤器元件。

[0028] 可简单地通过在滤器元件的两侧提供压力差使样品或稀释的样品过滤通过该滤器元件，使得在提供样品和形成残留物的一侧压力较高。例如，可通过适合地使用重力或适合地使用流体静压力差有利地造成这样的压力差。依赖于选择用于过滤步骤的装置，且依赖于滤器元件的参数(尤其是滤器元件的孔径或目径)，技术人员将能够调整用于使样品穿过滤器元件所施加的压力。简单讲，压力应足够高以通过迫使红血球和/或血小板穿过滤器元件有效地去除样品中存在的红血球和/或血小板。另一方面，压力应足够低，以便靶细胞不会被损害或被推动穿过滤器元件。可以各种形式使用滤器元件，条件是选择的滤器元件可符合特定的过滤工艺。例如，如果使用如下面定义和图8～9中示例的两个腔体的组件，优选在两个腔体之间使用包括一个或多个平薄片的滤器元件。同样可使用其它形式的滤器元件，例如漏斗形的元件或v-形的槽。

[0029] 可选择地，还可仅在扩散的基础上实现本发明方法的过滤步骤。例如，可选择装置，在该装置中通过滤器元件从无血小板和/或红血球的缓冲溶液分离包括血小板和/或红血球的样品。缓冲液例如可以是以上样品稀释的上下文中提到的任意缓冲液。如果孵育足够的时间段，则样品中存在的血小板和/或红血球将穿过滤器元件以在样品和缓冲液的不同浓度之间创建平衡。可通过持续从所述缓冲液移除透过滤器元件的任何血小板和/或红血球(例如更换缓冲液)来保持和维持定向的扩散过程。在仅仅通过扩散实现过滤的实施方式中，还可能使用密封袋形式的滤器元件，其中密封袋中包含具有靶细胞的样品。密封的滤器元件可被浸入没有红血球和血小板的适合的缓冲介质(例如PBS)中。袋状滤器元件中的红血球和/或血小板将逐渐透入周围的介质中。优选地，例如通过重复或持续使用新鲜的介质更换包含血细胞的介质来移除进入介质的细胞。这可通过例如使用流速为5ml/min的蠕动泵实现。

[0030] 为了进行预过滤，可在根据本发明的过滤步骤中使用具有孔径为10～30μm的滤器元件，尤其是如果生物样品是血液样品。使用用于预过滤的滤器元件以移除可能通过白细胞和血小板的聚集或通过纤维蛋白、纤维蛋白原和其他血液组分形成的细胞聚集物。因此，本发明的方法可包括在上述方法步骤(a)之前的步骤，在该步骤中样品被过滤通过具有孔径或目径在10μm和30μm之间的预滤器元件。预滤器元件可包括上文结合滤器元件所述的材料或由其组成。

[0031] 本方法试图富集和/或分离的靶细胞优选是在样品中以低浓度存在的细胞。根据特别优选的实施方式，靶细胞是肿瘤细胞，优选为播散的肿瘤细胞，且更优选为人播散的肿瘤细胞。播散的肿瘤细胞是从原发肿瘤分离出来且在外周血中循环或逐渐在骨髓中富集的癌细胞。这些细胞以非常低的浓度存在于血液或骨髓中，因此它们的检测和分离通常很复杂。例如，在血液中循环的肿瘤细胞正常以10-6～10-8个白细胞中有大约1个肿瘤细胞的浓度存在。相反地，红血球的浓度在每毫升人血液中存在4～6x109个细胞的范围内。存在于血液中的血小板的浓度为每毫升血液存在大约1.5～3.0x106个细胞。血液中大量的红血球和血小板具有如下不利影响，因为大部分靶细胞不能充分地与它们对应的结合分子相互作用以结合至分离基质上，而使靶细胞(诸如在血流中浮动的肿瘤细胞)经由分离表面(例如磁珠或包被的支撑表面)上的特异性结合分子(例如抗体)的结合效率常常很低。

[0032] 通过本发明的方法检测的播散的肿瘤细胞可源自任何癌症类型的原发肿瘤，例如来自以下原发肿瘤：前列腺癌、宫颈癌、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、脑癌、肺癌、支气管肺癌、肝癌、膀胱癌、皮肤癌、头颈癌、血液学癌症、宫颈癌、卵巢癌、胃癌、肾癌、子宫癌、骨癌、食道癌、喉癌、鼻咽癌、口咽癌、睾丸癌、外阴癌、肝细胞瘤、唾液腺癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、淋巴瘤、肉瘤、胆囊癌、胚细胞癌、多发性骨髓癌、小肠癌、胸腺癌等。优选地，播散的肿瘤细胞来源的癌症类型是癌(即上皮来源的肿瘤)，更优选地是乳腺癌、结肠癌、肺癌或前列腺癌。

[0033] 从本发明的意义上说，除了肿瘤细胞之外，在血液或骨髓中极少量存在的其它细胞类型可为靶细胞，诸如浆细胞、淋巴细胞的稀有亚型，例如记忆细胞、囊胚细胞、胚胎细胞、胎盘细胞等。

[0034] 当将靶细胞与红血球和/或血小板分离后，已被滤器元件保留的细胞被转移至或开始与分离表面相互接触。可使用任何适用于在残留物中的细胞和分离表面之间建立接触的方法。例如，当分离表面是被包被的载片，则可将靶细胞重悬在少量的缓冲液(如果需要)中，且用移液管将重悬的靶细胞转移至载片表面上。缓冲液可为例如在上面样品稀释的上下文中提到的任意缓冲液。包含残留物的等分试样通常具有0.5ml和8ml之间的体积，例如为大约1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml或7ml。如果需要，可使用上述讨论的缓冲液稀释等分试样以使体积达到10ml、20ml、20ml、30ml、40ml或50ml。可选择地，当亲和分离表面是小的珠子(诸如抗体固定在上面的磁珠)，则可将靶细胞重悬在缓冲液中，且随后将珠子加入细胞悬浮液以进行进一步的孵育。此外，分离表面可为颗粒形式，例如为玻璃颗粒或树脂颗粒，以便可引导已重悬在小体积缓冲液中的靶细胞穿过被所述颗粒填充的层析柱。此外，分离表面可具有毛细管的形式，包括靶细胞的悬浮液被引导穿过该毛细管。

[0035] 本文所使用的术语“分离表面”广义上指任意表面，该表面携带至少一种类型的适用于选择性结合靶细胞上的预定结构的亲和分子。分离表面可为通过亲和分子(诸如抗体)的固定被修饰的颗粒表面，例如为珠子(诸如磁珠或玻璃珠)的表面；其中亲和分子被指向靶细胞的确定的抗原结构。可选择地，分离表面可为基本平坦的支撑物的表面，诸如载片(例如载玻片或塑料载片)的表面。在优选实施方式中，分离表面是优选由玻璃或透明的塑料制成的生物芯片的一部分。分离表面还可呈现为层析树脂材料。

[0036] 上述支撑材料可被设置有包衣以提供分离表面的生物惰性。这意味着防止细胞被非特异性吸附至上述表面。根据特别优选的方面，分离表面被包被有天然或合成的亲水聚合物层。优选地，亲水聚合物在高度水合的支撑材料上形成三维结构。因此，这样的聚合物网常常被称为“水凝胶”。水凝胶可包含高达99％或更多的水，然而聚合物含量可为1％或甚至更低。例如在WO02/10759中描述了在本发明使用的用于制备水凝胶的方法。该国际申请(其整体并入本文)描述了提供水凝胶聚合物与支撑物材料结合的粘附介质层的使用。WO02/10759中提供的水凝胶包衣特别优选用于本发明的方法中。

[0037] 各种亲水聚合物可被用于水凝胶包衣。例如，该包衣可包括以下物质或由以下物质组成：多糖类、多元醇、聚醚类、聚酰胺类、多元羧酸、聚硫酸盐(polysulfate)、聚磺酸盐(polysulfonate)、聚磷酸盐、聚膦酸盐、和/或其组合或其官能化衍生物。所述官能化包括例如异硫氰酸盐类、异氰酸盐类、羧酸叠氮化物、N-羟基琥珀酰胺类、N-酰基咪唑类、磺酰氯衍生物、醛、酮、乙二醛、环氧乙烷、碳酸盐、芳基卤化物、酰亚胺酯类、酐类、卤代烷基(halogenalkyl)、卤代酰基(halogenacyl)、马来酰亚胺类、氮丙啶类、丙烯酰类、巯基类、二硫化物类、重氮烷、重氮乙酰类、咪唑氨甲酸酯类、酰肼类、重氮基、芳基叠氮化合物、二苯甲酮类、重氮丙酮酸盐类或二氮呤类。进一步优选的官能化包括次氮基三乙酸(NTA)衍生物，以便配体或抗体可通过金属螯合物被固定。链亲和素和/或生物素衍生物也适用于官能化。根据优选的实施方式，水凝胶包衣包括或由聚羧酸盐聚合物组成。根据进一步的优选实施方式，当例如通过ζ电势测定测量时，水凝胶包衣具有轻微的负电荷。

[0038] 水凝胶包衣可具有允许在水凝胶表面上捕获靶细胞的任何厚度。优选地，水凝胶包衣具有在大约100nm和大约5000nm之间、优选在大约500nm和大约3000nm之间的厚度，例如厚度为大约600nm、大约700nm、大约800nm、大约900nm、大约1000nm、大约1100nm、大约1200nm、大约1300nm、大约1400nm、大约1500nm、大约1600nm、大约1700nm、大约1800nm、或大约1900nm。可通过现有技术中可获得的常规方法测定包衣的厚度，例如通过原子力显微镜或椭圆偏振技术测定包衣的厚度。

[0039] 包衣优选提供了三维表面结构，在该结构中亲水聚合物链在至少部分垂直于基质表面的方向上排列，即呈刷子状。由于所述刷子状的水凝胶表面与平面结构相比具有增大的表面，因此刷子状的水凝胶表面示出对生物分子(诸如能够结合靶细胞的抗体和其它亲和分子)显著增强的固定能力。已发现刷子状结构的水凝胶包衣，特别是那些包括或由特定聚羧酸盐聚合物组成的水凝胶包衣为选择性使细胞吸附至固体支撑物以进行后续检测和/或量化提供了极好的表面。可从XanTec bioanalytics GmbH(杜塞尔多夫，德国)获得用于本发明的优选的水凝胶表面，例如为HC或HCX包被的载片。

[0040] 根据本发明，分离表面包括选择性结合至样品中的靶细胞的一种或多种不同类型的亲和分子，从而允许靶细胞与在去除红血球和/或血小板后从残留物存在的其它细胞分离。“亲和分子”广义上被理解为结合至细胞的预定结构、优选结合至靶细胞表面上存在的蛋白或多糖结构的分子。亲和分子优选为蛋白分子，诸如受体、凝集素、配体、抗体、抗体片段、核酸(诸如适体)、糖结构、或其组合。

[0041] 根据本发明，抗体分子或其抗原结合片段的使用对靶细胞的结合是特别优选的。在本发明的上下文中，术语“抗体”包括单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗独特型抗体(anti-idiotypic antibodies)、嵌合抗体和人源化抗体，只要这些抗体示出所需的免疫学活性，即特异性结合至靶细胞。具体地，该术语被理解为包括通过移植技术等制备的任何类型的人工抗体分子。在本方法中使用的抗体可具有任何同种类型，诸如IgG、IgM、IgA、IgE和IgD以及它们的亚类，例如IgG1、IgG2等。

[0042] 除了完整的抗体之外，本发明还指特异性结合至靶细胞的抗体的抗原结合片段。如本文所使用的，抗体的抗原结合片段是如下的片段：保留了用于靶细胞(例如播散的肿瘤细胞)特定抗原结构的完整抗体分子的至少一部分特异结合活性。本发明的抗原结合片段可包括Fv、Fab、F(ab')和F(ab')2片段。术语“抗原结合片段”进一步包括单链Fv抗体片段和二硫键连接的Fv片段(dsFv)。在现有技术中已描述了用于抗体片段重组制备的方法，且包括例如噬菌体展示技术或核糖体展示技术。可纯化通过这些方法制得的重组的抗体片段，且检验该抗体片段对靶细胞(例如肿瘤细胞)的结合亲和性和特异性。

[0043] 可以不同方法进行特异性亲和分子至水凝胶包被的分离表面的固定。适用于大部分应用的标准方法包括经由氨基或羟基官能团将亲和分子共价联结至使用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)预活化的水凝胶。因为固定的亲和分子是共价结合而不是吸附至水凝胶包衣，因此该固定过程同样很适用于所有类型的亲和分子，例如抗体、蛋白、多肽、低MW化合物、核酸等，只要这些亲和分子具有适合的反应基团诸如氨基、(二)硫化物部分或醛部分。为了可选择的联结方案，链霉亲和素、蛋白A、二硫化物或酰肼官能化的包衣也可在现有技术中获得。包含亲和分子的缓冲液可应用至整个分离表面或被点在所述表面的限定区域。能很容易地在一个基质上组合不同的亲和分子。在优选实施方式中，水凝胶包被的分离表面包括两种或更多种具有不同结合特异性的分子，诸如包括2、3、4或5种不同的抗体。

[0044] 当然，本发明的分离表面还可包括不同类型的亲和分子，诸如针对相同靶细胞的相同或不同抗原结构的不同的抗体或抗体片段。可选择地，当期望在相同的过程中同时富集不同类型的靶细胞时，则分离表面还可包括针对不同靶细胞的不同的抗体或抗体片段。优选地，本发明的分离表面上的亲和分子的总密度在大约0.1ng/mm2～大约100ng/mm2的范
2 2 2 2 2
围内，例如为大约0.5ng/mm 、大约1ng/mm、大约5ng/mm、大约8ng/mm、大约10ng/mm 、大约
15ng/mm2、大约20ng/mm2、大约30ng/mm2、大约40ng/mm2、大约50ng/mm2、大约60ng/mm2、大约
70ng/mm2、大约80ng/mm2、大约90ng/mm2、大约100ng/mm2或甚至更高的密度。尤其优选的是上述密度指为抗体或抗体片段的亲和分子。还优选地是被固定在分离表面上的亲和分子的结合能力实质上不受到联结方法影响。固定至分离表面后，亲和分子(例如抗体或抗体片段)保留高于50％、优选高于60％、高于70％、高于80％、高于90％且更优选高于95％的它们对靶分子的原始结合能力，即对未固定的靶的结合能力。

[0045] 基于亲和分子的能力选择本发明的亲和分子(例如抗体或该抗体来源的抗原结合片段)，以显示选择性结合至靶细胞(例如对肿瘤细胞)。如本文所使用的，选择性结合意味着相对于结合至样品中的非靶细胞，亲和分子结合至靶细胞强至少约4倍、通常超过约5倍、超过约6倍、超过约8倍、超过约10倍，超过约15倍、超过约20倍、超过约50倍，或甚至超过约100倍，如例如通过亲和分子/靶配体对的KD值所反映。例如，当在本发明的方法中使用全血样品，亲和分子应不显示出对在本发明步骤(a)中获得的滤液中存在的白细胞的任何实质结合。

[0046] 在另一方面中，分离表面上的亲和分子可为受体、凝集素、配体或其功能部分。此外，可采用对靶细胞上的结构具有低亲和性的亲和分子。虽然仅有一种相互作用将通常不会足以在分离过程中稳定，但在一个细胞与分离表面的接触区域上分布的几个弱相互作用的合作效应导致足够强的特异性相互作用。这对现有技术基于纳米颗粒的分离技术状态而言是显著有利的，因为那些颗粒的相对小的表面积太小以至于不能实现这样的合作机理。

[0047] 在优选实施方式中，要富集和/或分离的靶细胞是经由抗体或其片段结合至分离表面(例如水凝胶包被的支撑表面)的播散的肿瘤细胞，其中抗体或其片段对于这些肿瘤细胞的细胞表面标记具有特异性结合亲和力。播散的肿瘤细胞的适合的表面标记在本领域是公知的，包括表皮生长因子受体(EGFR)、表皮细胞粘附分子(EpCAM或CD326)、胰岛素生长因子-1受体(IGF-1R)、表皮生长因子受体2(Her2)、细胞角蛋白19(CK19)、细胞角蛋白20(CK20)、粘蛋白1(MUC1)、粘蛋白2(MUC2)、人表皮膜抗原(EMA)、表皮抗原(Ber-EP4)、叶酸受体α(FRα)。在文献中广泛讨论了另外的标记，例如参见Pantel等(2008),Nature Reviews,8,1-12；Pantel等(2009),Nat Rev Clin Oncol.,6(6):339-51。

[0048] 因此，在本发明的方法中用作亲和分子的抗体包括：抗-EpCAM的抗体，诸如抗体克隆323A3(可从Kamiya Biomedical Company获得，西雅图，美国)、抗体克隆MK-1-25(可从Acris获得，黑尔福德，德国)、抗体克隆AUA1(可从Novus Biologicals获得，利特尔顿，美国)、抗体克隆158206(可从R'n'D Systems GmbH获得，威斯巴登，德国)、抗体克隆528(可从Santa Cruz Biotechnology Inc.获得，海德尔堡，德国)；抗-IGF-1R的抗体，诸如CP-751,871(可从Pfizer Pharma AG获得，柏林，德国)；抗-CD19的抗体，诸如可从Santa Cruz Biotechnology Inc.(Heidelberg,Germany)获得的那些抗体，被称为产品编号为sc-
70563、sc-18895、sc-70560、sc-70559、sc-70561、sc-21714、sc-65295、sc-52311、sc-
69736、sc-65255、sc-8498、sc-52378、sc-20922、sc-18884、sc-18894、sc-19650、sc-51529、sc-8500-R、sc-13507、sc-53191、sc-8499、sc-18896和sc-69735)；抗-MUC1的抗体，诸如可从Santa Cruz Biotechnology Inc.(海德尔堡，德国)获得的那些抗体，被称为产品编号为sc-71611、sc-71610、sc-71612、sc-71613、sc-59931、sc-71614、sc-59794、sc-59795、sc-
59796、sc-59797、sc-52347、sc-6827、sc-53376、c-59798、sc-52085、sc-59799、sc-53377、sc-6826、sc-59793、sc-59800、sc-15333、sc-25274、sc-53379、sc-52086、sc-52087、sc-
52088、sc-52089、sc-52090、sc-52091、sc-52092、sc-52093、sc-6825、sc-53380、sc-73595、sc-53381、sc-56441、sc-65589、sc-65220、sc-69644、sc-73606、sc-80889、sc-73605、sc-
7313、和sc-52094；抗-MUC2的抗体，诸如可从Santa Cruz Biotechnology Inc.(海德尔堡，德国)获得的那些抗体，被称为产品编号为sc-59859、sc-7314、sc-15334、sc-23170、sc-
23171和sc-13312；抗-CK19的抗体，诸如可从Santa Cruz Biotechnology Inc.(海德尔堡，德国)获得的那些抗体，被称为产品编号为sc-53258、sc-53257、sc-33110、sc-33120、sc-
25724、sc-33111、sc-33119、sc-53003、和sc-56371；抗-CK20的抗体，诸如可从Santa Cruz Biotechnology Inc.(海德尔堡，德国)获得的那些抗体，被称为产品编号为sc-25725、sc-
17112、sc-52320、sc-70918、sc-56522、sc-56372和sc-58730；抗表皮膜抗原的抗体，诸如Dako Deutschland GmbH(汉堡，德国)的克隆E29；抗表皮抗原的抗体，诸如Dako Deutschland GmbH(汉堡，德国)的克隆Ber-EP4；抗-egfr的抗体，诸如可从Santa Cruz Biotechnology Inc.(海德尔堡，德国)获得的sc-120。进一步适合的抗体为例如：来自Novocastra Deutschland(柏林，德国)的抗体VU-1D9，来自Progen Biotechnik GmbH(海德尔堡，德国)的抗体Ks5+8.22/C22，来自Micromet(慕尼黑，德国)的抗体A45-BB3-Cy3，来自Enzo Life Sciences GmbH( 德国)的抗体Mov18/Zel。本发明还考虑上述抗体的
抗原结合片段的使用。

[0049] 在已公开的方法的一个实施方式中，在使靶细胞与分离表面接触之前，样品中的靶细胞可与适合的亲和分子(例如上述抗体或抗体片段)预孵育。例如，靶细胞可在初始步骤中与一种或多种针对靶细胞某些表面标记的抗体或抗体片段预孵育。分离表面包括固定的亲和分子，该亲和分子反过来针对用于预孵育的亲和分子。例如，当用于样品中靶细胞的预孵育的亲和分子是小鼠抗体时，则适合的分离表面应包括抗小鼠的抗体或其片段，其中抗小鼠的抗体或其片段捕获已在预孵育步骤中连接至靶细胞的小鼠抗体。可使用相同的原理使包含靶细胞的样品与针对各靶细胞特异的表面抗原的生物素化的抗体(诸如生物素化的IgG抗体)预孵育。可通过使用分离表面来捕获这些标记的抗体，其中分离表面被修饰以包括选择性结合至抗体的生物素残基的亲和分子(诸如链霉亲和素)。优选地，在预孵育步骤后从样品中去除任何未结合的生物素化的抗体，例如通过本发明的方法的过滤步骤。

[0050] 在使从残留物中获得的细胞与分离表面接触后，在适于使细胞与它们对应的亲和分子结合的条件下使细胞与分离表面孵育。取决于分离表面的性质和所选择的用于捕获靶细胞的亲和分子，孵育条件可发生变化。技术人员将容易地确定要适用于给定分离表面的最佳参数。例如，孵育时间可在大约5分钟至大约10小时之间变化，但一般应在大约30分钟和大约8小时之间，优选在大约2小时和大约6小时之间的范围内，例如3小时、4小时或5小时。温度应在大约10℃至大约40℃、优选从大约20℃至大约40℃、更优选从大约32℃至大约36℃的范围内。在尤其优选的方面，包含靶细胞的样品的孵育应在室温(例如在22℃至25℃)进行。

[0051] 在本发明的简单实施方式中，例如通过移液管将包含从过滤步骤获得的残留物的液体等分试样转移至分离表面上，且随后进行孵育。包含残留物的液体等分试样一般应具有0.5ml和8ml之间的体积，例如大约1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml或7ml。如果需要，可使用上面讨论的缓冲液稀释上述等分试样以得到10ml、20ml、20ml、30ml、40ml或50ml的体积。孵育没有必要必需包含分离表面的摇动。但是分离表面的摇动对于改善靶细胞与分离表面的结合是优选的。例如，当分离表面是基本平整的载片时，可通过将载片放置在Petri培养皿或细胞离心管中进行孵育，其中Petri培养皿或细胞离心管以0.2rpm至60rpm、优选在10rpm至20rpm之间(例如15rpm)的旋转速度在摇动平板摇床上摇动。

[0052] 可选择地，分离表面可在包含从过滤步骤获得的残留物的液体等分试样中缓慢地旋转，或分离表面可被放置在填充有所述液体等分试样的旋转管中。另一种选择是(如果需要重复地)使样品在平的、可选择的倾斜的(例如大约30°至40°，优选大约35°)分离表面(例如包被的载片)上流动。在这样的实施方式中，载片的表面可部分或完全浸入在适合的生理缓冲液(例如参见在上面与样品稀释有关的上下文中定义的缓冲液)中。由于样品中的细胞具有比缓冲液大的比重，因此细胞将沿着倾斜的分离表面流进装置底部的方向。

[0053] 在本发明的甚至更优选的实施方式中，孵育在流过式(flow-through)装置(例如图10中所示的装置)中进行。

[0054] 在包被的颗粒的情况中，例如在低速旋转的孵育器上的封闭的管中，颗粒悬浮液与纯化的样品混合且轻轻摇动。

[0055] 已在允许亲和分子与靶细胞结合的条件下孵育上述细胞和分离表面后，去除任何未结合的细胞和未结合的材料。这通过使分离表面与所述未结合的细胞和材料分离来实现。优选地，该步骤还包括使用适合的洗涤缓冲液(诸如在上面与样品稀释有关的上下文中提到的等渗缓冲液)洗涤分离表面。

[0056] 根据本发明，能分离处于天然状态的靶细胞，这样允许细胞后续的下游处理。例如，通过上述方法分离的细胞可被培养在标准细胞培养液中。这对于例如可在分离后进行进一步表征的肿瘤细胞是特别的优点。作为另一优点，与根据现有技术中已知的方法分离的细胞相比，通过本文公开的方法获得的细胞示出未受损害的细胞形态。如图7所示，使用普通基于磁性颗粒的系统(例如Veridex)分离的细胞易于丧失细胞的球形形状。结果，由于细胞核的丢失、不规则的浆-核比以及对用于抗体检测的标记染色呈阳性的细胞碎片的出现，而使很多细胞不能确定，从而导致假阳性的结果。相反，由于上述细胞没有联结至任何锋利边缘的颗粒而是结合至在大分子顶部浮动的柔软的表面，因此通过本发明的方法捕获的肿瘤细胞的球形形态没有改变。

[0057] 在又一方面中，本发明涉及一种用于样品中的靶细胞的检测和/或定量的方法，所述样品包括红血球和/或血小板。所述方法包括：

[0058] a)进行上面与靶细胞分离和/或富集有关的上下文中所描述的方法；以及

[0059] b)通过适合的方式检测和/或定量靶细胞。

[0060] 用于检测已被捕获的靶细胞的方法在现有技术中是公知的。例如，这些方法可基于对要检测和/或定量的靶细胞是高度特异的标记分子(例如表面蛋白或糖结构或核酸序列)的检测。适合的标记分子的选择应依赖于特定的靶细胞，且技术人员应毫不费力地选择适当的标记分子和特异性结合至这些标记分子的对应的亲和分子。

[0061] 根据进一步的方面，可通过使用可检测的标记的亲和分子(诸如可检测的标记的抗体或抗体片段)进行靶细胞的检测和/或定量。在检测和/或定量步骤中使用的亲和分子可为例如在本文其它地方已描述的用于固定在分离表面上的相同的分子。例如，可使用被标记的或可通过标记的二抗检测它们自身的抗体或抗体片段。

[0062] 根据另一方面，靶细胞的检测和/或定量包含可检测的标记的DNA探针。更优选地，检测和/或定量包括荧光原位杂交(FISH)。本领域中可获得在完整靶细胞中使用不同长度的标记探针进行FISH分析的各种方案，例如使用特异的DNA探针检测egfr的放大。在原位杂交测试中，常规地对要被检测和/或定量的靶细胞进行渗透，且这些细胞的DNA被部分解链。然后，在适度的温度下DNA与杂交溶液接触以使荧光标记的探针退火，该探针对选择用于检测靶细胞的特定核酸序列是特异的。例如，当期望检测和/或定量来源于血液中上皮组织的肿瘤细胞时，可使用针对egfr、HER2、PI3-激酶、c-myc、akt等的标记的核酸探针。已杂交至肿瘤DNA的探针示出egfr斑点数量大于2(例如为3、4、5、6、7、8、10或更多)，可与来自可已吸附至分离表面的白细胞的DNA(最多有2个egfr斑点)区分。常规使用一个或多个报告荧光标记FISH探针。与探针杂交后，在预定的严格条件或在增强的严格条件下洗涤靶细胞，直至获得适当的信噪比。然后例如通过荧光显微镜监控杂交的探针。通过使用具有不同荧光颜色的多条核酸探针，可在分离表面上的一个步骤中进行多颜色分析(即对不同序列)。FISH测试中使用的核酸探针通常长于例如在Southern印迹中使用的那些核酸探针。FISH探针可具有大约1kb、5kb、10kb、20kb、30kb、40kb、50kb、60kb或多达100kb的大小，或具有甚至200kb、
300kb或400kb的大小。可直接标记(例如通过使用荧光染料)或间接标记(例如通过半抗原，诸如地高辛或生物素)FISH探针。根据本发明，优选使用荧光标记，这样可直接观察与试验样品(例如来源于活检的组织的细胞)的基因组DNA的杂交结果。用于荧光标记的标记试剂盒可从不同的制造商获得，诸如通过Vysis Inc.(丹尼森市，伊利诺斯州，美国)购买的SpectrumOrange、SpectrumGreen和SpectrumRed标记试剂盒。

[0063] 当然，为了改善灵敏度可能组合上面用于检测和/或定量靶细胞的方法的一种或多种。例如，检测和/或定量可基于荧光原位杂交和基于抗体的检测的组合方法，如下面在实施例中所描述的。

[0064] 根据一个方面，靶细胞的检测和/或定量包含PCR，优选包含实时定量PCR(Real-Time PCR)。在该方法中，使用针对常用于各靶细胞的标记基因的引物以扩增指示样品中这些细胞丰度的产物。例如，如果靶细胞是肿瘤细胞(诸如播散的肿瘤细胞)，则可使用上面讨论的一种或多种编码特异性细胞表面标记的基因作为PCR扩增的模板。对于播散的肿瘤细胞，编码表面标记的适合的基因是编码例如表皮生长因子受体(EGFR)、表皮细胞粘附分子(EpCAM或CD326)、胰岛素生长因子-1受体(IGF-1R)、表皮生长因子受体2(Her2)、细胞角蛋白19(CK19)、细胞角蛋白20(CK20)、粘蛋白1(MUC1)、粘蛋白2(MUC2)等的那些基因。在特别优选的方面，针对不同标记基因的引物组合被用于靶细胞的检测和/或定量。

[0065] 此外，可使用双色光声法实现肿瘤细胞的检测。从而，作为第二对比剂的镀金碳纳米管的使用允许多重检测(见例如Galanzha等(2009),Nat.Nanotechnol.4,855)。

[0066] 下面参考附图更详细地解释本发明优选实施方式的示例性的优点方面。

附图说明

[0067] 图1示出了表达EGFR的乳腺肿瘤细胞系MDA-MB-468在部分抗体衍生的水凝胶表面上的培养，其中MDA-MB-468存在于人血清中。左：抗EGFR-IgG功能化的水凝胶表面。右上角：空白的水凝胶表面(对照)。

[0068] 图2示出了在聚羧酸盐(HC)表面(有抗体和没有抗体)上来自不同制剂的白细胞的非特异性结合(NSB)的比较。通过a)密度梯度离心或b)、c)细胞筛选从全血中制备白细胞部分。孵育在Cytospin离心管中、包含0.96～1.15×106个细胞的2ml PBS中使用EpCAM修饰的HCX-载片(XanTec bioanalytics GmbH，杜塞尔多夫，德国)和无反应性的HC-载片(XanTec bioanalytics GmbH，杜塞尔多夫，德国)进行。

[0069] 图3示出了可在本发明的方法中优选使用的水凝胶包被(coating)的示意性描绘。衬底(3)包被有附着促进层(2)和亲水聚合物(1)，其中亲水聚合物(1)具有刷状结构。亲水聚合物(1)被垂直设置于衬底表面，以便许多的官能团(4)可用于亲和分子的固定。

[0070] 图4示出了用于进行过滤步骤的装置的实施方式的示例性示意图。

[0071] 图5示出了用于进行过滤步骤的装置的另一实施方式的示例性示意图。

[0072] 图6示出了在使用抗体修饰的水凝胶载片进行亲和分离后MDA-468肿瘤细胞的回收率。

[0073] 图7示出了在不同的细胞分离过程后细胞形态的对比；A和B：被Veridex系统捕获的肿瘤细胞被抗EpCAM抗体包被的磁性颗粒和聚集的血小板围绕；被捕获的细胞的球形形态消失；C：在抗EpCAM抗体包被的HC-载片上捕获的肿瘤细胞。

[0074] 图8示出了用于进行过滤步骤的装置的又一实施方式的示例性示意图。

[0075] 图9a示出了使用图8的装置进行过滤步骤的第一方法。

[0076] 图9b和图9c示出了使用图8的装置进行过滤步骤的第二方法。

[0077] 图10示出了用于进行分离步骤的装置的实施方式的示例性示意图。

[0078] 图11a和图11b示出了用于进行分离步骤的装置的另一实施方式的示例性示意图。

具体实施方式

[0079] 图4中，用于进行过滤步骤的装置包括样品储液器1，其中样品储液器1用于接收和容纳可能包含靶细胞的稀释或未稀释的样品。储液器1具有出口孔2，在运行中，样品通过出口孔2离开储液器1而进入导管3。如图4中所示，出口孔2优选被设置在储液器1的底部中，且优选布置储液器1和导管3以便通过重力实现或至少通过重力辅助样品从储液器1至导管3的传送以及样品在导管3内的运动。在附图的全部现有描述中，术语诸如“底部”和“顶部”涉及附图中示出的方向。

[0080] 除了储液器1之外，可选择地可提供另外的储液器4用于接收和容纳可用于稀释样品的溶液或缓冲液。储液器4具有出口孔5，在运行中，溶液通过出口孔5离开储液器4而进入导管6。同样地，出口孔5优选被设置在储液器4的底部，且优选地布置储液器4和导管6以便通过重力实现或至少通过重力辅助样品从储液器4至导管6的传送以及导管6内的样品的运动。导管6连接至导管3以便样品和溶液可混合。

[0081] 布置导管3的传送端7，以便可选择地与来自储液器4的溶液混合的样品可被连续地、不连续地或间歇地供应至大致为圆柱形的滤器组件8，滤器组件8被设置在容器9内。

[0082] 滤器组件8在它的底部纵向端包括板10并在它的上部纵向端包括环状物11。板10和环状物11通过多个纵向的杆(图中未示出)相互连接。围绕杆的装置将薄片状的滤器元件12设置为环形闭合的，以便滤器元件12形成圆柱形的滤器组件8的圆周表面。在这点上，还可能为通过将滤器元件12连接至每个杆的径向内面，薄片状的滤器元件12在这些杆限定的空间内部被设置为环形闭合的。板10和环状物11可具有例如圆形、椭圆形、正方形、矩形、六边形或其它形状，同时圆柱形的滤器组件8具有对应的横截面形状。

[0083] 借助于该结构，从导管3的传送端7注入的样品可通过环状物11的开口进入滤器组件8，且滤液通过滤器元件12离开滤器组件8并被收集在容器9中。另一导管13被设置为例如连接至容器9的底部，例如通过重力的影响或通过使用合适的泵或抽吸设备可通过导管13从容器9移除滤液。提供另一容器14用于收集从容器9移除的滤液。

[0084] 在运行中，控制样品进入滤器组件8的流动和/或从容器9移除滤液的速率，以便滤器组件8内的液体表面15的绝对水平高于容器9内的液体表面16的水平。以这种方式，在滤器元件12的两侧有利地保持了流体静压力差，该流体静压力差迫使滤液通过滤器元件12。

[0085] 可选择性地提供气体导管17，用于向滤液中导入气体，以在液体内有利地产生运动。

[0086] 在图5示例性示出的可选择的实施方式中，用于进行过滤步骤的装置是错流过滤装置20。以通常的方式，错流过滤装置20包括彼此平行延伸且彼此接触的两个导管21、22，且滤器元件23被布置在导管21、22的侧壁中的对齐的开口中以便液体能够经由两个导管21、22之间的滤器元件23穿过。在运行中，稀释或未稀释的样品流24被导入导管21的一端，以便样品流24切线地穿过滤器元件23。将生理介质的反向流25导入导管22的相反端，以便生理介质的反向流25切线地穿过滤器元件23的相反面。通过保持导管21内的较高的压力，迫使滤液通过滤器元件23进入导管22，以便滞留物26离开导管21且滤液和生理介质的混合物27离开导管22。

[0087] 图8中示例性示出了用于进行过滤步骤的装置的又一可选择的实施方式。在示出的实施方式中，该装置30包括具有立方体形状的两个主体31和32。设置主体31和32，以便主体31和主体32的表面38a和38b分别彼此平行地延伸且彼此具有距离。以这种方式，在两个主体31和32之间存在间隙或间隔39。

[0088] 在每个表面38a和38b中，凹槽31a和32a分别形成于各主体31和32中。在示出的实施方式中，凹槽31a和32a同样具有立方体形状。凹槽31a和32a的开口彼此面对，且被适当地设置在主体31和32之间的间隔39中的公共滤器元件33封闭。为了确保凹槽31a和32a的密封，滤器元件33可被承载在具有环形结构且提供有适当的密封元件的框架33a中，其中密封元件密封地啮合表面38a和38b且围绕凹槽31a和32a的开口。

[0089] 两个导管34和36从凹槽31a延伸且从与表面38a相对的表面40a伸出，且两个导管35和37从凹槽32a延伸且从与表面38b相对的表面40b伸出，这些导管34、35、36和37允许流体导入凹槽31a和32a的内部且允许从凹槽31a和32a内部移除流体。因此，通过适当地导入通过例如导管34的稀释或未稀释的样品流和通过例如导管37的生理介质流，原则上有可能利用该装置30以类似于参考图5所描述的情况进行错流过滤。

[0090] 但是，图8示出的装置30尤其有利于进行过滤的两种不同方法。

[0091] 图9a中示例出了第一种方法，其中装置30不移动，但被调整了方向，以便滤器元件33和间隔39在垂直平面上延伸。为了进行有效的过滤，首先凹槽31a和32a均被缓冲液填充至内部凹槽体积的约50％的水平。随后，稀释或未稀释的样品通过例如导管35被导入凹槽
32a，从而相对于凹槽31a内的液体水平而升高了凹槽32a内的液体水平。以这种方式，在滤器元件33的两侧产生流体静压力差，该流体静压力差迫使滤液通过滤器元件33。当然还可能使用缓冲液和样品直接填充凹槽32a至适当的水平。

[0092] 图9b和9c中示例出了第二种方法，其中装置30进行摇摆运动且被初始定向，以便滤器元件33和间隔39在水平平面内延伸。首先，凹槽31a和32a也均被缓冲液填充至内部凹槽体积的约50％的水平。随后，稀释或未稀释的样品通过例如导管35被导入凹槽32a中。从图9b示出的水平定向开始，通过在两个相反的方向使装置30交替地倾斜而使装置30进入优选的缓慢的摇摆运动，如图9c示例的。优选最大的倾斜角度为25°。在装置30的摇摆运动的过程中呈现的倾斜位置处，两个凹槽31a和32a中的液体体积通过滤器元件33的部分彼此接触。由于摇摆运动，接触的区域经过滤器元件33的整个表面区域。利用摇动摇床(rocking shaker)可有利地实现摇摆运动。

[0093] 图10示出了用于使通过过滤步骤产生的滞留物与分离表面接触的装置50的横截面图。装置58包括具有分离表面52的优选为矩形的载片51。

[0094] 进一步地，装置50包括两个主体53和54，主体53和54在示例的实施方式中为立方体形状。在下主体54的上表面55中提供凹槽56，使凹槽56具有接收载片51及环形的密封元件59的形状和尺寸，且以便至少密封元件59轻微地突出于表面55。对应的凹槽57被提供在上主体53的下表面58中。当两个主体53和54彼此连接，同时两个表面55和58彼此邻近且彼此平行地延伸(如下面将详细解释的那样)时，使后一凹槽57具有相配地接收从下主体54的表面55突出的密封元件59的部分的尺寸和形状。

[0095] 在运行时，载片51位于凹槽56内部，且环形的密封元件59位于载片51的顶部。使该密封元件59具有如下尺寸和形状，以使密封元件59在其边缘区域环绕地啮合载片51的上分离表面52。然后主体53以这样的方式被放置在主体54的顶部以便环形的密封元件59被接收在凹槽57内部，且两个主体53和54利用例如螺钉彼此稳固地固定；其中通过分别在主体53和54中的多个对应的孔60和61导入螺钉。使凹槽56和57具有如下尺寸，使得在该位置上，载片51的分离表面52与凹槽57的内壁62相距3～500μm。

[0096] 在上主体53中，两个通孔提供为分别具有大直径部分63a和63b，且分别具有小直径部分64a和64b。小直径部分64a和64b通向凹槽57。因此，有可能在运行中通过通孔63a、64a将滞留物在凹槽57的一端导入凹槽57，且在凹槽57的相对端经由通孔63b、64b从凹槽57移除滤液，同时滞留物沿分离表面52流动且与分离表面52接触。由于分离表面52和凹槽57的内壁62之间的狭窄的间隔，流动基本上且有利地为层流。

[0097] 如图11a和11b示例性示出的，能将滞留物同时填充入通孔63a、63b和64a、64b，且使装置进入摇摆运动。在这些附图中，为了减少死体积，通孔63a、63b和64a、64b具有圆锥形的形状。

[0098] 实施例

[0099] 实施例1

[0100] 包含肿瘤细胞的试验样品的制备

[0101] 在未进行透化作用的情况下，使用4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Pierce/ThermoScientific)对已培养的来源于人乳腺癌的MDA-468细胞进行预染色。DAPI是结合至富含腺嘌呤-胸腺嘧啶的DNA的阳离子荧光染料。DAPI通常用于染细胞核。可通过视觉检测或适当的自动设备对染色的细胞进行计数。使用达尔伯克改良伊格尔培养液(DMEM)清洗上述细胞两次以移除多余的染料。为了发荧光控制预染色细胞的每次悬浮。人工计数出人全血样品中等量的肿瘤细胞，该人全血样品通过静脉穿刺从健康供血者收集在具有EDTA以防止凝固的收集管中。从收集开始4小时内使用这些血液样品。为了进行回收试验，将上述肿瘤细胞稀释至每100μl的细胞数量在50和500个细胞之间以最小化稀释和计数错误。

[0102] 实施例2

[0103] 用于细胞筛选的织物的制备

[0104] 分离输血套装的滤器(Sarstedt AG&Co；74.4255)，且移除织物滤器。通过使用胶粘剂将具有1μm目径的织物片(Sefar AG,Sefar Nitex 03-5/1,Sefar Petex07-5/1)固定在滤器架(fliter rack)上。当将该织物固定至滤器架上后，在真空中移除源自胶粘剂的任何剩余的溶剂达30分钟。使用来自通过在滤器架总体积上离心500ml血液获得的血沉棕黄色层的单核细胞的细胞悬浮液进行检漏测试(leak test)。通过使用双面医用胶带(50μm厚)将这样制备的滤器架固定在烧杯的中间，以便滤器架的封闭的底部与烧杯的底部接触。

[0105] 实施例3

[0106] 红血球和血小板从样品中的移除

[0107] 优选对在实施例2中制备的滤器架进行预湿以防止细胞至滤器构件的初始的非特异性粘附。因此，将10～15ml体积的生理等渗缓冲液加至滤器架。过滤在如图4所示的结构中进行。通过导管将缓冲液施加至圆柱形滤器架的中心，其中导管定位于滤器架的开口上方1～2cm处。使用蠕动泵设置1ml/min的流速。如在实施例1中制备的在加入(spike in)实验中每ml包含10～120个MDA-468细胞的血液样品(室温摇动下储存24小时)以100～200μl/min的流速通过第二导管被施加至滤器架。通过这种方式，可获得稀释率大约为1:5～1:10的血液样品。

[0108] 由于织物滤器元件的狭窄的目径，在滤器架的内部隔室中的液体的弯液面高于围绕滤器架的烧杯中的弯液面(见图4)。产生的压力导致红血球和血小板的移除，其中红血球和血小板穿过织物滤器元件的网孔并在烧杯中富集。为了保持烧杯中的弯液面，连接至蠕动泵的废物导管被固定在烧杯的底部。废物导管的流速被计算为样品导管和缓冲液导管的流速的总和。当已施加了预定体积的全血样品后，终止缓冲液至滤器架的添加。由于缓冲液通过废物导管连续排出，滤器元件中的液体体积也同样减少。当滤器元件中的剩下体积大约为1～3ml的细胞悬浮液时终止排出。然后用移液管将滞留的细胞悬浮液移至反应管。为了确保将滤器装置中的所有细胞转移至孵育室，用2ml的PBS洗涤滤器元件的内面5次，然后用移液管将洗涤后的PBS移至反应管。在使反应管在800rpm旋转减慢2分钟。丢弃9ml的上清液，且将具有剩余体积的细胞团重悬在1ml的PBS中用于随后转移至水凝胶载片。

[0109] 实施例4

[0110] 用于淘金的水凝胶包被的载片的获得

[0111] 使用20μl的250μg/ml抗-EpCAM/Trop-1抗体溶液(AF960；RnD Systems，明尼阿波利斯，美国)覆盖预活化的聚羧酸盐水凝胶载片(SL-HCX-5，XanTec Bioanalytics GmbH，杜塞尔多夫，德国)。在联结前，该抗体用5mM乙酸钠溶液(pH5.0)透析。在环境条件(室温和相对湿度为50～75％)下干燥抗体溶液，且干燥后在所述条件下将该溶液进一步孵育另外20min。在下一步骤中，在温和摇动的条件下整张载片被放置在Petri培养皿中，且被1M乙醇胺溶液(pH8.5)覆盖20min。使用磷酸盐缓冲盐水在Petri培养皿中摇动下进行两次洗涤步骤，每次10min，以除去残留的乙醇胺。为了随后的储存，载片用蒸馏水漂洗且在快速的氮气流中干燥。以这种方式制备的载片准备好与在实施例1～3中获得的包含MDA-468细胞的血液来源的细胞悬浮液进行孵育。

[0112] 可选择地，为了提供具有特别低的非特异性结合的非癌症细胞(例如血液白细胞)的背景的用于淘金的水凝胶包被的载片，可将水凝胶载片(SL-HCX-5，XanTec Bioanalytics GmbH，杜塞尔多夫，德国)放置在Petri培养皿或合适的载片架中。在使用前即刻制备具有0.01～0.025％(w/v)EDC的0.5M MES、0.05M NHS的活化溶液。使用该活化溶液覆盖水凝胶载片，且在温和摇动的同时孵育5分钟，随后在2mM乙酸中孵育至少30秒。然后用蒸馏水漂洗载片，且在快速的氮气流中或通过离心干燥。与上述HCX载片相比，根据该活化步骤制得的载片具有较低量的在水凝胶中形成的反应性琥珀酰亚胺酯，且由此对生物分子(例如抗体)具有较低的固定容量，该固定容量在孵育过程中减少非特异性结合的白细胞的背景。可如上面结合SL-HCX-5载片描述的那样进行使用抗体对水凝胶的修饰。

[0113] 实施例5

[0114] 水凝胶表面上的肿瘤细胞的孵育

[0115] 然后将2ml上述实施例3中获得的MDA-468细胞悬浮液转移至细胞系统(cyto-system)(Hettich AG，德国)孵育室，在该孵育室中抗体包被的载片(SL-HCX-5，XanTec Bioanalytics GmbH，杜塞尔多夫，德国)已被安装在上述细胞系统中。调整具有5°倾斜角度的摇动的平台摇床(Heidolph Duomax1030)为2循环/分钟。细胞在室温下孵育超过4小时。孵育后，丢弃上清液。在下面的洗涤步骤中，用移液管将2ml PBS移至孵育室中。在室温下孵育4小时后，丢弃PBS缓冲液，且重复洗涤一次。

[0116] 实施例6

[0117] 筛选后回收率的确定

[0118] 将来自如实施例1所述的健康志愿者的15ml血液分成5ml的等分试样。将110(+/-2)个MDA-468细胞加入每个等分样品中。如实施例3中所述的，使用三个等分样品中的每一个进行筛选。筛选后，在滤器架中剩余大约2ml残余体积的细胞悬浮液。然后小心地将包含细胞悬浮液的滤器架从烧杯中取出并转移至细胞离心系统(Hettich)，以便滤器架子的开口以载玻片的方向定向；其中使用超冷冻载玻片根据制造商的指导说明制备细胞离心系统。通过荧光显微镜(Ariol Platform，Genetix Ltd.New Milton，汉普郡，英国)人工或和自动地进行预染色肿瘤细胞的检测。回收率达到99～100％(见下面的表1)。

[0119] 表1：筛选后的回收率

[0120] 细胞数量(人工计数) 细胞数量(自动计数)
等分样品1 109 111
等分样品2 110 111
等分样品3 109 109

[0121] 实施例7

[0122] 在使用抗体修饰的水凝胶载片的基于亲和力的细胞分离中的回收率

[0123] 从如实施例1所述的健康志愿者抽取75ml全血，且对全部样品进行如实施例3所述的筛选步骤。筛选后，在滤器架中剩余大约3ml残余体积的细胞悬浮液。使用PBS将细胞悬浮液稀释至30ml的体积，且使用移液管将2ml的14等分的样品移至细胞离心管(Hettich)中，已根据制造商的方案使用抗体包被的HC-水凝胶载片代替冷冻的玻璃载片制备该细胞离心管。在细胞悬浮液转移进入细胞离心管后即刻将已用DAPI预染色的120(+/-2)个MDA-468细胞加入这些等分样品中。室温下，在2循环/分钟的速度的摇动的平台摇床(Heidolph Duomax 1030)上进行孵育。在水凝胶表面上孵育30、60、120、180、240、300和360分钟后，通过在荧光显微镜(Leica DMLB，Leica Microsystems GmbH，韦茨拉尔市，德国)中对DAPI预染色的MDA-468细胞进行人工细胞计数，确定细胞数。下面表2中描述了在平行样品中测量的细胞数。图6中示出了回收率的时间进程。

[0124] 表2：水凝胶载片分离后的回收率

[0125]时间(分钟) 计数1 计数2 平均值(％)
30 20 15 14.53
60 47 52 41.25
120 78 67 60.42
180 95 108 84.58
240 117 111 95
300 121 118 99.58
360 123 116 99.58

[0126] 实施例8

[0127] 通过FISH和免疫细胞化学的MDA-468细胞的检测

[0128] 通过FISH和免疫细胞化学的组合方案检测已通过使用如实施例5中所描述的水凝胶载片分离的MDA-468细胞。该方法集中在染色体畸变和肿瘤特异性的基因表达的检测。为了通过FISH检测egfr基因的放大，根据制造商的方案使用大DNA结构提取试剂盒(Large DNA Construct Isolation Kit，Qiagen，德国)和总基因组标记系统(Total Genomic Labelling System，GibcoInvitrogen，英国)从BAC的DNA制备与egfr基因序列互补的探针。

[0129] 室温下，MDA-468细胞被固定在冰冷的75％乙醇中的细胞系统(Hettich AG，德国)的孵育室中的水凝胶载片上达2分钟，且使用100μg/ml的RNase A预处理40分钟。然后细胞在120℃、在1×柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0，Dako，丹麦)中处理达3分钟。细胞重新在1％甲醛、1×PBS中固定达10分钟，且在一系列的乙醇中脱水。空气干燥的细胞在变性缓冲液(70％甲酰胺，0.6×SSC，pH7.4)中、在73℃变性达5分钟，且在一系列的乙醇中脱水。将悬浮在6.5μl杂交缓冲液(Abbott Molecular)中的1μl的Cot人DNA(Roche，德国)、作为参照探针的0.5μl的CEP7Spectrum Aqua(Abbott Molecular)和用于人egfr基因的2μl的光谱桔红色标记的探针施加在上述载片的顶部。这些样本在95℃处变性达3分钟，且在37℃杂交至少16小时。
然后，这些样本在72℃和室温(RT)下在2×SSC/NP-40缓冲液中洗涤2分钟。第二天，在46℃下，将该载片在50％的甲酰胺/2×SSC缓冲液中洗涤三次、每次10分钟；再洗涤两次，分别在
46℃、在2×SSC缓冲液中洗涤10分钟且在0.1×SSC/0.1％Tween-20缓冲液中洗涤5分钟。上述细胞在1×TBST中渗透三次、每次3分钟。通过在封闭血清(Dako，丹麦)中孵育20分钟降低非特异性结合。

[0130] 室温下，分别以1:100或1:200稀释在DakoREALTM抗体稀释剂(Dako，丹麦)中的抗TM广谱细胞角蛋白(pan-cytokeratin)(A45，Mikromet，德国)或波形蛋白(DB Pharmingen )的初级小鼠单克隆抗体与上述细胞孵育45分钟。然后，室温下，该样本与以1:200稀释的二级Alexa-488标记的抗小鼠抗体(MiBioTech)孵育45分钟。最后，载片使用1×TBST洗涤两次、每次3分钟，使用1×PBS洗涤1次、3分钟，使用具有DAPI的封片剂(Vector
Laboratories Inc.)复染色。

[0131] 分析没有显示凋亡或坏死形态的细胞角蛋白阳性或波形蛋白阳性的细胞的egfr的基因量。此外，对总计有500个细胞角蛋白阳性和波形蛋白阳性的细胞的egfr基因获得的频率记分，且与在3位健康志愿者中获得的记分进行对比。在荧光显微镜(MetaSystem GmbH，Zeiss，德国)下分析这些样本。对于每个细胞，计算靶探针和参照探针之间的比率，且取来自20个细胞的平均计算值进行评价，包含CEP7参照探针的最少两个信号。可示出MDA-468细胞包含3～7个荧光标记EGFR探针的斑点，同时包含2个CEP7参照探针的斑点。

[0132] 实施例9

[0133] 全基因组扩增

[0134] 在可选择的方法中，通过PCR检测在水凝胶表面上的MDA-468细胞。第一步骤中，水凝胶表面上的MDA-468细胞在冰上冷却至0℃，且被冷冻的9μl的Genomiphi样品缓冲液(GE Healthcare)覆盖。通过使用显微操作器CellTram vario进行单个细胞向PCR反应管的转移，其中显微操作器CellTram vario配备有与TransferMan NK 2(Eppendorf)联结的定制的毛细管Kappa MFKII，且TransferMan NK 2连接至倒置显微镜Axiovert 200(Zeiss)。PCR反应管被保持在-80℃最少15分钟的时间。融化后，向每个管加入1μl的1:10的蛋白酶溶液(Qiagen)。然后，细胞在温度循环器中于50℃孵育(15分钟)进行消化，且在70℃(15分钟)进行酶的失活。为了扩增肿瘤细胞的基因组，根据制造商的说明书使用Genomiphi试剂盒(GE Healthcare)进行全基因组扩增(WGA)。WGA反应后，根据制造商的说明书使用NucleoSEQ试剂盒(Macherey-Nagel)从产物中去除剩余的dNTP和随机六聚体引物。在下面描述的不同靶序列的扩增中使用以这种方式制备的样品。

[0135] 实施例10

[0136] 等位基因失衡(AI)的分析

[0137] 等位基因失衡(AI)的分析基于包括胞苷和腺苷的简单序列重复(微卫星)的长度多态序列的检测。如果在毛细管电泳评价中CA重复数不同的等位基因1和等位基因2之间的峰面积的比率超过1.3或低于0.7，则确定等位基因失衡。PCR反应在Mastercycler Gradient(Eppendorf)上进行，总反应体积为10μl，包含在AmpliTaq Gold缓冲液中的20ng来自MDA-468细胞的模板DNA(来自实施例9的基因组DNA或WGA产物)、SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中描述的引物(SEQ ID NO:1,CA-SSR1_For:[6-FAM]GTTTGAAGAATTTGAGCCAACC；SEQ ID NO:2,CA-SSR1_Rev:TTCTGTCTGCACACTTGGCAC)、三磷酸脱氧核苷酸、AmpliTaq Gold(Applied Biosystems)、TMAC、MgCl2(浓度见表3)。下面的循环条件用于所有的微卫星引物：95℃处10分钟的初始变性步骤，随后为95℃处30秒、56℃处30秒的复性、72℃处30秒的35个循环，及72℃处7分钟的最终延伸步骤。通过在2.5％琼脂糖凝胶上的电泳分离监控每次的PCR扩增。引物对是多重(multiplex)的。以独立的一式三份进行所有的PCR反应。

[0138] 表3：微卫星-PCR-筛选的PCR样品

[0139]

[0140] PCR产物被5倍稀释在PCR级的水(Merck)中，且将1μl每种稀释的样品与0.15μl的GeneScan-500-Rox大小标准(Applied Biosystems)和20μl的HIDI甲酰胺混合。混合物在95℃处变性2分钟，且在冰上突然冷却。通过毛细管电泳(CE)分离各片段，且在ABI PRISM 3100基因分析仪(Applied Biosystems)上通过激光诱发的荧光检测该片段。在杂合性(heterocygocity)的情况下、在信息的情况下检测到两个片段，该两个片段在长度上有2～
10碱基对的不同。通过等位基因1和2之间的比率确定AI状态。在同合性(homocygocity)的情况下，仅测量了一个片段，且没有获得关于细胞AI状态的信息。

[0141] 实施例11

[0142] 实时定量PCR

[0143] 经由MDA-468肿瘤细胞的升高的EGFR(表皮生长因子受体)基因量，将使用SYBR green作为报告因子(reporter)的实时定量PCR测试用于检测MDA-468肿瘤细胞。为了标准化基因量，同时确定看家基因SOD2(超氧化物歧化酶)。为了获得用于测量PCR产物浓度的标准浓度曲线，使用通过WGSA预扩增的白细胞DNA作为模板。一式三份测量所有样品。为了进行扩增和数据收集，而使用Mastercycler epgrandient S–realplex(Eppendorf)。所有反应在成对(twintec)的96孔PCR板(Eppendorf)中以15μl的总体积进行，且使用光学胶粘覆盖物(optical adhesive cover)(Applied Biosystems)密封。为了进行SYBR green测试，同时使用QuantiTect SYBR green试剂盒(Qiagen)，和1μM的SEQ ID NO:3～6中提供的每种引物。标准扩增方案由以下步骤组成：95℃处15分钟的初始变性步骤，然后为95℃处15秒、58℃处30秒和68℃处30秒的45个循环。荧光测量在68℃处的延伸阶段结束时进行。在每个运行过程中增加溶解曲线步骤作为最终步骤以证实PCR反应的特异性。对于每个样品，使用
10ng的DNA(2μl，5ng/μl)作为起始模板。一式三份测量所有样品和对照。在评价阶段，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检验两种测试类型的每个扩增反应不存在非特异性的PCR产物。

[0144] 使用Realplex software Ver.2分析原始数据。对于每个引物对，在每次运行中使用10ng、2.5ng、0.625ng和0.156ng的模板量进行标准浓度曲线。依赖于要测量的样品的类型使用白细胞DNA或WGA产物。在扩增曲线的指数区域中，扩增曲线的截点和阈值(CT-值)依赖于给定模板DNA的量。使用具有已知量的模板DNA的测试，产生校准线(CT vs.给定模板DNA的量的Log2)，且计算出它们的线性方程。为了确定未知样品的DNA的量，计算每一式三份样品的CT-值的平均值。然后计算靶基因对参照基因的商，从而得到EGFR对LINE1的相对基因量。使用在Michael Walter Pfaffl(2004):Real-time RT-PCR:Neue zur exakten mRNA Quantifizierung,Biospektrum BIOspektrum,1/04,10.Jahrgang,92-95中描述的CV方法计算标准偏差。在外周血的细胞角蛋白阳性细胞中检测癌症细胞，当细胞显示egfr的基因量高于2，则表明基因放大。

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