目前，治疗用蛋白质之所以能以适当的形式及充足的数量获得主要 是由于重组DNA技术的进展。重组蛋白质的可用性导致蛋白质配方及化 学修饰方面的进展。这种化学修饰的目的之一就是蛋白质保护。化学附 着可有效地阻止蛋白水解酶与蛋白质骨架本身的接触，从而阻止了蛋白 质的降解。其它的优势包括在特定环境条件下，增加治疗蛋白质的稳定 性及循环时间并且减小其免疫原性。描述蛋白质修饰及融合蛋白质的综 述性文章是：Francis Focus on Growth Factors,3:4-10 (1992年5月)(由Mediscript,Morntview Court,Friern Barnet Land,London N20,OLD,UK出版)。
聚乙二醇(“PEG”)就是一种这类化学修饰部分，它用来制备治 疗用蛋白质产品(动词“PEG化”(pegylate)意指附着至少一个PEG 分子)。例如Adagan即为腺苷脱氨酶的PEG修饰形式，已被获准用于治 疗严重复合型免疫缺陷疾病；PEG化的起氧歧化酶已进入治疗头部损伤 的临床试用阶段；PEG化的α-干扰素已在治疗肝炎的Ⅰ期临床试验中 进行了测试；另据报导PEG化的葡萄糖脑苷脂酶和PEG化的血红蛋白也 已进入临床前试验阶段。附着聚乙二醇对蛋白水解的保护作用已见报道 (Sada，等J.Fermentation Bioengineering 71:137-139, 1991)，附着特定的聚乙二醇部分的方法参见美国专利No.4,179,337, Davis et al.，“无免疫原性多肽”，于1979年12月18日公布。以 及美国专利No.4,002,531,Royer，“聚乙二醇对酶的修饰及其生 产的产品”，1977年1月11日公布。如果想对此领域有更全面的了解， 可参见Abuchowski等“Enzymes as Drugs”(J.S.Holcerberg and J.Roberts,eds.pp.367-383页(1981))。
已使用的其它水溶性多聚物如乙二醇、丙二醇共聚物，羧甲基纤维 素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1,3-二氧戊环(poly -1,3-dioxolane)，聚-1,3,6-三噁烷，乙烯马来酸酐共聚物， 多聚氨基酸(或者是单一聚体或者是随机共聚体)。
对于聚乙二醇分子来说，可通过多种方法将其加到蛋白质上。总的 来说，聚乙二醇分子是通过一个在蛋白质分子上发现的反应基团而联到 蛋白质分子上的。氨基，如赖氨酸残基上的或N-末端上的氨基通常用 于这类附着。例如，Royer(美国专利号4,002,531，见上述)认为 可利用还原性烷基化反应将聚乙二醇分子附着到酶上。Wright于1993 年4月28日公开的EP 0 539 167，“Peg Imidates and Protein Derivates Thereof”中认为带有自由氨基的肽及有机复合物可被PEG 的直接衍生物或有关的水溶性有机多聚体所修饰。Shaw在1990年2月 27日公开的美国专利号4,904,584中涉及修饰蛋白质中用于通过反应 性氨基基团附着聚乙二醇分子的赖氨酸残基的数目。
“G-CSF”，粒细胞集落刺激因子即为一种经过化学修饰的具体 治疗用蛋白质。G-CSF诱导嗜中性粒细胞的快速增殖并释放到血液 中，从而在抗感染中提供治疗效应。
欧洲专利公开EP 0 401 384于1990年12月12日公开的题为“化 学修饰的粒细胞集落刺激因子”中描述了用于制备附着有聚乙二醇分子 的G-CSF的材料和方法。
1992年3月4日公开的题为“连续性释放包含一个多肽分子共价结 合上一水溶性多聚体的药用组合物”的EP 0 473 268中报道了修饰的G -CSF及其类似物，描述了各种G-CSF及其共价结合上一水溶性颗粒 多聚体如聚乙二醇所产生的衍生物的使用。
于1989年10月4日公开的EP 0 335 423报道了一种修饰的具有人 类粒细胞集落刺激因子活性的多肽。
另一个例子是PGE化的IL-6，在题为“修饰的hIL-6”(参见 共同未决的U.S.S.N.07/632,070)的EP 0 442 724中公开了将聚 乙二醇分子附着到IL-6分子上。
于1985年9月11日公开的EP 0 154 316报道了一淋巴细胞活素 (Lymphokine)与一聚乙二醇的醛发生反应。
许多给蛋白质分子附着多聚物的方法涉及使用某一部分作为联接基 团。然而这些部分往往具有抗原性。可进行一种不涉及联接基团的tresyl chloride法，但由于tresyl chloride的使用会产生毒副产品，故很难 用该方法生产治疗用产品。参见Francis等：蛋白质药物的稳定性：体 内的降解途径及蛋白质稳定化的策略(Eds.Ahern.,T.and Manning, M.C.)(plenum,New York,1991)。同时还可参见Delgado等.， “通过Tresyl chloride激活偶联PEG到蛋白质在免疫亲合细胞制备 中的应用”。Fisher等eds.，水相系统分离在细胞生物学及生物技术中 的应用，Plenum Press,N.Y.N.Y.,1989 pp.211-213。
Chamow等(Bioconjugate Chem.5:133-140(1994))报道 了CD4免疫吸附素(immanoadhesin)通过与单甲氧基多聚乙二醇醛发生 还原性烷化作用进行修饰。作者报道50％的CD4-Ig在PEG化反应 程度可控的条件下进行MePEG修饰。出处同上，见137页。作者还报道 了在体外，修饰的CD4-Ig结合(对蛋白gp120)的能力与其MePEG化 的程度呈负相关。出处同上，同样也可参见Rose et al., Bioconjugate Chemistry 2:154-159(1991)，文中报道了连 接基团卡巴肼(carbohydrazide)选择性地附着到蛋白质底物(胰岛素) 的C-末端羧基上。
然而，在整个领域内或涉及特定蛋白质的领域内还没有一种方法能 够让水溶性多聚物选择性地附着到蛋白质如G-CSF的N-末端上。更 有甚者，目前存在的方法在任何反应基团上提供非选择性附着反应，无 论这些基团是在蛋白质内(例如，赖氨酸侧链基团)，还是在N-末端 上。这将会导致产物的不均一。例如，PEG化的G-CSF分子，有些分 子中含有数目不同于其它分子的聚乙二醇部分。比如一个含5个赖氨酸 残基的分子在上述反应中可能会形成一种不均一混合物，一些分子含有6 个聚乙二醇分子，一些分子中具有5个，一些分子中具有4个，一些分 子中具有3个，一些分子中具有2个，以及具有1个甚至一个聚乙二醇 分子也没有。并且在带有一些聚乙二醇的分子中，聚乙二醇分子在不同 的分子中可能不会附着于相同的位置。
以上这些都是开发治疗用PEG化蛋白质产品不中利因素。开发这类 药物时，产品生物活性的可预见性显得分外重要。例如，在超氧化物歧 化酶非选择性地与聚乙二醇分子结合的情况下，一部分修饰的酶完全丧 失活性(P.McGoff et al.Chem.Pharm.Bull.36:3079- 3091(1988))。如果这些治疗性蛋白质在组合物中各批量间有区别， 人们将无法对其生物活性进行预测。不同位点结合的聚乙二醇分子稳定 性不同，这一情况可能导致这些分子从蛋白质中解离出来。当然，如果 这些分子是随机附着而因此随机解离，那么治疗用蛋白质的药物动力学 就不可能准确预测。从消费者的角度考虑，不同批量的循环时间不尽相 同，因此剂量上也可能是不准确的。从生产者角度考虑，获准进入市场 的治疗用蛋白质的保存将增添麻烦。此外，上述方法没有一个提供无连 接部分(蛋白质和多聚体之间)的选择性N-末端化学修饰。如果合用 连接部分，由于可能的抗原性，可能产生不利影响。
因此，仍需要能选择性N端化学修饰蛋白质及其类似物，包括G- CSF及共有干扰素(以下就以这两种化学修饰的蛋白质为例加以说明)的 方法本发明从诸多方面阐述了这一需要。
本发明概述
本发明涉及N-端化学修饰的蛋白质的基本上均一的制品及其所用 的方法。出乎意料的是N-末端化学修饰的G-CSF显示出在该分子的 另一位点上含一个化学修饰的其它G-CSF各类所未发现的在稳定性方 面的优势。更出人意料的是在用于制备N-末端化学修饰的G-CSF的 本方法中，发现使用还原性烷基化反应能够提供选择性地修饰N-末端 的条件，并且该方法可广泛地应用于其它蛋白质(或其类似物)以及G -CSF。令人惊奇的是，利用还原性烷基化反应，其终产物-以胺键与 水溶性多聚体结合的蛋白质，要比具有酰胺键(amide link age)的 相同多聚物/蛋白质连接物稳定得多。另外一个这样修饰的蛋白质(如下 就以此为实施例加以描述)是共有干扰素(consensus interferon)。 因此，正如上面所要详述的，本发明具有涉及化学修饰蛋白质(或其类 似物)以及特定蛋白质的特殊修饰的诸多方面的内容。
一方面，本发明涉及N-末端化学修饰的G-CSF(或其类似物) 的基本上均一的制品及有关方法。在下面实施例中说明了N-末端单个 PEG化的mono-PEG的G-CSF要较其它类型的单个PEG化的G-CSF 更稳定。另外，由于G-CSF分子的N-末端在反应过程中较易与聚乙 二醇分子接近，N-末端PEG化比例较高，因此该方法操作起来比较具 有优势。
本发明还涉及一种还原性烷基化反应类型。该反应可选择性地激活 蛋白质或其类似物N-末端残基的氨基基团，从而使水溶性多聚体部分 选择性附着到N端。这样提供了多聚体/蛋白质结合分子的基本上均一的 制品以及(如果应用聚乙二醇的话)具有聚乙二醇部分直接偶联到蛋白 质部分上的PEG化蛋白质分子的制品。下面描述了用于G-CSF及共有 干扰素的这一方法，这些内容提供了本发明的其它方面。
附图简述
图1A为一PEG化的G-CSF离子交换色谱峰的色谱图复制品。
图1B各种类型单PEG化G-CSF的SDS-PAGE图。
图2：线A为重组人类甲二磺酰G-CSF标准样的SEC-HPLC图； 线B为SCM-PEG-GCSF反应混合物；线C为N-末端PEG化的G-CSF； 线D为35赖氨酸单个PEG化的G-CSF；线E为赖氨酸41单个PEG化 的G-CSF。
图3A、3B及3C为经内蛋白酶(endoproteinase)SV8肽酶切后 的HPLC图，3A为N-末端PEG化的G-CSF；3B为35赖氨酸单个PEG 化的G-CSF；3C为赖氨酸41单个PEG化的G-CSF。
图4是一条形图，图示在体外，单个PEG化的G-CSF种类与未PEG 化的标准样生物活性的比较。
图5A及5B显示了在体内单个PEG化的G-CSF衍生物生物活性的 分析结果，图5A显示仓鼠经皮下注射N-末端PEG化的G-CSF，35 赖氨酸单个PEG化的G-CSF或赖氨酸41单个PEG化的G-CSF后白血 球计数的平均值，图5B显示经单次皮下注射上述各种单个PEG化的G- CSF衍生物后曲线下的最终平均白血球数面积。
图6A、6B及6C为研究N-末端PEG化的G-CSF或35赖氨酸单个 PEG化的G-CSF的稳定性所得的SEC-HPLC图。图6A为在pH6.0， 4℃条件下研究N-末端单个PEG化的G-CSF稳定性的SEC-HPLC图， 图6B为相同条件下35赖氨酸单个PEG化的G-CSF图。图6C显示在pH 6.0及4℃下进一步对35赖氨酸单个PEG化的G-CSF稳定性研究结果。 时间(“T”)表示天。
图7显示了rh-G-CSF与甲氧聚乙二醇醛(MW6kDa)发生还原 性烷基化反应的过程中反应混合物的筛析(size exclusion)HPLC 分析结果。
图8显示了用MPEG(也在MW=6kDa)N-羟基琥珀酰酯的反应混 合物筛析(size exclusion)HPLC分析图。
图9为单次皮下注射剂量的单N-末端MPEG-GCSF接合物(由rh -G-CSF不同分子量的MPEG醛经过还原性烷化反应制得，其中MPEG 的分子量为6kDa、12kDa以及20kDa)后总的白血球反应情况。
详细描述
本发明涉及N-末端化学修饰蛋白质的基本上均一的制品及其所用 的方法。
一方面，本发明涉及N-末化学修饰的G-CSF的组合物及其所用 的方法。
本方法(用于N-末端修饰G-CSF以及还原性烷基化反应法)提供 了单聚体/蛋白质连接物的基本上均一的混合物。本文所用的“基本上均 一的”意指观察到的每个聚合物/蛋白质连接物分子中均只含一个聚合物 部分。制品中也许会包含未反应(即缺乏聚合物部分)的蛋白质。在下 面的一个实施例中，通过肽图谱(peptide mapping)及N-末端测序 证实，制备出的制品中至少含90％的单聚体/蛋白质连接物，未反应蛋 白质含量最多不超过10％。优选的是，N-末端单个PEG化物质含量至 少应达到制品的95％(正如在下面实施例中所述)，最优选的是，N- 末端单个PEG化物质占制品的99％或更高。这种单聚体/蛋白质连接物 具有生物活性。本文提供的“基本上均一”的N-末端PEG化的G-CSF 制品意指这些制品的均一性足以能够显示出均一制品所具有的优越性， 例如，易于在临床应用中预测不同批量的药物动力学。
人们可以选择制备聚合物/蛋白质连接物分子混合物，本文提供的优 势在于，人们可以选择单聚体/蛋白质连接物在混合物中的比例。这样， 如果需要的话，人们便可以制备出带有不同数目附着的聚合物分子(比 如2个、3个、4个等等)的各种蛋白质混合物，并与利用本发明方法 制备出的单聚体/蛋白质连接物结合，便可得到预定单聚体/蛋白质连接 物比例的混合物。
下面提供使用G-CSF的实施例，如上所述，G-CSF是用于治疗 造血障碍的治疗用蛋白质。一般来说，在本发明实施中有用的G-CSF 可以是从哺乳动物有机体中分离的，或者作为选择是化学合成方法的产 品，或者是通过原核生物或真核生物宿主表达外源性DNA序列而得到的 产品，其中这些DNA可从基因组或cDNA克隆或通过DNA合成得到。合 适的原核生物宿主包括各种细菌(如，E.coli)；合适的真核生物宿主 包括酵母(如S.cerevisiae)及哺乳动物细胞(如：中国仓鼠卵巢细 胞，猴细胞)。依据所用的宿主的不同，G-CSF表达产物可能会被哺 乳动物或其它真核细胞中的碳水化合物所糖基化，或非糖基化。G-CSF 表达产物中也可以包括一个起始的甲硫氨酸残基(在第-1位)。虽然 优选重组G-CSF(特别是来自E.coli)，本发明预测了使用任意或全 部其它生物中G-CSF的这类形式的最大商业实用性。
已有报道一些G-CSF类似物具有生物学功能，这些分子也可以是 化学修饰的，例如，添加上一个或多个聚乙二醇分子。G-CSF类似物 在美国专利No.4,810,643中已有报道。具报道有生物活性的其它G -CSF类似物的例子有AU-A-76380/91,EP 0 459 630,EP 0 272 703,EP 0 473 268以及EP 0 335 423中所描述的那些，虽然文中没提 供报道公开的每种类似物的活性。还可参见AU-A-10948/92,PCT US 94/00913以及EP 0 243 153。
一般来说，本发明中有用的G-CSF及其类似物可以通过进行本文 提供的化学修饰程序以选择性地修饰N-末端α-氨基，试验所得产品 的所需生物学特征，例如本文提供的生物活性试验来确定。当然，如果 需要对非人类哺乳动物进行这类治疗，可以使用重组非人类的G-CSF， 如重组鼠、牛及犬等的G-CSF产品。例如，参见PCT WO 9105798及 PCT WO 8910932。
因此，本发明的另一个方面包括N-末端化学修饰的G-CSF类似 物的组合物。如上所述，G-CSF类似物可包括具有氨基酸添加、缺失 和/或替代(与下面实施例1中所述的G-CSF氨基酸序列相比较而言) 的产物。那些当N-末端被PEG化时预期发挥功能以选择性刺激中性粒 细胞的产生的G-CSF类似物是为结合到G-CSF受体上并非必要的N -末端的类似物，见Hill et al.,PNAS-USA 90:5167-5171 (1993)；也可参见PCT US 94/00913。
使用的聚合物分子可选自水溶性多聚体。(对于本文描述的还原性 烷基化方法，多聚体应具有单个反应醛基)。选择性聚合物分子应是水 溶性的，使其要结合的蛋白质分子在水环境中不会发生沉淀现象，例如 生理环境中。从还原性烷基化反应角度考虑，选择的聚合物分子应具有 一个反应醛基，这样就可以根据本发明方法对聚合程度进行控制。多聚 体可以是分枝或不分枝的。对于终产物制品的治疗用途，优选的聚合分 子应是药用上可接受的。本领域的技术人员应能够根据该聚合物/蛋白质 连接物是否在治疗上使用来选择所需的聚合物，如果是在治疗上使用， 则应考虑其剂量，循环时间，对蛋白水解的抵抗力以及其它一些因素。 对于G-CSF来说，可用本文中提供的测试手段加以探知，本领域的技 术人员还应针对其它治疗性蛋白质选择合适的测试手段。水溶性多聚体 可选自如：上面所列出的(背景部分)各种分子以及葡聚糖或聚(n- 乙烯吡咯烷酮)，聚乙二醇，聚丙二醇，聚氧化丙烯/氧化乙烯 (prolypropylene oxide/ethylene oxide)共聚物，聚氧乙烯化多 元醇和聚乙烯醇。
出于下面所述的最优化考虑，聚合物的分子量可以是任意大小，并 且可以是带有分枝或不分枝的。对于聚乙二醇来说，最优选的分子量是 约为2kDa到大约100kDa之间(术语“大约”意指聚乙二醇制品中，一 些分子大于所述分子量，另一些分子小于所述分子量)。下面的实施例1 及实施例2涉及PEG6000，其选择便于纯化及提供一个合适的模式系统。 其它大小的使用取决于所需的治疗方案(情况例如所需的缓释持续时 间，效力如果在生物活性方面有效的话，处理的方便性，抗原性大小或 缺乏以及其它一些PEG对治疗性蛋白质及其类似物的已知效应。
本发明的一个具体方面就是N-末端单个PEG化的G-CSF分子， 它由一个聚乙二醇部分和一个G-CSF部分组成。对于该组合物，人们 可从多种聚乙二醇分子(以分子量及有无分枝等)，反应混合物中聚乙 二醇分子对G-CSF蛋白质分子的比例，所进行的PEG化反应的类型， 获得选择性N-末端PEG化的G-CSF的方法及所要使用的G-CSF的 类型等方面进行选择。此外，本组合物及方法还包括药用组合物的配方， 药剂的治疗和生产方法。
聚乙二醇分子对蛋白质分子的比例与它们在反应混合物中的浓度一 样，可以改变。一般来说，最佳比例(是指反应效率而言，即反应混合 物中没有多余未反应的蛋白质及聚合物分子)将根据所选聚乙二醇分子 量进行测定。此外，正如本方法的一个实施例中涉及的非特异性PEG化 反应和随后的N-末端单个PEG化产物的纯化，比例取决于可参加反应 的可得到的反应基团数(典型的是∝或 氨基)。本文的一个实施例 中涉及的蛋白质：PEG分子的反应比例相当低以获得基本上为单个PEG 化的产品(每个蛋白质分子对1.5个PEG分子)。
为了获得N-末端PEG化的G-CSF，也有多种如上所述的或者在 下面实施例2中所述的还原性烷基化反应的PEG化反应方法可供选择。 有关聚乙二醇部分与蛋白质部分之间无连接基团的聚合方法在Francis et al在：蛋白质药品的稳定性：体内降解途径及使蛋白质稳定的策略 (Eds.Ahern.,T.and Manning,M.C.Plenum,New York, 1991)中已有过描述。另外，Delgado et al.，“通过Tresyl Chloride激活方法偶联PEG到蛋白质在免疫亲合细胞制品中的应用”及 Fisher et al.,eds.，水相系统分离在细胞生物学及生物技术中的 应用，Plenum Press,N.Y.N.Y.,1989 pp.211-213中涉及利 用tresyl chloride，从而使聚乙二醇部分和蛋白质部分间没有连接 基团存在。该方法由于会产生毒副产品，故很难用于生产治疗用产品。 本发明的一个实例中涉及使用羧甲基甲氧聚乙二醇的N-羟基琥珀酰 脂。正如下面将会更为详细地讲座的另一实施例涉及使用还原性烷基化 反应方法。
获取N-末端PEG化的G-CSF制品的方法(即，如有必要，把该 部分从其它单个PEG化的部分中分离出来)可以经过从PEG化的G-CSF 分子群体中纯化N-末端PEG化的产物。例如，在下面的实施例中，PEG 化的G-CSF首先通过离子交换色谱分离以获得具有电荷特征的单个PEG 化物质(可能存在含有相同的表观电荷的其它多个PEG化的物质)，然 后使用分子筛层析(size exclusi on chromatography)分离单个PEG 化的产品。通过这种方法，将N-末端单个PEG化的G-CSF从其它类 型的单个PEG化的物质及其它多个PEG化的物质中分离出来。其它方法 已见报道。例如，PCT WO 90/04606，(1990年5月3日公开)中报 道了一种分离PEG-蛋白质加合物混合物的方法，其中包括用含PEG的 水性两相系统PEG/分离(partitioning)蛋白质加合物。
在另一方面，本发明还提供了选择性获得N-末端化学修饰蛋白质 (或其类似物)的方法。下述为一种利用还原性烷基化反应进行蛋白质 修饰的方法，它利用可获得的一价氨基(primary amino group)(赖 氨酸对N末端)的不同类型的特异性反应来进行特定蛋白质的修饰。在 适当的反应条件下，成功地用带有聚合物的羰基将蛋白质的N-末端进 行了选择性的修饰.在能够利用赖氨酸残基上ε-氨基和蛋白质N-末 端α-氨基的pKa差异的pH下进行该反应。通过这种选择性修饰，控制 水溶性聚合物附着到蛋白质上：聚合物的连接主要发生在蛋白质的N- 末端，而其它反应基团(如赖氨酸残基上的侧链氨基)则没有明显的修 饰发生。
更为重要而且令人惊奇的是，本发明提供了一种制备单聚体/蛋白质 连接物分子的基本上均一的制品的方法，不需使用其它化学修饰化学方 法所需的进一步纯化。此外，具有胺键的产物出乎意料地比以酰胺键形 成的产物更稳定。这一点将会在下面的详细研究中得到证明。更具体地 说，如果使用聚乙二醇，本发明还提供了没有可能的抗原性连接基团， 并具有直接偶联到蛋白质部分的聚乙二醇部分而无毒副产品的N-末端 PEG化的蛋白质。
反应可见下图描述(图中氰基硼氢钠为举例性还原剂)：
因此，本发明的一方面内容是制备聚合物/蛋白质连接物的方法，包 括：(a)在还原性烷基化反应条件下，将含多于一个氨基的蛋白质分 子与水溶性聚合物分子反应，反应液的pH应适于选择激活所说蛋白质 分子氨基末端的α-氨基，所以所述水溶性聚合物附着于所述α-氨基 基团，以及；(b)获取反应产物。可从任选从未反应的分子中分离反 应产物，但对于治疗用产品来说，这是优选的。
本发明的另一方面内容是这种还原性烷基化反应，它能够将聚合物 分子选择性地附着到任意在N-末端具有α-氨基的蛋白质上，并提供 了一种单聚体/蛋白质连接物的基本上均一的制品。这里所用的术语“单 聚体/蛋白质连接物”意指由一个聚合物部分附着到一个蛋白质部分上组 成的组合物(也包括本文所述的使用蛋白质类似物的那些连接物)。单 聚体/蛋白质连接物具有位于N-末端而不是侧链氨基上(如赖氨酸侧链 的氨基)的一个聚合物部分。制品优选含大于80％的单聚体/蛋白质连 接物，更优选大于95％的单聚体/蛋白质连接物。
对于基本均一的单聚体/蛋白质连接物分子群体，其反应条件应是让 水溶性聚合物分子选择性地附着到所需蛋白质的N-末端上。这种反应 条件一般造成赖氨酸氨基与N-末端α-氨基的pKa差异(pK是指氨基 质子化和非质子化各占50％时的pH)。一般来说，对于不同的蛋白质， 可使用不同的pH以使N-末端α-氨基得到最佳修饰。
pH往往也会影响所用的聚合物分子与蛋白质分子的比例。一般来 说，如果反应液pH低于pK，聚合物分子比例应大大超过蛋白质分子为 宜(即：N-末端的α-氨基反应性越少，达到最佳条件所需的聚合物 越多)。如果pH高于pK，则聚合物：蛋白质分子的比例不必要太大(即 得到的反应基团越多，所需的聚合物分子越少)。
另一个需要考虑的重要条件是聚合物的分子量。一般来说，聚合物 的分子量越大，结合到蛋白质上的聚合物分子数越少。同样，在优化这 些参数时，聚合物分子是否有分枝也应加以考虑。总之，聚合物分子量 越高(或分枝越多)，聚合物：蛋白质的比例亦应越高。
对于这个还原性烷基化反应，其还原剂在水溶液应该比较稳定，最 好仅能还原在还原性烷化反应初始阶段所形成的西佛碱(Schiff base)。优选的还原剂可选自硼氢化钠，氰基硼氢钠，硼酸二甲胺，硼 酸三甲胺以及硼酸吡啶。在下面实施例中使用的是氰基硼氢钠。
水溶性聚合物分子可以是上面描述的类型，其分子中应具备单个反 应醛基使其偶联到蛋白质分子上。对于聚乙二醇，使用用于与G-CSF 偶联及PEG12000用于和共有干扰素偶联在下面描述。值得一提的是对于 G-CSF，本方法中，PEG 12000,20000及25000均被成功地使用过。 聚乙二醇丙醛(见美国专利No.5,252,714)由于其在水中有较好的 稳定性而具有一定优势。
如上所述，本方法广泛适用于具有N-末端α-氨基的任何蛋白质 及其类似物。例如，由细菌表达外源性DNA而获得的蛋白质产品，由于 细菌表达的结果，其N-末端的甲硫氨酸(methionyl)残基上带有一 个α-氨基。如上所述，包括肽在内，均是一些肽类似物及其它的修饰 蛋白质。蛋白质类似物，如上所述的G-CSF类似物及非天然存在的共 有干扰素均适用于此方法。
因此，对于该N-末端化学修饰的G-CSF，本文所述的任意G- CSF或其类似物均合用(例如，出处同上的文章所描述的那些)。下面实 施例中所用的是细菌中产生的重组G-CSF，具有174个氨基酸残基及 一额外的甲硫氨基酸残基。如本文所述，化学修饰可使用本文描述的任 何水溶性聚合物分子进行，下面的实施例中使用的是聚乙二醇。
共有干扰素是本实施例中所用的另一种蛋白质。下面要描述的是用 本发明中的还原性烷化的反应进行蛋白质N-末端的单个PEG化修饰， 从而制备出化学修饰的共有干扰素。因此，本发明的另一方面涉及这些 制品。正如本文所用的，共有人淋巴细胞干扰素在此称为“共有干扰素”， 或“IFN-con”，意即为一个非天然多肽，它主要包括所有天然人白 细胞干扰素亚型序列共有的那些氨基酸残基，而且它还包括在所有亚型 无共同氨基酸的一个或多个位置上，主要发生于该位置一个氨基酸，并 且在任何情况下，不包括在至少一个天然存在的亚型中不出现于该位置 的任意氨基酸残基。IFN-con包括三个氨基酸序列，分别命名为IFN -con1、IFN-con2及IFN-con3，它在共同拥有的美国专利4,695, 623及4,897,471中公开，本文引用其全文以供参考。(美国专利Nos. 4,897,471及4,695,623中使用“α”命名，而本文未用)。编码 IFN-con的DNA序列可按上述专利或其它标准方法进行合成。IFN- con多肽最好是通过转化或转染合成的DNA序列到细菌宿主中，尤其是 E.coli表达产生。即IFNcon是重组IFN-con。以本领域的技术人员 已知的方法和在Klein et al.,J.Chromatog.454:205-215 (1988)中描述的用于IFN-con1的方法可纯化优选在E.coli中生 产出的IFN-con。纯化的IFN-con可能包括其异构体的混合物，如 纯化的IFN-con1中可能包含有甲硫酰IFN-con1，去甲硫氨酰IFN -con1及N-末端封闭的去甲硫氨酰IFN-con1(Klein et al., Arc.Biochem.Biophys.276:5 31-537(1990))。作为选择， IFN-con可包括特异性分离的异构体，可用本领域技术人员已知的诸如 等电点聚焦的技术来彼此分离IFN-con的异构形式。
因此，本发明的另一方面内容是化学修饰的共有干扰素，其中所说 的共有干扰素是选自IFN-con1,IFN-con2，及IFN-con3。化学 修饰时用本文所述的水溶性聚合物例如PEG，以及用于N-末端选择性 化学修饰的还原性烷基化方法。本文的实施例3中描述了IFN-con1的 化学修饰，包含将IFN-con1分子在N-末端与聚乙二醇分子(PEG 12000)相结合。
另一方面，本发明方法生产出的PEG化蛋白质是聚乙二醇部分直接 与蛋白质部分相连接，没有联接基团存在，也不产生任何毒副产品。实 施例中包括G-CSF及本文所述的共有干扰素。对于PEG化G-CSF蛋 白质分子的群体，其中聚乙二醇部分是直接偶联到G-CSF蛋白质部分 上(但并不一定是N-末端PEG化的G-CSF分子的群体)，还原性烷 基化反应可以在酸性或非酸性环境中进行。
本发明还有一方面是关于上述有关药用组合物。这种药用组合物可 适于注射，或者是口服，作用于肺、鼻腔以及其它形式的施用。一般来 说，包含于本发明中的药用组合物包含有效量的本发明的单聚体/蛋白质 连接物产物以及药用上可接受的稀释剂，保存剂，增溶剂，乳化剂，佐 剂及/或载体。这类组合物中包括各种缓冲液组份(如：Tris-HCl， 醋酸盐，磷酸盐)，pH及离子强度的稀释剂；添加剂诸如去污剂及增溶 剂(如：Tween 80，多聚山梨醇酯80)，抗氧化剂(如抗坏血酸，偏 亚硫酸氢钠)，保存剂(如：水杨乙汞，苯甲醇)以及填充物质(如： 乳糖，甘露醇)；将这些物质掺入聚合物分子如聚乳酸(polylactic acid)，聚乙二醇酸等做成的颗粒状制品中或掺入脂质体中。这些组合 物可能会影响本发明的N-末端化学修饰的蛋白质的物理状态稳定性， 在体内的释放速度及体内清除速度。例如参见Remington’s《药物学》 第18版。(1990,Mack出版公司.，Easton,PA 18042)pp.1435 -1712。本文引用以供参考。
本发明再有一个方面是涉及药品的治疗和生产方法。施用本发明生 产的聚合物/G-CSF连接物(或具有天然G-CSF的促血细胞生成活性 的类似物)来缓和或调理的症状的典型特征在于，造血或免疫功能的减 退，而且更具体地说是中性粒细胞数的减少。这些症状也许是因为治疗 其它疾病过程中(例如化疗或放疗)引起的。这也可能是由于患感染性 疾病，比如细菌、病毒、真菌或其它一些感染疾病。例如，由于细菌感 染所致败血症。或者，这种症状由遗传或环境因素造成的，如严重慢性 嗜中性粒细胞减少症或白血病。年龄因素也很重要，在老年病学中， 病人的嗜中性白细胞数目会减少或嗜中性白细胞活动性降低。一些这类 症状见Filgrastim(r-met Hu G-CSF)in clinical Practice, Morstyn,G.及T.M.Dexter编.，Marcel Dedder Inc.，N.Y. (1993)，pp.351。其它一些研究不多的可经过施用本发明的聚合体 /G-CSF连接物来缓和和调节的症状还有血液中脂类(或胆固醇)的减 少，一些心血管症状，因为G-CSF可诱导产生纤维蛋白溶酶原激活因 子。截止目前，G-CSF(或类似物)在这些情况中的激活模式还不十 分清楚。水溶性聚合物分子(如聚乙二醇)的添加，可给施用的病人带 来好处，因为生物活性的延缓滞留可允许每个疗程的G-CSF注射次数 更少。
一般来说，施用本发明生产的聚合物/共有干扰素可缓解和调理的症 状是那些可应用干扰素的症状，包括细胞增殖紊乱，病毒感染及自体免 疫紊乱，如综合性血管硬化症。参考McManus Balmer,DICP，“药物 治疗年鉴”24:761-767(1990)(具有生物活性的修饰因子在癌 症治疗中的应用：回顾。第一部分，干扰素)。用共有干扰素治疗细胞 增殖紊乱的方法及其组合物可参见1992年4月30日公开的PCT WO 92/06707，本文引用以供参考。例如，肝炎(A、B、C、D、E型) 可用本发明生产的PEG化共有干扰素分子来治疗。在下面的实施例中证 明在体外，化学修饰的共有干扰素活性为非化学修饰的共有干扰素的2 0 ％。
上述的各种分子，由于进行了进一步的研究，因而获得了有关不同 病人中不同的症状的治疗时所用的合适剂量水平的资料。普通技术人员 在考虑治疗方案，病人年龄及健康状况后，可确定合适的剂量。一般来 说，对于注射或灌注剂量应在每千克体重0.01μg至100μg之间(只 计算蛋白质部分的重量，没有计算化学修饰部分的重量)。
下面的实施例将说明以上提及各方面。在实施例1中，通过N-末 端PEG化的G-CSF与35赖氨酸或41赖氨酸(为met+174氨基酸G -CSF变体)单个PEG化的G-CSF相比较来证实前者的优点。实施例2 中描述了在N-末端PEG化G-CSF过程中的还原性烷基化反应。本方 法能够制备N-末端PEG化G-CSF的基本均一的制品。实施例3中讨 论了在共有干扰素N-末端PEG化中的还原性烷基化反应。
实施例1 A．重组人类met-G-CSF制备
重组人类met-G-CSF(本文有时称为“rh-G-CSF”或“r -met-hu-G-CSF”)按照Souza专利，美国专利No.,4,810,643 (本文引用以供参考)的。方法合用的rhG-CSF是来自E.coli的重 组表达产物其氨基酸序列(由DNA序列编码)所示如下(SEQ.ID.NO.1 和2)： ATG   ACT   CCA   TTA   GGT   CCT   GCT   TCT   TCT   CTG   CCG   CAA   AGC   TTT   CTG  M     T     P     L     G     P     A     S     S     L     P     Q     S     F     L CTG   AAA   TGT   CTG   GAA   CAG   GTT   CGT   AAA   ATC   CAG   GGT   GAC   GGT   GCT  L     K     C     L     E     Q     V     R     K     I     Q     G     D     G     A GCA   CTG   CAA   GAA   AAA   CTG   TGC   GCT   ACT   TAC   AAA   CTG   TGC   CAT   CCG  A     L     Q     E     K     L     C     A     T     Y     K     L     C     H     P GAA   GAG   CTG   GTA   CTG   CTG   GGT   CAT   TCT   CTT   GGG   ATC   CCG   TGG   GCT  E     E     L     V     L     L     G     H     S     L     G     I     P     W     A CCG   CTG   TCT   TCT   TGT   CCA   TCT   CAA   GCT   CTT   CAG   CTG   GCT   GGT   TGT  P     L     S     S     C     P     S     Q     A     L     Q     L     A     G     C CTG   TCT   CAA   CTG   CAT   TCT   GGT   CTG   TTC   CTG   TAT   CAG   GGT   CTT   CTG  L     S     Q     L     H     S     G     L     F     L     Y     Q     G     L     L CAA   GCT   CTG   GAA   GGT   ATC   TCT   CCG   GAA   CTG   GGT   CCG   ACT   CTG   GAC  Q     A     L     E     G     I     S     P     E     L     G     P     T     L     D ACT   CTG   CAG   CTA   GAT   GTA   GCT   GAC   TTT   GCT   ACT   ACT   ATT   TGG   CAA  T     L     Q     L     D     V     A     D     F     A     T     T     I     W     Q CAG   ATG   GAA   GAG   CTC   GGT   ATG   GCA   CCA   GCT   CTG   CAA   CCG   ACT   CAA  Q     M     E     E     L     G     M     A     P     A     L     Q     P     T     Q GGT   GCT   ATG   CCG   GCA   TTC   GCT   TCT   GCA   TTC   CAG   CGT   CGT   GCA   GGA  G     A     M     P     A     F     A     S     A     F     Q     R     R     A     G GGT   GTA   CTG   GTT   GCT   TCT   CAT   CTG   CAA   TCT   TTC   CTG   GAA   GTA   TCT  G     V     L     V     A     S     H     L     Q     S     F     L     E     V     S TAC   CGT   GTT   CTG   CGT   CAT   CTG   GCT   CAG   CCG   TAA   TAG  Y     R     V     L     R     H     L     A     Q     P     *     * (这也是用于对照动物的非PEG化的组合物)。作为选择，也可选用市 场上的Neupogen进行下面的PEG化反应(本文引用其包装说明书以供 参考)。
B．PEG化的G-CSF的制备
100mM pH 8.0的N-二羟乙基甘氨酸，内含10mg/ml的上述rh-G -CSF的溶液，加入到平均分子量为6000道尔顿的固态SCM-MPEG中 (羧甲氧聚乙二醇N-羟琥珀酰酯)(Union Carbide)。这里的SCM -MPEG要比rh-G-CSF多1.5摩尔。轻轻搅动1小时后，混合物以 无菌水稀释至2mg/ml,pH以稀盐酸调至4.0。反应在室温下进行。此 时反应混合物主要由三种形式的单个PEG化rh-G-CSF，一些双PEG 化的rh-G-CSF和未修饰的rh-G-CSG及反应副产品(N-羟琥 珀酰亚胺)组成。
C．N-末端PEG化rh-G-CSF的制备
三种形式的单个PEG化的rh-G-CSF可用离子交换色谱加以分 离。反应混合物上样于(1mg蛋白质每毫升树脂)Pharmacza S Sepharose FF柱(Pharmacia XK50/30库，柱床体积440ml)，以缓 冲液A(20mM的醋酸钠，pH 4.0)加以平衡。然后以3倍于柱床体积 的缓冲液A清洗。蛋白质样品用15倍于柱床体积的缓冲液B(20mM醋 酸钠，pH 4.0,1M NaCl)，其浓度梯度从0～23％进行线形梯度洗 脱。洗脱后柱床以等体积100％的缓冲液B加以清洗再以3体积的缓冲 液A重新平衡。整个过程的流速应维持在8ml/min。洗脱液在280nm处 加以监测，以5ml每管分部收集。按照图1A合并含各单PEG化rh-G -CSF种类的馏分。将这些合并物用带YM10 76mm膜350mL Amicon搅 拌室(stirred cell)浓缩。
将来自离子交换色谱的合并液进行分子筛层析，以使双PEG化的蛋 白质产物从单PEG化的蛋白质得以分离。大多数情况下，2-5ml溶液 中含5-10mg样品的混合物上柱，柱为120ml Pharmacia Superdex 75HR 16/60，以20mM的pH 4.0的醋酸钠将柱平衡。以1,5ml/min流 速洗脱100分钟。以2ml每管分部收集。洗脱液中蛋白质含量在280nm 处加在监测。合并不同峰的馏分并进行下一步的分析。下表中比较每个 峰处产量的相对比例。
表1
相对产量和修饰位点
修饰位点    参考图1A    相对产量
N-末端        峰1A        3
Lys-35        峰2A        2
Lys-41        峰3A        1
在这种反应条件下，17及24位的赖氨酸可能不会发生明显的PEG 化反应。
D．特征描述
为了鉴定每个样品的特征，从五个方面加以分析：(1)SDS -Page(图1B)，(2)分子筛层析HPLC(“SEC HPLC”)(图2)， (3)肽(酶切)分离图谱分析(图3A、3B及3C)，(4)在体外对 G-CSF生物活性的测试(图4)及(5)在体内(仓鼠体内)对其生物 活性的测试(图5A及5B)。
对于每个样品组合物，结果显示，对于N-末端单个PEG化G-CSF 来说，样品中被PEG化的比例已超过95％，余下的也许是未PEG化的物 质(尽管样品中余下的低于试验检测极限)。至于三种形式单个PEG化 产物(N-末端、赖氨酸41和赖氨酸35)的各自百分含量，结果显示， N-末端及赖氨酸41 PEG化产物已超过单个PEG化总产物的97％，PEG 化的赖氨酸35产率较低，可能是由于其在被测试条件中不稳定造成的。
表2
N-末端PEG化G-CSF组合物的百分比
           非还性SDS PAGE     SEC HPLD     N-末端测序* 单个PEG化的G-CSF    97.44           99.43          96.6 未修饰的G-CSF       2.56            0.57           3.4
*下面讨论的N-末端测序在此不能认为是定量试验，因为在进行 N-末端测序时，可能会造成聚乙二醇分子从蛋白质分子N-末端脱落下 来。
表3
三种形式的单个PEG化产物百分比
          N-末端PEG-       Lys 35 PEG-       Lys41 PEG-
             GSCF            GSCF**             GSCF
          (RI/UV=.96)*     (RI/UV=.72)       (RI/UV=1.12) 非还原性         97.44            77.41             100.00 SDS-PAGE SEC HPLC         99.43            93.38             99.96
*RI/UV为折射光与紫外光吸收比例的指数，其主要用来估计每 个蛋白质分子中含有聚乙二醇的分子数。应用聚乙二醇分子的折射和反 映蛋白质分子的紫外光吸收的指数，从SEC HPLC数据计算。
**这种形式G-CSF在测试条件下不稳定。
方法
1．SDS-PAGE.SDS-PAGE使用的是ISS Daiichi Pure Chemicals,Co.,Tokyo,Japan生产的非还原性4～20％的微胶， 并以考马斯亮蓝染色。凝胶以分子动态显像密度计(molecular Dynamics Densitometer with Image Quant)加以扫描。结果：如 图1B所示。1号泳道(左手一边为一标准分子量蛋白(Novex Mork 12 分子量标准品)。2道为3μg rh-G-CSF标准；3道为上样10μg SCM-PEG-GCSF反应混合物电泳结果；4道内加的是10μg N-末 端单个PEG化的G-CSF；5道内为10μg从N-末端met数起，第35 位赖氨酸残基单个PEG化的G-CSF；6道为10μg从N端甲硫氨酸起 第41位赖氨酸单个PEG化的G-CSF。从图可以看出，3道中含有N- 末端单个PEG化产物，并显示出单条带。
2．分子筛层析-高压液相色谱
SEC-HPLC使用的是Biosep SEC 3000柱，在水相HPLC系统中进 行的，并使用100mM磷酸钠，在pH 6.9条件下，以1ml/min流速洗脱 20min。监测280nm处的信号。结果：如图2所示，线“C”，因为只含 N-末端单个PEG化的rh-G-CSF，故只有一个峰，线“D”(赖氨 酸35单个PEG化产物)和“E”(赖氨酸41单个PEG化产物)情况相 同。这也显示单个PEG化G-CSF在不同收集管中是基本上纯的。
3．肽酶切分离图谱。使用下述方法，对三种样品(称为“Mono- PEG-1”、“Mono-PEG-2”及Mono-PEG-3“)加以分析。(a) 还原性烷基化反应。500μg的单个PEG化G-CSF等分样品进行快速 真空干燥，将其在含6M盐酸胍及1mM EDTA的0.3M Tris-HCl中配 制成1mg/950μl浓度，缓冲液pH 8.4。样品中加碘乙酸进行S-羧甲 基化，并在37℃孵育反应20分钟。样品然后用Sephadex G-25快速 旋转蛋白分离柱(Quick Spin Protein Columns)进行脱盐处理， 后更换缓冲液。经脱盐和更换缓冲液后，样品浓度用增加的缓冲液将其 稀释至0.5mg/ml。(b)蛋白质内切酶SV8消化。样品以SV8(酶与底 物比为1∶25)在25℃消化处理26小时。(c)HPLC肽酶切分离图 谱。消化后的蛋白质装入Vydac C4柱(4.6×250mm，颗粒直径5μ， 孔径300)，以0.1％TFA中乙腈的线性梯度进行洗脱，经HPLC作肽 图。肽段人工收集后置快速真空干燥器(Speed Vac)中将其干燥后以 备测序之用。结果：与对照标准样相比，(ⅰ)(图3A)为“Mono- PEG-1”(即N-末端单个PEG化产物)，57.3分钟时峰值减小而在 77.5分钟时出现一新峰；(ⅱ)(图3B)为“Mono-PEG-2”，(赖 氨酸35PEG化产物)，在30.3分钟时峰的高度有所下降并在66.3分钟 时出现一新的洗脱峰；(ⅲ)(图3C)为“Mono-PEG-3”(赖 氨酸41 PEG化产物)，30.3分钟时的峰消失，而在66.4分钟时出现 一新的洗脱峰。这些肽段在分离图谱中都显示出显著的差异。从图还可 以看出由于微小的消化差异在86.1分钟肽的两侧出现一些小的不完全 裂解物。(d)N-末端测序分析。上面图谱中每个“新”肽段都要经 过N-末端序列分析来鉴定。干燥后的肽段溶于0.1％TFA，在ABI蛋 白质测序仪中进行测序。对于“Mono-PEG-1”(N-末端PEG化产 物)，60％的“新”峰产物(77.5分钟时)进行了10个循环的测序。 起始得率5％，这意味着N-末端的甲硫氨酸残基被聚乙二醇分子。封 闭。必须注意到，象这种起始肽应该引起0起始得率，这里的小于5％ 值可能是由于在测序分析过程中造成聚乙二醇分子从N-末端甲硫氨酸 上脱落下来所致。N-末端肽段序列测定结果为：M-T-P-L-G -P-A-S-S。对于“Mono-PEG-2”(赖氨酸35 PEG化产物)， 收集了66.3分钟处峰值总体积的80％，并对其进行9轮循环测序。赖 氨酸35的回收率相当低，意味着PEG化发生在35位赖氨酸上。而41位 的赖氨酸回收率与其它氨基酸残基一样，说明该残基未发生修饰。肽在 30.3分钟处的峰高比相应标准参照图要低，肽在30.3分钟处的峰面积只 为相应肽的57.5％，对其序列测定结果为K-L-C-A-T-Y-K -L。对于“Mono-PEG-3”(赖氨酸41 PEG化产物)，对于在66.4 分钟洗脱的肽收集了峰总体积80％的样品，并对其进行9个循环的测 序，检测的序列为K-L-C-A-T-Y-K-L，其中含35并41 赖氨酸残基。35位赖氨酸的回收率与其它残基回收率一致，41位的赖 氨酸的回收率相当低，意味着PEG化在该处发生。结果：“Mono-PEG -1”为N-末端单个PEG化产物；“Mono-PEG-2”为35赖氨酸 部分PEG化产物；“Mono-PEG-3”为41赖氨酸PEG化产物。通过 比较对照标准样(非PEG化G-CSF)和单个PEG化的G-CSF 1、2 和3的图谱，可以看出“Mono-PEG-2”(Lys 35)和“Mono-PEG -3”(Lys 41)二者图谱N-末端肽峰高都略微有所下降。这说明赖 氨酸35和赖氨酸41的产物中均混杂有少量的N-末端PEG产物，或者N -末端的甲硫氨酸有少部分被PEG化。
4．体外活性。该物质有活性。图4显示的为体外分析结果。从图可 以看出，N-末端单个PEG化产物具有未修饰的rhG-CSF活性的68％。 方法：G-CSF体外生物测定是合用鼠32D细胞G-CSF依赖性克隆的 促有丝分裂试验。细胞以含5％FBS和20ng/ml rhG-CSF的Iscoves 培养基进行培养。在加样品之前，细胞用不含rhG-CSF的生长培养基 冲洗2次。以48至0.5ng/ml浓度范围(相当于4800～50IU/ml)作 12个点的rhG-CSF标准曲线。在标准曲线尝试范围内每份样品制备估 计落在标准曲线线型部分内(1000到3000 IU/ml)的4种稀释液，并 以一式三份。由于这些样品显然在体外活性较低，PEG化rhG-CSF样 品一般稀释不到4～10倍。每份40μl体积的样品或标准样稀释液加 到含10,000细胞/孔的96孔微滴度板的合适小孔中。在5.5％CO2,37 ℃培养48小时后，每孔加入0.5μmCi甲基-3H-胸腺嘧啶。18小时 后，收获平板细胞并计数，作出剂量反应曲线(logrhG-CSF浓度对CPM -背景)并对落在标准曲线线型部分范围内的点进行线性回归分析。用 所得的线性方程及稀释系数校正来测定未知试验样品的浓度。结果：如 图4所示。从图4可以看出，三种单个PEG化形式中，N-末端单个PEG 化G-CSF在体外显示最高生物活性。
5．体内活性。体内测定也证实了N-末端PEG化的G-CSF的活性。 体内测定是给金黄地鼠皮下一次注射0.1mg/kg体重剂量的样品而进行 的。每组4只动物在每个时间点经尾部抽血。收集的血样当天进行全血 细胞计数，并计算出白细胞平均数目。从图5A及5B可以看出，在皮下 单次注射0.1mg/kg体重剂量样品1天后出现作用高峰。两种单个PEG化 产物(N-末端及赖氨酸35)显示出延长的反应，而对赖氨酸41PEG化 的蛋白质的反应在体内并没显示出比未修饰的rhG-CSF活性增强(从 图5B可看出，其实活性还更差一些)。这些结果表明在蛋白质分子上附 着聚乙二醇分子能显著改变蛋白质的治疗效果并且PEG化蛋白质的益处 还取决于修饰位点。(单次皮下注射后曲线下的WBC净平均面积(根据 CRC标准数学表，26th Ed.(Beyer,W.H.,Ed.)CRC Press Inc.,Boca Raton,FL 1981.p.125来计算)与Lys-35及N-末 端单个PEG化产物一致)。
E．稳定性研究
另外，对上面制备的N-末端及35赖氨酸单个PEG化G-CSF稳定 性进行了研究。(41赖氨酸PEG化产物未被研究是因为已证实其没有超 出未修饰的G-CSF的额外活性)。研究表明N-末端PEG化的G-CSF 在贮存时出人意料地要比单个PEG化的G-CSF的其它形式赖氨酸35单 个PEG化产物更稳定。稳定性是以SEC-HPLC监测到产物裂解来测定 的。方法：N-末端PEG化G-CSF及赖氨酸35单个PEG化G-CSF研 究在4℃2个pH条件下完成的，即pH 4.0和pH 6.0，每个周期16天。 将pH升至6.0是为了使稳定性研究得以更快地进行。pH 6.0时，上述 所得的N-末端单个PEG化G-CSF和赖氨酸35单个PEG化G-CSF置 于含20mM磷酸钠、5mM醋酸钠、2.5％甘露醇、0.005％Tween-80， pH为6.0的缓冲液中至蛋白质终浓度为0.25mg/ml。每毫升等份液贮于 3ml无菌注射瓶中。每个注射瓶于4℃及29℃各保存16天。由SEC- HPLC绘图来分析其稳定性。如果后来的测量结果与最初测量结果(时间 =0)保持一致(由肉眼观察确定)，则样品在那段时间内被认为是稳 定的。 结果：如图6A-6C所示。 (a)4℃pH 6.0条件下比较。图6A显示pH 6.0,4℃条件下N-末 端单个PEG化G-CSF经过一定时间段后的SEC-HPLC图；图6B所示 为赖氨酸35单个PEG化G-CSF在pH 6.0,4℃条件下经过一定时间 段后的SEC-HPLC图。有一种解释认为赖氨酸35PEG化产物的裂解物 中，有的分子量正好与未修饰的G-CSF相近。 (b)pH 4.0,4℃条件下期限延长。pH 4.0,4℃条件下提供了的 控制条件是一个相当稳定的条件，在该条件下N-末端PEG化G-CSF 不降解。对于赖氨酸35PEG化产物，仍发生产物的降解，但其速率要缓 慢得多。 (c)pH 4.0,4℃条件下的稳定性比较。图6C显示在这些条件下， 延长时间期限时，G-CSSF的单个PEG化产物的SEC-HPLC图。从图 可以看出，在pH 6.0,4℃条件下，PEG化的赖氨酸35在16天或35 天时的去PEG水平增加不高于6天时所见水平(见图6B)。这意味着去 PEG化水平(不稳定性)有6天后，该条件下一直保持未变。
实施例2
本实施例陈述了一种利用还原性烷基化反应来制备单个PEG化G- CSF的基本上均一的群体的方法，和该群体的特征鉴定。在此使用了上面 实施例所述的重组G-CSF。可以看出，此方法不仅在制备N-末端化 学修饰的蛋白质方面具有优越性，而且本还原性烷基化反应过程中的胺 键产生实质上更稳定的产物，正如在贮存时聚集程度的较大差异所显示 的。
A．在N-末端α-氨基残基上附着的单甲氧聚乙二醇-GCSF连接 物的制备。
制备rhG-CSF反应溶液(1ml，浓度为5mg/ml，如上面实施例中 所述)，内含100mM磷酸钠，pH 5.0，还含有20mM NaCNBH3，将其充 分搅拌冷冻(4℃)后，加入摩尔数超出5倍的甲氧聚乙二醇醛(MPEG) (平均分子量为6kDa)。反应混合物在相同温度下持续搅拌。
反应过程中蛋白质的修饰程度用SEC-HPLC来对其监测，SEC- HPLC使用的是Bio-SilSEC 250-5柱(BIO-RAD)，在pH 6.8 条件下，用0.05M NaH2PO4,0.05M Na2HPO4,0.15M NaCl,0.01M NaN3，缓冲液以1ml/min流速进行洗脱。
10小时后SEC HPLC分析结果显示，已有92％的蛋白质转变成mono -MPEG-GCSF衍生物。这从图7可以看出，其中记录了蛋白质浓度(以 在A280处的吸光率测得)，显示了在8.72分钟时出现的单个PEG化G -CSF产物的洗脱峰，在9.78分钟出现的未发生反应的G-CSF的较小 洗脱峰。
作为比较图8显示了用MPEG的N-羟琥珀酰脂所得的峰。其分子量 也为6kDa.从图可以看出，在反应混合物中有：tri-MPEG-GCSF连 接物(峰肩均在7.25分钟)，di-MPEG-GCSF连接物(峰值在 7.62min)，mono-MPEG-GCSF连接物(峰值在9.87mi n)。
在10小时时间点，92％的蛋白质已被转化成单个PEG化产品，其 反应混合物的pH以100mM HCl调至pH 4.0，并用1mM HCl将反应混 合物稀释5倍。
mono-MPEG-GCSF衍生物用离子交换色谱法合用以20mM的醋酸钠 缓冲液pH为4.0平衡的HiLoad 16/10 S Sepharose HP柱 (Pharmacia)进行纯化。反应混合物以1ml/min流速装柱，未反应的 MPEG以3倍于柱体积的相同缓冲液进行洗脱。然后进行400分钟的线性 梯度洗脱，20mM醋酸钠浓度从0％～45％，pH 4.0，内含1M NaCl， 在4℃洗脱蛋白质-聚合物连接物。
将含mono-MPEG-GCSF衍生物的收集管合并，浓缩和过滤灭菌。
用不同平均分子量(12、20和25kDa)的MPEG醛修饰rh-G- CSF而得到的各种形式mono-MPEG-GCSF连接物以相似方法制备。
B．单个PEG化G-CSF的分析
1．分子量
利用SDS-PAGE，凝胶过滤，基质辅助激光解析质谱分析 (matrix assisted laser desorption)，以及平衡离心法测定单 个PEG化连接物的分子量。结果如下表4所示。
表4
  N-末端烷基化Mono-MPEG-GCSF连接物分子量 连接物    估计的    凝胶过滤    质谱测    超离心测
      分子量    测分子量    分子量    分子量 MPEG- (6kDa)-   24800       53024      24737     25548 G-CSF MPEG- (12kDa)-  30800       124343     30703     29711 GCSF MPEG- (20kDa)-  38800       221876     38577     38196 GCSF MPEG- (25kDa)-  43800       333266      N/D       N/D GCSF
制备的N-末端mono-MPEG-GCSF连接物结构以N-末端蛋白质 序列分析和肽酶切图谱法加以证实。N-末端用硫氨酰残基的溴化氰裂 解导致聚乙二醇分子的除去。
2．生物活性
PEG化MPEG-GCSF连接物的体外生物活性经过测定刺激鼠骨髓细胞 对3H胸腺嘧啶的吸收来测定。
体内生物活性经过将MPEG-GCSF连接物或rhG-CSF(100mg/克 体重剂量)皮下注射仓鼠后测量其总白细胞数目来测定。与未修饰的G -CSF相比，PEG化G-CSF生物活性的计算是以WB/时间曲线下面积减 去载体对照曲线下面积而得到的。MPEG-GCSF衍生物的相对活性的表 示是以其与未修饰的G-CSF相比的百分活性加以描述的。
如图9所示，显示了对用不同分子量(6kDa、12kDa及20kDa)的 MPEG醛经还原性烷基反应而制得的mono-N-末端MPEG-GCSF连接物 的总白细胞数目反应。从图可以看出，所有单个PEG化产物均诱导反应。 除了12kDa的PEG在第二天白细胞数目较20kDa PEG产物作用后白细胞 数目稍大外，所用的聚乙二醇分子量越大，获得的白细胞数目会越多。
3．稳定性研究
比较了用两种不同的化学方法(这里指胺及酰胺的还原性烷基化反 应)制备的N-末端PEG化G-CSF的聚合程度。出乎意料的是，发现 以胺键形成的N-末端PEG化G-CSF要比以酰胺键(实施例1中所述 的NHS法)形成的N-末端PEG化G-CSF稳定得多。
方法：两种形式的N-末端PEG化G-CSF产物置于pH 4.0的10mM NaOac中，其中含5％的山梨醇，蛋白质分子终浓度为每ml溶液中含1mg 蛋白质。G-CSF都用PEG6000PEG化。酰胺键连接物制备按实施例1， 胺键连接物制备按实施例2进行。每种形式的6等份样品在45℃保存8 周。8周后，以分子筛层析及离子交换色谱测定聚集程度。
结果：结果表明本发明的还原性烷基化反应产物要比乙酰化产物优 越得多，因为，令人吃惊的是，在升高的温度条件下产物经8周后，前 者的聚集程度要比后者的要小得多。下表为两种形式产物经分子筛层析 (SEC)或离子交换色谱(IE)分析后各自未发生聚集的百分数：
表5
      样本45℃下8周          ％主峰SEC/IE
       胺键产物                 82％/84％
       酰胺键产物               37％/65％*
*该值相对较高是因为离子交换色谱不能够进行聚集程度的彻底分 析。
实施例3
该实施例描述化学修饰的共有干扰素。更具体地说，该实施例描述 了一种制备单个PEG化IFN-con1的基本上均一的群体的方法，及该群 体的特征鉴定。
应该注意到，虽然本实施例中用的是IFN-con1，但上述的任一共 有干扰素均可被化学修饰。尽管本实施例中使用了聚乙二醇进行修饰， 但象这种化学修饰可用上述任一水溶性聚合物进行。对于PEG化作用， 虽然本实施例中使用的是PEG12000，但其它任何形式的水溶性PEG均可 使用(此处使用PEG12000是为了和易于处理和方便)。同样，这里也有 很多种化学修饰方法(诸如乙酰化反应)，但对于选择性N-末端化学 修饰(如N-末端PEG化反应)来说，最好还是用该实施例中所述的还 原性化反应。
A．共有干扰素的制备
干扰素IFN-αcon1(在这里指IFN-con1(可参见美国专利No. 4,695,623图2中的描述(引用其全文以供参考)它胜于制备单个PEG 化共有干扰素。IFN-con1是在细菌中表达外源性DNA而产生的，其N -末端具有一个甲硫氨酰残基。
B．共有干扰素的PEG化
IFN-con1溶液(3.45mg/ml，含35.25％的N-末端封闭形式) 溶于磷酸钠浓度为100mM,pH 4.0内含20mM NaCNBH3的溶液中，4℃ 冷却后充分混匀，加入超出8倍摩尔量的甲氧聚乙二醇醛(MPEG)(平 均分子量为12kDa)。
在反应过程中蛋白质的修饰程度用反相HPLC来监测，HPLC以多聚 (苯乙烯/二乙烯基苯)进行装柱，如PLRP-S(PL Seperation Sciences Polymer Labaratories)。
10小时后，反相HPLC分析结果表明，80％的N-末端具有未封闭 的α氨基的蛋白质转变成MPEG-IFN-con1衍生物。
在10小时时间点，反应混合物用水稀释5倍，mono-MPEG-IFN -con1衍生物的纯化用离子交换层析来完成，其所用的柱为Hiload 16/10 S Sepharose HP柱(Pharmacia)，以20mM的醋酸钠缓冲液 pH 4.0加以平衡。反应混合物以1ml/min的流速装入柱内，未反应的MPEG 醛以3倍于柱体积的相同缓冲液加以洗脱。然后在4℃条件下进行蛋白 质-聚合物连接物分子的洗脱，以0％～75％的20mM醋酸钠缓冲液进 行线性洗脱420分钟。缓冲液pH为4.0，含有1M NaCl。
合并含mono-MPEG-IFN-con1衍生物的馏分，经浓缩后再过滤 灭菌。
C．单个PEG化共有干扰素的分析
1．均一性
纯化的mono-MPEG-IFN-con1连接物均一性通过SDS-PAGE 加以检测，SDS-PAGE用的是10-20％或4-20％的预制梯度胶 (Integrated Separation System)。凝胶显示主要带在分子量为 35kDa处。
各种形式mono-MPEG-IFN-con1的有效半径(流体动力学半径) 测定用的是Superose 6HR 10/30(Pharmacia)凝胶过滤柱。在280nm 处经紫外吸收测定蛋白质。BIO-RAD凝胶过滤标准品作为球状蛋白质 分子量标记。
纯化的N-末端mono-MPEG-IFN-con1连接物结构采用N-末 端蛋白质测序及肽酶切图谱来加以证实。
在这里必须注意该IFN-con1制品中含有一些N-末端封闭物质， 它们未发生PEG化。然而，PEG化的物质匀为N-末端单个PEG化。因 而，在这种情况下，可考虑能用其它方法将末端封闭和未封闭的产物分 开，如用离子交换层析或分子筛分析法。
2．生物活性
mono-MPEG-IFN con1连接物体外生物活性是经过测定其抗病毒 活性来测定的。mono-MPEG-IFN con1连接物的体外生物活性经过测 定其在人(Hela)细胞中的抗病毒生物活性来确定。
发现mono-MPEG(12kDa)-IFN-con1连接物体外生物活性 (U/mg蛋白质为未修饰IFN-con1活性的20％。正如前面所述的PEG 化G-CSF，体外分析虽然对了解生物活性有一定作用，但由于特征性 缓慢释放，常测得的化学修饰蛋白质活性很低。体内生物活性要比体外 高。
D．N-末端封闭分子去除后化学修饰的共有干扰素。
前面所述的IFN-con1经预先去除其中的N-末端封闭分子部分之 后，也进行本发明的还原性烷基化反应。在上面所述的还原性烷基化反 应。在上面所述的还原性烷基化方法中使用了PEG12000和PEG20000两 种分子。
该分子的表观分子量如下
连接物           凝胶过滤测得的         SDS-PAG测得
                   表观分子量           的表观分子量 monoMPEG(12kDa)         104.0kDa             35.6kDa
IFN-con1 monoMPEG(20kDa)         175.1kDa             55.4kDa
IFN-con1
IFN-con1 20kDa PEG连接物的FPLC离子交换色谱分析结果中出 现3个峰：
MonoMPEG-IFN-con1：占总面积的66％(洗脱至265.93ml)。
蛋白质聚集物(aggregate)及寡聚MPEG-IFN-con1连接物： 占总面积的24％(洗脱至238.42ml)以及
未反应的IFN-con1：占10％的总面积(洗脱至328.77ml)。
该条件尚未进一步优化，可用色谱或其它方法进一步分离单个PEG 化的物质。
尽管用优选的实施例描述了本发明，但应明白对于本领域的技术人 员而言可进行变动和修改。因此，在所附的权利要求书中试图覆盖所有 落在所要求的本发明范围内的等价变化。
序列表 (1)一般信息：
(ⅰ)申请人：AMGEN INC
(ⅱ)发明题目：N-末端化学修饰的蛋白质组合物及方法。
(ⅲ  )序列个数：2
(ⅳ)联系地址：
 (A)地址：Amgen Inc.
 (B)街道：1840 Dehavilland Drive
 (C)城市：Thousand Daks
 (D)州：California
 (E)国家：USA
 (F)邮政区号：91320
(ⅴ)计算机可读形式：
 (A)贮存介质：软磁盘
 (B)计算机：IBM PC兼容机
 (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
 (D)软件：PatentIn Release#1.0,#1.2 5.版
(ⅵ)当前的申请资料：
 (A)申请号码：
 (B)申请日：
 (C)分类：
(ⅷ )代理人/代理信息：
 (A)姓名：Pessin,Karol M.
 (B)参考/摘要号：A-286 (2)SEQ ID NO:1信息：
(ⅰ)序列特征：
 (A)长度：531碱基对
 (B)类型：核酸
 (C)链型：单链
 (D)拓扑学特征：线形
(ⅱ)分子类型：cDNA
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1: ATGACTCCAT   TAGGTCCTGC   TTCTTCTCTG   CCGCAAAGCT   TTCTGCTGAA   ATGTCTGGAA   60 CAGGTTCGTA   AAATCCAGGG   TGACGGTGCT   GCACTGCAAG   AAAAACTGTG   CGCTACTTAC  120 AAACTGTGCC   ATCCGGAAGA   GCTGGTACTG   CTGGGTCATT   CTCTTGGGAT   CCCGTGGGCT  180 CCGCTGTCTT   CTTGTCCATC   TCAAGCTCTT   CAGCTGGCTG   GTTGTCTGTC   TCAACTGCAT  240 TCTGGTCTGT   TCCTGTATCA   GGGTCTTCTG   CAAGCTCTGG   AAGGTATCTC   TCCGGAACTG  300 GGTCCGACTC   TGGACACTCT   GCAGCTAGAT   GTAGCTGACT   TTGCTACTAC   TATTTGGCAA  360 CAGATGGAAG   AGCTCGGTAT   GGCACCAGCT   CTGCAACCGA   CTCAAGGTGC   TATGCCGGCA  420 TTCGCTTCTG   CATTCCAGCG   TCGTGCAGGA   GGTGTACTGG   TTGCTTCTCA   TCTGCAATCT  480 TTCCTGGAAG   TATCTTACCG   TGTTCTGCGT   CATCTGGCTC   AGCCGTAATA   G           531 (2)SEQ ID NO:2信息：
(ⅰ)序列特征：
 (A)长度：175氨基酸
 (B)类型：氨基酸
 (C)链型：单链
 (D)拓扑学特征：线形
(ⅱ )分子类型：蛋白质
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2: Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu 1                 5                  10                  15 Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu
         20                  25                  30 Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu
     35                  40                 45 Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser
 50                  55                  60 Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 65                   70                  75                  80 Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile
             85                  90                  95 Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala
        100                 105                 110 Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala
    115                 120                 125 Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala
130                 135                 140 Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 145                 150                 155                 160  Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro
            165                 170                 175