检测赤羽病抗体的胶体金试纸条及其制备方法
专利汇可以提供检测赤羽病抗体的胶体金试纸条及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了检测赤羽病 抗体 的胶体金 试纸 条及其制备方法，试纸条色括底衬，底衬上设置有吸 水 垫、 硝酸 纤维 素膜、玻璃纤维膜和样品垫，硝酸 纤维素 膜上设置有检测带和质控带，检测带中包被有G1重组蛋白，质控带中包被有赤羽病抗体，玻璃纤维膜中包被有胶体金-G1重组蛋白，G1重组蛋白的 氨 基酸序列如 序列表 SEQ ID NO.2所示；本发明具有检测简便、快捷、特异、敏感和成本低等优点；制备方法包括RNA制备、G1重组蛋白制备、胶体金-G1重组蛋白制备、赤羽病抗体制备和胶体金试纸条制备，该制备方法得到特异性好和敏感度高的本发明试纸条，该制备方法较简单，成本也较低。，下面是检测赤羽病抗体的胶体金试纸条及其制备方法专利的具体信息内容。
1.检测赤羽病抗体的胶体金试纸条，色括底衬，所述底衬上设置有吸水垫、硝酸纤维素膜、玻璃纤维膜和样品垫，所述硝酸纤维素膜上设置有检测带和质控带，其特征在于所述检测带中包被有G1重组蛋白，所述质控带中包被有赤羽病抗体，所述玻璃纤维膜中包被有胶体金-G1重组蛋白，所述G1重组蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ IDNO.2所示。
2.如权利要求1所述的检测赤羽病抗体的胶体金试纸条，其特征在于所述赤羽病抗体为多克隆抗体。
3.权利要求2所述的检测赤羽病抗体的胶体金试纸条的制备方法，其特征在于包括下述步骤：
1)RNA制备：用病毒RNA抽提试剂盒从赤羽病病毒中抽提分离囊膜糖蛋白G1基因，以该G1基因为模板进行RT-PCR扩增反应，测序，得到G1基因，所述G1基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，RT-PCR扩增反应的上游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示，下游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示；
2)G1重组蛋白制备：将上述G1基因构建到表达载体pET-28a(+)中得到重组质粒，再将该重组质粒导入表达宿主大肠杆菌BL21中，将该大肠杆菌BL21夜培养，按体积比
1∶200，将上述大肠杆菌BL21接种至LB培养基中，37℃培养至OD600为1时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷至其终浓度为1mmol/L，诱导表达4h，得到诱导菌液，将该诱导菌液
5000r/min离心10min，收集细菌沉淀，所述细菌沉淀先用0.01mol/L PH7.4磷酸盐缓冲液洗溶，然后5000r/min离心10min，重复洗离3次，得到去杂的细菌，根据Novagen公司的His.Bind Purification Kit说明书将去杂的细菌破碎、提取、纯化、层析、洗脱得到G1重组蛋白溶液，测序G1重组蛋白，该G1重组蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示，4℃冰箱保存备用；
3)胶体金-G1重组蛋白制备：用浓度为0.1mol/L K2CO3将胶体金溶液的pH值调节至7.9，然后在1mL的胶体金溶液中加入15.9ug的G1重组蛋白溶液，磁力搅拌混合均匀
30min，加入质量百分浓度为10％的牛血清白蛋白溶液，至牛血清白蛋白终浓度为1％，继续搅拌15min，再加入质量百分浓度为5％的聚乙二醇溶液，至聚乙二醇终浓度为0.5％，再继续搅拌15min，然后置于4℃冰箱过夜，次日以1500rpm离心10min，取上清液以13000rpm离心1h，在沉淀中边搅拌边加入胶体金溶液至沉淀溶解，得到胶体金-G1重组蛋白溶液，
4℃冰箱保存备用；
4)赤羽病抗体制备：按体积比1∶1，在赤羽病病毒中加入弗氏完全佐剂乳化为乳化液，用2ml注射器吸取上述乳化液1mL，注射至兔的腋下和腹股沟中，间隔14天，再吸取上述乳化液1.5mL，注射至兔的腋下和腹股沟中，间隔10天后，从耳静脉采血0.5～1.0ml，分离血清，以双相琼脂扩散试验测定免疫血清的抗体效价，在抗体效价不低于1∶16时，放兔血并分离血清，该血清即为多克隆的赤羽病抗体溶液；
5)胶体金试纸条制备：将上述G1重组蛋白溶液喷在硝酸纤维素膜的检测带上烘干备用，将上述赤羽病抗体溶液喷在硝酸纤维素膜的质控带上烘干备用，将上述胶体金-G1重组蛋白溶液喷在玻璃纤维膜上烘干备用，在不干胶的底衬上按顺序贴附吸水垫、含有G1重组蛋白和赤羽病抗体的硝酸纤维膜、含有胶体金-G1重组蛋白的玻璃纤维膜、样品垫，然后切割成4mm宽的纸条，得到胶体金试纸条。
检测赤羽病抗体的胶体金试纸条及其制备方法
技术领域
背景技术
发明内容
13000rpm离心1h，在沉淀中边搅拌边加入胶体金溶液至沉淀溶解，得到胶体金-G1重组蛋白溶液，4℃冰箱保存备用；胶体金溶液配制为常规方法，在此不作表述；
具体实施方式
10000r/min离心15min，取10mL上清加入到处理好的Ni2+NTA(1mL)柱中，上清与树脂悬浮作用30min后，依次用10mL denaturing bindingbuffer(pH7.9)、40mL denaturing washing buffer(pH7.9)、8mL denaturing elutionbuffer(pH7.9)过柱，取不同时间的洗液进行SDS-PAGE电泳分析纯化结果；薄层扫描分析纯化蛋白的浓度。
1h，在沉淀中边搅拌边加入胶体金溶液至沉淀溶解，得到胶体金-G1重组蛋白溶液，4℃冰箱保存备用。
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