生物材料及其用途
阅读：489发布：2023-03-02
专利汇可以提供生物材料及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且提供了调节慢性 炎症 反应的 试剂 ，其中所述试剂调节生 腱 蛋白‑C的 生物 活性。还提供了鉴定调节生腱蛋白‑C和慢性炎症的试剂的方法。还提供了所述试剂的用途。，下面是生物材料及其用途专利的具体信息内容。
1.一种试剂在制备用于治疗与特征为不适当的炎症的病症相关的慢性炎症反应的药物中的用途，其中，所述试剂下调生腱蛋白-C的生物活性，并且所述试剂为对生腱蛋白-C的FBG结构域具有特异性的抗体或其抗体片段。
2.如权利要求1所述的用途，其中，所述试剂是生腱蛋白-C的结合特性的抑制剂。
3.根据权利要求1所述的用途，其中，所述抗体或其抗体片段选自Fv片段、scFv片段、Fab、单可变域和域抗体。
4.如权利要求1所述的用途，其中，所述抗体或其抗体片段是人源化的。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其中，所述慢性炎症反应与自身免疫性病症有关。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其中，所述慢性炎症反应与类风湿性关节炎(RA)、炎性肠病、非愈合性伤口、癌症、动脉粥样硬化、糖尿病、红斑狼疮、哮喘、纤维化疾病、UV损伤或银屑病有关。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其中，所述慢性炎症反应与多发性硬化有关。
8.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其中，所述慢性炎症反应与舍格伦病有关。
9.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其中，所述慢性炎症反应与肺纤维化有关。
10.根据权利要求6所述的用途，其中，所述红斑狼疮为系统性红斑狼疮。
11.根据权利要求6所述的用途，其中，所述纤维化疾病为肝硬化。
12.根据权利要求6所述的用途，其中，所述慢性炎症反应与类风湿性关节炎(RA)、炎性肠病、动脉粥样硬化和/或银屑病有关。
13.根据权利要求12所述的用途，其中，所述慢性炎症反应为类风湿性关节炎。
14.根据权利要求12所述的用途，其中，所述慢性炎症反应为炎性肠病。
15.根据权利要求12所述的用途，其中，所述慢性炎症反应为动脉粥样硬化。
16.根据权利要求12所述的用途，其中，所述慢性炎症反应为银屑病。
17.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其中，所述试剂下调所述慢性炎症反应。
18.组合物在制备用于调节与特征为不适当的炎症的病症相关的慢性炎症反应的药物中的用途，所述组合物包含如权利要求1-17中任一项所限定的试剂和药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。
19.如权利要求18所述的用途，还包含至少一种其他试剂。
20.如权利要求19所述的用途，其中，所述至少一种其他试剂是抗炎剂、他汀类、生物剂、免疫抑制剂、水杨酸盐和/或杀微生物剂。
21.如权利要求20所述的用途，其中，所述至少一种其他试剂是生物制品。
22.如权利要求20所述的用途，其中，所述抗炎剂选自非甾体抗炎剂(NSAID)、皮质类固醇或缓解疾病的抗风湿性药物(DMARD)。
生物材料及其用途
[0002] 炎症是组织对有害刺激例如病原体、组织损伤或刺激物的复杂生物反应。其是组织为了去除致害（injurious）刺激以及启动组织的愈合过程进行的保护性攻击。与炎症有关的异常包括一大组不相关的异常，该异常是多种人类疾病（炎性疾病）的基础。具有炎症表现的疾病的实例包括（但不限于）：哮喘、自身免疫性疾病、肾小球肾炎、过敏症（超敏反应）、炎性肠病、再灌注损伤、类风湿性关节炎和移植排斥。
[0003] 特别地，慢性炎症是与上述疾病的多种相关的虚弱和严重的病情，并且其特征是，在感染或损伤部位的持久炎症，或者涉及免疫应答的改变，例如在自身免疫性疾病中。
[0004] 类风湿性关节炎(RA)虽然不是唯一的，但却是慢性炎症性病情的典型实例。RA的特征在于，由促炎细胞因子和基质金属蛋白酶(MMP)的持久合成所介导的滑膜炎以及关节软骨和骨的破坏。抑制炎症细胞因子例如TNFα和IL-6的合成的生物化合物在长期治疗RA方面是成功的。然而，需要重复治疗使得该生物化合物成为昂贵的治疗方法，并且不能提供长期缓解。此外，对细胞因子功能进行完全的全身性抑制并非没有内在的问题，例如感染风险的增加。因此，尽管在护理中有进步，但是其仍未满足在长时间内有效的经济的慢性炎症的治疗的需要(Smolen(2006)和Williams(2007))。
[0005] 支撑疾病的慢性的机制仍然不清楚并且促使炎症介质和破坏介质延长表达的因素（或多种因素）目前尚未知晓。
[0006] Toll样受体(TLR)在推动RA中炎症介质的生成中起关键作用，而TLR功能的阻滞在临床上可以是有显著的益处的(在Brentano(2005)和O’Neill(2002)中综述)。该受体家族形成免疫系统的完整部分。TLR通过识别病原相关分子模式(PAMPs)和损伤相关分子模式(DAMPs)来介导宿主防御感染和损伤(Matzinger(2002))。DAMP是根据组织损伤而产生的内源性促炎分子并且包括由损伤细胞或坏死细胞释放的细胞内分子、细胞外基质(ECM)分子的片段或对损伤上调的ECM分子(在Bianchi(2007)和Gordon(2002)中综述)。
[0007] 在活化后，TLR促进先天免疫应答和后天免疫应答，包括：促炎细胞因子和MMPs的表达的刺激(Medzhitov(2002))。TLR在来自RA患者的滑膜组织中高水平表达(Radstake(2004)、Roelofs(2005)、Sacre(2007)和(Sacre,2008年提交的原稿)，并且其保护在TLR4中具有靶向的删除以及功能的丧失的突变的小鼠免受实验性关节炎(Choe(2003)和Lee(2005)。此外，TLR4的抑制剂可以减轻小鼠的破坏性关节炎(Abdollahi-Roodsaz(2007))，而在1期预试验中假定的TLR4抑制剂使23例患有中度至重度RA的患者中的15例的症状得到改善(Vanags(2006)。然而，在疾病发病机制中涉及哪种TLR配体（或多种配体）不清楚。
[0008] 生腱蛋白-C是与组织损伤和伤口修复有关的ECM糖蛋白。生腱蛋白-C在胚胎发生过程中的活性组织再造时特异性表达，所述的表达在原肠胚形成和体节形成过程中最先观察到。在发育的随后阶段，表达限于乳腺和肺的分支形态发生的部位、正在发育的骨骼中、心血管系统中和上皮到间质转化部位的连接组织。一旦这些过程停止并且在胚胎发生结束之前，该表达下调(Jones(2000)。
[0009] 生腱蛋白-C在健康成人组织中不是通常地表达的，但在成人中，在极性炎症过程中特异性地并且短暂地被上调，而在慢性炎症中被持久地表达(Chiquet-Ehrismann(2003)中综述)。免疫组织化学研究显示，生腱蛋白-C在正常的人类关节中有少量表达，但在RA滑膜中；在炎症和纤维化的区域中，特别地在滑膜衬里以下的区域中；在侵袭血管翳和血管周围，生腱蛋白-C的表达水平极大地增加(Cutolo(1992)、MacCachren(1992)和Salter(1993))。在RA患者的滑膜流体中(Chevalier(1994)和Hasegawa(2007))以及在RA软骨(Salter(1993)和Chevalier(1994))中，生腱蛋白-C的水平也显著性增加。
[0010] 生腱蛋白-C是150万Da的大的六聚体蛋白。每条链包含不同的结构域，所述的链包括装配结构域(assembly domain)（TA）、EGF样结构域(EGF-like repeats)（EGF-L)、III型纤维蛋白样重复(fibronectin type III-like repeats)（TNIII)和纤维蛋白原样结构域(fibrinogen-like globe,FBG)(Orend(2005)中综述)。生腱蛋白-C的序列和其结构域显示于图13中。
[0011] 在之前，炎症中生腱蛋白-C的作用尚不确定，并且有证据表明对不同免疫细胞的作用不同。例如，生腱蛋白-C已经显示，支持原代人类外周血液和扁桃体淋巴细胞粘合和压延加工，从而暗示了在刺激淋巴细胞转移中的作用(Clark(1997))。此外，对于小鼠中伴刀豆球蛋白A诱导的肝损伤，生腱蛋白-C基因敲除小鼠（tenascin-C-null mice）展示了降低的淋巴细胞浸润和较低水平的IFN、TNF和IL-4mRNA(El-Karef(2007))。因此，证据表明，生腱蛋白-C涉及提高急性炎症细胞的活性。然而，还报道了生腱蛋白-C在体外抑制单核细胞趋药性(Loike(2001))，并且生腱蛋白-C基因敲除小鼠展示了哺乳动物肿瘤间质组织中单核细胞和巨噬细胞迁移的增加(Talts(1999))。该证据因此显示生腱蛋白-C具有抑制炎症细胞的作用。
[0012] 发明人已表明，生腱蛋白-C是内源性TLR4配体，所述内源性TLR4配体对于关节炎中观察到的破坏性关节炎症是必需的。
[0013] 此外，现在表明生腱蛋白-C不涉及炎症（急性炎症反应）的诱导，但涉及表征慢性炎症病情的炎症反应的延长。特别地，现已表明生腱蛋白-C是TLR4的内源性活化剂，并且证实了该分子对于破坏性关节炎是必需的。
[0014] 基于在小鼠体内，将生腱蛋白-C的FBG结构域注射到关节内，通过诱导关节炎证实了在关节中生腱蛋白-C在介导免疫应答中的作用。此外，由酵母多糖诱导的急性关节炎在生腱蛋白-C缺陷型小鼠中未被延长。野生型和生腱蛋白-C基因敲除小鼠对酵母多糖诱导的急性关节炎反应相同，证实了生腱蛋白-C似乎不涉及炎症的启动。然而，生腱蛋白-C基因敲除小鼠展示不太持久的滑膜炎显示了在关节炎的维持中的作用。生腱蛋白-C的靶向删除在用mBSA免疫而诱导的关节炎过程中保护小鼠免受持续侵蚀关节炎之害，这一观察结果强调了生腱蛋白-C在延长关节炎中的重要性。
[0015] 现已表明生腱蛋白-C能够激活关节中的细胞，并且已将生腱蛋白-C的主要活性域对应于纤维蛋白原样结构域(FBG)，其为在分子的C端227个氨基酸(26.9kDa)的球状结构域(Siri(1991))。
[0016] 在来自RA患者的滑膜培养物中，FBG的加入增强了促炎细胞因子的自发释放。该加入通过TLR4和MyD88依赖性信号途径的激活还刺激初级人类巨噬细胞中的TNF-α、IL-6和IL-8的合成，和RA滑膜成纤维细胞中的IL-6的合成。
[0017] 现已表明，如同LPS的情况下，TLR4表达对于由FBG诱导的细胞因子合成是必需的。然而，与LPS不同，无论是CD14还是MD-2都不表现为对于TLR-4活化而言必需的。对于其他配体激活TLR4来说，CD14是可有可无的。对于TLR4来说，以MyD88依赖性方式对脂质A作出响应不是必需的(Jiang(2005))，甚至在无CD14时纤连蛋白EDA也可以激活肥大细胞，
(Gondokaryono(2007))，而人类单核细胞THP-1细胞的透明质酸活化需要TLR4、CD44和MD-2的复合物，但不需要CD14(Taylor(2007))。
(Gondokaryono(2007))，而人类单核细胞THP-1细胞的透明质酸活化需要TLR4、CD44和MD-2的复合物，但不需要CD14(Taylor(2007))。
[0018] 由各个TLR4配体形成不同的受体复合物可以促进不同的细胞内衔接/信号分子的募集。这可以解释我们观察到FBG和LPS有不同的细胞响应，例如在RA滑膜成纤维细胞中由FBG诱导的IL-8的缺乏。类似地，TLR4和CD44复合体的透明质酸活化诱导了小鼠肺泡巨噬细胞细胞系基因表达样式与LPS所诱导的的不同(Taylor(2007))。FBG诱导人类巨噬细胞中IL-8的合成暗示发生了对细胞类型的特异性配体的识别和/或信号传输。
[0019] 生腱蛋白-C的表达的紧密调节样式使其成为治疗慢性炎症的有吸引力的靶。其主要地在健康的成年人中缺乏，而表达是当组织损伤是特异性地诱导的。在急性炎症过程中，生腱蛋白-C短暂地表达：诱导常常在炎症之前进行，而在炎症消退时，在组织中不存在其mRNA和蛋白质(于Chiquet-Ehrismann(2003)中综述)。
[0020] 现已显示，生腱蛋白-C的持久表达与慢性炎症有关。除了RA之外，在其他包括多发性硬化(Gutowski(1999))和Sjogrens疾病(Amin(2001))在内的自身免疫性疾病和不愈合性伤口以及糖尿病性和静脉性溃疡(Loots(1998))中观察到提高的生腱蛋白-C的水平。生腱蛋白-C的从头合成与口腔粘膜疾病中炎症的严重程度具有很好的相关性，并且生腱蛋白-C的血浆水平是给药或手术之前和之后炎性肠病的活性的可靠指示剂(在Chiquet-Ehrismann中综述(2003))。
[0021] 在本发明的第一个方面，提供了用于慢性炎症反应的调节的试剂，其中所述试剂调节生腱蛋白-C的生物活性。
[0022] 本发明的第一个方面的试剂可以通过改变生腱蛋白-C的转录、翻译和/或结合性来调节生腱蛋白-C的生物活性。
[0023] 可以使用本领域熟知的方法来确定此种试剂，例如：
[0024] (a)通过测定测试试剂对生腱蛋白-C的表达水平的效应，例如通过DNA印迹或相关的杂交技术；
[0026] (c)通过测定测试试剂对生腱蛋白-C活性的功能性标记物或生腱蛋白-C活性的结果的效应，例如通过实例的方法。
[0027] 本发明的第一个方面的试剂可以下调生腱蛋白-C的生物活性。
[0028] 本发明的第一个方面的试剂可以上调生腱蛋白-C的生物活性。免疫性分子和细胞以及炎症性分子和细胞的上调活性的需要与对于免疫缺陷患者和炎症性患者以及在疫苗开发中治疗的产生有关(见Harandi(2009))。
[0029] 本发明的第一个方面的试剂可以是生腱蛋白-C的转录的抑制剂。
[0030] 本发明的第一个方面的试剂可以是生腱蛋白-C的翻译的抑制剂。
[0031] 本发明的第一个方面的试剂可以是生腱蛋白-C的结合性质的抑制剂。例如，该试剂可以改变生腱蛋白-C的构象，使得其不再能够结合到其受体。
[0032] 本发明的第一个方面的试剂可以是生腱蛋白-C的竞争性结合抑制剂。本领域的技术人员应理解，所述试剂也可以通过直接地（通过作为生腱蛋白-C受体拮抗剂起作用）或间接地（通过结合中间或辅助分子）阻滞生腱蛋白-C受体的功能来抑制生腱蛋白-C的生物活性。
[0033] 本发明的第一个方面的试剂可以是TLR-4受体的拮抗剂。
[0034] 本领域的技术人员应理解，本发明的试剂对生腱蛋白-C的生物活性的抑制可以是完全的或部分的。例如，与炎症细胞中的生腱蛋白-C在尚未暴露于所述试剂时的生物活性相比，所述试剂可以抑制至少10%的生腱蛋白-C的生物活性，优选地至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%，以及最优选地100%的生腱蛋白-C的生物活性。
[0035] 本发明的第一个方面的试剂可以选自短干扰RNA(SiRNA)分子、短发夹RNA分子(shRNA)、反义寡核苷酸、对生腱蛋白-C具有结合亲和性的化合物、抗体（多克隆的或单克隆的）和其抗原结合片段、小的抑制剂化合物、多肽和蛋白质。
[0036] 在本发明的一个实施方案中，所述试剂是siRNA。RNA干扰是两步过程。所述第一步，其被称为起始步骤，将导入的dsRNA消化为21-23个核苷酸（nt）的小干扰RNA(siRNA)，这很可能通过Dicer酶的作用进行，所述的Dicer酶是dsRNA特异性核糖核酸酶Rnase III家族的成员，其以ATP依赖性方式处理（剪切）dsRNA（直接引入或者经转基因或病毒引入）。相继的剪切事件使RNA降解为19-21bp的双链体(siRNA)，每条链的3’端具有2个游离核苷酸（2-nucleotide 3’overhangs）(Hutvagner&Zamore,2002,Curr.Opin.Genetics and Development 12:225-232;Bernstein,2001,Nature 409:363-366)。
[0037] 在效应子（effector）步骤中，所述的siRNA双链体与核酸酶复合体结合，从而形成RNA诱导的沉默复合物(RISC)。RISC的活化需要siRNA双链体的ATP依赖性解旋。活化的RISC随后通过碱基配对的相互作用靶向同源转录物并且从siRNA的3’端将mRNA剪切为12个核苷酸的片段(Hutvagner&Zamore,2002,supra.;Hammond等人,2001,Nat.Rev.Gen.2:110-119(2001);Sharp,2001,Genes.Dev.15:485-90)。尽管剪切的机制仍未阐明，但研究表明各个RISC包含单链siRNA和RNase(Hutvagner&Zamore,2002,supra.)。
[0038] 鉴于RNAi显著的有效性，已建议在RNAi途径内的扩增步骤。可以通过复制所导入的dsRNA或者通过复制所形成的siRNA使扩增发生，所述的dsRNA能产生更多的siRNA。可替代地或另外地，可以通过RISC的多次翻转事件（multiple turnover events）实现扩增(Hammond等人,2001,supra.;Hutvagner&Zamore,2002,supra.)。RNAi的其他信息可以在以下综述中找到，Tuschl,2001,Chem.Biochem.2:239-245,Cullen,2002,Nat.Immunol.3:597-599以及Brantl,2002,Biochem.Biophys Act.1575:15-25。
[0039] 适合用于本发明的RNAi分子的合成可以如下地实现。首先，在生腱蛋白-C mRNA序列中AUG起始密码子下游扫描寻找AA二核苷酸序列。将每个AA和其3’相邻的19个核苷酸的出现记录为潜在的siRNA靶位点。优选地，siRNA靶位点从开放阅读框中选择，因为非翻译区域（UTR）中调节蛋白的结合位点更为丰富。UTR结合蛋白和/或翻译起始复合物可以干扰siRNA核酸内切酶复合物的结合(Tuschl,ChemBiochem.2:239-245)。然而，应当理解，目标为非翻译区的siRNA也可以是有效的。
[0040] 其次，使用序列比对软件，例如BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)将潜在的靶位点与适合的基因组数据库（例如人类、小鼠、大鼠等的）进行比较。将显示出相对于其他的序列具有显著同源的假定靶位点筛出。
[0041] 将合格的靶序列选择作为siRNA合成的模板。优选的序列是具有低的G/C含量的序列，因为已证实其与具有高于55%的G/C含量的序列相比，在介导基因沉默方面更加有效。优选地，沿靶基因的一段选择几个靶位点用于评价。为了更好地评价选择的siRNA，优选地结合使用阴性对照。优选地，阴性对照siRNA与siRNA具有相同的核苷酸组成，但缺乏显著的基因组同源性。因此，优选地使用siRNA的杂乱序列，只要杂乱序列与任何其它基因不显示任何显著同源性。
[0042] 可以按照上文所述地合成合适的siRNA分子，并使得它们互补并且因此与生腱蛋白-C的完整核苷酸序列或其部分结合。生腱蛋白-C的核苷酸序列见图14。
[0043] 在一个实施方案中，所述的试剂可以是短发夹RNA(shRNA)。
[0044] 小发夹RNA或短发夹RNA(shRNA)是形成紧密发卡环（tight hairpin turn）的RNA序列，所述的紧密发卡环可以通过RNA干扰用于沉默基因表达。shRNA使用导入细胞的载体（通常是腺病毒或慢病毒）并利用U6启动子以确保shRNA总是被表达。该载体通常传递给子代细胞，从而使基因沉默得到遗传。通过细胞机制将shRNA的发夹结构剪切为siRNA，然后该siRNA结合到RNA诱导的沉默复合物(RISC)。该复合物结合于并剪切mRNA，所述的mRNA与结合其的siRNA匹配(McIntyre(2006)和Paddison(2002))。
[0045] 本发明的第一方面的试剂可以是生腱蛋白-C或其变体的结构域。FBG结构域已显示出显著地涉及到生腱蛋白-C与其关于慢性炎症的持久性的靶点的相互作用中。因此，优选的结构域是FBG结构域（序列显示于图13中）或其变体。
[0046] 在替代实施方案中，所述试剂是反义寡核苷酸。
[0047] 反义分子的设计需要考虑对反义方法重要的两个方面，所述的反义分子可以用于有效降低生腱蛋白-C水平/活性。第一方面是将寡核苷酸递送至癌细胞的细胞质中，而第二方面是寡核苷酸的设计，所述的寡核苷酸特异性地结合细胞内特定的mRNA，并且此结合的方式抑制所述的mRNA的翻译。
[0048] 现有技术教导了可以用于将寡核苷酸有效递送至多种细胞类型的多个递送策略(例如,见Luft,1998,J Mol Med 76:75-6;Kronenwett等人,1998,Blood 91:852-62;Rajur等人,1997,Bioconjug Chem 8:935-40;Lavigne等人,1997,Biochem Biophys Res Commun 237:566-71;Aoki等人,1997,Biochem Biophys Res Commun 231:540-5)。
[0049] 此外，鉴定那些对序列的靶mRNA具有最高预测的结合亲和力的算法是可用的，所述的算法基于热力循环，该热力循环说明了靶mRNA和寡核苷酸二者中的结构改变的热力学(例如，参见Walton等人,1999,Biotechnol Bioeng 65:1-9)。
[0050] 使用体外系统，设计和预测特异性寡核苷酸的效率的一些方法也是已知的(例如，参见Matveeva等人,1998,Nature biotechnology 16:1374-1375)。
[0051] 一些临床试验证实了反义寡核苷酸的安全性、可行性和活性。例如已经可以成功地使用了适合于癌症治疗的反义寡核苷酸(Holmlund等人,1999,Curr Opin Mol Ther1:372-85;Gerwitz,1999,Curr Opin Mol Ther1:297-306)。最近报道了在小鼠模型中，人类肝素酶基因表达物在反义介导下的扩散抑制人癌细胞在胸膜中的扩散(Uno等人,2001,Cancer Res 61:7855-60)。
[0052] 因而，本领域的技术人员能够容易地设计和实施适合调节生腱蛋白-C表达的反义方法。
[0053] 有利地，所述的反义寡核苷酸的长度是15至35个碱基。例如20聚体寡核苷酸已显示抑制上皮生长因子受体mRNA的表达(Witters等人,Breast Cancer Res Treat 53:41-50(1999))，而25聚体寡核苷酸已显示使促肾上腺皮质激素的表达降低90%以上(Frankel等人,J Neurosurg 91:261-7(1999))。然而，应当理解的是，可能期待使用长度在该范围之外的寡核苷酸，例如10、11、12、13或14个碱基，或36、37、38、39或40个碱基。
[0054] 本领域的技术人员还将认识到，寡核苷酸会被细胞内源核酸酶降解或灭活。针对该问题，有可能使用修饰的寡核苷酸，例如所述修饰的寡核苷酸具有改变的核苷酸间的连接，其中天然存在的磷酸二酯连接被其他连接取代。例如Agrawal等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,7079-7083表明，使用氨基磷酸酯和寡核苷酸硫代磷酸酯的寡核苷酸时，在HIV-1的组织培养物中抑制增加。Sarin等人(1988)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,7448-7451证实了使用甲基膦酸酯，HIV-1的抑制增加。
Agrawal等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,7790-7794表明了在早期感染和慢性感染的细胞培养物二者中HIV-1复制的抑制，其使用核苷酸序列特异性寡核苷酸硫代磷酸酯。
Leither等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,3430-3434报道了在流感病毒复制的组织培养物中由寡核苷酸硫代磷酸酯导致的抑制。
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,7448-7451证实了使用甲基膦酸酯，HIV-1的抑制增加。
Agrawal等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,7790-7794表明了在早期感染和慢性感染的细胞培养物二者中HIV-1复制的抑制，其使用核苷酸序列特异性寡核苷酸硫代磷酸酯。
Leither等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,3430-3434报道了在流感病毒复制的组织培养物中由寡核苷酸硫代磷酸酯导致的抑制。
[0055] 具有人工连接的寡核苷酸显示出抵抗体内降解。例如，Shaw等人(1991)在Nucleic Acids Res.19,747-750中报道了除了在3’末端通过特定的加帽结构进行封闭之外未经修饰的寡核苷酸在体内对核酸酶更具抗性，而未经加帽寡核苷酸硫代磷酸酯在体内不发生降解。
[0056] 用于合成寡核苷酸硫代磷酸酯的H-磷酸酯法的详细描述在Agrawal和Tang(1990)Tetrahedron Letters 31,7541-7544中提供，据此通过引用将其教导内容并入本文。寡核苷酸甲基膦酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、磷酸酯、桥接氨基磷酸酯和桥接硫代磷酸酯的合成在本领域中是已知的。参见，例如Agrawal和Goodchild (1987)Tetrahedron Letters 28,3539;Nielsen等人(1988)Tetrahedron Letters 29,2911;Jager等人(1988)Biochemistry 27,7237;Uznanski等人(1987)Tetrahedron Letters 28,3401;Bannwarth(1988)Helv.Chim.Acta.71,1517;Crosstick and Vyle(1989)Tetrahedron Letters 30,4693;Agrawal等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,1401-1405，通过引用将其教导内容并入本文。其他的合成或生成方法也是可能的。在优选的实施方案中，尽管也可以合成和应用核糖核酸(RNA)序列，但所述的寡核苷酸是脱氧核糖核酸(DNA)。
[0057] 在本发明中有用的寡核苷酸优选地经设计使其抵抗内源性核苷酸分解酶的降解。寡核苷酸的体内降解生成长度减小的寡核苷酸降解产物。此种降解产物相对于其全长相对物，更有可能参与非特异性杂交并且更可能无效。因此，理想的是使用对体内降解具有抗性，并且能够到达靶细胞的寡核苷酸。可以通过用一个或多个内部人工核苷酸间键来取代天然磷酸二酯键，例如通过在键中用硫取代磷酸酯，从而使本发明的寡核苷酸对体内降解更具有抗性。可以使用的键的实例包括硫代磷酸酯(phosphorothioate)、甲基膦酸酯(methylphosphonates)、砜(sulphone)、硫酸酯(sulphate)、羰游基(ketyl)、二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)、各种氨基磷酸酯(phosphoramidate)、磷酸酯(phosphate ester)、桥接硫代磷酸酯(bridged phosphorothioate)和桥接氨基磷酸酯(bridged
phosphoramidate)。此种实例是示例性的，而不是限制性的，因为其它核苷酸间键在本领域中是熟知的。寡核苷酸的合成在本领域中是熟知的，所述的寡核苷酸具有一个或多个这些取代磷酸二酯核苷酸间键的键，该合成包括用于生成具有混合的核苷酸间键的寡核苷酸的合成途径。
phosphoramidate)。此种实例是示例性的，而不是限制性的，因为其它核苷酸间键在本领域中是熟知的。寡核苷酸的合成在本领域中是熟知的，所述的寡核苷酸具有一个或多个这些取代磷酸二酯核苷酸间键的键，该合成包括用于生成具有混合的核苷酸间键的寡核苷酸的合成途径。
[0058] 可以通过在5′端或3′端核苷酸上“加帽”或掺入类似基团，使得寡核苷酸对内源酶导致的延伸具有抗性。加帽的试剂以Amino-Link IITM的名义可商购自Applied BioSystems Inc,Foster City,CA。例如，Shaw等人(1991)Nucleic Acids Res.19,747-750和Agrawal等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88(17),7595-7599描述了加帽的方法。
[0059] 如Tang等人(1993)Nucl.Acids Res.21,2729-2735中所描述的，制备对核酸酶攻击具有抗性的寡核苷酸的进一步方法是使其成为“自稳定的”。自稳定的寡核苷酸在其3′端具有发夹环结构，并且对蛇毒磷酸二酯酶、DNA聚合酶I和胎牛血清的降解显示出增加的抗性。寡核苷酸的自稳定的区不干扰与互补核酸的杂交，而在小鼠中进行的药代动力学和稳定性研究显示了相对于其线性的对应物，自稳定的寡核苷酸的体内持久性增加。
[0060] 在一个实施方案中，所述试剂是具有生腱蛋白-C结合亲和力的化合物，所述化合物可以基本上可逆地或基本上不可逆地结合于生腱蛋白-C的活性位点。在进一步的实例中，所述化合物可以与生腱蛋白-C中不是活性位点的部分结合，从而干扰生腱蛋白-C与配体或受体的结合。在又一实例中，所述化合物可以与生腱蛋白-C的一部分结合从而通过别构效应降低其蛋白质活性。该别构效应可以是在生腱蛋白-C的活性的自然调节中，例如通过“上游活化剂”活化生腱蛋白-C中涉及的别构效应。
[0061] 检测受试化合物和生腱蛋白-C之间的相互作用的方法在本领域中是熟知的。例如，可以使用超滤结合离子喷雾质谱法/HPLC法，或使用其他物理和分析方法。此外，可以使用荧光能量共振转移(FRET)法，在该方法中，两个荧光标记团之间的结合可以通过测量所述的荧光标记当彼此接近时的相互作用进行测量。
[0062] 检测多肽与大分子例如DNA、RNA、蛋白质和磷脂的结合的替代方法包括表面等离子共振试验，例如在Plant等人,1995,Analyt Biochem 226(2),342-348中所描述的。方法可以利用标记的多肽，所述的多肽由例如放射性的或者荧光的标记进行标记。
[0063] 鉴定能够与多肽结合的化合物的方法为，其中将所述的多肽暴露于所述化合物，并且检测和/或测量所述化合物与所述多肽的任何结合的方法。可以测定化合物与多肽的结合的结合常数。适合用于检测和/或测量（定量）化合物与多肽的结合的方法对于本领域中的技术人员来说是熟知的，并且该方法可以例如使用适于高通量操作的方法，例如基于芯片的方法来进行。称为VLSIPSTM的新技术已使极小的芯片的生产成为可能，所述的芯片包含数十万个或更多的不同的分子探针。这些生物芯片或阵列具有排列于阵列中的探针，每个探针被指定了特定的位置。已经生产了生物芯片，其中每个位置具有，例如，10微米的规模。所述芯片可以用于确定靶分子是否与芯片上的探针相互作用。在选择的试验条件下将阵列暴露于靶分子之后，扫描装置可以检查阵列中的每个位置，并确定在那个位置上靶分子是否与探针相互作用。
[0064] 鉴定对生腱蛋白-C具有结合亲和力的化合物的另一种方法是酵母双杂交系统，其中本发明的多肽可以用于“捕获”结合生腱蛋白-C的蛋白质。所述的酵母双杂交系统描述于Fields&Song,Nature 340:245-246(1989)中。
[0065] 在本发明的进一步实施方案中，所述试剂是对生腱蛋白-C具有配体结合能力的化合物。
[0066] 例如，所述试剂可以是生腱蛋白-C受体的可溶的片段（例如FPRL1）。可选地，所述试剂可以是模拟抗体的高亲和力分子（所谓的‘亲合体(affibody)’）（例如，参见US 5831012和www.affibody.se）。这些配体是小的简单蛋白质，所述的蛋白质由三螺旋束组成，所述的三螺旋束基于蛋白质A（来自细菌金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的表面蛋白）的IgG结合域之一的支架。该支架作为亲和性配体具有优异的特点并且可以设计为高亲和力地结合于任何给定的靶蛋白。
[0067] 本发明的第一方面的试剂可以是抗体或其抗原结合片段。所述的抗原结合片段可以选自Fv片段（例如单链Fv和二硫键连接的Fv）、Fab样片段（例如Fab片段、Fab’片段和F(ab)2片段）、单可变域（例如VH和VL域）和域抗体（dAb，包括单形式和双形式（即dAb-连接子-dAb））。
[0068] 优选地，所述的抗体可以特异性地结合于激活TLR4的FBG结构域。
[0069] 使用抗体片段而不适用完整抗体有几倍的优点。其大小较小的片段可以引起更好的药理特性，例如更好的固体组织侵润。此外，抗原结合片段例如Fab、Fv、ScFv和dAb可以在大肠杆菌（E.coli）中表达并由大肠杆菌分泌，从而使得能容易地生产大量的所述片段。
[0070] 在本发明的范围之内也包括修饰形式的抗体和其抗原结合片段，例如通过聚乙二醇或其他适合的聚合物的共价结合进行修饰。
[0071] 生成抗体和抗体片段的方法在本领域中是熟知的。例如，可以通过几种方法中的任一种生成抗体，所述方法采用在体内诱导生成抗体分子，筛查免疫球蛋白文库(Orlandi.等人,1989.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:3833-3837;Winter等人,1991,Nature 349:293-299)或由培养物中的细胞系生成单克隆抗体分子。这些方法包括但不限于杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术和EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)杂交瘤技术(Kohler等人,
1975.Nature 256:4950497;Kozbor等人,1985.J.Immunol.Methods 81:31-42;Cote等人,
1983.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:2026-2030;Cole等人,1984.Mol.Cell.Biol.62:109-
120)。
1975.Nature 256:4950497;Kozbor等人,1985.J.Immunol.Methods 81:31-42;Cote等人,
1983.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:2026-2030;Cole等人,1984.Mol.Cell.Biol.62:109-
120)。
[0072] 对所选择的抗原而言适合的单克隆抗体可以通过已知的技术制备，所述的技术例如在“Monoclonal Antibodies:A manual of techniques”,H Zola(CRC Press,1988)和“Monoclonal Hybridoma Antibodies:Techniques and Applications”,J G R Hurrell(CRC Press,1982)中所公开的技术。
[0073] 可以使用本领域中熟知的方法得到抗体片段（参见，例如Harlow&Lane,1988,“Antibodies:A Laboratory Manual”,Cold Spring Harbor Laboratory,New York）。例如，可以通过抗体的蛋白水解或者通过在大肠杆菌或哺乳动物细胞（例如中国仓鼠卵巢细胞培养物或其他蛋白表达系统）中表达编码所述片段的DNA来制备根据本发明的抗体片段。可选地，可以将完整抗体按照传统的方法，使用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化得到抗体片段。
[0074] 本领域中的技术人员将认识到，对于人类的治疗或诊断，优选地使用人源化抗体。非人（如鼠）抗体的人源化形式是经基因工程改造的嵌合抗体或者抗体片段，优选地其具有来自非人类抗体的极少部分。人源化抗体包括这样的抗体，其中人类抗体（受体抗体）的互补决定区由来自非人的物种（供体抗体）的互补决定区的残基所取代，所述的非人的物种例如具有需要功能的小鼠、大鼠或兔的抗体。在一些情况下，人类抗体的Fv框架残基由相应的非人类残基所取代。人源化抗体也可以包含在受体抗体和引入的互补决定区或框架序列中均没有的残基。一般来说，人源化抗体将基本上包含所有的至少一个和通常两个可变域，其中所有的或基本上所有的互补决定区相当于非人类抗体的互补决定区，而所有的或基本上所有的框架区相当于有关的人类共有序列的框架区。人源化抗体任选地还包括抗体恒定区的至少一部分，例如Fc区，其通常衍生自人类抗体（参见，例如Jones等人,1986.Nature
321:522-525;Riechmann et al.,1988,Nature332:323-329;Presta,1992,Curr.
Op.Struct.Biol.2:593-596）。
321:522-525;Riechmann et al.,1988,Nature332:323-329;Presta,1992,Curr.
Op.Struct.Biol.2:593-596）。
[0075] 将非人类抗体人源化的方法在本领域中是熟知的。一般地，所述人源化抗体具有引入到其中的来自非人类来源的一个或多个氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基常被称为导入的残基，通常取自导入的可变域。如（例如，参见Jones等人,1986,Nature 321:522-525;Reichmann等人,1988.Nature 332:323-327;Verhoeyen等人,1988,Science 239:
1534-1536l;US4,816,567）所述，可以将人类互补决定区用相应的啮齿类互补决定区取代，理想地进行人源化作用。因此，此种人源化抗体是嵌合抗体，其中显著少于完整人类可变域的部分已被相应的来自非人类的序列所取代。在实践中，人源化抗体通常可以是人类抗体，在所述人类抗体中一些互补决定区残基，以及可能地一些框架残基被来自啮齿类抗体中的类似位点的残基所取代。
1534-1536l;US4,816,567）所述，可以将人类互补决定区用相应的啮齿类互补决定区取代，理想地进行人源化作用。因此，此种人源化抗体是嵌合抗体，其中显著少于完整人类可变域的部分已被相应的来自非人类的序列所取代。在实践中，人源化抗体通常可以是人类抗体，在所述人类抗体中一些互补决定区残基，以及可能地一些框架残基被来自啮齿类抗体中的类似位点的残基所取代。
[0076] 也可以使用本领域中已知的各种技术，包括噬菌体呈现文库来鉴定人类抗体（参见，例如Hoogenboom&Winter,1991,J.Mol.Biol.227:381;Marks等人,1991,J.Mol.Biol.222:581;Cole等人,1985,In:Monoclonal antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,pp.77;Boerner等人,1991.J.Immunol.147:86-95）。
[0077] 一旦得到适合的抗体，便可以测试其活性，例如通过ELISA。
[0078] 本发明的第一方面的试剂可以是抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段对Toll样受体4(TLR4)、Toll样受体4的共同受体（在与生腱蛋白-4、生腱蛋白-C或任何这些的结构域的结合中）具有特异性。
[0079] 初级受体的共同受体例如TLR4帮助信号分子与初级受体的结合从而促进配体识别和结合以及启动/维持由受体结合而导致的生物过程。
[0080] 本发明的第一方面的试剂可以是抗体或其抗原结合片段，所述的抗体或其抗原结合片段对生腱蛋白-C的FBG结构域具有特异性。
[0081] 在本发明的第二方面，提供了鉴定调节生腱蛋白-C活性的试剂的方法，所述方法包括以下步骤：
[0082] (i)提供一种或多种候选试剂；
[0083] (ii)使一个或多个细胞与生腱蛋白-C和所述的一种或多种候选试剂接触；
[0084] (iii)使一个或多个细胞与生腱蛋白-C接触并且不与候选试剂接触；
[0085] (iv)与对照步骤(iii)相比，确定步骤(ii)中所述候选试剂是否调节生腱蛋白-C对该一个或多个细胞的效应。
[0086] 可以使用实例的方法来实现确定所述候选试剂是否调节生腱蛋白-C的效应的方法。
[0087] 本发明的第二方面的方法可以引起生腱蛋白-C的活性被上调。
[0088] 本发明的第二方面的方法可以引起生腱蛋白-C的活性被下调。
[0089] 本发明的第二方面的方法可以包括表达Toll样受体4(TLR4)的步骤(ii)和步骤(iii)（上述）的细胞。
[0090] 本发明的第二方面的方法可以具有一个或多个细胞，所述细胞选自炎症细胞、成纤维细胞、成纤维样细胞（包括RA滑膜成纤维细胞，也称为滑膜细胞）、小鼠胚胎成纤维细胞、人胚肾细胞。
[0091] 所述的炎症细胞可以选自巨噬细胞、树突细胞、单核细胞、淋巴细胞、单核细胞样细胞和巨噬细胞样细胞。
[0092] 在本发明的第三方面，提供了鉴定调节慢性炎症反应的试剂的方法，其通过进行本发明的第二方面的方法完成。
[0093] 在该方法中，所述的慢性炎症可以与任何不适当炎症相关的疾病有关。此种疾病包括但不限于，类风湿性关节炎(RA)、自身免疫性疾病、炎性肠病、非愈合性伤口、多发性硬化、癌症、动脉粥样硬化、舍格伦病(sjogrens disease)、糖尿病、红斑狼疮（包括系统性红斑狼疮）、哮喘、纤维化疾病（包括肝硬化）、肺纤维化、UV损伤和银屑病。
[0094] 特别地，但不排除其他地感兴趣的，慢性炎症与类风湿性关节炎(RA)有关。
[0095] 在本发明的第四方面，提供了根据本发明的第二和第三方面的方法鉴定的试剂。该试剂可以调节慢性炎症反应。
[0096] 第四方面的试剂可以下调慢性炎症反应。
[0097] 第四方面的试剂可以上调慢性炎症反应。
[0098] 第四方面的试剂可以选自短的干扰RNA(siRNA)分子、短的发夹RNA分子(shRNA)、反义寡核苷酸、对生腱蛋白-C具有结合亲和力的化合物、抗体（多克隆或单克隆的）和其抗原结合片段、小的抑制剂化合物、多肽和蛋白质。
[0099] 在本发明的第一或第四方面，所述慢性炎症可以与任何与不适当炎症有关的疾病有关。此种疾病包括但不限于，类风湿性关节炎(RA)、自身免疫性疾病、炎性肠病、非愈合性伤口、多发性硬化、癌症、动脉粥样硬化、舍格伦病、糖尿病、红斑狼疮（包括系统性红斑狼疮）、哮喘、纤维化疾病（包括肝硬化）、肺纤维化、UV损伤和银屑病。
[0100] 在本发明的第五方面，提供了组合物，所述的组合物包含本发明的第一或第四方面中限定的试剂和药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。
[0101] 本领域的技术人员应认识到，此种有效量的试剂或其制剂可以作为单次推注剂量（即急性给药）进行递送，或者更优选地作为随时间的一系列剂量（即长期给药）进行递送。
[0102] 根据要使用的化合物的疗效/毒性和其所用于的适应症，可以将本发明的试剂在多种浓度下进行制剂。优选地，制剂包含的本发明的试剂的浓度为0.1μM至1mM，更优选地1μM至100μM、5μM至50μM、10μM至50μM、20μM至40μM并且最优选地约30μM。对于体外应用，制剂可以包含较低浓度的本发明的化合物，例如0.0025μM至1μM。
[0103] 本领域的技术人员将认识到，本发明的试剂一般地可以与适合的药物赋形剂稀释剂或载体形成混合物给药，所述的适合的药物赋形剂稀释剂或载体是按照预定的给药途径和标准药物规范（standard pharmaceutical practice）选择的（例如，参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy,19th edition,1995,Ed.Alfonso Gennaro,Mack Publishing Company,Pennsylvania,USA）。
[0104] 例如，对于速释、缓释或控释给药，本发明的试剂可以以片剂、胶囊、胚珠（ovules）、酏剂、溶液或悬浮液的形式经口腔、颊部或舌下给药，所述的试剂可以包含调味剂或着色剂。本发明的试剂也可以经海绵体内注射给药。
[0105] 该片剂可以包含赋形剂，例如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸二钙和甘氨酸；崩解剂，例如淀粉（优选地、玉米淀粉、马铃薯淀粉或木薯淀粉）、淀粉羟乙酸钠、交联羧甲纤维素钠和某些复合硅酸盐；和制粒粘合剂，例如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶和阿拉伯胶。此外，可以包括润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸、甘油二十二烷酸酯和滑石粉。
[0106] 在明胶胶囊中，也可以使用相似类型的固体组合物作为填充剂。在这点上，优选的赋形剂包括乳糖（lactose）、淀粉、纤维素、乳糖（milk sugar）或高分子量聚乙二醇。对于含水悬浮液和/或酏剂而言，本发明的化合物可以与各种甜味剂或调味剂、着色物质或染料，与乳化剂和/或悬浮剂以及与稀释剂例如水、乙醇、丙二醇和甘油，和它们的组合结合。
[0107] 本发明的试剂也可以经胃肠外，例如静脉内、关节内、动脉内、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内、颅内、肌肉内或皮下给药，或者它们可以通过输注技术给药。它们最好以无菌含水溶液的形式使用，所述溶液可以包含其他物质，例如足够的盐或葡萄糖以使溶液与血液等渗。如果必要，应对水溶液进行适当缓冲（优选地缓冲至pH为3至9）。通过本领域技术人员熟知的标准药品技术，容易地在无菌条件下实现适合胃肠外的制剂的制备。
[0108] 适于胃肠外给药的制剂包括含水和非水的无菌注射液，所述注射液可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使所述制剂与预定受体的血液等渗的溶质；以及含水和非水的无菌悬浮液，所述的悬浮液可以包括悬浮剂和增稠剂。所述制剂可以用单位剂量或多剂量容器提供，所述的容器例如为密封的安瓿和小瓶，并且所述制剂可以储存于冷冻干燥（冻干）的条件下，其仅在使用之前不久时需要加入无菌的液体载体，如用于注射的水。临时注射溶液和悬浮液可以由前面所述类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备。
[0109] 对于人类患者的口服和胃肠外给药，本发明的试剂的每日剂量水平一般为每个成年人1至1000mg（即约0.015to 15mg/kg），其以单次剂量或分次剂量给予。
[0110] 本发明的试剂也可以经鼻内或通过吸入给药，并且其方便地以干粉吸入器或者喷雾器气雾剂的形式进行递送，其从增压容器、泵、喷雾器或雾化器中提供，并且使用适合的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、氢氟烷诸如1,1,1,2-四氟乙烷(HFA 134A3)或1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷(HFA 227EA3)、二氧化碳或其他适合的气体。在增压气雾剂的情况下，可以通过提供阀门以递送测量的量来确定剂量单位。增压容器、泵、喷雾器或雾化器可以包含活性化合物的溶液或悬液，例如使用乙醇和推进剂的混合物作为溶剂，其可以另外包含润滑剂例如失水山梨醇三油酸酯。可以配制用于吸入器或吹入器的胶囊和药筒（cartridge）（例如由明胶制备），使其包含本发明的化合物和适合的粉末基（powder base）例如乳糖或淀粉的粉末混合物。
[0111] 气雾剂或干粉制剂优选地设置为每个测量剂量或‘puff’包含至少1mg的本发明的化合物用于递送给患者。应当理解，具有气雾剂的总体每日剂量可以根据患者改变，并且其可以在单次剂量中给予，或更通常地在全天中以分次剂量给药。
[0112] 作为另外一种选择，本发明的试剂可以以栓剂或子宫托的形式给药，或者其可以以洗剂、溶液、乳剂、软膏剂或扑粉的形式局部应用。本发明的化合物例如通过皮肤贴剂的使用也可以经皮给药。也可以通过眼途径给药本发明的试剂。
[0113] 对于经眼的使用，可以将本发明的试剂配制为等渗、pH调节、无菌盐水的微粒化悬浮液，或者优选地配制为等渗、pH经调节的、无菌盐水的微粒化溶液，任选地与防腐剂例如苯扎氯铵（benzylalkonium chloride）联合使用。作为另外一种选择，可以将其配制为软膏剂，例如配制到矿脂中。
[0114] 对于局部应用于皮肤，可以将本发明的试剂配制为适合的软膏剂，所述软膏剂包含悬浮或溶解于例如由以下的一种或多种组成的混合物中的活性化合物：矿物油、液体矿脂、白矿脂、丙二醇、聚氧化乙烯聚氧化丙烯化合物、乳化蜡和水。作为另外一种选择，可以将它们配制为适合的乳剂或者乳膏，它们悬浮或溶解于例如由以下的一种或多种组成的混合物中：矿物油、脱水山梨醇单硬脂酸酯、聚乙二醇、液状石蜡、聚山梨酯60、十六烷基酯蜡、棕榈醇、2-辛基十二醇、苯甲醇和水。
[0115] 适于口腔局部给药的制剂包括锭剂（lozenges），其包含调味基（flavoured basis）中的活性成分，所述的调味基通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶；锭剂（pastilles），包含惰性基中的活性成分，所述的惰性基例如为明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶；和漱口水，包含适合的液体载体中的活性成分。
[0116] 如果所述试剂是多肽，则可以优选使用缓释药物递送系统，例如微球。这些微球专门设计用于减少注射的频率。此种系统的实例是Nutropin Depot，其将重组人生长激素(rhGH)封装到生物可降解微球中，一旦注射，在一段持续的时间内该微球缓慢释放rhGH。
[0117] 作为另外一种选择，本发明的多肽试剂可以通过外科植入装置给药，所述外科植入装置直接将药物释放至需要的部位。
[0119] 也可以通过电合并（electroincorporation，EI)来递送蛋白质和多肽。当在皮肤表面上直径最高至30微米的小颗粒经历与在电穿孔中使用的那些相同或类似的电脉冲时，EI发生。在EI中，这些颗粒被驱使经过皮肤的角质层并进入深层。所述颗粒可以负载或包被药物或基因或可以简单地作为“弹丸（bullets）”，在皮肤中生成孔，药物可以通过该孔进入。
[0120] 蛋白质和多肽递送的替代方法是热敏ReGel注射剂。当低于体温时，ReGel是可以注射的液体，而在体温时其立即形成凝胶池（gel reservoir），所述凝胶池缓慢地受侵蚀并溶解为已知、安全、生物可降解的聚合物。活性药物随着生物聚合物的溶解随时间的延长而递送。
[0121] 也可以经口腔递送蛋白质和多肽药物。一个此种系统利用在体内维生素B12的口服吸收的自然过程来共同递送蛋白质和多肽。借助于维生素B12吸收系统，蛋白质或多肽可以穿过肠壁。在维生素B 12类似物和药物之间形成复合物，所述复合物既保留在复合物的维生素B12部分对内因子的显著亲和性，又保留复合物的药物部分的显著生物活性。
[0122] 给予本发明的寡核苷酸或多核苷酸试剂的方法在本领域中是熟知的（参见Dass,2002,J Pharm Pharmacol.54(1):3-27;Dass,2001,Drug Deliv.8(4):191-213;Lebedeva等人,2000,Eur J Pharm Biopharm.50(1):101-19;Pierce等人,2005,Mini Rev Med Chem.5(1):41-55;Lysik&Wu-Pong,2003,JPharm Sci.20032(8):1559-73;Dass,2004,Biotechnol Appl Biochem.40(Pt2):113-22;Medina,2004,Curr Pharm Des.10(24):
2981-9）。
2981-9）。
[0123] 本发明的第五方面的组合物可以进一步包含至少一种其他试剂。
[0124] 此种其他试剂可以是抗炎剂，其包括但不限于，非甾体抗炎剂(NSAID)、缓解疾病的抗风湿性药物(DMARD)、他汀类（包括HMG-CoA抑制剂，例如辛伐他汀）、生物剂（生物制品）、皮质类固醇、免疫抑制剂、水杨酸盐和/或杀微生物剂。非甾体抗炎剂包括抗代谢剂（例如甲氨蝶呤）和抗炎金剂（包括硫代苹果酸金钠、金硫代苹果酸盐或金盐，例如金诺芬）。生物制品包括抗TNF剂（包括阿达木单抗、依那西昔、英夫利昔单抗、抗IL-1试剂、抗IL-6试剂、抗B细胞试剂（利妥昔单抗（retoximab））、抗T细胞试剂（抗CD4抗体）、抗IL-15试剂、抗CLTA4试剂、抗RAGE试剂）、抗体、可溶受体、受体结合蛋白、细胞因子结合蛋白、功能改变或衰减的突变蛋白、RNAi、多核苷酸适体（polynucleotide aptemers）、反义寡核苷酸或ω-3脂肪酸。类固醇（也称为皮质类固醇）包括可的松、泼尼松龙或地塞米松。免疫抑制剂包括环孢素（cylcosporin）、FK506、雷帕霉素、霉芬酸。水杨酸盐包括阿司匹林、水杨酸钠、水杨酸胆碱和水杨酸镁。杀微生物剂包括奎宁和氯喹。例如，所述试剂可以与NSAID、DMARD或免疫抑制剂中的一种或多种联合给药。
[0125] 在本发明的第六方面，提供了如在本发明的第一、第四和第五方面所限定的试剂或组合物，所述的试剂或组合物用作药物。
[0126] 在本发明的第七方面，提供了如在本发明的第一、第四和第五方面所限定的试剂或组合物，所述的试剂或组合物用于慢性炎性疾病的治疗。
[0127] 在本发明的第八方面，提供了如在本发明的第一、第四和第五方面所限定的试剂或组合物在制备用于治疗慢性炎性疾病的药物中的用途。
[0128] 在本发明的第九方面，提供了治疗慢性炎性疾病的方法，所述方法包括向受试者给予有效量的如在本发明的第一、第四和第五方面所限定的试剂或组合物。
[0129] 在本发明的第六、第七、第八或第九方面所限定的试剂、组合物、用途或方法可以涉及慢性炎性疾病的治疗，其中所述疾病与任何与不适当炎症有关的疾病有关。此种疾病包括但不限于，类风湿性关节炎(RA)、炎性肠病、非愈合性伤口、多发性硬化、癌症、动脉粥样硬化、舍格伦病(sjogrens disease)、糖尿病、红斑狼疮（包括系统性红斑狼疮）、哮喘、纤维化疾病（包括肝硬化）、肺纤维化、UV损伤和银屑病。
[0130] 在本发明的第十方面，提供了用于进行本发明的第二方面的方法的多部件试剂盒，所述试剂盒包含：
[0131] (i)一个或多个细胞
[0132] (ii)一个或多个细胞的对照样品
[0133] (iii)生腱蛋白-C的样品
[0134] (iv)它们的使用说明
[0135] 在本发明的第十方面的试剂盒可以任选地包含：
[0136] (v)候选试剂。
[0137] 在本发明的第十方面的试剂盒还可以任选地包含：
[0138] (vi)确定候选试剂对生腱蛋白-C活性或慢性炎症的效应的装置。
[0139] 在本发明的第十一方面，提供了一种多部件试剂盒，所述试剂盒包含：
[0140] (i)如本发明的第一、第四或第五方面所限定的试剂和组合物
[0141] (ii)给药装置
[0142] (iii)它们的使用说明
[0143] 本发明的第十一方面的试剂盒还可以任选地包含：
[0144] (iv)至少一种其他试剂。
[0145] 定义
[0146] 所谓“炎症”，我们包括了以下的含义，液体、血浆蛋白和白细胞的局部累积，所述局部累积是通过组织损伤、感染或局部免疫应答启动的。
[0147] 所谓“急性炎症”，我们包括损伤、感染或局部免疫应答之后立即发生的炎症的起始阶段（起始）和短期短暂的炎症反应的含义。通常，急性炎症迅速消退，持续几分钟到不超过几天。
[0148] 所谓“慢性炎症”，我们包括持续炎症和/或不消退的炎症的含义。其常与健康组织的不适当（inappropriate）破坏有关。其可以是进行性的并持续数周或更长时间。慢性炎症通常与疾病的持续感染有关，所述疾病包括但不限于自身免疫性疾病。
[0149] 所谓“慢性关节炎”，我们包括持续炎症的含义，所述持续炎症在几周到几个月内进展并且不消退，从而导致如在人类疾病中所观察到的感染的关节变形和软骨和骨破坏的影像学证据(Kelly,Harris,Ruddy and Sledge,Textbook of Rheumatology 4th Edition)。
[0150] 在实验鼠模型中，慢性关节炎的特征是甚至在相对短的时间内不减退并且引起不适当的组织破坏的炎症。通过在滑膜和关节腔中的炎症细胞、软骨细胞以及软骨和骨侵蚀的延长存在对所述炎症进行组织学表征（并且可以鉴定）。
[0151] 所谓“试剂”，我们包括所有的化学实体，例如寡核苷酸、多核苷酸、多肽、模拟肽和小的化合物。
[0152] 所谓“片段”，我们指至少10个核苷酸，例如至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。
[0153] 所谓“变体”，我们指核苷酸序列与感兴趣的全长序列具有至少90%的序列同源性，例如具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同源性。
[0154] 两种核苷酸之间的序列百分比同源性可以使用适合的计算机程序例如University of Wisconsin Genetic Computing Group的GAP程序来确定，并且应当理解通过与任选地已比对其序列的多核苷酸相比来计算百分比同源性。
[0155] 比对可供选择地可以使用Clustal W程序进行(如在Thompson等人,1994,Nuc.Acid Res.22:4673-4680中所述的)。
[0156] 所使用的参数可以如下：
[0157] 快速成对比对参数（Fast pairwise alignment parameters）:K-tuple(字)大小;1,窗口大小（window size）;5,空格罚分（gap penalty）;3,顶部对角线数（number of top diagonals）;5。评分方法（Scoring method）:x%。
[0158] 多重比对参数（Multiple alignment parameters）:空格开放罚分（gap open penalty）;10,空格延伸罚分（gap extension penalty）;0.05。
[0159] 评分基质：BLOSUM。
[0160] 作为另外一种选择，BESTFIT程序也可以用于确定局部序列比对。
[0161] 所谓“抗体”，我们包括基本上完整的抗体分子，以及嵌合抗体、人源化抗体、人抗体（其中相对于天然存在的人抗体使至少一个氨基酸突变）、单链抗体、双特异性抗体、抗体重链、抗体轻链、抗体重链和/或轻链的同源二聚体和异源二聚体、和抗原结合片段及其衍生物。
[0162] 所谓“抗原结合片段”，我们指能够与生腱蛋白-C结合的抗体的功能片段。
[0163] 术语“受试者”指包括人类在内的所有动物。受试者的实例包括，人、牛、犬、猫、山羊、绵羊和猪。术语“患者”指患有需要治疗的疾病的受试者。
[0164] 如本文所使用的，‘药物制剂’指治疗有效量的根据本发明的制剂。
[0165] 如本文所使用的，‘治疗有效量’、或‘有效量’或‘治疗有效的’，指对给定的条件和给药方案提供治疗效果的量。其是预先确定的有效物质的量，该量经计算与需要的添加剂和稀释剂，即载体（carrier）或给药载体（vehicle）联合产生需要的治疗效果。此外，其意欲指足以减少并且最优选地预防在宿主的活性、功能和反应方面的临床显著性缺陷的量。作为另外一种选择，治疗有效量足以引起宿主在临床显著性疾病方面的改善。如本领域的技术人员所认识的那样，化合物的量可以依据其特定的活性而变化。适合的剂量可以包含，预先设定的量的活性组合物，其按照计算与需要的稀释剂联合产生需要的治疗效果。在制备本发明组合物的方法和用途中，提供了治疗有效量的活性组分。如在本领域中所熟知的，治疗有效量可以由具有普通技术的医学或兽医工作者基于患者特征来确定，所述患者特征例如年龄、体重、性别、病情、并发症、其他疾病等。
[0167] 图1：生腱蛋白-C缺陷型小鼠中急性炎症的加速消退。
[0168] (a)在注射酵母多糖之后，野生型（+/+）（白色柱）和糖蛋白-C基因敲除(-/-)(黑色柱)小鼠的足肿胀度随时间的变化。数据显示为，与注射之前的足直径相比，足直径增加的平均值+/-SEM(n=24只小鼠/基因型)。**=p<0.01。(b-e)在酵母多糖注射之后4天，用苏木精和伊红(b,d)以及蕃红-O染色的、野生型(b,c)和生腱蛋白-C基因敲除(d,e)小鼠的踝关节的代表性切面。框突出显示了关节滑膜(s)和软骨蛋白多糖（cp）。放大10倍。在注射酵母多糖之后4天，野生型小鼠（+/+）（白色柱）和糖蛋白-C基因敲除小鼠(-/-)(黑色柱)的膝关节中关节炎症（f）和软骨细胞死亡（g）的定量化。数据表示为平均值(+/-SD)（n=24只小鼠/基因型）。*=p<0.05。
[0169] 图2.注射抗原时在生腱蛋白-C缺陷型小鼠中诱导滑膜炎。
[0170] (a-b,g)假（sham）注射的野生型小鼠的膝关节的代表性切面。(c-f，h-i)在关节内注射mBSA之后24小时，野生型(c,d,h)或生腱蛋白-C基因敲除(e,f，i)小鼠的膝关节的代表性切面。分别通过(cap)、(M)和(J)突出显示了在野生型和生腱蛋白-C基因敲除小鼠的关节囊、半月板和关节腔中的炎症细胞浸润。（S）突出显示了假注射小鼠的健康滑膜，所述滑膜沿整个骨表面仅1-3个细胞厚并且（ST）突出显示了显著增厚的野生型和生腱蛋白-C基因敲除小鼠两者的滑膜。使用(a,c,e,g,h,i)苏木精和伊红(b,d,f)以及蕃红-O对切面进行了染色。放大10倍(a-f)或40倍(g-i)。(n=5只小鼠/基因型)。
[0171] 图3.在生腱蛋白-C缺陷型小鼠中滑膜炎快速消退。
[0172] 在关节内注射mBSA之后3天，野生型(a，b,f)或生腱蛋白-C基因敲除(c,d,e)小鼠的膝关节的代表性切面。(a,c)线突出显示了与生腱蛋白-C基因敲除小鼠相比，野生型小鼠关节囊的炎症的增加。(b,d)(cp)突出显示了与生腱蛋白-C基因敲除小鼠相比，野生型小鼠的软骨蛋白多糖流失的增加。(e,f)与生腱蛋白-C基因敲除小鼠相比，在野生型小鼠中观察到显著的滑膜增生（线）、关节腔细胞和纤维蛋白沉积（箭头）以及关节翳侵袭（箭头的头（arrow heads））。使用苏木精和伊红(a,c,e,f)以及蕃红-O(b,d)对切面进行染色。放大10倍(a-d)或20倍(e-f)。(n=5只小鼠/基因型)。
[0173] 图4.在抗原诱导的关节炎期间生腱蛋白-C缺陷型小鼠被保护免受组织破坏。
[0174] 在关节内注射mBSA之后7天，使用苏木精和伊红(a)以及蕃红-O(b)染色的野生型小鼠的膝关节的代表性切面。放大10倍。(n=24只小鼠/基因型)。箭头的头部（arrowhead）突出显示了骨侵蚀的区域。箭头突出显示了关节翳侵入关节软骨。(c-d)在关节内注射mBSA之后7天，使用苏木精和伊红(c)以及蕃红-O(d)染色的生腱蛋白-C基因敲除小鼠的膝关节的代表性切面。放大10倍。(n=24只小鼠/基因型)。J突出显示了关节腔并且AC接触关节软骨。(e)在注射mBSA之后24小时、3天和7天，野生型（白色柱）和糖蛋白-C基因敲除(黑色柱)小鼠的膝关节炎症的组织评分。数据表示平均值+/-SD(n=5只/基因型(24小时、3天)或24只/基因型(7天))。(f)在注射mBSA之后，在野生型小鼠（白色柱）和糖蛋白-C基因敲除小鼠(黑色柱)小鼠的膝关节中软骨细胞死亡、软骨表面侵蚀和骨侵蚀的定量化。在24小时、3天和7天显示软骨细胞死亡，以及在第7天显示软骨表面侵蚀和骨侵蚀。数据表示平均值+/-SD(n=5只/基因型(24小时、3天)或24只/基因型(7天))。
[0175] 图5.在原代人巨噬细胞和RA滑膜成纤维细胞中生腱蛋白-C诱导TNF-α、IL-6和IL-8合成。
[0176] (a-b)原代人巨噬细胞(a)和RA滑膜成纤维细胞(b)未被刺激（无添加）或者使用LPS(1ng/ml(a)或10ng/ml(b))或重组生腱蛋白-C(1.0μM-1.0nM)刺激24小时。数据是来自三次代表性实验的每一次中三次重复测量值的平均值(+/-SD)。（c）原代人巨噬细胞未被刺激（无添加）或使用LPS(1ng/ml)或重组生腱蛋白-C(1.0μM)刺激24小时。(-)显示了将细胞与单独的培养基一起预培养。(P)在刺激之前，使细胞与25μg/ml多粘菌素B预培养30分钟。(H)使细胞与无添加，或含有LPS，或生腱蛋白-C的培养基一起孵育，所述培养基在加入细胞之前煮沸15分钟。显示的数据是来自三次代表性实验的每一次中三次重复测量值的平均值(+/-SD)。
[0177] 图6.生腱蛋白-C的FBG结构域在体内和体外介导细胞因子合成的刺激。
[0178] (a)原代人巨噬细胞24小时未被刺激（无添加）或者使用LPS(1ng/ml)、重组生腱蛋白-C(TNC)或1.0μM生腱蛋白-C结构域(TA、EGF-L、TNIII1-5、TNIII1-3、TNIII3-5、TNIII5-7、TNIII6-8和FBG)刺激24小时。显示的数据是来自三次代表性实验的每一次中三次重复测量值的平均值(+/-SD)。（c）未刺激（无添加）或者使用LPS(10ng/ml(a)或重组FBG(1.0-0.01μM)刺激RA滑膜细胞细胞24小时。显示的数据是，相对于未刺激的细胞(+/-SEM)，来自五例不同患者的细胞因子水平的平均%变化。(c-h)在关节内注射PBS(c-e)或1μgFBG(f-h)之后3天，野生型小鼠的膝关节的代表性切面。使用苏木精和伊红(c,d,f，g)或蕃红-O(e,h)对切面进行染色。放大10倍(c,f)或25倍(d,e,g,h)。(n=5只小鼠/基因型)。(i)在关节内注射PBS(黑色柱)或1μg FBG（白色柱）之后3天，对野生型小鼠的膝关节中关节炎症、骨侵蚀、软骨表面侵蚀和软骨细胞死亡的定量化。数据表示平均值+/-SD(n=5只/基因型。
[0179] 图7.FBG介导的细胞因子合成是MyD88依赖性的。
[0180] （a）人RA滑膜成纤维细胞未被感染，单独使用表达GFP的腺病毒(AdGFP)感染或者使用表达表达显性阴性MyD88的腺病毒(AdMyD88dn)感染。细胞未被刺激、使用LPS(10ng/ml)或使用FBG(1μM)刺激24小时。显示的数据是三次独立实验的平均值(+/-SEM)。（b）从野生型(+/+)或MyD88缺陷型(-/-)小鼠中分离的小鼠胚胎成纤维细胞未被刺激(-)或使用PAM3(100ng/ml)、LPS(100ng/ml)、TNFα(100ng/ml)、IL-1(5ng/ml)和FBG(1μM)刺激24小时。显示的数据是三次独立实验的平均值(+/-SEM)。
[0181] 图8.FBG介导的细胞因子合成是TLR4依赖性的但不需要CD14orMD-2。
[0182] （a）在刺激之前，使原代人巨噬细胞与单独培养基或者与含有抗TLR2(10μg/ml)、TLR4(25μg/ml)或同型对照抗体(25μg/ml)功能阻滞抗体的培养基一起预培养30分钟。细胞未被刺激或使用LPS(1ng/ml)、FBG(1μM)或PAM3(10ng/ml)刺激24小时。显示的数据是三次独立实验的平均值(+/-SEM)。（b）从野生型、TLR2(TLR2-/-)或TLR4(TLR4-/-)缺陷型小鼠中分离的小鼠胚胎成纤维细胞未被刺激或使用PAM3(100ng/ml)、LPS(100ng/ml)、IL-1(5ng/ml)和FBG(1μM)刺激24小时。显示的数据是三次独立实验的平均值(+/-SEM)。（c）从野生型、TLR2(TLR2-/-)或TLR4(TLR4-/-)缺陷型小鼠中分离的骨髓来源巨噬细胞未被刺激或使用PAM3(100ng/ml)、LPS(100ng/ml)或FBG(1μM)刺激24小时。显示的数据是三次独立实验的平均值(+/-SEM)。（d）使人巨噬细胞与不含抑制剂、1μg/mlmsbB LPS或10μg/ml抗-CD14的抗体一起预培养24小时。显示的数据是三次独立实验的平均值(+/-SEM)。
[0183] 图9.足肿胀在注射酵母多糖之后随时间的变化。
[0184] 未注射的生腱蛋白-C基因敲除小鼠(a,e)(直径1.6mm)、在注射酵母多糖注射之后24小时(d,f)(直径2.5mm)和4天(b,h)(直径1.7mm)的生腱蛋白-C基因敲除小鼠以及来自酵母多糖注射后4天的野生型小鼠(c,g)(直径2.1mm)的足的代表性图。
[0185] 图10.重组蛋白的合成。
[0186] （a）包含不同结构域的生腱蛋白-C单体的结构域结构，所述结构域包括装配结构域（TA）、14和半EGF样重复（EGF-L）、17纤连蛋白III型样重复(TNIII)、8连续地表达的（1-8）和9，其可以选择性地剪切，以及纤维蛋白原样结构域（FBG）。（b）被合成的重组蛋白覆盖的区域、相应的氨基酸残基和每种蛋白质的分子量。
[0187] 图11.蛋白质纯度的分析。
[0188] 在还原性条件下，通过SDS-PAGE分析的银染凝胶，其显示了1μg的每种重组蛋白质。泳道：1(TA)、2(EGF-L)、3(TNIII1-5)、4(TNIII5-7)、5(TNIII6-8)、6(TNIII1-3)、7(TNIII3-5)和8(FBG)。
[0189] 图12.在体内FBG介导的关节炎症需要TLR4的表达。
[0190] 在关节内注射1μgFBG之后3天，TLR2(a)和TLR4(b)基因敲除小鼠的膝关节的代表性切面。使用苏木精和伊红对切面进行染色。放大10倍。(n=5只小鼠/基因型)。(c)在关节内注射1μg FBG之后3天，TLR2（白色柱）和TLR4（黑色柱）基因敲除小鼠的膝关节中关节炎症、骨侵蚀、软骨表面侵蚀和软骨细胞死亡的定量化。数据表示平均值+/-SD(n=5只/基因型。
[0191] 图13.人生腱蛋白-C和其结构域的氨基酸序列。
[0192] 图14.人生腱蛋白-C的核苷酸序列。
[0193] 图15.对特异性FBG肽作出响应的TNF合成。
[0194] TNF合成通过无添加，或与100μM的每种FBG肽(P1,P3-P9)一起孵育24小时的RA膜培养物来进行。
[0195] 图16.对特异性FBG肽的浓度改变作出响应的TNF和IL8合成。
[0196] TNF&IL8的合成通过无添加，或与25、100或250μM的FBG肽一起孵育24小时的RA膜培养物来进行。
[0197] 图17.对LPS、完整FBG结构域或特异性FBG肽作出响应的TNF和IL8合成。
[0198] IL8合成通过无添加、1ng/ml LPS、1μM完整FBG结构域(FBG)或者1或20μM的FBG肽一起孵育24小时之后的巨噬细胞进行。
[0199] 图18.对与FBG肽一起预培养之后的LPS和FBG作出响应的TNF和IL8合成。
[0200] 在与20μM的FBG肽一起预培养或者不进行预培养的条件下，通过与无添加、1ng/ml LPS、1μM完整FBG结构域(FBG)一起24小时后的巨噬细胞来进行TNF和IL8合成。
[0201] 图19.对生腱蛋白-C靶向siRNA作出响应的IL8和TNF合成。
[0202] 在荧光素酶特异性siRNA（对照），或者生腱蛋白-C靶向siRNA：oligo1(si1)、oligo 2(si 2)oligos 1+2的组合(si1+2)转染的RA成纤维细胞中生腱蛋白-C mRNA的水平。在存在或缺乏10ng/ml LPS的条件下，使用荧光素酶siRNA（对照），或者生腱蛋白-C靶向oligos
1+2的组合(siRNA)感染24小时的RA成纤维细胞中进行IL6合成。
1+2的组合(siRNA)感染24小时的RA成纤维细胞中进行IL6合成。
[0203] 实施例1-一般方法
[0204] 试剂
[0205] 酵母多糖、甲基化的BSA和弗氏完全佐剂、抗-FLAG M2抗体（小鼠单克隆抗体）、稻瘟素、同型对照抗体（小鼠IgG2a、IgG1)得自Sigma-Aldrich(Dorset,UK)。芬太尼得自VetaPharma Ltd.(Leeds,UK)。鲎试剂（Limulus amaebocyte lysate assay）得自Associates of Cape Cod(Liverpool,UK)。野生型人胚肾(HEK293-EBNA)细胞得自Invitrogen(Groningen,Netherlands)。M-CSF和鼠IL-1β得自PeproTech(Neuilly-Sur-Seine,France)。DMEM、RPMI1640、胎牛血清(FBS)、青霉素/链霉素、抗生素-抗真菌溶液PSA和β-巯基乙醇得自PAA Laboratories(Yeovil,UK)。稳定表达人TLR2和TLR4/CD14/MD-2的HEK293细胞系、多粘菌素B、msbB LPS和功能阻滞TLR2（克隆：TL2.1同型：小鼠IgG2a）和TLR4抗体（克隆：HTA125同型：小鼠IgG2a)得自Invivogen(Calne,UK)。酚-氯仿纯化的大肠杆菌（Escherichia coli ）LPS（粗糙和光滑）和Pam3Cys-Ser-Lys4(Pam3C)得自Alexis(Birmingham,UK)。鼠TNF-α和IL-1受体拮抗剂(IL-1ra-IL-1F3)得自R&D Systems(Abingdon,UK)。功能阻滞抗-CD14抗体（同型：小鼠IgG1）得自Abcam(Cambridge,UK)。人和鼠TNF-α、IL-6和IL-8ELISAs得自Pharmingen(Oxford,UK)。
[0206] 全长生腱蛋白-C的纯化
[0207] 为了确保细胞因子生产不受到细菌污染物例如LPS和LPS相关分子影响，如(Lange(2007))所述，我们从pCEP-pu载体所感染的哺乳动物细胞系HEK293的熟化培养基中纯化了重组的全长人生腱蛋白-C，所述的载体中有带组氨酸标签的人生腱蛋白-C。如(Lange(2007))所述，将生腱蛋白-C纯化为同源性并使用鲎试剂测定法根据生产商的说明确定无LPS污染。
[0208] 重组蛋白的合成
[0209] 合成并纯化了与生腱蛋白-C的每个结构域相对应的蛋白质(TA、EGF-L、各种TNIII重复和FBG)。参见实施例2。
[0210] 重组蛋白质中LPS污染的测定
[0211] 为了确定每种重组蛋白中LPS的水平，根据生产商的说明，使用了鲎试剂测定法（敏感性 0.7±0.5pg LPS/mg蛋白质）。在本研究中使用的所有重组蛋白具有的LPS水平小~于10pg/ml。
[0212] 腺病毒载体和其传播
[0213] 自行（in-house）构建了编码野生型MyD88(AdMyD88wt)，显性-阴性形式的MyD88(AdMyD88dn)和GFP对照(AdGFP)的重组、复制缺陷型腺病毒载体。在Andreakos(2004)中描述了这些病毒的合成。在本研究中使用的所有病毒是E1/E3缺失的，属于Ad5血清型。将病毒在293个人胚肾细胞中传播，所述的细胞是通过两次氧化铯梯度超速离心进行纯化的，并且通过如之前所述的菌斑试验确定病毒滴度(Sacre(2007))。
[0214] 动物
[0215] 由Saga (1992)所描述的原种的纯合的生腱蛋白-C缺陷型小鼠由Prof.Charles French-Constant(University of Edinburgh,UK)提供，该小鼠具有129/sv近交系，白腹及兔豚鼠外观等背景。年龄匹配的同源近交野生型129/sv小鼠得自Charles River(Margate,UK)。所有的生腱蛋白-C缺陷型和野生型129/sv小鼠均为雄性并且在实验时为8-10周龄。
[0216] 基于C57BL/6背景（黑毛小鼠的近交系）的纯合的TLR2和TLR4缺陷型小鼠得自B&K Universal(Hull,UK)Hoshino(1999)and Takeuchi(1999)。基于C57BL/6背景的纯合的MyD88缺陷型小鼠由Sanger Institute(Cambridge,UK)提供。年龄匹配的同源近交野生型C57B/L6小鼠得自Charles River(Margate,UK)。为了小鼠胚胎成纤维细胞的分离，使8-10周龄的一只雌鼠与8-10周龄的两只雄鼠交配。为了骨髓来源的巨噬细胞的分离，小鼠均为雌性并且在实验时为10-12周龄。
[0217] 所有动物均喂饲标准啮齿类食物并自由饮水，并且采用12小时光照/黑暗循环，在空调环境中，用锯屑笼进行饲养（<6只小鼠/笼）。所有动物操作规程均得到机构伦理委员会的批准。
[0218] 统计方法
[0219] 使用GraphPad version 3(GraphPad Software Inc.,San Diego,CA)计算平均值、SD、SEM和统计试验。通过单因素方差分析多组间平均值，接着适当时通过Dunnett多重比较检验进行分析。非配对t检验用于仅涉及两组的实验。
[0220] 实施例2-重组蛋白质的合成
[0221] 合成并纯化了与生腱蛋白-C的每个结构域相对应的蛋白质(TA、EGF-L、各种TNIII重复和FBG)。合成的重组蛋白质描述于图9。
[0222] 试剂
[0223] Pfu Turbo聚合酶得自Stratagene(Amsterdam,Netherlands)。Easy mix 50PCR管2+
得自Molecular Bioproducts(Lutterworth,UK)。RNeasy试剂盒和Ni -NTA-琼脂糖柱得自Qiagen(Crawley,UK)。pCR平末端的载体、pCEP4质粒载体、人胚肾(HEK293-EBNA)细胞核4-
12%Bis-Tris梯度凝胶得自Invitrogen(Groningen,Netherlands)。pET32b载体和BL21(DE3)Rosetta细胞得自Novagen(Kent,UK)。HiTrapQ柱、HiTrap S柱、Sephacryl S500HR柱和肝素琼脂糖凝胶柱得自Amersham(Buckinghamshire,UK)。
得自Molecular Bioproducts(Lutterworth,UK)。RNeasy试剂盒和Ni -NTA-琼脂糖柱得自Qiagen(Crawley,UK)。pCR平末端的载体、pCEP4质粒载体、人胚肾(HEK293-EBNA)细胞核4-
12%Bis-Tris梯度凝胶得自Invitrogen(Groningen,Netherlands)。pET32b载体和BL21(DE3)Rosetta细胞得自Novagen(Kent,UK)。HiTrapQ柱、HiTrap S柱、Sephacryl S500HR柱和肝素琼脂糖凝胶柱得自Amersham(Buckinghamshire,UK)。
[0224] 限制性内切酶得自New England BioLabs(Hitchin,UK)。DMEM、胎牛血清(FBS)和青霉素/链霉素得自PAA laboratories(Yeovil,UK)。FuGENE6转染试剂得自Roche Applied Science(Basel,Switzerland)。
[0225] 抗-FLAG M2抗体（小鼠单克隆抗体）、抗-FLAG M2-琼脂糖、FLAG肽得自Sigma-Aldrich(Dorset,UK)。抗四聚组氨酸抗体（小鼠单克隆抗体）得自Qiagen(Crawley,UK)。碱性磷酸酶标记山羊抗-（小鼠IgG）IgG和Western Blue稳定型碱性磷酸酶底物得自Promega(Southampton,UK)。SDS-PAGE的精确蛋白分子量标准品得自BioRad(Hemel Hempstead,UK)。
[0226] 引物设计
[0227] 使用在人生腱蛋白-C序列(Siri(1991)保藏编号P24821(Swiss-Prot))中公开的比对物来确定结构域边界。为了克隆每个结构域，我们设计了PCR引物，在PCR引物中，正向和反向引物包含与必需的编码序列的5’和3’端序列相对应的18-21个碱基。正向引物包含Nde1限制性位点，接着是编码序列之前的N端his标签。Nde1位点的最后三个碱基形成ATC甲硫氨酸起始密码子。反向引物包括编码序列之后的TTA终止密码子，接着是BamH1或Kpn1位点从而允许单向克隆至pET32b表达载体。
[0228] 表1
[0229]
[0230] 上述所有引物均从5’到3’端书写。Flag序列为粗体，His标签(CATCATCATCATCATCAT)加下划线，并且限制性酶切位点(CATATG=Nde1位点、GGATCC=BamH1、GGTACC=Kpn1位点)为加粗斜体。
[0231] PCR
[0232] PCR扩展使用10pmol/μl的每种引物、1μg模板、5μl DMSO和1.25单位Pfu Turbo聚合酶在25μl的总体积中进行。将该混合液加入到Easy mix 50管中的缓冲液和dNTP中。所有反应使用的模板是cDNA，所述的cDNA是使用RNeasy试剂盒分离的RNA，通过U87MG人胶质瘤细胞制备。反应进行40个循环，其中变性、退化和延伸温度分别为95℃、55-65℃（取决于引物的解链温度（Tm））和72℃。
[0233] 克隆
[0234] 将PCR产物与pCR平末端的载体连接，并对其测序以确保PCR没有引入错误。选择没有错误或者沉默突变的克隆。然后用经加工位于引物(TN5-7核TN6-8)中的Nde1和BamH1限制性位点使插入物与pET32b连接。在TA结构域（第494位）内和TNIII2（第2509位）处，人生腱蛋白-C具有内部BamH1位点。因此使用FW引物中的Nde1位点和pCR平末端的克隆位点中的Kpn1位点来克隆TA和TN1-8。人生腱蛋白-C不含内部Kpn1位点。使用引物中的Nde1和Kpn1位点来克隆TN1-5、TN1-3和TN3-5。FBG包含内部Nde1位点（第6439位）并因此使用Nde1和BamH1消化然后是Nde1消化的两步连接来克隆。（位置参见图14中给出的生腱蛋白-C的全长核苷酸序列之内的位点）。
[0235] 细菌的生长、诱导和溶菌
[0236] 将质粒转化至BL21(DE3)Rosetta细胞中，在含有50μg/ml羧苄西林的3L的LB培养基（Luria-Bertani medium）中培养，并用1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导。在3小时之后，通过4000rpm离心20分钟收获细胞，用冰冷清洗缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 8.0，100mM NaCl和1mM EDTA)清洗两次，并用French press裂解。通过在4℃下以12000rpm离心20分钟来收集包涵体。除了TA和FBG之外，蛋白质都完全位于上清液中。使用6M盐酸胍、50mM Tris-HCl，pH 8.0和10mM β-巯基乙醇，在室温下不断搅拌2小时从包涵体中提取重组TA和FBG蛋白。
[0237] 细菌蛋白质的纯化
[0238] 将包含重组蛋白质的溶液施加到Ni2+-NTA-琼脂糖柱中并用含有20mM咪唑的50mM Tris-HCl，pH 8.0进行清洗。之后，使用50mM Tris-HCl，pH 8.0清洗柱子并且用含有60mM咪唑的50mM Tris-HCl，pH 8.0洗脱蛋白质。对于TA和FBG，各自的清洗和洗脱缓冲液包含6M盐酸胍。在Ni色谱之后，TA和FBG不需要随后的纯化。TN1-3和TN6-8使用HiTrapQ柱通过阴离子交换层析进一步纯化，TN1-5、TN3-5和TN5-7使用HiTrapS柱通过阳离子交换层析来进一步纯化，而TN1-8使用HiTrap S柱，接着使用Sephacryl S500HR柱通过凝胶过滤来进一步纯化。
[0239] 不溶性蛋白质的再折叠
[0240] 通过使用含有6M盐酸胍的的50mM Tris-HCl，pH 8.0稀释至20μg/ml并在随后使用20mM进行处理，在4℃下搅拌16小时来再折叠TA和FBG。然后将所述溶液用15体积的含有
150mM NaCl、10mM CaCl2、5mM β-巯基乙醇和1mM 2-硫二乙醇在4℃下透析两次，每次24小时，用20mM Tris-HCl,pH 8.0在4℃下透析两次，每次8小时。在还原和非还原条件下通过使用SDSPAGE的大小变化来评价再折叠。蛋白质活性通过TA结构域聚合作用和FBG与肝素琼脂糖柱的结合来证实。
150mM NaCl、10mM CaCl2、5mM β-巯基乙醇和1mM 2-硫二乙醇在4℃下透析两次，每次24小时，用20mM Tris-HCl,pH 8.0在4℃下透析两次，每次8小时。在还原和非还原条件下通过使用SDSPAGE的大小变化来评价再折叠。蛋白质活性通过TA结构域聚合作用和FBG与肝素琼脂糖柱的结合来证实。
[0241] 使用哺乳动物细胞合成EGF-L结构域
[0242] 最初使用大肠杆菌表达系统表达和纯化EGF-L重复区是不成功的。这最可能可归因于难以实现蛋白质折叠，因为在该区域总共有91个半胱氨酸。因此，使用HEK293细胞来表达TN-C的EGF样结构域。
[0243] 进行了两个PCR反应。第一个PCR产物由限制性酶KpnI位点、Kozak序列，然后是TN-C信号序列组成。第二个PCR产物由FLAG肽、EGF样结构域序列、然后是组氨酸标签和BamH1限制性酶序列组成。
[0244] 如Ho (1989)所描述的，将两种PCR产物连接在一起。如上所述，进行PCR反应。将全部构建物克隆至PCR平末端的载体中并对其进行测序。然后，将其亚克隆至pCEP4中。使用Fugene将DNA转染至HEK293细胞并在含有10%(v/v)胎牛血清、青霉素(100单位/ml)和链霉素(100单位/ml)的杜氏改良培养基（Dulbecco's modified Eagle's medium,DMEM）中选择潮霉素抗性(200μg/ml)的细胞。从稳定转染的细胞中收集2升熟化培养基（在培养基中培养细胞之后收集）并混合。在3000rpm下离心混合的熟化培养基（2升）以便从培养基中分离细胞碎屑。
[0245] 然后，将该培养基应用于抗-FLAG柱中。按50ml每组分收集流出物。采用10柱体积的1M NaCl、50mM Tris-HCl，pH 7.5清洗柱，并在随后使用10倍柱体积的60%异丙醇清洗以确保LPS的去除。接着，使用50mMTris-HCl缓冲液，pH 7.5清洗柱并在最后使用pH 7.5的具有200μg/mlFLAG肽的50mM Tris-HCl缓冲液洗脱蛋白质。
[0246] 蛋白质纯度的分析
[0247] 将每种蛋白质针对1000倍体积的pH 7.5的150mM NaCl和50mM Tris进行透析。在还原条件下，通过SDS PAGE分析蛋白质纯度。为此，使1μg的每种纯化的重组蛋白通过4-12%Bis-Tris梯度凝胶并在随后银染所述凝胶从而证实是单条带（图10）。还进行了蛋白质印迹分析。将SDS-PAGE分离的蛋白质电转移至聚偏氟乙烯膜上。在Tris缓冲盐水中，用5%BSA阻滞膜，并在随后使膜与识别FLAG M2的初级抗体(1:2000稀释)(EGF-L)或tetra-his抗体(1:2000)（所有其他蛋白质）一起孵育。然后，使印迹与碱性磷酸酶结合的二次抗体和使用Western Blue稳定化的底物(Western Blue stabilized substrate)进行可视化的蛋白质带一起孵育，借此凝胶显示了在预期的Mw，通过每种抗体识别的单条特异性带（未显示）。
[0248] 实施例3-动物模型
[0249] 酵母多糖诱导的关节炎
[0250] 如在Keystone(1977)中所述的，在生腱蛋白-C缺陷型和野生型小鼠中，通过注射酵母多糖（酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)）来诱导酵母多糖诱导的关节炎(ZIA)。通过将15mg的酵母多糖溶解于1ml的无菌PBS中制备酵母多糖。将所述溶液煮沸两次并进行超声处理。通过腹膜内注射150μl的以1:10用无菌水稀释的Hypnorm，然后注射酵母多糖(10μl)至右足垫麻醉小鼠(d=0)。
[0251] 对照小鼠接受单独的10μl PBS注射或者和不进行注射。对于关节炎的肉眼评价，每日采用测微计(Kroeplin,Schluchlem,Germany)测量每只后足的厚度并且直径表达为每只小鼠每个发炎的后足的平均值。
[0252] 在实验完成之后（天数=4），处死小鼠并用10%（v/v）缓冲福尔马林固定后足，用10%EDTA脱钙并且石蜡处理。
[0253] 抗原诱导的关节炎
[0254] 如之前Brackertz (1977)所描述的，在生腱蛋白-C缺陷型和野生型小鼠中，诱导抗原诱导的关节炎(AIA)。简单地说，在第0天，通过腹膜内注射150μl的按1:10用无菌水稀释的Hypnorm，然后用200μg甲基化的BSA进行免疫从而麻醉小鼠。将mBSA在0.2ml弗氏完全佐剂中乳化并在尾基部进行真皮下注射。
[0255] 在第7天，使用无菌33-规格微导管（33-gauge microcannula），通过关节内注射mBSA（10μl无菌PBS中100μg）至右侧膝关节中来诱导关节炎。对照组小鼠接受单独的10l PBS注射或者不接受注射。
[0256] 在第14天，处死小鼠，切除膝关节并固定在10%（体积/体积）缓冲福尔马林中，用10%EDTA脱钙并用石蜡处理。
[0257] FBG的注射
[0258] 通过腹膜内注射150μl的按1:10用无菌水稀释的Hypnorm，并在随后使用无菌33-规格微导管，注射溶于10μl无菌PBS的100ng、1或3μgFBG至右侧膝关节中。对照组小鼠接受单独的10μl PBS注射或者不接受注射。
[0259] 在第3天和第7天，处死小鼠，切除膝关节并固定于10%（体积/体积）缓冲福尔马林中，用10%EDTA脱钙并用石蜡处理。
[0260] 膝关节的组织学
[0261] 在整个关节的7个深度上剪切冠状组织切面(4μm)；间隔80μm并采用苏木精和伊红以及蕃红-O染色以评价关节病理。如在Van Lent(2006)中所述的，使用以下的参数对组织病理变化进行评分。
[0262] 采用从0（无炎症）到3（重度炎症）的主观选择的尺度对炎症（炎症细胞流入滑膜（浸润液）和关节腔（渗出液）进行分级。软骨细胞死亡确定为含有空骨陷窝的软骨区相对于总区域的百分比。软骨表面侵蚀确定为相对于总软骨区的软骨丢失的量。在总膝关节切面的10个不同区域中确定骨破坏。以0（未破坏）到3（骨结构的完全丢失）的尺度对破坏进行分级。组织分析由不知道实验组的研究者进行。在实验组中，通过将至少5个深度上的切片/关节组织病理评分取平均值，计算每只动物的平均计分。
[0263] 结果
[0264] 在生腱蛋白-C缺陷型小鼠中酵母多糖诱导的关节炎症不持久
[0265] 使酵母多糖注入足垫中以诱导小鼠急性滑膜炎。野生型小鼠表现出快速足肿胀，在24小时达到最大足直径（2.56mm，相对于开始的足直径增加62%）。该肿胀在此后的24小时内保持。2天后，足直径减小，但到了第4天，足仍然是肿胀的（2.08mm，增加32%）（图1a）。在注射后24小时，生腱蛋白-C缺陷型小鼠表现出与野生型小鼠类似的足肿胀程度（2.41mm，相对于开始的足直径增加57%）。然而，生腱蛋白-C基因敲除小鼠的肿胀消退比野生型小鼠快；在2天时，足直径显著减小并且到了第4天减小至1.7mm（仅增加11%）（图1a）。到注射后的第4天，野生型小鼠的足仍可见肿胀和发红，而生腱蛋白-C基因敲除小鼠的足看不到肿胀或发红并且与未注射的足类似（图9）。
[0266] 在第4天，通过组织学反映出这种差异。野生型小鼠的滑膜显著发炎并表现出细胞侵润，并观察到软骨蛋白多糖的流失（图1b,c）。相比之下，生腱蛋白-C缺陷型小鼠的滑膜未表现出滑膜炎、细胞浸润或软骨蛋白多糖流失的流失（图1d,e）和与假注射和未注射的小鼠类似（未显示）。关节炎症的定量化揭示了尽管在野生型或生腱蛋白-C基因敲除小鼠中具有少量渗出液（关节腔中的细胞团），但生腱蛋白-C基因敲除小鼠中的浸润液水平（滑膜层中的细胞团）显著减低（图1f）。在任一基因型小鼠中未发生软骨或骨侵蚀（未显示），然而在野生型小鼠中发生低水平的软骨细胞死亡，该软骨细胞死亡在生腱蛋白-C基因敲除小鼠中未观察到（图1g）。因此，生腱蛋白-C表达表现出促进了急性炎症的维持。
[0267] 在抗原诱导的关节炎中生腱蛋白-C基因敲除小鼠被保护免受持续性炎症攻击和结构破坏
[0268] 为了确定生腱蛋白-C是否也促进更具破坏性的炎症性关节疾病，在使用mBSA免疫之后通过关节内注射mBSA至膝关节来诱导侵蚀性关节炎。该模型涉及细胞和液体两种免疫应答并诱导类似于人RA的病理变化(Brackertz(1977))。在生腱蛋白-C基因敲除和野生型小鼠中，mBSA的注射诱导相似的炎症反应。与假注射的（图2a、b、g）或未注射的（未显示）小鼠相比，在两种基因型小鼠中到了24小时细胞渗液和滑膜加厚明显（图2c-f、h、i）。
[0269] 然而，该现象发生在野生型小鼠中，而在生腱蛋白-C基因敲除小鼠中不持久。到了注射后第3天，野生型小鼠表现出半月板和关节囊的炎症增加、滑膜增生、细胞和纤维蛋白在关节腔中沉积、关节翳形成和局部的软骨蛋白流失（图3a、b、f）。相比之下，第3天，生腱蛋白-C基因敲除小鼠中炎症限于关节囊中，滑膜炎已消退并且在关节腔中不存在纤维蛋白/细胞沉积、无关节翳形成并且没有骨蛋白流失（图3c、d、e）。
[0270] 第7天，野生型小鼠表现出持久的炎症细胞侵润和关节腔渗出，广泛的滑膜炎和关节翳形成以及关节软骨的破坏和骨侵蚀（图4a、b）。假注射的膝部和未接受注射的小鼠的膝部健康并表现出未发炎或关节破坏（未显示）。生腱蛋白-C缺陷型小鼠还具有仅显示轻度炎症细胞浸润的健康关节，并且没有关节腔渗液、滑膜炎、关节翳形成、关节软骨的破坏或骨侵蚀（图4c、d）。接受假注射和或未接受注射的生腱蛋白-C缺陷型小鼠的关节也是健康的（未显示）。
[0271] 如在材料和方法中所描述的，关节疾病的评分得到了这些组织数据。在注射24小时后，在野生型小鼠和生腱蛋白-C基因敲除小鼠中观察到的细胞浸润和渗出液的水平无显著性差异。然而，虽然在野生型小鼠中细胞团随时间继续增大，但在生腱蛋白-C基因敲除小鼠中该反应衰减并且关节中的细胞数量随时间减少（图4e）。在野生型小鼠的软骨中，软骨细胞的高水平死亡随时间不断增加，但在生腱蛋白-C基因敲除小鼠中未观察到显著的死亡（图4f）。在24小时或3天时，在野生型小鼠中的软骨表面侵蚀和骨侵蚀不明显（未显示），但到了7天，发生显著的组织破坏。与此相反，在24小时、3天（未显示）或7天时生腱蛋白-C基因敲除小鼠未表现出组织破坏（图4f）。这些数据表明，虽然在生腱蛋白-C基因敲除小鼠关节炎症的引发（细胞流入滑膜和关节腔）不受影响，与在野生型小鼠中不同，其疾病不发展到组织破坏和细胞死亡。这些结果证实了生腱蛋白-C的表达在该模型中对于持续的滑膜炎和关节破坏是必需的。
[0272] 实施例4-细胞培养
[0273] 患者样品
[0274] 人单核细胞从外周血中分离(London Blood Bank)，并且如之前所述的(Foxwell(1998))，巨噬细胞得自使用100ng/ml的M-CSF分化4天后的单核细胞。
[0275] 如之前所述的(Brennan(1989))，RA膜细胞（表示所有滑膜细胞类型的混合种群）是从滑膜中分离的，所述滑膜得自接受关节置换手术的患者。如之前所述的(Brennan(1989))，RA滑膜成纤维细胞从RA膜细胞的混合群体中分离。该研究得到当地Trust伦理学委员会(Riverside NHS Research Committee)的批准，并且废物组织（在关节置换手术之后的滑膜）仅在收到患者签署的知情同意书之后获得并且组织是匿名的以保护患者身份。
[0276] 在分离之后立即将RA膜细胞和巨噬细胞在含有10%(v/v)FBS和100U/ml(单位/ml)青霉素/链霉素的RPMI 1640中，在96-孔组织培养平板中以1x105细胞/孔培养24小时，随后进行刺激。在刺激之前，使滑膜成纤维细胞（仅在传代2或3次的情况下使用）在含有10%(v/v)FBS和100U/ml(单位/ml)青霉素/链霉素的DMEM中，在96-孔组织培养平板上以1x104细胞/孔培养24小时。
[0277] 小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)
[0278] MEF表达高水平的所有9个鼠TLR的mRNA并对TLR配体活化具有特异性的和高度的反应性。具有TLR2、TLR4和MyD88的靶向缺失的小鼠的MEF证实了在其对特异性配体IL-6反应中具有严重缺陷(Kurt-Jones(2004))。从年龄匹配的妊娠雌性的野生型、TLR2和TLR4基因敲除小鼠中收获的d13胚胎中分离MEF(如在Todaro(1963)中所述)。在含有10%(v/v)FBS4
和100U/ml(单位/ml)青霉素/链霉素的DMEM中，在96-孔组织培养平板上以1x10细胞/孔培养成纤维细胞24小时。
和100U/ml(单位/ml)青霉素/链霉素的DMEM中，在96-孔组织培养平板上以1x10细胞/孔培养成纤维细胞24小时。
[0279] 如在Butler(1999))中所述的，通过吸取年龄匹配的雌性野生型、TLR2和TLR4基因敲除小鼠的股骨得到BMDM，并在DMEM,20%(v/v)FBS,10ml/L(v/v)抗菌-抗真菌溶液PSA、50μM β-巯基乙醇和10ng/ml M-CSF中培养细胞7天。
[0280] HEK293细胞系
[0281] 在刺激之前，在含有10%(v/v)FBS和10μg/ml稻瘟素的DMEM中，在96-孔组织培养平板上以1x104细胞/孔培养表达TLR2和TLR4/CD14/MD-2的HEK293细胞系24小时。
[0282] 细胞刺激和细胞因子合成的评价
[0283] 在37℃下将细胞与所标出的剂量的生腱蛋白-C和重组生腱蛋白-C片段（1.0μM-1.0nM）一起孵育。还对细胞进行了刺激，其中按照所标出的使用了LPS(对于人巨噬细胞使用1ng/ml，人成纤维细胞、RA膜细胞和HEK使用10ng/ml，MEFS和BMDM使用100ng/ml，以及HEKS使用10ng/ml)、PAM3(对于人巨噬细胞、人成纤维细胞和HEK使用10ng/ml，MEFS和BMDM使用100ng/ml)、鼠IL-1(对于MEFS，使用5ng/ml)和鼠TNF-α(对于MEFS，使用100ng/ml)。除非另外指明，否则使用粗LPS用于体外研究。
[0284] 对于腺病毒基因转移实验，将人RA滑膜成纤维细胞与腺病毒载体在100倍的多倍感染下一起孵育，2小时后清洗，在完全培养基中培养24小时，然后刺激24小时，在此时间之后收集上清液。
[0285] 按照所记载地，在刺激之前，将细胞与10μg/ml抗-CD14抗体、10μg/mlIL1受体拮抗剂、10μg/ml抗-TLR2抗体、25μg/ml抗-TLR4抗体、10或25μg/ml同型对照抗体、25μg/ml多粘菌素B或1μg/ml msbB LPS,在4℃下一起预孵育30分钟。按照记载地，在加入到细胞之前，将重组生腱蛋白-C和FBG以及LPS煮沸15分钟。
[0286] 在所有情况下，在整个实验时间期间，当通过MTT细胞活力试验(Sigma,Poole,UK)测试时，细胞的活力未受到显著影响。
[0287] 之后，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）,按照生产商的说明，检查上清液中是否存在细胞因子TNF-α、IL-6和IL-8。从光谱光度测量ELISA平板读板仪(Labsystems Multiscan Biochromic,Vantaa,Finland)读出吸光度，并使用Ascent软件程序(Thermo Labsystems,Altrincham,UK)进行分析。
[0288] 结果
[0289] 在原代人RA滑膜成纤维细胞和巨噬细胞中生腱蛋白-C诱导TNF-α,IL-6和IL-8的合成
[0290] 我们接下来研究了生腱蛋白-C是否可以激活先天性免疫应答。使用生腱蛋白-C刺激原代人巨噬细胞和RA滑膜成纤维细胞并测试了促炎细胞因子TNF-α、IL-6和IL-8的生成。使用细菌细胞壁成分LPS作为阳性对照。生腱蛋白-C诱导细胞类型特异性的细胞因子谱，该谱与LPS具有显著性差异。其剂量依赖性地刺激人巨噬细胞中TNF-α、IL-6和IL-8的生成（图
5a）。然而，生腱蛋白-C仅仅在滑膜成纤维细胞中诱导IL-6的合成，而LPS诱导IL-6和IL-8（图5b）。在成纤维细胞中，LPS和生腱蛋白-C菌不诱导TNF-α合成（数据未显示）。生腱蛋白-C刺激人巨噬细胞表达IL-6（图5c）、IL-8和TNF-α，以及刺激滑膜成纤维细胞表达IL-6（未显示）具有热敏性并且不受LPS抑制剂、多粘菌素B的影响。所有这些结果提供了强有力的证据，即生腱蛋白-C诱导细胞因子不是因为LPS污染。
5a）。然而，生腱蛋白-C仅仅在滑膜成纤维细胞中诱导IL-6的合成，而LPS诱导IL-6和IL-8（图5b）。在成纤维细胞中，LPS和生腱蛋白-C菌不诱导TNF-α合成（数据未显示）。生腱蛋白-C刺激人巨噬细胞表达IL-6（图5c）、IL-8和TNF-α，以及刺激滑膜成纤维细胞表达IL-6（未显示）具有热敏性并且不受LPS抑制剂、多粘菌素B的影响。所有这些结果提供了强有力的证据，即生腱蛋白-C诱导细胞因子不是因为LPS污染。
[0291] 纤维蛋白原样结构域(FBG)介导细胞的生腱蛋白-C
[0292] 生腱蛋白-C是大的六聚分子，其每个结构域与不同的细胞表面受体结合（在Orend(2005)中综述）。理解生腱蛋白-C的作用机制需要鉴定对于促进细胞因子生成关键的结构域（或多个结构域）。我们合成了含有该分子的不同的分子结构域的重组蛋白质（图10）。用大肠杆菌制备了每个结构域，经纯化（图11）并通过将纯的蛋白质接受鲎试剂试验发现其包含<10pg/mlLPS。生腱蛋白-C仅有一个结构域具有活性。纤维蛋白原样球（FBG）以与全长生腱蛋白-C同等程度，在人巨噬细胞中刺激TNF-α合成（图6a），在人巨噬细胞中刺激IL-6和IL-8合成（未显示）以及在RA滑膜成纤维细胞中刺激IL-6合成（未显示）。与全长生腱蛋白-C相似，FBG在RA滑膜成纤维细胞中不诱导IL-8合成，而在RA滑膜成纤维细胞中LPS诱导IL-8合成（数据未显示）。FBG诱导的细胞因子合成也具有热敏性并且不受多粘菌素B的影响（数据未显示）。
[0293] 生腱蛋白-C的FBG结构域诱导人RA滑膜中细胞因子生成和小鼠关节炎症
[0294] 我们研究了FBG是否可以在RA患者的滑膜中促进炎性细胞因子的表达。的该RA组织模型（包含所有滑膜细胞类型的混合群体）自发地产生高水平的IL-6、IL-8和TNF-α(Brennan(1989))（图6b）。FBG进一步地增强了所有这些细胞因子的合成（图6b）。为了确定FBG是否可以在体内诱导炎症，对野生型小鼠关节内注射FBG。我们观察到了短暂的和剂量依赖性的关节炎症刺激。在未注射的小鼠或注射PBS（图6c-e）或100ng FBG（数据未显示）的小鼠中未发生炎症或蛋白多糖流失的流失。在注射1μgFBG的小鼠中，观察到炎症细胞浸润（图6f）、轻度滑膜炎、关节翳形成（图6g）和蛋白多糖流失（图6h）。在注射3μgFBG的小鼠中观察到类似反应（数据未显示）。根据组织学定量，在注射FBG的小鼠中观察到高水平的细胞浸润和渗出及软骨细胞死亡，以及有限的软骨表面侵蚀和骨损伤（图6i）。
[0295] FBG介导的细胞因子合成依赖于Myd88
[0296] 已经表明，包括纤维蛋白原在内的许多DAMP(Smiley(2001))通过激活TLR刺激先天免疫应答。因此，我们研究了TLR是否也可以介导生腱蛋白-C诱导的细胞因子生成。骨髓分化因子88(MyD88)对于除了TLR3之外的所有TLR的信号传输是必需的(O’Neill(2008))。感染表达显性阴性MyD88的腺病毒的滑膜成纤维细胞废除了IL-6的FBG诱导（图7a），而感染了GFP对照病毒的滑膜成纤维细胞不如此。这些数据提示，FBG诱导的炎症依赖于有功能的MyD88。FBG的这种效应似乎没有受到IL-1的介导，因为IL-1受体拮抗剂的添加不抑制细胞因子的诱导（数据未显示）。为了证实FBG的作用是MyD88依赖性的，我们证明了FBG在胚胎成纤维细胞中不刺激细胞因子合成，所述的胚胎成纤维细胞是从靶向缺失MyD88基因的小鼠中分离的。TLR2配体PAM3、TLR4配体LPS和IL-1都通过MyD88进行信号传输。在缺陷型小鼠的MEF中，也消除了这些信号的刺激。然而，不经过MyD88的TNF-α信号未受到影响（图7b）。野生型MyD88的再转染使这些细胞对FBG、PAM3、LPS和IL-1的反应性恢复（数据未显示）。
[0297] 通过TLR4的FBG信号
[0298] TLR展示出对内源性配体的特异性；蛋白质被TLR2和4中的一个或两个识别（在O’Neill(2008)中综述）。抗TLR4的中和抗体抑制FBG和LPS两者在人巨噬细胞中诱导IL-6、IL-8和TNF-α合成和在RA滑膜成纤维细胞中诱导IL-6合成，但对TLR2配体PAM3的功能没有影响。抗TLR2的抗体抑制PAM3介导的细胞因子合成，但对LPS或FBG诱导的细胞因子合成没有影响。同型匹配的对照对于由任何配体（人巨噬细胞的TNF-α合成显示与图8a中）诱导的细胞因子合成都没有影响。为了证实FBG作用是TLR4依赖性的，我们证明了FBG在从靶向缺失TLR4基因的小鼠中分离的胚胎成纤维细胞或巨噬细胞中不刺激细胞因子合成。FBG介导的细胞因子合成在从靶向缺失TLR2基因的小鼠中分离的胚胎成纤维细胞或巨噬细胞中不受影响。从TLR2缺陷型小鼠中分离的细胞对PAM3无反应性，但对LPS和IL-1具有反应性。从TLR4缺陷型小鼠中分离的细胞对LPS无反应性，但对PAM3和IL-1具有反应（图8b,c）。此外，TLR4的表达对于FBG在体内的致关节炎作用是需要的；FBG能够诱导TLR2基因敲除的小鼠的关节炎症，但不诱导TLR4基因敲除小鼠（图12）。
[0299] FBG和LPS的不同的共受体需求
[0300] 通过TLR4的LPS信号传输由受体复合物介导，所述受体复合物包括可溶蛋白MD-2和GPI连接的细胞表面或可溶性CD14（在Fitzgerald(2004)中综述）。我们接下来检测了CD14和MD-2对于TLR4的FBG活化是否是必需的。这里作为阳性对照，我们检测了需要CD14和MD-2的光滑糖基化LPS的活性(Jiang(2005))。LPS介导人巨噬细胞的IL-6、IL-8和TNF-α合成，并且RA滑膜成纤维细胞的IL-6合成受到抗CD14抗体和拮抗LPS的抑制，所述的拮抗LPS得自msbB突变大肠杆菌，并与LPS竞争结合MD-2(Coats(2007))。相反，对于TLR2的活化不需要这些共受体的PAM3和FBG介导的细胞因子合成不受CD14抗体或msbB突变LPS的影响（图8d显示了人巨噬细胞的TNF-α合成）。这些数据提示，CD14和MD-2两者对于FBG介导的细胞因子合成均不是必需的。因此，尽管LPS和FBG两者均通过TLR4的活化进行信号传输，但它们对共受体可以有不同的需求。
[0301] 实施例5-生腱蛋白-C作用的抑制和人组织中的合成
[0302] 本实施例研究了以下效应：（1）生腱蛋白-C的促炎作用的预防和（2）在人RA滑膜中生腱蛋白-C表达的抑制。
[0303] 方法
[0304] 肽合成
[0305] Biogenes,Germany合成了包含整个FBG结构域的9个交叠的肽（表2）。在室温下切割肽（切割混合物：90%三氟醋酸盐、5%苯甲硫醚（thioanisol）、3%乙二硫醇、2%苯甲醚），通过反相高效液相色谱法纯化并通过MALDI TOF质谱分析进行表征。如高效液相色谱法所测定的，肽的纯度>85％。
[0306] 设备不能够合成肽7，推测是由于形成了阻止肽链延伸的次级结构（如之前(LaFleur(1997)所报道)。
[0307] 肽# 氨基酸序列
1 TIGLLYPFPKDCSQAMLNGDTTSGLYTIYL
2 YTIYLNGDKAEALEVFCDMTSDGGGWIVFL
3 WIVFLRRKNGRENFYQNWKAYAAGFGDRRE
4 GDRREEFWLGLDNLNKITAQGQYELRVD
5 ELRVDLRDHGETAFAVYDKFSVGDAKTRYK
6 KTRYKLKVEGYSGTAGDSMAYHNGRSFST
7 RSFSTFDKDTDSAITNCALSYKGAFWYRN
8 WYRNCHRVNLMGRYGDNNHSQGVNWFHWKG
9 FHWKGHEHSIQFAEMKLRPSNFRNLEGRRKRA
1 TIGLLYPFPKDCSQAMLNGDTTSGLYTIYL
2 YTIYLNGDKAEALEVFCDMTSDGGGWIVFL
3 WIVFLRRKNGRENFYQNWKAYAAGFGDRRE
4 GDRREEFWLGLDNLNKITAQGQYELRVD
5 ELRVDLRDHGETAFAVYDKFSVGDAKTRYK
6 KTRYKLKVEGYSGTAGDSMAYHNGRSFST
7 RSFSTFDKDTDSAITNCALSYKGAFWYRN
8 WYRNCHRVNLMGRYGDNNHSQGVNWFHWKG
9 FHWKGHEHSIQFAEMKLRPSNFRNLEGRRKRA
[0308] 表2跨越人生腱蛋白-C的整个FBG结构域的折叠肽
[0309] 患者样品和细胞培养物
[0310] 从接受关节置换手术的患者中得到的滑膜中分离RA膜细胞（代表所有滑膜细胞类型的混合群体）(Brennan(1989))。滑膜组织在含有5%胎牛血清(FCS)(GIBCO)、5mg/ml IV型胶原酶(Sigma)和0.15mg/ml DNA酶I(Sigma)的RPMI 1640(GIBCO)中消化，并在37℃下孵育2小时。
[0311] 在孵育之后，吸取组织，使其通过尼龙网进入无菌烧杯中。然后在完全培养基（补充10%FSC的RPMI）中清洗细胞三次。通过在补充10%FBS、1μM谷氨酰胺、100U/ml青霉素，和链霉素的DMEM(Bio-Whittaker)中进行选择，从RA膜细胞的混合群体中分离RA滑膜成纤维细胞。从外周血液(London Blood Bank)中分离人单核细胞并且在用100ng/ml M-CSF分化4天后，从单核细胞中得到巨噬细胞。
[0312] 该研究得到当地Trust伦理学委员会的批准，并且废物组织（在关节置换手术之后的滑膜）仅在患者接受签署知情同意书之后获得，并组织是匿名的以保护患者身份。
[0313] 细胞刺激和细胞因子合成的评价
[0314] 在分离之后立即使RA膜细胞在含有10%(v/v)FBS和100U/ml(单位/ml)青霉素/链霉素的RPMI 1640中，在96-孔组织培养平板中在1x105细胞/孔下进行培养。使细胞在37℃下，无添加、加缓冲液对照(PBS,1%BSA,0.01%NaN3)或加25μm、100μM或250μM的各个FBG跨越肽（spanning peptide）一起孵育24小时。
[0315] 以5×104个细胞每3.5-cm培养皿的浓度接种滑膜成纤维细胞（仅在传代2或3次的情况下使用）。在最终浓度为10nM时，在不含血清的OptiMEMI中使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）转染siRNA。使用了抗人生腱蛋白-C的两个不同siRNA(s7069和s229491)(Applied Biosystems)。
[0316] s7069的siRNA序列为（有义5’CGCGAGAACUUCUACCAAAtt 3’，反义5’UUUGGUAGAAGUUCUCGCGtc 3’)，而s229491的siRNA序列为(5’GGAAUAUGAAUAAAGAAGAtt 3’，反义5’UCUUCUUUAUUCAUAUUCCgg 3’)。将抗荧光素酶的siRNA转染为非靶向对照。
[0317] 在转染四小时后，将培养基换为用预平衡的含有10%FBS(v/v)的杜氏改良培养基，并使细胞进一步孵育48小时和72小时。然后，在37℃下，用10ng/ml LPS刺激细胞24小时。分别通过PCR和蛋白质印迹来测定生腱蛋白-C mRNA的量和蛋白质水平。使用QiaAmp RNA Blood mini kit(Qiagen,Germany)，从细胞中提取总RNA。使用 III Reverse Transcriptase(Invitrogen)和18-聚dT(Eurofins MWG Operon)，由等量的总RNA合成cDNA。
[0318] 通过基于定量的实时PCR的delta-delta ct方法来分析基因表达，所述的PCR使用TaqMan引物系列在Corbett Rotor-gene 6000机器(Corbett Research Ltd)上进行，所述的引物系列为人生腱蛋白-C(Hs01115663-m1)和人核糖体蛋白内源对照(RPLPO)(4310879E)(Applied Biosystems)。通过SDSPAGE和使用抗体MAB1908(Millipore)的蛋白质印迹法，从细胞上清液和细胞裂解物中检测生腱蛋白-C蛋白。
[0319] 在刺激之前，在96-孔组织培养平板中，用含有5%(v/v)FBS和100U/ml青霉素/链霉素的RPMI 1640在1x105细胞/孔下培养巨噬细胞24小时。使细胞在37℃下，无添加，加1.0μM FBG、1ng/ml LPS或者1或20μMFBG肽一起孵育24小时。除非另外指明，使细胞与20μM FBG肽一起预孵育15分钟。
[0320] 在整个实验时间期间，当通过MTT细胞生存力试验(Sigma,Poole,UK)检测时，细胞的生存力未受到显著影响。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）,按照生产商（R&D Systems）的说明，检测上清液中是否存在细胞因子TNF-α、IL-6和IL-8。在光谱光度测量ELISA读板仪(Labsystems Multiscan Biochromic,Vantaa,Finland)上读取吸光度并使用Ascent软件程序(Thermo Labsystems,Altrincham,UK)进行分析。
[0321] 统计方法
[0322] 使用GraphPad(GraphPad Software Inc.,San Diego,CA)计算平均值、SD和SEM。
[0323] 结果
[0324] 通过特异性FBG肽阻碍在RA膜培养物中的细胞因子合成
[0325] 肽抑制的方法已成功用于在生腱蛋白-C的FBG结构域中精确查找αvβ3整合素结合位点，并用于防止对生腱蛋白-C的该结构域作出响应的细胞粘合(Lafleur(1997)和Yokoyama(2000))
[0326] 我们合成了一系列的 30个氨基酸的8个交叠的肽，所述的肽跨越FBG的整个序列~（表2）。测试肽在RA滑膜培养物中自发阻滞细胞因子合成的能力。TNF和IL8合成被肽3和8的抑制但不被任何其他肽抑制（TNF显示于图15中）。肽3和8剂量依赖性地抑制细胞因子合成，在最高浓度下分别实现95%和56%抑制（图16）。虽然肽5对TNF合成没有影响，但在RA膜细胞中，其剂量依赖性地阻碍IL8合成，最大抑制为81%（图16）。
[0327] 为了定位在FBG内负责诱导细胞因子生成的的活性结构域，我们用每种FBG肽刺激了原代人巨噬细胞。肽1、5和6均以剂量依赖性方式诱导细胞因子合成（图17）。
[0328] 为了确定是否任何肽都可以阻碍FBG诱导的人巨噬细胞中细胞因子合成，在使用完整FBG或LPS刺激之前，使细胞与每种FBG肽一起预孵育。肽5特异性地阻碍FBG介导的细胞因子合成，而肽8阻碍对LPS和FBG两者有响应的细胞因子合成（图18）。
[0329] 因此，肽8非特异性地阻滞任意的刺激物所诱导的细胞因子生成。该结构域是介导细胞粘合的FBG的整合素结合结构域，从而可以用于阻止细胞附着在组织培养平板上。肽5特异性地阻滞FBG诱导的细胞因子合成，暗示了靶向该结构域可以用于阻止生腱蛋白-C诱导的炎症。
[0330] 沉默生腱蛋白-C的基因表达在RA滑膜成纤维细胞中抑制细胞因子合成
[0331] 抑制人RA滑膜中生腱蛋白-C表达的效应的检测已经鉴定了滑膜成纤维细胞是RA中生腱蛋白-C的主要来源（图1C）（Goh 2010中）。
[0332] 已经显示，在这些细胞中siRNA介导的生腱蛋白-C表达抑制（knockdown）具有94-96%的最大效率（图19）。在使用生腱蛋白-C siRNA转染的细胞中，与对照细胞相比，细胞因子合成和LPS诱导的细胞因子生成的基线水平分别被抑制了38%和44%（图19）。
[0333] 这些数据揭示，在RA滑膜成纤维细胞中沉默生腱蛋白-C降低了促炎细胞因子的合成，并暗示生腱蛋白-C表达的消除对于抑制滑膜中的炎症是可行的策略。
[0334] 该工作已确定阻碍生腱蛋白-C活性（用肽）和生腱蛋白-C表达（用siRNA）减低了人RA滑膜中炎症细胞因子合成。这些数据显示，生腱蛋白-C阻碍在治疗RA和其他炎性疾病方面具有潜在的临床益处。
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