基于区域选择性酰胺化透明质酸的药物递送系统
阅读：998发布：2020-08-05
专利汇可以提供基于区域选择性酰胺化透明质酸的药物递送系统专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 描述了包含透明质酸和 治疗 剂的新型的药物递送系统(DDS)，其中治疗剂直接或通过连接基连接到6－ 氨 基透明质酸上，并且其中药物或连接基与6－氨基透明质酸的连接通过酰胺键来实现。用于本发明DDS中的优选治疗剂是抗炎药、抗生素、抗 肿瘤 药。优选的连接基是： 琥珀酸 ，与氨基酸连接的琥珀酸，与肽连接的琥珀酸。DDS是稳定的并且不含不希望的反应副产物和杂质，且显示高 水 平的药理学效 力 。，下面是基于区域选择性酰胺化透明质酸的药物递送系统专利的具体信息内容。
1.包含透明质酸和一种治疗剂的药物递送系统，由此所述治疗剂 通过酰胺键共价连接在透明质酸的N-乙酰基-D-葡糖胺残基的C-6位 上，其中在该治疗剂和透明质酸之间的键直接连接或通过连接基连接。
2.权利要求1的DDS，其中所述治疗剂包含至少一个羧基或至少 一个氨基或至少一个羟基。
3.权利要求2的DDS，其中所述治疗剂包含至少一个羧基并且在 所述治疗剂和透明质酸之间的酰胺键是直接连接的。
4.权利要求1的DDS，其中所述治疗剂包含至少一个氨基或至少 一个羟基并且在所述治疗剂和透明质酸之间的酰胺键是经由连接基连 接的。
5.权利要求1-4的DDS，其中所述治疗剂选自：止痛药，抗高血 压药，麻醉药，利尿药，支气管扩张药，钙通道阻断剂，胆碱能药， CNS药，雌激素，免疫调节剂，免疫抑制剂，抗脂肪肝药，抗焦虑药， 抗溃疡药，抗心律不齐药，抗心绞痛药，抗生素，抗炎药，抗病毒药， 溶血栓药，血管扩张药，解热药，抗抑郁药，抗精神病药，抗肿瘤药， 溶粘蛋白剂，麻醉药拮抗剂，激素，抗惊厥药，抗组胺药，抗真菌药 和抗牛皮癣药，抗增殖药，抗生素。
6.权利要求5的DDS，其中所述治疗剂选自：抗炎药，抗生素和 抗肿瘤药。
7.权利要求1-6的DDS，其中所述治疗剂是喜树碱，布洛芬，甲 氨蝶呤，紫杉醇，头孢唑林，萘普生，赖诺普利，青霉素G，萘啶酸， 胆甾烷及其衍生物。
8.权利要求1-2、4-7的DDS，其中所述连接基选自：直链或支 链的、脂族、芳族或芳脂族C2-C20二羧酸，氨基酸，肽，与氨基酸连 接的直链或支链的、脂族、芳族或芳脂族C2-C20二羧酸，与肽连接的 直链或支链的、脂族、芳族或芳脂族C2-C20二羧酸，并且该连接基可 能被氨基或硫醇基取代。
9.权利要求8的DDS，其中所述连接基选自：琥珀酸，与氨基酸 连接的琥珀酸，与肽连接的琥珀酸。
10.权利要求1-9的DDS，其中所述透明质酸的仲羟基经过衍生 形成选自以下的基团：-OR，-OCOR，-SO2H，-OPO3H2，-O-CO-(CH2)n-COOH， -O-(CH2)n-OCOR，其中n是1-4且R是C1-C10烷基，-NH2，-NHCOCH3。
11.权利要求1-10的DDS，其中所述透明质酸的羧基是游离酸形 式，或者与碱金属或碱土金属或过渡金属成盐。
12.权利要求1-11的DDS用于制备药物组合物的应用。
13.药物组合物，其包含与可药用的赋形剂和/或稀释剂混合的权 利要求1-11的DDS。
14.权利要求13的药物组合物，其为可注射形式。
15.制备权利要求1-11的DDS的方法，该方法包括在6-氨基透 明质酸和包含-COOH的治疗剂或连接基之间形成酰胺键，当使用连接 基时，该方法进一步包括将所述治疗剂连接到所述连接基的步骤。
16.权利要求15的方法，其中所述6-氨基透明质酸通过用氨基 置换存在于N-乙酰基-D-葡糖胺单元中C6-位上的羟基而从透明质酸 获得。
17.权利要求16的方法，其中所述置换通过用适当的离去基团活 化C6位，然后用浓氨水、或用叠氮化钠和还原剂处理来进行。
18.权利要求17的方法，其中所述离去基团选自：磺酸酯，膦酸 酯(三苯基膦酸酯)，氰基(CN-)，亚硝酸酯(NO2-)，卤素，氯代，硫酸 酯，卤代硫酸酯，硝酸酯，卤代亚硫酸酯，氯代亚硫酸酯。
19.权利要求17-18的方法，其中用于活化C6位的试剂是烷基磺 酰卤或芳基磺酰卤，并且活化在有机碱或无机碱存在的条件下进行。
20.权利要求19的方法，其中用于活化C6位的试剂是甲磺酰氯 或对甲苯磺酰氯且有机碱是二异丙基乙胺或三乙胺。
技术领域
本发明涉及新型的药物递送系统(DDS)，其中透明质酸通过位于聚 合物内特定位置处的酰胺键与治疗剂连接，该连接是直接进行的或者 是通过连接基进行的。
背景技术
在不同类型的治疗中，如在癌治疗中，所遇到的问题是：(a)小分 子(抗癌药)本质上主要具有疏水性，因此具有较差的水溶性，并且其 生物学特性由此被削弱，和(b)对于特定组织或细胞的选择性不充分。
例如，喜树碱(CPT)是从喜树(Camptotheca acuminata)中获得的 不溶于水的光学活性生物碱。20(S)-喜树碱及其类似物是一类被认为 通过使拓扑异构酶I诱导的DNA磷酸二酯主链中的单链稳定化从而预 防重接合作用(relegation)的细胞毒剂。这导致在复制期间产生双链 DNA断裂，如果未被修复，则导致细胞凋亡。20(S)-喜树碱针对人癌 细胞系和体内动物异种移植物显示优异的抗肿瘤活性。除了其不溶于 水之外，其具有药理学重要性的内酯环在人血浆中是不稳定的，在人 血浆中，内酯环主要以其开环醇酸的形式存在，这种形式被白蛋白捕 获，从而使该药物失活。喜树碱的主要局限性是形成不稳定的药物- 靶复合物以及内酯环的不稳定性。根据三元复合物的可逆性和在DNA 复制期间致死性损伤的形成，可预期长时间暴露于该药物下可获得最 佳的细胞毒作用。几种喜树碱(CPT)类似物已经历了临床开发，但是尽 管它们具有有前途的临床作用，但是现有CPT类似物的全部治疗影响 是有限的；优化其治疗指数的许多手段目前正处于评价中。研究人员 试图通过制备新的化合物来解决问题。拓扑替康和伊立替康是被设计 用来通过引入官能团以增强溶解度来促进活性内酯形式化合物的非肠 道给药的合成类似物。在几种肿瘤的化疗处置中，它们目前是被广泛 认可的组分。拓扑替康在先前经过治疗的卵巢癌和小细胞肺癌患者中 具有良好活性，并且目前在美国被批准用作这些疾病的二线治疗药。 伊立替康是前体药物，其经历酶转化形成生物活性代谢物7-乙基-10- 羟基-喜树碱(SN38)。目前，当与作为用于晚期结直癌患者的一线治疗 药的氟嘧啶联合使用时，或者作为在基于5-氟尿嘧啶化疗失败后的单 一药剂时，伊立替康是被选择的疗法。几种另外的喜树碱类似物处在 不同的临床开发阶段，它们包括：9-氨基喜树碱，9-硝基喜树碱，7-(4- 甲基哌嗪基亚甲基)-10，11-亚乙二氧基-20(S)-喜树碱，甲磺酸依喜替 康(exatecan)和卡兰替康(karenitecin)。然而，这些化合物具有某些 缺点，例如它们不适合靶向于特定的组织或细胞受体。
在优化药物效力的努力中，可能的策略包括分子结构的化学修饰。 一个策略是将药物共价结合到水溶性的聚合物材料上。多种聚合物已 被用于与疏水性药物分子(包括喜树碱)结合，诸如聚(L-谷氨酸)- 紫杉醇(paclitaxe)；聚乙二醇(PEG)-喜树碱(Rowinsky EK等人，J. Clinical Oncology，Vol.21，No.1(2003)148-157)；聚(L-谷氨 酸)-喜树碱(Singer JW等人，Ann.N Y Acad.Sci.922(2000) 136-150)；聚(N-羟丙基甲基丙烯酰胺)-HA-多柔比星，羧甲基右旋 糖酐-喜树碱(CMD Clinical Cancer Research，11，1650-1657， 2005)，环糊精和CPT(Cheng J，Bioconjugate Chem.2003，14， 1007-1017)。然而，这些策略不能允许靶向于所需部位；有时候，由 于其特有的化学性质或者由于化学修饰，其已丧失其原始的/天然的靶 向性能力，聚合物根本不识别任何靶标。事实上，天然聚合物的功能 和生物学特性在化学修饰牵涉对这些特性的维持是不可缺少的基团时 很容易丧失。
紫杉醇(TXL)是抗白血病药和抗肿瘤药。其最初从太平洋紫杉(红 豆杉(Taxus bravifolia))的树皮中被分离出来，针对多种瘤显示高 活性，并且在临床上已用于转移性乳癌、难治性卵巢癌和几种其它恶 性肿瘤的治疗。TXL是高度疏水性药物，其天然形式在水中具有极低 的溶解性。TXL的持续输注已显示比推注或更快速的输注速率具有更 大的临床效力。为了克服溶解性问题并增强药物持续输注的临床效力， 已经通过使用乙酰苯甲酰氯将母药酯化而引入易受影响的酮基，然后 与一系列包含酰肼的马来酰亚胺反应，将TXL与聚乙二醇(PEG)结合 (Rodrigues PCA等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.，13，2003，355)。 TXL还被结合至透明质酸(在本申请中，透明质酸还称作HA)从而克服 溶解性问题并靶向于肿瘤细胞。合成策略涉及在HA的葡萄糖醛酸残基 的羧基处的药物结合(用琥珀酸酐连续处理TXL)，TXL-半琥珀酸酯 的活化，用己二酸二酰肼对HA的羧基进行官能化，然后使两个中间体 反应得到HA-紫杉醇结合物。结合物对已知表达透明质酸受体的人癌 细胞系(乳癌、结肠癌和卵巢癌)显示选择毒性；在相同浓度下没有观 察到对小鼠成纤维细胞系具有毒性(Luo，Y.，和Prestwich，G.D.， Bioconjugate Chem.，10(1999)755-763)。然而，这些衍生物不加 区别地在聚合物的不同位置上发生取代，从而丧失了天然的化学规律 性。
聚(L-谷氨酸)，聚乙二醇(PEG)和羧甲基右旋糖酐(CMD)缺乏生 物活性和靶向性能力；而天然HA相对于其它聚合物已显示优点，因为 其能使药物靶向于患病部位。抗癌聚合物药物可穿过癌部位，通过增 强的渗透和潴留(EPR)方式(被动机制)或通过采用在细胞表面上的受 体之间的特异性相互作用的主动靶向进行。HA不仅通过EPR方式起作 用，而且在体内具有多种被识别的细胞受体，并且其可与其它结构如 特别是蛋白聚糖相互作用。在不同的受体中，可述及的是CD44。对透 明质酸与蛋白受体(例如CD44)之间的相互作用的研究已显示：结合发 生在透明质酸的带负电荷的羧基与蛋白质的带正电荷的碱性氨基酸的 区域之间(J.Cell.Biol.vol 22，1993，257-264)。对于透明质酸 与蛋白聚糖的相互作用还需要游离羧基(Biochem.J.167，711， 1977)。因此，透明质酸的羧基和羟基的完整性对于识别和结合细胞结 构非常重要；这些基团的部分取代将不允许与这些蛋白大分子发生有 效的结合。这些游离的羧基和羟基对于形成适当的聚合物构型也是重 要的。关于受体CD44，公知其被许多肿瘤类型过度表达。在表达CD44 HA受体的细胞系中显示了衍生化HA的胞吞作用。荧光标记的HA-紫杉 酚结合物已经显示对已知过度表达HA受体的人癌细胞系具有选择性 毒性。HA肝脏受体(HARLEC)的存在暗示了HA可用作使药物靶向于肝 脏组织的载体分子。已表明HA用于在小鼠中从结肠腺癌发生的肝脏转 移。
已经描述了用属于甲氨蝶呤族的药物在C6位取代制备透明质酸 衍生物(WO01168105)。这些DDS的特征在于在透明质酸和药物之间 存在酯基，其具有特定的药物释放特征模式和在不同的生物学环境下 的稳定性。
附图说明
图1：6-NH2-HA的合成
HA→6-Cl-HA；HA-6-Ms→6-NH2-HA
条件：a)X＝Cl：MsCl，DMF，Δ；X＝OMs：MsCl，DMF，DIEA，-10 ℃；b)aq.NH4OH，Δ；c)X＝Cl：NaN3，DMSO，18-冠-6，Δ；X＝OMs： NaN3，水，Δ；d)NH4COOH，水，Pd/C，RT。
图2：HA-6-NH-CO-(CH2)2-CO-20-O-CPT的合成。
CPT→CPT-半琥珀酸酯→HA-6-NH-琥珀酸酯-20-O-CPT。
图3：HA-6-NH-CO-(CH2)2-CO-2’-O-TXL的合成。
TXL→TXL-半琥珀酸酯→HA-6-NH-琥珀酸酯-2’-O-TXL。
图4：HA-6-NH-CO-(CH2)2-CO-Gly-20-O-CPT。
图5：HA-6-NH-CO-gly-CO-(CH2)2-CO-20-O-CPT。
图6：HA-6-NH-CO-MTX。
图7：HA-6-NH-CO-IBP。
发明详述
本发明的目的是包含透明质酸和治疗剂的DDS，其特征在于治疗 剂直接或通过连接基连接到在N-乙酰基-D-葡糖胺残基的C6位带有氨 基的透明质酸衍生物上；该氨基代替了HA中在该位上天然存在的羟 基。为了简便起见，该衍生物在本文中被称作“6-氨基透明质酸”或 “6-NH2-HA”或“HA-6-NH2”；在本文中，对于其它的在6位被衍生化 的透明质酸使用了等价术语，其中NH2用有关取代基代替。
6-NH2-HA与治疗剂(或与连接基)的连接通过酰胺键实现，酰胺键 牵涉在一侧的6-NH2-HA基团的6-氨基和在另一侧的在治疗剂(或连接 基)上存在的适当的COOH基。当存在连接基时，治疗剂进一步通过共 价连接连接基。
置换度，即在与治疗剂或连接基用氨基连接时所牵涉的6-NH2-HA 的百分数，根据在酰胺形成反应中所用治疗剂/连接基的量的不同而 异。置换度可如此容易地被控制，导致DDS具有不同水平的药物负荷， 从而可用于不同的治疗目的。
本发明的DDS中包含的“透明质酸”(或“HA”)是包括二糖重复 单元的聚合物，该二糖重复单元由通过β(1→3)糖苷键结合的D-葡糖 醛酸和2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖(N-乙酰基-D-葡糖胺)组成；该 D-葡萄糖醛酸残基可为酸形式或盐形式。每个重复单元与下一个重复 单元通过β(1→4)糖苷键结合形成线型聚合物。透明质酸的平均分子量 优选为10,000到1,000,000，更优选为10,000到500,000。术语“透 明质酸”或“HA”包括游离酸形式和与例如碱金属(优选Na或K)、碱 土金属(优选Ca或Mg)、过渡金属(优选Cu、Zn、Ag、Au、Co、Ag)形 成的成盐形式。术语“透明质酸”/“HA”还包括它们的其中一个或多 个仲羟基被衍生化形成选自例如以下的基团的衍生物：-OR，-OCOR， -SO2H，-OPO3H2，-O-CO-(CH2)n-COOH，-O-(CH2)n-OCOR，其中n是1-4 且R是C1-C10烷基，-NH2，-NHCOCH3。
治疗剂(是指处在其游离状态下，即在结合到本发明的DDS中之前) 包含至少一个羧基或至少一个氨基或至少一个羟基。
当治疗剂包含至少一个羧基时，治疗剂和6-NH2-HA之间的酰胺连 接优选是直接连接，不使用连接基。
当治疗剂包含至少一个氨基或至少一个羟基时，药物优选借助连 接基连接到6-NH2-HA。
关于治疗活性剂所属的药理学类别不是关键。其可选自例如：止 痛药、抗高血压药、麻醉药(anestetic)、利尿药、支气管扩张药、 钙通道阻断剂、胆碱能药、CNS药、雌激素、免疫调节剂、免疫抑制 剂、抗脂肪肝药、抗焦虑药、抗溃疡药、抗心率不齐药、抗心绞痛药、 抗生素、抗炎药、抗病毒药、溶血栓药、血管扩张药、解热药、抗抑 郁药、抗精神病药、抗肿瘤药、溶粘蛋白剂(mucolytic)、麻醉药拮抗 剂、激素、抗惊厥药、抗组胺药、抗真菌药和治牛皮癣药、抗增殖药、 抗生素。其中，优选抗炎药、抗生素、抗肿瘤药(特别是抗癌药)。 适当的治疗剂的例子是喜树碱、布洛芬、甲氨蝶呤、紫杉醇、头孢唑 林、萘普生、赖诺普利、青霉素G、萘啶酸、胆甾烷及其衍生物。
连接基(是指处在其游离状态下，即在结合到本发明的DDS中之 前)总是包含至少一个羧基用于与6-NH2-HA连接；其还包含至少一个 可用于与治疗剂连接的其它基团，如氨基、硫醇、另外的羧基等等。
适当的连接基是，例如直链或支链的脂族、芳族或芳脂族C2-C20 二羧酸，氨基酸，肽，与氨基酸连接的直链或支链的脂族、芳族或芳 脂族C2-C20二羧酸，与肽连接的直链或支链的脂族、芳族或芳脂族C2-C20 二羧酸。
每当存在连接基时，则连接基的作用是在透明质酸和治疗剂之间 生成臂(arm)或间隔基(spacer)。连接基在一侧借助酰胺键与6-NH2-HA 连接并且在另一侧借助任何可能的共价型键与治疗剂连接。
当连接基是与氨基酸或肽连接的二羧酸时，与HA形成酰胺键的羧 基可以是二羧酸的游离酸基或者是氨基酸或肽的游离酸基。
优选的连接基是：丁二酸、与氨基酸连接的丁二酸、与肽连接的 丁二酸。
根据本发明优选的氨基酸选自：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮 氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、谷 氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和 酪氨酸。根据本发明优选的肽是由上述氨基酸的不同组合组成的肽或 仅由一种类型的氨基酸组成的肽，它们优选是二肽、三肽或四肽。
如实验部分所述的，本发明的DDS的特征在于存在通过酰胺键连 接到透明质酸的N-乙酰基-D-葡糖胺单元的C6上的治疗剂，该连接直 接进行或借助连接基进行。HA的其它基团不参与与药物的化学键合。 这是指透明质酸上的仲羟基和羧基都不参与任何的药物取代，并且本 发明的DDS在多糖上所保持的官能度与天然HA中的官能度接近。因此， 这些游离的官能度可完全(100％)被用于与受体如CD44或其它结构如 蛋白聚糖发生相互作用。
本发明的DDS是稳定的并且不含不希望的不利于其实际药用的反 应副产物和杂质。
这些DDS的制备允许获得保持了治疗剂的药理学效力的药物化合 物。因此，它们可成功地用于治疗所有的对DDS中的特定治疗剂有应 答的病状。同时，它们可以显示出一些在单独治疗剂中未被观察到的 性质，例如，它们对于一些细胞或组织显示更高亲合力，它们可提供 不同的生物利用度模式。
因此，本发明的另一方面是上述DDS在制备用于治疗适于每种治 疗剂的病状中的应用。
本发明的又一方面涉及包含与可药用的赋形剂和/或稀释剂混合 的本发明的DDS的药物组合物。该药物组合物可以是液体或固体形式； 其可通过经口、非肠道、局部、关节内途径给药。DDS的全身给药可 通过静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下途径给药。特别感兴趣的是包含 本发明DDS的可注射的药物组合物。
本发明的又一方面是制备上述DDS的方法。该方法包括在 6-NH2-HA与治疗剂(或连接基)上存在的羧基之间形成酰胺键，每当使 用连接基时，该方法还包括将药物与连接基连接的步骤，这一步骤在 酰胺形成步骤之前或之后进行无关紧要。
6-NH2-HA可以得自HA，通过在HA的N-乙酰基葡糖胺残基的C-6 上区域选择性引入氨基进行。优选过程举例说明如下：
a)使用离去基团置换游离形式或盐形式的透明质酸的N-乙酰基 -D-葡糖胺单元的C-6位上的羟基，从而获得6位活化的HA。
b)将6位活化的HA转化成6-NH2-HA。
c)将6-NH2-HA进行回收。
在步骤a)中，离去基团可以选自：磺酸酯，膦酸酯(三苯基膦酸 酯)，氰基(CN-)，亚硝酸酯(NO2-)，卤素(优选氯代)，硫酸酯，卤代 硫酸酯，硝酸酯，卤代亚硫酸酯(氯代亚硫酸酯)。
优选的离去基团是卤素，这一卤化作用可根据例如WO9918133和 WO0168105所述进行，两篇文献都处在本申请人的名义下。当离去基 团是氯时，区域选择性氯化作用优选根据以下过程进行。在-20℃到-10 ℃，优选在-10℃下，氯化试剂，如在N，N-二甲基甲酰胺中的甲磺酰 氯(Vilsmeir试剂)，被加入到在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的盐形 式(为钠形式或诸如TBA、吡啶或对称-三甲基吡啶的有机碱形式)、 优选钠形式的HA的溶液或悬浮液中。在2小时时间段内，反应温度从 -10℃升高到40-65℃，优选升高到60℃。然后，氯化反应在40℃到 65℃，优选60℃的温度下进行10-24小时，优选进行16小时。该反 应的后处理为：用饱和NaHCO3水溶液处理以实现pH 8，然后用NaOH 水溶液处理以实现pH 9；该步骤允许除去在反应期间在HA分子的仲 羟基处形成的甲酸酯基。然后通过加入稀HCl将反应混合物中和。然 后通过标准技术回收所需的6-氯-透明质酸。
其它优选的离去基团是磺酸酯，如烷基磺酸酯或芳基磺酸酯， 得到6-磺化-HA；在磺酸酯中，优选甲磺酸酯。区域选择性磺酰化采 用作为磺酰化试剂的烷基磺酰卤或芳基磺酰卤，优选烷基磺酰氯或 芳基磺酰氯，在有机碱或无机碱、优选有机碱存在的条件下进行。 烷基磺酰卤或芳基磺酰卤可优选选自：甲基磺酰基(甲磺酰基)，对- 甲苯磺酰基(甲苯磺酰基)，三氟甲磺酰基，trimsyl，tripsyl，1，1- 磺酰基-咪唑。有机碱优选自不同的有机胺，如二异丙基乙胺、三乙 胺。
溶剂选自：二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、甲酰胺。 一般的磺酰化过程如下所述。在卤素回流下通过搅拌，将碱，优选有 机碱，加入到盐形式、优选有机碱形式的HA的悬浮液或溶液中。然后， 滴加在适当的溶剂中、优选在相同溶剂中的烷基磺酰氯或芳基磺酰氯。 在2-90分钟(优选45-75分钟)的时段后，反应通过添加NaHCO3淬 灭以除去在反应期间在HA的仲羟基处形成的甲酸酯基。然后使反应继 续进行约10-20小时，优选进行18小时。反应产物(6-磺化-HA)通过 已知技术如沉淀、干燥从溶液中被直接回收，或者在回收之前溶液经 过处理使得获得处于适当盐形式的6-磺酸酯-HA，如HA-6-磺化 物：TBA。
根据步骤b)，置换C6位的离去基团，获得中间体6-NH2-HA化合 物。步骤b)可如下进行：用浓氨水在高温下(例如40-70℃，优选60-80 ℃)处理6位活化的HA达2-50小时，从而获得6-NH2-HA。特别地，当 离去基团是氯时，则6-氨基-HA的制备如下：用浓(25％)氨水，在 80℃下，在有或者没有DMSO的条件下，处理6-Cl-HA达7-48小时， 时间根据置换度的需要而异，其中6-Cl-HA为无机盐形式或有机盐形 式，优选分别是钠盐或四丁基铵(TBA)盐形式。或者，当离去基团是甲 磺酸酯时，则中间体6-氨基-HA的制备如下：用浓(25％)氨水，在 60℃下，处理6-甲磺酰酯-HA达18小时，其中6-甲磺酸酯-HA为无机 盐形式或有机盐形式，优选分别是钠盐或四丁基铵(TBA)盐形式，从而 实现甲磺酸酯基向氨基的完全转化。
6-NH2-HA中间体的合成还可如下逐步获得：用叠氮化物阴离子置 换6-Cl-HA中的氯或6-OMs-HA中的甲磺酸酯，然后还原。6-Cl-HA要 求更强的条件，因此置换在二甲基亚砜中进行，并且使用冠醚来增强 叠氮化物的亲核性。使用水作为溶剂和使用叠氮化钠作为亲核试剂， 6-OMs-HA显示了实现完全转化的更高反应性。还原阶段也在水中进 行，避免了进行盐交换的任何需要。有几种方法可用于在含水条件下 还原叠氮化物：在生理学缓冲剂中的二硫苏糖醇，在含水吡啶中的硫 化氢，在水/醇混合物中的氯化锌和氯化铵，在水中的铜盐和硼氢化钠， 在水中的催化氢化。含硫化合物被认为是第二选择，并且优选的方法 需要使用在水中的二价铜盐和硼氢化钠(Fringuelli J.Org.Chem. 2003，68，7041-7045)并且在水中进行的经典的催化氢化使用甲酸铵 作为氢供体和使用Pd/C作为催化剂。也可使用采用氯化锌和氯化铵进 行还原，因为其提供了阳性Kaiser试验，但是在纯化阶段可能出现问 题。
步骤c)根据本领域专家公知的技术进行。包括步骤a)到c)的方 法部分是区域选择性的，即其通过取代位于HA的C6位上的单独的伯 羟基进行；其它羟基不被取代。在6-NH2-HA和治疗剂(或连接基)之间 的酰胺形成步骤在用于该反应的标准反应条件下进行，参见实验部分 的举例说明。
当使用连接基时，该治疗剂可以在与6-NH2-HA形成酰胺步骤之前 或之后与连接基连接，优选在与6-NH2-HA形成酰胺步骤之前进行。
当在酰胺形成步骤之前将连接基与治疗剂连接时，后者以直接生 成本发明的最终DDS结束，其具有结构HA-6-NHCO-连接基-治疗剂。
当在酰胺形成步骤之后将连接基与治疗剂连接时，后者以生成结 构HA-6-NHCO-连接基的中间体化合物结束，其然后与治疗剂反应，获 得具有结构HA-6-NHCO-连接基-治疗剂的最终DDS。
当不使用连接基时，酰胺形成步骤以生成具有结构HA-6-NHCO-治 疗剂的最终DDS结束。
在连接基与治疗剂之间的键的类型不是关键性的，并且可通过任 何形成共价键的适当化学反应获得；酯，醚，仲胺/叔胺是这种键的例 子。
特别地，当治疗剂包含羟基且连接基包含羧基(除了参与酰胺键 的羧基之外)，治疗剂-连接基的键便利地是酯型：因此，包含羟基官 能度(例如喜树碱、紫杉醇)的治疗剂在氯化有机溶剂(如二氯甲烷)中 用连接基(例如丁二酸)处理，得到治疗剂-连接基单酯(例如半琥珀酸 酯)；所得到的单酯被活化(如使用N-羟基琥珀酸酯(NHS)，使用二 异丙基碳二亚胺(DIPC)在DMSO中，在环境温度下)并与6-NH2-HA反 应，得到本发明的DDS。
在另外的实施方案中，当治疗剂包含羟基且连接基包括氨基酸或 肽时，治疗剂可连接到所述氨基酸/肽的：(i)胺或(ii)羧基官能团上； 以这种方式，有可能通过酶促或pH辅助水解达到细胞的药物释放条 件。
在情况(i)中，通过用N-保护的氨基酸/肽(诸如苄氧羰基-甘氨酸 -OH)处理包含羟基官能团的治疗剂(诸如喜树碱、CPT)可以获得键合， 从而在氨基再生后得到相应的酯衍生物。然后，得到的具有游离NH2 基的产物用C2-C20二羧酸处理，得到相应的单酯。治疗剂-连接基单 酯然后与6-NH2-HA反应，得到最终的DDS。
在情况(ii)中，反应顺序包括：使包含羟基官能度的治疗剂(如 喜树碱、CPT)与C2-C20二羧酸(如琥珀酸)反应，得到相应的单酯(例 如半琥珀酸酯)；然后用其中羧基被保护的氨基酸(例如甘氨酸)或肽处 理该单酯；在除去保护基后并与6-NH2-HA反应，获得最终的DDS。
当治疗剂包含羧基时，其可直接通过酰胺键连接到6-NH2-HA的C6 位上的N原子上，不使用任何连接基，得到最终的具有结构HA-6-NHCO- 治疗剂的DDS。具有羧基官能团的治疗剂的例子是甲氨蝶呤(抗肿瘤 药)或布洛芬(抗炎药)。这些治疗剂也可借助连接基与6-NH2-HA连 接。在这种情况中，首先在6-NH2-HA的C6位上的N原子与连接基的 羧基官能团之间形成酰胺键；如此获得的化合物HA-6-NHCO-连接基然 后与治疗剂反应，获得最终的DDS。
本发明的反应条件是温和的并且允许获得的最终DDS是稳定的且 不含不希望的不利于其实际药用的副产物和杂质。现在通过以下的非 限制性实施例说明本发明。
实验部分
使用的缩写：
HA：透明质酸。TBA：四丁基铵。DMF：二甲基甲酰胺。DMSO：二 甲基亚砜。DIEA：N，N-二异丙基乙胺。DMAP：4-二甲基氨基吡啶。DCM： 二氯甲烷。DIPC：二异丙基碳二亚胺。TFA：三氟乙酸。THF：四氢呋 喃。MeOH：甲醇。EtOH：乙醇。CPT：喜树碱。MTX：甲氨蝶呤。TXL： 紫杉醇。EDC：N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺。Cbz：苄氧 羰基。Boc：叔丁氧羰基。HOBt：1-羟基苯并三唑。NHS：N-羟基琥珀 酰亚胺。EtOAc：乙酸乙酯。
6-Cl-HA、6-OMs-HA、6-NH2-HA和通式HA-6-NH-酰基，HA-6-O-酰 基和HA-O-酰基的所有所述衍生物的结构由NMR支持。1H NMR，1H DOSY， 13C NMR，HSQC谱图证实了所有DDS的6-脱氧-6-氨基-N-乙酰基-D-葡 糖胺的C6位上的药物的共价连接是HA-6-NH-酰基类型。
在装备有沿着z轴线性梯度的Varian Inova 500光谱仪上和在 Varian Mercury 200光谱仪上在D2O中获得HA衍生物的NMR谱图并 且按照说明获得其它中间体的谱图。除非另作说明，否则MW 20.000 的透明质酸用作原材料。
通过离子交换制备透明质酸的TBA盐。简而言之，安珀莱特 (Amberlite)IRA-120树脂用过量的20％四丁基氢氧化铵溶液处理24 小时，然后用水洗涤。然后将HA的水溶液(5％)温和地与树脂混合24 小时。过滤、浓缩和冷冻干燥，得到具有化学计算量的TBA含量的HA TBA盐，通过质子NMR被证实。
实施例1.通过NMR确定6-Cl-HA中的氯化物含量如下进行：使 用定量脉冲序列，相对于44.0ppm处的13C NMR峰(CH2Cl)对60.5ppm 处的13C NMR峰(CH2OH)进行积分。
实施例2.通过NMR确定HA-6-甲磺酸酯(6-Ms-HA)中的甲磺酸酯 含量如下进行：相对于1.95ppm处的峰(HA链的3H)对3.10-3.32ppm 区域内的峰(HA链的1H和甲磺酸酯的3H)进行积分。通过13C NMR和 HSQC NMR谱证实C6位的选择性：没有检测到第二个甲磺酸酯。
实施例3.通过NMR确定6-NH2-HA中的胺含量如下进行：使用定 量脉冲序列，对60.5ppm处的13C NMR峰(CH2OH)、44.0ppm处的13C NMR 峰(左侧的CH2Cl，仅当6-NH2-HA由6-Cl-HA获得时才存在)和40.5ppm 处的13C NMR峰(CH2NH2)进行积分。
实施例4.通过13C NMR确定6-N3-HA化合物中叠氮化物含量，相 对于51ppm处的CH2-N3信号对60.5ppm处的CH2-OH信号进行积分。
实施例5.结合用于水含量测定的热重分析和用于游离的和结合 的CPT测定的HPLC方法来确定DDS中的CPT含量。用于测定DDS中水 含量的热重分析的分析参数是：
热重天平： TGA Perkin Elmer
气氛： 氮
气流 炉内流：25mL/min；平衡流：50mL/min
温度范围 50-250℃
温度扫描速率 10℃/分钟
为了测定游离的喜树碱，注射结合物的1∶1的水/甲醇溶液。在水 解后测定总的喜树碱。水解在室温下、在搅拌下、在0.1M氢氧化钠 中进行2小时。随后向样品中加入一定量的可获得50％的最终甲醇浓 度(注射前的浓度)的甲醇，以防止喜树碱沉淀，然后用1M HCl溶液中 和，并最终加入25mM KH2PO4缓冲液(pH 2.5)，达到最终体积。从 总喜树碱中减去游离喜树碱获得结合的喜树碱。
用于测定DDS中的CPT的HPLC分析参数是：
色谱系统 Agilent 1100系列
柱设置： 柱名称：Merck Chromolith RP-18e
柱尺寸：100X4.60mm
温度：40℃
保护柱： 保护柱描述：Merck Guard Cartridge RP-18e
保护柱尺寸：5X4.6mm；温度：40℃
洗脱液A： 甲醇
洗脱液B： KH2PO4 25mM缓冲剂pH 2.5
流动相梯度 0’35％A+65％B；
15’55％A+45％B；
20’55％A+45％B
流速： 1mL/分钟
检测器： UV-VIS(λ＝370nm)；荧光计(激发λ＝380nm，发
射λ＝440nm)
运行时间： 20分钟
注射体积： 10μL
实施例6.重量平均分子量(Mw)的测定
透明质酸DDS的分子量通过HP-SEC(高效空间排阻色谱法)测量。 分析条件是：色谱仪：带有Rheodyne 9125注射器的HPLC泵980-PU (Jasco Ser.No.B3901325)。柱：TSK PWxl(TosoBioscience) G6000+G5000+G30006，10，13μm粒径；温度：40℃。流动相：NaCl 0.15M+0.01％NaN3。流量：0.8mL/min。检测器：MALLS(WYATT DAWN EOS-WYATT，USA)，λ＝690nm，(dn/dc＝0.167mL/g)，UV分光光 度检测器875-UV(Jasco，Ser.No.D3693916)，λ＝305nm， Interferometric Refractive Index OPTILAB REX(WYATT，USA)； λ＝690nm，灵敏度：128x；温度：35℃，注射体积：100μl，运行时 间：60分钟。
将待分析样品以约1.0毫克/毫升的浓度溶解在0.9％NaCl中， 并保持搅拌12小时，然后，将溶液过滤通过0.45μm的多孔过滤器 (Sartorius Minisart RC2517795Q)并最终注射到色谱仪中。该分析 允许测得Mw(重均分子量)，Mn(数均分子量)，PI(多分散性)。聚合 物样品溶液的浓度根据折射率的积分进行控制。
实施例7.6-Cl-HA钠盐的制备。
在氮气下，在20℃和机械搅拌下，将50g的透明质酸(hyaluronan) 钠盐悬浮在900mL的无水二甲基甲酰胺中，然后将悬浮液冷却到-10 ℃并在30分钟内加入97mL的甲磺酰氯，在-10℃持续另外30分钟后， 将温度升高到20℃，在1小时后，将温度逐渐升高(在1小时内)到 60℃并继续搅拌18.5小时。然后在剧烈搅拌下将反应混合物分次倾入 到冰和碳酸钠溶液的混合物(4L，初始pH＝11)中，当需要时通过添加 1.5M NaOH保持pH为约9，将得到的呈褐色的悬浮液(最终体积6L) 在pH 9.5下在室温下搅拌约48小时，从而形成透明溶液。将其过滤 以除去固体，然后进行超滤(截止值为10KDa的超滤膜)。得到的溶液 在旋转蒸发器中被浓缩到约1升的最终体积并进行冷冻干燥，获得 34.9g的6-Cl-HA钠盐，为白色固体(DS 66％摩尔/摩尔，通过13C NMR 测定)。13C NMR ppm：22.6，44.0，54.4，60.7，68.6，69.3，72.6， 73.8，74.1，75.5，76.3，80.1，80.9，82.3，101.0，103.4，174.0， 174.1，175.0。
实施例8.6-Cl-HA钠盐的制备。
根据实施例7的相同过过程，从50g的透明质酸钠盐开始并在60 ℃保持12小时，获得33.5g的6-Cl-HA钠盐，为米白色固体(DS 38％摩 尔/摩尔，通过13C NMR测定)。
实施例9.6-Cl-HA钠盐的制备。
根据实施例7的相同过过程，从50g的透明质酸钠盐开始并在60 ℃保持7小时，获得33.1g的6-Cl-HA钠盐，为米白色固体(DS 16％摩 尔/摩尔，通过13C NMR测定)。
实施例10.6-Cl-HA钠盐的制备。
根据实施例7的相同过程，从50g的透明质酸钠盐开始并在60℃ 保持5小时，获得32.4g的6-Cl-HA钠盐，为米白色固体(DS 8％摩 尔/摩尔，通过13C NMR测定)。
实施例11.6-O-甲磺酰基透明质酸钠盐(6-OMs-HA)的制备。
在氮气下，在-10℃和搅拌下，向20.03g(32.3mmol)的HA的TBA 盐在500ml的DMF中的溶液中加入4.86ml(28.4mmol)的DIEA。然 后滴加MsCl(1001μL；12.9mmol)，得到的混合物在-10℃搅拌1小时， 通过加入饱和NaHCO3溶液(1L)将反应混合物淬灭，并用水使总体积达 3升(得到的pH：9)；保持搅拌过夜。得到的溶液经过超滤和在旋转 蒸发器中进行浓缩。将溶液冷冻干燥得到11.12g的白色固体。总的甲 磺酸酯DS为12.3％摩尔/摩尔，通过质子NMR测定。
实施例12.6-O-甲磺酰基透明质酸钠盐(6-OMs-HA)的制备。
在氮气下，在-10℃和在搅拌下，向1.00g(1.61mmol)的HA的TBA 盐在40ml的DMF中的溶液中加入381μL(2.24mmol)的DIEA。然后 滴加MsCl(79μL；1.01mmol)，得到的混合物在-10℃搅拌1小时，通 过加入饱和NaHCO3溶液(50ml)将反应混合物淬灭，并用水使总体积达 200ml(得到的pH：9)；保持搅拌过夜。得到的溶液经过超滤和在旋 转蒸发器中进行浓缩。将溶液冷冻干燥得到588mg的白色固体。总的 甲磺酸酯DS为15％摩尔/摩尔，通过质子NMR测定。
实施例13.6-O-甲磺酰基透明质酸钠盐(6-OMs-HA)的制备。
在氮气下，在-10℃和在搅拌下，向42.2g(68.1mmol)的HA的TBA 盐在1.00升的DMF中的溶液中加入25.6ml(149.8mmol)的DIEA，然 后滴加MsCl(5.29ml；68.1mmol)，得到的混合物在-10℃搅拌1小时， 通过加入饱和NaHCO3溶液(2L)将反应混合物淬灭，并用水使总体积达 5.5升(得到的pH：9)；保持搅拌过夜。得到的溶液经过超滤和在旋 转蒸发器中进行浓缩。将溶液冷冻干燥得到26.0g的白色固体。总的 甲磺酸酯DS为18％摩尔/摩尔，通过质子NMR测定。
实施例14.6-O-甲磺酰基透明质酸钠盐(6-OMs-HA)的制备。
在氮气下，在-10℃和在搅拌下，向20.0g(32.3mmol)的HA的TBA 盐在500ml的DMF中的溶液中加入9.12ml(53.3mmol)的DIEA，然 后滴加MsCl(3.76ml；48.4mmol)，得到的混合物在-10℃搅拌1小时， 通过加入饱和NaHCO3溶液(1L)将反应混合物淬灭，并用水使总体积达 3升(得到的pH：9)；保持搅拌过夜。得到的溶液经过超滤和在旋转 蒸发器中进行浓缩。将溶液冷冻干燥得到11.12g的白色固体。总的甲 磺酸酯DS为30％摩尔/摩尔，通过质子NMR测定。
实施例15.6-O-甲磺酰基透明质酸钠盐(6-OMs-HA)的制备。
在氮气下，在-10℃和在搅拌下，向20.0g(32.3mmol)的HA的TBA 盐在500ml的DMF中的溶液中加入9.12ml(53.3mmol)的DIEA，然 后滴加MsCl(3.76ml；48.4mmol)，得到的混合物在-10℃搅拌1小时， 通过加入饱和NaHCO3溶液(1L)将反应混合物淬灭，并用水使总体积达 3升(得到的pH：9)；保持搅拌过夜。得到的溶液经过超滤和在旋转 蒸发器中进行浓缩。将溶液冷冻干燥得到11.12g的白色固体。总的甲 磺酸酯DS为30％摩尔/摩尔，通过质子NMR测定。
实施例16.6-NH2-HA TBA盐的制备。
在适合加压反应的反应器中，将得自实施例7的5.0g的6-Cl-HA 溶解在100ml浓NH4OH溶液中。将反应器密封并将溶液在80℃加热21 小时，然后将其冷却，真空除去过量的氨。在超滤后，溶液用装载TBA 的安珀莱特IRA-120处理，然后将其冷冻干燥，得到5.43g的6-NH2-HA TBA盐，为米白色固体(DS 33％摩尔/摩尔，通过13C NMR测定)。MW： 17.220，P.I.1.8。13C NMR ppm(不包括TBA信号)：22.6，40.5，44.0， 54.4，60.7，68.6，69.3，70.5，72.0，72.6，73.8，75.5，76.3，78.2， 80.1，80.9，82.3，99.7，101.0，103.4，174.0，174.1，175.0。
实施例17.6-NH2-HA TBA盐的制备。
在适合加压反应的反应器中，将得自实施例7的5.0g的6-Cl-HA 溶解在100ml浓NH4OH溶液中。将反应器密封并将溶液在80℃加热40 小时，然后将其冷却，真空除去过量的氨。在超滤后，溶液用装载TBA 的安珀莱特IRA-120处理，然后将其冷冻干燥，得到4.34g的6-NH2-HA TBA盐，为米白色固体(DS 42％摩尔/摩尔，通过13C NMR测定)。
实施例18.6-NH2-HA TBA盐的制备。
在适合加压反应的反应器中，将得自实施例7的5.0g的6-Cl-HA 溶解在100ml浓NH4OH溶液中。将反应器密封并将溶液在80℃加热48 小时，然后将其冷却，真空除去过量的氨。在超滤后，溶液用装载TBA 的安珀莱特IRA-120处理，然后将其冷冻干燥，得到4.05g的6-NH2-HA TBA盐，为米白色固体(DS 50％摩尔/摩尔，通过13C NMR测定)。
实施例19.6-NH2-HA TBA盐的制备。
在适合加压反应的反应器中，将得自实施例8的5.0g的6-Cl-HA 溶解在100ml浓NH4OH溶液中。将反应器密封并将溶液在80℃加热22 小时，然后将其冷却，真空除去过量的氨。在超滤后，溶液用装载TBA 的安珀莱特IRA-120处理，然后将其冷冻干燥，得到6.51g的6-NH2-HA TBA盐，为米白色固体(DS 20％摩尔/摩尔，通过13C NMR测定)。MW： 15.410，P.I.1.5。
实施例20.6-NH2-HA TBA盐的制备。
在适合加压反应的反应器中，将得自实施例8的5.0g的6-Cl-HA 溶解在100ml浓NH4OH溶液中。将反应器密封并将溶液在80℃加热38 小时，然后将其冷却，真空除去过量的氨。在超滤后，溶液用装载TBA 的安珀莱特IRA-120处理，然后将其冷冻干燥，得到5.90g的6-NH2-HA TBA盐，为米白色固体(DS 25％摩尔/摩尔，通过13C NMR测定)。MW： 16.370，P.I.1.6。
实施例21.6-NH2-HA TBA盐的制备。
在适合加压反应的反应器中，将得自实施例9的5.0g的6-Cl-HA 溶解在100ml浓NH4OH溶液中。将反应器密封并将溶液在80℃加热22 小时，然后将其冷却，真空除去过量的氨。在超滤后，溶液用装载TBA 的安珀莱特IRA-120处理，然后将其冷冻干燥，得到6.43g的6-NH2-HA TBA盐，为米白色固体(DS 13％摩尔/摩尔，通过13C NMR测定)。MW： 14.420，P.I.1.4。
实施例22.6-NH2-HA TBA盐的制备。
在适合加压反应的反应器中，将得自实施例9的5.0g的6-Cl-HA 溶解在100ml浓NH4OH溶液中。将反应器密封并将溶液在80℃加热7 小时，然后将其冷却，真空除去过量的氨。在超滤后，溶液用装载TBA 的安珀莱特IRA-120处理，然后将其冷冻干燥，得到5.95g的6-NH2-HA TBA盐，为米白色固体(DS 4％摩尔/摩尔，通过13C NMR测定)。MW： 13.960，P.I.1.4。
实施例23.6-NH2-HA TBA盐的制备。
在适合加压反应的反应器中，将得自实施例10的5.0g的6-Cl-HA 溶解在100ml浓NH4OH溶液中。将反应器密封并将溶液在80℃加热7 小时，然后将其冷却，真空除去过量的氨。在超滤后，溶液用装载TBA 的安珀莱特IRA-120处理，然后将其冷冻干燥，得到6.22g的6-NH2-HA TBA盐，为米白色固体(DS 2％摩尔/摩尔，通过13C NMR测定)。MW： 13.680，P.I.1.4。
实施例24.6-NH2-HA TBA盐的制备。
在可密封烧瓶中，将得自实施例15的100mg的6-OMs-HA溶解在 3ml浓NH4OH溶液中。将溶液在60℃加热18小时，然后将其冷却，并 真空除去过量的氨。在超滤后，溶液用装载TBA的安珀莱特IRA-120 处理，然后将其冷冻干燥，得到132mg的6-NH2-HA TBA盐，为白色固 体(DS 30％摩尔/摩尔，通过13C NMR测定)。
13C NMR ppm(不包括TBA信号)：22.3，40.5，53.9，60.4，68.1， 69.8，71.0，71.8，72.4，74.7，77.2，79.5，82.0，99.5，100.8， 103.0，173.0，173.9，174.3。
实施例25.6-NH2-HA TBA盐的制备
在适合加压反应的反应器中，将得自实施例14的10g的6-OMs-HA 溶解在200ml浓NH4OH溶液中。将反应器密封并在60℃加热18小时， 然后将其冷却，并真空除去过量的氨。用HCl溶液中和并在超滤之后， 溶液用装载TBA的安珀莱特IRA-120处理，然后将其冷冻干燥，得到 12.8g的6-NH2-HA TBA盐，为白色固体(DS 20％摩尔/摩尔，通过13C NMR 测定)。
实施例26.6-NH2-HA TBA盐的制备。
在适合加压反应的反应器中，将得自实施例13的10g的6-OMs-HA 溶解在200ml浓NH4OH溶液中。将反应器密封并在60℃加热18小时， 然后将其冷却，并真空除去过量的氨。用HCl溶液中和并在超滤之后， 溶液用装载TBA的安珀莱特IRA-120处理，然后将其冷冻干燥，得到 12.6g的6-NH2-HA TBA盐，为白色固体(DS 12％摩尔/摩尔，通过13C NMR 测定)。
实施例27.6-NH2-HA TBA盐的制备。
在可密封烧瓶中，将得自实施例12的500g的6-OMs-HA溶解在 15ml浓NH4OH溶液中。将溶液密封并在60℃加热18小时，然后将其 冷却，并真空除去过量的氨。用HCl溶液中和并在超滤之后，溶液用 装载TBA的安珀莱特IRA-120处理，然后将其冷冻干燥，得到628mg 的6-NH2-HA TBA盐，为白色固体(DS 8％摩尔/摩尔，通过13C NMR测 定)。
实施例28.6-NH2-HA TBA盐的制备。
在适合加压反应的反应器中，将得自实施例11的10g的6-OMs-HA 溶解在200ml浓NH4OH溶液中。将反应器密封并在60℃加热18小时， 然后将其冷却，并真空除去过量的氨。用HCl溶液中和并在超滤之后， 溶液用装载TBA的安珀莱特IRA-120处理，然后将其冷冻干燥，得到 12.9g的6-NH2-HA TBA盐，为白色固体(DS 6％摩尔/摩尔，通过13C NMR 测定)。
实施例29.6-NH2-HA钠盐的制备。
在可密封烧瓶中，将得自实施例15的100mg的6-OMs-HA溶解在 3ml浓NH4OH溶液中。将溶液在60℃加热18小时，然后将其冷却，并 真空除去过量的氨。溶液用0.5ml的饱和氯化钠处理并搅拌30分钟， 然后对其进行渗析并冷冻干燥，得到92mg的6-NH2-HA钠盐，为白色 固体(DS 30％摩尔/摩尔，通过13C NMR测定)。
实施例30.6-N3-HA钠盐的制备。
将得自实施例8的1.00g(2.38mmol)的6-Cl-HA钠盐转化成相应 的TBA盐如下进行：溶解在水中并用装载TBA的安珀莱特IRA-120处 理。得到的溶液经过冷冻干燥，得到1.53g的6-Cl-HA TBA盐。将该 固体溶解在30ml DMSO中，并加入5.0g的叠氮化钠和1.0g的18-冠 -6，加热到80℃并然后搅拌24小时。将混合物倾入到水中，得到的 溶液经过超滤和冷冻干燥，得到820mg的固体。叠氮化物形式的DS 为30％，通过13C NMR测定。
实施例31.6-N3-HA钠盐的制备。
将得自实施例14的200mg(0.5mmol)的6-OMs-HA钠盐溶解在4ml 水中，加入1.20g的叠氮化钠，并将溶液在80℃搅拌16小时，与水 进行渗析并冷冻干燥，得到180mg的白色固体。叠氮化物形式的DS 为15％，通过13C NMR分析，在质子NMR中没有观察到残留的甲磺酸酯。
实施例32.6-N3-HA钠盐的制备。
将得自实施例20的2.0g(4.8mmol)的6-OMs-HA钠盐溶解在40ml 水中，加入10.0g的叠氮化钠，并将溶液在80℃搅拌16小时，用水 渗析并冷冻干燥，得到1.65g的白色固体。叠氮化物形式的DS为10％， 通过13C NMR分析，在质子NMR中没有观察到残留的甲磺酸酯。
实施例33.6-NH2-HA钠盐的制备。
向得自实施例32的150mg(0.37mmol)的6-N3-HA钠盐和16mg (0.1mmol)的CuSO4在3ml水中的溶液中，在0℃和搅拌下，分份加入 38mg(1.0mmol)的NaBH4，最初观察到气体放出并形成黑色混合物。1 小时后，混合物用浓NH4OH处理以获得pH＝10并通过硅藻土过滤。 得到的溶液用1N HCl酸化到pH＝9，从而形成黑色沉淀，其使用硅 藻土短柱被滤出，得到的溶液用水进行渗析并冷冻干燥，得到135mg 的白色固体。氨基的DS为10％，通过13C NMR测定，并且没有观察到 残留的叠氮化物。
实施例33.6-NH2-HA钠盐的制备。
得自实施例32的200mg(0.50mmol)的6-N3-HA钠盐和120mg的甲 酸铵在4ml水中的溶液通过几个氮气/真空循环进行吹扫以除去空气， 然后，在氮气下，加入40mg 5％的Pd/C，并将混合物在室温下搅拌18 小时，然后将其通过硅藻土短柱过滤，用水渗析并冷冻干燥，得到 184mg的白色固体。氨基的DS为10％，通过13C NMR测定，并且没有观 察到残留的叠氮化物。
实施例34.CPT-20-O-半琥珀酸酯。
在室温和搅拌下，向2.98g(17.1mmol)的琥珀酸单叔丁基酯和 1.40g(11.5mmol)的对-二甲基氨基-吡啶在200ml二氯甲烷中的溶液 中加入2.68ml(17.3mmol)的二异丙基碳二亚胺和3.00g(8.62mmol) 的CPT，在搅拌过夜后，得到的悬浮液用80ml的二氯甲烷稀释，获得 的溶液用0.1N HCl溶液洗涤并用无水硫酸钠干燥。然后将其过滤并在 旋转蒸发器中蒸干，残余物用100ml MeOH进行结晶，过滤并用MeOH 洗涤。在过滤器上干燥后，固体用50ml三氟乙酸在二氯甲烷中的40％ v/v溶液处理，并且在室温下放置1小时后，得到的浅绿色溶液在旋 转蒸发器中蒸干，残余物用100ml MeOH进行结晶，过滤并用MeOH和 二乙醚洗涤，真空干燥后，得到3.67g(8.19mmol，95％)的浅黄色固 体。
实施例35.HA-6-NHCO(CH2)2-CO-20-O-CPT钠盐。
在氮气下，在室温和搅拌下，向得自实施例34的56mg(0.124mmol) 的CPT-20-O-半琥珀酸酯和17.3mg(0.150mmol)的N-羟基琥珀酰亚胺 在3ml的二甲基亚砜中的溶液中加入19μL(0.124mmol)的二异丙基碳 二亚胺。16小时后，加入得自实施例20的77mg(0.124mmol)的 6-NH2-HA TBA盐，并继续搅拌5小时，然后加入0.15ml的饱和NaCl 溶液并继续搅拌30分钟，在搅拌下将混合物倾入到10ml EtOH中，得 到的淤浆搅拌10分钟，然后过滤并用EtOH洗涤，将固体悬浮在10ml 二甲基甲酰胺中，成淤浆30分钟，过滤并用二甲基甲酰胺洗涤一次， 用MeOH洗涤两次，在过滤器上干燥后，将固体溶解在10ml水中并用 水渗析，然后将溶液过滤通过0.22μ孔径大小的膜并冷冻干燥，得到 60mg的白色固体，CPT形式的DS通过质子NMR测定为：25％摩尔/摩 尔。
实施例36.HA TBA盐和被活化的CPT-20-O-半琥珀酸酯之间的反 应。
在氮气下，在室温和搅拌下，向得自实施例34的56mg(0.124mmol) 的CPT-20-O-半琥珀酸酯和17.3mg(0.150mmol)的N-羟基琥珀酰亚胺 在3ml的二甲基亚砜的溶液中加入19μL(0.124mmol)的二异丙基碳二 亚胺。16小时后，加入77mg(0.124mmol)的HA TBA盐，并继续搅拌 5小时，然后加入0.15ml的饱和NaCl溶液，并继续搅拌30分钟。在 搅拌下将混合物倾入到10ml EtOH中，得到的浆料搅拌10分钟，然后 过滤并用EtOH洗涤，将固体悬浮在10ml二甲基甲酰胺中，成淤浆30 分钟，过滤并用二甲基甲酰胺洗涤一次，并用MeOH洗涤两次，在过滤 器上干燥后，将固体溶解在10ml水中并用水渗析，然后将溶液过滤通 过0.22μ孔径大小膜并冷冻干燥，得到48mg的白色固体。
CPT形式的DS通过质子NMR测定为：0％摩尔/摩尔。
实施例37.得自实施例35的HA-6-NHCO(CH2)2-CO-20-O-CPT通过 NMR进行结构确证。
得自实施例35的HA-6-NHCO(CH2)2-CO-20-O-CPT在D2O中的质子 光谱显示了可归属于结合的CPT-半琥珀酸酯的非常宽的信号峰。DOSY 权重谱证实了新信号属于与透明质酸链结合的物质。在5.5和5.8ppm 之间存在的两个二重峰可归属于CPT的内酯并且相对于属于结合的 CPT的其它信号进行正确的积分。HSQC谱证实了这一归属并且允许完 整地鉴定了所有的CPT-半琥珀酸酯信号和聚合物上新形成的酰胺 6-CH2的信号。
通过1H NMR定量测定，结合的CPT估计为25％摩尔/摩尔。通过 向NMR管中加入2mg的固体LiOH一水合物证实了DS。在几分钟后， 获得新的质子光谱，其显示了从结合物发生CPT的完全水解；CPT的 开环形式的锂盐的信号可以相对于HA被积分，证实了DS为25％摩尔 /摩尔。在该质谱中，观察到的琥珀酸酯链的信号是对于两个亚甲基在 两个不同化学位移处的两个宽的多重峰，表明琥珀酸酯仍然与聚合物 结合；这通过DOSY权重谱被证实，并且在pH 13下经过一周后，NMR 仍然显示半琥珀酸酯在聚合物上结合。
在得自实施例20的起始的6-NH2-HA中，胺DS通过13C NMR测定 估计为25％摩尔/摩尔，并且从HA-6-NHCO(CH2)2-CO-20-O-CPT的HSQC 谱中可见，在聚合物上没有残留痕量的6-CH2NH2。这些实验表明了， 在结合步骤中，CPT-20-O-半琥珀酸酯仅仅通过酰胺键与6-NH2-HA的 胺结合；这由其中使用天然HA TBA盐并且没有发现被结合的CPT的独 立反应(实施例36)所证实。
另外，结合的CPT以其内酯形式存在(从质子和碳化学位移以及 从质子积分可知)；为了对比，在碱性水中获得CPT的谱图，其中， CPT作为开环内酯羧化物形式是可溶的。在这种情况中，开环内酯的 质子和碳化学位移是明显不同的。
最后，可将纯的开环CPT的1D谱和2D谱(从碱性H2O中并使用水 抑制技术获得)叠放到水解的结合物的谱图上，表明在活化和结合反应 期间，CPT完整保留。
实施例38.HA-6-NHCO(CH2)2-CO-20-O-CPT钠盐。
在氮气下，在室温和搅拌下，向得自实施例34的1.03g(2.30mmol) 的CPT-20-O-半琥珀酸酯和318mg(2.76mmol)的N-羟基琥珀酰亚胺在 30ml二甲基亚砜中的溶液中加入356μL(2.30mmol)的二异丙基碳二 亚胺。16小时后，加入得自实施例20的1.50g(2.30mmol)的6-NH2-HA TBA盐，并继续搅拌5小时。然后加入3.0ml的饱和NaCl溶液，并继 续搅拌30分钟。在搅拌下将混合物倾入到120ml EtOH中，得到的浆 料搅拌10分钟，然后过滤并用EtOH洗涤，将固体悬浮在100ml二甲 基甲酰胺中，成淤浆30分钟，过滤并用二甲基甲酰胺洗涤一次，并用 MeOH洗涤两次，在过滤器上干燥后，将固体溶解在100ml水中并用水 渗析，然后将溶液过滤通过0.22μ孔径大小的膜并冷冻干燥，得到 1.01g的白色固体。CPT形式的DS通过质子NMR测定为：25％摩尔/ 摩尔。CPT形式的DS通过HPLC测定为：13％w/w。
实施例39.HA-6-NHCO(CH2)2-CO-20-O-CPT钠盐。
在氮气下，在室温和搅拌下，向得自实施例34的1.03g(2.30mmol) 的CPT-20-O-半琥珀酸酯和400mg(3.48mmol)的N-羟基琥珀酰亚胺在 30ml二甲基亚砜中的溶液中加入356μL(2.30mmol)的二异丙基碳二 亚胺。16小时后，加入得自实施例21的1.50g(2.30mmol)的6-NH2-HA TBA盐，并继续搅拌5小时，然后加入3.0ml的饱和NaCl溶液，并继 续搅拌30分钟。在搅拌下将混合物倾入到120ml EtOH中，得到的浆 料搅拌10分钟，然后过滤并用EtOH洗涤，将固体悬浮在100ml二甲 基甲酰胺中，成淤浆30分钟，过滤并用二甲基甲酰胺洗涤一次，并用 MeOH洗涤两次，在过滤器上干燥后，将固体溶解在100ml水中并用水 渗析，然后将溶液过滤通过0.22μ孔径大小的膜并冷冻干燥，得到 0.99g的白色固体。CPT形式的DS通过质子NMR测定为：12％摩尔/ 摩尔。CPT形式的DS通过HPLC测定为：7％w/w。
或者，从得自实施例26的1.00g的6-NH2-HA TBA盐开始，获得 653mg的白色固体(CPT形式的DS为：12％摩尔/摩尔，通过1H NMR测 定)。
实施例40.HA-6-NHCO(CH2)2-CO-20-O-CPT钠盐。
在氮气下，在室温和搅拌下，向得自实施例34的1.03g(2.30mmol) 的CPT-20-O-半琥珀酸酯和400mg(3.48mmol)的N-羟基琥珀酰亚胺在 30ml二甲基亚砜中的溶液中加入356μL(2.30mmol)的二异丙基碳二 亚胺。16小时后，加入得自实施例16的1.50g(2.30mmol)的6-NH2-HA TBA盐，并继续搅拌6小时。然后加入3.0ml的饱和NaCl溶液，并继 续搅拌30分钟。在搅拌下将混合物倾入到120ml EtOH中，得到的浆 料搅拌10分钟，然后过滤并用EtOH洗涤，将固体悬浮在100ml二甲 基甲酰胺中，成淤浆30分钟，过滤并用二甲基甲酰胺洗涤一次，并用 MeOH洗涤两次。在过滤器上干燥后，将固体溶解在100ml水中并用水 渗析，然后将溶液过滤通过0.22μ孔径大小的膜并冷冻干燥，得到 1.26g的白色固体。CPT形式的DS通过质子NMR测定为：33％摩尔/ 摩尔。
实施例41.HA-6-NHCO(CH2)2-CO-20-O-CPT钠盐。
在氮气下，在室温和搅拌下，向得自实施例34的867mg(1.94mmol) 的CPT-20-O-半琥珀酸酯和334mg(2.90mmol)的N-羟基琥珀酰亚胺在 30ml二甲基亚砜中的溶液中加入300μL(1.94mmol)的二异丙基碳二 亚胺。16小时后，加入得自实施例22的1.50g(2.30mmol)的6-NH2-HA TBA盐，并继续搅拌6小时。然后加入3.0ml的饱和NaCl溶液，并继 续搅拌30分钟。在搅拌下将混合物倾入到120ml EtOH中，得到的浆 料搅拌10分钟，然后过滤并用EtOH洗涤。将固体悬浮在100ml二甲 基甲酰胺中，成淤浆30分钟，过滤并用二甲基甲酰胺洗涤一次，并用 MeOH洗涤两次。在过滤器上干燥后，将固体溶解在100ml水中并用水 渗析。然后将溶液过滤通过0.22μ孔径大小的膜并冷冻干燥，得到 0.96g的白色固体。CPT形式的DS通过质子NMR测定为：3.5％摩尔/ 摩尔。CPT形式的DS通过HPLC测定为：2％w/w。
或者，从得自实施例29的1.00g的6-NH2-HA TBA盐开始，获得 640mg的白色固体(CPT形式的DS为：6％摩尔/摩尔，通过1H NMR测 定)。
实施例42.HA-6-NHCO(CH2)2-COOH钠盐。
将得自实施例19的1.50g(2.30mmol)的6-NH2-HA TBA盐在30ml 的二甲基亚砜中的溶液中加入481μL(3.45mmol)的三乙胺和345mg (3.45mmol)的琥珀酸酐。在室温下搅拌过夜后，加入3.0ml的饱和NaCl 溶液并继续搅拌30分钟。在搅拌下将混合物倾入到150ml EtOH中， 得到的淤浆搅拌10分钟，然后过滤并用EtOH、含10％水的EtOH、二 甲基甲酰胺和最后经甲醇洗涤。将固体溶解在100ml的0.1N NaOH溶 液中，在5分钟后，用3N HCl溶液调节pH为8。将溶液超滤，过滤 通过0.22μ孔径大小的膜并冷冻干燥，得到922mg的白色固体。
半琥珀酸酯形式的DS通过质子NMR测定为：20％摩尔/摩尔。
实施例43.CPT-20-O-CO-CH2-NHBoc。
向3.00g(17.1mmol)的Boc-Gly-OH和1.40g(11.4mmol)的4- 二甲基氨基吡啶在100ml二氯甲烷中的溶液中加入2.68ml(17.1mmol) 的二异丙基碳二亚胺和2.00g(5.75mmol)的CPT。在室温下搅拌过夜 后，得到的悬浮液用50ml二氯甲烷稀释，用0.1N HCl溶液洗涤，用 无水硫酸钠干燥，过滤并蒸发。残余物用最小量的甲醇结晶，过滤， 用甲醇洗涤并干燥，得到2.24g(78％)的白色固体。
实施例44.CPT-20-O-CO-CH2-NH2·TFA。
将得自实施例43的1.50g(2.97mmol)的CPT-20-O-CO-CH2-NHBoc 溶解在三氟乙酸在二氯甲烷中的100ml的40％溶液中。1小时后，在旋 转蒸发器中除去溶剂，残余物用二乙醚结晶，过滤，用二乙醚洗涤并 干燥，得到1.50g(0.289mmol，97％)的浅黄色固体。
实施例45.CPT-20-O-CO-CH2-NHCO-(CH2)2-COOH。
在氮气下，在室温下，向174mg(17.3mmol)的琥珀酸酐、0.50ml (2.9mmol)的DIEA和4mg(0.03mmol)的DMAP在50ml二氯甲烷中的溶 液中加入得自实施例44的750mg(1.44mmol)的 CPT-20-O-CO-CH2-NH2·TFA。18小时后，溶液用25ml二氯甲烷稀释， 用0.1N HCl溶液洗涤，用饱和NaHCO3溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥， 过滤并蒸发。残余物用最小量的甲醇结晶，过滤，用甲醇洗涤并干燥， 得到655mg(1.30mmol，90％)的白色固体。
实施例46.HA-6-NHCO-(CH2)2-CONH-Gly-20-O-CPT。
在氮气下，在室温和搅拌下，向得自实施例45的250mg (0.495mmol)的CPT-20-O-CO-CH2-NHCO-(CH2)2-COOH和86mg(0.75mmol) 的N-羟基琥珀酰亚胺在10ml二甲基亚砜中的溶液中加入77μL (0.50mmol)的二异丙基碳二亚胺。16小时后，加入得自实施例33的 310mg(0.50mmol)的6-NH2-HA TBA盐，并继续搅拌5小时。然后加入 1.0ml的饱和NaCl溶液，并继续搅拌30分钟。在搅拌下将混合物倾 入到40ml EtOH中，得到的淤浆搅拌10分钟，然后过滤并用EtOH洗 涤。将固体悬浮在30ml二甲基甲酰胺中，成淤浆30分钟，过滤并用 二甲基甲酰胺洗涤一次，并用MeOH洗涤两次，在过滤器上干燥后，将 固体溶解在40ml水中并用水渗析，然后将溶液过滤通过0.22μ孔径 大小膜并冷冻干燥，得到0.22g(100％)的白色固体。
CPT形式的DS通过质子NMR测定为：2％摩尔/摩尔，CPT形式的 DS通过HPLC测定为：1.5％w/w。
或者，从得自实施例28的100mg的6-NH2-HA TBA盐开始，获得 60mg的白色固体(CPT形式的DS为：6％摩尔/摩尔，通过1H NMR测定)。
实施例47.CPT-20-O-CO-(CH2)2-CONH-Gly-OH。
向得自实施例34的800mg(1.79mmol)的CPT-20-O-半琥珀酸酯、 549μL(3.94mmol)的三乙胺和343mg(1.79mmol)的EDC盐酸盐在80ml 二氯甲烷中的溶液中加入330mg(1.96mmol)的Gly-O-tert-Bu盐酸 盐。在室温下搅拌过夜后，溶液用0.1N HCl溶液洗涤，用无水硫酸钠 干燥，过滤并在旋转蒸发器中蒸发。残余物用最小量的甲醇结晶，过 滤，用甲醇洗涤并干燥，得到白色固体。将该固体溶解在包含5％v/v 水的25ml TFA中。1.5小时后，在旋转蒸发器中除去溶剂，残余物用 甲醇结晶。过滤，用甲醇洗涤并干燥，得到601mg(1.19mmol，66％) 的米白色固体。
实施例48.CPT-20-O-CO-(CH2)2-CONH-Gly-NH-6-HA。
在氮气下，在室温和搅拌下，向得自实施例47的250mg (0.495mmol)的CPT-20-O-CO-(CH2)2-CONH-Gly-OH和114mg (0.99mmol)的N-羟基琥珀酰亚胺在7ml二甲基亚砜中的溶液中加入 77μL(0.50mmol)的二异丙基碳二亚胺。16小时后，加入得自实施例 19的250mg(0.403mmol)的6-NH2-HA TBA盐，继续搅拌5小时。然后 加入0.7ml的饱和NaCl溶液并继续搅拌30分钟。在搅拌下将混合物 倾入到30ml EtOH中，得到的浆料搅拌10分钟，然后过滤并用EtOH 洗涤。将固体悬浮在25ml二甲基甲酰胺中，成淤浆30分钟，过滤并 用二甲基甲酰胺洗涤一次，并用MeOH洗涤两次。在过滤器上干燥后， 将固体溶解在30ml水中并用水渗析。然后将溶液过滤通过0.22μ孔 径大小膜并冷冻干燥，得到120mg的白色固体。
CPT形式的DS通过质子NMR测定为：20％摩尔/摩尔。CPT形式的 DS通过HPLC测定为：14.0％w/w。
或者，从得自实施例28的100mg的6-NH2-HA TBA盐开始，获得 63mg的白色固体(CPT形式的DS通过1H NMR测定为：6％摩尔/摩尔； CPT形式的DS通过HPLC测定为：4.82％w/w)。
实施例49.紫杉醇-2’-半琥珀酸酯。
将300mg(0.351mmol)的紫杉醇、42.2mg(0.422mmol)的琥珀酸 酐和9mg(0.07mmol)的DMAP在10ml无水吡啶中的溶液在室温下搅拌 3小时。在旋转蒸发器中除去溶剂，残余物用最小量的二氯甲烷溶解 并装载到硅胶柱上。用含甲醇的乙酸乙酯(从0％到100％)洗脱，得到 334mg(100％)的纯的紫杉醇-2′-半琥珀酸酯。
实施例50.HA-6-NHCO-(CH2)2-CO-2’-O-TXL。
在氮气下，在室温和搅拌下，向得自实施例49的334mg (0.351mmol)的紫杉醇-2′-半琥珀酸酯和115mg(1.00mmol)的N-羟基 琥珀酰亚胺在10ml二甲基亚砜中的溶液中加入62μL(0.35mmol)的二 异丙基碳二亚胺。16小时后，加入得自实施例23的217mg(0.35mmol) 的6-NH2-HA TBA盐，并继续搅拌7小时。然后加入0.7ml的饱和NaCl 溶液并继续搅拌30分钟。在搅拌下将混合物倾入到40ml EtOH中，得 到的浆料搅拌10分钟，然后过滤，并用EtOH和MeOH洗涤，将固体溶 解在25ml水中并用水渗析，然后将溶液过滤通过0.22μ孔径大小的 膜并冷冻干燥，得到130mg的白色固体。TXL形式的DS通过质子NMR 测定为：2％摩尔/摩尔。
或者，从得自实施例28的100mg的6-NH2-HA TBA盐开始，获得 62mg的白色固体(TXL形式的DS为：5％摩尔/摩尔，通过1H NMR测定)。
实施例51.HA-6-NH-MTX。
在氮气下，在室温和搅拌下，向330mg(0.726mmol)的甲氨蝶呤 和56mg(0.484mmol)的N-羟基琥珀酰亚胺在6ml二甲基亚砜中的溶液 中加入75μL(0.484mmol)的二异丙基碳二亚胺。16小时后，加入得 自实施例21的300mg(0.484mmol)的6-NH2-HA TBA盐，并继续搅拌 4.5小时。然后加入1.0ml的饱和NaCl溶液并继续搅拌30分钟。在 搅拌下将混合物倾入到30ml EtOH中，得到的浆料搅拌10分钟，然后 过滤，并用EtOH和3×DMF洗涤。将固体溶解在20ml水中并用水渗析。 然后将溶液过滤通过0.22μ孔径大小的膜并冷冻干燥，得到202mg的 黄色固体。MTX形式的DS通过质子NMR测定为：13％摩尔/摩尔。
或者，从得自实施例25的1.00g的6-NH2-HA TBA盐开始，获得 706mg的黄色固体(MTX形式的DS为：20％摩尔/摩尔，通过1H NMR测 定)。
实施例52.HA-6-NH-布洛芬。
在氮气下，在室温和搅拌下，向110mg(0.532mmol)的布洛芬和 61mg(0.532mmol)的N-羟基琥珀酰亚胺在6ml二甲基亚砜中的溶液中 加入75μL(0.484mmol)的二异丙基碳二亚胺。16小时后，加入得自 实施例21的300mg(0.484mmol)的6-NH2-HA TBA盐，并继续搅拌4.5 小时。然后加入1.0ml的饱和NaCl溶液并继续搅拌30分钟。在搅拌 下将混合物倾入到30ml EtOH中，得到的浆料搅拌10分钟，然后过滤， 并用EtOH和3×DMF洗涤。将固体溶解在20ml水中并用水渗析。然后 将溶液过滤通过0.22μ孔径大小的膜并冷冻干燥，得到180mg的白色 固体。布洛芬形式的DS通过质子NMR测定为：13％摩尔/摩尔。
或者，从得自实施例25的1.00g的6-NH2-HA TBA盐开始，获得 690mg的白色固体(布洛芬形式的DS为：20％摩尔/摩尔，通过1H NMR 测定)。
实施例53.6-NH2-HA钠盐的制备。
在适合加压反应的反应器中，将得自实施例8的5.0g的6-Cl-HA 溶解在100ml浓NH4OH溶液中。将反应器密封并将溶液在80℃加热22 小时，然后将其冷却并真空除去过量的氨。溶液用10ml饱和氯化钠处 理并搅拌30分钟。然后对其进行超滤和冷冻干燥，得到3.35g的 6-NH2-HA钠盐，为米白色固体(DS 20％摩尔/摩尔，通过测定13C NMR)。
实施例54.HA-6-NH-(4-甲酰基-苯甲酰基)。
向600mg(4.00mmol)的4-羧基-苯甲醛、506mg(4.40mmol)的N-羟 基琥珀酰亚胺和0.67ml(4.8mmol)的三乙胺在30mlDCM中的溶液中加 入767mg(4.00mmol)的EDC盐酸盐。在室温下搅拌4小时后，溶液用 0.1N HCl溶液洗涤两次，用水洗涤两次。然后用无水硫酸钠干燥并蒸 干，得到840mg(90％)的白色固体。将50mg的该固体溶解在0.60ml 的DMF中并被加入到得自实施例53的100mg的6-NH2-HA钠盐在5ml 磷酸盐缓冲液(pH＝7.2)中的溶液中。在室温下搅拌3小时后，得到的 悬浮液用水稀释到15ml，离心以除去固体，用水渗析并冷冻干燥，得 到92mg的白色固体。
4-甲酰基-苯甲酰基形式的DS通过质子NMR测定为：12％摩尔/ 摩尔。
实施例55.HA-6-NH-(4-戊基氨基甲基-苯甲酰基)。
向得自实施例54的82mg(0.205mmol)的HA-6-NH-(4-甲酰基-苯 甲酰基)在3.7ml的0.2M NaHCO3溶液的溶液中加入24μL(0.205mmol) 的戊胺和13mg(0.205mmol)的氰基硼氢化钠。在室温下搅拌过夜后， 悬浮液用水稀释到11ml，离心以除去固体，用水渗析并冷冻干燥，得 到75mg的白色固体。芳基形式的DS通过质子NMR测定为：6％摩尔/ 摩尔。
实施例56.HA-6-NH-Ac。
向得自实施例19的80mg(0.129mmol)的6-NH2-HA TBA盐在10ml 乙酸酐中的悬浮液中加入二甲基甲酰胺(10ml)以获得溶液，该溶液在 室温下搅拌16小时。然后加入0.5ml饱和NaCl溶液。搅拌30分钟后， 将混合物倾入到EtOH上并过滤。将固体溶解在10m l的0.1N NaOH溶 液中。10分钟后，将溶液中和，超滤和冷冻干燥，得到45mg的白色 固体(乙酰基形式的DS为20％，通过1H NMR测定)。
或者，从得自实施例26的200mg的6-NH2-HA TBA盐开始，获得 124mg的白色固体(乙酰基形式的DS为：12％摩尔/摩尔，通过1H NMR 测定)。
实施例57.HA-6-NH-α-吡啶甲酰基(picolinoyl)。
在氮气下，向57mg(0.46mmol)的甲酸吡啶在12mlDMSO中的溶液 中加入80mg(0.70mmol)的NHS和71μL(0.46mmol)的二异丙基碳二 亚胺。在室温下搅拌18小时后，加入得自实施例21的300mg(0.46mmol) 的6-NH2-HA TBA盐，并继续搅拌6小时。然后加入1.5ml的饱和NaCl 溶液并继续搅拌30分钟。将混合物倾入到25ml EtOH中然后过滤。固 体用Et OH洗涤，然后被溶解在20ml的0.1N NaOH溶液中。在搅拌10 分钟后，溶液用0.1N HCl溶液中和，超滤并冷冻干燥，得到180mg 的白色固体(α-吡啶甲酰基形式的DS为13％，通过1H NMR测定)。
或者，从得自实施例26的200mg的6-NH2-HA TBA盐开始，获得 117mg的白色固体(α-吡啶甲酰基形式的DS为：12％摩尔/摩尔，通过 1H NMR测定)。
实施例58.Cbz-Gly-6-HN-HA。
在氮气下，在室温和搅拌下，向67mg(0.323mmol)的Cbz-Gly-OH 和56mg(0.484mmol)的N-羟基琥珀酰亚胺在4ml二甲基亚砜的溶液中 加入50μL(0.323mmol)的二异丙基碳二亚胺。16小时后，加入得自 实施例21的200mg(0.323mmol)的6-NH2-HA TBA盐，继续搅拌5小 时，然后加入0.40ml的饱和NaCl溶液并继续搅拌30分钟。在搅拌下 将混合物倾入到15ml EtOH中，得到的浆料搅拌10分钟，然后过滤， 并用EtOH洗涤。将固体溶解在15ml水中并用水渗析。然后将溶液过 滤通过0.22μ孔径大小的膜并冷冻干燥，得到137mg的白色固体。
Cbz-Gly形式的DS通过质子NMR测定为：13％摩尔/摩尔。
实施例59.H2N-Gly-6-HN-HA。
将得自实施例58的70mg的Cbz-Gly-6-HN-HA溶解在包含50mg 甲酸铵的1.5ml水中。通过几次真空/氮气循环吹扫之后，向溶液中加 入40mg的10％Pd/C(湿)，然后在室温下搅拌18小时。在用水稀释 到8ml后，混合物进行离心并弃去固体。得到的带黑色的溶液通过硅 藻土短柱，经过浓缩和冷冻干燥，得到55mg的米白色固体。
Gly形式的DS通过质子NMR测定为：13％摩尔/摩尔。
实施例60.HA-6-NHCO-Ph。
在氮气下，在室温和搅拌下，向得自实施例21的250mg (0.403mmol)的6-NH2-HA TBA盐和84μL(0.604mmol)的三乙胺在 7ml DMSO中的溶液中加入47μL(0.403mmol)的苯甲酰氯。3小时后， 溶液用1ml饱和NaCl溶液处理并继续搅拌30分钟。在搅拌下将混合 物倾入到20ml EtOH中，得到的浆料搅拌10分钟，然后过滤，并用 EtOH洗涤。将固体溶解在15ml水中并用水渗析。然后将溶液过滤通 过0.22μ孔径大小的膜并冷冻干燥，得到157mg的白色固体。Bz形式 的DS通过质子NMR测定为：6％摩尔/摩尔。
或者，从得自实施例26的200mg的6-NH2-HA TBA盐开始，获得 110mg的白色固体(Bz形式的DS为：12％摩尔/摩尔，通过1H NMR测 定)。
实施例61.HA-6-NHCO-(邻-氨基-苯基)。
在氮气下，在室温和搅拌下，向得自实施例17的250mg (0.403mmol)的6-NH2-HA TBA盐和84μL(0.604mmol)的三乙胺在 10ml DMSO中的溶液中加入66mg的靛红酸酐。18小时后，溶液用1ml 饱和NaCl溶液处理并继续搅拌30分钟。在搅拌下将混合物倾入到 20ml EtOH中，得到的浆料搅拌10分钟，然后过滤，并用EtOH洗涤。 将固体溶解在15ml的0.1N NaOH溶液中。在搅拌10分钟后，溶液用 1N HCl溶液中和并用水渗析。然后将溶液过滤通过0.22μ孔径大小的 膜并冷冻干燥，得到175mg的白色固体。
邻氨基苯甲酰基(antranoyl)形式的DS通过质子NMR测定为：40％ 摩尔/摩尔。
或者，从得自实施例25的200mg的6-NH2-HA TBA盐开始，获得 134mg的白色固体(邻氨基苯甲酰基(antranoyl)形式的DS为：20％摩 尔/摩尔，通过1H NMR测定)。
实施例62.HA-6-NHCO-nPr。
在氮气下，在室温和搅拌下，向37μL(0.403mmol)的丁酸和70mg (0.604mmol)的N-羟基琥珀酰亚胺在2ml二甲基亚砜中的溶液中加入 62μL(0.403mmol)的二异丙基碳二亚胺。3小时后，加入得自实施例 20的250mg(0.403mmol)的6-NH2-HA TBA盐，并继续搅拌16小时。 然后加入1.0ml的饱和NaCl溶液并继续搅拌30分钟。在搅拌下将混 合物倾入到15ml EtOH中，得到的浆料搅拌10分钟，然后过滤，并用 EtOH洗涤。将固体溶解在15ml的0.1N NaOH溶液中。在搅拌10分钟 后，溶液用1N HCl溶液中和并用水渗析，然后将溶液过滤通过0.22μ 孔径大小的膜并冷冻干燥，得到131mg的白色固体。
丁酰基形式的DS通过质子NMR测定为：25％摩尔/摩尔。
或者，从得自实施例25的200mg的6-NH2-HA TBA盐开始，获得 120mg的白色固体(丁酰基形式的DS为：20％摩尔/摩尔，通过1H NMR 测定)。
实施例63.HA-6-NH-(CO)-CH2-CH(NHCbz)-COOH。
在氮气下，在室温和搅拌下，向得自实施例21的300mg(0.46mmol) 的6-NH2-HA TBA盐在12mlDMSO中的溶液中加入128μL(0.92mmol)的 三乙胺、11mg(0.09mmol)的DMAP和137mg(0.55mmol)的N-苄氧羰 基(Carbobenziloxy)-L-天冬氨酸酐。16小时后，加入1.0ml的饱 和NaCl溶液并继续搅拌30分钟。然后将混合物倾入到25ml EtOH中 并过滤。将固体溶解在5ml的0.1N NaOH中。在10分钟后，溶液被中 和，超滤并冷冻干燥，得到110mg的白色固体(酰基形式的DS为13％， 通过1H NMR测定)。
实施例64.5α-胆甾烷-3β-醇半琥珀酸酯。
在氮气下，在0℃和搅拌下，向1.00g(2.5mmol)的5α-胆甾烷 -3β-醇在50ml二氯甲烷中的溶液中加入672mg(3.8mmol)的琥珀酸 单叔丁酯、235mg(1.9mmol)的DMAP和958mg(5.0mmol)的EDC盐酸 盐。在30分钟后，使混合物恢复到室温并搅拌1小时。然后溶液用 10％w/v柠檬酸溶液、饱和NaHCO3溶液和饱和NaCl溶液洗涤。然后用 无水硫酸钠干燥，过滤并蒸干。固体用20ml三氟乙酸和1ml水的混合 物处理，得到的溶液在室温下搅拌2小时，蒸干，得到830mg的白色 固体。
实施例65.HA-6-NH-CO-(CH2)2-CO-3β-O-5α-胆甾烷。
在氮气下，向252mg(0.46mmol)的5α-胆甾烷-3β-醇半琥珀酸 酯在12ml DMSO中的溶液中加入80mg(0.70mmol)的NHS和71μL (0.46mmol)的二异丙基碳二亚胺。在室温下搅拌18小时后，加入得自 实施例21的300mg(0.46mmol)的6-NH2-HA TBA盐并继续搅拌6小时。 然后加入1.5ml的饱和NaCl溶液并继续搅拌30分钟。将混合物倾入 到25ml EtOH中然后过滤。固体用EtOH洗涤，然后被溶解在20ml的 0.1N NaOH溶液中。在搅拌10分钟后，溶液用0.1N HCl溶液中和， 超滤并冷冻干燥，得到197mg的白色固体(酰基形式的DS为13％，通 过1H NMR测定)。
或者，从得自实施例28的200mg的6-NH2-HA TBA盐开始，获得 124mg的白色固体(酰基形式的DS为：6％摩尔/摩尔，通过1H NMR测 定)。
实施例66.HA-6-NH-(N-Cbz-脯氨酰基(prolinoyl))。
在氮气下，向114mg(0.46mmol)的N-Cbz-L-脯氨酸在12ml DMSO 中的溶液中加入80mg(0.70mmol)的NHS和71μL(0.46mmol)的二异 丙基碳二亚胺。在室温下搅拌18小时后，加入得自实施例21的 300mg(0.46mmol)的6-NH2-HA TBA盐，并继续搅拌6小时。然后加入 1.5ml的饱和NaCl溶液并继续搅拌30分钟。将混合物倾入到25ml EtOH 中然后过滤。固体用EtOH洗涤，然后被溶解在20ml的0.1N NaOH溶 液中。在搅拌10分钟后，溶液用0.1N HCl溶液中和，超滤并冷冻干 燥，得到182mg的白色固体(酰基形式的DS为13％，通过1H NMR测定)。
或者，从得自实施例26的200mg的6-NH2-HA TBA盐开始，获得 113mg的白色固体(酰基形式的DS为：11％摩尔/摩尔，通过1H NMR 测定)。
实施例67.HA-6-NH-(S)-CH(COOH)-(CH2)4-NH2。
在氮气下，在室温和搅拌下，向得自实施例14的250mg (0.403mmol)的HA-6-O-Ms在10ml DMSO中的溶液中加入69μL (0.403mmol)的DIEA和295mg(2.02mmol)的L-赖氨酸。将溶液加热 到70℃并搅拌18小时。然后将其冷却，倾入到水中，用稀HCl溶液 中和，用2ml的饱和NaCl溶液处理，超滤和冷冻干燥，得到140mg 的米白色固体(赖氨酸形式的DS为30％摩尔/摩尔，通过1H NMR 测定)。
实施例68.HA-6-O-CO-(CH2)2-NHCbz。
在氮气下，在室温和搅拌下，向得自实施例13的1.00g(1.40mmol) 的6-OMs-HA TBA盐和937mg(4.2mmol)的Cbz-β-Ala在25ml DMSO 中的溶液中加入236mg(0.70mmol)的无水碳酸铯。然后将混合物加热 到70℃并搅拌18小时。然后将其冷却并倾入到水(100ml)中。调节pH 在6.5-7之间，并加10ml的饱和NaCl溶液。溶液经过超滤和冷冻 干燥，得到550mg的白色固体。Cbz-β-Ala形式的DS通过质子NMR 测定为18％摩尔/摩尔。
实施例69.HA-6-O-CO-(CH2)2-NH2。
通过几次真空/氮气循环进行吹扫之后，向得自实施例68的100mg 的HA-6-O-CO-(CH2)2-NHCbz和120mg的甲酸铵在2ml水中的溶液中加 入20mg的10％Pd/C(湿)。将混合物搅拌18小时，然后将其离心并 过滤通过硅藻土短柱。在超滤和冷冻干燥之后，获得80mg的米白色固 体，质子NMR显示Cbz被完全除去。
实施例70.TFA·H2N-Phe-Gly-20-O-CPT。
在氮气下，在室温和搅拌下，向348mg(1.00mmol)的CPT在20ml DCM中的悬浮液中加入482mg(1.5mmol)的Boc-HN-Phe-Gly-OH、158mg (1.3mmol)的DMAP和309μL(2.0mmol)的DIPC。在16小时后，得到 的溶液用0.1N HCl溶液和饱和NaHCO3溶液洗涤，然后用无水硫酸钠 干燥，过滤并蒸干。固体残余物从甲醇/乙醚中重结晶，得到350mg 固体。将该固体溶解在TFA在DCM中的20ml的80％溶液中并在室温下 搅拌2小时。减压除去溶剂，并通过与小份二乙醚共蒸发除去痕量的 TFA，残余物从MeOH/二乙醚中结晶，获得320mg的固体。
实施例71.HOOC-(CH2)2CO-Phe-Gly-20-O-CPT。
在氮气下，在室温和搅拌下，向60mg(0.60mmol)的琥珀酸酐、 171μL(1.0mmol)的DIEA和12mg(0.1mmol)的DMAP在20ml DCM中的 溶液中加入得自实施例70的320mg(0.52mmol)的 TFA·H2N-Phe-Gly-20-O-CPT。在16小时后，溶液用20ml DCM稀释， 用0.1N HCl溶液洗涤和用无水硫酸钠干燥。在过滤和蒸发溶剂之后， 残余物从MeOH/二乙醚中结晶，获得150mg的浅黄色固体。
实施例72.HA-6-NH-CO-(CH2)2-CO-HN-Phe-Gly-20-O-CPT。
在氮气下，在室温和搅拌下，向得自实施例71的75mg(0.105mmol) 的HOOC-(CH2)2CO-Phe-Gly-20-O-CPT在1ml DMSO中的溶液中加入 18.2mg(0.158mmol)的NHS和16μL(0.105mmol)的DIPC。在16小时 后，加入得自实施例21的71mg(0.11mmol)的6-NH2-HA TBA盐并继 续搅拌6小时。然后加入0.15ml的饱和NaCl溶液，并将混合物搅拌 30分钟。然后在搅拌下加入6ml的EtOH并将混合物过滤，固体用DMF 和EtOH洗涤，然后被溶解在5ml水中并用水渗析。冷冻干燥，得到 45mg的白色固体。CPT形式的DS通过质子NMR测定为：13％摩尔/摩 尔。
或者，从得自实施例26的200mg的6-NH2-HA TBA盐开始，获得 128mg的白色固体(酰基形式的DS为：12％摩尔/摩尔，通过1H NMR 测定)。
实施例73.TFA·H2N-Phe-Leu-Gly-20-O-CPT。
在氮气下，在室温和搅拌下，向348mg(1.00mmol)的CPT在20ml DCM中的悬浮液中加入653mg(1.5mmol)的Boc-HN-Phe-Leu-Gly-OH、 158mg(1.3mmol)的DMAP和309μL(2.0mmol)的DIPC。在16小时后， 得到的溶液用0.1N HCl溶液和饱和NaHCO3溶液洗涤，然后用无水硫 酸钠干燥，过滤并蒸干。固体残余物从MeOH/二乙醚中重结晶，以获 得480mg的固体。将该固体溶解在TFA在DCM中的5ml的40％溶液中 并在室温下搅拌2小时。减压除去溶剂并通过与小份二乙醚共蒸发除 去痕量的TFA，获得492mg的固体残余物。
实施例74.HOOC-(CH2)2CO-Phe-Leu-Gly-20-O-CPT。
在氮气下，在室温和搅拌下，向得自实施例73的492mg(0.63mmol) 的TFA·H2N-Phe-Leu-Gly-20-O-CPT在10ml DMF中的溶液中加入 109mg(0.63mmol)的琥珀酸单叔丁酯、85mg(0.63mmol)的HOBt、216μL (1.26mmol)的DIEA和146mg(0.76mmol)的EDC盐酸盐。然后将反应 混合物过夜达到室温。减压除去溶剂，残余物在EtOAc和水之间分配。 水相用EtOAc提取。合并的有机相用10％枸橼酸、饱和NaHCO3溶液和 盐水洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，过滤并蒸发。将残余物溶解在TFA 在DCM中的5ml的40％溶液中。2小时后，减压除去它们并通过与小份 二乙醚共蒸发除去痕量的TFA，获得490mg的固体。
实施例75.HA-6-NH-CO-(CH2)2-CO-HN-Phe-Leu-Gly-20-O-CPT。
在氮气下，在室温和搅拌下，向得自实施例74的490mg(0.63mmol) 的HOOC-(CH2)2CO-Phe-Leu-Gly-20-O-CPT在20ml DMSO中的溶液中 加入108mg(0.90mmol)的NHS、154μL(0.90mmo l)的DIEA和132mg (0.70mmol)的EDC盐酸盐。在16小时后，加入得自实施例21的390mg (0.63mmol)的6-NH2-HA TBA盐并继续搅拌6小时。然后加入2ml的饱 和NaCl溶液并将混合物搅拌30分钟。然后在搅拌下加入80ml的EtOH， 并将混合物过滤。固体用DMF和EtOH洗涤，然后溶解在15ml水中并 用水渗析。冷冻干燥，得到194mg的白色固体。CPT形式的DS通过质 子NMR测定为13％摩尔/摩尔。
或者，从得自实施例26的300mg的6-NH2-HA TBA盐开始，获得 222mg的白色固体(酰基形式的DS为：12％摩尔/摩尔，通过1H NMR 测定)。
实施例76.CPT-20-O-CO-(CH2)2-CO-HN-Gly-Phe-6-HN-HA。
在氮气下，在搅拌下，向280mg(1.0mmol)的 TFA·H2N-Gly-Phe-OtBu在20ml DMF中的溶液中加入得自实施例34 的450mg(1.0mmol)的CPT半琥珀酸酯、135mg(1.0mmol)的HOBt、 342μL(2.0mmol)的DIEA和230mg(1.2mmol)的EDC盐酸盐。然后将 反应混合物过夜达到室温。减压除去溶剂，并将残余物在EtOAc和水 之间分配，水相用EtOAc提取。合并的有机相用10％枸橼酸、饱和NaHCO3 溶液和盐水洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，过滤并蒸干。将残余物溶 解在TFA在DCM中的8ml的40％溶液中。在2小时后，减压除去溶剂 并通过与小份二乙醚共蒸发以除去痕量的三氟乙酸，获得固体。在氮 气下，在室温和搅拌下，向溶解在20ml DMSO中的该固体中加入172mg (1.5mmol)的NHS、171μL(0.90mmol)的DIEA和154μL(1.0mmol)的 DIPC。在16小时后，加入得自实施例19的620mg(0.63mmol)的 6-NH2-HA TBA盐并继续搅拌6小时。然后加入2ml的饱和NaCl溶液并 将混合物搅拌30分钟。然后在搅拌下加入100ml的EtOH并将混合物 过滤。固体用DMF和EtOH洗涤，然后溶解在20ml水中并用水渗析。 冷冻干燥，得到406mg的白色固体，CPT形式的DS通过质子NMR测定 为：20％摩尔/摩尔。
或者，从得自实施例26的300mg的6-NH2-HA TBA盐开始，获得 205mg的白色固体(酰基形式的DS为：12％摩尔/摩尔，通过1H NMR 测定)。
实施例77：抗增殖活性
在三个癌系(对CPT敏感的HT29：结肠直肠癌，H460：肺癌，H460M2： 肺转移癌)上测定DDS的抗增殖活性。将细胞在96孔板中、在补充有 以下成分的完全RPMI1640培养基(Sigma Chemical Co.)中在37℃下 在受控气氛(5％CO2)中与伊立替康和实施例38、39、41中的DDS进 行温孵：10％FBS(Hyclone Europe)、2mM L-谷氨酰胺(Hyclone Europe)和100U/ml青霉素G和100ug/ml链霉素(Sigma Chemical Co.)；在与参考剂量(在3-30nM和0.1-30μM的范围内)等摩尔 的剂量下检测DDS。
在第6天(治疗5天后)通过MTT试验测定细胞毒性，测量在蓝 色甲暨中通过线粒体脱氢酶向MTT四唑盐转化的细胞代谢能力来测量 细胞存活力，用分光光度计在570nm处读蓝色。试验了以下的DDS。
实施例 取代％ 实施例41 2％ 实施例39 7％ 实施例38 13％
本发明的DDS对各种肿瘤细胞的抗肿瘤作用如表A所报道；将这 些DDS的作用与伊立替康的作用进行比较。该参考物是目前用于治疗 中的CPT类似物；CPT不溶于含水溶液中，因此其不能用于治疗，并 且由于这两个原因，其不是适当的参考物。
表A显示了DDS和伊立替康将各种肿瘤系的细胞生长降低到对照 生长的50％时所必需的浓度值(IC50，μM)。
表A
细胞系 伊立替康 实施例41 实施例39 实施例38 HT29 (结肠直肠癌) 250.00 29.33 29.02 37.85 H460 (肺癌) 440.00 14.11 9.52 32.33 H460-M2 (肺转移癌) 460.00 23.30 33.11 47.50
这些数据显示本发明的DDS具有非常高的抗增殖活性。6-NH2-HA 和HA-6-NH-琥珀酸酯，作为制备最终DDS中所用的中间体化合物，也 在相同条件下进行了试验，并且该试验显示它们无细胞毒性。
实施例78：HA-6-NH-萘普生。
在氮气下，在室温和搅拌下，向93mg(0.403mmol)的萘普生和70mg (0.604mmol)的N-羟基琥珀酰亚胺在2ml二甲基亚砜中的溶液中加入 62μL(0.403mmol)的二异丙基碳二亚胺。在3小时后，加入得自实施 例19的250mg(0.403mmol)的HA-6-NH2TBA盐并继续搅拌16小时。 然后加入1.0ml的饱和NaCl溶液并继续搅拌30分钟。在搅拌下将混 合物倾入到15ml EtOH中，得到的浆料搅拌10分钟，然后过滤并用 EtOH洗涤。将固体溶解在15ml的0.1N NaOH溶液中。在搅拌10分钟 后，溶液用1N HCl溶液中和并用水渗析。然后将溶液过滤通过0.22μ 孔径大小的膜并冷冻干燥，得到128mg的白色固体。萘普生形式的DS 通过质子NMR测定为：20％摩尔/摩尔。
或者，从得自实施例26的200mg的HA-6-NH2TBA盐开始，获得 125mg的白色固体(萘普生形式的DS为：13％摩尔/摩尔，通过1H NMR 测定)。
实施例79：HA-6-NH-赖诺普利。
在氮气下，在室温和搅拌下，向178mg(0.403mmol)的赖诺普利 和70mg(0.604mmol)的N-羟基琥珀酰亚胺在2ml二甲基亚砜中的溶液 中加入62μL(0.403mmol)的二异丙基碳二亚胺。在3小时后，加入如 在实施例19中制得的250mg(0.403mmol)的HA-6-NH2TBA盐并继续搅 拌16小时。然后加入1.0ml的饱和NaCl溶液并继续搅拌30分钟。在 搅拌下将混合物倾入到15ml EtOH中，得到的浆料搅拌10分钟，然后 过滤并用EtOH洗涤。将固体溶解在15m l的0.1N NaOH溶液中。搅拌 10分钟后，溶液用1N HCl溶液中和并用水渗析。然后将溶液过滤通 过0.22μ孔径大小的膜并冷冻干燥，得到140mg的白色固体。赖诺普 利形式的DS通过质子NMR测定为：18％摩尔/摩尔。
或者，从如在实施例26中制得的200mg的HA-6-NH2TBA盐开始， 获得136的白色固体(赖诺普利形式的DS为：13％摩尔/摩尔，通过1H NMR测定)。
实施例80：HA-6-NH-萘啶酸化物。
在氮气下，在室温和搅拌下，向94mg(0.403mmol)的萘啶酸和70mg (0.604mmol)的N-羟基琥珀酰亚胺在2ml二甲基亚砜中的溶液中加入 62μL(0.403mmol)的二异丙基碳二亚胺。在3小时后，加入如在实施 例19中制得的250mg(0.403mmol)的HA-6-NH2TBA盐并继续搅拌16 小时。然后加入1.0ml的饱和NaCl溶液并继续搅拌30分钟。在搅拌 下将混合物倾入到15ml EtOH中，得到的浆料搅拌10分钟，然后过滤 并用EtOH洗涤。将固体溶解在15ml的0.1N NaOH溶液中。搅拌10 分钟后，溶液用1N HCl溶液中和并用水渗析。然后将溶液过滤通过 0.22μ孔径大小的膜并冷冻干燥，得到132mg的白色固体，萘啶酸化 物形式的DS通过质子NMR测定为：19％摩尔/摩尔。
或者，从如在实施例26中制得的200mg的HA-6-NH2TBA盐开始， 获得127mg的白色固体(萘啶酸化物形式的DS为：12％摩尔/摩尔，通 过1H NMR测定)。
实施例81：HA-6-NH-青霉素G。
在氮气下，在室温和搅拌下，向144mg(0.403mmol)的青霉素G 钠盐和70mg(0.604mmol)的N-羟基琥珀酰亚胺在2ml二甲基亚砜中的 溶液中加入62μL(0.403mmol)的二异丙基碳二亚胺，在3小时后，加 入如在实施例19中制得的250mg(0.403mmol)的HA-6-NH2TBA盐并继 续搅拌16小时。然后加入1.0ml的饱和NaCl溶液并继续搅拌30分钟。 在搅拌下将混合物倾入到15ml EtOH中，得到的浆料搅拌10分钟，然 后过滤并用EtOH洗涤。将固体溶解在15ml的0.1N NaOH溶液中。搅 拌10分钟后，溶液用1N HCl溶液中和并用水渗析。然后将溶液过滤 通过0.22μ孔径大小的膜并冷冻干燥，得到126mg的白色固体，青霉 素G形式的DS通过质子NMR测定为：16％摩尔/摩尔。
或者，从如在实施例26中制得的200mg的HA-6-NH2TBA盐开始， 获得119mg的白色固体(青霉素G形式的DS为11％摩尔/摩尔，通过 1H NMR测定)。
实施例82：HA-6-NH-头孢唑林。
在氮气下，在室温和搅拌下，向192mg(0.403mmol)的头孢唑林 钠盐和70mg(0.604mmol)的N-羟基琥珀酰亚胺在2ml二甲基亚砜中的 溶液中加入62μL(0.403mmol)的二异丙基碳二亚胺。在3小时后，加 入如在实施例19中制得的250mg(0.403mmol)的HA-6-NH2TBA盐并继 续搅拌16小时。然后加入1.0ml的饱和NaCl溶液并继续搅拌30分钟， 在搅拌下将混合物倾入到15ml EtOH中，得到的浆料搅拌10分钟。然 后过滤并用EtOH洗涤。将固体溶解在15ml的0.1N NaOH溶液中。搅 拌10分钟后，溶液用1N HCl溶液中和并用水渗析。然后将溶液过滤 通过0.22μ孔径大小的膜并冷冻干燥，得到129mg的白色固体。头孢 唑林形式的DS通过质子NMR测定为：17％摩尔/摩尔。
或者，从如在实施例26中制得的200mg的HA-6-NH2TBA盐开始， 获得121mg的白色固体(头孢唑林的DS为：10％摩尔/摩尔，通过1H NMR 测定)。
实施例83：HA-6-NH-Phe-Leu-Gly-Cbz。
在氮气下，在室温和搅拌下，向152mg(0.323mmol)的 Cbz-Gly-Leu-Phe-OH和56mg(0.484mmol)的N-羟基琥珀酰亚胺在4mL 二甲基亚砜中的溶液中加入50μL(0.323mmol)的二异丙基碳二亚胺。 在16小时后，加入得自实施例21的200mg(0.323mmol)的6-NH2-HA TBA盐并继续搅拌5小时。然后加入0.40ml的饱和NaCl溶液并继续 搅拌30分钟。在搅拌下将混合物倾入到15ml EtOH中，得到的浆料搅 拌10分钟，然后过滤并用EtOH洗涤。将固体溶解在15ml水中并用水 渗析。然后将溶液过滤通过0.22μ孔径大小的膜并冷冻干燥，得到145 毫克的白色固体。Phe-Leu-Gly-Cbz形式的DS通过质子NMR测定为： 13％摩尔/摩尔。
实施例84.HA-6-NH-Phe-Leu-Gly-NH2。
将得自实施例83的140mg(0.304mmol)的 HA-6-HN-Phe-Leu-Gly-Cbz溶解在包含100mg(1.6mmol)甲酸铵的3mL 水中。通过几次真空/氮气循环进行吹扫后，向溶液中加入80mg的10％ Pd/C(湿)，然后在室温下搅拌18小时。用水稀释到16mL后，将混合 物离心并弃去固体。得到的带黑色的溶液通过硅藻土短柱，经过浓缩 和冷冻干燥，得到113mg的米白色固体，通过在用TBA活化的安珀莱 特上进行离子交换被转化为相应的TBA盐。Phe-Leu-Gly形式的DS通 过质子NMR测定为：13％摩尔/摩尔。
实施例85.HA-6-NH-Phe-Leu-Gly-NH-MTX-OH。
在氮气下，在室温和搅拌下，向100mg(0.220mmol)的MTX和38mg (0.330mmol)的NHS在5mL无水DMSO中的溶液中加入35μL(0.220 mmol)的二异丙基碳二亚胺。在16小时后，加入得自实施例84的150 mg(0.226mmol)的HA-6-NH-Phe-Leu-Gly-NH2TBA盐并继续搅拌5小 时。然后加入0.50ml的饱和NaCl溶液并继续搅拌30分钟。在搅拌下 将混合物倾入到20ml EtOH中，得到的浆料搅拌10分钟，然后过滤并 用EtOH洗涤。将固体溶解在15ml水中并用水渗析。然后将溶液过滤 通过0.22μ孔径大小的膜并冷冻干燥，得到110毫克的带黄色的固体， MTX形式的DS通过质子NMR测定为：13％摩尔/摩尔。
实施例86：HA-6-NH-Phe-Gly-Cbz。
在氮气下，在室温和搅拌下，向114mg(0.323mmol)的Cbz-Gly- Phe-OH和56mg(0.484mmol)的N-羟基琥珀酰亚胺在4mL二甲基亚砜 中的溶液中加入50μL(0.323mmol)的二异丙基碳二亚胺。在16小时 后，加入得自实施例21的200mg(0.323mmol)的6-NH2-HA TBA盐并 继续搅拌5小时。然后加入0.40ml的饱和NaCl溶液并继续搅拌30 分钟。在搅拌下将混合物倾入到15ml EtOH中，得到的浆料搅拌10 分钟，然后过滤并用EtOH洗涤，将固体溶解在15ml水中并用水渗析， 然后将溶液过滤通过0.22μ孔径大小的膜并冷冻干燥，得到135毫克 的白色固体，Phe-Gly-Cbz形式的DS通过质子NMR测定为：13％摩尔 /摩尔。
实施例87：HA-6-NH-Phe-Gly-NH2。
将得自实施例86的130mg(0.30mmol)的HA-6-HN-Phe-Gly-Cbz 溶解在包含95mg(1.5mmol)甲酸铵的3mL水中。通过几次真空/氮气 循环进行吹扫后，向溶液中加入80mg的10％Pd/C(湿)，然后在室温 下搅拌18小时。用水稀释到16mL后，将混合物离心并弃去固体。得 到的带黑色的溶液通过硅藻土短柱，经过浓缩和冷冻干燥，得到115mg 的米白色固体，通过在用TBA活化的安珀莱特上进行离子交换被转化 为相应的TBA盐。Phe-Gly形式的DS通过质子NMR测定为：13％摩尔 /摩尔。
实施例88：HA-6-NH-Phe-Gly-NH-MTX-OH。
在氮气下，在室温和搅拌下，向100mg(0.220mmol)的MTX和38mg (0.330mmol)的NHS在5mL无水DMSO中的溶液中加入35μL(0.220 mmol)的二异丙基碳二亚胺。在16小时后，加入得自实施例87的150 mg(0.231mmol)的HA-6-NH-Phe-Gly-NH2TBA盐并继续搅拌5小时。 然后加入0.50ml的饱和NaCl溶液并继续搅拌30分钟。在搅拌下将混 合物倾入到20ml EtOH中，得到的浆料搅拌10分钟，然后过滤并用 EtOH洗涤。将固体溶解在15ml水中并用水渗析。然后将溶液过滤通 过0.22μ孔径大小的膜并冷冻干燥，得到105毫克的带黄色的固体。 MTX形式的DS通过质子NMR测定为：13％摩尔/摩尔。
例如，喜树碱(CPT)是从喜树(Camptotheca acuminata)中获得的 不溶于水的光学活性生物碱。20(S)-喜树碱及其类似物是一类被认为 通过使拓扑异构酶I诱导的DNA磷酸二酯主链中的单链稳定化从而预 防重接合作用(relegation)的细胞毒剂。这导致在复制期间产生双链 DNA断裂，如果未被修复，则导致细胞凋亡。20(S)-喜树碱针对人癌 细胞系和体内动物异种移植物显示优异的抗肿瘤活性。除了其不溶于 水之外，其具有药理学重要性的内酯环在人血浆中是不稳定的，在人 血浆中，内酯环主要以其开环醇酸的形式存在，这种形式被白蛋白捕 获，从而使该药物失活。喜树碱的主要局限性是形成不稳定的药物- 靶复合物以及内酯环的不稳定性。根据三元复合物的可逆性和在DNA 复制期间致死性损伤的形成，可预期长时间暴露于该药物下可获得最 佳的细胞毒作用。几种喜树碱(CPT)类似物已经历了临床开发，但是尽 管它们具有有前途的临床作用，但是现有CPT类似物的全部治疗影响 是有限的；优化其治疗指数的许多手段目前正处于评价中。研究人员 试图通过制备新的化合物来解决问题。拓扑替康和伊立替康是被设计 用来通过引入官能团以增强溶解度来促进活性内酯形式化合物的非肠 道给药的合成类似物。在几种肿瘤的化疗处置中，它们目前是被广泛 认可的组分。拓扑替康在先前经过治疗的卵巢癌和小细胞肺癌患者中 具有良好活性，并且目前在美国被批准用作这些疾病的二线治疗药。 伊立替康是前体药物，其经历酶转化形成生物活性代谢物7-乙基-10- 羟基-喜树碱(SN38)。目前，当与作为用于晚期结直癌患者的一线治疗 药的氟嘧啶联合使用时，或者作为在基于5-氟尿嘧啶化疗失败后的单 一药剂时，伊立替康是被选择的疗法。几种另外的喜树碱类似物处在 不同的临床开发阶段，它们包括：9-氨基喜树碱，9-硝基喜树碱，7-(4- 甲基哌嗪基亚甲基)-10，11-亚乙二氧基-20(S)-喜树碱，甲磺酸依喜替 康(exatecan)和卡兰替康(karenitecin)。然而，这些化合物具有某些 缺点，例如它们不适合靶向于特定的组织或细胞受体。
在优化药物效力的努力中，可能的策略包括分子结构的化学修饰。 一个策略是将药物共价结合到水溶性的聚合物材料上。多种聚合物已 被用于与疏水性药物分子(包括喜树碱)结合，诸如聚(L-谷氨酸)- 紫杉醇(paclitaxe)；聚乙二醇(PEG)-喜树碱(Rowinsky EK等人，J. Clinical Oncology，Vol.21，No.1(2003)148-157)；聚(L-谷氨 酸)-喜树碱(Singer JW等人，Ann.N Y Acad.Sci.922(2000) 136-150)；聚(N-羟丙基甲基丙烯酰胺)-HA-多柔比星，羧甲基右旋 糖酐-喜树碱(CMD Clinical Cancer Research，11，1650-1657， 2005)，环糊精和CPT(Cheng J，Bioconjugate Chem.2003，14， 1007-1017)。然而，这些策略不能允许靶向于所需部位；有时候，由 于其特有的化学性质或者由于化学修饰，其已丧失其原始的/天然的靶 向性能力，聚合物根本不识别任何靶标。事实上，天然聚合物的功能 和生物学特性在化学修饰牵涉对这些特性的维持是不可缺少的基团时 很容易丧失。
紫杉醇(TXL)是抗白血病药和抗肿瘤药。其最初从太平洋紫杉(红 豆杉(Taxus bravifolia))的树皮中被分离出来，针对多种瘤显示高 活性，并且在临床上已用于转移性乳癌、难治性卵巢癌和几种其它恶 性肿瘤的治疗。TXL是高度疏水性药物，其天然形式在水中具有极低 的溶解性。TXL的持续输注已显示比推注或更快速的输注速率具有更 大的临床效力。为了克服溶解性问题并增强药物持续输注的临床效力， 已经通过使用乙酰苯甲酰氯将母药酯化而引入易受影响的酮基，然后 与一系列包含酰肼的马来酰亚胺反应，将TXL与聚乙二醇(PEG)结合 (Rodrigues PCA等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.，13，2003，355)。 TXL还被结合至透明质酸(在本申请中，透明质酸还称作HA)从而克服 溶解性问题并靶向于肿瘤细胞。合成策略涉及在HA的葡萄糖醛酸残基 的羧基处的药物结合(用琥珀酸酐连续处理TXL)，TXL-半琥珀酸酯 的活化，用己二酸二酰肼对HA的羧基进行官能化，然后使两个中间体 反应得到HA-紫杉醇结合物。结合物对已知表达透明质酸受体的人癌 细胞系(乳癌、结肠癌和卵巢癌)显示选择毒性；在相同浓度下没有观 察到对小鼠成纤维细胞系具有毒性(Luo，Y.，和Prestwich，G.D.， Bioconjugate Chem.，10(1999)755-763)。然而，这些衍生物不加 区别地在聚合物的不同位置上发生取代，从而丧失了天然的化学规律 性。
聚(L-谷氨酸)，聚乙二醇(PEG)和羧甲基右旋糖酐(CMD)缺乏生 物活性和靶向性能力；而天然HA相对于其它聚合物已显示优点，因为 其能使药物靶向于患病部位。抗癌聚合物药物可穿过癌部位，通过增 强的渗透和潴留(EPR)方式(被动机制)或通过采用在细胞表面上的受 体之间的特异性相互作用的主动靶向进行。HA不仅通过EPR方式起作 用，而且在体内具有多种被识别的细胞受体，并且其可与其它结构如 特别是蛋白聚糖相互作用。在不同的受体中，可述及的是CD44。对透 明质酸与蛋白受体(例如CD44)之间的相互作用的研究已显示：结合发 生在透明质酸的带负电荷的羧基与蛋白质的带正电荷的碱性氨基酸的 区域之间(J.Cell.Biol.vol 22，1993，257-264)。对于透明质酸 与蛋白聚糖的相互作用还需要游离羧基(Biochem.J.167，711， 1977)。因此，透明质酸的羧基和羟基的完整性对于识别和结合细胞结 构非常重要；这些基团的部分取代将不允许与这些蛋白大分子发生有 效的结合。这些游离的羧基和羟基对于形成适当的聚合物构型也是重 要的。关于受体CD44，公知其被许多肿瘤类型过度表达。在表达CD44 HA受体的细胞系中显示了衍生化HA的胞吞作用。荧光标记的HA-紫杉 酚结合物已经显示对已知过度表达HA受体的人癌细胞系具有选择性 毒性。HA肝脏受体(HARLEC)的存在暗示了HA可用作使药物靶向于肝 脏组织的载体分子。已表明HA用于在小鼠中从结肠腺癌发生的肝脏转 移。
已经描述了用属于甲氨蝶呤族的药物在C6位取代制备透明质酸 衍生物(WO01168105)。这些DDS的特征在于在透明质酸和药物之间 存在酯基，其具有特定的药物释放特征模式和在不同的生物学环境下 的稳定性。
附图说明
图1：6-NH2-HA的合成
HA→6-Cl-HA；HA-6-Ms→6-NH2-HA
条件：a)X＝Cl：MsCl，DMF，Δ；X＝OMs：MsCl，DMF，DIEA，-10 ℃；b)aq.NH4OH，Δ；c)X＝Cl：NaN3，DMSO，18-冠-6，Δ；X＝OMs： NaN3，水，Δ；d)NH4COOH，水，Pd/C，RT。
图2：HA-6-NH-CO-(CH2)2-CO-20-O-CPT的合成。
CPT→CPT-半琥珀酸酯→HA-6-NH-琥珀酸酯-20-O-CPT。
图3：HA-6-NH-CO-(CH2)2-CO-2’-O-TXL的合成。
TXL→TXL-半琥珀酸酯→HA-6-NH-琥珀酸酯-2’-O-TXL。
图4：HA-6-NH-CO-(CH2)2-CO-Gly-20-O-CPT。
图5：HA-6-NH-CO-gly-CO-(CH2)2-CO-20-O-CPT。
图6：HA-6-NH-CO-MTX。
图7：HA-6-NH-CO-IBP。
发明详述
本发明的目的是包含透明质酸和治疗剂的DDS，其特征在于治疗 剂直接或通过连接基连接到在N-乙酰基-D-葡糖胺残基的C6位带有氨 基的透明质酸衍生物上；该氨基代替了HA中在该位上天然存在的羟 基。为了简便起见，该衍生物在本文中被称作“6-氨基透明质酸”或 “6-NH2-HA”或“HA-6-NH2”；在本文中，对于其它的在6位被衍生化 的透明质酸使用了等价术语，其中NH2用有关取代基代替。
6-NH2-HA与治疗剂(或与连接基)的连接通过酰胺键实现，酰胺键 牵涉在一侧的6-NH2-HA基团的6-氨基和在另一侧的在治疗剂(或连接 基)上存在的适当的COOH基。当存在连接基时，治疗剂进一步通过共 价连接连接基。
置换度，即在与治疗剂或连接基用氨基连接时所牵涉的6-NH2-HA 的百分数，根据在酰胺形成反应中所用治疗剂/连接基的量的不同而 异。置换度可如此容易地被控制，导致DDS具有不同水平的药物负荷， 从而可用于不同的治疗目的。
本发明的DDS中包含的“透明质酸”(或“HA”)是包括二糖重复 单元的聚合物，该二糖重复单元由通过β(1→3)糖苷键结合的D-葡糖 醛酸和2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖(N-乙酰基-D-葡糖胺)组成；该 D-葡萄糖醛酸残基可为酸形式或盐形式。每个重复单元与下一个重复 单元通过β(1→4)糖苷键结合形成线型聚合物。透明质酸的平均分子量 优选为10,000到1,000,000，更优选为10,000到500,000。术语“透 明质酸”或“HA”包括游离酸形式和与例如碱金属(优选Na或K)、碱 土金属(优选Ca或Mg)、过渡金属(优选Cu、Zn、Ag、Au、Co、Ag)形 成的成盐形式。术语“透明质酸”/“HA”还包括它们的其中一个或多 个仲羟基被衍生化形成选自例如以下的基团的衍生物：-OR，-OCOR， -SO2H，-OPO3H2，-O-CO-(CH2)n-COOH，-O-(CH2)n-OCOR，其中n是1-4 且R是C1-C10烷基，-NH2，-NHCOCH3。
治疗剂(是指处在其游离状态下，即在结合到本发明的DDS中之前) 包含至少一个羧基或至少一个氨基或至少一个羟基。
当治疗剂包含至少一个羧基时，治疗剂和6-NH2-HA之间的酰胺连 接优选是直接连接，不使用连接基。
当治疗剂包含至少一个氨基或至少一个羟基时，药物优选借助连 接基连接到6-NH2-HA。
关于治疗活性剂所属的药理学类别不是关键。其可选自例如：止 痛药、抗高血压药、麻醉药(anestetic)、利尿药、支气管扩张药、 钙通道阻断剂、胆碱能药、CNS药、雌激素、免疫调节剂、免疫抑制 剂、抗脂肪肝药、抗焦虑药、抗溃疡药、抗心率不齐药、抗心绞痛药、 抗生素、抗炎药、抗病毒药、溶血栓药、血管扩张药、解热药、抗抑 郁药、抗精神病药、抗肿瘤药、溶粘蛋白剂(mucolytic)、麻醉药拮抗 剂、激素、抗惊厥药、抗组胺药、抗真菌药和治牛皮癣药、抗增殖药、 抗生素。其中，优选抗炎药、抗生素、抗肿瘤药(特别是抗癌药)。 适当的治疗剂的例子是喜树碱、布洛芬、甲氨蝶呤、紫杉醇、头孢唑 林、萘普生、赖诺普利、青霉素G、萘啶酸、胆甾烷及其衍生物。
连接基(是指处在其游离状态下，即在结合到本发明的DDS中之 前)总是包含至少一个羧基用于与6-NH2-HA连接；其还包含至少一个 可用于与治疗剂连接的其它基团，如氨基、硫醇、另外的羧基等等。
适当的连接基是，例如直链或支链的脂族、芳族或芳脂族C2-C20 二羧酸，氨基酸，肽，与氨基酸连接的直链或支链的脂族、芳族或芳 脂族C2-C20二羧酸，与肽连接的直链或支链的脂族、芳族或芳脂族C2-C20 二羧酸。
每当存在连接基时，则连接基的作用是在透明质酸和治疗剂之间 生成臂(arm)或间隔基(spacer)。连接基在一侧借助酰胺键与6-NH2-HA 连接并且在另一侧借助任何可能的共价型键与治疗剂连接。
当连接基是与氨基酸或肽连接的二羧酸时，与HA形成酰胺键的羧 基可以是二羧酸的游离酸基或者是氨基酸或肽的游离酸基。
优选的连接基是：丁二酸、与氨基酸连接的丁二酸、与肽连接的 丁二酸。
根据本发明优选的氨基酸选自：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮 氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、谷 氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和 酪氨酸。根据本发明优选的肽是由上述氨基酸的不同组合组成的肽或 仅由一种类型的氨基酸组成的肽，它们优选是二肽、三肽或四肽。
如实验部分所述的，本发明的DDS的特征在于存在通过酰胺键连 接到透明质酸的N-乙酰基-D-葡糖胺单元的C6上的治疗剂，该连接直 接进行或借助连接基进行。HA的其它基团不参与与药物的化学键合。 这是指透明质酸上的仲羟基和羧基都不参与任何的药物取代，并且本 发明的DDS在多糖上所保持的官能度与天然HA中的官能度接近。因此， 这些游离的官能度可完全(100％)被用于与受体如CD44或其它结构如 蛋白聚糖发生相互作用。
本发明的DDS是稳定的并且不含不希望的不利于其实际药用的反 应副产物和杂质。
这些DDS的制备允许获得保持了治疗剂的药理学效力的药物化合 物。因此，它们可成功地用于治疗所有的对DDS中的特定治疗剂有应 答的病状。同时，它们可以显示出一些在单独治疗剂中未被观察到的 性质，例如，它们对于一些细胞或组织显示更高亲合力，它们可提供 不同的生物利用度模式。
因此，本发明的另一方面是上述DDS在制备用于治疗适于每种治 疗剂的病状中的应用。
本发明的又一方面涉及包含与可药用的赋形剂和/或稀释剂混合 的本发明的DDS的药物组合物。该药物组合物可以是液体或固体形式； 其可通过经口、非肠道、局部、关节内途径给药。DDS的全身给药可 通过静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下途径给药。特别感兴趣的是包含 本发明DDS的可注射的药物组合物。
本发明的又一方面是制备上述DDS的方法。该方法包括在 6-NH2-HA与治疗剂(或连接基)上存在的羧基之间形成酰胺键，每当使 用连接基时，该方法还包括将药物与连接基连接的步骤，这一步骤在 酰胺形成步骤之前或之后进行无关紧要。
6-NH2-HA可以得自HA，通过在HA的N-乙酰基葡糖胺残基的C-6 上区域选择性引入氨基进行。优选过程举例说明如下：
a)使用离去基团置换游离形式或盐形式的透明质酸的N-乙酰基 -D-葡糖胺单元的C-6位上的羟基，从而获得6位活化的HA。
b)将6位活化的HA转化成6-NH2-HA。
c)将6-NH2-HA进行回收。
在步骤a)中，离去基团可以选自：磺酸酯，膦酸酯(三苯基膦酸 酯)，氰基(CN-)，亚硝酸酯(NO2-)，卤素(优选氯代)，硫酸酯，卤代 硫酸酯，硝酸酯，卤代亚硫酸酯(氯代亚硫酸酯)。
优选的离去基团是卤素，这一卤化作用可根据例如WO9918133和 WO0168105所述进行，两篇文献都处在本申请人的名义下。当离去基 团是氯时，区域选择性氯化作用优选根据以下过程进行。在-20℃到-10 ℃，优选在-10℃下，氯化试剂，如在N，N-二甲基甲酰胺中的甲磺酰 氯(Vilsmeir试剂)，被加入到在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的盐形 式(为钠形式或诸如TBA、吡啶或对称-三甲基吡啶的有机碱形式)、 优选钠形式的HA的溶液或悬浮液中。在2小时时间段内，反应温度从 -10℃升高到40-65℃，优选升高到60℃。然后，氯化反应在40℃到 65℃，优选60℃的温度下进行10-24小时，优选进行16小时。该反 应的后处理为：用饱和NaHCO3水溶液处理以实现pH 8，然后用NaOH 水溶液处理以实现pH 9；该步骤允许除去在反应期间在HA分子的仲 羟基处形成的甲酸酯基。然后通过加入稀HCl将反应混合物中和。然 后通过标准技术回收所需的6-氯-透明质酸。
其它优选的离去基团是磺酸酯，如烷基磺酸酯或芳基磺酸酯， 得到6-磺化-HA；在磺酸酯中，优选甲磺酸酯。区域选择性磺酰化采 用作为磺酰化试剂的烷基磺酰卤或芳基磺酰卤，优选烷基磺酰氯或 芳基磺酰氯，在有机碱或无机碱、优选有机碱存在的条件下进行。 烷基磺酰卤或芳基磺酰卤可优选选自：甲基磺酰基(甲磺酰基)，对- 甲苯磺酰基(甲苯磺酰基)，三氟甲磺酰基，trimsyl，tripsyl，1，1- 磺酰基-咪唑。有机碱优选自不同的有机胺，如二异丙基乙胺、三乙 胺。
溶剂选自：二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、甲酰胺。 一般的磺酰化过程如下所述。在卤素回流下通过搅拌，将碱，优选有 机碱，加入到盐形式、优选有机碱形式的HA的悬浮液或溶液中。然后， 滴加在适当的溶剂中、优选在相同溶剂中的烷基磺酰氯或芳基磺酰氯。 在2-90分钟(优选45-75分钟)的时段后，反应通过添加NaHCO3淬 灭以除去在反应期间在HA的仲羟基处形成的甲酸酯基。然后使反应继 续进行约10-20小时，优选进行18小时。反应产物(6-磺化-HA)通过 已知技术如沉淀、干燥从溶液中被直接回收，或者在回收之前溶液经 过处理使得获得处于适当盐形式的6-磺酸酯-HA，如HA-6-磺化 物：TBA。
根据步骤b)，置换C6位的离去基团，获得中间体6-NH2-HA化合 物。步骤b)可如下进行：用浓氨水在高温下(例如40-70℃，优选60-80 ℃)处理6位活化的HA达2-50小时，从而获得6-NH2-HA。特别地，当 离去基团是氯时，则6-氨基-HA的制备如下：用浓(25％)氨水，在 80℃下，在有或者没有DMSO的条件下，处理6-Cl-HA达7-48小时， 时间根据置换度的需要而异，其中6-Cl-HA为无机盐形式或有机盐形 式，优选分别是钠盐或四丁基铵(TBA)盐形式。或者，当离去基团是甲 磺酸酯时，则中间体6-氨基-HA的制备如下：用浓(25％)氨水，在 60℃下，处理6-甲磺酰酯-HA达18小时，其中6-甲磺酸酯-HA为无机 盐形式或有机盐形式，优选分别是钠盐或四丁基铵(TBA)盐形式，从而 实现甲磺酸酯基向氨基的完全转化。
6-NH2-HA中间体的合成还可如下逐步获得：用叠氮化物阴离子置 换6-Cl-HA中的氯或6-OMs-HA中的甲磺酸酯，然后还原。6-Cl-HA要 求更强的条件，因此置换在二甲基亚砜中进行，并且使用冠醚来增强 叠氮化物的亲核性。使用水作为溶剂和使用叠氮化钠作为亲核试剂， 6-OMs-HA显示了实现完全转化的更高反应性。还原阶段也在水中进 行，避免了进行盐交换的任何需要。有几种方法可用于在含水条件下 还原叠氮化物：在生理学缓冲剂中的二硫苏糖醇，在含水吡啶中的硫 化氢，在水/醇混合物中的氯化锌和氯化铵，在水中的铜盐和硼氢化钠， 在水中的催化氢化。含硫化合物被认为是第二选择，并且优选的方法 需要使用在水中的二价铜盐和硼氢化钠(Fringuelli J.Org.Chem. 2003，68，7041-7045)并且在水中进行的经典的催化氢化使用甲酸铵 作为氢供体和使用Pd/C作为催化剂。也可使用采用氯化锌和氯化铵进 行还原，因为其提供了阳性Kaiser试验，但是在纯化阶段可能出现问 题。
步骤c)根据本领域专家公知的技术进行。包括步骤a)到c)的方 法部分是区域选择性的，即其通过取代位于HA的C6位上的单独的伯 羟基进行；其它羟基不被取代。在6-NH2-HA和治疗剂(或连接基)之间 的酰胺形成步骤在用于该反应的标准反应条件下进行，参见实验部分 的举例说明。
当使用连接基时，该治疗剂可以在与6-NH2-HA形成酰胺步骤之前 或之后与连接基连接，优选在与6-NH2-HA形成酰胺步骤之前进行。
当在酰胺形成步骤之前将连接基与治疗剂连接时，后者以直接生 成本发明的最终DDS结束，其具有结构HA-6-NHCO-连接基-治疗剂。
当在酰胺形成步骤之后将连接基与治疗剂连接时，后者以生成结 构HA-6-NHCO-连接基的中间体化合物结束，其然后与治疗剂反应，获 得具有结构HA-6-NHCO-连接基-治疗剂的最终DDS。
当不使用连接基时，酰胺形成步骤以生成具有结构HA-6-NHCO-治 疗剂的最终DDS结束。
在连接基与治疗剂之间的键的类型不是关键性的，并且可通过任 何形成共价键的适当化学反应获得；酯，醚，仲胺/叔胺是这种键的例 子。
特别地，当治疗剂包含羟基且连接基包含羧基(除了参与酰胺键 的羧基之外)，治疗剂-连接基的键便利地是酯型：因此，包含羟基官 能度(例如喜树碱、紫杉醇)的治疗剂在氯化有机溶剂(如二氯甲烷)中 用连接基(例如丁二酸)处理，得到治疗剂-连接基单酯(例如半琥珀酸 酯)；所得到的单酯被活化(如使用N-羟基琥珀酸酯(NHS)，使用二 异丙基碳二亚胺(DIPC)在DMSO中，在环境温度下)并与6-NH2-HA反 应，得到本发明的DDS。
在另外的实施方案中，当治疗剂包含羟基且连接基包括氨基酸或 肽时，治疗剂可连接到所述氨基酸/肽的：(i)胺或(ii)羧基官能团上； 以这种方式，有可能通过酶促或pH辅助水解达到细胞的药物释放条 件。
在情况(i)中，通过用N-保护的氨基酸/肽(诸如苄氧羰基-甘氨酸 -OH)处理包含羟基官能团的治疗剂(诸如喜树碱、CPT)可以获得键合， 从而在氨基再生后得到相应的酯衍生物。然后，得到的具有游离NH2 基的产物用C2-C20二羧酸处理，得到相应的单酯。治疗剂-连接基单 酯然后与6-NH2-HA反应，得到最终的DDS。
在情况(ii)中，反应顺序包括：使包含羟基官能度的治疗剂(如 喜树碱、CPT)与C2-C20二羧酸(如琥珀酸)反应，得到相应的单酯(例 如半琥珀酸酯)；然后用其中羧基被保护的氨基酸(例如甘氨酸)或肽处 理该单酯；在除去保护基后并与6-NH2-HA反应，获得最终的DDS。
当治疗剂包含羧基时，其可直接通过酰胺键连接到6-NH2-HA的C6 位上的N原子上，不使用任何连接基，得到最终的具有结构HA-6-NHCO- 治疗剂的DDS。具有羧基官能团的治疗剂的例子是甲氨蝶呤(抗肿瘤 药)或布洛芬(抗炎药)。这些治疗剂也可借助连接基与6-NH2-HA连 接。在这种情况中，首先在6-NH2-HA的C6位上的N原子与连接基的 羧基官能团之间形成酰胺键；如此获得的化合物HA-6-NHCO-连接基然 后与治疗剂反应，获得最终的DDS。
本发明的反应条件是温和的并且允许获得的最终DDS是稳定的且 不含不希望的不利于其实际药用的副产物和杂质。现在通过以下的非 限制性实施例说明本发明。
实验部分
使用的缩写：
HA：透明质酸。TBA：四丁基铵。DMF：二甲基甲酰胺。DMSO：二 甲基亚砜。DIEA：N，N-二异丙基乙胺。DMAP：4-二甲基氨基吡啶。DCM： 二氯甲烷。DIPC：二异丙基碳二亚胺。TFA：三氟乙酸。THF：四氢呋 喃。MeOH：甲醇。EtOH：乙醇。CPT：喜树碱。MTX：甲氨蝶呤。TXL： 紫杉醇。EDC：N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺。Cbz：苄氧 羰基。Boc：叔丁氧羰基。HOBt：1-羟基苯并三唑。NHS：N-羟基琥珀 酰亚胺。EtOAc：乙酸乙酯。
6-Cl-HA、6-OMs-HA、6-NH2-HA和通式HA-6-NH-酰基，HA-6-O-酰 基和HA-O-酰基的所有所述衍生物的结构由NMR支持。1H NMR，1H DOSY， 13C NMR，HSQC谱图证实了所有DDS的6-脱氧-6-氨基-N-乙酰基-D-葡 糖胺的C6位上的药物的共价连接是HA-6-NH-酰基类型。
在装备有沿着z轴线性梯度的Varian Inova 500光谱仪上和在 Varian Mercury 200光谱仪上在D2O中获得HA衍生物的NMR谱图并 且按照说明获得其它中间体的谱图。除非另作说明，否则MW 20.000 的透明质酸用作原材料。
通过离子交换制备透明质酸的TBA盐。简而言之，安珀莱特 (Amberlite)IRA-120树脂用过量的20％四丁基氢氧化铵溶液处理24 小时，然后用水洗涤。然后将HA的水溶液(5％)温和地与树脂混合24 小时。过滤、浓缩和冷冻干燥，得到具有化学计算量的TBA含量的HA TBA盐，通过质子NMR被证实。
实施例1.通过NMR确定6-Cl-HA中的氯化物含量如下进行：使 用定量脉冲序列，相对于44.0ppm处的13C NMR峰(CH2Cl)对60.5ppm 处的13C NMR峰(CH2OH)进行积分。
实施例2.通过NMR确定HA-6-甲磺酸酯(6-Ms-HA)中的甲磺酸酯 含量如下进行：相对于1.95ppm处的峰(HA链的3H)对3.10-3.32ppm 区域内的峰(HA链的1H和甲磺酸酯的3H)进行积分。通过13C NMR和 HSQC NMR谱证实C6位的选择性：没有检测到第二个甲磺酸酯。
实施例3.通过NMR确定6-NH2-HA中的胺含量如下进行：使用定 量脉冲序列，对60.5ppm处的13C NMR峰(CH2OH)、44.0ppm处的13C NMR 峰(左侧的CH2Cl，仅当6-NH2-HA由6-Cl-HA获得时才存在)和40.5ppm 处的13C NMR峰(CH2NH2)进行积分。
实施例4.通过13C NMR确定6-N3-HA化合物中叠氮化物含量，相 对于51ppm处的CH2-N3信号对60.5ppm处的CH2-OH信号进行积分。
实施例5.结合用于水含量测定的热重分析和用于游离的和结合 的CPT测定的HPLC方法来确定DDS中的CPT含量。用于测定DDS中水 含量的热重分析的分析参数是：
热重天平： TGA Perkin Elmer
气氛： 氮
气流 炉内流：25mL/min；平衡流：50mL/min
温度范围 50-250℃
温度扫描速率 10℃/分钟
为了测定游离的喜树碱，注射结合物的1∶1的水/甲醇溶液。在水 解后测定总的喜树碱。水解在室温下、在搅拌下、在0.1M氢氧化钠 中进行2小时。随后向样品中加入一定量的可获得50％的最终甲醇浓 度(注射前的浓度)的甲醇，以防止喜树碱沉淀，然后用1M HCl溶液中 和，并最终加入25mM KH2PO4缓冲液(pH 2.5)，达到最终体积。从 总喜树碱中减去游离喜树碱获得结合的喜树碱。
用于测定DDS中的CPT的HPLC分析参数是：
色谱系统 Agilent 1100系列
柱设置： 柱名称：Merck Chromolith RP-18e
柱尺寸：100X4.60mm
温度：40℃
保护柱： 保护柱描述：Merck Guard Cartridge RP-18e
保护柱尺寸：5X4.6mm；温度：40℃
洗脱液A： 甲醇
洗脱液B： KH2PO4 25mM缓冲剂pH 2.5
流动相梯度 0’35％A+65％B；
15’55％A+45％B；
20’55％A+45％B
流速： 1mL/分钟
检测器： UV-VIS(λ＝370nm)；荧光计(激发λ＝380nm，发
射λ＝440nm)
运行时间： 20分钟
注射体积： 10μL
实施例6.重量平均分子量(Mw)的测定
透明质酸DDS的分子量通过HP-SEC(高效空间排阻色谱法)测量。 分析条件是：色谱仪：带有Rheodyne 9125注射器的HPLC泵980-PU (Jasco Ser.No.B3901325)。柱：TSK PWxl(TosoBioscience) G6000+G5000+G30006，10，13μm粒径；温度：40℃。流动相：NaCl 0.15M+0.01％NaN3。流量：0.8mL/min。检测器：MALLS(WYATT DAWN EOS-WYATT，USA)，λ＝690nm，(dn/dc＝0.167mL/g)，UV分光光 度检测器875-UV(Jasco，Ser.No.D3693916)，λ＝305nm， Interferometric Refractive Index OPTILAB REX(WYATT，USA)； λ＝690nm，灵敏度：128x；温度：35℃，注射体积：100μl，运行时 间：60分钟。
将待分析样品以约1.0毫克/毫升的浓度溶解在0.9％NaCl中， 并保持搅拌12小时，然后，将溶液过滤通过0.45μm的多孔过滤器 (Sartorius Minisart RC2517795Q)并最终注射到色谱仪中。该分析 允许测得Mw(重均分子量)，Mn(数均分子量)，PI(多分散性)。聚合 物样品溶液的浓度根据折射率的积分进行控制。
实施例7.6-Cl-HA钠盐的制备。
在氮气下，在20℃和机械搅拌下，将50g的透明质酸(hyaluronan) 钠盐悬浮在900mL的无水二甲基甲酰胺中，然后将悬浮液冷却到-10 ℃并在30分钟内加入97mL的甲磺酰氯，在-10℃持续另外30分钟后， 将温度升高到20℃，在1小时后，将温度逐渐升高(在1小时内)到 60℃并继续搅拌18.5小时。然后在剧烈搅拌下将反应混合物分次倾入 到冰和碳酸钠溶液的混合物(4L，初始pH＝11)中，当需要时通过添加 1.5M NaOH保持pH为约9，将得到的呈褐色的悬浮液(最终体积6L) 在pH 9.5下在室温下搅拌约48小时，从而形成透明溶液。将其过滤 以除去固体，然后进行超滤(截止值为10KDa的超滤膜)。得到的溶液 在旋转蒸发器中被浓缩到约1升的最终体积并进行冷冻干燥，获得 34.9g的6-Cl-HA钠盐，为白色固体(DS 66％摩尔/摩尔，通过13C NMR 测定)。13C NMR ppm：22.6，44.0，54.4，60.7，68.6，69.3，72.6， 73.8，74.1，75.5，76.3，80.1，80.9，82.3，101.0，103.4，174.0， 174.1，175.0。
实施例8.6-Cl-HA钠盐的制备。
根据实施例7的相同过过程，从50g的透明质酸钠盐开始并在60 ℃保持12小时，获得33.5g的6-Cl-HA钠盐，为米白色固体(DS 38％摩 尔/摩尔，通过13C NMR测定)。
实施例9.6-Cl-HA钠盐的制备。
根据实施例7的相同过过程，从50g的透明质酸钠盐开始并在60 ℃保持7小时，获得33.1g的6-Cl-HA钠盐，为米白色固体(DS 16％摩 尔/摩尔，通过13C NMR测定)。
实施例10.6-Cl-HA钠盐的制备。
根据实施例7的相同过程，从50g的透明质酸钠盐开始并在60℃ 保持5小时，获得32.4g的6-Cl-HA钠盐，为米白色固体(DS 8％摩 尔/摩尔，通过13C NMR测定)。
实施例11.6-O-甲磺酰基透明质酸钠盐(6-OMs-HA)的制备。
在氮气下，在-10℃和搅拌下，向20.03g(32.3mmol)的HA的TBA 盐在500ml的DMF中的溶液中加入4.86ml(28.4mmol)的DIEA。然 后滴加MsCl(1001μL；12.9mmol)，得到的混合物在-10℃搅拌1小时， 通过加入饱和NaHCO3溶液(1L)将反应混合物淬灭，并用水使总体积达 3升(得到的pH：9)；保持搅拌过夜。得到的溶液经过超滤和在旋转 蒸发器中进行浓缩。将溶液冷冻干燥得到11.12g的白色固体。总的甲 磺酸酯DS为12.3％摩尔/摩尔，通过质子NMR测定。
实施例12.6-O-甲磺酰基透明质酸钠盐(6-OMs-HA)的制备。
在氮气下，在-10℃和在搅拌下，向1.00g(1.61mmol)的HA的TBA 盐在40ml的DMF中的溶液中加入381μL(2.24mmol)的DIEA。然后 滴加MsCl(79μL；1.01mmol)，得到的混合物在-10℃搅拌1小时，通 过加入饱和NaHCO3溶液(50ml)将反应混合物淬灭，并用水使总体积达 200ml(得到的pH：9)；保持搅拌过夜。得到的溶液经过超滤和在旋 转蒸发器中进行浓缩。将溶液冷冻干燥得到588mg的白色固体。总的 甲磺酸酯DS为15％摩尔/摩尔，通过质子NMR测定。
实施例13.6-O-甲磺酰基透明质酸钠盐(6-OMs-HA)的制备。
在氮气下，在-10℃和在搅拌下，向42.2g(68.1mmol)的HA的TBA 盐在1.00升的DMF中的溶液中加入25.6ml(149.8mmol)的DIEA，然 后滴加MsCl(5.29ml；68.1mmol)，得到的混合物在-10℃搅拌1小时， 通过加入饱和NaHCO3溶液(2L)将反应混合物淬灭，并用水使总体积达 5.5升(得到的pH：9)；保持搅拌过夜。得到的溶液经过超滤和在旋 转蒸发器中进行浓缩。将溶液冷冻干燥得到26.0g的白色固体。总的 甲磺酸酯DS为18％摩尔/摩尔，通过质子NMR测定。
实施例14.6-O-甲磺酰基透明质酸钠盐(6-OMs-HA)的制备。
在氮气下，在-10℃和在搅拌下，向20.0g(32.3mmol)的HA的TBA 盐在500ml的DMF中的溶液中加入9.12ml(53.3mmol)的DIEA，然 后滴加MsCl(3.76ml；48.4mmol)，得到的混合物在-10℃搅拌1小时， 通过加入饱和NaHCO3溶液(1L)将反应混合物淬灭，并用水使总体积达 3升(得到的pH：9)；保持搅拌过夜。得到的溶液经过超滤和在旋转 蒸发器中进行浓缩。将溶液冷冻干燥得到11.12g的白色固体。总的甲 磺酸酯DS为30％摩尔/摩尔，通过质子NMR测定。
实施例15.6-O-甲磺酰基透明质酸钠盐(6-OMs-HA)的制备。
在氮气下，在-10℃和在搅拌下，向20.0g(32.3mmol)的HA的TBA 盐在500ml的DMF中的溶液中加入9.12ml(53.3mmol)的DIEA，然 后滴加MsCl(3.76ml；48.4mmol)，得到的混合物在-10℃搅拌1小时， 通过加入饱和NaHCO3溶液(1L)将反应混合物淬灭，并用水使总体积达 3升(得到的pH：9)；保持搅拌过夜。得到的溶液经过超滤和在旋转 蒸发器中进行浓缩。将溶液冷冻干燥得到11.12g的白色固体。总的甲 磺酸酯DS为30％摩尔/摩尔，通过质子NMR测定。
实施例16.6-NH2-HA TBA盐的制备。
在适合加压反应的反应器中，将得自实施例7的5.0g的6-Cl-HA 溶解在100ml浓NH4OH溶液中。将反应器密封并将溶液在80℃加热21 小时，然后将其冷却，真空除去过量的氨。在超滤后，溶液用装载TBA 的安珀莱特IRA-120处理，然后将其冷冻干燥，得到5.43g的6-NH2-HA TBA盐，为米白色固体(DS 33％摩尔/摩尔，通过13C NMR测定)。MW： 17.220，P.I.1.8。13C NMR ppm(不包括TBA信号)：22.6，40.5，44.0， 54.4，60.7，68.6，69.3，70.5，72.0，72.6，73.8，75.5，76.3，78.2， 80.1，80.9，82.3，99.7，101.0，103.4，174.0，174.1，175.0。
实施例17.6-NH2-HA TBA盐的制备。
在适合加压反应的反应器中，将得自实施例7的5.0g的6-Cl-HA 溶解在100ml浓NH4OH溶液中。将反应器密封并将溶液在80℃加热40 小时，然后将其冷却，真空除去过量的氨。在超滤后，溶液用装载TBA 的安珀莱特IRA-120处理，然后将其冷冻干燥，得到4.34g的6-NH2-HA TBA盐，为米白色固体(DS 42％摩尔/摩尔，通过13C NMR测定)。
实施例18.6-NH2-HA TBA盐的制备。
在适合加压反应的反应器中，将得自实施例7的5.0g的6-Cl-HA 溶解在100ml浓NH4OH溶液中。将反应器密封并将溶液在80℃加热48 小时，然后将其冷却，真空除去过量的氨。在超滤后，溶液用装载TBA 的安珀莱特IRA-120处理，然后将其冷冻干燥，得到4.05g的6-NH2-HA TBA盐，为米白色固体(DS 50％摩尔/摩尔，通过13C NMR测定)。
实施例19.6-NH2-HA TBA盐的制备。
在适合加压反应的反应器中，将得自实施例8的5.0g的6-Cl-HA 溶解在100ml浓NH4OH溶液中。将反应器密封并将溶液在80℃加热22 小时，然后将其冷却，真空除去过量的氨。在超滤后，溶液用装载TBA 的安珀莱特IRA-120处理，然后将其冷冻干燥，得到6.51g的6-NH2-HA TBA盐，为米白色固体(DS 20％摩尔/摩尔，通过13C NMR测定)。MW： 15.410，P.I.1.5。
实施例20.6-NH2-HA TBA盐的制备。
在适合加压反应的反应器中，将得自实施例8的5.0g的6-Cl-HA 溶解在100ml浓NH4OH溶液中。将反应器密封并将溶液在80℃加热38 小时，然后将其冷却，真空除去过量的氨。在超滤后，溶液用装载TBA 的安珀莱特IRA-120处理，然后将其冷冻干燥，得到5.90g的6-NH2-HA TBA盐，为米白色固体(DS 25％摩尔/摩尔，通过13C NMR测定)。MW： 16.370，P.I.1.6。
实施例21.6-NH2-HA TBA盐的制备。
在适合加压反应的反应器中，将得自实施例9的5.0g的6-Cl-HA 溶解在100ml浓NH4OH溶液中。将反应器密封并将溶液在80℃加热22 小时，然后将其冷却，真空除去过量的氨。在超滤后，溶液用装载TBA 的安珀莱特IRA-120处理，然后将其冷冻干燥，得到6.43g的6-NH2-HA TBA盐，为米白色固体(DS 13％摩尔/摩尔，通过13C NMR测定)。MW： 14.420，P.I.1.4。
实施例22.6-NH2-HA TBA盐的制备。
在适合加压反应的反应器中，将得自实施例9的5.0g的6-Cl-HA 溶解在100ml浓NH4OH溶液中。将反应器密封并将溶液在80℃加热7 小时，然后将其冷却，真空除去过量的氨。在超滤后，溶液用装载TBA 的安珀莱特IRA-120处理，然后将其冷冻干燥，得到5.95g的6-NH2-HA TBA盐，为米白色固体(DS 4％摩尔/摩尔，通过13C NMR测定)。MW： 13.960，P.I.1.4。
实施例23.6-NH2-HA TBA盐的制备。
在适合加压反应的反应器中，将得自实施例10的5.0g的6-Cl-HA 溶解在100ml浓NH4OH溶液中。将反应器密封并将溶液在80℃加热7 小时，然后将其冷却，真空除去过量的氨。在超滤后，溶液用装载TBA 的安珀莱特IRA-120处理，然后将其冷冻干燥，得到6.22g的6-NH2-HA TBA盐，为米白色固体(DS 2％摩尔/摩尔，通过13C NMR测定)。MW： 13.680，P.I.1.4。
实施例24.6-NH2-HA TBA盐的制备。
在可密封烧瓶中，将得自实施例15的100mg的6-OMs-HA溶解在 3ml浓NH4OH溶液中。将溶液在60℃加热18小时，然后将其冷却，并 真空除去过量的氨。在超滤后，溶液用装载TBA的安珀莱特IRA-120 处理，然后将其冷冻干燥，得到132mg的6-NH2-HA TBA盐，为白色固 体(DS 30％摩尔/摩尔，通过13C NMR测定)。
13C NMR ppm(不包括TBA信号)：22.3，40.5，53.9，60.4，68.1， 69.8，71.0，71.8，72.4，74.7，77.2，79.5，82.0，99.5，100.8， 103.0，173.0，173.9，174.3。
实施例25.6-NH2-HA TBA盐的制备
在适合加压反应的反应器中，将得自实施例14的10g的6-OMs-HA 溶解在200ml浓NH4OH溶液中。将反应器密封并在60℃加热18小时， 然后将其冷却，并真空除去过量的氨。用HCl溶液中和并在超滤之后， 溶液用装载TBA的安珀莱特IRA-120处理，然后将其冷冻干燥，得到 12.8g的6-NH2-HA TBA盐，为白色固体(DS 20％摩尔/摩尔，通过13C NMR 测定)。
实施例26.6-NH2-HA TBA盐的制备。
在适合加压反应的反应器中，将得自实施例13的10g的6-OMs-HA 溶解在200ml浓NH4OH溶液中。将反应器密封并在60℃加热18小时， 然后将其冷却，并真空除去过量的氨。用HCl溶液中和并在超滤之后， 溶液用装载TBA的安珀莱特IRA-120处理，然后将其冷冻干燥，得到 12.6g的6-NH2-HA TBA盐，为白色固体(DS 12％摩尔/摩尔，通过13C NMR 测定)。
实施例27.6-NH2-HA TBA盐的制备。
在可密封烧瓶中，将得自实施例12的500g的6-OMs-HA溶解在 15ml浓NH4OH溶液中。将溶液密封并在60℃加热18小时，然后将其 冷却，并真空除去过量的氨。用HCl溶液中和并在超滤之后，溶液用 装载TBA的安珀莱特IRA-120处理，然后将其冷冻干燥，得到628mg 的6-NH2-HA TBA盐，为白色固体(DS 8％摩尔/摩尔，通过13C NMR测 定)。
实施例28.6-NH2-HA TBA盐的制备。
在适合加压反应的反应器中，将得自实施例11的10g的6-OMs-HA 溶解在200ml浓NH4OH溶液中。将反应器密封并在60℃加热18小时， 然后将其冷却，并真空除去过量的氨。用HCl溶液中和并在超滤之后， 溶液用装载TBA的安珀莱特IRA-120处理，然后将其冷冻干燥，得到 12.9g的6-NH2-HA TBA盐，为白色固体(DS 6％摩尔/摩尔，通过13C NMR 测定)。
实施例29.6-NH2-HA钠盐的制备。
在可密封烧瓶中，将得自实施例15的100mg的6-OMs-HA溶解在 3ml浓NH4OH溶液中。将溶液在60℃加热18小时，然后将其冷却，并 真空除去过量的氨。溶液用0.5ml的饱和氯化钠处理并搅拌30分钟， 然后对其进行渗析并冷冻干燥，得到92mg的6-NH2-HA钠盐，为白色 固体(DS 30％摩尔/摩尔，通过13C NMR测定)。
实施例30.6-N3-HA钠盐的制备。
将得自实施例8的1.00g(2.38mmol)的6-Cl-HA钠盐转化成相应 的TBA盐如下进行：溶解在水中并用装载TBA的安珀莱特IRA-120处 理。得到的溶液经过冷冻干燥，得到1.53g的6-Cl-HA TBA盐。将该 固体溶解在30ml DMSO中，并加入5.0g的叠氮化钠和1.0g的18-冠 -6，加热到80℃并然后搅拌24小时。将混合物倾入到水中，得到的 溶液经过超滤和冷冻干燥，得到820mg的固体。叠氮化物形式的DS 为30％，通过13C NMR测定。
实施例31.6-N3-HA钠盐的制备。
将得自实施例14的200mg(0.5mmol)的6-OMs-HA钠盐溶解在4ml 水中，加入1.20g的叠氮化钠，并将溶液在80℃搅拌16小时，与水 进行渗析并冷冻干燥，得到180mg的白色固体。叠氮化物形式的DS 为15％，通过13C NMR分析，在质子NMR中没有观察到残留的甲磺酸酯。
实施例32.6-N3-HA钠盐的制备。
将得自实施例20的2.0g(4.8mmol)的6-OMs-HA钠盐溶解在40ml 水中，加入10.0g的叠氮化钠，并将溶液在80℃搅拌16小时，用水 渗析并冷冻干燥，得到1.65g的白色固体。叠氮化物形式的DS为10％， 通过13C NMR分析，在质子NMR中没有观察到残留的甲磺酸酯。
实施例33.6-NH2-HA钠盐的制备。
向得自实施例32的150mg(0.37mmol)的6-N3-HA钠盐和16mg (0.1mmol)的CuSO4在3ml水中的溶液中，在0℃和搅拌下，分份加入 38mg(1.0mmol)的NaBH4，最初观察到气体放出并形成黑色混合物。1 小时后，混合物用浓NH4OH处理以获得pH＝10并通过硅藻土过滤。 得到的溶液用1N HCl酸化到pH＝9，从而形成黑色沉淀，其使用硅 藻土短柱被滤出，得到的溶液用水进行渗析并冷冻干燥，得到135mg 的白色固体。氨基的DS为10％，通过13C NMR测定，并且没有观察到 残留的叠氮化物。
实施例33.6-NH2-HA钠盐的制备。
得自实施例32的200mg(0.50mmol)的6-N3-HA钠盐和120mg的甲 酸铵在4ml水中的溶液通过几个氮气/真空循环进行吹扫以除去空气， 然后，在氮气下，加入40mg 5％的Pd/C，并将混合物在室温下搅拌18 小时，然后将其通过硅藻土短柱过滤，用水渗析并冷冻干燥，得到 184mg的白色固体。氨基的DS为10％，通过13C NMR测定，并且没有观 察到残留的叠氮化物。
实施例34.CPT-20-O-半琥珀酸酯。
在室温和搅拌下，向2.98g(17.1mmol)的琥珀酸单叔丁基酯和 1.40g(11.5mmol)的对-二甲基氨基-吡啶在200ml二氯甲烷中的溶液 中加入2.68ml(17.3mmol)的二异丙基碳二亚胺和3.00g(8.62mmol) 的CPT，在搅拌过夜后，得到的悬浮液用80ml的二氯甲烷稀释，获得 的溶液用0.1N HCl溶液洗涤并用无水硫酸钠干燥。然后将其过滤并在 旋转蒸发器中蒸干，残余物用100ml MeOH进行结晶，过滤并用MeOH 洗涤。在过滤器上干燥后，固体用50ml三氟乙酸在二氯甲烷中的40％ v/v溶液处理，并且在室温下放置1小时后，得到的浅绿色溶液在旋 转蒸发器中蒸干，残余物用100ml MeOH进行结晶，过滤并用MeOH和 二乙醚洗涤，真空干燥后，得到3.67g(8.19mmol，95％)的浅黄色固 体。
实施例35.HA-6-NHCO(CH2)2-CO-20-O-CPT钠盐。
在氮气下，在室温和搅拌下，向得自实施例34的56mg(0.124mmol) 的CPT-20-O-半琥珀酸酯和17.3mg(0.150mmol)的N-羟基琥珀酰亚胺 在3ml的二甲基亚砜中的溶液中加入19μL(0.124mmol)的二异丙基碳 二亚胺。16小时后，加入得自实施例20的77mg(0.124mmol)的 6-NH2-HA TBA盐，并继续搅拌5小时，然后加入0.15ml的饱和NaCl 溶液并继续搅拌30分钟，在搅拌下将混合物倾入到10ml EtOH中，得 到的淤浆搅拌10分钟，然后过滤并用EtOH洗涤，将固体悬浮在10ml 二甲基甲酰胺中，成淤浆30分钟，过滤并用二甲基甲酰胺洗涤一次， 用MeOH洗涤两次，在过滤器上干燥后，将固体溶解在10ml水中并用 水渗析，然后将溶液过滤通过0.22μ孔径大小的膜并冷冻干燥，得到 60mg的白色固体，CPT形式的DS通过质子NMR测定为：25％摩尔/摩 尔。
实施例36.HA TBA盐和被活化的CPT-20-O-半琥珀酸酯之间的反 应。
在氮气下，在室温和搅拌下，向得自实施例34的56mg(0.124mmol) 的CPT-20-O-半琥珀酸酯和17.3mg(0.150mmol)的N-羟基琥珀酰亚胺 在3ml的二甲基亚砜的溶液中加入19μL(0.124mmol)的二异丙基碳二 亚胺。16小时后，加入77mg(0.124mmol)的HA TBA盐，并继续搅拌 5小时，然后加入0.15ml的饱和NaCl溶液，并继续搅拌30分钟。在 搅拌下将混合物倾入到10ml EtOH中，得到的浆料搅拌10分钟，然后 过滤并用EtOH洗涤，将固体悬浮在10ml二甲基甲酰胺中，成淤浆30 分钟，过滤并用二甲基甲酰胺洗涤一次，并用MeOH洗涤两次，在过滤 器上干燥后，将固体溶解在10ml水中并用水渗析，然后将溶液过滤通 过0.22μ孔径大小膜并冷冻干燥，得到48mg的白色固体。
CPT形式的DS通过质子NMR测定为：0％摩尔/摩尔。
实施例37.得自实施例35的HA-6-NHCO(CH2)2-CO-20-O-CPT通过 NMR进行结构确证。
得自实施例35的HA-6-NHCO(CH2)2-CO-20-O-CPT在D2O中的质子 光谱显示了可归属于结合的CPT-半琥珀酸酯的非常宽的信号峰。DOSY 权重谱证实了新信号属于与透明质酸链结合的物质。在5.5和5.8ppm 之间存在的两个二重峰可归属于CPT的内酯并且相对于属于结合的 CPT的其它信号进行正确的积分。HSQC谱证实了这一归属并且允许完 整地鉴定了所有的CPT-半琥珀酸酯信号和聚合物上新形成的酰胺 6-CH2的信号。
通过1H NMR定量测定，结合的CPT估计为25％摩尔/摩尔。通过 向NMR管中加入2mg的固体LiOH一水合物证实了DS。在几分钟后， 获得新的质子光谱，其显示了从结合物发生CPT的完全水解；CPT的 开环形式的锂盐的信号可以相对于HA被积分，证实了DS为25％摩尔 /摩尔。在该质谱中，观察到的琥珀酸酯链的信号是对于两个亚甲基在 两个不同化学位移处的两个宽的多重峰，表明琥珀酸酯仍然与聚合物 结合；这通过DOSY权重谱被证实，并且在pH 13下经过一周后，NMR 仍然显示半琥珀酸酯在聚合物上结合。
在得自实施例20的起始的6-NH2-HA中，胺DS通过13C NMR测定 估计为25％摩尔/摩尔，并且从HA-6-NHCO(CH2)2-CO-20-O-CPT的HSQC 谱中可见，在聚合物上没有残留痕量的6-CH2NH2。这些实验表明了， 在结合步骤中，CPT-20-O-半琥珀酸酯仅仅通过酰胺键与6-NH2-HA的 胺结合；这由其中使用天然HA TBA盐并且没有发现被结合的CPT的独 立反应(实施例36)所证实。
另外，结合的CPT以其内酯形式存在(从质子和碳化学位移以及 从质子积分可知)；为了对比，在碱性水中获得CPT的谱图，其中， CPT作为开环内酯羧化物形式是可溶的。在这种情况中，开环内酯的 质子和碳化学位移是明显不同的。
最后，可将纯的开环CPT的1D谱和2D谱(从碱性H2O中并使用水 抑制技术获得)叠放到水解的结合物的谱图上，表明在活化和结合反应 期间，CPT完整保留。
实施例38.HA-6-NHCO(CH2)2-CO-20-O-CPT钠盐。
在氮气下，在室温和搅拌下，向得自实施例34的1.03g(2.30mmol) 的CPT-20-O-半琥珀酸酯和318mg(2.76mmol)的N-羟基琥珀酰亚胺在 30ml二甲基亚砜中的溶液中加入356μL(2.30mmol)的二异丙基碳二 亚胺。16小时后，加入得自实施例20的1.50g(2.30mmol)的6-NH2-HA TBA盐，并继续搅拌5小时。然后加入3.0ml的饱和NaCl溶液，并继 续搅拌30分钟。在搅拌下将混合物倾入到120ml EtOH中，得到的浆 料搅拌10分钟，然后过滤并用EtOH洗涤，将固体悬浮在100ml二甲 基甲酰胺中，成淤浆30分钟，过滤并用二甲基甲酰胺洗涤一次，并用 MeOH洗涤两次，在过滤器上干燥后，将固体溶解在100ml水中并用水 渗析，然后将溶液过滤通过0.22μ孔径大小的膜并冷冻干燥，得到 1.01g的白色固体。CPT形式的DS通过质子NMR测定为：25％摩尔/ 摩尔。CPT形式的DS通过HPLC测定为：13％w/w。
实施例39.HA-6-NHCO(CH2)2-CO-20-O-CPT钠盐。
在氮气下，在室温和搅拌下，向得自实施例34的1.03g(2.30mmol) 的CPT-20-O-半琥珀酸酯和400mg(3.48mmol)的N-羟基琥珀酰亚胺在 30ml二甲基亚砜中的溶液中加入356μL(2.30mmol)的二异丙基碳二 亚胺。16小时后，加入得自实施例21的1.50g(2.30mmol)的6-NH2-HA TBA盐，并继续搅拌5小时，然后加入3.0ml的饱和NaCl溶液，并继 续搅拌30分钟。在搅拌下将混合物倾入到120ml EtOH中，得到的浆 料搅拌10分钟，然后过滤并用EtOH洗涤，将固体悬浮在100ml二甲 基甲酰胺中，成淤浆30分钟，过滤并用二甲基甲酰胺洗涤一次，并用 MeOH洗涤两次，在过滤器上干燥后，将固体溶解在100ml水中并用水 渗析，然后将溶液过滤通过0.22μ孔径大小的膜并冷冻干燥，得到 0.99g的白色固体。CPT形式的DS通过质子NMR测定为：12％摩尔/ 摩尔。CPT形式的DS通过HPLC测定为：7％w/w。
或者，从得自实施例26的1.00g的6-NH2-HA TBA盐开始，获得 653mg的白色固体(CPT形式的DS为：12％摩尔/摩尔，通过1H NMR测 定)。
实施例40.HA-6-NHCO(CH2)2-CO-20-O-CPT钠盐。
在氮气下，在室温和搅拌下，向得自实施例34的1.03g(2.30mmol) 的CPT-20-O-半琥珀酸酯和400mg(3.48mmol)的N-羟基琥珀酰亚胺在 30ml二甲基亚砜中的溶液中加入356μL(2.30mmol)的二异丙基碳二 亚胺。16小时后，加入得自实施例16的1.50g(2.30mmol)的6-NH2-HA TBA盐，并继续搅拌6小时。然后加入3.0ml的饱和NaCl溶液，并继 续搅拌30分钟。在搅拌下将混合物倾入到120ml EtOH中，得到的浆 料搅拌10分钟，然后过滤并用EtOH洗涤，将固体悬浮在100ml二甲 基甲酰胺中，成淤浆30分钟，过滤并用二甲基甲酰胺洗涤一次，并用 MeOH洗涤两次。在过滤器上干燥后，将固体溶解在100ml水中并用水 渗析，然后将溶液过滤通过0.22μ孔径大小的膜并冷冻干燥，得到 1.26g的白色固体。CPT形式的DS通过质子NMR测定为：33％摩尔/ 摩尔。
实施例41.HA-6-NHCO(CH2)2-CO-20-O-CPT钠盐。
在氮气下，在室温和搅拌下，向得自实施例34的867mg(1.94mmol) 的CPT-20-O-半琥珀酸酯和334mg(2.90mmol)的N-羟基琥珀酰亚胺在 30ml二甲基亚砜中的溶液中加入300μL(1.94mmol)的二异丙基碳二 亚胺。16小时后，加入得自实施例22的1.50g(2.30mmol)的6-NH2-HA TBA盐，并继续搅拌6小时。然后加入3.0ml的饱和NaCl溶液，并继 续搅拌30分钟。在搅拌下将混合物倾入到120ml EtOH中，得到的浆 料搅拌10分钟，然后过滤并用EtOH洗涤。将固体悬浮在100ml二甲 基甲酰胺中，成淤浆30分钟，过滤并用二甲基甲酰胺洗涤一次，并用 MeOH洗涤两次。在过滤器上干燥后，将固体溶解在100ml水中并用水 渗析。然后将溶液过滤通过0.22μ孔径大小的膜并冷冻干燥，得到 0.96g的白色固体。CPT形式的DS通过质子NMR测定为：3.5％摩尔/ 摩尔。CPT形式的DS通过HPLC测定为：2％w/w。
或者，从得自实施例29的1.00g的6-NH2-HA TBA盐开始，获得 640mg的白色固体(CPT形式的DS为：6％摩尔/摩尔，通过1H NMR测 定)。
实施例42.HA-6-NHCO(CH2)2-COOH钠盐。
将得自实施例19的1.50g(2.30mmol)的6-NH2-HA TBA盐在30ml 的二甲基亚砜中的溶液中加入481μL(3.45mmol)的三乙胺和345mg (3.45mmol)的琥珀酸酐。在室温下搅拌过夜后，加入3.0ml的饱和NaCl 溶液并继续搅拌30分钟。在搅拌下将混合物倾入到150ml EtOH中， 得到的淤浆搅拌10分钟，然后过滤并用EtOH、含10％水的EtOH、二 甲基甲酰胺和最后经甲醇洗涤。将固体溶解在100ml的0.1N NaOH溶 液中，在5分钟后，用3N HCl溶液调节pH为8。将溶液超滤，过滤 通过0.22μ孔径大小的膜并冷冻干燥，得到922mg的白色固体。
半琥珀酸酯形式的DS通过质子NMR测定为：20％摩尔/摩尔。
实施例43.CPT-20-O-CO-CH2-NHBoc。
向3.00g(17.1mmol)的Boc-Gly-OH和1.40g(11.4mmol)的4- 二甲基氨基吡啶在100ml二氯甲烷中的溶液中加入2.68ml(17.1mmol) 的二异丙基碳二亚胺和2.00g(5.75mmol)的CPT。在室温下搅拌过夜 后，得到的悬浮液用50ml二氯甲烷稀释，用0.1N HCl溶液洗涤，用 无水硫酸钠干燥，过滤并蒸发。残余物用最小量的甲醇结晶，过滤， 用甲醇洗涤并干燥，得到2.24g(78％)的白色固体。
实施例44.CPT-20-O-CO-CH2-NH2·TFA。
将得自实施例43的1.50g(2.97mmol)的CPT-20-O-CO-CH2-NHBoc 溶解在三氟乙酸在二氯甲烷中的100ml的40％溶液中。1小时后，在旋 转蒸发器中除去溶剂，残余物用二乙醚结晶，过滤，用二乙醚洗涤并 干燥，得到1.50g(0.289mmol，97％)的浅黄色固体。
实施例45.CPT-20-O-CO-CH2-NHCO-(CH2)2-COOH。
在氮气下，在室温下，向174mg(17.3mmol)的琥珀酸酐、0.50ml (2.9mmol)的DIEA和4mg(0.03mmol)的DMAP在50ml二氯甲烷中的溶 液中加入得自实施例44的750mg(1.44mmol)的 CPT-20-O-CO-CH2-NH2·TFA。18小时后，溶液用25ml二氯甲烷稀释， 用0.1N HCl溶液洗涤，用饱和NaHCO3溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥， 过滤并蒸发。残余物用最小量的甲醇结晶，过滤，用甲醇洗涤并干燥， 得到655mg(1.30mmol，90％)的白色固体。
实施例46.HA-6-NHCO-(CH2)2-CONH-Gly-20-O-CPT。
在氮气下，在室温和搅拌下，向得自实施例45的250mg (0.495mmol)的CPT-20-O-CO-CH2-NHCO-(CH2)2-COOH和86mg(0.75mmol) 的N-羟基琥珀酰亚胺在10ml二甲基亚砜中的溶液中加入77μL (0.50mmol)的二异丙基碳二亚胺。16小时后，加入得自实施例33的 310mg(0.50mmol)的6-NH2-HA TBA盐，并继续搅拌5小时。然后加入 1.0ml的饱和NaCl溶液，并继续搅拌30分钟。在搅拌下将混合物倾 入到40ml EtOH中，得到的淤浆搅拌10分钟，然后过滤并用EtOH洗 涤。将固体悬浮在30ml二甲基甲酰胺中，成淤浆30分钟，过滤并用 二甲基甲酰胺洗涤一次，并用MeOH洗涤两次，在过滤器上干燥后，将 固体溶解在40ml水中并用水渗析，然后将溶液过滤通过0.22μ孔径 大小膜并冷冻干燥，得到0.22g(100％)的白色固体。
CPT形式的DS通过质子NMR测定为：2％摩尔/摩尔，CPT形式的 DS通过HPLC测定为：1.5％w/w。
或者，从得自实施例28的100mg的6-NH2-HA TBA盐开始，获得 60mg的白色固体(CPT形式的DS为：6％摩尔/摩尔，通过1H NMR测定)。
实施例47.CPT-20-O-CO-(CH2)2-CONH-Gly-OH。
向得自实施例34的800mg(1.79mmol)的CPT-20-O-半琥珀酸酯、 549μL(3.94mmol)的三乙胺和343mg(1.79mmol)的EDC盐酸盐在80ml 二氯甲烷中的溶液中加入330mg(1.96mmol)的Gly-O-tert-Bu盐酸 盐。在室温下搅拌过夜后，溶液用0.1N HCl溶液洗涤，用无水硫酸钠 干燥，过滤并在旋转蒸发器中蒸发。残余物用最小量的甲醇结晶，过 滤，用甲醇洗涤并干燥，得到白色固体。将该固体溶解在包含5％v/v 水的25ml TFA中。1.5小时后，在旋转蒸发器中除去溶剂，残余物用 甲醇结晶。过滤，用甲醇洗涤并干燥，得到601mg(1.19mmol，66％) 的米白色固体。
实施例48.CPT-20-O-CO-(CH2)2-CONH-Gly-NH-6-HA。
在氮气下，在室温和搅拌下，向得自实施例47的250mg (0.495mmol)的CPT-20-O-CO-(CH2)2-CONH-Gly-OH和114mg (0.99mmol)的N-羟基琥珀酰亚胺在7ml二甲基亚砜中的溶液中加入 77μL(0.50mmol)的二异丙基碳二亚胺。16小时后，加入得自实施例 19的250mg(0.403mmol)的6-NH2-HA TBA盐，继续搅拌5小时。然后 加入0.7ml的饱和NaCl溶液并继续搅拌30分钟。在搅拌下将混合物 倾入到30ml EtOH中，得到的浆料搅拌10分钟，然后过滤并用EtOH 洗涤。将固体悬浮在25ml二甲基甲酰胺中，成淤浆30分钟，过滤并 用二甲基甲酰胺洗涤一次，并用MeOH洗涤两次。在过滤器上干燥后， 将固体溶解在30ml水中并用水渗析。然后将溶液过滤通过0.22μ孔 径大小膜并冷冻干燥，得到120mg的白色固体。
CPT形式的DS通过质子NMR测定为：20％摩尔/摩尔。CPT形式的 DS通过HPLC测定为：14.0％w/w。
或者，从得自实施例28的100mg的6-NH2-HA TBA盐开始，获得 63mg的白色固体(CPT形式的DS通过1H NMR测定为：6％摩尔/摩尔； CPT形式的DS通过HPLC测定为：4.82％w/w)。
实施例49.紫杉醇-2’-半琥珀酸酯。
将300mg(0.351mmol)的紫杉醇、42.2mg(0.422mmol)的琥珀酸 酐和9mg(0.07mmol)的DMAP在10ml无水吡啶中的溶液在室温下搅拌 3小时。在旋转蒸发器中除去溶剂，残余物用最小量的二氯甲烷溶解 并装载到硅胶柱上。用含甲醇的乙酸乙酯(从0％到100％)洗脱，得到 334mg(100％)的纯的紫杉醇-2′-半琥珀酸酯。
实施例50.HA-6-NHCO-(CH2)2-CO-2’-O-TXL。
在氮气下，在室温和搅拌下，向得自实施例49的334mg (0.351mmol)的紫杉醇-2′-半琥珀酸酯和115mg(1.00mmol)的N-羟基 琥珀酰亚胺在10ml二甲基亚砜中的溶液中加入62μL(0.35mmol)的二 异丙基碳二亚胺。16小时后，加入得自实施例23的217mg(0.35mmol) 的6-NH2-HA TBA盐，并继续搅拌7小时。然后加入0.7ml的饱和NaCl 溶液并继续搅拌30分钟。在搅拌下将混合物倾入到40ml EtOH中，得 到的浆料搅拌10分钟，然后过滤，并用EtOH和MeOH洗涤，将固体溶 解在25ml水中并用水渗析，然后将溶液过滤通过0.22μ孔径大小的 膜并冷冻干燥，得到130mg的白色固体。TXL形式的DS通过质子NMR 测定为：2％摩尔/摩尔。
或者，从得自实施例28的100mg的6-NH2-HA TBA盐开始，获得 62mg的白色固体(TXL形式的DS为：5％摩尔/摩尔，通过1H NMR测定)。
实施例51.HA-6-NH-MTX。
在氮气下，在室温和搅拌下，向330mg(0.726mmol)的甲氨蝶呤 和56mg(0.484mmol)的N-羟基琥珀酰亚胺在6ml二甲基亚砜中的溶液 中加入75μL(0.484mmol)的二异丙基碳二亚胺。16小时后，加入得 自实施例21的300mg(0.484mmol)的6-NH2-HA TBA盐，并继续搅拌 4.5小时。然后加入1.0ml的饱和NaCl溶液并继续搅拌30分钟。在 搅拌下将混合物倾入到30ml EtOH中，得到的浆料搅拌10分钟，然后 过滤，并用EtOH和3×DMF洗涤。将固体溶解在20ml水中并用水渗析。 然后将溶液过滤通过0.22μ孔径大小的膜并冷冻干燥，得到202mg的 黄色固体。MTX形式的DS通过质子NMR测定为：13％摩尔/摩尔。
或者，从得自实施例25的1.00g的6-NH2-HA TBA盐开始，获得 706mg的黄色固体(MTX形式的DS为：20％摩尔/摩尔，通过1H NMR测 定)。
实施例52.HA-6-NH-布洛芬。
在氮气下，在室温和搅拌下，向110mg(0.532mmol)的布洛芬和 61mg(0.532mmol)的N-羟基琥珀酰亚胺在6ml二甲基亚砜中的溶液中 加入75μL(0.484mmol)的二异丙基碳二亚胺。16小时后，加入得自 实施例21的300mg(0.484mmol)的6-NH2-HA TBA盐，并继续搅拌4.5 小时。然后加入1.0ml的饱和NaCl溶液并继续搅拌30分钟。在搅拌 下将混合物倾入到30ml EtOH中，得到的浆料搅拌10分钟，然后过滤， 并用EtOH和3×DMF洗涤。将固体溶解在20ml水中并用水渗析。然后 将溶液过滤通过0.22μ孔径大小的膜并冷冻干燥，得到180mg的白色 固体。布洛芬形式的DS通过质子NMR测定为：13％摩尔/摩尔。
或者，从得自实施例25的1.00g的6-NH2-HA TBA盐开始，获得 690mg的白色固体(布洛芬形式的DS为：20％摩尔/摩尔，通过1H NMR 测定)。
实施例53.6-NH2-HA钠盐的制备。
在适合加压反应的反应器中，将得自实施例8的5.0g的6-Cl-HA 溶解在100ml浓NH4OH溶液中。将反应器密封并将溶液在80℃加热22 小时，然后将其冷却并真空除去过量的氨。溶液用10ml饱和氯化钠处 理并搅拌30分钟。然后对其进行超滤和冷冻干燥，得到3.35g的 6-NH2-HA钠盐，为米白色固体(DS 20％摩尔/摩尔，通过测定13C NMR)。
实施例54.HA-6-NH-(4-甲酰基-苯甲酰基)。
向600mg(4.00mmol)的4-羧基-苯甲醛、506mg(4.40mmol)的N-羟 基琥珀酰亚胺和0.67ml(4.8mmol)的三乙胺在30mlDCM中的溶液中加 入767mg(4.00mmol)的EDC盐酸盐。在室温下搅拌4小时后，溶液用 0.1N HCl溶液洗涤两次，用水洗涤两次。然后用无水硫酸钠干燥并蒸 干，得到840mg(90％)的白色固体。将50mg的该固体溶解在0.60ml 的DMF中并被加入到得自实施例53的100mg的6-NH2-HA钠盐在5ml 磷酸盐缓冲液(pH＝7.2)中的溶液中。在室温下搅拌3小时后，得到的 悬浮液用水稀释到15ml，离心以除去固体，用水渗析并冷冻干燥，得 到92mg的白色固体。
4-甲酰基-苯甲酰基形式的DS通过质子NMR测定为：12％摩尔/ 摩尔。
实施例55.HA-6-NH-(4-戊基氨基甲基-苯甲酰基)。
向得自实施例54的82mg(0.205mmol)的HA-6-NH-(4-甲酰基-苯 甲酰基)在3.7ml的0.2M NaHCO3溶液的溶液中加入24μL(0.205mmol) 的戊胺和13mg(0.205mmol)的氰基硼氢化钠。在室温下搅拌过夜后， 悬浮液用水稀释到11ml，离心以除去固体，用水渗析并冷冻干燥，得 到75mg的白色固体。芳基形式的DS通过质子NMR测定为：6％摩尔/ 摩尔。
实施例56.HA-6-NH-Ac。
向得自实施例19的80mg(0.129mmol)的6-NH2-HA TBA盐在10ml 乙酸酐中的悬浮液中加入二甲基甲酰胺(10ml)以获得溶液，该溶液在 室温下搅拌16小时。然后加入0.5ml饱和NaCl溶液。搅拌30分钟后， 将混合物倾入到EtOH上并过滤。将固体溶解在10m l的0.1N NaOH溶 液中。10分钟后，将溶液中和，超滤和冷冻干燥，得到45mg的白色 固体(乙酰基形式的DS为20％，通过1H NMR测定)。
或者，从得自实施例26的200mg的6-NH2-HA TBA盐开始，获得 124mg的白色固体(乙酰基形式的DS为：12％摩尔/摩尔，通过1H NMR 测定)。
实施例57.HA-6-NH-α-吡啶甲酰基(picolinoyl)。
在氮气下，向57mg(0.46mmol)的甲酸吡啶在12mlDMSO中的溶液 中加入80mg(0.70mmol)的NHS和71μL(0.46mmol)的二异丙基碳二 亚胺。在室温下搅拌18小时后，加入得自实施例21的300mg(0.46mmol) 的6-NH2-HA TBA盐，并继续搅拌6小时。然后加入1.5ml的饱和NaCl 溶液并继续搅拌30分钟。将混合物倾入到25ml EtOH中然后过滤。固 体用Et OH洗涤，然后被溶解在20ml的0.1N NaOH溶液中。在搅拌10 分钟后，溶液用0.1N HCl溶液中和，超滤并冷冻干燥，得到180mg 的白色固体(α-吡啶甲酰基形式的DS为13％，通过1H NMR测定)。
或者，从得自实施例26的200mg的6-NH2-HA TBA盐开始，获得 117mg的白色固体(α-吡啶甲酰基形式的DS为：12％摩尔/摩尔，通过 1H NMR测定)。
实施例58.Cbz-Gly-6-HN-HA。
在氮气下，在室温和搅拌下，向67mg(0.323mmol)的Cbz-Gly-OH 和56mg(0.484mmol)的N-羟基琥珀酰亚胺在4ml二甲基亚砜的溶液中 加入50μL(0.323mmol)的二异丙基碳二亚胺。16小时后，加入得自 实施例21的200mg(0.323mmol)的6-NH2-HA TBA盐，继续搅拌5小 时，然后加入0.40ml的饱和NaCl溶液并继续搅拌30分钟。在搅拌下 将混合物倾入到15ml EtOH中，得到的浆料搅拌10分钟，然后过滤， 并用EtOH洗涤。将固体溶解在15ml水中并用水渗析。然后将溶液过 滤通过0.22μ孔径大小的膜并冷冻干燥，得到137mg的白色固体。
Cbz-Gly形式的DS通过质子NMR测定为：13％摩尔/摩尔。
实施例59.H2N-Gly-6-HN-HA。
将得自实施例58的70mg的Cbz-Gly-6-HN-HA溶解在包含50mg 甲酸铵的1.5ml水中。通过几次真空/氮气循环吹扫之后，向溶液中加 入40mg的10％Pd/C(湿)，然后在室温下搅拌18小时。在用水稀释 到8ml后，混合物进行离心并弃去固体。得到的带黑色的溶液通过硅 藻土短柱，经过浓缩和冷冻干燥，得到55mg的米白色固体。
Gly形式的DS通过质子NMR测定为：13％摩尔/摩尔。
实施例60.HA-6-NHCO-Ph。
在氮气下，在室温和搅拌下，向得自实施例21的250mg (0.403mmol)的6-NH2-HA TBA盐和84μL(0.604mmol)的三乙胺在 7ml DMSO中的溶液中加入47μL(0.403mmol)的苯甲酰氯。3小时后， 溶液用1ml饱和NaCl溶液处理并继续搅拌30分钟。在搅拌下将混合 物倾入到20ml EtOH中，得到的浆料搅拌10分钟，然后过滤，并用 EtOH洗涤。将固体溶解在15ml水中并用水渗析。然后将溶液过滤通 过0.22μ孔径大小的膜并冷冻干燥，得到157mg的白色固体。Bz形式 的DS通过质子NMR测定为：6％摩尔/摩尔。
或者，从得自实施例26的200mg的6-NH2-HA TBA盐开始，获得 110mg的白色固体(Bz形式的DS为：12％摩尔/摩尔，通过1H NMR测 定)。
实施例61.HA-6-NHCO-(邻-氨基-苯基)。
在氮气下，在室温和搅拌下，向得自实施例17的250mg (0.403mmol)的6-NH2-HA TBA盐和84μL(0.604mmol)的三乙胺在 10ml DMSO中的溶液中加入66mg的靛红酸酐。18小时后，溶液用1ml 饱和NaCl溶液处理并继续搅拌30分钟。在搅拌下将混合物倾入到 20ml EtOH中，得到的浆料搅拌10分钟，然后过滤，并用EtOH洗涤。 将固体溶解在15ml的0.1N NaOH溶液中。在搅拌10分钟后，溶液用 1N HCl溶液中和并用水渗析。然后将溶液过滤通过0.22μ孔径大小的 膜并冷冻干燥，得到175mg的白色固体。
邻氨基苯甲酰基(antranoyl)形式的DS通过质子NMR测定为：40％ 摩尔/摩尔。
或者，从得自实施例25的200mg的6-NH2-HA TBA盐开始，获得 134mg的白色固体(邻氨基苯甲酰基(antranoyl)形式的DS为：20％摩 尔/摩尔，通过1H NMR测定)。
实施例62.HA-6-NHCO-nPr。
在氮气下，在室温和搅拌下，向37μL(0.403mmol)的丁酸和70mg (0.604mmol)的N-羟基琥珀酰亚胺在2ml二甲基亚砜中的溶液中加入 62μL(0.403mmol)的二异丙基碳二亚胺。3小时后，加入得自实施例 20的250mg(0.403mmol)的6-NH2-HA TBA盐，并继续搅拌16小时。 然后加入1.0ml的饱和NaCl溶液并继续搅拌30分钟。在搅拌下将混 合物倾入到15ml EtOH中，得到的浆料搅拌10分钟，然后过滤，并用 EtOH洗涤。将固体溶解在15ml的0.1N NaOH溶液中。在搅拌10分钟 后，溶液用1N HCl溶液中和并用水渗析，然后将溶液过滤通过0.22μ 孔径大小的膜并冷冻干燥，得到131mg的白色固体。
丁酰基形式的DS通过质子NMR测定为：25％摩尔/摩尔。
或者，从得自实施例25的200mg的6-NH2-HA TBA盐开始，获得 120mg的白色固体(丁酰基形式的DS为：20％摩尔/摩尔，通过1H NMR 测定)。
实施例63.HA-6-NH-(CO)-CH2-CH(NHCbz)-COOH。
在氮气下，在室温和搅拌下，向得自实施例21的300mg(0.46mmol) 的6-NH2-HA TBA盐在12mlDMSO中的溶液中加入128μL(0.92mmol)的 三乙胺、11mg(0.09mmol)的DMAP和137mg(0.55mmol)的N-苄氧羰 基(Carbobenziloxy)-L-天冬氨酸酐。16小时后，加入1.0ml的饱 和NaCl溶液并继续搅拌30分钟。然后将混合物倾入到25ml EtOH中 并过滤。将固体溶解在5ml的0.1N NaOH中。在10分钟后，溶液被中 和，超滤并冷冻干燥，得到110mg的白色固体(酰基形式的DS为13％， 通过1H NMR测定)。
实施例64.5α-胆甾烷-3β-醇半琥珀酸酯。
在氮气下，在0℃和搅拌下，向1.00g(2.5mmol)的5α-胆甾烷 -3β-醇在50ml二氯甲烷中的溶液中加入672mg(3.8mmol)的琥珀酸 单叔丁酯、235mg(1.9mmol)的DMAP和958mg(5.0mmol)的EDC盐酸 盐。在30分钟后，使混合物恢复到室温并搅拌1小时。然后溶液用 10％w/v柠檬酸溶液、饱和NaHCO3溶液和饱和NaCl溶液洗涤。然后用 无水硫酸钠干燥，过滤并蒸干。固体用20ml三氟乙酸和1ml水的混合 物处理，得到的溶液在室温下搅拌2小时，蒸干，得到830mg的白色 固体。
实施例65.HA-6-NH-CO-(CH2)2-CO-3β-O-5α-胆甾烷。
在氮气下，向252mg(0.46mmol)的5α-胆甾烷-3β-醇半琥珀酸 酯在12ml DMSO中的溶液中加入80mg(0.70mmol)的NHS和71μL (0.46mmol)的二异丙基碳二亚胺。在室温下搅拌18小时后，加入得自 实施例21的300mg(0.46mmol)的6-NH2-HA TBA盐并继续搅拌6小时。 然后加入1.5ml的饱和NaCl溶液并继续搅拌30分钟。将混合物倾入 到25ml EtOH中然后过滤。固体用EtOH洗涤，然后被溶解在20ml的 0.1N NaOH溶液中。在搅拌10分钟后，溶液用0.1N HCl溶液中和， 超滤并冷冻干燥，得到197mg的白色固体(酰基形式的DS为13％，通 过1H NMR测定)。
或者，从得自实施例28的200mg的6-NH2-HA TBA盐开始，获得 124mg的白色固体(酰基形式的DS为：6％摩尔/摩尔，通过1H NMR测 定)。
实施例66.HA-6-NH-(N-Cbz-脯氨酰基(prolinoyl))。
在氮气下，向114mg(0.46mmol)的N-Cbz-L-脯氨酸在12ml DMSO 中的溶液中加入80mg(0.70mmol)的NHS和71μL(0.46mmol)的二异 丙基碳二亚胺。在室温下搅拌18小时后，加入得自实施例21的 300mg(0.46mmol)的6-NH2-HA TBA盐，并继续搅拌6小时。然后加入 1.5ml的饱和NaCl溶液并继续搅拌30分钟。将混合物倾入到25ml EtOH 中然后过滤。固体用EtOH洗涤，然后被溶解在20ml的0.1N NaOH溶 液中。在搅拌10分钟后，溶液用0.1N HCl溶液中和，超滤并冷冻干 燥，得到182mg的白色固体(酰基形式的DS为13％，通过1H NMR测定)。
或者，从得自实施例26的200mg的6-NH2-HA TBA盐开始，获得 113mg的白色固体(酰基形式的DS为：11％摩尔/摩尔，通过1H NMR 测定)。
实施例67.HA-6-NH-(S)-CH(COOH)-(CH2)4-NH2。
在氮气下，在室温和搅拌下，向得自实施例14的250mg (0.403mmol)的HA-6-O-Ms在10ml DMSO中的溶液中加入69μL (0.403mmol)的DIEA和295mg(2.02mmol)的L-赖氨酸。将溶液加热 到70℃并搅拌18小时。然后将其冷却，倾入到水中，用稀HCl溶液 中和，用2ml的饱和NaCl溶液处理，超滤和冷冻干燥，得到140mg 的米白色固体(赖氨酸形式的DS为30％摩尔/摩尔，通过1H NMR 测定)。
实施例68.HA-6-O-CO-(CH2)2-NHCbz。
在氮气下，在室温和搅拌下，向得自实施例13的1.00g(1.40mmol) 的6-OMs-HA TBA盐和937mg(4.2mmol)的Cbz-β-Ala在25ml DMSO 中的溶液中加入236mg(0.70mmol)的无水碳酸铯。然后将混合物加热 到70℃并搅拌18小时。然后将其冷却并倾入到水(100ml)中。调节pH 在6.5-7之间，并加10ml的饱和NaCl溶液。溶液经过超滤和冷冻 干燥，得到550mg的白色固体。Cbz-β-Ala形式的DS通过质子NMR 测定为18％摩尔/摩尔。
实施例69.HA-6-O-CO-(CH2)2-NH2。
通过几次真空/氮气循环进行吹扫之后，向得自实施例68的100mg 的HA-6-O-CO-(CH2)2-NHCbz和120mg的甲酸铵在2ml水中的溶液中加 入20mg的10％Pd/C(湿)。将混合物搅拌18小时，然后将其离心并 过滤通过硅藻土短柱。在超滤和冷冻干燥之后，获得80mg的米白色固 体，质子NMR显示Cbz被完全除去。
实施例70.TFA·H2N-Phe-Gly-20-O-CPT。
在氮气下，在室温和搅拌下，向348mg(1.00mmol)的CPT在20ml DCM中的悬浮液中加入482mg(1.5mmol)的Boc-HN-Phe-Gly-OH、158mg (1.3mmol)的DMAP和309μL(2.0mmol)的DIPC。在16小时后，得到 的溶液用0.1N HCl溶液和饱和NaHCO3溶液洗涤，然后用无水硫酸钠 干燥，过滤并蒸干。固体残余物从甲醇/乙醚中重结晶，得到350mg 固体。将该固体溶解在TFA在DCM中的20ml的80％溶液中并在室温下 搅拌2小时。减压除去溶剂，并通过与小份二乙醚共蒸发除去痕量的 TFA，残余物从MeOH/二乙醚中结晶，获得320mg的固体。
实施例71.HOOC-(CH2)2CO-Phe-Gly-20-O-CPT。
在氮气下，在室温和搅拌下，向60mg(0.60mmol)的琥珀酸酐、 171μL(1.0mmol)的DIEA和12mg(0.1mmol)的DMAP在20ml DCM中的 溶液中加入得自实施例70的320mg(0.52mmol)的 TFA·H2N-Phe-Gly-20-O-CPT。在16小时后，溶液用20ml DCM稀释， 用0.1N HCl溶液洗涤和用无水硫酸钠干燥。在过滤和蒸发溶剂之后， 残余物从MeOH/二乙醚中结晶，获得150mg的浅黄色固体。
实施例72.HA-6-NH-CO-(CH2)2-CO-HN-Phe-Gly-20-O-CPT。
在氮气下，在室温和搅拌下，向得自实施例71的75mg(0.105mmol) 的HOOC-(CH2)2CO-Phe-Gly-20-O-CPT在1ml DMSO中的溶液中加入 18.2mg(0.158mmol)的NHS和16μL(0.105mmol)的DIPC。在16小时 后，加入得自实施例21的71mg(0.11mmol)的6-NH2-HA TBA盐并继 续搅拌6小时。然后加入0.15ml的饱和NaCl溶液，并将混合物搅拌 30分钟。然后在搅拌下加入6ml的EtOH并将混合物过滤，固体用DMF 和EtOH洗涤，然后被溶解在5ml水中并用水渗析。冷冻干燥，得到 45mg的白色固体。CPT形式的DS通过质子NMR测定为：13％摩尔/摩 尔。
或者，从得自实施例26的200mg的6-NH2-HA TBA盐开始，获得 128mg的白色固体(酰基形式的DS为：12％摩尔/摩尔，通过1H NMR 测定)。
实施例73.TFA·H2N-Phe-Leu-Gly-20-O-CPT。
在氮气下，在室温和搅拌下，向348mg(1.00mmol)的CPT在20ml DCM中的悬浮液中加入653mg(1.5mmol)的Boc-HN-Phe-Leu-Gly-OH、 158mg(1.3mmol)的DMAP和309μL(2.0mmol)的DIPC。在16小时后， 得到的溶液用0.1N HCl溶液和饱和NaHCO3溶液洗涤，然后用无水硫 酸钠干燥，过滤并蒸干。固体残余物从MeOH/二乙醚中重结晶，以获 得480mg的固体。将该固体溶解在TFA在DCM中的5ml的40％溶液中 并在室温下搅拌2小时。减压除去溶剂并通过与小份二乙醚共蒸发除 去痕量的TFA，获得492mg的固体残余物。
实施例74.HOOC-(CH2)2CO-Phe-Leu-Gly-20-O-CPT。
在氮气下，在室温和搅拌下，向得自实施例73的492mg(0.63mmol) 的TFA·H2N-Phe-Leu-Gly-20-O-CPT在10ml DMF中的溶液中加入 109mg(0.63mmol)的琥珀酸单叔丁酯、85mg(0.63mmol)的HOBt、216μL (1.26mmol)的DIEA和146mg(0.76mmol)的EDC盐酸盐。然后将反应 混合物过夜达到室温。减压除去溶剂，残余物在EtOAc和水之间分配。 水相用EtOAc提取。合并的有机相用10％枸橼酸、饱和NaHCO3溶液和 盐水洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，过滤并蒸发。将残余物溶解在TFA 在DCM中的5ml的40％溶液中。2小时后，减压除去它们并通过与小份 二乙醚共蒸发除去痕量的TFA，获得490mg的固体。
实施例75.HA-6-NH-CO-(CH2)2-CO-HN-Phe-Leu-Gly-20-O-CPT。
在氮气下，在室温和搅拌下，向得自实施例74的490mg(0.63mmol) 的HOOC-(CH2)2CO-Phe-Leu-Gly-20-O-CPT在20ml DMSO中的溶液中 加入108mg(0.90mmol)的NHS、154μL(0.90mmo l)的DIEA和132mg (0.70mmol)的EDC盐酸盐。在16小时后，加入得自实施例21的390mg (0.63mmol)的6-NH2-HA TBA盐并继续搅拌6小时。然后加入2ml的饱 和NaCl溶液并将混合物搅拌30分钟。然后在搅拌下加入80ml的EtOH， 并将混合物过滤。固体用DMF和EtOH洗涤，然后溶解在15ml水中并 用水渗析。冷冻干燥，得到194mg的白色固体。CPT形式的DS通过质 子NMR测定为13％摩尔/摩尔。
或者，从得自实施例26的300mg的6-NH2-HA TBA盐开始，获得 222mg的白色固体(酰基形式的DS为：12％摩尔/摩尔，通过1H NMR 测定)。
实施例76.CPT-20-O-CO-(CH2)2-CO-HN-Gly-Phe-6-HN-HA。
在氮气下，在搅拌下，向280mg(1.0mmol)的 TFA·H2N-Gly-Phe-OtBu在20ml DMF中的溶液中加入得自实施例34 的450mg(1.0mmol)的CPT半琥珀酸酯、135mg(1.0mmol)的HOBt、 342μL(2.0mmol)的DIEA和230mg(1.2mmol)的EDC盐酸盐。然后将 反应混合物过夜达到室温。减压除去溶剂，并将残余物在EtOAc和水 之间分配，水相用EtOAc提取。合并的有机相用10％枸橼酸、饱和NaHCO3 溶液和盐水洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，过滤并蒸干。将残余物溶 解在TFA在DCM中的8ml的40％溶液中。在2小时后，减压除去溶剂 并通过与小份二乙醚共蒸发以除去痕量的三氟乙酸，获得固体。在氮 气下，在室温和搅拌下，向溶解在20ml DMSO中的该固体中加入172mg (1.5mmol)的NHS、171μL(0.90mmol)的DIEA和154μL(1.0mmol)的 DIPC。在16小时后，加入得自实施例19的620mg(0.63mmol)的 6-NH2-HA TBA盐并继续搅拌6小时。然后加入2ml的饱和NaCl溶液并 将混合物搅拌30分钟。然后在搅拌下加入100ml的EtOH并将混合物 过滤。固体用DMF和EtOH洗涤，然后溶解在20ml水中并用水渗析。 冷冻干燥，得到406mg的白色固体，CPT形式的DS通过质子NMR测定 为：20％摩尔/摩尔。
或者，从得自实施例26的300mg的6-NH2-HA TBA盐开始，获得 205mg的白色固体(酰基形式的DS为：12％摩尔/摩尔，通过1H NMR 测定)。
实施例77：抗增殖活性
在三个癌系(对CPT敏感的HT29：结肠直肠癌，H460：肺癌，H460M2： 肺转移癌)上测定DDS的抗增殖活性。将细胞在96孔板中、在补充有 以下成分的完全RPMI1640培养基(Sigma Chemical Co.)中在37℃下 在受控气氛(5％CO2)中与伊立替康和实施例38、39、41中的DDS进 行温孵：10％FBS(Hyclone Europe)、2mM L-谷氨酰胺(Hyclone Europe)和100U/ml青霉素G和100ug/ml链霉素(Sigma Chemical Co.)；在与参考剂量(在3-30nM和0.1-30μM的范围内)等摩尔 的剂量下检测DDS。
在第6天(治疗5天后)通过MTT试验测定细胞毒性，测量在蓝 色甲暨中通过线粒体脱氢酶向MTT四唑盐转化的细胞代谢能力来测量 细胞存活力，用分光光度计在570nm处读蓝色。试验了以下的DDS。
实施例 取代％ 实施例41 2％ 实施例39 7％ 实施例38 13％
本发明的DDS对各种肿瘤细胞的抗肿瘤作用如表A所报道；将这 些DDS的作用与伊立替康的作用进行比较。该参考物是目前用于治疗 中的CPT类似物；CPT不溶于含水溶液中，因此其不能用于治疗，并 且由于这两个原因，其不是适当的参考物。
表A显示了DDS和伊立替康将各种肿瘤系的细胞生长降低到对照 生长的50％时所必需的浓度值(IC50，μM)。
表A
细胞系 伊立替康 实施例41 实施例39 实施例38 HT29 (结肠直肠癌) 250.00 29.33 29.02 37.85 H460 (肺癌) 440.00 14.11 9.52 32.33 H460-M2 (肺转移癌) 460.00 23.30 33.11 47.50
这些数据显示本发明的DDS具有非常高的抗增殖活性。6-NH2-HA 和HA-6-NH-琥珀酸酯，作为制备最终DDS中所用的中间体化合物，也 在相同条件下进行了试验，并且该试验显示它们无细胞毒性。
实施例78：HA-6-NH-萘普生。
在氮气下，在室温和搅拌下，向93mg(0.403mmol)的萘普生和70mg (0.604mmol)的N-羟基琥珀酰亚胺在2ml二甲基亚砜中的溶液中加入 62μL(0.403mmol)的二异丙基碳二亚胺。在3小时后，加入得自实施 例19的250mg(0.403mmol)的HA-6-NH2TBA盐并继续搅拌16小时。 然后加入1.0ml的饱和NaCl溶液并继续搅拌30分钟。在搅拌下将混 合物倾入到15ml EtOH中，得到的浆料搅拌10分钟，然后过滤并用 EtOH洗涤。将固体溶解在15ml的0.1N NaOH溶液中。在搅拌10分钟 后，溶液用1N HCl溶液中和并用水渗析。然后将溶液过滤通过0.22μ 孔径大小的膜并冷冻干燥，得到128mg的白色固体。萘普生形式的DS 通过质子NMR测定为：20％摩尔/摩尔。
或者，从得自实施例26的200mg的HA-6-NH2TBA盐开始，获得 125mg的白色固体(萘普生形式的DS为：13％摩尔/摩尔，通过1H NMR 测定)。
实施例79：HA-6-NH-赖诺普利。
在氮气下，在室温和搅拌下，向178mg(0.403mmol)的赖诺普利 和70mg(0.604mmol)的N-羟基琥珀酰亚胺在2ml二甲基亚砜中的溶液 中加入62μL(0.403mmol)的二异丙基碳二亚胺。在3小时后，加入如 在实施例19中制得的250mg(0.403mmol)的HA-6-NH2TBA盐并继续搅 拌16小时。然后加入1.0ml的饱和NaCl溶液并继续搅拌30分钟。在 搅拌下将混合物倾入到15ml EtOH中，得到的浆料搅拌10分钟，然后 过滤并用EtOH洗涤。将固体溶解在15m l的0.1N NaOH溶液中。搅拌 10分钟后，溶液用1N HCl溶液中和并用水渗析。然后将溶液过滤通 过0.22μ孔径大小的膜并冷冻干燥，得到140mg的白色固体。赖诺普 利形式的DS通过质子NMR测定为：18％摩尔/摩尔。
或者，从如在实施例26中制得的200mg的HA-6-NH2TBA盐开始， 获得136的白色固体(赖诺普利形式的DS为：13％摩尔/摩尔，通过1H NMR测定)。
实施例80：HA-6-NH-萘啶酸化物。
在氮气下，在室温和搅拌下，向94mg(0.403mmol)的萘啶酸和70mg (0.604mmol)的N-羟基琥珀酰亚胺在2ml二甲基亚砜中的溶液中加入 62μL(0.403mmol)的二异丙基碳二亚胺。在3小时后，加入如在实施 例19中制得的250mg(0.403mmol)的HA-6-NH2TBA盐并继续搅拌16 小时。然后加入1.0ml的饱和NaCl溶液并继续搅拌30分钟。在搅拌 下将混合物倾入到15ml EtOH中，得到的浆料搅拌10分钟，然后过滤 并用EtOH洗涤。将固体溶解在15ml的0.1N NaOH溶液中。搅拌10 分钟后，溶液用1N HCl溶液中和并用水渗析。然后将溶液过滤通过 0.22μ孔径大小的膜并冷冻干燥，得到132mg的白色固体，萘啶酸化 物形式的DS通过质子NMR测定为：19％摩尔/摩尔。
或者，从如在实施例26中制得的200mg的HA-6-NH2TBA盐开始， 获得127mg的白色固体(萘啶酸化物形式的DS为：12％摩尔/摩尔，通 过1H NMR测定)。
实施例81：HA-6-NH-青霉素G。
在氮气下，在室温和搅拌下，向144mg(0.403mmol)的青霉素G 钠盐和70mg(0.604mmol)的N-羟基琥珀酰亚胺在2ml二甲基亚砜中的 溶液中加入62μL(0.403mmol)的二异丙基碳二亚胺，在3小时后，加 入如在实施例19中制得的250mg(0.403mmol)的HA-6-NH2TBA盐并继 续搅拌16小时。然后加入1.0ml的饱和NaCl溶液并继续搅拌30分钟。 在搅拌下将混合物倾入到15ml EtOH中，得到的浆料搅拌10分钟，然 后过滤并用EtOH洗涤。将固体溶解在15ml的0.1N NaOH溶液中。搅 拌10分钟后，溶液用1N HCl溶液中和并用水渗析。然后将溶液过滤 通过0.22μ孔径大小的膜并冷冻干燥，得到126mg的白色固体，青霉 素G形式的DS通过质子NMR测定为：16％摩尔/摩尔。
或者，从如在实施例26中制得的200mg的HA-6-NH2TBA盐开始， 获得119mg的白色固体(青霉素G形式的DS为11％摩尔/摩尔，通过 1H NMR测定)。
实施例82：HA-6-NH-头孢唑林。
在氮气下，在室温和搅拌下，向192mg(0.403mmol)的头孢唑林 钠盐和70mg(0.604mmol)的N-羟基琥珀酰亚胺在2ml二甲基亚砜中的 溶液中加入62μL(0.403mmol)的二异丙基碳二亚胺。在3小时后，加 入如在实施例19中制得的250mg(0.403mmol)的HA-6-NH2TBA盐并继 续搅拌16小时。然后加入1.0ml的饱和NaCl溶液并继续搅拌30分钟， 在搅拌下将混合物倾入到15ml EtOH中，得到的浆料搅拌10分钟。然 后过滤并用EtOH洗涤。将固体溶解在15ml的0.1N NaOH溶液中。搅 拌10分钟后，溶液用1N HCl溶液中和并用水渗析。然后将溶液过滤 通过0.22μ孔径大小的膜并冷冻干燥，得到129mg的白色固体。头孢 唑林形式的DS通过质子NMR测定为：17％摩尔/摩尔。
或者，从如在实施例26中制得的200mg的HA-6-NH2TBA盐开始， 获得121mg的白色固体(头孢唑林的DS为：10％摩尔/摩尔，通过1H NMR 测定)。
实施例83：HA-6-NH-Phe-Leu-Gly-Cbz。
在氮气下，在室温和搅拌下，向152mg(0.323mmol)的 Cbz-Gly-Leu-Phe-OH和56mg(0.484mmol)的N-羟基琥珀酰亚胺在4mL 二甲基亚砜中的溶液中加入50μL(0.323mmol)的二异丙基碳二亚胺。 在16小时后，加入得自实施例21的200mg(0.323mmol)的6-NH2-HA TBA盐并继续搅拌5小时。然后加入0.40ml的饱和NaCl溶液并继续 搅拌30分钟。在搅拌下将混合物倾入到15ml EtOH中，得到的浆料搅 拌10分钟，然后过滤并用EtOH洗涤。将固体溶解在15ml水中并用水 渗析。然后将溶液过滤通过0.22μ孔径大小的膜并冷冻干燥，得到145 毫克的白色固体。Phe-Leu-Gly-Cbz形式的DS通过质子NMR测定为： 13％摩尔/摩尔。
实施例84.HA-6-NH-Phe-Leu-Gly-NH2。
将得自实施例83的140mg(0.304mmol)的 HA-6-HN-Phe-Leu-Gly-Cbz溶解在包含100mg(1.6mmol)甲酸铵的3mL 水中。通过几次真空/氮气循环进行吹扫后，向溶液中加入80mg的10％ Pd/C(湿)，然后在室温下搅拌18小时。用水稀释到16mL后，将混合 物离心并弃去固体。得到的带黑色的溶液通过硅藻土短柱，经过浓缩 和冷冻干燥，得到113mg的米白色固体，通过在用TBA活化的安珀莱 特上进行离子交换被转化为相应的TBA盐。Phe-Leu-Gly形式的DS通 过质子NMR测定为：13％摩尔/摩尔。
实施例85.HA-6-NH-Phe-Leu-Gly-NH-MTX-OH。
在氮气下，在室温和搅拌下，向100mg(0.220mmol)的MTX和38mg (0.330mmol)的NHS在5mL无水DMSO中的溶液中加入35μL(0.220 mmol)的二异丙基碳二亚胺。在16小时后，加入得自实施例84的150 mg(0.226mmol)的HA-6-NH-Phe-Leu-Gly-NH2TBA盐并继续搅拌5小 时。然后加入0.50ml的饱和NaCl溶液并继续搅拌30分钟。在搅拌下 将混合物倾入到20ml EtOH中，得到的浆料搅拌10分钟，然后过滤并 用EtOH洗涤。将固体溶解在15ml水中并用水渗析。然后将溶液过滤 通过0.22μ孔径大小的膜并冷冻干燥，得到110毫克的带黄色的固体， MTX形式的DS通过质子NMR测定为：13％摩尔/摩尔。
实施例86：HA-6-NH-Phe-Gly-Cbz。
在氮气下，在室温和搅拌下，向114mg(0.323mmol)的Cbz-Gly- Phe-OH和56mg(0.484mmol)的N-羟基琥珀酰亚胺在4mL二甲基亚砜 中的溶液中加入50μL(0.323mmol)的二异丙基碳二亚胺。在16小时 后，加入得自实施例21的200mg(0.323mmol)的6-NH2-HA TBA盐并 继续搅拌5小时。然后加入0.40ml的饱和NaCl溶液并继续搅拌30 分钟。在搅拌下将混合物倾入到15ml EtOH中，得到的浆料搅拌10 分钟，然后过滤并用EtOH洗涤，将固体溶解在15ml水中并用水渗析， 然后将溶液过滤通过0.22μ孔径大小的膜并冷冻干燥，得到135毫克 的白色固体，Phe-Gly-Cbz形式的DS通过质子NMR测定为：13％摩尔 /摩尔。
实施例87：HA-6-NH-Phe-Gly-NH2。
将得自实施例86的130mg(0.30mmol)的HA-6-HN-Phe-Gly-Cbz 溶解在包含95mg(1.5mmol)甲酸铵的3mL水中。通过几次真空/氮气 循环进行吹扫后，向溶液中加入80mg的10％Pd/C(湿)，然后在室温 下搅拌18小时。用水稀释到16mL后，将混合物离心并弃去固体。得 到的带黑色的溶液通过硅藻土短柱，经过浓缩和冷冻干燥，得到115mg 的米白色固体，通过在用TBA活化的安珀莱特上进行离子交换被转化 为相应的TBA盐。Phe-Gly形式的DS通过质子NMR测定为：13％摩尔 /摩尔。
实施例88：HA-6-NH-Phe-Gly-NH-MTX-OH。
在氮气下，在室温和搅拌下，向100mg(0.220mmol)的MTX和38mg (0.330mmol)的NHS在5mL无水DMSO中的溶液中加入35μL(0.220 mmol)的二异丙基碳二亚胺。在16小时后，加入得自实施例87的150 mg(0.231mmol)的HA-6-NH-Phe-Gly-NH2TBA盐并继续搅拌5小时。 然后加入0.50ml的饱和NaCl溶液并继续搅拌30分钟。在搅拌下将混 合物倾入到20ml EtOH中，得到的浆料搅拌10分钟，然后过滤并用 EtOH洗涤。将固体溶解在15ml水中并用水渗析。然后将溶液过滤通 过0.22μ孔径大小的膜并冷冻干燥，得到105毫克的带黄色的固体。 MTX形式的DS通过质子NMR测定为：13％摩尔/摩尔。
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