用于细胞生长的片状微纤维化制品
阅读：1014发布：2020-08-26
专利汇可以提供用于细胞生长的片状微纤维化制品专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及利用微 纤维 化热塑性聚合材料的基质培养细胞。更具体地讲，本发明涉及培养细胞的方法。另外，本发明涉及分散在细胞培养基中用于培养细胞的微纤维化制品。本发明的用于培养细胞的热塑性聚合材料基质用于组织工程和 伤口愈合 应用。，下面是用于细胞生长的片状微纤维化制品专利的具体信息内容。
1.一种培养细胞的方法，包括：
提供双轴取向、具有片状表面的热塑性基体的基质，所述基质分 散在细胞培养基中；并且
在所述基质上接种细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述片状表面包括平均长度 小于20微米的微薄片。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述微薄片的平均长度为1 至3微米。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述微薄片的平均宽度小于 200微米。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述微薄片的平均宽度为5 至30微米。
6.根据权利要求2所述的方法，其中所述微薄片的平均厚度为1 至20微米。
7.根据权利要求2所述的方法，其中所述微薄片的表面长宽比为 从1:1至1:20。
8.根据权利要求2所述的方法，其中所述微薄片的表面积大于 0.5m2/克。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述基质包括半结晶聚合物 组分和空隙引发组分的可熔融加工的不混溶混合物。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述双轴取向的热塑性基 体的基质包含聚烯烃。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述半结晶聚合物组分选 自聚乙烯均聚物、聚丙烯均聚物、聚乙烯共聚物、聚丙烯共聚物、包 含聚丙烯的共混物以及包含聚乙烯的共混物。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述双轴取向的热塑性基 体的基质包含脂族聚酯。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述脂族聚酯选自聚(丁二 酸丁二醇酯)均聚物、聚(己二酸丁二醇酯)均聚物、聚(己二酸丁二酸丁 二醇酯)共聚物、聚(丁二酸己二酸乙二醇酯)共聚物、聚(己二酸乙二醇 酯)均聚物、聚丙交酯、聚对二氧环己酮、聚已内酯、聚(3-羟基丁酸酯)、 聚(3-羟基戊酸酯)、聚乙交酯、聚(氧乙烯乙醇酸酯)、聚丙交酯共聚物、 和聚乙交酯共聚物。
14.根据权利要求9所述的方法，其中所述空隙引发组分选自有 机和无机固体、以及不混溶的聚合物。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述双轴取向的热塑性基 体的基质包含两种或更多种聚合物的共混物。
16.根据权利要求12所述的方法，其中所述基质是可生物降解的。
17.根据权利要求12所述的方法，其中所述基质是可生物吸收的。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞选自哺乳动物细 胞、细菌和真菌。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述细胞为成纤维细胞。
20.一种用于培养细胞的制品，包括双轴取向、具有片状表面的 热塑性基体的基质，所述基质分散在细胞培养基中。
21.根据权利要求20所述的制品，其中所述片状表面包括微薄片。
22.根据权利要求20所述的制品，其中所述基质包括双轴取向的 微纤维化膜或泡沫。
23.根据权利要求21所述的制品，其中所述微薄片是构成基质中 10微米或更大的深度所必需的。
24.根据权利要求20所述的制品，其中所述细胞培养基还包含细 胞。
25.根据权利要求22所述的制品，其中所述制品在膜或泡沫的整 个厚度上包括具有微纤维化形态的所述基质。
26.根据权利要求20所述的制品，容纳在容器中。
27.一种组织支架，包括双轴取向的热塑性基体的基质，所述基 体具有分散在细胞培养基内的片状表面。
28.根据权利要求27所述的支架，其中所述基质包含脂族聚酯。
技术领域
背景技术
组织工程和伤口愈合是重建和/或再生失去的或损坏的组织的方 法。早期在开发用于细胞生长的细胞外基质方面所作的努力包括使用 可生物降解材料和可生物吸收材料。在这些基质的开发中，透明质酸 和胶原已被采用作为工程组织用于器官的置换、烧伤或溃烂皮肤的置 换、骨丢失的置换或甚至用于脑组织的置换。这些材料通常是昂贵的 并且在大量制备时具有可变的特性。
诸如聚乳酸均聚物和聚已酸内酯均聚物之类的聚合物及其相关的 共聚物和共混物作为支架和/或细胞外基质提供用于细胞渗透和聚合物 降解的多孔结构。然而，为了成功进行组织再生，足够的细胞增殖和 适当的分化必须在三维细胞复合物中实现。非织造织物已经在组织应 用中被用作支架，如以下文献中所述：Aigner，J.et al.，“Cartilage Tissue Engineering with Novel Nonwoven Structured Biomaterial Based on Hyaluronic Acid Benzyl Ester”，J.Biomed.Mater.Res.，1998，42，172-181 (爱格纳等人，“基于透明质酸苄基酯的新型非织造结构生物材料的 软骨组织工程”，《生物医学材料研究杂志》，1998年第42卷第172-181 页)；Bhat，G.S.，“Nonwovens as Three-Dimensional Textiles for Composites”，Mater.Manuf.Process，1995，10，67-688(巴哈特，“非织 物作为三维纺织物用于复合材料”，《材料与制造工艺》，1995年第 10卷第67-688页)；Ma，T.，Tissue Engineering Human Placenta Trophoblast Cells in 3-D Fibrous Matrix：Spatial Effects on Cell Proliferation and Function”，Biotechnol.Prog.，1999，15，715-724(马， “三维纤维基质中的人胎盘滋养层细胞组织工程：对细胞增殖和功能 在空间上的影响”，《生物工艺学进展》，1999年第15卷第715-724 页)以及Bhattarai，S.R.et al.，“Novel Biodegradable Electrospun Membrane：Scaffold for Tissue Engineering”，Biomaterials，2004，25， 2595-2602(巴塔拉伊等人，“新型可生物降解的静电纺丝膜：用于组 织工程的支架”，《生物材料》，2004年第25卷第2595-2602页)。
细胞生物学研究细胞(组成生物体的基本单位)的结构和功能。 人体的形态和功能是其组成细胞的形态、功能和行为的总和。因此， 该领域的研究已发展为使得对疾病的预防和治疗以及人的行为有了更 好的了解。技术和方法学的改进已使细胞生物学在对细胞的了解上发 展到了新的水平。
在生长的细胞系统中，循环是通过母细胞分裂成两个子细胞而形 成细胞来发生的。该循环在多细胞机体中以及在分离细胞的培养中发 生。细胞的所有组分在以有丝分裂(核分裂)和胞质分裂(细胞质的 分裂)的分裂事件结束的循环中加倍。
多细胞机体中的细胞通过细胞分化变成特化细胞以执行特定功 能。更高级的有机体的生命周期从单细胞阶段开始，并且随着个体的 生长变得更复杂并且呈现出其特征形式。由于特化细胞类型的群体以 某种模式保持聚集，因此分化的细胞维持其特征形式和个性。几种细 胞类型构成组织，并且不同的组织形成器官。
细胞及其细胞组分的运动是相对于它们的环境来说的。极为多样 的移动(作为一种运动形式)与变形虫的运动类似。这种细胞内运动 通过形成伪足而完成，其中细胞质在伪足延出和收回过程中活跃地流 动。在一些情况下，已知该细胞施加了改变胚胎的发育组织和器官的 形状的力。细胞通过体腔、淋巴管和组织间隙蠕动，以寻找并吞食细 菌、异物和已死亡或正在死亡的细胞。在伤口愈合的活动中，邻近细 胞向伤口表面蠕动，覆盖伤口表面，同时其它细胞渗透并且填补间隙。 组织细胞以约0.5至50微米/分钟的速度非常缓慢地蠕动，然而，结构 细胞(例如成纤维细胞)在约一小时内增加其自身的长度，并以大约1 至2毫米/天的速度移动。有关细胞和细胞生物学的更多信息可见于 McGraw-Hill Encyclopedia of Science & Technology，1987，3，317-384 (《麦格劳-希尔科技百科全书》，1987年，第3卷第317-384页)。
在开发用于细胞生长的基质中，细胞分化和增殖相对于传统的培 养技术来说常常很困难。培养的细胞通常被从其组织特异性细胞外基 质分离出来，接着悬浮在生长培养基中，在该培养基中其附着在培养 皿的底部以形成汇合单层。细胞常常丧失其形态以及其生化特性和功 能特性。因此，去分化细胞与其最初的组织环境相比可能有不同的行 为。为了细胞增殖和分化的进行，必须附着到具有足够表面积的支架 上。该支架或基质表面可用肽序列进行改性以促进细胞的识别和快速 粘附。此外，三维基质需要多孔结构，以允许营养物质和气体扩散进 入附着在薄片上的大量细胞。营养物质、气体与废物在整个支架上在 增殖的细胞间进行自由交换对于维持细胞活力是必要的。这使得基质 在扩展时期内可用作分化和增殖的载体。
诸如聚乳酸均聚物和聚已酸内酯均聚物之类的聚合物及其相关的 共聚物和共混物作为支架和/或细胞外基质提供用于细胞渗透和聚合物 降解的多孔结构。然而，为了成功进行组织再生，足够的细胞增殖和 适当的分化必须在三维细胞复合物中实现。非织造织物已经在组织应 用中被用作支架，如以下文献中所述：Aigner，J.et al.，“Cartilage Tissue Engineering with Novel Nonwoven Structured Biomaterial Based on Hyaluronic Acid Benzyl Ester”，J.Biomed.Mater.Res.，1998，42，172-181 (爱格纳等人，“基于透明质酸苄基酯的新型非织造结构生物材料的 软骨组织工程”，《生物医学材料研究杂志》，1998年第42卷第172-181 页)；Bhat，G.S.，“Nonwovens as Three-Dimensional Textiles for Composites”，Mater.Manuf.Process，1995，10，67-688(巴哈特，“非织 物作为三维纺织物用于复合材料”，《材料与制造工艺》，1995年第 10卷第67-688页)；Ma，T.，Tissue Engineering Human Placenta Trophoblast Cells in 3-D Fibrous Matrix：Spatial Effects on Cell Proliferation and Function”，Biotechnol.Prog.，1999，15，715-724(马， “三维纤维基质中的人胎盘滋养层细胞组织工程：对细胞增殖和功能 在空间上的影响”，《生物工艺学进展》，1999年第15卷第715-724 页)以及Bhattarai，S.R.et al.，“Novel Biodegradable Electrospun Membrane：Scaffold for Tissue Engineering”，Biomaterials，2004，25， 2595-2602(巴塔拉伊等人，“新型可生物降解的静电纺丝膜：用于组 织工程的支架”，《生物材料》，2004年第25卷第2595-2602页)。
细胞生物学研究细胞(组成生物体的基本单位)的结构和功能。 人体的形态和功能是其组成细胞的形态、功能和行为的总和。因此， 该领域的研究已发展为使得对疾病的预防和治疗以及人的行为有了更 好的了解。技术和方法学的改进已使细胞生物学在对细胞的了解上发 展到了新的水平。
在生长的细胞系统中，循环是通过母细胞分裂成两个子细胞而形 成细胞来发生的。该循环在多细胞机体中以及在分离细胞的培养中发 生。细胞的所有组分在以有丝分裂(核分裂)和胞质分裂(细胞质的 分裂)的分裂事件结束的循环中加倍。
多细胞机体中的细胞通过细胞分化变成特化细胞以执行特定功 能。更高级的有机体的生命周期从单细胞阶段开始，并且随着个体的 生长变得更复杂并且呈现出其特征形式。由于特化细胞类型的群体以 某种模式保持聚集，因此分化的细胞维持其特征形式和个性。几种细 胞类型构成组织，并且不同的组织形成器官。
细胞及其细胞组分的运动是相对于它们的环境来说的。极为多样 的移动(作为一种运动形式)与变形虫的运动类似。这种细胞内运动 通过形成伪足而完成，其中细胞质在伪足延出和收回过程中活跃地流 动。在一些情况下，已知该细胞施加了改变胚胎的发育组织和器官的 形状的力。细胞通过体腔、淋巴管和组织间隙蠕动，以寻找并吞食细 菌、异物和已死亡或正在死亡的细胞。在伤口愈合的活动中，邻近细 胞向伤口表面蠕动，覆盖伤口表面，同时其它细胞渗透并且填补间隙。 组织细胞以约0.5至50微米/分钟的速度非常缓慢地蠕动，然而，结构 细胞(例如成纤维细胞)在约一小时内增加其自身的长度，并以大约1 至2毫米/天的速度移动。有关细胞和细胞生物学的更多信息可见于 McGraw-Hill Encyclopedia of Science & Technology，1987，3，317-384 (《麦格劳-希尔科技百科全书》，1987年，第3卷第317-384页)。
在开发用于细胞生长的基质中，细胞分化和增殖相对于传统的培 养技术来说常常很困难。培养的细胞通常被从其组织特异性细胞外基 质分离出来，接着悬浮在生长培养基中，在该培养基中其附着在培养 皿的底部以形成汇合单层。细胞常常丧失其形态以及其生化特性和功 能特性。因此，去分化细胞与其最初的组织环境相比可能有不同的行 为。为了细胞增殖和分化的进行，必须附着到具有足够表面积的支架 上。该支架或基质表面可用肽序列进行改性以促进细胞的识别和快速 粘附。此外，三维基质需要多孔结构，以允许营养物质和气体扩散进 入附着在薄片上的大量细胞。营养物质、气体与废物在整个支架上在 增殖的细胞间进行自由交换对于维持细胞活力是必要的。这使得基质 在扩展时期内可用作分化和增殖的载体。
发明内容
本发明涉及培养细胞的制品和方法。在一个方面，提供一种培养 细胞的方法，其包括双轴取向的热塑性基体基质，该基质具有分散在 细胞培养基中的片状结构，并且在该基质上接种细胞。片状表面包括 微薄片，该微薄片的平均长度小于20微米，并且通常为1至3微米。 该微薄片的平均宽度小于200微米，并且通常为5至30微米。微薄片 具有1至20微米的平均厚度，并且表面长宽比为1:1至1:20。微薄片 的表面积大于0.5m2/g。本发明的微薄片往往彼此大致平行，并且形状 如同一块板或板状丝带，以利于细胞附连更大的表面积。基质中薄片 的刚度和三维结构使得细胞可保持其分化和增殖能力。
在另一方面，本发明提供用于培养细胞的微纤维化制品，该制品 包括具有整合的基质的热塑性聚合物薄膜，所述整合的基质是具有来 自片状表面的双轴取向的热塑性微薄片，其中所述微纤维化制品被分 散在细胞培养基中。基板的微薄片被整合进微纤维化制品中的深度达 到10微米或更大，所述制品位于热塑性薄膜的至少一个表面上。作为 另外一种选择，该微纤维化制品可在热塑性薄膜的整个厚度上具有微 纤维化形态。
本发明提供被接种到微薄片基质的片状表面上的细胞，其中该基 质浸入细胞培养基中。细胞培养基可含有来自多种细胞系的细胞。此 外，本发明包括具有至少一个微纤维化表面的薄膜的制品，在该微纤 维化表面上，细胞生长基质是组织支架。同样，本发明包括作为多孔 装置或容器的基质的微纤维化制品。
本发明的以上概述并非旨在描述本发明每个公开的实施例或每个 实施方案。下面的附图和具体实施方式更具体地举例说明了示例性实 施例。
在另一方面，本发明提供用于培养细胞的微纤维化制品，该制品 包括具有整合的基质的热塑性聚合物薄膜，所述整合的基质是具有来 自片状表面的双轴取向的热塑性微薄片，其中所述微纤维化制品被分 散在细胞培养基中。基板的微薄片被整合进微纤维化制品中的深度达 到10微米或更大，所述制品位于热塑性薄膜的至少一个表面上。作为 另外一种选择，该微纤维化制品可在热塑性薄膜的整个厚度上具有微 纤维化形态。
本发明提供被接种到微薄片基质的片状表面上的细胞，其中该基 质浸入细胞培养基中。细胞培养基可含有来自多种细胞系的细胞。此 外，本发明包括具有至少一个微纤维化表面的薄膜的制品，在该微纤 维化表面上，细胞生长基质是组织支架。同样，本发明包括作为多孔 装置或容器的基质的微纤维化制品。
本发明的以上概述并非旨在描述本发明每个公开的实施例或每个 实施方案。下面的附图和具体实施方式更具体地举例说明了示例性实 施例。
附图说明
图1是双轴取向的热塑性基体的扫描电镜照片的数字图象，该基 板具有包括分散在实例3细胞培养基中的微薄片的片状表面。
具体实施方式
对于下面定义的术语，除非权利要求或说明书的其它地方给出不 同的定义，否则这些定义应被应用。
术语“微纤维化制品”被定义为双轴取向的、有空隙的(voided)或 有微空隙的(microvoided)热塑性薄膜、薄片或泡沫，其可通过施加足够 的流体能量以破坏表面而被微纤维化。所述片状表面包括从双轴取向 的膜基板制备的双轴取向的、热塑性的、基本呈矩形的微薄片基质。 可选地，微薄片可从薄膜的微纤维化表面获得。
术语“微纤维化表面”是指包括由一层或多层可微纤维化材料制 成的微薄片的表面。微薄片是部分已经与连续薄膜至少部分机械地分 离或分裂的材料。微薄片的大小和形状通常具有取决于可微纤维化材 料类型及其物理和化学性质的尺寸，例如取向的类型和程度、空隙的 存在和大小、多层、层厚度和球粒等，但并不限于此。微薄片优选地 一端与微纤维化材料保持附接，但是也可以与基膜完全分开。
术语“微薄片”是指包括片状结构的微纤维化结构。微薄片往往 彼此大致平行，形状如同一块板或板状丝带，其中微薄片的两个尺寸 的长度尺度是微薄片的第三尺寸的长度尺度的至少10倍，优选地至少 20倍。薄片可以彼此相连并且往往在宽度或长度方向上是连续的。尺 寸可以用扫描电镜进行测量。
术语“有空隙的”可以是热塑性聚合物的有微空隙的薄膜，或从 半结晶聚合物和空隙引发粒子的不混溶混合物制备的有空隙薄膜。如 本文所用，术语“薄膜”将涵盖薄片(包括发泡薄片)，并且还应该 理解，具有相同设置的微纤维化表面也可采用其它构造和外形(例如 管状)。术语“有空隙的”包括“有微空隙的”。
术语“细胞系”为在有利条件下不断增长和复制的细胞培养物。 细胞系起源于具有有限寿命的细胞培养物，并且如果以所需的间隔维 持并分盘，则可进行有规律地培养。
术语“细胞培养基”为盐、碳水化合物、维生素、氨基酸、代谢 前体、生长因子、激素和痕量元素的复杂混合物。培养基组分可根据 具体的目标细胞系而改变。
术语“完全生长培养基”应由添加了激素、痕量元素、生长因子 和血清的细胞培养基组成。其为是一种维持细胞或微生物的活力的物 质。
“培养细胞”被定义为在合成环境(即完全培养基)中生长的细 胞。例如，哺乳动物细胞的培养可取决于生长培养基、pH值、温度、 渗透度和其它因素。细胞培养是独立于生物体的细胞的生长。
术语“细胞的收获”即从细胞培养基移出细胞。细胞系可锚定于 培养皿或培养瓶中以单层生长。细胞系也可锚定于双轴取向的热塑性 基体的基质中以三维结构生长，所述基质具有包括微薄片的片状表面。 这些细胞以规律的间隔进行继代培养以维持细胞活力。
术语“汇合度”是指细胞在基质上的生长程度。
术语“接种”或“播种”是指将细胞置于双轴取向的热塑性基体 基质上的操作或步骤，所述基质具有包括分散在细胞培养基中的微薄 片的片状表面。
术语“哺乳动物细胞”指衍生自小鼠、人、猴子和大鼠细胞系的 多种来源，但并不限于此。
术语“细胞外基质”是由包括双轴取向的热塑性基体基质的合成 支架组成，该基质具有包括微薄片的片状表面，用于细胞在三维结构 中增殖和分化。
术语“可生物降解的”是指微纤维或微纤维化制品通过天然存在 的微生物(例如细菌、真菌、藻类)的作用和/或天然环境因素而降解。
术语“可生物吸收的”是指微纤维或微纤维化制品可通过生化作 用和/或水解作用被分解，并由活组织吸收。
术语“微纤维化的程度或深度”指少至10微米，但是可以最多50 微米或更大、100微米或更大，最多整个微纤维化膜的厚度，其通过蓬 松度进行测量。
由端点表示的数值范围详述包括包含在该范围内的所有数值(例 如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4和5)。
如本说明书以及所附的权利要求中所使用的，“一种”、“该” 和“所述”包括复数指代，除非内容另外清楚指出。因此，例如，包 含“该化合物”的组合物这一表达方式包括两种或更多种化合物的混 合物。如本说明书以及所附权利要求中所用，术语“或”通常是以其 包括“和/或”的含义使用，除非该内容另外明确指出。
除非另外指明，否则说明书和权利要求中所用的表示数量或成分 的所有数字、特性的量度等在所有情况下均应理解为被术语“约”所 修饰。因此，除非有相反的指示，否则在上述说明书和所附权利要求 中设定的数字参数为近似值，该近似值的改变可取决于通过本领域的 技术人员利用本发明的教导内容而获得的所需特性。在最低限度上， 并且无意于将等同原则的应用受制于权利要求的范围，每个数字参数 应至少按照所报告的有效数字之数并且通过应用普通的舍入技术来理 解。虽然在本发明的广泛范围内设定的数字范围和参数为近似值，但 具体例子中设定的数值会尽可能准确地报告。然而，任何数值都固有 地含有一定的误差，这些误差必定是由它们各自的试验测定中存在的 标准偏差引起。
本发明提供用于培养细胞的方法。该方法包括提供双轴取向的热 塑性基体的基质，该基质具有包括分散在细胞培养基中的微薄片的片 状表面。在另一个实施例中，该方法包含分散在细胞培养基质中的微 纤维化制品，其中微薄片上还接种有细胞。该微薄片的平均长度小于 20微米，并且表面积大于0.5m2/g。
在本发明中所使用的微纤维化制品包括具有整合到被取向的热塑 性薄膜上的片状表面的、双轴取向的热塑性基体的基质，该基质用于 在三维阵列中培养细胞以进行细胞的增殖和分化。微纤维化制品在伤 口愈合和组织工程应用中提供细胞附着和增殖。包括微薄片的双轴取 向的热塑性聚合物基板提供刚度和矩形几何形状。制造这些薄片提供 了高的强度、薄片间的间隙和薄片几何形状。微薄片分散在细胞培养 基中，并且进一步接种有培养细胞。用细胞接种微薄片允许具有高密 度的细胞和广泛的延展性。
可用于形成具有包括微薄片的片状表面的、双轴取向的热塑性基 体的基质和微纤维化制品的聚合物包括任何可熔融加工的热塑性晶 体、半结晶或可结晶的聚合物或共聚物，其中包括嵌段、接枝和无规 共聚物。半结晶聚合物由非晶区和晶区的混合物组成。晶区更为有序， 并且链段实际上包络在晶格中。一些聚合物可通过热处理、拉伸或取 向，并且通过溶剂诱导进行半结晶，其中这些方法可控制真晶成度。 本发明中可用的半结晶聚合物包括聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯共聚物、 聚乙烯共聚物、聚α-烯烃、聚氧甲烯、聚偏氟乙烯、聚(乙烯醇)、聚(甲 基戊烯)、聚(乙烯-三氟氯乙烯)、聚氟乙烯、聚环氧乙烷、聚对苯二甲 酸乙二酯、聚对苯二甲酸丁二酯、尼龙6、尼龙6，6、尼龙6，12、聚丁 烯、聚丙交酯、间规立构聚苯乙烯和热致性液晶聚合物。优选的聚烯 烃包括容易以低成本获得的聚丙烯和聚乙烯，并且可在微纤维化制品 中提供期望的特性，例如高模量和高拉伸强度。
可用的聚合物优选为可经过处理以具有高定向比的聚合物，这种 聚合物在某种程度上增强了机械完整性，并且具有半结晶的性质。取 向的半结晶聚合物显著改善了在取向方向上的强度和弹性模数，并且 低于其熔点的半结晶聚合物的取向形成了链折叠和链缺陷较少的取向 晶相。对于取向的半结晶聚合物，最有效的温度范围在聚合物的α结 晶温度与其熔点之间。α结晶温度或α过渡温度对应于聚合物的次级 转变，在该次级转变中晶体亚单元可在较大的晶体单元中移动。
因此，在这方面优选的聚合物为显示出α过渡温度(Tαc)的聚合 物，并且包括，例如：高密度聚乙烯、线形低密度聚乙烯、乙烯α-烯 烃共聚物、聚丙烯、聚偏二氟乙烯、聚氟乙烯、聚(乙烯三氟氯乙烯)、 聚氧甲烯、聚环氧乙烷、乙烯-乙烯醇共聚物及其共混物。
微纤维和微纤维化制品也可由具有热塑性聚合物组分和空隙引发 组分的、有空隙的、被取向的薄膜制备而成。这种被取向的有空隙的 薄膜在美国专利No.6,331,343(佩雷斯(Perez)等人)、美国专利 6,468,451(佩雷斯等人)和美国专利No.6,645,618(霍布斯(Hobbs)等 人)中有所描述，这些专利的整个公开内容以引用方式并入。
使用有空隙的、被取向的薄膜时，热塑性聚合物组分包括所描述 的聚合物，包括均聚物、共聚物和共混物。该热塑性聚合组分还可以 包括少量的第二聚合物，以给本发明的微纤维化制品赋予期望的特性。 这种共混物的第二聚合物可以是半结晶或无定形的，并且基于脂族聚 酯组分的重量而言，通常小于30重量％。可添加少量的其它聚合物(例 如)用以增强刚度、抗断裂性、Elmendorff抗撕强度、伸长、拉伸强度 和冲击强度，这是本领域已知的。
选择空隙引发组分以使得其在半结晶聚合物组分中不混溶。其可 以是平均粒度为约0.1至20微米(优选为1至10微米)的有机或无机 固体，并且可以是任何形状，包括非晶形、菱面体、纺锤形、板状、 菱形、立方体和球体。
用作空隙引发组分的可用无机固体包括实心玻璃或中空玻璃、陶 瓷或金属颗粒、微球体或小珠；沸石颗粒；无机化合物，包括但不限 于诸如二氧化钛、氧化铝和二氧化硅之类的金属氧化物；金属、碱金 属或碱土金属的碳酸盐或硫酸盐；高岭土、滑石、炭黑等。选择无机 空隙引发组分以使其具有较小的表面相互作用，由于化学性质或物理 形状，当其分散在脂族聚酯组分中时，通常无机空隙引发组分不应与 聚合物组分发生化学反应(包括路易斯酸/碱相互作用)，并且具有最 小的范德瓦尔斯相互作用。
优选的空隙引发组分包含热塑性聚合物(包括半结晶聚合物和非 晶态聚合物)，以提供与第二聚合物组分不混溶的共混物。不混溶的 共混物显示出多种非晶相，这些非晶相(例如)使用差示扫描量热计 或动态力学分析通过存在的多个非晶态玻璃化转变温度而确定。如本 文所用，“不混溶性”是指具有有限溶解度和非零界面张力的聚合物 共混物，也就是说，混合的自由能大于零的共混物：
ΔG≌ΔHm>0
聚合物的可混和性由热力学和动力学因素确定。非极性聚合物的 常用可混和性预测因子为溶解参数的差值或弗洛里-赫金斯相互作用参 数。对于具有非特异性相互作用的聚合物，例如聚烯烃，弗洛里-赫金 斯相互作用参数可通过溶度参数之差的平方乘以系数(V/RT)而算出，其 中V为重复单元非晶相的摩尔体积，R为气体常数，并且T为绝对温 度。因此，两种非极性聚合物之间的弗洛里-赫金斯相互作用参数始终 为正数。
可用作空隙引发组分的聚合物包括上述半结晶聚合物以及非晶态 聚合物，选择的这些聚合物从熔融状态冷却后可立即形成离散相。可 用的非晶态聚合物包括(但不限于)：聚苯乙烯、聚碳酸酯、一些聚 烯烃、环状烯烃共聚物(COC)(例如乙烯降冰片烯共聚物)和韧化聚合 物(例如苯乙烯/丁二烯橡胶(SBR)和乙烯/丙烯/二烯橡胶(EPDM))。
使用不混溶聚合共混物时，可选择第一热塑性聚合物组分和空隙 引发聚合物组分的相对量以使得第一热塑性聚合物形成连续相，并且 空隙引发聚合物组分形成不连续相。由于共混物中空隙引发聚合物的 量的增加，因此将达到一个组成范围，在该组成范围内空隙引发聚合 物不再易于被确定为分散相或离散相。共混物中空隙引发聚合物的量 的进一步增加将生成两个双连续相，然后引起相转化(其中空隙引发 聚合物成为连续相)。优选地，热塑性聚合组分形成连续相，同时空 隙引发组分形成分散在第一聚合物连续相中的分散相或离散相。如果 空隙引发聚合物为半结晶并且以足以形成双连续相的量使用，微纤维 化之后的取向将形成两种不同微薄片的复合结构，这两种微纤维分别 得自热塑性聚合物组分和空隙引发聚合物。
通常，当空隙引发组分的量增加时，最终的薄膜中空隙的量也会 增加。因此，受薄膜中空隙的量所影响的特性(例如机械性能、密度、 透光率等)将取决于空隙引发组分的添加量。
优选地，无论空隙引发组分是有机的还是无机的，组合物中空隙 引发组分的量为1重量％至49重量％，更优选为5重量％至40重量％， 最优选为5重量％至25重量％。在这些组成范围中，第一热塑性聚合 物可形成连续相，同时空隙引发组分形成离散相、不连续相。
另外，所选的空隙引发聚合物组分必须与所选的半结晶聚合物组 分不能混溶。在本文中，不混溶性是指离散相不会以基本方式溶解到 连续相中，即离散相必须在由连续相提供的基质中形成分离的、可识 别的区域。
高熔体强度聚丙烯泡沫可用于制备微纤维化制品。发泡聚丙烯可 由丙烯均聚物组成或可包含具有50重量％或以上的丙烯单体含量的共 聚物。此外，发泡聚丙烯可包含丙烯均聚物或共聚物与除丙烯均聚物 或共聚物之外的均聚物或共聚物的混合物或共混物，如美国专利 No.6,468,451(佩雷斯等人)中所述。
尤其可用的丙烯共聚物为丙烯与一个或多个非丙烯单体的共聚 物。丙烯共聚物包括丙烯的无规共聚物、嵌段共聚物和接枝共聚物以 及选自由C3-C8 α-烯烃和C4-C10双烯组成的群组的烯烃单体。丙烯 共聚物也可包括丙烯的三元共聚物和选自C3-C8 α-烯烃组成的组的 α-烯烃，其中这种三元共聚物的α-烯烃含量优选小于45重量％。C3-C8 α-烯烃包括1-丁烯、异丁烯、1-戊烯、3-甲基-1-丁烯、1-己烯、3，4- 二甲基-1-丁烯、1-庚烯、3-甲基-1-己烯等。C4-C10双烯的例子包括1，3- 丁二烯、1，4-戊二烯、异戊二烯、1，5-己二烯、2，3-二甲基己二烯等。
其它可添加到泡沫组分中高熔体强度聚丙烯的聚合物包括高、中、 低和线形低密度聚乙烯、氟聚合物、聚(1-丁烯)、乙烯/丙烯酸共聚物、 乙烯/醋酸乙烯酯共聚物、乙烯/丙烯共聚物、苯乙烯/丁二烯共聚物、乙 烯/苯乙烯共聚物、乙烯/丙烯酸乙酯共聚物、离聚物和热塑性弹性体(例 如苯乙烯/乙烯/丁烯/苯乙烯(SEBS))，以及乙烯/丙烯/双烯共聚物 (EPDM)。
脂族聚酯也可用于制备微纤维化制品或微薄片，其包括聚(羟基链 烷酸酯)的均聚物和共聚物以及衍生自一种或多种链烷二醇与一种或多 种链烷二羧酸(或酰基衍生物)的反应产物的脂族聚酯的均聚物和共 聚物。也可使用脂族聚酯与一种或多种另外的半结晶或非晶态聚合物 的可混溶与不混溶的共混物。
一类可用的脂族聚酯是聚(羟基链烷酸酯)(得自羟基酸的缩合反应 或开环聚合反应)或其衍生物。适用的聚(羟基链烷酸酯)可以用化学式 H(O-R-C(O)-)n-OH表示，其中R为直链或支链的亚烷基部分，并且n 为1到20之间的数，优选为1到12之间的数。R还可包含一个或多个 链中(即位于链中)的醚氧原子。通常，羟基酸的R基使得侧链羟基 为伯羟基或仲羟基。
可用的聚(羟基链烷酸酯)包括(例如)以下物质的均聚物和共聚物： 聚(3-羟基丁酸酯)、聚(4-羟基丁酸酯)、聚(3-羟基戊酸酯)、聚(乳酸)(也 称为聚丙交酯)、聚(3-羟基丙酸酯)、聚(4-氢戊酸酯)、聚(3-羟基戊酸 酯)、聚(3-羟基己酸酯)、聚(3-羟基庚酸酯)、聚(3-羟基辛酸酯)、聚对二 氧环己酮和聚己内酯、聚乙醇酸(也称为聚乙交酯)。也可使用两种 或更多种上述羟基酸的共聚物，例如3-羟基丁酸酯和3-羟基戊酸酯的 共聚物、乳酸盐和3-羟基丙酸酯的共聚物以及乙交酯和对二氧环己酮 的共聚物。也可使用两种或更多种聚(羟基链烷酸酯)的共混物，以及与 一种或多种半结晶或非晶态聚合物的共混物。
另一类可用的脂族聚酯包括衍生自一种或多种链烷二醇与一种或 多种链烷二羧酸的反应产物(或酰基衍生物)的脂族聚酯。这种聚酯 具有以下通式：
其中R’和R”分别表示可以是直链或支链并具有1至20、优选 具有1至12个碳原子的亚烷基部分，并且m是使得酯为聚合物的数， 并且优选是使得脂族聚酯的分子量为10,000至300,000，优选为约 30,000至200,000的数。每个n独立地为0或1。R’和R”还可包含 一个或多个链中(即位于链中)醚氧原子。
脂族聚酯的例子包括衍生自以下物质的均聚物和共聚物(a)一种或 多种下列二元酸(或其衍生物)：琥珀酸、己二酸、1，12-二羧基十二 烷、富马酸和马来酸，以及(b)一种或多种下列二醇：乙二醇、聚乙二 醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、1，2-丙二醇、1，2-丙二醇、1，3-丁二醇、 1，4-丁二醇、1，6-己二醇、二甘醇和聚丙二醇，以及(c)任选少量(即0.5-7.0 摩尔％)的具有多于两个官能度的多元醇，例如甘油、新戊二醇和季戊 四醇。
这类聚合物可包括聚(丁二酸丁二醇酯)均聚物、聚(己二酸丁二醇 酯)均聚物、聚(己二酸丁二酸丁二醇酯)共聚物、聚(丁二酸己二酸乙二 醇酯)共聚物和聚(己二酸乙二醇酯)均聚物。
市售的脂族聚酯包括聚丙交酯、聚乙交酯、聚丙交酯和乙交酯的 共聚物、L-丙交酯和三亚甲基碳酸酯的共聚物、聚(对二氧环己酮)、聚 (丁二酸丁二醇酯)和聚(己二酸丁二醇酯)。
特别可用的脂族聚酯包括衍生自半结晶聚乳酸的脂族聚酯。聚乳 酸(或聚丙交酯)的主要降解产物是乳酸(这在自然界中是常见的)， 是无毒的并且广泛用于食品、制药和医学行业。聚合物可通过乳酸二 聚体、丙交酯的开环聚合反应制备而成。乳酸具有光学活性，并且二 聚体存在四种不同的形式：L，L-丙交酯、D，D-丙交酯、D，L-丙交酯(内 消旋丙交酯)以及L，L-丙交酯和D，D-丙交酯的外消旋混合物。通过聚 合这些作为纯化合物或作为共混物的丙交酯，可获得具有不同立体构 型和不同物理特性(包括结晶度)的聚丙交酯聚合物。L，L-丙交酯或 D，D-丙交酯生成半结晶聚丙交酯并且是优选的，同时衍生自D，L-丙交 酯的聚丙交酯是非晶态的。
聚丙交酯优选具有高对映体比率以最大化聚合物固有的结晶度。 聚(乳酸)的结晶度是基于聚合物主链的规整性和与其它聚合物链线性 结晶的能力。如果相对少量的一种对映体(例如D-)与相对的对映体(例 如L-)共聚合，聚合物链会变为不规则的形状，并且结晶较少。基于这 些原因，为了最大化结晶度，期望具有的聚(乳酸)为至少85％，优选至 少90％，并且最优选至少95％的一种异构体。
近似等摩尔的D-聚丙交酯和L-聚丙交酯的共混物也可用于本发明 中。与D-聚丙交酯和L-聚丙交酯各自相比(约190℃)，该共混物形 成了具有较高熔点(约210℃)的独特晶体结构，并且具有改善的热稳定 性。可参考H.Tsuji等人的Polymer《聚合物》，1999年第40卷第 6699-6708页。
也可使用聚(乳酸)与其它脂族聚酯的共聚物，包括嵌段和无规共聚 物。可用的共聚单体包括乙交酯、β-丙内酯、四甲基乙交酯、β-丁内 酯、γ-丁内酯、新戊内酯、2-羟基丁酸、α-羟基异丁酸、α-羟基戊酸、 α-羟基异戊酸、α-羟基己酸、α-羟基丁酸、α-羟基异己酸、α-羟基 -β-甲基戊酸、α-羟基辛酸、α-羟基癸酸、α-羟基肉豆蔻酸和α-羟 基硬脂酸。
聚(乳酸)与一种或多种其它脂族聚酯或一种或多种其它聚合物的 共混物也可用于本发明中。可用的共混物的例子包括聚(乳酸)和聚(乙 烯醇)、聚乙二醇/聚丁二酸酯、聚环氧乙烷、聚己内酯和聚乙交酯。
在脂族聚酯与第二非晶态或半结晶聚合物的共混物中，如果第二 聚合物以相对较小的量存在，第二聚合物通常会形成分散在脂族聚酯 连续相中的离散相。由于共混物中第二聚合物的量的增加，因此将达 到一个组成范围，在该组成范围内第二聚合物不再易于被确定为分散 相或离散相。共混物中第二聚合物的量的进一步增加将生成两个双连 续相，然后引起相转化(其中第二聚合物成为连续相)。优选地，脂 族聚酯组分形成连续相，同时第二组分形成分散在第一聚合物的连续 相中的不连续相或分散相，或者两种聚合物形成双连续相。当第二聚 合物以足以形成双连续相的量存在时，随后的取向和微纤维化可形成 包含两种聚合物的微纤维的复合制品。
可用的聚丙交酯可通过以下专利所述进行制备：美国专利No. 6,111,060(葛鲁柏(Gruber)等人)；美国专利No.5,997,568(刘(Liu))； 美国专利No.4,744,365(卡普兰(Kaplan)等人)；美国专利No.5,475,063 (卡普兰等人)；WO 98/24951(蔡(Tsai)等人)；WO 00/12606(蔡等 人)；WO 84/04311(林(Lin))；美国专利No.6,117,928(希尔图南(Hiltunen) 等人)；美国专利No.5,883,199(麦卡锡(McCarthy)等人)；WO 99/50345 (科斯塔德(Kolstad)等人)；WO 99/06456(王(Wang)等人)；WO 94/07949(葛鲁柏等人)；WO 96/22330(兰德尔(Randall)等人)；WO 98/50611(赖安(Ryan)等人)；美国专利No.6143863(葛鲁柏等人)； 美国专利No.6,093,792(格罗斯(Gross)等人)；美国专利No.6,075,118 (王等人)和美国专利No.5,952,433(王等人)，以上各个美国专利 的公开内容以引用的方式并入本文。也可参考J.W.Leenslag，et al.，J. Appl.Polymer Science，1984，29，2829-2842(李斯拉格等人，《应用聚 合物科学杂志》，1984年，第29卷第2829-2842页)和H.R.Kricheldorf， Chemosphere，2001，43，49-54(克瑞德夫，《光化层》，2001年，第43 卷第49-54页)。
制备微薄片或微纤维化制品时，应选择聚合物的分子量以使得聚 合物在给定的加工条件下是可熔融加工的。聚丙交酯的分子量(例如) 可为约10,000至300,000并且优选为约30,000至200,000。对于聚丙烯 和聚乙烯来说，分子量可为5,000至500,000并且优选为约190,000至 300,000。可熔融加工是指聚合物材料在用于处理薄膜的温度下是流体 或可用泵抽取的，并且在该温度下没有显著降解或胶凝。一般来讲， 聚合物的分子量超过缠结分子量，其通过粘度对分子量(Mn)的双对数坐 标图而确定。高于缠结分子量时图的斜率为约3.4，然而分子量较低的 聚合物的斜率为1。
为了获得尽可能大的物理特性并且使聚合物薄膜适合纤维化，聚 合物链需要沿两条主轴取向(双轴取向)。分子取向的程度通常由拉 伸比(即纵向和横向尺寸的最终长度与初始长度之比)限定。取向可 以通过包括压延和长度定向等步骤的技术组合得以实现。
选择取向的条件以使得薄膜的完整性得以维持。因此，当纵向和/ 或横向拉伸时，选择温度以避免连续相的基本撕裂或分裂并且使薄膜 完整性得以维持。如果温度过低或取向比过高，薄膜会特别易于撕裂 或者甚至受到重大损伤。优选地，取向温度高于连续相的玻璃化转变 温度。这种温度条件允许在X和Y方向具有最大取向而不损怀薄膜的 完整性，使薄膜的空隙形成最大化，并且因此尽可能地使表面微纤维 化变得容易。在薄膜中，当变形应力由于取向超过聚合物分子的解缠 比率时，会发生小的破损或撕裂(微空隙)。可参考(例如)Roger S. Porter and Li-Hui Wang，Journal of Macromolecular Science-Rev. Macromol.Chem.Phys.，C35(1)，63-115(1995)(波特和王丽辉，《高分 子科学期刊-高分子物理化学》，第C35(1)卷，第63-115页(1995年))。
已经开发出制备高取向微纤维化热塑性聚合薄膜的一般方法。聚 合物薄膜通过使用T型模或“衣架模”的典型熔体挤出而形成，并且 使用多辊层叠件而进行淬火。将辊的温度维持在21℃左右，使得挤出 的薄膜迅速地淬火并且使结晶最小化，即，该薄膜基本上为非晶态。 然后，使用两步法拉伸薄膜或挤出的外形。在第一步中，在高于玻璃 化转变温度的温度下，将薄膜以相对较高的应变速率拉伸到足够的拉 伸比使得薄膜产生微空隙，但不会受到重大损坏。该薄膜可通过多种 方法进行拉伸，包括但不限于辊拉(压延)、使用热轧辊的纵向取向、 区域拉伸或液体培养基中的热拉伸。纵向取向已被广泛用于传统的薄 膜加工，这种薄膜加工经常用在顺序双轴取向加工的第一步中。如果 使用成空隙剂，由于粒子从热塑性聚合物脱粘可实现广泛的空隙形成。 同样，成空隙剂可以被添加到聚合物熔体中以改善微纤维化效率，例 如非相容聚合物、二氧化硅、碳酸钙或云母材料，或用以赋予微纤维 所需的特性，例如抗静电剂或着色剂。通常，第一步中可根据使用的 聚合物达到4:1-6:1的拉伸比。用于制备微纤维薄片或微薄片的双轴取 向的薄膜和微纤维化这类薄膜的工艺在美国专利No.6,331,433中有所 描述，该专利也以引用的方式并入本文。
第二步的拉伸过程在低于聚合物熔点并比第一步温度较高的拉伸 温度下进行。在这一步中，所述薄膜被进一步拉伸为较高的比率并且 观察到微纤维结构。分子取向的增加可使用X射线散射进行测量并且 通过DSC改变结晶度。通常在第二步中，由于施加在该方法中的更高 取向和温度，结晶度显著增加。优选的拉伸方法是使用以不同速度运 行的热轧辊进行纵向取向。最终的有空隙的或有微空隙的薄膜具有银 色外观并且在拉伸方向(纵向)上可被容易地分裂。另外的拉伸步骤 使得薄膜进一步取向，但并不是必要的。
例如，有了聚丙交酯，薄膜可被拉伸其长度的6倍以上。在一个 实施例中，有了聚丙交酯，总拉伸比大于6:1并且优选在9:1至约18:1 的范围内。“总拉伸比”为薄膜最终面积与薄膜初始面积的比率。
此外，结晶可在熔融处理过的薄膜中形成，该薄膜包含(例如) 脂族聚酯和空隙引发组分。优选的是，脂族聚酯薄膜基本上非晶态并 且通过后续加工(例如压延、拉伸、再结晶和再结晶后的退火)的最 佳结合增加了结晶度。据信薄膜结晶度的最大化将提高微纤维化效率。 通常，脂族聚酯被浇铸为基本非晶态的薄膜，然后通过应变诱导结晶 使结晶度增加。具体可用的脂族聚酯/空隙引发组分共混物的组合包括， 例如聚丙交酯和无机粒子(例如CaCO3)以及聚丙交酯和聚丙烯。
薄膜或泡沫可以在高于热塑性聚合物相的玻璃化转变温度的温度 下通过沿相互垂直的方向拉伸来进行双轴取向。一般来讲，薄膜首先 沿一个方向进行拉伸，然后沿垂直于第一个方向的第二方向拉伸。然 而，如果需要，拉伸可以沿两个方向同时进行。在典型的工艺中，薄 膜首先沿一系列旋转辊上或两对压送辊之间的挤压方向进行拉伸，然 后通过拉幅机装置沿其横向方向进行拉伸。薄膜可以沿每个方向进行 拉伸，最多在其拉伸方向上达到初始尺寸的2至10倍。
对于一些聚合材料，优选的是将横向方向的拉伸限制为小于2倍。 已经发现的是，如果薄膜沿第一方向(例如沿纵向方向)进行取向， 并且随后沿其垂直方向进行大于2倍的取向，则微纤维化膜的能力将 丧失。优选的是，薄膜沿第一方向单轴取向到期望的拉伸比，然后沿 垂直方向进行小于2倍的单轴取向。然而，应当理解，在单轴取向中， 通过拉幅机装置可以抑制薄膜沿横向方向收缩，并且这种抑制会对薄 膜施加小程度的双轴取向。这种小程度的双轴取向可以增强随后的微 纤维化。
可对拉伸后的薄膜进一步加工。例如，薄膜可通过使薄膜经受足 以进一步使脂族聚酯组分结晶的温度同时抑制薄膜在两个拉伸方向缩 回而进行退火或热定型。
取向后，可将空隙施加到不混溶共混物的薄膜上。随着薄膜的拉 伸，由于两种组分的不混溶性和两相之间较差的附着性，两种组分分 离。当薄膜包含连续相和不连续相时，不连续相用于引发在连续相的 基质中仍保持基本上离散、不连续的空隙。当两个连续相存在时，形 成的空隙在整个聚合物薄膜上是基本上连续的。典型的空隙具有主要 尺寸X和Y，分别与纵向和横向的取向度成比例。次要尺寸Z(垂直 于薄膜平面)仍保持基本上与取向前离散相(空隙引发组分)的横截 面尺寸相同。由于不混溶共混物的相之间较差的应力传递，因此出现 空隙。据信共混物组分之间的低分子吸引力是造成不混溶相行为的原 因；当薄膜通过取向或拉伸而受力时，低界面张力导致空隙的形成。
空隙具有相对平坦的形状、不规则的尺寸，并且缺乏明显的界线。 空隙通常与薄膜共面，具有纵向(X)和横向(Y)(取向的方向)的主轴。 空隙的尺寸是可变的并且与离散相的尺寸和取向度成比例。具有相对 较大的离散相区域和/或相对较高取向度的薄膜将产生相对较大的空 隙。具有高离散相比例的薄膜通常会产生在取向上空隙含量相对较高 的薄膜。空隙在薄膜基质中的尺寸，分布和数量可通过诸如小角度x 射线散射法(SAXS)、共聚焦显微镜、扫描电子显微镜(SEM)或密度测量 法之类的技术而确定。另外，由于显著的空隙含量，对薄膜进行视觉 检测可发现增强的不透明度或银色的外观。
由含有用于生成空隙的次要不混溶组分的聚合物混合物形成的泡 沫和薄膜对于形成片状微纤维化制品是重要的。通常，经连续工艺取 向的泡沫或薄膜可以在纵向方向上获得最多约6:1的拉伸比，以及在横 向方向上最多约10:1的拉伸比。在批量方法取向的薄膜或泡沫中，可 以在纵向和横向方向上均获得最多约15:1的拉伸比。
一般来讲，较大的空隙含量增强了随后的微纤维化，并且随后， 使用本发明的方法，对于单轴取向薄膜，纤维的产量也就更大。优选 地，当制备的制品具有至少一个微纤维化表面时，通过密度进行测量， 聚合物薄膜将具有超过5％，更优选超过10％；也就是说，改变的密度 除以初始密度；(δ初始-δ最终)/δ初始。出人意料的是，已经发现空隙 可在远不及将微空隙赋予之前所述有微空隙的薄膜所必需的条件严苛 的条件下，被赋予给两种组分(第一聚合物和空隙引发)聚合物薄膜。 据信不混溶共混物(具有有限的两相溶解度和大于零的混合自由能) 有利于形成随后的微纤维化必需的空隙。此外，通过在第一取向阶段 中利用较低的取向温度以辅助形成空隙。由于微空隙通常是非细胞的、 相对平面的并且具有薄膜纵向(取向的方向)上的主要轴线，因此具 有微空隙的薄膜不同于其它具有空隙的薄膜或制品，例如具有微空隙 的薄膜或泡沫制品。微空隙通常不互相连接，但是邻近的微空隙可相 交。
取向温度过低可导致薄膜外观不均匀。第一取向温度的增加可减 少不均匀的拉伸，获得外观更均匀的拉伸薄膜。第一取向温度还会影 响取向过程中发生的成空隙量。在空隙形成发生的温度范围内，取向 温度越低，通常在取向过程中发生的空隙形成量越大。随着第一取向 温度的升高，空隙形成的程度被降低到消除点。样品的电子显微图显 示出，在没有空隙形成发生的温度下，离散相区域在拉伸过程中通常 会变形。这与高度成空隙的取向样品形成对比；高度成空隙的取向样 品的电子显微图显示出分散相区域在取向期间保持其近似的形状。希 望第二取向在相同的方向或在垂直于第一取向的方向。该第二取向温 度通常类似于或高于第一取向温度。
由于可观的微空隙含量，薄膜的视觉检测可显示出增强的不透明 度或银色的外观，所述空隙含量可用作制备微纤维化表面的取向薄膜 的适合性实证检验。相反，缺乏可观微空隙含量的薄膜表面具有透明 的外观。已经发现的是，缺乏可观微空隙含量的取向薄膜即使可被纵 向分裂仍不易于微纤维化，这是具有纤维形态的高取向聚合物薄膜的 特征。
薄膜的厚度将根据所需的最终用途进行选择并且可通过对工艺条 件的控制而实现。浇注薄膜通常具有的厚度小于100密耳(2.5mm)，并 且优选在20至70密耳(0.8至1.8mm)之间。然而，根据获得的制品 所需的特性，可以浇注出该范围以外的厚度。浇铸薄膜和吹塑薄膜也 可用于制备微纤维化制品。薄膜的最终厚度将通过浇注厚度和取向度 部分确定。对于大多数用途，微纤维化前的薄膜最终厚度将为1至20 密耳(0.025至0.5mm)，优选为3至10密耳(0.075至0.25mm)。 此外，本文所述的方法也可以有利地用于已同时进行了双轴拉伸的薄 膜。这种拉伸可以采用(例如)美国专利No.4,330,499(沃弗塞斯(Aufsess) 等人)和美国专利No.4,595,738(胡夫纳格尔(Hufnagel)等人)中所公 开的方法和装置实现，更优选地采用美国专利No.4,675,582(荷姆斯 (Hommes)等人)；美国专利No.4,825,111(荷姆斯等人)；美国专利 No.4,853,602(荷姆斯等人)；美国专利No.5,036,262(史科贝许 (Schonbach))；美国专利No.5,051,225(荷姆斯等人)和美国专利No. 5,072,493(荷姆斯等人)中所公开的方法和装置实现，这些专利的公 开内容以引用方式并入本文。
根据挤出制品的厚度、温度和薄膜淬火的方法，热塑性基底的形 态在整个制品的厚度上可不相同，也就是说，两个表面的形态和/或表 面与基质的形态可以不同。形态上的较小差别通常不会阻止微纤维化 表面在薄膜的任一个主表面上形成，但是如果制品的两个表面上都需 要微纤维化表面，优选地要小心控制浇注条件以确保在整个制品厚度 上相对均匀的非晶态形态。用于本发明的聚合物基质包括平均长度为 20微米或更少的微薄片和/或微纤维化制品。
微纤维化材料还可包括双轴取向的聚合物和泡沫聚合物，优选的 是热塑性聚合物。泡沫可通过添加一种或多种聚合物和气体或超临界 的流体到双螺杆或单螺杆挤出机中采用挤出加工而制成。其后，泡沫 聚合物为双轴取向的。示例性高熔融强度的可发泡热塑性聚合物包括 可由丙烯均聚物组成的聚丙烯或可包含丙烯单体含量为50重量％或以 上的共聚物的聚丙烯。可发泡聚丙烯可包含丙烯均聚物或共聚物与非 丙烯均聚物或共聚物的均聚物或共聚物的混合物或共混物。其它含微 纤维化聚丙烯的材料和制品在美国专利No.6,692,823(科迪(Kody)等 人)、美国专利6,468,451(佩雷斯等人)和美国专利No.6,890,649(霍 布斯等人)中有所描述。
在一个实施例中，微纤维和/或微纤维化制品可采用美国专利 No.6,110,588中所述的方法由具有微空隙的薄膜制备而成，该专利的整 个公开内容以引用方式并入。本发明所公开的具有微空隙的薄膜得自 具有应变诱导结晶度的熔融处理过的高取向半结晶薄膜。应变诱导结 晶度是可通过诸如压延、退火、拉伸和再结晶等后续加工的最佳结合 而获得的结晶度。
取向热塑性薄膜可通过施加足够的流体能量到表面以从聚合物基 质释放微纤维而被微纤维化。相对于传统的机械纤维化过程，在微纤 维化过程中，相对更大量的能量被施加到薄膜表面以释放微薄片。微 薄片是由双轴取向的、有空隙的热塑性基体或泡沫热塑性基体而获得 的。微纤维化后，大部分材料表面包括片状结构。这些结构的平均厚 度为1至20微米，优选地为小于5微米，并且平均宽度为1至数百微 米、优选地为约5至约30微米。片状结构通常可以显示具有大于0.5m2/g 的表面积，优选地大于0.7m2/g，以上是在氮气作为被吸收物质的条件 下采用Autosorb-6物理吸附分析仪(Autosorb-6 Physisorption Analyzer) (康塔仪器公司(佛罗里达州博茵顿沙滩)(Quantachrome Instruments， Boynton Beach，FL))。扫描电子显微镜显示出用于本发明的微薄片通 常彼此平行，并且形状如同一块板或板状丝带，其中微薄片的两个尺 寸的长度尺度是微薄片的第三尺寸的长度尺度的至少10倍，优选地至 少20倍。微薄片的片状表面的长宽比可以在1:1到1:20的范围内，并 且可取决于薄膜或泡沫的取向的平衡。拉伸较不平衡会导致更易形成 条带状的微薄片。此外，薄片可以彼此相连，并且往往在宽度和长度 方向上是连续的。尺寸可以用扫描电镜进行测量。因此，表面积超过 所期望的矩形成型微纤维的表面积，并且这种表面积增强了与诸如混 凝土和热固性塑料等基质的粘结，以及在需要时提供更大的表面积用 于增强可生物降解性。
可选地，在微纤维化前，薄膜可通过传统的机械方法经微纤维化 步骤由双轴取向的薄膜制备宏观薄片。机械纤维化的传统方法使用具 有切割元件(例如接触移动薄膜的针或齿)的转鼓或辊。齿可完全或 部分地穿透薄膜的表面，以在其上施加宏观纤维化表面。其它类似的 宏观纤维化处理是已知的，并且包括如扭曲、刷(如用针辊)、摩擦 (例如用皮革垫)和弯曲等机械作用。通过这种传统的宏观纤维化方 法获得的薄片在尺寸上是宏观的，通常在其横截面上为数百微米。
使薄膜表面微纤维化的一种方法是通过流体喷射的方式。在该方 法中，一个或多个细液流的射流冲击热塑性聚合物薄膜的表面(可通 过筛网或移动带支承)，从而从聚合物基质释放微薄片。薄膜的一个 或两个表面可被微纤维化。微纤维化的程度取决于薄膜暴露于流体喷 射的时间、流体喷射的压力、流体喷射的横截面积、流体接触角、聚 合物特性，并且在较小程度上取决于流体温度。不同类型和尺寸的筛 网可用于支承薄膜。
可使用任何类型的流体或气流。液态流体可包括水或有机溶剂， 例如乙醇或甲醇。可使用适合的气体(例如氮气、空气或二氧化碳) 以及液体和气体的混合物。任何这类流体优选为非溶胀的(即不被聚 合物基质吸收)，这会降低微薄片的取向和结晶度。为了在微纤维化 过程中施加电荷，优选的流体为水并且最优选为基本上不含任何污染 物(例如可消除静电电荷的盐或矿物质)的去离子或蒸馏水。流体温 度可升高，尽管使用环境温度流体可获得合适的结果。流体的压力应 足以施加一些程度的微纤维化到薄膜的至少一部分，并且适合的条件 可根据流体、聚合物的性质(包括组分和形态)、流体喷射的构造、 冲击的角度和温度而广泛改变。一般来讲，与具有微空隙的薄膜相比， 使有空隙的薄膜和有空隙的泡沫微纤维化所需的条件不那么严苛。
通常，虽然可使用更低的压力和更长的暴露时间，但流体在室温 下以及大于6800kPa(1000psi)(优选大于10,300kPa(1500psi))的压力 下为水。这种流体通常将施加基于以下条件计算所得的最小10W或 20W/cm2：假定流体具有不可压缩性、表面是光滑的并且摩擦不产生损 失。
流体喷射的构造(即横截面形状)可以大致呈圆形，但也可采用 其它形状。该射流可包括横贯部分薄膜或横贯薄膜宽度的狭槽。射流 可以是静止的，当薄膜相对于射流传输时，射流可相对于静止薄膜移 动，或薄膜和射流可相对于彼此移动。例如，薄膜可通过送料辊的方 式在纵向方向上传输，同时射流横向移动到纤维网。优选地，使用多 个射流，这时薄膜利用辊传输通过微纤维化室，并且薄膜由筛网或纤 维织品支承，这使得流体从微纤维化表面流出。薄膜可在单程中微纤 维化，或作为另外一种选择，薄膜可利用多次通过射流而微纤维化。
可构建射流以使得全部或部分薄膜表面被微纤维化。作为另外一 种选择，可构建射流以使得仅所选的薄膜区被微纤维化。薄膜的某些 区域也可使用常规的掩蔽剂进行掩蔽以使所选的区域没有被微纤维 化。同样，可执行该方法使得微纤维化表面仅部分穿透或完全通过起 始薄膜的厚度。如果期望微纤维化表面通过薄膜的厚度拉伸，可选择 条件以使得制品的完整性得以维持，并且薄膜没有被切断形成各个纱 线或薄片。筛网或网孔可被用于在微纤维化制品的表面上形成图案。
例如可使用水缠绕机器通过使纤维材料暴露于流体喷射以使一个 或两个表面微纤维化。水缠绕机器通常通过使用高速水射流用于增强 微纤维或纱线的膨松度，以在纤维网粘结过程中包裹或缠绕各个微纤 维，也被称为水射流或水刺。作为另外一种选择，可使用高压水射流 (具有旋转或振动头)，也允许人工控制流体射流的喷射。
使用流体射流可以控制微纤维化的程度以提供低程度或高程度的 微纤维化。可期望低程度的微纤维化通过在表面部分地暴露尽可能少 量的微纤维而增大表面积，从而施加纤维纹理到薄膜的表面。因此， 增大的表面积增强了表面的可粘合性。这种制品是有用的，例如作为 研磨涂层的基板和作为印刷接受面，如钩环扣件、夹层粘接剂和背衬 带。相反，需要高程度的微纤维化以将高纤维纹理施加到表面以提供 类似布的薄膜、绝缘制品、过滤制品或提供用于随后从聚合物基质采 收各个微薄片(即微薄片的移除)。
在另一个实施例中，微纤维化可以通过将样品浸入高能量空化介 质中来进行。完成这类空化的一种方法是通过向流体施加超声波。微 纤维化的速率取决于空化强度。超声波系统可以从低声波振幅、低能 量的超声波清洗器到聚焦低振幅系统，直到高振幅、高强度的声学探 针系统。
一种方法(包括超声波能量的应用)涉及在纤维薄膜所沉浸的液 体介质中使用探针系统。喇叭形辐射体(探针)应至少部分地浸在液 体中。对于探针系统，取向薄膜在介质中通过放置在振荡的喇叭形辐 射体与穿孔金属板或筛网之间(其它放置的方法也是可能的)而经受 超声波振动。有利的是，使用超声波时薄膜的两个主表面都被微纤维 化。微纤维化在纤维材料中的深度取决于空化强度、在空化介质中花 费的时间量以及纤维材料的特性。空化强度是许多可变因素，例如施 加的幅度和振动频率、流体特性、流体温度和施加的压力以及在空化 介质中的位置。强度(每单位面积的功率)通常在喇叭形辐射体下达 到最高，但是这可能会受到声波调焦的影响。
方法包括将薄膜设置在空化介质(通常为水)中超声波喇叭形辐 射体和薄膜支承体之间，该空化介质保持于槽中。由于极端空化在该 区域内发生，因此该支承体用于抑制薄膜从喇叭形辐射体脱离。薄膜 可由各种装置支承，例如筛网(可被穿孔的旋转装置)，或通过调整 可将薄膜送入超声波浴的张力辊进行支承。薄膜对喇叭形辐射体的张 力可作为另外一种选择使用，但是正确的定位可提供更好的纤维化效 率。薄膜的相对面与喇叭形辐射体和筛网之间的距离通常小于约5mm (0.2英寸)。可调节从薄膜到槽底部的距离以产生可在薄膜上最大化 空化能量的驻波，或者作为另外一种选择，可使用其它聚焦技术。也 可使用其它喇叭形辐射体到薄膜的距离。当薄膜设置在喇叭形辐射体 的附近或在距离喇叭形辐射体四分之一波长处时，通常会产生最好的 结果，然而这取决于诸如流体容器的形状和使用的辐射面等因素。通 常将样品设置在喇叭形辐射体的附近或者第一或第二四分之一波长处 是优选的。
超声波压力振幅可表示为：
Po＝2πB/λ＝(2π/λ)ρc2ymax
强度可表示为：
I＝(Po)2/2ρc
其中
Po＝最大(峰值)声压振幅
I＝声强
B＝介质的体积模量
λ＝介质中的波长
ymax＝峰值声幅
ρ＝介质的密度，以及
c＝介质中的波速。
超声波清洗浴系统通常可在1至10W/cm2的范围内，而喇叭形辐 射体(探针)系统可达到300至1000W/cm2或更高。一般来讲，这些 系统的功率密度水平(每单位面积的功率，或强度)可通过将传送的 能量除以辐射面的表面积而确定。然而，由于流体中的波衰减，实际 强度可能会有所降低。选择条件以使得可提供声空化。一般来讲，较 高的振幅和/或施加的压力在介质中提供较多的空化。一般来讲，空化 强度越高，产生微薄片的速率越快，从而获得的微薄片越细(直径越 小)。不受理论的束缚，据信高压冲击波由初始空化气泡的伸缩而产 生，其冲击薄膜导致微纤维化。
超声波振动频率通常为20至500千赫，优选为20至200千赫， 并且更优选为20至100千赫。然而，在不脱离本发明范围的前提下， 也可利用声波频率。功率密度(每单位面积的能量，或强度)可以在 1W/cm2至1kW/cm2或更高的范围内。在本发明的方法中，优选的是， 功率密度为10W/cm2或更高，并且优选为50W/cm2或更高。
薄膜和喇叭形辐射体之间的间隙可为(但不限于)0.001至3.0英 寸(0.03至76mm)，优选为0.005至0.05英寸(0.13至1.3mm)。温 度可以在5至150℃，优选在10至100℃，并且更优选在20至60℃的 范围内。表面活性剂或其它添加剂可添加到空化介质中或结合到纤维 薄膜中。处理时间取决于样品的初始形态、薄膜厚度和空化强度。该 时间可在1毫秒至一小时，优选地在1/10秒至15分钟，并且最优选地 在二分之一秒至5分钟的范围内。
此外，在任一种微纤维化方法中，微纤维化的程度或深度可以被 控制。可以制备微纤维化制品，其中微纤维化的深度(即微纤维化层 的厚度)少达10微米，但可以是50微米或更高、100微米或更高，甚 至达到完全微纤维化膜的厚度。可期望低程度的微纤维化通过在表面 部分地暴露尽可能少量的微薄片而增大表面积，从而施加纤维纹理到 薄膜的表面。相反，需要高程度的微纤维化以将高纤维纹理施加到表 面以提供类似布的薄膜、绝缘制品和过滤制品。
在任一种微纤维化方法中，大部分的微薄片由于从聚合物基质不 完全释放而保持与纤维网的连接。有利的是，微纤维化制品(已固定 到纤维网上)提供了方便并且安全的处理、存储和传送微薄片的方法。 对于许多专利申请，期望使微薄片保持固定在纤维网上，如美国专利 No.6,645,618(霍布斯等人)和美国专利No.6,890,649(霍布斯等人) 中所述，这些专利以引用方式并入本文。
可选地，微薄片可通过诸如用针辊、刮削等机械方法从薄膜的表 面进行采收。由于各个微薄片的高模量，采收的微薄片通常保持其膨 松度(蓬松度)。如果需要，蓬松度可通过传统的方法进行改善，例 如那些用于增强吹塑微薄片蓬松度的方法，例如通过增加人造短纤维。
用于本发明的微纤维化制品和微薄片呈现对细胞生长来说非常重 要的纤维尺寸。板状的微薄片有利于细胞附着，其中较高的表面积应 使用脂族聚酯快速降解。亚细胞薄片尺寸的微薄片具有优良的机械强 度和悬垂性，并且可以连续法进行制备。
如本发明中所述，组织细胞需要固体基质，细胞在固体基质上可 移动并仅伸出很短的凸起到液体介质中。在人体中，胶原、其它细胞 外纤维或其它细胞的表面会用作固体基质。同样，细胞可以容易地蠕 动到玻璃和其它共同组织培养基质上。组织细胞的运动性可受到基质 (例如微薄片)的粘附性和物理形状的强烈影响，其中细胞积聚在粘 附性更强的区域上，并且增加了粘附性梯度。这些细胞与其基质粘附 性成比例变平。细胞可沿着微薄片和曲面取向，该微薄片和曲面优先 沿着最小局部曲率的方向拉伸和移动。随着细胞的生长，与另一细胞 的接触可抑制彼此的运动。然而，白细胞和癌细胞对于抑制及其扩散 性是相对不敏感的。
来源于组织的细胞(例如哺乳动物细胞)可在作为合成环境的细 胞培养基中进行培养。完全生长培养基被定义为包含营养物质，并且 被称为微生物或细胞可在其上或在其中生长的物质。细胞培养基含有 盐、碳水化合物、维生素、氨基酸和代谢前体。另外，该培养基可用 血清、生长因子、痕量元素、激素和抗生素进行补充，被称之为完全 生长培养基。培养基冲洗附着在容器表面的细胞，培养物可以在其中 生长，并且随后进行继代培养。在没有添加激素或生长因子的情况下， 一些细胞系会无法生长。培养基的所需组分在各种细胞系中有所不同， 并且构成了细胞培养基的全面清单。一些示例培养基包括伊格尔最低 必需培养基、达尔伯克改良的伊格尔培养基和艾斯科乌改良的达尔伯 克培养基。细胞培养基专用于其各自的细胞系。细胞培养基的列表可 得自英杰生命技术有限公司(Invitrogen Corporation)(加利福尼亚州卡 尔斯巴德)。
细胞培养基有益于细胞生长和发展。除了列出的营养物质以外， 培养基帮助维持培养体系中的pH值和渗透度。大多数脊椎动物细胞的 典型细胞培养基在260到320mOsm/kg的范围内，较为完善的细胞系可 经受更大的渗透压变化。这同时适用于原核或真核细胞，即使在实践 中，细胞培养是指对衍生自多细胞真核细胞、特别是动物细胞的细胞 进行的培养。对于各细胞类型，培养条件(生长培养基、pH值和温度) 差别较大，并且对于特定的细胞类型，条件的变化可导致不同的表型 被表达。对于细胞培养的参考可见于Sanford，K.K.，The growth in vitro of single isolated tissue cells，J.Natl.Cancer Inst.1948，9，229-246(桑福 德，“单个分离组织细胞的体外培养”，《国家癌症研究所期刊》， 1948年第9卷第229-246页)；Freshney，R.I.，Culture of Animal Cells：A Manual of Basic Technique，4 th Ed.New York：Wiley Liss，2000(福士尼， 《动物细胞的培养：基本技术手册，第4版》，纽约：威利-莉斯公司， 2000年)；Jacoby，W.B.，Pasten，I.H.，eds.，“Monolayer culture techniques in Methods in Enzymology”，Cell Culture，1979，58，New York，Academic Press(贾柯比、帕斯登，“酶学方法中的单层培养技术”，《细胞培 养》，1979年，第58页，纽约，学术出版社)；以及WO 00/53721、 09/14/2000(威克特(Wickert，P.D.)等人)。
通常，用于培养细胞的容器提供污染屏蔽，以保护培养，使之不 受外部环境的污染，同时维持适当的内部环境。玻璃和塑料(即聚苯 乙烯)最常用于细胞生长。在本发明中，微薄片或微纤维化制品可分 散在用于培养细胞的容器内的细胞培养基中。将细胞接种到微纤维化 制品的表面上，并且提供其生长环境。另外，微纤维化制品可包括用 于培养细胞的多孔板装置的基质。
使细胞系生长，并将其保持在适于细胞培养连续生长和复制的条 件下。所有细胞系均源于寿命有限的细胞培养，但是偶尔有一些细胞 继续繁殖，这是因为遗传的不稳定性。这些细胞可无限期地培养。细 胞系可见于美国细胞、菌种库(ATCC)生物制品(弗吉尼亚州的马纳萨 斯)。
如果将细胞有规律地分盘，其可被培养更长时间，随后置换培养 基并且稀释细胞(首先用胰岛素从支承体分离细胞后)，这称为继代 培养。如本发明的文章所述，培养细胞成功与否关键在于对细胞在被 转移到人工环境之前所处的自然环境的模拟。其次，培养的细胞可经 常进行继代培养。当细胞汇合达到约70到90％时，可能必须对其进行 继代培养。细胞单层的继代培养涉及细胞间和细胞到细胞的表面连接 的破损。通常，蛋白质粘附连接用胰蛋白酶进行消化。在细胞离散和 分散成单细胞悬液后，细胞被进一步稀释或分离并被转移到新鲜的培 养容器中以进行持续的再附着、生长和分裂。在汇合的细胞层中细胞 彼此接触以形成单层。有许多培养基可用来复制出最好的人工环境， 让所关注的细胞系成功生长。
哺乳动物的细胞对于伤口愈合的评价是重要的，因为其最终产生 纤维组织而非新细胞。例如，小鼠和人的二倍体成纤维细胞可添加到 细胞培养基中，在高温下培养，其中每3-5天更换一次培养基，并进行 继代。细胞的单层(细胞从该单层被移除)将继续被培养。细胞密度 对于细胞生长也是重要的，其中细胞需要不断提供的能量和物质来维 持。完整的细胞培养基(其中分散着微纤维化制品)支持细胞的生存。
描述培养细胞的方法。在本发明中，双轴取向的热塑性基体的基 质具有包括微薄片的片状表面，并且分散于细胞培养基中，其中该基 质上接种有细胞。所述基质起到细胞外基质的作用。对于在组织支架 中的细胞来说，具有起细胞外基质作用的聚合材料是重要的，所述材 料使细胞能在其中生长、粘附和增殖。该基质较小的扁平微薄片提供 类似于活体组织的用于细胞生长的基体，在活体组织中存在伤口愈合 和组织支架应用的可能。微薄片支持细胞增殖和细胞附着。当微薄片 提供大量的开放空间、硬度和平面形态时，可观察到这些特性。双轴 取向的热塑性基体具有包括微薄片的片状表面，与具有类似尺寸的圆 形纤维相比，其几何形状对于一些聚合材料的更快的生物降解是重要 的，因为其具有更大的表面积。扫描电子显微图显示出纤维尺寸、几 何形状和间隙可影响基质上的细胞密度、细胞形态和细胞分散量。微 纤维化制品更小的扁平薄片散布程度更高，有更多的细胞附着点，显 示出具有更高的细胞密度，如图1的实例3中所示。
此外，微纤维化制品的三维结构具有刚性，并能抵抗断裂和坍塌。 胞外基质指引细胞彼此相互作用并且促使产生具体的细胞功能。合成 支架可包含生物可降解和生物相容性材料，例如脂族聚酯。支架的微 薄片之间的间隙使制品具有高度多孔的特性，允许细胞渗透以及聚合 物降解。在伤口愈合中，特别是在一级和二级伤口中，上皮细胞移动 至伤口表面并在此增殖，形成上皮。生物可降解材料可引导这些细胞 在整个表面上移动并且有利于伤口愈合。
聚丙交酯、聚乙交酯和其共聚物以及其它已知的脂族聚酯可在本 发明中使用。这些聚合物的共聚单体含量可用于控制降解时间和速率。 可使用各种表面处理，例如等离子体处理、电晕处理和具有指定肽序 列的聚合物的吸附。营养物质和生长因子也可施加到表面上。微纤维 化表面可随后被接种和培养以形成类似于体内组织的功能组织。细胞 外基质可进一步用作用于大规模培养的通用细胞培养基，因为其具有 坚固的纤维强度。
培养细胞需要其可在基质上粘附、增殖和分化，并进一步发展新 组织的环境。支架的形态为细胞存活提供步骤。合成细胞外基质的体 外和体内应用可使细胞具有三维的排列方式。细胞可在该环境中旺盛 地生长，在该环境中，其行为和生长类似于人体中的细胞。
此外，本发明提供用作细胞生长基质的制品，其中可被接种的微 薄片分散在细胞培养基中。在脊椎动物中，几乎所有细胞都与细胞外 的高分子或细胞外基质的复杂网状物相接触。主要组分为胶原和蛋白 聚糖，其中纤丝状形式的胶原的直径为0.01到1微米，取决于组织和 生物体。传统培养技术中所遇到的一个困难是去分化。细胞通常从其 组织特异的细胞外基质分离，接着悬浮在培养基中，在该培养基中， 其附着到培养皿的底部形成汇合单层。去分化细胞可失去其形态以及 其生化和功能特性，导致其表现与在最初的组织环境中相比完全不同。 为了让细胞增殖和分化，细胞附着到微纤维化制品是重要的。基质表 面可用肽序列进行改性以促进识别和迅速粘附。包括微薄片的双轴取 向的热塑性基体的三维基质可使营养物质扩散进入基质中，并使细胞 废物扩散到基质外。使用成纤维细胞，通过细胞附着和增殖可使脂族 聚酯微薄片参与到三维人造组织的形成中。薄片尺寸、形状、表面能 和可生物吸收性使这些纤维可用作胞外基质或用于体内应用。
微纤维化聚合材料，例如聚(乳酸)、聚(碳酸盐)、聚丙烯与 其共聚物和共混物已与培养细胞一起被研究过，以评价其在细胞生长 中的有效性。对这些材料进行取向和微纤维化以获得三维基质。在组 织工程中，期望建立能很好地发挥功能，以代替生命系统中不能正常 工作的器官或组织，或成为其一部分的结构。对于代替和恢复有缺陷 的组织或器官，这提供了更有效并且成本更低的方法。在组织工程中， 组织的来源将是受试者本身的细胞，因此能免受人体自身免疫系统的 排斥。在大多数组织工程的情况中，基质被用来将细胞递送到期望的 位置，限定组织的空间，以及引导组织发展的过程。这些细胞大部分 具有锚定依赖性并且需要可粘附的基质以进行粘附。理想的是，基质 起到与人体本身的天然细胞外基质(ECM)类似的作用。所述ECM使细 胞具有具体的功能并且控制细胞彼此相互作用的方式。本发明中使用 的合成热塑性组织支架提供该功能。
热塑性聚合材料提供合成支架的优良的实例。然而，聚合材料优 选为生物相容性材料。常见的合成聚合材料包括聚(乳酸)(PLA)和聚(ε -己内酯)PCL，它们是生物可降解材料。这些材料可被挤压，并且微纤 维化，从而形成高度缠结的多孔材料，该材料具有小于20微米的平均 有效长度和小于200微米的宽度。
实例
这些实例仅仅是用于示例性目的，并且无意于限制附带的权利要 求的范围。除非另外指明，否则实例以及说明书其余部分中的所有份 数、百分数、比率等均按重量计。除非另外指明，否则所用溶剂和其 它试剂均得自威斯康星州密尔沃基的西格玛奥德里奇化学公司。
缩写表
缩写或商品 名 描述 纤维-1 按照美国专利6,468,451实例3中所述制备双轴取向的纤维化 泡沫纤维，不同的是使用按重量计70/30的聚乳酸/聚己内酯 共混物代替PP/弹性体，并且按照美国专利No.6,331,343中所 述以4 x 4比率对泡沫纤维进行双轴取向。聚乳酸具有1.25g/cc 的密度和58℃的玻璃化转变温度。聚已酸内酯为可从马里兰 州陶氏塑料公司(DOW Plastics，Midland，MI)商购获得的 TONE767。 纤维-2 PLA低密度泡沫-在2000psi下进行双轴取向2.8 x 2.8和水 刺。按照美国专利6,468,451实例3中所述制备双轴取向的纤 维化聚乳酸泡沫纤维，不同的是使用聚乳酸代替PP/弹性体， 并且按照美国专利No.6,331,343中所述以2.8 x 2.8比率对泡 沫共混物进行双轴取向。聚乳酸具有1.25g/cc的密度和58℃ 的玻璃化转变温度。 纤维-3 按照美国专利6,331,343实例3中所述制备纤维化聚丙烯-聚 对苯二甲酸乙二醇酯纤维，不同的是使用PET(按照美国专 利6,331,343实例6中所述，得自3M公司(明尼苏达州圣保 罗)的挤出级聚对苯二甲酸乙二醇酯)代替PBT。
实例1-3和比较例C1
对于实例1-3，使用纤维1-3。对于比较例C1，不使用纤维，而是 将存在于Transwell板中的膜留在其中。细胞生长和测试的程序在以下 多步骤方法中给出。
步骤1：消毒
使用环氧乙烷通过以下方式对纤维-1到纤维-3中每个纤维样品进 行消毒：在37摄氏度(冷循环)下使样品暴露于环氧乙烷气体中4-4.5 小时，然后在37摄氏度下暴露于空气中2-3天。
步骤2：细胞培养准备
开始细胞培养的第一步是制备细胞将在其中生长的培养基。将一 包粉末状的伊格尔基本培养基(Basal Medium Eagle，BME)添加到1,000 毫升的无菌水中并且搅拌直至溶解。接下来，称量出0.35毫克的碳酸 氢钠并且将其溶解到BME溶液中，并且测量该溶液的pH值。期望的 pH值为约7.4。将溶液在水浴中加热至37℃。当溶液达到37℃时，添 加5毫升抗生素青霉素和50毫升胎牛血清(FBSO)(它们同样被加热到 37℃)。将包含最终溶液的瓶子标记上“完全”以表明其包含所需的 一切。
使用的细胞为L929小鼠成纤维细胞。将1毫升小鼠成纤维细胞添 加到3毫升上述制备完成的培养基中，并且用5毫升的移液管通过手 动滴定法使其分开。将4毫升完全培养基中的悬浮细胞转移到两个200 毫升塑料的培养烧瓶(各2毫升)中。将所述两个烧瓶放置在设置为 37℃的培养箱中。四天后，通过倒出两个烧瓶中的旧培养基并且吸取 30毫升达尔伯克改良的伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，DMEM)(37℃)到每个培养瓶中，更换培养基。细胞粘附在烧 瓶的底部，所以它们不会被倒出来。更换培养基五天后，细胞变得过 于拥挤，对其进行继代培养。首先，将BME和一瓶胰蛋白酶在水浴中 加热到37℃。接下来，从培养箱取出一个烧瓶并且将其培养基倒入一 次性烧瓶。将5毫升的胰蛋白酶添加到烧瓶中的细胞单层中，持续时 间15-30秒，然后将其倒入一次性烧瓶。将烧瓶紧紧密封并放入培养箱， 持续时间10-15分钟。从培养箱取出烧瓶，并且竖直握持烧瓶时，细胞 慢慢地沿侧壁滑至底部。将5毫升BME添加到烧瓶中，并且将培养基 中的细胞手动吸移到单细胞悬液中。将0.2毫升悬浮细胞的样品放入两 个包含30毫升BME的新培养烧瓶中(在37℃)。将两个新烧瓶放回 培养箱中。继续进行这一更换培养基和继代的步骤四次。使用血球计 对细胞进行计数，以了解每毫米培养基的悬浮液中有多少细胞。需要 15毫升培养基中的细胞，浓度为5 x 105细胞/mL。制备15毫升悬浮液 中的细胞后，就可以将其接种到材料上。
步骤3：接种细胞
将细胞接种到一块大约2.5厘米 x 2.5厘米的材料上(1英寸 x 1 英寸)。添加细胞前，将这块材料放置在双层培养板(Transwell plate) (每个板包含6个孔)的24毫米孔中。对于实施例1-3，孔中的膜用 无菌刀片移除，对于比较例C1，膜被保留并且不添加纤维材料。该膜 由具有0.4微米孔的聚碳酸酯制备。这是细胞可在其上生长的理想表 面，并且可以提供很好的对比。将两毫升BME添加到板的底部(材料 下面)并且使这块材料吸收培养基。然后，将1毫升悬浮液中的细胞 添加到材料的顶部。为了防止材料浮动，将与双层培养板配套的插片 放置到孔和材料上。覆盖该培养板并且用条带进行密封，然后放置在 培养箱中。24小时后，该培养板已制备好，可拍摄SEM图。
步骤4：使用SEM显微图进行的细胞生长分析
通过SEM显微图研究各材料以确定细胞生长是否发生。结果总结 在表1中。
表1
实例 SEM显微图概述 C1 细胞正常粘附。约一半的细胞伸长，并且它们在膜上均匀地 展开。细胞明显已增殖。 1 细胞的密集度比C1稍微低些。存在细胞粘附，但是比C1 中更多圆形细胞。 2 细胞的密集度比C1小很多。存在细胞粘附，它们没有被拉 长，以显示对材料的良好附连。 3 细胞在该材料上的密集度与C1上一样。一些细胞被粘附， 但是与C1中的相比，有更多圆形细胞。
术语“微纤维化制品”被定义为双轴取向的、有空隙的(voided)或 有微空隙的(microvoided)热塑性薄膜、薄片或泡沫，其可通过施加足够 的流体能量以破坏表面而被微纤维化。所述片状表面包括从双轴取向 的膜基板制备的双轴取向的、热塑性的、基本呈矩形的微薄片基质。 可选地，微薄片可从薄膜的微纤维化表面获得。
术语“微纤维化表面”是指包括由一层或多层可微纤维化材料制 成的微薄片的表面。微薄片是部分已经与连续薄膜至少部分机械地分 离或分裂的材料。微薄片的大小和形状通常具有取决于可微纤维化材 料类型及其物理和化学性质的尺寸，例如取向的类型和程度、空隙的 存在和大小、多层、层厚度和球粒等，但并不限于此。微薄片优选地 一端与微纤维化材料保持附接，但是也可以与基膜完全分开。
术语“微薄片”是指包括片状结构的微纤维化结构。微薄片往往 彼此大致平行，形状如同一块板或板状丝带，其中微薄片的两个尺寸 的长度尺度是微薄片的第三尺寸的长度尺度的至少10倍，优选地至少 20倍。薄片可以彼此相连并且往往在宽度或长度方向上是连续的。尺 寸可以用扫描电镜进行测量。
术语“有空隙的”可以是热塑性聚合物的有微空隙的薄膜，或从 半结晶聚合物和空隙引发粒子的不混溶混合物制备的有空隙薄膜。如 本文所用，术语“薄膜”将涵盖薄片(包括发泡薄片)，并且还应该 理解，具有相同设置的微纤维化表面也可采用其它构造和外形(例如 管状)。术语“有空隙的”包括“有微空隙的”。
术语“细胞系”为在有利条件下不断增长和复制的细胞培养物。 细胞系起源于具有有限寿命的细胞培养物，并且如果以所需的间隔维 持并分盘，则可进行有规律地培养。
术语“细胞培养基”为盐、碳水化合物、维生素、氨基酸、代谢 前体、生长因子、激素和痕量元素的复杂混合物。培养基组分可根据 具体的目标细胞系而改变。
术语“完全生长培养基”应由添加了激素、痕量元素、生长因子 和血清的细胞培养基组成。其为是一种维持细胞或微生物的活力的物 质。
“培养细胞”被定义为在合成环境(即完全培养基)中生长的细 胞。例如，哺乳动物细胞的培养可取决于生长培养基、pH值、温度、 渗透度和其它因素。细胞培养是独立于生物体的细胞的生长。
术语“细胞的收获”即从细胞培养基移出细胞。细胞系可锚定于 培养皿或培养瓶中以单层生长。细胞系也可锚定于双轴取向的热塑性 基体的基质中以三维结构生长，所述基质具有包括微薄片的片状表面。 这些细胞以规律的间隔进行继代培养以维持细胞活力。
术语“汇合度”是指细胞在基质上的生长程度。
术语“接种”或“播种”是指将细胞置于双轴取向的热塑性基体 基质上的操作或步骤，所述基质具有包括分散在细胞培养基中的微薄 片的片状表面。
术语“哺乳动物细胞”指衍生自小鼠、人、猴子和大鼠细胞系的 多种来源，但并不限于此。
术语“细胞外基质”是由包括双轴取向的热塑性基体基质的合成 支架组成，该基质具有包括微薄片的片状表面，用于细胞在三维结构 中增殖和分化。
术语“可生物降解的”是指微纤维或微纤维化制品通过天然存在 的微生物(例如细菌、真菌、藻类)的作用和/或天然环境因素而降解。
术语“可生物吸收的”是指微纤维或微纤维化制品可通过生化作 用和/或水解作用被分解，并由活组织吸收。
术语“微纤维化的程度或深度”指少至10微米，但是可以最多50 微米或更大、100微米或更大，最多整个微纤维化膜的厚度，其通过蓬 松度进行测量。
由端点表示的数值范围详述包括包含在该范围内的所有数值(例 如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4和5)。
如本说明书以及所附的权利要求中所使用的，“一种”、“该” 和“所述”包括复数指代，除非内容另外清楚指出。因此，例如，包 含“该化合物”的组合物这一表达方式包括两种或更多种化合物的混 合物。如本说明书以及所附权利要求中所用，术语“或”通常是以其 包括“和/或”的含义使用，除非该内容另外明确指出。
除非另外指明，否则说明书和权利要求中所用的表示数量或成分 的所有数字、特性的量度等在所有情况下均应理解为被术语“约”所 修饰。因此，除非有相反的指示，否则在上述说明书和所附权利要求 中设定的数字参数为近似值，该近似值的改变可取决于通过本领域的 技术人员利用本发明的教导内容而获得的所需特性。在最低限度上， 并且无意于将等同原则的应用受制于权利要求的范围，每个数字参数 应至少按照所报告的有效数字之数并且通过应用普通的舍入技术来理 解。虽然在本发明的广泛范围内设定的数字范围和参数为近似值，但 具体例子中设定的数值会尽可能准确地报告。然而，任何数值都固有 地含有一定的误差，这些误差必定是由它们各自的试验测定中存在的 标准偏差引起。
本发明提供用于培养细胞的方法。该方法包括提供双轴取向的热 塑性基体的基质，该基质具有包括分散在细胞培养基中的微薄片的片 状表面。在另一个实施例中，该方法包含分散在细胞培养基质中的微 纤维化制品，其中微薄片上还接种有细胞。该微薄片的平均长度小于 20微米，并且表面积大于0.5m2/g。
在本发明中所使用的微纤维化制品包括具有整合到被取向的热塑 性薄膜上的片状表面的、双轴取向的热塑性基体的基质，该基质用于 在三维阵列中培养细胞以进行细胞的增殖和分化。微纤维化制品在伤 口愈合和组织工程应用中提供细胞附着和增殖。包括微薄片的双轴取 向的热塑性聚合物基板提供刚度和矩形几何形状。制造这些薄片提供 了高的强度、薄片间的间隙和薄片几何形状。微薄片分散在细胞培养 基中，并且进一步接种有培养细胞。用细胞接种微薄片允许具有高密 度的细胞和广泛的延展性。
可用于形成具有包括微薄片的片状表面的、双轴取向的热塑性基 体的基质和微纤维化制品的聚合物包括任何可熔融加工的热塑性晶 体、半结晶或可结晶的聚合物或共聚物，其中包括嵌段、接枝和无规 共聚物。半结晶聚合物由非晶区和晶区的混合物组成。晶区更为有序， 并且链段实际上包络在晶格中。一些聚合物可通过热处理、拉伸或取 向，并且通过溶剂诱导进行半结晶，其中这些方法可控制真晶成度。 本发明中可用的半结晶聚合物包括聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯共聚物、 聚乙烯共聚物、聚α-烯烃、聚氧甲烯、聚偏氟乙烯、聚(乙烯醇)、聚(甲 基戊烯)、聚(乙烯-三氟氯乙烯)、聚氟乙烯、聚环氧乙烷、聚对苯二甲 酸乙二酯、聚对苯二甲酸丁二酯、尼龙6、尼龙6，6、尼龙6，12、聚丁 烯、聚丙交酯、间规立构聚苯乙烯和热致性液晶聚合物。优选的聚烯 烃包括容易以低成本获得的聚丙烯和聚乙烯，并且可在微纤维化制品 中提供期望的特性，例如高模量和高拉伸强度。
可用的聚合物优选为可经过处理以具有高定向比的聚合物，这种 聚合物在某种程度上增强了机械完整性，并且具有半结晶的性质。取 向的半结晶聚合物显著改善了在取向方向上的强度和弹性模数，并且 低于其熔点的半结晶聚合物的取向形成了链折叠和链缺陷较少的取向 晶相。对于取向的半结晶聚合物，最有效的温度范围在聚合物的α结 晶温度与其熔点之间。α结晶温度或α过渡温度对应于聚合物的次级 转变，在该次级转变中晶体亚单元可在较大的晶体单元中移动。
因此，在这方面优选的聚合物为显示出α过渡温度(Tαc)的聚合 物，并且包括，例如：高密度聚乙烯、线形低密度聚乙烯、乙烯α-烯 烃共聚物、聚丙烯、聚偏二氟乙烯、聚氟乙烯、聚(乙烯三氟氯乙烯)、 聚氧甲烯、聚环氧乙烷、乙烯-乙烯醇共聚物及其共混物。
微纤维和微纤维化制品也可由具有热塑性聚合物组分和空隙引发 组分的、有空隙的、被取向的薄膜制备而成。这种被取向的有空隙的 薄膜在美国专利No.6,331,343(佩雷斯(Perez)等人)、美国专利 6,468,451(佩雷斯等人)和美国专利No.6,645,618(霍布斯(Hobbs)等 人)中有所描述，这些专利的整个公开内容以引用方式并入。
使用有空隙的、被取向的薄膜时，热塑性聚合物组分包括所描述 的聚合物，包括均聚物、共聚物和共混物。该热塑性聚合组分还可以 包括少量的第二聚合物，以给本发明的微纤维化制品赋予期望的特性。 这种共混物的第二聚合物可以是半结晶或无定形的，并且基于脂族聚 酯组分的重量而言，通常小于30重量％。可添加少量的其它聚合物(例 如)用以增强刚度、抗断裂性、Elmendorff抗撕强度、伸长、拉伸强度 和冲击强度，这是本领域已知的。
选择空隙引发组分以使得其在半结晶聚合物组分中不混溶。其可 以是平均粒度为约0.1至20微米(优选为1至10微米)的有机或无机 固体，并且可以是任何形状，包括非晶形、菱面体、纺锤形、板状、 菱形、立方体和球体。
用作空隙引发组分的可用无机固体包括实心玻璃或中空玻璃、陶 瓷或金属颗粒、微球体或小珠；沸石颗粒；无机化合物，包括但不限 于诸如二氧化钛、氧化铝和二氧化硅之类的金属氧化物；金属、碱金 属或碱土金属的碳酸盐或硫酸盐；高岭土、滑石、炭黑等。选择无机 空隙引发组分以使其具有较小的表面相互作用，由于化学性质或物理 形状，当其分散在脂族聚酯组分中时，通常无机空隙引发组分不应与 聚合物组分发生化学反应(包括路易斯酸/碱相互作用)，并且具有最 小的范德瓦尔斯相互作用。
优选的空隙引发组分包含热塑性聚合物(包括半结晶聚合物和非 晶态聚合物)，以提供与第二聚合物组分不混溶的共混物。不混溶的 共混物显示出多种非晶相，这些非晶相(例如)使用差示扫描量热计 或动态力学分析通过存在的多个非晶态玻璃化转变温度而确定。如本 文所用，“不混溶性”是指具有有限溶解度和非零界面张力的聚合物 共混物，也就是说，混合的自由能大于零的共混物：
ΔG≌ΔHm>0
聚合物的可混和性由热力学和动力学因素确定。非极性聚合物的 常用可混和性预测因子为溶解参数的差值或弗洛里-赫金斯相互作用参 数。对于具有非特异性相互作用的聚合物，例如聚烯烃，弗洛里-赫金 斯相互作用参数可通过溶度参数之差的平方乘以系数(V/RT)而算出，其 中V为重复单元非晶相的摩尔体积，R为气体常数，并且T为绝对温 度。因此，两种非极性聚合物之间的弗洛里-赫金斯相互作用参数始终 为正数。
可用作空隙引发组分的聚合物包括上述半结晶聚合物以及非晶态 聚合物，选择的这些聚合物从熔融状态冷却后可立即形成离散相。可 用的非晶态聚合物包括(但不限于)：聚苯乙烯、聚碳酸酯、一些聚 烯烃、环状烯烃共聚物(COC)(例如乙烯降冰片烯共聚物)和韧化聚合 物(例如苯乙烯/丁二烯橡胶(SBR)和乙烯/丙烯/二烯橡胶(EPDM))。
使用不混溶聚合共混物时，可选择第一热塑性聚合物组分和空隙 引发聚合物组分的相对量以使得第一热塑性聚合物形成连续相，并且 空隙引发聚合物组分形成不连续相。由于共混物中空隙引发聚合物的 量的增加，因此将达到一个组成范围，在该组成范围内空隙引发聚合 物不再易于被确定为分散相或离散相。共混物中空隙引发聚合物的量 的进一步增加将生成两个双连续相，然后引起相转化(其中空隙引发 聚合物成为连续相)。优选地，热塑性聚合组分形成连续相，同时空 隙引发组分形成分散在第一聚合物连续相中的分散相或离散相。如果 空隙引发聚合物为半结晶并且以足以形成双连续相的量使用，微纤维 化之后的取向将形成两种不同微薄片的复合结构，这两种微纤维分别 得自热塑性聚合物组分和空隙引发聚合物。
通常，当空隙引发组分的量增加时，最终的薄膜中空隙的量也会 增加。因此，受薄膜中空隙的量所影响的特性(例如机械性能、密度、 透光率等)将取决于空隙引发组分的添加量。
优选地，无论空隙引发组分是有机的还是无机的，组合物中空隙 引发组分的量为1重量％至49重量％，更优选为5重量％至40重量％， 最优选为5重量％至25重量％。在这些组成范围中，第一热塑性聚合 物可形成连续相，同时空隙引发组分形成离散相、不连续相。
另外，所选的空隙引发聚合物组分必须与所选的半结晶聚合物组 分不能混溶。在本文中，不混溶性是指离散相不会以基本方式溶解到 连续相中，即离散相必须在由连续相提供的基质中形成分离的、可识 别的区域。
高熔体强度聚丙烯泡沫可用于制备微纤维化制品。发泡聚丙烯可 由丙烯均聚物组成或可包含具有50重量％或以上的丙烯单体含量的共 聚物。此外，发泡聚丙烯可包含丙烯均聚物或共聚物与除丙烯均聚物 或共聚物之外的均聚物或共聚物的混合物或共混物，如美国专利 No.6,468,451(佩雷斯等人)中所述。
尤其可用的丙烯共聚物为丙烯与一个或多个非丙烯单体的共聚 物。丙烯共聚物包括丙烯的无规共聚物、嵌段共聚物和接枝共聚物以 及选自由C3-C8 α-烯烃和C4-C10双烯组成的群组的烯烃单体。丙烯 共聚物也可包括丙烯的三元共聚物和选自C3-C8 α-烯烃组成的组的 α-烯烃，其中这种三元共聚物的α-烯烃含量优选小于45重量％。C3-C8 α-烯烃包括1-丁烯、异丁烯、1-戊烯、3-甲基-1-丁烯、1-己烯、3，4- 二甲基-1-丁烯、1-庚烯、3-甲基-1-己烯等。C4-C10双烯的例子包括1，3- 丁二烯、1，4-戊二烯、异戊二烯、1，5-己二烯、2，3-二甲基己二烯等。
其它可添加到泡沫组分中高熔体强度聚丙烯的聚合物包括高、中、 低和线形低密度聚乙烯、氟聚合物、聚(1-丁烯)、乙烯/丙烯酸共聚物、 乙烯/醋酸乙烯酯共聚物、乙烯/丙烯共聚物、苯乙烯/丁二烯共聚物、乙 烯/苯乙烯共聚物、乙烯/丙烯酸乙酯共聚物、离聚物和热塑性弹性体(例 如苯乙烯/乙烯/丁烯/苯乙烯(SEBS))，以及乙烯/丙烯/双烯共聚物 (EPDM)。
脂族聚酯也可用于制备微纤维化制品或微薄片，其包括聚(羟基链 烷酸酯)的均聚物和共聚物以及衍生自一种或多种链烷二醇与一种或多 种链烷二羧酸(或酰基衍生物)的反应产物的脂族聚酯的均聚物和共 聚物。也可使用脂族聚酯与一种或多种另外的半结晶或非晶态聚合物 的可混溶与不混溶的共混物。
一类可用的脂族聚酯是聚(羟基链烷酸酯)(得自羟基酸的缩合反应 或开环聚合反应)或其衍生物。适用的聚(羟基链烷酸酯)可以用化学式 H(O-R-C(O)-)n-OH表示，其中R为直链或支链的亚烷基部分，并且n 为1到20之间的数，优选为1到12之间的数。R还可包含一个或多个 链中(即位于链中)的醚氧原子。通常，羟基酸的R基使得侧链羟基 为伯羟基或仲羟基。
可用的聚(羟基链烷酸酯)包括(例如)以下物质的均聚物和共聚物： 聚(3-羟基丁酸酯)、聚(4-羟基丁酸酯)、聚(3-羟基戊酸酯)、聚(乳酸)(也 称为聚丙交酯)、聚(3-羟基丙酸酯)、聚(4-氢戊酸酯)、聚(3-羟基戊酸 酯)、聚(3-羟基己酸酯)、聚(3-羟基庚酸酯)、聚(3-羟基辛酸酯)、聚对二 氧环己酮和聚己内酯、聚乙醇酸(也称为聚乙交酯)。也可使用两种 或更多种上述羟基酸的共聚物，例如3-羟基丁酸酯和3-羟基戊酸酯的 共聚物、乳酸盐和3-羟基丙酸酯的共聚物以及乙交酯和对二氧环己酮 的共聚物。也可使用两种或更多种聚(羟基链烷酸酯)的共混物，以及与 一种或多种半结晶或非晶态聚合物的共混物。
另一类可用的脂族聚酯包括衍生自一种或多种链烷二醇与一种或 多种链烷二羧酸的反应产物(或酰基衍生物)的脂族聚酯。这种聚酯 具有以下通式：
其中R’和R”分别表示可以是直链或支链并具有1至20、优选 具有1至12个碳原子的亚烷基部分，并且m是使得酯为聚合物的数， 并且优选是使得脂族聚酯的分子量为10,000至300,000，优选为约 30,000至200,000的数。每个n独立地为0或1。R’和R”还可包含 一个或多个链中(即位于链中)醚氧原子。
脂族聚酯的例子包括衍生自以下物质的均聚物和共聚物(a)一种或 多种下列二元酸(或其衍生物)：琥珀酸、己二酸、1，12-二羧基十二 烷、富马酸和马来酸，以及(b)一种或多种下列二醇：乙二醇、聚乙二 醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、1，2-丙二醇、1，2-丙二醇、1，3-丁二醇、 1，4-丁二醇、1，6-己二醇、二甘醇和聚丙二醇，以及(c)任选少量(即0.5-7.0 摩尔％)的具有多于两个官能度的多元醇，例如甘油、新戊二醇和季戊 四醇。
这类聚合物可包括聚(丁二酸丁二醇酯)均聚物、聚(己二酸丁二醇 酯)均聚物、聚(己二酸丁二酸丁二醇酯)共聚物、聚(丁二酸己二酸乙二 醇酯)共聚物和聚(己二酸乙二醇酯)均聚物。
市售的脂族聚酯包括聚丙交酯、聚乙交酯、聚丙交酯和乙交酯的 共聚物、L-丙交酯和三亚甲基碳酸酯的共聚物、聚(对二氧环己酮)、聚 (丁二酸丁二醇酯)和聚(己二酸丁二醇酯)。
特别可用的脂族聚酯包括衍生自半结晶聚乳酸的脂族聚酯。聚乳 酸(或聚丙交酯)的主要降解产物是乳酸(这在自然界中是常见的)， 是无毒的并且广泛用于食品、制药和医学行业。聚合物可通过乳酸二 聚体、丙交酯的开环聚合反应制备而成。乳酸具有光学活性，并且二 聚体存在四种不同的形式：L，L-丙交酯、D，D-丙交酯、D，L-丙交酯(内 消旋丙交酯)以及L，L-丙交酯和D，D-丙交酯的外消旋混合物。通过聚 合这些作为纯化合物或作为共混物的丙交酯，可获得具有不同立体构 型和不同物理特性(包括结晶度)的聚丙交酯聚合物。L，L-丙交酯或 D，D-丙交酯生成半结晶聚丙交酯并且是优选的，同时衍生自D，L-丙交 酯的聚丙交酯是非晶态的。
聚丙交酯优选具有高对映体比率以最大化聚合物固有的结晶度。 聚(乳酸)的结晶度是基于聚合物主链的规整性和与其它聚合物链线性 结晶的能力。如果相对少量的一种对映体(例如D-)与相对的对映体(例 如L-)共聚合，聚合物链会变为不规则的形状，并且结晶较少。基于这 些原因，为了最大化结晶度，期望具有的聚(乳酸)为至少85％，优选至 少90％，并且最优选至少95％的一种异构体。
近似等摩尔的D-聚丙交酯和L-聚丙交酯的共混物也可用于本发明 中。与D-聚丙交酯和L-聚丙交酯各自相比(约190℃)，该共混物形 成了具有较高熔点(约210℃)的独特晶体结构，并且具有改善的热稳定 性。可参考H.Tsuji等人的Polymer《聚合物》，1999年第40卷第 6699-6708页。
也可使用聚(乳酸)与其它脂族聚酯的共聚物，包括嵌段和无规共聚 物。可用的共聚单体包括乙交酯、β-丙内酯、四甲基乙交酯、β-丁内 酯、γ-丁内酯、新戊内酯、2-羟基丁酸、α-羟基异丁酸、α-羟基戊酸、 α-羟基异戊酸、α-羟基己酸、α-羟基丁酸、α-羟基异己酸、α-羟基 -β-甲基戊酸、α-羟基辛酸、α-羟基癸酸、α-羟基肉豆蔻酸和α-羟 基硬脂酸。
聚(乳酸)与一种或多种其它脂族聚酯或一种或多种其它聚合物的 共混物也可用于本发明中。可用的共混物的例子包括聚(乳酸)和聚(乙 烯醇)、聚乙二醇/聚丁二酸酯、聚环氧乙烷、聚己内酯和聚乙交酯。
在脂族聚酯与第二非晶态或半结晶聚合物的共混物中，如果第二 聚合物以相对较小的量存在，第二聚合物通常会形成分散在脂族聚酯 连续相中的离散相。由于共混物中第二聚合物的量的增加，因此将达 到一个组成范围，在该组成范围内第二聚合物不再易于被确定为分散 相或离散相。共混物中第二聚合物的量的进一步增加将生成两个双连 续相，然后引起相转化(其中第二聚合物成为连续相)。优选地，脂 族聚酯组分形成连续相，同时第二组分形成分散在第一聚合物的连续 相中的不连续相或分散相，或者两种聚合物形成双连续相。当第二聚 合物以足以形成双连续相的量存在时，随后的取向和微纤维化可形成 包含两种聚合物的微纤维的复合制品。
可用的聚丙交酯可通过以下专利所述进行制备：美国专利No. 6,111,060(葛鲁柏(Gruber)等人)；美国专利No.5,997,568(刘(Liu))； 美国专利No.4,744,365(卡普兰(Kaplan)等人)；美国专利No.5,475,063 (卡普兰等人)；WO 98/24951(蔡(Tsai)等人)；WO 00/12606(蔡等 人)；WO 84/04311(林(Lin))；美国专利No.6,117,928(希尔图南(Hiltunen) 等人)；美国专利No.5,883,199(麦卡锡(McCarthy)等人)；WO 99/50345 (科斯塔德(Kolstad)等人)；WO 99/06456(王(Wang)等人)；WO 94/07949(葛鲁柏等人)；WO 96/22330(兰德尔(Randall)等人)；WO 98/50611(赖安(Ryan)等人)；美国专利No.6143863(葛鲁柏等人)； 美国专利No.6,093,792(格罗斯(Gross)等人)；美国专利No.6,075,118 (王等人)和美国专利No.5,952,433(王等人)，以上各个美国专利 的公开内容以引用的方式并入本文。也可参考J.W.Leenslag，et al.，J. Appl.Polymer Science，1984，29，2829-2842(李斯拉格等人，《应用聚 合物科学杂志》，1984年，第29卷第2829-2842页)和H.R.Kricheldorf， Chemosphere，2001，43，49-54(克瑞德夫，《光化层》，2001年，第43 卷第49-54页)。
制备微薄片或微纤维化制品时，应选择聚合物的分子量以使得聚 合物在给定的加工条件下是可熔融加工的。聚丙交酯的分子量(例如) 可为约10,000至300,000并且优选为约30,000至200,000。对于聚丙烯 和聚乙烯来说，分子量可为5,000至500,000并且优选为约190,000至 300,000。可熔融加工是指聚合物材料在用于处理薄膜的温度下是流体 或可用泵抽取的，并且在该温度下没有显著降解或胶凝。一般来讲， 聚合物的分子量超过缠结分子量，其通过粘度对分子量(Mn)的双对数坐 标图而确定。高于缠结分子量时图的斜率为约3.4，然而分子量较低的 聚合物的斜率为1。
为了获得尽可能大的物理特性并且使聚合物薄膜适合纤维化，聚 合物链需要沿两条主轴取向(双轴取向)。分子取向的程度通常由拉 伸比(即纵向和横向尺寸的最终长度与初始长度之比)限定。取向可 以通过包括压延和长度定向等步骤的技术组合得以实现。
选择取向的条件以使得薄膜的完整性得以维持。因此，当纵向和/ 或横向拉伸时，选择温度以避免连续相的基本撕裂或分裂并且使薄膜 完整性得以维持。如果温度过低或取向比过高，薄膜会特别易于撕裂 或者甚至受到重大损伤。优选地，取向温度高于连续相的玻璃化转变 温度。这种温度条件允许在X和Y方向具有最大取向而不损怀薄膜的 完整性，使薄膜的空隙形成最大化，并且因此尽可能地使表面微纤维 化变得容易。在薄膜中，当变形应力由于取向超过聚合物分子的解缠 比率时，会发生小的破损或撕裂(微空隙)。可参考(例如)Roger S. Porter and Li-Hui Wang，Journal of Macromolecular Science-Rev. Macromol.Chem.Phys.，C35(1)，63-115(1995)(波特和王丽辉，《高分 子科学期刊-高分子物理化学》，第C35(1)卷，第63-115页(1995年))。
已经开发出制备高取向微纤维化热塑性聚合薄膜的一般方法。聚 合物薄膜通过使用T型模或“衣架模”的典型熔体挤出而形成，并且 使用多辊层叠件而进行淬火。将辊的温度维持在21℃左右，使得挤出 的薄膜迅速地淬火并且使结晶最小化，即，该薄膜基本上为非晶态。 然后，使用两步法拉伸薄膜或挤出的外形。在第一步中，在高于玻璃 化转变温度的温度下，将薄膜以相对较高的应变速率拉伸到足够的拉 伸比使得薄膜产生微空隙，但不会受到重大损坏。该薄膜可通过多种 方法进行拉伸，包括但不限于辊拉(压延)、使用热轧辊的纵向取向、 区域拉伸或液体培养基中的热拉伸。纵向取向已被广泛用于传统的薄 膜加工，这种薄膜加工经常用在顺序双轴取向加工的第一步中。如果 使用成空隙剂，由于粒子从热塑性聚合物脱粘可实现广泛的空隙形成。 同样，成空隙剂可以被添加到聚合物熔体中以改善微纤维化效率，例 如非相容聚合物、二氧化硅、碳酸钙或云母材料，或用以赋予微纤维 所需的特性，例如抗静电剂或着色剂。通常，第一步中可根据使用的 聚合物达到4:1-6:1的拉伸比。用于制备微纤维薄片或微薄片的双轴取 向的薄膜和微纤维化这类薄膜的工艺在美国专利No.6,331,433中有所 描述，该专利也以引用的方式并入本文。
第二步的拉伸过程在低于聚合物熔点并比第一步温度较高的拉伸 温度下进行。在这一步中，所述薄膜被进一步拉伸为较高的比率并且 观察到微纤维结构。分子取向的增加可使用X射线散射进行测量并且 通过DSC改变结晶度。通常在第二步中，由于施加在该方法中的更高 取向和温度，结晶度显著增加。优选的拉伸方法是使用以不同速度运 行的热轧辊进行纵向取向。最终的有空隙的或有微空隙的薄膜具有银 色外观并且在拉伸方向(纵向)上可被容易地分裂。另外的拉伸步骤 使得薄膜进一步取向，但并不是必要的。
例如，有了聚丙交酯，薄膜可被拉伸其长度的6倍以上。在一个 实施例中，有了聚丙交酯，总拉伸比大于6:1并且优选在9:1至约18:1 的范围内。“总拉伸比”为薄膜最终面积与薄膜初始面积的比率。
此外，结晶可在熔融处理过的薄膜中形成，该薄膜包含(例如) 脂族聚酯和空隙引发组分。优选的是，脂族聚酯薄膜基本上非晶态并 且通过后续加工(例如压延、拉伸、再结晶和再结晶后的退火)的最 佳结合增加了结晶度。据信薄膜结晶度的最大化将提高微纤维化效率。 通常，脂族聚酯被浇铸为基本非晶态的薄膜，然后通过应变诱导结晶 使结晶度增加。具体可用的脂族聚酯/空隙引发组分共混物的组合包括， 例如聚丙交酯和无机粒子(例如CaCO3)以及聚丙交酯和聚丙烯。
薄膜或泡沫可以在高于热塑性聚合物相的玻璃化转变温度的温度 下通过沿相互垂直的方向拉伸来进行双轴取向。一般来讲，薄膜首先 沿一个方向进行拉伸，然后沿垂直于第一个方向的第二方向拉伸。然 而，如果需要，拉伸可以沿两个方向同时进行。在典型的工艺中，薄 膜首先沿一系列旋转辊上或两对压送辊之间的挤压方向进行拉伸，然 后通过拉幅机装置沿其横向方向进行拉伸。薄膜可以沿每个方向进行 拉伸，最多在其拉伸方向上达到初始尺寸的2至10倍。
对于一些聚合材料，优选的是将横向方向的拉伸限制为小于2倍。 已经发现的是，如果薄膜沿第一方向(例如沿纵向方向)进行取向， 并且随后沿其垂直方向进行大于2倍的取向，则微纤维化膜的能力将 丧失。优选的是，薄膜沿第一方向单轴取向到期望的拉伸比，然后沿 垂直方向进行小于2倍的单轴取向。然而，应当理解，在单轴取向中， 通过拉幅机装置可以抑制薄膜沿横向方向收缩，并且这种抑制会对薄 膜施加小程度的双轴取向。这种小程度的双轴取向可以增强随后的微 纤维化。
可对拉伸后的薄膜进一步加工。例如，薄膜可通过使薄膜经受足 以进一步使脂族聚酯组分结晶的温度同时抑制薄膜在两个拉伸方向缩 回而进行退火或热定型。
取向后，可将空隙施加到不混溶共混物的薄膜上。随着薄膜的拉 伸，由于两种组分的不混溶性和两相之间较差的附着性，两种组分分 离。当薄膜包含连续相和不连续相时，不连续相用于引发在连续相的 基质中仍保持基本上离散、不连续的空隙。当两个连续相存在时，形 成的空隙在整个聚合物薄膜上是基本上连续的。典型的空隙具有主要 尺寸X和Y，分别与纵向和横向的取向度成比例。次要尺寸Z(垂直 于薄膜平面)仍保持基本上与取向前离散相(空隙引发组分)的横截 面尺寸相同。由于不混溶共混物的相之间较差的应力传递，因此出现 空隙。据信共混物组分之间的低分子吸引力是造成不混溶相行为的原 因；当薄膜通过取向或拉伸而受力时，低界面张力导致空隙的形成。
空隙具有相对平坦的形状、不规则的尺寸，并且缺乏明显的界线。 空隙通常与薄膜共面，具有纵向(X)和横向(Y)(取向的方向)的主轴。 空隙的尺寸是可变的并且与离散相的尺寸和取向度成比例。具有相对 较大的离散相区域和/或相对较高取向度的薄膜将产生相对较大的空 隙。具有高离散相比例的薄膜通常会产生在取向上空隙含量相对较高 的薄膜。空隙在薄膜基质中的尺寸，分布和数量可通过诸如小角度x 射线散射法(SAXS)、共聚焦显微镜、扫描电子显微镜(SEM)或密度测量 法之类的技术而确定。另外，由于显著的空隙含量，对薄膜进行视觉 检测可发现增强的不透明度或银色的外观。
由含有用于生成空隙的次要不混溶组分的聚合物混合物形成的泡 沫和薄膜对于形成片状微纤维化制品是重要的。通常，经连续工艺取 向的泡沫或薄膜可以在纵向方向上获得最多约6:1的拉伸比，以及在横 向方向上最多约10:1的拉伸比。在批量方法取向的薄膜或泡沫中，可 以在纵向和横向方向上均获得最多约15:1的拉伸比。
一般来讲，较大的空隙含量增强了随后的微纤维化，并且随后， 使用本发明的方法，对于单轴取向薄膜，纤维的产量也就更大。优选 地，当制备的制品具有至少一个微纤维化表面时，通过密度进行测量， 聚合物薄膜将具有超过5％，更优选超过10％；也就是说，改变的密度 除以初始密度；(δ初始-δ最终)/δ初始。出人意料的是，已经发现空隙 可在远不及将微空隙赋予之前所述有微空隙的薄膜所必需的条件严苛 的条件下，被赋予给两种组分(第一聚合物和空隙引发)聚合物薄膜。 据信不混溶共混物(具有有限的两相溶解度和大于零的混合自由能) 有利于形成随后的微纤维化必需的空隙。此外，通过在第一取向阶段 中利用较低的取向温度以辅助形成空隙。由于微空隙通常是非细胞的、 相对平面的并且具有薄膜纵向(取向的方向)上的主要轴线，因此具 有微空隙的薄膜不同于其它具有空隙的薄膜或制品，例如具有微空隙 的薄膜或泡沫制品。微空隙通常不互相连接，但是邻近的微空隙可相 交。
取向温度过低可导致薄膜外观不均匀。第一取向温度的增加可减 少不均匀的拉伸，获得外观更均匀的拉伸薄膜。第一取向温度还会影 响取向过程中发生的成空隙量。在空隙形成发生的温度范围内，取向 温度越低，通常在取向过程中发生的空隙形成量越大。随着第一取向 温度的升高，空隙形成的程度被降低到消除点。样品的电子显微图显 示出，在没有空隙形成发生的温度下，离散相区域在拉伸过程中通常 会变形。这与高度成空隙的取向样品形成对比；高度成空隙的取向样 品的电子显微图显示出分散相区域在取向期间保持其近似的形状。希 望第二取向在相同的方向或在垂直于第一取向的方向。该第二取向温 度通常类似于或高于第一取向温度。
由于可观的微空隙含量，薄膜的视觉检测可显示出增强的不透明 度或银色的外观，所述空隙含量可用作制备微纤维化表面的取向薄膜 的适合性实证检验。相反，缺乏可观微空隙含量的薄膜表面具有透明 的外观。已经发现的是，缺乏可观微空隙含量的取向薄膜即使可被纵 向分裂仍不易于微纤维化，这是具有纤维形态的高取向聚合物薄膜的 特征。
薄膜的厚度将根据所需的最终用途进行选择并且可通过对工艺条 件的控制而实现。浇注薄膜通常具有的厚度小于100密耳(2.5mm)，并 且优选在20至70密耳(0.8至1.8mm)之间。然而，根据获得的制品 所需的特性，可以浇注出该范围以外的厚度。浇铸薄膜和吹塑薄膜也 可用于制备微纤维化制品。薄膜的最终厚度将通过浇注厚度和取向度 部分确定。对于大多数用途，微纤维化前的薄膜最终厚度将为1至20 密耳(0.025至0.5mm)，优选为3至10密耳(0.075至0.25mm)。 此外，本文所述的方法也可以有利地用于已同时进行了双轴拉伸的薄 膜。这种拉伸可以采用(例如)美国专利No.4,330,499(沃弗塞斯(Aufsess) 等人)和美国专利No.4,595,738(胡夫纳格尔(Hufnagel)等人)中所公 开的方法和装置实现，更优选地采用美国专利No.4,675,582(荷姆斯 (Hommes)等人)；美国专利No.4,825,111(荷姆斯等人)；美国专利 No.4,853,602(荷姆斯等人)；美国专利No.5,036,262(史科贝许 (Schonbach))；美国专利No.5,051,225(荷姆斯等人)和美国专利No. 5,072,493(荷姆斯等人)中所公开的方法和装置实现，这些专利的公 开内容以引用方式并入本文。
根据挤出制品的厚度、温度和薄膜淬火的方法，热塑性基底的形 态在整个制品的厚度上可不相同，也就是说，两个表面的形态和/或表 面与基质的形态可以不同。形态上的较小差别通常不会阻止微纤维化 表面在薄膜的任一个主表面上形成，但是如果制品的两个表面上都需 要微纤维化表面，优选地要小心控制浇注条件以确保在整个制品厚度 上相对均匀的非晶态形态。用于本发明的聚合物基质包括平均长度为 20微米或更少的微薄片和/或微纤维化制品。
微纤维化材料还可包括双轴取向的聚合物和泡沫聚合物，优选的 是热塑性聚合物。泡沫可通过添加一种或多种聚合物和气体或超临界 的流体到双螺杆或单螺杆挤出机中采用挤出加工而制成。其后，泡沫 聚合物为双轴取向的。示例性高熔融强度的可发泡热塑性聚合物包括 可由丙烯均聚物组成的聚丙烯或可包含丙烯单体含量为50重量％或以 上的共聚物的聚丙烯。可发泡聚丙烯可包含丙烯均聚物或共聚物与非 丙烯均聚物或共聚物的均聚物或共聚物的混合物或共混物。其它含微 纤维化聚丙烯的材料和制品在美国专利No.6,692,823(科迪(Kody)等 人)、美国专利6,468,451(佩雷斯等人)和美国专利No.6,890,649(霍 布斯等人)中有所描述。
在一个实施例中，微纤维和/或微纤维化制品可采用美国专利 No.6,110,588中所述的方法由具有微空隙的薄膜制备而成，该专利的整 个公开内容以引用方式并入。本发明所公开的具有微空隙的薄膜得自 具有应变诱导结晶度的熔融处理过的高取向半结晶薄膜。应变诱导结 晶度是可通过诸如压延、退火、拉伸和再结晶等后续加工的最佳结合 而获得的结晶度。
取向热塑性薄膜可通过施加足够的流体能量到表面以从聚合物基 质释放微纤维而被微纤维化。相对于传统的机械纤维化过程，在微纤 维化过程中，相对更大量的能量被施加到薄膜表面以释放微薄片。微 薄片是由双轴取向的、有空隙的热塑性基体或泡沫热塑性基体而获得 的。微纤维化后，大部分材料表面包括片状结构。这些结构的平均厚 度为1至20微米，优选地为小于5微米，并且平均宽度为1至数百微 米、优选地为约5至约30微米。片状结构通常可以显示具有大于0.5m2/g 的表面积，优选地大于0.7m2/g，以上是在氮气作为被吸收物质的条件 下采用Autosorb-6物理吸附分析仪(Autosorb-6 Physisorption Analyzer) (康塔仪器公司(佛罗里达州博茵顿沙滩)(Quantachrome Instruments， Boynton Beach，FL))。扫描电子显微镜显示出用于本发明的微薄片通 常彼此平行，并且形状如同一块板或板状丝带，其中微薄片的两个尺 寸的长度尺度是微薄片的第三尺寸的长度尺度的至少10倍，优选地至 少20倍。微薄片的片状表面的长宽比可以在1:1到1:20的范围内，并 且可取决于薄膜或泡沫的取向的平衡。拉伸较不平衡会导致更易形成 条带状的微薄片。此外，薄片可以彼此相连，并且往往在宽度和长度 方向上是连续的。尺寸可以用扫描电镜进行测量。因此，表面积超过 所期望的矩形成型微纤维的表面积，并且这种表面积增强了与诸如混 凝土和热固性塑料等基质的粘结，以及在需要时提供更大的表面积用 于增强可生物降解性。
可选地，在微纤维化前，薄膜可通过传统的机械方法经微纤维化 步骤由双轴取向的薄膜制备宏观薄片。机械纤维化的传统方法使用具 有切割元件(例如接触移动薄膜的针或齿)的转鼓或辊。齿可完全或 部分地穿透薄膜的表面，以在其上施加宏观纤维化表面。其它类似的 宏观纤维化处理是已知的，并且包括如扭曲、刷(如用针辊)、摩擦 (例如用皮革垫)和弯曲等机械作用。通过这种传统的宏观纤维化方 法获得的薄片在尺寸上是宏观的，通常在其横截面上为数百微米。
使薄膜表面微纤维化的一种方法是通过流体喷射的方式。在该方 法中，一个或多个细液流的射流冲击热塑性聚合物薄膜的表面(可通 过筛网或移动带支承)，从而从聚合物基质释放微薄片。薄膜的一个 或两个表面可被微纤维化。微纤维化的程度取决于薄膜暴露于流体喷 射的时间、流体喷射的压力、流体喷射的横截面积、流体接触角、聚 合物特性，并且在较小程度上取决于流体温度。不同类型和尺寸的筛 网可用于支承薄膜。
可使用任何类型的流体或气流。液态流体可包括水或有机溶剂， 例如乙醇或甲醇。可使用适合的气体(例如氮气、空气或二氧化碳) 以及液体和气体的混合物。任何这类流体优选为非溶胀的(即不被聚 合物基质吸收)，这会降低微薄片的取向和结晶度。为了在微纤维化 过程中施加电荷，优选的流体为水并且最优选为基本上不含任何污染 物(例如可消除静电电荷的盐或矿物质)的去离子或蒸馏水。流体温 度可升高，尽管使用环境温度流体可获得合适的结果。流体的压力应 足以施加一些程度的微纤维化到薄膜的至少一部分，并且适合的条件 可根据流体、聚合物的性质(包括组分和形态)、流体喷射的构造、 冲击的角度和温度而广泛改变。一般来讲，与具有微空隙的薄膜相比， 使有空隙的薄膜和有空隙的泡沫微纤维化所需的条件不那么严苛。
通常，虽然可使用更低的压力和更长的暴露时间，但流体在室温 下以及大于6800kPa(1000psi)(优选大于10,300kPa(1500psi))的压力 下为水。这种流体通常将施加基于以下条件计算所得的最小10W或 20W/cm2：假定流体具有不可压缩性、表面是光滑的并且摩擦不产生损 失。
流体喷射的构造(即横截面形状)可以大致呈圆形，但也可采用 其它形状。该射流可包括横贯部分薄膜或横贯薄膜宽度的狭槽。射流 可以是静止的，当薄膜相对于射流传输时，射流可相对于静止薄膜移 动，或薄膜和射流可相对于彼此移动。例如，薄膜可通过送料辊的方 式在纵向方向上传输，同时射流横向移动到纤维网。优选地，使用多 个射流，这时薄膜利用辊传输通过微纤维化室，并且薄膜由筛网或纤 维织品支承，这使得流体从微纤维化表面流出。薄膜可在单程中微纤 维化，或作为另外一种选择，薄膜可利用多次通过射流而微纤维化。
可构建射流以使得全部或部分薄膜表面被微纤维化。作为另外一 种选择，可构建射流以使得仅所选的薄膜区被微纤维化。薄膜的某些 区域也可使用常规的掩蔽剂进行掩蔽以使所选的区域没有被微纤维 化。同样，可执行该方法使得微纤维化表面仅部分穿透或完全通过起 始薄膜的厚度。如果期望微纤维化表面通过薄膜的厚度拉伸，可选择 条件以使得制品的完整性得以维持，并且薄膜没有被切断形成各个纱 线或薄片。筛网或网孔可被用于在微纤维化制品的表面上形成图案。
例如可使用水缠绕机器通过使纤维材料暴露于流体喷射以使一个 或两个表面微纤维化。水缠绕机器通常通过使用高速水射流用于增强 微纤维或纱线的膨松度，以在纤维网粘结过程中包裹或缠绕各个微纤 维，也被称为水射流或水刺。作为另外一种选择，可使用高压水射流 (具有旋转或振动头)，也允许人工控制流体射流的喷射。
使用流体射流可以控制微纤维化的程度以提供低程度或高程度的 微纤维化。可期望低程度的微纤维化通过在表面部分地暴露尽可能少 量的微纤维而增大表面积，从而施加纤维纹理到薄膜的表面。因此， 增大的表面积增强了表面的可粘合性。这种制品是有用的，例如作为 研磨涂层的基板和作为印刷接受面，如钩环扣件、夹层粘接剂和背衬 带。相反，需要高程度的微纤维化以将高纤维纹理施加到表面以提供 类似布的薄膜、绝缘制品、过滤制品或提供用于随后从聚合物基质采 收各个微薄片(即微薄片的移除)。
在另一个实施例中，微纤维化可以通过将样品浸入高能量空化介 质中来进行。完成这类空化的一种方法是通过向流体施加超声波。微 纤维化的速率取决于空化强度。超声波系统可以从低声波振幅、低能 量的超声波清洗器到聚焦低振幅系统，直到高振幅、高强度的声学探 针系统。
一种方法(包括超声波能量的应用)涉及在纤维薄膜所沉浸的液 体介质中使用探针系统。喇叭形辐射体(探针)应至少部分地浸在液 体中。对于探针系统，取向薄膜在介质中通过放置在振荡的喇叭形辐 射体与穿孔金属板或筛网之间(其它放置的方法也是可能的)而经受 超声波振动。有利的是，使用超声波时薄膜的两个主表面都被微纤维 化。微纤维化在纤维材料中的深度取决于空化强度、在空化介质中花 费的时间量以及纤维材料的特性。空化强度是许多可变因素，例如施 加的幅度和振动频率、流体特性、流体温度和施加的压力以及在空化 介质中的位置。强度(每单位面积的功率)通常在喇叭形辐射体下达 到最高，但是这可能会受到声波调焦的影响。
方法包括将薄膜设置在空化介质(通常为水)中超声波喇叭形辐 射体和薄膜支承体之间，该空化介质保持于槽中。由于极端空化在该 区域内发生，因此该支承体用于抑制薄膜从喇叭形辐射体脱离。薄膜 可由各种装置支承，例如筛网(可被穿孔的旋转装置)，或通过调整 可将薄膜送入超声波浴的张力辊进行支承。薄膜对喇叭形辐射体的张 力可作为另外一种选择使用，但是正确的定位可提供更好的纤维化效 率。薄膜的相对面与喇叭形辐射体和筛网之间的距离通常小于约5mm (0.2英寸)。可调节从薄膜到槽底部的距离以产生可在薄膜上最大化 空化能量的驻波，或者作为另外一种选择，可使用其它聚焦技术。也 可使用其它喇叭形辐射体到薄膜的距离。当薄膜设置在喇叭形辐射体 的附近或在距离喇叭形辐射体四分之一波长处时，通常会产生最好的 结果，然而这取决于诸如流体容器的形状和使用的辐射面等因素。通 常将样品设置在喇叭形辐射体的附近或者第一或第二四分之一波长处 是优选的。
超声波压力振幅可表示为：
Po＝2πB/λ＝(2π/λ)ρc2ymax
强度可表示为：
I＝(Po)2/2ρc
其中
Po＝最大(峰值)声压振幅
I＝声强
B＝介质的体积模量
λ＝介质中的波长
ymax＝峰值声幅
ρ＝介质的密度，以及
c＝介质中的波速。
超声波清洗浴系统通常可在1至10W/cm2的范围内，而喇叭形辐 射体(探针)系统可达到300至1000W/cm2或更高。一般来讲，这些 系统的功率密度水平(每单位面积的功率，或强度)可通过将传送的 能量除以辐射面的表面积而确定。然而，由于流体中的波衰减，实际 强度可能会有所降低。选择条件以使得可提供声空化。一般来讲，较 高的振幅和/或施加的压力在介质中提供较多的空化。一般来讲，空化 强度越高，产生微薄片的速率越快，从而获得的微薄片越细(直径越 小)。不受理论的束缚，据信高压冲击波由初始空化气泡的伸缩而产 生，其冲击薄膜导致微纤维化。
超声波振动频率通常为20至500千赫，优选为20至200千赫， 并且更优选为20至100千赫。然而，在不脱离本发明范围的前提下， 也可利用声波频率。功率密度(每单位面积的能量，或强度)可以在 1W/cm2至1kW/cm2或更高的范围内。在本发明的方法中，优选的是， 功率密度为10W/cm2或更高，并且优选为50W/cm2或更高。
薄膜和喇叭形辐射体之间的间隙可为(但不限于)0.001至3.0英 寸(0.03至76mm)，优选为0.005至0.05英寸(0.13至1.3mm)。温 度可以在5至150℃，优选在10至100℃，并且更优选在20至60℃的 范围内。表面活性剂或其它添加剂可添加到空化介质中或结合到纤维 薄膜中。处理时间取决于样品的初始形态、薄膜厚度和空化强度。该 时间可在1毫秒至一小时，优选地在1/10秒至15分钟，并且最优选地 在二分之一秒至5分钟的范围内。
此外，在任一种微纤维化方法中，微纤维化的程度或深度可以被 控制。可以制备微纤维化制品，其中微纤维化的深度(即微纤维化层 的厚度)少达10微米，但可以是50微米或更高、100微米或更高，甚 至达到完全微纤维化膜的厚度。可期望低程度的微纤维化通过在表面 部分地暴露尽可能少量的微薄片而增大表面积，从而施加纤维纹理到 薄膜的表面。相反，需要高程度的微纤维化以将高纤维纹理施加到表 面以提供类似布的薄膜、绝缘制品和过滤制品。
在任一种微纤维化方法中，大部分的微薄片由于从聚合物基质不 完全释放而保持与纤维网的连接。有利的是，微纤维化制品(已固定 到纤维网上)提供了方便并且安全的处理、存储和传送微薄片的方法。 对于许多专利申请，期望使微薄片保持固定在纤维网上，如美国专利 No.6,645,618(霍布斯等人)和美国专利No.6,890,649(霍布斯等人) 中所述，这些专利以引用方式并入本文。
可选地，微薄片可通过诸如用针辊、刮削等机械方法从薄膜的表 面进行采收。由于各个微薄片的高模量，采收的微薄片通常保持其膨 松度(蓬松度)。如果需要，蓬松度可通过传统的方法进行改善，例 如那些用于增强吹塑微薄片蓬松度的方法，例如通过增加人造短纤维。
用于本发明的微纤维化制品和微薄片呈现对细胞生长来说非常重 要的纤维尺寸。板状的微薄片有利于细胞附着，其中较高的表面积应 使用脂族聚酯快速降解。亚细胞薄片尺寸的微薄片具有优良的机械强 度和悬垂性，并且可以连续法进行制备。
如本发明中所述，组织细胞需要固体基质，细胞在固体基质上可 移动并仅伸出很短的凸起到液体介质中。在人体中，胶原、其它细胞 外纤维或其它细胞的表面会用作固体基质。同样，细胞可以容易地蠕 动到玻璃和其它共同组织培养基质上。组织细胞的运动性可受到基质 (例如微薄片)的粘附性和物理形状的强烈影响，其中细胞积聚在粘 附性更强的区域上，并且增加了粘附性梯度。这些细胞与其基质粘附 性成比例变平。细胞可沿着微薄片和曲面取向，该微薄片和曲面优先 沿着最小局部曲率的方向拉伸和移动。随着细胞的生长，与另一细胞 的接触可抑制彼此的运动。然而，白细胞和癌细胞对于抑制及其扩散 性是相对不敏感的。
来源于组织的细胞(例如哺乳动物细胞)可在作为合成环境的细 胞培养基中进行培养。完全生长培养基被定义为包含营养物质，并且 被称为微生物或细胞可在其上或在其中生长的物质。细胞培养基含有 盐、碳水化合物、维生素、氨基酸和代谢前体。另外，该培养基可用 血清、生长因子、痕量元素、激素和抗生素进行补充，被称之为完全 生长培养基。培养基冲洗附着在容器表面的细胞，培养物可以在其中 生长，并且随后进行继代培养。在没有添加激素或生长因子的情况下， 一些细胞系会无法生长。培养基的所需组分在各种细胞系中有所不同， 并且构成了细胞培养基的全面清单。一些示例培养基包括伊格尔最低 必需培养基、达尔伯克改良的伊格尔培养基和艾斯科乌改良的达尔伯 克培养基。细胞培养基专用于其各自的细胞系。细胞培养基的列表可 得自英杰生命技术有限公司(Invitrogen Corporation)(加利福尼亚州卡 尔斯巴德)。
细胞培养基有益于细胞生长和发展。除了列出的营养物质以外， 培养基帮助维持培养体系中的pH值和渗透度。大多数脊椎动物细胞的 典型细胞培养基在260到320mOsm/kg的范围内，较为完善的细胞系可 经受更大的渗透压变化。这同时适用于原核或真核细胞，即使在实践 中，细胞培养是指对衍生自多细胞真核细胞、特别是动物细胞的细胞 进行的培养。对于各细胞类型，培养条件(生长培养基、pH值和温度) 差别较大，并且对于特定的细胞类型，条件的变化可导致不同的表型 被表达。对于细胞培养的参考可见于Sanford，K.K.，The growth in vitro of single isolated tissue cells，J.Natl.Cancer Inst.1948，9，229-246(桑福 德，“单个分离组织细胞的体外培养”，《国家癌症研究所期刊》， 1948年第9卷第229-246页)；Freshney，R.I.，Culture of Animal Cells：A Manual of Basic Technique，4 th Ed.New York：Wiley Liss，2000(福士尼， 《动物细胞的培养：基本技术手册，第4版》，纽约：威利-莉斯公司， 2000年)；Jacoby，W.B.，Pasten，I.H.，eds.，“Monolayer culture techniques in Methods in Enzymology”，Cell Culture，1979，58，New York，Academic Press(贾柯比、帕斯登，“酶学方法中的单层培养技术”，《细胞培 养》，1979年，第58页，纽约，学术出版社)；以及WO 00/53721、 09/14/2000(威克特(Wickert，P.D.)等人)。
通常，用于培养细胞的容器提供污染屏蔽，以保护培养，使之不 受外部环境的污染，同时维持适当的内部环境。玻璃和塑料(即聚苯 乙烯)最常用于细胞生长。在本发明中，微薄片或微纤维化制品可分 散在用于培养细胞的容器内的细胞培养基中。将细胞接种到微纤维化 制品的表面上，并且提供其生长环境。另外，微纤维化制品可包括用 于培养细胞的多孔板装置的基质。
使细胞系生长，并将其保持在适于细胞培养连续生长和复制的条 件下。所有细胞系均源于寿命有限的细胞培养，但是偶尔有一些细胞 继续繁殖，这是因为遗传的不稳定性。这些细胞可无限期地培养。细 胞系可见于美国细胞、菌种库(ATCC)生物制品(弗吉尼亚州的马纳萨 斯)。
如果将细胞有规律地分盘，其可被培养更长时间，随后置换培养 基并且稀释细胞(首先用胰岛素从支承体分离细胞后)，这称为继代 培养。如本发明的文章所述，培养细胞成功与否关键在于对细胞在被 转移到人工环境之前所处的自然环境的模拟。其次，培养的细胞可经 常进行继代培养。当细胞汇合达到约70到90％时，可能必须对其进行 继代培养。细胞单层的继代培养涉及细胞间和细胞到细胞的表面连接 的破损。通常，蛋白质粘附连接用胰蛋白酶进行消化。在细胞离散和 分散成单细胞悬液后，细胞被进一步稀释或分离并被转移到新鲜的培 养容器中以进行持续的再附着、生长和分裂。在汇合的细胞层中细胞 彼此接触以形成单层。有许多培养基可用来复制出最好的人工环境， 让所关注的细胞系成功生长。
哺乳动物的细胞对于伤口愈合的评价是重要的，因为其最终产生 纤维组织而非新细胞。例如，小鼠和人的二倍体成纤维细胞可添加到 细胞培养基中，在高温下培养，其中每3-5天更换一次培养基，并进行 继代。细胞的单层(细胞从该单层被移除)将继续被培养。细胞密度 对于细胞生长也是重要的，其中细胞需要不断提供的能量和物质来维 持。完整的细胞培养基(其中分散着微纤维化制品)支持细胞的生存。
描述培养细胞的方法。在本发明中，双轴取向的热塑性基体的基 质具有包括微薄片的片状表面，并且分散于细胞培养基中，其中该基 质上接种有细胞。所述基质起到细胞外基质的作用。对于在组织支架 中的细胞来说，具有起细胞外基质作用的聚合材料是重要的，所述材 料使细胞能在其中生长、粘附和增殖。该基质较小的扁平微薄片提供 类似于活体组织的用于细胞生长的基体，在活体组织中存在伤口愈合 和组织支架应用的可能。微薄片支持细胞增殖和细胞附着。当微薄片 提供大量的开放空间、硬度和平面形态时，可观察到这些特性。双轴 取向的热塑性基体具有包括微薄片的片状表面，与具有类似尺寸的圆 形纤维相比，其几何形状对于一些聚合材料的更快的生物降解是重要 的，因为其具有更大的表面积。扫描电子显微图显示出纤维尺寸、几 何形状和间隙可影响基质上的细胞密度、细胞形态和细胞分散量。微 纤维化制品更小的扁平薄片散布程度更高，有更多的细胞附着点，显 示出具有更高的细胞密度，如图1的实例3中所示。
此外，微纤维化制品的三维结构具有刚性，并能抵抗断裂和坍塌。 胞外基质指引细胞彼此相互作用并且促使产生具体的细胞功能。合成 支架可包含生物可降解和生物相容性材料，例如脂族聚酯。支架的微 薄片之间的间隙使制品具有高度多孔的特性，允许细胞渗透以及聚合 物降解。在伤口愈合中，特别是在一级和二级伤口中，上皮细胞移动 至伤口表面并在此增殖，形成上皮。生物可降解材料可引导这些细胞 在整个表面上移动并且有利于伤口愈合。
聚丙交酯、聚乙交酯和其共聚物以及其它已知的脂族聚酯可在本 发明中使用。这些聚合物的共聚单体含量可用于控制降解时间和速率。 可使用各种表面处理，例如等离子体处理、电晕处理和具有指定肽序 列的聚合物的吸附。营养物质和生长因子也可施加到表面上。微纤维 化表面可随后被接种和培养以形成类似于体内组织的功能组织。细胞 外基质可进一步用作用于大规模培养的通用细胞培养基，因为其具有 坚固的纤维强度。
培养细胞需要其可在基质上粘附、增殖和分化，并进一步发展新 组织的环境。支架的形态为细胞存活提供步骤。合成细胞外基质的体 外和体内应用可使细胞具有三维的排列方式。细胞可在该环境中旺盛 地生长，在该环境中，其行为和生长类似于人体中的细胞。
此外，本发明提供用作细胞生长基质的制品，其中可被接种的微 薄片分散在细胞培养基中。在脊椎动物中，几乎所有细胞都与细胞外 的高分子或细胞外基质的复杂网状物相接触。主要组分为胶原和蛋白 聚糖，其中纤丝状形式的胶原的直径为0.01到1微米，取决于组织和 生物体。传统培养技术中所遇到的一个困难是去分化。细胞通常从其 组织特异的细胞外基质分离，接着悬浮在培养基中，在该培养基中， 其附着到培养皿的底部形成汇合单层。去分化细胞可失去其形态以及 其生化和功能特性，导致其表现与在最初的组织环境中相比完全不同。 为了让细胞增殖和分化，细胞附着到微纤维化制品是重要的。基质表 面可用肽序列进行改性以促进识别和迅速粘附。包括微薄片的双轴取 向的热塑性基体的三维基质可使营养物质扩散进入基质中，并使细胞 废物扩散到基质外。使用成纤维细胞，通过细胞附着和增殖可使脂族 聚酯微薄片参与到三维人造组织的形成中。薄片尺寸、形状、表面能 和可生物吸收性使这些纤维可用作胞外基质或用于体内应用。
微纤维化聚合材料，例如聚(乳酸)、聚(碳酸盐)、聚丙烯与 其共聚物和共混物已与培养细胞一起被研究过，以评价其在细胞生长 中的有效性。对这些材料进行取向和微纤维化以获得三维基质。在组 织工程中，期望建立能很好地发挥功能，以代替生命系统中不能正常 工作的器官或组织，或成为其一部分的结构。对于代替和恢复有缺陷 的组织或器官，这提供了更有效并且成本更低的方法。在组织工程中， 组织的来源将是受试者本身的细胞，因此能免受人体自身免疫系统的 排斥。在大多数组织工程的情况中，基质被用来将细胞递送到期望的 位置，限定组织的空间，以及引导组织发展的过程。这些细胞大部分 具有锚定依赖性并且需要可粘附的基质以进行粘附。理想的是，基质 起到与人体本身的天然细胞外基质(ECM)类似的作用。所述ECM使细 胞具有具体的功能并且控制细胞彼此相互作用的方式。本发明中使用 的合成热塑性组织支架提供该功能。
热塑性聚合材料提供合成支架的优良的实例。然而，聚合材料优 选为生物相容性材料。常见的合成聚合材料包括聚(乳酸)(PLA)和聚(ε -己内酯)PCL，它们是生物可降解材料。这些材料可被挤压，并且微纤 维化，从而形成高度缠结的多孔材料，该材料具有小于20微米的平均 有效长度和小于200微米的宽度。
实例
这些实例仅仅是用于示例性目的，并且无意于限制附带的权利要 求的范围。除非另外指明，否则实例以及说明书其余部分中的所有份 数、百分数、比率等均按重量计。除非另外指明，否则所用溶剂和其 它试剂均得自威斯康星州密尔沃基的西格玛奥德里奇化学公司。
缩写表
缩写或商品 名 描述 纤维-1 按照美国专利6,468,451实例3中所述制备双轴取向的纤维化 泡沫纤维，不同的是使用按重量计70/30的聚乳酸/聚己内酯 共混物代替PP/弹性体，并且按照美国专利No.6,331,343中所 述以4 x 4比率对泡沫纤维进行双轴取向。聚乳酸具有1.25g/cc 的密度和58℃的玻璃化转变温度。聚已酸内酯为可从马里兰 州陶氏塑料公司(DOW Plastics，Midland，MI)商购获得的 TONE767。 纤维-2 PLA低密度泡沫-在2000psi下进行双轴取向2.8 x 2.8和水 刺。按照美国专利6,468,451实例3中所述制备双轴取向的纤 维化聚乳酸泡沫纤维，不同的是使用聚乳酸代替PP/弹性体， 并且按照美国专利No.6,331,343中所述以2.8 x 2.8比率对泡 沫共混物进行双轴取向。聚乳酸具有1.25g/cc的密度和58℃ 的玻璃化转变温度。 纤维-3 按照美国专利6,331,343实例3中所述制备纤维化聚丙烯-聚 对苯二甲酸乙二醇酯纤维，不同的是使用PET(按照美国专 利6,331,343实例6中所述，得自3M公司(明尼苏达州圣保 罗)的挤出级聚对苯二甲酸乙二醇酯)代替PBT。
实例1-3和比较例C1
对于实例1-3，使用纤维1-3。对于比较例C1，不使用纤维，而是 将存在于Transwell板中的膜留在其中。细胞生长和测试的程序在以下 多步骤方法中给出。
步骤1：消毒
使用环氧乙烷通过以下方式对纤维-1到纤维-3中每个纤维样品进 行消毒：在37摄氏度(冷循环)下使样品暴露于环氧乙烷气体中4-4.5 小时，然后在37摄氏度下暴露于空气中2-3天。
步骤2：细胞培养准备
开始细胞培养的第一步是制备细胞将在其中生长的培养基。将一 包粉末状的伊格尔基本培养基(Basal Medium Eagle，BME)添加到1,000 毫升的无菌水中并且搅拌直至溶解。接下来，称量出0.35毫克的碳酸 氢钠并且将其溶解到BME溶液中，并且测量该溶液的pH值。期望的 pH值为约7.4。将溶液在水浴中加热至37℃。当溶液达到37℃时，添 加5毫升抗生素青霉素和50毫升胎牛血清(FBSO)(它们同样被加热到 37℃)。将包含最终溶液的瓶子标记上“完全”以表明其包含所需的 一切。
使用的细胞为L929小鼠成纤维细胞。将1毫升小鼠成纤维细胞添 加到3毫升上述制备完成的培养基中，并且用5毫升的移液管通过手 动滴定法使其分开。将4毫升完全培养基中的悬浮细胞转移到两个200 毫升塑料的培养烧瓶(各2毫升)中。将所述两个烧瓶放置在设置为 37℃的培养箱中。四天后，通过倒出两个烧瓶中的旧培养基并且吸取 30毫升达尔伯克改良的伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，DMEM)(37℃)到每个培养瓶中，更换培养基。细胞粘附在烧 瓶的底部，所以它们不会被倒出来。更换培养基五天后，细胞变得过 于拥挤，对其进行继代培养。首先，将BME和一瓶胰蛋白酶在水浴中 加热到37℃。接下来，从培养箱取出一个烧瓶并且将其培养基倒入一 次性烧瓶。将5毫升的胰蛋白酶添加到烧瓶中的细胞单层中，持续时 间15-30秒，然后将其倒入一次性烧瓶。将烧瓶紧紧密封并放入培养箱， 持续时间10-15分钟。从培养箱取出烧瓶，并且竖直握持烧瓶时，细胞 慢慢地沿侧壁滑至底部。将5毫升BME添加到烧瓶中，并且将培养基 中的细胞手动吸移到单细胞悬液中。将0.2毫升悬浮细胞的样品放入两 个包含30毫升BME的新培养烧瓶中(在37℃)。将两个新烧瓶放回 培养箱中。继续进行这一更换培养基和继代的步骤四次。使用血球计 对细胞进行计数，以了解每毫米培养基的悬浮液中有多少细胞。需要 15毫升培养基中的细胞，浓度为5 x 105细胞/mL。制备15毫升悬浮液 中的细胞后，就可以将其接种到材料上。
步骤3：接种细胞
将细胞接种到一块大约2.5厘米 x 2.5厘米的材料上(1英寸 x 1 英寸)。添加细胞前，将这块材料放置在双层培养板(Transwell plate) (每个板包含6个孔)的24毫米孔中。对于实施例1-3，孔中的膜用 无菌刀片移除，对于比较例C1，膜被保留并且不添加纤维材料。该膜 由具有0.4微米孔的聚碳酸酯制备。这是细胞可在其上生长的理想表 面，并且可以提供很好的对比。将两毫升BME添加到板的底部(材料 下面)并且使这块材料吸收培养基。然后，将1毫升悬浮液中的细胞 添加到材料的顶部。为了防止材料浮动，将与双层培养板配套的插片 放置到孔和材料上。覆盖该培养板并且用条带进行密封，然后放置在 培养箱中。24小时后，该培养板已制备好，可拍摄SEM图。
步骤4：使用SEM显微图进行的细胞生长分析
通过SEM显微图研究各材料以确定细胞生长是否发生。结果总结 在表1中。
表1
实例 SEM显微图概述 C1 细胞正常粘附。约一半的细胞伸长，并且它们在膜上均匀地 展开。细胞明显已增殖。 1 细胞的密集度比C1稍微低些。存在细胞粘附，但是比C1 中更多圆形细胞。 2 细胞的密集度比C1小很多。存在细胞粘附，它们没有被拉 长，以显示对材料的良好附连。 3 细胞在该材料上的密集度与C1上一样。一些细胞被粘附， 但是与C1中的相比，有更多圆形细胞。
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