治疗性地触发靶组织中的先天性免疫应答
阅读：428发布：2021-05-12
专利汇可以提供治疗性地触发靶组织中的先天性免疫应答专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了 治疗 组合物，其呈现 哺乳动物 模式识别 受体(PRR)激动剂的人工库，以便PRR激动剂的模式概括了哺乳动物病原体的PRR激动剂特征的独特部分。所述PRR激动剂的人工库可在治疗媒介物中一起配制以用于组合呈现给驻留在哺乳动物宿主的靶组织中的先天性免疫细胞，并且所述媒介物适于将所述PRR激动剂递送给所述靶组织，以便调节免疫应答。，下面是治疗性地触发靶组织中的先天性免疫应答专利的具体信息内容。
1.免疫原性组合物治疗哺乳动物宿主的靶组织中的免疫失调的用途，其中所述组合物包含哺乳动物模式识别受体(PRR)激动剂的人工库，所述PRR激动剂概括了在所述靶组织中有致病性的微生物哺乳动物病原体的PRR激动剂特征的独特部分，所述PRR激动剂特征的独特部分不同于所述微生物哺乳动物病原体的任何原生PRR激动剂特征，其中所述哺乳动物PRR激动剂的人工库在治疗媒介物中一起配制以便于在向哺乳动物宿主施用之后进行组合呈现，并且所述组合物包含所述微生物哺乳动物病原体的组分，这些组分是至少5种独特哺乳动物PRR的激动剂，且其中所述组合物是用于调节所述靶组织中的先天性免疫应答。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述治疗媒介物包括重组微生物、所述重组微生物的细胞级分、微生物细胞的细胞级分、微粒或脂质体，其各自包含所述微生物哺乳动物病原体的组分，所述组分提供一起构成了PRR激动剂的所述人工库的PRR激动剂。
3.根据权利要求2所述的用途，其中所述重组微生物包含编码至少一种所述PRR激动剂的组分的重组基因。
4.根据权利要求2或3所述的用途，其中所述治疗媒介物包含所述重组微生物的完全灭活的或减毒的细胞。
5.根据权利要求2所述的用途，其中所述微生物细胞的所述细胞级分包括所述微生物哺乳动物病原体的分离的细胞级分。
6.如权利要求5所述的组合物，其中所分离的细胞级分是以下一种或多种：细菌外膜级分；细菌内膜级分；来自微生物细胞组分的梯度离心的沉淀；或染色体DNA。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的用途，其中所述PRR和所述相应的PRR激动剂选自由以下组成的组：
8.根据权利要求1至7中任一项所述的用途，其中所述靶组织和所述相应的微生物哺乳动物病原体选自由以下组成的组：
9.根据权利要求1至8中任一项所述的用途，其中所述治疗媒介物进一步包含以下一种或多种：GMCSF、维生素D、NOHA、α1抗胰蛋白酶、谷胱甘肽、类异戊二烯或α-半乳糖基神经酰胺。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的用途，其中所述治疗媒介物被配制用于向所述靶组织递送所述PRR激动剂。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的用途，其中所述哺乳动物宿主患有以所述靶组织中的所述免疫失调为特征的疾病或病状。
12.根据权利要求11所述的用途，其中所述疾病是癌症或炎性病症。
13.根据权利要求11所述的用途，其中所述疾病或病状是：寻常痤疮；急性播散性脑脊髓炎；急性出血性白质脑炎；阿狄森氏病；无丙种球蛋白血症；过敏症；斑形脱发；阿尔茨海默氏病；肌萎缩性侧索硬化；自身免疫性贫血、溶血性贫血；恶性贫血；强直性脊柱炎；抗GBM/TBM肾炎；抗磷脂综合征；抗合成酶综合征；颞动脉炎(亦称为“巨细胞性动脉炎”)；幼年型关节炎；牛皮癣性关节炎；反应性关节炎(莱特尔氏综合征，rea)；类风湿性关节炎；哮喘；
动脉粥样硬化；特异反应性过敏；特应性皮炎；自身免疫性肠病；自身免疫性再生障碍性贫血；白洛氏病/白洛氏同心性硬化；巴特综合征；贝切综合征；伯杰氏病；比克斯塔夫氏脑炎；
Blau综合征；慢性支气管炎；大疱性类天疱疮；粘液囊炎；自身免疫性心肌病；卡斯尔曼氏病；乳糜泻；慢性疲劳综合征；慢性炎性脱髓鞘多神经病；慢性复发性多灶性骨髓炎；丘-施综合征；瘢痕性类天疱疮；原发性胆汁性肝硬化；科根综合征；冷凝集素病；结肠炎；补体成分2缺乏症；混合性结缔组织病；未分化结缔组织病；COPD(慢性阻塞性肺病)；颅动脉炎；
CREST综合征；冷球蛋白血症；库兴氏综合征；皮肤白细胞破碎性血管炎；间质性膀胱炎；泪腺炎；迪戈氏病；德尔肯氏病；皮炎；疱疹样皮炎；自身免疫性孕酮性皮炎；皮肌炎；糖尿病；
肾原性尿崩症；1型糖尿病；弥漫型皮肤全身性硬化症；盘状红斑狼疮；憩室炎；德雷斯勒综合征；痛经(经期痉挛/疼痛)；湿疹；子宫内膜异位症；点炎症相关的关节炎；嗜酸细胞性筋膜炎；嗜酸细胞性肠胃炎；获得性大疱性表皮松解症；结节性红斑；原发性混合性冷球蛋白血症；伊文综合征；进行性肌肉骨化症；纤维肌痛；纤维化肺泡炎；萎缩性胃炎；胃肠类天疱疮；巨细胞性动脉炎；肾小球性肾炎；古德帕斯彻氏综合征；急性痛风；关节炎性痛风；格雷夫斯氏病；格林巴利综合征(GBS)；溶血性贫血；桥本氏脑炎；桥本氏甲状腺炎；自身免疫性溶血性贫血；亨-舍二氏紫癜；自身免疫性肝炎；病毒性肝炎；妊娠疱疹；低丙种球蛋白血症；
特发性炎性脱髓鞘疾病；特发性肺纤维化；Iga肾病；肠梗阻(肠阻塞)；包涵体肌炎；炎性肠病、克罗恩氏病；炎性肠病、溃疡性结肠炎；炎性脱髓鞘多神经病；自身免疫性内耳病；间质性膀胱炎；肠易激综合征(IBS)；幼年特发性关节炎；幼年型类风湿性关节炎；川崎病；肾结石；Lambert-Eaton肌无力综合征；白细胞破碎性血管炎；扁平苔癣；硬化性苔癣；线性iga病(LAD)；卢伽雷氏病(也称肌萎缩性侧索硬化)；狼疮样肝炎；狼疮；红斑狼疮；自身免疫性淋巴组织增生综合征；马吉德综合征；梅尼埃病；脑膜炎；显微镜下多血管炎；米-费综合征；硬斑病；穆-哈二氏病；多发性硬化症；多发性硬化症；重症肌无力；肌炎；包涵体肌炎；肾炎；肾病综合征；视神经脊髓炎(也称德维克病)；神经性肌强直；中性粒细胞减少症；由骨髓抑制性化疗引起的中性粒细胞减少症；眼部瘢痕性类天疱疮；眼部炎症(眼前部的急性和慢性非细菌性炎症)；眼球阵挛-肌阵挛综合征；Ord甲状腺炎；骨关节炎；佩吉特氏骨病；复发性风湿病；自身免疫性胰腺炎；PANDAS(与链球菌有关的小儿自身免疫性神经精神障碍)；副肿瘤性小脑变性；帕金森氏病；阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)；帕-罗二氏综合征；睫状体扁平部炎；帕-特二氏综合征；骨盆炎性疾病；天疱疮；寻常天疱疮；非风湿性心包炎；自身免疫性周围神经病；静脉周脑脊髓炎；POEMS综合征；结节性多动脉炎；复发性多软骨炎；自身免疫性多内分泌腺综合征；风湿性多肌痛；风湿性多肌痛；多发性肌炎；原发性硬化性胆管炎；进行性炎性神经病；慢性前列腺炎；假性痛风；牛皮癣；牛皮癣；纯红细胞再生障碍；坏疽性脓皮病；拉斯穆森氏脑炎；雷诺现象；莱特尔氏综合征；不宁腿综合征；早产儿视网膜病；腹膜后纤维化；风湿热；过敏性鼻炎；结节病；施密特综合征；施尼茨勒综合征；巩膜炎；硬皮病；
全身性硬化；肖格伦综合征；脊柱关节病；斯提耳氏病；亚急性细菌性心内膜炎(SBE)；苏萨克氏综合征；斯威特氏综合征；西登哈姆氏舞蹈病；交感性眼炎；高安氏动脉炎；颞下颌关节病(TMJD或TMD)或TMJ综合征；自身免疫性血小板减少性紫癜；特发性血小板减少性紫癜；
托-享综合征；移植排斥；横贯性脊髓炎；未分化脊柱关节病；荨麻疹；自身免疫性葡萄膜炎；
非风湿性瓣膜病；血管炎；白斑病和；或韦格纳氏肉芽肿病。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的用途，其中所述组合物是以有效调节选自由以下组成的组的生物标志物的量使用：PD1、PDL1、IP-10、MIG、RANTES、中性粒细胞、Ly6C单核细胞和NKG2D。
15.根据权利要求12所述的用途，其中所述组合物是以有效下调存在于所述靶组织中的细胞中的PD1和/或PDL1表达的量使用。
16.根据权利要求12或15所述的用途，其中所述治疗媒介物还包括癌抗原。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的用途，其中所述治疗媒介物还包括不是所述微生物哺乳动物病原体的组分的异源PRR激动剂。
18.根据权利要求1至15中任一项所述的用途，其中所述组合物是用于调节所述宿主中的适应性免疫应答。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的用途，其中所述治疗媒介物是用于在不是所述靶组织的施用部位处施用。
20.根据权利要求19所述的用途，其中所述施用部位是皮肤或皮下组织。
21.根据权利要求19所述的用途，其中所述施用部位是肠的部位。
22.根据权利要求19所述的用途，其中所述施用部位是非肠部位。
23.根据权利要求19所述的用途，其中所述施用部位是呼吸道。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的用途，其中所述治疗媒介物被配制以便在施用之后所述PRR激动剂的全身分布。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的用途，其中所述治疗媒介物在给药持续时间内以多个剂量施用，并且所述给药持续时间是至少两周。
26.根据权利要求25所述的用途，其中所述剂量是每天或每隔一天皮下施用。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的用途，其中所述宿主是人患者。
28.根据权利要求27所述的用途，其中所述患者是免疫抑制的或免疫受损的。
29.根据权利要求27或28所述的用途，其中所述患者是老年患者。
30.根据权利要求27或28所述的用途，其中所述患者是儿科患者。
31.一种治疗宿主的免疫失调的方法，所述方法包括向所述宿主施用有效量的如权利要求1至30中任一项所述的治疗媒介物以用于其中所述的用途。
32.一种药物制剂，其包含变栖克雷伯氏杆菌的细胞、细胞片段或细胞成分。
33.如权利要求32所述的药物制剂，其中所述变栖克雷伯氏杆菌是变栖克雷伯氏杆菌的致病菌株。
34.如权利要求32或33所述的制剂，其用于药物中。
35.如权利要求32至34中任一项所述的制剂，其用于治疗以免疫失调为特征的病状或加强治疗性免疫应答。
36.一种治疗受试者中的中性粒细胞减少症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如权利要求1至7中任一项所述的治疗媒介物。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述中性粒细胞减少症由骨髓抑制性化疗引起。
38.一种或多种致病性微生物物种的灭活或减毒微生物的制剂；或包含所述微生物物种的组分的细胞壁提取物、细胞膜提取物、全细胞提取物或PRR激动剂配制剂；其用于治疗受试者中由针对特定器官或组织的癌症的骨髓抑制性化疗引起的中性粒细胞减少症，其中所述制剂、细胞壁提取物、细胞膜提取物、全细胞提取物或PRR激动剂配制剂引发所述受试者中的免疫应答，且其中所述致病性微生物物种在健康受试者的相应特定器官或组织中是致病性的。
39.如权利要求38所述的制剂，其中所述癌症位于如权利要求8所述的靶组织中，且所述致病性微生物物种是如权利要求8所述的相应微生物哺乳动物病原体。
40.如权利要求38所述的制剂，其中，
所述癌症位于肾中且所述一种或多种致病性细菌种选自大肠杆菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、普罗威登斯菌属种、摩根氏菌属种和粪肠球菌；或
所述癌症位于肺中且所述一种或多种致病性细菌种选自肺炎链球菌、卡他莫拉菌、肺炎支原体、肺炎克雷伯氏杆菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎衣原体和嗜肺军团菌；
或
所述癌症位于骨中且所述致病性细菌种是金黄色葡萄球菌；或
所述癌症位于结肠中且所述一种或多种致病性细菌种选自脆弱拟杆菌、普通拟杆菌、多形拟杆菌、产气荚膜梭菌、艰难梭菌、大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和福氏志贺菌；或
所述癌症位于前列腺中且所述一种或多种致病性细菌种选自大肠杆菌、棒状杆菌属种、粪肠球菌和淋病奈瑟氏菌；或
所述癌症位于皮肤中且所述一种或多种致病性细菌种选自金黄色葡萄球菌、白喉棒杆菌、溃疡棒状杆菌和铜绿假单胞菌；或
所述癌症位于口腔中且所述一种或多种致病性细菌种选自产黑色素普氏菌、厌氧链球菌、绿色链球菌和放线菌属种；或
所述癌症位于睾丸中且所述一种或多种致病性细菌种选自大肠杆菌、肠炎沙门氏菌和金黄色葡萄球菌；或
所述癌症位于子宫中且所述一种或多种致病性细菌种选自脆弱拟杆菌、大肠杆菌、淋病奈瑟氏菌和沙眼衣原体；或
所述癌症位于卵巢中且所述一种或多种致病性细菌种选自脆弱拟杆菌、大肠杆菌、淋病奈瑟氏菌和沙眼衣原体；或
所述癌症位于阴道中且所述一种或多种致病性细菌种选自脆弱拟杆菌和大肠杆菌；或所述癌症位于乳腺中且所述致病性细菌种是金黄色葡萄球菌；或
所述癌症位于胆囊中且所述一种或多种致病性细菌种选自脆弱拟杆菌、普通拟杆菌、多形拟杆菌、产气荚膜梭菌、艰难梭菌、大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和福氏志贺菌；或
所述癌症位于膀胱中且所述致病性细菌种是大肠杆菌；或
所述癌症是与头或颈有关的淋巴瘤且所述一种或多种致病性细菌种选自白喉棒状杆菌、溃疡棒状杆菌、溶血隐秘杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、产黑色素普氏菌、厌氧链球菌、绿色链球菌和放线菌属种；或
所述癌症是与胸部有关的淋巴瘤且所述一种或多种致病性细菌种选自肺炎链球菌、卡他莫拉菌、肺炎支原体、肺炎克雷伯氏杆菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎衣原体和嗜肺军团菌；或
所述癌症是与腹腔有关的淋巴瘤且所述一种或多种致病性细菌种选自脆弱拟杆菌、普通拟杆菌、多形拟杆菌、产气荚膜梭菌、艰难梭菌、大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、福氏志贺菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、普罗威登斯菌属种、摩根氏菌属种和粪肠球菌；或
所述癌症是与腋窝或腹股沟区有关的淋巴瘤且所述一种或多种致病性细菌种选自金黄色葡萄球菌、白喉棒杆菌、溃疡棒状杆菌和铜绿假单胞菌。
41.一种预测哺乳动物受试者具有受益于用包含PRR激动剂的抗原性配制剂的治疗的增加的可能性的程度的方法，所述方法包括就基因组多态性对从所述患者分离的样品进行筛选，所述基因组多态性是诊断性SNP或与所述诊断性SNP处于遗传连锁不平衡，其中如果所述诊断性SNP包含响应等位基因，那么所述受试者具有受益于所述治疗的增加的可能性，且其中所述诊断性SNP和所述相应的响应等位基因是以下一个或多个：
42.如权利要求41所述的方法，其中所述受试者是人患者。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述患者患有以免疫失调为特征的疾病。
44.如权利要求42所述的方法，其中所述患者患有IBD。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述IBD是克罗恩氏病。
46.如权利要求44所述的方法，其中所述IBD是溃疡性结肠炎。
47.如权利要求44所述的方法，其中所述IBD是胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、改道性结肠炎、白塞氏综合征或未定型结肠炎。
48.如权利要求41至47中任一项所述的方法，其中使用包含PRR激动剂的抗原性配制剂的所述治疗是部位特异性免疫疗法(SSI)。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述SSI包括使用一种或多种致病性微生物物种的灭活或减毒微生物的制剂；或包含所述微生物物种的组分的细胞壁提取物、细胞膜提取物、全细胞提取物或PRR激动剂配制剂；其用于治疗受试者的特定器官或组织中的免疫功能障碍，其中所述制剂、细胞壁提取物、细胞膜提取物、全细胞提取物或PRR激动剂配制剂引发所述受试者中的免疫应答，且其中所述致病性微生物物种在健康受试者的相应特定器官或组织中是致病性的。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述免疫功能障碍位于如权利要求8所述的靶组织中，且所述致病性微生物物种是如权利要求8所述的相应微生物哺乳动物病原体；任选地其中所述免疫功能障碍是IBD、或克罗恩氏病或溃疡性结肠炎，且所述致病性微生物物种是大肠杆菌。
51.如权利要求41至48中任一项所述的方法，其中所述抗原性配制剂包含如权利要求1至7中任一项所述的治疗媒介物。
52.如权利要求41至51中任一项所述的方法，其中所述基因组多态性在所述诊断性SNP的1Mbp内、或500Kbp内、或100kbp内。
53.如权利要求41至52中任一项所述的方法，其中所述受试者对于所述响应等位基因而言是纯合的。
54.如权利要求41至52中任一项所述的方法，其中所述患者对于所述响应等位基因而言是杂合的。
55.如权利要求41至54中任一项所述的方法，其中所述基因组多态性与所述诊断性SNP处于连锁不平衡，其中r-平方值大于0.8或大于0.9。
56.根据权利要求1至30中任一项所述的用途，还包括测试所述宿主的连接到一个或多个与IBD有关的SNP上的遗传标志物。
57.根据权利要求56所述的用途，其中所述SNP是以下一个或多个：rs1748195、rs34856868、rs11583043、rs6025、rs10798069、rs7555082、rs11681525、rs4664304、rs3116494、rs7556897、rs111781203、rs35320439、rs113010081、rs616597、rs724016、rs2073505、rs4692386、rs6856616、rs2189234、rs395157、rs4703855、rs564349、rs7773324、rs13204048、rs7758080、rs1077773、rs2538470、rs17057051、rs7011507、rs3740415、rs7954567、rs653178、rs11064881、rs9525625、rs3853824、rs17736589、rs9319943、rs7236492、rs727563、rs17391694、rs6679677、rs3897478、rs9286879、rs1728918、rs10865331、rs6716753、rs12994997、rs6837335、rs13126505、rs10065637、rs7702331、rs17695092、rs12663356、rs9264942、rs9491697、rs13204742、rs212388、rs10486483、rs864745、rs7015630、rs6651252、rs3764147、rs16967103、rs2066847、rs2945412、rs2024092、rs4802307、rs516246、rs2284553、rs10797432、rs6426833、rs2816958、rs1016883、rs17229285、rs9847710、rs3774959、rs11739663、rs254560、rs6927022、rs798502、rs4722672、rs4380874、rs4728142、rs483905、rs561722、rs28374715、rs11150589、rs1728785、rs7210086、rs1126510、rs6088765、rs6017342、rs12103、rs35675666、rs12568930、rs11209026、rs2651244、rs4845604、rs670523、rs4656958、rs1801274、rs2488389、rs7554511、rs3024505、rs6545800、rs925255、rs10495903、rs7608910、rs6740462、rs917997、rs2111485、rs1517352、rs2382817、rs3749171、rs4256159、rs3197999、rs2472649、rs7657746、rs2930047、rs11742570、rs1363907、rs4836519、rs2188962、rs6863411、rs11741861、rs6871626、rs12654812、rs17119、rs9358372、rs1847472、rs6568421、rs3851228、rs6920220、rs12199775、rs1819333、rs1456896、rs9297145、rs1734907、rs38904、rs921720、rs1991866、rs10758669、rs4743820、rs4246905、rs10781499、rs12722515、rs1042058、rs11010067、rs2790216、rs10761659、rs2227564、rs1250546、rs6586030、rs7911264、rs4409764、rs907611、rs10896794、rs11230563、rs4246215、rs559928、rs2231884、rs2155219、rs6592362、rs630923、rs11612508、rs11564258、rs11168249、rs7134599、rs17085007、rs941823、rs9557195、rs194749、rs4899554、rs8005161、rs17293632、rs7495132、rs529866、rs7404095、rs26528、rs10521318、rs3091316、rs12946510、rs12942547、rs1292053、rs1893217、rs7240004、rs727088、rs11879191、rs17694108、rs11672983、rs6142618、rs4911259、rs1569723、rs913678、rs259964、rs6062504、rs2823286、rs2836878、rs7282490、rs2266959、rs2412970、rs2413583、rs2641348、rs7517810、rs1260326、rs7438704、rs10061469、rs2503322、rs5743289、rs6667605、rs1440088、rs3774937、rs477515、rs1182188、rs17780256、rs11083840、rs3766606、rs13407913、rs6708413、rs2457996、rs10051722、rs4976646、rs7746082、rs38911、rs13277237、rs2227551、rs7097656、rs12778642、rs11229555、rs174537、rs568617、rs2226628、rs566416、rs11054935、rs3742130、rs1569328、rs2361755、rs3091315、rs1654644、rs4243971、rs6087990、rs6074022、rs5763767。
58.一种治疗患有免疫功能障碍的受试者的方法，所述方法包括进行如权利要求41至
55中任一项所述的方法，或请求所述方法的结果，以及如果所述受试者具有受益于所述治疗的增加的可能性，那么施用有效量的所述抗原性配制剂。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述患者是抗TNFα初次使用的患者。
60.一种诊断或保险范围筛选的方法，所述方法包括请求诊断测定的结果，所述诊断测定包括如权利要求41至55中任一项所述的方法。
61.包含PRR激动剂的抗原性配制剂用于治疗受试者的用途，其中在治疗之前发现所述受试者具有受益于通过如权利要求41至57中任一项所述的方法的所述治疗的增加的可能性。
62.一种鉴别适于用包含PRR激动剂的抗原性配制剂治疗的受试者或将受试者从所述治疗中排除的方法，所述方法包括确定所述受试者是否具有受益于通过如权利要求41至57中任一项所述的方法的所述治疗的增加的可能性。
63.一种用于预测哺乳动物受试者具有受益于用包含PRR激动剂的抗原性配制剂的治疗的增加的可能性的程度的试剂盒，所述试剂盒包括用于就基因组多态性对从所述患者分离的样品进行筛选的试剂，所述基因组多态性是诊断性SNP或与所述诊断性SNP处于遗传连锁不平衡，其中如果所述诊断性SNP包含响应等位基因，那么所述受试者具有受益于所述治疗的增加的可能性，且其中所述诊断性SNP和所述相应的响应等位基因如权利要求41中所阐述。
64.如权利要求63所述的试剂盒，其中用于筛选的所述试剂是对所述基因组多态性有特异性的探针或引物。
65.如权利要求48所述的方法，其中所述SSI包括衍生自大肠杆菌的PRR激动剂的配制剂。
66.如权利要求41至65中任一项所述的方法，其中所述诊断性SNP、所述相应的响应等位基因和所述基因组多态性的基因组位置是以下一个或多个：
67.如权利要求41至65中任一项所述的方法，其中所述受试者患有克罗恩氏病，且所述诊断性SNP、所述相应的响应等位基因和所述基因组多态性的基因组位置是以下一个或多个：
68.如权利要求41至65中任一项所述的方法，其中所述受试者患有溃疡性结肠炎，且所述诊断性SNP、所述相应的响应等位基因和所述基因组多态性的基因组位置是以下一个或多个：
69.一种用于测定患有炎性肠病的人患者的SSI治疗的功效的体外方法，所述方法包括体外测定来自接受治疗的所述患者的样品中IL-18、IP-10、IFNγ、IL-12P70、IL-17A和TGFα中的一个或多个的水平。
70.如权利要求69所述的方法，其中所述SSI包括用包含衍生自大肠杆菌的PRR激动剂的配制剂的治疗。
71.一种预测哺乳动物受试者具有受益于用包含PRR激动剂的抗原性配制剂的治疗的增加的可能性的程度的方法，所述方法包括筛选从所述患者分离的样品的Eotaxin 1、GROα、IL-10、PDGF AA和RANTES中的一个或多个的水平。
72.如权利要求71所述的方法，其中如果Eotaxin 1的水平低于预定阈值水平，那么所述受试者具有受益于所述治疗的增加的可能性。
73.如权利要求71或72所述的方法，其中所述抗原性配制剂包含如权利要求1至10中任一项所述的治疗媒介物。
治疗性地触发靶组织中的先天性免疫应答
技术领域
背景技术
[0002] 越来越认识到免疫失调(即免疫应答与免疫耐受之间的失衡)不仅是过敏和自身免疫性疾病中的主要因素，而且其还在以下广泛多种病理状况中具有潜在机理作用，包括癌症(参见Mills等人,2016,Cancer Res；76(3)；1–4)、代谢疾病(肥胖症、糖尿病)、变性疾病(阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩性侧索硬化、骨质疏松症)、呼吸和心血管疾病(参见Immune Rebalancing,第1版:The Future of Immunosuppression,2016,Boraschi和Penton-Rol编著,Academic Press)。
[0003] 在脊椎动物中，免疫调控的一个重要方面涉及先天性免疫系统和适应性免疫系统的协同活动。此协同活动涉及免疫细胞内的代谢、酶促和分子遗传变化，由此协调细胞、细胞因子和趋化因子通信途径的精巧系统，此系统介导这些补体系统的不同组分的协调活动(参见Iwasaki和Madzhitov,2015,Nature Immunology 16:343-353；WO0209748；WO03051305；Turner等人,2014,BBA-Molecular Cell Research 1843:11 2563-2582)。此协调活动的一个方面在于以下认识：先天性免疫系统的模式识别受体(PRR)的配体可用作疫苗佐剂以改善适应性免疫应答(参见Maisonneuve等人,2014,PNAS111(34),12294-9；
WO2007035368)。
WO2007035368)。
[0004] 涉及B细胞受体和T细胞受体对特定抗原的识别的免疫记忆是适应性免疫系统的长期的识别和主要特征，并且是疫苗功效的基础(参见Nature Immunology,Focus on immunological memory:2011年6月,第12卷第6期第461-575页)。先天性免疫记忆是近年来认识到且不太了解的免疫系统的特征(参见Netea等人,2015,Nature Immunology 16,675-679；及Bordon,2014,Nature Reviews Immunology 14,713)。
[0005] 了解到广泛多种先天性和适应性免疫细胞驻留在非淋巴组织中，其在组织动态平衡中发挥不同作用(参见Nature Immunology,Focus on tissue-resident leukocytes,2013年10月,第14卷第10期第977-1100页)。此动态平衡的复杂性在以下观察中是明显的：
甚至组织驻留的免疫细胞的个体发生在一些情况下也可不同于并非组织驻留的相似免疫细胞的个体发生(Italiani和Boraschi,Frontiers in Immunology,2014年10月,第5卷,第
514条)。
发明内容
甚至组织驻留的免疫细胞的个体发生在一些情况下也可不同于并非组织驻留的相似免疫细胞的个体发生(Italiani和Boraschi,Frontiers in Immunology,2014年10月,第5卷,第
514条)。
发明内容
[0006] 提供了构成哺乳动物模式识别受体(PRR)激动剂的人工库的免疫调节性或免疫原性组合物。选择PRR激动剂库以使得其实际上概括微生物病原体(且更具体地说，在选定的靶组织中有致病性的病原体)的PRR激动剂特征的独特部分。PRR激动剂特征在以下意义上讲是独特的：其不同于在靶组织中无致病性的微生物的PRR激动剂特征；并且其在以下意义上讲也是独特的：其不同于野生型病原体的原生PRR激动剂特征。PRR激动剂的这个独特人工库随后可被配制以使得PRR激动剂共同存在于治疗媒介物中，例如以便于PRR激动剂库可以组合形式存在。治疗媒介物可例如是重组微生物、微生物细胞的细胞级分、微粒或脂质体。组合物可例如包含至少最小数目的独特哺乳动物PRR(例如至少5个)的微生物激动剂，如本文中更详细地描述。媒介物可随后例如全身递送，以使得PRR激动剂库呈现给宿主(如哺乳动物宿主)的靶组织中驻留的先天性免疫细胞。治疗媒介物可例如聚集PRR激动剂的人工库，以使得多个PRR激动剂的邻近性在宿主中的全身分布期间得以保持。此类组合物可用于治疗广泛多种以免疫失调为特征的疾病，包括肿瘤疾病和自身免疫性疾病。
[0007] 创新的方面涉及免疫原性组合物在治疗哺乳动物宿主的靶组织中的免疫失调的方法中的用途，其中所述组合物包含哺乳动物PRR的上述人工库。PRR激动剂的人工库可在治疗媒介物中一起配制以便在向哺乳动物宿主施用之后进行组合呈现。组合物可例如包含微生物哺乳动物病原体的组分，它们是所选数目的独特哺乳动物PRR的激动剂(如下文中更详细地论述)，例如至少5个。组合物可例如适合用于调节靶组织中的先天性免疫应答。治疗媒介物可例如包括重组微生物、重组微生物的细胞级分、微生物细胞的细胞级分、微粒或脂质体，其各自包含微生物哺乳动物病原体的组分，这些组分提供共同构成PRR激动剂的人工库的PRR激动剂。重组微生物可例如包含编码至少一种PRR激动剂的组分的重组基因。在选择的方面中，治疗媒介物可例如包含重组微生物的全灭活或减毒细胞。或者，可使用微生物哺乳动物病原体的细胞级分，例如，细菌外膜级分；细菌内膜级分；来自微生物细胞组分的梯度离心的沉淀；或染色体DNA。治疗媒介物可例如被配制以用于向靶组织递送PRR激动剂。
[0008] 在选择的实施方案中，PRR和相应的PRR激动剂可例如选自由以下组成的组：
[0009]
[0010]
[0011]
[0012] 治疗媒介物可例如包括另外的治疗部分，如以下一种或多种：GMCSF、维生素D、NOHA、α1抗胰蛋白酶、谷胱甘肽、类异戊二烯或α-半乳糖基神经酰胺。在替代实施方案中，治疗媒介物进一步包括抗原，如癌抗原。或者，治疗媒介物可进一步包括异源PRR激动剂，如不是微生物哺乳动物病原体的组分的PRR激动剂。
[0013] 治疗的受试者如哺乳动物宿主或人患者可例如患有以靶组织中的免疫失调为特征的疾病或病状，如癌症或炎性病症。
[0014] 组合物可适于以有效调节例如以下一个或多个生物标志物的量使用；PD1、PDL1、IP-10、MIG、RANTES、中性粒细胞、Ly6C单核细胞和NKG2D。在选择的实施方案中，组合物可例如适合以有效下调靶组织中存在的细胞中的PD1和/或PDL1表达的量使用。组合物可因此适合用于调节宿主中的适应性免疫应答，例如伴随先天性免疫应答的调节。
[0015] 治疗媒介物是供在不是靶组织的施用部位处施用，并且所述部位可以是例如皮肤、皮下组织、呼吸道。施用可以是肠溶性或非肠溶性的。治疗媒介物可被配制以便于在局部施用部位处施用之后PRR激动剂的全身分布。治疗媒介物可在给药持续时间上以多个剂量施用，并且所述给药持续时间可以是例如至少两周，或本文所公开或本领域中已知的任何其它宽的给药方案范围。
[0016] 在选择的实施方案中，根据本发明治疗的人患者可以是例如免疫抑制的或免疫受损的，或者可以是老年或儿科患者。
[0018] 图1是根据本发明的一方面的部位特异性免疫疗法(SSI)的示意性时间轴，其示出了在第-31天肺炎克雷伯氏杆菌(KPN)全灭活细胞SSI的气管内(IT)滴注、以及从第-10天开始每隔一天的SSI或盐水(安慰剂)的皮下(SQ)注射，其中在第0天进行静脉内(IV)Lewis肺癌(LLC)施用，继之在第18天处死(sac)。
[0019] 图2是示出了替代的SSI配制剂在鼠科癌症模型中的治疗功效的图。
[0020] 图3是示出了SSI介导的抗肿瘤功效的鼠科预感染模型的示意性时间轴。
[0021] 图4是示出了在鼠科Lewis肺癌(LLC)癌症模型中预感染之后SSI的抗癌功效的图。
[0022] 图5是示出了替代的SSI疗法在鼠科B16皮肤癌模型中的肿瘤体积随时间变化的线图。10X QBSAU和1X QBSAU在本文中分别表示为QBSAUR和QBSAU。
[0023] 图6是示出了替代的SSI疗法在鼠科B16皮肤癌模型中在第7天的肿瘤体积的条形图。
[0024] 图7是示出了替代的SSI疗法在鼠科B16皮肤癌模型中在第8天的肿瘤体积的条形图。
[0025] 图8是示出了替代的SSI疗法在鼠科B16皮肤癌模型中在第10天的肿瘤体积的条形图。
[0026] 图9是示出了替代的SSI疗法在鼠科B16皮肤癌模型中在第12天的肿瘤体积的条形图。
[0027] 图10是示出了替代的SSI疗法在鼠科B16皮肤癌模型中在第14天的肿瘤体积的条形图。
[0028] 图11是示出了SSI施用方案的示意图(上图)和示出了SSI在鼠科癌症模型中的治疗功效的条形图(下图)。
[0029] 图12是示出了各种SSI共配制剂在鼠科癌症模型中的功效的图表。
[0030] 图13是各种SSI共配制剂在鼠科癌症模型中的功效的替代条形图表示。
[0031] 图14是示出了SSI治疗在结肠炎模型的替代模型动物中的功效的一系列图：对数Y轴刻度，示出了IFN-γ(A)和IL-17A表达(B)的相对水平、及IL-17A表达的累积数据(C)、以及在增加结肠组织中的IL-18基因表达方面QBECO与QBKPN相比的功效的部位特异性证据(D)。
[0032] 图15是示出了SSI治疗在结肠炎模型的替代模型动物中的功效的一系列图：微生物组(A和B)及组织学(C)。
[0033] 图16是示出了SSI在鼠科哮喘/过敏症模型中的功效的条形图。
[0034] 图17包括两个条形图，示出了SSI在鼠科哮喘/过敏症模型中的功效，显示了A)嗜酸性粒细胞、B)淋巴细胞的计数。
[0035] 图18包括两个条形图，示出了SSI在鼠科哮喘/过敏症模型中的功效，显示了A)IL-4和B)IL-5浓度。
[0036] 图19是示出了在第三次SQ SSI注射之后24小时在器官(心脏、肺和脾)中测量的Cy5.5标记的KPN SSI(QBKPN)的离体成像结果的条形图。
[0037] 图20是示出了在用安慰剂或QBKPN治疗下，盐水或HDM暴露之后的室内尘螨(HDM)特异性IgE应答的条形图。
[0038] 图21是示出了针对来自动物模型的哮喘的抗炎SSI治疗的方面的一系列条形图(A-E)，尤其是在用安慰剂或QBKPN SSI治疗的盐水或HDM暴露小鼠中的BAL细胞计数和分类。
[0039] 图22包括两个条形图，示出了针对来自动物模型的哮喘的抗炎SSI治疗的方面，尤其是与嗜曙红细胞增多有关的血清(A)和BAL(B)介质。
[0040] 图23是一系列条形图，示出了针对来自动物模型的哮喘的抗炎SSI治疗的方面，尤其是在HDM暴露和QBPKN治疗之后的Th1(A)和Th2(B和C)肺基因表达。
[0041] 图24是一系列条形图，示出了针对来自动物模型的哮喘的抗炎SSI治疗的方面，尤其是HDM暴露和QBKPN治疗对Th1-(A-C)和Th2-(D-F)介导的BAL液细胞因子水平的影响。
[0042] 图25是示出了针对来自动物模型的哮喘的抗炎SSI治疗的方面的图，尤其是显示总细胞因子谱的部分归一化的BAL细胞因子的主成分分析(PCA)。
[0043] 图26是示出了针对来自动物模型的哮喘的抗炎SSI治疗的方面的条形图，尤其示出了在HDM暴露和QBPKN治疗之后的气道杯状细胞定量。
[0044] 图27A是示出了针对来自动物模型的COPD的抗炎SSI治疗的方面的条形图，尤其是BAL细胞分类。图27B反映了这些数据，其显示KPN SSI干预削弱了香烟烟雾暴露诱导的肺巨噬细胞和淋巴细胞中而不是总细胞或中性粒细胞的增加。图27B示出了在过滤后的空气或香烟烟雾暴露组中在安慰剂和KPN SSI治疗之后的BAL细胞计数和分类：(a)BAL总细胞，(b)淋巴细胞，(c)巨噬细胞，及(d)中性粒细胞。将各组与对照相比，*p<0.05；将KB组与安慰剂对照相比，#p<0.05。数据是每组9-10只小鼠的平均值±SD。
[0045] 图28A-D：图28A示出的数据显示KPN SSI干预削弱了香烟烟雾暴露诱导的Th1倾向的肺炎性应答的增强，如下。在过滤的空气或香烟烟雾暴露组中在安慰剂和KB治疗之后的BAL上清液分析。(a)IFNγ，(b)CXCL9，(c)CXCL10，(d)CCL5，(e)IL-6，(f)G-CSF，(g)CXCL1，(h)IL-17。将各组与对照相比，*p<0.05；将KPN SSI组与安慰剂对照相比，#p<0.05。数据是每组10只小鼠的平均值±SD。图28B提供的数据显示KPN SSI干预差异性地调节血清免疫介质中香烟烟雾暴露诱导的变化，如下。在过滤的空气或香烟烟雾暴露组中在安慰剂和KPN治疗之后的血清分析：(a)VEGF，(b)IL-1β，(c)CCL2，(d)CXCL9，(e)CXCL10，及(f)CCL5。将各组与对照相比，*p<0.05；将KB组与安慰剂对照相比，#p<0.05。数据是每组9-10只小鼠的平均值±SD。图28C提供的数据显示KPN SSI干预增加血液和肺的Ly6CHI单核细胞和中性粒细胞，如下。在过滤的空气或香烟烟雾暴露组中在安慰剂和KB治疗之后的血液(a-b)和肺(c-d)Ly6CHI单核细胞和中性粒细胞的流式细胞分析。将各组与对照相比，*p<0.05。将KB组与安慰剂对照相比，#p<0.05。数据是每组10只小鼠的平均值±SD。图28D是系列条形图(A-C)，示出了针对来自动物模型的COPD的抗炎SSI治疗的方面，尤其是所选肺基因表达图谱。
[0046] 图29是一系列条形图(A-G)，其示出了针对来自动物模型的COPD的抗炎SSI治疗的方面，尤其是所选BAL细胞因子表达图谱。
[0047] 图30是一系列条形图(A-C)，其示出了针对来自动物模型的COPD的抗炎SSI治疗的方面，尤其是血清细胞因子表达图谱。
[0048] 图31是示出了使用变栖克雷伯氏杆菌(Klebsiella varicola)SSI在转移至肺的B16黑素瘤模型中降低的肿瘤负荷的条形图。
[0049] 图32是条形图，示出了QBKPN SSI在CD25阳性细胞不存在下减轻肺结节的功效。
[0050] 图33包括三个条形图：图33A是条形图，示出了与转移至肺的B16黑素瘤模型中施用的KPN SSI配制剂(QBKPN)有关的δCt(循环阈值)值，其中对KPN SSI进行连续稀释(10x、100x和1000x)。δCt值与样品中的靶核酸量成反比。如所示，肿瘤负荷随SSI稀释度的增加而增加。图33B是条形图，示出了如通过肺中的B16肿瘤结节数量所量度的KPN SSI的相似剂量依赖性作用。图33C是条形图，示出了提供治疗效果的多种给药方案，其中注射之间的间隔时间范围在1至7天，全部都提供治疗效果。
[0051] 图34包括两个条形图，示出了表达Rae-1的细胞比例与转移至肺的B16黑素瘤模型中的肿瘤负荷成反比(A)并且这依赖于NKG2D表达(B)。
[0052] 图35是条形图，显示QBKPN SSI在Lewis肺癌(LLC)-RFP模型中在减轻肺中的肿瘤结节方面提供明显更强的作用。
[0053] 图36是条形图，示出了在用LLC接种之后第15天时肺中LLC-RFP细胞数量的伴随减少。
[0054] 图37是显示QBECO SSI在MC38结肠癌模型中赋予比QBKPN或QBSAU更大的存活优势的线图。
[0055] 图38是条形图，显示用QBKPN SSI而不是10X QBSAU治疗的小鼠在皮肤和肺肿瘤模型中展现增加的肺特异性Rae-1表达。
[0056] 图39是条形图，示出了在皮肤和肺肿瘤模型中与安慰剂治疗小鼠相比QBKPN治疗小鼠的肺中的减少的PD-1表达。
[0057] 图40是条形图，显示用10X QBSAU而不是QBKPN治疗的小鼠在B16皮肤和肺肿瘤模型中展现与安慰剂对照相比皮肤肿瘤负荷的降低。
[0058] 图41是条形图，显示静脉内(IV)SSI和皮下(SQ)SSI治疗在B16肺转移模型中都提供治疗益处。
[0060] 图43包括4个条形图，示出了QBKPN在B16肺癌模型中治疗和预防癌症的功效。
[0061] 图44是条形图，示出了QBKPN在B16肺癌模型中治疗和预防癌症的功效的方面。
[0062] 图45是条形图，示出了SSI疗法如何快速地产生涉及骨髓细胞群(特别是中性粒细胞)的可检测的治疗效果的方面。
[0063] 图46是条形图，示出了SSI疗法如何快速地产生涉及骨髓细胞群(特别是Ly6C单核细胞)的可检测的治疗效果的方面。
[0064] 图47是示出了替代细胞级分在肺中B16黑素瘤模型中的功效的一系列图，包括剂量依赖性和部位特异性功效。图47A包括三个条形图，示出了1X和0.01X KPN外膜级分(i)都是有效的，呈剂量依赖性方式，其中1X级分具有与全灭活细胞配制剂相当的功效，1X和4X DNA级分也一样(ii)，而内膜级分显示了缺乏强统计显著性的剂量依赖性趋势(iii)。图47B是示出了外膜SSI的10次注射之后的结果的条形图，显示外膜级分以剂量依赖性方式增加Rae-1表达。图47C包括两个条形图，示出了在肿瘤植入之前2天收集的血液中，在QBKPN SSI、安慰剂或各种浓度的OM级分(0.01X、1X、10X或20X)的4次注射之后中性粒细胞和单核细胞的血细胞计数的OM剂量依赖性升高。图47D是一列散点图，示出了在B16肺癌模型中KPN级分与大肠杆菌级分相比的部位特异性功效。
[0065] 图48是条形图，示出了QBKPN SSI在24小时杀伤测定中在高剂量(1/20、1/200稀释度)下增加NCI-H358癌细胞死亡。
[0066] 图49是条形图，示出了KPN SSI在24小时细胞杀伤测定中在替代剂量(1/20稀释度、1/200稀释度)下增强NCI-H358癌细胞的γδT细胞介导的杀伤。
[0067] 图50是条形图，示出了KPN SSI(QBKPN)在24小时细胞杀伤测定中在1/200和1/2000稀释度下增强唑来膦酸盐在诱导γδT细胞介导的癌细胞溶解中的作用。
[0068] 图51是示出了QBECO SSI在MC-38结肠癌模型中的治疗功效的线图。
[0069] 图52是示出了在使用NKG2D敲除小鼠的MC-38结肠癌模型中NKG2D表达与QBECO功效有关的线图。
[0070] 图53是模型中性粒细胞减少症系统中的治疗方案的示意图。
[0071] 图54是一系列描绘了中性粒细胞减少症模型中的流式细胞术结果的4个图，示出了对活的CD45+CD11b+细胞设门的来自肺样品的特定细胞群的计数。
[0072] 图55包括两列散点图，其示出了在中性粒细胞减少症模型中的肺样品中的中性粒细胞的比例(A)和数量(B)。
[0073] 图56包括两个图，其示出了在中性粒细胞减少症模型中的脾脏样品中的中性粒细胞的比例(A)和数量(B)。
[0074] 图57是条形图，示出了具有来自被分成肿瘤患者群和肿瘤出现前的患者群的肺癌患者的血液样品中的所示特征的细胞的比例，显示出在肿瘤患者群中与肿瘤出现前的患者相比PDL1和PD1表达的增加。
[0075] 图58是条形图，示出了具有来自被分成肿瘤患者群和肿瘤出现前的患者群的肺癌患者的血液样品中的所示特征的细胞的相对数量，显示出在肿瘤患者群中与肿瘤出现前的患者相比PDL1和PD1表达的增加。
[0076] 图59包括两个条形图，示出了在以下两类患者中在以下时间下赘生性肺癌中PD-L1表达的SSI介导的减少：患者01-001(图A)和患者01-002(图B)，第1周，第4天(W1D4)；第1周，第5天(W1D5)；第2周(W2)、第4周(W4)、第12周(W12)和第16周(W16)。
[0077] 图60包括两个条形图，示出了在以下两类赘生性肺癌患者中PD-1表达的SSI介导的减少：患者01-001(图A)和患者01-002(图B)。
[0078] 图61包括两个条形图，示出了在以下两类赘生性肺癌患者中M1巨噬细胞比例的增加：患者01-001(图A)和患者01-002(图B)。
[0079] 图62包括两个条形图，示出了在用不同QBKPN剂量的B16接种小鼠的肺中(A)GzmA、GzmB、Prf1和(B)Tyr的RT-qPCR倍数变化。数据点是平均值+/-SD。使用单向Tukey’s多重比较ANOVA检验计算显著性。**p<0.01，***p<0.001和****p<0.0001。
[0080] 图63包括三个条形图，示出了在QBECO或QBKPN刺激之后在HEK细胞中的模式识别受体的激活，分别显示如下：A)如通过NK-κB激活所测量的Toll样受体(TLR)激活；B)如通过NK-κB激活所测量的NOD2和C型凝集素受体(CTL)；以及C)如通过IRF3激活所测量的RLR(Rig-1样受体)。
[0081] 图64是PRR库指纹条形图，其中针对来自减去阴性对照数据之后的1/10稀释度数据的QBECO和QBKPN SSI构建PRR指纹。条柱依次代表TLR2、3、4、5、7、8、9、NOD1、NOD2、Dectin 1a、Dectin 1b和Mincle。未示出RIG-1和MDA5。阳性对照对于各PRR有特异性(即，TLR4的LPS)。
[0082] 图65是PRR指纹雷达图，其中针对来自减去阴性对照数据之后的1/10稀释度数据的QBECO和QBKPN SSI构建PRR指纹，并且在雷达图上绘制。
[0083] 图66是条形图，示出了在用安慰剂、QBKPN或狂犬病疫苗治疗之后第7天时血液中的中性粒细胞水平。将中性粒细胞水平通过流式细胞术来测量并且评估为中性粒细胞(Ly6G+)占总CD45+细胞的百分比。N＝4-5只小鼠/组。*是与安慰剂相比P<0.05，如通过学生t检验所评估。示出了平均值±标准偏差。QBKPN是来源于克雷伯氏杆菌的细菌SSI。狂犬病是含有灭活狂犬病病毒的Imrab 3TF狂犬病疫苗。
[0084] 图67是条形图，示出了在用安慰剂、QBKPN或狂犬病疫苗治疗之后第7天时血液中的Ly6CHI单核细胞水平。将Ly6CHI单核细胞水平通过流式细胞术来测量并且评估为Ly6CHI单HI - +核细胞(Ly6C Ly6G )占总CD45 细胞的百分比。N＝4-5只小鼠/组。*是与安慰剂相比P<
0.05，如通过学生t检验所评估。示出了平均值±标准偏差。QBKP N是来源于克雷伯氏杆菌的细菌SSI。狂犬病是含有灭活狂犬病病毒的Imrab 3TF狂犬病疫苗。Fel-O-Vac是含有三种灭活病毒的猫鼻气管炎-嵌杯病毒病-泛白细胞减少症(Feline Rhinotracheitis-Calici-Panle ukopenia Vaccine)疫苗。Nobivac是含有灭活流感病毒H3H8的犬流感病毒H3H8。
0.05，如通过学生t检验所评估。示出了平均值±标准偏差。QBKP N是来源于克雷伯氏杆菌的细菌SSI。狂犬病是含有灭活狂犬病病毒的Imrab 3TF狂犬病疫苗。Fel-O-Vac是含有三种灭活病毒的猫鼻气管炎-嵌杯病毒病-泛白细胞减少症(Feline Rhinotracheitis-Calici-Panle ukopenia Vaccine)疫苗。Nobivac是含有灭活流感病毒H3H8的犬流感病毒H3H8。
[0085] 图68是一列散点图，示出了使用QBKPN增强黑素瘤相关抗原gp100的效应的癌抗原增强作用。将QBKPN SSI与gp100组合的抗肿瘤功效与不相关对照抗原OVA(SIINFEKL)相比，包括用CpG辅佐的OVA。
[0086] 图69是一列散点图，示出了在用B16黑素瘤激发的小鼠中的表面转移样肿瘤结节，证明了用另外的PRR激动剂(STING激动剂2’2’-cGMAP)加强的微生物SSI QBKPN的功效的提高。
[0087] 图70是一列散点图，示出了在用B16黑素瘤激发的小鼠的血浆中治疗诱导的IFN-γ水平，证明了当微生物SSI QBKPN用STING激动剂加强时IFN-γ水平的提高。
[0089] 图71B是表示风险评分的对数分布的小提琴图，使用基于3个IBD SNP(P-值：1.385E-04)的风险评分比较所有CD受试者的最后记录的响应。
[0090] 图72是表示风险评分的对数分布的小提琴图，使用基于84个IBD SNP(P-值：1.255E-02)的风险评分比较所有UC受试者的最后记录的响应。
[0091] 图73是表示风险评分的对数分布的小提琴图，使用基于112个IBD SNP(P-值：8.184E-07)的风险评分比较所有CD和UC受试者的最后记录的响应。
[0092] 图74是示出了在用QBECO对比安慰剂治疗的患者中血清IL-18水平的变化的图。
[0093] 图75是一组4个图，示出了与临床响应有关的QBECO治疗下的血清免疫细胞因子变化。
[0094] 图76是一组3个图，示出了通过患者对QBECO的响应，Eotaxin-1、IL-10和IL-12p40的基线水平。
[0095] 图77是示出了在鼠科DSS结肠炎模型中体重随时间的变化的图。
[0096] 图78是示出了在鼠科DSS结肠炎模型中疾病活动指数随时间的变化的图。
[0097] 图79是示出了在鼠科DSS结肠炎模型中FITC-葡聚糖测定随时间的变化的图。
[0098] 图80是示出了在有或没有初始QBECO SSI治疗的无病小鼠中的中性粒细胞血液水平随时间的图(平均值+/-SEM，n＝10只小鼠/组)。
[0099] 图81是示出了在有或没有初始QBECO SSI治疗的无病小鼠中细胞因子的血液水平随时间的三个图的集合(平均值+/-SEM，n＝10只小鼠/组)。
[0101] 图83：包括6个条形图，示出了在肺组织中关于CXCL10(IP-10)、CCL2(MCP-1)和CCR2的基因表达。每隔一天用安慰剂、QBKPN或QBECO治疗小鼠持续10天，之后经由尾静脉注射将B16F10肿瘤植入到肺中。肿瘤接种之后，继续每隔一天的治疗。在第5天(A、C、E)或第17天(B、D、F)对小鼠施以安乐死。
[0102] 发明详述
[0103] 在以下发明详述中，列举了各个实施例的具体实施方案以及实验程序，其可用于执行本发明实践中的广泛多种修改和改动。为清楚起见，根据如在下文列举的定义中所反映的通常理解的含义，在本文中使用多种技术术语。
[0104] 一般定义
[0105] “免疫原”是指能够引发生物体免疫系统的免疫应答的分子或包含所述分子的组合物。“抗原”是指能够结合至免疫应答的产物的分子。
[0106] “致病的”因子是已知引起自然界中的宿主感染的因子，如微生物，如细菌或病毒，且在这种意义上，“致病的”在本发明的上下文中使用时意指“天然致病的”。虽然广泛多种微生物能够在人工条件下引起感染，如将微生物人工接种到组织中，但天然地引起感染的微生物的范围必然有限并且已被医疗实践所广为接受。
[0107] “感染”是其中身体或其一部分受病原体(例如，微生物，如细菌)侵袭的状态或状况，所述病原体在适宜条件下繁殖并产生有害的作用(Taber’s Cyclopedic Medical Dictionary,第14版,C.L.Thomas编著,F.A.Davis Company,PA,USA)。感染并不总是在临床上明显的并且可仅造成局部细胞损伤。感染可保持亚临床的，并且如果身体的防御机制有效，那么可以是暂时的。感染可局部扩散，从而变得在临床上明显，如急性、亚急性或慢性临床感染或疾病状态。当病原体进入淋巴或血管时，局部感染也可变为全身性的。感染常伴有炎症，但炎症可在无感染的情况下出现。
[0108] “炎症”是针对损伤的特征性组织反应(标志为肿胀、发红、发热和疼痛)，并且包括当受伤时出现在活组织中的连续变化。感染与炎症是不同的病状，但一者可因另一者而出现(Taber’s Cyclopedic Medical Dictionary,上述)。因此，炎症可在无感染的情况下出现，且感染可在无炎症的情况下出现(不过炎症通常是由致病细菌或病毒的感染引起)。炎症的特征表现为以下症状：发红(皮肤发红)、发热(灼热)、肿胀(肿块)、疼痛(痛)。皮肤上的局部可见炎症可由这些症状的组合而变得明显，特别是在施用部位处的发红。
[0109] 各个受试者可根据本发明的替代方面来治疗或测定或取样。如本文所用，“受试者”是动物，例如脊椎动物或哺乳动物。因此，受试者可以是患者，例如人，其患有免疫失调。受试者也可以是实验动物，例如，免疫失调的动物模型。在一些实施方案中，术语“受试者”与“患者”可互换使用，并且可包括人、非人哺乳动物、非人灵长类动物、大鼠、小鼠或狗。健康受试者可以是不患有如癌症或免疫功能障碍的疾病或疑似患有所述疾病或不患有慢性病症或病状的人。“健康受试者”也可以是没有免疫受损的受试者。免疫受损意指免疫系统以异常或不完全的方式发挥作用的任何病况。免疫受损可归因于疾病、某些药物、或出生时存在的病状。免疫受损的受试者可更常见于婴儿、老年人及接受广泛药物或放疗的个体中。
[0110] 来自受试者的“样品”可包括任何相关生物材料，包括例如取自患者的细胞、组织或体液样品。例如，样品可方便地包括皮肤、颊部、血液、粪便、毛发或尿液的样品。用于诊断和预后方法中的样品核酸可例如获自受试者的选定细胞类型或组织。例如，受试者的体液(例如血液)可通过已知技术获得。或者，可对干燥样品(例如毛发或皮肤)进行核酸测试。
[0111] 术语“多态性”是指生物序列(如基因组序列)内的位置，其在群内变化。多态性是由不同的“等位基因”构成。术语“基因型”是指在基因组中，例如在细胞、组织样品或个体中的特异性等位基因。多态性的位置可通过其在例如基因组内或序列(如反映了基因组基因座的蛋白质)内的位置来鉴别。其可例如以在指定位置处发现的不同氨基酸或碱基的表征形式来提供。对于二倍体基因组，基因型通常是由至少两个等位基因构成，这些等位基因可为相同(纯合的)或不同的(杂合的)。个体多态性是本领域中通常分配的唯一标识符(如“参照SNP”、“refSNP”或“rs#”)，例如在NCBI网站可获得的核苷酸序列变异的单核苷酸多态性数据库(dbSNP)(Single Nucleotide Polymorphism Database(dbSNP)of Nucleotide Sequence Variation)中。
[0112] 多态性、等位基因或基因型的表征可通过广泛多种方法中的任一种来进行。这些方法可例如不同地涉及核酸(如基因组DNA)的杂交、标记、克隆、测序和/或扩增，例如使用PCR、LCR、xMAP、侵染测定、质谱法、焦磷酸测序、选择性寡核苷酸杂交、选择性扩增、选择性引物延伸或探针。在本上下文中，术语“探针”包括天然存在的或重组的单链或双链核酸或化学合成的核酸。探针可例如是具有适于与含有多态性区域的核酸选择性杂交的长度的多核苷酸。标记的探针也可结合多态性的扩增来使用。DNA微阵列技术(有时称为DNA芯片或基因芯片)可例如用于基因组表征，例如用于表征点突变、单核苷酸多态性(SNP)和/或短串联重复序列(STR)。例如，能够特异性地与等位基因变体杂交的几个探针可通过多种方法(包括平版印刷术)连接于固相支持物。其它方法包括激光捕捉显微切割(LCM)、比较基因组杂交(CGH)和染色质免疫沉淀(ChiP)。等位基因特异性杂交可例如利用探针，所述探针与多态性位点重叠并且具有约5、或替代地10、或替代地20、或替代地25、或替代地30个在多态性区域周围的核苷酸。或者，特异性等位基因在来自受试者的DNA中的存在在一些情况下可通过限制酶分析来表征。类似地，使用可描述为“错配切割”测定的技术，通过保护作用防止切割剂(如核酸酶、羟胺或四氧化锇)的切割，由此检测RNA/RNA DNA/DNA或RNA/DNA异源双链体中的错配碱基。在电泳迁移率中的变化可用于表征等位基因变体，例如以便检测单链构象多态性。
[0113] 本文所述的许多方法可使用试剂盒进行，所述试剂盒包含例如至少一个探针或引物核酸、或本文所述的一种或多种组合物及试剂盒的使用说明书。试剂盒可例如包括至少一个探针或引物，所述探针或引物能够特异性地与多态性区域杂交或邻近于多态性区域，以便寡核苷酸对多态性区域有“特异性”。试剂盒还可包括至少一种进行特定测定所必需的试剂。试剂盒还可包括阳性对照、阴性对照、测序标记或抗体，例如用于测定受试者的基因型或生物标志物图谱。
[0114] “免疫应答”包括但不限于在施用组合物之后于哺乳动物中的一个或多个以下响应：抗体、中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞(包括如本文所述的M1样巨噬细胞和M2样巨噬细胞)、B细胞或T细胞(包括辅助T细胞、天然杀伤细胞、细胞毒性T细胞、γ-δ(γδ)T细胞)的诱导或激活，如通过免疫原性组合物中的一种或多种免疫原的诱导或激活。对组合物的免疫应答因此通常包括在宿主动物中针对组合物的细胞和/或抗体介导的应答的发展。在一些实施方案中，免疫应答是使得其也将造成免疫失调或以免疫失调为特征的疾病进展的减慢或停止。免疫应答可因此包括细胞免疫应答和/或体液免疫应答中的一者或两者，并且可以是适应性应答或先天性免疫应答。
[0115] “免疫失调”是不适当调节的免疫应答，如不适当抑制的或不适当强健的免疫应答。免疫失调可例如在以下情形下：自身免疫性疾病、炎性疾病或变性疾病(如类风湿性关节炎、克罗恩氏病、炎性肠病、多发性硬化症、神经变性疾病或过敏症)或肿瘤性疾病如癌症、或针对病原体的宿主防御。炎性肠病(IBD)是常常给予一组结肠和小肠炎性病状的名称，通常以免疫失调的相似症状和不确定的病因为特征。IBD的主要亚型在临床上被识别为克罗恩氏病和溃疡性结肠炎。除克罗恩氏病和溃疡性结肠炎之外，IBD还可包括识别为以下任一种的病状：胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、改道性结肠炎、白塞氏综合征或未定型结肠炎。这些病状之间的差异主要涉及胃肠道(GIT)中的炎性变化的位置和性质。举例来说，通常认为克罗恩氏病潜在地累及胃肠道从口腔到肛门的任何部分，其中大多数病例的标志是在末端回肠和结肠中消化道的复发和缓解型肉芽肿炎症。相比之下，溃疡性结肠炎通常被认为局限于结肠和直肠。其中这些炎性病状可表现出症状的胃肠道的各个区域包括：肠道或肠，包括：小肠(其具有三个部分：十二指肠、空肠和回肠)；大肠(其具有三个部分：盲肠；结肠，包括升结肠、横结肠、降结肠和乙状结肠；及直肠)；以及肛门。
[0116] “部位特异性免疫疗法”(SSI)是在一个或多个解剖位点(如器官或组织)处有效治疗性或预防性地改变免疫状态的方面或免疫系统生理机能的免疫调节治疗。在一些情况下，举例来说，SSI可适于改善免疫失调或治疗以免疫失调为特征的病状。
[0117] “癌症”或“赘生物”是不发挥生理机能的细胞的任何不想要的生长。一般说来，癌细胞已从其正常细胞分裂对照上释放，即生长没有受到细胞环境中的常规生化和物理影响的调节的细胞。因此，“癌症”是关于以异常的不受控制的细胞生长为特征的疾病的通用术语。在大多数情况下，癌细胞增殖形成恶性的克隆细胞。肿块或细胞团块、“赘生物”或“肿瘤”一般会侵袭和破坏周围正常组织。如本文所用，“恶性肿瘤”意指在具有异常生长的生物体中产生有害影响的任何细胞类型或组织的异常生长。术语“恶性肿瘤”或“癌症”包括学术上是良性但具有变为恶性的风险的细胞生长。癌细胞可在称为“转移”的过程中通过淋巴系统或血流从其原发部位扩散到身体的其它部分。许多癌症是治疗难以治愈的并且被证实是致死性的。癌症或赘生物的实例包括但不限于在如本文所述或本领域技术人员已知的各种器官和组织中的转化和永生化的细胞、肿瘤、癌瘤。
[0118] 大多数癌症属于三个主要组织类别之一：癌瘤，其是主要癌症并且是上皮细胞或覆盖器官、腺体或其它身体结构(例如皮肤、子宫、肺、乳腺、前列腺、胃、肠)的外表面或内表面的细胞的癌症，且其有转移倾向；癌瘤，其来源于结缔组织或支持组织(例如骨、软骨、肌腱、韧带、脂肪、肌肉)；以及血液肿瘤，其来源于骨髓和淋巴组织。癌瘤可以是腺癌(其一般在能够分泌的器官或腺体如乳腺、肺、结肠、前列腺或膀胱中发展)或可为鳞状细胞癌(其起源于鳞状上皮且一般在身体的大部分区域中发展)。肉瘤可为骨肉瘤或骨原性肉瘤(骨)、软骨肉瘤(软骨)、平滑肌肉瘤(平滑肌)、横纹肌肉瘤(骨骼肌)、间皮肉瘤或间皮瘤(体腔的膜衬)、纤维肉瘤(纤维组织)、血管肉瘤或血管内皮瘤(血管)、脂肪肉瘤(脂肪组织)、神经胶质瘤或星形细胞瘤(见于脑中的神经原性结缔组织)、粘液肉瘤(原始胚性结缔组织)或间叶瘤或混合中胚层肿瘤(混合结缔组织型)。血液肿瘤可为骨髓瘤，其起源于骨髓的浆细胞；白血病，其可为“液体癌症”并且是骨髓的癌症且可为髓细胞性或粒细胞性白血病(髓细胞样和粒细胞性白细胞)、淋巴性、淋巴细胞性、或成淋巴细胞性白血病(淋巴样和淋巴细胞性血细胞)或脾大性红细胞增多或红细胞增多(各种血细胞产物，但以红细胞占优势)；或淋巴瘤，其可为实体肿瘤并且在腺体或淋巴系统的淋巴结中发展，且其可为何杰金氏或非何杰金氏淋巴瘤。另外，还存在混合型癌症，如腺鳞癌、混合中胚层肿瘤、癌肉瘤或畸胎癌。
[0119] 基于原发部位命名的癌症可与组织学上的分类有关。例如，肺癌通常是小细胞肺癌或非小细胞肺癌，其可为鳞状细胞癌、腺癌或大细胞癌；皮肤癌通常是基底细胞癌、鳞状细胞癌或黑素瘤。淋巴瘤可出现在与头、颈和胸部有关的淋巴结中以及腹部淋巴结或腋窝或腹股沟淋巴结中。癌症类型和阶段的鉴别和分类可通过使用例如由Surveillance,Epidemiology,and End Results(SEER)Program of the National Cancer Institute所提供的信息来进行，这是在美国关于癌症发生率和存活率的权威性信息来源并且在世界范围内被认可。SEER计划目前收集并公开来自基于14个群体的癌症登记和覆盖大约26％美国人口的三个补充登记的癌症发生率和存活率数据。此项计划常规地收集关于以下的数据：患者人口统计学、原发肿瘤部位、形态、诊断时的阶段、第一疗程、及关于生命状况的随访，并且它是美国唯一的基于人群的全面信息来源，包括在诊断之时的癌症阶段及在每个阶段内的存活率。超过3百万原位和侵袭性癌症病例的信息包括在SEER数据库中，并且每年在SEER覆盖区域内新增大约170,000个新病例。SEER计划的发生率和存活率数据可用于选取关于特定癌症部位和阶段的标准存活。例如，为了确保最佳比较组，特定准则可选自数据库，包括诊断日期和确切阶段(例如，在本文中的肺癌实例的情况下，选择年份以匹配回顾性综述的时间框架，并选择3B和4期肺癌；并且在本文中的结肠癌实例的情况下，也选择年份以匹配回顾性综述的时间框架，并选择4期结肠癌)。
[0120] 癌症也可基于其起源的器官来命名，即“原发部位”，例如，乳腺、脑、肺、肝、皮肤、前列腺、睾丸、膀胱、结肠和直肠、子宫颈、子宫等的癌症。即使癌症转移到不同于原发部位的身体的另一部分，此命名也保留。在本发明下，治疗是针对癌症部位，而不是癌症的类型，以便有症状的或在病因学上定位于肺中的任何类型的癌症都将基于其在肺中的定位来治疗。
[0121] PRR配体
[0122] 本发明的方面涉及PRR配体的使用。PRR配体可例如商购获得，例如，在减毒或灭活重组细菌的广泛可获得的制剂中，其可以是例如TLR2、TLR4和TLR5的配体。病原体相关分子模式(PAMP)的组合物可包括由包括以下的PRR识别的PAMP：Toll样受体(TLR)、NOD样受体(NLR)、RIG-I样受体(RLR)、C型凝集素受体(CLR)(包括Dectin-1)、胞质dsDNA感受器(cytosolic dsDNA sensor,CDS)和参与炎性体形成的NLR。
[0123] Toll样受体2(TLR2)参与了广泛多种微生物分子的识别，这些微生物分子代表了广泛的物种组，包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌以及支原体和酵母。TLR2识别细胞壁组分，如来自革兰氏阳性细菌的肽聚糖、脂胞壁酸和脂蛋白；来自分枝杆菌的脂阿拉伯甘露聚糖；和来自酵母细胞壁的酵母聚糖。Toll样受体3(TLR3)识别双链RNA(dsRNA)。细菌脂多糖(LPS)是由Toll样受体4(TLR4)识别，TLR4与至少三种不同的胞外蛋白相互作用：LPS结合蛋白(LBP)、CD14和髓样分化蛋白2(MD-2)，以便诱导信号传导级联，由此引起NF-κB的激活和促炎性细胞因子的产生。LPS一般是由多糖区组成，多糖区通过碳水化合物脂质部分(即脂质A)锚定在细菌外膜中，所述脂质A主要负责LPS的免疫刺激活性。具体来说，活性形式的脂质A含有6个脂酰基，其例如可见于致病细菌中，所述致病细菌是大肠杆菌或沙门氏菌属种的菌株。Toll样受体5(TLR5)识别来自革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的鞭毛蛋白。Toll样受体7(TLR7)和TLR8识别单链RNA和小的合成分子，如咪唑并喹啉和核苷类似物。Toll样受体9(TLR9)识别普遍存在于微生物而非脊椎动物基因组DNA中的特异性未甲基化的CpG基序。
[0124] NLR是至少22种胞质先天性免疫感受器的家族，包括NOD1(CARD4)和NOD2(CARD15)，它们是参与肽聚糖(PGN)的识别的胞内模式识别受体。这些受体检测PGN内的特异性基序。NOD1感测含有二氨基庚二酸(diaminopimelatic acid)(DAP)的胞壁肽(具体来说，d-Glu-内消旋-DAP二肽“iE-DAP”二肽)，其主要见于革兰氏阴性细菌以及某些革兰氏阳性细菌的PGN中。NOD2识别见于几乎所有细菌PGN中的胞壁酰二肽(MDP)结构。
[0125] RIG-I-样受体(RLR)(尤其是RIG-I和MDA-5)检测病毒RNA种类。
[0126] CLR配体包括Dectin-1和Mincle(巨噬细胞诱导型C型凝集素)激动剂。Dectin-1是β-葡聚糖的特异性受体，β-葡聚糖是见于真菌细胞壁中的葡萄糖聚合物。Mincle是识别广泛多种配体如受损的细胞、真菌组分、酵母组分和分枝杆菌组分的多任务处理危险信号受体。
[0127] 胞质DNA感受器(CDS)结合来自病原体的胞内DNA，并且存在多个可呈现针对特定DNA的识别的情境偏好的CDS。
[0128] 环状二核苷酸(CDN)和呫吨酮衍生物如DMXAA结合至并激活STING(干扰素基因的刺激因子)。
[0129] 炎性体是参与成熟IL-1β的产生的多蛋白复合体，具体来说，通过将pro–IL-1β和pro–IL-18裂解为活性的和可分泌型。炎性体可分为NLRP1、NLRP3、NLRC4和AIM2亚型，其被广泛多种微生物分子、危险信号和结晶物质激活。
[0130] 表1：PRR受体及其配体
[0131]
[0132]
[0133] 表2：胞质核酸感测PRR及其配体(Broz和Monack,2013,Nature Reviews Immunology 13,551–565)
[0134]
[0135] 本发明的方面因此涉及使用来源于选定微生物病原体的PRR激动剂。例如，肽聚糖(PGN)可获自在选定的靶组织或器官中有致病性的细菌或菌株，以用作NOD1/NOD2激动剂。类似地，细胞壁组分可获自在选定的靶组织或器官中有致病性的细菌或菌株，以用作TLR2激动剂。类似地，DNA(包括双链DNA，具体来说，重复双链DNA)可获自在选定的靶组织或器官中有致病性的微生物病原体，如细菌或菌株，以用作DAI、LRRFIP1、RIG1、TLR9、AIM2或胞质DNA感受器(CDS)激动剂。β-葡聚糖肽可获自在选定的靶组织或器官中有致病性的真菌或酵母，以用作Dectin-1激动剂。环状二核苷酸可获自在选定的靶组织或器官中有致病性的微生物病原体，以用作STING激动剂。
[0136] 本发明的方面涉及具有独特PRR激动剂特征的组合物，其包含共同集合在治疗媒介物中的PRR激动剂的库，以使得PRR激动剂的所选集合是独特的。在本上下文中，“治疗媒介物”是将PRR激动剂聚集并保持在例如药学上可接受的颗粒或囊泡中的配制剂，如重组微生物。例如，PRR激动剂特征可不同于参照PRR激动剂特征，例如不同于将呈现在微生物上的PRR激动剂的集合，所述微生物在靶组织中没有致病性。PRR特征也可在以下意义上是独特的：其不同于微生物哺乳动物病原体的原生PRR激动剂特征，例如，通过基因的重组表达而改变，其改变的是病原体的野生型PRR激动剂特征。为了确定PRR激动剂特征的独特性，PRR激动剂的水平或种类可直接测量，或可例如通过测定作为PRR激动剂/受体结合的结果的细胞中信号传导途径的激活或抑制来测量。
[0137] 重组实施方案
[0138] 本发明的各种基因和核酸序列可以是重组序列。术语“重组”意指重组的东西，因此当关于核酸构建体进行制备时，该术语指的是由结合到一起或借助于分子生物学技术产生的核酸序列构成的分子。核酸“构建体”因此是重组核酸，其一般是通过聚集可互操作的组分序列而制得。当关于蛋白质或多肽进行制备时，术语“重组体”是指使用由分子生物学技术构建的重组核酸构建体表达的蛋白质或多肽分子。当关于遗传组合物或生物体或细胞进行制备时，术语“重组体”指的是未出现在亲代基因组中的等位基因的新组合。重组核酸构建体可包括与如下核酸序列连接或通过操作以便与此核酸序列连接的核苷酸序列，所述核酸序列在自然界中没有与该核苷酸序列连接，或者在自然界中所述核苷酸序列在不同位置与该核酸序列连接。因此，称核酸构建体为“重组体”是指利用基因工程，即通过人工干预(以使得其是人为的)操作的核酸分子。重组核酸构建体可例如通过转化引入到宿主细胞中。这种重组核酸构建体可包含来源于相同的宿主细胞物种或不同的宿主细胞物种的序列，其已被分离并再引入到宿主物种的细胞中。重组核酸构建体序列可被整合到宿主细胞基因组中，作为宿主细胞的原始转化的结果或作为后续重组和/或修复事件的结果。
[0139] 本发明的重组构建体可包含多种功能性分子或基因组组分，根据需要以便例如介导转化植物中的基因表达或抑制。在本上下文中，“DNA调控序列”、“控制元件”和“调控元件”指的是转录和翻译控制序列，如启动子、增强子、聚腺苷酸化信号、终止子、和调控基因表达的蛋白质降解信号、以及例如涉及组蛋白的甲基化或乙酰化(例如，组蛋白甲基转移酶或乙酰基转移酶)的表观遗传调控信号，由此造成转录状况中的构象变化和基因表达差异。在本公开的上下文中，“启动子”意指当启动子与基因可操作地连接时足以指导基因转录的序列。启动子因此为含有DNA序列的基因的部分，所述DNA序列提供RNA聚合酶的结合和转录的起始。启动子序列通常但不总是位于基因的5′非编码区。启动子与基因当在功能上相连以便允许通过启动子介导基因表达时是“可操作连接的”。术语“可操作连接”因此表示DNA区段经过排列以便于它们发挥与其预期目的一致的作用，例如在启动子中引发转录并继续进行经过基因的编码区段至基因的终止子部分。在一些情况下，当适当的分子(如转录激活蛋白)结合至启动子时，可发生基因表达。表达是以下过程：基因编码序列的信息通过转录转化为mRNA且随后通过翻译转化为多肽(蛋白质)，作为结果蛋白质得到表达。如本文中所用的术语，基因或核酸如果能够在特定的宿主细胞中在适当的条件下表达，便是“可表达的”。
[0140] 如本文所用，“分离的”核酸是指从其原始环境(例如，若其为天然存在的，则指自然环境)中去除的组分。分离的核酸或多肽可含有小于约50％、小于约75％、小于约90％、小于约99.9％或小于介于50与99.9％其最初所相关的细胞或生物组分之间的任何整数值。使用PCR扩增以便于其可充分地与细胞组分的其余部分相区分(例如在凝胶上)的多核苷酸由此例如是“分离的”。本发明的多核苷酸可以是“大体上纯的”，即具有如使用纯化技术所实现的高度分离。
[0141] 在生物分子的情形中，“内源性”是指天然地见于给定生物体或细胞中和/或由给定生物体或细胞产生的分子如核酸。“内源性”分子也可被称为“天然”分子。相反地，在生物分子的情形中，“外源性”是指通常或天然地未见于自然界中的给定生物体或细胞中和/或不由给定生物体或细胞产生的分子如核酸。
[0142] 如本文中用于描述核酸或氨基酸序列，术语“异源”是指例如通过转化被人工地引入特定的宿主细胞中的分子或分子的部分，如DNA序列。异源DNA序列可例如通过转化被引入宿主细胞中。这种异源分子可包括来源于宿主细胞的序列。异源DNA序列可以整合到宿主细胞基因组中，作为宿主细胞的原始转化的结果或作为后续重组事件的结果。
[0143] 本公开的各个方面涵盖与其它序列同源的核酸或氨基酸序列。如术语在本文中所用，如果两个序列大体上相同并且所述序列的功能活性是保守的，那么这样的氨基酸或核酸序列便与另一序列“同源”(如本文所用，序列保守或同一性不表示进化上的关系)。如果核酸序列编码大体相同的氨基酸序列，即使核酸序列本身不是大体相同的(例如由于遗传密码的简并性)，那么核酸序列也可以是同源的。
[0144] 提及生物序列“实质同源性”或“实质同一性”意指在替代方案中大于70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、
87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性、高达100％序列同一性。同源性可指的是如文中所指示的核酸或氨基酸序列。在替代实施方案中，序列同一性可例如是至少75％、至少90％或至少95％。为比较同一性而对序列进行的最佳比对可使用以下多种算法进行：如Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math 2:482的局部同源性算法；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444的相似性搜寻方法；以及这些算法的计算化实施(如GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，在Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,Madison,Wis.,U.S.A.中)。序列同一性还可使用BLAST算法测定，如Altschul等人(1990),J.Mol.Biol.215:403-10(使用公开的设置默认值)中所述。用于执行BLAST分析的软件可通过生物技术信息国家中心(NCBI)在互联网网站上获得。BLAST算法涉及首先通过在查询序列中鉴别长度W的短字串来鉴别高计分序列对(HSP)，当短字串与数据库序列中的相同长度的字串比对时，匹配或符合某个正阈值计分T。T称为相邻字串计分阈值。原始的相邻字串命中作为启动搜索以发现含有它们的更长HSP的种子。这些字串命中在沿着每个序列的两个方向上延伸直到累积比对计分增加为止。在每个方向上当下面的参数满足时，字串命中的延伸停止：累积比对计分从它的最大获得值降低了量X；由于一个或多个负分值残基对比的累积，累积分值趋向零或更低值；或者达到任一个序列的末端。
BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLAST程序可使用默认值如下：字长(W)
11，BLOSUM62计分矩阵(Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-
10919)比对(B)50，期望值(E)10，M＝5，N＝4，并且比较两条链。利用BLAST算法，对两个序列间的统计学相似性的一个度量是最小总和概率(P(N))，其指示了两个核苷酸或氨基酸序列间偶然出现匹配的概率。在替代实施方案中，如果在测试序列的比较中的最小总和概率小于约1、小于约0.1、小于约0.01或小于约0.001，那么认为核苷酸或氨基酸序列大体上相同。
87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性、高达100％序列同一性。同源性可指的是如文中所指示的核酸或氨基酸序列。在替代实施方案中，序列同一性可例如是至少75％、至少90％或至少95％。为比较同一性而对序列进行的最佳比对可使用以下多种算法进行：如Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math 2:482的局部同源性算法；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444的相似性搜寻方法；以及这些算法的计算化实施(如GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，在Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,Madison,Wis.,U.S.A.中)。序列同一性还可使用BLAST算法测定，如Altschul等人(1990),J.Mol.Biol.215:403-10(使用公开的设置默认值)中所述。用于执行BLAST分析的软件可通过生物技术信息国家中心(NCBI)在互联网网站上获得。BLAST算法涉及首先通过在查询序列中鉴别长度W的短字串来鉴别高计分序列对(HSP)，当短字串与数据库序列中的相同长度的字串比对时，匹配或符合某个正阈值计分T。T称为相邻字串计分阈值。原始的相邻字串命中作为启动搜索以发现含有它们的更长HSP的种子。这些字串命中在沿着每个序列的两个方向上延伸直到累积比对计分增加为止。在每个方向上当下面的参数满足时，字串命中的延伸停止：累积比对计分从它的最大获得值降低了量X；由于一个或多个负分值残基对比的累积，累积分值趋向零或更低值；或者达到任一个序列的末端。
BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLAST程序可使用默认值如下：字长(W)
11，BLOSUM62计分矩阵(Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-
10919)比对(B)50，期望值(E)10，M＝5，N＝4，并且比较两条链。利用BLAST算法，对两个序列间的统计学相似性的一个度量是最小总和概率(P(N))，其指示了两个核苷酸或氨基酸序列间偶然出现匹配的概率。在替代实施方案中，如果在测试序列的比较中的最小总和概率小于约1、小于约0.1、小于约0.01或小于约0.001，那么认为核苷酸或氨基酸序列大体上相同。
[0145] 表示两个氨基酸序列大体相同的替代指示是，一条肽与抗体具有特异性免疫反应性，所述抗体与另一条肽也具有特异性免疫反应性。如果抗体优先结合至肽并且不大量地结合至样品中存在的其它蛋白质，以便抗体与肽的优先结合在免疫测定中是可检测的并且可和与其它肽的非特异性结合区别开，那么抗体对肽有特异性免疫反应性。可使用以下多种免疫测定形式评估抗体对肽的特异性免疫反应性，例如，固相ELISA免疫测定以用于选择与蛋白质有特异性免疫反应性的单克隆抗体(参见Harlow和Lane(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Publications,New York)。
[0146] 两个核酸序列大体相同的可替代指标是在中等严格条件下，或严格条件下两个序列互相杂交。例如，在中等严格条件下，可在65℃下在0.5M NaHPO4、7％十二烷基硫酸钠(SDS)、1mM EDTA中进行与结合滤膜的序列的杂交，并在42℃下在0.2×SSC/0.1％SDS中洗涤。(参见，Ausubel等人(编者),1989,Current Protocols in Molecular Biology,第1卷,Green Publishing Associates,Inc.和John Wiley&Sons,Inc.,New York,在第2.10.3页)。或者，例如，在严格条件下，可在65℃下在0.5M NaHPO4、7％SDS、1mM EDTA中进行与结合滤膜的序列的杂交，并在68℃下在0.1×SSC/0.1％SDS中洗涤。(参见，Ausubel等人(编者),1989,上述)。根据目标序列，利用已知方法可以修改杂交条件(参见，Tijssen,1993,Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes,第I部分,第2章“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays”,Elsevier,N.Y.)。
一般说来，选择的严格条件为比在限定的离子浓度和pH下特定序列的热解链温度低约5℃。
术语“在严格(低、中等)条件下杂交的多核苷酸”旨在涵盖单链和双链多核苷酸，不过仅一条链将与另一多核苷酸的互补链杂交。在指定溶液中的洗涤可进行持续范围从几分钟至几天的时间，并且本领域技术人员将容易选择区分结合序列中的不同同源性水平的适当洗涤时间。
一般说来，选择的严格条件为比在限定的离子浓度和pH下特定序列的热解链温度低约5℃。
术语“在严格(低、中等)条件下杂交的多核苷酸”旨在涵盖单链和双链多核苷酸，不过仅一条链将与另一多核苷酸的互补链杂交。在指定溶液中的洗涤可进行持续范围从几分钟至几天的时间，并且本领域技术人员将容易选择区分结合序列中的不同同源性水平的适当洗涤时间。
[0147] 在本领域中，众所周知可以在多肽的结构中进行某些修饰和改变而基本上不改变该多肽的生物学功能，从而得到生物学等同的多肽。如本文所用，术语“保守的氨基酸取代”是指在肽的给定位置处一个氨基酸被另一氨基酸取代，其中可在没有任何明显的功能损失或获得下进行取代，以获得生物学等同的多肽。在进行这种改变时，可以基于侧链取代基，例如，它们的大小、电荷、疏水性、亲水性等的相对类似性进行类似氨基酸残基的取代，并且通过常规测试可以检测这种取代对肽功能的影响。相反，如本文所用，术语“非保守氨基酸取代”是指在肽中的给定位置处一个氨基酸被另一氨基酸的取代，其中该取代可引起肽功能的明显丧失或获得下，以获得生物学上不等同的多肽。
[0148] 在一些实施方案中，可进行保守氨基酸取代，其中氨基酸残基被具有相似亲水性值(例如，值加上或减去2.0内)的另一氨基酸残基取代，其中将以下亲水性值分配给氨基酸残基(如美国专利号4,554,101中所详述)：Arg(+3.0)；Lys(+3.0)；Asp(+3.0)；Glu(+3.0)；Ser(+0.3)；Asn(+0.2)；Gln(+0.2)；Gly(0)；Pro(-0.5)；Thr(-0.4)；Ala(-0.5)；His(-0.5)；
Cys(-1.0)；Met(-1.3)；Val(-1.5)；Leu(-1.8)；Ile(-1.8)；Tyr(-2.3)；Phe(-2.5)；以及Trp(-3.4)。可进行非保守氨基酸取代，其中残基的亲水性值显著不同，例如相差超过2.0。
Cys(-1.0)；Met(-1.3)；Val(-1.5)；Leu(-1.8)；Ile(-1.8)；Tyr(-2.3)；Phe(-2.5)；以及Trp(-3.4)。可进行非保守氨基酸取代，其中残基的亲水性值显著不同，例如相差超过2.0。
[0149] 在替代实施方案中，可进行保守氨基酸取代，其中氨基酸残基被具有相似亲水指数(例如，值加上或减去2.0内)的另一氨基酸残基取代。在这种实施方案中，每个氨基酸残基可基于其疏水性和电荷特征而被分配如下亲水指数：Ile(+4.5)；Val(+4.2)；Leu(+3.8)；Phe(+2.8)；Cys(+2.5)；Met(+1.9)；Ala(+1.8)；Gly(-0.4)；Thr(-0.7)；Ser(-0.8)；Trp(-
0.9)；Tyr(-1.3)；Pro(-1.6)；His(-3.2)；Glu(-3.5)；Gln(-3.5)；Asp(-3.5)；Asn(-3.5)；
Lys(-3.9)；以及Arg(-4.5)。可进行非保守氨基酸取代，其中残基的亲水指数显著不同，例如相差超过2.0。
0.9)；Tyr(-1.3)；Pro(-1.6)；His(-3.2)；Glu(-3.5)；Gln(-3.5)；Asp(-3.5)；Asn(-3.5)；
Lys(-3.9)；以及Arg(-4.5)。可进行非保守氨基酸取代，其中残基的亲水指数显著不同，例如相差超过2.0。
[0150] 在替代实施方案中，可进行保守氨基酸取代，其中氨基酸残基被另一种相同类型的氨基酸残基取代，其中氨基酸被分成非极性、酸性、碱性和中性类别，如下：非极性：Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Pro、Met；酸性：Asp、Glu；碱性：Lys、Arg、His；中性：Gly、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Tyr。可进行非保守氨基酸取代，其中残基不属于同一类别，例如，碱性氨基酸被中性或非极性氨基酸取代。
[0151] 微生物
[0152] 大多数动物在某种程度上寄居有微生物，如细菌，它们与宿主动物以共栖或共生关系存在。因此，通常无害细菌的许多物种见于健康动物中，且通常局限于特定器官和组织的表面。通常，这些微生物群落有助于身体的正常功能，如同所谓的微生物组的成员一样。一般无害的微生物(如大肠杆菌)可在健康的受试者中引起感染，其结果范围是轻度感染至死亡。微生物是否有致病性(即引起感染)取决于以下因素，如：对特定宿主细胞、组织或器官的进入或接触途径；微生物的固有毒力；存在于潜在感染部位的微生物的量；或宿主动物的健康状况。因此，通常无害的微生物可变为感染的致病性给定有利条件，且甚至最有毒力的微生物一般也需要特定环境来引起感染。因此，作为正常菌群的成员的微生物物种当移动超越其在内源性菌群中的正常生态作用之外时可为病原体。例如，内源性物种可在解剖学上接近的区域中其生态位之外例如通过连续扩散引起感染。当这出现时，这些通常无害的内源性细菌为致病性的。
[0153] 已知特定的微生物物种引起另外健康的受试者的特定细胞、组织或器官中的感染。通常在身体的特定器官和组织中引起感染的细菌和病毒的实例在下文中列出；并且这些实例在以下意义上不是限制性的：本领域技术人员将能基于如由以下出版物所示的本领域中的知识来识别并鉴别在其它方面健康的生物体的各种器官和组织中引起感染或通常引起感染的感染性或致病性细菌(并且识别每个细菌种的感染的相对频率)：Manual of Clinical Microbiology第8版,Patrick Murray编著,2003,ASM Press American Society for Microbiology,Washington DC,USA；Mandell,Douglas,and Bennett’s Principles and Practice of Infectious Diseases第5版,G.L.Mandell,J.E.Bennett,R.Dolin编著,2000,Churchill Livingstone,Philadelphia,PA,USA，所有都以引用方式并入本文。
[0154] 皮肤感染通常是由以下引起：细菌种：金黄色葡萄球菌、β溶血性链球菌A、B、C或G组、白喉棒状杆菌、溃疡棒状杆菌或铜绿假单胞菌；或病毒性病原体：麻疹病毒、风疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、埃可病毒(echovirus)、柯萨奇病毒、腺病毒、牛痘病毒、单纯疱疹病毒或细小病毒B19。
[0155] 软组织(例如，脂肪和肌肉)感染通常是由以下引起：细菌种：酿脓链球菌、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌或其它梭菌属种；或病毒性病原体：流感病毒或柯萨奇病毒。
[0156] 乳腺感染通常是由以下细菌种引起：金黄色葡萄球菌或酿脓链球菌。
[0157] 头和颈淋巴结的感染通常是由以下引起：细菌种：金黄色葡萄球菌或酿脓链球菌；或病毒性病原体：艾巴氏病毒(Epstein-Barr)、巨细胞病毒、腺病毒、麻疹病毒、风疹病毒、单纯疱疹病毒、柯萨奇病毒或水痘-带状疱疹病毒。
[0158] 手臂/腋窝淋巴结的感染通常是由以下引起：细菌种：金黄色葡萄球菌或酿脓链球菌；或病毒性病原体：麻疹病毒、风疹病毒、艾巴氏病毒、巨细胞病毒、腺病毒或水痘-带状疱疹病毒。
[0159] 纵隔淋巴结的感染通常是由以下引起：细菌种：绿色链球菌、消化球菌属种、消化链球菌属种、拟杆菌属种、梭杆菌属种或结核分枝杆菌；或病毒性病原体：麻疹病毒、风疹病毒、艾巴氏病毒、巨细胞病毒、水痘-带状疱疹病毒或腺病毒。
[0160] 肺门淋巴结的感染通常是由以下引起：细菌种：肺炎链球菌、卡他莫拉菌、肺炎支原体、肺炎克雷伯氏杆菌、流感嗜血杆菌、肺炎衣原体、百日咳杆菌或结核分枝杆菌；或病毒性病原体：流感病毒、腺病毒、鼻病毒、冠状病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒或柯萨奇病毒。
[0161] 腹内淋巴结的感染通常是由以下引起：细菌种：小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、沙门氏菌属种、酿脓链球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌或结核分枝杆菌；或病毒性病原体：麻疹病毒、风疹病毒、艾巴氏病毒、巨细胞病毒、水痘-带状疱疹病毒、腺病毒、流感病毒或柯萨奇病毒。
[0162] 腿/腹股沟区淋巴结的感染通常是由以下引起：细菌种：金黄色葡萄球菌或酿脓链球菌；或病毒性病原体：麻疹病毒、风疹病毒、艾巴氏病毒、巨细胞病毒或单纯疱疹病毒。
[0163] 血液感染(即败血病)通常是由以下引起：细菌种：金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、肠道球菌属种、大肠杆菌、克雷伯氏杆菌属种、肠杆菌属种、变形杆菌属种、铜绿假单胞菌、脆弱拟杆菌、肺炎链球菌或B族链球菌；或病毒性病原体：麻疹病毒、风疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、埃可病毒、柯萨奇病毒、腺病毒、艾巴氏病毒、单纯疱疹病毒或巨细胞病毒。
[0164] 骨的感染通常是由以下引起：细菌种：金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、酿脓链球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、其它链球菌属种、大肠杆菌、假单胞菌属种、肠杆菌属种、变形杆菌属种或沙雷氏菌属种；或病毒性病原体：细小病毒B19、风疹病毒或乙型肝炎病毒。
[0165] 关节感染通常是由以下引起：细菌种：金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、酿脓链球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、其它链球菌属种、大肠杆菌、假单胞菌属种、肠杆菌属种、变形杆菌属种、沙雷氏菌属种、淋病奈瑟氏菌、沙门氏菌属种、结核分枝杆菌、流感嗜血杆菌；或病毒性病原体：细小病毒B19、风疹病毒、乙型肝炎病毒；或真菌病原体：多育赛多孢子菌
[0166] 脑膜感染通常是由以下引起：细菌种：流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、肺炎链球菌、无乳链球菌或单核细胞增多性李斯特菌；或病毒性病原体：埃可病毒、柯萨奇病毒、其它肠道病毒或腮腺炎病毒。
[0167] 脑感染通常是由以下引起：细菌种：链球菌属种(包括咽峡炎链球菌、星座链球菌、中间链球菌)、金黄色葡萄球菌、拟杆菌属种、普氏菌属种、变形杆菌属种、大肠杆菌、克雷伯氏杆菌属种、假单胞菌属种、肠杆菌属种或伯氏疏螺旋体；或病毒性病原体：柯萨奇病毒、埃可病毒、脊髓灰质炎病毒、其它肠道病毒、腮腺炎病毒、单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、黄病毒或布尼亚病毒。
[0168] 脊髓感染通常是由以下引起：细菌种：流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、单核细胞增多性李斯特菌或伯氏疏螺旋体；或病毒性病原体：柯萨奇病毒、埃可病毒、脊髓灰质炎病毒、其它肠道病毒、腮腺炎病毒、单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、黄病毒或布尼亚病毒。
[0169] 眼/眼眶的感染通常是由以下引起：细菌种：金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌、肺炎链球菌、米勒链球菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、沙眼衣原体、流感嗜血杆菌、假单胞菌属种、克雷伯氏杆菌属种或苍白密螺旋体；或病毒性病原体：腺病毒、单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒或巨细胞病毒。
[0170] 唾液腺感染通常是由以下引起：细菌种：金黄色葡萄球菌、绿色链球菌(例如唾液链球菌、血链球菌、变异链球菌)、消化链球菌属种、或拟杆菌属种、或其它口腔厌氧菌；或病毒性病原体：腮腺炎病毒、流感病毒、肠道病毒或狂犬病病毒。
[0171] 口腔感染通常是由以下引起：细菌种：产黑色素普氏菌、厌氧链球菌、绿色链球菌、放线菌属种、消化链球菌属种、或拟杆菌属种、或其它口腔厌氧菌；或病毒性病原体：单纯疱疹病毒、柯萨奇病毒或艾巴氏病毒。
[0172] 扁桃体感染通常是由以下细菌种引起：酿脓链球菌或C组或G组B-溶血性链球菌；或病毒性病原体：鼻病毒、流感病毒、冠状病毒、腺病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒或单纯疱疹病毒。
[0173] 鼻窦感染通常是由以下引起：细菌种：肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、α-链球菌、厌氧细菌(例如普氏菌属种)或金黄色葡萄球菌；或病毒性病原体：鼻病毒、流感病毒、腺病毒或副流感病毒。
[0174] 鼻咽感染通常是由以下引起：细菌种：酿脓链球菌或C组或G组B-溶血性链球菌；或病毒性病原体：鼻病毒、流感病毒、冠状病毒、腺病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒或单纯疱疹病毒。
[0175] 甲状腺感染通常是由以下引起：细菌种：金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌或肺炎链球菌；或病毒性病原体：腮腺炎病毒或流感病毒。
[0176] 喉感染通常是由以下引起：细菌种：肺炎支原体、肺炎衣原体或酿脓链球菌；或病毒性病原体：鼻病毒、流感病毒、副流感病毒、腺病毒、冠状病毒或人偏肺病毒。
[0177] 气管感染通常是由以下引起：细菌种：肺炎支原体；或病毒性病原体：副流感病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒或腺病毒。
[0178] 支气管感染通常是由以下引起：细菌种：肺炎支原体、肺炎衣原体、百日咳杆菌、肺炎链球菌或流感嗜血杆菌；或病毒性病原体：流感病毒、腺病毒、鼻病毒、冠状病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒或柯萨奇病毒。
[0179] 肺感染通常是由以下引起：细菌种：肺炎链球菌、卡他莫拉菌、肺炎支原体、肺炎克雷伯氏杆菌或流感嗜血杆菌；或病毒性病原体：流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒或副流感病毒。
[0180] 胸膜感染通常是由以下引起：细菌种：金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、脆弱拟杆菌、普氏菌属种、核粒梭杆菌、消化链球菌属种或结核分枝杆菌；或病毒性病原体：流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒或副流感病毒。
[0181] 纵隔感染通常是由以下引起：细菌种：绿色链球菌、消化球菌属种、消化链球菌属种、拟杆菌属种、梭杆菌属种或结核分枝杆菌；或病毒性病原体：麻疹病毒、风疹病毒、艾巴氏病毒或巨细胞病毒。
[0182] 心脏感染通常是由以下引起：细菌种：链球菌属种(包括轻型链球菌、牛链球菌、血链球菌、变异链球菌、咽峡炎链球菌)、肠道球菌属种、葡萄球菌属种、白喉棒状杆菌、产气荚膜梭菌、脑膜炎奈瑟氏菌或沙门氏菌属种；或病毒性病原体：肠道病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒、脊髓灰质炎病毒、腺病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒或流感病毒。
[0183] 食道感染通常是由以下引起：细菌种：放线菌属种、鸟分枝杆菌、结核分枝杆菌或链球菌属种；或病毒性病原体：巨细胞病毒、单纯疱疹病毒或水痘-带状疱疹病毒。
[0184] 胃感染通常是由以下引起：细菌种：酿脓链球菌或幽门螺杆菌；或病毒性病原体：巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、艾巴氏病毒、轮状病毒、诺瓦克病毒(noroviruses)或腺病毒。
[0185] 小肠感染通常是由以下引起:细菌种：大肠杆菌、艰难梭菌、脆弱拟杆菌、普通拟杆菌、多形拟杆菌、产气荚膜梭菌、肠炎沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌或福氏志贺菌(Shigella flexneri)；或病毒性病原体：腺病毒、星状病毒、杯状病毒、诺瓦克病毒、轮状病毒或巨细胞病毒。
[0186] 结肠/直肠感染通常是由以下引起：细菌种：大肠杆菌、艰难梭菌、脆弱拟杆菌、普通拟杆菌、多形拟杆菌、产气荚膜梭菌、肠炎沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌或福氏志贺菌；或病毒性病原体：腺病毒、星状病毒、杯状病毒、诺瓦克病毒、轮状病毒或巨细胞病毒。
[0187] 肛门感染通常是由以下引起：细菌种：酿脓链球菌、拟杆菌属种、梭杆菌属种、厌氧链球菌、梭菌属种、大肠杆菌、肠杆菌属种、铜绿假单胞菌或苍白密螺旋体；或病毒性病原体：单纯疱疹病毒。
[0188] 会阴感染通常是由以下引起：细菌种：大肠杆菌、克雷伯氏杆菌属种、肠道球菌属种、拟杆菌属种、梭杆菌属种、梭菌属种、铜绿假单胞菌、厌氧链球菌、梭菌属种或肠杆菌属种；或病毒性病原体：单纯疱疹病毒。
[0189] 肝脏感染通常是由以下引起：细菌种：大肠杆菌、克雷伯氏杆菌属种、链球菌属(咽峡炎组)、肠道球菌属种、其它绿色链球菌、或拟杆菌属种；或病毒性病原体：甲型肝炎病毒、艾巴氏病毒、单纯疱疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、麻疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、柯萨奇病毒或腺病毒。
[0190] 胆囊感染通常是由以下细菌种引起：大肠杆菌、克雷伯氏杆菌属种、肠杆菌属种、肠道球菌、拟杆菌属种、梭杆菌属种、梭菌属种、肠炎沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌或福氏志贺菌。
[0191] 胆道感染通常是由以下引起：细菌种：大肠杆菌、克雷伯氏杆菌属种、肠杆菌属种、肠道球菌、拟杆菌属种、梭杆菌属种、梭菌属种、肠炎沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌或福氏志贺菌；或病毒性病原体：甲型肝炎病毒、艾巴氏病毒、单纯疱疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、麻疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、柯萨奇病毒或腺病毒。
[0192] 胰腺感染通常是由以下引起：细菌种：大肠杆菌、克雷伯氏杆菌属种、肠道球菌属种、假单胞菌属种、葡萄球菌属种、支原体属种、伤寒沙门氏菌、钩端螺旋体属种或军团菌属种；或病毒性病原体：腮腺炎病毒、柯萨奇病毒、乙型肝炎病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒2或水痘-带状疱疹病毒。
[0193] 脾脏感染通常是由以下引起：细菌种：链球菌属种、葡萄球菌属种、沙门氏菌属种、假单胞菌属种、大肠杆菌或肠道球菌属种；或病毒性病原体：艾巴氏病毒、巨细胞病毒、腺病毒、麻疹病毒、风疹病毒、柯萨奇病毒或水痘-带状疱疹病毒。
[0194] 肾上腺感染通常是由以下引起：细菌种：链球菌属种、葡萄球菌属种、沙门氏菌属种、假单胞菌属种、大肠杆菌或肠道球菌属种；或病毒性病原体：水痘-带状疱疹病毒。
[0195] 肾脏感染通常是由以下细菌种引起：大肠杆菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、普罗威登斯菌属种、摩根氏菌属种、粪肠球菌或铜绿假单胞菌；或病毒性病原体：BK病毒或腮腺炎病毒。
[0196] 输尿管感染通常是由以下细菌种引起：大肠杆菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、普罗威登斯菌属种、摩根氏菌属种或肠道球菌属种。
[0197] 膀胱感染通常是由以下引起：细菌种：大肠杆菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、普罗威登斯菌属种、摩根氏菌属种、粪肠球菌或空肠棒状杆菌(Corynebacterium jekeum)；或病毒性病原体：腺病毒或巨细胞病毒。
[0198] 腹膜感染通常是由以下细菌种引起：金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌、肺炎链球菌、大肠杆菌、克雷伯氏杆菌属种、变形杆菌属种、肠道球菌、脆弱拟杆菌、产黑色普氏菌、消化球菌属种、消化链球菌属种、梭杆菌属种或梭菌属种。
[0199] 腹膜后区感染通常是由以下细菌种引起：大肠杆菌或金黄色葡萄球菌。
[0200] 前列腺感染通常是由以下引起：细菌种：大肠杆菌、克雷伯氏杆菌属种、肠杆菌属种、奇异变形杆菌、肠道球菌属种、假单胞菌属种、棒状杆菌属种或淋病奈瑟氏菌；或病毒性病原体：单纯疱疹病毒。
[0201] 睾丸感染通常是由以下引起：细菌种：大肠杆菌、肺炎克雷伯氏杆菌、铜绿假单胞菌、葡萄球菌属种、链球菌属或肠炎沙门氏菌；或病毒性病原体：腮腺炎病毒、柯萨奇病毒或淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒。
[0202] 阴茎感染通常是由以下引起：细菌种：金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌、淋病奈瑟氏菌或苍白密螺旋体；或病毒性病原体：单纯疱疹病毒。
[0203] 卵巢/附件的感染通常是由以下细菌种引起：淋病奈瑟氏菌、沙眼衣原体、阴道加德纳氏菌(Gardenerella vaginalis)、普氏菌属种、拟杆菌属种、消化球菌属种、链球菌属种或大肠杆菌。
[0204] 子宫感染通常是由以下细菌种引起：淋病奈瑟氏菌、沙眼衣原体、阴道加德纳氏菌、普氏菌属种、拟杆菌属种、消化球菌属种、链球菌属种或大肠杆菌。
[0205] 子宫颈感染通常是由以下引起：细菌种：淋病奈瑟氏菌、沙眼衣原体或苍白密螺旋体；或病毒性病原体：单纯疱疹病毒。
[0206] 阴道感染通常是由以下引起：细菌种：阴道加德纳氏菌、普氏菌属种、拟杆菌属种、消化球菌属种、大肠杆菌、淋病奈瑟氏菌、沙眼衣原体或苍白密螺旋体；或病毒性病原体：单纯疱疹病毒。
[0207] 外阴感染通常是由以下引起：细菌种：金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌或苍白密螺旋体；或病毒性病原体：单纯疱疹病毒。
[0208] 细菌种被操作性地归类为相似菌株的集合(其一般是指具有可鉴别的生理学但通常无形态学区别的假定的共同祖先的组，并且可使用针对细菌表面抗原的血清学技术对其进行鉴别)。因此，每个细菌种(例如，肺炎链球菌)具有许多菌株(或血清型)，其可在引起感染的能力方面不同或在引起特定器官/部位中的感染的能力方面不同。举例来说，虽然肺炎链球菌存在至少90种血清型，但血清型1、3、4、7、8和12最经常在人中引起肺炎球菌疾病。
[0209] 大肠杆菌的某些菌株，称为肠外致病性大肠杆菌(ExPEC)，更可能引起尿路感染或其它肠外感染如新生儿脑膜炎；而其它菌株，包括肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)、产志贺毒素大肠杆菌(STEC)、肠凝集性大肠杆菌(EAEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)和弥漫性粘附大肠杆菌(DAEC)，更可能引起胃肠感染/腹泻。甚至在ExPEC菌株的子类别中，特定的毒力因子(例如，1型菌毛的产生)使得某些菌株更能引起膀胱的感染，而其它毒力因子(例如，P菌毛的产生)使得其它菌株更能引起肾脏的感染。根据本发明，更可能引起膀胱感染的ExPEC菌株可针对配制剂选出以靶向膀胱癌中的免疫失调，而更可能引起肾脏感染的ExPEC菌株可针对配制剂选出以靶向肾癌中的免疫失调。同样，大肠杆菌的ETEC、EPEC、EHEC、STEC、EAEC、EIEC或DAEC菌株(即，引起结肠感染的菌株)中的一个或多个可针对配制剂选出以治疗结肠中的免疫失调。
[0210] 类似地，特定病毒可存在许多亚型。例如，存在三种类型的流感病毒，即流感A病毒、流感B病毒和流感病毒C，它们在流行病学、宿主范围和临床特征上是不同的。例如，流感A病毒更可能与病毒性肺部感染有关，而流感B病毒更可能与肌炎(即，肌肉感染)有关。此外，这三种类型的流感病毒各自具有许多亚型，它们在流行病学、宿主范围和临床特征上也可以是不同的。根据本发明，可选择最常与肺部感染有关的流感A病毒亚型以靶向肺中的免疫失调，而可选择最常与肌炎有关的流感病毒B菌株以治疗肌肉/软组织中的免疫失调。
[0211] 存在与一些病理组织状态有关的特定微生物群，例如，特定肿瘤的微生物群。例如，梭杆菌属和普罗维登斯菌属与结肠直肠癌有关。
[0212] 本发明的组合物包含致病性微生物物种的免疫原(细菌、病毒或真菌)，其在特定的组织或器官中有致病性，其中免疫原是以哺乳动物PRR激动剂的人工库形式提供，所述PRR激动剂概括了在靶组织中有致病性的微生物哺乳动物病原体的PRR激动剂特征的独特部分。在选择的实施方案中，PRR激动剂特征的部分在以下意义上是独特的：其不同于在靶组织中无致病性的微生物的参照PRR激动剂特征；并且其也不同于微生物哺乳动物病原体的原生PRR激动剂特征。将哺乳动物PRR激动剂的此独特人工库在治疗媒介物中一起配制以便于组合呈现给驻留在哺乳动物宿主的靶组织中的先天性免疫细胞。
[0213] 配制剂和治疗媒介物
[0214] 本发明的组合物可单独或与其它化合物(例如，核酸分子、小分子、肽或肽类似物)组合提供，在脂质体、佐剂或任何药学上可接受的载体存在下，呈适于向哺乳动物，例如人施用的形式(“治疗媒介物”)。如本文所用，“药学上可接受的载体”或“赋形剂”包括生理学相容的任何及所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。载体可适于任何适当的施用形式，包括皮下、皮内、静脉内、胃肠外、腹膜内、肌内、舌下、吸入、肿瘤内或经口施用。药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散体和用于无菌可注射溶液或分散体的临时制备的无菌粉末。此类介质和试剂在药学活性物质中的使用是本领域中公知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物(即，本发明的特定细菌、细菌抗原或其组合物)不相容，考虑了其在本发明的药物组合物中的应用。也可在组合物中掺入补充性活性化合物。
[0215] 本发明的方面涉及纳米颗粒(NP)配制剂的使用。例如，病毒样颗粒(VLP)本质上是空的病毒颗粒，其具有完整的蛋白质壳，且在一些实施方案中，具有包膜。通常，VLP缺乏遗传物质。VLP的产生可例如通过病毒蛋白在哺乳动物、鸟类、昆虫、植物、酵母或细菌细胞中的表达实现。或者，可产生完全合成的VLP。替代的纳米颗粒配制剂乳液、脂质体藻酸盐、壳聚糖和聚乳酸-乙交酯(PLGA)NP。可适用于诱导免疫应答的NP/TLR配体制剂的实例是以下的配体：TLR2(Pam(3)Cys)、TLR9(聚I:C)、TLR4(3-O-脱酰基-4 0-单磷酰基脂质A(MPL))、TLR7(9-苄基-8-羟基腺嘌呤)、TLR7/8(瑞喹莫德，R848)和TLR9(CpG DNA)。
[0216] 除选定的共配制剂之外，广泛多种佐剂也可用于增强所需免疫应答(参见Levast等人,2014,Vaccines,2,297-322)。
[0217] 根据本发明的PRR配体的治疗可与更多传统及现存的疗法组合。对于癌症，举例来说，这些疗法可包括化疗、放疗、手术等，或刺激免疫系统、减轻炎症或在其它方面使受试者受益的疗法，如营养素、维生素及补充剂。例如，维生素A、维生素D、维生素E、维生素C、复合维生素B、硒、锌、辅酶Q10、β胡萝卜素、鱼油、姜黄、绿茶、菠萝蛋白酶、白藜芦醇、磨碎的亚麻籽、大蒜、番茄红素、水飞蓟、褪黑激素、其它抗氧化剂、甲氰咪呱、吲哚美辛或COX-2抑制剂(例如，CelebrexTM[塞利昔布]或VioxxTM[罗非考昔])也可施用于受试者。
[0218] 常规的药学实践可用于提供合适的配制剂或组合物以便向受试者施用化合物。可采用替代施用途径，例如，胃肠外、静脉内、皮内、皮下、肌内、颅内、眶内、眼部、脑室内、囊内、脊柱内、鞘内、脑池内、腹膜内、鼻内、吸入、气溶胶、局部、肿瘤内、舌下或经口施用。治疗性配制剂可呈液体溶液或混悬液形式；对于经口施用，配制剂可呈片剂或胶囊形式；对于鼻内配制剂，呈粉末、滴鼻剂或气溶胶形式；以及对于舌下配制剂，呈滴剂、气溶胶或片剂形式。
[0219] 本领域中公知的用于制备配制剂的方法见于例如“Remington’s Pharmaceutical Sciences”(第20版),编者A.Gennaro,2000,Mack Publishing Company,Easton,PA中。用于胃肠外施用的配制剂可例如含有赋形剂、无菌水或盐水、聚二醇如聚乙二醇、植物来源的油类、或氢化萘。生物相容性、生物可降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物、或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可用于控制化合物的释放。其它潜在有用的胃肠外递送系统包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵、可植入输注系统和脂质体。供吸入的配制剂可含有赋形剂，例如乳糖，或可以是含有例如聚氧乙烯-9-月桂基醚、甘胆酸盐和脱氧胆酸盐的水溶液，或可以是以滴鼻剂形式施用的油溶液，或作为凝胶。关于治疗性或预防性组合物，可以有效中止或延缓癌症的进展或转移或提高受试者视病症而定的存活率(相对于例如来源于SEER数据库的预后)的量将致病性细菌种施用于个体。
[0220] 药物组合物或配制剂可以多种方式包装，这取决于用于施用药物的方法。例如，制造或包装的物品包括其中存放有适当形式的药物配制剂的容器。合适的容器可例如包括材料如瓶(塑料和玻璃)、小药囊、安瓿、塑料袋、金属筒和小瓶。容器可具有无菌入口，例如，容器可以是静脉内溶液袋或者具有塞子的小瓶，该塞子可被皮下注射针头穿透。包装或容器还可包括适于控制接触包装或容器的内容物的防干扰或多用途机构，例如，与包含于包装中的小瓶相匹配的多剂量小瓶配接器。容器或包装可包括标签，例如，说明容器的内容物的标签，举例来说，鉴别其中的药物组合物和/或指明施用模式或途径的药物标签。标签还可包括适当的警告，例如，指定容器或包装的储藏条件，或列举治疗模式的禁忌症或副作用。制品因此可采用包含药物组合物或适于帮助药物组合的使用的附件的“试剂盒”形式。试剂盒可包括标签或包装说明书，其中术语“包装说明书”用于指代通常包括在治疗性产品的商业包装中的说明，其含有关于适应症、用法、剂量、施用、禁忌症的信息和/或关于使用此类治疗性产品的警告。试剂盒还可包括与使用药物组合物有关的附件，包括缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。试剂盒还可适于递送药物组合物的选定剂型，例如，包括多个单位剂量。此类试剂盒可包括记忆辅助物或机构，采用其中剂量有待使用的治疗方案的预期时机的物理或书面指示的形式。
[0221] “伴随诊断(companion diagnistic)”可与药物治疗或组合物有关。伴随诊断是通过提供诊断或预后信息促进相关治疗的测定，通常采用诊断测试的形式以便确定治疗对特定患者的适用性。床边伴随诊断(Point-of-care companion diagnistic)可例如涉及提供诊断组合物和/或制品，以及提供药物配制剂，例如，作为试剂盒的一部分。或者，伴随诊断可作为监测受试者的疗法或预测预期治疗的治疗功效的测定来单独提供。伴随诊断可例如采取以下形式：医疗装置(如成像工具)，或由此类装置进行的过程(例如用于体外进行测定)，其提供了关于相应的药物或生物产品的安全和有效使用的信息。伴随诊断可与本文所公开的疗法一起使用以便提供关于治疗功效或不希望有的副作用或风险证据的诊断或预后信息。伴随诊断与具体治疗剂的使用可规定在说明书中，例如，在诊断装置的标签和/或相应治疗产品的标签上。伴随诊断测试的类型可例如包括：筛选和检测，呈筛选基因型模式(如基因SSI响应标志物)的测试形式；预后和治疗诊断，如用于生化SSI响应标志物的测定，所述标志物有助于预测疾病的未来过程或指示患者对疗法的响应；监测，例如以评估处方疗法的有效性和适当给药；或复发，涉及分析患者对于疾病复发风险的测试。
[0222] 根据本发明的组合物的“有效量”包括治疗有效量或预防有效量。“治疗有效量”是指在获得所需治疗结果(如免疫失调的减轻或消除)必需的剂量和时间段下有效的量。组合物的治疗有效量可根据以下因素而变化：如疾病状态、个体的年龄、性别和体重、以及化合物引发个体中的所需响应的能力。可对给药方案进行调整以提供最佳治疗响应。治疗有效量也可以是：其中组合物的治疗有益效果超过任何毒性或有害效果的量。“预防有效量”是指在获得所需预防结果(如免疫失调的改善)必需的剂量和时间段下有效的量。通常，预防剂量是在癌症之前或癌症的较早期在受试者中使用，以便预防有效量可小于治疗有效量。
[0223] 关于任何具体的受试者，治疗的时机和剂量可根据个体需要以及施用或监督组合物施用的人员的专业判断随时间进行调整(例如，时机可以是每天、每隔一天、每周、每月)。例如，在皮下或皮内施用的情况下，组合物可每隔一天施用。可以皮下施用大约0.05ml的初始剂量，接着每隔一天从0.01增至0.02ml，直到在注射部位处实现足够的皮肤反应(例如，在注射部位处直径1英寸至2英寸的可见发红的延迟反应)。一旦达到此足够的免疫应答，此给药便以维持剂量继续进行。可不时地调整维持剂量以便实现注射部位处的所需的可见皮肤反应(炎症)。给药可持续剂量持续时间，例如至少1周、2周、2个月、6个月、1、2、3、4或5年或更久。
[0224] 口服剂量可例如在每天4次、每天一次或每周一次的范围内。给药可持续剂量持续时间，例如至少1周、2周、2个月、6个月、1、2、3、4或5年或更久。在一些实施方案中，本发明可包括通过以下方式同时或依次地施用组合物：舌下或通过吸入施用；或施用于一种或多种上皮组织(即，通过皮内或皮下注射施用于皮肤；通过吸入施用于肺上皮；通过口腔摄取施用于胃肠粘膜；通过舌下给药施用于口腔粘膜)。因此，在一些实施方案中，施用本发明组合物以便引起上皮组织中的免疫应答。在一些实施方案中，一种或多种上皮施用途径可与一种或多种另外的施用途径(如肿瘤内、肌内或静脉内施用)组合。
[0225] 在免疫原性配制剂的情况下，可单独或与其它化合物(例如与免疫佐剂)组合提供免疫原性有效量的本发明组合物。所述组合物可例如包含与载体分子如牛血清白蛋白或匙孔血蓝蛋白连接以提高免疫原性的化合物。免疫原性组合物是包含引发所需免疫应答的材料的组合物。免疫原性组合物可以选择、激活或扩增(但不限于)：免疫系统的记忆B、T细胞、中性粒细胞、单核细胞或巨噬细胞。
[0226] 供注射施用的包含灭活重组细菌的抗原性组合物可制备如下。细菌可生长在合适的培养基中，并且用生理盐水溶液洗涤。随后可将细菌离心，再悬浮于盐水溶液中并进行热灭活。可将悬浮液通过直接显微镜计数来标准化，以所需的量混合，并且保存在适当的容器中，可以批准的方式就安全性、保质期和无菌性对其进行测试。除致病性细菌种和/或其抗原之外，适于施用于人的灭活细菌疫苗还可包含0.4％苯酚防腐剂和/或0.9％氯化钠。细菌疫苗还可包含痕量的脑心浸液(牛肉)、胨、酵母提取物、琼脂、绵羊血、葡萄糖、磷酸钠和/或其它培养基组分。
[0227] 在选择的实施方案中，可在至少一周的给药持续时间内，在施用部位处，以在介于一小时与一个月之间的给药间隔时间下给予的连续剂量施用药剂。任选地，可真皮内或皮下施用药剂。任选地，药剂可以一定剂量施用，以使得每个剂量有效地引起施用部位处的可见局部炎性免疫响应。任选地，可施用药剂以使得在1至48小时内出现施用部位处的可见局部炎症。然而，可见的局部炎性免疫响应可能并不总是存在于所有情形下，尽管引发了免疫应答。存在可监测免疫应答的进行的其它方法。例如，可将来自经历免疫反应的受试者的免疫细胞谱(及表征中的相对变化)与来自未经历免疫反应的受试者相比。
[0228] 另一方面，提供了一种监测治疗方案在关于特定器官或组织中的免疫功能障碍而被治疗的个体中的功效的方法。所述方法涉及在个体已经接受治疗方案一段时间之后测量在由特定的器官或组织获得的治疗后免疫样品中的免疫应答的特征。
[0229] 在一些实施方案中，来源于作为GIT的特定区域的内源性菌群的成员的细菌的PRR激动剂可用于配制本发明的免疫原性组合物。表3的数行列出了许多细菌种，以及其中每个种可形成内源性菌群的一部分的生物区域。例如，营养缺陷菌属种通常是口腔内源性菌群的成员。
[0230] 表3：人细菌正常菌群(内源性细菌性人病原体)
[0231]
[0232]
[0233]
[0234]
[0235]
[0236]
[0237] 内源性微生物菌群(如细菌)通过连续扩散或菌血性扩散可以到达发病机理的组织。在有利的条件下，内源性生物体可变为致病性的并局部侵袭并通过连续扩散至相邻组织和器官而扩散。皮肤、口腔和结肠的内源性细菌菌群也是被认为容易菌血性扩散的种。作为具体的内源性菌群域的成员的细菌因此可引起这些细菌可扩散至的组织或器官中的感染。因此，本发明的一方面涉及来源于内源性微生物病原体的PRR激动剂治疗免疫失调的用途，所述免疫失调具有局限于其中内源性细菌可扩散以引起感染的GIT的区域的症状。表2的数列列举了内源性菌群的域。表4的数行列举了免疫失调可在其中有症状或在病因学上定位其中的GIT区域。因此，本发明的一方面涉及来源于内源性微生物病原体的PRR激动剂配制用于治疗免疫失调的免疫原性组合物的用途，所述免疫失调是有症状的或在病因学上定位于病原体可在其中扩散以引起感染的GIT的区域中。因此，在替代实施方案中，在表2的第一列中列出的区域中有症状的免疫失调可用包含哺乳动物PRR激动剂的人工库的免疫原性组合物治疗，所述PRR激动剂概括了微生物哺乳动物病原体的PRR激动剂特征的独特部分，所述病原体是表2第1行中列出的一个或多个内源性菌群域的内源性菌群的成员并且在适当的行中用X或检查标志物表示。
[0238] 表4：内源性菌群的组织/器官致病性
[0239]组织/器官部位 口腔 胃 十二指肠/空肠 回肠 结肠
口腔 X
扁桃体 X
鼻咽/鼻窦 X
食道 X
胃 X
小肠 X X
结肠/直肠 X
肛门 X
口腔 X
扁桃体 X
鼻咽/鼻窦 X
食道 X
胃 X
小肠 X X
结肠/直肠 X
肛门 X
[0240] 根据表1和2中的组合信息，出现在表2的第1列中列出的GIT的特定区域中的免疫失调可用包含哺乳动物PRR激动剂的人工库的抗原性组合物治疗以使得表2的列标题实际上被表1的细菌种替代，所述PRR激动剂概括了微生物哺乳动物病原体的PRR激动剂特征的独特部分，所述病原体是表1的相应细菌种中的一种。
[0241] 在一些实施方案中，PRR激动剂可来源于外源性细菌病原体。例如，来源于表5中列出的生物体的PRR激动剂可在PRR激动剂的人工库中使用以治疗在与表5的相关生物体一起列出的GIT区域中有症状的免疫失调。在一些实施方案中，可组合使用来源于内源性和外源性微生物物种的PRR激动剂。
[0242] 表5：外源性细菌性人病原体及其在GIT中的感染部位
[0243]
[0244]
[0245] 在一些实施方案中，用于本发明中的PRR激动剂可来源于病毒性病原体。表6提供了病毒性病原体的示例性列表以及据报道每个病毒性种是其中的病原体的组织和器官。因此，本发明的一方面涉及利用来源于指定病毒的PRR激动剂的免疫原性组合物来治疗在邻近于表6中的病毒名称被鉴别的GIT的区域中有症状的免疫失调。
[0246] 表6：病毒性人病原体及其感染部位
[0247]
[0248]
[0249] 在一些实施方案中，PRR激动剂所来源于的以用于本发明的免疫原性组合物中的病原体可以是作为在其中被治疗的免疫失调有症状的GIT的区域中的急性感染的常见原因的病原体。表7鉴别了此类细菌性和病毒性病原体以及它们常在其中引起感染的GIT的区域。因此，在选择的实施方案中，在表7的第1列中所鉴别的GIT区域中有症状的免疫失调可用包含哺乳动物PRR激动剂的人工库的免疫原性组合物来治疗，所述PRR激动剂概括了在表7的第2列中列出的致病性生物体的PRR激动剂特征的独特部分。
[0250] 表7：GIT的选定区域的急性感染(细菌和病毒)的常见原因
[0251]
[0252] 人是包括各种原生动物和蠕虫的广泛胃肠寄生虫的宿主，它们在本发明中构成GIT的病原体(Schafer,T.W.,Skopic,A.Parasites of the small intestine.Curr Gastroenterol Reports 2006；8:312-20；Jernigan,J.,Guerrant,R.L.,Pearson,
R.D.Parasitic infections of the small intestine.Gut 1994；35:289-93；
Sleisenger&Fordtran’s Gastrointestinal and liver disease.第8版2006；Garcia,L.S.Diagnostic medical parasitology.第5版2007)。本发明的组合物因此可包括各种原生动物的PRR激动剂，各种原生动物包括例如：肠兰伯式鞭毛虫、小球隐孢子虫、人隐孢子虫、贝氏等孢子球虫、肉孢子虫属种、球虫样体(环孢子虫属种)、比氏肠胞虫、痢疾内变形虫、斯帕内阿米巴、结肠内阿米巴、哈氏内阿米巴、微小内蜒阿米巴、嗜碘阿米巴、脆弱双核内变形虫、人酵母菌、圆孢子虫、微孢子虫、克氏锥虫、梅氏唇鞭毛虫、人五毛滴虫、结肠小袋虫。类似地，本发明的组合物可包括各种蠕虫的抗原组分，各种蠕虫包括例如：绦虫(Cestode/tapeworm)、牛肉绦虫、有钩绦虫、裂头属种、短膜壳绦虫、长膜壳绦虫、犬复孔绦虫、线虫(蛔虫)、人蛔虫、粪类圆线虫、美洲板口线虫、十二指肠钩虫、犬钩虫、毛首鞭形线虫、菲律宾毛线虫、毛圆线虫属种、毛线虫属种、美洲板口线虫、异尖线虫和相关物种、哥斯达黎加管圆线虫、蠕形住肠蛲虫、吸虫(Trematode/fluke)、布氏姜片虫、异形吸虫属种、棘口吸虫属种、中华枝睾吸虫、后睾吸虫属种、片吸虫属种、横川后殖吸虫、曼氏血吸虫、日本裂体吸虫、湄公血吸虫、刚果裂体吸虫、棘口吸虫属种和并殖吸虫属种。
R.D.Parasitic infections of the small intestine.Gut 1994；35:289-93；
Sleisenger&Fordtran’s Gastrointestinal and liver disease.第8版2006；Garcia,L.S.Diagnostic medical parasitology.第5版2007)。本发明的组合物因此可包括各种原生动物的PRR激动剂，各种原生动物包括例如：肠兰伯式鞭毛虫、小球隐孢子虫、人隐孢子虫、贝氏等孢子球虫、肉孢子虫属种、球虫样体(环孢子虫属种)、比氏肠胞虫、痢疾内变形虫、斯帕内阿米巴、结肠内阿米巴、哈氏内阿米巴、微小内蜒阿米巴、嗜碘阿米巴、脆弱双核内变形虫、人酵母菌、圆孢子虫、微孢子虫、克氏锥虫、梅氏唇鞭毛虫、人五毛滴虫、结肠小袋虫。类似地，本发明的组合物可包括各种蠕虫的抗原组分，各种蠕虫包括例如：绦虫(Cestode/tapeworm)、牛肉绦虫、有钩绦虫、裂头属种、短膜壳绦虫、长膜壳绦虫、犬复孔绦虫、线虫(蛔虫)、人蛔虫、粪类圆线虫、美洲板口线虫、十二指肠钩虫、犬钩虫、毛首鞭形线虫、菲律宾毛线虫、毛圆线虫属种、毛线虫属种、美洲板口线虫、异尖线虫和相关物种、哥斯达黎加管圆线虫、蠕形住肠蛲虫、吸虫(Trematode/fluke)、布氏姜片虫、异形吸虫属种、棘口吸虫属种、中华枝睾吸虫、后睾吸虫属种、片吸虫属种、横川后殖吸虫、曼氏血吸虫、日本裂体吸虫、湄公血吸虫、刚果裂体吸虫、棘口吸虫属种和并殖吸虫属种。
[0253] 根据上文，在各个方面中，本发明可涉及用哺乳动物PRR激动剂的人工库的配制剂治疗免疫失调，所述PRR激动剂概括了以下微生物病原体的PRR激动剂特征的独特部分：发酵氨基酸球菌；不动杆菌属种；放线棒菌属种；放线菌属种；产气单孢菌属种；分叉棍状厌氧菌；氢消化厌氧球菌；解乳消化厌氧球菌；普氏厌氧球菌；奇异菌属种；杆菌属种；粪拟杆菌；吉氏拟杆菌；埃氏拟杆菌；脆弱拟杆菌；屎拟杆菌；卵形拟杆菌；内脏拟杆菌；多形拟杆菌；普通拟杆菌；青春双歧杆菌；两岐双岐杆菌；短双岐杆菌；链状双歧杆菌；齿双歧杆菌；长双歧杆菌；沃氏嗜胆菌；洋葱伯克霍尔德菌；溶纤维丁酸弧菌；简明弯曲菌；曲形弯曲菌；纤细弯曲菌；空肠弯曲菌；直肠弯曲菌；昭和弯曲菌；黄褐二氧化碳嗜纤维菌；西地西菌属种；弗氏柠檬酸杆菌；克氏柠檬酸杆菌；梭菌属种；惰性脱硫单胞菌；异型瘤菌属种；侵蚀艾肯菌；产气肠杆菌；阴沟肠杆菌；日沟维肠杆菌；阪崎肠杆菌；泰勒肠杆菌；肠球菌属种；大肠杆菌；费格森埃希菌；赫氏埃希菌；伤口埃希菌；真杆菌属种；大芬戈尔德菌；微生子梭杆菌；死亡梭杆菌；舟形梭杆菌；坏死梭杆菌；核粒梭杆菌；拉氏梭杆菌；可变梭杆菌；阴道加德菌；麻疹病毒孪生球菌；球链菌属种；蜂房哈夫尼菌；螺杆菌属种；克雷伯氏杆菌属种；嗜酸乳杆菌；发酵乳杆菌；罗伊氏乳杆菌；唾液乳杆菌；非脱羧勒克菌；勒米诺菌属种；埃氏巨型球菌；多酸光岗菌；弯曲动弯杆菌；羞怯动弯杆菌；威斯康星米勒菌；摩氏摩根菌；成团泛菌；小球菌属种；不解糖嗜胨菌；厌氧性消化链球菌；产生消化链球菌；不解糖卟啉单胞菌；奇异变形杆菌；彭氏变形杆菌；普通变形杆菌；雷氏普罗威登斯菌；斯氏普罗威登斯菌；铜绿假单胞菌；
肠内滴虫；生产瘤胃球菌；液化沙雷菌；粘质沙雷氏菌；气味沙雷菌；无乳链球菌；咽峡炎链球菌；牛链球菌；星座链球菌；中间链球菌；C+G组链球菌；溶糊精琥珀酸弧菌；萨特氏菌属种；极尖泰氏菌；韦荣球菌属种；气杆菌属种；炭疽杆菌；蜡样芽孢杆菌；其它杆菌属种；回归热螺旋体；布鲁氏菌属种；大肠弯曲菌；胎儿弯曲菌；空肠弯曲菌；生痰弯曲菌；双酶梭菌；肉毒杆菌；艰难梭菌；吲哚梭菌；曼氏梭菌；产气荚膜梭菌；索氏梭菌；产孢梭菌；近端梭菌；迟缓爱德华氏菌；土拉弗朗西斯菌；单核细胞增多性李斯特菌；牛分枝杆菌；结核分枝杆菌；小球菌属种；类志贺邻单胞菌；立氏立克次氏体；沙门氏菌属种；鲍氏志贺氏菌；痢疾志贺菌；
福氏志贺菌；宋内志贺菌；其它螺旋菌属种；兽疫链球菌；惠普尔养障体；霍乱弧菌；河流孤菌；弗尼斯氏弧菌；霍氏弧菌；副溶血弧菌；小肠结肠炎耶尔森氏菌；假结核耶尔森氏菌；单纯疱疹病毒(1和2)；巨细胞病毒；腺病毒；正呼肠孤病毒；轮状病毒；甲病毒；冠状病毒；环曲病毒；人偏肺病毒；水疱性口腔炎病毒；马丘波病毒；胡宁病毒；脊髓灰质炎病毒；柯萨奇病毒；埃可病毒；甲型肝炎病毒；诺瓦克病毒及其它杯状病毒；星状病毒；小核糖核酸病毒；或戊型肝炎病毒。
肠内滴虫；生产瘤胃球菌；液化沙雷菌；粘质沙雷氏菌；气味沙雷菌；无乳链球菌；咽峡炎链球菌；牛链球菌；星座链球菌；中间链球菌；C+G组链球菌；溶糊精琥珀酸弧菌；萨特氏菌属种；极尖泰氏菌；韦荣球菌属种；气杆菌属种；炭疽杆菌；蜡样芽孢杆菌；其它杆菌属种；回归热螺旋体；布鲁氏菌属种；大肠弯曲菌；胎儿弯曲菌；空肠弯曲菌；生痰弯曲菌；双酶梭菌；肉毒杆菌；艰难梭菌；吲哚梭菌；曼氏梭菌；产气荚膜梭菌；索氏梭菌；产孢梭菌；近端梭菌；迟缓爱德华氏菌；土拉弗朗西斯菌；单核细胞增多性李斯特菌；牛分枝杆菌；结核分枝杆菌；小球菌属种；类志贺邻单胞菌；立氏立克次氏体；沙门氏菌属种；鲍氏志贺氏菌；痢疾志贺菌；
福氏志贺菌；宋内志贺菌；其它螺旋菌属种；兽疫链球菌；惠普尔养障体；霍乱弧菌；河流孤菌；弗尼斯氏弧菌；霍氏弧菌；副溶血弧菌；小肠结肠炎耶尔森氏菌；假结核耶尔森氏菌；单纯疱疹病毒(1和2)；巨细胞病毒；腺病毒；正呼肠孤病毒；轮状病毒；甲病毒；冠状病毒；环曲病毒；人偏肺病毒；水疱性口腔炎病毒；马丘波病毒；胡宁病毒；脊髓灰质炎病毒；柯萨奇病毒；埃可病毒；甲型肝炎病毒；诺瓦克病毒及其它杯状病毒；星状病毒；小核糖核酸病毒；或戊型肝炎病毒。
[0254] 在替代方面中，本发明可涉及用哺乳动物PRR激动剂的人工库的配制剂治疗免疫失调，所述PRR激动剂概括了微生物哺乳动物病原体的PRR激动剂特征的独特部分，所述病原体是常见的小肠和大肠病原体，例如：大肠杆菌、艰难梭菌、脆弱拟杆菌、普通拟杆菌、多形拟杆菌、产气荚膜梭菌、肠炎沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、福氏志贺菌；腺病毒、星状病毒、杯状病毒、诺瓦克病毒、轮状病毒和巨细胞病毒。
[0255] 在选择的实施方案中，本发明涉及评估患者先前对生物体的暴露的诊断步骤。例如，诊断步骤可包括采集对所选病原体的暴露的病史，和/或评估患者对所选病原体的免疫应答。例如，可进行血清学测试以检测在患者血清中针对所选病原体的抗体。关于本发明的此方面，所选病原体的抗原决定簇可基于以下诊断指示被选出用于免疫原性组合物中例如借助于在患者血清中针对所述病原体的抗原决定簇的抗体的存在用于所选患者上：所述患者先前一次或多次暴露于所述病原体。
[0256] 在其它选择的实施方案中，本发明涉及评估患者对用所选免疫原性组合物的治疗的免疫应答的诊断步骤。例如，诊断步骤可包括评估患者对所述免疫原性组合物的免疫决定簇的免疫应答，例如，使用血清测试来检测针对那些免疫原性决定簇的抗体。关于本发明的此方面，如果评估指出存在针对所述组合物的免疫原性决定簇的积极免疫应答，那么用所选免疫原性组合物的治疗可继续；并且如果评估指出不存在针对所述免疫原性组合物的免疫原性决定簇的充分积极的免疫应答，那么所述治疗可中止，并且可开始用不同免疫原性组合物的替代治疗。
[0257] 本发明的配制剂的免疫调节性质可用于治疗以病理性免疫失调为特征的多种疾病，例如，使用来源于内源性病原体或外源性病原体的PRR激动剂，所述病原体在免疫失调在其中有症状或有表现的组织或器官中有致病性，包括细菌性、病毒性和真菌性病原体。表8列出了以免疫失调为特征的疾病，其可根据本发明的替代方面进行治疗。
[0258] 表8：免疫失调疾病的列表
[0259]
[0260]
[0261]
[0262]
[0263]
[0264]
[0265]
[0266] 如上表中所提供，关节炎是慢性炎性疾病。具体说来，关节炎被理解为一个或多个关节的炎症的描述。存在许多类型的关节炎或具有关节炎症状的病状，包括(但不限于)以下：强直性脊柱炎、白塞氏病、埃-当二氏综合征、家族性地中海热、纤维肌痛、传染性红斑(fifth disease)、巨细胞性动脉炎、痛风、血色病、亨-舍二氏紫癜、伴有回归热的高免疫球蛋白血症D、炎性肠病性关节炎(包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)、幼年型类风湿性关节炎、幼年脊柱关节病、莱姆疾病、马凡综合征、骨关节炎、假痛风、牛皮癣关节炎、反应性关节炎(莱特尔氏综合征)、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、SEA综合征(血清阴性、末端病、关节病)、干燥综合征、斯提耳氏病(Still’s disease)、全身性红斑狼疮(SLE)、TNF受体相关的周期性综合征和韦格纳氏肉芽肿病(及其它脉管炎综合征)。
[0267] 筛选
[0268] 可有利地例如通过一级序列分析或通过表观遗传变化的分析针对先天免疫病症如遗传病症对患者进行筛选。例如，已经鉴别了与涉及先天免疫的基因产物有关的多种遗传病症(参见Mogensen T.,2009,Clinical Microbiology Reviews,第22卷,第2期,第240-273页)，如TLR基因(TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7和TLR9)、信号传导蛋白基因(MyD88、Mal、IRAK1、IRAK4、NEMO、IκBα、IRF5)、NLR基因(NOD2、NALP1、NALP3)及其它(CD14、UNC93B)。经鉴定为患有与受损的TLR信号传导或NF-κB活化有关的孟德尔(Medelian)原发性免疫缺陷的患者可例如不受益于一些实施方案，或可需要适于其病状的手段。在编码先天信号传导途径的组分的基因中具有多态性的患者也可在用SSI治疗之前被鉴别，例如，在编码含有TIR-结构域的衔接子诱导的β干扰素(TRIF)的基因中具有突变。
[0269] 存在用于逃避先天性免疫系统的多种微生物策略(Mogensen T.,2009,Clinical Microbiology Reviews,第22卷,第2期,第240-273页)，并且本发明的实施方案可因此适于避免此类策略对触发先天性应答的抑制作用。所选实施方案提供缺乏阻止TLR信号传导的毒力因子的重组微生物，如缺乏含有TIR结构域的蛋白的重组大肠杆菌(Cirl,C.等人,2008,Nat.Med.14:399–406)。革兰氏阴性细菌配制剂可有利地包含由TLR(如TLR4)识别的LPS，而非不由TLR识别的LPS形式(Hornef,M.W.等人,2002,Nat.Immunol.3:1033–1040)。类似地，细菌配制剂可有利地包含激活TLR(如TLR5)而非不激活的一类鞭毛蛋白(Andersen-Nissen,E.等人,2005,Proc.Natl.Acad.Sci.USA102:9247–9252)。在一些实施方案中，可有利地排除蛋白水解降解所触发的先天性应答的重要组分的肽酶，如墨西哥利什曼原虫的无鞭毛体特异性半胱氨酸肽酶，其可蛋白水解降解IκB和NF-κB(Cameron,P.等人,2004,J.Immunol.173:3297–3304)。在替代实施方案中，这些不希望有的组分可通过适当的制造步骤(以例如洗涤或分级分离微生物制剂以便除去组分)从配制剂中除去。
[0270] 可例如通过鉴别PRR基因中的多态性(参见WO 2009003905)对患者进行基因分型。与炎症及免疫相关疾病和病症有关的基因可例如是筛选如下的受试者：AIDS(KIR3DL1、NKAT3、NKB1、AMB11、KIR3DS1、IFNγ、CXCL12、SDF1)；自身免疫性淋巴细胞增生综合征(TNFRSF6、APT1、FAS、CD95、ALPS1A)；联合免疫缺陷(IL2RG、SCIDX1、SCIDX、IMD4)；HIV-1(CCL5、SCYA5、D17S136E、TCP228)、HIV易感性或感染(IL10、CSIF、CMKBR2、CCR2、CMKBR5、CCCKR5(CCR5))；免疫缺陷(CD3E、CD3G、AICDA、AID、HIGM2、TNFRSF5、CD40、UNG、DGU、HIGM4、TNFSF5、CD40LG、HIGM1、IGM、FOXP3、IPEX、AIID、XPID、PIDX、TNFRSF14B、TACI)；炎症(IL-10、IL-1(IL-1a、IL-1b)、IL-13、IL-17(IL-17a(CTLA8)、IL-17b、IL-17c、IL-17d、IL-17f)、II-
23、Cx3cr1、ptpn22、TNFa、IBD的NOD2/CARD15、IL-6、IL-12(IL-12a、IL-12b)、CTLA4、Cx3cl1)；严重联合免疫缺陷(SCIDs)(JAK3、JAKL、DCLRE1C、ARTEMIS、SCIDA、RAG1、RAG2、ADA、PTPRC、CD45、LCA、IL7R、CD3D、T3D、IL2RG、SCIDX1、SCIDX、IMD4)。或者，可例如筛选涉及所选的信号传导途径的基因，由此鉴别例如大致容易接受SSI治疗的患者，如：GM-CSF信号传导(LYN；ELK1；MAPK1；PTPN11；AKT2；PIK3CA；CAMK2A；STAT5B；PIK3CB；PIK3C3；GNB2L1；
BCL2L1；MAPK3；ETS1；KRAS；RUNX1；PIM1；PIK3C2A；RAF1；MAP2K2；AKT1；JAK2；PIK3R1；STAT3；
MAP2K1；CCND1；AKT3；STAT1)；IL-10信号传导(TRAF6；CCR1；ELK1；IKBKB；SP1；FOS；NFKB2；
MAP3K14；MAPK8；MAPK13；RELA；MAPK14；TNF；IKBKG；RELB；MAP3K7；JAK1；CHUK；STAT3；NFKB1；
JUN；IL1R1；IL6)；Toll样受体信号传导(IRAK1；EIF2AK2；MYD88；TRAF6；PPARA；ELK1；IKBKB；
FOS；NFKB2；MAP3K14；MAPK8；MAPK13；RELA；TLR4；MAPK14；IKBKG；RELB；MAP3K7；CHUK；NFKB1；
TLR2；JUN)。
23、Cx3cr1、ptpn22、TNFa、IBD的NOD2/CARD15、IL-6、IL-12(IL-12a、IL-12b)、CTLA4、Cx3cl1)；严重联合免疫缺陷(SCIDs)(JAK3、JAKL、DCLRE1C、ARTEMIS、SCIDA、RAG1、RAG2、ADA、PTPRC、CD45、LCA、IL7R、CD3D、T3D、IL2RG、SCIDX1、SCIDX、IMD4)。或者，可例如筛选涉及所选的信号传导途径的基因，由此鉴别例如大致容易接受SSI治疗的患者，如：GM-CSF信号传导(LYN；ELK1；MAPK1；PTPN11；AKT2；PIK3CA；CAMK2A；STAT5B；PIK3CB；PIK3C3；GNB2L1；
BCL2L1；MAPK3；ETS1；KRAS；RUNX1；PIM1；PIK3C2A；RAF1；MAP2K2；AKT1；JAK2；PIK3R1；STAT3；
MAP2K1；CCND1；AKT3；STAT1)；IL-10信号传导(TRAF6；CCR1；ELK1；IKBKB；SP1；FOS；NFKB2；
MAP3K14；MAPK8；MAPK13；RELA；MAPK14；TNF；IKBKG；RELB；MAP3K7；JAK1；CHUK；STAT3；NFKB1；
JUN；IL1R1；IL6)；Toll样受体信号传导(IRAK1；EIF2AK2；MYD88；TRAF6；PPARA；ELK1；IKBKB；
FOS；NFKB2；MAP3K14；MAPK8；MAPK13；RELA；TLR4；MAPK14；IKBKG；RELB；MAP3K7；CHUK；NFKB1；
TLR2；JUN)。
[0271] 另外，患者可例如针对位于与炎性病症有关的基因组的非编码区中的SNP进行基因分型，如通过公开可获得的GWAS数据集所鉴别的SNP，例如在连接到序列上的基因组区域中的SNP，所连接的序列在免疫功能相关的基因表达中发挥调控作用。
[0272] 替代实施方案
[0273] 虽然本文公开了本发明的各种实施方案，但可根据本领域技术人员的普通常识在本发明的范围内进行许多调整和修改。这种修改包括为了达到相同的效果以大体相同的手段对本发明任一方面进行已知等同物的替代。数值范围包括定义该范围的数值，并且包括在各自范围内的所有数值和分数。本文中所用的词语“包含(comprising)”是开放性术语，基本上相当于短语“包括但不限于”，且词语“含有(comprises)”也具有相应的含义。术语如“基本上由……组成(consisting essentially of)”和“基本上由……组成(consists essentially of)”允许未明确列举的要素，但排除现有技术中可找到的要素或影响本发明的基础或新颖特征的要素。除非文中另外清楚指出，如本文所用的单数形式“一种”、“一个”和“所述”包括复数指示物。因此，例如，提及“某物”包括一个以上此物。本文对参考文献的引用并非承认这些参考文献是本发明的现有技术。本说明书中引用的任何优先权文件和所有公开出版物，包括但不限于专利和专利申请，以引用的方式并入本文，就如同每一出版物明确且单独地指出将其以引用的方式并入本文一般，并且就像在本文中对其进行了完全阐述一样。本发明包括大体上如前所述并参照实施例和附图的所有实施方案和变型。本文不旨在作为所有实施方案有任何特定用途的承诺。
[0274] 如本文所用，术语“约”或“大致”当涉及可测量的值(如参数、量、持续时间等)时，意在包括指定值的+/-20％或更小、优选+/-10％或更小、更优选+/-5％或更小、且仍更优选+/-1％或更小的变化，只要这种变化对于实施所公开的发明是适当的。应理解，修饰语“约”或“大致”所涉及的值本身也被具体地且优选地公开。
[0275] 在本发明中引用的所有参考文献据此以引用的方式整体并入。具体说来，本文中具体提及的所有参考文献的教导以及本文中引用的文献中引用的所有文献以引用的方式并入。
[0276] 阐述重组DNA技术的一般原理的标准参考著作包括：Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,第1-3卷,Sambrook等人编著,Cold Spring Harbor
Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989；Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel等人编著,Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York,
1992(定期更新)(“Ausubel等人1992”)；the series Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；Innis等人,PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Academic Press:San Diego,1990；PCR 2:A Practical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编著(1995)；Harlow和Lane编著(1988)Antibodies,a Laboratory Manual；and Animal Cell Culture(R.I.Freshney编著(1987)。微生物学的一般原理阐述于例如Davis,B.D.等人,Microbiology,第3版,Harper&Row,publishers,Philadelphia,Pa.(1980)中。
Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989；Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel等人编著,Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York,
1992(定期更新)(“Ausubel等人1992”)；the series Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；Innis等人,PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Academic Press:San Diego,1990；PCR 2:A Practical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编著(1995)；Harlow和Lane编著(1988)Antibodies,a Laboratory Manual；and Animal Cell Culture(R.I.Freshney编著(1987)。微生物学的一般原理阐述于例如Davis,B.D.等人,Microbiology,第3版,Harper&Row,publishers,Philadelphia,Pa.(1980)中。
[0277] 在本说明书通篇中对“一个实施方案”或“一实施方案””的提及意在表示关于包括在本发明的至少一个实施方案中的实施方案所述的具体特点、结构或特征。因此，短语“在一个实施方案中”或“在一实施方案中”在本说明书通篇的不同地方的出现不一定都指的是相同实施方案，但也可以是。此外，正如对于本领域技术人员显而易见的那样，在一个或多个实施方案中，可以按任何合适的方式组合具体的特点、结构或特征。此外，尽管本文所述的一些实施方案包括其它实施方案中所包括的某些特点但不包括其它特点，但是不同实施方案的特点的组合意在落入本发明的范围内并且形成不同实施方案，如本领域的技术人员可以理解的。例如，在所附权利要求书中，所要求保护的实施方案的任一个可以任何组合形式使用。
[0278] 在本发明的此描述中，将参考形成其一部分的附图，且附图仅通过实施本发明的特定实施方案的说明来示出。应理解，可利用其它实施方案并且可在不脱离本发明范围的情况下进行结构或逻辑的改变。因此，该描述没有限制含义，并且本发明的范围由所附权利要求限定。
[0279] 除非明确相反地指出，优选叙述(特征)和实施方案可与任何其它特征或实施方案组合。具体说来，指出为优选或有利的任何特征都可与指出为优选或有利的任何其它一个或多个特征或叙述组合。
[0280] 在一些实施方案中，本发明排除涉及医学或外科治疗的步骤。类似地，在一些实施方案中，本发明不要求保护天然存在的实施方案，以使得本发明的方面仅涉及人为的组合物。此外，在本发明的选择方面中，因此不要求保护先前已知的产品、制备产品的方法或使用产品的方法。
[0281] 通用代号和缩写：
[0282] SSI 部位特异性免疫调节剂
[0283] MC-38 鼠科结肠腺癌细胞系
[0284] PD1 程序化细胞死亡1
[0285] OD 光密度
[0286] IP 腹膜内
[0287] SC 皮下
[0288] SOP 标准操作方案
[0289] RPM 每分钟转数
[0290] EDTA 乙二胺四乙酸
[0291] ANOVA 方差分析
[0292] Ly6G 淋巴细胞抗原6复合体，基因座G
[0293] Ly6C 淋巴细胞抗原6复合体，基因座C
[0294] CD45 分化簇45
[0295] SD 标准偏差
[0296] NA 无值；不适用；不存在
[0297] Rae1 核糖核酸输出1
[0298] CD3 分化簇3
[0299] CD11b 分化分子簇11B
[0300] KO 敲除
[0301] PBS 磷酸盐缓冲盐水
[0302] NKG2D 天然杀伤组2，成员D
[0303] g 克
[0304] μM 微米
[0305] μL 微升
[0306] hr 小时
[0307] min 分钟
[0308] QBECO 大肠杆菌全灭活细胞SSI
[0309] QBKPN 肺炎克雷伯氏杆菌亲缘分支组III(也称为变栖克雷伯氏杆菌)全灭活细胞SSI
[0310] QBSAU 金黄色葡萄球菌全灭活细胞SSI实施例
[0311] 实施例1：重组微生物
[0312] 大肠杆菌和马尔他布鲁氏菌(Brucella melitensis)中的毒力因子家族(称为含有TIR结构域的蛋白)通过直接结合至MyD88阻止TLR信号传导，由此抑制先天免疫并增强细菌毒力。本发明的方面因此提供缺乏含有TIR结构域的蛋白的表达的重组细菌、或妨碍对病原体的先天性宿主免疫应答的其它毒力因子。
[0313] 金黄色葡萄球菌
[0314] 在选择的实施方案中，组合物可由重组金黄色葡萄球菌菌株来制备。例如，具有以下等位基因的序列型ST-291或同源序列的菌株与以下各物至少99％相同：arcc-3、aroe-37、glpf-19、gmk-2、pta-20、tpi-26和yqil-32(Larsen等人,2012,O.J.Clin.Micobiol 50(4):1355-1361)。菌株可完全缺乏针对以下类别抗生素的抗性基因：氨基糖苷类、β-内酰胺、氟喹诺酮类、磷霉素、梭链孢酸、MLS-大环内酯、林可酰胺和链霉杀阳菌素B、硝基咪唑、噁唑烷酮、利胆醇、利福平、磺胺、四环素、甲氧苄啶和糖肽。或者，菌株可具有一个或多个抗性基因，如blaZβ-内酰胺抗性基因(登记AP004832)。类似地，菌株可包含或不包含一种或多种毒力因子基因(Cosentino等人,2013,PLoS ONE 8(10):e77302)，所述基因与选定的数据库序列(在下表中由登记号鉴别)具有例如至少90％、95％、99％或100％同一性。[列举缺乏白细胞毒素的菌株，特别是靶向先天性免疫系统]
[0315] 表9：金黄色葡萄球菌-粘附毒力因子
[0316]
[0317]
[0318] 表10：金黄色葡萄球菌-毒素毒力因子
[0319]
[0320]
[0321] 表11：金黄色葡萄球菌-胞外酶毒力因子
[0322]毒力因子 蛋白质功能 登记号
geh 甘油酯水解酶 HE681097.1
hysA 透明质酸酶 BA000018.3
nuc 耐热核酸酶 BA000018.3
sspA 丝氨酸V8蛋白酶 FR821779.1
sspB 半胱氨酸蛋白酶 BX571856.1
sspC 半胱氨酸蛋白酶 CP003808.1
nuc 耐热核酸酶 CP003808.1
splA 丝氨酸蛋白酶splA CP003194.1
splC 丝氨酸蛋白酶splC BX571856.1
splB 丝氨酸蛋白酶splB CP002110.1
sak 葡萄球菌激酶 CP000253.1
scn 补体抑制剂SCIN CP002120.1
splE 丝氨酸蛋白酶splE BX571856.1
splF 丝氨酸蛋白酶splF CP002110.1
geh 甘油酯水解酶 AM990992.1
sspB 半胱氨酸蛋白酶 CP002110.1
hysA 透明质酸酶 AM990992.1
geh 甘油酯水解酶 HE681097.1
hysA 透明质酸酶 BA000018.3
nuc 耐热核酸酶 BA000018.3
sspA 丝氨酸V8蛋白酶 FR821779.1
sspB 半胱氨酸蛋白酶 BX571856.1
sspC 半胱氨酸蛋白酶 CP003808.1
nuc 耐热核酸酶 CP003808.1
splA 丝氨酸蛋白酶splA CP003194.1
splC 丝氨酸蛋白酶splC BX571856.1
splB 丝氨酸蛋白酶splB CP002110.1
sak 葡萄球菌激酶 CP000253.1
scn 补体抑制剂SCIN CP002120.1
splE 丝氨酸蛋白酶splE BX571856.1
splF 丝氨酸蛋白酶splF CP002110.1
geh 甘油酯水解酶 AM990992.1
sspB 半胱氨酸蛋白酶 CP002110.1
hysA 透明质酸酶 AM990992.1
[0323] 表12：金黄色葡萄球菌-宿主免疫逃避毒力因子
[0324]
[0325]
[0326] 表13：金黄色葡萄球菌-分泌系统毒力因子
[0327]
[0328] 重组菌株可包含一种或多种质粒(Carattoli等人,2014,Antimocrobial Agents and Chemotherapy 58(7):3895-3903)，例如与质粒rep5(登记NC005011)或质粒rep16(登记CP002115.1)具有90％、95％、99％或100％同一性。
[0329] 克雷伯氏杆菌属种
[0330] 在选择的实施方案中，组合物可由重组克雷伯氏杆菌菌株来制备，如肺炎克雷伯氏杆菌或变栖克雷伯氏杆菌(以前鉴别为肺炎克雷伯氏杆菌)。例如，具有以下等位基因的序列型或同源序列的菌株与以下各物至少99％相同：gapa16、infb24、mdh30、pgi40、phoe92、rpob17、tonb67。菌株可完全缺乏针对以下类别抗生素的抗性基因：氨基糖苷类、β-内酰胺、氟喹诺酮类、磷霉素、梭链孢酸、MLS-大环内酯、林可酰胺和链霉杀阳菌素B、硝基咪唑、噁唑烷酮、利胆醇、利福平、磺胺、四环素、甲氧苄啶和糖肽。或者，菌株可具有一个或多个抗性基因，如blaLEN24β-内酰胺抗性基因(登记AM850914)。类似地，菌株可包含或不包含下表中所鉴别的一种或多种毒力因子(参见，Letícia等人,2014,BMC Biology 12:41)。
[0331] 表14：KPN毒力因子
[0332]
[0333]
[0334] 大肠杆菌(前列腺)
[0335] 在选择的实施方案中，组合物可由重组大肠杆菌菌株来制备，所述重组大肠杆菌菌株特别适于前列腺免疫功能障碍的疗法。例如，具有以下等位基因的序列型或同源序列的菌株与以下各物至少99％相同：adk-37、fumc-38、gyrb-19、icd-37、mdh-151、pura-11、reca-26(序列型1231)。菌株可完全缺乏针对以下类别抗生素的抗性基因：氨基糖苷类、β-内酰胺、氟喹诺酮类、磷霉素、梭链孢酸、MLS-大环内酯、林可酰胺和链霉杀阳菌素B、硝基咪唑、噁唑烷酮、利胆醇、利福平、磺胺、四环素、甲氧苄啶和糖肽。类似地，菌株可包含或不包含一种或多种毒力因子基因，这些基因与选定的数据库序列(在下表中由登记号鉴别)具有例如至少90％、95％、99％或100％同一性。菌株也可缺乏stx全毒素毒力因子。
[0336] 表15：大肠杆菌-毒力因子
[0337]毒力因子 蛋白质功能 登记号
iroN 肠杆菌素铁载体受体蛋白 CP000243
sfaS S-菌毛小亚基 CP000243
senB 编码质粒的肠毒素 CP000038
iss 增加的血清存活 CU928160
gad 谷氨酸脱羧酶 CP002167
cnf1 细胞毒性坏死因子 CP002167
ccI 阴沟肠道菌素 DQ298019
iroN 肠杆菌素铁载体受体蛋白 CP000243
sfaS S-菌毛小亚基 CP000243
senB 编码质粒的肠毒素 CP000038
iss 增加的血清存活 CU928160
gad 谷氨酸脱羧酶 CP002167
cnf1 细胞毒性坏死因子 CP002167
ccI 阴沟肠道菌素 DQ298019
[0338] 大肠杆菌菌株的血清型可例如为O18ac:H7，例如，表示H型血清型基因fliC(登记AF228492、和O型血清型基因wzx(登记GU299793)和wzy(登记GU299793)的存在。
[0339] 重组菌株可包含一种或多种质粒，例如与质粒IncFIB(登记AP001918)和/或质粒IncFII(29)(登记CP003035)和/或质粒ColRNAI(登记DQ298019)和/或质粒Col156(登记NC009781)具有90％、95％、99％或100％同一性。
[0340] 重组大肠杆菌可例如来源于与大肠杆菌UT189具有至少80％、90％或95％序列同一性的大肠杆菌菌株(参见Chen等人,2006,Proc Natl Acad Sci U S A 103:5977-82)。
[0341] 大肠杆菌(结肠)
[0342] 在选择的实施方案中，组合物可由重组大肠杆菌菌株来制备，所述重组大肠杆菌菌株特别适于结肠免疫功能障碍的疗法。例如，具有以下等位基因的序列型或同源序列的菌株与以下各物至少99％相同：adk-76、fumc-43、gyrb-9、icd-36、mdh-404、pura-14、reca-10(序列型ST-5292)。菌株可完全缺乏针对以下类别抗生素的抗性基因：氨基糖苷类、β-内酰胺、氟喹诺酮类、磷霉素、梭链孢酸、MLS-大环内酯、林可酰胺和链霉杀阳菌素B、硝基咪唑、噁唑烷酮、利胆醇、利福平、磺胺、四环素、甲氧苄啶和糖肽。或者，菌株可具有一种或多种抗性基因，如strB或strA氨基糖苷类抗性基因(登记号M96392或AF321551)、和/或sul1磺胺抗性基因(登记AY224185)、和/或sul2磺胺抗性基因(登记GQ421466)、和/或dfrA5甲氧苄啶抗性(登记X12868)。类似地，菌株可包含或不包含一种或多种毒力因子基因，这些基因与选定的数据库序列(在下表中由登记号鉴别)具有例如至少90％、95％、99％或100％同一性。菌株还可具有与stx全毒素毒力因子基因stx1(登记M19437)具有至少95％或99％或
100％同一性的基因。
100％同一性的基因。
[0343] 表16：大肠杆菌-毒力因子
[0344]
[0345]
[0346] 大肠杆菌菌株的血清型可例如为O117:H7，例如表示H型血清型基因fliC(登记AF228492，和O型血清型基因wzx(登记EU694096)的存在。
[0347] 重组菌株可包含一种或多种质粒，如下表中所列。
[0348] 表17：大肠杆菌质粒
[0349]质粒 注解 登记号
IncFII(pRSB107) pRSB107 AJ851089
IncB/O/K/Z CU928147
Col(BS512) NC_010656
IncFIB(AP001918) AP001918
IncB/O/K/Z GU256641
Col156 NC_009781
IncFII AY458016
IncFII(pRSB107) pRSB107 AJ851089
IncB/O/K/Z CU928147
Col(BS512) NC_010656
IncFIB(AP001918) AP001918
IncB/O/K/Z GU256641
Col156 NC_009781
IncFII AY458016
[0350] 重组大肠杆菌(结肠)可例如来源于与大肠杆菌SE15或任何O117:H7血清型大肠杆菌具有至少80％、90％或95％序列同一性的大肠杆菌菌株。
[0351] 实施例2：最小SSI配制剂
[0352] 此实施例说明在包含TLR激动剂和微生物抗原的最小SSI配制剂中的适度功效。在此实施例中，TLR激动剂为TLR2/6激动剂、二酰化的脂蛋白(InVivogen Pam2CSK4)和TLR4激动剂(LPS,Sigma L1519)。微生物抗原是来自肺炎克雷伯氏杆菌(CUSABIO CSB-EP340587KBG)的重组外膜蛋白A(ompA)。将这些组分在一起配制于脂质体媒介物中，并且根据图1所示的治疗时间轴在SSI疗法的鼠科模型中施用。如图2所示，仅有TLR的脂质体与TLR+Ag脂质体构建体具有不同的活性程度，表明替代免疫原性途径的结合可加强SSI作用。重要的是注意到，在此数据的情形中，这些最小配制剂的抗原组分在大肠杆菌中重组地表达，制造商给出的纯度为>90％(SDS-PAGE)，附带特征是抗原制剂包含另外的细菌组分，包括另外的PRR激动剂，其充当另外的先天免疫原。
[0353] 实施例3：SSI介导MyD88-/-小鼠中的抗肿瘤活性
[0354] 先天性免疫防御中的病原体识别和炎症信号传导涉及许多途径，包括MyD88依赖性和非MyD88依赖性途径(Mogensen,2009,Clinical Microbiology Reviews,22(2):240)。在此实施例中，使用MyD88-/-小鼠的商用品系中的B16黑素瘤模型，观察到B16肿瘤负荷在MyD88小鼠中相对于B6小鼠是提高的(遗传上匹配，除MyD88敲除外)。这与文献报道一致的是：MyD88敲除固有地不太能控制疾病。在用克雷伯氏杆菌SSI(“KPN SSI”)的SSI疗法的模型中，在WT B6和MyD88敲除小鼠中在KPN SSI治疗之后都观察到显著降低的肿瘤负荷。证明SSI可以非MyD88依赖性方式发挥作用，至少部分表明替代PRR信号传导途径(通常认为的经典TLR信号传导除外)参与了SSI介导的先天性免疫应答。这与另一示例性观察结果一致：
NOD样受体NLRP3在用KPN SSI和ECO SSI处理的培养细胞中是上调的。或者，在一些实施方案中，SSI可经由在TLR下游处除MyD88以外的衔接子(如TRIF)介导经典TLR信号传导。此外，在另外的研究中已显示SSI疗法可结合MyD88信号传导途径。总之，这些结果是可由SSI疗法结合的稳固且多样的PRR信号传导途径的证据。
NOD样受体NLRP3在用KPN SSI和ECO SSI处理的培养细胞中是上调的。或者，在一些实施方案中，SSI可经由在TLR下游处除MyD88以外的衔接子(如TRIF)介导经典TLR信号传导。此外，在另外的研究中已显示SSI疗法可结合MyD88信号传导途径。总之，这些结果是可由SSI疗法结合的稳固且多样的PRR信号传导途径的证据。
[0355] 实施例4：对相关菌株的预暴露增强SSI功效
[0356] 此实施例显示在一些实施方案中，生物体对微生物病原体的预暴露增强后续的SSI功效。
[0357] 在根据图3所示的治疗时间轴进行治疗的SSI疗法的动物模型中，用肺炎克雷伯氏杆菌的预感染增强使用克雷伯氏杆菌属的不同菌株的KPN SSI功效，而用肺炎链球菌的预感染未能诱导KPN SSI功效(在肺癌模型中)。如图4所示的结果显示SSI响应可需要或受益于生物体对至少密切相关的病原体的预暴露。这与来自肺炎克雷伯氏杆菌测试阴性但可携带产酸克雷伯氏杆菌(即常见于研究动物群体中的菌株)的群体的小鼠中KPN SSI活性的另一观察结果一致，表明在一些情况下，对产酸克雷伯氏杆菌的预暴露足以诱导对KPN SSI的响应性。来自Jackson Labs(JAX)的小鼠与来自Taconic(TAC)的小鼠相比在预暴露方面的差异在图4中是明显的，这表明即使没有预感染，肺炎链球菌(SPN)也不引发与来自JAX的小鼠中QBKPN所实现的相同治疗功效。在来源于TAC的小鼠中，预感染是QBKPN显示功效所需的。
[0358] 实施例5：灭活肺炎克雷伯氏杆菌治疗降低鼠科黑素瘤模型中的肿瘤负荷
[0359] 此实施例说明了使用热灭活的肺炎克雷伯氏杆菌SSI在转移样B16黑素瘤中的克雷伯氏杆菌介导的抗癌功效。KPN SSI的皮下注射显著地降低肿瘤负荷。此外，用热灭活的大肠杆菌(ECO SSI)或金黄色葡萄球菌(SAU SSI)的皮下治疗在肺肿瘤模型不具有治疗效果。这说明使用肺特异性病原体的皮下免疫诱导激活肺特异性抗肿瘤响应。为了说明预暴露对肺炎克雷伯氏杆菌的影响，在用KPN SSI皮下注射之前，将小鼠经由气管内感染暴露于活的肺炎克雷伯氏杆菌。对肺炎克雷伯氏杆菌的预暴露显著地提高KPN SSI诱导的抗肿瘤免疫以及在肺中的转移样B16黑素瘤的控制。在暴露小鼠中的抗肿瘤功效与单核细胞和中性粒细胞的流入有关，但与T细胞流入到肺中无关。总的来说，这些数据说明在一些实施方案中，对肺炎克雷伯氏杆菌的预暴露可诱导组织特异性免疫记忆，例如先天性免疫记忆，其介导肿瘤细胞溶解。
[0360] 实施例6：在皮肤癌模型中的部位特异性
[0361] 此实施例说明了金黄色葡萄球菌SSI在鼠科皮肤癌模型中的部位特异性。此实施例涉及浓缩的金黄色葡萄球菌SSI(10X QBSAU，在本文中命名为“QBSAUR”)以及克雷伯氏杆菌属种SSI、大肠杆菌SSI和安慰剂在B16皮肤肿瘤模型中的使用，其中在第0天将约100,000个B16黑素瘤细胞以100ul的体积注射到C57BL/6小鼠的右侧腹中。在第-10天开始SSI治疗并且继续直到第+12天。在第7天开始监测肿瘤体积，并且在第14天达到终点。图5-10的肿瘤体积结果显著说明了金黄色葡萄球菌SSI配制剂的部位特异性。
[0362] 实施例7：SSI的使用增强癌抗原应答
[0363] 此实施例说明了SSI(如克雷伯氏杆菌属种SSI，缩写为“KPN SSI”)与由转化的癌细胞(在此情况下，在B16黑素瘤动物模型中)表达的模型癌抗原(在此情况下，OVA或鸡蛋卵清蛋白)的组合作用。OVA并不天然存在于哺乳动物或细菌中，并且在C57Bl/6小鼠中有免疫原性，具有已知的CD4-和CD8-相关表位。在此实施例中，B16细胞已经被转染以表达胞质OVA蛋白，造成OVA表位在肿瘤MHC中的呈递，由此容许黑素瘤的OVA特异性T细胞识别。在一些研究中，使用完整蛋白；证明宿主免疫系统将蛋白加工成相关抗原。在其它研究中，使用纯化的OVA抗原(SIINFELK，I类限制的、CD8特异性抗原)。一些研究还使用OT1细胞(通过T细胞受体特异性地识别SIINFEKL的转基因CD8细胞)作为读出系统。
[0364] 所生成的数据提供关于混合有SSI的模型癌抗原的功效提高的证据。在一个结果中，在结合使用克雷伯氏杆菌属种SSI+OVA的治疗中与PBS+OVA相比(针对Tyrp1，即黑素瘤特异性基因，进行照相评估并通过定量PCR)可见减少的肿瘤结节计数。与此一致，KPN SSI+OVA提高OVA特异性CD8T细胞在肺中的比例。类似地，与有效的抗肿瘤免疫(粒酶B和IFN-γ)有关的基因的表达在KPN SSI+OVA的情况下与PBS+OVA相比有所增加。相同研究显示了在肺癌模型中的存活数据，其中克雷伯氏杆菌属种SSI+OVA示出了与对照相比存活的延长；且大肠杆菌SSI+OVA显示存活改善了很多。
[0365] 在一项替代研究中，观察到SSI诱导或增强表位扩散的过程(参见图11；且关于背景，参见Vanderlugt&Miller,2002,Nature Reviews Immunology 2,85-95)。在此研究中，将小鼠用克雷伯氏杆菌属种SSI治疗，然后用B16黑素瘤激发(IV)。5天后，使小鼠接受对黑素瘤中的天然癌抗原有特异性的TCR转基因细胞(Pmel T细胞)的过继性转移。还用FTY-720(芬戈莫德)治疗小鼠，以防止T细胞从淋巴结中出去并且容许从肿瘤的引流淋巴结回收细胞。评估所回收的pmel T细胞的活化状态，并且发现SSI提高T细胞在激活(即抗原暴露)的引流淋巴结中的比例。这提供了证据表明SSI可适于加强免疫原性癌抗原的加工和呈递，包括自体抗原和外源性施用的癌抗原。
[0366] 实施例8：组分配制剂
[0367] 此实施例涉及出于配制替代SSI的目的而进行的微生物制剂的分级分离。在替代实施方案中，级分可例如由以下来制备：细菌外膜(例如来自革兰氏阴性属种)；细菌内膜；梯度离心的沉淀(例如来自蔗糖梯度)；染色体DNA；荚膜糖蛋白级分；或肽聚糖级分，如肽聚糖菌蜕。在替代实施方案中，工程化或重组生物体可在SSI中使用，其中涉及与具体的细胞级分有关的途径的基因已被修饰，特别是涉及确定上述级分的组成的基因。
[0368] 关于细胞级分制剂，可例如使细菌生长并热灭活。可例如将细胞级分再悬浮于无菌盐水+0.4％苯酚中。可例如使用2步蔗糖密度梯度收集内膜，如例如在Methods in Enzymology,第125卷:309-328,1986中所述。可将在培育250ml细胞之后获得的细菌沉淀再悬浮于20％蔗糖、10mM Tris-HCl pH 8.0和50ug/ml DNA酶1中。可在23℃下培育细胞10min。然后可将细胞置于冰上并通过弗氏(French)压碎器在15,000psi下裂解两次；可在4℃下通过在5,000x g下离心10min除去未破裂的细胞。上清液可在2步蔗糖梯度(60％和
70％)上分层并在4℃的温度下在SW28吊桶式转头中在23,000rpm下离心18小时。可在20％与60％蔗糖之间的接合处收集内膜。可用无菌蒸馏水稀释蔗糖至低于20％并且可在4℃下将膜在超速离心机中在41,000rpm下沉淀1小时。可用无菌水洗涤内膜一次，然后再悬浮于无菌盐水+0.4％苯酚中。还可从60％与70％蔗糖梯度步骤之间的接合处收集粗的外膜制剂。
70％)上分层并在4℃的温度下在SW28吊桶式转头中在23,000rpm下离心18小时。可在20％与60％蔗糖之间的接合处收集内膜。可用无菌蒸馏水稀释蔗糖至低于20％并且可在4℃下将膜在超速离心机中在41,000rpm下沉淀1小时。可用无菌水洗涤内膜一次，然后再悬浮于无菌盐水+0.4％苯酚中。还可从60％与70％蔗糖梯度步骤之间的接合处收集粗的外膜制剂。
[0369] 例如肺炎克雷伯氏杆菌的染色体DNA可使用Qiagen Blood and Tissue midi试剂盒来制备。可收获来自每个菌株的15或40ml肉汤培养物的细胞。然后可遵循关于纯化总DNA的制造方案。
[0370] 证明了在B16肺癌模型中用肺炎克雷伯氏杆菌(KPN)外膜级分的组分配制剂的功效，其中从肿瘤细胞接种之前10天开始，通过静脉内注射每隔一天注射SSI。比较三种SSI，即全灭活的细胞KPN(QBKPN)、1X外膜(OM)级分(具有接近全细胞配制剂的外膜浓度的外膜浓度)和0.01X稀释度的外膜级分。如图47A所示，1X和0.01X KPN外膜级分(i)在肺的B16黑素瘤模型中都是有效的，呈剂量依赖性方式，其中1X级分具有与全灭活细胞配制剂相当的功效，1X和4X DNA级分也一样(ii)，而内膜级分显示了缺乏强统计显著性的剂量依赖性趋势(iii)。
[0371] 如图47B所示，在外膜SSI的10次注射之后，1X外膜级分以剂量依赖性方式提高Rae-1的表达。
[0372] 需要注意，在用肿瘤细胞接种之前，更高浓度的膜级分引起动物中的病理状况。具体说来，10X和20X外膜级分在小鼠中引发强毒性，如通过先天性细胞(单核细胞和中性粒细胞)向血液中的募集高度增加伴有健康状况恶化(例如，显著的重量减轻、步态、蜷缩姿势、眼睛病状)所证明。类似地，在一些实施方案中，浓缩的全细胞制剂不引发毒性。图47C示出了在肿瘤植入之前2天收集的血液中，在SSI或安慰剂的4次注射之后中性粒细胞和单核细胞血细胞计数的升高。
[0373] 如图47D中所示，KPN级分在B16肺癌模型中显示出与大肠杆菌级分相比的部位特异性优先肺活性。具体说来，与安慰剂对照相比，全QBKPN在降低肺肿瘤负荷中是有效的。全灭活大肠杆菌配制剂(QBECO)不如QBKPN有效。QBKPN级分(OM或DNA单独)是有效的。当组合(OM+DNA)时，QBKPN级分与全QBKPN大致同样有效。QBECO级分(OM、DNA或OM+DNA)不显示与QBKPN部分相同的功效。总之，其示出了与QBKPN级分，特别是组合的DNA(4x)和OM(1x)级分有关的部位特异性。
[0374] 实施例9：共配制和共施用
[0375] 此实施例说明了其中SSI与另外的治疗组分共配制或共施用的实施方案。
[0376] 一类另外的治疗组分包括用于激活或募集先天性免疫细胞的分子或组合物，并且它们包括：
[0377] -GMCSF(特别是对于癌症)，例如，其量协同地募集并促进中性粒细胞的产生并且增强SSI诱导的先天性免疫应答。
[0378] -维生素D(用于炎性疾病如IBD，和癌症)，例如，其量有效分化并激活单核细胞并且在调控先天性免疫功能起作用。在替代实施方案中，联合SSI使用的维生素D可例如是维生素D3、D2或钙三醇(1,25-二羟胆钙化醇)中的一种或多种。在一些实施方案中，维生素D3和/或D2可例如以有效在SSI和维生素D施用部位处提供局部有效量的钙三醇的剂量局部给予。例如，维生素D前体(D3和/或D2)可以一旦在施用部位处通过局部单核细胞和/或巨噬细胞(表达CYP27B1)转化为钙三醇活性形式便在局部有效的量施用。在替代实施方案中，钙三醇可以在SSI施用部位处局部有效的剂量施用，并且这可为例如小于其它全身性作用所需剂量的剂量。
[0379] 用于共配制或共施用的另一类治疗组分包括减轻免疫抑制的分子或组合物：
[0380] -NOHA(N(Ω)-羟基-正-L-精氨酸)，即精氨酸酶抑制剂-精氨酸酶降解免疫激活所需的精氨酸。NOHA可例如以通过产生可用的游离精氨酸来有效减轻免疫抑制的量使用。
[0381] -α1抗胰蛋白酶-例如，其量有效减轻通过分泌蛋白酶的中性粒细胞介导的免疫抑制。
[0382] 用于共配制或共施用的另一类治疗组分包括防止氧化损伤并改善应激下的免疫功能的分子或组合物：
[0383] -谷胱甘肽及其它抗氧化剂，特别是用于纤维化疾病(如IBD)。
[0384] 用于共配制或共施用的另一类治疗组分包括先天性细胞毒性淋巴细胞的共刺激分子(例如用于抗癌治疗)：
[0385] -磷酸抗原(类异戊二烯分子，如焦磷酸异戊烯)-由在抗癌响应中起重要作用的人外周血Vγ9Vδ2T细胞所识别，例如，其量有效激活并分化单核细胞，单核细胞与NK细胞协同起作用以靶向固体和液体癌。在示例性实施方案中，已发现SSI与唑来膦酸盐的共配制或共施用增加人外周血Vγ9Vδ2T细胞上的标志物(例如CD25和CD69)的激活。
[0386] -由I型NKT细胞识别的糖脂分子(如合成的α-半乳糖苷神经酰胺)
[0387] 如表18以及图12和13所示，在使用LLC模型的改善抗癌作用的SSI共配制剂的体内论证中，采用GMCSF和维生素D(D3)的共配制剂显示了最佳性能，然后是NOHA(精氨酸酶抑制剂)和α1-抗胰蛋白酶。
[0388] 表18：共配制剂-比较相对于安慰剂在肿瘤计数中的平均差
[0389]
[0390] 实施例10：结肠炎动物模型，抗炎功效
[0391] 此实施例说明了小鼠自发性结肠炎模型(Muc2敲除“KO”小鼠)的结果，该模型模拟了与克罗恩氏病和溃疡性结肠炎有关的潜在的免疫系统缺陷和慢性细菌感染。IBD患者通常在其正常保护性结肠粘膜屏障中表现出结构和/或功能缺陷。粘液屏障主要依赖于杯状细胞来源的粘蛋白(Muc2)的释放，Muc2防止微生物和腔内抗原接触胃肠道的上皮表面。Muc2KO小鼠在其刚断乳(1月龄)后是健康的，随着其年龄的增长，发生进行性腹泻和散发性直肠脱垂。结肠组织的组织学分析显示隐窝增生、隐窝脓肿、炎性细胞浸润和粘膜下层水肿。因此，Muc2KO小鼠具有缺陷型胃肠粘膜屏障并且之后自发性地发展成结肠炎，类似人中的溃疡性结肠炎。在此模型中，年幼的(2月龄)Muc2KO小鼠具有较不严重的结肠炎，且较年长的(3月龄)Muc2KO小鼠具有更严重的结肠炎。
[0392] 如图14A、14B和14C所示，来自此动物模型的结果说明大肠杆菌SSI(QBECO)减少结肠中的促炎性标志物(使用qPCR基因表达数据)。图14D说明了QBECO在结肠中在增加IL-18基因表达方面与QBKPN相比的部位特异性活性。IFN-γ表达数据尤其说明了SSI功效可如何受到结肠炎的阶段的影响(比较年长与年幼小鼠中的表达数据)。与由活化的T细胞产生的细胞因子(IBD炎症的标志物)有关的IL17A数据说明了在大肠杆菌SSI治疗之后炎症的此标志物的显著减少。因此，QBECO治疗大体上改善了组织病理学评分的所有组成部分，包括浸润、完整性、增生和水肿。T淋巴细胞在结肠组织中的浸润(IBD在患者和小鼠模型中的标志)因QBECO治疗而显著减轻。因此，此实施例说明SSI如QBECO可用于显著降低IBD模型中疾病的严重程度，包括大体上减轻适应性免疫系统的过度响应。
[0393] 还显示QBECO对胃肠微生物组具有积极的影响。肠道微生物组中细菌种的变化在IBD患者(和小鼠模型)中可为有害的(‘不健康的’细菌)或治疗性的(‘健康的’细菌)。一些细菌促进健康的免疫环境并可改善症状(例如，乳杆菌种)，而其它(例如，γ-变形菌门)则在IBD中具有有害影响。我们在QBECO SSI治疗之前和之后分析了肠道微生物组。如图15A和15B所示，QBECO SSI改善了Muc2小鼠的结肠中的生态失调，增加乳杆菌(健康的细菌种)的相对比例并减少γ-变形菌门(不健康的细菌种)的相对比例。如图15C所示，QBECO SSI还减轻了MUC2自发性结肠炎小鼠的结肠中的组织学炎症/损伤评分的所有方面(浸润、完整性、增生和水肿)。这些结果说明使用来源于GI病原体的配制剂(如QBECO)的SSI治疗对胃肠微生物组具有治疗效果。因此，本发明的方面涉及SSI(如大肠杆菌来源的SSI)用于治疗IBD中的生态失调的用途。
[0394] 总而言之，QBECO治疗显著地改善总体组织学评分并减轻结肠组织中的T细胞浸润。此外，观察到促炎介质在结肠(IL-17A)和血清(KC)中的减少。QBECO治疗不影响受累及组织中的调控性T细胞标志物(FoxP3)和抗炎生长因子(TGF-β)的表达。另外，SSI治疗的小鼠表现出抗微生物凝集素RegIII-β和RegIII-γ水平的降低。由QBECO引起的抗微生物凝集素的变化允许肠道微生物组的调整，由此带来γ-变形菌门的减少和乳杆菌的显著增加。
[0395] 实施例11：在哮喘/过敏症中的SSI功效
[0396] 此实施例提供了动物模型数据，这些数据说明了SSI疗法KPN SSI在治疗哮喘/过敏症中的功效。如图16所示，KPN SSI减少哮喘小鼠中的总BAL细胞计数。如图17所示，KPN SSI减少BAL中的嗜酸性粒细胞和淋巴细胞计数：A)嗜酸性粒细胞，B)淋巴细胞。如图18所示，KPN SSI减少BAL上清液中的TH2细胞因子：A)IL-4，B)IL-5。
[0397] 实施例12：SubQ施用的SSI的全身分布
[0398] 此实施例示出了在鼠科模型中皮下施用的KPN SSI的全身分布；使用花青染料(Cy5.5)标记的全灭活KPN细胞及光学体内背侧和腹侧全身成像。首次注射之后，成像(在1小时、3小时、6小时、24小时和47小时)揭示SSI的最高浓度在注射部位处的全身分布。首次注射之后，SSI在大约24小时内从循环中清除。在替代注射部位处进行后续注射，并且成像(在1小时、3小时、6小时和24小时)揭示最高浓度见于新的注射部位且惊人地见于先前注射部位处的全身分布。这提供了在局部施用的配制剂全身分散之后在炎症部位处优先的SSI递送/保留的例证。血液样品的显微评估证实在血液中检测到的Cy5.5荧光不是游离染料。如图19所示，24小时之后SSI在器官中的分布显示与心和脾相比KPN SSI在肺中的优先积聚。
[0399] 实施例13：手术伤口治疗
[0400] 在此实施例中，SSI的局部配制剂被配制以便施用于伤口，例如，手术伤口、部分厚度烧伤、撕裂伤、慢性伤口或血管溃疡。局部SSI配制剂可例如包含在软膏或凝胶中配制的来源于微生物的PPR激动剂，所述微生物是皮肤病原体。
[0401] 实施例14：治疗响应在IBD中的持久性
[0402] 此实施例显示用于克罗恩氏病的有效治疗可在SSI周期性给药的延长时期内进行。具体说来，在涉及患有中度至重度克罗恩氏病的成人的1/2期、随机化、安慰剂对照、双盲临床试验中，克罗恩氏病活动指数(CDAI，Best等人,1976,Gastroenterology 70(3):439–444)平均起来在治疗第16周比第8周下降更显著。更具体地说，截至第8周，在SSI治疗患者中CDAI评分的平均减少为大约80点；截至第16周，CDAI评分的平均减少为大约120点。
这说明通过16周的SSI治疗实现的持续临床改善。
这说明通过16周的SSI治疗实现的持续临床改善。
[0403] 此实施例涉及通过皮下注射每隔一天施用的全灭活大肠杆菌SSI制剂的使用。通过调整剂量使剂量针对患者个体化，以使得每个剂量有效引起施用部位处的可见局部炎性免疫响应(在注射部位处直径1英寸至2英寸的可见发红的延迟反应)。
[0404] 因此，本发明的方面涉及SSI在延长的持续期内的使用，其中给药间隔时间和给药持续时间适于在整个给药持续期内提供增加的治疗益处，如在克罗恩氏患者中在最终16周的持续期内CDAI评分的逐渐下降。
[0405] 实施例15：肺炎症-哮喘
[0406] 此实施例说明了SSI(KPN SSI)在鼠科室内尘螨(HDM)诱导的哮喘模型中的治疗功效，例示了关于SSI在治疗哮喘炎症中的使用的潜在机理基础。在此实施例中，将BALB/c小鼠经鼻内暴露于HDM持续两周。用KPN SSI或安慰剂皮下治疗小鼠持续HDM暴露之前的1周及整个两周暴露期。最后一次暴露之后24小时，就炎性细胞浸润、基因表达、细胞因子水平、杯状细胞化生对肺进行分析，并且关于过敏原特异性血清IgE水平来分析血清。
[0407] 方法
[0408] 动物
[0409] 6-8周龄的雌性小鼠购自Jackson Laboratory(Bar Harbor,ME)。使用每组10只小鼠。在研究的整个持续期，将小鼠圈养在环境受控的无特异性病原体的条件下，伴有12:12小时亮/暗循环。
[0410] 过敏原暴露方案
[0411] 在异氟烷麻醉下将小鼠经鼻内暴露于盐水(35μL)或室内尘螨(HDM，屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssimus)，Greer Laboratories,Lenoir,NC)，在35μL盐水中25μg。进行HDM或盐水鼻暴露持续第1周的5个连续日和第2周的4个连续日(实验日：1-5；8-11，图1)。在最后一次暴露后24小时对小鼠施以安乐死。
[0412] 克雷伯氏杆菌干预策略
[0413] KPN SSI来源于最初由患者感染分离的克雷伯氏杆菌，其中将全热灭活的细胞悬浮于含有0.4％苯酚作为防腐剂的生理盐水中，最终OD600是5.0。安慰剂是含有0.4％苯酚的生理盐水。在实验的第-7、-5、-3天预防性地给予KB或安慰剂，并且在实验第1、3、5、8、10天继续进行治疗。将30μL安慰剂或KB皮下注射于在腹部的右下和左下象限及胸部的右上和左上象限中进入皮肤的替代部位处。
[0414] 血液收集、支气管肺泡灌洗(BAL)以及关于BAL细胞分类的细胞离心分析
[0415] 通过根据细胞形态和瑞氏-吉姆萨(Wright-Giemsa)染色检查细胞离心涂片进行BAL细胞分类计数。由不知情的观察者来区分每只小鼠总共100个细胞。
[0416] 通过ELISA对HDM特异性免疫球蛋白的定量
[0417] 将HDM包被于96孔板(2.5ug/孔)上并在4℃下培育过夜。在用PBS中的5％FBS封闭之后，添加未稀释的血清并在4℃下培育过夜。洗涤之后，添加生物素抗小鼠IgE(BD Bioscience-San Jose,CA,USA)并在37℃下培育1小时。将链霉亲和素-HRP/TMB底物用于目测水平并在450nm下记录吸光度。
[0418] 基因表达
[0419] 通过用TissueLyser LT(Qiagen–Toronto,Ontario,Canada)匀化来裂解右肺组织并且使用PureLink RNA迷你试剂盒(Life Technologies-Carlsbad,CA,USA)进行RNA分离。将iScript cDNA合成试剂盒-170-8891用于cDNA合成(Biorad)。使用具有Taqman探针的TaqMan Fast Advanced Master Mix(Applied Biosystems)，通过在StepOnePLus RT-PCR机器(Applied Biosystems-Foster City,CA,USA)上的定量RT-PCR完成针对IL-4
(Mn00445259_m1)、IL-13(Mn00434204_m1)和IFN-γ(Mn01168134_m1)的基因表达。
(Mn00445259_m1)、IL-13(Mn00434204_m1)和IFN-γ(Mn01168134_m1)的基因表达。
[0420] BAL和血清样品的细胞因子和趋化因子分析
[0421] 根据制造商方案，使用Milliplex小鼠细胞因子/趋化因子试剂盒(Millipore,St.Charles,MO,USA)同时定量31种细胞因子/趋化因子/生长因子生物标志物。通过使用Bio-PlexTM200系统(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)进行多重任务。31-plex是由以下组成：eotaxin、G-CSF、GM-CSF、IFNγ、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-13、IL-15、IL-17、IP-10、KC、LIF、MCP-1、M-CSF、MIG、MIP-1α、MIP-1β、MIP-2、RANTES、TNFα和VEGF。这些标志物的测定灵敏度在0.1-33.3pg/mL范围内。因为在多重任务中的IL-13水平主要低于检测，所以通过ELISA(eBioscience San Diego,CA,USA)测量BAL液中的IL-13蛋白水平。
[0422] 组织学
[0423] 对肺进行解剖并用5mL 10％福尔马林使其膨胀。将组织用石蜡包埋并切成3μm。用过碘酸-希夫氏使切片染色以定量含粘液的杯状细胞。使用Aperio Slidescanner(Vista,CA),版本11.1.2.760，在60X放大倍数下扫描染色切片。通过在肺气道中使用Aperio Image Scope软件以截面方式进行颜色分割来鉴别阳性染色像素以表示针对基底膜长度(μM)归一化的强阳性像素(过碘酸-希夫氏)的数量。
[0424] 数据分析
[0425] 使用GraphPad Prism分析数据并表示为平均值±SD。通过单向ANOVA继之以Sidak事后检验进行多组比较。比较四个实验组组合；盐水-安慰剂对比盐水-克雷伯氏杆菌、盐水-安慰剂对比HDM-安慰剂、盐水-克雷伯氏杆菌对比HDM-克雷伯氏杆菌、HDM-安慰剂对比HDM-克雷伯氏杆菌。为了统计分析，将低于标准的最低值的任何值记录为标准的一半最低值。在有和没有IL-13ELISA下，针对BAL多重数据进行主成分分析(PCA)。使用prcomp命令在R(版本3.2.4)中完成PCA。(R Core Team(2016)R:A language and environment for statistical computing.R Foundation for Statistical Computing,Vienna,Austria.URL https://www.R-project.org/)。
[0426] 结果
[0427] 图20是示出了在用安慰剂或QBKPN治疗下，盐水或HDM暴露之后的HDM特异性IgE应答的图。在HDM治疗的小鼠与其适当对照(HDM安慰剂对比盐水安慰剂和HDM QBKPN对比盐水QBKPN)之间，*P<0.05。
[0428] 图21是一系列图，示出了在用安慰剂或QBKPN治疗的盐水或HDM暴露小鼠中的BAL细胞计数和分类：A)BAL总细胞；B)BAL中性粒细胞；C)BAL淋巴细胞；D)BAL巨噬细胞；图(E)；BAL嗜酸性粒细胞。数据是每组10只小鼠的平均值±SEM(*＝p<0.05)。数据是每组10只小鼠的平均值±SD。在HDM治疗小鼠与其适当对照之间，*P<0.05。在HDM QBKPN治疗小鼠与HDM安慰剂治疗小鼠之间，#P<0.05。
[0429] 图22包含两个图，示出了与嗜曙红细胞增多有关的BAL和血清介质：血清IL-5(A)和BAL eotaxin(B)。数据是每组10只小鼠的平均值±SD(*＝p<0.05)，HDM治疗小鼠与其适当对照之间。在HDM QBKPN治疗小鼠与HDM安慰剂治疗小鼠之间，#P<0.05。
[0430] 图23是一系列图，示出了在HDM暴露和QBPKN治疗之后的Th1和Th2肺基因表达：A)Th-1-介导的响应IFN-g细胞因子基因表达，B)Th-2-介导的响应IL-4细胞因子基因表达，及C)IL-13细胞因子基因表达(数据是每组10只小鼠的平均值±SD；在HDM治疗小鼠与其适当对照之间，*P<0.05)。
[0431] 图24是一系列条形图，示出了HDM暴露和QBKPN治疗对Th1-和Th2-介导的BAL液细胞因子水平的影响：A)IFN-g细胞因子水平；B)IL-2细胞因子水平；C)TNF-a细胞因子水平；D)IL-4细胞因子水平；E)IL-5细胞因子水平；F)IL-13细胞因子水平(数据是每组10只小鼠的平均值±SD；在HDM治疗小鼠与其适当对照之间，*P<0.05)。
[0432] 图25是示出了BAL细胞因子的主成分分析(PCA)的图，其显示了整体细胞因子谱的部分归一化。由此使用基于所有多重数据的主成分分析(PCA)例示了各组之间的整体BAL细胞因子谱的变化。不同实验组基于第一主要成分(PC1)分开地群集。在安慰剂治疗的小鼠内，盐水暴露的小鼠与HDM暴露的小鼠分开地进行群集。KB治疗使HDM暴露小鼠与盐水对照的分离最小化。在盐水对照组内，KB与安慰剂治疗的小鼠是相似的–如通过它们群集在一起所示。由于PC1似乎最佳地将小鼠区分到不同的组中，所以鉴别了对PC1具有最大作用的细胞因子。确定PC1的前5个细胞因子是LIF(白血病抑制因子；8.2％)、IL-5(8.2％)、Eotaxin(8.1％)、IL-4(7.5％)和CXCL10(7.3％)。用通过ELISA测量的另外的哮喘标志物(IL-13)完成主成分分析，由此提供与确定PC1的以下前5个细胞因子相似的群集：IL-5(7.3％)、eotaxin(7.2％)、LIF(白血病抑制因子；7.2％)、IL-4(6.8％)和IL-13(6.7％)。
[0433] 图26是示出了在HDM暴露和QBPKN治疗之后的气道杯状细胞定量的条形图。杯状细胞定量表示为强阳性像素的数量/基底膜长度。数据是每组10只小鼠的平均值±SD。在HDM治疗小鼠与其适当对照之间，*P<0.05。在HDM QBKPN治疗小鼠与HDM安慰剂治疗小鼠之间，#P<0.05。
[0434] 表19：BAL细胞因子变化
[0435]
[0436]
[0437] 表20：血清细胞因子水平
[0438]
[0439]
[0440] 如此实施例所示，在哮喘中，QBKPN SSI：减少BAL总细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞和嗜酸性粒细胞；减少嗜曙红细胞增多的介质，包括血清IL-5和BAL eotaxin；减少BAL中的Th2细胞因子(IL-4和IL-5)；并且减轻杯状细胞增生。总之，具体来说，此实施例显示HDM暴露的小鼠发展出实验过敏性哮喘的典型症状，包括杯状细胞增生、过敏原特异性血清IgE的升高、气道嗜曙红细胞增多以及TH2细胞因子(包括IL-4、IL-13和IL-5)的伴随增加。使用KPN SSI的治疗减轻HDM介导的气道嗜曙红细胞增多、总BAL细胞数量、支气管肺泡灌洗(BAL)TH2细胞因子产生及杯状细胞化生。此实施例证明使用KPN SSI的治疗减轻HDM诱导的TH2-倾向的气道炎性响应及相关杯状细胞化生。本发明的一方面因此提供使用微生物生物制剂(如来源于细菌性肺病原体的组合物)的治疗(如皮下治疗)，作为用于过敏性气道疾病的治疗，例如以便减轻过敏原诱导的TH2-倾向的气道炎性响应和/或相关杯状细胞化生。这些结果因此表明用生物制剂的SSI治疗能够在不依赖于调控过敏原特异性IgE的过程中同时靶向促进气道嗜曙红细胞增多的两种关键分子组分。具体地说，KPN SSI可以一定剂量施用持续一段时间以便能有效减轻HDM诱导的TH2倾向的过敏性气道炎症和/或气道嗜曙红细胞增多和/或杯状细胞的粘液含量，并且这可例如不依赖于调节过敏原特异性IgE水平。
[0441] 实施例16：肺炎–COPD
[0442] 此实施例说明了在COPD的鼠科模型、即短期(3周)烟雾模型中的抗炎功效。在此模型中，每隔一天(用安慰剂或KPN SSI)预治疗小鼠3次(1周中的周一、周三和周五)。然后使小鼠在第8-25天暴露于烟雾(进行空气或香烟烟雾暴露，在前两周持续5个连续工作日且在第3周持续4个连续工作日(在周末不进行治疗或暴露)，每隔一个工作日(周一、周三和周五)继续治疗(安慰剂或KPN SSI)。在第26天，最后一次空气/香烟烟雾暴露之后24小时对小鼠施以安乐死并且收集样品。
[0443] 简言之，通过将小鼠置于树脂玻璃仅鼻暴露室，确保鼻从主室延伸，来完成香烟烟雾暴露(Kentucky Research Grade Cigarettes)。将香烟置于吸烟机器中并用打火机点燃并且在排烟罩中抽真空。将吸烟机器中的20cc注射器充满烟雾，自动阀转动之后烟雾注射到仅鼻暴露室中。每次烟雾抽吸循环耗费1.5分钟。每只小鼠每天抽吸3支香烟，暴露持续总共45分钟。对照空气暴露在不暴露于烟雾下持续相似的持续期。在整个烟雾暴露过程及烟雾暴露后的30分钟监测动物。
[0444] 热灭活的克雷伯氏杆菌菌株(来源于患者感染)施用如下。将KPN SSI或安慰剂媒介物(含有0.4％苯酚的生理盐水)每隔一天预防性地施用3次，并且在整个烟雾施用期间治疗性地继续进行方案。将30μL安慰剂或KPN SSI的皮下注射液施用于右下腹、左下腹、右上胸和左上胸，每次注射顺时针方向旋转。
[0445] 进行细胞离心并基于形态和瑞氏-吉姆萨染色来评估。然后使用制备的细胞离心载玻片计数BAL细胞分类，其中以不知情的方式计数每只小鼠100个细胞。
[0446] BAL和血清样品的免疫介质谱分析进行如下。使用Bio-PlexTM200系统(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)，根据制造商方案(Eve Technologies Corp,Calgary,AB,Canada)，使用31种细胞因子/趋化因子/生长因子多重试剂盒进行BAL和血清中的可溶性介质分析。31-plex测定包括以下介质：Eotaxin、G-CSF、GM-CSF、IFNγ、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-13、IL-15、IL-17、IP-10(CXCL10)、KC(CXCL1)、LIF、MCP-1(CCL2)、M-CSF、MIG(CXCL9)、MIP-1α(CCL3)、MIP-1β(CCL4)、MIP-2(CXCL2)、RANTES(CCL5)、TNFα和VEGF。这些标志物的测定灵敏度在0.1-33.3pg/mL范围内。
[0447] 血液Ly6CHI单核细胞/巨噬细胞和中性粒细胞的流式细胞分析进行如下。将血液收集于EDTA包被的管(BD Microtainer)中以防止凝结并且在染色之前储存于冰上。在红细胞溶解(BD溶解缓冲液)之前，用CD11b-FITC、Ly6G-PE、CD11c-PerCPCy5.5和Ly6C-APC对血液染色。在FACSCalibur(BD Bioscience)上进行流式细胞术。在FlowJo V10.1上完成分析。中性粒细胞被定义为Ly6G+CD11b+细胞。Ly6CHI单核细胞/巨噬细胞被定义为Ly6CHILy6G-CD11b+细胞。
[0448] 如下进行数据分析。将GraphPad Prism 6软件(GraphPad Software,San Diego,CA)用于进行结果的统计分析。数据表示为平均值±SD。对所选的组比较进行单向ANOVA分析，继之使用Sidak事后检验进行多重比较。比较四个实验组组合；空气-安慰剂对比空气-KB、空气-安慰剂对比香烟烟雾-安慰剂、空气-KB对比香烟烟雾-KB、香烟烟雾-安慰剂对比香烟烟雾-KB。
[0449] 将体重和临床评分(例如，蜷缩姿势、与其它动物的互动、活动水平)用于监测在KPN的存在或不存在下暴露于过滤的空气或香烟烟雾的小鼠的整体健康状态。针对每个动物的开始体重对体重归一化。在用安慰剂或KPN治疗的空气暴露组中没有记录到体重变化(p>0.05)。然而，香烟烟雾暴露的小鼠具有显著的体重损失(p<0.05)且KPN治疗不能逆转此有害影响(p>0.05)。对于任何组都没有观察到临床评分的变化。
[0450] 对总BAL细胞计数和细胞分类进行分析以评估肺气道炎症。图27A是示出了BAL细胞分类的条形图，显示QBKPN通过减少淋巴细胞和巨噬细胞群在烟雾暴露之后减少总BAL细胞计数。在安慰剂治疗的动物中，香烟烟雾暴露诱导BAL中总细胞数量的增加，这用KPN干预未得到减轻(图27B(a)，p<0.05)。香烟烟雾暴露诱导的BAL总细胞的增加是归结于淋巴细胞、巨噬细胞和中性粒细胞(图27B(b)-(d)，p<0.05)，而非嗜酸性粒细胞(p>0.05，数据未示出)。KPN干预削弱香烟烟雾暴露组中淋巴细胞和巨噬细胞的增加(p<0.05)，但巨噬细胞相对于空气+KPN仍保持升高(图27B(b)-(c)。PN干预对香烟烟雾诱导的中性粒细胞的增加没有影响(图27B(d))。
[0451] 先前的报道已经表明小鼠香烟烟雾暴露模型产生TH1倾向的炎性响应。此实施例说明KPN SSI干预削弱了香烟烟雾暴露诱导的TH1倾向的肺部炎性响应，如通过31种细胞因子、趋化因子和生长因子(包括TH1和非TH1介质)的多重分析所证明。香烟烟雾暴露诱导在BAL液中测量的31种介质中的15种(46.7％)，包括IFNγ、CXCL9、CXCL10、CCL5、IL-6、IL-17、G-CSF、CXCL1、LIF、CCL2、CCL3、CCL4、TNFα、eotaxin和VEGF(p<0.05)。在香烟烟雾暴露下，在10个样品中有4个的IL-17是升高的，其值接近此介质的检测水平(0.64pg/ml)。KPN干预削弱了香烟烟雾诱导的IFNγ、CXCL9、CXCL10、CCL5、IL-6、G-CSF和IL-17的增加(图28A)，即与TH1倾向的炎性响应有关的所有介质。KPN SSI干预对空气暴露的动物中所测量的任何介质没有影响。
[0452] 血清免疫介质蛋白表达谱受到香烟烟雾暴露的最小影响，但由KPN干预得到加强，如通过应用于来自四个实验组的血清的31种介质的相同多重测定所证明。香烟烟雾暴露仅诱导VEGF的增加，其相对于空气暴露对照具有升高的水平(图28B(a)，p<0.05)。KPN SSI干预没有逆转香烟烟雾暴露诱导的血清VEGF的上升。在空气暴露的动物中，KPN干预相对于空气+安慰剂仅减少1种介质，即IL12p40，而IL-1β、CCL2、CXCL9和CXCL10的水平(图28B(b)-(d)p<0.05)则增加。在烟雾暴露的小鼠中，KPN干预相对于香烟烟雾+安慰剂组增加了CXCL9、CXCL10和CCL5的水平。总的来说，这些血清数据说明SSI干预在不依赖于香烟烟雾暴露的情况下诱导全身影响，可施用SSI干预以便对香烟烟雾诱导的肺部炎症的局部抑制有效。
[0453] 为了说明在此COPD模型中的全身性细胞免疫应答，将流式细胞术用于评估在香烟烟雾暴露和KPN干预之后Ly6CHI单核细胞/巨噬细胞(即炎性单核细胞群体)和中性粒细胞在血液中的水平。香烟烟雾暴露没有诱导血液Ly6CHI单核细胞/巨噬细胞或中性粒细胞的增加(图28C(a)-(b))。惊人地，KPN SSI干预增加香烟烟雾暴露组中的血液Ly6CHI单核细胞/巨噬细胞和中性粒细胞(p<0.05)及空气暴露动物中的中性粒细胞。全身性Ly6CHI单核细胞/巨噬细胞和中性粒细胞的增加与肺组织中的局部增加的类似模式有关(图28C(c)-(d))，其中KB诱导这些细胞类型的增加，这通过香烟烟雾暴露进一步加剧(p<0.05)。
[0454] 图28D包括关于所选肺基因表达图谱的三个条形图，其显示QBKPN减少在烟雾暴露之后的肺组织中的三个重要炎性细胞因子基因(IL-6、IL-1β和IL-17A)的表达。
[0455] 图29示出了所选BAL细胞因子表达图谱，其中6个条形图显示QBKPN引起COPD模型中G-CSF、IL-6和IP-10的显著减少，以及IL-4、KC、MIG、TNFα的向下趋势。
[0456] 图30示出了血清细胞因子表达图谱，其鉴别了针对SSI功效的许多标志物，尤其是升高的IP-10、MIG和RANTES的血清水平。这些血清标志物因此可用作SSI功效的生物标志物，例如以鉴别针对具体SSI的应答者或非应答者；或作为剂量调节方案中的有效给药的标志物。
[0457] 此实施例说明QBKPN SSI减少了COPD模型的炎性环境中的许多标志物，具体说来：减少BAL总细胞、淋巴细胞和巨噬细胞；减少通常在COPD中升高的细胞因子(包括IL-6、IL-1β和IL-17A)的基因表达；以及降低COPD中BAL中的重要细胞因子(包括IL-6、IP-10和G-CSF)水平。更具体地说，这些结果证明KPN治疗削弱了香烟烟雾诱导的TH1倾向的肺部炎症及BAL细胞性。在对照空气暴露的和实验香烟烟雾暴露的动物中，KPN SSI诱导全身免疫应答，包括免疫介质产生以及单核细胞和中性粒细胞的动员，这反映在Ly6CHI单核细胞/巨噬细胞和中性粒细胞增加的局部肺环境中。此实施例因此显示用微生物组分的干预可用于改变香烟烟雾暴露相关的COPD发病机理的过程，所述微生物组分提高免疫应答的某些方面，而非一般抑制免疫应答。
[0458] COPD具有包括哮喘和炎性肠病(IBD)的其它炎性疾病的许多潜在途径。IBD和COPD具有共同的观察结果，包括改变的微生物组、免疫功能障碍、改变的上皮细胞功能和慢性炎症。在哮喘与IBD之间还存在显著的重叠，包括改变的呼吸道微生物组和免疫功能障碍。总之，COPD与受益于SSI的其它炎性疾病之间的相似性(如本文所证明)表明用PRR激动剂库(如微生物产物或合成配制剂)对免疫应答的方面的提高可用作COPD的治疗手段。
[0459] 在急性香烟烟雾暴露诱导的炎症的此实施例中，观察到在用KPN治疗削弱的BAL中IFN-γ、CXCL9、CXCL10、CCL-5、IL-6、G-CSF和IL-17的升高。在TH1倾向的炎性介质中的这种减少与肺巨噬细胞和淋巴细胞募集的伴随减少有关，其中KPN治疗减少BAL淋巴细胞和巨噬细胞的数量。有趣的是，KPN在空气暴露的和香烟烟雾暴露的动物中全身地诱导TH1倾向的趋化因子特征(CXCL9、CXCL10、CCL-5)，与感染中所见的类似。实际上，与TH1肺部炎症的减弱并行，KPN治疗诱导全身免疫激活，其中Ly6CHI单核细胞/巨噬细胞和中性粒细胞增加。因此，此实施例表明KPN SSI主动地刺激免疫应答的方面，这可适于造成TH1倾向的免疫细胞的全身动员和募集，但在BAL方面的局部减少。
[0460] 此实施例表明KPN SSI施用全身性地增加促炎性细胞因子(例如IL-1β)和血液炎性单核细胞(定义为Ly6CHI)和中性粒细胞，与急性感染中所见的响应类似。通过流式细胞术进一步鉴别了炎性单核细胞和中性粒细胞在肺组织中的增加。在肺部炎症实施例(即实施例15和16)中，在对照小鼠(在COPD研究中空气暴露的和在哮喘研究中盐水暴露的)中，QBKPN SSI提高血清中的细胞因子水平。因此，这些可用作功效的生物标志物，特别是IP-10(CXCL10)，其在QBKPN SSI治疗的对照小鼠中在哮喘和COPD实施例中都是增加的。
[0461] 实施例17：变栖克雷伯氏杆菌SSI
[0462] 在转移至肺的鼠科B16黑素瘤模型中，用克雷伯氏杆菌亲缘分支组组III(变栖克雷伯氏杆菌)的全灭活细胞配制的SSI在降低肿瘤负荷方面是有效的，如图31中所示(其中变栖克雷伯氏杆菌被鉴定为“QBKPN”)。
[0463] 实施例18：CD25耗尽
[0464] CD25在活化的T细胞、活化的B细胞、Tregs和静息记忆T细胞(参与适应性免疫的细胞)上表达。利用抗CD25抗体，此实施例说明了在CD25阳性细胞不存在下QBKPN SSI在减轻肺结节方面的功效，如图32所示。这说明SSI功效的方面在B16黑素瘤模型(预防性地施用SSI，其中用IV注射的B16黑素瘤细胞激发小鼠且在B16注射后18天计数肿瘤病灶)中不依赖于CD25阳性适应性免疫细胞。因此，本发明的方面涉及调节不依赖于CD25+细胞的免疫应答，例如先天性免疫应答。
[0465] 实施例19：剂量依赖性和Rae-1表达
[0466] 在转移至肺的鼠科B16黑素瘤模型中，KPN SSI的稀释液逐渐降低功效(其中通过Trp-1表达的QPCR定量测量肿瘤负荷)。图33A示出了在B16激发之后第5天与KPN SSI配制剂(QBKPN)及KPN SSI的连续稀释液(10x、100x和1000x)有关的Ct(循环阈值)值。Ct值因此指示荧光信号超过阈值(即超过背景水平)所需的PCR循环的数量。δCt值考虑管家基因的Ct值，且水平因此与样品中靶核酸的量成反比。如所示，肿瘤负荷随SSI稀释度的增加而增加。如图33B所示，此剂量依赖性还反映在B16肿瘤结节在肺中的数量的测定中。图33C是条形图，示出了提供治疗效果的多种给药方案，其中注射之间的间隔时间范围为1至7天，全部都提供治疗效果。
[0467] 如图34所示，其它分析说明表达Rae-1的细胞的比例与肿瘤负荷负相关，证明了以下事实：SSI以剂量依赖性方式增加靶组织的Rae-1表达。增强的Rae-1信号将促进通过先天性淋巴样细胞(如NK细胞)上的NKG2D(参见下文)受体的免疫刺激，由此造成增加的癌细胞杀伤和降低的肿瘤负荷，如此实施例中所证明。实际上，高SSI诱导的Rae-1表达造成癌症负荷降低。
[0468] 如图34(B)所示，在NKG2D(天然杀伤组2，成员D)敲除小鼠中，QBKPN在B16肺转移模型中的治疗功效被消除。这说明了NKG2D信号传导在治疗性SSI响应的各种方面中的重要作用，强化了关于靶组织中Rae-1表达增加的证据的重要性。
[0469] 实施例20：部位特异性
[0470] 肺
[0471] 在表达红色荧光蛋白(LLC-RFP)的鼠科Lewis肺癌中，将KPN SSI(QBKPN)的功效与大肠杆菌(QBECO)和金黄色葡萄球菌(QBSAU)SSI(KPN是小鼠中的肺病原体，而ECO和SAU则不是)相比。如图35所示，QBKPN在减轻肺的肿瘤结节方面提供了显著更强的作用。如图36所示，在用LLC接种之后第15天时肺中的LLC-RFP细胞数量存在伴随减少。
[0472] 替代数据说明虽然在QBKPN与QBECO下的免疫浸润在一些系统中在早期时间点下可为相当的，但中性粒细胞水平在QBKPN下与QBECO相比在第7天是提高的(流量数据)。而且，基因阵列分析证明先天性浸润在QBKPN中与QBECO相比的长期持续(约72小时)。这些数据进一步指示在肺中正在进行的免疫应答响应于QBKPN对比QBECO是不同的。
[0473] 结肠
[0474] 在MC38结肠癌模型中，QBECO赋予比QBKPN或10X浓缩的QBSAU(QBSAUR)更大的存活优势，如图37所示。
[0475] 皮肤
[0476] 在B16黑素瘤模型中，将100,000个B16黑素瘤细胞在第0天以100μl的体积注射到C57BL/6小鼠的右侧腹中，在第-10天开始SSI治疗且继续直到第+12天。在第7天开始监测肿瘤体积，并在第14天达到终点。如图5所示，10X浓缩的QBSAU或QBSAUR比QBKPN或QBECO在减小皮肤中的B16肿瘤体积方面要有效得多。
[0477] 皮肤和肺
[0478] 将B16黑素瘤模型用于通过IV施用接种肺肿瘤，且通过背侧皮下注射接种皮肤肿瘤，以使得每只动物兼具位于皮肤中的癌和位于肺中的癌。在此项研究中，在用B16黑素瘤5
细胞(1x 10 个细胞/100μl/小鼠)IV和SQ植入之前第-8、-6、-4和-2天，对实验组中的小鼠(N＝5只/组)每隔一天SQ注射安慰剂(30μl)、QBKPN(30μl的4.91OD600)或10X QBSAU(30μl的
8.6OD600)。在第-8、-6、-4和-2天用QBKPN或10X QBSAU经SQ注射4个对照组中的小鼠(N＝5只/组)：这些对照小鼠中的2组用B16肿瘤IV(QBKPN单阳性对照)或SQ(10X QUSAU单阳性对照)在第0天接种，充当单阳性对照；而这些对照小鼠中的2组不接受任何肿瘤接种，充当阴性对照。每隔一天连续地对小鼠给予SSI治疗或安慰剂对照的SQ施用直到肿瘤植入后第5天终止实验。在第5天对肺和皮肤中的肿瘤负荷进行计数。
细胞(1x 10 个细胞/100μl/小鼠)IV和SQ植入之前第-8、-6、-4和-2天，对实验组中的小鼠(N＝5只/组)每隔一天SQ注射安慰剂(30μl)、QBKPN(30μl的4.91OD600)或10X QBSAU(30μl的
8.6OD600)。在第-8、-6、-4和-2天用QBKPN或10X QBSAU经SQ注射4个对照组中的小鼠(N＝5只/组)：这些对照小鼠中的2组用B16肿瘤IV(QBKPN单阳性对照)或SQ(10X QUSAU单阳性对照)在第0天接种，充当单阳性对照；而这些对照小鼠中的2组不接受任何肿瘤接种，充当阴性对照。每隔一天连续地对小鼠给予SSI治疗或安慰剂对照的SQ施用直到肿瘤植入后第5天终止实验。在第5天对肺和皮肤中的肿瘤负荷进行计数。
[0479] 用QBKPN而非10X QBSAU治疗的小鼠展现升高的肺特异性Rae-1表达(图38)及单核细胞和中性粒细胞向肺中的募集。在相同模型中与安慰剂治疗小鼠相比在QBKPN治疗小鼠的肺中还存在减少的PD-1表达(图39)。相比之下，在肺中的PD-L1表达在各组之间是相同的。用10X QBSAU而非QBKPN治疗小鼠在B16皮肤和肺肿瘤模型中造成与安慰剂对照相比皮肤肿瘤负荷的降低(图40)。
[0480] 因此，QBKPN通过在兼具皮肤和肺肿瘤的动物中升高Rae-1的表达及单核细胞和中性粒细胞的募集展现在肺中的部位特异性。类似地，10X QBSAU通过减轻这些动物中的皮肤肿瘤展现部位特异性功效。
[0481] 实施例21：给药途径和日程安排
[0482] 静脉内SSI对比皮下SSI
[0483] 在此实施例中，在B16肺转移模型中IV或SQ施用KPN SSI(QBKPN)。在第0天，IV施用B16细胞以接种肿瘤。在第1、3、5和7天，(IV或SQ)施用KPN SSI。在第9天，达到终点并测量肿瘤计数。如图41所示，两种施用途径都提供治疗益处。
[0484] 预防对比治疗日程安排
[0485] 在此实施例中，比较在用癌细胞激发之前(预防)或激发之后(治疗)SSI治疗的日程安排。此实施例还证明免疫与功效有关，特别是巨噬细胞的M1/M2比率。图42是研究设计的示意图，其是基于QBKPN在B16肺癌模型中在治疗对比预防方案中的功效。如图43所示，预防方案提供较早期的治疗益处，而到第17天，治疗方案显示出极强的功效趋势。预防和治疗方案的功效都反映在肺的M1/M2巨噬细胞比率中的功效与替代M2标志物CD206的共同关联中，如在图44中针对第10天的治疗组和第17天的预防组所示。
[0486] 早期时间点血液分析
[0487] 此实施例说明了SSI疗法如何快速地产生涉及骨髓细胞群的可检测的治疗效果的方面，从而提供治疗性生物标志物的实例。如图45所示，对于QBKPN和QBECO SSI，中性粒细胞在所有时间点下都增加，其中在注射后3小时内甚至见到显著增加。如图46所示，Ly6CHILy6G+CD11b+细胞(Ly6C单核细胞)在3和7小时时都有显著增加，其中到大约24小时有降至安慰剂水平的减少趋势。因此，由SSI疗法引起的细胞免疫应答的特征在于快速起效，在数小时内，继之在数天内消退。此细胞应答模式支持在数天内测量的间隔时间下重复施用的给药方案，例如，每1、2、3、4、5、6或7天施用一次。
[0488] 实施例22：SSI细胞毒性
[0489] 此实施例显示SSI(QBKPN)在高剂量下可直接引起癌细胞死亡的增加。将NCI-H358细胞(人肺细胞系)与QBKPN的连续稀释液一起在体外培育24小时。使用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记测定(绿色荧光细胞染色染料，用于标记靶细胞)评估功效，其中红色活/死生存力染料7-AAD(7-氨基放线菌素D)用于鉴别细胞毒性测定样品中存在的杀伤/死细胞。如图48所示，在此24小时杀伤测定中，QBKPN在高剂量(1/20、1/200稀释)下增加NCI-H358癌细胞的死亡。使用相同测定，还显示KPN SSI在24小时杀伤测定中在相似剂量(1/20稀释、1/200稀释)下增加γδT细胞介导的NCI-H358癌细胞杀伤，如图49所示。另外，KPN SSI(QBKPN)在1/200和1/2000稀释度下增强唑来膦酸盐在诱导γδT细胞介导的癌细胞溶解方面的作用，如图50所示。
[0490] 如此实施例所示，在选择的实施方案中，SSI可直接施用于癌组织，例如癌症的手术切除部位处。例如，SSI(如QBSAU)可局部施用于皮肤的黑素瘤或施用于皮肤黑素瘤的手术切除部位。
[0491] 实施例23：在MC-38IP注射模型中的NKG2D敲除小鼠
[0492] 此实施例说明了NKG2D受体在介导对SSI的治疗响应中的参与。此实情展现于鼠科存活研究中，在MC-38细胞(来源于原发性小鼠结肠癌的鼠科腺癌细胞系)的IP注射之后。腹膜内注射肿瘤细胞以容许肿瘤细胞接种于肠，产生MC-38细胞结肠癌模型。将QBECO治疗在野生型小鼠(C57BL/6小鼠)和NKG2D敲除小鼠(C57BL/6背景)中与安慰剂相比。在MC-38注射之前每隔一天用QBECO或安慰剂(10只/组)治疗野生型和NKG2D小鼠持续10天。在整个存活研究期间每隔一天持续进行治疗。
[0493] 如图51中所示，此研究证实QBECO在MC-38结肠癌模型中的治疗功效，在野生型小鼠中显示出与安慰剂治疗相比在用QBECO治疗下存活期的统计学显著增加。如图52所示，NKG2D表达与QBECO功效有关，因为在用QBECO或安慰剂治疗的NKG2D敲除小鼠之间在存活上不存在统计学差异。免疫分型证实NKG2D敲除小鼠具有降低水平的NKG2D阳性细胞。有趣的是，QBECO在野生型小鼠内在各时间点下引起NKG2D的减少(说明了NKG2D表达作为SSI功效的生物标志物的用途)。免疫分型还显示在用QBECO治疗的野生型的NKG2D KO小鼠中与安慰剂相比到第-9天中性粒细胞和到第-1天单核细胞的特征性增加。在QBECO治疗之后还存在PDL1+的增加，其中QBECO在整个实验期间引起血液中的PDL1+细胞的增加，在野生型小鼠中在第-9和-1天有显著性，且在NKG2D敲除小鼠中有通过削弱模式展现的相似性。在野生型小鼠中，QBECO在不载有肿瘤的小鼠(第-9天、第-1天)中引起血液中PD1+细胞的增加，而在载有肿瘤的小鼠中，QBECO诱导PD1+细胞的初始增加，该种增加到第11天时有所削弱，此趋势持续以使得在存活时QBECO引起血液中PD1+细胞的减少。NKG2D敲除小鼠以较小幅度遵循此趋势且无显著性。总之，这些数据表明PD1和PDL1可用作指示SSI功效的生物标志物。
[0494] 实施例24：治疗中性粒细胞减少症
[0495] 此实施例说明了SSI在小鼠模型中治疗中性粒细胞减少症的用途。在脾(在小鼠中，代表循环)和肺中响应于SSI治疗(QBKPN)和中性粒细胞耗尽(抗Ly6G)单克隆抗体评估中性粒细胞群，如图53中的治疗方案所示。在所示小鼠中，从第-10天到第+10天每隔一天进行SSI治疗。在备选部位处以0.03ml OD5.0溶液的剂量SC注射SSI(QBKPN)。在所示小鼠中，从第-1天到第+11天每隔两天进行抗Ly6G治疗。以200μg/小鼠的剂量IP注射抗体(Bio-X-Cel克隆1A8)。在第0天，用B16黑素瘤(200,000个细胞/小鼠)IV注射所有小鼠。在第+12天，将小鼠处死。单细胞悬液是由脾和肺生成。使用单克隆抗体(BioLegend)和Miltenyi MacsQuant血细胞计数器，通过流式细胞术评估中性粒细胞群(CD45+CD11b+Ly6G-hi Ly6C-中间体)，并使用FlowJo软件进行分析。来自肺的代表性染色数据示于图54中，是来自肺样品、针对活的CD45+CD11b+细胞设门。中性粒细胞在肺(图55A，示出了活的CD45+CD11b+细胞的％)和脾(图56A)中的比例是由主要血细胞计数数据来计算。中性粒细胞(CD45+CD11b+Ly6G+Ly6C+细胞)在肺(图55B)和脾(图56B)中的数量是通过将细胞比例乘以总细胞数来计算。
[0496] 在肺和脾中，QBKPN治疗显著地提高中性粒细胞的比例(图55A和图56A)。QBKPN治疗显著地增加中性粒细胞在脾中的数量(图56B)。这些数据说明QBKPN SSI诱导循环中性粒细胞的比例和数量的扩大。
[0497] 用抗Ly6G单克隆抗体治疗小鼠的平行群组。不存在QBKPN治疗下，就比例和数量而言，抗Ly6G完全耗尽肺和脾中的中性粒细胞(图55和56)。然而，在肺(图55)和脾(图56)中的中性粒细胞群在QBKPN治疗的小鼠中保持高水平，尽管有抗Ly6G单克隆抗体治疗。由于使用荧光标记的抗Ly6G抗体(表示抗原的表达)检测到中性粒细胞，所以数据表明QBKPN治疗不致使中性粒细胞对抗Ly6G介导的耗尽有抗性。因此，这些数据说明了在中性粒细胞减少症的模型中QBKPN SSI诱导的中性粒细胞隔室的扩大。
[0498] 许多常见的疗法(包括用于治疗癌症的化疗药物)抑制骨髓功能并减少中性粒细胞计数，从而导致中性粒细胞减少症。如本文所示，可因此给予SSI以恢复中性粒细胞计数。在此种SSI疗法中还存在另外的治疗益处。在治疗基础疾病的情形下，除治疗中性粒细胞减少症之外，具有PRR激动剂特征的靶向SSI的选择造成先天性免疫功能在靶组织中的部位特异性恢复，所述PRR激动剂特征概括了在靶组织中有致病性的微生物病原体的PRR激动剂特征的独特部分。这可例如涉及由SSI介导的抗癌免疫响应或抗炎免疫响应(除治疗中性粒细胞减少症的作用之外)。
[0499] 化疗通常造成骨髓抑制，其中临床上最相关的部分是在化疗后2-10天之间出现的中性粒细胞减少症。关于此的临床意义是重要的，它干扰了维持化疗剂量和日程安排的能力并且带来中性粒细胞减少性败血症的风险。因此，可向接受骨髓抑制性化疗作为中性粒细胞减少症的预防或治疗的患者给予SSI，例如，在化疗周期之间每隔一天施用。
[0500] 实施例25：患者中的PD1和PDL1标志物
[0501] 此实施例提供显示SSI用于下调肿瘤疾病中的PD1和PDL1表达的功效的临床资料。其还显示PD1和PDL1作为SSI功效标志物的用途，强化了实施例23中的NKG2D小鼠模型数据。
鉴于以下理解，这是显著的：PD1(在T细胞上表达)及其配体PD-L1在防止T细胞活化和介导病理性免疫抑制方面起作用。
鉴于以下理解，这是显著的：PD1(在T细胞上表达)及其配体PD-L1在防止T细胞活化和介导病理性免疫抑制方面起作用。
[0502] 在KPN SSI的肺癌临床试验中，6名患者存在于两个不同的疾病组中：肿瘤出现前的和肿瘤的(6名患者中的2名是肿瘤的)。此实施例提供由血液样品获得的数据，通过流式细胞术进行分析。
[0503] 如表21所示，2名肿瘤患者表现出与肿瘤出现前患者相比升高的PDL1和PD1表达。这在图57的条形图中显示为不同细胞群的百分比，且在图58中显示为具有所示特征的细胞的相对数量。肿瘤患者(01-001和01-002)与肿瘤出现前患者相比表达更高水平的PD1和PDL1，且具有较低水平的M1巨噬细胞。
[0504] 表21：在SSI治疗之前患者中的PD1和PDL1标志物
[0505]
[0506] 在SSI治疗下，肿瘤患者显示出PD1和PDL1表达的显著减少以及M1(CD45+ CD14+ HLA-DR+ CD86+)巨噬细胞百分比的显著增加。图59显示了在患者01-001(图A)和患者01-002(图B)中在以下时间PD-L1表达的减少：第1周，第4天(W1D4)；第1周，第5天(W1D5)；第2周(W2)；第4周(W4)；第12周(W12)和第16周(W16)；在SSI治疗的过程中，每隔一天。图60显示了在这些患者中在这些时间点PD-1表达的减少。图61显示了在这些患者中在这些时间点M1巨噬细胞比例的增加。如所示，在SSI治疗下，随着时间过去，在CD45+细胞(所有白细胞)上的PDL1表达减少，在CD3+细胞(淋巴细胞)中的PD1表达减少，并且在血液中的M1巨噬细胞(CD45+ CD14+ HLA-DR+ CD86+)增加。在这些患者中，SSI治疗在第12周(W12)中止，并且测定表明相对M2巨噬细胞群(CD14+CD163+)一般减少直到治疗的中止，然后反弹。
[0507] 实施例26：粒酶和穿孔素表达
[0508] 此实施例说明在B16黑素瘤小鼠肺模型中的SSI剂量、肿瘤负荷与粒酶A、粒酶B和穿孔素的表达之间的关系，提供了关于有效的SSI疗法提高粒酶和穿孔素水平同时降低肿瘤负荷的证据。
[0509] 用B16黑素瘤细胞静脉内注射小鼠以提供小鼠肺癌模型。如下皮下地注射五个小鼠组(n＝5)：安慰剂(盐水)、1x QBKPN、1/50x QBKPN、1/500x QBKPN或1/5000x QBKPN(1x KPN SSI的一系列稀释度)。在肿瘤接种之前十天，每隔一天预防性地施用SSI。每隔一天用SSI连续地注射小鼠直到在肿瘤注射后14天对它们施以安乐死。将右肺腔静脉后叶移除并保存在 中。
[0510] 通过小型珠磨机(Qiagen,目录号85600)将整个小鼠右肺腔静脉后叶在溶解缓冲液中匀化。使用 RNA迷你试剂盒(ThermoFisher Scientific,目录号12183018A)提取所有匀浆中的RNA。将NanodropTM分光光度计用于定量RNA浓度和纯度。使用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad,目录号170-8891)将1微克RNA逆转录成cDNA。对于定量PCR，将50纳克cDNA装载到反应板的各孔中。除cDNA之外，这些孔还含有 Fast Advanced
Master Mix(ThermoFisher Scientific,Cat No.4444554)和 基因表达测定探
针。针对以下各物对样品进行定量：粒酶A(ThermoFisher Scientific,Mm01304452_m1)、粒酶B(ThermoFisher Scientific,Mm00442837_m1)、穿孔素(ThermoFisher Scientific,Mm00812512_m1)、酪氨酸酶(ThermoFisher Scientific,Mm00495817_m1)和GAPDH
(ThermoFisher Scientific,Mm99999915_g1)作为管家基因。将两个技术重复针对目标基因(GOI)铺板，且一份是针对管家基因。
Master Mix(ThermoFisher Scientific,Cat No.4444554)和 基因表达测定探
针。针对以下各物对样品进行定量：粒酶A(ThermoFisher Scientific,Mm01304452_m1)、粒酶B(ThermoFisher Scientific,Mm00442837_m1)、穿孔素(ThermoFisher Scientific,Mm00812512_m1)、酪氨酸酶(ThermoFisher Scientific,Mm00495817_m1)和GAPDH
(ThermoFisher Scientific,Mm99999915_g1)作为管家基因。将两个技术重复针对目标基因(GOI)铺板，且一份是针对管家基因。
[0511] 将ddCt方法用于计算基因表达倍数变化。对GOI的技术复制品求平均值，并且，在GraphPad Prism 7.00上，使用ROUT方法在95％置信度下针对离群值来测试生物重复。将GzmB:1/500x-3和Prf1:1/500x-3的技术离群值从进一步的分析中移走。通过用Ct,GAPDH减去Ct,GOI计算dCt值。通过用安慰剂组的平均dCt减去样品的dCt计算ddCt值。通过获取具有底数2的ddCt的负指数(2-ddCt)来计算倍数变化。使用单向Tukey’s多重比较ANOVA检验，在95％置信度下关于显著性来分析各治疗组的平均倍数变化。
[0512] 图62示出了上述测定的结果，显示了在B16接种小鼠的肺中用不同的QBKPN剂量在(A)GzmA、GzmB、Prf1，和(B)Tyr中的RT-qPCR倍数变化，在第14天对小鼠施以安乐死。对从小鼠的右肺腔静脉后叶分离的50ng cDNA进行 基因表达测定。将值针对GAPDH并且相对于安慰剂组(其是用盐水注射的小鼠)的基因表达进行归一化。数据点是平均值+/-SD。
所有数据点具有n＝5，GzmB-1/500X和Prf1-1/500X除外，其在移除dCt离群值之后具有n＝
4。使用单向Tukey’s多重比较ANOVA检验计算显著性。**p<0.01，***p<0.001和****p<
0.0001。
所有数据点具有n＝5，GzmB-1/500X和Prf1-1/500X除外，其在移除dCt离群值之后具有n＝
4。使用单向Tukey’s多重比较ANOVA检验计算显著性。**p<0.01，***p<0.001和****p<
0.0001。
[0513] 根据此实施例的一方面，SSI可被配制并以一种给药方案施用以便在靶器官或组织中有效介导一种或多种粒酶或穿孔素(如粒酶A、粒酶B和穿孔素)增加的表达。
[0514] 实施例27：独特的SSI激动独特的PRR
[0515] 此实施例说明QBECO和QBKPN SSI都激活多个PRR，并且QBECO和QBKPN各自激活不同的PRR，其中不同的PRR库指纹是针对每种SSI来鉴别。
[0516] 此实施例中的这些数据是由具有单一PRR的细胞系中的QBKPN和QBECO PRR激活测定获得。所用细胞系是HEK293细胞系，其表达单一人Toll样受体(TLR2、3、4、5、7、8和9)、NOD样受体(NOD1和NOD2)、C型凝集素(Dectin 1a、Dectin 1b和Mincle)或RIG-1样受体(RIG-1和MDA5)。
[0517] 如图63中所示，两个TLR被QBECO和QBKPN(TLR 2和TLR4)高度激活。一个TLR仅被QBKPN(TLR5)高度激活。1个PRR被QBECO和QBKPN(NOD2)适当地激活。4个仅被QBECO(TLR3、TLR7、TLR8、TLR9)适当地激活，而2个仅被QBKPN(Dectin 1a、Dectin 1b)适当地激活。NOD1、Mincle、RIG-1和MDA5未被QBECO或QBKPN激活。
[0518] TLR2和TLR4定位在质膜上且主要分别识别脂蛋白和LPS。TLR5是响应于鞭毛蛋白的质膜受体。在RNA/DNA识别TLR中，TLR3仅被QBECO(而非被QBKPN)稍微激活。TLR3主要是病毒RNA的dsRNA受体。位于内吞溶酶体中并且还识别RNA(细菌性和病毒性)的TLR7和8仅由QBECO激活。最终，识别CpG-DNA并位于内吞溶酶体中的TLR9也仅由QBECO激活。在此情形下，相关的是不知道HEK细胞在内吞溶酶体中高度摄取细菌。因此，TLR 7、8和9的QBKPN激活的缺乏可归因于DNA/RNA与这些受体无相互作用。Nod样受体(NLR)是胞浆受体。NOD1不被QBECO或QBKPN激活，但识别胞壁酰二肽(MDP)的NOD2被QBECO和QBKPN激活。分别识别短dsRNA和长dsRNA的其它胞浆受体RIG-1和MDA5不被激活。C型凝集素受体(CLR)位于质膜中并且主要识别碳水化合物。Mincle没有通过QBKPN或QBECO而增加。Dectin 1a和Dectin 1b主要是β-葡聚糖的真菌受体，但也可见细菌碳水化合物。
[0519] 当制成条形图(图64)或雷达图(图65)时，出现整体PRR库指纹。这些结果全部来源于相关SSI的1/10稀释液，其中从吸光度值中减去阴性对照。
[0520] 实施例28：病毒SSI
[0521] 此实施例说明病毒性SSI诱导的免疫改变类似于细菌SSI，如通过与QBKPN SSI治疗相比在病毒SSI治疗的7天之后血液中的免疫关联物所证明。用安慰剂、QBKPN或三种病毒SSI模型治疗小鼠：狂犬病疫苗、猫鼻气管炎-嵌杯病毒病-泛白细胞减少症疫苗和犬流感疫苗。每隔一天皮下注射30μL治疗剂。终点是第4次SSI注射之后24小时(第7天)。在终点时，收集血液并且染色以用于流式细胞术，以便测定中性粒细胞和Ly6CHI单核细胞在血液中的数量作为CD45+细胞的百分比。
[0522] 如图66所示，狂犬病疫苗(灭活的狂犬病病毒)当与安慰剂相比时将中性粒细胞水平增至与QBKPN治疗下所见的水平相当的水平。如图67所示，用狂犬病疫苗、Fel-O-Vac(猫鼻气管炎-嵌杯病毒病-泛白细胞减少症病毒)和Nobivac(犬流感H3H8病毒)的治疗全都具有Ly6CHI单核细胞的相似的增加，与QBKPN治疗相当。
[0523] 这些数据显示由病毒组合物产生的SSI诱导与由细菌组合物产生的SSI相似的免疫响应。表明病毒SSI在血液中的中性粒细胞和Ly6CHI单核细胞水平上提供与QBKPN等效的响应。
[0524] 实施例29：癌抗原增强作用
[0525] 此实施例说明SSI当与癌抗原组合使用时增强免疫应答。如下更详细地阐述，肺靶向的SSI QBKPN介导肿瘤负荷的降低，并且当在与黑素瘤相关抗原(gp100)的组合疗法中使用时进一步降低肿瘤负荷。此效应对于癌抗原的使用有特异性，如通过以下事实所证明：不相关的(有免疫原性，但非肿瘤相关的)抗原不影响肿瘤负荷。SSI癌抗原组合疗法既有效作为共配制组合物，也有效作为SSI和抗原的单独注射液。这证明了SSI作为佐剂驱动对免疫原性癌抗原的免疫应答的用途。
[0526] 将QBKPN SSI与黑素瘤特异性抗原gp100组合的抗肿瘤功效与不相关的对照抗原OVA(也称为SIINFEKL)在来源于Jackson Laboratories的C57Bl/6小鼠中相比。在大约第-31天，用肺炎克雷伯氏杆菌(2.5x105个细胞/小鼠，在用异氟烷麻醉之后通过口咽滴注)感染小鼠，然后休息。在5-7天内，所有小鼠完全从肺炎克雷伯氏杆菌激发中恢复。从第-10天开始，用QBKPN SSI注射(S.C.)一些小鼠；从第-10天到第+12天每隔一天注射小鼠。在旋转部位(根据本文实施例中的典型方案)中以0.03ml的5.0OD悬液的剂量进行注射。
[0527] 在第-10、-6和-4天，还用所示抗原和/或佐剂治疗一些小鼠，与SSI共混合或在远端部位(后颈)s.c.施用。肽疫苗是由黑素瘤特异性抗原gp10025-33(KVPRNQDWL，100μg/小鼠)或来自OVA(OVA257-264，SIINFEKL，100μg/小鼠)的免疫原性对照抗原组成。佐剂是由商用CpG(ODN 1585VacciGrade，30μg/小鼠s.c)组成。在第0天，用B16黑素瘤(3x105个细胞/小鼠，i.v.)激发小鼠。在第+14天，将小鼠处死，计数表面转移，并且收集脾和血液。汇集各组中的脾细胞。将脾细胞(1x106个细胞/孔)与gp10025-33、OVA257-264或对照肽(流感病毒NP366-374)(所有肽，10μg/ml下培养5天，然后关于IFN-γ评估(通过特异性ELISA)上清液作为免疫原性的读出。将血液收集到含有肝素的管中，然后离心以除去细胞。根据制造商方案进行ELISA(RND Systems DuoSet DY485，检测限值：31.2pg/ml)。对所有样品用技术重复(n＝3)进行ELISA以产生针对各培养条件(再刺激的脾细胞)或动物(血清分析)的细胞因子值；将细胞因子数据报告为组平均值+/-标准偏差。通过未配对的T检验(GraphPad PRISM)评估统计差异。
[0528] 如图68所示，肺炎克雷伯氏杆菌预暴露的小鼠的QBKPN治疗显著地(p<0.0001)减轻肺中的转移样B16黑素瘤。在无佐剂的情况下癌抗原(gp100)的施用没有显著作用，与在鼠科系统中对非佐剂疫苗的响应的相对缺乏一致。癌抗原与佐剂(CpG)的施用以比SSI单独较小的程度降低肿瘤负荷(p＝0.0023)。QBKPN SSI与gp100(肿瘤相关抗原)的组合与QBKPN单独相比显著地(p<0.05)提高抗肿瘤功效。在用作共配制剂的SSI/抗原组合与单独的注射液之间在抗肿瘤功效上不存在统计差异。SSI与非特异性抗原(OVA)的组合不提高抗肿瘤功效超出QBKPN SSI单独的水平。
[0529] 这些数据表明QBKPN SSI可充当佐剂以诱导/提高癌症疫苗的功效，并且此佐剂效果可作为共配制剂或单独的施用利用。这些结果证明了抗癌作用，其中SSI(单独或与抗原一起)优于佐剂抗原(gp100+CpG)。与此一致，SSI治疗在无或有抗原的情况下提高IFN-γ的循环水平。
[0530] 实施例30：STING激动剂和SSI
[0531] 此实施例说明了用另外的PRR激动剂(在此情况下是STING激动剂)加强的微生物SSI的提高的功效。这些配制剂构成一类人工PRR激动剂库，其中微生物PRR激动剂库是用一种或多种另外的异源PRR激动剂加强。
[0532] QBKPN SSI与STING激动剂2’2’-cGMAP(inVivoGen)组合的抗肿瘤功效在C57Bl/6小鼠中证明如下。在大约第-31天，在用异氟烷麻醉之后通过口咽滴注，用肺炎克雷伯氏杆菌(2.5x105个细胞/小鼠)感染小鼠，然后休息。在5-7天内，所有小鼠完全从肺炎克雷伯氏杆菌激发中恢复。从第-10天开始，用QBKPN SSI注射(S.C.)一些小鼠；从第-10天到第+12天每隔一天注射小鼠。在旋转部位中以0.03ml的5.0OD悬液的剂量进行注射。在第-10、-6和-4天，还用STING激动剂(10μg/小鼠在20μl盐水中的SC注射液)治疗一些小鼠，与SSI共混合或在远端部位(后颈)s.c.施用。在第0天，通过肿瘤细胞(2.0x105个细胞/小鼠)的单细胞悬液的尾静脉(I.V)注射，用B16黑素瘤激发小鼠。在第+14天，收集血浆用于ELISA，然后处死小鼠并且计数和记录可见的转移。将血清收集到含有肝素的管中，然后离心以除去细胞。根据制造商方案进行ELISA(RND Systems DuoSet DY485，检测限值：31.2pg/ml)。对所有血浆样品用技术重复(n＝3)进行ELISA以产生各动物的细胞因子值；将细胞因子数据报告为组平均值+/-标准偏差(n＝7只小鼠/组)。通过未配对的T检验(GraphPad PRISM)评估统计差异。
[0533] 如图69所示，肺炎克雷伯氏杆菌预暴露的小鼠的QBKPN治疗显著地(p<0.0001)减轻肺中的转移样B16黑素瘤。STING激动剂单独的施用也降低肿瘤负荷(p＝0.0038)。SSI与STING激动剂的组合进一步降低肿瘤负荷；在SSI和激动剂的共注射之后肿瘤结节的数量与未治疗的(p<0.0001)、单独SSI(p＝0.0206)或单独STING激动剂(p＝0.0006)相比显著减少(图1)。同样，用SSI与STING激动剂的同时疗法(单独的注射部位)与未治疗的(p<0.0001)或单独激动剂(p＝0016)相比降低肿瘤负荷。
[0534] 如图70所示，SSI治疗和STING激动剂治疗都提高IFN-γ的循环水平(分别p<0.0001和p＝0.0038)。SSI与STING激动剂的组合进一步提高细胞因子水平，尽管STING激动剂治疗在18天期间未曾进行。组合治疗之后的细胞因子水平在统计上大于单试剂治疗。在肿瘤负荷与血浆IFN-γ水平之间存在显著的负相关。总之，这些数据说明了使用STING激动剂和SSI的有效组合疗法。
[0535] 实施例31：SSI疗法响应的遗传标志物
[0536] 此实施例提供对于患有IBD且接受SSI疗法治疗的受试者的遗传分析，示出了与IBD有关的遗传标志物用于鉴别适合于SSI治疗的患者群体的用途。在此实施例中，有48名患有IBD的受试者及大约240万单核苷酸多态性(SNP)，它们是遵循Infinium Omni2.5-8珠粒芯片上的基因分型的分析对象。这些基因分析的终点是变化的并且涵盖临床响应以及疾病活性的目标标志物的使用。在标准质量控制测量(包括呼叫频率、次要等位基因频率及哈迪-温伯格平衡测试(Hardy-Weinberg equilibrium test))之后，总共1,271,655个SNP可用于分析。113个已知的IBD基因座在芯片上表示并且通过质量控制。在研究受试者中，纳入31个克罗恩氏病(CD)和12个溃疡性结肠炎(UC)病例。
[0537] 许多IBD相关的SNP与IBD病例中的SSI治疗结果相关，使用p＝0.05作为名义显著性，例如：
[0538] CD表型和IBD相关的SNP
[0539] ●CD中最后一个记录的响应(响应对比无响应)-标记FASLG的SNP，TNFSF18基因是最高相关(p＝0.0033)。
[0540] ●相同的FASLG，TNFSF18基因座也与CD病例中CDAI的下降相关(p＝0.018)。
[0541] ●钙卫蛋白中的CD下降与标记以下4个基因座的许多SNP相关：
[0542] ○NEXN、FUBP1、DNAJB4、GIPC2、MGC27382；
[0543] ○ATF4、TAB1；
[0544] ○IL23R；
[0545] ○IL8、CXCL1、CXCL6、CXCL3、PF4、CXCL5、CXCL2(所有p<0.05)。
[0546] ●CRP中的8周下降与标记NOTCH2的SNP相关(p＝0.002)。
[0547] UC表型和IBD相关的SNP
[0548] ●在16周时Mayo评分下降与标记以下的SNP相关：
[0549] ○HNF4A
[0550] ○IRFI
[0551] ○GPR12
[0552] ○nd FOXO1(所有p<0.05)
[0553] ●HNF4A和GPR12也与治疗16周之后UC中CRP的下降相关。
[0554] IBD表型和IBD相关的SNP
[0555] ●在组合的所有IBD病例中的持续响应显示与标记基因座FASLG、TNFSF18(p＝0.02)以及JAK2(p＝0.04)的SNP相关。
[0556] 在针对以上列举的表型的芯片中的所有SNP的分析揭示了如表22中概述的许多关联：
[0557] 表22：在基因分型平台上所有SNP的无偏分析
[0558]SNPID P值 基因
kgp10600643 0.00037 BMPR1B
rs1998639 0.00043 CD1D、KIRREL
rs9578586 0.00046 SGCG、SACS
rs1467073 0.00055 DENND3、SLC45A4
rs12364461 0.00062 P2RY2、P2RY6、ARHGEF17、FCHSD2
kgp8836175 0.00069 ZFHX3
kgp10600643 0.00037 BMPR1B
rs1998639 0.00043 CD1D、KIRREL
rs9578586 0.00046 SGCG、SACS
rs1467073 0.00055 DENND3、SLC45A4
rs12364461 0.00062 P2RY2、P2RY6、ARHGEF17、FCHSD2
kgp8836175 0.00069 ZFHX3
[0559] 使用基于所有已知IBD相关SNP的累积基因风险评分(GRS；参见Jostins等人,(2013)PLoS ONE 8(10):e76328)，鉴别出与对SSI治疗具有比非响应者更高的由112个IBD相关SNP(以下列出)得出的GRS的CD响应者的高度显著的关联(p＝2.43x 10-5)，如图71A所示。使用这些SNP中的仅3个，在原始p值<0.05(rs9286879、rs7517810、rs17391694)下，还证明了与CD响应者的显著关联(P值：1.385E-04)，如图71B所示。类似地，在UC响应者中观察到与非响应者相比存在与更高GRS的关联，如图72所示(p＝0.012)，提供了CD表型的独立验证和上文总结的GRS发现结果。鉴于绝大多数IBD相关基因座在CD与UC之间共用，将这些数据组合作为所有IBD病例中的累积GRS是有效的。尽管只有少数病例，但在最后一次随访时在GRS与响应之间存在极显著的关联，如图73所示(p＝8.18x 10-7)。
[0560] 累积GRS与CD、UC和组合IBD患者群中最后记录的响应之间的显著关联表明患有遗传上富集与IBD相关的遗传标志物的IBD的个体更可能对SSI有响应。此外，因为大多数这些遗传变体与其它免疫介导疾病相关，所以这表明此方法可扩展到当用SSI治疗时除IBD以外的其他患者群组。这些发现结果表明可鉴别出更可能对SSI治疗有响应的受试者，如IBD受试者。因此，本发明的一方面涉及提供与SSI疗法有关的伴随诊断性基因检测测定。可在此类测定中使用的SNP和遗传基因座在以下中列出。
[0561] ●243个IBD易感性SNP的列表：rs1748195、rs34856868、rs11583043、rs6025、rs10798069、rs7555082、rs11681525、rs4664304、rs3116494、rs7556897、rs111781203、rs35320439、rs113010081、rs616597、rs724016、rs2073505、rs4692386、rs6856616、rs2189234、rs395157、rs4703855、rs564349、rs7773324、rs13204048、rs7758080、rs1077773、rs2538470、rs17057051、rs7011507、rs3740415、rs7954567、rs653178、rs11064881、rs9525625、rs3853824、rs17736589、rs9319943、rs7236492、rs727563、rs17391694、rs6679677、rs3897478、rs9286879、rs1728918、rs10865331、rs6716753、rs12994997、rs6837335、rs13126505、rs10065637、rs7702331、rs17695092、rs12663356、rs9264942、rs9491697、rs13204742、rs212388、rs10486483、rs864745、rs7015630、rs6651252、rs3764147、rs16967103、rs2066847、rs2945412、rs2024092、rs4802307、rs516246、rs2284553、rs10797432、rs6426833、rs2816958、rs1016883、rs17229285、rs9847710、rs3774959、rs11739663、rs254560、rs6927022、rs798502、rs4722672、rs4380874、rs4728142、rs483905、rs561722、rs28374715、rs11150589、rs1728785、rs7210086、rs1126510、rs6088765、rs6017342、rs12103、rs35675666、rs12568930、rs11209026、rs2651244、rs4845604、rs670523、rs4656958、rs1801274、rs2488389、rs7554511、rs3024505、rs6545800、rs925255、rs10495903、rs7608910、rs6740462、rs917997、rs2111485、rs1517352、rs2382817、rs3749171、rs4256159、rs3197999、rs2472649、rs7657746、rs2930047、rs11742570、rs1363907、rs4836519、rs2188962、rs6863411、rs11741861、rs6871626、rs12654812、rs17119、rs9358372、rs1847472、rs6568421、rs3851228、rs6920220、rs12199775、rs1819333、rs1456896、rs9297145、rs1734907、rs38904、rs921720、rs1991866、rs10758669、rs4743820、rs4246905、rs10781499、rs12722515、rs1042058、rs11010067、rs2790216、rs10761659、rs2227564、rs1250546、rs6586030、rs7911264、rs4409764、rs907611、rs10896794、rs11230563、rs4246215、rs559928、rs2231884、rs2155219、rs6592362、rs630923、rs11612508、rs11564258、rs11168249、rs7134599、rs17085007、rs941823、rs9557195、rs194749、rs4899554、rs8005161、rs17293632、rs7495132、rs529866、rs7404095、rs26528、rs10521318、rs3091316、rs12946510、rs12942547、rs1292053、rs1893217、rs7240004、rs727088、rs11879191、rs17694108、rs11672983、rs6142618、rs4911259、rs1569723、rs913678、rs259964、rs6062504、rs2823286、rs2836878、rs7282490、rs2266959、rs2412970、rs2413583、rs2641348、rs7517810、rs1260326、rs7438704、rs10061469、rs2503322、rs5743289、rs6667605、rs1440088、rs3774937、rs477515、rs1182188、rs17780256、rs11083840、rs3766606、rs13407913、rs6708413、rs2457996、rs10051722、rs4976646、rs7746082、rs38911、rs13277237、rs2227551、rs7097656、rs12778642、rs11229555、rs174537、rs568617、rs2226628、rs566416、rs11054935、rs3742130、rs1569328、rs2361755、rs3091315、rs1654644、rs4243971、rs6087990、rs6074022、rs5763767。
[0562] ●共同生成图71A的GRS的112个SNP的子集：rs10065637、rs1016883、rs1042058、rs10521318、rs10758669、rs1077773、rs10781499、rs10865331、rs10896794、rs11054935、rs11083840、rs11150589、rs11168249、rs11209026、rs11583043、rs11672983、rs11739663、rs11742570、rs1182188、rs1260326、rs12778642、rs13204048、rs13277237、rs1517352、rs1569723、rs1654644、rs17085007、rs17119、rs17229285、rs1728918、rs1734907、rs17391694、rs1748195、rs17780256、rs1801274、rs1847472、rs1893217、rs194749、rs2024092、rs2111485、rs212388、rs2155219、rs2188962、rs2189234、rs2227551、rs2231884、rs2413583、rs2472649、rs2641348、rs2651244、rs26528、rs2816958、rs2823286、rs2836878、rs2930047、rs3024505、rs35320439、rs3742130、rs3764147、rs3766606、rs38904、rs395157、rs4243971、rs4409764、rs4692386、rs4728142、rs477515、rs4802307、rs4836519、rs483905、rs4976646、rs516246、rs559928、rs564349、rs566416、rs568617、rs6017342、rs6088765、rs616597、rs6426833、rs6651252、rs6667605、rs6856616、rs6863411、rs6920220、rs7097656、rs7134599、rs7210086、rs7236492、rs7240004、rs724016、rs7282490、rs7495132、rs7517810、rs7702331、rs7758080、rs864745、rs917997、rs921720、rs925255、rs9264942、rs9286879、rs9297145、rs9319943、rs941823、rs9491697、rs9847710、rs12199775、rs12654812、rs1292053、rs2227564、rs3197999、rs6074022。
[0563] 112个SNP的上述子集展现与对SSI疗法的响应的不同程度的关联，如表23A和23B中所列，其鉴别了每个SNP的相关等位基因以及反映那个等位基因与SSI响应的关联的优势率。在表23A中，大于1的优势率表明指定等位基因与对SSI疗法的响应正相关，小于1的优势率表明替代等位基因与对SSI疗法的响应正相关，并且表中列出的等位基因与对SSI疗法的响应负相关。在表23B中，在表23A中呈负的优势率已被转化成替代等位基因的正优势率，以便所有优势率都大于1并且响应等位基因是与对SSI疗法的响应相关的等位基因。
[0564] 表23A：与对SSI疗法的响应相关(或负相关)的SNP等位基因
[0565]
[0566]
[0567]
[0568]
[0569]
[0570] 表23B：与对SSI疗法的响应相关的SNP等位基因
[0571]
[0572]
[0573]
[0574]
[0575]
[0576] 在112个SNP的上述子集内，数量分别与临床功效的特定标志物相关，并且这些SNP又在空间上与基因相关，以便与这些基因相关的替代标志物(如SNP)也可充当SSI功效的标志物，如表24中所列举。
[0577] 表24：所选SNP和相关基因
[0578]
[0579]
[0580]
[0581] 上述IBD相关的SNP在空间上与基因有关(Liu等人,Nature Genetics.47.9(2015年9月):p979)，以便与这些基因有关的替代标志物(如SNP)也可充当SSI功效的标志物，如表25中所列举：
[0582] 表25：另外的SNP和相关基因
[0583]
[0584]
[0585] 上述IBD相关的SNP在空间上与基因有关(Jostins,等人,Nature.2012；491:119–124)，以便与这些基因有关的替代标志物(如SNP)也可充当SSI功效的标志物，如表26中所列举：
[0586] 表26：其它SNP和相关基因
[0587]
[0588]
[0589] 上述IBD相关的SNP在空间上与基因有关(Jostins,等人,Nature.2012；491:119–124)，以便与这些基因有关的替代标志物(如SNP)也可充当SSI功效的标志物，如表27a中所列举：
[0590] 表27a：其它所选SNP和相关基因
[0591]
[0592]
[0593]
[0594] 成对基因座之间的相关系数可由术语r-平方(r2)反映，该术语可用于度量替代遗传标志物提供相似诊断或预后信息的程度。r2的值在0与1的范围内(当两个标志物提供相同信息时为1，且当它们处于理想的平衡中时为0)。常规地，具有r2>0.8的标志物可被认为处于高连锁不平衡中，以便它们可提供相似的诊断或预后信息。因此，本文所述的测定的一方面涉及与以上鉴别的例如具有r2>0.7、r2>0.8、r2>0.9或r2>0.95的标志物处于连锁不平衡中的标志物的使用。另外，提供相关信息的标志物的特征可为基因组中的物理邻近性，例如彼此相距在1Mbp内，例如，彼此相距在50Kb、60Kb、70Kb、80Kb、90Kb、100Kb、200Kb、300Kb、400Kb或500Kb内。
[0595] 根据上文，“遗传SSI响应标志物”意指遗传生物标志物，其存在与对SSI治疗的响应的概率相关。示例性遗传SSI响应标志物公开于此实施例中，证明了与在IBD患者中对SSI的响应的相关性。遗传SSI响应标志物可通过广泛的基因组测定来检测，并且也可通过查询基因组的转录或翻译产物(例如，与具体的基因组等位基因相关的蛋白质同工型)的测定来检测。类似地，本文中公开“生化SSI响应标志物”提供对SSI疗法的响应的生化指标，其包括例如在细胞群中或在生物相关分子的丰度或浓度中的瞬时或特殊变化。生化和遗传SSI响应标志物可用作SSI治疗情形下的诊断或预后指标，例如用于一般的IBD，或用于特定形式的IBD，如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎。示例性遗传SSI响应标志物列于表27b以及表23至26中。
[0596] 表27b：遗传SSI应答标志物
[0597]
[0598] 实例32：PRR受体靶标
[0599] 此实施例提供了作为替代SSI的靶标的PRR受体的分析。
[0600] 表28：由所选SSI刺激的PRR的列表，包括QBKPN、QBECO和QBSAU。当PRR是“任选的”时，这表明一些实施方案可被设计以包括指定PRR的激动剂。
[0601]
[0602]
[0603]
[0604]
[0605] 表29：在所选分级分离的SSI中、特别是在如本文所例示的DNA级分中的PRR激动剂[0606]
[0607]
[0608] 表30：在所选分级分离的SSI中、特别是在如本文所例示的外膜级分中的PRR激动剂
[0609]
[0610] 因此，在选择的实施方案中，使用来源于靶组织的微生物病原体的微生物PRR激动剂,提供了靶向PRR的所选子集的SSI疗法。例如，提供了一种包含至少所选数目的独特PRR的微生物激动剂的免疫原性组合物，以用于引发靶组织中的先天性应答，其中PRR激动剂是来自单一微生物物种的微生物组分，其在靶组织中选择性地致病。由激动剂所靶向的独特PRR的数目可例如是5至25的数目，或至少在这个整数范围内的数目，例如至少5、6等。独特的PRR可例如选自表28、29和/或30中所列的PRR。
[0611] 实施例33：SSI疗法的细胞因子标志物
[0612] 此实施例提供了指示SSI疗法的各个方面的细胞因子标志物的指标。这些数据反映了来自克罗恩氏病患者群组的42种细胞因子/趋化因子的分析，这些患者在涉及68名患者的随机化安慰剂对照试验的基线、第4周、第8周、第16周和第24周时接受了采用QBECO的SSI疗法。
[0613] 在QBECO暴露下的细胞因子变化
[0614] 在第8周和第16周时间点时，QBECO暴露增加IL-18和IP-10。IL-18的血清水平展示在第8周在用QBECO对比安慰剂治疗的患者之间的最显著差异(中值变化24pg/mL，调整的p＝0.0256)(图74)。IL-18的这种增加在第16周时间点时也是明显的。展现显著差异的第二血清生物标志物是IFNγ-诱导蛋白10(IP-10，也称为CXCL10)，其在第8周(中值变化7pg/mL，调整的p＝0.036)和第16周(中值变化22pg/mL，调整的p＝0.0151)在QBECO暴露患者中展示更大的增加。
[0615] 血管内皮生长因子A(VEGF-A)在第8周(中值变化14pg/mL，调整的p＝0.0483)时在QBECO组中显示一些增加，但此差异在第16周治疗时间点的结束时丧失。许多其它免疫因子显示从基线增至QBECO暴露8周的强趋势；它们包括：粒细胞集落刺激因子(GCSF)、IFNγ、IL-17A、IL-6、IL-7和转化生长因子-α(TGFα)。
[0616] 这些血清免疫因子在患者于第16周后取消所有治疗之后都不保持升高并且在第24周再次评估，说明这些生物标志物大多数有助于评估在治疗时对QBECO的免疫响应性。
[0617] 与临床响应相关的血清生物标志物细胞因子浓度变化
[0618] 在暴露于QBECO的患者(N＝42，包括最初针对QBECO随机化的那些和在第8周从安慰剂转换的那些)中进行亚分析以评估随时间的任何免疫变化是否与临床结果相关。Il-18在具有临床响应和缓解的那些患者中比非响应者增加更少。IP-10在具有临床响应和缓解的那些患者中比非响应者增加更少。IFNγ、IL-12p70、IL-17A和TGFα显示对于响应者与非响应者相比随时间的增加的显著差异。具体说来，IFNγ、IL-12p70、IL-17A和TGFα在经历针对QBECO的临床响应的患者中与非响应者相比在第8周具有随时间的更多增加(调整的p＝0.0344)(图75)。
[0619] 与临床响应相关的基线血清免疫因子
[0620] 较低的Eotaxin 1是响应于QBECO治疗有缓解的预测性生物标志物。具体说来，Eotaxin-1(C-C趋化因子11)的基线血清水平与临床缓解有强关联(调整的p＝0.0016)，其中在基线处具有更高水平的患者不太可能在到QBECO治疗的第8周时进入临床缓解(图76)。虽然在对多重比较校正之后未达到统计显著性，但具有较高基线IL-10和IL-12p40的患者也不太可能在到第8周时具有对QBECO治疗的临床响应(图76)。
[0621] 试验结果表明先前已暴露于TNFα抑制剂如RemicadeTM或HumeraTM的患者不太可能在QBECO治疗的第8周之后经历临床缓解或响应。这对于可具有更严重的免疫功能障碍的治疗组来说更困难，因为他们暴露于这些免疫抑制药物和/或归因于他们的病状性质。将与通过先前TNFα抑制剂暴露得到的与临床结果相关的免疫因子的平均基线血清水平分组提供了支持此观点的证据。与患者对QBECO、Eoxtaxin-1、IL-10和IL-12p40的响应负相关的基线血清免疫因子在先前暴露于抗TNFα疗法的患者中与未暴露的患者相比更高(表31)。
[0622] 表31.通过先前的TNFα抑制剂暴露分组的Eotaxin-1、IL-10和IL-12p40的平均基线血清水平
[0623]
[0624]
[0625] *来自IL-10测定的20个读数和来自IL-12p40的5个读数超出了测定的范围或不可靠
[0626] 在抗TNFα初次治疗的患者中的高响应率和缓解率
[0627] 在抗TNFα初次治疗的患者中，用QBECO SSI持续8周的治疗产生64％的统计上显著的响应率，相比之下在安慰剂对照中是27％(p＝0.041)。在治疗8周之后的临床缓解率也是可观的，为50％，是安慰剂(23％)的两倍(p＝0.16)。使用标准克罗恩氏病活动指数(CDAI)评估临床响应率和缓解率，定义为CDAI减少≥70点(响应)和CDAI评分≤150点(缓解)。抗TNFα初次治疗的患者包括例如没有用免疫抑制药物和 治疗的患者。在先前用TNFα抑制剂治疗且已完成16周的SSI治疗的患者中，
40％处于缓解中，表明此更具激发性的患者组可响应于具有较长治疗的QBECO SSI。
40％处于缓解中，表明此更具激发性的患者组可响应于具有较长治疗的QBECO SSI。
[0628] 构建复合预测模型以评估到治疗第8周时患者响应于QBECO的可能性
[0629] 使用正规化逻辑回归建模方法(其同时选择与响应有强关联的变量且对它们进行优化加权以产生预测评分)，构建复合预测模型，其既包括基线生物标志物测量(即，42种免疫因子，包括细胞因子、趋化因子和生长因子)，也包括基线临床和人口统计特征。后者可用的变量包括招募年龄、随机化时的年龄、诊断时的年龄、从诊断到随机化的时间、性别、种族(是否为高加索人)、地点(是否为温哥华)、先前抗TNFα疗法、基线克罗恩氏病活动指数(CDAI)评分、基线粪便钙卫蛋白水平、和基线C-反应蛋白水平。
[0630] 可对接受者操作曲线下面积(AUROC)进行“优化调整”以校正模型拟合的潜在过高估计。此“优化调整的”AUROC因此可更容易可靠地应用于未来的独立数据。
[0631] 如此实施例中的分析所示，高基线血清Eotaxin-1是在QBECO治疗8周之后的临床响应的最强阴性生物标志物预测变量并且包括在生成的所有模型中。在临床/人口统计变量中-性别(雌性更可能响应于QBECO治疗)和先前的抗TNFα疗法(先前暴露的那些不太可能响应于QBECO)是最强的预测变量。表32总结了所生成的不同模型。就预测模型的商业可行性来说，典型的商业生物标志物标准需要AUROC>7。在优化调整之后，由此类数据生成的复合模型实现了此水平的预测值，其中包括以下变量：性别、先前TNFα疗法、以及Eotaxin-1、GROα(也称为CXCL1-中性粒细胞趋化因子)、IL-10、PDGF AA和RANTES(也称为CCL5-针对活化的T细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞的趋化因子)的基线水平。或者，也可使用Eotaxin、GROα、IL10、PDGF AA、RANTES、性别和先前aTNFα开发预测模型，从而以高置信度预测响应。
[0632] 表32.在QBECO治疗8周之后四个预测模型关于临床响应和临床缓解的性能
[0633]
[0634]
[0635] *-在0.05水平下是显著的。
[0636] 分析
[0637] 在QBECO暴露下的细胞因子变化：IL-18(调整的p在第8周时＝0.011且在第16周时＝0.067)和IP-10(调整的p在第8周时＝0.036且在第16周时＝0.015)显示在暴露于QBECO下的实质和统计上显著的增加。这两个细胞因子还显示在第8周时对于临床响应者和非响应者(调整的p对于两者都＝0.0328)以及在临床缓解中和不在临床缓解中的那些(调整的p对于两者都＝0.0368)的不同轨迹。此外，IL-18显示随机化为QBECO和安慰剂的那些的不同轨迹(调整的p＝0.0256)。
[0638] 细胞因子与结果的关联：基线Eotaxin-1浓度在QBECO暴露的受试者中与临床结果最强地相关；在基线处具有更高Eotaxin-1浓度的那些在QBECO暴露8周之后更可能实现临床缓解(调整的p＝0.0016)。
[0639] 复合生物标志物：Eotaxin-1、GRO-α、IL-10、PDGF AA和RANTES的基线浓度与临床变量即性别和先前抗TNFAα暴露组合提供8周临床结果的预测，其明显优于偶然(优化调整的AUROC对于响应＝0.70，95％CI[0.59,0.81]且对于缓解＝0.71，95％CI[0.60,0.82])。此模型对于安慰剂组中的受试者具有一些可观察的预测能力(AUROC对于响应＝0.67 95％CI[0.45,0.89]且对于缓解＝0.70[0.47,0.93]。
[0640] 总结
[0641] QBECO SSI疗法通过随时间增加某些细胞因子(IL-18和IP-10)引起生物响应。惊人的是，虽然两种细胞因子在QBECO治疗之后都增加，但作为响应者的患者增加更少。可因此调整治疗方案(如给药)以实现此结果。
[0642] IFNg、IL-12P70、IL-17A和TGFa在响应者中比非响应者增加更多。可因此调整治疗方案(如给药)以实现此结果。TGFa可例如用作粘膜愈合的标志物。
[0643] 较低的Eotaxin 1水平可用作患者更适于SSI治疗的指标。
[0644] 结论：
[0645] ●血清IL-18从基线至治疗第8周和第16周的增加是关于QBECO暴露/活性的最佳生物标志物(在所评估的42个中)；
[0646] ●IFNγ、IL-12p70、IL-17A和TGFα的血清水平在QBECO治疗8周之后的后续升高与临床响应相关；
[0647] ●具有更高基线水平的Eotaxin-1(及较低水平的IL-10和IL-12p40)的克罗恩氏患者在治疗8周之后不太可能经历对QBECO的临床响应或缓解；先前的抗TNFα疗法可能易于具有较高水平的这些因子，且抗TNFα初次治疗的患者代表适于QBECO SSI疗法的独特的克罗恩氏患者群体；
[0648] ●包括基线血清生物标志物和临床/人口统计资料的复合模型将能够预测：在优化调整(AUROC≥7)之后，患者响应于8周QBECO治疗的可能性；最终模型中的变量包括性别、先前的抗TNFα疗法以及Eotaxin-1、GROα、IL-10、PDGF AA和RANTES的基线血清水平。
[0649] 此生物标志物分析说明了可行的预测复合模型的建立，其可提供对于克罗恩氏病的个性化治疗。此生物标志物分析单独或与本文所例示的遗传分析组合时都可有用，示出了基于推导基因评分在响应者与非响应者之间的显著分组。
[0650] 实施例34：DSS结肠炎模型
[0651] 此实施例示出了来自化学诱导的结肠炎的小鼠模型的结果，该模型是用于评估QBECO SSI疗法的功效。向小鼠给予饮用水中的葡聚糖硫酸钠(DSS)以诱导结肠炎，其模拟人的溃疡性结肠炎。在疾病模型中，将一个群组的小鼠暴露于DSS持续7日，第二组暴露于DSS持续7日，继之以3日的水。在DSS暴露之前，在10天时期内每隔一天向小鼠给予SSI注射液。在DSS暴露期间每隔一天继续进行SSI注射。如所示，结果表明用QBECO的SSI治疗通过限制重量减轻(图77)、降低疾病严重性(图78)并保持粘膜屏障功能(图79)来改善疾病严重程度。QBECO SSI治疗在此模型中的药效学是通过用QBECO或安慰剂治疗的无病小鼠中的血液中性粒细胞(图80)和血液细胞因子(图81)水平来说明，其中QBKPN的药代动力学(图82)一般用于模拟SSI的药代动力学，包括QBECO(将QBKPN SSI用荧光标记并皮下注射到无病小鼠中，在48小时内的不同时间点下对小鼠放血)。
[0652] 实施例35：组织生物标志物
[0653] 此实施例说明了来自小鼠癌症模型的结果，示出了对SSI疗法的组织特异性生物标志物响应。如图83中所示，肺组织中的基因表达证明了针对CXCL10(IP-10)、CCL2(MCP-1)和CCR2的组织特异性SSI响应。在此实施例中，每隔一天用安慰剂、QBKPN或QBECO治疗小鼠持续10天，之后经由尾静脉注射将B16F10肿瘤植入到肺中。肿瘤接种之后，继续每隔一天的治疗。在第5天(A、C、E)或第17天(B、D、F)对小鼠施以安乐死。因此，在替代实施方案中，CXCL10(IP-10)、CCL2(MCP-1)和/或CCR2可用作生化SSI响应标志物，例如在活检组织样品测定中。
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