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血液样本DNA提取 试剂盒及其应用

阅读：446发布：2020-05-12

专利汇可以提供血液样本DNA提取试剂盒及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供一种血液样本 DNA提取试剂盒及其应用。所述试剂盒包含细胞裂解液A和稳定液B。本发明通过向细胞裂解液中添加稳定液，使得血液样本DNA提取过程中由抗凝剂所导致的PCR抑制得以有效消除。本发明方法提取成本低，提取耗时10min左右，总检测耗时仅需60min左右，非常适合于大规模96孔板快提操作。，下面是血液样本DNA提取试剂盒及其应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.血液样本DNA提取试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含细胞裂解液A和稳定液B；
所述细胞裂解液A选自50～100mM Tris-HCl、50～75mM NaCl、0.5％～5％Triton X-
100、50～100mM DTT中的至少一种；
所述稳定液B选自10％～30％甘油、10％～25％DMSO、0.5％～5％Tween-20中的至少一种。
2.权利要求1所述试剂盒在DNA提取及基因检测中的应用。
3.血液样本DNA提取及基因检测方法，其特征在于，所述方法包括：向采集的血液样本中加入样本10～30倍体积量的细胞裂解液A，25℃～35℃振荡混匀；然后，加入与细胞裂解液A等量的稳定液B，25℃～35℃振荡混匀后静置，取上清用水稀释10～20倍作为模板，用于PCR反应，进行目标基因的检测或分型；
其中，所述细胞裂解液A、稳定液B采用权利要求1中所述的细胞裂解液A、稳定液B。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所采集的血液样本中含有抗凝剂，所述抗凝剂选自EDTA、肝素、柠檬酸钠中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括：将5μL血液样本加入到96孔板中，加入50μL细胞裂解液A，震混瞬离，室温振荡裂解10min；然后加入50μL稳定液B，震混瞬离，静置，取上清稀释10～20倍作为模板进行实时荧光定量PCR反应。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所检测的目标基因位于人2号染色体上，实时荧光定量PCR反应所用引物和探针的核苷酸序列分别如下：
引物：
chr2_2-F：5′-GGAGTTGTATGACGCTGG-3′
chr2_2-R：5′-AAGATGGATGCTGAGCTG-3′
探针1：5′-CACTCGCATTCACA-3′
探针2：5′-CGGCACTCACATT-3′
探针1、探针2分别带有不同的荧光基团和淬灭基团。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，PCR反应体系如下：2×RealFAST Probe No-ROX Mix 2.5μL，ROX Ⅰ 0.1μL，模板1，10μM chr2_2-F、chr2_2-R、探针1、探针2各0.2μL，不含核酸酶的水0.6μL。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，PCR反应程序如下：95℃5min；95℃10sec，
60℃20sec，40个循环；4℃保存。
9.根据权利要求3-8任一项所述的方法，其特征在于，血液样本中抗凝剂的浓度为1～
2mg/mL。

说明书全文

血液样本DNA提取 试剂盒及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种血液样本DNA提取试剂盒及其应用。

背景技术

[0002] 随着分子检测技术在育种领域中的应用普及，养殖场或育种场对生产性状关联SNP检测需求增多，目前生产中多采用提取血液DNA后进行PCR，随后对PCR产物电泳的方法进行SNP分型检测。该方法不仅在DNA提取过程中需要用到多种仪器，耗费大量人力、试剂、时间成本，且增加了检测区域PCR 气溶胶污染几率，影响了基因分型检测技术的广泛应用。

[0003] 基于目前市场上对快速获得DNA进行基因分型检测的需求，亟待开发一种能够快速从血液获得DNA以用于下游Taqman检测的方法，一步实现从血液到分型，降低成本，减少时间、人力和试剂消耗。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种血液样本DNA提取试剂盒及其应用。

[0005] 本发明技术原理如下：实现血液快速获取DNA，用于下游Taqman SNP检测需要实现血液DNA的快速简便获取，并克服血液裂解液或粗提DNA中杂质对PCR的抑制和荧光信号的淬灭。研究显示，常用的血液抗凝剂如EDTA、肝素、柠檬酸钠等都可以抑制PCR反应，直接裂解血液释放DNA用于后续PCR扩增的方法必须要消除血液中PCR抑制成分的影响，通过基因工程改造获得对PCR抑制剂高耐受性或热启动Taq酶，克服抑制成分的影响。本发明选用商品化的热启动Taq酶，并通过在血液裂解液中加入稳定液后，进行后续Taqman检测，使得由抗凝剂导致的PCR抑制得以消除。

[0006] 为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种血液样本DNA提取试剂盒，所述试剂盒包含细胞裂解液A和稳定液B；

[0007] 所述细胞裂解液A选自50～100mM Tris-HCl、50～75mM NaCl、0.5％～5％Triton X-100、50～100mM DTT中的至少一种；

[0008] 所述稳定液B选自10％～30％甘油、10％～25％DMSO、0.5％～5％Tween-20中的至少一种。

[0009] 优选地，细胞裂解液A成分为：50mM Tris-HCl、50mM DTT，稳定液B成分为：10％甘油、20％DMSO。

[0010] 第二方面，本发明提供所述试剂盒在DNA提取及基因检测中的应用。

[0011] 第三方面，本发明提供血液样本DNA提取及基因检测方法，所述方法包括：向采集的血液样本中加入样本10～30倍体积量的细胞裂解液A，25℃～35℃振荡混匀；然后，加入与细胞裂解液A等量的细胞裂解液B，25℃～35℃振荡混匀后静置，取上清用水稀释10～20倍作为模板，用于PCR反应，进行目标基因的检测或分型。所采集的血液样本中含有抗凝剂，所述抗凝剂为EDTA(1～2mg/ml)、肝素(10～12IU/ml)或草酸钾(2mg/ml)。

[0012] 在本发明的一个具体实施方式中，所述方法包括：将5μL血液样本加入到96孔板中，加入50μL细胞裂解液A，震混瞬离，室温振荡裂解10min；然后加入50μL稳定液B，震混瞬离，静置，取上清稀释10～20倍作为模板进行实时荧光定量PCR反应。

[0013] 所检测的目标基因位于人2号染色体上，编号为chr2-2的SNP位点。

[0014] 实时荧光定量PCR反应所用引物和探针的核苷酸序列分别如下(SEQ ID NO:1-4)：

[0015] 引物：

[0016] chr2_2-F：5′-GGAGTTGTATGACGCTGG-3′

[0017] chr2_2-R：5′-AAGATGGATGCTGAGCTG-3′

[0018] 探针1：5′-CACTCGCATTCACA-3′

[0019] 探针2：5′-CGGCACTCACATT-3′

[0020] 探针1、探针2分别带有不同的荧光基团(如VIC、FAM)和淬灭基团(BHQ1)。

[0021] 优选地，PCR反应体系如下：2×RealFAST Probe No-ROX Mix 2.5μL，ROXⅠ0.1μL，模板1，10μM chr2_2-F、chr2_2-R、探针1、探针2各0.2μL，不含核酸酶的水0.6μL。

[0022] RealFAST Probe No-ROX Mix来自北京擎科新业生物技术有限公司的2×T5Fast qPCR Mix(Probe)试剂盒。

[0023] 优选地，PCR反应程序如下：95℃5min；95℃10sec，60℃20sec，40个循环；4℃保存。

[0024] 前述的方法，血液样本中抗凝剂的浓度为1～2mg/ml。所述抗凝剂优选为EDTA、肝素、柠檬酸钠。

[0025] 借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

[0026] (一)本发明提供的从血液快速获取DNA用于下游Taqman基因分型方法适用于养殖场/育种场一个或多个位点的大规模现场快速检测需求，如猪繁殖力相关性状主效基因，如雌激素受体基因(ESR)、猪卵泡刺激素β亚基基因(FSHβ)，骨形态发生蛋白2(BMP2)、鸡的dw基因、母鸡产绿壳蛋基因等。

[0027] (二)本发明方法提取成本低，提取耗时10min左右，总检测耗时仅需60min左右，实现了大规模96孔板快提操作。相比常规DNA提取-PCR-电泳-成像方法，本方法优势明显：

[0028] 1、快速。血液或血卡裂解仅需10min左右，Taqman分型仅需50min左右，总耗时较常规提取方法减少50％以上。

[0029] 2、操作简单。室温下即可裂解释放DNA，无需额外加热；裂解体系涡旋混匀，无需离心。

[0030] 3、可批量。为便于现场大规模使用，优化扩容至96孔板操作。

[0031] 4、价格便宜。血液裂解、Taqman反应检测试剂成本远低于常规DNA提取-PCR-电泳-成像方法。

[0032] 5、仪器配套少。仅利用实时荧光定量PCR(qPCR)仪，无需依赖其他复杂仪器设备。

[0033] 6、兼容性广。对血液、血卡适用，且适用于不同物种的血液。附图说明

[0034] 图1为本发明实施例1中96孔板基因分型检测结果。

[0035] 图2为本发明实施例2中细胞裂解液A、稳定液B的优化结果。

[0036] 图3为本发明实施例3中抗凝剂为EDTA的血液样本Taqman分型结果。

[0037] 图4为本发明实施例3中抗凝剂为肝素的血液样本Taqman分型结果。

[0038] 图5为本发明实施例3中抗凝剂为草酸钾的血液样本Taqman分型结果。

[0039] 图中，Allele X：显性纯合子，Allele Y：隐性纯合子，Both：杂合子，NTC：未检测到分型，×：未检测到。

具体实施方式

[0040] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

[0041] 实施例1血液样本DNA提取及基因检测/分型方法

[0042] 本实施例提供的血液样本DNA提取及基因检测/分型方法，包括如下步骤：血液快速简易裂解，裂解液稀释为扩增模板，Taqman探针法分型鉴定。

[0043] 将从人体(96位受试者)采集的5μL血液样本(样本中抗凝剂为EDTA，浓度为1mg/ml)加入到96深孔板中，加入50μL细胞裂解液A，稍稍震混瞬离，室温振荡裂解10min；随后加入50μL稳定液B，震混瞬离。静置，取上清用水稀释10～20倍作为模板进行Taqman分型检测。

[0044] 细胞裂解液A成分为：50mM Tris-HCl、50mM DTT。

[0045] 稳定液B成分为：10％甘油、20％DMSO。

[0046] Taqman分型检测体系，所用反应体系及程序如下所示：

[0047] 反应体系:

[0048]试剂体系(5μL)/孔
RealFAST Probe No-ROX Mix(2×) 2.5μL
ROX Ⅰ 0.1μL
血液裂解液稀释样本 1μL
chr2_2-F(10μM) 0.2μL
chr2_2-R(10μM) 0.2μL
探针1(10μM) 0.2μL
探针2(10μM) 0.2μL
不含核酸酶的水 0.6μL
总体积 5μL

[0049] 反应程序:

[0050]

[0051] RealFAST Probe No-ROX Mix购自北京擎科新业生物技术有限公司的2×T5Fast qPCR Mix(Probe)试剂盒，包含PCR缓冲体系、PCR增强剂、热启动Taq DNA聚合酶等，用于快速PCR扩增反应。Taqman基因分型反应体系所用引物和探针由北京擎科新业生物技术有限公司合成，序列如下：

[0052] 检测位点：人2号染色体某SNP(Single Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性)位点，编号为chr2-2。

[0053] 引物：

[0054] chr2_2-F：5′-GGAGTTGTATGACGCTGG-3′

[0055] chr2_2-R：5′-AAGATGGATGCTGAGCTG-3′

[0056] 探针：

[0057] 探针1：5′-FAM-CACTCGCATTCACA-BHQ1-3′

[0058] 探针2：5′-VIC-CGGCACTCACATT-BHQ1-3′

[0059] 96孔板基因分型检测结果见图1。96个样本应用本发明方法检出率为100％，与常规提取法获得DNA相比，检出一致性为100％。Taqman分型聚类程度显示，VIC、FAM、杂合聚类区分明显。

[0060] 实施例2细胞裂解液A、稳定液B的优化

[0061] 细胞裂解液A成分为：50mL NaCl、0.5％Triton X-100，稳定液B成分为：10％甘油、0.5％Tween-20。对上述裂解液A和稳定液B的组合，测试其在血液(抗凝剂为EDTA浓度为
1mg/ml)样本中的应用。

[0062] 将从人体(24位受试者)采集的5uL血液样本(样本中抗凝剂EDTA浓度为1～2mg/ml)加入到96深孔板中，加入50uL细胞裂解液A，稍稍震混瞬离，室温振荡裂解10min；随后加入50uL稳定液B，震混瞬离。静置，取上清用水稀释10～20倍作为模板进行Taqman分型检测。

[0063] Taqman分型检测体系，所用反应体系及程序如下所示：

[0064] 反应体系:

[0065]试剂体系(5μL)/孔
RealFAST Probe No-ROX Mix(2×) 2.5μL
ROX Ⅰ 0.1μL
血液裂解液稀释样本 1μL
chr2_2-F(10μM) 0.2μL
chr2_2-R(10μM) 0.2μL
探针1(10μM) 0.2μL
探针2(10μM) 0.2μL
不含核酸酶的水 0.6μL
总体积 5μL

[0066] 反应程序:

[0067]

[0068] RealFAST Probe No-ROX Mix购自北京擎科新业生物技术有限公司的2×T5Fast qPCR Mix(Probe)试剂盒，包含PCR缓冲体系、PCR增强剂、热启动Taq DNA聚合酶等，用于快速PCR扩增反应。Taqman基因分型反应体系所用引物和探针由北京擎科新业生物技术有限公司合成，序列如下：

[0069] 检测位点：人2号染色体某SNP(Single Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性)位点，编号为chr2-2。

[0070] 引物：

[0071] chr2_2-F：5′-GGAGTTGTATGACGCTGG-3′

[0072] chr2_2-R：5′-AAGATGGATGCTGAGCTG-3′

[0073] 探针：

[0074] 探针1：5′-FAM-CACTCGCATTCACA-BHQ1-3′

[0075] 探针2：5′-VIC-CGGCACTCACATT-BHQ1-3′

[0076] Taqman分型结果见图2，该裂解液和稳定液组合处理后，聚类差，未获得有效分型。

[0077] 实施例3对不同种类抗凝剂血液样本的适用性

[0078] 分别测试实施例1中的细胞裂解液A和稳定液B组合对不同种类抗凝剂血液样本的适用性，裂解血液后进行Taqman基因分型检测。

[0079] 细胞裂解液A成分为：50mM Tris-HCl、50mM DTT；细胞裂解液B成分为：10％甘油、20％DMSO。

[0080] 将从人体(24位受试者)采集的5uL血液样本，抗凝剂分别为EDTA(1mg/ml)、肝素(10IU/ml)、草酸钾(2mg/ml)，加入到96深孔板中，加入50uL细胞裂解液A，稍稍震混瞬离，室温振荡裂解10min；随后加入50uL稳定液B，震混瞬离。静置，取上清用水稀释10倍作为模板进行Taqman分型检测。

[0081] Taqman分型检测体系，所用反应体系及程序如下所示：

[0082] 反应体系:

[0083]试剂体系(5μL)/孔
RealFAST Probe No-ROX Mix(2×) 2.5μL
ROX Ⅰ 0.1μL
血液裂解液稀释样本 1μL
chr2_2-F(10μM) 0.2μL
chr2_2-R(10μM) 0.2μL
探针1(10μM) 0.2μL
探针2(10μM) 0.2μL
不含核酸酶的水 0.6μL
总体积 5μL

[0084] 反应程序:

[0085]

[0086]

[0087] RealFAST Probe No-ROX Mix购自北京擎科新业生物技术有限公司的2×T5Fast qPCR Mix(Probe)试剂盒，包含PCR缓冲体系、PCR增强剂、热启动Taq DNA聚合酶等，用于快速PCR扩增反应。Taqman基因分型反应体系所用引物和探针由北京擎科新业生物技术有限公司合成，序列如下：

[0088] 检测位点：人2号染色体某SNP(Single Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性)位点，编号为chr2-2。

[0089] 引物：

[0090] chr2_2-F：5′-GGAGTTGTATGACGCTGG-3′

[0091] chr2_2-R：5′-AAGATGGATGCTGAGCTG-3′

[0092] 探针：

[0093] 探针1：5′-FAM-CACTCGCATTCACA-BHQ1-3′

[0094] 探针2：5′-VIC-CGGCACTCACATT-BHQ1-3′

[0095] 抗凝剂分别为EDTA(1mg/ml)、肝素(10IU/ml)、草酸钾(2mg/ml)，本发明细胞裂解液A和稳定液B适用于对分别含上述三种抗凝剂的血液样本，其裂解液的Taqman分型有效(图3～图5)。

[0096] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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