已经开发了各种技术来检测在检验中一种或多种分析物的存 在。例如，荧光、发光、化学发光或电化学发光技术已经用于检测 生物样品内的分析物。在许多生物检验中，包括其中微米或纳米颗 粒用于检测生物样品中一种或多种分析物的存在和/或量的检验，信 号传导事件的产生用于检测分析物的存在。然而此类本领域已知的 生物检验具有限制。因此，提供具有一种或多种增强特性，包括但 不限于，增强的敏感性、特异性、精确性、再现性及其组合的检验 可能是有利的。
发明内容
在某些实施方式中，目前描述的主题提供液基检验，包括其上 连接有对一种或多种目的分析物具有亲和力的结合成员(binding member)的磁性捕获颗粒(magnetic capture particle)，和其上也 连接有对一种或多种目的分析物具有亲和力的结合成员的SERS-活 性纳米颗粒。当与包含一种或多种分析物的生物样品接触时，形成磁 性捕获颗粒-分析物-SERS-活性纳米颗粒复合物。磁性捕获颗粒的磁性 质可以用于在用于检测SERS信号的检验容器内的预定区域中定位磁性 捕获颗粒-分析物-SERS-活性纳米颗粒复合物。
在其它实施方式中，目前描述的主题提供引入参考标记的磁性捕 获/液基检验。在此类实施方式中，除了对目的分析物特异的结合成员 之外，用于磁性沉降(magnetic pull-down)的磁性颗粒被能够产生可 检测信号的参考标记标记。由磁性捕获颗粒-分析物-SERS-活性纳米颗 粒复合物的SERS-活性纳米颗粒发射的信号可以参考与磁性捕获颗粒 连接的参考标记的信号以补偿球团大小(pellet size)、形状或定位的 变化。
在进一步的实施方式中，裂解试剂(lysis reagent)可用于检验， 例如使用或不使用磁性沉降的液基检验。裂解试剂的使用对于例如在 生物样品(biological matrices)(例如人类血液、血浆或血清)中，或 在细胞中的目的分析物，可以提供增加的信号和/或提高的检测限。
在还另一实施方式中，提供用于在液基检验中放大信号的方法。 此类方法包括在将磁性捕获复合物定位之前，添加与在检验溶液中已 经存在的报道分子(例如SERS-活性纳米颗粒)具有相同信号-产生能力 的第二等分试样报道分子。该第二等分试样报道分子其上连接有对在 检验溶液中存在的报道分子的结合成员具有亲和力的一种或多种结合 成员。因此第二报道分子能够结合第一报道分子，导致更高的信号每 磁性捕获颗粒-分析物-报道分子复合物。
在其它实施方式中，提供用于在磁性捕获/液基检验中改进拉曼 参考光谱和光谱分析的方法。在一种实施方式中，与使用在溶液中获 得的分析物的参考光谱相反，一种或多种目的分析物的参考光谱用设 置在磁化球团(magnetized pellet)中的分析物获得。在另一实施方式 中，提供用于改进SERS光谱分析的方法，包括选择进行分析内的波长 区域和基于来自最初分析的结果，选择光谱拟合方法(例如最小二乘法 拟合技术)的分量(components)。
在某些实施方式中，目前描述的主题提供复合纳米结构体 (composite nanostructures)，包括本文称为″卫星″结构的复合结构， 其包括与核颗粒结合的多个信号承载颗粒，例如纳米颗粒。在其它实 施方式中，提供本文称为″核-壳″结构的复合结构，其包括核颗粒， 围绕核颗粒的活性材料，例如拉曼-活性材料，以及围绕活性材料的一 个或多个壳，例如金属壳。目前描述的卫星和核-壳结构可用于放大或 增强检验例如SERS检验中的信号。
在某些实施方式中，提供设计成形成具有一致大小、形状和密度 的磁性颗粒球团(magnetic particle pellet)的样品管，其中样品管 具有物理地将磁性颗粒球团限制成所需大小的尺寸。样品管可以包括 允许检测从磁性颗粒球团产生的光信号的光学窗。提供用于形成磁性 颗粒球团的系统，其使用与样品管相邻并且在其下定位的磁体。该系 统可用于磁性捕获检验。目前描述的主题还涉及在样品管中可靠地形 成更小、更致密的磁性颗粒球团的方法。
本文还提供适于实施目前描述的检验的代表性的系统和仪器。
目前描述的主题的特定方面已经在上文描述，其由目前公开的主 题全部或部分地提出，当与下文作为最佳描述的附带的实施例和附图 联系时，随着说明书的继续描述，其它目的将变得明显。

这样已经从总体上描述了目前描述的主题，现在将参考附图， 其不必是按比例的图，并且其中：
图1为代表性的目前描述的磁性捕获检验的示意性视图；
图2为描述使用参考标记，例如SERS-活性纳米颗粒作为在磁性 捕获颗粒上的参考的示意性视图；
图3为无参考信号和参考信号的比较的图形表示。无参考信号(B) 为反式-1，2-双(4-吡啶基)乙烯 (BPE)(trans-1，2-bis(4-pyrridyl)ethylene)(BPE)拉曼报道子在 1590cm-1下的峰强度，参考信号(A)为1590cm-1和1180cm-1下的峰强 度的比，其为对应于4，4′-二吡啶基(DPY)报道子的峰强度。注意图形 左侧的刻度对应于参考信号(A)，而图形右侧的刻度对应于参考信号 (B)；
图4为适于与目前描述的检验一起使用的光学系统的实例的示意 性视图；
图5A-5D为由样品管旋转的球团形成的示意性表示；
图6为在具有和不具有裂解试剂(rgts)的缓冲液、血浆、以及裂 解的血液中4，4′-二吡啶基(DPY)报道子的比较的图形表示；
图7为使用信号放大方法的目前描述的检验的代表性的示意性 图形；
图8A和8B为在不存在(8A)和存在(8B)目前描述的信号放大 方法中用相同试剂进行的液基免疫检验的比较；
图9为在多核苷酸检测模式中目前描述的放大方法的代表性的示 意性图形；
图10A和10B呈现来自不存在(10A)和存在(10B)目前描述的信 号放大方法下的DNA杂交检验的结果；
图11A和11B显示由于特征的杂散排列(spurious alignment)， 导致随机信号可以错误地分派给输入变量。标准偏差为10,000的正常 分布的随机噪音使用最小二乘法拟合。在该实例中，标志物4被赋予0.5 的权重以平衡其它标志物的负权重。
图12A和12B显示在溶液(A)中和在磁性颗粒球团(B)中获得的 代表性参考光谱。相对于标志物1标志物5峰(接近865nm)在球团较 高，在880nm下的峰的形状稍微不同。
图13为在多因子试验(multiplexing experiment)中五种标志物 之一的浓度评价的图形表示。浓度水平20对应于2.5E8标志物颗粒/mL。 使用基于球团的参考光谱(封闭的菱形(closed diamonds)的评估比 基于溶液的参考光谱(开环)显示更高的准确性和精确度，特别在低浓 度下。直线显示1∶1关系(为了清楚，基于溶液的数据点偏离在x轴上基 于球团的点)；
图14显示根据目前描述的主题的一种实施方式的卫星结构的透 射电子显微图片(TEM)；
图15描述根据目前描述的主题的实施方式使用卫星结构以放大 分析物信号的三明治检验；
图16A描述根据目前描述的主题的实施方式使用卫星结构以放大 分析物信号的三明治检验；图16B显示施加磁场后的图16A的三明治检 验；
图17描述根据目前描述的主题的实施方式的核-壳复合颗粒的截 面图；
图18A为显示根据目前描述的主题的一种实施方式的样品管的 侧面图；
图18B为沿图18A所示的样品管的截面A-A的截面侧面图；
图18C为显示18A所示的样品管的仰视图的图；
图19A为显示根据目前描述的主题的一种实施方式的与样品管相 邻并且在其下定位的磁体的侧面图；
图19B为显示图19A所示的磁体和样品管的俯视图的图；
图20为描述使用根据目前描述的主题的一种实施方式的样品管 的甲状腺刺激激素(TSH)检验结合曲线的图。

下文参考附图将更全面地描述目前描述的主题，其中目前描述的 主题的一些，但不是所有实施方式都显示。本文提出的目前描述的主 题的许多改进和其它实施方式，将提醒目前描述的主题所属领域的技 术人员具有上述说明书和附图中提出的教导的益处。因此，可以理解 目前描述的主题不限于描述的特定实施方式，改进和其它实施方式将 旨在包括在所附权利要求的范围内。虽然本文使用特定术语，它们仅 以通用和描述性意义使用，不旨在限制。
当用于本申请，包括权利要求时，术语″a，″″an，″和″the″是指 ″一个或多个″。这样，例如，除非上下文明确地相反(例如多个样品)， 提到″a样品″包括多个样品，等等。
贯穿该说明书和权利要求，单词″包括(comprise)″、″包括 (comprises)″和″(comprising)″以非排他性意义使用，除非上下文 需要例外。
如本文所用。当指数值时术语″约″是指包括来自特定量的变化， 在某些实施方式中为±50％，在某些实施方式中为±20％，在某些 实施方式中为±10％，在某些实施方式中为±5％，在某些实施方式 中为±1％，在某些实施方式中为±0.5％，以及在某些实施方式中 为±0.1％，此类变化适合进行所描述的方法或使用所描述的组合。
此外，当量、浓度或其它值或参数以范围、优选范围或最高优选 值和最低优选值的列表给出时，应该理解成具体地描述了所有由任何 上限范围或优选值和任何下限范围或优选值形成的所有范围，而无论 范围是否单独地描述。当本文列举一系列数值时，除非另外指出，该 范围旨在包括其端点，以及范围内的所有整数和分数。当定义范围时， 其不旨在将目前描述的主题的范围限制到列举的特定值。
1.使用SERS-活性颗粒的检验
在某些实施方式中，目前描述的主题提供用于确定在生物样品中 目的分析物或配体的存在或量的诊断检验。因此，在某些实施方式中， 目前描述的主题提供用于使用SERS-活性纳米颗粒进行诊断检验的检 验方法、组合物、系统、仪器、和试剂盒。
如以下本文更详细地描述，目前描述的检验的检测能力比本领域 已知的检验以一种或多种方式提高。这些提高包括，但不限于信号强 度的增加、增强的特异性、更高的准确性、提高的再现性及其组合。 目前描述的检验还可以以比本领域已知的检验更短的时间提供诊断结 果。此类改进，无论单独或组合，允许使用本申请中目前描述的方法 应用于如下应用：例如使用拉曼光谱作为检测方法的诊断检验、组织 的光学成像，以及其中需要此类增强的其它应用。
当在诊断检验中使用时，对于目前描述的方法观察到的增强特性 能够以比使用本领域已知的SERS方法可测定的更低浓度来检测生物标 志物，包括但不限于，蛋白质、多核苷酸和代谢物，还能够检测细胞(例 如，整个有机体)。这些增强的特性对其中拉曼信号必须通过，即透射 通过复杂的介质(例如全血或血清)的应用中是有益的。此外，可能需 要具有增强特性的诊断检验以用于患者中状况或疾病状态的早期诊 断。
A总体概述：表面增强拉曼光谱
当分子用特定频率的光子照射时，光子散射。多数入射光子弹性 散射而不改变频率(瑞利散射)，而小部分入射光子(约1个每106)与照 射分子的振动模式相互作用，并且非弹性散射。非弹性散射的光子频 率改变，具有更高的频率(反斯托克斯)或更低的频率(斯托克斯 (Stokes))。通过将非弹性散射光子的频率相对于其强度作图，观察到 所述分子的独特的拉曼光谱。然而，传统的拉曼光谱的低敏感性限制 了其在表征其中靶分析物典型地以少量存在的生物样品中的应用。
当拉曼-活性分子在金属表面上或极接近于金属表面例如约 内被吸收时，由拉曼-活性分子产生的拉曼信号的强度可以增强。例如， 迄今为止已经报道拉曼信号增加约103到106倍，在某些情况下，增加 1014倍。该增强被称为表面增强拉曼散射(SERS)效应。SERS效应首次由 Fleishman等报道于1974，其从粗糙的银电极表面上吸附的吡啶上观察 到强烈的拉曼散射。参见Fleishman等，″Raman spectra of pyridine adsorbed at a silver electrode，″Chem.Phys.Lett，26， 163(1974)；还参见Jeanmaire，D.L.，and Van Dyne.R.P.. ″Surface Raman spectroelectrochemistry.1.Heterocyclic， aromatic，and aliphatic-amines absorbed on anodized silver electrode.″J.Electroanal.Chem.，84(1)，1-20(1977)；Albrecht. M.G..and Creighton.J.A..″Anomalously intense Raman spectra of pyridine at a silver electrode，″J.A.C.S.，99，5215-5217 (1977)。从此以后，就在金属表面的表面上吸附的许多不同分子上观 察到SERS。See，例如，A.Campion，A.and Kambhampati，P.， ″Surface-enhanced Raman scattering，″Chem.Soc.Rev.，27，241 (1998)。
SERS增强的量级依赖于许多参数，包括在吸附分子中存在的各种 键关于金属表面处电磁场的位置和取向。SERS出现的机制被认为是由 以下的组合产生：(i)增强入射光局部强度的金属中的表面等离子共 振；和(ii)在金属表面和拉曼-活性分子之间电荷传输复合物的形成和 随后转移。
SERS效应可以用在金属胶质颗粒、双电极基质上的金属膜和金属 颗粒阵列(包括金属纳米颗粒)上吸附或极接近于其的拉曼-活性分子 来观察。例如，Kneipp等报道在胶质银纳米颗粒的聚集簇上吸附的染 料，Cresyl violet(甲酚紫)的单一分子的检测。参见Kneipp，K.等. ″Single molecule detection using surface-enhanced Raman scattering(SERS)，Phys.Rev.Lett，78(9)，1667-1670(1997)。 同一年，Nie和Emory观察到表面增强共振拉曼光谱(SERRS)信号，其 中拉曼-活性分子的吸收能量和纳米颗粒的吸收能量之间的共振产生 在单一银纳米颗粒上吸附的染料分子的高至1010至约1012的增强，其 中纳米颗粒从球形至棒形，具有约100nm的尺寸。参见Nie，S..and Emory.S.R..″Probing single molecules and single nanoparticles by surface enhanced Raman scattering，″Science， 275，1102-1106(1997)；Emory，S.R.，and Nie，S.，″Near-field surface-enhanced Raman spectroscopy on single silver nanoparticles，″Anal Chem.，69，2631(1997)。
与SERS-活性分子相连，例如在其上吸附或与其连接的拉曼增强 颗粒本文也称为″SERS-活性颗粒″。更具体地，本文提到的SERS-活性 颗粒，包括具有导致、引起或否则支持表面增强拉曼光散射(SERS)或 表面增强共振拉曼光散射(SERRS)的表面的颗粒。许多表面能够产生 SERS信号，包括粗糙化的表面、织构表面(textured surface)和包括 光滑表面的其它表面。
″拉曼散射″通常是指在分子上光子入射的非弹性散射。非弹性散 射的光子具有不同于入射光的频率(νo)的光学频率(νi)。入射光和非 弹性散射光之间能量(ΔE)的差可以表示为(ΔE)＝h|νo-νi|，其中 h为普朗克常数，并且对应于被分子吸收的能量。入射辐射可以为任何 频率νo，但典型地为在可见或近红外光区域的单色辐射。绝对差|νo- νi|为例如振动的红外频率。更具体地，产生除了频率为νo之外的光 的方法被称为″拉曼散射″。″拉曼散射″的辐射的频率ν1可以比νo大或 小，但频率为ν1＜νo(斯托克司辐射)的光的量大于频率为ν1＞νo(反 斯托克司辐射)的光的量。
如本文所用，术语″辐射″是指以电磁辐射形式的能量，其能够在 测试下的样品，例如包括连接有一种或多种SERS-活性报道分子的 SERS-活性纳米颗粒的样品中能够导致表面增强拉曼散射。更具体地， 术语″辐射″是指以电磁辐射形式的能量，其能够引起纳米颗粒的表面 在接近纳米颗粒表面的报道分子中导致、发射、支持或否则引起光散 射，例如拉曼散射。如本文所用，″报道分子″是指当其用合适波长的 辐射照射时能够产生拉曼光谱的任何分子或化学化合物。″报道分子″ 本文还可称为″标记″、″染料″、″拉曼-活性分子″或″SERS-活性分子″， 每一个都可以相互替代地使用。
″表面增强拉曼散射″或″SERS″是指当拉曼-活性分子在金属表 面上或极接近于金属表面例如约内被吸收时，当拉曼散射信号或 强度增强出现的现象。″表面增强共振拉曼散射″或″SERRS″是指当极接 近于SERS-活性纳米颗粒表面的报道分子与激发波长共振时出现的增 强的SERS信号。
B.适合与目前描述的方法一起使用的代表性纳米颗粒
1.一般纳米颗粒
任何SERS-活性颗粒适合在目前描述的方法中使用。此类SERS- 活性颗粒典型地为纳米颗粒，也被称为″纳米标签″。如本文所用，术 语″纳米颗粒″、″纳米结构″、″纳米晶体″″纳米标签″和″纳米组 分″可相互替代地使用，是指具有范围约1nm至约1000nm，包括1nm 和1000nm之间的任何整数(包括约1，2，5，10，20，50，60，70，80， 90，100，200，500和1000nm)的尺寸的颗粒。在某些实施方式中，纳 米颗粒为金属纳米颗粒。在某些实施方式中，纳米颗粒是核直径为约2 nm至约200nm(包括约2，5，10，20，50，60，70，80，90，100和 200nm)的球形颗粒或基本上球形的颗粒。在某些实施方式中，纳米颗 粒具有约2nm至约100nm(包括约2，5，10，20，30，40，50，60，70， 80，90和100nm)的核直径，在某些实施方式中，具有约20nm至100nm (包括20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33， 34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49， 50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65， 66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81， 82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97， 98，99和100nm)的核直径。当回顾目前描述的主题时，本领域普通技 术人员将意识到，适合与目前描述的检验一起使用的纳米颗粒可以包 括核，例如金属核，其导致拉曼效应，并且可以进一步包括一个或多 个SERS-活性材料、密封材料(encapsulant)和/或外壳结构的层，其对 纳米颗粒结构的大小，例如总直径也有贡献。
适合与目前描述的方法一起使用的SERS-活性纳米颗粒典型地包 括至少一种金属，即选自元素周期表中通常已知为金属的至少一种元 素。合适的金属包括第11族金属，例如Cu，Ag和Au，或本领域技术人 员已知支持SERS的任何其它金属，例如碱金属。在某些实施方式中， 纳米颗粒基本上包括单一金属元素。例如金纳米颗粒的制备由Frens， G.，Nat.Phys.Sci.，241，20(1972)描述。在其它实施方式中， 纳米颗粒包括至少两种元素的组合，例如合金，例如二元合金。在某 些实施方式中，纳米颗粒有磁性。
在其它实施方式中，金属包括例如在Au2S/Au核-壳颗粒中的其它 组分。已经报道AU2S/AU核-壳颗粒具有宽范围可调的近IR光学共振。 参见Averitt.R.D.，等.″Ultrafast optical properties of gold nanoshells，″JOSA B，16(10)，1824-1832(1999)。此外，可以使 用Ag核/Au壳颗粒，例如由Cao，Y.W.，等，″DNA-modified core-shell Ag/Au nanoparticles，″J.Am.Chem.Soc，123(32)， 7961-7962(2001)描述的那些，或Au核/Ag壳颗粒，或包括SERS-活 性金属的任何核-壳组合。适合在核-壳颗粒中使用的其它组合也适合 与目前描述的方法一起使用，包括Au-或Ag-官能化的二氧化硅/氧化 铝胶体，Au-或Ag-官能化的TiO2胶体、Au纳米颗粒覆盖的Au纳米 颗粒(参见，例如，Mucic，等，″DNA-directed synthesis of binary nanoparticle network materials，″J.Am.Chem.Soc，120(48)， 12674(1998))；Au纳米颗粒覆盖的TiO2胶体；以及具有Si核和金属壳 的颗粒(即，″纳米壳″)，例如银-覆盖的SiO2胶体或金覆盖的SiO2胶体。 参见，例如，Jackson，等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101(52)： 17930-5(2004)；还参见Oldenburg等的美国专利Nos.6,344,272 和6,685,986，每一篇都将其全文引入以作参考。此类纳米壳在生 物传感应用中的用途已经描述。参见West等的美国专利No. 6,699,724，将其全文引入以作参考。
适于与与目前描述的方法一起使用的另一类纳米颗粒包括具有 内表面的纳米颗粒。此类纳米颗粒包括中空颗粒和中空纳米晶体或多 孔或半多孔纳米颗粒。例如参见Ostafin等的美国专利No. 6,913,825，将其全文引入以作参考。因此，目前描述的主题还提供包 括对SERS有活性的核-壳颗粒的纳米颗粒或对SERS有活性的中空纳米 颗粒。在某些实施方式中，此类纳米颗粒可以展示提高的SERS信号。
虽然意识到颗粒形状和长宽比能够影响纳米颗粒的物理、光学和 电子学性质，特定形状、长宽比或存在/不存在内表面区域不与将颗粒 认定为纳米颗粒有关。因此，适于与目前描述的方法一起使用的纳米 颗粒可以具有各种形状、大小和组成。此外，纳米颗粒可以是实心的， 或如上文所述在某些实施方式中可以是中空的。合适的纳米颗粒的非 限制性实例包括胶态金属中空或填充的纳米棒(nanobar)，磁性、顺磁 性、导电或绝缘的纳米颗粒，合成颗粒、水凝胶(胶体或棒)，等等。 本领域技术人员将意识到纳米颗粒可以以各种形状存在，包括但不限 于球形、棒形、碟形、锥体、立方体、圆柱体、纳米螺旋、纳米弹簧、 纳米环、棒形纳米颗粒、箭形纳米颗粒、泪珠形纳米颗粒、四针状纳 米颗粒(tetrapod-shaped nanoparticles)、棱柱形纳米颗粒，以及 多种其它几何或非几何形状。
此外，适于与目前描述的方法一起使用的纳米颗粒可以同向性的 或各向异性的。如本文中所述，各向异性纳米颗粒具有长度和宽度。 在某些实施方式中，各向异性纳米颗粒的长度为与产生纳米颗粒的孔 径平行的尺寸。在某些实施方式中，各向异性纳米颗粒具有约350nm 以下的直径(宽度)。在其它实施方式中，各向异性纳米颗粒具有约250 nm以下的直径(宽度)，以及某些实施方式中，约100nm以下的直径(宽 度)。在某些实施方式中，各向异性纳米颗粒的宽度为约15nm至约 300nm。此外，在某些实施方式中，各向异性纳米颗粒具有长度，其 中长度为约10nm至350nm。
许多SERS文献(无论试验上的还是理论上的)暗示，与球形相比， 各向异性颗粒(棒形、三角形、棱柱)可以提供拉曼信号的增加的增强。 例如，所谓的″天线效应″预言预期拉曼增强在更高曲率的区域更大。 近年来描述了各向异性颗粒的许多报道，包括银(Ag)棱柱和″分枝的″ 金(Au)颗粒。
各向异性Au和Ag纳米棒可以以与颗粒类似的 方式，通过电沉积到预成形的氧化铝模板来产生。参见，例如. Nicewarner-Pena.S.R..等.″Submicrometer metallic barcodes，″ Science，294，137-141(2001)；Walton.I.D.，等.″Particles for multiplexed analysis in solution：detection and identification of striped metallic particles using optical microscopy，″Anal. Chem.74，2240-2247(2002)。这些颗粒可以通过将材料(典型地Au 和Ag)的交互层，沉积到预成形的氧化铝模板来制备，并且可以具有约 250nm的直径和约6微米的长度。
2.密封的SERS-活性纳米颗粒
SERS-活性金属纳米颗粒在水性溶液中具有聚集的趋势，并且一 旦聚集难以再分散。此外，一些拉曼-活性分子的化学组成与用于将其 它分子，例如蛋白质连接至金属纳米颗粒的化学性质(chemistries) 不相容。这些性质能够限制拉曼-活性分子、连接化学性质和要连接到 金属纳米颗粒的其它分子的选择。
因此，在某些实施方式中，当固定，例如吸附到或共价连接到纳 米颗粒时，SERS-活性报道分子可以被包被或密封在例如不同材料的壳 中，所述不同材料包括聚合物、玻璃或陶瓷材料。此类实施方式本文 称为″密封的SERS-活性纳米颗粒″。用于制备密封的SERS-活性纳米颗 粒的方法描述于Natan的美国专利6,514,767，将其全文引入以作参考。
目前描述的方法一起使用的合适纳米颗粒的实例包括Oxonica Nanotags(Oxonica Inc.，Mountain View，California)。在一种实 施方式中，纳米标记包括直径约50nm的金核，被不同的报道分子包被， 并且如上文所述被密封，在某些实施方式中，在10nm至50nm的保护 性玻璃涂层，在某些实施方式中，15nm至40nm的保护性玻璃涂层， 在某些实施方式中，30nm至40nm的保护性玻璃涂层，以及在某些 实施方式中，35nm的保护性玻璃涂层中。纳米标记进一步在例如Natan 的美国专利6,514,767；Natan的美国专利申请Nos.2003/0166297和 Natan的2005/0158870 A1中描述，在此将其内容引入以作参考。
目前描述的密封的SERS-活性纳米颗粒可以包括金属纳米颗粒， 极接近于金属纳米颗粒表面的亚单层、单层或多层的一种或多种报道 分子。术语″极接近于″是指在纳米颗粒外表面的50nm以下内。与纳米 颗粒核的外表面连接的具有亚单层、单层或多层的一种或多种报道分 子的纳米颗粒还可以包括密封壳。在此类实施方式中，报道分子位于 金属纳米颗粒的外表面和密封壳的内表面之间的界面上。
包括密封的纳米颗粒的纳米颗粒核可以为金属球，例如金、银或 铜球(具有约20nm至约200nm的直径)。在某些实施方式中，纳米颗 粒核包括扁圆的或扁长的金属椭圆体。纳米颗粒核的直径可以部分基 于入射光的波长选择。在某些实施方式中，密封壳包括介电材料，例 如聚合物、玻璃、金属、金属氧化物例如TiO2和SnO2、金属硫化物或陶 瓷材料。在某些实施方式中，密封材料为玻璃，例如SiOx。为了将目 前描述的SERS-活性纳米颗粒密封在玻璃中，金属纳米颗粒核可以用玻 璃底漆，即导致玻璃的均匀涂层生长的材料处理，或可以改进玻璃涂 层至颗粒的粘合，或二者。然后玻璃可以通过本领域已知的标准技术 在金属纳米颗粒上生长。
密封过程可以在将一种或多种报道分子连接或吸附到核纳米颗 粒之后或期间进行。这样，染料从周围溶剂螯合(sequestered)到金属 纳米颗粒核的表面上作为涂层。此类构造提供具有稳定SERS活性的金 属纳米颗粒核。染料可以在金属纳米颗粒核的表面上形成亚单层、完 整的单层或多层组件(assembly)。染料层可以包括单一染料或不同染 料的混合物。
这样，在某些实施方式中，SERS-活性报道分子在纳米颗粒核的 外表面上形成层，其中所述层至少部分地覆盖纳米颗粒核的外表面， 并且被内表面和外表面限定。密封材料设置在纳米颗粒核的至少一个 外表面上和SERS-活性报道分子层的外表面，以至少部分地围绕纳米颗 粒核，所述纳米颗粒核至少部分地被SERS-活性报道分子层覆盖。
此外，在某些实施方式中，密封材料可以被改性(例如通过本领 域已知的标准技术衍生化)以连接分子，包括生物分子，至其外表面。 该特性允许目前描述的密封的SERS-活性纳米颗粒缀合至分子，包括生 物分子，例如蛋白质和核酸，或至不干扰染料的拉曼活性的固体基质。 玻璃和其它适合用作密封壳使用的材料包含顺从分子连接的官能团。 例如，将玻璃浸入合适的碱，允许烷基三氯硅烷或烷基三烷氧基硅烷 与在烷基三氯硅烷或烷基三烷氧基硅烷基团的烷基末端获得的其它官 能度共价连接。在某些实施方式中，氨基烷基三烷氧基硅烷基团、巯 基烷基三烷氧基硅烷基团、或羧基烷基三烷氧基硅烷基团的一种或多 种可以共价连接到玻璃表面。这样，玻璃表面可以用许多形式的生物 分子和生物分子超结构，包括细胞以及氧化物、金属、聚合物等等改 性。同样地，玻璃表面可以用良好组织的单分子层改性。因此，玻璃 涂层支持许多类型化学官能化(本文也称为″衍生″)。同样其它形式的 密封材料也可被官能化。因此，目前描述的纳米颗粒可以被固定到本 领域已知的具有化学反应性官能度的任何物质。
密封材料的厚度可以依赖于SERS-活性纳米颗粒所需的物理性质 而变化。物理性质，例如沉降系数可以受密封材料的厚度影响。通常， 密封材料越厚，SERS-活性染料从周围溶剂螯合到金属纳米颗粒核上越 有效。
在其中密封材料为玻璃的实施方式中，玻璃的厚度典型地为约1 nm至约50nm。在列举的非限制性实施方式中，密封的SERS-活性纳 米颗粒包括金纳米颗粒，其具有从约50nm至约100nm的直径，密 封在玻璃球中，所述玻璃球具有约以下厚度，在在某些实施方式中，约 10nm至约50nm；在某些实施方式中，约15nm至约40nm；在某 些实施方式中，约35nm。目前描述的密封的SERS-活性纳米颗粒的 尺寸优化可以由本领域技术人员实现。例如，在本领域已知核-壳纳米 颗粒(例如，Au/AuS纳米颗粒)支持SERS，并且与纯金属纳米颗粒相比 具有不同的光学性质。同样地，在本领域已知相对于具有相同长轴的 球形，来自长椭球的SERS能够增强。此外，已知单一颗粒增强是波长 依赖性的。这样，粒径可以″调整″以实现用于给出激发波长的最大SERS 信号。因此，颗粒的组成，或其大小或形状可以根据目前描述的主题 而改变以优化SERS信号的强度。
目前描述的密封的SERS-活性纳米颗粒易于处理和贮存。此外， 它们还在溶剂和空气中抗聚集、稳定抗染料的分解，是化学惰性的， 并且可以例如通过磁性沉降技术来浓缩，以及不损失SERS活性地再分 散。
如以下本文更具体地描述，目前描述的主题还提供能够增强使用 SERS-活性颗粒的检验的更特异化的纳米颗粒。
3.报道分子
报道分子可以是当暴露到合适的辐射时提供拉曼信号的任何分 子。″报道分子″是指能够产生拉曼信号的任何分子或化学化合物。本 文″报道分子″还可称为″标记″、″染料″、″拉曼-活性分子″或 ″SERS-活性分子″，每一个都可相互替换地使用。具有强拉曼光谱的许 多不同的报道分子是已知的，并且可用于形成不同的″风味(flavors)″ 的SERS-活性颗粒，以使能够有多因子能力(术语″风味″是指当照射时 提供不同拉曼特征的颗粒)。此类颗粒典型地能够在近红外(NIR)波长 区域起作用，能够在全血中检测，并且是耐光的。此外，许多不同″ 风味″可以用单一波长激发。
C.代表性的捕获探针
捕获探针，例如抗体或DNA探针，可以使用生物缀合技术固定到 保护性玻璃涂层上。该方法的优点在于SERS信号-产生报道分子极接近 于金表面固定，被玻璃涂层保护免受生物或化学攻击。此外，消除了 报道分子和捕获探针之间的竞争性结合，允许在纳米颗粒核表面的报 道分子以及在玻璃表面的捕获探针的各自最大表面覆盖率。
更具体地，SERS-活性纳米颗粒可以用能够结合靶分析物的分子， 例如结合伴侣的特异结合成员来官能化。结合事件形成可检测的信号， 其指示分析物的存在和/或量。可检测的信号能够对应于SERS标记的定 位检测或能够通过在SERS光谱中的可检测的波长移位来表示。
官能化SERS-活性纳米颗粒的使用比非官能化纳米颗粒具有几个 优点。首先，官能团通过提供与靶分析物的特定相互作用来提供针对 纳米颗粒的特异性的程度。其次，靶分析物自身不必是拉曼活性的； 其存在可以通过测定连接到纳米颗粒的拉曼-活性染料的SERS光谱来 确定。此类测定本文称为″间接检测″，其中生物样品中靶分析物或配 体的存在或不存在通过检测不直接从靶分析物或目的配体发出的SERS 信号来确定。
可以将适合与目前描述的方法一起使用的SERS-活性纳米颗粒官 能化从而以至少两种不同方式与靶分析物结合。在某些实施方式中， SERS-活性报道分子，即SERS-活性染料，可以与结合伴侣的特异结合 成员缀合，而在其它实施方式中，结合伴侣的特异结合成员可以直接 连接到纳米颗粒。在其中纳米颗粒核至少部分地被密封壳围绕的实施 方式中，结合成员可以连接到密封壳的外表面。
如本文所用，术语″缀合″是指包括任选地通过连接基团结合在一 起的两个或多个亚单位以形成单一分子结构的分子。该结合可以通过 亚单位之间的直接化学键或通过连接基团形成。缀合物中的此类结合 典型地是不可逆的。如本文所用，术语″亲和力″是指结合伴侣的一种 结合成员与另一成员之间在特定结合位点的吸引强度。术语″特异性″ 及其衍生词，是指结合成员与结合伴侣的另一成员结合的可能性。一 种结合成员，例如结合蛋白与结合伴侣的另一成员，例如配体或分析 物之间的此类结合，可以是可逆的。
术语″特异结合成员″是指对于其存在至少一种单独的、互补性的 结合分子的分子。特异结合成员为与特定分子结合、连接或否则相连 的分子。该结合、连接或相连可以是化学的或物理的。与特异结合成 员结合的特异分子可以是各种分子的任何，包括但不限于，抗原、半 抗原、蛋白质、碳水化合物、核苷酸序列、核酸、氨基酸、肽、酶等。 此外，特定类型的特异结合成员将结合特定类型的分子。在此类实例 中，特异结合成员被称为″特异结合伴侣″。因此，抗体将特异性地结 合抗原。其它特异结合伴侣包括亲和素和生物素、碳水化合物和凝集 素、互补核苷酸序列、互补肽序列、酶和酶辅因子等。
1.直接连接有结合伴侣的特异结合成员的SERS-活性纳米 颗粒
在某些实施方式中，特异结合伴侣的结合成员，例如抗体，例如 单克隆抗体，可以直接连接到纳米颗粒的表面。在示例性的实施方式 中，结合伴侣的特异结合成员，例如单克隆抗体，能够用连接子，例 如聚乙二醇(PEG)处理，并且通过PEG连接子直接连接到纳米颗粒。
本领域技术人员将意识到，连接子的选择可以依赖于检验的目标 通过各种因素确定。例如，PEG用作连接子可以稳定抗体的取向以使抗 原的表位从纳米颗粒的表面向外指去。这样，官能化的纳米颗粒可以 设计成将表位或其它结合区域到测试溶液的呈递最大化，由此有效地 增加检验的敏感性。
依赖于结合成员，可以使用其它连接子。例如，可以将烷基硫醇 用作用于抗体和肽的连接子。短链烷基硫醇，包括但不限于，N-琥珀 酰亚氨基-S-乙酰基硫代乙酸酯(盐)(SATA)、N-琥珀酰亚氨基-S-乙酰 基硫代丙酸酯(盐)(SATP)可以在巯基去保护后用作连接子。其它性质 也可以确定连接子的选择，例如连接子链的长度。例如，可能需要PEG， 因为其还用于保护试剂的表面，并且其是柔韧性的，这可以增加试剂 与目的分析物结合的能力。
特异结合成员，例如抗体，也可以用连接子，例如硫醇化的PEG 连接子改性，并且连接到纳米颗粒。
2.代表性的结合成员
在某些实施方式中，或通过SERS-活性报道分子，或直接连接到 纳米颗粒本身的外表面的与目前描述的SERS-活性纳米颗粒缀合的结 合成员，包括多肽或蛋白质，例如葡萄糖结合蛋白。代表性的结合成 员包括但不限于，对靶分析物具有亲和力的特异结合成员，包括核酸、 蛋白质结构域、抗体片段、细胞和针对靶分析物的抗体，例如前列腺 特异抗原(PSA)、肌酸激酶MB(CKMB)同工酶、心肌肌钙蛋白I(cTnI)、 甲状腺刺激激素(TSH)、甲型流感(Flu A)抗原、乙型流感(Flu B)抗原 和呼吸道合胞病毒(RSV)抗原。针对此类靶分析物的抗体在本领域是已 知的。
分析物和结合成员可以作为结合伴侣。本文所用的术语″相连 (associates)″或″结合″是指具有相关性结合常数(Kd)的结合伴 侣，其足够强从而允许通过检测装置检测与蛋白质的结合。Kd可以在 一半蛋白质结合时的游离分析物的浓度来计算，反之亦然。当目的分 析物为葡萄糖时，结合伴侣的Kd值为约0.0001mM至约50mM。
D.通常的诊断检验
SERS-活性纳米颗粒可用于诊断检验。例如Rohr等证明了使用包 括多个组分和洗涤步骤的SERS检测的免疫检验。参见Rohr.T.E.. 等.，″Immunoassay employing surface-enhanced Raman spectroscopy，″Anal.Biochem.，182：388(1989)。同样，Ni等证 明了在包括孵育和洗涤步骤的异相检测检验中连接到金载玻片(gold slide)上的报道子。参见Ni.J.，等.″Immunoassay Readout Method Using Extrinsic Raman Labels Adsorbed on Immunogold Colloids，″ Anal.Chem.，71：4903(1999)。由SERS Rohr等.和Ni等，以及本 领域已知的其它公开的SERS检验，需要非常长的孵育和洗涤步骤。
使用SERS的检验的另一实例公开于Tarcha等的美国专利No. 5,266,498，将其全文引入以作参考。Tarcha等公开了多试剂系统的使 用，其中标记或抗体连接到SERS表面。第二试剂包含标记或抗体的互 补伴侣。
在某些实施方式中，目前描述的SERS-活性纳米颗粒可以用作生 物检验中的光学标记。在某些实施方式中，要检测的靶分子，例如抗 原，被连接到固体表面的第一结合伴侣捕获。也对靶分子特异的第二 结合伴侣，可以连接到SERS-活性纳米颗粒。当存在分析物时，第一 和第二结合伴侣都结合靶(target)，从而形成SERS-活性纳米颗粒-靶- 固体表面的三明治。该固体表面可以是固定的基质或可移动的颗粒。
E.液基检验
使用SERS-活性纳米颗粒的液基检验方法已经之前公开。参见， 例如，Hirsch 等.″A Whole Blood Immunoassay Using Gold Nanoshells，″Anal.Chem.，75(10)，2377-2381(2003)，将其全 文引入以作参考。Hirsch等公开了在目的分析物存在下通过测定由于 颗粒相互作用导致的光吸收改变的颗粒聚集的检测。由Hirsch等公开 的在该检验中纳米颗粒的聚集，检测作为颗粒聚集结果出现的等离子 共振降低。然而，Hirsch等未公开用于检测的拉曼信号的使用。
在目前描述的检验中的一种实施方式中，SERS-活性颗粒可用于 所谓的″无洗涤″或″均相″检验。在此类检验中，将样品收集到容器， 例如试样收集容器、检验容器或其它适合与目前描述的检验一起使用 的样品容器，并且该检验无需将样品从容器，例如检验容器中取出来 进行。有利地是，可以将样品收集入已经包含进行检验所需的所有试 剂的容器。然而，在某些实施方式中，可以在试样收集后将一种或多 种试剂加入容器。适合与目前描述的检验一起使用的代表性容器进一 步详细地描述于以下本文的第III节。
在其它实施方式中，目前描述的SERS-活性纳米颗粒可用于异相 检验。如本文所用，术语″异相检验″通常是指其中检验的一种或多种 组分顺序地添加到所述检验或从所述检验除去的检验。更具体地，异 相检验可以部分地依赖于通过在检验期间分析物与固相表面的结合， 将分析物从液体样品转移到固相。在检验的特定阶段，其顺序依赖于 检验策略而变化，固相和液相分离，并且在两种分离相之一上进行引 起分析物的检测和/或定量的确定。这样，异相检验例如可以包括用抗 原或抗体包被的固体基质(solid support)，所述抗原或抗体结合目的 分析物，由此将分析物从测试下的样品中的其它组分分离或除去。这 些其它组分可以通过一步或多步洗涤步骤从样品中选择性地除去，并 且分析物保持结合在固体基质上，其中其可被检测，或可通过另外的 洗涤步骤除去并随后检测。
在液基检验中，将样品典型地例如在周围条件下孵育，但是可以 提供受控的条件，例如特定的温度或摇动样品。孵育阶段后，然后可 以将容器置于读出器以获得来自一种或多种SERS-活性颗粒的信号，所 述SERS-活性颗粒预先加载或随后添加到容器。拉曼信号产生和当通过 特定波长的入射辐射，例如激光辐射询问(interrogation)时，检测拉 曼信号。
1.表面固定的目的靶分析物
在液基检验的某些实施方式中，目的靶分析物固定在例如固体基 质，例如容器例如试样收集容器或检验容器的官能化内表面的定位区 域。然后固定的目的靶分析物可以与包括缀合有特异结合成员的SERS- 活性纳米颗粒的检测试剂接触，所述特异结合成员例如抗体，对目的 靶分析物具有亲和力。SERS-活性纳米颗粒可以与固定的目的靶分析物 相互作用或相连(associate with)，例如可逆或不可逆地结合。合适 的孵育时间后，SERS-活性纳米颗粒和固定的靶分析物之间的该相互作 用可以用过用合适波长的入射辐射照射固体基质的定位区域和测定由 SERS-活性报道分子发射的SERS信号来检测。此外，因为各类型的SERS- 活性报道分子显示独特的SERS光谱，单一SERS光谱可用于通过将包 含不同SERS-活性报道分子的SERS-活性纳米颗粒包括在检测试剂中来 检测多种目的靶分析物。因此，目前描述的SERS-活性纳米颗粒可用于 多因子检验形式。
2.报道子的选择和使用
报道分子优选显示具有窄线宽的相对简单的拉曼光谱。该特征允 许在同一样品体积中检测几种不同的拉曼-活性试样。因此，该特征允 许制造各自包括不同染料的多种SERS-活性纳米颗粒，以使各染料的拉 曼光谱在不同类型的纳米颗粒的混合物中区分开。该特征允许多因子 检测在小样品体积中的几种不同的靶试样。这样，与报道分子相连或 连接的纳米颗粒还适合在多因子化学检验中使用，其中SERS-活性纳米 颗粒的身份(identity)编码检验的靶的身份。
此类报道分子，当与SERS-活性纳米颗粒相连或连接时，在多因 子检验中提供光谱多样性和可分辨性。各SERS-活性纳米颗粒，当偶联 到靶-特异性试剂时，可以编码该特定靶分子的身份。此外，特定拉曼 信号的强度可以揭示该特定靶分子的量。因此，SERS-活性纳米颗粒可 用于多因子检验以产生关于靶分子的定性和/或定量信息，而不需要试 剂的位置敏感性定位。
依赖于检验的需要，检测试剂可以包括多于一种类型的标记，例 如多于一种类型的SERS-活性报道分子。例如，不同类型的SERS-活性 报道分子可以在不同波长下表现出拉曼信号，即拉曼光谱或拉曼光谱 特性，并且可用于形成用于特定目的分析物的独特的拉曼″指纹″，由 此增强检验的特异性。不同的报道分子可以连接到不同的特异结合成 员以提供能够检测多于一种的目的分析物，例如多种目的分析物的试 剂。此外，多种报道分子可用于形成内标信号，其可用于从信号检测， 特别是显示或期待显示相对弱的信号的样品中区分背景噪音。此外， 多于一种的SERS-报道分子可用于避免或克服从测试下的样品溶液发 射出的非特异性辐射，即从不能对直接或间接测定目的分析物有贡献 的样品溶液发射出的辐射。
F.在液基检验中的磁性捕获
在液基检验的某些实施方式中，磁性捕获试剂可用于促进颗粒在 检验容器中的定位。在此类实施方式中，磁性捕获颗粒可以用对一种 或多种目的分析物具有亲和力的结合成员标记。此类磁性捕获颗粒可 以与一种或多种目的分析物结合，所述目的分析物还可以与SERS-活性 纳米颗粒结合，以形成磁性捕获颗粒-分析物-SERS-活性纳米颗粒复合 物。磁性捕获颗粒的磁性质可用于在检验容器内的预定区域中定位磁 性捕获颗粒-分析物-SERS-活性纳米颗粒以用于检测SERS信号。
因此，在某些实施方式中，磁性捕获颗粒-分析物-SERS-活性纳 米颗粒复合物定位于检验容器，例如试样收集容器或管内的预定区域。 然后辐射可以针对该定位区域，并且可以检测SERS信号。磁性捕获颗 粒-分析物-SERS-活性纳米颗粒复合物的定位可以增加报道分子-表面 的相互作用，并且通过浓缩SERS效应到检验容器的特定区域来增加信 号。
颗粒的磁性捕获可以使用本领域已知的任何方法实现，包括但不 限于，在检验容器的定位区域放置强磁体或诱导磁场。磁场可以例如 通过一种或多种永磁体或电磁体来诱导。
更具体地，在某些实施方式中，目前描述的缀合有对目的靶分析 物具有亲和力的特异结合成员的SERS-活性纳米颗粒可以设置在容器， 例如试样收集容器中，其在设置怀疑含有一种或多种目的靶分析物于 其中之前、同时或之后。磁性颗粒，也缀合有对目的靶分析物具有亲 和力的特异结合成员，可以设置在容器中。存在于样品中的目的靶分 析物可以与SERS-活性纳米颗粒和磁性颗粒结合，从而形成复合物，例 如磁性捕获颗粒-分析物-SERS-活性纳米颗粒复合物，其中靶分析物被 夹心在SERS-活性纳米颗粒和磁性颗粒之间。参见，例如，图1，其 显示适合与目前描述的主题一起使用的代表性磁性捕获检验。
现在参考图1，显示用于检测生物样品中一种或多种分析物存在 的代表性磁性捕获检验的示意性视图。目前描述的磁性捕获检验包括 一种或多种磁性捕获颗粒100，其与对生物样品中一种或多种目的分析 物130具有亲和力的至少一种特异结合成员110a相连。该检验还包括 一种或多种SERS-活性纳米颗粒120，其与对一种或多种分析物130具有 亲和力的至少一种结合成员110b相连。与SERS-活性纳米颗粒120 相连的结合成员110b可以和与磁性捕获颗粒100相连的结合成员 110a相同或不同。磁性颗粒100和SERS-活性纳米颗粒120与包括一 种或多种目的分析物130的生物样品接触，孵育一段时间以形成磁性捕 获颗粒-分析物-SERS-活性纳米颗粒复合物140，例如抗体-抗原″三 明治″结构，如果一种或多种分析物130存在于生物样品中的话。将 磁性捕获颗粒-分析物-SERS-活性纳米颗粒复合物140暴露到磁场(未 示出)，以诱导复合物140向容器150，例如检验容器或试样收集容器的 定位区域移动，以形成球团(pellet)160。将球团(pellet)160在例如 图4所示的系统中用一种或多种波长的入射辐射照射，以诱导SERS-活 性报道分子产生可检测的信号，来检测生物样品中一种或多种分析物 的存在或量。当回顾目前描述的主题时，本领域技术人员将意识到磁 性捕获颗粒100，SERS-活性纳米颗粒120及其组合可以在样品设置 在其中之前包括在容器150中，或者可以在样品设置在其中之前、同时 或之后添加到容器150。
因此，在某些实施方式中，磁性颗粒富集可以有利地在目前描述 的检验中使用。在一种此类方法中，其上连接有针对目的分析物的一 种或多种捕获探针的SERS-活性颗粒可以在样品收集之前存在于容器， 例如试样收集容器中，或在某些实施方式中，收集后添加。孵育阶段 期间，靶分析物通过捕获探针结合到SERS-活性颗粒表面。磁性颗粒， 同样其上连接有针对目的靶的捕获探针并且已经在容器中提供，可以 与相同的靶，例如一种或多种目的分析物上的不同表位连接，从而形 成其中靶分析物夹心在SERS-活性纳米颗粒和磁性颗粒之间的复合物。 然后磁体可用于在容器中的特定空间浓缩这些三明治，即形成球团。 磁体可以在容器置于读出器之前应用或可以整合到读出器中。然后所 需波长的入射辐射，例如激光束，可以聚焦在浓缩的SERS-活性纳米颗 粒-靶-磁性颗粒三明治复合物的球团，从SERS-活性纳米颗粒获得SERS 信号。
同样在本文中还更详细地公开的是，目前描述的检验的磁性捕获 实施方式可以包括使多种类型的SERS-活性纳米颗粒与样品接触，其中 各类型SERS-活性纳米颗粒其上连接显示独特拉曼信号的SERS-活性报 道分子。此类实施方式可用于检测多种目的分析物，本文称为多因子 检测(multiplexing)。
G.在磁性沉降的液基检验中的参考和对照
在传统的免疫检验中，抗原的检测可以通过在两种抗体之间″夹 心″抗原来出现，其中一种抗体用光、比色、或放射性报道子标记。然 后测定的信号，例如光、比色、或放射性报道子可用于确定样品中存 在的抗原的浓度。传统的酶联免疫吸附检验(ELISA)免疫检验为此类技 术的实例。该技术方法的一个问题在于光信号的量级除了抗原的存在 和/或量之外依赖于几个因素。例如，光学器件(optics)的排列和性能 可以影响测定信号。典型地，为了避免此问题，测定具有已知抗原浓 度的其它对照样品。
如上所述，在目前描述的主题的一种实施方式中，测定信号通过 在SERS-标记的纳米标记和磁性捕获颗粒之间形成抗原介导的复合物 来产生。复合物可以通过施加磁场从溶液分离，测定来自所得磁性球 团的光信号。
磁性球团相对于询问光学器件(interrogating optics)的位置 能够影响测定光信号的量级，并最终影响检验的校准。此外，磁性球 团的形状不必总是一致的。例如，改变磁性颗粒的表面官能度能够改 变球团的密度和/或形状。
根据目前描述的主题的实施方式，可以补偿球团大小、形状或定 位的变化。这些方法还可应用于其中形成球团的其它检验形式。在一 种实施方式中，用于磁性沉降的磁性颗粒用除了捕获探针之外的参考 标记标记，例如对目的抗原特异的抗体。参考标记可以为能够产生(通 过自身或当某种类型刺激时)可检测的信号，包括但不限于荧光团、有 机染料、稀土元素和拉曼报道子的任何部分，并且还可以包括包含此 类组分的颗粒。参考标记的具体实例包括本文所述类型的SERS-活性颗 粒和二氧化硅颗粒，所述二氧化硅颗粒在二氧化硅颗粒上或遍及二氧 化硅颗粒分布有荧光团。
将参考标记引入检验的实例描述于图2。目前描述的引入参考标 记的磁性捕获检验包括一种或多种磁性捕获颗粒200，其与对生物样品 中一种或多种目的分析物240具有亲和力的至少一种特异结合成员 210a相连。在该实施方式中，一种或多种磁性捕获颗粒200还与能够产 生可检测信号的至少一种参考标记230相连。在某些实施方式中，参考 标记230包括具有与一种或多种SERS-活性纳米颗粒220不同的报道分 子的第二SERS-活性纳米颗粒，其与一种或多种分析物240形成复合物 250。
该检验还包括一种或多种SERS-活性纳米颗粒220，其与对一种 或多种分析物240具有亲和力的至少一种结合成员210b相连。与SERS- 活性纳米颗粒220相连的结合成员210b可以和与磁性捕获颗粒200相 连的结合成员210a相同或不同。
如图1中所示的检验，磁性颗粒200和SERS-活性纳米颗粒220 与包括一种或多种目的分析物240的生物样品接触，孵育一段时间以形 成磁性捕获颗粒-分析物-SERS-活性纳米颗粒复合物250，如果在生物 样品中存在一种或多种分析物240的话。将磁性捕获颗粒-分析物 -SERS-活性纳米颗粒复合物250暴露到磁场(未示出)以诱导复合物 250向容器，例如检验容器或试样收集容器的定位区域移动，以形成 之前图1中所示的球团。
将所有存在于容器中的磁性颗粒(无论是否络合)沉降到容器的 定位区域，例如光学读取区域。将包括磁性捕获颗粒-分析物-SERS- 活性纳米颗粒复合物250的球团在例如图4所示的系统中用一种或多 种波长的入射辐射照射，以诱导SERS-活性纳米颗粒220产生第一可检 测信号，参考标记230产生第二可检测信号。SERS-活性纳米颗粒220 的第一可检测信号可以与参考标记230的第二可检测信号比较，来检测 生物样品中一种或多种分析物240的存在或量。
来自颗粒220的拉曼信号与存在的分析物240，例如抗原的量有 关；而来自参考标记230(例如与颗粒220具有不同SERS-报道分子的纳 米颗粒)的信号，起参考的作用，并且校正球团形状、密度和/或位置 的变化。这样，校准可以基于将报道子1，例如颗粒220的强度与报道 子2，例如，参考标记230的强度比较。例如，信号可以通过(报道子 1强度)/(报道子2强度)，换句话说，报道子1的强度相对于报道子 2的强度的比值来计算。
虽然图2显示一个SERS-活性颗粒每磁性捕获颗粒，多个参考标 记/颗粒每磁性颗粒也是可行的，或作为选择，磁性捕获颗粒的一部分 用一种或多种参考标记，而剩下的磁性捕获颗粒无参考。
如图1中所述的检验，当回顾目前描述的主题时本领域技术人员 将意识到磁性捕获颗粒200，SERS-活性纳米颗粒220，及其组合可 以在样品设置在其中之前包括在容器中，或者可以在样品设置在其中 之前、同时或之后添加到容器。
目前描述的主题还包括以下实施方式，其中磁性颗粒-SERS-活性 纳米颗粒三明治预络合，并且可作为参考标记与目前描述的方法一起 使用。该复合物是惰性的，即，其不与目的分析物络合。已知量的此 类预络合颗粒可以作为标记添加到样品。
H.在液基检验中使用裂解试剂
在进一步的实施方式中，裂解试剂可用于使用或不使用磁性沉降 的检验，例如液基检验。当用于生物样品(biological matrices)，例 如人类血液、血浆或血清时，裂解试剂可以提供用于生物标志物检测 的增加的信号和/或改进的限制。具体地，当用于使用SERS-活性颗粒 的免疫检验时，裂解试剂的添加与不包含裂解试剂的样品相比增加拉 曼信号的强度。
适合与目前描述的方法一起使用的一种裂解试剂包括一种或多 种以下组分：(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)(HEPES)缓冲液、 氯化钠、乙二胺四乙酸(EDTA)、β甘油磷酸酯、和蛋白酶抑 制剂、及其组合。参见，例如，Hirsch，L.R.，等，″A Whole Blood Immunoassay Using Gold Nanoshells，″Anal.Chem.75，2377-2381 (2003)。许多洗涤剂适合作为裂解试剂使用。阴离子洗涤剂的代表性 实例包括，但不限于胆酸的盐、辛酸、十二烷基硫酸钠(SDS)和脱氧胆 酸。阳离子洗涤剂的代表性实例包括，但不限于十六烷基吡啶和苯扎 氯铵。两性离子洗涤剂的代表性实例包括，但不限于3-[(3-胆酰胺基 丙基)二甲氨基]丙磺酸(CHAPS)和磷脂酰胆碱。非离子洗涤剂的代表性 实例包括，但不限于毛地黄皂苷、20(聚氧乙烯失水山梨醇，单 月桂酸酯(盐))和X-100。裂解试剂还可以包括蛋白酶抑制剂， 包括但不限于抑肽酶、EDTA、亮肽素、α-巨球蛋白、胃蛋白酶抑制剂 (pepstatin)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、甲苯磺酰基-L-赖氨酸氯甲基酮 (TLCK)、和甲苯磺酰基-L-苯丙氨酸氯甲基酮(TPCK)，并且可以依赖于 特定的蛋白酶靶来选择。
适合与目前描述的主题一起使用的其它裂解试剂包括，但不限于 二硫苏糖醇、乙二醇四乙酸(EGTA)、胆酸钠、脱氧胆酸钠、NP-40、甘 氨胆酸、牛磺胆酸钠、牛磺脱氧胆酸、十六烷基三甲基溴化铵、Brij 35、 Brij 58P、N-癸酰基-N-甲基葡糖胺、Igepal CA-630、N-壬酰基-N- 甲基葡糖胺、辛基-b-D-1-硫代吡喃葡萄糖苷、Span 20、X-1 14、40、80、3-(4-庚基)苯基3-羟基丙基)二甲 氨基丙烷磺酸酯(盐)和氨基硫代甜菜碱-14。裂解试剂也可用于裂解细 胞。
本领域技术人员将意识到本领域已知的其它裂解试剂也适合与 目前描述的方法一起使用。此外，本领域技术人员将意识到裂解试剂 以有效的量与样品接触以充分地裂解样品的所有细胞内含物。该方法 的实例在实施例2中提供。
如在实施例2中所提供的，在通过SERS检测的免疫检验中，当与 不包含裂解试剂的样品相比，将裂解试剂添加到测试下的样品导致生 物样品中的生物标志物检测的更高的信号水平和/或增加的敏感性。增 加的敏感性赋予许多益处，例如″得出结果的时间(time to result)″ 可以降低，患者输出可以潜在地提高。在裂解试剂存在下观察到的较 大的拉曼信号还导致仪器成本的降低。裂解试剂可用于增加各种检验 的敏感性，包括但不限于，测流检验、酶联免疫吸附检验和表面等离 子共振检验。裂解试剂还可用于处理除了血液、血清或血浆之外的生 物样品类型，例如用于结核病检测的唾液，或用于需要生物标志物检 测的诊断的任何其它类试样。裂解试剂的单独组分可以单独或组合使 用以实现类似的效果。
I用于检测由测试下的样品发射的SERS信号的代表性仪器
现在参考图4，提供用于与目前描述的检验一起使用的代表性系 统。系统400包括光源402，其能够产生能够诱导SERS-活性颗粒中的拉 曼信号的电磁辐射。在某些实施方式中，光源402为激光，其在在某些 实施方式中为能够在近红外光谱区域操作的激光，例如发射波长约785 nm的固态二极管激光。从光源402发射的电磁辐射，例如一种或多种特 定波长的光，可由光纤404引导至透镜406a。光纤404可以为任何适合 与目前描述的系统一起使用的光学光纤。例如光纤404可以为单一光纤 404a或光纤束404b。
透镜406a将通过光纤404传输的光放大，然后引导该光通过滤光 片407a(其在某些实施方式中可以带通滤波片)到分光镜408，例如介电 分光镜。将光入射到分光镜408的部分引导至透镜406b，其将光聚焦到 样品412上，样品412包含于容器410，例如试样收集容器或检验容器。 样品412可以包括本文描述的一种或多种磁性捕获颗粒-分析物-SERS- 活性纳米颗粒复合物。入射到样品412上的光能够从包括样品412的磁 性捕获颗粒-分析物-SERS-活性纳米颗粒复合物诱导SERS信号，即散射 的辐射。从样品412散射的辐射照射由透镜406b收集，并引导至分光镜 408。散射的射线的部分传输通过分光镜408，并引导至滤波片407b， 例如长通滤波片。通过滤波片407b后，散射的辐射引导至透镜406c， 其将散射的辐射聚焦到光纤414。光纤414可以为适合与目前描述的系 统一起使用的任何光学光纤。例如光纤414可以为单一光纤414a或光纤 阵列414b。光纤414将散射的辐射引导至分光光度计416，其在某些实 施方式中包括电荷耦合器件(CCD)418。
在某些实施方式中，激光用作用于检测一种或多种目的靶分析物 的入射辐射的激发源。当回顾目前描述的主题时，本领域技术人员可 以确定适合与本文所述SERS-活性报道分子一起使用的激光的类型，包 括强度和激发波长。由样品散射或发射的辐射可以使用本领域已知的 检测系统检测。
在某些实施方式中，可以使用超过一种类型的辐射源，或超过一 种的激发波长。例如，在其中要检测两种目的分析物的实施方式中， 试剂可以包括两种不同类型的SERS-活性报道分子和/或两种不同类型 的特异结合成员。在其它实施方式中，单一波长的入射辐射可用于从 两种或更多不同的SERS-活性报道分子诱导不同的拉曼光谱。然而在某 些实施方式中，不同波长的入射辐射可用于产生就各目的分析物而言 不同的拉曼信号。当回顾目前描述的主题时，本领域技术人员将意识 到，要使用的特定波长的选择依赖于目的分析物、所用的特异结合成 员、以及所用的特定SERS-活性报道分子。
目前描述的检验可以使用本领域已知的任何合适的拉曼分光光 度计系统进行，包括例如Multimode Multiple Spectrometer Raman Spectrometer(Centice，Morrisville，North Carolina，United States of America)，例如在Brady等的美国专利7,002,679描述的拉 曼分光光度计系统，将其全文引入以作参考。更具体地，使用顺磁性 颗粒的拉曼光谱检验的系统和方法公开于Carron等的美国专利申请 公开No.2006/0240572，适合与目前描述的检验一起使用的拉曼分光 光度计系统公开于Carron等的美国专利申请公开No.2005/0248758， 将其每一篇全文引入以作参考。
传感装置，例如光学检测器、照射源、和计算机系统、微处理器、 和计算机软件和算法，可以以任何组合用于实施本文描述的方法。因 此，在某些实施方式中，软件、或其它计算机可读仪器可用于解释、 分析、编译或否则解析输出与目前描述的光学检验相关的数据。软件 或其它计算机系统可用于显示、存储输出结果或将输出结果(无论以数 据或其它形式)传递给一个或多个用户。
J.在液基检验中用于放大SERS信号的方法
生物检验通常需要在各种介质中的生物分子的准确的敏感检测。 开发更敏感检验的一种方法是增加检验的输出信号。目前描述的方法 证明，在某些实施方式中，信号增强3倍或更高倍是可行的。因此，在 某些实施方式中，目前描述的主题提供用于在以上所述类型或图1中 所述的液基检验中放大输出信号的方法。
根据一种实施方式的放大方法以要添加到溶液的样品开始，所述 溶液包含磁性捕获颗粒和报道分子两者，例如但不限于包括SERS报道 分子的SERS-活性纳米颗粒，并且孵育短时间，期间可以形成包括磁性 捕获颗粒、分析物和报道分子的复合物。
在磁性捕获颗粒定位前，目前描述的主题的信号放大特性由另一 等分试样的报道分子(例如与要添加到检验溶液的第一等分试样具有 相同信号产生能力的另一等分试样的SERS-活性纳米颗粒，例如相同的 拉曼报道分子)产生。该第二等分试样的报道分子(例如第二等分试样 的SERS-活性纳米颗粒)，呈递识别在最初在检验中存在的第一等分试 样报道分子(例如SERS-活性纳米颗粒)上的抗体的抗体(或另一分子， 例如特异结合成员)。第二等分试样的报道分子的存在导致在测试下的 样品中更高数量的报道分子每三明治，因此更高的信号每三明治复合 物。
例如，如图7所示，可以将包被有抗体的SERS-活性纳米颗粒添加 到检验溶液，所述抗体识别在第一等分试样的SERS-活性纳米颗粒上的 未结合抗体。当这些第二抗体结合第一等分试样的SERS-活性纳米颗粒 时，信号水平从一SERS-活性纳米颗粒每三明治复合物上升到三。
更具体地，现在参考图7，描述了使用信号放大方法的目前描述 的检验的代表性示意性视图。目前描述的检验包括一种或多种磁性捕 获颗粒700，其与对生物样品中一种或多种目的730具有亲和力的至少 一种特异结合成员710a相连。该检验还包括第一等分试样的能够产生 可检测信号的一种或多种报道分子720，例如一种或多种SERS-活性纳 米颗粒，其与对一种或多种分析物730具有亲和力的至少一种结合成员 710b相连。与报道分子720相连的结合成员710b可以和与磁性捕获颗粒 700相连的结合成员710a相同或不同。磁性颗粒700和报道分子720与 包括一种或多种目的分析物730的生物样品接触，并孵育一段时间以形 成磁性捕获颗粒-分析物-报道分子复合物740，例如抗体-抗原″三明 治″结构，如果一种或多种分析物730存在于生物样品中的话。
然后图7中所示的检验包括第二等分试样的一种或多种报道分子 750，其能够产生可检测信号并与至少一种特异结合成员710c相连， 所述特异结合成员710c对第一等分试样的报道分子720的特异结合成 员710b具有亲和力。第二等分试样的报道分子750可以在将样品和/ 或第一等分试样的一种或多种报道分子720设置在容器760之前、同时 或之后，设置在容器760，其中第二等分试样的报道分子750的一种或 多种报道分子与第一等分试样的报道分子720的一种或多种报道分子 相同。
将与报道分子750相连的包括磁性捕获颗粒700，分析物730， 报道分子720的三明治复合物的复合物740，暴露到磁场(未示出)以诱 导复合物740向容器760，例如检验容器或试样收集容器的定位区域移 动，以形成球团770。将球团770在例如图4所示的系统中用一种或多种 波长下的入射辐射照射，以诱导报道分子产生可检测信号，来检测生 物样品中一种或多种分析物的存在或量。
当回顾目前描述的主题时，本领域技术人员将意识到磁性捕获颗 粒700、报道分子720、报道分子750及其组合可在样品设置在其中 之前包括在容器760，或可以在样品设置在其中之前、同时或之后添加 到容器760；
依赖于检验的形式，第二等分试样的SERS标记可以在任何阶段添 加，例如与第一等分试样的SERS标记顺序地或同时，或与样品顺序地 或同时添加。同样，为了避免检验中背景噪音的大的增加，优选第二 SERS-活性纳米颗粒表面上的生物分子不识别在磁性捕获颗粒的表面 上的生物分子。在免疫检验的情况下，该特性可以通过将生物分子(例 如起源于不同物种的抗体)固定到磁性捕获纳米颗粒和SERS-活性纳 米颗粒上来实现。例如，在某些实施方式中，起始检验溶液可以包括 具有在羊中产生的抗体的磁性捕获颗粒，并且SERS-活性纳米颗粒可以 呈递在鼠中产生的抗体。如果第二等分试样的SERS-活性纳米颗粒用抗 鼠抗体标记，不发生与磁性捕获颗粒的结合。目前描述的方法方法可 以有利地用于检测任何分析物，包括DNA，条件是使用具有正交表位 (orthogonal epitopes)的两种结合伴侣。
在给定检验中增加信号输出的其它益处在于可使用较不复杂(和 较便宜)的检测系统以用于测试分析物。
现在参考图8，提供目前描述的放大策略的代表性结果。图8A 显示没有之前图1中所示放大的同源蛋白(homogenous protein)检验 的典型结合曲线。y轴为量化各样品的SERS信号水平的算法的输出。图 8B显示用与图7中所示放大步骤相同的试剂和浓度进行的检验。该图显 示当包含放大步骤时3倍或以上的信号增加。
目前描述的方法可有利地用于检测任何分析物，条件是使用具有 正交表位的两种结合伴侣。例如，在某些实施方式中，目前描述的放 大方法可用于检测多核苷酸。术语″多核苷酸″的使用不旨在将目前描 述的方法限制到包括DNA的多核苷酸。本领域技术人员将意识到多核苷 酸可以包括核糖核酸和核糖核酸与脱氧核糖核酸的组合。此类脱氧核 糖核酸和核糖核酸包括天然发生的分子和人工合成的类似物。更具体 地，术语″多核苷酸″旨在包括单数的核酸，以及复数的核酸，并且指 分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(mRNA)、质粒DNA(pDNA)或 短干扰RNA(siRNA)。多核苷酸可以为单链或双链、线性或环状的。多 核苷酸可以包括传统的磷酸二酯键或非传统的键(例如，酰胺键，例在 肽核酸(PNA)中发现)。术语″核酸″是指在多核苷酸中存在的任何一种 或多种核酸片段，例如DNA或RNA片段″。分离的″核酸或多核苷酸是 指核酸分子、DNA或RNA，其已经从其天然环境中除下。分离的多核苷 酸的实例包括在异源宿主细胞中保持的重组多核苷酸或在溶液中纯化 (部分纯或基本纯)的多核苷酸。根据本发明的分离的多核苷酸或核酸 进一步包括合成产生的此类分子。分离的多核苷酸还包括分离的表达 载体、表达构建体或其群体。″多核苷酸″还可以指如在聚合酶链反应 中的其自身扩增产物。″多核苷酸″可以包含改性的核酸，例如硫代磷 酸化、磷酸化、成环原子改性的衍生物，等等。″多核苷酸″可以是天 然发生的多核苷酸(即，在无人类干涉下存在于自然中的多核苷酸)， 或重组多核苷酸(即，仅在人类干涉下存在的多核苷酸)。虽然术语″ 多核苷酸″和″寡核苷酸″都指核苷酸的聚合物，如本文所用，寡核苷 酸在长度上典型地少于100个核苷酸。
图9提供用于多核苷酸检测的方法方法的示意性视图。现在参考 图9，目前描述的放大方法包括其上连接有捕获探针910a，例如具有 15个碱基对的捕获探针的磁性捕获颗粒900。还提供报道分子920， 例如SERS-活性纳米颗粒，其上连接有捕获探针910b，例如具有15个 碱基对的捕获探针。当与靶多核苷酸930，例如具有30个碱基对的多 核苷酸接触时，复合物940形成并且包括由靶多核苷酸分子930构成 的双链多核苷酸950以及捕获探针910a和910b组成。然后，复合物 940可以与报道分子960，例如SERS-活性纳米颗粒接触以形成复合物 980，所述报道分子960上连接有捕获探针910c，例如，和与报道分 子920连接的未结合捕获探针910b互补的捕获探针，所述复合物 980包括双链多核苷酸970，所述双链多核苷酸970包括捕获探针910b 和910c。将复合物980暴露到磁场(未示出)以诱导复合物980向容器 (例如图7所示的检验容器或试样收集容器)的定位区域移动，以形成磁 化的球团。该球团在例如图4所示的系统中用一种或多种波长的入射辐 射照射，以诱导报道分子产生可检测的信号，从而检测在生物样品中 一种或多种靶DNA的存在或量。
来自目前描述的DNA检验的数据示于图10A和10B。
K.在磁性沉降的液基检验中产生改进的拉曼参考光谱和光 谱分析
在另一实施方式中，目前描述的主题提供用于在基于拉曼光谱的 分析中产生参考光谱的方法。该方法可在本文描述类型的液体检验中 有利地与磁性颗粒偶联的纳米颗粒一起使用。为了确定样品中特定的 SERS-活性纳米颗粒的量，拉曼信号通常必须由已知量的特定SERS-活 性纳米颗粒产生。典型地，该已知信号或参考信号由溶液中特定的 SERS-活性纳米颗粒产生，因为样品处理可以简化
在某些检验系统中，例如本文描述的那些，SERS-活性颗粒与磁 性颗粒通过参与目的分析物的反应来络合。将这些结合颗粒(combined particles)通过外磁体降低到小体积(small volume)。由该球团内纳 米颗粒产生的拉曼信号可以使用之前从溶液中获得的参考信号来分 析。
然而，目前描述的主题假设，来自球团的拉曼光谱不同于来自溶 液的拉曼光谱，即使相同的单SERS-活性纳米颗粒类型包含于样品中。 如果上述参考光谱获自球团，而不是溶液，则可以获得改进的结果。 这些溶液光谱与球团光谱的差异可以在定量样品中纳米颗粒的量上引 起误差。在多因子环境中该观察尤其正确，在所述多因子环境中具有 独特拉曼信号的几种SERS-活性纳米颗粒存在于样品中。例如，未包含 于参考光谱中的样品信号内的特性可以解释为来自样品内的其它 SERS-活性纳米颗粒(参见实施例4)。
在来自溶液和球团的光谱中的差异不应大至对SERS-活性纳米颗 粒的定量有影响(参见实施例4)。当一种SERS-活性纳米颗粒以较大量 存在而另一种完全缺失时，这特别正确。在这些情况下，小误差可以 导致缺失SERS-活性纳米颗粒的假阳性结果。
根据此实施方式，拉曼光谱可以通过最小二乘拟合来分析，在该 情况下参考信号用于各潜在组分。在最小二乘拟合技术中，分析的信 号假定由光谱的线性组合组成，每一个所起的作用依照样品内特定 SERS-活性纳米颗粒的相对量而变化。不能与任何参考信号″拟合″的测 定信号内的特征可以大体上划分成背景信号。然而，如果测定信号的 特性符合任一参考信号的特征，然后拟合将指定全部信号中的某些部 分为该参考源。如果光谱受纳米颗粒的成球团影响，然后例如这些改 变将必然地导致量化上的误差。如果这些改变在参考光谱中捕获，然 后此类误差样品分析可以降低。本领域技术人员将意识到，其它多变 量分析技术，包括但不限于，偏最小二乘、主成分分析等，可以与目 前描述的方法一起使用。
在进一步的实施方式中，目前描述的主题提供分析拉曼光谱的方 法，特别是从SERS-活性纳米颗粒获得的那些，特别是在其中具有不同 拉曼光谱的颗粒用于鉴定多种分析物的多因子情况。为了确定样品中 特定SERS-活性纳米颗粒的量(具有特定SERS-活性纳米颗粒的纳米颗 粒，其产生独特的拉曼信号)，典型地在宽的波长或波数范围内记录样 品光谱，然后将其与一种或多种参考光谱比较。该比较涉及将样品光 谱与参考光谱在一致和合适的波长或波数范围内匹配。
目前描述的主题证明，由该典型比较组成的纳米颗粒组分的评估 可以基于一次比较的结果以两种方式改进(refined)。首先，由于对于 不同组分的光谱作用(spectral contributions)之间的差异可以在光 谱范围上变化，光谱内的特定范围在依赖于一次评估中的组分的相对 量的计算中可以更重地加权。其次，评估为不存在或以非常低浓度存 在的组分可以从分析中除去，并且残余的组分再次评估。在哪一种情 况，拟合精度(″拟合优度″)上的增加可以计算和评价。″拟合优度″表 示样品光谱和拟合光谱之间的差异，并且可以通过本领域已知的任何 方法确定，以及可以被报道为例如最小二乘拟合技术的残数 (residual)。这两种方法可以组合或单独应用。此外，目前描述的方 法可应用于各种SERS-活性纳米颗粒，所述各种SERS-活性纳米颗粒类 似地具有必须区分的光谱。
II.复合纳米颗粒和其使用方法
目前描述的主题提供包括本文还称为″卫星″结构的复合结构的 复合纳米颗粒，其包括与核颗粒结合的多个信号承载颗粒，例如纳米 颗粒，以及复合结构，本文称为“核-壳”结构，其包括核颗粒、围 绕核颗粒的活性材料，例如拉曼活性材料，以及围绕活性材料的一个 或多个壳，例如金属壳。目前描述的卫星和核-壳结构可用于放大或否 则增强检验例如SERS检验中的信号。
因此，在某些实施方式中，目前描述的主题提供用于进行检验的 方法，该方法包括：提供至少一种卫星结构、核-壳结构或其组合；将 卫星结构和/或核-壳结构与怀疑含有一种或多种靶分析物的样品接 触，并进行检测步骤以确定样品中一种或多种靶分析物的存在或不存 在。
更具体地，在一种实施方式中，信号增强可以通过以下实现：提 供复合结构，其具有与核颗粒(例如，微米颗粒)结合的多个信号承载 卫星(例如，纳米颗粒)，以使所得的复合卫星结构能够产生多种信号。 这样，卫星结构可以改进检验中分析物的检测，例如用于具有低浓度 分析物的样品。
根据目前描述的主题的各种方面，卫星颗粒可以是金属、半导体、 有机和/或无机纳米颗粒。类似地，核颗粒可以是磁性、二氧化硅、金 属(例如，金)或无机微米颗粒或纳米颗粒。卫星和核颗粒可以在形状 上是球形或非球形的。卫星颗粒可以使用静电、共价或范德华力与各 核颗粒结合。此外，卫星颗粒典型地包括便于检测的报道分子，例如 荧光、拉曼-活性或酶报道分子。卫星颗粒和/或至少一种核颗粒其上 可以具有与其结合的其它分子，例如抗体、核酸探针或阻断剂。
在进一步的实施方式中，目前描述的主题提供核-壳结构，其包 括核颗粒、围绕核颗粒的活性材料例如拉曼-活性材料、以及围绕活性 材料的壳，其中所述壳可以为邻接的层(contiguous layer)或多个纳 米颗粒，其优选相互极接近。核和壳材料可以相同或不同，并且可以 按需要地选自增强活性材料的光谱的材料。例如金核和金壳将在表面 增强拉曼散射应用中改进拉曼-活性材料的可检测光谱。
该方法的另外方面可以包括使用表面增强拉曼散射检测靶分析 物。可以将多个具有例如针对靶分析物的抗体的磁性、金属或半导体 珠，连同具有针对目的分析物的类似结合分子的复合结构一起引入该 检验。分析物(如果存在)变成夹心在复合结构和珠之间。珠可以通过 例如施加磁场操作，以浓缩用于通过拉曼光谱检测的多个三明治结构。 目前描述的主题的另外方面包括使多个目前描述的复合结构与细胞或 组织在使复合结构与分析物(例如，正常细胞或癌细胞)连接的条件下 接触，并且将所述结构成像。
A.卫星纳米颗粒
目前描述的主题提供微米颗粒-纳米颗粒卫星结构，在某些实施 方式中，其可用于放大或增强检验，例如SERS检验中的信号。
现在参考图14，显示根据目前描述的主题的一种实施方式的卫 星结构1400的透射电镜显微照片(TEM)。卫星结构1400包括与较大颗粒 (例如，载体)结合的多个较小颗粒(例如，信号部分)，例如与微米颗粒 1414结合的多个纳米颗粒1412。如以下更详细地描述，卫星结构1400 能够放大检验中的分析物信号。这样，卫星结构1400可以放大信号以 检测否则在例如包含较低浓度分析物的样品中不能检测的分析物。
将理解本文描述的卫星结构1400可用于检测任何数量的分析物。 术语″分析物″不旨在受限制，并且可以为任何目的分子，例如蛋白质、 核酸或代谢物。作为选择分析物可以为细胞，例如癌细胞。此外，用 于分析分析物的检验可以是均相或异相的。例如，异相检验典型地需 要通过洗涤或其它物理方法，分离检验过程的单独步骤之间的反应要 素，而均相检验不需要任何分离步骤。此外，任何所需的检验可用于 鉴定和分析所述分析物。例如，可以使用三明治免疫检验，其实例将 在本文中更详细地提供。此外，卫星结构1400可用于放大多个分析物 的信号传导事件，以便可以使用多因子检测以检测此类多种分析物。 例如，具有独特信号的(例如独特的SERS光谱)的第一卫星结构包括针 对第一分析物的抗体，并且直接与显示不同的独特信号(例如独特的 SERS光谱)的第二卫星结构混合，所述第二卫星结构具有对第二类型分 析物的特异的第二抗体。
纳米颗粒1412可以为任何合适的能够产生可检测信号的颗粒， 所述可检测信号用于检测结合事件的出现。例如，纳米颗粒1412可以 为金属、半导体、有机或无机纳米颗粒。在如图14所示的实例中，纳 米颗粒1412为金颗粒。类似地，微米颗粒1414可以为任何需要的便 于其上连接多个纳米颗粒1412的载体。例如，微米颗粒1414可以为 磁性、二氧化硅、金属(例如，金)和/或有机微米颗粒。在如图14所示 的实例中，微米颗粒为胺-官能化的二氧化硅颗粒。纳米颗粒1412典 型地能够本身提供可检测信号，例如它们可以为量子点或SERS-活性颗 粒。适合与目前描述的方法一起使用的其它颗粒对本领域技术人员是 已知的。例如，各纳米颗粒1412可以包含报道分子例如荧光、拉曼和 酶报道分子，其能够使纳米颗粒充当信号传导元件，如果纳米颗粒自 己不能这样做的话。参见，例如美国专利No.6,514,767，在此将其全 文引入以作参考。
尽管术语″微米颗粒″贯穿全文地使用，应理解微米颗粒1414可 以为比纳米颗粒1412大的任何颗粒(其中纳米颗粒定义为具有约2nm 至约200nm直径的大小)。各种技术可以用于使纳米颗粒1412与各微 米颗粒1414结合，例如使用静电、共价或范德华力。此外，纳米颗粒 1412可以使用各种连接子(例如聚合物、DNA、氨基酸、短碳链、抗生 蛋白链菌素/生物素连接等等)连接到微米颗粒1414，这允许微米颗粒 周围更高密度的纳米颗粒。连接子的长度和类型可以选择以调整连接 至微米颗粒1414的纳米颗粒1412的数目，以及纳米颗粒和微米颗粒之 间的间隔。纳米颗粒1412和/或微米颗粒1414还可以被包被(例如， 用聚合物)以控制颗粒间的相互作用。
任何数量的纳米颗粒1412可以结合至微米颗粒1414，尽管纳米 颗粒的精确数量可以通过进行的特定试验控制。例如，可以通过优化 颗粒的比和反应期间的混合条件来获得具有纳米颗粒1412相对于微 米颗粒1414的均匀和最大分布的卫星结构1400。此外，纳米颗粒1412 和微米颗粒1414可以依赖于要检测的分析物(例如形状为球形或非球 形(例如，纳米棒))，而具有各种形状和构造。例如，图14显示透射 电镜显微图像，其中纳米颗粒1412和微米颗粒1414在形状上为球 形，纳米颗粒直径40nm，微米颗粒直径1μm。此外，微米颗粒1414 在直径上可以为亚微米(例如，0.5μm)。
此外，纳米颗粒1412和/或微米颗粒1414可以用物质(例如有 机或无机化合物、聚合物、蛋白质、受体、抗体、核酸探针以及阻断 剂)标记，来增强或促进与分析物的结合事件，或促进与分析物的结合 事件，或防止不期望的相互作用。示例性的阻断剂包括白蛋白、酪蛋 白、聚乙烯醇、聚(乙二醇)和γ球蛋白。
各种检测技术可用于通过卫星结构1400检测一种或多种目的分 析物，例如荧光或拉曼光谱。为了进行该检测，在卫星结构1400和分 析物之间典型地存在至少一种结合事件(例如，通过以下所述的三明 治)。信号的放大由基于信号结合事件产生多种信号的多个纳米颗粒 1412产生，而不是产生来自该结合事件的仅一种信号的信号纳米颗粒。
图15描述根据目前描述的主题的一种实施方式的三明治检验 1500。具体地，该检验包括固定在载体1524上的抗体1522a，而卫星结 构1510也包括固定在纳米颗粗1512之一上的抗体1522b。尽管该具体 实施方式描述抗体1522b通过纳米颗粒1512偶联到卫星结构1510， 应理解在某些实施方式中，其可以有利地将抗体1522b连接到载体微米 颗粒1514。分析物1516在抗体1522a，1522b之间捕获，其导致结合 事件。卫星结构1510便于产生多个由各纳米颗粒1512的信号传导事 件导致的可检测信号事件，其导致分析物1516和捕获分析物的纳米颗 粒1512之间的结合事件的放大。应理解在载体(support)1524上的抗 体1522a和卫星结构1510上的抗体1522b不需要相同。
图16A描述根据目前描述的主题的另一实施方式的三明治检验 1600。检验1600包括包含检验容器1628，检验容器1628包含多个卫 星结构1610、分析物1616和珠1630。珠1630可以为能够被磁场吸引的 磁性、半导体或金属材料，或否则可以为便于例如通过重力或离心分 离/富集的结构。依赖于卫星颗粒1610和分析物1616的数量，可以 存在任何数量的珠1630，珠可以为能够在珠和卫星结构之间夹心分析 物的任何大小和构造。例如，根据一个示例性实施方式，其不旨在限 制，三明治检验1600可以包括约1,000至100,000个珠1630，约1,000 至100,000个卫星结构1610每检验，以及约50至10,000个纳米颗粒 1612每微米颗粒1614。此外，珠1630其上可以设置物质例如抗体、 核酸探针、阻断剂等等。
分析物1616可被捕获或夹心在卫星结构1610和珠1630之间。 在这点上，分析物1616可以与各卫星结构1610的纳米颗粒1612连 接，而珠1630可以与分析物连接，以使分析物夹心在纳米颗粒和珠之 间，导致结合事件。使多种分析物1616被捕获一段预定时间后，磁场(例 如通过永磁体或电磁体提供)可以施加到检验1600，其在特定位置，例 如检验容器1628的底部将夹心的分析物1616浓缩为浓缩的球团 1632，如图16B所示。依赖于施加的磁场的方向，球团1632可以在检验 容器1628的底部或一侧形成。然后可以分析球团1632以通过由卫星结 构提供的信号确定分析物1616的存在。由各卫星结构1610产生的信号 通过如上所述多个纳米颗粒1612的存在而增强。表面增强拉曼散射 (SERS)可用于检测来自包含拉曼-活性材料的卫星结构1610的信号。
目前描述的主题的进一步实施方式涉及细胞成像，其中卫星结构 1610可以用于促进细胞的分析。使用分析细胞的传统技术，受限数量 的颗粒能够连接到细胞，例如癌细胞，以促进用于鉴定正常细胞或癌 细胞的细胞的成像。例如，其上连接有十个表面标志物的细胞将仅能 够与十个纳米颗粒结合，因此仅存在与十个表面标志物对应的十个信 号传导事件。通过使各自具有多个纳米颗粒的卫星结构1610与细胞连 接，可以通过各卫星结构与细胞的结合产生多个信号传导事件。例如， 继续上述实施例，可以存在十个卫星结构1610，每一个卫星结构都包 括十个纳米颗粒1612，此类信号由100个纳米颗粒产生，这样将各独 立的结合事件放大10倍。同样地，信号传导事件的放大可以增强使用 细胞成像的细胞的鉴定。如上讨论，卫星结构1610可以用例如抗体涂 层标记，以促进结合事件。卫星结构1610的大小可以定制，以能够通 过优化与纳米颗粒1612连接的微米颗粒1614的大小来用最大化数量 的纳米颗粒1612装饰细胞。这样，如果微米颗粒1614非常小，仅少量 的纳米颗粒1612可以连接至其。另一方面，如果微米颗粒1614非常 大，仅少数卫星结构1610可以与细胞结合。
B.复合核-壳纳米颗粒
在某些实施方式中，目前描述的主题提供复合颗粒，本文也称为 “核-壳”结构，其包括核颗粒，围绕核颗粒的活性材料，例如拉曼- 活性材料，以及围绕活性材料的一个或多个壳，例如金属壳，其在某 些实施方式中可用于放大或增强检验，例如SERS检验中的信号。
现在参考图17，复合结构1700包括核1702，围绕核的活性材料， 例如拉曼-活性材料1704，以及围绕活性材料的连续壳1706。典型地 外壳1706为20nm厚或以下。在一特定实施方式中，核1702为直径约20 至约200nm的金核，壳1706也是金并具有2至20nm的厚度，活性 材料为拉曼-活性材料例如反式-1，2-双(4-吡啶基)乙烯(SPE)。此外， 薄的＜5nm的二氧化硅层可设置在壳1706下的拉曼-活性材料上。二氧 化硅的优点在于某些情况促进金壳的装配。作为选择，双功能分子可 用于促进金与拉曼-活性材料的结合。金为有利的金属在于提供表面增 强拉曼散射，但是金属例如银和铜(或任何此类金属的合金)也是可用 的。
在核-壳复合结构的进一步实施方式中，核-壳结构与图17类似， 但是具有由纳米颗粒制成的壳，其典型地具有等于或小于核的大小。 在一种此类实施方式中，核为直径约20nm至约200nm的金核，活 性材料为拉曼-活性材料例如反式-1，2-双(4-吡啶基(pyrridyl))乙烯 (BPE)，纳米颗粒也是金并具有约2nm至核的大小的直径。此外，薄的 ＜5nm的二氧化硅层可设置在纳米颗粒下的拉曼-活性材料上。作为选 择，双功能分子可用于促进金与拉曼-活性材料的结合。金为有利的金 属在于提供表面增强拉曼散射，但是金属例如银和铜(或任何此类金属 的合金)也是可用的。
应理解图14-17所示和以上所述的实施方式不旨在受限制。具体 地，目前描述的主题的卫星和核/壳结构可以在各种检验中使用以增强 分析物信号，例如均相检验或测流检验。单一检验使用两种类型的颗 粒也是可行的。纳米颗粒1512和微米颗粒1514的大小、数量、材 料和构造壳依赖于要鉴定的分析物1516以及信号传导事件的所需放 大而变化。类似地，对于核/壳结构1700，大小、材料和厚度可以适合 特定的检验或环境。
正如指出的，目前描述的主题的特别有利的应用在于表面增强拉 曼散射。当两种金属纳米结构极接近时，发生来自两种结构的等离子 场(plasmonic fields)的电磁耦合，产生大的电磁场增强。当拉曼活 性分子置于增强的电磁场时，来自所述分子的拉曼信号的强度，显示 比所述分子在分离的纳米颗粒上的信号增加几个数量级。传统地，本 领域技术人员已经尝试聚集多个金属纳米颗粒，但是此类聚集是困难 的并且极大地不可控制。然而目前描述的主题能够以更有利的方式提 供所需的电磁耦合。
此外，不限制到任何特定的理论，相信两种相互作用的等离子结 构(核和壳或核和卫星)将允许调整出现复合结构的表面等离子共振下 的波长。预期该调整连同激发激光的波长进一步增强来自复合结构的 拉曼信号，由此增加任何检验的敏感性。
目前描述的主题的复合结构可以由任何合适的技术制造。例如， 以下专利文献提供纳米颗粒形成上的描述，包括二氧化硅涂层：美国 专利Nos.6,548,168和6,514,767以及美国专利申请公开No. 2001/0002315，在此将其全文引入以作参考。用于形成和操作金属颗 粒的其它方法对本领域技术人员是已知的。
除了如上讨论的球形颗粒外，其它构造也是可行的，例如棒状或 其它加长形状的颗粒，并且核包括多个颗粒。
III.样品管及其使用方法
该样品管及其使用方法可与任何目前描述的颗粒或检验方法一 起使用。
A.通常的样品收集容器
在某些实施方式中，样品容器选自以下：比色皿(cuvette)，试 管，通常例如血液收集管，检验容器，或任何其它与测试下的样品和 SERS测定相容的样品收集容器。在某些实施方式中，样品收集容器， 例如试管，可以具有比周围环境大气压低的内压。此类样品收集容器 公开于Cohen的美国专利Nos.5,860,937；Carroll等的5,906,744； 以及Augello等的6,821,789，在此将其每一篇全文引入以作参考。此 外，在某些实施方式中，样品收集容器包括包含目前描述的SERS-活性 纳米颗粒的检测试剂。在此类实施方式中，在用户，例如患者或医疗 技术人员收集要检测的生物样品，例如血液之前，样品收集容器在其 中设置检测试剂。该检测试剂，例如可以固定在样品收集容器的内表 面，例如内壁上，或否则简单地设置在样品容器内。
样品收集容器，例如血液收集管，可以与设置在其中的检测试剂 一起运送给用户。作为选择，用户可以选择合适的检测试剂并在收集 样品试样前将检测试剂引入收集装置。此外，目前描述的主题可以包 括试剂盒，其包括一个或多个样品收集容器，例如血液收集管，一种 或多种试剂，例如一种或多种检测试剂，其包括其上连接有SERS-活性 报道分子的纳米颗粒、磁性捕获颗粒及其单独组分。此类试剂盒可以 包括任何数量的检验组分，包括但不限于或者与纳米颗粒连接或者单 独包装的多种报道分子或多种特异结合成员。
B目前描述的样品收集容器
在传统的免疫检验中，抗原的检测可以通过在两个抗体之间″夹 心″所述抗原来发生，其中一个抗体被光学的或比色的报道子 (colorometric reporter)标记。然后测定的光信号可用于确定在样品 中存在的抗原的浓度。传统的酶联免疫吸附检验(ELISA)免疫检验为该 类型技术的实例。
磁性捕获检验包括用靶-特异性物质，例如配体或抗体，包被小 的磁学上易感的颗粒，例如在大小上范围从几百纳米至几十微米的微 珠。将颗粒引入包含靶实体，以及不想要的分子的溶液的孔。靶实体 然后与磁性颗粒上的涂层结合。细胞，蛋白质、核酸序列等为靶实体 的实例。将磁体置于孔附近以施加磁场到孔和溶液。
将包括与颗粒结合的靶实体的磁性颗粒，吸引到磁体。磁体提供 足以以有利的方式累积所述颗粒的磁力。依赖于磁体的布置，颗粒可 以在孔的底部或侧壁收集。需要均匀的颗粒分离轮廓(separation profile)，例如其中珠均匀地在各孔的基部周围分布以产生″平坦轮廓 ″，或其中颗粒同样地被拉向孔的一侧的轮廓。
在另一检验形式中，使用表面增强拉曼散射(SERS)报道子(光信 号)的磁性捕获检验通过在SERS-标记的纳米标记和磁性捕获颗粒之间 形成抗原介导的复合物来产生。再次参考图1，描述了磁性捕获SERS 检验的实例。使用此技术方法，光信号的量级可以依赖于磁性颗粒球 团的大小、密度和位置。
磁性颗粒球团相对于询问光学器件(interrogating optics)的 大小、密度和位置可以影响测定的光信号的量级和再现性。例如，改 变磁性颗粒的表面官能度可以改变球团的形状，这然后又可以导致显 著不同的光信号。在之前的样品分析中，试管设计成具有大的窗，检 测反应可以通过将试管保持在磁体上以将磁性颗粒吸引沉降至试管的 底部而淬灭。由于试管的窗与磁性颗粒的绝对数量相比相对大，致密 的球团可能不一致地(consistently)形成，可能需要额外的球团形成 的步骤。形成一致磁性球团的一种方法包括将磁体安装在样品管之下， 其中磁体的中心位置偏离样品管轴的中心。该方法示于图5。对于磁体 诱导球团在样品管的底部形成，其可以典型地花费仅几秒钟。典型地， 球团采取环形(torus)，其中在球团的中心发现几乎没有颗粒。使样品 管绕其中心轴旋转可以以此方式调节球团感受的磁场，以使球团变得 更致密。这样，在某些实施方式中，目前描述的主题提供可靠地形成 小且致密的磁性颗粒球团的方法。
现在参考图5，图解了通过使在偏心安装的磁体上的样品管旋转 的可靠的球团形成过程。图5A显示样品管500和磁体510的侧视图。 如图5A所示，将磁体510(例如，棒)安装在样品管500下，其中磁 体的中心偏离样品管轴的中心(图5A中虚线所示)。容器500和磁体 510的俯视图示于图5B，其中磁体510的顶部用横截面区域520表示。 在本文所述类型的液基检验中，对于磁体510诱导球团在样品管500的 底部形成，其可以典型地花费短时间，例如几秒钟。典型地，球团采 取环形，其中在球团的中心发现几乎没有颗粒。图5C显示环形球团530 的形成的俯视图。磁体510的横截面区域520可以通过球团530的中心看 到，其几乎不包含颗粒。目前描述的主题提供，使样品管500绕其中心 轴旋转调节球团530感受的磁场，以此方式使球团530变得更致密。现 在参考图5D，显示在使样品管500绕其中心轴旋转后形成的致密球团 540的俯视图。
C.在使用磁性颗粒的液基检验中的球团形成
小尺寸的磁体和样品管的额外旋转可以导致更可靠且致密的磁 性颗粒球团。然而在磁体位置上，以及在旋转速度上的波动可以调节 球团位置和密度，并因此最终地可以改变测定的光信号。因此形成磁 性颗粒球团的步骤必须非常小心和熟练地进行。所以，存在对在样品 管中用于形成具有一致密度和形状的磁性颗粒球团的系统的需要，并 且这可以用更简单的过程实现。
再次参考图1和4，图解例示了磁性捕获检验和检测系统的实例。 该检验使用与磁性颗粒连接的捕获抗体。检测抗体与表面增强拉曼散 射(SERS)标记的纳米颗粒连接。捕获抗体和检测抗体各自特异性地与 靶分析物上的不同的独特表位结合。因此，可以形成在SERS-标记的纳 米颗粒和磁性捕获颗粒之间的抗原介导的复合物(S-A-M″三明治″)。 然后S-A-M三明治复合物可以通过施加磁场从样品溶液分离。磁体用于 将三明治复合物吸引至试管的底部，其中测定来自所得磁性颗粒球团 的光信号。目前描述的主题可以与该方法和技术一起使用。
使用此技术方法，光信号的量级可以依赖于磁性颗粒球团的大 小、密度和位置。磁性球团的形状不必总是一致的。例如，改变磁性 颗粒的表面官能度可以改变球团的密度和/或形状。如图5所示，另一 方法是使用安装于样品管之下的磁体。小的球团可以通过使样品管绕 其中心轴旋转而在样品管的底部形成。本文还提供用于目前描述的方 法的样品管。
现在参考图18A至18C，根据目前描述的主题的至少一种实施方 式，样品管1810可以包括具有开口端1814的细长体(elongated body) 1812，和具有封闭端1818的锥形部分1816。锥形部分1816可以在封闭 端1818处进一步包括平底1820。样品管1810可以具有中心纵轴1822， 其垂直于平底1820。尽管图18A-18C所列举的实施方式图解例示了圆 柱形的细长体1812，目前描述的主题不限于具有该形状的样品管。细 长体1812可以具有任何所需的形状，例如，三角形，正方形，多边形 例如五边形、六边形和八边形的，以及其它几何形状。细长体的形状 不是关键的。在图18A至18C中例举的锥形部分1816，也不限于圆 锥体，并且可以具有任何锥形形状，例如与细长体匹配的外部形状或 不同于细长体的形状，只要该部分为锥形的，或否则导致与细长体的 直径或尺寸相比降低的直径或尺寸。
根据各种实施方式，样品管1810可以包括具有范围从约0.1mm 至约1.25mm(例如约0.635mm)的厚度1825的壁1824。任何壁厚都是 可接受的，可以使用在此给定厚度之上或之下的壁厚。根据各种实施 方式，细长体1812可以在开口端1814处具有范围从约2.0mm至约25 mm的内径1826，如，在某些实施方式中，约2.0mm至约12mm，或 在特定的实施方式中，约10.2mm。任何内径都是可接受的，可以使用 在此给定量之上或之下的内径。同样，当使用不具有直径的几何形状 时，所述直径可以作为沿着规定空间的长度或平均长度或最长长度。 该特性应用到目前描述的主题的所有方面。
细长体1812可以向锥形部分1816逐渐变细，例如以轻微的方式， 比如以0度至约5度，例如从1度至3度的角。可以使用在此给定量之上 或之下的角度。平底1820可以具有中心轴1834，锥形部分1816可以向 中心轴1834逐渐变细。该角度可以从约10度至约50度，或从约15度至 约45度，或从约15度至40度，或从20度至30度。可以使用在此给定量 之上或之下的角度。每一情况下的角度使用中心轴1834作为基线确定。
根据各种实施方式，样品管1810可以具有任何全长1823，例如 范围从约10mm至约50mm，例如，从20至30mm，例如25.4mm。 任何全长都是可接受的，可以使用在此长度之上或之下的全长。根据 各种实施方式，样品管1810可以限定内部体积。内部体积可以范围从 约0.1mL至约50ml，在某些实施方式中，从约0.1mL至约2.0mL 或以上，或从约0.2mL至约1.5mL，例如，约1.4mL，或约0.4mL。 可以使用该范围之上或之下的量，并且这不是关键的。
根据各种实施方式，锥形部分1816可以具有任何长度，例如范围 从约2.0mm至约10.0mm，例如，约6.35mm。可以使用此长度之 上或之下的长度。根据各种实施方式，锥形部分1816可以限定任何量 的内部体积，例如范围从约10μL至约50mL，从约10μL至约5 mL，从约10μL至约1mL，从约10μL至约500μL，或从约50μ L至约400μL，例如，约200μL。内部体积可在此范围之上或之 下。
样品管1810可以包括具有内表面1826和外表面1828的平底 1820。内表面1826和/或外表面1828可以具有光学性能加工面或磨 光面。根据各种实施方式，平底1820可以具有任何厚度，例如范围从 约0.10mm至约2.0mm，或从0.25mm至约1.0mm，例如，约 0.635mm。可以使用在此量之上或之下的其它厚度。
根据各种实施方式，平底1820可以具有任何范围从约0.25mm 至约10mm，在某些实施方式中，从约0.25mm至约2.5mm，或从 约0.5mm至约1.25mm，例如，约1mm的任何内径1829。在各种实 施方式中，平底1820可以具有例如范围从约1.25mm至约25mm， 例如在某些实施方式中，约1.25mm至约6mm，以及在某些实施方 式中，约2.50mm的外径1830。
通常，对于本文提到的任何尺寸或体积，其它样品管大小和尺寸 可以是合适的。通常，可以考虑样品的类型和体积、检验的类型、试 剂的体积和/或磁性颗粒球团的所需大小。
根据各种实施方式，样品管1810可以包括限定开口端1814的边 缘1821。边缘1821可以具有任何厚度，例如范围从约0.25mm至约 1.25mm，例如约0.80mm。
根据各种实施方式，样品管1810可以进一步包括帽或封闭装置 (未示出)，其具有打开位置和用于密封开口端1814的关闭位置。在某 些实施方式中，帽可以配置成紧密地适合开口端1814。帽可以具有配 置成保护和覆盖试管开口的周长，以及帮助维持样品管的内部不含任 何污染物的大小和形状。帽可以通过将它们逆着摩擦阻力下压来密封 至样品管。封闭物可以任何形状，并且可以涉及任何封闭技术，例如 揿压装配、螺丝装配、塞子等。在某些实施方式中，帽可以通过柔性 铰链与样品管1810连接。
根据各种实施方式，样品管1810可以包括任何不与置于其中的 组分反应的材料。根据各种实施方式，该材料可对光和背景光谱的传 输具有最小影响。样品管1810可以包括玻璃、陶瓷和/或聚合材料， 例如聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、环烯烃共聚物等，或其 任意组合。样品管1810可以通过标准方法制造，例如，比如注塑或其 它模塑技术。
根据各种实施方式，样品管1810可以包括导热材料和/或包括 具有允许快速热传递的厚度的壁，所述热传递例如聚合酶链反应热循 环期间发生。
根据各种实施方式，平底1820可以包括光学质量窗。光学窗的 基本性质可以包括表面质量、厚度均匀性和/或光学纯度。光学质量涉 及最小化或无吸收和散射损失，以便能够达到所需的透射水平。光学 质量还包括光学性质，例如折射指数的均匀性。根据各种实施方式， 光学质量窗可以不具有刮痕，或具有大于λ/2或不大于λ/4的疵点 (defects)，其中λ为发射光的波长。
目前描述的主题不限制到单独的样品管。根据各种实施方式，样 品管可以包括多孔板。样品管可以包括，例如96-孔板、384-孔板或 1536-孔板。在各种实施方式中，多孔板可用于高通量应用，典型地包 括自动化系统。在此类系统中，例如，各96-孔板可以排列成8x12孔， 各384-孔板可以排列成16x24孔，各1536孔板可以排列成32x48孔。 任何排列可与目前描述的主题一起使用。
根据各种实施方式，用于在样品管中形成磁性颗粒球团的系统可 以包括样品管和与样品管相邻且在其下定位的磁体。样品管可以包括 具有密闭平底的锥形部分，该样品管能够容纳包含于其中的磁性颗粒 的体积。在某些实施方式中，磁体可以与样品管的平底相邻(例如在其 下)地定位，其中磁体能够提供足以将在体积内包含的磁性颗粒吸引到 平底，从而形成磁性颗粒球团。根据各种实施方式，样品管可以包含 设置在样品管内包括样品磁性颗粒的样品。
根据各种实施方式，样品管可以进一步包含设置在样品管内的磁 性颗粒。样品管的平底可以具有内径，并且可以形成直径或大小基本 上与内径相同(内径的10％内、5％内、1％内)的磁性颗粒球团。
根据各种实施方式，磁性颗粒可以包括顺磁性、超顺磁性和/或 铁磁性材料。磁性颗粒可以为或包含任何传统的磁性材料，并且可以 为任何大小/直径。磁性颗粒可以为任何大小，并且根据各种实施方式， 可以具有范围从约0.05微米至约5.0微米的直径，或较小或较大的直径 或长度/宽度。磁性颗粒可以包括，例如氧化铁、磁铁矿或其组合。磁 性颗粒可以包括密封的磁性颗粒，例如，包括富磁铁矿核，密封有聚 合物壳的颗粒。磁性颗粒可以包括，例如顺磁性微球，例如直径约1 微米，购自Bangs Laboratories，Inc.，Fishers，Indiana。
根据各种实施方式，磁体的表面积(例如，LxW)可以与平底的 表面积相同、更大或更小。例如，现在参考图19，磁体1940的表面 积可以大于平底1920的表面积。磁体1940可以与样品管1910的平 底1920相邻且之下定位。根据各种实施方式，磁体完全地覆盖和包围 (encompasses)平底。根据各种实施方式，磁体可以具有比平底的表 面积大的表面积，例如比其大约1％至约200％，或约3％至100％，或 约5％至50％，或约5％至25％，或约5％至15％或约1％至10％。关于表面积磁 体可以多么大上没有限制。磁体具有比平底大的表面积且包围平底， 允许样品管1910以具有相对于磁体的灵活性角度而安置，并且还产生 一致的磁性颗粒球团。
虽然图19A和19B所示的实施方式举例说明了圆形的磁体1940， 可以使用任何其它所需形状的磁体。优选地，磁体提供基本上均匀平 行的磁场，其延伸入样品管1910所占据体积的全部或部分，并且具有 朝向磁体表面的均匀梯度。磁体1940可以为三角形、正方形、矩形、 六边形、梯形、或椭圆形，或其它几何形状。
根据各种实施方式，磁体1940可以包括任何类型的外部磁场- 产生装置。磁体1940可以包括，例如，一个或多个铁磁体、铁氧磁材 料、聚合物-键合的磁体、稀土磁体、陶瓷磁体和/或电磁体，或其任 何组合。磁体可以为电磁装置。磁体1940可以包括，例如氧化铁、磁 铁矿、钆、磁钢、镍铁铝磁合金、钡-锶、钕-铁-硼、和/或钐钴合金， 或其任何组合等。磁体1940可以产生足够的磁场以将所有的磁性颗粒 吸引到平底1920，并且磁体1940可以安置成样品管1910在由磁体 1940提供的磁场的影响内。如果磁场太弱，磁性颗粒球团要么可能不 完整，要么可能花费太长以完整。根据各种实施方式，磁体可以具有 范围从约1毫特斯拉(mT)至约1特斯拉(T)的强度，或在此范围之上的强 度，例如10T。磁体可以是单件或可以是多件的，例如多个磁体以任 何构型配置(例如堆叠、彼此相邻排列等)。
磁体可以例如包在保护性壳内。根据各种实施方式，该壳可以进 一步能够接受多个样品管，并且一个或多个磁体能够在该壳上排列， 以使各样品管定位在与至少一个磁体相邻的壳内。根据各种实施方式， 可以使用多个电磁体，其中各电磁体独立地受控制，例如使用专用的 电源。
根据各种实施方式，该系统可以包括多个样品管，各样品管包括 具有封闭平底的锥形部分，并能够容纳包含于其中的磁性颗粒的体积。 该系统可以进一步包括与多个样品管相邻且在其下定位的一个或多个 磁体，其中一个或多个磁体能够提供足以将磁性颗粒吸引到各样品管 的各自平底的磁力。
如图19A所示，样品管1910可以具有纵轴1922，磁体1940可以 提供磁场1942，其基本上平行于纵轴1922排列。磁场1942可以维持 其基本上平行的排列到由样品管1910包围的体积。样品管1910和 磁体1940可以相邻地定位，以使磁场1942可以基本上沿纵轴1922排 列。此外，磁场1942的平行排列可以在整个体积稍微地变化，只要不 背离目前描述的主题。
如图19A和19B，平底1920可以包括内表面1926，磁体1940 可以提供基本上垂直于内表面1926排列的磁场1942。当穿透包含磁 性颗粒的样品管1910内的流体时，磁场1942可以维持其基本上垂直 排列，并且沿整个内表面1926具有基本上均匀的强度。
根据至少一种实施方式，在样品管中形成磁性颗粒球团的方法 中，可以提供这样的样品管，其包括具有封闭平底的锥形部分，并且 在其中限定内部体积，以及在内部体积内包含磁性颗粒。磁体可以与 平底相邻且在其下定位，其中磁体能够提供磁力，该磁力足以将磁性 颗粒吸引到平底并在平底中形成磁性颗粒球团。根据各种实施方式， 平底具有内径，磁性颗粒球团具有与内径基本上相同或比其大的球团 直径。
根据各种实施方式，磁体可以与样品管的平底相邻且在其下定 位，并且当形成磁性颗粒球团时，磁体和样品管都保持静止(例如，不 需要旋转)。根据各种实施方式，磁性颗粒球团可以在约1秒至约5分钟 或更多的时间形成在平底上，在某些实施方式中，约1分钟。
在至少一种实施方式中，可以提供多个样品管，每一样品管包括 细长体和具有封闭平底的锥形部分，以及其中限定内部体积。各样品 管可以在内部体积内包含磁性颗粒。该方法可以进一步包括将一个或 多个磁体与多个样品管相邻且在其下地定位，其中一个或多个磁体能 够提供足以将磁性颗粒吸引到各样品管的各自平底的磁力。根据各种 实施方式，提供到多个样品管的每一个的磁力在各样品管中可以基本 上相等。根据各种实施方式，可以将磁力提供给各样品管基本上相同 的时间阶段。根据各种实施方式，在时间上在基本上相同的时刻在各 样品管中磁力开始吸引磁性颗粒。
根据各种实施方式，检测信号的系统可以包括样品管，所述样品 管包括具有封闭平底的锥形部分且能够容纳包含于其中的磁性颗粒复 合物的体积。样品管可以包含能够产生可检测信号的磁性颗粒复合物 的体积。根据各种实施方式，磁体可以与样品管的平底相邻且在其下 地定位。磁体能够提供磁力，该磁力足以将包含在体积内的磁性颗粒 复合物吸引到平底，以形成磁性颗粒复合物球团。根据各种实施方式， 该系统可以包括检测器，其能够检测由在形成的球团中的磁性颗粒复 合物产生的信号。
根据各种实施方式，磁性颗粒复合物可以包括包含对靶分析物特 异的第一捕获探针的磁性颗粒，包括对靶分析物特异的第二捕获探针 的SERS-活性颗粒，以及靶分析物。磁性颗粒复合物能够产生拉曼信号。 该复合物通过磁场的施加从溶液中分离，并且测定来自所得磁性球团 的光信号。SERS-标记的纳米标记进一步描述于例如美国专利No. 6,514,767B1；美国专利No.7,192,778B2；和美国专利申请公开 No.2005/158870A1，在此将其全文引入以作参考。磁性捕获试剂和 磁性捕获检验进一步描述于例如美国专利No.5,945,281；美国专利 No.6,514,415B2；和O.Olsvik，″Magnetic Separation Techniques in Diagnostic Microbiology，″Clinical Microbiology Reviews， Vol.7，43-54(1994)，在此将其全文引入以作参考。这些方法和/ 或可以用于目前描述的主题。
根据该系统的各种实施方式，样品管可以包括包含光学窗的平 底。由磁性颗粒复合物产生的信号可以通过该光学窗检测。该信号可 以为例如拉曼信号。根据各种实施方式，检测器可以包括能够询问磁 性颗粒复合物的激光。检测器可以包括，例如分光光度计和/或电荷耦 合装置。参考图4，图解说明了用于检测由磁性颗粒复合物产生的信 号的光学系统。图4中的系统可以与目前描述的主题的样品管和方法 一起使用。
根据各种实施方式，在样品中检测靶分析物的方法可以包括提供 样品管，所述样品管包括具有封闭平底的锥形部分，和容纳包含于其 中的磁性颗粒复合物的体积。磁性颗粒复合物可以包括靶分析物和能 够产生可检测信号。该方法可以进一步包括将磁体与平底相邻且在其 下定位，其中所述磁体能够提供磁力，该磁力足以将包含在样品管内 的磁性颗粒复合物吸引到平底，并形成磁性颗粒复合物球团。根据各 种实施方式，磁性颗粒复合物球团可以形成在平底上。根据各种实施 方式，可以检测和分析由磁性颗粒复合物球团产生的信号，以确定靶 分析物的存在或不存在。在某些实施方式中，可以确定所述分析物的 定量和/或鉴定。
根据该方法的各种实施方式，可以提供多个样品管。各样品管可 以包含包括靶分析物的磁性颗粒复合物的体积。该方法可以进一步包 括定位一个或多个磁体，以使提供给多个样品管的每一个的磁力可以 在各样品管中基本上相等。根据各种实施方式，磁力可以提供给各样 品管基本上相同的时间阶段。根据各种实施方式，磁力可以在时间上 在基本上相同的时刻开始吸引在各样品管中的磁性颗粒复合物。
根据该方法的各种实施方式，磁性颗粒复合物可以包括包含对靶 分析物特异的第一捕获探针的磁性颗粒，包括对靶分析物特异的第二 捕获探针的SERS-活性颗粒，以及靶分析物。磁性颗粒复合物的实例描 述于图1。根据各种实施方式，靶分析物可以包括第一表位和与第一表 位不同的第二表位。第一捕获探针可以包括与第一表位特异性结合的 第一部分，并且第二捕获探针可以包括与第二表位特异性结合的第二 部分。因此，可以形成″三明治″复合物。根据各种实施方式，磁性颗 粒复合物可以能够产生拉曼信号。
在至少一种实施方式中，将包括对靶分析物特异的第一捕获探针 的磁性颗粒，包括对靶分析物特异的第二捕获探针的SERS-活性颗粒， 以及要分析的样品引入样品管。进一步提供合适的条件以允许磁性颗 粒复合物形成。例如，可以形成例如图1中所示的″三明治″复合物的 磁性颗粒复合物。根据各种实施方式，该方法可以包括多个样品管。 可以安置一个或多个磁体以便在时间上在基本上相同的时刻基本上相 等的磁力可以提供给各样品管。根据各种实施方式，磁性颗粒复合物 形成可以被等效地淬灭。目前描述的主题可以使用光源，例如激光， 以询问磁性颗粒复合物。样品管可以包括光学窗，并且信号可以通过 该光学窗检测。信号可以使用分光光度计和/或电荷耦合装置来检测。
这样，使用目前描述的主题，适合磁性捕获检验的磁性球团可以 用更简单地过程实现，该过程优选包括不旋转试管和/或磁体以完成用 于检测目的(例如SERS或其它检测技术)的磁性球团。一致均相和/或可 再现的测试可以使用目前描述的主题实现，以便在样品管形成可再现 的磁性球团，该磁性球团具有对本文所述检测目的而言充分的所需特 征和参数。使用目前描述的主题，磁体和样品管的排列不是关键的， 可以获得一致均相和/或可再现的磁性颗粒复合物，其能够产生用于检 测目的的可检测信号。在一些过去的检测系统中，磁体的排列是重要 的，其中如果排列不合适，磁性颗粒将不以用于检验目的而言充分的 一致和所需的方式形成。
使用目前描述的主题，另一优点在于目前描述的主题实现都在同 一时间(例如，10分钟内，5分钟内，1分钟内，30秒内，15秒内，等) 淬灭的能力。样品管的设计允许淬灭在基本上同一时间发生，以使三 明治化(sandwiching)淬灭并且抗体反应停止，其允许实现具有所需含 量的更好的磁性颗粒复合物，以旨在实现准确、完整和可再现的使用 SERS的检验等。
参考图20，显示甲状腺-刺激激素(TSH)检验的结果。该检验使 用根据目前描述的主题的实施方式的样品管进行。该检验一式三份地 进行，并显示所得的结合曲线。获得的最低检测限(MDL)和可靠检测限 (RDL)至少和使用之前的样品管设计典型地观察到的同样良好。
IV代表性的目的靶分析物
目前描述的方法可用于评估或测定在生物样品中一种或多种靶 分析物的存在或量。如本文所用，术语″分析物″，通常是指要检测的 物质，其可存在或怀疑存在于测试样品中。更具体地，″分析物″可以 为对于其存在天然发生的特异结合伴侣(例如结合蛋白或受体)，或对 于其可以制备特异结合伴侣的任何物质。因此″分析物″为可以在检验 中结合一种或多种特异结合伴侣的物质。在某些实施方式中，分析物 可以为要检测或测定的任何化合物，例如代谢物，并且其具有至少一 个结合位点。
靶分析物可以为任何分子或化合物，其中存在或量要在测试下的 样品中确定。可以通过目前描述的方法测定的分析物的种类的实例包 括，但不限于，氨基酸、肽、多肽、蛋白质、碳水化合物、脂肪酸、 脂质、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸、糖蛋白，例如前列腺特异性抗 原(PSA)、蛋白聚糖、脂蛋白、脂多糖、药物、药物代谢物、小的有机 分子、无机分子和天然或合成的聚合物。靶分析物的实例包括但不限 于，葡萄糖、游离脂肪酸、乳酸、C-反应蛋白和抗炎症介质，例如细 胞因子、类二十烷酸(eicosanoids)或白三烯。在某些实施方式中，靶 分析物选自脂肪酸、C-反应蛋白和白三烯。在另一实施方式中，靶分 析物选自葡萄糖、乳酸和脂肪酸。
更具体地，在某些实施方式中，如上文所述，分析物可以包括葡 萄糖、前列腺特异性抗原(PSA)、肌酸激酶MB(CKMB)同工酶、心肌肌 钙蛋白(cTnI)、甲状腺-刺激激素(TSH)、流感A(Flu A)抗原、流感B (Flu B)抗原和呼吸道合胞病毒(RSV)抗原。
前列腺特异性抗原(PSA)为由前列腺的细胞产生的蛋白，并且典 型地少量存在于正常人的血清中。在患有前列腺癌或其它前列腺疾病 的人中PSA可以升高。认为正常的PSA血液水平典型地为约0.0至4.0 ng/mL，而4至10ng/mL(纳克每毫升)的PSA水平认为是可疑的。
肌酸激酶(CK)、也称为磷酸肌酸激酶或肌酸磷酸激酶(CPK)为主 要在心脏、脑和骨骼肌中发现的酶。肌酸激酶包括三种在结构上稍微 不同的同工酶：CK-BB(也称为CPK-1)集中在脑和肺；CK-MB(也称 为CPK-2)发现主要在心脏中；CK-MM(也称为CPK-3)发现主要在骨 骼肌中。用于特定同工酶的CPK诊断测试典型地当总CPK水平升高时进 行，并且可以帮助区分受损组织的来源。例如，脑的损伤，例如中风， 或肺的损伤，例如肺栓塞，可以与CK-BB的水平升高有关。此外，在健 康受试者中CK-MM正常地负责几乎所有的CPK酶活性。当该特定酶升高 时，其通常指示骨骼肌的受损或胁迫。
CK-MB水平可以在患有胸痛的受试者中测定以诊断他们是否具有 心脏病发作和/或作为心脏病发作期间心肌受损的指示。典型地，在心 脏病发作后首个2至3小时内CK-MB值显示CK-MB值的显著升高。如果对 于心肌没有进一步的损伤，水平峰值出现在12-24小时，并在组织死亡 后12-48小时返回正常。CK-MB水平通常不随由心绞痛、肺栓塞(肺中的 血凝块)或充血性心力衰竭引起的胸痛而上升。升高的CK-MB水平还可 以在遭受以下疾病的受试者中观察到：心肌炎(例如由病毒引起的心肌 的炎症)、电损伤、心脏损伤、心脏除颤和开心手术。在此类检验中测 定的血液血清CK-MB值典型地范围从约0.0至约10ng/mL。CK-MB值 高于约5ng/mL典型地确认为心肌梗塞的诊断。
心肌肌钙蛋白I(cTnI)也是主要心脏事件的独立预测因子。参见， 例如.Polancyzk.C.A.，等.″Cardiac troponin I as a predictor of major cardiac events in emergency department patients with acute chest pain，″J.Am.Coll.Cardiol，32，8-14(1998)。在 怀疑患有心肌梗塞的受试者中测定的血液血清中的cTnI值范围从约 0.4ng/mL至约1.5ng/mL。然而同作者的具有0.1ng/mL的较低检 测限的cTnI检验具有对检测心脏损伤更敏感的潜力。
甲状腺-刺激激素(TSH)由脑垂腺前叶中的促甲状腺细胞 (thyrotrope cells)合成和分泌，其调节甲状腺的内分泌功能。TSH 水平在怀疑患有甲状腺激素的过量(甲状腺机能亢进)或缺陷(甲状腺 机能减退)的受试者的血液中测试。成人中正常的TSH水平范围从约0.4 毫-国际单位每升(mIU/L)至约4.5mIU/L。目前的TSH检验包括用于测 定血液血清或血浆中TSH的三明治ELISA，其中样品中的TSH被抗-TSH 单克隆抗体结合，然后通过分光光度法或比色法检测。
目前描述的检验还用于检测流感病毒。存在三种类型的流感病 毒：甲型流感病毒；乙型流感病毒；和丙型流感病毒。甲型流感(Flu A) 和丙型流感(Flu C)感染多个物种，而乙型流感(Flu B)几乎专门地 感染人类。甲型病毒是三种流感中最有毒性的人类病原体，并且典型 地引起最严重的疾病。甲型流感病毒可以基于对这些病毒应答的抗体 再分为不同的血清型，并包括H1N1(即，″西班牙流感″)；H2N2(即，″ 香港流感″)；H5N1(即，鸟类流感菌株或″鸟流感″)；H7N7；H1N2； H9N2；H7N2；H7N3和H10N7。乙型流感几乎为专门地人类病原体，比甲 型流感不常见，仅包括一种血清型。丙型流感病毒感染人类和猪，并 且可以引起严重的疾病和局部流行，但比其它类型更不常见。
对于流感有用的诊断测试包括快速免疫检验、免疫荧光检验、聚 合酶链反应(PCR)、血清学和病毒培养。免疫荧光检验需要使用荧光- 标记的抗体将固定在显微镜载玻片上的试样染色，以通过荧光显微镜 观察。培养方法使用在细胞培养中的起始病毒分离，然后血细胞吸附 抑制、免疫荧光或中和检验以确认流感病毒的存在。诊断流感感染的 抗原检测检验包括DIRECTIGENTM EZ Flu A或DIRECTIGENTM EZ Flu A+B测试试剂盒，(购自BD Diagnostic Systems，Sparks， Maryland)。此类快速色谱免疫检验可用于直接检测来自症状患者的鼻 咽洗涤物/抽出物、鼻咽拭子和喉拭子的甲型流感或甲型和乙型流感病 毒抗原。此外，此类诊断测试可用于区分甲型流感和乙型流感。
呼吸道合胞病毒(RSV)是婴儿和1岁之下的儿童中细支气管炎和 肺炎的最常见起因。RSV为反义包膜RNA病毒。RSV感染的诊断可以通过 病毒分离、病毒抗原的检测、病毒RNA的检测、血清抗体上升的证实、 以及这些方法的组合来进行。用于检测呼吸道病毒的传统方法包括细 胞培养和直接荧光抗体(DFA)。酶免疫检验(EIA)和快速的手动系统对 于特定病毒例如流感A/B和RSV是可利用的。目前，大多数临床实验室 使用抗原检测检验以诊断RSV感染，例如DIRECTIGENTM EZ RSV test (购自BD Diagnostic Systems，Sparks，Maryland)，其为用于在怀 疑具有病毒性呼吸道感染的受试者的的鼻咽洗涤物、鼻咽抽出物、鼻 咽拭子和鼻咽拭子/洗涤物中，直接和定量检测RSV抗原的快速色谱免 疫检验。
因此，在某些实施方式中，目前描述的主题提供用于检测生物样 品(例如血液血清)中靶分析物的存在或量的方法，其中靶分析物包括 葡萄糖、前列腺特异性抗原(PSA)、肌酸激酶MB(CKMB)同工酶、心肌 肌钙蛋白I(cTnI)、甲状腺-刺激激素(TSH)、甲型流感(Flu A)抗原、 乙型流感(Flu B)抗原和呼吸道合胞病毒(RSV)抗原，该方法包括使生 物样品与试剂接触，所述试剂包括具有与其相连的至少一种特异结合 成员的一种或多种SERS-活性纳米颗粒，以及至少一种SERS-活性报道 分子，所述特异结合成员对于分析物，例如目的分析物的特异结合蛋 白或单克隆抗体或多克隆抗体具有亲和力；用某一波长下的入射辐射 照射生物样品以诱导SERS-活性报道分子产生SERS信号；和测定SERS 信号以检测生物样品中的分析物的存在或量。
如本文所用，术语″碳水化合物″包括，但不限于单糖、二糖、低 聚糖和多糖。″碳水化合物″还包括，但不限于，包括碳、氢和氧但不 落入传统糖定义的分子，即包含至少3个碳原子的直链多羟基醇的醛或 酮衍生物。这样，例如，本文所使用的碳水化合物可以包含低于3个碳 原子。
如本文所用的术语″脂肪酸″，包括所有脂肪酸，包括游离脂肪酸 (FFA)和酯化成其它分子的脂肪酸。具体脂肪酸的实例包括，但不限于 棕榈酸酯(盐)、硬脂酸酯(盐)、油酸酯(盐)、亚油酸酯(盐)和花生四 烯酸酯(盐)。本文按照本领域已知的含义使用术语″游离脂肪酸″，即 FFA不是其它分子，例如甘油三酯或磷脂的部分。游离脂肪酸还包括结 合到或吸附到白蛋白上的未酯化的脂肪酸。如本文所用，术语″未结 合的游离脂肪酸″(未结合FFA)用于表示未结合到或吸附到白蛋白或 其它血清蛋白的游离脂肪酸。
如本文所用，术语″脂质″按照本领域通常的含义使用，即为主要 或排他地由非极性化学基团构成的生物来源的物质，因此其在大多数 有机溶剂中易溶，但在水性溶剂中仅微溶。脂质的实例包括，但不限 于，脂肪酸、甘油三酯、甘油磷脂、鞘脂、胆固醇、类固醇及其衍生 物。例如，″脂质″包括但不限于，神经酰胺，其是鞘脂的衍生物和神 经酰胺的衍生物，例如鞘磷脂、脑苷脂和神经节苷脂。″脂质″还包括， 但不限于，常见种类的甘油磷脂(或磷脂)，例如磷脂酸、磷脂酰乙醇 胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油等。
如本文所用，″药物″可以为已知的药物或对特定细胞类型的活性 或作用尚未知的候选药物。″药物代谢物″为化学变化成另一化合物的 任何副产物或分解产物。如本文所用，″小有机分子″包括，但不限于， 不精确符合本文强调的其它分类的有机分子或化合物。更具体地，如 本文所用的术语″小有机分子″，是指具有相对低分子量和不是蛋白 质、多肽或核酸的有机化合物，无论是天然发生或人工创造(例如，通 过化学合成)的。典型地，小分子具有低于约1500g/mol的分子量。同 样，小分子典型地具有多个碳-碳键。
此外，在某些实施方式中，目前描述的主题提供检测一种或多种 核酸的方法，所述核酸例如脱氧核糖核酸(DNA)、DNA片段、核苷酸、 多核苷酸、寡核苷酸等。通常，该方法使一种或多种核酸、DNA片段、 核苷酸、多核苷酸、寡核苷酸与目前描述的其上连接有寡核苷酸的 SERS-活性纳米颗粒接触，并且检测其存在或在SERS光谱上的改变。 在示例性的实施方式中，与目前描述的SERS活性纳米颗粒连接的寡核 苷酸具有与靶核酸、DNA片段、核苷酸、多核苷酸或寡核苷酸的部分序 列互补的序列。可检测的SERS光谱，和/或在SERS光谱上的改变可以 作为连接在SERS活性纳米颗粒的寡核苷酸和靶核酸、DNA片段、核苷 酸、多核苷酸或寡核苷酸杂交的结果观察到。
目前描述的SERS-活性纳米颗粒、寡核苷酸或二者同时可以被官 能化以将寡核苷酸连接到纳米颗粒。此类方法在本领域是已知的，例 如在3′-末端或5′-末端用烷烃硫醇官能化的寡核苷酸容易与纳米颗 粒，包括金或其它金属纳米颗粒连接。参见，例如，Whitesides， Proceedings of the Robert A.Welch Foundation 39th Conference On Chemical Research Nanophase Chemistry，Houston，Tex.，pp. 109-121(1996)；还参见.Mucic等.Chem.Commun.555-557(1996) (描述了一种将3′巯基DNA连接到平的金表面的方法，其还用于将寡核 苷酸连接到纳米颗粒)。
适合将寡核苷酸连接到固体表面的其它官能团包括硫代磷酸酯 (盐)基团(参见，例如，Beebe等的U.S.Pat.No.5,472,881，用于 将寡核苷酸-硫代磷酸酯(盐)结合到金表面，其全文引入以作参考)， 取代烷基硅氧烷(参见，例如.Burwell.Chemical Technology，4， 370-377(1974)和Matteucci and Caruthers.J.Am.Chem.Soc， 103，3185-3191(1981)，用于将寡核苷酸结合到二氧化硅和玻璃表面， 以及Grabar等.Anal.Chem.，67，735-743(1995)，用于氨基烷基 硅氧烷的结合和用于类似的巯基烷基硅氧烷的结合)。用5′硫代核苷或 3′硫代核苷封端的寡核苷酸也可用于将寡核苷酸连接到固体表面。
用于将寡核苷酸连接到纳米颗粒的其它方法在本领域是已知的。 此类方法描述于以下的代表性文献中。Nuzzo等.J.Am.Chem.Soc， 109，2358(1987)(在金上的二硫化物)；Allara and Nuzzo，Langmuir， 1，45(1985)(在铝上的羧酸)；Allara and Tompkins，J.Colloid Interface Sci.，49，410-421(1974)(在铜上的羧酸)；Iler.The Chemistry Of Silica，Chapter 6，John Wiley & Sons，New York(1979) (在二氧化硅上的羧酸)；Timmons and Zisman.J.Phys.Chem.，69， 984-990(1965)(在铂上的羧酸)；Soriaga and Hubbard，J.Am.Chem. Soc，104，3937(1982)(在铂上的芳香环化合物)；Hubbard，Acc. Chem.Res.，13，177(1980)(在铂上的环丁砜，亚砜和其它官能 化溶剂)；Hickman等，J.Am.Chem.Soc，111，7271(1989)(在 铂上的异腈)；Maoz and Sagiv，Langmuir，3，1045(1987)(在二 氧化硅上的硅烷)；Maoz and Sagiv，Langmuir，3，1034(1987)(在 二氧化硅上的硅烷)；Wasserman等.Langmuir，5，1074(1989)(在 二氧化硅上的硅烷)；Eltekova and Eltekov，Langmuir，3，951(1987) (在二氧化钛和二氧化硅上的芳香羧酸、醛、醇和甲氧基)；Lecetal.. J.Phys.Chem.，92，2597(1988)(在金属上的刚性磷酸酯 (盐)(rigid phosphates))。
此外，用环状二硫化物(例如具有包括至少两个硫原子的5元环或 6元环的环状二硫化物)官能化的寡核苷酸也适合与目前描述的主题一 起使用。合适的环状二硫化物可以商业上获得，或可以通过已知方法 合成。环状二硫化物的还原形式也可以使用。在某些实施方式中，环 状二硫化物可以进一步具有与其连接的连接子，例如烃部分，例如类 固醇残基。
各纳米颗粒可以具有与其连接的多个寡核苷酸。结果，各纳米颗 粒-寡核苷酸缀合物可以与具有互补序列的多个寡核苷酸或核酸结合。 制备预定序列的寡核苷酸的方法是已知的。参见，例如，Sambrook等. Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2nd ed.1989)and F. Eckstein(ed.)oligonucleotides and Analogues，1st Ed.(Oxford University Press，New York，1991)。固相合成方法可用于寡核糖 核苷酸和寡脱氧核糖核苷酸(合成DNA的已知方法也可用于合成RNA)。 寡核糖核苷酸和寡脱氧核糖核苷酸也可酶促地制备。
因此，目前描述的主题提供用于检测核酸的方法。任何类型的核 酸可以通过目前描述的方法检测。因此，目前描述的方法可用于几种 其中需要检测核酸的应用，例如，用于疾病的诊断和用于核酸的测序。 可以通过目前描述的方法检测的核酸的实例包括，但不限于基因(例如 与特定疾病相关的基因)、病毒RNA和DNA、细菌DNA、真菌DNA、cDNA、 mRNA、RNA和DNA片段、寡核苷酸、合成寡核苷酸，改性寡核苷酸、 单链和双链核酸、天然和合成的核酸等。
检测核酸的方法的应用的代表性实例包括，但不限于，诊断和/ 或监视病毒性疾病(例如，人类免疫缺陷性病毒、肝炎病毒、疱疹病毒、 细胞巨化病毒和爱泼斯坦-巴尔病毒)、细菌病毒(例如，肺结核、莱姆 病、幽门螺杆菌(H.pylori)、大肠杆菌(Escherichia coli)感 染，军团菌(Legionella)感染，支原体(Mycoplasma)感染、沙门氏菌 (Salmonella)感染)、性传播疾病(例如，淋病)、遗传疾病(例如，囊 肿性纤维化、杜兴氏肌营养不良、苯丙酮尿症、镰状细胞贫血)、和癌 症(例如，与癌症发育相关的基因)；用于取证；用于DNA测序；用于亲 子鉴定；用于细胞系鉴定；用于监视基因治疗；以及用于许多其它目 的。
要检测的核酸可以通过已知方法分离，或可以直接在以下中检 测：细胞、组织样品、生物流体(例如，唾液，尿，血液，血清等)、 包含PCR组分的溶液、包含过量(large excess)的寡核苷酸或高分子量 DNA的溶液以及其它样品，这在本领域也是已知的。参见，例如， Sambrook等.Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2nd ed. 1989)以及B.D.Hames和S.J.Higgins.Eds.，Gene Probes 1 (IRL Press，New York，1995)。制备使用杂交探针检测的核酸的方 法在本领域也是已知的。参见，例如，Sambrook等.Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2nd ed.1989)以及B.D.Hames和 S.J.Higgins.Eds.，Gene Probes 1(IRL Press，New York，1995)。 如果核酸以少量存在，其可以通过本领域已知的方法应用，包括聚合 酶链反应(PCR)扩增。参见，例如，Sambrook等.Molecular Cloning： A Laboratory Manual(2nd ed.1989)以及B.D.Hame s和S.J. Higgins，Eds.，Gene Probes 1(IRL Press，New York，1995)。
用于检测核酸的一种目前描述的方法包括：使核酸与一种或多种 目前描述的其上连接有寡核苷酸的纳米颗粒接触。要检测的核酸可以 具有至少两个部分。这些部分的长度和它们之间的距离(如果有的话) 可以选择以使当纳米颗粒上的寡核苷酸与核酸杂交时，可以观察到可 检测的SERS信号。这些长度和距离可以经验地确定和依赖于所用的颗 粒类型和其大小以及在检验中所用溶液中存在的电解液的类型(在本 领域也是已知的，特定的电解液影响核酸的构象)。
同样，当核酸要在其它核酸的存在下检测时，必须选择纳米颗粒 上的寡核苷酸要结合到其的核酸的部分，以使它们包含充分地独特序 列，从而使核酸的检测是特异的。用于这样做的指南在本领域是已知 的。纳米颗粒-寡核苷酸缀合物与核酸的接触在对使纳米颗粒上的寡核 苷酸与核酸的靶序列杂交有效的条件下发生。这些杂交条件在本领域 是已知的，并且对于所用的具体系统易于优化。参见，例如，Sambrook 等.Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2nd ed.1989)。 在某些实施方式中，使用严谨杂交条件。
用于通过使用其上连接有寡核苷酸的SERS-活性纳米颗粒检测核 酸的代表性方法公开于Park等的美国专利No.7,169,556，将其全 文引入以作参考。
如本文所用，术语″样品″包括任何液体或流体样品，包括来自生 物来源的样品，例如生理体液(physiological fluid)，包括全血或全 血组分，例如血液红细胞、白细胞、血小板、血清和血浆；腹水；尿； 唾液；汗；乳；滑液；腹腔液；羊水；全脑脊髓液(percerebrospinal fluid)；淋巴液；肺栓塞；脑脊髓液；心包液；子宫颈阴道样品；组 织提取物；细胞提取物；或怀疑含有目的分析物的身体的其它组分。 除了生理体液之外，用于进行环境或食品生产检验的其它液体样品， 例如水、食品等，也适合与目前描述的主题一起使用。怀疑包含分析 物的固体材料也可用作测试样品。在某些情况下，将固体测试样品改 性以形成液体介质或以释放分析物可能是有利的。
在某些实施方式中，样品可以在使用之前预处理，例如从血液制 备血浆，稀释粘性流体等。此类处理方法可以包括过滤、蒸馏、浓缩、 使干扰化合物失活和添加试剂。
样品可以是获自受试者的任何样品。术语″受试者″是指从其可以 获得样品的有机体、组织或细胞。受试者可以包括用于医疗目的，例 如诊断和/或治疗状况或疾病的人类受试者，或用于医学、兽医目的或 发育目的的动物受试者。受试者还可以包括来自组织培养、细胞培养、 器官复制、干细胞生产等的样品材料。合适的动物受试者包括哺乳动 物和鸟类。本文所用的术语″鸟类″包括，但不限于，鸡、鸭、鹅、鹌 鹑、火鸡和野鸡。本文所用的术语″哺乳动物″包括，但不限于，灵长 类，例如人类、猴子、猿等；牛(bovine)，例如牛(cattle)、公牛等； 羊(ovine)，例如绵羊等；山羊(caprine)，例如山羊等；猪(porcine)， 例如猪(pigs)、肉猪等；马科动物(equines)，例如，马(horses)、驴、 斑马等；猫科动物，包括野生和驯养的猫；犬(canines)，包括狗；兔 形动物，包括兔(rabbits)、野兔等；和啮齿动物，包括小鼠、大鼠等。 优选地，受试者为哺乳动物或哺乳动物细胞。更优选地，受试者为人 类或人类细胞。人类受试者包括，但不限于，胎儿、新生儿、婴儿、 青少年和成人受试者。进一步地，″受试者″可以包括患有或怀疑患有 状况或疾病的患者。这样，本文术语″受试者″和″患者″可相互替换地 使用。受试者也可以指在用于活力、分化、标志物生产、表达等的测 试中在实验室或生物处理培养物中的细胞或细胞的集合。
目前描述的方法可用于诊断、用于预后、或疾病状态或状况的监 视。如本文所用术语″诊断″是指其中评估疾病、障碍或其它医疗状况 的存在、不存在、严重性或过程的预测过程。为了本文的目的，诊断 还包括用于确定由治疗导致的结果的预测过程。同样地，术语″诊断″ 是指确定样品试样是否显示状况或疾病的一种或多种特性。术语″诊断 ″包括证实例如靶抗原或与目标结合的试剂的存在或不存在，或证实， 或否则确定状况或疾病的一种或多种特性，包括类型、级别、阶段或 类似的情况。如本文所用，术语″诊断″可以包括将一种形式的疾病从 另一种中区分。术语″诊断″包括最初诊断或检测、预后，以及监视状 况或疾病。
术语″预后″及其衍生词，是指确定或预测疾病或状况的过程。疾 病或状况的过程可以基于预期寿命或生活质量确定。″预后″包括使用 或不使用治疗的疾病或状况的时间过程的确定。在涉及治疗的情况下， 预后包括确定用于疾病或状况的治疗。
如本文所用，术语″风险″是指其中评估特定后果的可能性的预测 过程。
术语″监视″，例如在″监视疾病或状况的过程″中，是指从具有或 怀疑具有疾病或状况的受试者中获得的样品的正在进行的诊断。
术语″标志物″是指分子，例如蛋白质，包括抗原，当在样品中检 测到时表征或指示疾病或状况的存在。
目前描述的主题还提供用于监视受试者中疾病状态的方法，包括 慢性疾病，例如但不限于，心脏病、冠心病、糖尿病、代谢障碍、炎 症疾病，例如类风湿性关节炎和癌症。代谢障碍可以包括，但不限于， 高血脂、血脂过少、甲状腺功能亢进和甲状腺机能减退。
此外，目前描述的方法可用于监视慢性疾病的特定标志物。通过 监视分子矫作物(molecular artifacts)、代谢物的浓度和疾病状态的 缺失和/或有益分子，可以评估受试者的进展、衰退或稳定性，可以依 次调整或因此修订治疗。例如，可以使用目前描述的生物传感器体内 监视的用于心脏病的标志物包括，但不限于总脂肪酸、乳酸酯(盐)、 葡萄糖、游离脂肪酸和各种强心剂，例如但不限于心脏糖苷 (cardioglycosides)和拟交感神经药。糖尿病的标志物包括，但不限 于，葡萄糖、乳酸酯(盐)和脂肪酸。同样地，用于冠心病的标记包括， 但不限于C-反应肽和游离脂肪酸。通常，各种代谢障碍的标记包括， 但不限于特定脂肪酸。
目前描述的SERS-活性纳米颗粒还适合在用于监视药物治疗的装 置中使用。实际上，SERS-活性纳米颗粒可以设计成特异性地结合药物、 候选药物或药物代谢物。以此方式，可以监视药物血浆浓度，并且剂 量可以基于由SERS法提供的浓度测定调整或维持。因此，药物方案可 以对于特定受试者个别地加以考虑，包括使用与药物或药物代谢物特 异且可逆地结合的SERS-活性纳米颗粒以确定药物的血浆浓度。然后由 SERS法提供的浓度可以用于确定受试者中药物的生物利用度。然后给 药给受试者的药物的剂量可以改变以增加或降低给受试者的药物的生 物利用度，以提供最大治疗益处和避免毒性。
目前描述的SERS-活性纳米颗粒还可用于同时地监视各种代谢 物，其测定可用于描述(profile)受试者的代谢或身体状态，例如剧烈 锻炼的延长期期间，葡萄糖以厌氧过程分解成乳酸。目前描述的SERS- 活性纳米颗粒可用于确定运动员的乳酸酯(盐)阀值，以最大化训练的 益处和降低恢复时间。类似地，SERS-活性纳米颗粒可用于确定士兵中 的乳酸酯(盐)阀值，以防止疲劳和虚脱，以及降低恢复时间。为此， 目前描述的SERS-活性纳米颗粒可用于锻炼或身体应激(physical stress)期间监视葡萄糖水平、乳酸水平和其它代谢物。
目前描述的SERS-活性纳米颗粒还可用于监视在急救设备中，例 如急救室或手术后恢复室或医院中患者中的状况或疾病。例如，在提 供监视受试者中葡萄糖水平的实施方式中，当监视葡萄糖水平并保持 正常时，研究已经显示死亡率在手术后患者中可以降低高达30％。这样， 目前描述的基于SERS-的诊断检验可以在其中监视葡萄糖或其它代谢 物对于受试者的恢复或综合健康是必要的情况下使用。
在测试下的样品中存在的一种或多种分析物的量可以以浓度表 示。如本文所用，术语″浓度″具有本领域的普通意义。浓度可以表示 为定性值，例如表示为指示靶分析物的存在或不存在的阴性或阳性结 果，例如″是″或″否″应答，或表示为定量值。此外，给定分析物的 浓度可以报道为相对值或绝对值，例如报道为″定量值″。目前描述的 检验，在某些实施方式中，能够检测浓度范围为约5fg/mL至约500 ng/mL；在某些实施方式中，浓度范围为约10fg/mL至约100ng/mL， 在某些实施方式中，浓度范围为约50fg/mL至约50ng/mL的目的分 析物。
分析物的定量(浓度)可以等于0，表示不存在寻找的特定分析物， 或特定分析物的浓度低于检验的检测限。测定的浓度可以为SERS信号 而没有额外的测定或操作。作为选择，测定的定量可以表达为特定分 析物的测定值相对于另一化合物(包括但不限于标准或另一分析物)的 测定值的差、百分比或比例。差可以为负，指示测定分析物的量上的 降低。定量还可表达为分析物与在时间上不同点测定的自身的差或比 例。分析物的定量可以直接从产生的信号确定，或产生的信号可用于 算法，将算法设计成将产生的信号的值与样品中分析物的定量相关。
目前描述的SERS-活性纳米颗粒能经受检验(amenable)以与能够 连续地测定一种或多种分析物的浓度的装置仪器使用。如本文所用， 与分析物的测定一起的术语″连续地″，用于表示装置在装置寿命的任 一时间产生或能够产生可检测信号。可检测信号可以是持续的，这在 于即使不检测信号装置也总是产生信号。作为选择，装置可以间断地 (episodically)使用，以便在任何所需的时间产生和检测可检测信号。
V.细胞成像
小尺寸的目前描述的SERS-活性纳米颗粒允许将纳米颗粒引入细 胞。例如已经证明了使用SERS以研究化疗剂与DNA的络合。参见Nabiev. I.R..等.″Selective analysis of antitumor drug interactions with living cancer cells as probed by surface-enhanced Raman spectroscopy，Eur.Biophys.J.，19，311-316(1991)；Morjani. H，等，″Molecular and cellular interactions between intoplicine，DNA，and topoisomerase II studied by surface-enhanced Raman scattering spectroscopy，″Cancer Res.， 53，4784-4790(1993)。SERS还用于研究针对特定癌症的化疗抗性的 机制。参见Breuzard.G.，等.″surface-enhanced Raman scattering reveals adsorption of mitoxantrone on plasma membrane of living cells，″Biochem.Biophys.Res.Comm.，320，615-621(2004)。 此外，SERS还用于表征细胞内特定化学药品的分布和用于区分细胞的 细胞质和细胞核。参见Kneipp.K.，等.″Surface-enhanced Raman spectroscopy in single living cell susing gold nanoparticles，″ Appl.Spectrosc，56(2)，150-154(2002)。
因此，在某些实施方式中，用报道分子标记的纳米颗粒可以用于 细胞成像，例如，以区分生物样品中的异常细胞(例如显示异常的细胞， 例如癌细胞)和正常细胞。在此类实施方式中，由染料产生的拉曼信号 的强度与检测的细胞的密度成比例。此外，在某些实施方式中，用报 道分子标记的纳米颗粒还可用另一物质(例如，结合伴侣的特异结合成 员，例如抗体)标记，以促进与目的细胞的结合。用于细胞成像的SERS- 活性纳米颗粒公开于美国专利申请公开Nos.2006/0054506和 2006/0046313，将其每一篇全文引入以作参考。
因此，在某些实施方式中，目前描述的主题提供用于检测样品细 胞中一种或多种靶结构的存在的方法，所述方法包括：(a)使一种或 多种样品细胞与用一种或多种结合成员标记的一种或多种SERS-活性 纳米颗粒，在适合使一种或多种结合成员与样品细胞中一种或多种靶 结构结合的条件下接触，其中SERS-活性纳米颗粒上连接有能够产生可 区分拉曼信号的报道分子；和(b)从所述样品细胞中检测一种或多种 可区分SERS信号以指示所述样品细胞中一种或多种靶结构的存在。
在某些实施方式中，目前描述的SERS-活性纳米颗粒可用于细胞 内染色微观结构。在此类实施方式中，SERS-活性纳米颗粒可以用与已 知靶微观结构或受体特异性结合的至少一种配体标记。在某些实施方 式中，可以使用一套SERS-活性纳米颗粒探针，其中该套中的各成员包 括与已知靶或受体特异性结合的配体和当与靶结合时可以产生可区分 SERS信号的一种或多种SERS-活性染料的组合。
在合适的条件下，标记的SERS-活性纳米颗粒可以与细胞内的受 体和其它微观结构特异性结合。然后″染色″细胞可以例如通过使用扫 描拉曼显微镜来成像，以确定细胞中特异受体和微观结构的存在和位 置。此外，来自与特定配体相连的个体拉曼-活性染料的SERS信号可用 于区分细胞内的特异受体和微观结构，和以形成细胞中受体和微观结 构的轮廓。根据目前描述的方法检验的靶细胞的轮廓可以与从相同类 型的正常细胞类似地获得的轮廓比较，以确定在靶细胞中异常的存在。 靶细胞可以是活的或死的。
如本文所用，术语″微观结构″包括但不限于，细胞外基质分子， 例如纤连蛋白和层粘连蛋白；细胞内结构，例如肌动蛋白纤丝和微管； 细胞核结构，例如组蛋白；等等。用于与此类纤维结构结合的合适配 体可以选自本文公开的配体，并且包括但不限于，抗体，例如抗纤连 蛋白抗体和抗肌动蛋白抗体，以及其它天然发生的配体，例如抗组蛋 白蛋白。
包含拉曼光谱信息的细胞图像可以通过本领域已知的各种方法 获得。例如，可以将显微镜耦合到电荷-耦合装置(CCD)照相机，以便 可以获得样品的完整图像。典型地，在此类实施方式中，波数(或波长) 滤波装置，例如单色仪或液晶可调滤波器，可以插在样品和CCD照相机 之间。在任何一时间滤波装置仅允许窄带宽的散射辐射到达CCD照相 机。多幅图像可以通过CCD照相机采集，其中各图像覆盖特定范围的散 射辐射。来自图像中各点的光谱可以用软件组装(assembled)。作为选 择，来自图像单个点的光可以分散通过单色仪，并且该点的完整光谱 可以在阵列探测器上获得。可以扫描样品以使图像中各点分别地获得。 然后拉曼图像在软件中组装。在另一方法中，可以构建用辐射的线激 发样品的的线扫描仪器。该线在空间上沿着CCD照相机的一条轴成像， 同时沿着正交轴光谱上地分散。照相机的各读出获得线中各空间像素 的完整光谱。为了完成图像，将线扫描越过样品。适合成像的拉曼仪 器的实例描述于Talley，等.，″nanoparticle Based Surface-Enhanced Raman Spectroscopy，″NATO Advanced Study Institute：Biophotonics，Ottawa，Canada(January 6，2005)。
在某些实施方式中，可以将目前描述的SERS-活性纳米颗粒通过 主动摄入机制引入细胞或组织。用于将纳米颗粒引入细胞的另一机制 为通过使用小肽，其可以与细胞表面的吞饮受体结合，并且将纳米颗 粒通过胞吞作用拉入细胞。参见，Tkachenko，A.G.，等，″Cellular trajectories of peptide-modified gold particle complexes： comparis on of nuclear localization signals and peptide transduction domains，″Bioconjugate Chem.，15，482-490(2004)。 此外，SERS-活性纳米颗粒可以通过以下引入细胞：显微注射、转染、 电穿孔和胞吞作用-介导的途径，包括使用两性肽，例如PEP-1，使用 阳离子脂质类试剂，例如LIPOFECTAMINETM(Invitrogen Corp.， Carlsbad，California，United States of America)，以及使用胶 束和转染试剂例如转铁蛋白、甘露糖、半乳糖和Arg-Gly-Asp(RGD)， 以及其它试剂例如树枝状分子(dendrimer)类试剂SUPERFECTTM (Qiagen，Inc.，Valencia，California，United States of America)。 细胞内的间接方法可用于显示颗粒与所需的靶结合。适合证明探针特 异性的一种方法为免疫荧光，其可用于验证SERS-活性纳米颗粒的位 置。许多商业上可获得的荧光探针用于标记活细胞中的细胞内结构(例 如线粒体、高尔基体和内质网)。通过与靶向相同结构的抗体缀合，可 以确定活跃标记它们的靶的纳米颗粒的片段。同样地，可以确定非特 异性结合的纳米颗粒的百分比。验证SERS-活性纳米颗粒位置的另一途 径为使用荧光蛋白融合，例如GFP及其类似物。
在某些实施方式中，提供包括目前描述的SERS-活性纳米颗粒的 成像试剂以用于医疗诊断。目前描述的成像试剂用于通常使患者成像， 和/或特异性诊断患者中疾病组织的存在。如上文所述，通过选择纳米 颗粒核的大小、形状和组成；染料的鉴定、密封材料的组成和厚度， 如果需要，SERS-活性纳米颗粒的最佳激发和发射频率可以调整成在约 630nm至约1000nm之间出现，即用于通过组织吸收和散射的最小区域。
通过施加包括一种或多种目前描述的SERS-活性纳米颗粒的成像 试剂给细胞、组织样品，或给受试者，例如患者，然后使用本领域已 知的可以进行光谱成像的任何系统(包括但不限于点扫描共焦显微镜、 线扫描系统和光学相干层析系统)扫描细胞、组织样品，或受试者，可 以进行成像过程。在组织样品，或受试者中细胞目前描述的SERS-活性 纳米颗粒的存在还可以通过在单波长带上检测的任何成像系统，以及 包括激发光源和滤波成像检测的荧光成像系统来观察到。适合与目前 描述的SERS-活性纳米颗粒一起使用的其它成像系统公开于Tuchin.V. V..Handbook of optical biomedical diagnostics，Bellingham， Wash.，USA：SPIE Press，2002，在此将其全文引入以作参考。其它 成像方法，包括时域法，例如动态光散射光谱和层析成像、飞行时间 成像、准弹性光散射光谱、光子相关光谱、多普勒光谱和扩散波光谱 适合与目前描述的主题一起使用。所有这些技术允许区分光子，并且 其中它们已经基于它们的时间签名。因为SERS-活性纳米颗粒比荧光物 质等可以具有不同的时间签名，使用这些方法它们可以区分组织和其 它标记。可用的仪器参数还包括调节光源和时间敏感检测器。调节可 以是脉冲的或连续的。
细胞、组织样品，或受试者的扫描提供细胞、组织样品，或受试 者内部区域的光谱或图像，并可用于检测或诊断状况或疾病状态的存 在。所谓细胞、组织样品，或受试者的区域，是指完整的细胞、组织 样品，或受试者或细胞、组织样品，或受试者的特定区域或部分。当 受试者为患者时，目前描述的成像试剂可用于提供患者的内部器官， 包括脉管系统、心脏、肝和脾的图像，并且使胃肠区域或其它体腔成 像，或以其它方式对本领域，例如组织表征、血池成像等的技术人员 而言是显而易见的。
在某些实施方式中，目前描述的主题还提供在体内诊断异常病状 的方法，该方法包括将靶向参与异常病状的分子的多个SERS-活性纳米 颗粒引入与异常病状接触的体液，其中SERS-活性纳米颗粒可以变得与 参与异常病状的分子相连，并且在体内使相连的SERS-活性纳米颗粒成 像。目前描述的方法通常应用于SERS-活性纳米颗粒探针可及的任何器 官，包括胃肠道、心脏、肺、肝、子宫颈、乳房等。
在某些实施方式中，可将目前描述的SERS-活性纳米颗粒通过内 窥镜(如在结肠镜检查的情况下)，或针，或与一次性探针(tip)或套筒， 或通过胞吞作用、转染、显微注射等来引入受试者。在其它实施方式 中，SERS-活性纳米颗粒探针可以通过直接引入成像探针本身来引入。 在某些实施方式中，个体光纤、或光纤的束，可引入活有机体以用于 成像。已经证实此类方法用于使神经、脑、微脉管、细胞成像，以及 用于表征生物分布。凝胶包被的光纤在传感器文献中是已知的。目前 描述的SERS-活性纳米颗粒可以非共价地与凝胶结合，其中当引入组织 时，所述纳米颗粒扩散到组织。将SERS-活性纳米颗粒固定到光纤外表 面，以使它们可以扩散入它们接触的液相的各种其它方法，也适合与 目前描述的主题一起使用。
在某些实施方式中，目前描述的主题提供用SERS-活性纳米颗粒 标记动物的方法，该方法包括将SERS-活性纳米颗粒引入所述动物。目 前描述的SERS-活性纳米颗粒可以通过任何合适的方法引入动物，包括 但不限于，任何皮下移植法或静脉内地。SERS-活性纳米颗粒可以使用 合适的仪器检测。在某些实施方式中，目前描述的主题提供用于动物 (包括牲畜和驯养的宠物)的鉴定系统，其中SERS-活性纳米颗粒移植到 动物的皮肤(或皮)下以能够鉴定。
实施例
已经概括以下实施例以提供本领域技术人员实施目前描述的主 题的代表性实施方式的指南。按照本说明书和本领域的通常水平，本 领域技术人员可以意识到以下实施例仅旨在示例性的，并且可以使用 许多改变、改进和变化而无需背离目前描述的主题的范围。通过举例 但绝不是限制地提供以下实施例。
实施例1
使用参考标记的磁性捕获SERS检验
NanoplexTM  Biotags购自Oxonica Inc.(Mountain View， California)。该颗粒是金颗粒，具有约50nm直径，并且用选自反式 -1，2-双(4-吡喃基)乙烯(BPE)或4，4′-二吡啶基(DPY)的拉曼报道子 标记，并按照本文所述用玻璃密封。玻璃密封材料是生物素化的。磁 性颗粒(直径约1微米)购自Bangs Laboratories，Inc.(Fishers， Indiana)并用抗生蛋白链菌素标记。生物素化的BPE-和DPY-标记的 纳米颗粒的两种溶液各自与抗生蛋白链菌素包被的磁性颗粒混合。然 后将这两种溶液以7∶3的比混合，并且使用图4中所示类型的系统施加 磁场，由此在样品管的底部形成球团。然后将球团重复地破坏和再形 成，就每一球团构造(pellet configuration)测定拉曼信号，其中同 时地测定来自BPE和DPY报道子的拉曼信号。在记录的拉曼光谱中， 在1590cm-1处的峰值对应于BPE拉曼报道子，在1180cm-1处的峰值对 应于DPY报道子。
当不使用参考时，BPE报道子的信号单独提供信号可再现性的测 定。使用DPY报道子作为参考，计算BPE和DPY报道子的比例。图3 显示无参考和参考信号的比较。对于无参考信号五个循环的成球 (pelleting)和破坏的变化系数为8.4％，对于参考信号为3.8％。因此， 当使用第二报道子作为参考时，信号变化的降低减少55％。
实施例2
使用裂解试剂的磁性捕获SERS检验
使用Sulfo-SMCC(硫代琥珀酰亚胺(sulfosuccinimidyl)-4-(N- 马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(盐))将具有表面巯基的 Oxonica NanoplexTM纳米颗粒用羊抗人cTnI多克隆抗体 (BiosPacific，Emeryville，CA)标记。分别地，使用1-乙基-3-[3- 二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)将磁性颗粒(Bioclone 1- μm羧基封端的磁珠)用抗人cTnI单克隆抗体(BiosPacific， Emeryville，California)标记。形成抗体-标记的纳米颗粒和磁性颗 粒的预混试剂(master mix)，其产生包含5.1x108纳米颗粒和15μ g磁性颗粒的162μL各检验。还制备包含10mM HEPES，50mM β- 甘油磷酸酯，70mM NaCl，2mM EDTA，1％Triton X100，和1X Sigma Protease Inhibitor Cocktail P2714的裂解试剂溶液。
为了测试裂解试剂对检验性能的影响，制备由PBS-稀释缓冲液、 血浆或血液组成的样品。将该样品分成四组。在第一组中。将裂解试 剂加至三种培养基(缓冲液、血浆和血液)的每一种，约10分钟后，将 样品掺入(spiked)预先溶解于缓冲液的心肌肌钙蛋白I至终浓度100 ng/mL。在第二组样品中，再次添加裂解试剂，但是，反而，以0ng/mL 向组成样品(constitute samples)中添加无肌钙蛋白I的缓冲液。第三 和四组由无裂解试剂的对照样品组成，包含0或100ng/mL的肌钙蛋白 I。对于每一样品，将100μL样品加至62μL的预混试剂溶液，并孵 育30分钟(缓慢旋转，室温)。在血浆和血液样品中生物体液的终浓度 为21％。通过形成磁性球团终止反应，来自各试管中球团的SERS信号在 常规仪器上读取。
图6显示具有或不具有裂解试剂(0和100ng/mL心肌肌钙蛋白I) 的SERS信号水平。在图上的误差棒指示来自三个重复试验的标准偏差。
实施例3
通过旋转样品管的球团形成
将来自Bangs Laboratories在水中分散的磁性颗粒(直径约1微 米)用于如下形成致密的球团。磁体(例如，棒)安装在样品管之下，其 中磁体的中心偏离样品管轴的中心(参见图5)。几秒后，磁体在样品 管的底部诱导球团的形成。将样品管沿其中心轴旋转，从而经验地调 节球团附近的磁场使得球团变得更致密。图5中的示意图显示通过旋转 样品管在偏心安装的磁体之上球团形成的过程。
在将磁体置于样品管之下后，颗粒被磁体以秒的方式捕获。形成 的球团在形状上可以是不规则的，并且可以类似环形的横截面。沿其 主轴旋转样品管后，球团变得更致密。一些更多旋转后，球团形状不 再改变。所得的球团比不使用样品管旋转形成的球团更致密和更小。
实施例4
改进的拉曼参考光谱
进行多因子试验，其中五种不同的SERS-活性纳米颗粒，即具有 不同的拉曼染料(本文也被称为″标志物″)的SERS-活性纳米颗粒以变 化的比例一起混合。使用生物素-亲和素结合技术以将纳米颗粒结合至 磁珠(直径约1微米)。按照上文紧接的实施例3所述形成球团。使用两 套参考光谱分析成球团的混合物的光谱：在溶液中的纳米颗粒和在磁 珠-球团中的纳米颗粒。
使用用于单独包含各SERS-活性纳米颗粒的球团的拟合权重构建 校准曲线。然后就各混合物评估SERS-活性纳米颗粒浓度。SERS-活性 纳米颗粒浓度范围从1.25E7颗粒/mL至2.5E8颗粒/mL。即使溶液中 和球团中的参考光谱难以视觉上区分(参见图12)，差异对于在多因子 系统中准确评估低浓度可以是重要的。如表1中所示，改进了0和低浓 度的浓度评估的准确性和精确性。

标志物1的浓度评估还绘制于图13。虽然该参考技术的上述描述 基于由SERS-活性纳米颗粒产生的信号，该SERS-活性纳米颗粒与磁性 颗粒偶合并沉降到球团以用于拉曼分析，该概念还适用于其中检测期 间标志物被构造成特定的构型的任何情况，所述特定构型不同于可能 用作标志物的早期构型。
如图11所示，由于特征的杂散排列，导致随机信号可能错误地指 派输入变量。具有标准偏差为10,000的正常分布的随机噪音使用最小 二乘法拟合。输入信号1100示于图11A。拟合光谱1110反应在输入信号 1100中由于随机噪音导致的误差。在该特定情况下，标志物4被指定为 0.5的权重以平衡其它标志物的负权重。用于标志物4的拟合光谱1120 示于图11B。
代表性的参考光谱示于图12。参考图12A，光谱1200表示在溶 液中的标志物1的SERS光谱，而光谱1210表示在溶液中的标志物5的 SERS光谱。现在参考图12B，光谱1220表示在球团中的标志物1的 SERS光谱，而光谱1230表示在球团中的标志物5的SERS光谱。
尽管借助于视图和实施例已经相当详细地描述了前述主题，以旨 在澄清理解，本领域技术人员应该理解在所附权利要求及其等效的范 围可以实施某些变化和改进。
本文将所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献以似乎各单 独的出版物、专利申请、专利和其它参考文献特异地和单独地指出通 过参考引入的相同程度来引入以作参考。应该理解，尽管本文引用了 许多专利申请、专利和其它参考文献，此类引用不构成任一篇这些文 献形成本领域公知常识的部分的供认。