1.一种用于鉴定样品中的含有靶核苷酸序列的一个或多个核酸分子的方法，所述靶核苷酸序列因一种或多种核苷酸、一个或多个拷贝数、一种或多种转录物序列和/或一个或多个甲基化残基而不同于所述样品或其他样品中的其他核酸分子中的核苷酸序列，所述方法包括：
提供含有的一个或多个核酸分子的样品，所述一个或多个核酸分子潜在含有因一种或多种核苷酸、一个或多个拷贝数、一种或多种转录物序列和/或一个或多个甲基化残基而不同于其他核酸分子中的所述核苷酸序列的所述靶核苷酸序列；
提供能够消化所述样品中存在的含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的一种或多种酶；
提供一个或多个一级寡核苷酸引物组，每个一级寡核苷酸引物组包括(a)第一一级寡核苷酸引物，其包含与邻近所述靶核苷酸序列的序列互补的核苷酸序列，和(b)第二一级寡核苷酸引物，其包含与由所述第一一级寡核苷酸引物形成的延伸产物的一部分互补的核苷酸序列；
将所述样品、所述一个或多个一级寡核苷酸引物组、能够消化所述样品中的含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的所述一种或多种酶、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物以及DNA聚合酶共混以形成聚合酶链式反应混合物；
使所述聚合酶链式反应混合物经历适于消化所述聚合酶链式反应混合物中存在的含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的条件，以及包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成包含所述靶核苷酸序列或其互补序列的一级延伸产物；
将所述一级延伸产物与连接酶和一个或多个寡核苷酸探针组共混以形成连接反应混合物，其中每个寡核苷酸探针组包括(a)第一寡核苷酸探针，其具有5’引物特异性部分和3’靶核苷酸序列特异性部分，和(b)第二寡核苷酸探针，其具有5’靶核苷酸序列特异性部分和
3’引物特异性部分，并且其中探针组的所述第一寡核苷酸探针和所述第二寡核苷酸探针被构造成以碱基特异性方式杂交于一级延伸产物的互补靶核苷酸序列上；
使所述连接反应混合物经历一个或多个连接反应循环，由此将所述一个或多个寡核苷酸探针组的所述第一寡核苷酸探针和所述第二寡核苷酸探针连接在一起以在所述连接反应混合物中形成连接产物序列，其中每个连接产物序列包含所述5’引物特异性部分、所述靶特异性部分和所述3’引物特异性部分；
提供一个或多个二级寡核苷酸引物组，每个二级寡核苷酸引物组包括(a)第一二级寡核苷酸引物，其包含与所述连接产物序列的所述5’引物特异性部分相同的核苷酸序列和(b)第二二级寡核苷酸引物，其包含与所述连接产物序列的所述3’引物特异性部分互补的核苷酸序列；
将所述连接产物序列、所述一个或多个二级寡核苷酸引物组、能够消化含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的所述一种或多种酶、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物以及DNA聚合酶共混以形成第二聚合酶链式反应混合物；
使所述第二聚合酶链式反应混合物经历适于消化所述第二聚合酶链式反应混合物中存在的含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的条件，以及包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成二级延伸产物；以及
对所述样品中的所述二级延伸产物进行检测和区分以鉴定含有靶核苷酸序列的一个或多个核酸分子的存在，所述靶核苷酸序列因一种或多种核苷酸、一个或多个拷贝数、一种或多种转录物序列和/或一个或多个甲基化残基而不同于所述样品中的其他核酸分子中的核苷酸序列。
2.一种用于鉴定样品中的含有靶核苷酸序列的一个或多个核酸分子的方法，所述靶核苷酸序列因一种或多种核苷酸、一个或多个拷贝数、一种或多种转录物序列和/或一个或多个甲基化残基而不同于所述样品或其他样品中的其他核酸分子中的核苷酸序列，所述方法包括：
提供含有一个或多个核酸分子的样品，所述一个或多个核酸分子潜在含有因一种或多种核苷酸、一个或多个拷贝数、一种或多种转录物序列和/或一个或多个甲基化残基而不同于其他核酸分子中的所述核苷酸序列的所述靶核苷酸序列；
提供能够消化所述样品中存在的含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的一种或多种酶；
提供一个或多个一级寡核苷酸引物组，每个一级寡核苷酸引物组包括(a)第一一级寡核苷酸引物，其包含与邻近所述靶核苷酸序列的序列互补的核苷酸序列，和(b)第二一级寡核苷酸引物，其包含与由所述第一一级寡核苷酸引物形成的延伸产物的一部分互补的核苷酸序列；
将所述样品、所述一个或多个一级寡核苷酸引物组、能够消化所述样品中的含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的所述一种或多种酶、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物以及DNA聚合酶共混以形成聚合酶链式反应混合物；
使所述聚合酶链式反应混合物经历适于消化所述聚合酶链式反应混合物中存在的含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的条件，以及包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成包含所述靶核苷酸序列或其互补序列的一级延伸产物；
将所述一级延伸产物与连接酶和一个或多个寡核苷酸探针组共混以形成连接反应混合物，其中每个寡核苷酸探针组包括(a)第一寡核苷酸探针，其具有5’部分和3’靶核苷酸序列特异性部分，和(b)第二寡核苷酸探针，其具有5’靶核苷酸序列特异性部分和3’部分，其中所述探针组的所述第一寡核苷酸探针的所述5’部分与所述第二寡核苷酸探针的所述3’部分的一部分互补，其中所述探针组中的一个探针包含产生可检测信号的部分，并且其中探针组的所述第一寡核苷酸探针和所述第二寡核苷酸探针被构造成以碱基特异性方式杂交于一级延伸产物的互补靶核苷酸序列上；
使所述连接反应混合物经历一个或多个连接反应循环，由此将所述一个或多个寡核苷酸探针组的所述第一寡核苷酸探针和所述第二寡核苷酸探针连接在一起以在所述连接反应混合物中形成连接产物序列，其中每个连接产物序列包含所述5’部分、所述靶特异性部分、所述3’部分和所述产生可检测信号的部分；
使所述连接产物序列的所述5’部分与其互补的3’部分杂交；
检测在所述杂交后产生的来自所述产生可检测信号的部分的信号；以及
基于所述检测区分所述样品中的连接产物序列以鉴定含有靶核苷酸序列的一个或多个核酸分子的存在，所述靶核苷酸序列因一种或多种核苷酸、一个或多个拷贝数、一种或多种转录物序列和/或一个或多个甲基化残基而不同于所述样品中的其他核酸分子中的核苷酸序列。
3.如权利要求1或2所述的方法，其还包括：
在所述共混形成聚合酶链式反应混合物之前或同时，使所述样品与至少第一甲基化敏感性酶接触以形成限制性酶反应混合物，其中所述第一甲基化敏感性酶裂解所述样品中的在至少一种甲基化敏感性酶识别序列内含有一个或多个未甲基化残基的核酸分子，并且由此所述检测包括检测含有所述靶核苷酸序列的一个或多个核酸分子，其中所述核酸分子初始含有一个或多个甲基化残基。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述第一一级寡核苷酸引物包含与所述靶核苷酸序列中位于所述一个或多个甲基化残基的上游的区互补的核苷酸序列，并且所述第二一级寡核苷酸引物包含与所述靶核苷酸序列中位于所述一个或多个甲基化残基的下游的区相同的核苷酸序列。
5.如权利要求3所述的方法，其还包括：
在所述共混形成聚合酶链式反应混合物之前使所述限制性酶反应混合物在适于将未甲基化的胞嘧啶残基转化为尿嘧啶残基的条件下经历亚硫酸氢盐处理，其中所述提供的一级寡核苷酸引物组的所述第一一级寡核苷酸引物包含与含有一个或多个甲基化未裂解限制性位点的所述亚硫酸氢盐处理的靶核苷酸序列互补的核苷酸序列，并且所述提供的一级寡核苷酸引物组的所述第二一级寡核苷酸引物包含与由所述第一寡核苷酸引物形成的所述延伸产物的一部分互补的核苷酸序列。
6.如权利要求5所述的方法，其还包括：
提供裂解在甲基化敏感性酶识别序列内含有未甲基化残基的核酸分子的一种或多种第二甲基化敏感性酶；以及
将所述至少一种第二甲基化敏感性酶与包含所述亚硫酸氢盐处理的限制性酶反应混合物的所述聚合酶链式反应混合物共混，以形成第二限制性酶反应混合物，其中在所述杂交处理过程中，所述第二甲基化敏感性酶裂解所述样品中潜在存在的在至少一个甲基化敏感性酶识别序列内含有一个或多个未甲基化残基的核酸分子。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述一级寡核苷酸引物组的一种或两种一级寡核苷酸引物具有3’部分，所述3’部分包含可裂解核苷酸或核苷酸类似物和阻断基团，使得所述一种或多种引物的3’端不适于聚合酶延伸，所述方法还包括：
在所述杂交处理过程中裂解一种或两种寡核苷酸引物的所述可裂解核苷酸或核苷酸类似物，从而在所述延伸处理之前释放一种或两种寡核苷酸引物上的游离3’OH端。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述一级寡核苷酸引物组的所述第一一级寡核苷酸引物包含5’部分，所述5’部分具有与亚硫酸氢盐处理的未甲基化靶序列中的与所述一级寡核苷酸引物杂交的核苷酸序列部分相同，但是与亚硫酸氢盐处理的甲基化靶序列中的对应核苷酸序列部分具有一个或多个核苷酸序列错配的核苷酸序列。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述DNA聚合酶缺乏5’核酸酶活性、3’核酸酶活性和链置换活性。
10.如权利要求4所述的方法，其还包括；
提供能够与所述亚硫酸氢盐处理的靶核苷酸序列的含有未甲基化残基的区杂交的一种或多种阻断寡核苷酸；以及
在所述经历之前，使包含所述亚硫酸氢盐处理的限制性酶反应混合物的所述聚合酶链式反应混合物与所述一种或多种阻断寡核苷酸接触，其中所述一种或多种阻断寡核苷酸在所述杂交处理过程中与互补亚硫酸氢盐处理的靶核酸序列杂交并且在所述延伸处理过程中阻止一级寡核苷酸引物延伸。
11.如权利要求1或2所述的方法，其中所述一级寡核苷酸引物组的一种或两种一级寡核苷酸引物具有3’部分，所述3’部分包含可裂解核苷酸或核苷酸类似物和阻断基团，使得所述一种或多种引物的3’端不适于聚合酶延伸，所述方法还包括：
在所述杂交处理过程中裂解一种或两种寡核苷酸引物的所述可裂解核苷酸或核苷酸类似物，从而在所述延伸处理之前释放一种或两种寡核苷酸引物上的游离3’OH端。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述可裂解核苷酸包含一个或多个RNA碱基。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述一级寡核苷酸引物组的所述第一一级寡核苷酸引物包含5’部分，所述5’部分具有与野生型核酸分子中的与所述一级寡核苷酸引物杂交的核苷酸序列部分相同，但是与所述靶核酸分子中的对应核苷酸序列部分具有一个或多个核苷酸序列错配的核苷酸序列。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述一个或多个序列错配位于离所述第一一级寡核苷酸引物的5’端两个核苷酸碱基处，和/或离所述第一一级寡核苷酸引物的5’端三个核苷酸碱基处。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述DNA聚合酶缺乏5’核酸酶活性、3’核酸酶活性和链置换活性。
16.一种用于鉴定样品中的一个或多个靶核糖核酸分子的方法，所述靶核糖核酸分子由于可变剪接、可变转录物、可变起始位点、可变编码序列、可变非编码序列、外显子插入、外显子缺失、内含子插入、易位、突变或基因组水平上的其他重排而在序列上不同于所述样品中的其他核糖核酸分子；所述方法包括：
提供含有一个或多个靶核糖核酸分子的样品，所述一个或多个靶核糖核酸分子在序列上潜在不同于其他核糖核酸分子；
使所述样品与能够消化所述样品中潜在存在的含有dU的核酸分子的一种或多种酶接触；
提供一种或多种寡核苷酸引物，每种引物与所述一个或多个靶核糖核酸分子互补；
将所述所接触的样品、所述一种或多种寡核苷酸引物、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物以及反转录酶共混以形成反转录混合物；
在所述反转录混合物中产生互补脱氧核糖核酸(cDNA)分子，每个cDNA分子包含与所述靶核糖核酸分子序列互补并且含有dU的核苷酸序列；
提供一个或多个寡核苷酸引物组，每个引物组包括(a)第一寡核苷酸引物，其包含与cDNA核苷酸序列中邻近所述cDNA的所述靶核糖核酸分子序列互补序列的部分互补的核苷酸序列，和(b)第二寡核苷酸引物，其包含与由所述第一寡核苷酸引物形成的延伸产物的一部分互补的核苷酸序列；
将含有所述cDNA分子的所述反转录混合物、所述一个或多个寡核苷酸引物组、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物和聚合酶共混以形成聚合酶反应混合物；
使所述聚合酶链式反应混合物经历包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成一种或多种不同的一级延伸产物；
提供一个或多个寡核苷酸探针组，每个探针组包括(a)第一寡核苷酸探针，其具有5’引物特异性部分和3’靶序列特异性部分，和(b)第二寡核苷酸探针，其具有5’靶序列特异性部分和3’引物特异性部分，其中探针组的所述第一寡核苷酸探针和所述第二寡核苷酸探针被构造成以碱基特异性方式杂交于一级延伸产物的对应于所述靶核糖核酸分子序列的互补部分上；
使所述一级延伸产物与连接酶和所述一个或多个寡核苷酸探针组接触以形成连接反应混合物；
使所述连接反应混合物经历一个或多个连接反应循环，由此将所述一个或多个寡核苷酸探针组的所述第一探针和所述第二探针连接在一起以在所述连接酶反应混合物中形成连接产物序列，其中每个连接产物序列包含所述5’引物特异性部分、所述靶特异性部分和所述3’引物特异性部分；
提供一个或多个二级寡核苷酸引物组，每个二级寡核苷酸引物组包括(a)第一二级寡核苷酸引物，其包含与所述连接产物序列的所述5’引物特异性部分相同的核苷酸序列和(b)第二二级寡核苷酸引物，其包含与所述连接产物序列的所述3’引物特异性部分互补的核苷酸序列；
将所述连接产物序列、所述一个或多个二级寡核苷酸引物组与能够消化含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的一种或多种酶、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物以及DNA聚合酶共混以形成第二聚合酶链式反应混合物；
使所述第二聚合酶链式反应混合物经历适于消化所述第二聚合酶链式反应混合物中存在的含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的条件，以及包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成二级延伸产物；以及
对所述样品中的所述二级延伸产物进行检测和区分，从而鉴定由于可变剪接、可变转录物、可变起始位点、可变编码序列、可变非编码序列、外显子插入、外显子缺失、内含子插入、易位、突变或基因组水平上的其他重排而在序列上不同于所述样品中的其他核糖核酸分子的一个或多个核糖核酸分子的存在。
17.一种用于鉴定样品中的一个或多个靶核糖核酸分子的方法，所述一个或多个靶核糖核酸分子由于可变剪接、可变转录物、可变起始位点、可变编码序列、可变非编码序列、外显子插入、外显子缺失、内含子插入、易位、突变或基因组水平上的其他重排而在序列上不同于所述样品中的其他核糖核酸分子；所述方法包括：
提供含有一个或多个靶核糖核酸分子的样品，所述一个或多个靶核糖核酸分子在序列上潜在不同于其他核糖核酸分子；
使所述样品与能够消化所述样品中潜在存在的含有dU的核酸分子的一种或多种酶接触；
提供一种或多种寡核苷酸引物，每种引物与所述一个或多个靶核糖核酸分子互补；
将所述所接触的样品、所述一种或多种寡核苷酸引物、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物以及反转录酶共混以形成反转录混合物；
在所述反转录混合物中产生互补脱氧核糖核酸(cDNA)分子，每个cDNA分子包含与所述靶核糖核酸分子序列互补并且含有dU的核苷酸序列；
提供一个或多个寡核苷酸引物组，每个引物组包括(a)第一寡核苷酸引物，其包含与cDNA核苷酸序列中邻近所述cDNA的所述靶核糖核酸分子序列互补序列的部分互补的核苷酸序列和(b)第二寡核苷酸引物，其包含与由所述第一寡核苷酸引物形成的延伸产物的一部分互补的核苷酸序列；
将含有所述cDNA分子的所述反转录混合物、所述一个或多个寡核苷酸引物组、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物和聚合酶共混以形成聚合酶反应混合物；
使所述聚合酶链式反应混合物经历包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成一种或多种不同的一级延伸产物；
提供一个或多个寡核苷酸探针组，每个探针组包括(a)第一寡核苷酸探针，其具有5’部分和3’靶核苷酸序列特异性部分，和(b)第二寡核苷酸探针，其具有5’靶核苷酸序列特异性部分和3’部分，其中所述探针组的所述第一寡核苷酸探针的所述5’部分与所述第二寡核苷酸探针的所述3’部分的一部分互补，其中所述探针组中的一个探针包含产生可检测信号的部分，并且其中所述探针组的所述第一寡核苷酸探针和所述第二寡核苷酸探针被构造成以碱基特异性方式杂交于一级延伸产物的对应于所述靶核糖核酸分子序列的互补部分上；
使所述一级延伸产物与连接酶和所述一个或多个寡核苷酸探针组接触以形成连接反应混合物；
使所述连接反应混合物经历一个或多个连接反应循环，由此将所述一个或多个寡核苷酸探针组的所述第一探针和所述第二探针连接在一起以在所述连接酶反应混合物中形成连接产物序列，其中每个连接产物序列包含所述5’部分、所述靶特异性部分、所述3’部分和所述产生可检测信号的部分；
使所述连接产物序列的所述5’部分与其互补的3’部分杂交；
检测在所述杂交后产生的来自所述产生可检测信号的部分的信号；以及
基于所述检测对所述样品中的所述连接产物序列进行区分，以鉴定由于可变剪接、可变转录物、可变起始位点、可变编码序列、可变非编码序列、外显子插入、外显子缺失、内含子插入、易位、突变或基因组水平上的其他重排而在序列上不同于所述样品中的其他核糖核酸分子的一个或多个核糖核酸分子的存在。
18.一种用于鉴定样品中的一个或多个靶微核糖核酸(miRNA)分子的方法，所述一个或多个靶微核糖核酸分子因一个或多个碱基而在序列上不同于所述样品中的其他miRNA分子，所述方法包括：
提供含有一个或多个靶miRNA分子的样品，所述一个或多个靶miRNA分子因一个或多个碱基而在序列上潜在不同于所述样品中的其他miRNA分子
使所述样品与能够消化所述样品中潜在存在的含有dU的核酸分子的一种或多种酶接触；
提供一个或多个寡核苷酸引物组，每个引物组包括(a)第一寡核苷酸引物，其具有5’茎-环部分、阻断基团、环区内的内引物特异性部分和与所述靶miRNA分子序列的3’部分互补的3’核苷酸序列部分，(b)第二寡核苷酸引物，其具有与所述靶miRNA分子序列的5’端的互补序列互补的3’核苷酸序列部分，和5’引物特异性部分，(c)第三寡核苷酸引物，其包含与所述第一寡核苷酸引物的所述内引物特异性部分相同的核苷酸序列，以及(d)第四寡核苷酸引物，其包含与所述第二寡核苷酸引物的所述5’引物特异性部分相同的核苷酸序列；
将所述所接触的样品、引物组的所述一个或多个第一寡核苷酸引物、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物和反转录酶共混以形成反转录反应混合物，其中所述第一寡核苷酸引物与所述靶miRNA分子序列(如果样品中存在的话)杂交，并且所述反转录酶使所述杂交的第一寡核苷酸引物的3’端延伸以产生包含所述靶miRNA分子序列的所述互补序列的延伸的第一寡核苷酸引物；
将所述反转录反应混合物与所述引物组的所述第二寡核苷酸引物、所述第三寡核苷酸引物和所述第四寡核苷酸引物在下述条件下共混以形成聚合酶反应混合物，所述条件有效地使引物组的所述一种或多种第二寡核苷酸引物与所述延伸的第一寡核苷酸引物的包含所述靶miRNA分子序列的所述互补序列的区杂交并且进行延伸以产生包含所述5’引物特异性部分、对应于所述靶miRNA分子序列的核苷酸序列和所述内引物特异性部分的所述互补序列的一级延伸产物；
使所述聚合酶链式反应混合物经历包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成多种一级延伸产物；
将所述多种一级延伸产物与连接酶和一个或多个寡核苷酸探针组共混以形成连接反应混合物，其中每个寡核苷酸探针组包括(a)第一寡核苷酸探针，其具有5’引物特异性部分和3’靶序列特异性部分，和(b)第二寡核苷酸探针，其具有5’靶序列特异性部分、与一级延伸产物互补的部分和3’引物特异性部分，其中探针组的所述第一寡核苷酸探针和所述第二寡核苷酸探针被构造成以碱基特异性方式杂交于一级延伸产物的对应于所述靶miRNA分子序列的互补部分上；
使所述连接反应混合物经历一个或多个连接反应循环，由此将所述一个或多个寡核苷酸探针组的所述第一寡核苷酸探针和所述第二寡核苷酸探针连接在一起以在所述连接反应混合物中形成连接产物序列，其中每个连接产物序列包含所述5’引物特异性部分、所述靶特异性部分和所述3’引物特异性部分；
提供一个或多个二级寡核苷酸引物组，每个二级寡核苷酸引物组包括(a)第一二级寡核苷酸引物，其包含与所述连接产物序列的所述5’引物特异性部分相同的核苷酸序列和(b)第二二级寡核苷酸引物，其包含与所述连接产物序列的所述3’引物特异性部分互补的核苷酸序列；
将所述连接产物序列、所述一个或多个二级寡核苷酸引物组与能够消化含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的一种或多种酶、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物以及DNA聚合酶共混以形成第二聚合酶链式反应混合物；
使所述第二聚合酶链式反应混合物经历适于消化所述第二聚合酶链式反应混合物中存在的含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的条件，以及包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成二级延伸产物；以及
对所述样品中的所述二级延伸产物进行检测和区分，从而鉴定因一个或多个碱基而在序列上不同于所述样品中的其他miRNA分子的一个或多个靶miRNA分子。
19.一种用于鉴定样品中的一个或多个靶微核糖核酸(miRNA)分子的方法，所述一个或多个靶微核糖核酸分子因一个或多个碱基而在序列上不同于所述样品中的其他miRNA分子，所述方法包括：
提供含有一个或多个靶miRNA分子的样品，所述一个或多个靶miRNA分子因一个或多个碱基而在序列上潜在不同于所述样品中的其他miRNA分子
使所述样品与能够消化所述样品中潜在存在的含有dU的核酸分子的一种或多种酶接触；
提供一个或多个寡核苷酸引物组，每个引物组包括(a)第一寡核苷酸引物，其具有5’茎-环部分、阻断基团、环区内的内引物特异性部分和与所述靶miRNA分子序列的3’部分互补的3’核苷酸序列部分，(b)第二寡核苷酸引物，其具有与所述靶miRNA分子序列的5’端的互补序列互补的3’核苷酸序列部分，和5’引物特异性部分，(c)第三寡核苷酸引物，其包含与所述第一寡核苷酸引物的所述内引物特异性部分相同的核苷酸序列，以及(d)第四寡核苷酸引物，其包含与所述第二寡核苷酸引物的所述5’引物特异性部分相同的核苷酸序列；
将所述所接触的样品、引物组的所述一个或多个第一寡核苷酸引物、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物和反转录酶共混以形成反转录反应混合物，其中所述第一寡核苷酸引物与所述靶miRNA分子序列(如果样品中存在的话)杂交，并且所述反转录酶使所述杂交的第一寡核苷酸引物的3’端延伸以产生包含所述靶miRNA分子序列的所述互补序列的延伸的第一寡核苷酸引物；
将所述反转录反应混合物与所述引物组的所述第二寡核苷酸引物、所述第三寡核苷酸引物和所述第四寡核苷酸引物在下述条件下共混以形成聚合酶反应混合物，所述条件有效地使引物组的所述一种或多种第二寡核苷酸引物与所述延伸的第一寡核苷酸引物的包含所述靶miRNA分子序列的所述互补序列的区杂交并且进行延伸以产生包含所述5’引物特异性部分、对应于所述靶miRNA分子序列的核苷酸序列和所述内引物特异性部分的所述互补序列的一级延伸产物；
使所述聚合酶链式反应混合物经历包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成多种一级延伸产物；
将所述多种一级延伸产物与连接酶和一个或多个寡核苷酸探针组共混以形成连接反应混合物，其中每个寡核苷酸探针组包括(a)第一寡核苷酸探针，其具有5’部分和3’靶核苷酸序列特异性部分，和(b)第二寡核苷酸探针，其具有5’靶核苷酸序列特异性部分和3’部分，其中所述探针组的所述第一寡核苷酸探针的所述5’部分与所述第二寡核苷酸探针的所述3’部分的一部分互补，其中所述探针组中的一个探针包含产生可检测信号的部分，并且其中探针组的所述第一寡核苷酸探针和所述第二寡核苷酸探针被构造成以碱基特异性方式杂交于一级延伸产物的对应于所述靶miRNA分子序列的互补部分上；
使所述连接反应混合物经历一个或多个连接反应循环，由此将所述一个或多个寡核苷酸探针组的所述第一寡核苷酸探针和所述第二寡核苷酸探针连接在一起以在所述连接反应混合物中形成连接产物序列，其中每个连接产物序列包含所述5’部分、所述靶特异性部分、所述3’部分和所述产生可检测信号的部分；
使所述连接产物序列的所述5’部分与其互补的3’部分杂交；
检测在所述杂交后产生的来自所述产生可检测信号的部分的信号；以及
基于所述检测区分所述样品中的连接产物序列以鉴定因一个或多个碱基而在序列上不同于所述样品中的其他miRNA分子的一个或多个靶miRNA分子的存在。
20.一种用于鉴定样品中的一个或多个靶微核糖核酸(miRNA)分子的方法，所述一个或多个靶微核糖核酸分子因一个或多个碱基而在序列上不同于所述样品中的其他miRNA分子，所述方法包括：
提供含有一个或多个miRNA分子的样品，所述一个或多个miRNA分子因一个或多个碱基差异而在序列上潜在不同于其他miRNA分子；
使所述样品与能够消化所述样品中潜在存在的含有dU的核酸分子的一种或多种酶接触
将所述所接触的样品与连接酶和包含5’磷酸、5’茎-环部分、环区内的内引物特异性部分、阻断基团和与所述靶miRNA分子序列的3’部分互补的3’核苷酸序列的第一寡核苷酸探针共混以形成连接反应；
将所述靶miRNA分子序列在其3’端处连接至所述第一寡核苷酸探针的所述5’磷酸，以产生包含附加至所述第一寡核苷酸探针的所述靶miRNA分子序列(如果样品中存在的话)的嵌合核酸分子；
提供一个或多个寡核苷酸引物组，每个引物组包括(a)第一寡核苷酸引物，其包含与所述靶miRNA分子序列的5’端的互补序列互补的3’核苷酸序列，和5’引物特异性部分，(b)第二寡核苷酸引物，其包含与所述第一寡核苷酸探针的所述内引物特异性部分互补的核苷酸序列，以及(c)第三寡核苷酸引物，其包含与所述第一寡核苷酸引物的所述5’引物特异性部分相同的核苷酸序列；
将所述嵌合核酸分子、所述一种或多种第二寡核苷酸引物、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物和反转录酶共混以形成反转录反应混合物，其中引物组的所述一种或多种第二寡核苷酸引物与所述嵌合核酸分子的所述内引物特异性部分杂交，并且在其3’端处进行延伸，以产生所述嵌合核酸分子(如果样品中存在的话)的互补序列；
将所述反转录反应混合物与引物组的所述第一寡核苷酸引物和所述第三寡核苷酸引物共混以形成聚合酶反应混合物；
使所述聚合酶链式反应混合物经历包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成包含所述5’引物特异性部分、对应于所述靶miRNA分子序列的核苷酸序列和所述内引物特异性部分的所述互补序列的一级延伸产物。
将所述一级延伸产物与连接酶和一个或多个寡核苷酸探针组共混以形成连接反应混合物，其中每个寡核苷酸探针组包括(a)第一寡核苷酸探针，其具有5’引物特异性部分和3’靶序列特异性部分，和(b)第二寡核苷酸探针，其具有5’靶序列特异性部分、与一级延伸产物互补的部分和3’引物特异性部分，其中探针组的所述第一寡核苷酸探针和所述第二寡核苷酸探针被构造成以碱基特异性方式杂交于一级延伸产物的对应于所述靶miRNA分子序列的互补部分上；
使所述连接反应混合物经历一个或多个连接反应循环，由此将所述一个或多个寡核苷酸探针组的所述第一寡核苷酸探针和所述第二寡核苷酸探针连接在一起以在所述连接反应混合物中形成连接产物序列，其中每个连接产物序列包含所述5’引物特异性部分、所述靶特异性部分和所述3’引物特异性部分；
提供一个或多个二级寡核苷酸引物组，每个二级寡核苷酸引物组包括(a)第一二级寡核苷酸引物，其包含与所述连接产物序列的所述5’引物特异性部分相同的核苷酸序列和(b)第二二级寡核苷酸引物，其包含与所述连接产物序列的所述3’引物特异性部分互补的核苷酸序列；
将所述连接产物序列和所述一个或多个二级寡核苷酸引物组与能够消化含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的一种或多种酶、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物以及DNA聚合酶共混以形成第二聚合酶链式反应混合物；
使所述第二聚合酶链式反应混合物经历适于消化所述第二聚合酶链式反应混合物中存在的含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的条件，以及包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成二级延伸产物；以及
对所述样品中的所述二级延伸产物进行检测和区分，从而鉴定因一个或多个碱基而在序列上不同于所述样品中的其他miRNA分子的一个或多个靶miRNA分子。
21.一种用于鉴定样品中的一个或多个靶微核糖核酸(miRNA)分子的方法，所述一个或多个靶微核糖核酸分子因一个或多个碱基而在序列上不同于所述样品中的其他miRNA分子，所述方法包括：
提供含有一个或多个miRNA分子的样品，所述一个或多个miRNA分子因一个或多个碱基差异而在序列上潜在不同于其他miRNA分子；
使所述样品与能够消化所述样品中潜在存在的含有dU的核酸分子的一种或多种酶接触
将所述所接触的样品与连接酶和包含5’磷酸、5’茎-环部分、环区内的内引物特异性部分、阻断基团和与所述靶miRNA分子序列的3’部分互补的3’核苷酸序列的第一寡核苷酸探针共混以形成连接反应；
将所述靶miRNA分子序列在其3’端处连接至所述第一寡核苷酸探针的所述5’磷酸，以产生包含附加至所述第一寡核苷酸探针的所述靶miRNA分子序列(如果样品中存在的话)的嵌合核酸分子；
提供一个或多个寡核苷酸引物组，每个引物组包括(a)第一寡核苷酸引物，其包含与所述靶miRNA分子序列的5’端的互补序列互补的3’核苷酸序列，和5’引物特异性部分，(b)第二寡核苷酸引物，其包含与所述第一寡核苷酸探针的所述内引物特异性部分互补的核苷酸序列，以及(c)第三寡核苷酸引物，其包含与所述第一寡核苷酸引物的所述5’引物特异性部分相同的核苷酸序列；
将所述嵌合核酸分子、所述一种或多种第二寡核苷酸引物、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物和反转录酶共混以形成反转录反应混合物，其中引物组的所述一种或多种第二寡核苷酸引物与所述嵌合核酸分子的所述内引物特异性部分杂交，并且在其3’端处进行延伸，以产生所述嵌合核酸分子(如果样品中存在的话)的互补序列；
将所述反转录反应混合物与引物组的所述第一寡核苷酸引物和所述第三寡核苷酸引物共混以形成聚合酶反应混合物；
使所述聚合酶链式反应混合物经历包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成包含所述5’引物特异性部分、对应于所述靶miRNA分子序列的核苷酸序列和所述内引物特异性部分的所述互补序列的一级延伸产物；
将所述一级延伸产物与连接酶和一个或多个寡核苷酸探针组共混以形成连接反应混合物，其中每个寡核苷酸探针组包括(a)第一寡核苷酸探针，其具有5’部分和3’靶核苷酸序列特异性部分，和(b)第二寡核苷酸探针，其具有5’靶核苷酸序列特异性部分和3’部分，其中所述探针组的所述第一寡核苷酸探针的所述5’部分与所述第二寡核苷酸探针的所述3’部分的一部分互补，其中所述探针组中的一个探针包含产生可检测信号的部分，并且其中探针组的所述第一寡核苷酸探针和所述第二寡核苷酸探针被构造成以碱基特异性方式杂交于一级延伸产物的对应于所述靶miRNA分子序列的互补部分上；
使所述连接反应混合物经历一个或多个连接反应循环，由此将所述一个或多个寡核苷酸探针组的所述第一寡核苷酸探针和所述第二寡核苷酸探针连接在一起以在所述连接反应混合物中形成连接产物序列，其中每个连接产物序列包含所述5’部分、所述靶特异性部分、所述3’部分和所述产生可检测信号的部分；
使所述连接产物序列的所述5’部分与其互补的3’部分杂交；
检测在所述杂交后产生的来自所述产生可检测信号的部分的信号；以及
基于所述检测区分所述样品中的连接产物序列以鉴定因一个或多个碱基而在序列上不同于所述样品中的其他miRNA分子的一个或多个靶miRNA分子的存在。
22.如权利要求1、16、18或20中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸探针组的所述第二寡核苷酸探针还包含unitaq检测部分，从而形成包含所述5’引物特异性部分、所述靶特异性部分、所述unitaq检测部分和所述3’引物特异性部分的连接产物序列，所述方法还包括：
提供一种或多种unitaq检测探针，其中每个unitaq检测探针与互补的unitaq检测部分杂交并且所述检测探针包含彼此分开的淬灭剂分子和可检测标记；
将所述一种或多种unitaq检测探针添加至所述第二聚合酶链式反应混合物；以及在所述使所述第二聚合酶链式反应混合物经历适于一个或多个聚合酶链式反应循环的条件的过程中，使所述一个或多个unitaq检测探针与所述连接产物序列或其互补序列上的互补unitaq检测部分杂交，由此所述淬灭剂分子和所述可检测标记在所述延伸处理的过程中从所述一种或多种unitaq检测探针裂解，由此所述检测包括对所述裂解的可检测标记的检测。
23.如权利要求1、16、18或20中任一项所述的方法，所述方法还包括：
提供一种或多种寡核苷酸检测探针，其中每个寡核苷酸检测探针与连接产物接点部分或其互补序列杂交，并且所述检测探针包含彼此分开的淬灭剂分子和可检测标记；
将所述一种或多种寡核苷酸检测探针添加至所述第二聚合酶链式反应混合物；以及在所述使所述第二聚合酶链式反应混合物经历适于一个或多个聚合酶链式反应循环的条件的过程中，使所述一种或多种寡核苷酸检测探针与所述连接产物序列或其互补序列上的互补检测部分杂交，由此所述淬灭剂分子和所述可检测标记在所述延伸处理的过程中从所述一种或多种寡核苷酸检测探针裂解，由此所述检测包括对所述裂解的可检测标记的检测。
24.如权利要求2、17、19或21中任一项所述的方法，所述方法还包括：
在所述连接之前或之后将每种一级延伸产物的至少一个链固定在固体支持物上，其中所述连接产物序列与所述固定的一级延伸产物杂交；以及
在所述连接之后将未连接的寡核苷酸探针和非靶特异性连接产物从所述样品中去除；
以及
在所述杂交之前，使所述连接产物序列从所述固定的一级延伸产物中变性。
25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸探针组的所述第一寡核苷酸探针的所述3’部分包含可裂解的核苷酸或核苷酸类似物和阻断基团，使得所述3’端不适于聚合酶延伸或连接，所述方法还包括；
当所述探针与其所述一级延伸产物的互补靶核苷酸序列杂交时使所述第一寡核苷酸探针的所述可裂解的核苷酸或核苷酸类似物裂解，从而在所述连接之前释放所述第一寡核苷酸探针上的3’OH。
26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述第二寡核苷酸探针在其5’端具有与所述第一寡核苷酸探针的3’端重叠的相同核苷酸，并且在探针组的所述第一寡核苷酸探针和所述第二寡核苷酸探针在相邻位置处杂交于一级延伸产物的互补靶核苷酸序列上形成接点时，所述第二寡核苷酸探针的所述重叠相同核苷酸在与所述第一寡核苷酸探针的所述接点处形成侧翼，所述方法还包括：
用具有5’核酸酶活性的酶裂解所述第二寡核苷酸探针的所述重叠相同核苷酸，从而在所述连接之前释放所述第二寡核苷酸探针的5’端处的磷酸。
27.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述一个或多个寡核苷酸探针组还包括具有靶特异性部分的第三寡核苷酸探针，其中所述探针组的所述第二寡核苷酸探针和所述第三寡核苷酸探针被构造成彼此相邻地杂交于所述靶核苷酸序列，在所述第二寡核苷酸探针与所述第三寡核苷酸探针之间具有接点，从而允许所述第二寡核苷酸探针与所述第三寡核苷酸探针之间连接形成包含探针组的所述第一寡核苷酸探针、所述第二寡核苷酸探针和所述第三寡核苷酸探针的连接产物序列。
28.一种用于鉴定样品中的含有靶核苷酸序列的一个或多个核酸分子的方法，所述靶核苷酸序列因一个或多个甲基化残基而不同于所述样品或其他样品中的其他核酸分子中的核苷酸序列，所述方法包括：
提供含有一个或多个核酸分子的样品，所述一个或多个核酸分子潜在包含因一个或多个甲基化残基而不同于其他核酸分子中的所述核苷酸序列的所述靶核苷酸序列；
使所述样品与能够消化所述样品中存在的含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的一种或多种酶接触；
使所述样品与一种或多种甲基化敏感性酶接触以形成限制性酶反应混合物，其中所述一种或多种所述甲基化敏感性酶裂解所述样品中的在至少一种甲基化敏感性酶识别序列内含有一个或多个未甲基化残基的核酸分子；
提供一个或多个一级寡核苷酸引物组，每个一级寡核苷酸引物组包括(a)第一一级寡核苷酸引物，其包含与所述靶核苷酸序列中位于所述一个或多个甲基化残基的上游的区互补的核苷酸序列和(b)第二一级寡核苷酸引物，其包含与所述靶核苷酸序列中位于所述一个或多个甲基化残基的下游的区相同的核苷酸序列；
将所述限制性酶反应混合物与所述一个或多个一级寡核苷酸引物组、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物以及DNA聚合酶共混以形成一级聚合酶链式反应混合物；
使所述一级聚合酶链式反应混合物经历包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成包含所述靶核苷酸序列或其互补序列的一级延伸产物；
提供一个或多个二级寡核苷酸引物组，每个二级寡核苷酸引物组包括能够与所述一级延伸产物杂交的第一嵌套式寡核苷酸引物和第二嵌套式寡核苷酸引物；
将所述一级延伸产物、所述一个或多个二级寡核苷酸引物组、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物以及DNA聚合酶共混以形成二级聚合酶链式反应混合物；
使所述第二聚合酶链式反应混合物经历包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成二级延伸产物；以及
对所述样品中的所述二级延伸产物进行检测和区分以鉴定含有因一个或多个甲基化残基而不同于所述样品中的其他核酸分子中的核苷酸序列的靶核苷酸序列的一个或多个核酸分子的存在。
29.如权利要求28所述的方法，所述方法还包括：
提供一种或多种寡核苷酸检测探针，其中每个寡核苷酸检测探针与所述一级延伸产物中的靶核苷酸序列或其互补序列杂交，并且所述检测探针包含彼此分开的淬灭剂分子和可检测标记；
将所述一种或多种寡核苷酸检测探针添加至所述第二聚合酶链式反应混合物；以及在所述经历中，使所述一种或多种寡核苷酸检测探针与所述一级延伸产物的互补部分杂交，由此所述淬灭剂分子和所述可检测标记在所述二级聚合酶链式反应混合物的所述一个或多个聚合酶链式反应循环的所述延伸处理过程中从所述一种或多种寡核苷酸检测探针裂解，由此所述检测包括对所述裂解的可检测标记的检测。
30.如权利要求28所述的方法，其中所述一级寡核苷酸引物组的一种或两种一级寡核苷酸引物具有3’部分，所述3’部分包含可裂解核苷酸或核苷酸类似物和阻断基团，使得所述一种或多种引物的3’端不适于聚合酶延伸，所述方法还包括：
在所述一级聚合酶链式反应混合物的所述一个或多个聚合酶链式反应循环的所述杂交处理过程中裂解一种或两种一级寡核苷酸引物的所述可裂解核苷酸或核苷酸类似物，从而在所述延伸处理之前释放一种或两种一级寡核苷酸引物上的游离3’OH端。
31.如权利要求28所述的方法，其中所述一级寡核苷酸引物组的所述一级寡核苷酸引物包含相同的或基本相同的5’核苷酸序列部分，所述5’核苷酸序列部分的长度介于约6至
20个碱基之间。
32.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述样品选自由以下项组成的组：组织、细胞、血清、血液、血浆、羊水、痰、尿液、体液、身体分泌物、身体排泄物、无细胞循环核酸、无细胞循环肿瘤核酸、妊娠女性的无细胞循环胎儿核酸、循环肿瘤细胞、肿瘤、肿瘤活检和外来体。
33.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述一种或多种靶核苷酸序列是包含以下项的低丰度核酸分子：一个或多个核苷酸碱基突变、插入、缺失、易位、剪接变体、miRNA变体、可变转录物、可变起始位点、可变编码序列、可变非编码序列、可变剪接、外显子插入、外显子缺失、内含子插入、或基因组水平上的其他重排和/或甲基化核苷酸碱基。
34.如权利要求33所述的方法，其中具有一个或多个核苷酸碱基突变、插入、缺失、易位、剪接变体、miRNA变体、可变转录物、可变起始位点、可变编码序列、可变非编码序列、可变剪接、外显子插入、外显子缺失、内含子插入、或基因组水平上的其他重排和/或甲基化核苷酸碱基的所述低丰度核酸分子被鉴定并与所述样品中的具有与所述低丰度核酸分子类似的核苷酸序列，但没有所述一个或多个核苷酸碱基突变、插入、缺失、易位、剪接变体、miRNA变体、可变转录物、可变起始位点、可变编码序列、可变非编码序列、可变剪接、外显子插入、外显子缺失、内含子插入、或基因组水平上的其他重排和/或甲基化核苷酸碱基的高丰度核酸分子区分开。
35.如权利要求34所述的方法，其中相对于所述样品中的所述高丰度核酸分子的拷贝数来定量一种或多种低丰度靶核苷酸序列的拷贝数。
36.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中对所述一种或多种靶核苷酸序列进行定量或计数。
37.如权利要求36所述的方法，其中相对于所述样品或经历相同后续步骤的其他样品中的其他核苷酸序列来定量或计数所述一种或多种靶核苷酸序列。
38.如权利要求37所述的方法，其中对一种或多种靶核苷酸序列的所述相对拷贝数进行定量或计数。
39.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其还包括：
基于所述鉴定诊断或预后疾病状态。
40.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其还包括：
基于所述鉴定区分基因型或疾病易感性。
41.一种与微量滴定板组合使用以向所述微量滴定板的行和/或列中的两个或更多个孔同时添加液体的装置，所述微量滴定板具有相对的顶部表面和底部表面，其中所述顶部表面具有通向所述孔的开口并且所述底部表面限定了所述孔的闭合端，所述装置包括：
第一层，所述第一层由第一边界和第二边界限定，其中计量室在所述第一层的所述第一边界与所述第二边界之间延伸并且彼此流体连通，所述第一层被构造成在操作位置中装配成接近所述微量滴定板，其中所述第一层的所述第一边界最靠近所述微量滴定板的所述顶部表面并且每个所述计量室与所述微量滴定板的行和/或列中的单个孔流体连通，所述第一层还包括与一个或多个所述计量室流体连通的填充室，以及
第二层，所述第二层由第一边界和第二边界限定，其中填充口在所述第二层的所述第一边界与所述第二边界之间延伸，所述第二层被构造成在操作位置中装配成接近所述第一层，其中所述第二层的所述第一边界最靠近所述第一层的所述第二边界并且所述填充口与所述填充室对准，其中，当所述第一层、所述第二层和所述微量滴定板相对于彼此被定位在其操作位置时，通过所述填充口进入所述装置的液体将穿过所述填充室、所述计量室并且进入所述微量滴定板的行和/或列中的两个或更多个孔中。
42.如权利要求41所述的装置，其中所述第二层包括在所述第二层的所述第一边界与所述第二边界之间延伸的空气通路，其中所述空气通路与所述计量室对准。
43.如权利要求41所述的装置，其还包括：
中间层，所述中间层由第一边界和第二边界限定，其中中间层通路在所述中间层的所述第一边界与所述第二边界之间延伸，所述中间层被构造成在操作位置中装配在所述微量滴定板与所述第一层之间，其中所述中间层的所述第一边界与所述微量滴定板的所述顶部表面相邻并且所述中间层的所述第二边界与所述第一层的所述第一边界相邻，并且一个所述中间层通路与所述微量滴定板的行和/或列中的单个孔对准，其中，当所述第一层、所述第二层、所述中间层和所述微量滴定板相对于彼此被定位在其操作位置时，通过所述填充口进入所述装置的液体将穿过所述填充室、所述计量室、所述中间层通路，并且进入所述微量滴定板的所述孔中。
44.如权利要求43所述的装置，其中所述中间层通路包括疏水性壁。
45.如权利要求43所述的装置，其中所述中间层通路是爆破阀。
46.如权利要求41所述的装置，其中所述第一层还包括与所述填充室流体连通的溢流室。
47.如权利要求46所述的装置，其中所述中间层还包括使所述溢流室与所述填充室连接的溢流通路。
48.如权利要求46所述的装置，其中所述第二层具有在所述第二层的所述第一边界与所述第二边界之间延伸的溢流空气通路，其中所述溢流空气通路与所述溢流室对准。
49.如权利要求43所述的装置，其还包括：
第三层，所述第三层具有第一边界和第二边界，其中填充口连接器在所述第三层的所述第一边界与所述第二边界之间延伸，所述第三层被构造成在操作位置中装配在所述第一层与所述第二层之间，其中所述第三层的所述第一边界与所述第一层的所述第二边界相邻并且所述填充口连接器与所述填充口对准，其中，当所述第一层、所述第二层、所述第三层、所述中间层和所述微量滴定板相对于彼此被定位在其操作位置时，通过所述填充口进入所述装置的液体将穿过所述填充口连接器、所述填充室、所述计量室、所述中间层通路，并且进入所述微量滴定板的所述孔中。
50.如权利要求41所述的装置，其中所述装置被构造成允许通过毛细管作用填充所述计量室。
51.如权利要求41所述的装置，其中所述装置被构造成允许通过机械力填充所述计量室。
52.如权利要求41所述的装置，其中所述第一层在所述计量室的相对末端上设置有一对间隔开的填充室并且所述第二层设置有一对间隔开的填充口，每个所述填充口与所述一对间隔开的填充室中的一个所述填充室流体连通，由此所述一对间隔开的填充口中的一个所述填充口向所述一对间隔开的填充室中的一个所述填充室和半个所述计量室提供液体，而所述一对间隔开的填充口中的另一个所述填充口向所述一对填充室中的另一个所述填充室和另一半所述计量室提供液体。
53.如权利要求41所述的装置，其中所述第一层在所述计量室的相对末端上设置有一对间隔开的填充室并且所述第二层设置有一对间隔开的填充口，每个所述填充口与所述一对间隔开的填充室中的一个所述填充室流体连通，由此所述一对间隔开的填充口中的一个所述填充口向所述一对填充室中的一个所述填充室和全部的所述计量室提供液体，而所述一对间隔开的填充口中的另一个所述填充口向所述一对填充室中的另一个所述填充室和全部的所述计量室提供液体。
54.如权利要求41所述的装置，其中所述装置被构造成用液体填充所述微量滴定板的两个或更多个行和列。
55.如权利要求41所述的装置，其中所述第一层具有第一区域和第二区域，所述第一区域具有在两个或更多个行中的所述计量室，所述第二区域具有在两个或更多个列中的所述计量室，其中所述第一区域和所述第二区域彼此移位。
56.如权利要求41-55中任一项所述的装置，其中所述层是集成的，从而赋予所述装置单片结构。
57.一种向微量滴定板的行和/或列中的两个或更多个孔添加液体的方法，所述微量滴定板具有相对的顶部表面和底部表面，其中所述顶部表面具有通向所述孔的开口并且所述底部表面限定了所述孔的闭合端，所述方法包括：
提供装置，其包括：
第一层，所述第一层具有第一边界和第二边界，其中计量室在所述第一层的所述第一边界与所述第二边界之间延伸并且彼此流体连通，所述第一层被构造成在操作位置中装配成接近所述微量滴定板，其中所述第一层的所述第一边界最靠近所述微量滴定板的所述顶部表面并且一个所述计量室与所述微量滴定板的行和/或列中的单个孔流体连通，所述第一层还包括与一个或多个所述计量室流体连通的填充室，以及
第二层，所述第二层具有第一边界和第二边界，其中填充口在所述第二层的所述第一边界与所述第二边界之间延伸，所述第二层被构造成在操作位置中装配成接近所述第一层，其中所述第二层的所述第一边界最靠近所述第一层的所述第二边界并且所述填充口与所述填充室对准，其中，当所述第一层、所述第二层和所述微量滴定板相对于彼此被定位在其操作位置时，通过所述填充口进入所述装置的液体将穿过所述填充室、所述计量室并且进入所述微量滴定板的行和/或列中的两个或更多个孔中；
用液体填充所述装置；以及
将所述装置中的液体排放到所述微量滴定板的行和/或列中的两个或更多个孔中。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述装置还包括：
中间层，所述中间层具有第一边界和第二边界，其中中间层通路在所述中间层的所述第一边界与所述第二边界之间延伸，所述中间层被构造成在操作位置中装配在所述微量滴定板与所述第一层之间，其中所述中间层的所述第一边界与所述微量滴定板的所述顶部表面相邻并且所述中间层的所述第二边界与所述第一层的所述第一边界相邻，并且一个所述中间层通路与所述微量滴定板的行和/或列中的单个孔对准，其中，当所述第一层、所述第二层、所述中间层和所述微量滴定板相对于彼此被定位在其操作位置时，通过所述填充口进入所述装置的液体将穿过所述填充室、所述计量室、所述中间层通路，并且进入所述微量滴定板的所述孔中。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述中间层通路包括疏水性壁。
60.如权利要求58所述的方法，其中所述中间层通路是爆破阀。
61.如权利要求58所述的方法，其中所述装置还包括：
第三层，所述第三层具有第一边界和第二边界，其中填充口连接器在所述第三层的所述第一边界与所述第二边界之间延伸，所述第三层被构造成在操作位置中装配在所述第一层与所述第二层之间，其中所述第三层的所述第一边界与所述第二层的所述第二边界相邻并且所述填充口连接器与所述填充口对准，其中，当所述第一层、所述第二层、所述第三层、所述中间层和所述微量滴定板相对于彼此被定位在其操作位置时，通过所述填充口进入所述装置的液体将穿过所述填充口连接器、所述填充室、所述计量室、所述中间层通路，并且进入所述微量滴定板的所述孔中。
62.如权利要求57所述的方法，其中所述填充通过毛细管作用进行。
63.如权利要求57所述的方法，其中所述排放通过机械力进行。
64.如权利要求57所述的方法，其中所述第一层在所述计量室的相对侧设置有一对间隔开的填充室并且所述第二层设置有一对间隔开的填充口，每个所述填充口与所述一对间隔开的填充室中的一个所述填充室流体连通，由此，在所述填充过程中，所述一对间隔开的填充口中的一个所述填充口向所述一对间隔开的填充室中的一个所述填充室和半个所述计量室提供液体，而所述一对间隔开的填充口中的另一个所述填充口向所述一对间隔开的填充室中的另一个所述填充室和另一半所述计量室提供液体。
65.如权利要求57所述的方法，其中所述第一层在所述计量室的相对侧设置有一对间隔开的填充室并且所述第二层设置有一对间隔开的填充口，每个所述填充口与所述一对间隔开的填充室中的一个所述填充室流体连通，由此，在所述填充过程中，所述一对间隔开的填充口中的一个所述填充口向所述一对间隔开的填充室中的一个所述填充室和全部的所述计量室提供液体，而所述一对间隔开的填充口中的另一个所述填充口向所述一对间隔开的填充室中的另一个所述填充室和全部的所述计量室提供液体。
66.如权利要求57所述的方法，其中所述装置被构造成在所述填充过程中用液体填充所述微量滴定板的两个或更多个行和列。
67.如权利要求57所述的方法，其中所述第一层具有第一区域和第二区域，所述第一区域具有在两个或更多个行中的所述计量室，所述第二区域具有在两个或更多个列中的所述计量室，其中所述第一区域和所述第二区域彼此移位。
68.如权利要求57-67中任一项所述的方法，其中所述层是集成的，从而赋予所述装置单片结构。