一种粪便中血吸虫DNA提取方法及其快速鉴定LF-RPA方法
专利汇可以提供一种粪便中血吸虫DNA提取方法及其快速鉴定LF-RPA方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种 粪便 中血吸虫DNA提取方法及其快速鉴定LF-RPA方法。本发明的方法通过提取寄生虫虫卵DNA进行诊断，检测结果可以被未经任何训练的非专业人员肉眼所识别，有利于 基层 单位或边远区落后地方的推广使用，建立起来的诊断方法具有良好的敏感性，特异性，且能够区分日本血吸虫、曼氏血吸虫和东毕血吸虫，对于低强度感染的诊断具备优势，对于防治血吸虫等吸虫的感染具有重大的意义。，下面是一种粪便中血吸虫DNA提取方法及其快速鉴定LF-RPA方法专利的具体信息内容。
1.一种粪便中血吸虫DNA提取方法，所述方法为：
（1）取感染血吸虫的动物粪便置于小烧杯中，加入RO水，玻璃棒搅拌均匀；
（2）用100目和180目铜筛网过滤，反复冲洗后收集180目铜筛网上的粪便于量杯中，注满生理盐水，室温下静置，弃上清，取沉淀涂片计数虫卵；
（3）将沉淀转移至小研钵中，倒入少量液氮冷冻，待液氮挥发完以后，进行研磨，反复倒入液氮冷冻研磨，如此反复三次；将研磨后显微镜下观察有无完整虫卵，如有继续研磨；
（4）将研磨后粉末仔细刮入1.5mlEP管中，加蛋白酶K，混匀将研磨后粉末仔细刮入
1.5mlEP管中，加蛋白酶K，混匀；
（5）加入缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置；
（6）加入无水乙醇，充分震荡颠倒混匀，此时会出现絮状沉淀，瞬离取出管盖内壁水珠；
（7）将上述液体和絮状物转移至吸附柱中，吸附柱放入收集管中，离心，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；
（8）向吸附柱加入漂洗液PW，离心，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中，重复此步骤两次；
（9）将吸附柱放入收集管中，离心，倒掉废液，将吸附柱置于室温放置，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
（10）将吸附柱转移至一个新的1.5mlEP管中，向吸附膜中央悬空滴加洗脱液TE，室温放置，离心，吸附柱弃掉，盖上EP管，做好标记，放入-20℃冰箱保存。
2.一种基于粪便中分离出的DNA的LF-RPA检测试剂盒，所述试剂盒中包括：
用于检测日本血吸虫的引物对和探针，所述引物对上游引物的核苷酸序列为TCTACTAAAACCGCGCACTAAGTTGTATATTGG（SEQ ID NO.7），下游引物的核苷酸序列为Biotin-TTCCTTATTTTCACAAGGTGAAGTCAAGCG（SEQ ID NO.8）；所述探针的核苷酸序列为 FAM-AACGTTCGATCGTTATGTCAAATAGGACAA(THF) AGGCAT CCTTAGCCAT G-C3-spacer（SEQ ID NO.9）；
用于检测曼式血吸虫的引物对和探针，所述引物对上游引物的核苷酸序列为AT CTG AAT CCG ACC AAC CGT TCT ATG AAA ATC G（SEQ ID NO.10），下游引物的核苷酸序列为Biotin -ATATTAACGCCCACGCTCTCGCAAATAATCTA AAAC（SEQ ID NO.11）；所述探针的核苷酸序列为 FAM- ACCAACCGTTCTATGAAAATCGTTGTATCT（THF）CGAAACCACTGGACTTTTTATG -C3-spacer（SEQ ID NO.12）；
用于检测东毕吸虫的引物对和探针，所述引物对上游引物的核苷酸序列为TTTAGCTTGGAGTATAGTGGTATGTCTTTTTTAG（SEQ ID NO.13），下游引物的核苷酸序列为Biotin-TATATTTGGTTTCCTTTGCTATAAACCAAAGG（SEQ ID NO.14）；所述探针的核苷酸序列为 FAM-AATGATGTTTGTCTTTAGTTGGTTGTCTTC (THF) ATTATTTTTATTAGTAGGTTC3-spacer（SEQ ID NO.15）。
3.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下组成成分：LF-RPA引物探针混合液，LF-RPA反应预混液，PCRD试纸条和PCRD试纸条缓冲液PCRD extraction buffer；所述LF-RPA引物探针混合液中，引物的核苷酸序列如权利要求1中所述，探针的核苷酸序列为权利要求1所述。
4.根据权利要求2所述的检测试剂盒在检测、鉴定日本血吸虫，曼式血吸虫，东毕吸虫中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，检测方法包括以下步骤：
1)对待检测核酸样品进行重组酶聚合酶扩增；
扩增时所使用的引物对和探针为：
用于检测日本血吸虫的引物对和探针，所述引物对上游引物的核苷酸序列为TCTACTAAAACCGCGCACTAAGTTGTATATTGG（SEQ ID NO.7），下游引物的核苷酸序列为Biotin-TTCCTTATTTTCACAAGGTGAAGTCAAGCG（SEQ ID NO.8）；所述探针的核苷酸序列为 FAM-AACGTTCGATCGTTATGTCAAATAGGACAA(THF) AGGCAT CCTTAGCCAT G-C3-spacer（SEQ ID NO.9）；
用于检测曼式血吸虫的引物对和探针，所述引物对上游引物的核苷酸序列为AT CTG AAT CCG ACC AAC CGT TCT ATG AAA ATC G（SEQ ID NO.10），下游引物的核苷酸序列为Biotin -ATATTAACGCCCACGCTCTCGCAAATAATCTA AAAC（SEQ ID NO.11）；所述探针的核苷酸序列为 FAM- ACCAACCGTTCTATGAAAATCGTTGTATCT（THF）CGAAACCACTGGACTTTTTATG -C3-spacer（SEQ ID NO.12）；
用于检测东毕吸虫的引物对和探针，所述引物对上游引物的核苷酸序列为TTTAGCTTGGAGTATAGTGGTATGTCTTTTTTAG（SEQ ID NO.13），下游引物的核苷酸序列为Biotin-TATATTTGGTTTCCTTTGCTATAAACCAAAGG（SEQ ID NO.14）；所述探针的核苷酸序列为 FAM-AATGATGTTTGTCTTTAGTTGGTTGTCTTC (THF) ATTATTTTTATTAGTAGGTTC3-spacer（SEQ ID NO.15） ；
2) 将待检测核酸样品，LF-RPA引物探针混合液，缓冲液、醋酸镁溶液等混于反应管中；
将RPA反应体系缓慢涡旋混匀，放置与37℃水浴锅中充分反应20min，在冰上停止反应；将LF-RPA扩增产物移取2μl到灭菌离心管中，加入98μl的运行缓冲液，充分涡旋混匀后，将10μl样品稀释液滴加至侧流层析免疫试纸条末端，并将侧流层析试纸条迅速转移到含有200μl反应缓冲液的1.5mlEP管中，室温孵育5-10min，观察结果；如果试纸条同时出现检测线和控制线，表明该粪样含有相应的血吸虫DNA；如果试纸条只出现控制线，则该粪样不含对应的血吸虫DNA；同时阴性对照试纸条只出现控制线，不出现检测线。
一种粪便中血吸虫DNA提取方法及其快速鉴定LF-RPA方法
技术领域
背景技术
发明内容
用于检测曼式血吸虫的引物对和探针，所述引物对上游引物的核苷酸序列为AT CTG AAT CCG ACC AAC CGT TCT ATG AAA ATC G（SEQ ID NO.10），下游引物的核苷酸序列为Biotin -ATATTAACGCCCACGCTCTCGCAAATAATCTA AAAC（SEQ ID NO.11）；所述探针的核苷酸序列为 FAM- ACCAACCGTTCTATGAAAATCGTTGTATCT（THF）CGAAACCACTGGACTTTTTATG -C3-spacer（SEQ ID NO.12）；
用于检测东毕吸虫的引物对和探针，所述引物对上游引物的核苷酸序列为TTTAGCTTGGAGTATAGTGGTATGTCTTTTTTAG（SEQ ID NO.13），下游引物的核苷酸序列为Biotin-TATATTTGGTTTCCTTTGCTATAAACCAAAGG（SEQ ID NO.14）；所述探针的核苷酸序列为 FAM-
AATGATGTTTGTCTTTAGTTGGTTGTCTTC (THF) ATTATTTTTATTAGTAGGTTC3-spacer（SEQ ID NO.15）；
进一步的，所述试剂盒包括以下组成成分：LF-RPA引物探针混合液，LF-RPA反应预混液，PCRD试纸条和PCRD试纸条缓冲液(PCRD extraction buffer)；所述LF-RPA引物探针混合液中，引物的核苷酸序列为上述引物组合，探针的核苷酸序列为上述探针组合。
扩增时所使用的引物对和探针为：
用于检测日本血吸虫的引物对和探针，所述引物对上游引物的核苷酸序列为TCTACTAAAACCGCGCACTAAGTTGTATATTGG（SEQ ID NO.7），下游引物的核苷酸序列为Biotin-TTCCTTATTTTCACAAGGTGAAGTCAAGCG（SEQ ID NO.8）；所述探针的核苷酸序列为 FAM-AACGTTCGATCGTTATGTCAAATAGGACAA(THF) AGGCAT CCTTAGCCAT G-C3-spacer（SEQ ID NO.9）；
用于检测曼式血吸虫的引物对和探针，所述引物对上游引物的核苷酸序列为AT CTG AAT CCG ACC AAC CGT TCT ATG AAA ATC G（SEQ ID NO.10），下游引物的核苷酸序列为Biotin -ATATTAACGCCCACGCTCTCGCAAATAATCTA AAAC（SEQ ID NO.11）；所述探针的核苷酸序列为 FAM- ACCAACCGTTCTATGAAAATCGTTGTATCT（THF）CGAAACCACTGGACTTTTTATG -C3-spacer（SEQ ID NO.12）；
用于检测东毕吸虫的引物对和探针，所述引物对上游引物的核苷酸序列为TTTAGCTTGGAGTATAGTGGTATGTCTTTTTTAG（SEQ ID NO.13），下游引物的核苷酸序列为Biotin-TATATTTGGTTTCCTTTGCTATAAACCAAAGG（SEQ ID NO.14）；所述探针的核苷酸序列为 FAM-
AATGATGTTTGTCTTTAGTTGGTTGTCTTC (THF) ATTATTTTTATTAGTAGGTTC3-spacer（SEQ ID NO.15）；
将待检测核酸样品，LF-RPA引物探针混合液，缓冲液、醋酸镁溶液等混于反应管中，在
20℃-50℃条件下反应5-30分钟，得到反应产物；
2) 将待检测核酸样品，LF-RPA引物探针混合液，缓冲液、醋酸镁溶液等混于反应管中；
将RPA反应体系缓慢涡旋混匀，放置与37℃水浴锅中充分反应20min，在冰上停止反应；将LF-RPA扩增产物移取2μl到灭菌离心管中，加入98μl的运行缓冲液，充分涡旋混匀后，将10μl样品稀释液滴加至侧流层析免疫试纸条末端，并将侧流层析试纸条迅速转移到含有200μl反应缓冲液的1.5mlEP管中，室温孵育5-10min，观察结果。如果试纸条同时出现检测线和控制线，表明该样品含有血吸虫DNA。如果试纸条只出现控制线，这该样品不含血吸虫DNA。同时阴性对照试纸条只出现控制线，不出现检测线。
M61098.1），东毕吸虫（GenBank：HQ283100.1）基因组序列为模板，用Primer5软件设计引物并合成。
（1）显微镜下计数虫卵，转移至1.5mlEP管中，8000rpm离心5min弃上清，得纯净的虫卵，虫卵涂片计数。
以GenBank公布的日本血吸虫（GenBank：AF412221.1），曼式血吸虫（GenBank：
M61098.1），东毕吸虫（GenBank：HQ283100.1）基因组序列为模板，根据LF-RPA引物和探针实际原则，并参考了nfo-TwistAmp试剂盒操作手册要求，设计并合成特异性引物和特异性探针。用于LF-RPA扩增反应引物需要对方向引物5’端用生物素进行标记，另外其探针根据LF-RPA扩增反应进行设计，探针5’端用羧基荧光素(FAM)进行标记，探针3’端用阻断聚合酶扩增的集团修饰（C3 Spacer），并对探针进行四氢呋喃脱碱基位点（THF）修饰，将设计成功的引物和探针送至苏州金唯智公司合成。（见表3）
按照表4中顺序依次加入反应液，确保几乎同时将醋酸镁溶液加入反应液中启动反应。
将RPA反应体系缓慢涡旋混匀，放置与37℃水浴锅中充分反应20min，在冰上停止反应。将LF-RPA扩增产物移取2μl到灭菌离心管中，加入98μl的运行缓冲液，充分涡旋混匀后，将10μl样品稀释液滴加至侧流层析免疫试纸条末端，并将侧流层析试纸条迅速转移到含有200μl反应缓冲液的1.5mlEP管中，室温孵育5-10min，观察结果。如果试纸条同时出现检测线和控制线，表明该样品含有血吸虫DNA。如果试纸条只出现控制线，这该样品不含血吸虫DNA。同时阴性对照试纸条只出现控制线，不出现检测线。
表4，LF-RPA的反应体系
引物浓度摸索
为确定LF-RPA最佳反应引物浓度，虫卵DNA浓度和虫卵DNA用量一致的前提下，引物工作浓度为10μM，配制多个LF-RPA反应管，分别加入引物量为0.5μl、1μl、1.5μl、2μl、2.5μl，在37℃下反应20min，冰上终止反应，结合侧流层析免疫试纸条检测，观察结果。
20min，结合侧流层析免疫试纸条检测，观察结果。
由表6所示可见，虫卵DNA和粪便DNA为模板的特异性检测中，特异性引物只有配备相应物种的DNA才能检出阳性，与其余两种血吸虫没有交叉性，提示，粪便DNA进行血吸虫虫种诊断具有可行性和特异性。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 人神经突起生长因子（Neuritin）多克隆抗体的制备方法及其应用 | 2021-06-28 | 0 |
| 检测磺胺类药物的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法 | 2020-07-26 | 4 |
| 快速检测大豆Bowman-Brik胰蛋白酶抑制因子的胶体金免疫层析试纸及制备方法 | 2020-08-30 | 3 |
| 苄青霉噻唑酸人工抗原及其抗体的制备方法与应用 | 2021-08-12 | 0 |
| 一种基于海胆状核壳型金@钯纳米球的免疫传感器的制备方法及应用 | 2022-07-30 | 3 |
| HCG周期检测试剂盒及其制备方法 | 2021-03-04 | 5 |
| 克拉霉素衍生物及其制备方法与应用 | 2021-07-09 | 3 |
| 青霉素结合蛋白PBP6的β-内酰胺类抗生素受体法检测试剂盒制备方法及检测方法 | 2021-09-13 | 0 |
| 猪圆环病毒2型抗体胶体金免疫层析检测试纸及制备方法 | 2020-07-14 | 4 |
| 一种被设置在免疫读取设备中的照明系统 | 2021-06-07 | 3 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
