细胞表面缀合物及相关的细胞组合物和方法
阅读：97发布：2020-10-10
专利汇可以提供细胞表面缀合物及相关的细胞组合物和方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本文提供了含有细胞表面分子和至少一种药剂如至少一种亲和标签的细胞表面缀合物，以及表达此类细胞表面缀合物的工程化细胞。在一些实施方案中，所述细胞表面分子不含有细胞内 信号 传导结构域或不能介导细胞内信号传导。在一些实施方案中，被工程化以含有所述细胞表面缀合物的细胞如T细胞进一步含有特异性地结合 抗原 的基因工程化重组受体，如嵌合抗原受体(CAR)。还提供了检测、鉴定、选择或靶向表达所述细胞表面缀合物的细胞的方法，所述方法例如结合制造工程化细胞的方法或结合将此类细胞向受试者的给予，包括过继 细胞疗法 的方法。，下面是细胞表面缀合物及相关的细胞组合物和方法专利的具体信息内容。
1.一种细胞表面缀合物，其包含：
(a)细胞表面分子，所述细胞表面分子缺乏功能性细胞内信号传导结构域和/或不能介
导细胞内信号传导；以及
(b)与所述细胞表面分子连接的至少一种药剂，所述药剂能够结合链霉亲和素、链霉亲
和素类似物或链霉亲和素突变蛋白。
2.权利要求1的细胞表面缀合物，其中所述药剂展现平衡解离常数(KD)为从或从约10-
4M至或至约10-10M的对链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白的结合亲和力。
3.一种细胞表面缀合物，其包含：
(a)细胞表面分子，所述细胞表面分子缺乏功能性细胞内信号传导结构域和/或不能介
导细胞内信号传导；以及
(b)至少一种药剂，所述至少一种药剂被连接至所述细胞表面分子并且能够可逆地结
合试剂和/或能够在竞争物质的存在下被竞争，其中所述药剂是长度为小于50个氨基酸的肽。
4.权利要求3的细胞表面缀合物，其中所述药剂展现平衡解离常数(KD)为从或从约10-
4M至或至约10-10M的对所述试剂的结合亲和力。
5.权利要求3或权利要求4的细胞表面缀合物，其中所述试剂是链霉亲和素、链霉亲和
素类似物或链霉亲和素突变蛋白。
6.一种细胞表面缀合物，其包含：
(a)细胞表面分子，所述细胞表面分子缺乏功能性细胞内信号传导结构域和/或不能介
导细胞内信号传导；以及
(b)与所述细胞表面分子连接的至少一种药剂，所述药剂具有平衡解离常数(KD)为大于
10-7M或平衡缔合常数(KA)为小于107M-1的对试剂的结合亲和力。
7.权利要求6的细胞表面缀合物，其中所述试剂是链霉亲和素、链霉亲和素类似物或链
霉亲和素突变蛋白。
8.权利要求1-7中任一项的细胞表面缀合物，其中所述细胞表面分子包含跨膜结构域
和/或能够在所述细胞的表面上表达。
9.权利要求1-8中任一项的细胞表面缀合物，其中与参考细胞表面分子相比，所述细胞
表面分子是经修饰的，任选地其中所述参考细胞表面分子是包含细胞内信号传导结构域的细胞表面受体。
10.权利要求9的细胞表面缀合物，其中与所述参考细胞表面分子相比，所述经修饰的
细胞表面分子展现改变的细胞内化、酶促活性和/或配体结合。
11.一种细胞表面缀合物，其包含：
(a)与参考细胞表面分子相比被修饰的细胞表面分子，其中与所述参考细胞表面分子
相比，所述经修饰的细胞表面分子展现改变的细胞内化、酶促活性和/或配体结合；以及(b)与所述细胞表面分子连接的至少一种药剂，所述药剂能够结合链霉亲和素、链霉亲
和素类似物或链霉亲和素突变蛋白。
12.权利要求11的细胞表面缀合物，其中所述细胞表面分子缺乏功能性细胞内信号传
导结构域和/或不能介导细胞内信号传导。
13.一种细胞表面缀合物，其包含：
(a)包含前列腺特异性膜抗原(PSMA)的细胞表面分子或其经修饰的细胞表面分子；以
及
(b)与所述细胞表面分子连接的至少一种药剂，所述药剂能够结合链霉亲和素、链霉亲
和素类似物或链霉亲和素突变蛋白。
14.权利要求13的细胞表面缀合物，其中：
所述经修饰的细胞表面分子缺乏功能性细胞内信号传导结构域和/或不能介导细胞内
信号传导；和/或
所述经修饰的细胞表面分子与参考细胞表面分子相比被修饰，其中与所述参考细胞表
面分子相比，所述经修饰的细胞表面分子展现改变的细胞内化、酶促活性和/或配体结合。
15.权利要求11-14中任一项的细胞表面缀合物，其中所述细胞表面分子包含跨膜结构
域和/或能够在所述细胞的表面上表达。
16.权利要求11-15中任一项的细胞表面缀合物，其中所述药剂展现平衡解离常数(KD)
为从或从约10-4M至或至约10-10M的对链霉亲和素、链霉亲和素类似物或链霉亲和素突变蛋白的结合亲和力。
17.权利要求1-16中任一项的细胞表面缀合物，其中所述药剂与所述试剂的结合是可
逆的和/或能够在竞争物质的存在下被竞争。
18.权利要求17的细胞表面缀合物，其中所述竞争物质对所述试剂展现的结合亲和力
高于所述药剂对所述试剂展现的结合亲和力。
19.权利要求18的细胞表面缀合物，其中：
所述竞争物质展现平衡解离常数(KD)为在或约在10-10M与10-14M之间的对所述试剂的结
合亲和力；和/或
所述药剂展现平衡解离常数(KD)为大于10-10M的对所述试剂的结合亲和力。
20.权利要求1、2、5、7-20中任一项的细胞表面缀合物，其中所述药剂与所述链霉亲和
素、链霉亲和素类似物或链霉亲和素突变蛋白的结合是可逆的和/或能够在生物素、生物素类似物或其生物活性片段的存在下被竞争。
21.权利要求1-20中任一项的细胞表面缀合物，其中所述至少一种药剂直接与所述细
胞表面分子连接。
22.权利要求1-20中任一项的细胞表面缀合物，其中所述至少一种药剂经由至少一个
接头间接与所述细胞表面分子连接。
23.权利要求1-22中任一项的细胞表面缀合物，其中所述至少一种药剂包含从或从约1
种至4种、或1种至2种药剂。
24.权利要求1-23中任一项的细胞表面缀合物，其中所述至少一种药剂仅包含一种药
剂。
25.权利要求1-24中任一项的细胞表面缀合物，其中所述药剂与所述细胞表面分子的
细胞外部分或区域连接，任选地其中所述细胞外部分或区域位于所述细胞表面分子的N末端或C末端。
26.权利要求1-25中任一项的细胞表面缀合物，其中所述药剂被连接在所述细胞表面
分子的N末端。
27.权利要求1-26中任一项的细胞表面缀合物，其中所述药剂被连接在所述细胞表面
分子的C末端。
28.一种细胞表面缀合物，所述细胞表面缀合物包含在所述细胞表面分子的细胞外部
分或区域与药剂连接的细胞表面分子，所述药剂能够结合作为或包含链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白的试剂，任选地其中所述细胞外部分或区域位于所述细胞表面分子的N末端或C末端。
29.一种细胞表面缀合物，所述细胞表面缀合物包含在所述细胞表面分子的细胞外部
分或区域与药剂连接的细胞表面分子，所述药剂能够可逆地结合试剂，其中所述药剂是长度为小于50个氨基酸的肽，任选地其中所述细胞外部分或区域位于所述细胞表面分子的N末端或C末端。
30.权利要求28或权利要求29的细胞表面缀合物，其中所述药剂展现平衡解离常数(KD)
为从或从约10-4M至或至约10-10M的结合亲和力。
31.一种细胞表面缀合物，所述细胞表面缀合物包含在所述细胞表面分子的细胞外部
分或区域与药剂连接的细胞表面分子，其中所述药剂展现平衡解离常数(KD)为大于10-7M或平衡缔合常数(KA)为小于107M-1的对试剂的结合亲和力，任选地其中所述细胞外部分或区域位于所述细胞表面分子的N末端或C末端。
32.权利要求28-31中任一项的细胞表面缀合物，其中所述药剂被连接在所述细胞表面
分子的N末端。
33.权利要求28-31中任一项的细胞表面缀合物，其中所述药剂被连接在所述细胞表面
分子的C末端。
34.权利要求28-33中任一项的细胞表面缀合物，其中所述试剂是或包含链霉亲和素、
链霉亲和素类似物或链霉亲和素突变蛋白。
35.权利要求28-34中任一项的细胞表面缀合物，其中所述药剂与所述试剂的结合是可
逆的和/或能够在竞争物质的存在下被竞争。
36.权利要求35的细胞表面缀合物，其中所述竞争物质对所述试剂展现的结合亲和力
高于所述药剂对所述试剂展现的结合亲和力。
37.权利要求36的细胞表面缀合物，其中：
所述竞争物质展现平衡解离常数(KD)为在或约在10-10M与10-14M之间的对所述试剂的结
合亲和力；和/或
所述药剂展现平衡解离常数(KD)为大于10-10M的对所述试剂的结合亲和力。
38.权利要求28、34-37中任一项的细胞表面缀合物，其中所述药剂与所述链霉亲和素、
链霉亲和素类似物或链霉亲和素突变蛋白的结合是可逆的和/或能够在生物素或生物素类似物的存在下被竞争。
39.权利要求28-38中任一项的细胞表面缀合物，其中所述药剂直接与所述细胞表面分
子连接。
40.权利要求28-38中任一项的细胞表面缀合物，其中所述药剂经由至少一个接头间接
与所述细胞表面分子连接。
41.权利要求28-40中任一项的细胞表面缀合物，其中所述细胞表面分子仅与一种药剂
连接。
42.权利要求1-41中任一项的细胞表面缀合物，其中所述细胞表面分子不是嵌合抗原
受体(CAR)。
43.权利要求28-30中任一项的细胞表面缀合物，其中所述细胞表面分子与参考细胞表
面分子相比是经修饰的。
44.权利要求43的细胞表面缀合物，其中所述经修饰的细胞表面分子缺乏功能性细胞
内信号传导结构域和/或不能介导细胞内信号传导；和/或与所述参考细胞表面分子相比，所述经修饰的细胞表面分子展现改变的细胞内化、酶促活性和/或配体结合。
45.权利要求43或权利要求44的细胞表面缀合物，其中所述参考细胞表面分子是天然
哺乳动物细胞表面分子。
46.权利要求1-45中任一项的细胞表面缀合物，其中所述细胞表面分子包含能够由抗
体或其抗原结合片段识别的表位。
47.权利要求1-33中任一项的细胞表面缀合物，其是融合蛋白。
48.权利要求1、2、5、7-28和34-47中任一项的细胞表面缀合物，其中参考在SEQ ID NO:
1中所示的氨基酸序列中的在链霉亲和素中的位置，在与位置44至47对应的序列位置处，所述链霉亲和素类似物或突变蛋白包含氨基酸序列Val44-Thr45-Ala46-Arg47或Ile44-Gly45-Ala46-Arg47。
49.权利要求1、2、5、7-28和34-48中任一项的细胞表面缀合物，其中所述链霉亲和素类似物或突变蛋白包含：
a)在SEQ ID NO:3-6、27和28中任一个中所示的氨基酸序列；
b)如下氨基酸序列，所述氨基酸序列展现与SEQ ID NO:3-6、27和28中任一个至少或至
少约85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或更高序列同一性并且含有与Val44-Thr45-Ala46-Arg47或Ile44-Gly45-Ala46-Arg47对应的氨基酸序列并且可逆地结合所述药剂；或
c)a)或b)的功能片段，所述功能片段结合所述药剂。
50.权利要求48或权利要求49的细胞表面缀合物，其中参考在SEQ ID NO:1中所示的氨
基酸序列中的在链霉亲和素中的位置，在与117、120和/或121对应的位置处，所述链霉亲和素类似物或突变蛋白进一步包含一个或多个氨基酸置换。
51.权利要求50的细胞表面缀合物，其中：
所述一个或多个氨基酸置换选自Glu117、Asp117、Arg117、Ser120、Ala120、Gly120、Trp121、Tyr121或Phe121；或
所述一个或多个氨基酸置换选自Glu117、Gly120或Tyr121中的一个或多个；
或
所述氨基酸置换选自Glu117、Gly120或Tyr121。
52.权利要求1、2、5、7-28和34-51中任一项的细胞表面缀合物，其中所述链霉亲和素类似物或突变蛋白包含：
a)在SEQ ID NO:27或28中所示的氨基酸序列；
b)如下氨基酸序列，所述氨基酸序列展现与SEQ ID NO:27或28至少或至少约85％、
86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性并且含有与Val44、Thr45、Ala46、Arg47、Glu117、Gly120和Tyr121对应的氨基酸序列并且可逆地结合所述药剂；或
c)a)或b)的功能片段，所述功能片段结合所述药剂。
53.权利要求3-5、17-19和35-37中任一项的细胞表面缀合物，其中所述竞争物质是或
包含生物素、生物素类似物或其生物活性片段。
54.权利要求1-53中任一项的细胞表面缀合物，其中所述药剂是亲和标签。
55.权利要求3、4、6、8-10、17-19、21-27、29-33、35-37、39-47和54中任一项的细胞表面缀合物，其中所述药剂是或包含Strep标签、His标签、Flag标签、Xpress标签、Avi标签、钙调蛋白标签、聚谷氨酸盐标签、HA标签、Myc标签、Nus标签、S标签、X标签、SBP标签、Softag、V5标签、CBP、GST、MBP、GFP、硫氧还蛋白标签或其任何组合。
56.权利要求1-55中任一项的细胞表面缀合物，其中所述药剂是或包含一种或多种链
霉亲和素结合肽，其任选地是Strep标签。
57.权利要求56的细胞表面缀合物，其中所述链霉亲和素结合肽包含序列Trp-Ser-
His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:8)或Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(SEQ ID NO:7)。
58.权利要求56或权利要求57的细胞表面缀合物，其中所述药剂包含序列Trp-Ser-
His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ
ID NO:17)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-
Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:18)和Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-
(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:19)。
59.权利要求9-58中任一项的细胞表面缀合物，其中所述参考细胞表面分子是细胞表
面受体、配体、糖蛋白、细胞粘附分子、抗原、整合素或分化簇(CD)。
60.权利要求59的细胞表面缀合物，其中所述参考细胞表面分子是细胞表面受体。
61.权利要求9-60中任一项的细胞表面缀合物，其中所述参考细胞表面分子选自
EpCAM；VEGFR；整合素，任选地整合素αvβ3、α4、αIIbβ3、α4β7、α5β1、αvβ3或αv；TNF受体超家族的成员，任选地TRAIL-R1或TRAIL-R2；表皮生长因子受体家族的成员；PDGF受体；干扰素受体；叶酸受体；GPNMB；ICAM-1；HLA-DR；CEA；CA-125；MUC1；TAG-72；IL-6受体；5T4；GD2；
GD3；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；或分化簇细胞表面分子，任选地CD2、CD3、CD4、CD5、CD11、CD11a/LFA-1、CD15、CD18/ITGB2、CD19、CD20、CD22、CD23/IgE受体、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD41、CD44、CD51、CD52、CD62L、CD74、CD80、CD125、CD147/基础免疫球蛋白、CD152/CTLA-4、CD154/CD40L、CD195/CCR5和CD319/SLAMF7。
62.权利要求9-61中任一项的细胞表面缀合物，其中所述参考细胞表面分子是表皮生
长因子受体家族的成员。
63.权利要求9-62中任一项的细胞表面缀合物，其中所述参考细胞表面分子是表皮生
长因子受体(EGFR)、erbB-2受体酪氨酸蛋白激酶(errb2，HER2)、erbB-3受体酪氨酸蛋白激酶、erbB-4受体酪氨酸蛋白激酶、肝细胞生长因子受体(HGFR/c-MET)或胰岛素样生长因子受体-1(IGF-1R)。
64.权利要求9-63中任一项的细胞表面缀合物，其中所述参考细胞表面分子是人的。
65.权利要求9-64中任一项的细胞表面缀合物，其中所述经修饰的细胞表面分子缺乏
功能性细胞内信号传导结构域和/或不能介导细胞内信号传导。
66.权利要求9-65中任一项的细胞表面缀合物，其中与所述参考细胞表面分子相比，所
述经修饰的细胞表面分子被截短以缺乏所述细胞内信号传导结构域或运输结构域的全部
或一部分。
67.权利要求9-66中任一项的细胞表面缀合物，其中与所述参考细胞表面分子相比，所
述经修饰的细胞表面分子展现改变的细胞内化、酶促活性和/或配体结合。
68.权利要求9-67中任一项的细胞表面缀合物，其中所述经修饰的细胞表面分子包含
所述参考细胞表面分子的一个或多个细胞外结构域。
69.权利要求9-68中任一项的细胞表面缀合物，其中所述经修饰的细胞表面分子能够
结合所述参考细胞表面分子的天然配体和/或底物。
70.权利要求9-68中任一项的细胞表面缀合物，其中所述经修饰的细胞表面分子与所
述参考细胞表面分子的天然配体和/或底物的结合减少，或所述经修饰的细胞表面分子不结合所述参考细胞表面分子的天然配体和/或底物。
71.权利要求70的细胞表面缀合物，其中所述经修饰的细胞表面分子包含所述参考细
胞表面分子的至少一个细胞外结构域，但缺乏由所述参考细胞表面分子的天然配体和/或底物识别的一个或多个其他细胞外结构域。
72.权利要求71的细胞表面缀合物，其中所述至少一个细胞外结构域包含由特异性地
结合所述参考细胞表面分子的抗体或其抗原结合片段识别的表位。
73.权利要求46-72中任一项的细胞表面缀合物，其中所述抗体或抗原结合片段选自
AMG-102、AMG-479、BIIB022OA-5D5、CP-751,871、IMC-Al2、R1507、3F8、阿巴伏单抗、阿昔单抗、阿德木单抗、阿夫土珠、阿仑单抗、喷替酸阿妥莫单抗、麻安莫单抗、阿泊珠单抗、阿西莫单抗、阿塞珠单抗、阿特珠单抗(＝托西珠单抗)、巴利昔单抗、贝妥莫单抗、贝那利珠单抗、贝索单抗、莫比伐珠单抗、博纳吐单抗、本妥昔单抗、莫坎妥珠单抗、卡罗单抗喷地肽、卡妥索单抗、CC49、西利珠单抗、西莫白介素、西妥昔单抗、西妥木单抗、克立昔单抗、泰坦-克利妥珠单抗、CNTO-95、可那木单抗、达西珠单抗、达利珠单抗、达雷木单抗、地莫单抗、依美昔单抗、厄妥索单抗、依决洛单抗、依法利珠单抗、埃罗妥珠单抗、PEG化恩莫单抗、西依匹莫单抗、依帕珠单抗、厄利珠单抗、埃达珠单抗、法索单抗、法拉莫单抗、法勒珠单抗、芬妥木单抗、加利昔单抗、加维莫单抗、吉妥单抗、维汀-格仑妥木单抗、戈利昔单抗、伊巴利珠单抗、替伊莫单抗、伊戈伏单抗、英妥木单抗、伊妥木单抗、伊诺莫单抗、奥英妥珠单抗、伊匹木单抗、凯利昔单抗、拉贝珠单抗、林妥珠单抗、来沙木单抗、鲁卡木单抗、鲁昔单抗、马帕木单抗、马司莫单抗、马妥珠单抗、米拉妥珠单抗、明瑞莫单抗、米妥莫单抗、莫罗单抗-CD3、他那莫单抗、那他株单抗、耐昔妥珠单抗、奥瑞珠单抗、奥度莫单抗、奥法木单抗、奥拉单抗、莫奥珠单抗、奥戈伏单抗、奥昔珠单抗、帕尼单抗、帕妥珠单抗、喷妥莫单抗、普立昔单抗、PRO
140、尼妥珠单抗、罗妥木单抗、利妥昔单抗、罗维珠单抗、鲁利单抗、沙妥莫单抗喷地肽、西利珠单抗、索土珠单抗、他多赛珠单抗、帕他普莫单抗、替奈昔单抗、特普利珠单抗、
TGN1412、替西木单抗(＝曲美木单抗)、替加珠单抗、托西珠单抗(＝atlizumab)、托利珠单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗、曲美木单抗、妥考妥珠单抗、维多株单抗、维妥珠单抗、维西珠单抗、vitaxin、伏洛昔单抗、伏妥莫单抗、扎鲁木单抗、扎木单抗、齐拉木单抗、阿佐莫单抗、阿特珠单抗、贝伐珠单抗 地诺单抗、地努图希单抗、纳武单抗、奥滨尤妥珠单
抗、派姆单抗、皮地利珠单抗(CT-011)、雷莫芦单抗、司妥昔单抗、曲妥珠单抗-美坦新偶联物、CEA-scan Fab片段、OC125单克隆抗体、ab75705、B72.3、MPDL3280A、MSB001078C、MEDI4736、或其抗原结合片段。
74.权利要求9-73中任一项的细胞表面缀合物，其中所述参考细胞表面分子是参考
EGFR，并且所述经修饰的细胞表面分子是经修饰的EGFR。
75.权利要求74的细胞表面缀合物，其中所述经修饰的EGFR包含由西妥昔单抗或其抗
原结合片段特异性识别的表位。
76.权利要求74或权利要求75的细胞表面缀合物，其中所述经修饰的EGFR缺乏所述参
考EGFR的EGFR结构域I、EGFR结构域II、EGFR近膜结构域和EGFR酪氨酸激酶结构域中的一个或多个。
77.权利要求74-76中任一项的细胞表面缀合物，其中所述经修饰的EGFR缺乏所述参考
EGFR的EGFR结构域I、EGFR结构域II、EGFR近膜结构域和EGFR酪氨酸激酶结构域中的全部结构域。
78.权利要求74-77中任一项的细胞表面缀合物，其中所述经修饰的EGFR包含细胞外结
构域，所述细胞外结构域由所述参考EGFR的亚结构域III和亚结构域IV组成或基本上由其组成。
79.权利要求74-78中任一项的细胞表面缀合物，其中所述经修饰的EGFR包含在SEQ ID
NO:44或46中所示的氨基酸序列或展现与SEQ ID NO:44或46至少或至少约85％、90％或
95％序列同一性的氨基酸序列。
80.权利要求9-73中任一项的细胞表面缀合物，其中所述参考细胞表面分子是参考
HER2，并且所述经修饰的细胞表面分子是经修饰的HER2。
81.权利要求80的细胞表面缀合物，其中所述经修饰的HER2包含由曲妥珠单抗或其抗
原结合片段特异性识别的表位。
82.权利要求80或权利要求81的细胞表面缀合物，其中所述经修饰的HER2缺乏所述参
考HER2的HER2结构域I、HER2结构域II、HER2结构域III中的一个或多个。
83.权利要求80-82中任一项的细胞表面缀合物，其中所述经修饰的HER2缺乏所述参考
HER2的HER2结构域I、HER2结构域II和HER2结构域III中的全部结构域。
84.权利要求80-83中任一项的细胞表面缀合物，其中所述经修饰的HER2包含细胞外结
构域，所述细胞外结构域由所述参考HER2的结构域IV组成或基本上由其组成。
85.权利要求80-84中任一项的细胞表面缀合物，其中所述经修饰的HER2包含在SEQ ID
NO:92中所示的氨基酸序列或展现与SEQ ID NO:92至少或至少约85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。
86.权利要求9-72中任一项的细胞表面缀合物，其中所述参考细胞表面分子是参考
PSMA，并且所述经修饰的细胞表面分子是经修饰的PSMA。
87.权利要求86的细胞表面缀合物，其中所述参考PSMA是野生型PSMA，任选地野生型人
PSMA。
88.权利要求87的细胞表面缀合物，其中所述参考PSMA是人PSMA和/或包含SEQ ID NO:
94中所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO:96或97中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
89.权利要求86-88中任一项的细胞表面缀合物，其中所述经修饰的PSMA包含所述参考
PSMA的细胞外部分和跨膜结构域。
90.权利要求86-89中任一项的细胞表面缀合物，其中与所述参考PSMA相比，所述经修
饰的PSMA在所述细胞内区域中包含一个或多个氨基酸修饰。
91.权利要求86-90中任一项的细胞表面缀合物，其中所述一个或多个氨基酸修饰包含
一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。
92.权利要求86-91中任一项的细胞表面缀合物，其中与所述参考PSMA相比，所述经修
饰的PSMA展现改变的细胞内化。
93.权利要求86-92中任一项的细胞表面缀合物，其中参考在SEQ ID NO:94中所示的氨
基酸序列中的位置，所述经修饰的PSMA包含与W2G对应的氨基酸取代或者不包含W2或者不包含在位置2处的任何残基。
94.权利要求86-93中任一项的细胞表面缀合物，其中与所述参考PSMA相比，所述经修
饰的PSMA包含11个N末端氨基酸的缺失或截短。
95.权利要求86-94中任一项的细胞表面缀合物，其中所述经修饰的PSMA包含能够由抗
体或其抗原结合片段识别的表位。
96.权利要求95的细胞表面缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段选自J591、DFO-
J591、CYT-356、J415、3/A12、3/F11、3/E7、D2B、107-1A4、YPSMA-1、YPSMA-2、3E6、2G7、
24.4E6、GCP-02、GCP-04、GCP-05、J533、E99、1G9、3C6、4.40、026、D7-Fc、D7-CH3、4D4、A5、及其抗原结合片段。
97.权利要求1-96中任一项的细胞表面缀合物，其中所述细胞表面缀合物不是免疫原
性的和/或在给予它的受试者中不诱导免疫应答。
98.一种多核苷酸，其包含编码权利要求1-97中任一项的细胞表面缀合物的核酸序列。
99.权利要求98的多核苷酸，其中所述核酸序列进一步包含信号序列。
100.权利要求99的多核苷酸，其中所述信号序列编码源自GMCSFRα链的信号肽。
101.权利要求98-100中任一项的多核苷酸，其中所述核酸序列是第一核酸序列，并且
所述多核苷酸进一步包含编码重组受体的第二核酸序列。
102.权利要求101的多核苷酸，其中所述重组受体是或包含嵌合抗原受体(CAR)。
103.权利要求101或权利要求102的多核苷酸，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸
序列被内部核糖体进入位点(IRES)或者编码自切割肽或导致核糖体跳跃的肽的核苷酸序
列分开，所述自切割肽或导致核糖体跳跃的肽任选地是T2A、P2A、E2A或F2A。
104.权利要求101-103中任一项的多核苷酸，其中所述第一核酸序列在所述第二核酸
序列的上游。
105.权利要求101-103中任一项的多核苷酸，其中所述第一核酸序列在所述第二核酸
序列的下游。
106.一种载体，其包含权利要求98-105中任一项的多核苷酸。
107.权利要求106的载体，其是病毒载体。
108.权利要求106或权利要求107的载体，其是逆转录病毒载体。
109.权利要求106-108中任一项的载体，其是慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。
110.一种产生工程化细胞的方法，所述方法包括将权利要求96-105中任一项的多核苷
酸或权利要求106-109中任一项的载体引入细胞中。
111.一种工程化细胞，其通过权利要求110的方法产生。
112.一种工程化细胞，其包含权利要求98-105中任一项的多核苷酸或权利要求106-
109中任一项的载体。
113.一种工程化细胞，其包含权利要求1-97中任一项的细胞表面缀合物。
114.权利要求113的工程化细胞，其进一步包含：重组受体。
115.权利要求114的工程化细胞，其中所述重组受体能够结合靶抗原，所述靶抗原与疾
病或障碍的细胞或组织相关、对疾病或障碍的细胞或组织是特异的和/或在疾病或障碍的细胞或组织上表达。
116.权利要求115的工程化细胞，其中所述疾病或障碍是感染性疾病或障碍、自身免疫
性疾病、炎性疾病、或肿瘤或癌症。
117.权利要求115或权利要求116的工程化细胞，其中所述靶抗原是肿瘤抗原。
118.权利要求115-117中任一项的工程化细胞，其中所述靶抗原选自αvβ6整合素(avb6
整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、CC基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、表皮生长因子蛋白(EGFR)、截短的表皮生长因子蛋白(tEGFR)、III型表皮生长因子受体突变(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2
(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、G蛋白偶联受体5D(GPCR5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Ra)、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、间皮素、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、天然杀伤组2成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Wilms肿瘤1(WT-1)。
119.权利要求115-118中任一项的工程化细胞，其中所述靶抗原选自ROR1、HER2、L1-
CAM、CD19、CD20、CD22、间皮素、CEA、乙型肝炎表面抗原、抗叶酸受体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP-2、EGP-4、EPHa2、ErbB2、ErbB3、ErbB4、FBP、胎儿乙酰胆碱e受体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、kdr、κ轻链、路易斯Y、L1-细胞粘附分子、MAGE-A1、间皮素、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2D配体、NY-ESO-1、MART-1、gp100、癌胚胎抗原、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原、PSMA、雌激素受体、孕酮受体、肝配蛋白B2、CD123、CS-1、c-Met、GD-2、MAGE A3、CE7、Wilms肿瘤1(WT-1)和细胞周期蛋白A1(CCNA1)。
120.权利要求114-119中任一项的工程化细胞，其中所述重组受体是功能性非TCR抗原
受体或转基因TCR。
121.权利要求114-120中任一项的工程化细胞，其中所述重组受体是嵌合抗原受体
(CAR)。
122.权利要求114-121中任一项的工程化细胞，其中所述重组受体包含含有抗原结合
结构域的细胞外部分。
123.权利要求122的工程化细胞，其中所述抗原结合结构域是或包含抗体或抗体片段。
124.权利要求123的工程化细胞，其中所述抗体片段是单链片段。
125.权利要求123或权利要求124的工程化细胞，其中所述片段包含通过柔性接头连接
的抗体可变区。
126.权利要求123-125中任一项的工程化细胞，其中所述片段包含scFv。
127.权利要求114-126中任一项的工程化细胞，其中所述重组受体包含细胞内信号传
导区域。
128.权利要求127的工程化细胞，其中所述细胞内信号传导区域包含细胞内信号传导
结构域。
129.权利要求128的工程化细胞，其中所述细胞内信号传导结构域是或包含主要信号
传导结构域、能够在T细胞中诱导初级激活信号的信号传导结构域、T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域和/或包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的信号传导结构域。
130.权利要求128或权利要求129的工程化细胞，其中所述细胞内信号传导结构域是或
包含CD3链的细胞内信号传导结构域，任选地CD3-zeta(CD3ζ)链或其信号传导部分。
131.权利要求127-130中任一项的工程化细胞，其进一步包含设置在所述细胞外结构
域与所述细胞内信号传导区域之间的跨膜结构域。
132.权利要求127-131中任一项的工程化细胞，其中所述细胞内信号传导区域进一步
包含共刺激信号传导结构域。
133.权利要求132的工程化细胞，其中所述共刺激信号传导结构域包含T细胞共刺激分
子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
134.权利要求132或权利要求133的工程化细胞，其中所述共刺激信号传导结构域包含
CD28、4-1BB或ICOS的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
135.权利要求132-134中任一项的工程化细胞，其中所述共刺激信号传导结构域位于
所述跨膜结构域与所述细胞内信号传导结构域之间。
136.权利要求111-135中任一项的工程化细胞，其中所述细胞是免疫细胞。
137.权利要求136的工程化细胞，其中所述细胞是淋巴细胞。
138.权利要求111-137中任一项的工程化细胞，其中所述细胞是T细胞或NK细胞。
139.权利要求138的工程化细胞，其中所述细胞是T细胞，所述T细胞是CD8+T细胞或CD4
+T细胞。
140.一种组合物，其包含权利要求111-139中任一项的工程化细胞。
141.权利要求140的组合物，其进一步包含药学上可接受的赋形剂。
142.一种治疗方法，其包括将权利要求111-139中任一项的工程化细胞或权利要求140
或权利要求141的组合物给予至患有疾病或障碍的受试者。
143.权利要求142的方法，其中所述疾病或障碍是癌症、肿瘤、自身免疫性疾病或障碍、或感染性疾病。
144.权利要求142或权利要求143的方法，其进一步包括向所述受试者给予结合分子，
所述结合分子能够识别在所述工程化细胞上表达的所述细胞表面缀合物的所述药剂；并且检测表达所述细胞表面缀合物的细胞。
145.权利要求144的方法，其中检测包括体内成像。
146.一种鉴定表达细胞表面缀合物的细胞的方法，所述方法包括使包含表达或可能表
达权利要求1-97中任一项的细胞表面缀合物的细胞或权利要求111-139中任一项的工程化细胞的组合物、或权利要求140或权利要求141的组合物与能够识别所述细胞表面缀合物的所述药剂的结合分子接触。
147.权利要求146的方法，其在体外、离体或在体内进行。
148.权利要求146或权利要求147中任一项的方法，其中经由体内成像来检测表达所述
细胞表面分子的细胞。
149.权利要求145或权利要求148的方法，其中所述体内成像方法选自磁共振成像
(MRI)、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)、计算机断层扫描(CT)、计算机轴向断层扫描(CAT)、电子束计算机断层扫描(EBCT)、高分辨率计算机断层扫描(HRCT)、内摆线断层扫描、正电子发射断层扫描(PET)、闪烁扫描、γ照相机、β+检测器、γ检测器、荧光成像、低光成像、X射线和生物发光成像。
150.权利要求145、权利要求148或权利要求149的方法，其中所述结合分子与提供信号
或诱导在体内可检测的信号的部分缀合。
151.权利要求150的方法，其中所述部分是放射性同位素、生物发光化合物、化学发光
化合物、荧光化合物、金属螯合物或酶。
152.一种鉴定用细胞表面缀合物转导的细胞的方法，所述方法包括：
(a)使得用编码所述细胞表面缀合物的权利要求98-105中任一项的多核苷酸或权利要
求106-109中任一项的载体转导的组合物、或权利要求111-139中任一项的工程化细胞、或权利要求140或权利要求141的组合物与能够识别所述细胞表面缀合物的药剂的结合分子
接触；并且
(b)鉴定与所述结合分子结合的细胞。
153.一种鉴定用细胞表面缀合物转导的细胞的方法，所述方法包括：
(a)将编码所述细胞表面缀合物的权利要求98-105中任一项的多核苷酸或权利要求
106-109中任一项的载体引入细胞中；
(b)使包含(a)的所述细胞的组合物与能够识别所述细胞表面缀合物的所述药剂的结
合分子接触；并且
(c)鉴定所述组合物的与所述结合分子结合的细胞。
154.一种选择用细胞表面缀合物转导的细胞的方法，所述方法包括：
(a)使得用编码所述细胞表面缀合物的权利要求98-105中任一项的多核苷酸或权利要
求106-109中任一项的载体转导的组合物、或权利要求111-139中任一项的工程化细胞、或权利要求140或权利要求141的组合物与能够识别所述细胞表面缀合物的药剂的结合分子
接触；并且
(b)分离与所述结合分子结合的细胞。
155.一种选择用细胞表面缀合物转导的细胞的方法，所述方法包括：
(a)将编码所述细胞表面缀合物的权利要求98-105中任一项的多核苷酸或权利要求
106-109中任一项的载体引入细胞中；
(b)使包含(a)的所述细胞的组合物与能够识别所述细胞表面缀合物的所述药剂的结
合分子接触；并且
(c)分离所述组合物的与所述结合分子结合的细胞。
156.权利要求154或权利要求155的方法，其中所述结合分子与可检测部分缀合或能够
产生可检测的信号。
157.权利要求156的方法，其中所述可检测部分包含荧光蛋白。
158.权利要求144-157中任一项的方法，其中所述药剂是链霉亲和素结合肽。
159.权利要求158的方法，其中所述链霉亲和素结合肽是或包含序列Trp-Ser-His-
Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:8)或Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(SEQ ID NO:
7)。
160.权利要求159的方法，其中所述链霉亲和素结合肽是或包含序列Trp-Ser-His-
Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID
NO:17)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-
Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:18)和Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)
2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:19)。
161.权利要求144-160中任一项的方法，其中所述结合分子是能够可逆地结合所述药
剂和/或能够在竞争物质的存在下被竞争的试剂。
162.权利要求161的方法，其中所述试剂是链霉亲和素、链霉亲和素类似物或突变蛋
白。
163.权利要求162的方法，其中参考在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列中的在链霉亲
和素中的位置，在与位置44至47对应的序列位置处，所述链霉亲和素类似物或突变蛋白包含氨基酸序列Val44-Thr45-Ala46-Arg47或Ile44-Gly45-Ala46-Arg47。
164.权利要求162或权利要求163的方法，其中所述链霉亲和素类似物或突变蛋白包
含：
a)在SEQ ID NO:3-6、27和28中任一个中所示的氨基酸序列；
b)如下氨基酸序列，所述氨基酸序列展现与SEQ ID NO:3-6、27和28中任一个至少或至
少约85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或更高序列同一性并且含有与Val44-Thr45-Ala46-Arg47或Ile44-Gly45-Ala46-Arg47对应的氨基酸序列并且可逆地结合所述药剂；或
c)a)或b)的功能片段，所述功能片段结合所述药剂。
165.权利要求163或权利要求164的方法，其中参考在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序
列中的在链霉亲和素中的位置，在与117、120和/或121对应的位置处，所述链霉亲和素类似物或突变蛋白进一步包含一个或多个氨基酸置换。
166.权利要求165的方法，其中：
所述一个或多个氨基酸置换选自Glu117、Asp117、Arg117、Ser120、Ala120、Gly120、Trp121、
121 121
Tyr 或Phe ；或
所述一个或多个氨基酸置换选自Glu117、Gly120或Tyr121中的一个或多个；
或
所述氨基酸置换选自Glu117、Gly120或Tyr121。
167.权利要求162-166中任一项的方法，其中所述链霉亲和素类似物或突变蛋白包含：
a)在SEQ ID NO:27或28中所示的氨基酸序列；
b)如下氨基酸序列，所述氨基酸序列展现与SEQ ID NO:27或28至少或至少约85％、
86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性并且含有与Val44、Thr45、Ala46、Arg47、Glu117、Gly120和Tyr121对应的氨基酸序列并且可逆地结合所述药剂；或
c)a)或b)的功能片段，所述功能片段结合所述药剂。
168.权利要求161-167中任一项的方法，其进一步包括破坏所述结合分子与所述药剂
的可逆结合。
169.权利要求168的方法，其中所述破坏包括使所述细胞与包含能够逆转所述结合分
子与所述药剂之间的键的竞争物质的组合物接触。
170.权利要求169的方法，其中所述竞争物质是游离结合配偶体和/或是竞争剂。
171.权利要求169或权利要求170的方法，其中所述竞争物质是或包含生物素、生物素
类似物或其生物活性片段。
172.权利要求144-171中任一项的方法，其中所述结合分子是特异性结合所述药剂的
抗体或抗原结合片段。
173.权利要求172的方法，其中所述结合分子是抗Strep标签抗体。
174.一种分子，其包含与细胞毒性剂缀合的链霉亲和素或链霉亲和素类似物或突变蛋
白。
175.权利要求174的分子，其包含链霉亲和素类似物或突变蛋白。
176.权利要求174或权利要求175的方法，其中所述链霉亲和素或链霉亲和素类似物或
突变蛋白与链霉亲和素结合肽结合。
177.权利要求176的分子，其中所述链霉亲和素结合肽是或包含序列Trp-Ser-His-
Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:8)或Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(SEQ ID NO:
7)。
178.权利要求176或权利要求177的方法，其中所述链霉亲和素结合肽是或包含序列
Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-
Lys(SEQ ID NO:17)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-
His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:18)和Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-
(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:19)。
179.权利要求176-178中任一项的分子，其中所述链霉亲和素或链霉亲和素类似物或
-4 -10
突变蛋白展现平衡解离常数(KD)为从或从约10 M至或至约10 M的对所述链霉亲和素结合
肽的结合亲和力。
180.权利要求174-179中任一项的分子，其中参考在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列
中的在链霉亲和素中的位置，在与位置44至47对应的序列位置处，所述链霉亲和素类似物
44 45 46 47 44 45 46 47
或突变蛋白包含氨基酸序列Val -Thr -Ala -Arg 或Ile -Gly -Ala -Arg 。
181.权利要求174-180中任一项的分子，其中所述链霉亲和素类似物或突变蛋白包含：
a)在SEQ ID NO:3-6、27和28中任一个中所示的氨基酸序列；
b)如下氨基酸序列，所述氨基酸序列展现与SEQ ID NO:3-6、27和28中任一个至少或至
少约85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或更高序列同一性并且含有与Val44-Thr45-Ala46-Arg47或Ile44-Gly45-Ala46-Arg47对应的氨基酸序列并且可逆地结合所述药剂；或
c)a)或b)的功能片段，所述功能片段结合所述链霉亲和素结合肽。
182.权利要求180或权利要求181的方法，其中参考在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序
列中的在链霉亲和素中的位置，在与117、120和/或121对应的位置处，所述链霉亲和素类似物或突变蛋白进一步包含一个或多个氨基酸置换。
183.权利要求182的分子，其中：
所述一个或多个氨基酸置换选自Glu117、Asp117、Arg117、Ser120、Ala120、Gly120、Trp121、Tyr121或Phe121；或
117 120 121
所述一个或多个氨基酸置换选自Glu 、Gly 或Tyr 中的一个或多个；
或
所述氨基酸置换选自Glu117、Gly120或Tyr121。
184.权利要求174-183中任一项的分子，其中所述链霉亲和素类似物或突变蛋白包含：
a)在SEQ ID NO:27或28中所示的氨基酸序列；
b)如下氨基酸序列，所述氨基酸序列展现与SEQ ID NO:27或28至少或至少约85％、
86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性并且含有与Val44、Thr45、Ala46、Arg47、Glu117、Gly120和Tyr121对应的氨基酸序列并且可逆地结合所述药剂；或
c)a)或b)的功能片段，所述功能片段可逆地结合所述链霉亲和素结合肽。
185.权利要求174-184中任一项的分子，其中所述细胞毒性剂是毒素。
186.权利要求185的分子，其中所述毒素是肽毒素、蓖麻毒素A链毒素、相思豆毒素A链、白喉毒素(DT)A链、假单胞菌外毒素、志贺毒素A链、白树毒素、苦瓜毒蛋白、美洲商陆抗病毒蛋白、皂草素、天花粉蛋白或大麦毒素。
187.权利要求185的分子，其中所述毒素是光毒素。
188.一种杀伤细胞的方法，所述方法包括将权利要求174-187中任一项的分子给予至
先前给予过权利要求111-139中任一项的细胞、或权利要求140或权利要求141的组合物的受试者。
189.权利要求188的方法，其中在所述受试者展现与所给予的细胞相关的毒性结果的
时候或在所述受试者展现针对所给予的细胞的可检测的和/或细胞介导的免疫应答的时候给予所述分子。
190.权利要求189的方法，其中所述毒性结果与神经毒性或细胞因子释放综合征(CRS)
相关。
细胞表面缀合物及相关的细胞组合物和方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2017年1月20日提交的标题为“细胞表面缀合物及相关的细胞组合物和方法(CELL SURFACE CONJUGATES AND RELATED CELL COMPOSITIONS AND METHODS)”的
美国临时申请号62/448,936的优先权，将其内容通过引用以其全文并入。
美国临时申请号62/448,936的优先权，将其内容通过引用以其全文并入。
[0004] 本申请是与电子格式的序列表一起提交申请的。序列表以2018年1月19日创建的名为735042002640SeqList.TXT的文件提供，其大小为209,044字节。将在电子格式的序列
表中的信息通过引用以其全文并入。
表中的信息通过引用以其全文并入。
技术领域
[0005] 本发明的公开文本在一些方面涉及含有细胞表面分子和至少一种药剂(如至少一种亲和标签)的细胞表面缀合物，以及表达此类细胞表面缀合物的工程化细胞。在一些实施
方案中，所述细胞表面分子不含有细胞内信号传导结构域或不能介导细胞内信号传导。在
一些实施方案中，被工程化以含有细胞表面缀合物的细胞(如T细胞)，进一步含有与抗原特
异性结合的基因工程化重组受体(如嵌合抗原受体)。本公开文本还提供了检测、鉴定、选择
或靶向表达细胞表面缀合物的细胞的方法，例如结合制造工程化细胞的方法或结合将此类
细胞向受试者的给予(包括过继细胞疗法的方法)。
方案中，所述细胞表面分子不含有细胞内信号传导结构域或不能介导细胞内信号传导。在
一些实施方案中，被工程化以含有细胞表面缀合物的细胞(如T细胞)，进一步含有与抗原特
异性结合的基因工程化重组受体(如嵌合抗原受体)。本公开文本还提供了检测、鉴定、选择
或靶向表达细胞表面缀合物的细胞的方法，例如结合制造工程化细胞的方法或结合将此类
细胞向受试者的给予(包括过继细胞疗法的方法)。
背景技术
[0006] 各种策略可用于治疗疾病或病症(如癌症或肿瘤)，包括给予细胞疗法。此外，策略可用于将免疫细胞工程化以表达基因工程化重组受体如嵌合抗原受体(CAR)，以及向受试
者给予含有此类细胞的组合物。需要改进的策略，例如，通过在给予至受试者时结合此类疗
法来改善工程化组合物和/或改善监测或调节工程化组合物的能力，来增加治疗功效。提供
了满足此类需求的组合物、细胞和方法。
者给予含有此类细胞的组合物。需要改进的策略，例如，通过在给予至受试者时结合此类疗
法来改善工程化组合物和/或改善监测或调节工程化组合物的能力，来增加治疗功效。提供
了满足此类需求的组合物、细胞和方法。
发明内容
[0007] 本文提供了细胞表面缀合物，所述细胞表面缀合物含有缺乏功能性细胞内信号传导结构域和/或不能介导细胞内信号传导的细胞表面分子；以及与细胞表面分子连接的至
少一种药剂，所述药剂能够结合链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白。在一些实施方案中，所
述药剂展现平衡解离常数(KD)为从或从约10-4M至或至约10-10M的对链霉亲和素或者链霉亲
和素、链霉亲和素类似物或突变蛋白的结合亲和力。
少一种药剂，所述药剂能够结合链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白。在一些实施方案中，所
述药剂展现平衡解离常数(KD)为从或从约10-4M至或至约10-10M的对链霉亲和素或者链霉亲
和素、链霉亲和素类似物或突变蛋白的结合亲和力。
[0008] 还提供了细胞表面缀合物，所述细胞表面缀合物含有缺乏功能性细胞内信号传导结构域和/或不能介导细胞内信号传导的细胞表面分子；以及与细胞表面分子连接并且能
够可逆地结合试剂和/或能够在竞争物质的存在下竞争结合所述试剂的至少一种药剂，其
中所述药剂是长度为小于50个氨基酸的肽。在一些实施方案中，所述药剂展现平衡解离常
数(KD)为从或从约10-4M至或至约10-10M的对所述试剂的结合亲和力。在一些任何此类实施
方案中，所述试剂是链霉亲和素或者链霉亲和素、链霉亲和素类似物或突变蛋白。
够可逆地结合试剂和/或能够在竞争物质的存在下竞争结合所述试剂的至少一种药剂，其
中所述药剂是长度为小于50个氨基酸的肽。在一些实施方案中，所述药剂展现平衡解离常
数(KD)为从或从约10-4M至或至约10-10M的对所述试剂的结合亲和力。在一些任何此类实施
方案中，所述试剂是链霉亲和素或者链霉亲和素、链霉亲和素类似物或突变蛋白。
[0009] 在一些实施方案中，所述细胞表面分子包含跨膜结构域和/或能够在细胞表面上表达。在一些实施方案中，与参考细胞表面分子相比，所述细胞表面分子是经修饰的，任选
地其中所述参考细胞表面分子是包含细胞内信号传导结构域的细胞表面受体。在一些实施
方案中，与所述参考细胞表面分子相比，经修饰的细胞表面分子展现改变的细胞内化、酶促
活性和/或配体结合。
地其中所述参考细胞表面分子是包含细胞内信号传导结构域的细胞表面受体。在一些实施
方案中，与所述参考细胞表面分子相比，经修饰的细胞表面分子展现改变的细胞内化、酶促
活性和/或配体结合。
[0010] 还提供了细胞表面缀合物，所述细胞表面缀合物含有(a)与参考细胞表面分子相比被修饰的细胞表面分子，其中与所述参考细胞表面分子相比，所述经修饰的细胞表面分
子展现改变的细胞内化、酶促活性和/或配体结合；以及(b)与所述细胞表面分子连接的至
少一种药剂，所述药剂能够结合链霉亲和素、链霉亲和素类似物或链霉亲和素突变蛋白。
子展现改变的细胞内化、酶促活性和/或配体结合；以及(b)与所述细胞表面分子连接的至
少一种药剂，所述药剂能够结合链霉亲和素、链霉亲和素类似物或链霉亲和素突变蛋白。
[0011] 在一些实施方案中，所述细胞表面分子缺乏功能性细胞内信号传导结构域和/或不能介导细胞内信号传导。还提供了细胞表面缀合物，所述细胞表面缀合物含有(a)包含前
列腺特异性膜抗原(PSMA)的细胞表面分子或其经修饰的细胞表面分子；以及(b)与所述细
胞表面分子连接的至少一种药剂，所述药剂能够结合链霉亲和素、链霉亲和素类似物或链
霉亲和素突变蛋白。在一些实施方案中，所述经修饰的细胞表面分子缺乏功能性细胞内信
号传导结构域和/或不能介导细胞内信号传导；和/或与参考细胞表面分子相比，所述经修
饰的细胞表面分子被修饰，其中与所述参考细胞表面分子相比，所述经修饰的细胞表面分
子展现改变的细胞内化、酶促活性和/或配体结合。在一些实施方案中，所述细胞表面分子
包含跨膜结构域和/或能够在细胞表面上表达。在一些实施方案中，所述药剂展现平衡解离
常数(KD)为从或从约10-4M至或至约10-10M的对链霉亲和素、链霉亲和素类似物或链霉亲和
素突变蛋白的结合亲和力。
列腺特异性膜抗原(PSMA)的细胞表面分子或其经修饰的细胞表面分子；以及(b)与所述细
胞表面分子连接的至少一种药剂，所述药剂能够结合链霉亲和素、链霉亲和素类似物或链
霉亲和素突变蛋白。在一些实施方案中，所述经修饰的细胞表面分子缺乏功能性细胞内信
号传导结构域和/或不能介导细胞内信号传导；和/或与参考细胞表面分子相比，所述经修
饰的细胞表面分子被修饰，其中与所述参考细胞表面分子相比，所述经修饰的细胞表面分
子展现改变的细胞内化、酶促活性和/或配体结合。在一些实施方案中，所述细胞表面分子
包含跨膜结构域和/或能够在细胞表面上表达。在一些实施方案中，所述药剂展现平衡解离
常数(KD)为从或从约10-4M至或至约10-10M的对链霉亲和素、链霉亲和素类似物或链霉亲和
素突变蛋白的结合亲和力。
[0012] 本文提供了细胞表面缀合物，所述细胞表面缀合物含有缺乏功能性细胞内信号传导结构域和/或不能介导细胞内信号传导的细胞表面分子；以及与所述细胞表面分子连接
的至少一种药剂，所述药剂具有平衡解离常数(KD)为大于10-7M或平衡缔合常数(KA)为小于
107M-1的对试剂的结合亲和力。在一些情形中，所述试剂是链霉亲和素或链霉亲和素类似物
或突变蛋白。
的至少一种药剂，所述药剂具有平衡解离常数(KD)为大于10-7M或平衡缔合常数(KA)为小于
107M-1的对试剂的结合亲和力。在一些情形中，所述试剂是链霉亲和素或链霉亲和素类似物
或突变蛋白。
[0013] 在任何所提供的实施方案中，所述细胞表面分子是细胞表面蛋白。
[0014] 在一些任何此类实施方案中，所述药剂与所述试剂的结合是可逆的和/或能够在竞争物质的存在下竞争结合所述试剂。在一些方面，所述竞争物质对所述试剂展现的结合
亲和力高于所述药剂对所述试剂展现的结合亲和力。在一些实施方案中，所述竞争物质展
现平衡解离常数(KD)在或约在10-10M与10-14M之间的对所述试剂的结合亲和力；和/或所述
药剂展现平衡解离常数(KD)为大于10-10M的对所述试剂的结合亲和力。
亲和力高于所述药剂对所述试剂展现的结合亲和力。在一些实施方案中，所述竞争物质展
现平衡解离常数(KD)在或约在10-10M与10-14M之间的对所述试剂的结合亲和力；和/或所述
药剂展现平衡解离常数(KD)为大于10-10M的对所述试剂的结合亲和力。
[0016] 在一些任何此类实施方案中，所述至少一种药剂直接与细胞表面分子连接。在一些任何此类实施方案中，所述至少一种药剂经由至少一个接头间接地与细胞表面分子连
接。
接。
[0017] 在一些方面，含有所述细胞表面分子以及所述至少一种药剂(例如肽，如链霉亲和素结合肽)的所述细胞表面缀合物是融合蛋白。
[0018] 在一些任何此类实施方案中，所述至少一种药剂包括从或从约1至4种或者从或从约1至2种药剂。在一些任何此类实施方案中，所述至少一种药剂是仅一种药剂。在一些任何
此类实施方案中，所述药剂与所述细胞表面分子的细胞外部分或区域连接，任选地其中所
述细胞外部分或区域位于所述细胞表面分子的N末端或C末端。在一些任何此类实施方案
中，所述药剂被连接在所述细胞表面分子的N末端。在一些任何此类实施方案中，所述药剂
被连接在所述细胞表面分子的C末端。
此类实施方案中，所述药剂与所述细胞表面分子的细胞外部分或区域连接，任选地其中所
述细胞外部分或区域位于所述细胞表面分子的N末端或C末端。在一些任何此类实施方案
中，所述药剂被连接在所述细胞表面分子的N末端。在一些任何此类实施方案中，所述药剂
被连接在所述细胞表面分子的C末端。
[0019] 还提供了细胞表面缀合物，所述细胞表面缀合物含有细胞表面分子(如细胞表面蛋白)，所述细胞表面分子在其N末端与药剂连接，所述药剂能够结合作为或含有链霉亲和
素或链霉亲和素突变蛋白的试剂。
素或链霉亲和素突变蛋白的试剂。
[0020] 还提供了细胞表面缀合物，所述细胞表面缀合物含有细胞表面分子(如细胞表面蛋白)，所述细胞表面分子在其N末端与能够可逆地结合试剂的药剂连接，其中所述药剂是
长度为小于50个氨基酸的肽。
长度为小于50个氨基酸的肽。
[0021] 在一些任何此类实施方案中，所述药剂展现平衡解离常数(KD)为从或从约10-4至10-10M的对试剂(例如，作为或含有链霉亲和素或链霉亲和素类似物或突变蛋白的试剂)的
结合亲和力。
结合亲和力。
[0022] 还提供了细胞表面缀合物，所述细胞表面缀合物包含在细胞表面分子的细胞外部分或区域与药剂连接的细胞表面分子，所述药剂能够结合作为或包含链霉亲和素或链霉亲
和素突变蛋白的试剂，任选地其中所述细胞外部分或区域位于所述细胞表面分子的N末端
或C末端。
和素突变蛋白的试剂，任选地其中所述细胞外部分或区域位于所述细胞表面分子的N末端
或C末端。
[0023] 还提供了细胞表面缀合物，所述细胞表面缀合物包含在细胞表面分子的细胞外部分或区域与药剂连接的细胞表面分子，所述药剂能够可逆地结合所述试剂，其中所述药剂
是长度为小于50个氨基酸的肽，任选地其中所述细胞外部分或区域位于所述细胞表面分子
的N末端或C末端。在一些实施方案中，所述药剂展现平衡解离常数(KD)为从或从约10-4M至
或至约10-10M的结合亲和力。
是长度为小于50个氨基酸的肽，任选地其中所述细胞外部分或区域位于所述细胞表面分子
的N末端或C末端。在一些实施方案中，所述药剂展现平衡解离常数(KD)为从或从约10-4M至
或至约10-10M的结合亲和力。
[0024] 还提供了细胞表面缀合物，所述细胞表面缀合物包含在所述细胞表面分子的细胞外部分或区域与药剂连接的细胞表面分子，其中所述药剂展现平衡解离常数(KD)为大于10
-7M或平衡缔合常数(KA)为小于107M-1的对试剂的结合亲和力，任选地其中所述细胞外部分
或区域位于所述细胞表面分子的N末端或C末端。在一些实施方案中，所述药剂被连接在所
述细胞表面分子的N末端。在一些实施方案中，所述药剂被连接在所述细胞表面分子的C末
端。
-7M或平衡缔合常数(KA)为小于107M-1的对试剂的结合亲和力，任选地其中所述细胞外部分
或区域位于所述细胞表面分子的N末端或C末端。在一些实施方案中，所述药剂被连接在所
述细胞表面分子的N末端。在一些实施方案中，所述药剂被连接在所述细胞表面分子的C末
端。
[0025] 还提供了细胞表面缀合物，所述细胞表面缀合物含有在细胞表面分子的N末端与药剂连接的细胞表面分子(如细胞表面蛋白)，其中所述药剂展现平衡解离常数(KD)为大于
10-7M或平衡缔合常数(KA)为小于107M-1的对试剂的结合亲和力。在一些任何此类实施方案
中，所述试剂是或含有链霉亲和素或链霉亲和素类似物或突变蛋白。
10-7M或平衡缔合常数(KA)为小于107M-1的对试剂的结合亲和力。在一些任何此类实施方案
中，所述试剂是或含有链霉亲和素或链霉亲和素类似物或突变蛋白。
[0026] 在一些任何此类实施方案中，所述药剂与所述试剂(例如作为或含有链霉亲和素或链霉亲和素类似物或突变蛋白的试剂)的结合是可逆的和/或能够在竞争物质的存在下
竞争结合所述试剂。在一些情况下，所述竞争物质对所述试剂展现的结合亲和力高于所述
药剂对所述试剂展现的结合亲和力。在一些例子中，竞争物质展现在或约在10-10与10-14之
间的对试剂的结合亲和力；和/或所述药剂展现小于10-10的对所述试剂的结合亲和力。在一
些任何此类实施方案中，所述试剂是链霉亲和素或链霉亲和素类似物或突变蛋白，并且所
述药剂与链霉亲和素或链霉亲和素类似物或突变蛋白的结合是可逆的和/或能够在生物素
或生物素类似物的存在下竞争结合所述试剂。
竞争结合所述试剂。在一些情况下，所述竞争物质对所述试剂展现的结合亲和力高于所述
药剂对所述试剂展现的结合亲和力。在一些例子中，竞争物质展现在或约在10-10与10-14之
间的对试剂的结合亲和力；和/或所述药剂展现小于10-10的对所述试剂的结合亲和力。在一
些任何此类实施方案中，所述试剂是链霉亲和素或链霉亲和素类似物或突变蛋白，并且所
述药剂与链霉亲和素或链霉亲和素类似物或突变蛋白的结合是可逆的和/或能够在生物素
或生物素类似物的存在下竞争结合所述试剂。
[0027] 在一些任何此类实施方案中，所述药剂直接地与所述细胞表面分子连接，如与细胞表面蛋白连接，包括与如所描述的经修饰的细胞表面分子连接。在一些任何此类实施方
案中，所述药剂经由至少一个接头间接地与细胞表面分子连接。在一些任何此类实施方案
中，所述细胞表面分子如细胞表面蛋白与仅一种药剂连接。
案中，所述药剂经由至少一个接头间接地与细胞表面分子连接。在一些任何此类实施方案
中，所述细胞表面分子如细胞表面蛋白与仅一种药剂连接。
[0028] 在一些任何此类实施方案中，所述细胞表面分子不是嵌合抗原受体(CAR)。
[0029] 在一些任何此类实施方案中，所述细胞表面分子如细胞表面蛋白缺乏功能性细胞内信号传导结构域和/或不能介导细胞内信号传导。在一些任何此类实施方案中，与参考细
胞表面分子相比，所述细胞表面分子是经修饰的。在一些任何此类实施方案中，所述参考细
胞表面分子是天然哺乳动物细胞表面分子。在一些任何此类实施方案中，所述经修饰的细
胞表面分子包含或保留所述参考细胞表面分子的表位，所述表位能够由抗体或其抗原结合
片段识别。在一些实施方案中，所述经修饰的细胞表面分子缺乏功能性细胞内信号传导结
构域和/或不能介导细胞内信号传导；和/或与所述参考细胞表面分子相比，所述经修饰的
细胞表面分子展现改变的细胞内化、酶促活性和/或配体结合。
胞表面分子相比，所述细胞表面分子是经修饰的。在一些任何此类实施方案中，所述参考细
胞表面分子是天然哺乳动物细胞表面分子。在一些任何此类实施方案中，所述经修饰的细
胞表面分子包含或保留所述参考细胞表面分子的表位，所述表位能够由抗体或其抗原结合
片段识别。在一些实施方案中，所述经修饰的细胞表面分子缺乏功能性细胞内信号传导结
构域和/或不能介导细胞内信号传导；和/或与所述参考细胞表面分子相比，所述经修饰的
细胞表面分子展现改变的细胞内化、酶促活性和/或配体结合。
[0030] 在一些任何此类实施方案中，所述细胞表面缀合物是融合蛋白。
[0031] 在一些任何此类实施方案中，参考在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列中的链霉亲和素中的位置，在与位置44至47对应的序列位置处，链霉亲和素类似物或突变蛋白含有
氨基酸序列Val44-Thr45-Ala46-Arg47或Ile44-Gly45-Ala46-Arg47。在一些任何此类实施方案
中，链霉亲和素类似物或突变蛋白含有a)在SEQ ID NO:3-6、27和28中任一个中所示的氨基
酸序列；b)如下氨基酸序列，所述氨基酸序列展现与SEQ ID NO:3-6、27和28中任一个至少
或至少约85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或更高序列同一性并且含有与Val44-Thr45-Ala46-Arg47或Ile44-Gly45-
Ala46-Arg47对应的氨基酸序列并且可逆地结合所述药剂；或c)a)或b)的功能片段，所述功
能片段可逆地结合所述药剂和/或其中在竞争物质的存在下竞争结合所述药剂。
氨基酸序列Val44-Thr45-Ala46-Arg47或Ile44-Gly45-Ala46-Arg47。在一些任何此类实施方案
中，链霉亲和素类似物或突变蛋白含有a)在SEQ ID NO:3-6、27和28中任一个中所示的氨基
酸序列；b)如下氨基酸序列，所述氨基酸序列展现与SEQ ID NO:3-6、27和28中任一个至少
或至少约85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或更高序列同一性并且含有与Val44-Thr45-Ala46-Arg47或Ile44-Gly45-
Ala46-Arg47对应的氨基酸序列并且可逆地结合所述药剂；或c)a)或b)的功能片段，所述功
能片段可逆地结合所述药剂和/或其中在竞争物质的存在下竞争结合所述药剂。
[0032] 在一些任何此类实施方案中，参考在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列中的链霉亲和素中的位置，在与117、120和/或121对应的位置处，链霉亲和素类似物或突变蛋白进一
步含有一个或多个氨基酸置换。在一些方面，所述一个或多个氨基酸置换选自Glu117、
Asp117、Arg117、Ser120、Ala120、Gly120、Trp121、Tyr121或Phe121；或者所述一个或多个氨基酸置换选自Glu117、Gly120或Tyr121中的一种或多种；或者所述氨基酸置换选自Glu117、Gly120或
121
Tyr 。
步含有一个或多个氨基酸置换。在一些方面，所述一个或多个氨基酸置换选自Glu117、
Asp117、Arg117、Ser120、Ala120、Gly120、Trp121、Tyr121或Phe121；或者所述一个或多个氨基酸置换选自Glu117、Gly120或Tyr121中的一种或多种；或者所述氨基酸置换选自Glu117、Gly120或
121
Tyr 。
[0033] 在一些任何此类实施方案中，链霉亲和素类似物或突变蛋白含有a)在SEQ ID NO:27或28中所示的氨基酸序列；b)如下氨基酸序列，所述氨基酸序列展现与SEQ ID NO:27或
28至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
44 45 46 47 117 120
96％、97％、98％、99％或更高序列同一性并且含有与Val 、Thr 、Ala 、Arg 、Glu 、Gly
和Tyr121对应的氨基酸序列，并且可逆地结合所述药剂和/或在其中在竞争物质的存在下竞
争结合所述药剂；或c)a)或b)的功能片段，所述功能片段可逆地结合所述药剂和/或其中在
竞争物质的存在下竞争结合所述药剂。
28至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
44 45 46 47 117 120
96％、97％、98％、99％或更高序列同一性并且含有与Val 、Thr 、Ala 、Arg 、Glu 、Gly
和Tyr121对应的氨基酸序列，并且可逆地结合所述药剂和/或在其中在竞争物质的存在下竞
争结合所述药剂；或c)a)或b)的功能片段，所述功能片段可逆地结合所述药剂和/或其中在
竞争物质的存在下竞争结合所述药剂。
[0034] 在一些任何此类实施方案中，所述药剂是亲和标签。在一些任何此类实施方案中，所述药剂是或含有Strep标签、His标签、Flag标签、Xpress标签、Avi标签、钙调蛋白
(Calmodulin)标签、聚谷氨酸盐(Polyglutamate)标签、HA标签、Myc标签、Nus标签、S标签、X标签、SBP标签、Softag、V5标签、CBP、GST、MBP、GFP、硫氧还蛋白(Thioredoxin)标签或其任何组合。在一些任何此类实施方案中，所述药剂是或包含一种或多种链霉亲和素结合肽，其
任选地是Strep标签。
(Calmodulin)标签、聚谷氨酸盐(Polyglutamate)标签、HA标签、Myc标签、Nus标签、S标签、X标签、SBP标签、Softag、V5标签、CBP、GST、MBP、GFP、硫氧还蛋白(Thioredoxin)标签或其任何组合。在一些任何此类实施方案中，所述药剂是或包含一种或多种链霉亲和素结合肽，其
任选地是Strep标签。
[0035] 在一些任何此类实施方案中，链霉亲和素结合肽含有序列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:8)或Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(SEQ ID NO:7)。
[0036] 在一些任何此类实施方案中，所述药剂含有序列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:17)、Trp-Ser-
His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ
ID NO:18)和Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-
Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:19)。
His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ
ID NO:18)和Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-
Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:19)。
[0037] 在一些任何此类实施方案中，竞争物质是或含有生物素、生物素类似物或其生物活性片段。此类实施方案包括其中所述药剂是链霉亲和素结合肽并且所述试剂是链霉亲和
素或链霉亲和素突变蛋白或类似物(包括如所描述的任一种)的那些实施方案。
素或链霉亲和素突变蛋白或类似物(包括如所描述的任一种)的那些实施方案。
[0038] 在一些任何此类实施方案中，所述参考细胞表面分子是细胞表面蛋白，所述细胞表面蛋白是细胞表面受体、配体、糖蛋白、细胞粘附分子、抗原、整合素或分化簇(CD)。在一
些实施方案中，所述参考细胞表面分子是细胞表面受体。在一些任何此类实施方案中，所述
参考细胞表面分子选自EpCAM、VEGFR、整合素(例如，整合素αvβ3、α4、αIIbβ3、α4β7、α5β1、αvβ3、αv)、TNF受体超家族的成员(例如，TRAIL-R1、TRAIL-R2)、表皮生长因子受体家族的成
员、PDGF受体、干扰素受体、叶酸受体、GPNMB、ICAM-1、HLA-DR、CEA、CA-125、MUC1、TAG-72、IL-6受体、5T4、GD2、GD3、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、或分化簇(例如，CD2、CD3、CD4、CD5、CD11、CD11a/LFA-1、CD15、CD18/ITGB2、CD19、CD20、CD22、CD23/IgE受体、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD41、CD44、CD51、CD52、CD62L、CD74、CD80、CD125、CD147/基础免疫球蛋白(basigin)、CD152/CTLA-4、CD154/CD40L、CD195/CCR5和CD319/SLAMF7)。
些实施方案中，所述参考细胞表面分子是细胞表面受体。在一些任何此类实施方案中，所述
参考细胞表面分子选自EpCAM、VEGFR、整合素(例如，整合素αvβ3、α4、αIIbβ3、α4β7、α5β1、αvβ3、αv)、TNF受体超家族的成员(例如，TRAIL-R1、TRAIL-R2)、表皮生长因子受体家族的成
员、PDGF受体、干扰素受体、叶酸受体、GPNMB、ICAM-1、HLA-DR、CEA、CA-125、MUC1、TAG-72、IL-6受体、5T4、GD2、GD3、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、或分化簇(例如，CD2、CD3、CD4、CD5、CD11、CD11a/LFA-1、CD15、CD18/ITGB2、CD19、CD20、CD22、CD23/IgE受体、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD41、CD44、CD51、CD52、CD62L、CD74、CD80、CD125、CD147/基础免疫球蛋白(basigin)、CD152/CTLA-4、CD154/CD40L、CD195/CCR5和CD319/SLAMF7)。
[0039] 在一些任何此类实施方案中，所述参考细胞表面分子(如参考细胞表面蛋白)是表皮生长因子受体家族的成员。在一些任何此类实施方案中，所述参考细胞表面分子是表皮
生长因子受体(EGFR)、erbB-2受体酪氨酸蛋白激酶(errb2，HER2)、erbB-3受体酪氨酸蛋白
激酶、erbB-4受体酪氨酸蛋白激酶、肝细胞生长因子受体(HGFR/c-MET)或胰岛素样生长因
子受体-1(IGF-1R)。在一些任何此类实施方案中，所述参考细胞表面分子是前列腺特异性
膜抗原(PSMA)。
生长因子受体(EGFR)、erbB-2受体酪氨酸蛋白激酶(errb2，HER2)、erbB-3受体酪氨酸蛋白
激酶、erbB-4受体酪氨酸蛋白激酶、肝细胞生长因子受体(HGFR/c-MET)或胰岛素样生长因
子受体-1(IGF-1R)。在一些任何此类实施方案中，所述参考细胞表面分子是前列腺特异性
膜抗原(PSMA)。
[0040] 在一些任何此类实施方案中，所述参考细胞表面分子(如参考细胞表面蛋白)是人的。
[0041] 在一些任何此类实施方案中，所述经修饰的细胞表面分子缺乏功能性细胞内信号传导结构域和/或不能介导细胞内信号传导。在一些任何此类实施方案中，与所述参考细胞
表面分子相比，所述经修饰的细胞表面分子被截短，例如被截短以除去或缺失细胞内区域
的全部或一部分，即所述参考细胞表面分子的包含在细胞内部的分子的一部分。在一些情
况下，细胞内区域是含有细胞内信号传导结构域或运输结构域的区域。在一些任何此类实
施方案中，与所述参考细胞表面分子相比，所述经修饰的细胞表面分子被截短以缺乏细胞
内信号传导结构域或运输结构域的全部或一部分。在一些任何此类实施方案中，所述经修
饰的细胞表面分子含有所述参考细胞表面分子的一个或多个细胞外结构域。在一些实施方
案中，与所述参考细胞表面分子相比，经修饰的细胞表面分子展现改变的细胞内化、酶促活
性和/或配体结合。
表面分子相比，所述经修饰的细胞表面分子被截短，例如被截短以除去或缺失细胞内区域
的全部或一部分，即所述参考细胞表面分子的包含在细胞内部的分子的一部分。在一些情
况下，细胞内区域是含有细胞内信号传导结构域或运输结构域的区域。在一些任何此类实
施方案中，与所述参考细胞表面分子相比，所述经修饰的细胞表面分子被截短以缺乏细胞
内信号传导结构域或运输结构域的全部或一部分。在一些任何此类实施方案中，所述经修
饰的细胞表面分子含有所述参考细胞表面分子的一个或多个细胞外结构域。在一些实施方
案中，与所述参考细胞表面分子相比，经修饰的细胞表面分子展现改变的细胞内化、酶促活
性和/或配体结合。
[0042] 在一些任何此类实施方案中，所述经修饰的细胞表面分子能够结合所述参考细胞表面分子的天然配体或底物。在一些任何此类实施方案中，所述经修饰的细胞表面分子与
所述参考细胞表面分子的天然配体或底物的结合减少，或所述经修饰的细胞表面分子不结
合所述参考细胞表面分子的天然配体或底物。在一些任何此类实施方案中，所述经修饰的
细胞表面分子含有所述参考细胞表面分子的至少一个细胞外结构域，但缺乏由所述参考细
胞表面分子的天然配体或底物识别的一个或多个其他细胞外结构域。在一些方面，所述至
少一个细胞外结构域含有由特异性地结合所述参考细胞表面分子的抗体或其抗原结合片
段识别的表位。在一些任何此类实施方案中，所述抗体或抗原结合片段选自AMG-102、AMG-
479、BIIB022OA-5D5、CP-751,871、IMC-Al2、R1507、3F8、阿巴伏单抗(abagovomab)、阿昔单抗、阿德木单抗(adecatumumab)、阿夫土珠(afutuzumab)、阿仑单抗、喷替酸阿妥莫单抗
(altumomab pentetate)、麻安莫单抗(anatumomab mafenatox)、阿泊珠单抗
(apolizumab)、阿西莫单抗、阿塞珠单抗(aselizumab)、阿特珠单抗(atlizumab)(＝托西珠
单抗(tocilizumab))、巴利昔单抗、贝妥莫单抗(bectumomab)、贝那利珠单抗
(benralizumab)、贝索单抗(besilesomab)、莫比伐珠单抗(bivatuzumab mertansine)、博
纳吐单抗、本妥昔单抗(brentuximab vedotin)、莫坎妥珠单抗(cantuzumab mertansine)、
卡罗单抗喷地肽(capromab pendetide)、卡妥索单抗(catumaxomab)、CC49、西利珠单抗
(cedelizumab)、西莫白介素(celmoleukin)、西妥昔单抗、西妥木单抗(cixutumumab)、克立
昔单抗(clenoliximab)、泰坦-克利妥珠单抗(clivatuzumab tetraxetan)、CNTO-95、可那
木单抗(conatumumab)、达西珠单抗(dacetuzumab)、达利珠单抗(daclizumab)、达雷木单抗
(daratumumab)、地莫单抗(detumomab)、依美昔单抗(ecromeximab)、厄妥索单抗
(ertumaxomab)、依决洛单抗(edrecolomab)、依法利珠单抗(efalizumab)、埃罗妥珠单抗
(elotuzumab)、PEG化恩莫单抗(enlimomab pegol)、西依匹莫单抗(epitumomab
cituxetan)、依帕珠单抗(epratuzumab)、厄利珠单抗(erlizumab)、埃达珠单抗
(etaracizumab)、法索单抗(fanolesomab)、法拉莫单抗(faralimomab)、法勒珠单抗
(farletuzumab)、芬妥木单抗(figitumumab)、加利昔单抗(galiximab)、加维莫单抗
(gavilimomab)、吉妥单抗(gemtuzumab ozogamicin)、维汀-格仑妥木单抗、戈利昔单抗
(gomiliximab)、伊巴利珠单抗(ibalizumab)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、伊戈
伏单抗(igovomab)、英妥木单抗(intetumumab)、伊妥木单抗(iratumumab)、伊诺莫单抗
(inolimomab)、奥英妥珠单抗(inotuzumab ozogamicin)、伊匹木单抗(ipilimumab)、凯利
昔单抗(keliximab)、拉贝珠单抗(labetuzumab)、林妥珠单抗(lintuzumab)、来沙木单抗
(lexatumumab)、鲁卡木单抗(lucatumumab)、鲁昔单抗(lumiliximab)、马帕木单抗
(mapatumumab)、马司莫单抗(maslimomab)、马妥珠单抗(matuzumab)、米拉妥珠单抗
(milatuzumab)、明瑞莫单抗(minretumomab)、米妥莫单抗(mitumomab)、莫罗单抗
(muromonab)-CD3、他那莫单抗(naptumomab estafenatox)、那他株单抗(natalizumab)、耐
昔妥珠单抗(necitumumab)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥度莫单抗(odulimomab)、奥法木
单抗(ofatumumab)、奥拉单抗(olaratumab)、莫奥珠单抗(oportuzumab monatox)、奥戈伏
单抗(oregovomab)、奥昔珠单抗(otelixizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、帕妥珠单抗
(pertuzumab)、喷妥莫单抗(pemtumomab)、普立昔单抗(priliximab)、PRO 140、尼妥珠单抗
(nimotuzumab)、罗妥木单抗(robatumumab)、利妥昔单抗(rituximab)、罗维珠单抗
(rovelizumab)、鲁利单抗(ruplizumab)、沙妥莫单抗喷地肽(satumomab pendetide)、西利
珠单抗(siplizumab)、索土珠单抗(sontuzumab)、他多赛珠单抗(tadocizumab)、帕他普莫
单抗(taplitumomab paptox)、替奈昔单抗(teneliximab)、特普利珠单抗(teplizumab)、
TGN1412、替西木单抗(ticilimumab)(＝曲美木单抗(tremelimumab))、替加珠单抗
(tigatuzumab)、托西珠单抗(tocilizumab)(＝atlizumab)、托利珠单抗(toralizumab)、托
西莫单抗(tositumomab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、曲美木单抗(tremelimumab)、妥考妥
珠单抗、维多株单抗(vedolizumab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、维西珠单抗
(visilizumab)、vitaxin、伏洛昔单抗(volociximab)、伏妥莫单抗(votumumab)、扎鲁木单
抗(zalutumumab)、扎木单抗(zanolimumab)、齐拉木单抗(ziralimumab)、阿佐莫单抗
(zolimomab aritox)、阿特珠单抗(Atezolizumab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)
地诺单抗(denosumab)、地努图希单抗(dinutuximab)、纳武单抗
(nivolumab)、奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、皮地利珠单抗
(pidilizumab)(CT-011)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、司妥昔单抗(siltuximab)、曲妥珠单
抗-美坦新偶联物(ado-trastuzumab emtansine)、CEA-scan Fab片段、OC125单克隆抗体、
ab75705、B72.3、MPDL3280A、MSB001078C、MEDI4736、或其抗原结合片段。
所述参考细胞表面分子的天然配体或底物的结合减少，或所述经修饰的细胞表面分子不结
合所述参考细胞表面分子的天然配体或底物。在一些任何此类实施方案中，所述经修饰的
细胞表面分子含有所述参考细胞表面分子的至少一个细胞外结构域，但缺乏由所述参考细
胞表面分子的天然配体或底物识别的一个或多个其他细胞外结构域。在一些方面，所述至
少一个细胞外结构域含有由特异性地结合所述参考细胞表面分子的抗体或其抗原结合片
段识别的表位。在一些任何此类实施方案中，所述抗体或抗原结合片段选自AMG-102、AMG-
479、BIIB022OA-5D5、CP-751,871、IMC-Al2、R1507、3F8、阿巴伏单抗(abagovomab)、阿昔单抗、阿德木单抗(adecatumumab)、阿夫土珠(afutuzumab)、阿仑单抗、喷替酸阿妥莫单抗
(altumomab pentetate)、麻安莫单抗(anatumomab mafenatox)、阿泊珠单抗
(apolizumab)、阿西莫单抗、阿塞珠单抗(aselizumab)、阿特珠单抗(atlizumab)(＝托西珠
单抗(tocilizumab))、巴利昔单抗、贝妥莫单抗(bectumomab)、贝那利珠单抗
(benralizumab)、贝索单抗(besilesomab)、莫比伐珠单抗(bivatuzumab mertansine)、博
纳吐单抗、本妥昔单抗(brentuximab vedotin)、莫坎妥珠单抗(cantuzumab mertansine)、
卡罗单抗喷地肽(capromab pendetide)、卡妥索单抗(catumaxomab)、CC49、西利珠单抗
(cedelizumab)、西莫白介素(celmoleukin)、西妥昔单抗、西妥木单抗(cixutumumab)、克立
昔单抗(clenoliximab)、泰坦-克利妥珠单抗(clivatuzumab tetraxetan)、CNTO-95、可那
木单抗(conatumumab)、达西珠单抗(dacetuzumab)、达利珠单抗(daclizumab)、达雷木单抗
(daratumumab)、地莫单抗(detumomab)、依美昔单抗(ecromeximab)、厄妥索单抗
(ertumaxomab)、依决洛单抗(edrecolomab)、依法利珠单抗(efalizumab)、埃罗妥珠单抗
(elotuzumab)、PEG化恩莫单抗(enlimomab pegol)、西依匹莫单抗(epitumomab
cituxetan)、依帕珠单抗(epratuzumab)、厄利珠单抗(erlizumab)、埃达珠单抗
(etaracizumab)、法索单抗(fanolesomab)、法拉莫单抗(faralimomab)、法勒珠单抗
(farletuzumab)、芬妥木单抗(figitumumab)、加利昔单抗(galiximab)、加维莫单抗
(gavilimomab)、吉妥单抗(gemtuzumab ozogamicin)、维汀-格仑妥木单抗、戈利昔单抗
(gomiliximab)、伊巴利珠单抗(ibalizumab)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、伊戈
伏单抗(igovomab)、英妥木单抗(intetumumab)、伊妥木单抗(iratumumab)、伊诺莫单抗
(inolimomab)、奥英妥珠单抗(inotuzumab ozogamicin)、伊匹木单抗(ipilimumab)、凯利
昔单抗(keliximab)、拉贝珠单抗(labetuzumab)、林妥珠单抗(lintuzumab)、来沙木单抗
(lexatumumab)、鲁卡木单抗(lucatumumab)、鲁昔单抗(lumiliximab)、马帕木单抗
(mapatumumab)、马司莫单抗(maslimomab)、马妥珠单抗(matuzumab)、米拉妥珠单抗
(milatuzumab)、明瑞莫单抗(minretumomab)、米妥莫单抗(mitumomab)、莫罗单抗
(muromonab)-CD3、他那莫单抗(naptumomab estafenatox)、那他株单抗(natalizumab)、耐
昔妥珠单抗(necitumumab)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥度莫单抗(odulimomab)、奥法木
单抗(ofatumumab)、奥拉单抗(olaratumab)、莫奥珠单抗(oportuzumab monatox)、奥戈伏
单抗(oregovomab)、奥昔珠单抗(otelixizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、帕妥珠单抗
(pertuzumab)、喷妥莫单抗(pemtumomab)、普立昔单抗(priliximab)、PRO 140、尼妥珠单抗
(nimotuzumab)、罗妥木单抗(robatumumab)、利妥昔单抗(rituximab)、罗维珠单抗
(rovelizumab)、鲁利单抗(ruplizumab)、沙妥莫单抗喷地肽(satumomab pendetide)、西利
珠单抗(siplizumab)、索土珠单抗(sontuzumab)、他多赛珠单抗(tadocizumab)、帕他普莫
单抗(taplitumomab paptox)、替奈昔单抗(teneliximab)、特普利珠单抗(teplizumab)、
TGN1412、替西木单抗(ticilimumab)(＝曲美木单抗(tremelimumab))、替加珠单抗
(tigatuzumab)、托西珠单抗(tocilizumab)(＝atlizumab)、托利珠单抗(toralizumab)、托
西莫单抗(tositumomab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、曲美木单抗(tremelimumab)、妥考妥
珠单抗、维多株单抗(vedolizumab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、维西珠单抗
(visilizumab)、vitaxin、伏洛昔单抗(volociximab)、伏妥莫单抗(votumumab)、扎鲁木单
抗(zalutumumab)、扎木单抗(zanolimumab)、齐拉木单抗(ziralimumab)、阿佐莫单抗
(zolimomab aritox)、阿特珠单抗(Atezolizumab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)
地诺单抗(denosumab)、地努图希单抗(dinutuximab)、纳武单抗
(nivolumab)、奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、皮地利珠单抗
(pidilizumab)(CT-011)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、司妥昔单抗(siltuximab)、曲妥珠单
抗-美坦新偶联物(ado-trastuzumab emtansine)、CEA-scan Fab片段、OC125单克隆抗体、
ab75705、B72.3、MPDL3280A、MSB001078C、MEDI4736、或其抗原结合片段。
[0043] 在一些任何此类实施方案中，所述参考细胞表面受体是EGFR，并且所述经修饰的细胞表面受体是经修饰的EGFR。在一些方面，所述经修饰的EGFR含有由西妥昔单抗或其抗
原结合片段特异性识别的表位。在一些情形中，所述经修饰的EGFR缺乏参考EGFR的EGFR结
构域I、EGFR结构域II、EGFR近膜结构域和EGFR酪氨酸激酶结构域中的一个或多个。在一些
任何此类实施方案中，所述经修饰的EGFR缺乏参考EGFR的EGFR结构域I、EGFR结构域II、
EGFR近膜结构域和EGFR酪氨酸激酶结构域中的全部结构域。在一些任何此类实施方案中，
所述经修饰的EGFR包含细胞外结构域，所述细胞外结构域由参考EGFR的亚结构域III和亚
结构域IV组成或基本上由其组成。在一些任何此类实施方案中，所述经修饰的EGFR包含在
SEQ ID NO:44或46中所示的氨基酸序列或展现与SEQ ID NO:44或46至少或至少约85％、
90％或95％序列同一性的氨基酸序列。
原结合片段特异性识别的表位。在一些情形中，所述经修饰的EGFR缺乏参考EGFR的EGFR结
构域I、EGFR结构域II、EGFR近膜结构域和EGFR酪氨酸激酶结构域中的一个或多个。在一些
任何此类实施方案中，所述经修饰的EGFR缺乏参考EGFR的EGFR结构域I、EGFR结构域II、
EGFR近膜结构域和EGFR酪氨酸激酶结构域中的全部结构域。在一些任何此类实施方案中，
所述经修饰的EGFR包含细胞外结构域，所述细胞外结构域由参考EGFR的亚结构域III和亚
结构域IV组成或基本上由其组成。在一些任何此类实施方案中，所述经修饰的EGFR包含在
SEQ ID NO:44或46中所示的氨基酸序列或展现与SEQ ID NO:44或46至少或至少约85％、
90％或95％序列同一性的氨基酸序列。
[0044] 在一些任何此类实施方案中，所述参考细胞表面受体是HER2，并且所述经修饰的细胞表面受体是经修饰的HER2。在一些方面，所述经修饰的HER2含有由曲妥珠单抗或其抗
原结合片段特异性识别的表位。在一些任何此类实施方案中，所述经修饰的HER2缺乏参考
HER2的HER2结构域I、HER2结构域II、HER2结构域III中的一个或多个。在一些任何此类实施
方案中，所述经修饰的HER2缺乏参考HER2的HER2结构域I、HER2结构域II和HER2结构域III
中的全部结构域。在一些任何此类实施方案中，所述经修饰的HER2包含细胞外结构域，所述
细胞外结构域由参考HER2的结构域IV组成或基本上由其组成。在一些任何此类实施方案
中，所述经修饰的HER2含有在SEQ ID NO:92中所示的氨基酸序列或展现与SEQ ID NO:92至
少或至少约85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。
原结合片段特异性识别的表位。在一些任何此类实施方案中，所述经修饰的HER2缺乏参考
HER2的HER2结构域I、HER2结构域II、HER2结构域III中的一个或多个。在一些任何此类实施
方案中，所述经修饰的HER2缺乏参考HER2的HER2结构域I、HER2结构域II和HER2结构域III
中的全部结构域。在一些任何此类实施方案中，所述经修饰的HER2包含细胞外结构域，所述
细胞外结构域由参考HER2的结构域IV组成或基本上由其组成。在一些任何此类实施方案
中，所述经修饰的HER2含有在SEQ ID NO:92中所示的氨基酸序列或展现与SEQ ID NO:92至
少或至少约85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。
[0045] 在一些实施方案中，所述参考细胞表面分子是参考PSMA，并且所经修饰的细胞表面分子是经修饰的PSMA。在一些实施方案中，所述参考PSMA是野生型PSMA，任选地野生型人
PSMA。在一些实施方案中，所述参考PSMA是人PSMA和/或包含SEQ ID NO:94中所示的氨基酸
序列或由SEQ ID NO:96或97中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，
所述经修饰的PSMA包含参考PSMA的细胞外部分和跨膜结构域。
PSMA。在一些实施方案中，所述参考PSMA是人PSMA和/或包含SEQ ID NO:94中所示的氨基酸
序列或由SEQ ID NO:96或97中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，
所述经修饰的PSMA包含参考PSMA的细胞外部分和跨膜结构域。
[0046] 在一些实施方案中，与参考PSMA相比，所述经修饰的PSMA在细胞内区域中包含一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰包含一个或多个氨
基酸取代、缺失和/或插入。在一些实施方案中，与参考PSMA相比，所述经修饰的PSMA展现改
变的细胞内化。
基酸取代、缺失和/或插入。在一些实施方案中，与参考PSMA相比，所述经修饰的PSMA展现改
变的细胞内化。
[0047] 在一些实施方案中，参考在SEQ ID NO:94中所示的氨基酸序列中的位置，所述经修饰的PSMA包含与W2G对应的氨基酸取代或者不包含W2或者不包含在位置2处的任何残基。
在一些实施方案中，与参考PSMA相比，所述经修饰的PSMA包含11个N末端氨基酸的缺失或截
短。
在一些实施方案中，与参考PSMA相比，所述经修饰的PSMA包含11个N末端氨基酸的缺失或截
短。
[0048] 在一些实施方案中，所述经修饰的PSMA包含能够由抗体或其抗原结合片段识别的表位。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段选自J591、DFO-J591、CYT-356、J415、
3/A12、3/F11、3/E7、D2B、107-1A4、YPSMA-1、YPSMA-2、3E6、2G7、24.4E6、GCP-02、GCP-04、GCP-05、J533、E99、1G9、3C6、4.40、026、D7-Fc、D7-CH3、4D4、A5、及其抗原结合片段。
3/A12、3/F11、3/E7、D2B、107-1A4、YPSMA-1、YPSMA-2、3E6、2G7、24.4E6、GCP-02、GCP-04、GCP-05、J533、E99、1G9、3C6、4.40、026、D7-Fc、D7-CH3、4D4、A5、及其抗原结合片段。
[0049] 在一些任何此类实施方案中，所述细胞表面缀合物不是免疫原性的和/或在给予它的受试者中不诱导免疫应答。
[0050] 还提供了含有编码本文描述的任何实施方案的细胞表面缀合物的核酸序列的多核苷酸。在一些实施方案中，所述核酸序列进一步含有信号序列。在一些情形中，所述信号
序列编码源自GMCSFRα链的信号肽。
序列编码源自GMCSFRα链的信号肽。
[0051] 在一些任何此类实施方案中，所述核酸序列是第一核酸序列，并且所述多核苷酸进一步含有编码重组受体的第二核酸序列。在一些情况下，所述重组受体是或含有嵌合抗
原受体(CAR)。在一些任何此类实施方案中，所述第一核酸序列和所述第二核酸序列被内部
核糖体进入位点(IRES)或编码自切割肽或导致核糖体跳跃的肽的核苷酸序列分开，所述自
切割肽或导致核糖体跳跃的肽任选地是T2A或P2A。在一些实施方案中，所述第一核酸序列
在所述第二核酸序列的上游。在一些实施方案中，所述第一核酸序列在所述第二核酸序列
的下游。
原受体(CAR)。在一些任何此类实施方案中，所述第一核酸序列和所述第二核酸序列被内部
核糖体进入位点(IRES)或编码自切割肽或导致核糖体跳跃的肽的核苷酸序列分开，所述自
切割肽或导致核糖体跳跃的肽任选地是T2A或P2A。在一些实施方案中，所述第一核酸序列
在所述第二核酸序列的上游。在一些实施方案中，所述第一核酸序列在所述第二核酸序列
的下游。
[0052] 提供了含有本文描述的任何实施方案的多核苷酸的载体。在一些实施方案中，所述载体是病毒载体。在一些任何此类实施方案中，所述载体是逆转录病毒载体。在一些任何
此类实施方案中，所述载体是慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。
此类实施方案中，所述载体是慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。
[0053] 还提供了产生工程化细胞的方法，所述方法包括将上面描述的任何实施方案的多核苷酸或上面描述的任何实施方案的载体引入细胞中。还提供了通过本文描述的方法产生
的工程化细胞。在一些实施方案中，所述工程化细胞含有本文描述的任何实施方案的多核
苷酸或本文描述的任何实施方案的载体。
的工程化细胞。在一些实施方案中，所述工程化细胞含有本文描述的任何实施方案的多核
苷酸或本文描述的任何实施方案的载体。
[0054] 在一些任何此类实施方案中，所述工程化细胞含有上面描述的任何实施方案的细胞表面缀合物。在一些情形中，所述工程化细胞进一步含有重组受体。在一些方面，所述重
组受体结合与疾病或障碍相关的靶抗原。在一些情况下，所述疾病或障碍是感染性疾病或
障碍、自身免疫性疾病、炎性疾病、或肿瘤或癌症。
组受体结合与疾病或障碍相关的靶抗原。在一些情况下，所述疾病或障碍是感染性疾病或
障碍、自身免疫性疾病、炎性疾病、或肿瘤或癌症。
[0055] 在一些任何此类实施方案中，所述靶抗原是肿瘤抗原。在一些实施方案中，所述靶抗原是选自以下的靶抗原：αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-
H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为
NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、CC基序趋化因子配
体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、表皮生长因子蛋白(EGFR)、截短的表皮生长因子蛋白(tEGFR)、III型
表皮生长因子受体突变(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配
蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或
FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、
O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、G蛋白偶联受体5D(GPCR5D)、
Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子
量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞
抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Ra)、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、激酶插入结构域受体
(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的8家
族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、间皮素、c-
Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、天然杀伤组2成员D(NKG2D)配体、黑色
素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕
酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体
酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋
白72(TAG72)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Wilms肿
瘤1(WT-1)。
H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为
NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、CC基序趋化因子配
体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、表皮生长因子蛋白(EGFR)、截短的表皮生长因子蛋白(tEGFR)、III型
表皮生长因子受体突变(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配
蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或
FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、
O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、G蛋白偶联受体5D(GPCR5D)、
Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子
量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞
抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Ra)、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、激酶插入结构域受体
(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的8家
族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、间皮素、c-
Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、天然杀伤组2成员D(NKG2D)配体、黑色
素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕
酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体
酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋
白72(TAG72)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Wilms肿
瘤1(WT-1)。
[0056] 在一些任何此类实施方案中，所述靶抗原选自ROR1、HER2、L1-CAM、CD19、CD20、CD22、间皮素、CEA、乙型肝炎表面抗原、抗叶酸受体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP-2、EGP-4、EPHa2、ErbB2、ErbB3、ErbB4、FBP、胎儿乙酰胆碱e受体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、kdr、κ轻链、路易斯Y、L1-细胞粘附分子、MAGE-A1、间皮素、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2D配体、NY-ESO-1、MART-1、gp100、癌胚胎抗原、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原、PSMA、雌激素受体、孕酮受体、肝配蛋白B2、CD123、CS-1、c-Met、GD-2、MAGE A3、CE7、Wilms肿瘤1(WT-1)和细胞周期蛋白A1(CCNA1)。
[0057] 在一些任何此类实施方案中，所述重组受体是功能性非TCR抗原受体或转基因TCR。在一些任何此类实施方案中，所述重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。在一些任何此类实
施方案中，所述重组受体包含含有抗原结合结构域的细胞外部分。在一些例子中，所述抗原
结合结构域是或含有抗体或抗体片段。
施方案中，所述重组受体包含含有抗原结合结构域的细胞外部分。在一些例子中，所述抗原
结合结构域是或含有抗体或抗体片段。
[0058] 在一些实施方案中，所述抗体片段是单链片段。在一些实施方案中，所述片段含有通过柔性免疫球蛋白接头连接的抗体可变区。在一些任何此类实施方案中，所述片段包含
scFv。在一些任何此类实施方案中，所述重组受体包含激活型细胞内信号传导结构域。
scFv。在一些任何此类实施方案中，所述重组受体包含激活型细胞内信号传导结构域。
[0059] 在工程化细胞的一些实施方案中，所述激活型细胞内信号传导结构域能够在T细胞中诱导初级激活信号，是T细胞受体(TCR)组分，和/或含有基于免疫受体酪氨酸的激活基
序(ITAM)。在一些任何此类实施方案中，所述激活型细胞内信号传导结构域是或含有CD3-
zeta(CD3ζ)链的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
序(ITAM)。在一些任何此类实施方案中，所述激活型细胞内信号传导结构域是或含有CD3-
zeta(CD3ζ)链的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
[0060] 在一些任何此类实施方案中，所述工程化细胞进一步含有连接细胞外部分和激活型细胞内信号传导结构域的跨膜结构域。
[0061] 在一些任何此类实施方案中，所述重组受体含有共刺激信号传导结构域。在一些情形中，所述共刺激信号传导结构域含有T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其
信号传导部分。在一些任何此类实施方案中，所述共刺激信号传导结构域含有CD28、4-1BB
或ICOS的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。在一些任何此类实施方案中，所述共
刺激信号传导结构域位于所述跨膜结构域与所述激活型细胞内信号传导结构域之间。
信号传导部分。在一些任何此类实施方案中，所述共刺激信号传导结构域含有CD28、4-1BB
或ICOS的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。在一些任何此类实施方案中，所述共
刺激信号传导结构域位于所述跨膜结构域与所述激活型细胞内信号传导结构域之间。
[0062] 在一些任何此类实施方案中，所述细胞是免疫细胞。在一些情况下，所述细胞是淋巴细胞。在一些任何此类实施方案中，所述细胞是T细胞或NK细胞。在一些例子中，所述细胞
是T细胞，所述T细胞是CD8+T细胞或CD4+T细胞。
是T细胞，所述T细胞是CD8+T细胞或CD4+T细胞。
[0063] 还提供了含有上面描述的任何实施方案的工程化细胞的组合物。在一些情况下，所述组合物进一步含有药学上可接受的赋形剂。
[0064] 还提供了治疗方法，所述方法包括将上面描述的任何实施方案的工程化细胞或上面描述的任何实施方案的组合物给予至患有疾病或障碍的受试者。在一些实施方案中，所
述疾病或障碍是癌症、肿瘤、自身免疫性疾病或障碍、或感染性疾病。在一些任何此类实施
方案中，所述方法进一步涉及向受试者给予结合分子，所述结合分子能够识别在工程化细
胞上表达的细胞表面缀合物的药剂；并且检测表达细胞表面缀合物的细胞。在一些方面，检
测包括体内成像。
述疾病或障碍是癌症、肿瘤、自身免疫性疾病或障碍、或感染性疾病。在一些任何此类实施
方案中，所述方法进一步涉及向受试者给予结合分子，所述结合分子能够识别在工程化细
胞上表达的细胞表面缀合物的药剂；并且检测表达细胞表面缀合物的细胞。在一些方面，检
测包括体内成像。
[0065] 还提供了鉴定表达细胞表面缀合物的细胞的方法，所述方法包括使含有表达或可能表达本文描述的任何实施方案的细胞表面缀合物的细胞的组合物与能够识别细胞表面
缀合物的药剂的结合分子接触。在一些方面，所述方法在体外、离体或在体内进行。在一些
实施方案中，经由体内成像来检测表达细胞表面分子的细胞。在一些任何此类实施方案中，
所述体内成像方法选自磁共振成像(MRI)、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)、计算机断
层扫描(CT)、计算机轴向断层扫描(CAT)、电子束计算机断层扫描(EBCT)、高分辨率计算机
断层扫描(HRCT)、内摆线断层扫描、正电子发射断层扫描(PET)、闪烁扫描、γ照相机、β+检
测器、γ检测器、荧光成像、低光成像、X射线和生物发光成像。
缀合物的药剂的结合分子接触。在一些方面，所述方法在体外、离体或在体内进行。在一些
实施方案中，经由体内成像来检测表达细胞表面分子的细胞。在一些任何此类实施方案中，
所述体内成像方法选自磁共振成像(MRI)、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)、计算机断
层扫描(CT)、计算机轴向断层扫描(CAT)、电子束计算机断层扫描(EBCT)、高分辨率计算机
断层扫描(HRCT)、内摆线断层扫描、正电子发射断层扫描(PET)、闪烁扫描、γ照相机、β+检
测器、γ检测器、荧光成像、低光成像、X射线和生物发光成像。
[0067] 还提供了鉴定用细胞表面缀合物转导的细胞的方法，所述方法包括使得用编码细胞表面缀合物的本文描述的任何实施方案的多核苷酸或本文描述的任何实施方案的载体
转导的组合物与能够识别细胞表面缀合物的药剂的结合分子接触；并且鉴定与所述结合分
子结合的细胞。还提供了鉴定用细胞表面缀合物转导的细胞的方法，所述方法包括将编码
细胞表面缀合物的本文描述的任何实施方案的多核苷酸或本文描述的任何实施方案的载
体引入细胞中；使包含所述细胞的组合物与能够识别细胞表面缀合物的药剂的结合分子接
触；并且鉴定组合物的与所述结合分子结合的细胞。
转导的组合物与能够识别细胞表面缀合物的药剂的结合分子接触；并且鉴定与所述结合分
子结合的细胞。还提供了鉴定用细胞表面缀合物转导的细胞的方法，所述方法包括将编码
细胞表面缀合物的本文描述的任何实施方案的多核苷酸或本文描述的任何实施方案的载
体引入细胞中；使包含所述细胞的组合物与能够识别细胞表面缀合物的药剂的结合分子接
触；并且鉴定组合物的与所述结合分子结合的细胞。
[0068] 还提供了选择用细胞表面缀合物转导的细胞的方法，所述方法包括使得用编码细胞表面缀合物的本文描述的任何实施方案的多核苷酸或本文描述的任何实施方案的载体
转导的组合物与能够识别细胞表面缀合物的药剂的结合分子接触；并且分离与所述结合分
子结合的细胞。进一步提供了选择用细胞表面缀合物转导的细胞的方法，所述方法包括将
编码细胞表面缀合物的本文描述的任何实施方案的多核苷酸或本文描述的任何实施方案
的载体引入细胞中；使包含所述细胞的组合物与能够识别细胞表面缀合物的药剂的结合分
子接触；并且分离组合物的与所述结合分子结合的细胞。
转导的组合物与能够识别细胞表面缀合物的药剂的结合分子接触；并且分离与所述结合分
子结合的细胞。进一步提供了选择用细胞表面缀合物转导的细胞的方法，所述方法包括将
编码细胞表面缀合物的本文描述的任何实施方案的多核苷酸或本文描述的任何实施方案
的载体引入细胞中；使包含所述细胞的组合物与能够识别细胞表面缀合物的药剂的结合分
子接触；并且分离组合物的与所述结合分子结合的细胞。
[0069] 在一些任何此类实施方案中，所述结合分子与可检测部分缀合或能够产生可检测的信号。在一些情形中，所述可检测部分含有荧光蛋白。
[0070] 在一些任何此类实施方案中，所述药剂是链霉亲和素结合肽。在一些情况下，所述链霉亲和素结合肽是或包含序列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:8)或
Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(SEQ ID NO:7)。在一些方面，所述链霉亲和素结合肽
是或含有序列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-
Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:17)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-
(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:18)和Trp-Ser-His-
Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-
Glu-Lys(SEQ ID NO:19)。
Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(SEQ ID NO:7)。在一些方面，所述链霉亲和素结合肽
是或含有序列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-
Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:17)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-
(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:18)和Trp-Ser-His-
Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-
Glu-Lys(SEQ ID NO:19)。
[0071] 在一些实施方案中，所述结合分子是能够可逆地结合所述药剂的试剂。在一些方面，所述试剂是链霉亲和素类似物或突变蛋白。在一些情形中，参考在SEQ ID NO:1中所示
的氨基酸序列中的链霉亲和素中的位置，在与位置44至47对应的序列位置处，所述链霉亲
和素类似物或突变蛋白含有氨基酸序列Val44-Thr45-Ala46-Arg47或Ile44-Gly45-Ala46-
Arg47。
的氨基酸序列中的链霉亲和素中的位置，在与位置44至47对应的序列位置处，所述链霉亲
和素类似物或突变蛋白含有氨基酸序列Val44-Thr45-Ala46-Arg47或Ile44-Gly45-Ala46-
Arg47。
[0072] 在一些任何此类实施方案中，链霉亲和素类似物或突变蛋白含有a)在SEQ ID NO:3-6、27和28中任一个中所示的氨基酸序列；b)如下氨基酸序列，所述氨基酸序列展现与SEQ
ID NO:3-6、27和28中任一个至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性并且含有与Val44-Thr45-Ala46-Arg47或Ile44-Gly45-Ala46-Arg47对应的氨基酸序列并且可逆地结合所述药剂；或c)a)
或b)的功能片段，所述功能片段可逆地结合所述药剂。在一些实施方案中，参考在SEQ ID
NO:1中所示的氨基酸序列中的链霉亲和素中的位置，在与117、120和/或121对应的位置处，
链霉亲和素类似物或突变蛋白进一步含有一个或多个氨基酸置换。
ID NO:3-6、27和28中任一个至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性并且含有与Val44-Thr45-Ala46-Arg47或Ile44-Gly45-Ala46-Arg47对应的氨基酸序列并且可逆地结合所述药剂；或c)a)
或b)的功能片段，所述功能片段可逆地结合所述药剂。在一些实施方案中，参考在SEQ ID
NO:1中所示的氨基酸序列中的链霉亲和素中的位置，在与117、120和/或121对应的位置处，
链霉亲和素类似物或突变蛋白进一步含有一个或多个氨基酸置换。
[0073] 在一些任何此类实施方案中，所述一个或多个氨基酸置换选自Glu117、Asp117、Arg117、Ser120、Ala120、Gly120、Trp121、Tyr121或Phe121；或者所述一个或多个氨基酸置换选自Glu117、Gly120或Tyr121中的一种或多种；或者所述氨基酸置换选自Glu117、Gly120或Tyr121。
[0074] 在一些任何此类实施方案中，链霉亲和素类似物或突变蛋白含有a)在SEQ ID NO:27或28中所示的氨基酸序列；b)如下氨基酸序列，所述氨基酸序列展现与SEQ ID NO:27或
28至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％或更高序列同一性并且含有与Val44、Thr45、Ala46、Arg47、Glu117、Gly120
121
和Tyr 对应的氨基酸序列，并且可逆地结合所述药剂；或c)a)或b)的功能片段，所述功能
片段可逆地结合所述药剂。
28至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％或更高序列同一性并且含有与Val44、Thr45、Ala46、Arg47、Glu117、Gly120
121
和Tyr 对应的氨基酸序列，并且可逆地结合所述药剂；或c)a)或b)的功能片段，所述功能
片段可逆地结合所述药剂。
[0075] 在一些任何此类实施方案中，所述方法进一步包括破坏所述结合分子与所述药剂的可逆结合。在一些方面，所述破坏包括使所述细胞与含有能够逆转所述结合分子与所述
药剂之间的键的物质的组合物接触。在一些情况下，所述物质是自由结合配偶体和/或是竞
争剂。在一些实施方案中，所述物质是或含有生物素、生物素类似物或其生物活性片段。
药剂之间的键的物质的组合物接触。在一些情况下，所述物质是自由结合配偶体和/或是竞
争剂。在一些实施方案中，所述物质是或含有生物素、生物素类似物或其生物活性片段。
[0076] 在一些任何此类实施方案中，所述结合分子是特异性结合所述药剂的抗体或抗原结合片段。在一些例子中，所述结合分子是抗Strep标签抗体。
[0077] 本文还提供了含有与细胞毒性剂缀合的链霉亲和素或链霉亲和素类似物或突变蛋白的分子。在一些方面，所述分子含有链霉亲和素类似物或突变蛋白。在一些实施方案
中，所述链霉亲和素或链霉亲和素类似物与链霉亲和素结合肽结合。
中，所述链霉亲和素或链霉亲和素类似物与链霉亲和素结合肽结合。
[0078] 在一些例子中，链霉亲和素结合肽含有序列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:8)或Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(SEQ ID NO:7)。在一些任何此类实
施方案中，所述链霉亲和素结合肽是或含有序列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-
(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:17)、Trp-Ser-His-
Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID
NO:18)和Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-
Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:19)。
施方案中，所述链霉亲和素结合肽是或含有序列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-
(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:17)、Trp-Ser-His-
Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID
NO:18)和Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-
Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:19)。
[0079] 在一些任何此类实施方案中，所述链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白展现平衡解离常数(KD)为从或从约10-4M至10-10M的对链霉亲和素结合肽的结合亲和力。在一些任何此
类实施方案中，参考在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列中的链霉亲和素中的位置，在与位
置44至47对应的序列位置处，链霉亲和素类似物或突变蛋白含有氨基酸序列Val44-Thr45-
Ala46-Arg47或Ile44-Gly45-Ala46-Arg47。
类实施方案中，参考在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列中的链霉亲和素中的位置，在与位
置44至47对应的序列位置处，链霉亲和素类似物或突变蛋白含有氨基酸序列Val44-Thr45-
Ala46-Arg47或Ile44-Gly45-Ala46-Arg47。
[0080] 在一些任何此类实施方案中，所述链霉亲和素类似物或突变蛋白含有a)在SEQ ID NO:3-6、27和28中任一个中所示的氨基酸序列；b)如下氨基酸序列，所述氨基酸序列展现与
SEQ ID NO:3-6、27和28中任一个至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性并且含有与Val44-Thr45-Ala46-Arg47或Ile44-Gly45-Ala46-Arg47对应的氨基酸序列并且可逆地结合所述药剂；
或c)a)或b)的功能片段，所述功能片段结合所述链霉亲和素结合肽。在一些实施方案中，参
考在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列中的链霉亲和素中的位置，在与117、120和/或121对
应的位置处，链霉亲和素类似物或突变蛋白进一步含有一个或多个氨基酸置换。
SEQ ID NO:3-6、27和28中任一个至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性并且含有与Val44-Thr45-Ala46-Arg47或Ile44-Gly45-Ala46-Arg47对应的氨基酸序列并且可逆地结合所述药剂；
或c)a)或b)的功能片段，所述功能片段结合所述链霉亲和素结合肽。在一些实施方案中，参
考在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列中的链霉亲和素中的位置，在与117、120和/或121对
应的位置处，链霉亲和素类似物或突变蛋白进一步含有一个或多个氨基酸置换。
[0081] 在一些任何此类实施方案中，所述一个或多个氨基酸置换选自Glu117、Asp117、Arg117、Ser120、Ala120、Gly120、Trp121、Tyr121或Phe121；或者所述一个或多个氨基酸置换选自Glu117、Gly120或Tyr121中的一种或多种；或者所述氨基酸置换选自Glu117、Gly120或Tyr121。
[0082] 在一些任何此类实施方案中，链霉亲和素类似物或突变蛋白含有a)在SEQ ID NO:27或28中所示的氨基酸序列；b)如下氨基酸序列，所述氨基酸序列展现与SEQ ID NO:27或
28至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％或更高序列同一性并且含有与Val44、Thr45、Ala46、Arg47、Glu117、Gly120和Tyr121对应的氨基酸序列，并且可逆地结合所述药剂；或c)a)或b)的功能片段，所述功能
片段可逆地结合所述链霉亲和素结合肽。
28至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％或更高序列同一性并且含有与Val44、Thr45、Ala46、Arg47、Glu117、Gly120和Tyr121对应的氨基酸序列，并且可逆地结合所述药剂；或c)a)或b)的功能片段，所述功能
片段可逆地结合所述链霉亲和素结合肽。
[0083] 在一些任何此类实施方案中，所述细胞毒性剂是毒素。在一些例子中，所述毒素是肽毒素、蓖麻毒素A链毒素、相思豆毒素A链、白喉毒素(DT)A链、假单胞菌外毒素、志贺毒素A
链、白树毒素、苦瓜毒蛋白(Momordin)、美洲商陆抗病毒蛋白、皂草素、天花粉蛋白或大麦毒
素。在一些情形中，所述细胞毒素是光毒素。
链、白树毒素、苦瓜毒蛋白(Momordin)、美洲商陆抗病毒蛋白、皂草素、天花粉蛋白或大麦毒
素。在一些情形中，所述细胞毒素是光毒素。
[0084] 还提供了杀伤细胞的方法，所述方法包括将本文描述的任何实施方案的分子给予至先前给予过本文描述的任何实施方案的细胞或上面描述的任何实施方案的组合物的受
试者。在一些方面，在所述受试者展现与所给予的细胞相关的毒性结果的时候或在所述受
试者展现针对所给予的细胞的可检测的和/或细胞介导的免疫应答的时候给予所述分子。
在一些情形中，所述毒性结果与神经毒性或细胞因子释放综合征(CRS)相关。
附图说明
试者。在一些方面，在所述受试者展现与所给予的细胞相关的毒性结果的时候或在所述受
试者展现针对所给予的细胞的可检测的和/或细胞介导的免疫应答的时候给予所述分子。
在一些情形中，所述毒性结果与神经毒性或细胞因子释放综合征(CRS)相关。
附图说明
[0085] 图1描绘了用于从相同构建体中在一个细胞中表达两种蛋白质的、被2A核糖体跳跃元件分开的、编码重组受体(例如，CAR)和所提供的示例性细胞表面缀合物(例如，与
Strep-标签(ST)连接的细胞表面分子(CSM)(CSM-ST))的核酸分子的示意图。还显示了通过
使经基因修饰的细胞与(A)结合固体表面的非抗体试剂(例如Strep-Tactin)或(B)对细胞
表面缀合物的药剂具特异性的抗Strep-标签抗体接触来靶向所表达的细胞表面缀合物的
药剂，以便独立于所表达的重组受体选择经基因修饰的细胞的示例性方法。
Strep-标签(ST)连接的细胞表面分子(CSM)(CSM-ST))的核酸分子的示意图。还显示了通过
使经基因修饰的细胞与(A)结合固体表面的非抗体试剂(例如Strep-Tactin)或(B)对细胞
表面缀合物的药剂具特异性的抗Strep-标签抗体接触来靶向所表达的细胞表面缀合物的
药剂，以便独立于所表达的重组受体选择经基因修饰的细胞的示例性方法。
[0086] 图2描绘了用于从相同构建体中在一个细胞中表达两种蛋白质的、被T2A核糖体开关分开的、编码重组受体(例如，Tg受体)和所提供的示例性细胞表面缀合物(例如，与
Strep-标签(ST)连接的截短的表皮生长因子受体(tEGFR)(tEGFR-ST))的核酸分子的示意
图。还显示了通过使经基因修饰的细胞与(A)结合固体表面的非抗体试剂(例如Strep-
Tactin)或(B)对细胞表面缀合物的药剂具特异性的抗Strep-标签抗体接触来靶向所表达
的细胞表面缀合物的药剂，以便独立于所表达的重组受体选择经基因修饰的细胞的示例性
方法。
Strep-标签(ST)连接的截短的表皮生长因子受体(tEGFR)(tEGFR-ST))的核酸分子的示意
图。还显示了通过使经基因修饰的细胞与(A)结合固体表面的非抗体试剂(例如Strep-
Tactin)或(B)对细胞表面缀合物的药剂具特异性的抗Strep-标签抗体接触来靶向所表达
的细胞表面缀合物的药剂，以便独立于所表达的重组受体选择经基因修饰的细胞的示例性
方法。
具体实施方式
[0087] I.用于加工基因修饰的细胞的细胞表面缀合物
[0088] 本文提供了细胞表面缀合物，所述细胞表面缀合物含有细胞表面分子(如细胞表面蛋白)和至少一种药剂(如亲和标签，例如肽剂)。在一些实施方案中，将所提供的细胞表
面缀合物工程化或在细胞中表达以允许如经由对所述缀合物的药剂具特异性的结合分子
对细胞的特异性靶向、对细胞的分离或选择、或对细胞的检测中的一种或多种，所述结合分
子不结合或识别所述缀合物的细胞表面分子。在一些实施方案中，所述细胞表面分子不是
重组受体，如不是抗原受体，例如，不是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，所提供的
细胞表面缀合物被共工程化到表达重组受体(例如CAR)的细胞中，由此可以利用所述细胞
表面缀合物来处理表达重组受体的细胞，如结合用于检测、选择、分离或基于自杀地删减工
程化细胞的方法。
面缀合物工程化或在细胞中表达以允许如经由对所述缀合物的药剂具特异性的结合分子
对细胞的特异性靶向、对细胞的分离或选择、或对细胞的检测中的一种或多种，所述结合分
子不结合或识别所述缀合物的细胞表面分子。在一些实施方案中，所述细胞表面分子不是
重组受体，如不是抗原受体，例如，不是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，所提供的
细胞表面缀合物被共工程化到表达重组受体(例如CAR)的细胞中，由此可以利用所述细胞
表面缀合物来处理表达重组受体的细胞，如结合用于检测、选择、分离或基于自杀地删减工
程化细胞的方法。
[0089] 多种策略可用于产生和给予工程化细胞用于过继疗法。通常，通过引入一种或多种基因工程化核酸或其产物来将细胞工程化。此类产物包括基因工程化抗原受体，包括工
程化T细胞受体(TCR)和功能性非TCR抗原受体(如嵌合抗原受体(CAR)，包括激活的、刺激的
和共刺激的CAR)、及其组合。例如，策略可用于将表达嵌合受体(如CAR)的细胞(如T细胞)工
程化，以及向受试者给予含有此类工程化细胞的组合物。在产生工程化细胞的整个过程中，
能够鉴定、检测、定位和/或选择所转导的细胞是有益的。在给予工程化细胞用于过继疗法
之后，还需要监测所转导的细胞并提供耗尽或减少受试者中转导细胞数量的机制。
程化T细胞受体(TCR)和功能性非TCR抗原受体(如嵌合抗原受体(CAR)，包括激活的、刺激的
和共刺激的CAR)、及其组合。例如，策略可用于将表达嵌合受体(如CAR)的细胞(如T细胞)工
程化，以及向受试者给予含有此类工程化细胞的组合物。在产生工程化细胞的整个过程中，
能够鉴定、检测、定位和/或选择所转导的细胞是有益的。在给予工程化细胞用于过继疗法
之后，还需要监测所转导的细胞并提供耗尽或减少受试者中转导细胞数量的机制。
[0090] 用于选择和分离细胞的已知方法包括使用CAR特异性抗体来结合目标细胞。例如，使用生物素化的山羊抗小鼠IgG(Fab')2(Jackson ImmunoReseach)用于检测经CAR修饰的T
细胞在本领域中是已知的(Brentjens等人,Sci.Transl.Med.2013年3月；5(177):
177ra38)。由于这种多克隆抗体的灵敏度低，在患者样品中淋巴细胞数目低的情况下，仅在
使用Dynabeads对T细胞进行非特异性扩增之后才能完成对经CAR修饰的T细胞的检测。这阻
止了在输注之后直接评估在体内循环的经CAR-修饰的T细胞。还已经描述了使用蛋白质L用
于通过流式细胞术检测经CAR修饰的T细胞(Zheng等人,J.Transl.Med.2012年2月；10:29)。
这种试剂在多参数流式细胞术测定中的检测和灵敏度方面具有有限的用途。尚未显示该试
剂在其他测定形式中的用途。另一种方法利用直接引入CAR中特定位点的Strep-标签II序
列，由此使用针对Strep-标签的结合试剂直接评估CAR(Liu等人(2016)Nature
Biotechnology,34:430；国际专利申请公开号WO 2015095895)。此外，特异性结合CAR多肽
的单克隆抗体也是已知的(参见国际专利申请公开号WO2014190273)。尽管在一些情境中有
用，但是直接或间接结合CAR的试剂可能有激活CAR以诱导细胞信号传导和工程化细胞的激
活的风险，关于在离体产生和制造过程中分离或选择细胞这并不总是期望的。
细胞在本领域中是已知的(Brentjens等人,Sci.Transl.Med.2013年3月；5(177):
177ra38)。由于这种多克隆抗体的灵敏度低，在患者样品中淋巴细胞数目低的情况下，仅在
使用Dynabeads对T细胞进行非特异性扩增之后才能完成对经CAR修饰的T细胞的检测。这阻
止了在输注之后直接评估在体内循环的经CAR-修饰的T细胞。还已经描述了使用蛋白质L用
于通过流式细胞术检测经CAR修饰的T细胞(Zheng等人,J.Transl.Med.2012年2月；10:29)。
这种试剂在多参数流式细胞术测定中的检测和灵敏度方面具有有限的用途。尚未显示该试
剂在其他测定形式中的用途。另一种方法利用直接引入CAR中特定位点的Strep-标签II序
列，由此使用针对Strep-标签的结合试剂直接评估CAR(Liu等人(2016)Nature
Biotechnology,34:430；国际专利申请公开号WO 2015095895)。此外，特异性结合CAR多肽
的单克隆抗体也是已知的(参见国际专利申请公开号WO2014190273)。尽管在一些情境中有
用，但是直接或间接结合CAR的试剂可能有激活CAR以诱导细胞信号传导和工程化细胞的激
活的风险，关于在离体产生和制造过程中分离或选择细胞这并不总是期望的。
[0091] 在一些方面，外在标记基因结合工程化细胞疗法用于允许检测或选择细胞，并且在一些情况下还用于促进通过ADCC进行细胞自杀。这样的标记基因的示例是截短的表皮生
长因子受体(EGFRt)，其可以与转导细胞中的目标转基因(CAR或TCR)共表达(参见，例如美
国专利号8,802,374)。EGFRt含有由抗体西妥昔单抗 识别的表位。出于这个原
因， 可以用于鉴定或选择已经用EGFRt构建体工程化的细胞，包括还用另一种重
组受体(如嵌合抗原受体(CAR))共同工程化的细胞。另外地，EGFRt通常用作结合细胞疗法
的自杀机制。在一些方面，当EGFRt在具有目标转基因(例如CAR或TCR)的细胞中共表达时，
它可以被西妥昔单抗单克隆抗体靶向，以经由ADCC减少或耗尽转化的经基因修饰的细胞
(参见，美国专利号8,802,374和Liu等人,Nature Biotech.2016年4月；34(4):430-434)。重
要地，使用tEGFR的自杀杀伤方法要求抗体表位的可用性。
长因子受体(EGFRt)，其可以与转导细胞中的目标转基因(CAR或TCR)共表达(参见，例如美
国专利号8,802,374)。EGFRt含有由抗体西妥昔单抗 识别的表位。出于这个原
因， 可以用于鉴定或选择已经用EGFRt构建体工程化的细胞，包括还用另一种重
组受体(如嵌合抗原受体(CAR))共同工程化的细胞。另外地，EGFRt通常用作结合细胞疗法
的自杀机制。在一些方面，当EGFRt在具有目标转基因(例如CAR或TCR)的细胞中共表达时，
它可以被西妥昔单抗单克隆抗体靶向，以经由ADCC减少或耗尽转化的经基因修饰的细胞
(参见，美国专利号8,802,374和Liu等人,Nature Biotech.2016年4月；34(4):430-434)。重
要地，使用tEGFR的自杀杀伤方法要求抗体表位的可用性。
[0092] 本领域已知的上述方法可能具有干扰细胞的加工、产生和/或功能的潜在问题。需要有助于涉及转导细胞产品的产生、监测和给予后阶段的细胞表面标记。例如，用于有效选
择和分离对转基因呈阳性的细胞和用于在体内和离体监测转基因表达细胞的方法是期望
的。所提供的细胞表面缀合物和方法解决了此类需求和/或解决了与现有方法和试剂相关
的一个或多个问题。在一些实施方案中，与结合工程化细胞使用的现有标记或选择策略相
比，所提供的缀合物提供了一个或多个优点。
择和分离对转基因呈阳性的细胞和用于在体内和离体监测转基因表达细胞的方法是期望
的。所提供的细胞表面缀合物和方法解决了此类需求和/或解决了与现有方法和试剂相关
的一个或多个问题。在一些实施方案中，与结合工程化细胞使用的现有标记或选择策略相
比，所提供的缀合物提供了一个或多个优点。
[0093] 在一些实施方案中，所提供的缀合物是含有细胞表面分子的缀合物，所述细胞表面分子缺乏细胞内信号传导结构域和/或不能介导细胞内信号传导，所述细胞表面分子连
接或缀合了药剂如亲和标签(例如肽)。在一些实施方案中，所述药剂是由结合分子识别的
一种药剂。在一些实施方案中，所提供的细胞表面缀合物的药剂是链霉亲和素结合肽(例如
Strep- )，熟知的结合分子可用于所述链霉亲和素结合肽。在一些方面，细胞表面缀
合物是包含细胞表面分子或其修饰形式和药剂(例如亲和标签)的融合蛋白。
接或缀合了药剂如亲和标签(例如肽)。在一些实施方案中，所述药剂是由结合分子识别的
一种药剂。在一些实施方案中，所提供的细胞表面缀合物的药剂是链霉亲和素结合肽(例如
Strep- )，熟知的结合分子可用于所述链霉亲和素结合肽。在一些方面，细胞表面缀
合物是包含细胞表面分子或其修饰形式和药剂(例如亲和标签)的融合蛋白。
[0094] 在一些实施方案中，所述细胞表面分子是经修饰的细胞表面分子，其与参考细胞表面分子相比发生了改变。在一些实施方案中，所述参考细胞表面分子是天然哺乳动物细
胞表面分子。在一些情况下，所述细胞表面分子被修饰，例如，与参考细胞表面分子相比，被
截短或含有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。在一些实施方案中，所述细胞表面分
子含有截短，例如，除去细胞内信号传导结构域和/或其他细胞内结构域或一个或多个细胞
外结构域的全部或一部分的截短。在一些实施方案中，所述细胞表面分子含有或保留至少
一个由抗体或抗原结合片段识别的表位，在一些情况下，所述表位另外允许独立于所述药
剂靶向所述缀合物的细胞表面分子，例如，以介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)用于作为安
全开关机制选择性删减或自杀工程化细胞。在一些实施方案中，所述缀合物的细胞表面分
子含有经修饰的表皮生长因子受体(EGFR)，如截短的EGFR(参见，例如美国专利号8,802,
374)。在一些实施方案中，所述缀合物的细胞表面分子含有经修饰的前列腺特异性膜抗原
(PSMA)，如经修饰的PSMA，例如截短的PSMA(tPSMA)。
胞表面分子。在一些情况下，所述细胞表面分子被修饰，例如，与参考细胞表面分子相比，被
截短或含有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。在一些实施方案中，所述细胞表面分
子含有截短，例如，除去细胞内信号传导结构域和/或其他细胞内结构域或一个或多个细胞
外结构域的全部或一部分的截短。在一些实施方案中，所述细胞表面分子含有或保留至少
一个由抗体或抗原结合片段识别的表位，在一些情况下，所述表位另外允许独立于所述药
剂靶向所述缀合物的细胞表面分子，例如，以介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)用于作为安
全开关机制选择性删减或自杀工程化细胞。在一些实施方案中，所述缀合物的细胞表面分
子含有经修饰的表皮生长因子受体(EGFR)，如截短的EGFR(参见，例如美国专利号8,802,
374)。在一些实施方案中，所述缀合物的细胞表面分子含有经修饰的前列腺特异性膜抗原
(PSMA)，如经修饰的PSMA，例如截短的PSMA(tPSMA)。
[0095] 在一些实施方案中，所述药剂是由结合分子识别的一种药剂，其中与其结合是可逆的和/或其中与结合分子的结合能够在竞争物质的存在下被竞争或破坏。在一些实施方
案中，所述结合分子是或包含如下试剂，所述试剂对所述竞争物质展现的结合亲和力比对
所述药剂展现的结合亲和力更高。在一些实施方案中，所述结合分子是如下试剂，所述试剂
是或包含链霉亲和素或链霉亲和素类似物或突变蛋白，并且所述药剂是链霉亲和素结合
肽，例如Strep-
案中，所述结合分子是或包含如下试剂，所述试剂对所述竞争物质展现的结合亲和力比对
所述药剂展现的结合亲和力更高。在一些实施方案中，所述结合分子是如下试剂，所述试剂
是或包含链霉亲和素或链霉亲和素类似物或突变蛋白，并且所述药剂是链霉亲和素结合
肽，例如Strep-
[0096] 在一些实施方案中，某些链霉亲和素突变蛋白分子(例如Strep-Tactin)能够在生物素或生物素类似物或模拟物的存在下可逆地结合某些链霉亲和素结合肽(例如Strep-
)，所述生物素或生物素类似物或模拟物对链霉亲和素突变蛋白展现的结合亲和力
高于链霉亲和素突变蛋白对链霉亲和素结合肽展现的结合亲和力。因此，在某些方面，所述
细胞表面缀合物的药剂(例如链霉亲和素结合肽，如Strep- )与所述结合分子(例如
链霉亲和素突变蛋白，如Strep-Tactin)之间的结合可以通过添加竞争物质(例如生物素或
生物素模拟物)破坏。在一些实施方案中，此类结合试剂，例如链霉亲和素突变蛋白结合试
剂，不会通过ADCC诱导基于自杀的杀伤。此外，链霉亲和素突变蛋白可以被格式化为可溶性
试剂或结合在固相中(如在固定相中，如存在于柱(例如柱色谱或平面色谱)中)，以促进细
胞选择或分离。
)，所述生物素或生物素类似物或模拟物对链霉亲和素突变蛋白展现的结合亲和力
高于链霉亲和素突变蛋白对链霉亲和素结合肽展现的结合亲和力。因此，在某些方面，所述
细胞表面缀合物的药剂(例如链霉亲和素结合肽，如Strep- )与所述结合分子(例如
链霉亲和素突变蛋白，如Strep-Tactin)之间的结合可以通过添加竞争物质(例如生物素或
生物素模拟物)破坏。在一些实施方案中，此类结合试剂，例如链霉亲和素突变蛋白结合试
剂，不会通过ADCC诱导基于自杀的杀伤。此外，链霉亲和素突变蛋白可以被格式化为可溶性
试剂或结合在固相中(如在固定相中，如存在于柱(例如柱色谱或平面色谱)中)，以促进细
胞选择或分离。
[0097] 在一些实施方案中，所述细胞表面缀合物含有(1)经修饰的细胞表面分子，如缺乏细胞内信号传导结构域和/或用于结合同源配体的一个或多个细胞外结构域的经修饰的细
胞表面受体，以及(2)至少一种链霉亲和素结合肽药剂(Strep- )。描述了示例性细胞
表面分子，并且其包括例如经修饰的表皮生长因子受体。在一些实施方案中，所述细胞表面
缀合物可以经由结合分子试剂检测，所述结合分子试剂是或包含链霉亲和素突变蛋白。在
替代性例子中，可以通过高亲和力单克隆抗Strep标签抗体实现链霉亲和素或结合肽(例如
Strep- )的特异性检测。
胞表面受体，以及(2)至少一种链霉亲和素结合肽药剂(Strep- )。描述了示例性细胞
表面分子，并且其包括例如经修饰的表皮生长因子受体。在一些实施方案中，所述细胞表面
缀合物可以经由结合分子试剂检测，所述结合分子试剂是或包含链霉亲和素突变蛋白。在
替代性例子中，可以通过高亲和力单克隆抗Strep标签抗体实现链霉亲和素或结合肽(例如
Strep- )的特异性检测。
[0098] 在一些实施方案中，所述药剂与细胞表面分子(如经修饰的细胞表面分子)的细胞外(N末端或C末端)部分融合。在一些实施方案中，仅在细胞表面分子的暴露的N末端或C末
端连接所述药剂使所述药剂暴露，使得其易于检测和/或其检测在空间上不被阻断。在一些
实施方案中，细胞表面分子含有能够由结合分子(如抗体或抗原结合片段或配体)识别或结
合的表位，例如以诱导或实施结合安全开关方法的自杀删减。因此，在所述细胞表面分子的
N末端序列或C末端序列处连接所述药剂可以保留细胞表面分子表位的接近，供特异性抗体
或抗原结合片段的识别。在一些实施方案中，所述细胞表面缀合物保留例如经由西妥昔单
抗与工程化细胞上的EGFRt的结合介导的所述细胞表面分子的安全开关功能。
端连接所述药剂使所述药剂暴露，使得其易于检测和/或其检测在空间上不被阻断。在一些
实施方案中，细胞表面分子含有能够由结合分子(如抗体或抗原结合片段或配体)识别或结
合的表位，例如以诱导或实施结合安全开关方法的自杀删减。因此，在所述细胞表面分子的
N末端序列或C末端序列处连接所述药剂可以保留细胞表面分子表位的接近，供特异性抗体
或抗原结合片段的识别。在一些实施方案中，所述细胞表面缀合物保留例如经由西妥昔单
抗与工程化细胞上的EGFRt的结合介导的所述细胞表面分子的安全开关功能。
[0099] 在一些实施方案中，所提供的细胞表面缀合物包括其中细胞的选择或鉴定可以与细胞的激活或自杀分开的那些。在一些情况下，使用针对特定抗原受体(例如CAR)的抗体的
选择过程可能导致所述受体(例如CAR)的意外激活以及通过所述受体(例如CAR)的无意信
号传导。通过所提供的细胞表面缀合物避免了这个问题，所述细胞表面缀合物独立于抗原
受体在细胞表面上表达。在一些实施方案中，所提供的细胞表面缀合物允许重组受体(例如
CAR)的功能保持分离并且不受涉及细胞表面缀合物的活性的影响。在一些情况下，所述缀
合物的检测作为转导的确认将不会导致CAR的意外激活和通过CAR的无意信号传导。因此，
在一些实施方案中，可以降低偏离靶标效应(off target effect)的可能性。
选择过程可能导致所述受体(例如CAR)的意外激活以及通过所述受体(例如CAR)的无意信
号传导。通过所提供的细胞表面缀合物避免了这个问题，所述细胞表面缀合物独立于抗原
受体在细胞表面上表达。在一些实施方案中，所提供的细胞表面缀合物允许重组受体(例如
CAR)的功能保持分离并且不受涉及细胞表面缀合物的活性的影响。在一些情况下，所述缀
合物的检测作为转导的确认将不会导致CAR的意外激活和通过CAR的无意信号传导。因此，
在一些实施方案中，可以降低偏离靶标效应(off target effect)的可能性。
[0100] 同样，由于所述缀合物的细胞表面分子不是抗原受体，例如CAR，并且独立于抗原受体在工程化细胞上共表达，所以对工程化细胞的识别可以基于细胞表面缀合物的表达而
不基于信号传导分子。在一些方面，所提供的细胞表面缀合物具有以下优点：经由所提供的
缀合物的药剂检测或选择工程化细胞不依赖于抗原受体(例如CAR)的表达，和/或表达了多
少抗原受体(例如CAR)。
不基于信号传导分子。在一些方面，所提供的细胞表面缀合物具有以下优点：经由所提供的
缀合物的药剂检测或选择工程化细胞不依赖于抗原受体(例如CAR)的表达，和/或表达了多
少抗原受体(例如CAR)。
[0101] 所提供的细胞表面缀合物还为工程化细胞提供了不需要针对每种细胞疗法重新配置或开发的一般或通用标记。因此，与某些现有技术方法不同，所提供的缀合物和方法避
免了为每种转基因开发单独的标记试剂的需要和/或避免了开发特异性靶向受体(例如CAR
或TCR)的某些结构域的单独的选择试剂。因此，所提供的方法比现有技术方法耗时更少并
且节省了试剂资源。
免了为每种转基因开发单独的标记试剂的需要和/或避免了开发特异性靶向受体(例如CAR
或TCR)的某些结构域的单独的选择试剂。因此，所提供的方法比现有技术方法耗时更少并
且节省了试剂资源。
[0102] 在可用的现有技术方法中，在一些情况下，选择过程可能导致细胞的损失或损伤。在一些方面，使用相同的结合分子(例如在EGFRt的情况下为西妥昔单抗)选择细胞和选择
性靶向细胞进行自杀的方法并不理想。在一些情况下，使用特异性抗体(例如西妥昔单抗)
经由蛋白质标记(例如EGFRt)选择或分离转导细胞的方法可能导致由于基于ADCC自杀的机
制引起的细胞损失。然而，在工程化细胞的离体生产和进一步加工期间，不希望细胞的自杀
和损失。由于所提供的细胞表面缀合物可以由非抗体试剂(例如链霉亲和素突变蛋白试剂)
识别，因此可以避免与结合细胞制造的选择过程中的细胞损失相关的问题。此外，与直接或
间接地结合重组受体(例如CAR)的试剂(所述试剂可能有刺激CAR以诱导细胞信号传导和工
程化细胞的刺激的风险)不同，所提供的实施方案允许在不通过CAR刺激信号的情况下将细
胞工程化、选择、分离、产生、加工或制造。
性靶向细胞进行自杀的方法并不理想。在一些情况下，使用特异性抗体(例如西妥昔单抗)
经由蛋白质标记(例如EGFRt)选择或分离转导细胞的方法可能导致由于基于ADCC自杀的机
制引起的细胞损失。然而，在工程化细胞的离体生产和进一步加工期间，不希望细胞的自杀
和损失。由于所提供的细胞表面缀合物可以由非抗体试剂(例如链霉亲和素突变蛋白试剂)
识别，因此可以避免与结合细胞制造的选择过程中的细胞损失相关的问题。此外，与直接或
间接地结合重组受体(例如CAR)的试剂(所述试剂可能有刺激CAR以诱导细胞信号传导和工
程化细胞的刺激的风险)不同，所提供的实施方案允许在不通过CAR刺激信号的情况下将细
胞工程化、选择、分离、产生、加工或制造。
[0103] 此外，在一些情况下，采用抗体分子进行细胞选择的现有技术方法以抗体与特定靶标的结合是不可逆的或无法有效或快速可逆的方式进行。在一些情况下，识别细胞表面
标记或直接识别抗原受体(例如CAR)的高亲和力抗体(以及特别是KD为10-9M或更低的抗体)
导致抗体从细胞中的分离较慢。在一些情况下，当此类抗体用于结合细胞的产生和制造来
选择抗原受体(例如CAR)工程化细胞时，如果抗体保持附着于细胞，则存在残留抗体可能保
留在最终的配制品或制品中的风险。向受试者给予此类产品可能导致受试者的不良效果。
因此，在一些方面，本文提供的细胞表面缀合物含有药剂(例如链霉亲和素结合肽，如Strep
标签)，所述药剂对某些结合分子试剂(例如链霉亲和素突变蛋白，如Strep-Tactin)展现较
低的亲和力相互作用，以便避免这个问题并降低结合分子试剂保留在药物产品中的风险。
另外，关于制造细胞疗法，完全解离或破坏药剂与其结合分子的结合的方法是期望的。
标记或直接识别抗原受体(例如CAR)的高亲和力抗体(以及特别是KD为10-9M或更低的抗体)
导致抗体从细胞中的分离较慢。在一些情况下，当此类抗体用于结合细胞的产生和制造来
选择抗原受体(例如CAR)工程化细胞时，如果抗体保持附着于细胞，则存在残留抗体可能保
留在最终的配制品或制品中的风险。向受试者给予此类产品可能导致受试者的不良效果。
因此，在一些方面，本文提供的细胞表面缀合物含有药剂(例如链霉亲和素结合肽，如Strep
标签)，所述药剂对某些结合分子试剂(例如链霉亲和素突变蛋白，如Strep-Tactin)展现较
低的亲和力相互作用，以便避免这个问题并降低结合分子试剂保留在药物产品中的风险。
另外，关于制造细胞疗法，完全解离或破坏药剂与其结合分子的结合的方法是期望的。
[0104] 在一些实施方案中，所提供的细胞表面缀合物通过保留或保存由特定抗体识别的表位而保留所述缀合物的细胞表面分子(例如EGFRt或PSMA)的安全开关功能。例如，所提供
的细胞表面缀合物可以被对所述缀合物的细胞表面分子特异的结合分子(例如抗体或其抗
原结合片段)和对所述缀合物的药剂特异的结合分子特异性结合，如非竞争性结合。在一些
方面，通过ADCC靶向细胞表面分子，这取决于细胞表面分子的抗体表位的可用性，在各种应
用中提供增加的细胞表面缀合物的功能。
的细胞表面缀合物可以被对所述缀合物的细胞表面分子特异的结合分子(例如抗体或其抗
原结合片段)和对所述缀合物的药剂特异的结合分子特异性结合，如非竞争性结合。在一些
方面，通过ADCC靶向细胞表面分子，这取决于细胞表面分子的抗体表位的可用性，在各种应
用中提供增加的细胞表面缀合物的功能。
[0105] 作为ADCC介导的活性的替代物，可以通过靶向细胞表面缀合物的药剂来促进受试者中转导细胞产物的耗尽或减少。在一些实施方案中，可以将所提供的药剂进一步修饰以
展现安全开关特性，如通过将对所述药剂特异的结合分子与毒素或其他细胞毒性剂(下文
也称为“自杀剂”)连接或缀合。在一些方面，所提供的自杀剂不依赖于细胞自杀的ADCC机
制，所述ADCC机制在一些情况下由于抗体的药代动力学可能是缓慢的。在一些实施方案中，
所述结合分子不是抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，所述自杀剂的结合分子是链
霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白，如所描述的任何一种，其在一些情况下与作为链霉亲和
素结合剂的药剂结合。在一些实施方案中，可以使用通过将与试剂(Strep- )缀合
的毒素递送至药剂(Strep- )的自杀。在一些方面，与使用抗体激活ADCC相比，由毒素
缀合的试剂介导的杀伤允许更快的递送。与基于抗体的自杀机制相比，此类自杀剂(例如链
霉亲和素突变蛋白-毒素)可以对工程化细胞展现更迅速或更快的特异性细胞杀伤作用。在
一些实施方案中，相比基于抗体的机制启动的细胞杀伤，所述细胞杀伤的启动更快约超过
或超过或约1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍。
展现安全开关特性，如通过将对所述药剂特异的结合分子与毒素或其他细胞毒性剂(下文
也称为“自杀剂”)连接或缀合。在一些方面，所提供的自杀剂不依赖于细胞自杀的ADCC机
制，所述ADCC机制在一些情况下由于抗体的药代动力学可能是缓慢的。在一些实施方案中，
所述结合分子不是抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，所述自杀剂的结合分子是链
霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白，如所描述的任何一种，其在一些情况下与作为链霉亲和
素结合剂的药剂结合。在一些实施方案中，可以使用通过将与试剂(Strep- )缀合
的毒素递送至药剂(Strep- )的自杀。在一些方面，与使用抗体激活ADCC相比，由毒素
缀合的试剂介导的杀伤允许更快的递送。与基于抗体的自杀机制相比，此类自杀剂(例如链
霉亲和素突变蛋白-毒素)可以对工程化细胞展现更迅速或更快的特异性细胞杀伤作用。在
一些实施方案中，相比基于抗体的机制启动的细胞杀伤，所述细胞杀伤的启动更快约超过
或超过或约1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍。
[0106] 还提供了由细胞表达的细胞表面缀合物的方法和用途，如结合加工、制造或给予后监测，结合过继疗法。在一些实施方案中，提供了用于在体内或离体检测表达细胞表面缀
合物的转导细胞的方法。在一些实施方案中，提供了选择(如分离或回收)已成功转导以表
达细胞表面缀合物的细胞的方法。在一些实施方案中，还提供了用于将表达细胞表面缀合
物的细胞自杀杀伤的方法。
合物的转导细胞的方法。在一些实施方案中，提供了选择(如分离或回收)已成功转导以表
达细胞表面缀合物的细胞的方法。在一些实施方案中，还提供了用于将表达细胞表面缀合
物的细胞自杀杀伤的方法。
[0107] 在一些实施方案中，所提供的方法涉及将细胞与细胞表面缀合物和所需的重组受体转基因(例如CAR或TCR)共同工程化。还提供了用于用细胞表面缀合物和重组受体来共同
工程化细胞的载体。在一些实施方案中，提供了含有细胞表面缀合物的编码序列的骨架载
体构建体。在一些情况下，通过在将细胞基因工程化以独立表达细胞表面缀合物和重组受
体的方法中使用这样的骨架构建体来实现提高的效率。在一些实施方案中，含有细胞表面
缀合物的骨架表达载体可以用于插入特异性靶向抗原的独特重组受体(CAR、TCR等)的转基
因序列。在一些实施方案中，所得的载体构建体包括编码重组受体的核酸序列、编码2A元件
(例如T2A核糖体跳跃元件)的序列、和编码细胞表面缀合物的序列(例如在编码CAR的序列
的下游)。因此，在一些方面，编码重组受体(例如CAR)和缀合物的构建体被2A元件(例如，
T2A核糖体开关)分开，用于从相同构建体中表达两种蛋白质。在一些实施方案中，可以修饰
此类提供的构建体以容易地编码任何重组受体(例如CAR)。
工程化细胞的载体。在一些实施方案中，提供了含有细胞表面缀合物的编码序列的骨架载
体构建体。在一些情况下，通过在将细胞基因工程化以独立表达细胞表面缀合物和重组受
体的方法中使用这样的骨架构建体来实现提高的效率。在一些实施方案中，含有细胞表面
缀合物的骨架表达载体可以用于插入特异性靶向抗原的独特重组受体(CAR、TCR等)的转基
因序列。在一些实施方案中，所得的载体构建体包括编码重组受体的核酸序列、编码2A元件
(例如T2A核糖体跳跃元件)的序列、和编码细胞表面缀合物的序列(例如在编码CAR的序列
的下游)。因此，在一些方面，编码重组受体(例如CAR)和缀合物的构建体被2A元件(例如，
T2A核糖体开关)分开，用于从相同构建体中表达两种蛋白质。在一些实施方案中，可以修饰
此类提供的构建体以容易地编码任何重组受体(例如CAR)。
[0108] 还提供了用于使用表达细胞表面缀合物的细胞的方法。提供了细胞分离和基因工程的方法。提供了编码细胞表面缀合物的核酸(如构建体，例如病毒载体)和/或细胞表面缀
合物的编码核酸和/或蛋白质，以及用于如通过转导将此类核酸引入细胞中的方法。还提供
了含有工程化细胞的组合物，以及用于向受试者给予和监测细胞和组合物(如用于过继细
胞疗法)的方法、试剂盒和设备。
合物的编码核酸和/或蛋白质，以及用于如通过转导将此类核酸引入细胞中的方法。还提供
了含有工程化细胞的组合物，以及用于向受试者给予和监测细胞和组合物(如用于过继细
胞疗法)的方法、试剂盒和设备。
[0109] II.细胞表面缀合物
[0110] 本文提供了细胞表面缀合物，所述细胞表面缀合物含有细胞表面分子和至少一种药剂(例如肽)，如亲和标签，所述药剂能够由结合分子特异性识别。在一些实施方案中，所
提供的缀合物是或包括融合蛋白。在一些实施方案中，所述缀合物的细胞表面分子缺乏功
能性细胞内信号传导结构域和/或不能介导细胞内信号传导。在一些方面，所述细胞表面分
子是与参考细胞表面分子相比发生了改变的经修饰的细胞表面分子，例如，是缺乏所述参
考细胞表面分子的细胞内信号传导结构域的全部或部分的截短的细胞表面受体，和/或含
有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。在一些实施方案中，所述缀合物的细胞表面分
子展现改变的细胞内化、酶促活性和/或配体结合。在一些实施方案中，所述药剂(例如肽)，
如亲和标签，与所述细胞表面分子的N末端或C末端部分连接。在一些实施方案中，所述药剂
是链霉亲和素结合肽(例如Strep- )，并且所述细胞表面分子是经修饰的EGFR，如截
短的EGFR。在一些实施方案中，所述药剂是链霉亲和素结合肽(例如Strep- )，并且
所述细胞表面分子是经修饰的PSMA，如截短的PSMA。
提供的缀合物是或包括融合蛋白。在一些实施方案中，所述缀合物的细胞表面分子缺乏功
能性细胞内信号传导结构域和/或不能介导细胞内信号传导。在一些方面，所述细胞表面分
子是与参考细胞表面分子相比发生了改变的经修饰的细胞表面分子，例如，是缺乏所述参
考细胞表面分子的细胞内信号传导结构域的全部或部分的截短的细胞表面受体，和/或含
有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。在一些实施方案中，所述缀合物的细胞表面分
子展现改变的细胞内化、酶促活性和/或配体结合。在一些实施方案中，所述药剂(例如肽)，
如亲和标签，与所述细胞表面分子的N末端或C末端部分连接。在一些实施方案中，所述药剂
是链霉亲和素结合肽(例如Strep- )，并且所述细胞表面分子是经修饰的EGFR，如截
短的EGFR。在一些实施方案中，所述药剂是链霉亲和素结合肽(例如Strep- )，并且
所述细胞表面分子是经修饰的PSMA，如截短的PSMA。
[0111] 在一些实施方案中，所提供的缀合物含有以下组分：细胞表面分子(CSM)、接头(L)和药剂(A)，其由下式表示：CSM-(L)q-(A)m，其中q是0或更大并且m是至少1或是1。在一些实
施方案中，选择变量q和m，使得所得的细胞表面缀合物在细胞上表达，并且可以经由所述药
剂被结合分子检测，并且任选地，被对所述细胞表面分子的表位特异的抗体或抗原结合片
段识别。在一些实施方案中，m是1至5，如1至4或1至3，例如，至少或至少约或约或1、2、3、4或
5。在一些实施方案中，q是0至5，并且可以取决于所连接的药剂的数目。在一些实施方案中，
可以按顺序连接几个接头。
施方案中，选择变量q和m，使得所得的细胞表面缀合物在细胞上表达，并且可以经由所述药
剂被结合分子检测，并且任选地，被对所述细胞表面分子的表位特异的抗体或抗原结合片
段识别。在一些实施方案中，m是1至5，如1至4或1至3，例如，至少或至少约或约或1、2、3、4或
5。在一些实施方案中，q是0至5，并且可以取决于所连接的药剂的数目。在一些实施方案中，
可以按顺序连接几个接头。
[0112] 在一些方面，所述至少一种药剂直接与所述细胞表面分子连接。在一些方面，所述至少一种药剂经由至少一个接头间接地与所述细胞表面分子连接(linked或joined)。在一
些实施方案中，所述药剂(例如肽)，如亲和标签，经由其N末端或其C末端与所述细胞表面分
子连接。在一些实施方案中，所述药剂被连接在所述细胞表面分子的膜远端细胞外部分。在
一些实施方案中，所述药剂被连接在所述细胞表面分子的N末端。在一些实施方案中，所述
药剂被连接在所述细胞表面分子的C末端。在一些实施方案中，所述药剂是长度为小于50个
氨基酸的肽标签，所述肽标签直接或间接经由接头与所述细胞表面分子的细胞外(N末端)
或(C末端)部分融合。在一些实施方案中，所述药剂与所述细胞表面分子的细胞外部分或结
构域连接。在一些实施方案中，q是0并且m是1，并且所述药剂直接与所述细胞表面分子的N
末端连接。在一些实施方案中，所提供的缀合物是或包括融合蛋白，如含有包括一种或多种
细胞表面分子、接头或药剂的组分的融合蛋白。
些实施方案中，所述药剂(例如肽)，如亲和标签，经由其N末端或其C末端与所述细胞表面分
子连接。在一些实施方案中，所述药剂被连接在所述细胞表面分子的膜远端细胞外部分。在
一些实施方案中，所述药剂被连接在所述细胞表面分子的N末端。在一些实施方案中，所述
药剂被连接在所述细胞表面分子的C末端。在一些实施方案中，所述药剂是长度为小于50个
氨基酸的肽标签，所述肽标签直接或间接经由接头与所述细胞表面分子的细胞外(N末端)
或(C末端)部分融合。在一些实施方案中，所述药剂与所述细胞表面分子的细胞外部分或结
构域连接。在一些实施方案中，q是0并且m是1，并且所述药剂直接与所述细胞表面分子的N
末端连接。在一些实施方案中，所提供的缀合物是或包括融合蛋白，如含有包括一种或多种
细胞表面分子、接头或药剂的组分的融合蛋白。
[0113] 在一些方面，所述接头可以是肽、多肽或化学接头，其可以是可切割的或不可切割的。在一些方面，所述接头是肽，如含有短的氨基酸序列以连接多肽序列(或编码这样的氨
基酸序列的核酸)的肽。在一些实施方案中，所述接头是缓解或减少可能由所述药剂接近所
述细胞表面分子引起的空间位阻和/或增加或改变所述缀合物的一种或多种特性(如表达、
特异性或免疫原性)的一种接头。在一些实施方案中，可以通过重组方法促进连接或缀合。
在一些实施方案中，所述接头是肽或多肽，并且所提供的缀合物是融合蛋白。
基酸序列的核酸)的肽。在一些实施方案中，所述接头是缓解或减少可能由所述药剂接近所
述细胞表面分子引起的空间位阻和/或增加或改变所述缀合物的一种或多种特性(如表达、
特异性或免疫原性)的一种接头。在一些实施方案中，可以通过重组方法促进连接或缀合。
在一些实施方案中，所述接头是肽或多肽，并且所提供的缀合物是融合蛋白。
[0114] 融合蛋白可以包括细胞表面分子，所述细胞表面分子是细胞表面蛋白，如所描述的任何一种，其直接或间接地与肽或多肽剂(例如亲和标签，如链霉亲和素结合肽)连接。编
码融合蛋白的核酸序列可以含有所述细胞表面蛋白和所述至少一种肽或多肽剂的编码序
列，使得所述核酸序列含有两种或更多种蛋白质(在一些情况下2种、3种、4种、5种或更多种
蛋白质)的编码序列。在一些实施方案中，每个编码序列在相同的阅读框中，使得当融合蛋
白在宿主细胞中转录和翻译时，产生含有所述细胞表面蛋白和所述至少一种肽或多肽剂
(例如链霉亲和素结合肽)的蛋白质。在一些方面，所述两种或更多种蛋白质中的每一种可
以与构建体中的另一种蛋白质相邻，或者被含有1个、2个、3个或更多个但通常少于20个、15
个、10个、9个、8个、7个或6个氨基酸的接头多肽(如肽接头)分开。
码融合蛋白的核酸序列可以含有所述细胞表面蛋白和所述至少一种肽或多肽剂的编码序
列，使得所述核酸序列含有两种或更多种蛋白质(在一些情况下2种、3种、4种、5种或更多种
蛋白质)的编码序列。在一些实施方案中，每个编码序列在相同的阅读框中，使得当融合蛋
白在宿主细胞中转录和翻译时，产生含有所述细胞表面蛋白和所述至少一种肽或多肽剂
(例如链霉亲和素结合肽)的蛋白质。在一些方面，所述两种或更多种蛋白质中的每一种可
以与构建体中的另一种蛋白质相邻，或者被含有1个、2个、3个或更多个但通常少于20个、15
个、10个、9个、8个、7个或6个氨基酸的接头多肽(如肽接头)分开。
[0115] 示例性肽接头包括(Gly-Ser)n氨基酸序列，其在一些情况下可以包括分散在其中以增加溶解度的一些Glu或Lys残基。可以将接头长度定制为更长或更短，以确保结合分子
接近所述药剂并确保抗体或抗原结合片段(或其他结合分子)接近所述缀合物的细胞表面
分子。在一些实施方案中，所述接头是如GGGSGGGS(SEQ ID NO:59)；GGGGS(SEQ ID NO:60)；
GGGS(SEQ ID NO:61)；GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:62)；GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID
NO:55)；GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:56)所示的任何一个。在一些实施方案中，所述接头是可切
割接头。在一些实施方案中，可切割接头包含Phe-Leu接头、Gly-Phe-Leu-Gly接头(SEQ ID
NO:99)、Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala接头(如SEQ ID NO:98中所示)、Val-Cit接头或Phe-Lys
接头(参见，例如美国专利6,214,345)。
接近所述药剂并确保抗体或抗原结合片段(或其他结合分子)接近所述缀合物的细胞表面
分子。在一些实施方案中，所述接头是如GGGSGGGS(SEQ ID NO:59)；GGGGS(SEQ ID NO:60)；
GGGS(SEQ ID NO:61)；GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:62)；GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID
NO:55)；GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:56)所示的任何一个。在一些实施方案中，所述接头是可切
割接头。在一些实施方案中，可切割接头包含Phe-Leu接头、Gly-Phe-Leu-Gly接头(SEQ ID
NO:99)、Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala接头(如SEQ ID NO:98中所示)、Val-Cit接头或Phe-Lys
接头(参见，例如美国专利6,214,345)。
[0116] 在一些实施方案中，所述细胞表面缀合物是非免疫原性的。在一些实施方案中，所述细胞表面缀合物不包含免疫原性的表位和/或不被免疫应答识别或不能在动物中诱导、
引发或启动可检测的免疫应答，例如体液或细胞介导的免疫。细胞介导的免疫应答包括例
如T细胞应答，如T细胞增殖、淋巴因子分泌、细胞毒性应答、局部炎性反应和/或募集另外的
免疫细胞。体液应答包括例如激活B细胞，导致产生针对免疫原性表位的抗体。表达细胞表
面缀合物的细胞诱导或引发免疫应答(如体液或细胞介导的免疫应答)的能力可以在向受
试者给予此类细胞后进行评估。在一些实施方案中，可以对来自受试者的血清通过诸如
ELISpot、细胞内细胞因子染色、ELISA(例如对于细胞因子)或基于细胞的抗体检测方法(例
如，通过流式细胞术)等方法来鉴定特异性结合和/或中和细胞表面缀合物的结合表位的抗
体的存在。在一些实施方案中，可以使用表达细胞表面缀合物的细胞(例如，经辐射的细胞)
作为刺激细胞，使用细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)测定检测特异性结合并诱导细胞毒性和/或
混合的淋巴细胞反应的CD8+T细胞来评估细胞介导的对细胞表面缀合物的免疫应答。
引发或启动可检测的免疫应答，例如体液或细胞介导的免疫。细胞介导的免疫应答包括例
如T细胞应答，如T细胞增殖、淋巴因子分泌、细胞毒性应答、局部炎性反应和/或募集另外的
免疫细胞。体液应答包括例如激活B细胞，导致产生针对免疫原性表位的抗体。表达细胞表
面缀合物的细胞诱导或引发免疫应答(如体液或细胞介导的免疫应答)的能力可以在向受
试者给予此类细胞后进行评估。在一些实施方案中，可以对来自受试者的血清通过诸如
ELISpot、细胞内细胞因子染色、ELISA(例如对于细胞因子)或基于细胞的抗体检测方法(例
如，通过流式细胞术)等方法来鉴定特异性结合和/或中和细胞表面缀合物的结合表位的抗
体的存在。在一些实施方案中，可以使用表达细胞表面缀合物的细胞(例如，经辐射的细胞)
作为刺激细胞，使用细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)测定检测特异性结合并诱导细胞毒性和/或
混合的淋巴细胞反应的CD8+T细胞来评估细胞介导的对细胞表面缀合物的免疫应答。
[0117] 在一些实施方案中，编码细胞表面缀合物的多核苷酸还含有编码信号肽的信号序列，例如以用于将所表达的蛋白质靶向分泌途径以将所述缀合物插入细胞膜中。在一些方
面，所述信号肽的长度为约5个-30个氨基酸并且存在于所编码的缀合物的N末端。在一些实
施方案中，多核苷酸编码按N末端至C末端的顺序含有以下的缀合物：信号肽、药剂(例如亲
和标签，如链霉亲和素结合肽)和细胞表面分子(例如经修饰的细胞表面分子，如EGFRt)。在
一些实施方案中，所述信号肽是参考细胞表面分子的天然信号肽(例如包含在SEQ ID NO:
64-69中任一个中所示的序列中的天然信号肽)。在一些实施方案中，所述信号肽是异源的
或非天然的信号肽，如SEQ ID NO:48中所示的GMCSFRα链信号肽，在一些情况下，其由SEQ
ID NO:47中所示的核苷酸编码。在一些实施方案中，多核苷酸编码按N末端至C末端的顺序
含有以下的缀合物：细胞表面分子(例如PSMA)或经修饰的细胞表面分子(例如tPSMA)和药
剂(例如亲和标签，如链霉亲和素结合肽)。
面，所述信号肽的长度为约5个-30个氨基酸并且存在于所编码的缀合物的N末端。在一些实
施方案中，多核苷酸编码按N末端至C末端的顺序含有以下的缀合物：信号肽、药剂(例如亲
和标签，如链霉亲和素结合肽)和细胞表面分子(例如经修饰的细胞表面分子，如EGFRt)。在
一些实施方案中，所述信号肽是参考细胞表面分子的天然信号肽(例如包含在SEQ ID NO:
64-69中任一个中所示的序列中的天然信号肽)。在一些实施方案中，所述信号肽是异源的
或非天然的信号肽，如SEQ ID NO:48中所示的GMCSFRα链信号肽，在一些情况下，其由SEQ
ID NO:47中所示的核苷酸编码。在一些实施方案中，多核苷酸编码按N末端至C末端的顺序
含有以下的缀合物：细胞表面分子(例如PSMA)或经修饰的细胞表面分子(例如tPSMA)和药
剂(例如亲和标签，如链霉亲和素结合肽)。
[0118] A.细胞表面分子，例如经修饰的细胞表面分子
[0119] 在一些实施方案中，所述缀合物的细胞表面分子含有至少一个细胞外结构域和跨膜结构域。在一些实施方案中，所述细胞表面分子能够在细胞表面上表达。在一些实施方案
中，所述细胞表面分子是细胞表面受体、配体、糖蛋白、细胞粘附分子、抗原、整合素或分化
簇(CD)或是其修饰形式。在一些实施方案中，所述细胞表面分子不是嵌合抗原受体。在一些
实施方案中，所述细胞表面分子是经修饰的细胞表面分子，其与参考细胞表面分子相比发
生了改变。在一些情况下，经修饰的细胞表面分子缺乏功能性细胞内信号传导结构域和/或
不能介导细胞内信号传导。
中，所述细胞表面分子是细胞表面受体、配体、糖蛋白、细胞粘附分子、抗原、整合素或分化
簇(CD)或是其修饰形式。在一些实施方案中，所述细胞表面分子不是嵌合抗原受体。在一些
实施方案中，所述细胞表面分子是经修饰的细胞表面分子，其与参考细胞表面分子相比发
生了改变。在一些情况下，经修饰的细胞表面分子缺乏功能性细胞内信号传导结构域和/或
不能介导细胞内信号传导。
[0120] 在一些实施方案中，所述细胞表面缀合物的所述细胞表面分子含有与参考细胞表面分子相比发生改变的经修饰的细胞表面分子。在一些实施方案中，所述参考细胞表面分
子是细胞表面受体、配体、糖蛋白、细胞粘附分子、抗原、整合素或分化簇(CD)。在一些实施
方案中，所述参考细胞表面分子是细胞表面受体。在一些实施方案中，所述参考细胞表面分
子是天然哺乳动物细胞表面分子，如天然哺乳动物细胞表面受体。在一些情况下，所述细胞
表面分子是天然的人膜蛋白。
子是细胞表面受体、配体、糖蛋白、细胞粘附分子、抗原、整合素或分化簇(CD)。在一些实施
方案中，所述参考细胞表面分子是细胞表面受体。在一些实施方案中，所述参考细胞表面分
子是天然哺乳动物细胞表面分子，如天然哺乳动物细胞表面受体。在一些情况下，所述细胞
表面分子是天然的人膜蛋白。
[0121] 在一些实施方案中，所述参考细胞表面分子可以是包含含有由抗体或其抗原结合片段识别的一个或多个表位的细胞外结构域或区域的一种细胞表面分子。所述抗体或抗原
结合片段可以包括多克隆和单克隆抗体，包括完整抗体和功能性(抗原结合)抗体片段，所
述功能性(抗原结合)抗体片段包括片段抗原结合(Fab)片段、F(ab')2片段、Fab'片段、Fv片
段、重组IgG(rIgG)片段、能够特异性结合抗原的可变重链(VH)区、单链抗体片段(包括单链
可变片段(scFv))以及单结构域抗体(例如，sdAb、sdFv、纳米抗体)片段。抗体或其抗原结合
片段可以包括完整或全长抗体，包括任何类别或亚类(包括IgG及其亚类，IgM、IgE、IgA和
IgD)的抗体，或全长抗体的部分或片段。在一些方面，所述抗体是经临床批准的抗体或其抗
原结合片段。在一些方面，所述一个或多个表位可以含有分子或蛋白质的连续或非连续序
列。在一些方面，所述一个或多个表位存在于所述参考细胞表面分子的细胞外部分或区域
中，使得所述参考细胞表面分子可以被抗体或抗原结合片段识别、鉴定或检测。
结合片段可以包括多克隆和单克隆抗体，包括完整抗体和功能性(抗原结合)抗体片段，所
述功能性(抗原结合)抗体片段包括片段抗原结合(Fab)片段、F(ab')2片段、Fab'片段、Fv片
段、重组IgG(rIgG)片段、能够特异性结合抗原的可变重链(VH)区、单链抗体片段(包括单链
可变片段(scFv))以及单结构域抗体(例如，sdAb、sdFv、纳米抗体)片段。抗体或其抗原结合
片段可以包括完整或全长抗体，包括任何类别或亚类(包括IgG及其亚类，IgM、IgE、IgA和
IgD)的抗体，或全长抗体的部分或片段。在一些方面，所述抗体是经临床批准的抗体或其抗
原结合片段。在一些方面，所述一个或多个表位可以含有分子或蛋白质的连续或非连续序
列。在一些方面，所述一个或多个表位存在于所述参考细胞表面分子的细胞外部分或区域
中，使得所述参考细胞表面分子可以被抗体或抗原结合片段识别、鉴定或检测。
[0122] 在一些实施方案中，所述参考细胞表面分子的细胞外结构域在一些情况下还含有能够与结合配偶体、抗原、底物或配体特异性结合的结合结构域。在此类实施方案中，所提
供的细胞表面分子包括经修饰的细胞表面分子，其中这样的结合结构域被修饰或改变，例
如被突变或缺失，使得与所述参考细胞表面分子与结合配偶体、抗原、底物或配体的结合相
比，经修饰的细胞表面分子与其正常同源结合配偶体、抗原、底物或配体结合的能力被降
低。在一些情况下，所述改变的结合被减少了大于或大于约40％、大于或大于约50％、大于
或大于约60％、大于或大于约70％、大于或大于约80％、大于或大于约90％或更多。
供的细胞表面分子包括经修饰的细胞表面分子，其中这样的结合结构域被修饰或改变，例
如被突变或缺失，使得与所述参考细胞表面分子与结合配偶体、抗原、底物或配体的结合相
比，经修饰的细胞表面分子与其正常同源结合配偶体、抗原、底物或配体结合的能力被降
低。在一些情况下，所述改变的结合被减少了大于或大于约40％、大于或大于约50％、大于
或大于约60％、大于或大于约70％、大于或大于约80％、大于或大于约90％或更多。
[0123] 在一些实施方案中，所述细胞表面分子是膜蛋白或膜整合蛋白。在一些实施方案中，所述细胞表面分子含有跨膜结构域。在一些方面，所述细胞表面分子是I型、II型、III型
或IV型膜蛋白。在一些方面，I型蛋白具有疏水性残基的单个跨膜延伸，其中跨膜结构域的
氨基(N)-末端侧上的多肽部分暴露于膜的外侧并且羧基(C)-末端部分暴露于细胞质侧。在
一些方面，I型膜蛋白被细分为Ia型(具有可切割的信号序列)和Ib(没有可切割的信号序
列)。在一些方面，II型膜蛋白仅跨越膜一次，但它们的氨基末端位于细胞的细胞质侧并且
羧基末端位于外部。在一些方面，III型膜蛋白在单个多肽链中具有多个跨膜结构域，并且
可以细分为IIIa型蛋白质(具有可切割的信号序列)和IIIb型(氨基末端暴露在膜的外表面
上，但是没有可切割的信号序列)。在一些方面，IV型蛋白具有多个同源结构域，其构成多次
跨越膜的组件，其中结构域存在于单个多肽链或一个或多个不同的多肽链上。
或IV型膜蛋白。在一些方面，I型蛋白具有疏水性残基的单个跨膜延伸，其中跨膜结构域的
氨基(N)-末端侧上的多肽部分暴露于膜的外侧并且羧基(C)-末端部分暴露于细胞质侧。在
一些方面，I型膜蛋白被细分为Ia型(具有可切割的信号序列)和Ib(没有可切割的信号序
列)。在一些方面，II型膜蛋白仅跨越膜一次，但它们的氨基末端位于细胞的细胞质侧并且
羧基末端位于外部。在一些方面，III型膜蛋白在单个多肽链中具有多个跨膜结构域，并且
可以细分为IIIa型蛋白质(具有可切割的信号序列)和IIIb型(氨基末端暴露在膜的外表面
上，但是没有可切割的信号序列)。在一些方面，IV型蛋白具有多个同源结构域，其构成多次
跨越膜的组件，其中结构域存在于单个多肽链或一个或多个不同的多肽链上。
[0124] 在一些实施方案中，所述参考细胞表面分子进一步含有细胞内(或细胞质)区域或结构域，即存在于细胞内部和/或存在于细胞的细胞质侧的一个或多个连续氨基酸的区域。
在一些情况下，参考细胞表面分子的细胞内区域含有细胞内信号传导结构域和/或能够介
导细胞内信号传导(通过直接或间接调节细胞信号转导途径和/或下游反应、功能或活性
(例如，基因和蛋白质表达、分子亚细胞定位的变化、细胞内运输、蛋白质-蛋白质相互作用
的变化、受体内化、细胞分化、增殖和/或存活))。
在一些情况下，参考细胞表面分子的细胞内区域含有细胞内信号传导结构域和/或能够介
导细胞内信号传导(通过直接或间接调节细胞信号转导途径和/或下游反应、功能或活性
(例如，基因和蛋白质表达、分子亚细胞定位的变化、细胞内运输、蛋白质-蛋白质相互作用
的变化、受体内化、细胞分化、增殖和/或存活))。
[0125] 在一些实施方案中，细胞内信号传导区域或结构域(例如存在于或含有参考细胞表面分子的细胞质尾部)含有一个或多个基序或残基，所述一个或多个基序或残基能够在
发出分子或细胞信号时(例如，当被激活或暴露于其同源抗原或配体时)在细胞中被磷酸化
和/或与信号转导途径或下游过程中的一种或多种衔接子蛋白相互作用。在一些实施方案
中，所述基序是或含有基于酪氨酸的基序(例如YXXO，其中Y是酪氨酸、X是任何氨基酸并且O
是具有庞大疏水性基团的氨基酸)、或基于二亮氨酸的基序(例如LL)。在一些方面，参考细
胞表面分子的细胞内信号传导结构域可以存在于I型膜蛋白的C末端处或附近，或存在于II
型膜蛋白的N末端处或附近。在此类实施方案中，所提供的细胞表面分子包括经修饰的细胞
表面分子，其中这样一种细胞内区域或结构域的氨基酸残基被修饰或改变(例如被突变，例
如通过一个或多个取代、缺失、截短和/或插入)，使得经修饰的细胞表面分子调节细胞信号
转导途径和/或下游反应、功能或活性的能力被降低或阻止。在一些情况下，与参考细胞表
面分子的这种信号传导和/或下游反应、功能或活性相比，所述改变的信号传导和/或下游
反应、功能或活性被减少了大于或大于约40％、大于或大于约50％、大于或大于约60％、大
于或大于约70％、大于或大于约80％、大于或大于约90％或更多。
发出分子或细胞信号时(例如，当被激活或暴露于其同源抗原或配体时)在细胞中被磷酸化
和/或与信号转导途径或下游过程中的一种或多种衔接子蛋白相互作用。在一些实施方案
中，所述基序是或含有基于酪氨酸的基序(例如YXXO，其中Y是酪氨酸、X是任何氨基酸并且O
是具有庞大疏水性基团的氨基酸)、或基于二亮氨酸的基序(例如LL)。在一些方面，参考细
胞表面分子的细胞内信号传导结构域可以存在于I型膜蛋白的C末端处或附近，或存在于II
型膜蛋白的N末端处或附近。在此类实施方案中，所提供的细胞表面分子包括经修饰的细胞
表面分子，其中这样一种细胞内区域或结构域的氨基酸残基被修饰或改变(例如被突变，例
如通过一个或多个取代、缺失、截短和/或插入)，使得经修饰的细胞表面分子调节细胞信号
转导途径和/或下游反应、功能或活性的能力被降低或阻止。在一些情况下，与参考细胞表
面分子的这种信号传导和/或下游反应、功能或活性相比，所述改变的信号传导和/或下游
反应、功能或活性被减少了大于或大于约40％、大于或大于约50％、大于或大于约60％、大
于或大于约70％、大于或大于约80％、大于或大于约90％或更多。
[0126] 在一些实施方案中，所述参考细胞表面分子不同于由重组受体(例如嵌合抗原受体(CAR))靶向的抗原(例如细胞表面表达的抗原)和/或与其不相同。在一些实施方案中，所
述参考细胞表面分子或其修饰形式不被重组受体(例如嵌合抗原受体(CAR))的配体-或抗
原-结合结构域特异性结合和/或识别。
述参考细胞表面分子或其修饰形式不被重组受体(例如嵌合抗原受体(CAR))的配体-或抗
原-结合结构域特异性结合和/或识别。
[0127] 在一些实施方案中，所述参考细胞表面分子是或包括细胞表面蛋白和/或受体。在一些实施方案中，所述参考细胞表面分子是EpCAM、VEGFR、整合素(例如，整合素αvβ3、α4、αIIbβ3、α4β7、α5β1、αvβ3、αv)、TNF受体超家族(例如，TRAIL-R1、TRAIL-R2)、PDGF受体、干扰素受体、叶酸受体、GPNMB、ICAM-1、HLA-DR、CEA、CA-125、MUC1、TAG-72、IL-6受体、5T4、GD2、GD3、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、或分化簇(例如，CD2、CD3、CD4、CD5、CD11、CD11a/LFA-1、CD15、CD18/ITGB2、CD19、CD20、CD22、CD23/IgE受体、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD41、CD44、CD51、CD52、CD62L、CD74、CD80、CD125、CD147/基础免疫球蛋白、CD152/CTLA-4、CD154/CD40L、CD195/CCR5、CD319/SLAMF7)。
[0128] 合适的参考细胞表面分子(例如用于修饰的细胞表面分子)包括在美国专利号8,802,374中描述的那些，将所述专利通过引用特此并入。在一些实施方案中，所述参考细胞
表面分子是表皮生长因子受体(EGFR)、erbB-2受体酪氨酸蛋白激酶、erbB-3受体酪氨酸蛋
白激酶、erbB-4受体酪氨酸蛋白激酶、肝细胞生长因子受体(HGFR/c-MET)或胰岛素样生长
因子受体-1(IGFR-1)。在一些实施方案中，所述参考细胞表面分子含有在SEQ ID NO:49-54
中任一个中所示的氨基酸序列或展现与SEQ ID NO:49-54中任一个至少或至少约85％、
86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
表面分子是表皮生长因子受体(EGFR)、erbB-2受体酪氨酸蛋白激酶、erbB-3受体酪氨酸蛋
白激酶、erbB-4受体酪氨酸蛋白激酶、肝细胞生长因子受体(HGFR/c-MET)或胰岛素样生长
因子受体-1(IGFR-1)。在一些实施方案中，所述参考细胞表面分子含有在SEQ ID NO:49-54
中任一个中所示的氨基酸序列或展现与SEQ ID NO:49-54中任一个至少或至少约85％、
86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
[0129] 在一些实施方案中，所述参考细胞表面分子可以是包含由抗体识别的表位的一种分子，所述抗体包括但不限于3F8、阿巴伏单抗(abagovomab)、阿昔单抗、阿德木单抗
(adecatumumab)、阿夫土珠(afutuzumab)、阿仑单抗、喷替酸阿妥莫单抗(altumomab
pentetate)、麻安莫单抗(anatumomab mafenatox)、阿泊珠单抗(apolizumab)、阿西莫单
抗、阿塞珠单抗(aselizumab)、阿特珠单抗(atlizumab)(＝托西珠单抗(tocilizumab))、巴
利昔单抗、贝妥莫单抗(bectumomab)、贝那利珠单抗(benralizumab)、贝索单抗
(besilesomab)、莫比伐珠单抗(bivatuzumab mertansine)、博纳吐单抗、本妥昔单抗
(brentuximab vedotin)、莫坎妥珠单抗(cantuzumab mertansine)、卡罗单抗喷地肽
(capromab pendetide)、卡妥索单抗(catumaxomab)、CC49、西利珠单抗(cedelizumab)、西
莫白介素(celmoleukin)、泊西他珠单抗(citatuzumab bogatox)、克立昔单抗
(clenoliximab)、泰坦-克利妥珠单抗(clivatuzumab tetraxetan)、CNTO-95、可那木单抗
(conatumumab)、达西珠单抗(dacetuzumab)、达利珠单抗(daclizumab)、达雷木单抗
(daratumumab)、地莫单抗(detumomab)、依美昔单抗(ecromeximab)、依决洛单抗
(edrecolomab)、依法利珠单抗(efalizumab)、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)、PEG化恩莫单抗
(enlimomab pegol)、西依匹莫单抗(epitumomab cituxetan)、依帕珠单抗(epratuzumab)、
厄利珠单抗(erlizumab)、埃达珠单抗(etaracizumab)、法索单抗(fanolesomab)、法拉莫单
抗(faralimomab)、法勒珠单抗(farletuzumab)、加利昔单抗(galiximab)、加维莫单抗
(gavilimomab)、吉妥单抗(gemtuzumab ozogamicin)、维汀-格仑妥木单抗、戈利昔单抗
(gomiliximab)、伊巴利珠单抗(ibalizumab)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、伊戈
伏单抗(igovomab)、英妥木单抗(intetumumab)、伊妥木单抗(iratumumab)、伊诺莫单抗
(inolimomab)、奥英妥珠单抗(inotuzumab ozogamicin)、伊匹木单抗(ipilimumab)、凯利
昔单抗(keliximab)、拉贝珠单抗(labetuzumab)、林妥珠单抗(lintuzumab)、来沙木单抗
(lexatumumab)、鲁卡木单抗(lucatumumab)、鲁昔单抗(lumiliximab)、马帕木单抗
(mapatumumab)、马司莫单抗(maslimomab)、米拉妥珠单抗(milatuzumab)、明瑞莫单抗
(minretumomab)、米妥莫单抗(mitumomab)、莫罗单抗(muromonab)-CD3、他那莫单抗
(naptumomab estafenatox)、那他株单抗(natalizumab)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥度
莫单抗(odulimomab)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥拉单抗(olaratumab)、莫奥珠单抗
(oportuzumab monatox)、奥戈伏单抗(oregovomab)、奥昔珠单抗(otelixizumab)、喷妥莫
单抗(pemtumomab)、普立昔单抗(priliximab)、PRO 140、利妥昔单抗(rituximab)、罗维珠
单抗(rovelizumab)、鲁利单抗(ruplizumab)、沙妥莫单抗喷地肽(satumomab pendetide)、
西利珠单抗(siplizumab)、索土珠单抗(sontuzumab)、他多赛珠单抗(tadocizumab)、帕他
普莫单抗(taplitumomab paptox)、替奈昔单抗(teneliximab)、特普利珠单抗
(teplizumab)、TGN1412、替西木单抗(ticilimumab)(＝曲美木单抗(tremelimumab))、替加
珠单抗(tigatuzumab)、托西珠单抗(tocilizumab)(＝atlizumab)、托利珠单抗
(toralizumab)、托西莫单抗(tositumomab)、曲美木单抗(tremelimumab)、妥考妥珠单抗、
维多株单抗(vedolizumab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、维西珠单抗(visilizumab)、
vitaxin、伏洛昔单抗(volociximab)、伏妥莫单抗(votumumab)、扎木单抗(zanolimumab)、
齐拉木单抗(ziralimumab)、阿佐莫单抗(zolimomab aritox)。阿特珠单抗
(Atezolizumab)、贝伐珠单抗(bevacizumab) 地诺单抗(denosumab)、地努图
希单抗(dinutuximab)、纳武单抗(nivolumab)、奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab)、派姆单抗
(pembrolizumab)、皮地利珠单抗(pidilizumab)(CT-011)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、司
妥昔单抗(siltuximab)、曲妥珠单抗-美坦新偶联物(ado-trastuzumab emtansine)、CEA-
scan Fab片段、OC125单克隆抗体、ab75705、B72.3、MPDL3280A、MSB001078C、MEDI4736、或其抗原结合片段、其类似物或衍生物、或选自以下的抗原结合抗体片段：Fab片段、Fab'片段、F
(ab)’2片段、单链Fv(scFv)或二硫化物稳定的Fv(dsFv)。在一些实施方案中，经修饰的细胞
表面分子包含由上述抗体或其抗原结合片段中任何一种识别的表位。
(adecatumumab)、阿夫土珠(afutuzumab)、阿仑单抗、喷替酸阿妥莫单抗(altumomab
pentetate)、麻安莫单抗(anatumomab mafenatox)、阿泊珠单抗(apolizumab)、阿西莫单
抗、阿塞珠单抗(aselizumab)、阿特珠单抗(atlizumab)(＝托西珠单抗(tocilizumab))、巴
利昔单抗、贝妥莫单抗(bectumomab)、贝那利珠单抗(benralizumab)、贝索单抗
(besilesomab)、莫比伐珠单抗(bivatuzumab mertansine)、博纳吐单抗、本妥昔单抗
(brentuximab vedotin)、莫坎妥珠单抗(cantuzumab mertansine)、卡罗单抗喷地肽
(capromab pendetide)、卡妥索单抗(catumaxomab)、CC49、西利珠单抗(cedelizumab)、西
莫白介素(celmoleukin)、泊西他珠单抗(citatuzumab bogatox)、克立昔单抗
(clenoliximab)、泰坦-克利妥珠单抗(clivatuzumab tetraxetan)、CNTO-95、可那木单抗
(conatumumab)、达西珠单抗(dacetuzumab)、达利珠单抗(daclizumab)、达雷木单抗
(daratumumab)、地莫单抗(detumomab)、依美昔单抗(ecromeximab)、依决洛单抗
(edrecolomab)、依法利珠单抗(efalizumab)、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)、PEG化恩莫单抗
(enlimomab pegol)、西依匹莫单抗(epitumomab cituxetan)、依帕珠单抗(epratuzumab)、
厄利珠单抗(erlizumab)、埃达珠单抗(etaracizumab)、法索单抗(fanolesomab)、法拉莫单
抗(faralimomab)、法勒珠单抗(farletuzumab)、加利昔单抗(galiximab)、加维莫单抗
(gavilimomab)、吉妥单抗(gemtuzumab ozogamicin)、维汀-格仑妥木单抗、戈利昔单抗
(gomiliximab)、伊巴利珠单抗(ibalizumab)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、伊戈
伏单抗(igovomab)、英妥木单抗(intetumumab)、伊妥木单抗(iratumumab)、伊诺莫单抗
(inolimomab)、奥英妥珠单抗(inotuzumab ozogamicin)、伊匹木单抗(ipilimumab)、凯利
昔单抗(keliximab)、拉贝珠单抗(labetuzumab)、林妥珠单抗(lintuzumab)、来沙木单抗
(lexatumumab)、鲁卡木单抗(lucatumumab)、鲁昔单抗(lumiliximab)、马帕木单抗
(mapatumumab)、马司莫单抗(maslimomab)、米拉妥珠单抗(milatuzumab)、明瑞莫单抗
(minretumomab)、米妥莫单抗(mitumomab)、莫罗单抗(muromonab)-CD3、他那莫单抗
(naptumomab estafenatox)、那他株单抗(natalizumab)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥度
莫单抗(odulimomab)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥拉单抗(olaratumab)、莫奥珠单抗
(oportuzumab monatox)、奥戈伏单抗(oregovomab)、奥昔珠单抗(otelixizumab)、喷妥莫
单抗(pemtumomab)、普立昔单抗(priliximab)、PRO 140、利妥昔单抗(rituximab)、罗维珠
单抗(rovelizumab)、鲁利单抗(ruplizumab)、沙妥莫单抗喷地肽(satumomab pendetide)、
西利珠单抗(siplizumab)、索土珠单抗(sontuzumab)、他多赛珠单抗(tadocizumab)、帕他
普莫单抗(taplitumomab paptox)、替奈昔单抗(teneliximab)、特普利珠单抗
(teplizumab)、TGN1412、替西木单抗(ticilimumab)(＝曲美木单抗(tremelimumab))、替加
珠单抗(tigatuzumab)、托西珠单抗(tocilizumab)(＝atlizumab)、托利珠单抗
(toralizumab)、托西莫单抗(tositumomab)、曲美木单抗(tremelimumab)、妥考妥珠单抗、
维多株单抗(vedolizumab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、维西珠单抗(visilizumab)、
vitaxin、伏洛昔单抗(volociximab)、伏妥莫单抗(votumumab)、扎木单抗(zanolimumab)、
齐拉木单抗(ziralimumab)、阿佐莫单抗(zolimomab aritox)。阿特珠单抗
(Atezolizumab)、贝伐珠单抗(bevacizumab) 地诺单抗(denosumab)、地努图
希单抗(dinutuximab)、纳武单抗(nivolumab)、奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab)、派姆单抗
(pembrolizumab)、皮地利珠单抗(pidilizumab)(CT-011)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、司
妥昔单抗(siltuximab)、曲妥珠单抗-美坦新偶联物(ado-trastuzumab emtansine)、CEA-
scan Fab片段、OC125单克隆抗体、ab75705、B72.3、MPDL3280A、MSB001078C、MEDI4736、或其抗原结合片段、其类似物或衍生物、或选自以下的抗原结合抗体片段：Fab片段、Fab'片段、F
(ab)’2片段、单链Fv(scFv)或二硫化物稳定的Fv(dsFv)。在一些实施方案中，经修饰的细胞
表面分子包含由上述抗体或其抗原结合片段中任何一种识别的表位。
[0130] 在一些实施方案中，所述参考细胞表面分子是前列腺特异性膜抗原(PSMA)。PSMA是II型跨膜蛋白，其含有短的细胞质氨基末端、单个跨膜结构域和大的细胞外结构域。PSMA
含有与包括共催化金属肽酶在内的肽酶家族M28蛋白展现相似度的氨基酸序列。野生型全
长人PSMA是750个氨基酸的蛋白质，其包括19个氨基酸残基的细胞内部分、24个氨基酸残基
的跨膜部分和707个氨基酸残基的细胞外部分。在人中，PSMA由FOLH1基因(例如，描述于
GenBank登录号DD461260中(如SEQ ID NO:96中所示))及其同种型和变体编码。示例性的人
PSMA氨基酸序列示于例如UniProt登录号Q04609中(如SEQ ID NO:94所示)。
含有与包括共催化金属肽酶在内的肽酶家族M28蛋白展现相似度的氨基酸序列。野生型全
长人PSMA是750个氨基酸的蛋白质，其包括19个氨基酸残基的细胞内部分、24个氨基酸残基
的跨膜部分和707个氨基酸残基的细胞外部分。在人中，PSMA由FOLH1基因(例如，描述于
GenBank登录号DD461260中(如SEQ ID NO:96中所示))及其同种型和变体编码。示例性的人
PSMA氨基酸序列示于例如UniProt登录号Q04609中(如SEQ ID NO:94所示)。
[0131] 在一些情况下，PSMA的细胞外部分折叠成三个不同的结构和功能结构域：蛋白酶结构域(残基56-116和352-590)、顶端结构域(残基117-351)和C末端螺旋结构域(残基592-
750)，所述位置是参考野生型人PSMA序列(例如在SEQ ID NO:94中所示的氨基酸序列)的位
置(参见，例如Davis等人,(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.102(17):5981-5986；Mesters等人,
(2006)EMBO Journal 25:1375-1384)。
750)，所述位置是参考野生型人PSMA序列(例如在SEQ ID NO:94中所示的氨基酸序列)的位
置(参见，例如Davis等人,(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.102(17):5981-5986；Mesters等人,
(2006)EMBO Journal 25:1375-1384)。
[0132] 在一些情况下，PSMA具有酶促活性或催化活性。在一些方面，PSMA中的特定结构域和/或残基参与酶促或催化活性。PSMA通常含有双核锌位点并且可以充当谷氨酸羧肽酶或
叶酸水解酶，催化从聚-γ-谷氨酸化叶酸中水解切割谷氨酸。PSMA还具有N-乙酰化α连接的
酸性二肽酶(NAALADase)活性和二肽基肽酶IV型活性。酶促位点含有两个锌离子，并且由两
个口袋构成，即谷氨酸敏感口袋(S1'口袋)和非药效团口袋(S1口袋)。来自三个结构域的氨
基酸残基通常参与底物识别、结合和/或催化活性。在一些情况下，参考野生型人PSMA序列
(例如，在SEQ ID NO:94中所示的氨基酸序列)的位置，活性位点残基和/或在PSMA中参与底
物结合和/或催化活性的残基包括在位置210、257、269、272、377、387、387、424、424、425、
433、436、453、517、518、519、552、553、534、535、536、552、553、628、666、689、699和/或700处的氨基酸残基。在一些情况下，活性位点残基包括一个或多个残基来配位活性锌离子，如参
考示例性人PSMA序列(例如在SEQ ID NO:94中所示的氨基酸序列)的位置与His377、
Asp387、Glu425、Asp453和/或His553对应的一个或多个残基。在一些实施方案中，PSMA的N-
乙酰化α连接的酸性二肽酶(NAALADase)结构域也可以被定义为包括氨基酸残基274-587，
所述位置是参考示例性人PSMA序列(例如在SEQ ID NO:94中所示的氨基酸序列)的位置
(Speno等人,(1999)Molecular Pharmacology 55:179-185)。
叶酸水解酶，催化从聚-γ-谷氨酸化叶酸中水解切割谷氨酸。PSMA还具有N-乙酰化α连接的
酸性二肽酶(NAALADase)活性和二肽基肽酶IV型活性。酶促位点含有两个锌离子，并且由两
个口袋构成，即谷氨酸敏感口袋(S1'口袋)和非药效团口袋(S1口袋)。来自三个结构域的氨
基酸残基通常参与底物识别、结合和/或催化活性。在一些情况下，参考野生型人PSMA序列
(例如，在SEQ ID NO:94中所示的氨基酸序列)的位置，活性位点残基和/或在PSMA中参与底
物结合和/或催化活性的残基包括在位置210、257、269、272、377、387、387、424、424、425、
433、436、453、517、518、519、552、553、534、535、536、552、553、628、666、689、699和/或700处的氨基酸残基。在一些情况下，活性位点残基包括一个或多个残基来配位活性锌离子，如参
考示例性人PSMA序列(例如在SEQ ID NO:94中所示的氨基酸序列)的位置与His377、
Asp387、Glu425、Asp453和/或His553对应的一个或多个残基。在一些实施方案中，PSMA的N-
乙酰化α连接的酸性二肽酶(NAALADase)结构域也可以被定义为包括氨基酸残基274-587，
所述位置是参考示例性人PSMA序列(例如在SEQ ID NO:94中所示的氨基酸序列)的位置
(Speno等人,(1999)Molecular Pharmacology 55:179-185)。
[0133] 在一些方面，PSMA的细胞内(N末端)部分含有参与细胞内化(例如分子的网格蛋白依赖性内吞内化)的氨基酸残基。在一些方面，细胞内化由以下N末端氨基酸介导：例如在
SEQ ID NO:94中所示的示例性人PSMA氨基酸序列的位置1-5处的氨基酸残基(例如，MWNLL；
参见，例如Rajasekaran等人(2003)Mol.Biol.Cell.14:4835-4845)。在一些方面，PSMA的细
胞内部分含有基序或残基，所述基序或残基能够在发出分子或细胞信号(如用于分子内化)
时在细胞中被磷酸化和/或与信号转导途径或下游过程中的一种或多种衔接子蛋白相互作
用。在一些实施方案中，示例性基序包括基于二亮氨酸的基序(例如，LL)。
SEQ ID NO:94中所示的示例性人PSMA氨基酸序列的位置1-5处的氨基酸残基(例如，MWNLL；
参见，例如Rajasekaran等人(2003)Mol.Biol.Cell.14:4835-4845)。在一些方面，PSMA的细
胞内部分含有基序或残基，所述基序或残基能够在发出分子或细胞信号(如用于分子内化)
时在细胞中被磷酸化和/或与信号转导途径或下游过程中的一种或多种衔接子蛋白相互作
用。在一些实施方案中，示例性基序包括基于二亮氨酸的基序(例如，LL)。
[0134] 在一些实施方案中，所述参考细胞表面分子是PSMA，如哺乳动物PSMA，例如人PSMA。在一些实施方案中，所述参考表面分子是野生型PSMA，任选地野生型人PSMA，或其等
位基因变体或其他变体，例如，其替代性同种型或片段。在一些实施方案中，所述PSMA是全
长PSMA。在一些实施方案中，所述参考细胞表面分子含有在SEQ ID NO:94中所示的氨基酸
序列或展现与SEQ ID NO:94至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述PSMA包含在SEQ ID NO:94中所示的序列或基本上由其组成。
位基因变体或其他变体，例如，其替代性同种型或片段。在一些实施方案中，所述PSMA是全
长PSMA。在一些实施方案中，所述参考细胞表面分子含有在SEQ ID NO:94中所示的氨基酸
序列或展现与SEQ ID NO:94至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述PSMA包含在SEQ ID NO:94中所示的序列或基本上由其组成。
[0135] 在一些实施方案中，所述PSMA由SEQ ID NO:96中所示的核酸序列或展现与SEQ ID NO:96至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，所述PSMA由
经修饰的核酸序列(例如，被修饰为不含CpG和/或被密码子优化的核酸序列)编码。在一些
实施方案中，经修饰的核酸序列被密码子优化以在人细胞中表达。在一些方面，密码子优化
涉及平衡所选择的密码子的百分比与公开的人转移RNA的丰度，使得没有任何一者超负荷
或受限。在一些实施方案中，编码PSMA的不含CpG的核酸序列是或包括不含有CpG序列的经
修饰的cDNA序列。在一些方面，与野生型或未经修饰的PSMA相比，不含CpG的核酸和/或密码
子优化的序列不会改变蛋白质序列。在一些实施方案中，参考PSMA由SEQ ID NO:97中所示
的核酸序列编码。在一些方面，由不含CpG的PSMA编码的PSMA与在SEQ ID NO:94中所示的蛋
白质序列具有显著的百分比同一性。
96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，所述PSMA由
经修饰的核酸序列(例如，被修饰为不含CpG和/或被密码子优化的核酸序列)编码。在一些
实施方案中，经修饰的核酸序列被密码子优化以在人细胞中表达。在一些方面，密码子优化
涉及平衡所选择的密码子的百分比与公开的人转移RNA的丰度，使得没有任何一者超负荷
或受限。在一些实施方案中，编码PSMA的不含CpG的核酸序列是或包括不含有CpG序列的经
修饰的cDNA序列。在一些方面，与野生型或未经修饰的PSMA相比，不含CpG的核酸和/或密码
子优化的序列不会改变蛋白质序列。在一些实施方案中，参考PSMA由SEQ ID NO:97中所示
的核酸序列编码。在一些方面，由不含CpG的PSMA编码的PSMA与在SEQ ID NO:94中所示的蛋
白质序列具有显著的百分比同一性。
[0136] 在一些实施方案中，所述参考细胞表面分子是PSMA，其包含由抗体或其抗原结合片段识别的表位，所述抗体或其抗原结合片段包括但不限于J591、DFO-J591、CYT-356、
J415、3/A12、3/F11、3/E7、D2B、107-1A4、YPSMA-1、YPSMA-2、3E6、2G7、24.4E6、GCP-02、GCP-
04、GCP-05、J533、E99、1G9、3C6、4.40、026、D7-Fc、D7-CH3、4D4、A5、或其抗原结合片段、其类似物或衍生物、或选自以下的抗原结合抗体片段：Fab片段、Fab'片段、F(ab)’2片段、单链Fv(scFv)或二硫化物稳定的Fv(dsFv)。在一些实施方案中，示例性抗体或其抗原结合片段包
括在以下文献中描述的那些、或其片段、其缀合物或其衍生物：US 2002/0049712；US 2002/
0147312；US 2003/0082187；US 2004/0136998；US 2005/0202020；US 2006/0088539；US
2007/0071759；US 2010/0297653；US 2011/0020273；US 2013/0225541；US 2013/0315830；
US 2014/0099257；US 2014/0227180；US 2015/0168413；US 2016/0303253；US 2017/
0051074；US 6572856；US 7476513；US 8470330；US 8986655；WO 2006/078892；WO 2010/
135431；WO 2014/198223；WO 2015/177360；WO 2016/057917；WO 2016/130819；WO 2016/
145139；WO 2016/201300；WO 2017/004144；WO 2017/023761；AU 2002/356844；AU 2006/
204913；AU 2006/235421；AU 2006/262231；AU 2006/315500；AU 2010/325969；AU 2013/
328619；AU 2015/205574；CA 2353267；EP 1390069；EP 1520588；EP 1581794；EP 1599228；
EP 1610818；EP 2906250；Banerjee等人(2011)Angew Chem Int Ed Engl.50(39):9167-
9170；Maurer等人(2016)Nature Reviews Urology 13:226-235；Rowe等人(2016)Prostate
Cancer Prostatic Dis.19(3):223-230；Mease等人,(2013)Curr Top Med Chem.13(8):
951-962；Osborne等人,(2013)Urol Oncol.31(2):144-154；Philipp Wolf(2011),
Prostate Specific Membrane Antigen as Biomarker and Therapeutic Target for
Prostate Cancer,Prostate Cancer-Diagnostic and Therapeutic Advances,
Dr.Philippe E.Spiess(编辑),Intech,第81-100页；Ruggiero等人,(2011)J Nucl Med.52
(10):1608-1615；Liu等人,(1997)Cancer Research57:3629-3634；Regino等人,(2009)
Curr Radiopharm.January；2(1):9-17；Kampmeier等人(2014)EJNMMI Research 4:13；
Wolf等人,(2010)The Prostate 70:562-569；Tykvart等人(2014)The Prostate 74:1674-
1690；Jin等人,(2016)EMJ Urol.4(1):62-69以及Tino等人(2000)Hybridoma 19(3):
24957。
J415、3/A12、3/F11、3/E7、D2B、107-1A4、YPSMA-1、YPSMA-2、3E6、2G7、24.4E6、GCP-02、GCP-
04、GCP-05、J533、E99、1G9、3C6、4.40、026、D7-Fc、D7-CH3、4D4、A5、或其抗原结合片段、其类似物或衍生物、或选自以下的抗原结合抗体片段：Fab片段、Fab'片段、F(ab)’2片段、单链Fv(scFv)或二硫化物稳定的Fv(dsFv)。在一些实施方案中，示例性抗体或其抗原结合片段包
括在以下文献中描述的那些、或其片段、其缀合物或其衍生物：US 2002/0049712；US 2002/
0147312；US 2003/0082187；US 2004/0136998；US 2005/0202020；US 2006/0088539；US
2007/0071759；US 2010/0297653；US 2011/0020273；US 2013/0225541；US 2013/0315830；
US 2014/0099257；US 2014/0227180；US 2015/0168413；US 2016/0303253；US 2017/
0051074；US 6572856；US 7476513；US 8470330；US 8986655；WO 2006/078892；WO 2010/
135431；WO 2014/198223；WO 2015/177360；WO 2016/057917；WO 2016/130819；WO 2016/
145139；WO 2016/201300；WO 2017/004144；WO 2017/023761；AU 2002/356844；AU 2006/
204913；AU 2006/235421；AU 2006/262231；AU 2006/315500；AU 2010/325969；AU 2013/
328619；AU 2015/205574；CA 2353267；EP 1390069；EP 1520588；EP 1581794；EP 1599228；
EP 1610818；EP 2906250；Banerjee等人(2011)Angew Chem Int Ed Engl.50(39):9167-
9170；Maurer等人(2016)Nature Reviews Urology 13:226-235；Rowe等人(2016)Prostate
Cancer Prostatic Dis.19(3):223-230；Mease等人,(2013)Curr Top Med Chem.13(8):
951-962；Osborne等人,(2013)Urol Oncol.31(2):144-154；Philipp Wolf(2011),
Prostate Specific Membrane Antigen as Biomarker and Therapeutic Target for
Prostate Cancer,Prostate Cancer-Diagnostic and Therapeutic Advances,
Dr.Philippe E.Spiess(编辑),Intech,第81-100页；Ruggiero等人,(2011)J Nucl Med.52
(10):1608-1615；Liu等人,(1997)Cancer Research57:3629-3634；Regino等人,(2009)
Curr Radiopharm.January；2(1):9-17；Kampmeier等人(2014)EJNMMI Research 4:13；
Wolf等人,(2010)The Prostate 70:562-569；Tykvart等人(2014)The Prostate 74:1674-
1690；Jin等人,(2016)EMJ Urol.4(1):62-69以及Tino等人(2000)Hybridoma 19(3):
24957。
[0137] 1.示例性经修饰的细胞表面分子
[0138] 在一些实施方案中，与参考细胞表面分子相比，经修饰的细胞表面分子含有一个或多个氨基酸修饰，如一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。在一些实施方案中，经修饰
的细胞表面分子(如经修饰的细胞表面受体)被修饰以去除任何信号传导和/或运输结构
域。在一些情况下，经修饰的细胞表面分子缺乏功能性细胞内信号传导结构域和/或不能介
导细胞内信号传导。在一些实施方案中，与野生型或未经修饰的细胞表面分子相比，经修饰
的细胞表面分子(例如经修饰的细胞表面受体)展现改变的细胞内化、细胞运输、酶促活性
和/或配体结合。在一些实施方案中，经修饰的细胞表面分子含有和/或保留由结合分子识
别和/或结合的表位，所述结合分子是例如对细胞表面分子具特异性的抗体或其抗原结合
片段和/或能够结合细胞表面分子的配体。
的细胞表面分子(如经修饰的细胞表面受体)被修饰以去除任何信号传导和/或运输结构
域。在一些情况下，经修饰的细胞表面分子缺乏功能性细胞内信号传导结构域和/或不能介
导细胞内信号传导。在一些实施方案中，与野生型或未经修饰的细胞表面分子相比，经修饰
的细胞表面分子(例如经修饰的细胞表面受体)展现改变的细胞内化、细胞运输、酶促活性
和/或配体结合。在一些实施方案中，经修饰的细胞表面分子含有和/或保留由结合分子识
别和/或结合的表位，所述结合分子是例如对细胞表面分子具特异性的抗体或其抗原结合
片段和/或能够结合细胞表面分子的配体。
[0139] 在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰(如一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入，包括截短)可以存在于细胞表面分子的一个或多个细胞内(例如，细胞质)和/或
细胞外部分。在一些实施方案中，经修饰的细胞表面分子被截短，例如通过连续缺失参考细
胞表面分子的C末端或N末端氨基酸残基的连续序列，例如缺失参考细胞表面分子的从或从
约50个至800个氨基酸，如50个至600个，例如至少或约至少50个、60个、70个、80个、90个、
100个、200个、300个、400个、500个、600个或更多个连续氨基酸。在一些方面，经修饰的细胞表面分子被截短，例如通过缺失蛋白质的细胞内(例如，细胞质)部分的连续氨基酸残基，例
如，存在于I型膜蛋白的C末端部分或在II型膜蛋白的N末端部分。在一些方面，经修饰的细
胞表面分子被截短，例如通过缺失蛋白质的细胞外结构域或部分的连续氨基酸残基，例如，
存在于I型膜蛋白的N末端部分或II型膜蛋白的C末端部分。
细胞外部分。在一些实施方案中，经修饰的细胞表面分子被截短，例如通过连续缺失参考细
胞表面分子的C末端或N末端氨基酸残基的连续序列，例如缺失参考细胞表面分子的从或从
约50个至800个氨基酸，如50个至600个，例如至少或约至少50个、60个、70个、80个、90个、
100个、200个、300个、400个、500个、600个或更多个连续氨基酸。在一些方面，经修饰的细胞表面分子被截短，例如通过缺失蛋白质的细胞内(例如，细胞质)部分的连续氨基酸残基，例
如，存在于I型膜蛋白的C末端部分或在II型膜蛋白的N末端部分。在一些方面，经修饰的细
胞表面分子被截短，例如通过缺失蛋白质的细胞外结构域或部分的连续氨基酸残基，例如，
存在于I型膜蛋白的N末端部分或II型膜蛋白的C末端部分。
[0140] 在一些实施方案中，细胞表面分子包含一个或多个细胞外结构域或区域，并且所述修饰在细胞表面分子的细胞外部分中。在一些方面，细胞表面分子的细胞外部分的示例
性修饰可以去除参与表位结合、酶促活性和/或配体结合和/或信号传导或功能的结构域或
区域。在一些方面，细胞表面分子的细胞外部分的示例性修饰包含和/或保留由结合分子识
别和/或结合的一个或多个表位，所述结合分子是例如对细胞表面分子具特异性的抗体或
其抗原结合片段和/或能够结合细胞表面分子的配体。在一些方面，细胞表面分子的细胞外
部分的示例性修饰生成经修饰的细胞表面分子，所述经修饰的细胞表面分子展现与参考细
胞表面分子相比改变的酶促活性和/或配体结合。
性修饰可以去除参与表位结合、酶促活性和/或配体结合和/或信号传导或功能的结构域或
区域。在一些方面，细胞表面分子的细胞外部分的示例性修饰包含和/或保留由结合分子识
别和/或结合的一个或多个表位，所述结合分子是例如对细胞表面分子具特异性的抗体或
其抗原结合片段和/或能够结合细胞表面分子的配体。在一些方面，细胞表面分子的细胞外
部分的示例性修饰生成经修饰的细胞表面分子，所述经修饰的细胞表面分子展现与参考细
胞表面分子相比改变的酶促活性和/或配体结合。
[0141] 在一些实施方案中，细胞表面分子包含一个或多个细胞内和/或细胞质结构域或区域，并且所述修饰在细胞表面分子的细胞内(例如，细胞质)部分中。在一些方面，细胞表
面分子的细胞内(例如，细胞质)部分的修饰(例如，取代、缺失、截短和/或插入)可以去除参
与引发、介导、激活、抑制和/或传递细胞信号传导和/或下游活性或功能(例如基因和蛋白
质表达、分子亚细胞定位的变化、细胞内运输、蛋白质-蛋白质相互作用的变化、受体内化、
细胞分化、增殖和/或存活)的结构域或区域。在一些方面，细胞表面分子的细胞内(例如，细
胞质)部分的修饰生成经修饰的细胞表面分子，所述经修饰的细胞表面分子缺乏功能性细
胞内信号传导结构域和/或不能介导细胞内信号传导和/或展现改变的功能或活性(例如，
改变的细胞内化和/或细胞运输)。在一些实施方案中，经修饰的细胞表面分子引发、介导、
激活、抑制和/或传递与参考细胞表面分子的细胞表面分子相关的细胞信号传导和/或调节
(regulating或modulating)活性和/或功能的能力被降低了大于或大于约20％、30％、
40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多。在一些实施方案中，经修饰的细胞表面分子(如经修饰的细胞表面受体)是惰性的，不能引发或介导细胞内信号。
面分子的细胞内(例如，细胞质)部分的修饰(例如，取代、缺失、截短和/或插入)可以去除参
与引发、介导、激活、抑制和/或传递细胞信号传导和/或下游活性或功能(例如基因和蛋白
质表达、分子亚细胞定位的变化、细胞内运输、蛋白质-蛋白质相互作用的变化、受体内化、
细胞分化、增殖和/或存活)的结构域或区域。在一些方面，细胞表面分子的细胞内(例如，细
胞质)部分的修饰生成经修饰的细胞表面分子，所述经修饰的细胞表面分子缺乏功能性细
胞内信号传导结构域和/或不能介导细胞内信号传导和/或展现改变的功能或活性(例如，
改变的细胞内化和/或细胞运输)。在一些实施方案中，经修饰的细胞表面分子引发、介导、
激活、抑制和/或传递与参考细胞表面分子的细胞表面分子相关的细胞信号传导和/或调节
(regulating或modulating)活性和/或功能的能力被降低了大于或大于约20％、30％、
40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多。在一些实施方案中，经修饰的细胞表面分子(如经修饰的细胞表面受体)是惰性的，不能引发或介导细胞内信号。
[0142] 在一些实施方案中，经修饰的细胞表面分子保留参考细胞表面分子的跨膜结构域和参考细胞表面分子的至少一个细胞外结构域。在一些实施方案中，经修饰的细胞表面分
子含有在SEQ ID NO:49-54或94中任一个中所示的氨基酸序列，但缺乏(例如被截短或缺
失)与SEQ ID NO:49-54或94中任一个的细胞质结构域对应的氨基酸残基。
子含有在SEQ ID NO:49-54或94中任一个中所示的氨基酸序列，但缺乏(例如被截短或缺
失)与SEQ ID NO:49-54或94中任一个的细胞质结构域对应的氨基酸残基。
[0143] 在一些实施方案中，改变了所提供的缀合物的经修饰的细胞表面分子结合参考细胞表面分子的天然配体的能力。例如，在一些实施方案中，经修饰的细胞表面分子结合参考
细胞表面分子的天然配体的能力被降低和减弱了。在一些实施方案中，细胞表面分子被修
饰以含有参考细胞表面分子的至少一个细胞外结构域，但缺乏由参考细胞表面分子的天然
配体识别的一个或多个其他细胞外结构域。在一些实施方案中，经修饰的细胞表面分子与
参考细胞表面分子的配体的结合被减少了大于或大于约20％、30％、40％、50％、60％、
70％、80％、90％、95％或更多。
细胞表面分子的天然配体的能力被降低和减弱了。在一些实施方案中，细胞表面分子被修
饰以含有参考细胞表面分子的至少一个细胞外结构域，但缺乏由参考细胞表面分子的天然
配体识别的一个或多个其他细胞外结构域。在一些实施方案中，经修饰的细胞表面分子与
参考细胞表面分子的配体的结合被减少了大于或大于约20％、30％、40％、50％、60％、
70％、80％、90％、95％或更多。
[0144] 在一些实施方案中，与参考细胞表面分子相比，经修饰的细胞表面分子(如经修饰的细胞表面受体)被修饰或截短，以保留含有由已知抗体或其功能片段识别的细胞外表位
的结合结构域。因此，在一些实施方案中，这种细胞表面分子的修饰通过保持在细胞外结构
域中存在的由已知抗体或其功能片段识别的表位并且去除不由已知抗体识别的任何信号
传导或运输结构域和/或任何细胞外结构域来实现。经修饰的细胞表面分子可以包括如所
描述的任何经修饰的细胞表面分子，其保留与上面描述的示例性抗体和抗原结合片段中的
一种或多种的结合，例如展现与参考细胞表面分子相同或相似的结合。
的结合结构域。因此，在一些实施方案中，这种细胞表面分子的修饰通过保持在细胞外结构
域中存在的由已知抗体或其功能片段识别的表位并且去除不由已知抗体识别的任何信号
传导或运输结构域和/或任何细胞外结构域来实现。经修饰的细胞表面分子可以包括如所
描述的任何经修饰的细胞表面分子，其保留与上面描述的示例性抗体和抗原结合片段中的
一种或多种的结合，例如展现与参考细胞表面分子相同或相似的结合。
[0145] 在一些实施方案中，经修饰的细胞表面分子是经修饰的或截短的酪氨酸激酶受体。可以根据本文描述的实施方案进行修饰的酪氨酸激酶受体的例子包括但不限于内皮生
长因子受体家族的成员(EGRF/ErbB1/HER1；ErbB2/HER2/neu；ErbB3/HER3；ErbB4/HER4)、肝
细胞生长因子受体(HGFR/c-MET)和胰岛素样生长因子受体-1(IGF-1R)。根据一些实施方
案，所提供的细胞表面缀合物含有经修饰的酪氨酸激酶受体，所述经修饰的酪氨酸激酶受
体保留了由已知抗体或其功能片段识别的细胞外表位，并且缺乏含有至少一个酪氨酸激酶
结构域的细胞质结构域或其功能蛋白。缺乏至少一个酪氨酸激酶结构域的经修饰的酪氨酸
激酶受体使得所述受体呈惰性。可以用于识别经修饰的酪氨酸激酶受体的商业抗体包括但
不限于AMG-102、AMG-479、BIIB022OA-5D5、CP-751,871、IMC-A12、R1507、西妥昔单抗、西妥木单抗(cixutumumab)、厄妥索单抗(ertumaxomab)、芬妥木单抗(figitumumab)、马妥珠单
抗(matuzumab)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、帕尼单抗(panitumumab)、帕妥珠单抗
(pertuzumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、罗妥木单抗(robatumumab)、曲妥珠单抗
(trastuzumab)、扎鲁木单抗(zalutumumab)。
长因子受体家族的成员(EGRF/ErbB1/HER1；ErbB2/HER2/neu；ErbB3/HER3；ErbB4/HER4)、肝
细胞生长因子受体(HGFR/c-MET)和胰岛素样生长因子受体-1(IGF-1R)。根据一些实施方
案，所提供的细胞表面缀合物含有经修饰的酪氨酸激酶受体，所述经修饰的酪氨酸激酶受
体保留了由已知抗体或其功能片段识别的细胞外表位，并且缺乏含有至少一个酪氨酸激酶
结构域的细胞质结构域或其功能蛋白。缺乏至少一个酪氨酸激酶结构域的经修饰的酪氨酸
激酶受体使得所述受体呈惰性。可以用于识别经修饰的酪氨酸激酶受体的商业抗体包括但
不限于AMG-102、AMG-479、BIIB022OA-5D5、CP-751,871、IMC-A12、R1507、西妥昔单抗、西妥木单抗(cixutumumab)、厄妥索单抗(ertumaxomab)、芬妥木单抗(figitumumab)、马妥珠单
抗(matuzumab)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、帕尼单抗(panitumumab)、帕妥珠单抗
(pertuzumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、罗妥木单抗(robatumumab)、曲妥珠单抗
(trastuzumab)、扎鲁木单抗(zalutumumab)。
[0146] 在一些实施方案中，经修饰的细胞表面分子是经修饰的前列腺特异性膜抗原(PSMA)。可以用于识别经修饰的酪氨酸激酶受体的抗体包括但不限于J591、DFO-J591、CYT-
356、J415、3/A12、3/F11、3/E7、D2B、107-1A4、YPSMA-1、YPSMA-2、3E6、2G7、24.4E6、GCP-02、GCP-04、GCP-05、J533、E99、1G9、3C6、4.40、026、D7-Fc、D7-CH3、4D4和A5。
356、J415、3/A12、3/F11、3/E7、D2B、107-1A4、YPSMA-1、YPSMA-2、3E6、2G7、24.4E6、GCP-02、GCP-04、GCP-05、J533、E99、1G9、3C6、4.40、026、D7-Fc、D7-CH3、4D4和A5。
[0147] 细胞表面缀合物的示例性细胞表面分子的非限制性例子示于表1中。
[0148] 在一些实施方案中，经修饰的细胞表面分子与具有SEQ ID NO:49-54或94中任一个中所示的氨基酸序列的参考细胞表面分子相比被修饰，其中经修饰的细胞表面分子至少
含有参考细胞表面分子的细胞外结构域和跨膜结构域的一部分但缺乏(例如被截短或缺
失)与这种参考细胞表面分子的细胞质结构域对应的氨基酸残基。在一些实施方案中，例如
经修饰的细胞表面分子还缺乏用于结合细胞表面分子的天然配体(如在表1中所示的天然
配体)的一个或多个细胞外配体结合结构域。在一些实施方案中，这样的经修饰的细胞表面
分子展现减少的(例如减少了大于20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多)对参考细胞表面分子的天然配体的结合。在一些实施方案中，经修饰的细胞表面分子保留了
至少一个细胞外结构域，所述至少一个细胞外结构域含有对参考细胞表面分子特异的已知
抗体的表位，如在表1中列出的或本文(例如在章节II.A中)描述的抗体的表位。
含有参考细胞表面分子的细胞外结构域和跨膜结构域的一部分但缺乏(例如被截短或缺
失)与这种参考细胞表面分子的细胞质结构域对应的氨基酸残基。在一些实施方案中，例如
经修饰的细胞表面分子还缺乏用于结合细胞表面分子的天然配体(如在表1中所示的天然
配体)的一个或多个细胞外配体结合结构域。在一些实施方案中，这样的经修饰的细胞表面
分子展现减少的(例如减少了大于20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多)对参考细胞表面分子的天然配体的结合。在一些实施方案中，经修饰的细胞表面分子保留了
至少一个细胞外结构域，所述至少一个细胞外结构域含有对参考细胞表面分子特异的已知
抗体的表位，如在表1中列出的或本文(例如在章节II.A中)描述的抗体的表位。
[0149]
[0150]
[0151]
[0152] a.经修饰的EGFR，例如截短的EGFR
[0153] 在一些实施方案中，细胞表面分子是经修饰的EGFR，所述经修饰的EGFR与参考EGFR(如参考人EGFR，例如在SEQ ID NO:64中所示的参考EGFR或在SEQ ID NO:49中所示的
其成熟序列)相比被修饰或改变。参考天然EGFR的结构含有四个细胞外结构域(结构域I-
IV，分别对应于SEQ ID NO:64的残基35-206、207-333、334-499和500-645)、跨膜结构域(对
应于SEQ ID NO:64的残基646-668)和细胞质结构域(对应于SEQ ID NO:64的残基669-
1210)(其中在其中包含EGFR近膜结构域(对应于SEQ ID NO:64的残基669-712)和EGFR酪氨
酸激酶结构域(对应于SEQ ID NO:64的残基713-982))。
其成熟序列)相比被修饰或改变。参考天然EGFR的结构含有四个细胞外结构域(结构域I-
IV，分别对应于SEQ ID NO:64的残基35-206、207-333、334-499和500-645)、跨膜结构域(对
应于SEQ ID NO:64的残基646-668)和细胞质结构域(对应于SEQ ID NO:64的残基669-
1210)(其中在其中包含EGFR近膜结构域(对应于SEQ ID NO:64的残基669-712)和EGFR酪氨
酸激酶结构域(对应于SEQ ID NO:64的残基713-982))。
[0154] 在一个实施方案中，经修饰的细胞表面分子是截短的EGFR(tEGFR)，其缺乏膜远端EGF结合结构域和含有酪氨酸激酶结构域的细胞质信号传导尾部，但保留了跨膜结构域和
由已知抗体或其功能片段(例如，西妥昔单抗、马妥珠单抗、耐昔妥珠单抗、尼妥珠单抗、扎
鲁木单抗或帕尼单抗)识别的细胞外膜近端表位。在一些实施方案中，当被T细胞表达时，
EGF结合结构域和细胞内信号传导结构域的缺乏使得EGFR失活(惰性)。
由已知抗体或其功能片段(例如，西妥昔单抗、马妥珠单抗、耐昔妥珠单抗、尼妥珠单抗、扎
鲁木单抗或帕尼单抗)识别的细胞外膜近端表位。在一些实施方案中，当被T细胞表达时，
EGF结合结构域和细胞内信号传导结构域的缺乏使得EGFR失活(惰性)。
[0155] 在一些实施方案中，经修饰的EGFR缺乏参考EGFR的结构域I、结构域II、近膜结构域和酪氨酸激酶结构域中的一个或多个。在一些情况下，经修饰的EGFR缺乏参考EGFR的结
构域I、结构域II、近膜结构域和酪氨酸激酶结构域中的全部。在一些情况下，经修饰的EGFR
缺乏结构域I、结构域II和细胞质结构域中的全部。在此类实施方案中，经修饰的EGFR含有
或基本上含有参考EGFR的结构域III和IV。在一些实施方案中，例如经修饰的EGFR保留了由
已知抗体或其功能片段识别的表位。
构域I、结构域II、近膜结构域和酪氨酸激酶结构域中的全部。在一些情况下，经修饰的EGFR
缺乏结构域I、结构域II和细胞质结构域中的全部。在此类实施方案中，经修饰的EGFR含有
或基本上含有参考EGFR的结构域III和IV。在一些实施方案中，例如经修饰的EGFR保留了由
已知抗体或其功能片段识别的表位。
[0156] 在一些实施方案中，经修饰的EGFR包含在SEQ ID NO:44中所示的氨基酸序列或在SEQ ID NO:46中所示的其成熟形式、或展现与SEQ ID NO:44或46至少或至少约85％、86％、
87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列中包含的氨基酸，其中所述经修饰的EGFR缺乏EGF结合结构域，保留了由
已知抗体识别的表位并且缺乏这种参考EGFR的细胞质信号传导结构域的全部或功能部分。
可以识别经修饰的EGFR上的表位的结合分子的示例包括FDA批准的抗EGFR单克隆抗体
(mAb)西妥昔单抗或另一种抗EGFR抗体。
87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列中包含的氨基酸，其中所述经修饰的EGFR缺乏EGF结合结构域，保留了由
已知抗体识别的表位并且缺乏这种参考EGFR的细胞质信号传导结构域的全部或功能部分。
可以识别经修饰的EGFR上的表位的结合分子的示例包括FDA批准的抗EGFR单克隆抗体
(mAb)西妥昔单抗或另一种抗EGFR抗体。
[0157] 在一些实施方案中，经修饰的EGFR(如tEGFR)由在SEQ ID NO:57中所示的核苷酸序列、或与SEQ ID NO:57至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列(如其含有简并密码子的序列)
编码。编码的经修饰的EGFR可以含有用于表达为表面分子或表面蛋白的信号肽。在一些实
施方案中，经修饰的EGFR(如tEGFR)由如下核苷酸编码，所述核苷酸含有编码在SEQ ID NO:
64中包含的参考EGFR天然信号肽的序列。在一些实施方案中，经修饰的EGFR(如tEGFR)由如
下核苷酸编码，所述核苷酸含有编码例如在SEQ ID NO:48中所示的非天然或异源信号肽的
序列。在一些实施方案中，经修饰的EGFR由在SEQ ID NO:45中所示的核苷酸序列或与SEQ
ID NO:45至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％或99％序列同一性的序列(如其含有简并密码子的序列)编码。
93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列(如其含有简并密码子的序列)
编码。编码的经修饰的EGFR可以含有用于表达为表面分子或表面蛋白的信号肽。在一些实
施方案中，经修饰的EGFR(如tEGFR)由如下核苷酸编码，所述核苷酸含有编码在SEQ ID NO:
64中包含的参考EGFR天然信号肽的序列。在一些实施方案中，经修饰的EGFR(如tEGFR)由如
下核苷酸编码，所述核苷酸含有编码例如在SEQ ID NO:48中所示的非天然或异源信号肽的
序列。在一些实施方案中，经修饰的EGFR由在SEQ ID NO:45中所示的核苷酸序列或与SEQ
ID NO:45至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％或99％序列同一性的序列(如其含有简并密码子的序列)编码。
[0158] b.经修饰的Her2，例如截短的Her2
[0159] 在一些实施方案中，细胞表面分子是经修饰的HER2/neu/ErbB2，所述经修饰的HER2/neu/ErbB2与参考HER2/neu/ErbB2(如参考人HER2/neu/ErbB2，例如在SEQ ID NO:65
中所示的参考HER2/neu/ErbB2或在SEQ ID NO:50中所示的其成熟序列)相比被修饰或改
变。参考天然HER2/neu/ErbB2的结构含有细胞外结构域(对应于SEQ ID NO:65的残基23-
652)、跨膜结构域(对应于SEQ ID NO:65的残基653-675)、和细胞质结构域(对应于SEQ ID
NO:65的残基676-1255)。参考天然HER2/neu/ErbB2细胞外结构域的结构含有分别与SEQ ID
NO:50的残基1-195、196-319、320-488和489-630对应的结构域I-IV(美国专利申请公开号
US 2014/0186867和美国专利号US 7,449,184)。
中所示的参考HER2/neu/ErbB2或在SEQ ID NO:50中所示的其成熟序列)相比被修饰或改
变。参考天然HER2/neu/ErbB2的结构含有细胞外结构域(对应于SEQ ID NO:65的残基23-
652)、跨膜结构域(对应于SEQ ID NO:65的残基653-675)、和细胞质结构域(对应于SEQ ID
NO:65的残基676-1255)。参考天然HER2/neu/ErbB2细胞外结构域的结构含有分别与SEQ ID
NO:50的残基1-195、196-319、320-488和489-630对应的结构域I-IV(美国专利申请公开号
US 2014/0186867和美国专利号US 7,449,184)。
[0160] 在一个实施方案中，经修饰的细胞表面分子是截短的HER2/neu/ErbB2(HER2t)，其缺乏细胞质结构域，但保留了跨膜结构域和由已知抗体或其功能片段(例如曲妥珠单抗、
2C4、厄妥索单抗、帕妥珠单抗)识别的细胞外膜近端表位。在一些实施方案中，当被T细胞表
达时，配体结合结构域和细胞内信号传导结构域的缺乏使得HER2/neu/ErbB2失活(惰性)。
2C4、厄妥索单抗、帕妥珠单抗)识别的细胞外膜近端表位。在一些实施方案中，当被T细胞表
达时，配体结合结构域和细胞内信号传导结构域的缺乏使得HER2/neu/ErbB2失活(惰性)。
[0161] 在一些实施方案中，经修饰的HER2/neu/ErbB2缺乏参考HER2/neu/ErbB2的结构域I、结构域II和结构域III中的一个或多个。在一些情况下，经修饰的HER2/neu/ErbB2缺乏参
考HER2/neu/ErbB2的全部细胞外结构域。在一些情况下，经修饰的HER2/neu/ErbB2缺乏全
部细胞外和细胞质结构域。在此类实施方案中，经修饰的HER2/neu/ErbB2含有或基本上含
有参考HER2/neu/ErbB2的保留的结构域IV、和跨膜结构域。在一些实施方案中，例如经修饰
的HER2/neu/ErbB2保留了由已知抗体或其功能片段识别的表位。
考HER2/neu/ErbB2的全部细胞外结构域。在一些情况下，经修饰的HER2/neu/ErbB2缺乏全
部细胞外和细胞质结构域。在此类实施方案中，经修饰的HER2/neu/ErbB2含有或基本上含
有参考HER2/neu/ErbB2的保留的结构域IV、和跨膜结构域。在一些实施方案中，例如经修饰
的HER2/neu/ErbB2保留了由已知抗体或其功能片段识别的表位。
[0162] 在一些实施方案中，经修饰的HER2/neu/ErbB2包含在SEQ ID NO:92中所示的氨基酸序列、或展现与SEQ ID NO:92至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列中包含的氨基酸，其中所述经修饰的HER2/neu/ErbB2缺乏配体结合结构域，保留了由已知抗体识别的
表位并且缺乏这种参考HER2/neu/ErbB2的细胞质信号传导结构域的全部或功能部分。在一
些实施方案中，配体结合结构域可以与EGF、转化生长因子α(TGFα)、双调蛋白、结合肝素的
EGF样生长因子、β细胞素和上皮调节蛋白结合。可以识别经修饰的HER2/neu/ErbB2上的表
位的结合分子的示例包括FDA批准的抗HER2单克隆抗体(mAb)曲妥珠单抗、2C4、厄妥索单
抗、帕妥珠单抗或另一种抗HER2/neu/ErbB2抗体。在一些实施方案中，所述结合分子可以识
别经修饰的HER2/neu/ErbB2的结构域IV中的表位(曲妥珠单抗)，或者可以识别经修饰的
HER2/neu/ErbB2的结构域II中的表位(帕妥珠单抗)。
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列中包含的氨基酸，其中所述经修饰的HER2/neu/ErbB2缺乏配体结合结构域，保留了由已知抗体识别的
表位并且缺乏这种参考HER2/neu/ErbB2的细胞质信号传导结构域的全部或功能部分。在一
些实施方案中，配体结合结构域可以与EGF、转化生长因子α(TGFα)、双调蛋白、结合肝素的
EGF样生长因子、β细胞素和上皮调节蛋白结合。可以识别经修饰的HER2/neu/ErbB2上的表
位的结合分子的示例包括FDA批准的抗HER2单克隆抗体(mAb)曲妥珠单抗、2C4、厄妥索单
抗、帕妥珠单抗或另一种抗HER2/neu/ErbB2抗体。在一些实施方案中，所述结合分子可以识
别经修饰的HER2/neu/ErbB2的结构域IV中的表位(曲妥珠单抗)，或者可以识别经修饰的
HER2/neu/ErbB2的结构域II中的表位(帕妥珠单抗)。
[0163] 在一些实施方案中，经修饰的HER2/neu/ErbB2(如HER2t)由在SEQ ID NO:91中所示的核苷酸序列、或与SEQ ID NO:91至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列(如其含有简并密码子的序列)编码。编码的经修饰的HER2/neu/ErbB2可以含有用于表达为表面分子或表面
蛋白的信号肽。在一些实施方案中，经修饰的HER2/neu/ErbB2(如HER2t)由如下核苷酸编
码，所述核苷酸含有编码在SEQ ID NO:65中包含的参考HER2/neu/ErbB2天然信号肽的序
列。在一些实施方案中，经修饰的HER2/neu/ErbB2(如HER2t)由如下核苷酸编码，所述核苷
酸含有编码例如在SEQ ID NO:48中所示的非天然或异源信号肽的序列。在一些实施方案
中，经修饰的HER2/neu/ErbB2由在SEQ ID NO:93中所示的核苷酸序列、或与SEQ ID NO:93
至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％或99％序列同一性的序列(如其含有简并密码子的序列)编码。
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列(如其含有简并密码子的序列)编码。编码的经修饰的HER2/neu/ErbB2可以含有用于表达为表面分子或表面
蛋白的信号肽。在一些实施方案中，经修饰的HER2/neu/ErbB2(如HER2t)由如下核苷酸编
码，所述核苷酸含有编码在SEQ ID NO:65中包含的参考HER2/neu/ErbB2天然信号肽的序
列。在一些实施方案中，经修饰的HER2/neu/ErbB2(如HER2t)由如下核苷酸编码，所述核苷
酸含有编码例如在SEQ ID NO:48中所示的非天然或异源信号肽的序列。在一些实施方案
中，经修饰的HER2/neu/ErbB2由在SEQ ID NO:93中所示的核苷酸序列、或与SEQ ID NO:93
至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％或99％序列同一性的序列(如其含有简并密码子的序列)编码。
[0164] c.经修饰的PSMA，例如截短的PSMA
[0165] 在一些实施方案中，经修饰的细胞表面分子是经修饰的前列腺特异性膜抗原(PSMA)。在一些实施方案中，与参考细胞表面分子相比，经修饰的细胞表面分子被修饰，所
述参考细胞表面分子是PSMA，如野生型或未经修饰的PSMA，例如人PSMA，例如含有SEQ ID
NO:94中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，与参考PSMA相比，经修饰的PSMA含有一个
或多个氨基酸修饰，如一个或多个氨基酸取代、缺失、截短和/或插入。在一些实施方案中，
与参考、野生型或未经修饰的PSMA相比，经修饰的PSMA展现改变的细胞内化、细胞运输、酶
促活性和/或配体结合。
述参考细胞表面分子是PSMA，如野生型或未经修饰的PSMA，例如人PSMA，例如含有SEQ ID
NO:94中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，与参考PSMA相比，经修饰的PSMA含有一个
或多个氨基酸修饰，如一个或多个氨基酸取代、缺失、截短和/或插入。在一些实施方案中，
与参考、野生型或未经修饰的PSMA相比，经修饰的PSMA展现改变的细胞内化、细胞运输、酶
促活性和/或配体结合。
[0166] 在一些实施方案中，经修饰的PSMA包含野生型或未经修饰的PSMA的全部或基本上全部的跨膜结构域；或者经修饰的PSMA包含具有与野生型或未经修饰的PSMA相同或至少相
同数量的氨基酸的跨膜结构域。在一些实施方案中，PSMA包含细胞外结构域，所述细胞外结
构域含有由本文描述的结合PSMA的任何抗体或其抗原结合片段识别的表位。
同数量的氨基酸的跨膜结构域。在一些实施方案中，PSMA包含细胞外结构域，所述细胞外结
构域含有由本文描述的结合PSMA的任何抗体或其抗原结合片段识别的表位。
[0167] 在一些实施方案中，参考、野生型或未经修饰的PSMA是人PSMA和/或包含在SEQ ID NO:94中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰的PSMA含有在SEQ ID NO:94中所示
的氨基酸序列的细胞外结构域和/或跨膜结构域或其部分或片段。
的氨基酸序列的细胞外结构域和/或跨膜结构域或其部分或片段。
[0168] 在一些实施方案中，经修饰的PSMA包含至少一个氨基酸取代，例如在第二氨基酸残基处，其中色氨酸被甘氨酸取代(对应于W2G，参考SEQ ID NO:94中所示的PSMA中的位
置)。在一些实施方案中，参考在SEQ ID NO:94中所示的氨基酸序列中的位置，经修饰的
PSMA包含与W2G对应的至少一个氨基酸取代或者不包含W2或者不包含在位置2处的任何残
基。例如，在一些实施方案中，经修饰的PSMA包含在SEQ ID NO:95中所示的氨基酸序列或其
片段，或展现与SEQ ID NO:95至少为或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列或其片段，并且包含所述至少一个氨基酸取代。
置)。在一些实施方案中，参考在SEQ ID NO:94中所示的氨基酸序列中的位置，经修饰的
PSMA包含与W2G对应的至少一个氨基酸取代或者不包含W2或者不包含在位置2处的任何残
基。例如，在一些实施方案中，经修饰的PSMA包含在SEQ ID NO:95中所示的氨基酸序列或其
片段，或展现与SEQ ID NO:95至少为或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列或其片段，并且包含所述至少一个氨基酸取代。
[0169] 在一些实施方案中，置，经修饰的PSMA包含在位置2、3、4、5、6、7、8、9、10或14处(参考在SEQ ID NO:94中所示的PSMA序列中的位)的一个或多个氨基酸残基处的氨基酸取代(至丙氨酸)。
[0170] 在一些实施方案中，与野生型或未经修饰的PSMA相比，PSMA是经修饰的PSMA，其包含细胞内部分中的一个或多个N末端氨基酸残基的缺失。野生型全长人PSMA是750个氨基酸
的蛋白质，其包括19个氨基酸残基的细胞内部分、24个氨基酸残基的跨膜部分和707个氨基
酸残基的细胞外部分。例如，在一些实施方案中，经修饰的PSMA含有在N末端处的缺失(对应
于编码PSMA或其修饰形式的核酸序列中的编码序列的5'末端)，所示缺失在PSMA的细胞内
部分中。
的蛋白质，其包括19个氨基酸残基的细胞内部分、24个氨基酸残基的跨膜部分和707个氨基
酸残基的细胞外部分。例如，在一些实施方案中，经修饰的PSMA含有在N末端处的缺失(对应
于编码PSMA或其修饰形式的核酸序列中的编码序列的5'末端)，所示缺失在PSMA的细胞内
部分中。
[0171] 在一些方面，在细胞内部分中含有一个或多个缺失的经修饰的PSMA也被称为PSMA的截短形式、截短的PSMA或tPSMA。在一些方面，截短的PSMA或tPSMA含有在野生型或未经修
饰的PSMA的N末端处或附近的一个或多个氨基酸残基(任选地连续的氨基酸残基)的缺失或
截短。在一些方面，经修饰的PSMA含有在PSMA的细胞内部分或结构域内一个或多个氨基酸
残基(例如，一个或多个连续的氨基酸残基)的缺失或截短。在一些实施方案中，含有N末端
氨基酸的缺失的PSMA蛋白允许经N末端修饰的PSMA成功定位于细胞膜和中心体，和/或与野
生型或未经修饰的PSMA相比(i)展现减少的内源信号传导；(ii)展现增加的细胞表面表达；
和/或(iii)展现减少的细胞内化。在一些实施方案中，经修饰的PSMA展现减少的内源信号
传导或减少的细胞内化，例如，减少了大于或大于约20％、30％、40％、50％、60％、70％、
80％、90％或更多。在一些实施方案中，经修饰的PSMA展现增加的细胞表面表达或增加的向
细胞膜和中心体的定位，例如增加了大于或大于约20％、30％、40％、50％、60％、70％、
80％、90％或更多。在一些方面，可以使用细胞成像技术(如使用特异性结合PSMA或其变体
的标记的结合分子(例如，抗体)的共聚焦显微镜)来评估细胞表面表达和/或细胞内化。
饰的PSMA的N末端处或附近的一个或多个氨基酸残基(任选地连续的氨基酸残基)的缺失或
截短。在一些方面，经修饰的PSMA含有在PSMA的细胞内部分或结构域内一个或多个氨基酸
残基(例如，一个或多个连续的氨基酸残基)的缺失或截短。在一些实施方案中，含有N末端
氨基酸的缺失的PSMA蛋白允许经N末端修饰的PSMA成功定位于细胞膜和中心体，和/或与野
生型或未经修饰的PSMA相比(i)展现减少的内源信号传导；(ii)展现增加的细胞表面表达；
和/或(iii)展现减少的细胞内化。在一些实施方案中，经修饰的PSMA展现减少的内源信号
传导或减少的细胞内化，例如，减少了大于或大于约20％、30％、40％、50％、60％、70％、
80％、90％或更多。在一些实施方案中，经修饰的PSMA展现增加的细胞表面表达或增加的向
细胞膜和中心体的定位，例如增加了大于或大于约20％、30％、40％、50％、60％、70％、
80％、90％或更多。在一些方面，可以使用细胞成像技术(如使用特异性结合PSMA或其变体
的标记的结合分子(例如，抗体)的共聚焦显微镜)来评估细胞表面表达和/或细胞内化。
[0172] 在一些实施方案中，经修饰的PSMA含有或保留甲硫氨酸作为第一残基，其在一些情况下是翻译所必需的。在一些实施方案中，与野生型或未经修饰的PSMA相比，PSMA是经修
饰的PSMA，所述经修饰的PSMA包含细胞内部分中的一个或多个N末端氨基酸残基(任选地连
续的氨基酸残基)的缺失，但不包括翻译所必需的初始甲硫氨酸的缺失。
饰的PSMA，所述经修饰的PSMA包含细胞内部分中的一个或多个N末端氨基酸残基(任选地连
续的氨基酸残基)的缺失，但不包括翻译所必需的初始甲硫氨酸的缺失。
[0173] 在一些实施方案中，PSMA或经修饰的PSMA包括在以下文献中描述的PSMA：例如，国际PCT公开号WO 2015143029，Rajasekaran等人(2003)Mol.Biol.Cell.14:4835-4845，
Rajasekaran等人(2008)Mol Cancer Ther.(2008)7(7):2142–2151，Barinka等人(2004)
Eur.J.Biochem.271:2782–2790，以及Davis等人(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.102(17)-
5981-5986。
Rajasekaran等人(2008)Mol Cancer Ther.(2008)7(7):2142–2151，Barinka等人(2004)
Eur.J.Biochem.271:2782–2790，以及Davis等人(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.102(17)-
5981-5986。
[0174] 在一些实施方案中，参考在野生型或未经修饰的PSMA(例如，在SEQ ID NO:94中所示的PSMA序列)中的位置，经修饰的PSMA含有11个N末端氨基酸和/或前11个氨基酸的缺失
或缺乏11个N末端氨基酸和/或前11个氨基酸。在一些实施方案中，参考在野生型或未经修
饰的PSMA(例如，在SEQ ID NO:94中所示的PSMA序列)中的位置，经修饰的PSMA含有15个N末
端氨基酸的缺失或缺乏15个N末端氨基酸。在一些实施方案中，参考在野生型或未经修饰的
PSMA(例如，在SEQ ID NO:94中所示的PSMA序列)中的位置，经修饰的PSMA含有氨基酸N末端
氨基酸6-14的缺失或缺乏氨基酸N末端氨基酸6-14。
或缺乏11个N末端氨基酸和/或前11个氨基酸。在一些实施方案中，参考在野生型或未经修
饰的PSMA(例如，在SEQ ID NO:94中所示的PSMA序列)中的位置，经修饰的PSMA含有15个N末
端氨基酸的缺失或缺乏15个N末端氨基酸。在一些实施方案中，参考在野生型或未经修饰的
PSMA(例如，在SEQ ID NO:94中所示的PSMA序列)中的位置，经修饰的PSMA含有氨基酸N末端
氨基酸6-14的缺失或缺乏氨基酸N末端氨基酸6-14。
[0175] 在一些实施方案中，经修饰的PSMA包含一个或多个C末端氨基酸残基的缺失。在一些实施方案中，参考在SEQ ID NO:94中所示的PSMA中的位置，经修饰的PSMA包含氨基酸残
基103-750、626-750、721-747或736-750的缺失。在一些实施方案中，参考在SEQ ID NO:94
中所示的PSMA中的位置，经修饰的PSMA包含15个C末端氨基酸残基的缺失。
基103-750、626-750、721-747或736-750的缺失。在一些实施方案中，参考在SEQ ID NO:94
中所示的PSMA中的位置，经修饰的PSMA包含15个C末端氨基酸残基的缺失。
[0176] 在一些实施方案中，经修饰的PSMA由经修饰的核酸序列(例如，被修饰为不含CpG和/或被密码子优化的核酸序列)编码。
[0177] B.药剂(例如亲和标签)
[0178] 在细胞表面缀合物的一些实施方案中，细胞表面分子(如经修饰的细胞表面分子)与至少一种药剂连接。在一些实施方案中，所述药剂是肽或多肽。在一些实施方案中，所述
药剂是肽。在一些实施方案中，所述肽是人工的、合成的或是较长多肽的一部分。肽的长度
通常为大于或等于2个氨基酸，如长度为大于或等于2个且小于或等于50个或40个氨基酸的
一种肽。在一些实施方案中，所述肽在7个与40个氨基酸之间、8个与20个氨基酸之间、10个
与17个氨基酸之间、7个与13个氨基酸之间或8个与10个氨基酸之间。在一些实施方案中，所
述肽具有在7个与20个氨基酸之间的长度。在一些实施方案中，所述肽具有7个、8个、9个、10
个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个氨基酸的长度。
药剂是肽。在一些实施方案中，所述肽是人工的、合成的或是较长多肽的一部分。肽的长度
通常为大于或等于2个氨基酸，如长度为大于或等于2个且小于或等于50个或40个氨基酸的
一种肽。在一些实施方案中，所述肽在7个与40个氨基酸之间、8个与20个氨基酸之间、10个
与17个氨基酸之间、7个与13个氨基酸之间或8个与10个氨基酸之间。在一些实施方案中，所
述肽具有在7个与20个氨基酸之间的长度。在一些实施方案中，所述肽具有7个、8个、9个、10
个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个氨基酸的长度。
[0179] 在一些实施方案中，所述药剂是已知由结合分子识别的亲和标签。在一些实施方案中，所述亲和标签具有足够的残基以提供由抗体或由非抗体结合分子识别的表位，但是，
在一些方面，是足够短的使得其不会干扰或空间阻断由如上所述的已知抗体识别的细胞表
面分子的表位。合适的标签多肽通常具有至少5个或6个氨基酸残基，并且通常在约8个-50
个氨基酸残基之间，典型地在9个-30个残基之间。此类标签是熟知的并且可以容易地合成
和设计。
在一些方面，是足够短的使得其不会干扰或空间阻断由如上所述的已知抗体识别的细胞表
面分子的表位。合适的标签多肽通常具有至少5个或6个氨基酸残基，并且通常在约8个-50
个氨基酸残基之间，典型地在9个-30个残基之间。此类标签是熟知的并且可以容易地合成
和设计。
[0180] 在一些实施方案中，所述药剂(如亲和标签)是链霉亲和素结合肽(例如Strep-标签)、寡聚组氨酸或多组氨酸(例如His标签)、MAT标签、谷胱甘肽-S-转移酶、免疫球蛋白结
构域、钙调蛋白或其类似物、硫氧还蛋白、几丁质结合蛋白(CBP)、钙调蛋白结合肽(CBP)、
FLAG-肽、HA-标签、麦芽糖结合蛋白(MBP)、HSV表位(例如gd标签)、myc表位、和/或生物素化
的载体蛋白。此类药剂(如亲和标签)的示例包括MAT标签(序列：His-Asn-His-Arg-His-
Lys-His-Gly-Gly-Gly-Cys)(SEQ ID NO:63)、HA-标签(序列：Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-
Asp-Tyr-Ala)(SEQ ID NO:20)、VSV-G-标签(序列：Tyr-Thr-Asp-Ile-Glu-Met-Asn-Arg-
Leu-Gly-Lys)(SEQ ID NO:21)、HSV-标签(序列：Gln-Pro-Glu-Leu-Ala-Pro-Glu-Asp-Pro-
Glu-Asp)(SEQ ID NO:22)、T7表位(Ala-Ser-Met-Thr-Gly-Gly-Gln-Gln-Met-Gly)(SEQ ID
NO:22)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、单纯性疱疹病毒糖蛋白D的HSV表位(序列Gln-Pro-Glu-
Leu-Ala-Pro-Glu-Asp-Pro-Glu-Asp(SEQ ID NO:24))、转录因子c-myc的“myc”表位(序列
Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu(SEQ ID NO:25))、V5-标签(序列：Gly-Lys-
Pro-Ile-Pro-Asn-Pro-Leu-Leu-Gly-Leu-Asp-Ser-Thr)(SEQ ID NO:26)、或谷胱甘肽-S-
转移酶(GST)。此类药剂(例如亲和标签)的示例还可以包括链霉亲和素结合肽(例如Strep-
标签)，如包含在SEQ ID NO:7-19中任一个中所示的序列的任何一种。已知识别此类标签的
结合分子是已知的，并且包括但不限于用于识别流感血凝素(HA)标签多肽的抗体12CA5
(Field等人(1988)Mol.Cell.Biol.5:2159-2165)；用于识别c-myc标签的8F9、3C7、6E10、
G4、B7和9E10抗体(参见，例如，Evan等人(1985)Molecular and Cellular Biology 5:
3610-3616)；以及用于识别单纯性疱疹病毒糖蛋白D(gD)标签的已知抗体及其抗体
(Paborsky等人(1990)Protein Engineering 3:547-553)、或识别链霉亲和素结合肽(例如
Strep-标签)的任何已知结合分子(如包含链霉亲和素突变蛋白(例如Strep-Tactin)的抗
体分子或试剂)。
构域、钙调蛋白或其类似物、硫氧还蛋白、几丁质结合蛋白(CBP)、钙调蛋白结合肽(CBP)、
FLAG-肽、HA-标签、麦芽糖结合蛋白(MBP)、HSV表位(例如gd标签)、myc表位、和/或生物素化
的载体蛋白。此类药剂(如亲和标签)的示例包括MAT标签(序列：His-Asn-His-Arg-His-
Lys-His-Gly-Gly-Gly-Cys)(SEQ ID NO:63)、HA-标签(序列：Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-
Asp-Tyr-Ala)(SEQ ID NO:20)、VSV-G-标签(序列：Tyr-Thr-Asp-Ile-Glu-Met-Asn-Arg-
Leu-Gly-Lys)(SEQ ID NO:21)、HSV-标签(序列：Gln-Pro-Glu-Leu-Ala-Pro-Glu-Asp-Pro-
Glu-Asp)(SEQ ID NO:22)、T7表位(Ala-Ser-Met-Thr-Gly-Gly-Gln-Gln-Met-Gly)(SEQ ID
NO:22)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、单纯性疱疹病毒糖蛋白D的HSV表位(序列Gln-Pro-Glu-
Leu-Ala-Pro-Glu-Asp-Pro-Glu-Asp(SEQ ID NO:24))、转录因子c-myc的“myc”表位(序列
Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu(SEQ ID NO:25))、V5-标签(序列：Gly-Lys-
Pro-Ile-Pro-Asn-Pro-Leu-Leu-Gly-Leu-Asp-Ser-Thr)(SEQ ID NO:26)、或谷胱甘肽-S-
转移酶(GST)。此类药剂(例如亲和标签)的示例还可以包括链霉亲和素结合肽(例如Strep-
标签)，如包含在SEQ ID NO:7-19中任一个中所示的序列的任何一种。已知识别此类标签的
结合分子是已知的，并且包括但不限于用于识别流感血凝素(HA)标签多肽的抗体12CA5
(Field等人(1988)Mol.Cell.Biol.5:2159-2165)；用于识别c-myc标签的8F9、3C7、6E10、
G4、B7和9E10抗体(参见，例如，Evan等人(1985)Molecular and Cellular Biology 5:
3610-3616)；以及用于识别单纯性疱疹病毒糖蛋白D(gD)标签的已知抗体及其抗体
(Paborsky等人(1990)Protein Engineering 3:547-553)、或识别链霉亲和素结合肽(例如
Strep-标签)的任何已知结合分子(如包含链霉亲和素突变蛋白(例如Strep-Tactin)的抗
体分子或试剂)。
[0181] 药剂的另外的例子包括但不限于二硝基苯酚或地高辛、凝集素、蛋白质A、蛋白质G、金属、金属离子、次氮基三乙酸衍生物(NT A)、RGD-基序、葡聚糖、聚乙烯亚胺(PEI)、氧化还原聚合物、糖蛋白、适体、染料、直链淀粉、麦芽糖、纤维素、几丁质、谷胱甘肽、钙调蛋白、明胶、多粘菌素、肝素、NAD、NADP、赖氨酸、精氨酸、苯甲脒、聚U、或寡聚-dT。凝集素如伴刀豆凝集素A已知结合多糖和糖基化蛋白。染料的说明性例子是三嗪染料(如Cibacron blue
F3G-A(CB)或Red HE-3B)，其特异性结合NADH依赖性酶。通常，Green A结合Co A蛋白、人血
清白蛋白、和脱氢酶。在一些情况下，染料7-氨基放线菌素D和4',6-二脒基-2-苯基吲哚结
合DNA。
F3G-A(CB)或Red HE-3B)，其特异性结合NADH依赖性酶。通常，Green A结合Co A蛋白、人血
清白蛋白、和脱氢酶。在一些情况下，染料7-氨基放线菌素D和4',6-二脒基-2-苯基吲哚结
合DNA。
[0182] 在一些实施方案中，所述药剂(例如肽)(如亲和标签)由结合分子识别，其中平衡解离常数(KD)为从或从约10-4M至10-10M或平衡缔合常数(KA)为从或从约104M-1至1010M-1。在
一些实施方案中，所述药剂(如亲和标签，例如肽)由具有低结合亲和力(例如KD大于或大于
约10-7M、10-6M、10-5M、10-4M或更大，或者KA为小于或小于约107M-1、106M-1、105M-1、104M-1或更小)的结合分子识别。
一些实施方案中，所述药剂(如亲和标签，例如肽)由具有低结合亲和力(例如KD大于或大于
约10-7M、10-6M、10-5M、10-4M或更大，或者KA为小于或小于约107M-1、106M-1、105M-1、104M-1或更小)的结合分子识别。
[0183] 在一些实施方案中，所述药剂(如亲和标签)由结合分子识别，所述结合分子是或包含具有与所述药剂结合的至少一个结合位点Z的结合试剂。在一些实施方案中，所述结合
位点Z是抗生物素蛋白或链霉亲和素或其突变蛋白或类似物的天然生物素结合位点，其中
在单个分子中可以存在多达四个结合位点(例如含有四个结合位点Z的四聚体)，由此同源
四聚体可以含有多达4个相同的结合位点，即Z1，然而异源四聚体可以含有多达4个可能不
同的结合位点，例如含有Z1和Z2。
位点Z是抗生物素蛋白或链霉亲和素或其突变蛋白或类似物的天然生物素结合位点，其中
在单个分子中可以存在多达四个结合位点(例如含有四个结合位点Z的四聚体)，由此同源
四聚体可以含有多达4个相同的结合位点，即Z1，然而异源四聚体可以含有多达4个可能不
同的结合位点，例如含有Z1和Z2。
[0184] 在一些实施方案中，所述药剂由结合分子识别，所述结合分子是或包含作为寡聚物或聚合物的试剂。在一些实施方案中，所述寡聚物或聚合物可以通过将蛋白质的单个分
子按其天然存在的样子直接或间接地连接，或者通过将单体的单个分子或构成单个分子的
亚基的复合物直接或间接地连接(例如，将蛋白质的二聚体、三聚体、四聚体等按其天然存
在的样子直接或间接地连接)而生成。例如，链霉亲和素或抗生物素蛋白的四聚体同源二聚
体或异源二聚体可以称为相应的寡聚物或聚合物的单个分子或最小构成要素。在一些实施
方案中，寡聚物或聚合物可以含有蛋白质的至少2个单个分子的连接(例如是2聚体)，或者
可以是蛋白质的单个分子(例如，单体、四聚体)的至少3聚体、4聚体、5聚体、6聚体、7聚体、8聚体、9聚体、10聚体、11聚体、12聚体、13聚体、14聚体、15聚体、16聚体、17聚体、18聚体、19聚体、20聚体、25聚体、30聚体、35聚体、40聚体、45聚体或50聚体。在一些情况下，寡聚物可以含有多个结合位点Z1，如至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、40个、45个、50个或更多个结合位点Z1。在一些实施方案中，寡聚物生成或产生自多个单个分子，所述多个单个分子可以是(例如链霉亲和
素、链霉亲和素突变蛋白、抗生物素蛋白或抗生物素蛋白突变蛋白的)异源四聚体，和/或生
成或产生自多个两个或更多个不同的单个分子(例如链霉亲和素、链霉亲和素突变蛋白、抗
生物素蛋白或抗生物素蛋白突变蛋白的不同的同源四聚体)，所述两个或更多个不同的单
个分子在它们的结合位点Z(例如Z1和Z2)方面不同，在这种情况下多个不同的结合位点Z
(例如Z1和Z2)可以存在于寡聚物中。例如，在一些情况下，寡聚物可以含有多个结合位点Z1
和多个结合位点Z2，其组合可以包括至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、
12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、40个、45个、50个或更多个组合的结合位点Z1和Z2。
子按其天然存在的样子直接或间接地连接，或者通过将单体的单个分子或构成单个分子的
亚基的复合物直接或间接地连接(例如，将蛋白质的二聚体、三聚体、四聚体等按其天然存
在的样子直接或间接地连接)而生成。例如，链霉亲和素或抗生物素蛋白的四聚体同源二聚
体或异源二聚体可以称为相应的寡聚物或聚合物的单个分子或最小构成要素。在一些实施
方案中，寡聚物或聚合物可以含有蛋白质的至少2个单个分子的连接(例如是2聚体)，或者
可以是蛋白质的单个分子(例如，单体、四聚体)的至少3聚体、4聚体、5聚体、6聚体、7聚体、8聚体、9聚体、10聚体、11聚体、12聚体、13聚体、14聚体、15聚体、16聚体、17聚体、18聚体、19聚体、20聚体、25聚体、30聚体、35聚体、40聚体、45聚体或50聚体。在一些情况下，寡聚物可以含有多个结合位点Z1，如至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、40个、45个、50个或更多个结合位点Z1。在一些实施方案中，寡聚物生成或产生自多个单个分子，所述多个单个分子可以是(例如链霉亲和
素、链霉亲和素突变蛋白、抗生物素蛋白或抗生物素蛋白突变蛋白的)异源四聚体，和/或生
成或产生自多个两个或更多个不同的单个分子(例如链霉亲和素、链霉亲和素突变蛋白、抗
生物素蛋白或抗生物素蛋白突变蛋白的不同的同源四聚体)，所述两个或更多个不同的单
个分子在它们的结合位点Z(例如Z1和Z2)方面不同，在这种情况下多个不同的结合位点Z
(例如Z1和Z2)可以存在于寡聚物中。例如，在一些情况下，寡聚物可以含有多个结合位点Z1
和多个结合位点Z2，其组合可以包括至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、
12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、40个、45个、50个或更多个组合的结合位点Z1和Z2。
[0185] 可以使用在本领域中已知的任何方法(如在公布的美国专利申请号US2004/0082012中描述的任何方法)来生成寡聚物。在一些实施方案中，所述寡聚物或聚合物含有
两个或更多个单个分子，所述两个或更多个单个分子可以交联，如通过多糖或双功能接头。
两个或更多个单个分子，所述两个或更多个单个分子可以交联，如通过多糖或双功能接头。
[0186] 在一些实施方案中，所述寡聚物或聚合物通过在多糖的存在下将单个分子或构成单个分子的亚基的复合物交联而获得。在一些实施方案中，寡聚物或聚合物可以通过将羧
基残基引入多糖(例如葡聚糖)中来制备。在一些方面，所述试剂的单个分子(例如，单体、四
聚体)可以使用常规碳二亚胺化学经由内部赖氨酸残基的伯氨基基团和/或游离N末端与葡
聚糖骨架中的羧基基团偶联。在一些实施方案中，偶联反应以每摩尔葡聚糖约60摩尔的试
剂单个分子(例如单体、四聚体)的摩尔比进行。
基残基引入多糖(例如葡聚糖)中来制备。在一些方面，所述试剂的单个分子(例如，单体、四
聚体)可以使用常规碳二亚胺化学经由内部赖氨酸残基的伯氨基基团和/或游离N末端与葡
聚糖骨架中的羧基基团偶联。在一些实施方案中，偶联反应以每摩尔葡聚糖约60摩尔的试
剂单个分子(例如单体、四聚体)的摩尔比进行。
[0187] 在一些情况下，在所述药剂与所述至少一个结合位点Z之间的结合相互作用是非共价相互作用。在一些实施方案中，在所述药剂与所述至少一个结合位点Z之间的结合相互
作用(如非共价相互作用)是可逆的。在一些实施方案中，所述结合试剂含有能够可逆地结
合所述药剂的多个结合位点。可以用于此类可逆系统的结合分子试剂在本领域中已有描述
并且是已知的，参见例如美国专利号5,168,049；5,506,121；6,103,493；7,776,562；7,981,
632；8,298,782；8,735,540；9,023,604；以及国际公开的PCT申请号WO 2013/124474和WO
2014/076277。
作用(如非共价相互作用)是可逆的。在一些实施方案中，所述结合试剂含有能够可逆地结
合所述药剂的多个结合位点。可以用于此类可逆系统的结合分子试剂在本领域中已有描述
并且是已知的，参见例如美国专利号5,168,049；5,506,121；6,103,493；7,776,562；7,981,
632；8,298,782；8,735,540；9,023,604；以及国际公开的PCT申请号WO 2013/124474和WO
2014/076277。
[0188] 在一些实施方案中，所述结合分子对所述药剂的识别是可逆的，例如在竞争物质的存在下被竞争。在一些实施方案中，所述药剂是其中可以在竞争物质的存在下介导可逆
缔合的一种药剂，所述竞争物质是或含有也能够由所述药剂识别或结合的结合位点。在一
些方面，竞争物质可以充当竞争者，因为在竞争物质与结合分子之间的结合亲和力高于在
结合分子和药剂之间的结合亲和力和/或因为竞争物质存在的浓度比药剂更高，从而分离
和/或解离在药剂与结合分子之间的相互作用。在一些方面，在药剂与结合分子之间的可逆
结合可以通过使表达细胞表面缀合物并被结合分子结合的细胞与竞争物质接触(例如通过
将竞争物质添加到这样的细胞组合物中)来进行。
缔合的一种药剂，所述竞争物质是或含有也能够由所述药剂识别或结合的结合位点。在一
些方面，竞争物质可以充当竞争者，因为在竞争物质与结合分子之间的结合亲和力高于在
结合分子和药剂之间的结合亲和力和/或因为竞争物质存在的浓度比药剂更高，从而分离
和/或解离在药剂与结合分子之间的相互作用。在一些方面，在药剂与结合分子之间的可逆
结合可以通过使表达细胞表面缀合物并被结合分子结合的细胞与竞争物质接触(例如通过
将竞争物质添加到这样的细胞组合物中)来进行。
[0189] 在一些实施方案中，所述药剂是或包括对熟练技术人员而言已知的部分作为亲和标签。在一些此类实施方案中，结合分子是或包含作为相应结合配偶体的试剂，例如已知与
亲和标签结合的抗体或抗体片段。在此类实施方案中，复合物在试剂的一个或多个结合位
点Z之间形成，所述试剂可以是抗体或抗体片段，并且通过添加游离抗原(即游离肽(表位标
签)或游离蛋白(如MBP或CBP))可以竞争性地破坏抗原。在一些实施方案中，亲和标签也可
以是寡核苷酸标签。在一些情况下，这样的寡核苷酸标签可以例如用于与具有互补序列的
寡核苷酸杂交，连接至所述试剂或包括在所述试剂中。
亲和标签结合的抗体或抗体片段。在此类实施方案中，复合物在试剂的一个或多个结合位
点Z之间形成，所述试剂可以是抗体或抗体片段，并且通过添加游离抗原(即游离肽(表位标
签)或游离蛋白(如MBP或CBP))可以竞争性地破坏抗原。在一些实施方案中，亲和标签也可
以是寡核苷酸标签。在一些情况下，这样的寡核苷酸标签可以例如用于与具有互补序列的
寡核苷酸杂交，连接至所述试剂或包括在所述试剂中。
[0190] 在一些情况下，结合分子是或包含如下试剂，所述试剂含有能够结合过渡金属离子的至少两个螯合基团K，从而使得所述试剂能够结合寡聚组氨酸亲和标签、多聚体谷胱甘
肽-S-转移酶、或生物素化的载体蛋白或其他药剂。通常，金属阳离子(如Ni、Cd、Zn、Co或Cu)通常用于结合亲和标签，如含有寡聚组氨酸的序列(包括六组氨酸或His-Asn-His-Arg-
His-Lys-His-Gly-Gly-Gly-Cys标签(MAT标签；SEQ ID NO:63))、和N-甲基丙烯酰基-(L)-
半胱氨酸甲酯。在一些实施方案中，在所述药剂(例如肽)(如亲和标签)与所述试剂的一个
或多个结合位点Z之间的结合在二价、三价或四价阳离子的存在下发生。在这方面，在一些
实施方案中，所述试剂包括通常通过合适的螯合剂保持的(例如络合的)二价、三价或四价
阳离子。在一些实施方案中，所述药剂(例如肽)(如亲和标签)可以包括含有例如络合物、二
价、三价或四价阳离子的部分。在一些此类实施方案中，所述药剂与所述试剂的一个或多个
结合位点Z之间的结合可以通过金属离子螯合作用破坏。金属螯合可以例如通过添加EGTA
或EDTA来完成。相应的金属螯合剂的例子包括但不限于乙二胺、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二
醇四乙酸(EGTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、N,N-双(羧甲基)甘氨酸(也称为次氮基三乙
酸，NTA)、l,2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸(BAPTA)、2,3-二巯基-1-丙醇(二
巯基丙醇)、卟啉和亚铁血红素。例如，EDTA与大多数单价、二价、三价和四价金属离子形成
络合物，如例如，银(Ag+)、钙(Ca2+)、锰(Mn2+)、铜(Cu2+)、铁(Fe2+)、钴(Co+)和锆(Zr4+)，而BAPTA对Ca2+具有特异性。作为说明性例子，本领域中使用的标准方法是在寡聚组氨酸标签
与铜(Cu2+)、镍(Ni2+)、钴(Co2+)或锌(Zn2+)离子之间形成络合物，所述离子通过螯合剂次氮
基三乙酸(NTA)呈现。
肽-S-转移酶、或生物素化的载体蛋白或其他药剂。通常，金属阳离子(如Ni、Cd、Zn、Co或Cu)通常用于结合亲和标签，如含有寡聚组氨酸的序列(包括六组氨酸或His-Asn-His-Arg-
His-Lys-His-Gly-Gly-Gly-Cys标签(MAT标签；SEQ ID NO:63))、和N-甲基丙烯酰基-(L)-
半胱氨酸甲酯。在一些实施方案中，在所述药剂(例如肽)(如亲和标签)与所述试剂的一个
或多个结合位点Z之间的结合在二价、三价或四价阳离子的存在下发生。在这方面，在一些
实施方案中，所述试剂包括通常通过合适的螯合剂保持的(例如络合的)二价、三价或四价
阳离子。在一些实施方案中，所述药剂(例如肽)(如亲和标签)可以包括含有例如络合物、二
价、三价或四价阳离子的部分。在一些此类实施方案中，所述药剂与所述试剂的一个或多个
结合位点Z之间的结合可以通过金属离子螯合作用破坏。金属螯合可以例如通过添加EGTA
或EDTA来完成。相应的金属螯合剂的例子包括但不限于乙二胺、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二
醇四乙酸(EGTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、N,N-双(羧甲基)甘氨酸(也称为次氮基三乙
酸，NTA)、l,2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸(BAPTA)、2,3-二巯基-1-丙醇(二
巯基丙醇)、卟啉和亚铁血红素。例如，EDTA与大多数单价、二价、三价和四价金属离子形成
络合物，如例如，银(Ag+)、钙(Ca2+)、锰(Mn2+)、铜(Cu2+)、铁(Fe2+)、钴(Co+)和锆(Zr4+)，而BAPTA对Ca2+具有特异性。作为说明性例子，本领域中使用的标准方法是在寡聚组氨酸标签
与铜(Cu2+)、镍(Ni2+)、钴(Co2+)或锌(Zn2+)离子之间形成络合物，所述离子通过螯合剂次氮
基三乙酸(NTA)呈现。
[0191] 在一些实施方案中，所述药剂(如亲和标签)包括钙调蛋白结合肽，并且所述结合分子试剂包括例如在美国专利5,985,658中描述的多聚体钙调蛋白。在一些实施方案中，所
述药剂(如亲和标签)包括FLAG肽，并且所述结合分子试剂包括与FLAG肽(例如与如美国专
利4,851,341中描述的单克隆抗体4E11结合的FLAG肽)结合的抗体。在一个实施方案中，所
述药剂(如亲和标签)包括寡聚组氨酸标签，并且所述试剂包括结合所述寡聚组氨酸标签的
抗体或过渡金属离子。在一些情况下，所有这些结合复合物的破坏可以通过金属离子螯合
作用(例如，钙螯合作用，例如通过添加EDTA或EGTA)实现。在一些实施方案中，钙调蛋白、抗
体如4E11或螯合金属离子或游离螯合剂可以通过常规方法多聚化，例如，通过与链霉亲和
素或抗生物素蛋白或其寡聚物的生物素化和络合，或者通过在第一步骤中基本上如
Noguchi,A等人Bioconjugate Chemistry(1992)3,132-137所描述的将羧基残基引入多糖
(例如葡聚糖)中，并且在第二步骤中使用常规碳二亚胺化学将钙调蛋白或抗体或螯合的金
属离子或游离螯合剂经由伯氨基与多糖(例如葡聚糖)骨架中的羧基基团连接。
述药剂(如亲和标签)包括FLAG肽，并且所述结合分子试剂包括与FLAG肽(例如与如美国专
利4,851,341中描述的单克隆抗体4E11结合的FLAG肽)结合的抗体。在一个实施方案中，所
述药剂(如亲和标签)包括寡聚组氨酸标签，并且所述试剂包括结合所述寡聚组氨酸标签的
抗体或过渡金属离子。在一些情况下，所有这些结合复合物的破坏可以通过金属离子螯合
作用(例如，钙螯合作用，例如通过添加EDTA或EGTA)实现。在一些实施方案中，钙调蛋白、抗
体如4E11或螯合金属离子或游离螯合剂可以通过常规方法多聚化，例如，通过与链霉亲和
素或抗生物素蛋白或其寡聚物的生物素化和络合，或者通过在第一步骤中基本上如
Noguchi,A等人Bioconjugate Chemistry(1992)3,132-137所描述的将羧基残基引入多糖
(例如葡聚糖)中，并且在第二步骤中使用常规碳二亚胺化学将钙调蛋白或抗体或螯合的金
属离子或游离螯合剂经由伯氨基与多糖(例如葡聚糖)骨架中的羧基基团连接。
[0192] 在一些情况下，所述结合分子是或包含如下试剂，所述试剂是链霉亲和素或抗生物素蛋白或链霉亲和素的任何类似物或突变蛋白或抗生物素蛋白的类似物或突变蛋白(例
如中性抗生物素蛋白)。在一些实施方案中，结合分子试剂能够结合作为链霉亲和素结合肽
的药剂。在一些实施方案中，可以用生物素或生物素类似物或模拟物进行结合的破坏或逆
转。已知识别此类药剂的此类链霉亲和素结合肽和结合分子试剂的示例如下所述。
如中性抗生物素蛋白)。在一些实施方案中，结合分子试剂能够结合作为链霉亲和素结合肽
的药剂。在一些实施方案中，可以用生物素或生物素类似物或模拟物进行结合的破坏或逆
转。已知识别此类药剂的此类链霉亲和素结合肽和结合分子试剂的示例如下所述。
[0193] 1.示例性链霉亲和素结合肽药剂及对其的结合分子
[0194] 在一些实施方案中，药剂(例如肽)(如亲和标签)由是或包含链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白的试剂识别。在一些实施方案中，所述药剂可以是生物素、生物素衍生物或类
似物、或链霉亲和素结合肽或能够特异性结合链霉亲和素、链霉亲和素突变蛋白或类似物、
抗生物素蛋白或抗生物素蛋白突变蛋白或类似物的其他分子。在一些实施方案中，所述药
剂(如亲和标签)是链霉亲和素结合肽。
似物、或链霉亲和素结合肽或能够特异性结合链霉亲和素、链霉亲和素突变蛋白或类似物、
抗生物素蛋白或抗生物素蛋白突变蛋白或类似物的其他分子。在一些实施方案中，所述药
剂(如亲和标签)是链霉亲和素结合肽。
[0195] 在一些实施方案中，链霉亲和素结合肽含有具有在SEQ ID NO:9中所示的通式的序列，例如含有在SEQ ID NO:10中所示的序列。在一些实施方案中，肽序列具有在SEQ ID
NO:11中所示的通式，例如在SEQ ID NO:12中所示。在一个例子中，肽序列是Trp-Arg-His-
Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(也称为Strep- 在SEQ ID NO:7中所示)。在一个例子中，肽
序列是Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:58)或最小序列Trp-Ser-
His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(也称为Strep- II，在SEQ ID NO:8中所示)。在一些实施
方案中，所述药剂含有至少两个链霉亲和素结合肽模块的顺序排列，其中在所述两个模块
之间的距离为至少0个且不大于50个氨基酸，其中一个结合模块具有3个至8个氨基酸并且
含有至少序列His-Pro-Xaa(SEQ ID NO:9)，其中Xaa是谷氨酰胺、天冬酰胺或甲硫氨酸，并
且其中另一个结合模块具有相同或不同的链霉亲和素肽配体，如在SEQ ID NO:11中所示
(参见例如国际公开的PCT申请号WO 02/077018；美国专利号7,981,632)。在一些实施方案
中，链霉亲和素结合肽含有具有在SEQ ID NO:13或14中任一个中所示的式的序列。在一些
实施方案中，所述药剂可以例如通过顺序排列两个链霉亲和素结合模块含有双-Strep-标
签，例如可作为Twin-Strep- 从IBA GmbH, Germany商购获得，例如含有
序列(SAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK)(SEQ ID NO:16)。在一些实施方案中，链霉亲和素
结合肽具有在SEQ ID NO:15-19中任一个中所示的氨基酸序列。在大多数情况下，所有这些
链霉亲和素结合肽结合相同的结合位点，即链霉亲和素的生物素结合位点。
NO:11中所示的通式，例如在SEQ ID NO:12中所示。在一个例子中，肽序列是Trp-Arg-His-
Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(也称为Strep- 在SEQ ID NO:7中所示)。在一个例子中，肽
序列是Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:58)或最小序列Trp-Ser-
His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(也称为Strep- II，在SEQ ID NO:8中所示)。在一些实施
方案中，所述药剂含有至少两个链霉亲和素结合肽模块的顺序排列，其中在所述两个模块
之间的距离为至少0个且不大于50个氨基酸，其中一个结合模块具有3个至8个氨基酸并且
含有至少序列His-Pro-Xaa(SEQ ID NO:9)，其中Xaa是谷氨酰胺、天冬酰胺或甲硫氨酸，并
且其中另一个结合模块具有相同或不同的链霉亲和素肽配体，如在SEQ ID NO:11中所示
(参见例如国际公开的PCT申请号WO 02/077018；美国专利号7,981,632)。在一些实施方案
中，链霉亲和素结合肽含有具有在SEQ ID NO:13或14中任一个中所示的式的序列。在一些
实施方案中，所述药剂可以例如通过顺序排列两个链霉亲和素结合模块含有双-Strep-标
签，例如可作为Twin-Strep- 从IBA GmbH, Germany商购获得，例如含有
序列(SAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK)(SEQ ID NO:16)。在一些实施方案中，链霉亲和素
结合肽具有在SEQ ID NO:15-19中任一个中所示的氨基酸序列。在大多数情况下，所有这些
链霉亲和素结合肽结合相同的结合位点，即链霉亲和素的生物素结合位点。
[0196] 在一些实施方案中，链霉亲和素结合肽由包含链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白的试剂识别，所述试剂展现对所述肽的结合亲和力。在一些实施方案中，链霉亲和素或链霉
亲和素突变蛋白对链霉亲和素结合肽的结合亲和力的KD为小于1x 10-4M、5x 10-4M、1x 10-
5M、5x 10-5M、1x 10-6M、5x 10-6M或1x 10-7M，但通常大于1x 10-13M、1x 10-12M或1x 10-11M。例如，如在美国专利号5,506,121中所披露的肽序列(Strep-标签)可以充当生物素模拟物并
展示对链霉亲和素的结合亲和力，例如，KD为大约在10-4M与10-5M之间。在一些情况下，可以
通过在链霉亲和素分子内进行突变来进一步改善结合亲和力，参见例如美国专利号6,103,
493或国际公开的PCT申请号WO2014/076277。在一些实施方案中，结合亲和力可以通过本领
域已知的方法(例如下面描述的任何方法)来确定。
亲和素突变蛋白对链霉亲和素结合肽的结合亲和力的KD为小于1x 10-4M、5x 10-4M、1x 10-
5M、5x 10-5M、1x 10-6M、5x 10-6M或1x 10-7M，但通常大于1x 10-13M、1x 10-12M或1x 10-11M。例如，如在美国专利号5,506,121中所披露的肽序列(Strep-标签)可以充当生物素模拟物并
展示对链霉亲和素的结合亲和力，例如，KD为大约在10-4M与10-5M之间。在一些情况下，可以
通过在链霉亲和素分子内进行突变来进一步改善结合亲和力，参见例如美国专利号6,103,
493或国际公开的PCT申请号WO2014/076277。在一些实施方案中，结合亲和力可以通过本领
域已知的方法(例如下面描述的任何方法)来确定。
[0197] 在一些实施方案中，链霉亲和素结合肽由如下试剂识别，所述试剂是或包含链霉亲和素、链霉亲和素突变蛋白或类似物、抗生物素蛋白、抗生物素蛋白突变蛋白或类似物
(如中性抗生物素蛋白)或其混合物，其中此类试剂含有用于与包含链霉亲和素结合肽的药
剂可逆缔合的一个或多个结合位点Z。在一些实施方案中，所述试剂是或含有可逆地结合链
霉亲和素结合肽的链霉亲和素的类似物或突变蛋白或抗生物素蛋白的类似物或突变蛋白。
在一些实施方案中，物质(例如竞争性试剂)可以是生物素、生物素衍生物或类似物或链霉
亲和素结合肽，其能够竞争与所述药剂对所述一个或多个结合位点Z的结合。在一些实施方
案中，所述缀合物的所述药剂和所述物质(例如竞争性试剂)是不同的，并且与所述药剂的
亲和力相比，所述物质(例如竞争性试剂)对所述一个或多个结合位点Z展现的结合亲和力
更高。
(如中性抗生物素蛋白)或其混合物，其中此类试剂含有用于与包含链霉亲和素结合肽的药
剂可逆缔合的一个或多个结合位点Z。在一些实施方案中，所述试剂是或含有可逆地结合链
霉亲和素结合肽的链霉亲和素的类似物或突变蛋白或抗生物素蛋白的类似物或突变蛋白。
在一些实施方案中，物质(例如竞争性试剂)可以是生物素、生物素衍生物或类似物或链霉
亲和素结合肽，其能够竞争与所述药剂对所述一个或多个结合位点Z的结合。在一些实施方
案中，所述缀合物的所述药剂和所述物质(例如竞争性试剂)是不同的，并且与所述药剂的
亲和力相比，所述物质(例如竞争性试剂)对所述一个或多个结合位点Z展现的结合亲和力
更高。
[0198] 在一些实施方案中，识别所述药剂(例如链霉亲和素结合肽(例如Strep-标签))的结合分子是或包含链霉亲和素，所述链霉亲和素可以是野生型链霉亲和素、链霉亲和素突
变蛋白或类似物，如链霉亲和素样多肽。在一些实施方案中，所述结合分子是或包含抗生物
素蛋白，所述抗生物素蛋白可以是野生型抗生物素蛋白或抗生物素蛋白的突变蛋白或类似
物(如中性抗生物素蛋白)、具有经修饰的精氨酸的去糖基化的抗生物素蛋白(其通常展现
更中性的pI并且可用作天然抗生物素蛋白的替代物)。通常，去糖基化的中性形式的抗生物
素蛋白包括例如，那些可商购获得的形式，如可通过Sigma Aldrich公司获得的
“Extravidin”、或可获自Thermo Scientific或Invitrogen公司的“NeutrAvidin”。
变蛋白或类似物，如链霉亲和素样多肽。在一些实施方案中，所述结合分子是或包含抗生物
素蛋白，所述抗生物素蛋白可以是野生型抗生物素蛋白或抗生物素蛋白的突变蛋白或类似
物(如中性抗生物素蛋白)、具有经修饰的精氨酸的去糖基化的抗生物素蛋白(其通常展现
更中性的pI并且可用作天然抗生物素蛋白的替代物)。通常，去糖基化的中性形式的抗生物
素蛋白包括例如，那些可商购获得的形式，如可通过Sigma Aldrich公司获得的
“Extravidin”、或可获自Thermo Scientific或Invitrogen公司的“NeutrAvidin”。
[0199] 在一些实施方案中，所述药剂(如链霉亲和素结合肽)由结合分子试剂识别，所述结合分子试剂是或包含链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白或类似物。在一些实施方案中，
野生型链霉亲和素(wt-链霉亲和素)具有由Argarana等人,Nucleic Acids Res.14(1986)
1871-1882所披露的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。通常，链霉亲和素自然地作为四个相同亚
基的四聚体发生，即它是同源四聚体，其中每个亚基含有针对生物素、生物素衍生物或类似
物或生物素模拟物的单一结合位点。链霉亲和素亚基的示例性序列是在SEQ ID NO:1中所
示的氨基酸序列，但是这样的序列还可以包括在来自其他链霉菌属(Streptomyces)物种的
同源物中存在的序列。特别地，链霉亲和素的每个亚基可以展现对生物素的强结合亲和力，
解离常数(Kd)近似于约10-14M。在一些情况下，链霉亲和素可以作为其中四个结合位点中仅
有一个有功能的单价四聚体存在(Howarth等人(2006)Nat.Methods,3:267-73；Zhang等人
(2015)Biochem.Biophys.Res.Commun.,463:1059-63)、作为其中四个结合位点中的两个有
功能的二价四聚体存在(Fairhead等人(2013)J.Mol.Biol.,426:199-214)，或者可以以单
体或二聚体形式存在(Wu等人(2005)J.Biol.Chem.,280:23225-31；Lim等人(2010)
Biochemistry,50:8682-91)。
野生型链霉亲和素(wt-链霉亲和素)具有由Argarana等人,Nucleic Acids Res.14(1986)
1871-1882所披露的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。通常，链霉亲和素自然地作为四个相同亚
基的四聚体发生，即它是同源四聚体，其中每个亚基含有针对生物素、生物素衍生物或类似
物或生物素模拟物的单一结合位点。链霉亲和素亚基的示例性序列是在SEQ ID NO:1中所
示的氨基酸序列，但是这样的序列还可以包括在来自其他链霉菌属(Streptomyces)物种的
同源物中存在的序列。特别地，链霉亲和素的每个亚基可以展现对生物素的强结合亲和力，
解离常数(Kd)近似于约10-14M。在一些情况下，链霉亲和素可以作为其中四个结合位点中仅
有一个有功能的单价四聚体存在(Howarth等人(2006)Nat.Methods,3:267-73；Zhang等人
(2015)Biochem.Biophys.Res.Commun.,463:1059-63)、作为其中四个结合位点中的两个有
功能的二价四聚体存在(Fairhead等人(2013)J.Mol.Biol.,426:199-214)，或者可以以单
体或二聚体形式存在(Wu等人(2005)J.Biol.Chem.,280:23225-31；Lim等人(2010)
Biochemistry,50:8682-91)。
[0200] 在一些实施方案中，链霉亲和素可以是任何形式，如野生型或未经修饰的链霉亲和素，如来自链霉菌属物种的链霉亲和素或其功能活性片段，所述功能活性片段包括含有
针对所述药剂(例如链霉亲和素结合肽)和/或针对生物素、生物素衍生物或类似物或生物
素模拟物的结合位点的至少一个功能性亚基，例如通常含有在SEQ ID NO:1中所示的来自
阿维丁链霉菌(Streptomyces avidinii)的野生型链霉亲和素的至少一个功能性亚基或其
功能活性片段。例如，在一些实施方案中，链霉亲和素可以包括野生型链霉亲和素的片段，
所述片段在N末端和/或C末端被缩短。这种最小链霉亲和素包括在SEQ ID NO:1的氨基酸位
置10至16的区域中的N末端开始并且在SEQ ID NO:1的氨基酸位置133至142的区域中的C末
端终止的任何链霉亲和素。在一些实施方案中，链霉亲和素的功能活性片段含有在SEQ ID
NO:2中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，如在SEQ ID NO:2中所示的链霉亲和素可以
在对应于Ala13(其编号如SEQ ID NO:1中所示)的位置处进一步含有N末端甲硫氨酸。关于
链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白中残基的位置是参考在SEQ ID NO:1中残基的编号。
针对所述药剂(例如链霉亲和素结合肽)和/或针对生物素、生物素衍生物或类似物或生物
素模拟物的结合位点的至少一个功能性亚基，例如通常含有在SEQ ID NO:1中所示的来自
阿维丁链霉菌(Streptomyces avidinii)的野生型链霉亲和素的至少一个功能性亚基或其
功能活性片段。例如，在一些实施方案中，链霉亲和素可以包括野生型链霉亲和素的片段，
所述片段在N末端和/或C末端被缩短。这种最小链霉亲和素包括在SEQ ID NO:1的氨基酸位
置10至16的区域中的N末端开始并且在SEQ ID NO:1的氨基酸位置133至142的区域中的C末
端终止的任何链霉亲和素。在一些实施方案中，链霉亲和素的功能活性片段含有在SEQ ID
NO:2中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，如在SEQ ID NO:2中所示的链霉亲和素可以
在对应于Ala13(其编号如SEQ ID NO:1中所示)的位置处进一步含有N末端甲硫氨酸。关于
链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白中残基的位置是参考在SEQ ID NO:1中残基的编号。
[0201] 在一些方面，链霉亲和素突变蛋白包括如下多肽，所述多肽与未经修饰的或野生型链霉亲和素的序列区别一个或多个氨基酸取代、缺失或添加，但包括含有针对所述药剂
(例如链霉亲和素结合肽)和/或生物素、生物素衍生物或类似物或链霉亲和素结合肽的结
合位点的至少一个功能性亚基。在一些方面，链霉亲和素样多肽和链霉亲和素突变蛋白可
以是如下多肽，所述多肽本质上与野生型链霉亲和素是免疫学等同的，并且特别是能够以
与wt-链霉亲和素相同或不同的亲和力结合生物素、生物素衍生物或生物素类似物。在一些
情况下，链霉亲和素样多肽或链霉亲和素突变蛋白可以含有不是野生型链霉亲和素的一部
分的氨基酸，或者它们可以仅包括野生型链霉亲和素的一部分。在一些实施方案中，链霉亲
和素样多肽是与野生型链霉亲和素不相同的多肽，因为宿主不具有为了将宿主产生的多肽
转化为野生型链霉亲和素的结构所必需的酶。在一些实施方案中，链霉亲和素也可以作为
链霉亲和素四聚体和链霉亲和素二聚体(特别是链霉亲和素同源四聚体、链霉亲和素同源
二聚体、链霉亲和素异源四聚体和链霉亲和素异源二聚体)存在。通常，每个亚基通常具有
针对生物素或生物素类似物或针对链霉亲和素结合肽的结合位点。链霉亲和素或链霉亲和
素突变蛋白的例子在例如WO 86/02077、DE 19641876 Al、US 6,022,951、WO 98/40396或WO
96/24606中有提及。
(例如链霉亲和素结合肽)和/或生物素、生物素衍生物或类似物或链霉亲和素结合肽的结
合位点的至少一个功能性亚基。在一些方面，链霉亲和素样多肽和链霉亲和素突变蛋白可
以是如下多肽，所述多肽本质上与野生型链霉亲和素是免疫学等同的，并且特别是能够以
与wt-链霉亲和素相同或不同的亲和力结合生物素、生物素衍生物或生物素类似物。在一些
情况下，链霉亲和素样多肽或链霉亲和素突变蛋白可以含有不是野生型链霉亲和素的一部
分的氨基酸，或者它们可以仅包括野生型链霉亲和素的一部分。在一些实施方案中，链霉亲
和素样多肽是与野生型链霉亲和素不相同的多肽，因为宿主不具有为了将宿主产生的多肽
转化为野生型链霉亲和素的结构所必需的酶。在一些实施方案中，链霉亲和素也可以作为
链霉亲和素四聚体和链霉亲和素二聚体(特别是链霉亲和素同源四聚体、链霉亲和素同源
二聚体、链霉亲和素异源四聚体和链霉亲和素异源二聚体)存在。通常，每个亚基通常具有
针对生物素或生物素类似物或针对链霉亲和素结合肽的结合位点。链霉亲和素或链霉亲和
素突变蛋白的例子在例如WO 86/02077、DE 19641876 Al、US 6,022,951、WO 98/40396或WO
96/24606中有提及。
[0202] 在一些实施方案中，链霉亲和素突变蛋白可以含有不是未经修饰的或野生型链霉亲和素的一部分的氨基酸，或者可以仅包括野生型或未经修饰的链霉亲和素的一部分。在
一些实施方案中，链霉亲和素突变蛋白含有至少一个亚基，所述至少一个亚基与未经修饰
的或野生型链霉亲和素的亚基相比(例如与在SEQ ID NO:1中所示的野生型链霉亲和素亚
基或例如在SEQ ID NO:2中所示的其功能活性片段相比)可以具有一个或多个氨基酸取代
(置换)。在一些实施方案中，与野生型或未经修饰的链霉亲和素相比，链霉亲和素突变蛋白
的至少一个亚基可以具有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、
13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个氨基酸差异，和/或含有包含展现与SEQ ID NO:1或2中所示的氨基酸序列至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的至少一个亚基，其中此类链霉亲和素突变蛋白展现结合所述药剂(例如链霉亲和素结合肽)和/或生物素、
生物素衍生物或类似物或生物素模拟物的功能活性。在一些实施方案中，氨基酸置换(取
代)是保守的或非保守的突变。链霉亲和素突变蛋白的例子在本领域中是已知的，参见例如
美国专利号5,168,049；5,506,121；6,022,951；6,156,493；6,165,750；6,103,493；或6,
368,813；或国际公开的PCT申请号WO 2014/076277。
一些实施方案中，链霉亲和素突变蛋白含有至少一个亚基，所述至少一个亚基与未经修饰
的或野生型链霉亲和素的亚基相比(例如与在SEQ ID NO:1中所示的野生型链霉亲和素亚
基或例如在SEQ ID NO:2中所示的其功能活性片段相比)可以具有一个或多个氨基酸取代
(置换)。在一些实施方案中，与野生型或未经修饰的链霉亲和素相比，链霉亲和素突变蛋白
的至少一个亚基可以具有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、
13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个氨基酸差异，和/或含有包含展现与SEQ ID NO:1或2中所示的氨基酸序列至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的至少一个亚基，其中此类链霉亲和素突变蛋白展现结合所述药剂(例如链霉亲和素结合肽)和/或生物素、
生物素衍生物或类似物或生物素模拟物的功能活性。在一些实施方案中，氨基酸置换(取
代)是保守的或非保守的突变。链霉亲和素突变蛋白的例子在本领域中是已知的，参见例如
美国专利号5,168,049；5,506,121；6,022,951；6,156,493；6,165,750；6,103,493；或6,
368,813；或国际公开的PCT申请号WO 2014/076277。
[0203] 在一些实施方案中，链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白包括含有一个或多于一个功能性亚基(如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个，以及在一些情况下，5个、6个、
7个、8个、9个、10个、11个、12个或更多个功能性亚基)的蛋白质，所述功能性亚基含有针对
生物素、生物素衍生物或类似物或链霉亲和素结合肽的一个或多个结合位点Z。在一些实施
方案中，链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白可以包括单体；二聚体，包括异源二聚体或同源
二聚体；四聚体，包括同源四聚体、异源四聚体、单价四聚体或二价四聚体；或者可以包括更
高级的多聚体或其寡聚物。
7个、8个、9个、10个、11个、12个或更多个功能性亚基)的蛋白质，所述功能性亚基含有针对
生物素、生物素衍生物或类似物或链霉亲和素结合肽的一个或多个结合位点Z。在一些实施
方案中，链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白可以包括单体；二聚体，包括异源二聚体或同源
二聚体；四聚体，包括同源四聚体、异源四聚体、单价四聚体或二价四聚体；或者可以包括更
高级的多聚体或其寡聚物。
[0204] 在一些实施方案中，结合分子试剂是或含有链霉亲和素突变蛋白。在一些实施方案中，与在SEQ ID NO:1中所示的野生型链霉亲和素或其生物活性部分相比，链霉亲和素突
变蛋白含有一个或多个突变(例如氨基酸置换)。例如，链霉亲和素的生物活性部分可以包
括在N末端和/或C末端处被缩短的链霉亲和素变体，其在一些情况下被称为最小链霉亲和
素。在一些实施方案中，可以对其进行任何突变的N末端缩短的最小链霉亲和素，与在SEQ
ID NO:1中所示的序列相比，在氨基酸位置10至16的区域中的N末端开始并且在氨基酸位置
133至142的区域中的C末端终止。在一些实施方案中，可以对其进行任何突变的N末端缩短
的链霉亲和素，含有在SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，最小链霉亲
和素含有从位置Ala13至Ser139的氨基酸序列，并且任选地具有N末端甲硫氨酸残基而不是
Ala13。出于本文的目的，氨基酸位置的编号始终是指在SEQ ID NO:1中所示的wt-链霉亲和
素的编号(例如Argarana等人,Nucleic Acids Res.14(1986),1871-1882，还参见图3)。
变蛋白含有一个或多个突变(例如氨基酸置换)。例如，链霉亲和素的生物活性部分可以包
括在N末端和/或C末端处被缩短的链霉亲和素变体，其在一些情况下被称为最小链霉亲和
素。在一些实施方案中，可以对其进行任何突变的N末端缩短的最小链霉亲和素，与在SEQ
ID NO:1中所示的序列相比，在氨基酸位置10至16的区域中的N末端开始并且在氨基酸位置
133至142的区域中的C末端终止。在一些实施方案中，可以对其进行任何突变的N末端缩短
的链霉亲和素，含有在SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，最小链霉亲
和素含有从位置Ala13至Ser139的氨基酸序列，并且任选地具有N末端甲硫氨酸残基而不是
Ala13。出于本文的目的，氨基酸位置的编号始终是指在SEQ ID NO:1中所示的wt-链霉亲和
素的编号(例如Argarana等人,Nucleic Acids Res.14(1986),1871-1882，还参见图3)。
[0205] 在一些实施方案中，链霉亲和素突变蛋白是如在美国专利号6,103,493中所描述的突变体。在一些实施方案中，基于野生型链霉亲和素的氨基酸序列(如在SEQ ID NO:1中
所示的)，链霉亲和素突变蛋白在氨基酸位置44至53的区域内含有至少一个突变。在一些实
施方案中，链霉亲和素突变蛋白在一个或多个残基44、45、46和/或47处含有突变。在一些实
施方案中，链霉亲和素突变蛋白含有疏水性脂肪族氨基酸(例如Val、Ala、Ile或Leu)对野生
型链霉亲和素的位置44处的Glu的置换，位置45处的任何氨基酸，位置46处的脂肪族氨基酸
(如疏水性脂肪族氨基酸)，和/或碱性氨基酸(例如Arg或Lys，如通常Arg)对位置47处的Val
的置换。在一些实施方案中，Ala处于位置46和/或Arg处于位置47和/或Val或Ile处于位置
44。在一些实施方案中，链霉亲和素突变体含有残基Val44-Thr45-Ala46-Arg47，例如在含有
SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的示例性链霉亲和素突变蛋白中所示的
(也称为链霉亲和素突变体1，SAM1)。在一些实施方案中，链霉亲和素突变蛋白含有残基
Ile44-Gly45-Ala46-Arg47，例如在含有SEQ ID NO:5或6中所示的氨基酸序列的示例性链霉亲
和素突变蛋白中所示的(也称为SAM2)。在一些情况下，这种链霉亲和素突变蛋白描述于例
如美国专利6,103,493中，并且可以在商标Strep- 下商购获得。
所示的)，链霉亲和素突变蛋白在氨基酸位置44至53的区域内含有至少一个突变。在一些实
施方案中，链霉亲和素突变蛋白在一个或多个残基44、45、46和/或47处含有突变。在一些实
施方案中，链霉亲和素突变蛋白含有疏水性脂肪族氨基酸(例如Val、Ala、Ile或Leu)对野生
型链霉亲和素的位置44处的Glu的置换，位置45处的任何氨基酸，位置46处的脂肪族氨基酸
(如疏水性脂肪族氨基酸)，和/或碱性氨基酸(例如Arg或Lys，如通常Arg)对位置47处的Val
的置换。在一些实施方案中，Ala处于位置46和/或Arg处于位置47和/或Val或Ile处于位置
44。在一些实施方案中，链霉亲和素突变体含有残基Val44-Thr45-Ala46-Arg47，例如在含有
SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的示例性链霉亲和素突变蛋白中所示的
(也称为链霉亲和素突变体1，SAM1)。在一些实施方案中，链霉亲和素突变蛋白含有残基
Ile44-Gly45-Ala46-Arg47，例如在含有SEQ ID NO:5或6中所示的氨基酸序列的示例性链霉亲
和素突变蛋白中所示的(也称为SAM2)。在一些情况下，这种链霉亲和素突变蛋白描述于例
如美国专利6,103,493中，并且可以在商标Strep- 下商购获得。
[0206] 在一些实施方案中，链霉亲和素突变蛋白是如在国际公开的PCT申请号WO 2014/076277中所描述的突变体。在一些实施方案中，参考在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置，
链霉亲和素突变蛋白在氨基酸位置44至53的区域中含有至少两个半胱氨酸残基。在一些实
施方案中，所述半胱氨酸残基存在于位置45和52，以产生连接这些氨基酸的二硫桥。在这样
的实施方案中，氨基酸44通常是甘氨酸或丙氨酸，并且氨基酸46通常是丙氨酸或甘氨酸，并
且氨基酸47通常是精氨酸。在一些实施方案中，参考在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置，
链霉亲和素突变蛋白在氨基酸残基115至121的区域中含有至少一个突变或氨基酸差异。在
一些实施方案中，链霉亲和素突变蛋白含有在氨基酸位置117、120和121处的至少一个突
变、和/或氨基酸118和119的缺失以及至少氨基酸位置121的取代。
链霉亲和素突变蛋白在氨基酸位置44至53的区域中含有至少两个半胱氨酸残基。在一些实
施方案中，所述半胱氨酸残基存在于位置45和52，以产生连接这些氨基酸的二硫桥。在这样
的实施方案中，氨基酸44通常是甘氨酸或丙氨酸，并且氨基酸46通常是丙氨酸或甘氨酸，并
且氨基酸47通常是精氨酸。在一些实施方案中，参考在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置，
链霉亲和素突变蛋白在氨基酸残基115至121的区域中含有至少一个突变或氨基酸差异。在
一些实施方案中，链霉亲和素突变蛋白含有在氨基酸位置117、120和121处的至少一个突
变、和/或氨基酸118和119的缺失以及至少氨基酸位置121的取代。
[0207] 在一些实施方案中，链霉亲和素突变蛋白在与位置117对应的位置处含有突变，所述突变可以是大的疏水性残基像Trp、Tyr或Phe，或者带电残基像Glu、Asp或Arg，或者亲水
性残基像Asn或Gin，或者在一些情况下，疏水性残基Leu、Met或Ala，或者极性残基Thr、Ser
或His。在一些实施方案中，位置117处的突变与以下突变组合：与位置120对应的位置处的
突变(所述突变可以是突变为小的残基像Ser或Ala或Gly)，以及与位置121对应的位置处的
突变(所述突变可以是突变为疏水性残基，如庞大的疏水性残基像Trp、Tyr或Phe)。在一些
实施方案中，在位置117处的突变与以下突变组合：与在SEQ ID NO:1中所示的野生型链霉
亲和素或其生物活性片段的位置120对应的位置处的突变(所述突变可以是疏水性残基如
Leu、Ile、Met或Val，或通常Tyr或Phe)，以及与在SEQ ID NO:1中所示的野生型链霉亲和素
或其生物活性片段的位置相比的位置121对应的位置处的突变(所述突变可以是突变为小
的残基像Gly、Ala或Ser，或突变为Gln，或突变为疏水性残基像Leu、Val、Ile、Trp、Tyr、Phe或Met)。在一些实施方案中，此类突变蛋白还可以含有残基Val44-Thr45-Ala46-Arg47或残
基Ile44-Gly45-Ala46-Arg47。在一些实施方案中，链霉亲和素突变蛋白含有残基Val44、
Thr45、Ala46、Arg47、Glu117、Gly120和Tyr121。在一些实施方案中，突变蛋白链霉亲和素含有在SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28中所示的氨基酸序列或展现与在SEQ ID NO:27或SEQID
NO:28中所示的氨基酸序列至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列，含有残基Val44、Thr45、Ala46、Arg47、Glu117、Gly120和Tyr121，并且展现结合生物素、生物素类似物或链霉亲和素结合肽的功能活性。
性残基像Asn或Gin，或者在一些情况下，疏水性残基Leu、Met或Ala，或者极性残基Thr、Ser
或His。在一些实施方案中，位置117处的突变与以下突变组合：与位置120对应的位置处的
突变(所述突变可以是突变为小的残基像Ser或Ala或Gly)，以及与位置121对应的位置处的
突变(所述突变可以是突变为疏水性残基，如庞大的疏水性残基像Trp、Tyr或Phe)。在一些
实施方案中，在位置117处的突变与以下突变组合：与在SEQ ID NO:1中所示的野生型链霉
亲和素或其生物活性片段的位置120对应的位置处的突变(所述突变可以是疏水性残基如
Leu、Ile、Met或Val，或通常Tyr或Phe)，以及与在SEQ ID NO:1中所示的野生型链霉亲和素
或其生物活性片段的位置相比的位置121对应的位置处的突变(所述突变可以是突变为小
的残基像Gly、Ala或Ser，或突变为Gln，或突变为疏水性残基像Leu、Val、Ile、Trp、Tyr、Phe或Met)。在一些实施方案中，此类突变蛋白还可以含有残基Val44-Thr45-Ala46-Arg47或残
基Ile44-Gly45-Ala46-Arg47。在一些实施方案中，链霉亲和素突变蛋白含有残基Val44、
Thr45、Ala46、Arg47、Glu117、Gly120和Tyr121。在一些实施方案中，突变蛋白链霉亲和素含有在SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28中所示的氨基酸序列或展现与在SEQ ID NO:27或SEQID
NO:28中所示的氨基酸序列至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列，含有残基Val44、Thr45、Ala46、Arg47、Glu117、Gly120和Tyr121，并且展现结合生物素、生物素类似物或链霉亲和素结合肽的功能活性。
[0208] 在一些实施方案中，链霉亲和素突变蛋白可以含有以任何组合的任何上述突变，并且所得的链霉亲和素突变蛋白可以展现KD为小于2.7 x 10-4M的对链霉亲和素结合肽(如
包含氨基酸Trp Arg His Pro Gln Phe Gly Gly的一种链霉亲和素结合肽；也称为Strep-
(在SEQ ID NO:7中所示))的结合亲和力，和/或KD为小于1.4 x 10-4M的对链霉亲和
素结合肽(如包含氨基酸Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys的一种链霉亲和素结合肽；也
称为Strep- II(在SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:58中所示))的结合亲和力，和/或KD为
小于1 x 10-4M、5 x 10-4M、1 x 10-5M、5x 10-5M、1 x 10-6M、5 x 10-6M或1 x 10-7M，但通常大于1 x 10-13M、1 x 10-12M或1 x 10-11M的对在SEQ ID NO:7-19或58中任一个中所示的链霉
亲和素结合肽中任一个的结合亲和力。
包含氨基酸Trp Arg His Pro Gln Phe Gly Gly的一种链霉亲和素结合肽；也称为Strep-
(在SEQ ID NO:7中所示))的结合亲和力，和/或KD为小于1.4 x 10-4M的对链霉亲和
素结合肽(如包含氨基酸Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys的一种链霉亲和素结合肽；也
称为Strep- II(在SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:58中所示))的结合亲和力，和/或KD为
小于1 x 10-4M、5 x 10-4M、1 x 10-5M、5x 10-5M、1 x 10-6M、5 x 10-6M或1 x 10-7M，但通常大于1 x 10-13M、1 x 10-12M或1 x 10-11M的对在SEQ ID NO:7-19或58中任一个中所示的链霉
亲和素结合肽中任一个的结合亲和力。
[0209] 在一些实施方案中，链霉亲和素突变蛋白展现在SEQ ID NO:3-6、27或28中任一个中所示的氨基酸序列，或与在SEQ ID NO:3-6、27或28中任一个中所示的氨基酸序列展现至
少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序-4
列，并且展现KD为小于2.7 x 10 M的对链霉亲和素结合肽(如包含氨基酸Trp Arg His Pro
Gln Phe Gly Gly的一种链霉亲和素结合肽；也称为Strep- (在SEQ ID NO:7中所
示))的结合亲和力，和/或KD为小于1.4 x 10-4M的对链霉亲和素结合肽(如包含氨基酸Trp
Ser His Pro Gln Phe Glu Lys的一种链霉亲和素结合肽；也称为Strep- II(在SEQ
ID NO:8或58中所示))的结合亲和力，和/或KD为小于1 x 10-4M、5 x 10-4M、1 x 10-5M、5x
10-5M、1 x 10-6M、5 x 10-6M或1 x 10-7M，但通常大于1 x 10-13M、1 x 10-12M或1 x 10-11M的对在SEQ ID NO:7-19或58中任一个中所示的肽配体中任一个的结合亲和力。
少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序-4
列，并且展现KD为小于2.7 x 10 M的对链霉亲和素结合肽(如包含氨基酸Trp Arg His Pro
Gln Phe Gly Gly的一种链霉亲和素结合肽；也称为Strep- (在SEQ ID NO:7中所
示))的结合亲和力，和/或KD为小于1.4 x 10-4M的对链霉亲和素结合肽(如包含氨基酸Trp
Ser His Pro Gln Phe Glu Lys的一种链霉亲和素结合肽；也称为Strep- II(在SEQ
ID NO:8或58中所示))的结合亲和力，和/或KD为小于1 x 10-4M、5 x 10-4M、1 x 10-5M、5x
10-5M、1 x 10-6M、5 x 10-6M或1 x 10-7M，但通常大于1 x 10-13M、1 x 10-12M或1 x 10-11M的对在SEQ ID NO:7-19或58中任一个中所示的肽配体中任一个的结合亲和力。
[0210] 在一些实施方案中，链霉亲和素突变蛋白还展现与其他链霉亲和素配体(例如但不限于生物素、亚氨基生物素、硫辛酸、脱硫生物素、二氨基生物素、HABA(羟基偶氮苯-苯甲
酸)和/或二甲基-HABA)的结合。在一些实施方案中，链霉亲和素突变蛋白展现对另一种链
霉亲和素配体(如生物素或脱硫生物素)的结合亲和力，所述结合亲和力大于所述链霉亲和
素突变蛋白对链霉亲和素肽配体(如在SEQ ID NO:7-19或58中任一个中所示的)的结合亲
和力。因此，在一些实施方案中，生物素或生物素类似物或衍生物(例如脱硫生物素)可以用
作所提供的方法中的竞争试剂。例如，作为例子，命名为Strep- 的突变蛋白链霉亲和
素(例如含有在SEQ ID NO:4中所示的序列)与命名为Strep- II的链霉亲和素肽(例
如含有SEQ ID NO:8或58中所示的氨基酸)的相互作用由KD为大约10-6M的结合亲和力表征，
相比之下对于生物素-链霉亲和素相互作用的KD为大约10-13M。在一些情况下，能够以KD在或
在约10-10与10-13M之间的高亲和力结合Strep- 的生物素可以与Strep- II竞
争结合位点。
酸)和/或二甲基-HABA)的结合。在一些实施方案中，链霉亲和素突变蛋白展现对另一种链
霉亲和素配体(如生物素或脱硫生物素)的结合亲和力，所述结合亲和力大于所述链霉亲和
素突变蛋白对链霉亲和素肽配体(如在SEQ ID NO:7-19或58中任一个中所示的)的结合亲
和力。因此，在一些实施方案中，生物素或生物素类似物或衍生物(例如脱硫生物素)可以用
作所提供的方法中的竞争试剂。例如，作为例子，命名为Strep- 的突变蛋白链霉亲和
素(例如含有在SEQ ID NO:4中所示的序列)与命名为Strep- II的链霉亲和素肽(例
如含有SEQ ID NO:8或58中所示的氨基酸)的相互作用由KD为大约10-6M的结合亲和力表征，
相比之下对于生物素-链霉亲和素相互作用的KD为大约10-13M。在一些情况下，能够以KD在或
在约10-10与10-13M之间的高亲和力结合Strep- 的生物素可以与Strep- II竞
争结合位点。
[0211] 在一些实施方案中，结合分子是如下试剂，所述试剂是一种或多种链霉亲和素或抗生物素蛋白、或链霉亲和素的任何类似物或突变蛋白、或抗生物素蛋白的类似物或突变
蛋白(例如中性抗生物素蛋白)的寡聚物或聚合物。在一些实施方案中，所述寡聚物由相同
链霉亲和素、链霉亲和素突变蛋白、抗生物素蛋白或抗生物素蛋白突变蛋白的多个单个分
子(例如多个同源四聚体)生成或产生，在这种情况下，所述寡聚物的每个结合位点Z(例如
Z1)是相同的。
蛋白(例如中性抗生物素蛋白)的寡聚物或聚合物。在一些实施方案中，所述寡聚物由相同
链霉亲和素、链霉亲和素突变蛋白、抗生物素蛋白或抗生物素蛋白突变蛋白的多个单个分
子(例如多个同源四聚体)生成或产生，在这种情况下，所述寡聚物的每个结合位点Z(例如
Z1)是相同的。
[0212] 在一些实施方案中，结合分子试剂是一种或多种链霉亲和素或抗生物素蛋白、或链霉亲和素的任何类似物或突变蛋白、或抗生物素蛋白的类似物或突变蛋白(例如中性抗
生物素蛋白)的寡聚物或聚合物。在一些实施方案中，所述寡聚物由相同链霉亲和素、链霉
亲和素突变蛋白、抗生物素蛋白或抗生物素蛋白突变蛋白的多个单个分子(例如多个同源
四聚体)生成或产生，在这种情况下，所述寡聚物的每个结合位点Z(例如Z1)是相同的。例
如，在一些情况下，寡聚物可以含有多个结合位点Z1，如至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、
24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、40个、45个、50个或更多个结合位点Z1。在一些实施方案中，寡聚物生成或产生自多个单个分子，所述多个单个
分子可以是链霉亲和素、链霉亲和素突变蛋白、抗生物素蛋白或抗生物素蛋白突变蛋白的
异源四聚体，和/或生成或产生自多个的两个或更多个不同的单个分子(例如，链霉亲和素、
链霉亲和素突变蛋白、抗生物素蛋白或抗生物素蛋白突变蛋白的不同的同源四聚体)，所述
两个或更多个不同的单个分子在它们的结合位点Z(例如Z1和Z2)方面不同，在这种情况下
多个不同的结合位点Z(例如Z1和Z2)可以存在于所述寡聚物中。例如，在一些情况下，寡聚
物可以含有多个结合位点Z1和多个结合位点Z2，其组合可以包括至少2个、3个、4个、5个、6
个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、40个、45个、50个或更多个组合的结合位点Z1和Z2。
生物素蛋白)的寡聚物或聚合物。在一些实施方案中，所述寡聚物由相同链霉亲和素、链霉
亲和素突变蛋白、抗生物素蛋白或抗生物素蛋白突变蛋白的多个单个分子(例如多个同源
四聚体)生成或产生，在这种情况下，所述寡聚物的每个结合位点Z(例如Z1)是相同的。例
如，在一些情况下，寡聚物可以含有多个结合位点Z1，如至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、
24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、40个、45个、50个或更多个结合位点Z1。在一些实施方案中，寡聚物生成或产生自多个单个分子，所述多个单个
分子可以是链霉亲和素、链霉亲和素突变蛋白、抗生物素蛋白或抗生物素蛋白突变蛋白的
异源四聚体，和/或生成或产生自多个的两个或更多个不同的单个分子(例如，链霉亲和素、
链霉亲和素突变蛋白、抗生物素蛋白或抗生物素蛋白突变蛋白的不同的同源四聚体)，所述
两个或更多个不同的单个分子在它们的结合位点Z(例如Z1和Z2)方面不同，在这种情况下
多个不同的结合位点Z(例如Z1和Z2)可以存在于所述寡聚物中。例如，在一些情况下，寡聚
物可以含有多个结合位点Z1和多个结合位点Z2，其组合可以包括至少2个、3个、4个、5个、6
个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、40个、45个、50个或更多个组合的结合位点Z1和Z2。
[0213] 在一些情况下，相应的寡聚物或聚合物可以通过多糖交联。在一个实施方案中，链霉亲和素或抗生物素蛋白或者链霉亲和素或抗生物素蛋白的类似物(例如中性抗生物素蛋
白)的寡聚物或聚合物可以通过如下来制备：在第一步骤中将羧基残基引入多糖(例如葡聚
糖)中，基本上如在Noguchi,A等人Bioconjugate Chemistry(1992)3,132-137中所描述的。
在一些此类方面，然后可以在第二步骤中使用常规碳二亚胺化学将链霉亲和素或抗生物素
蛋白或其类似物经由内部赖氨酸残基的伯氨基基团和/或游离N末端与葡聚糖骨架中的羧
基基团连接。在一些情况下，链霉亲和素或抗生物素蛋白或者链霉亲和素或抗生物素蛋白
的任何类似物的交联寡聚物或聚合物还可以通过经由双功能分子(用作接头)如戊二醛交
联或者通过本领域中描述的其他方法获得。
白)的寡聚物或聚合物可以通过如下来制备：在第一步骤中将羧基残基引入多糖(例如葡聚
糖)中，基本上如在Noguchi,A等人Bioconjugate Chemistry(1992)3,132-137中所描述的。
在一些此类方面，然后可以在第二步骤中使用常规碳二亚胺化学将链霉亲和素或抗生物素
蛋白或其类似物经由内部赖氨酸残基的伯氨基基团和/或游离N末端与葡聚糖骨架中的羧
基基团连接。在一些情况下，链霉亲和素或抗生物素蛋白或者链霉亲和素或抗生物素蛋白
的任何类似物的交联寡聚物或聚合物还可以通过经由双功能分子(用作接头)如戊二醛交
联或者通过本领域中描述的其他方法获得。
[0214] 在一些实施方案中，寡聚物或聚合物通过使用双功能接头或其他化学接头(如戊二醛)交联单个分子或构成单个分子的亚基的复合物或者通过本领域已知的其他方法获
得。在一些方面，链霉亲和素或抗生物素蛋白或者链霉亲和素或抗生物素蛋白的任何突变
蛋白或类似物的交联寡聚物或聚合物可以通过经由双功能分子(用作接头)如戊二醛交联
单个链霉亲和素或抗生物素蛋白分子或通过本领域中描述的其他方法获得。例如，有可能
通过将硫醇基团引入链霉亲和素突变蛋白(例如，这可以通过使链霉亲和素突变蛋白与2-
亚氨基硫杂环戊烷(Trauts试剂)反应并且通过例如在单独的反应中激活在链霉亲和素突
变蛋白中可用的氨基基团来进行)来生成链霉亲和素突变蛋白的寡聚物。在一些实施方案
中，氨基基团的这种激活可以通过使链霉亲和素突变蛋白与可商购获得的异双功能交联剂
(如磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-甲酸酯(磺基SMCC)或琥珀酰亚胺
基-6-(β-马来酰亚胺丙酰胺基)己酸酯(SMPH))的反应来实现。在一些此类实施方案中，将
如此获得的两种反应产物混合在一起，通常导致在一批经修饰的链霉亲和素突变蛋白中包
含的硫醇基团与另一批经修饰的链霉亲和素突变蛋白的激活的(如通过马来酰亚胺官能
团)氨基酸反应。在一些情况下，通过这一反应，形成链霉亲和素突变蛋白的多聚体/寡聚
物。这些寡聚物可以具有任何合适数量的单个分子，如至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、
24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、40个、45个、50个或更多个，并且寡聚化程度可以根据反应条件而改变。
得。在一些方面，链霉亲和素或抗生物素蛋白或者链霉亲和素或抗生物素蛋白的任何突变
蛋白或类似物的交联寡聚物或聚合物可以通过经由双功能分子(用作接头)如戊二醛交联
单个链霉亲和素或抗生物素蛋白分子或通过本领域中描述的其他方法获得。例如，有可能
通过将硫醇基团引入链霉亲和素突变蛋白(例如，这可以通过使链霉亲和素突变蛋白与2-
亚氨基硫杂环戊烷(Trauts试剂)反应并且通过例如在单独的反应中激活在链霉亲和素突
变蛋白中可用的氨基基团来进行)来生成链霉亲和素突变蛋白的寡聚物。在一些实施方案
中，氨基基团的这种激活可以通过使链霉亲和素突变蛋白与可商购获得的异双功能交联剂
(如磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-甲酸酯(磺基SMCC)或琥珀酰亚胺
基-6-(β-马来酰亚胺丙酰胺基)己酸酯(SMPH))的反应来实现。在一些此类实施方案中，将
如此获得的两种反应产物混合在一起，通常导致在一批经修饰的链霉亲和素突变蛋白中包
含的硫醇基团与另一批经修饰的链霉亲和素突变蛋白的激活的(如通过马来酰亚胺官能
团)氨基酸反应。在一些情况下，通过这一反应，形成链霉亲和素突变蛋白的多聚体/寡聚
物。这些寡聚物可以具有任何合适数量的单个分子，如至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、
24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、40个、45个、50个或更多个，并且寡聚化程度可以根据反应条件而改变。
[0215] 在一些实施方案中，可以经由尺寸排阻色谱法分离寡聚物或聚合物试剂，并且可以使用任何所希望的级分作为结合分子试剂。例如，在一些实施方案中，在2-亚氨基硫杂环
戊烷和异双功能交联剂(如磺基SMCC)的存在下，使经修饰的的链霉亲和素突变蛋白反应之
后，可以经由尺寸排阻色谱法分离寡聚物或聚合物试剂，并且可以使用任何所希望的级分
作为所述试剂。在一些实施方案中，寡聚物不具有(并且不需要具有)单一分子量，但是它们
可以观察到统计权重分布，如高斯分布。在一些情况下，可以将具有多于三个链霉亲和素或
突变蛋白四聚体(例如同源四聚体或异源四聚体)的任何寡聚物用作可溶性试剂，例如通常
3个至50个四聚体(例如同源四聚体或异源四聚体)、10个至40个四聚体(例如，同源四聚体
或异源四聚体)、或25个至35个四聚体(例如同源四聚体或异源四聚体)。寡聚物可以具有例
如从3个至25个链霉亲和素突变蛋白四聚体，例如同源四聚体或异源四聚体。在一些方面，
在链霉亲和素突变蛋白的分子量为约50kDa的情况下，可溶性寡聚物可以具有如下的分子
量：从约150kDa至约2000kDa、约150kDa至约1500kDa、约150kDa至约1250kDa、约150kDa至
1000kDa、约150kDa至约500kDa或约150kDa至约300kDa、约300kDa至约2000kDa、约300kDa至
约1500kDa、约300kDa至约1250kDa、约300kDa至1000kDa、约300kDa至约500kDa、约500kDa至
约2000kDa、约500kDa至约1500kDa、约500kDa至约1250kDa、约500kDa至1000kDa、约1000kDa
至约2000kDa、约1000kDa至约1500kDa、约1000kDa至约1250kDa、约1250kDa至约2000kDa或
约1500kDa至约2000kDa。通常，因为每个链霉亲和素分子/突变蛋白具有四个生物素结合位
点，所以这样的试剂可以提供12个至160个结合位点Z，如12个至100个结合位点Z。
戊烷和异双功能交联剂(如磺基SMCC)的存在下，使经修饰的的链霉亲和素突变蛋白反应之
后，可以经由尺寸排阻色谱法分离寡聚物或聚合物试剂，并且可以使用任何所希望的级分
作为所述试剂。在一些实施方案中，寡聚物不具有(并且不需要具有)单一分子量，但是它们
可以观察到统计权重分布，如高斯分布。在一些情况下，可以将具有多于三个链霉亲和素或
突变蛋白四聚体(例如同源四聚体或异源四聚体)的任何寡聚物用作可溶性试剂，例如通常
3个至50个四聚体(例如同源四聚体或异源四聚体)、10个至40个四聚体(例如，同源四聚体
或异源四聚体)、或25个至35个四聚体(例如同源四聚体或异源四聚体)。寡聚物可以具有例
如从3个至25个链霉亲和素突变蛋白四聚体，例如同源四聚体或异源四聚体。在一些方面，
在链霉亲和素突变蛋白的分子量为约50kDa的情况下，可溶性寡聚物可以具有如下的分子
量：从约150kDa至约2000kDa、约150kDa至约1500kDa、约150kDa至约1250kDa、约150kDa至
1000kDa、约150kDa至约500kDa或约150kDa至约300kDa、约300kDa至约2000kDa、约300kDa至
约1500kDa、约300kDa至约1250kDa、约300kDa至1000kDa、约300kDa至约500kDa、约500kDa至
约2000kDa、约500kDa至约1500kDa、约500kDa至约1250kDa、约500kDa至1000kDa、约1000kDa
至约2000kDa、约1000kDa至约1500kDa、约1000kDa至约1250kDa、约1250kDa至约2000kDa或
约1500kDa至约2000kDa。通常，因为每个链霉亲和素分子/突变蛋白具有四个生物素结合位
点，所以这样的试剂可以提供12个至160个结合位点Z，如12个至100个结合位点Z。
[0216] 在一些实施方案中，结合分子试剂，如任何描述的链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白(例如Strep- )试剂，可以用一种或多种可检测标记进行标记。在一些实施方案
中，将所述试剂用荧光标记进行标记。示例性标记的Strep- 试剂是已知的，或可商
购获得，包括例如Strep-Tactin-HRP、Strep-Tactin AP、Strep-Tactin Chromeo 488、
Strep-Tactin Chromeo 546、或Strep-Tactin Oyster 645，每种都可获自IBA(Goettingen
Germany)。
中，将所述试剂用荧光标记进行标记。示例性标记的Strep- 试剂是已知的，或可商
购获得，包括例如Strep-Tactin-HRP、Strep-Tactin AP、Strep-Tactin Chromeo 488、
Strep-Tactin Chromeo 546、或Strep-Tactin Oyster 645，每种都可获自IBA(Goettingen
Germany)。
[0217] 在一些实施方案中，链霉亲和素结合肽(例如Strep-标签，如Strep- II或双-Strep-标签)可以由抗体或抗原结合片段识别。在一些实施方案中，所述抗体含有可以
特异性结合细胞表面缀合物的药剂的表位或区域的至少一个结合位点。针对此类链霉亲和
素结合肽的抗体是已知的，包括针对例如存在于Strep- II或双-Strep-标签中的肽
序列SAWSHPQFEK(SEQ ID NO:58)或最小序列WSHPQFEK(SEQ ID NO:8)的抗体(Schmidt T.
和Skerra A.,Nature protocols,2007；国际专利申请公开号WO2015067768)。在一些实施
方案中，可以使用例如可商购获得的StrepMAB-Classic(IBA,Goettingen Germany)、
StrepMAB-lmmo(IBA)、抗Strep标签II抗体(Genscript)、或Strep-标签抗体(Qiagen)来检
测链霉亲和素结合肽(例如Strep-标签，如Strep- II或双-Strep-标签)。在一些实
施方案中，将所述抗体或结合配偶体用一种或多种可检测标记进行标记，以促进工程化细
胞的纯化、选择和/或检测。例如，分离可以基于与荧光标记的抗体的结合。
特异性结合细胞表面缀合物的药剂的表位或区域的至少一个结合位点。针对此类链霉亲和
素结合肽的抗体是已知的，包括针对例如存在于Strep- II或双-Strep-标签中的肽
序列SAWSHPQFEK(SEQ ID NO:58)或最小序列WSHPQFEK(SEQ ID NO:8)的抗体(Schmidt T.
和Skerra A.,Nature protocols,2007；国际专利申请公开号WO2015067768)。在一些实施
方案中，可以使用例如可商购获得的StrepMAB-Classic(IBA,Goettingen Germany)、
StrepMAB-lmmo(IBA)、抗Strep标签II抗体(Genscript)、或Strep-标签抗体(Qiagen)来检
测链霉亲和素结合肽(例如Strep-标签，如Strep- II或双-Strep-标签)。在一些实
施方案中，将所述抗体或结合配偶体用一种或多种可检测标记进行标记，以促进工程化细
胞的纯化、选择和/或检测。例如，分离可以基于与荧光标记的抗体的结合。
[0218] C.示例性缀合物
[0219] 在一些实施方案中，缀合物含有经修饰的EGFR和能够结合链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白的至少一种药剂(例如亲和标签)。在一些实施方案中，经修饰的EGFR是如上所
述的任何一种，如在SEQ ID NO:46中所示的EGFRt。在一些实施方案中，缀合物含有经修饰
的HER2和能够结合链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白的至少一种药剂(例如亲和标签)。在
一些实施方案中，经修饰的HER2/neu/ErbB2是如上所述的任何一种，如在SEQ ID NO:92中
所示的HER2t。在一些此类实施方案中，所述药剂是链霉亲和素结合肽，如Strep-
Strep- II或双-Strep-标签，包括上面描述的和在SEQ ID NO:7、8、15-19或58中所
示的任何一种。
述的任何一种，如在SEQ ID NO:46中所示的EGFRt。在一些实施方案中，缀合物含有经修饰
的HER2和能够结合链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白的至少一种药剂(例如亲和标签)。在
一些实施方案中，经修饰的HER2/neu/ErbB2是如上所述的任何一种，如在SEQ ID NO:92中
所示的HER2t。在一些此类实施方案中，所述药剂是链霉亲和素结合肽，如Strep-
Strep- II或双-Strep-标签，包括上面描述的和在SEQ ID NO:7、8、15-19或58中所
示的任何一种。
[0220] 在一些实施方案中，链霉亲和素结合肽与细胞表面分子的N末端部分融合。在一些实施方案中，所提供的细胞表面缀合物包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列含有其中从N
末端至C末端顺序包含以下的氨基酸残基：链霉亲和素结合肽(例如Strep- Strep-
II或双-Strep-标签，如在SEQ ID NO:7、8、15-19或58中任一个中所示的)和经修饰
的EGFR(例如EGFRt，如在SEQ ID NO:46中所示的)。在一些情形中，链霉亲和素结合肽直接
与经修饰的EGFR融合。在一些情形中，链霉亲和素结合肽间接与经修饰的EGFR融合或连接，
例如经由如所描述的至少一个多肽接头(例如，在SEQ ID NO:55、56、59-62、98或99中任一
个中所示的)。例如，在一些方面，链霉亲和素结合肽与附着于经修饰的EGFR上的第一多肽
接头连接。在一些方面，含有EGFRt和链霉亲和素结合肽的细胞表面缀合物是融合蛋白。
末端至C末端顺序包含以下的氨基酸残基：链霉亲和素结合肽(例如Strep- Strep-
II或双-Strep-标签，如在SEQ ID NO:7、8、15-19或58中任一个中所示的)和经修饰
的EGFR(例如EGFRt，如在SEQ ID NO:46中所示的)。在一些情形中，链霉亲和素结合肽直接
与经修饰的EGFR融合。在一些情形中，链霉亲和素结合肽间接与经修饰的EGFR融合或连接，
例如经由如所描述的至少一个多肽接头(例如，在SEQ ID NO:55、56、59-62、98或99中任一
个中所示的)。例如，在一些方面，链霉亲和素结合肽与附着于经修饰的EGFR上的第一多肽
接头连接。在一些方面，含有EGFRt和链霉亲和素结合肽的细胞表面缀合物是融合蛋白。
[0221] 在一些实施方案中，所提供的细胞表面缀合物包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列含有其中从N末端至C末端顺序包含以下的氨基酸残基：链霉亲和素结合肽(例如
Strep- Strep- II或双-Strep-标签，如在SEQ ID NO:7、8、15-19或58中任一
个中所示的)和经修饰的HER2/neu/ErbB2(例如HEr2t，如在SEQ ID NO:92中所示的)。在一
些情形中，链霉亲和素结合肽直接与经修饰的HER2/neu/ErbB2融合。在一些情形中，链霉亲
和素结合肽间接与经修饰的EGFR融合或连接，例如经由如所描述的至少一个多肽接头(例
如，在SEQ ID NO:55、56、59-62、98或99中任一个中所示的)。例如，在一些方面，链霉亲和素结合肽与附着于经修饰的HER2/neu/ErbB2上的第一多肽接头连接。在一些方面，含有HER2t
和链霉亲和素结合肽的细胞表面缀合物是融合蛋白。
Strep- Strep- II或双-Strep-标签，如在SEQ ID NO:7、8、15-19或58中任一
个中所示的)和经修饰的HER2/neu/ErbB2(例如HEr2t，如在SEQ ID NO:92中所示的)。在一
些情形中，链霉亲和素结合肽直接与经修饰的HER2/neu/ErbB2融合。在一些情形中，链霉亲
和素结合肽间接与经修饰的EGFR融合或连接，例如经由如所描述的至少一个多肽接头(例
如，在SEQ ID NO:55、56、59-62、98或99中任一个中所示的)。例如，在一些方面，链霉亲和素结合肽与附着于经修饰的HER2/neu/ErbB2上的第一多肽接头连接。在一些方面，含有HER2t
和链霉亲和素结合肽的细胞表面缀合物是融合蛋白。
[0222] 在一些实施方案中，所述缀合物按N末端至C末端顺序包含：(1)至少一种药剂(例如Strep- )，所述至少一种药剂具有在SEQ ID NO:8、15-19或58中任一个中所示的
氨基酸序列或与SEQ ID NO:8、15-19或58中任一个至少或至少约85％、86％、87％、88％、
89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列；(2)任选地，至少一个肽接头，如在SEQ ID NO:55、56、59-62、98或99中所示的肽接头；以及(3)经
修饰的EGFR，所述经修饰的EGFR具有在SEQ ID NO:46中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:
46至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％序列同一性的序列。
氨基酸序列或与SEQ ID NO:8、15-19或58中任一个至少或至少约85％、86％、87％、88％、
89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列；(2)任选地，至少一个肽接头，如在SEQ ID NO:55、56、59-62、98或99中所示的肽接头；以及(3)经
修饰的EGFR，所述经修饰的EGFR具有在SEQ ID NO:46中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:
46至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％序列同一性的序列。
[0223] 在一些实施方案中，所述缀合物按N末端至C末端顺序包含：(1)至少一种药剂(例如Strep- )，所述至少一种药剂具有在SEQ ID NO:8、15-19或58中任一个中所示的氨
基酸序列或与SEQ ID NO:8、15-19或58中任一个至少或至少约85％、86％、87％、88％、
89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列；(2)任选地，至少一个肽接头，如在SEQ ID NO:55、56、59-62、98或99中所示的肽接头；以及(3)经
修饰的HER2/neu/ErbB2，所述经修饰的HER2/neu/ErbB2具有在SEQ ID NO:92中所示的氨基
酸序列或与SEQ ID NO:92至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。
基酸序列或与SEQ ID NO:8、15-19或58中任一个至少或至少约85％、86％、87％、88％、
89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列；(2)任选地，至少一个肽接头，如在SEQ ID NO:55、56、59-62、98或99中所示的肽接头；以及(3)经
修饰的HER2/neu/ErbB2，所述经修饰的HER2/neu/ErbB2具有在SEQ ID NO:92中所示的氨基
酸序列或与SEQ ID NO:92至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。
[0224] 在一些实施方案中，所述缀合物含有PSMA或其修饰形式(例如经修饰的PSMA)、和能够结合链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白的至少一种药剂(例如亲和标签)。在一些实施
方案中，经修饰的PSMA是如上所述的任何一种(如在SEQ ID NO:95中所示的)、或SEQ ID
NO:94的N末端截短。在一些此类实施方案中，所述药剂是链霉亲和素结合肽，如Strep-
Strep- II或双-Strep-标签，包括上面描述的和在SEQ ID NO:7、8、15-19
或58中所示的任何一种。
方案中，经修饰的PSMA是如上所述的任何一种(如在SEQ ID NO:95中所示的)、或SEQ ID
NO:94的N末端截短。在一些此类实施方案中，所述药剂是链霉亲和素结合肽，如Strep-
Strep- II或双-Strep-标签，包括上面描述的和在SEQ ID NO:7、8、15-19
或58中所示的任何一种。
[0225] 在一些实施方案中，所述缀合物按N末端至C末端顺序包含：(1)PSMA或经修饰的PSMA，所述PSMA或经修饰的PSMA具有在SEQ ID NO:94或95中任一个中所示的氨基酸序列或
与SEQ ID NO:94或95中任一个至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列；(2)任选地，至少一个肽接头，如在SEQ ID NO:55、56、59-62、98或99中所示的肽接头；以及(3)至少一种药剂(例如
Strep- )，所述至少一种药剂具有在SEQ ID NO:8、15-19或58中所示的氨基酸序列
或与SEQ ID NO:8、15-19或58至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。
与SEQ ID NO:94或95中任一个至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列；(2)任选地，至少一个肽接头，如在SEQ ID NO:55、56、59-62、98或99中所示的肽接头；以及(3)至少一种药剂(例如
Strep- )，所述至少一种药剂具有在SEQ ID NO:8、15-19或58中所示的氨基酸序列
或与SEQ ID NO:8、15-19或58至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。
[0226] 在一些实施方案中，细胞表面缀合物蛋白质在其N末端进一步含有用于将所表达的缀合物靶向分泌途径以作为表面或膜蛋白插入膜中的信号肽。在一些实施方案中，所述
信号肽是细胞表面分子的天然信号肽，例如，包含在SEQ ID NO:64中的EGFR。在一些实施方
案中，所述信号肽是非天然或异源的信号肽。在一些实施方案中，所述信号肽源自粒细胞巨
噬细胞集落刺激因子受体(GMCSFR)α链，其具有在SEQ ID NO:48中所示的氨基酸序列，例如
由在SEQ ID NO:47中所示的序列或其具有简并密码子的序列编码。
信号肽是细胞表面分子的天然信号肽，例如，包含在SEQ ID NO:64中的EGFR。在一些实施方
案中，所述信号肽是非天然或异源的信号肽。在一些实施方案中，所述信号肽源自粒细胞巨
噬细胞集落刺激因子受体(GMCSFR)α链，其具有在SEQ ID NO:48中所示的氨基酸序列，例如
由在SEQ ID NO:47中所示的序列或其具有简并密码子的序列编码。
[0227] III.工程化细胞
[0228] 本文提供了表达所提供的细胞表面缀合物中任何一种的工程化细胞。在一些实施方案中，工程化细胞共表达细胞表面缀合物和一种或多种重组抗原受体。在一些实施方案
中，所述细胞可以包括用重组受体(例如嵌合抗原受体)基因工程化的细胞。
中，所述细胞可以包括用重组受体(例如嵌合抗原受体)基因工程化的细胞。
[0229] A.重组抗原受体
[0230] 提供了表达重组受体的工程化细胞(如T细胞)，所述重组受体包括含有配体结合结构域或其结合片段的嵌合受体(如功能性非TCR抗原受体、如嵌合抗原受体(CAR))，并且
还包括T细胞受体(TCR)(如转基因TCR)及其组分。嵌合受体(如CAR)通常包括(在一些方面
经由接头和/或一个或多个跨膜结构域)与一种或多种细胞内信号传导组分连接的细胞外
抗原(或配体)结合结构域。
还包括T细胞受体(TCR)(如转基因TCR)及其组分。嵌合受体(如CAR)通常包括(在一些方面
经由接头和/或一个或多个跨膜结构域)与一种或多种细胞内信号传导组分连接的细胞外
抗原(或配体)结合结构域。
[0231] 1.嵌合抗原受体
[0232] 在一些实施方案中，提供了工程化细胞(如T细胞)，其表达对特定抗原(或标记或配体)具有特异性的CAR，所述特定抗原例如为在特定细胞类型的表面上表达的抗原。在一
些实施方案中，所述抗原是多肽。在一些实施方案中，它是碳水化合物或其他分子。在一些
实施方案中，与正常或非靶向细胞或组织相比，抗原在疾病或病症的细胞例如肿瘤细胞或
致病细胞上选择性表达或过表达。在其他实施方案中，抗原在正常细胞上表达和/或在工程
化细胞上表达。
些实施方案中，所述抗原是多肽。在一些实施方案中，它是碳水化合物或其他分子。在一些
实施方案中，与正常或非靶向细胞或组织相比，抗原在疾病或病症的细胞例如肿瘤细胞或
致病细胞上选择性表达或过表达。在其他实施方案中，抗原在正常细胞上表达和/或在工程
化细胞上表达。
[0233] 在特定实施方案中，重组受体(如嵌合受体)含有细胞内信号传导结构域或区域，所述细胞内信号传导结构域或区域包括激活的或刺激的细胞质信号传导结构域或区域(也
可互换地称为激活的或刺激的细胞内信号传导结构域或区域)，例如能够在T细胞中诱导初
级激活信号的激活的或刺激的细胞质(细胞内)结构域或区域，例如，T细胞受体(TCR)组分
的细胞质信号传导结构域或区域(例如，CD3-zeta(CD3ζ)链或其功能变体或信号传导部分
的ζ链的细胞质信号传导结构域或区域)；和/或所述细胞内信号传导区域包含基于免疫受
体酪氨酸的激活基序(ITAM)。
可互换地称为激活的或刺激的细胞内信号传导结构域或区域)，例如能够在T细胞中诱导初
级激活信号的激活的或刺激的细胞质(细胞内)结构域或区域，例如，T细胞受体(TCR)组分
的细胞质信号传导结构域或区域(例如，CD3-zeta(CD3ζ)链或其功能变体或信号传导部分
的ζ链的细胞质信号传导结构域或区域)；和/或所述细胞内信号传导区域包含基于免疫受
体酪氨酸的激活基序(ITAM)。
[0234] 在一些实施方案中，嵌合受体还含有特异性地结合至配体(例如抗原)抗原的细胞外配体结合结构域。在一些实施方案中，嵌合受体是CAR，其含有特异性地结合至抗原的细
胞外抗原识别结构域。在一些实施方案中，配体(如抗原)是在细胞表面上表达的蛋白质。在
一些实施方案中，CAR是TCR样CAR，并且抗原是加工过的肽抗原，如细胞内蛋白的肽抗原，其
与TCR一样在主要组织相容性复合物(MHC)分子的背景下在细胞表面上被识别。
胞外抗原识别结构域。在一些实施方案中，配体(如抗原)是在细胞表面上表达的蛋白质。在
一些实施方案中，CAR是TCR样CAR，并且抗原是加工过的肽抗原，如细胞内蛋白的肽抗原，其
与TCR一样在主要组织相容性复合物(MHC)分子的背景下在细胞表面上被识别。
[0235] 示例性抗原受体(包括CAR)以及将这种受体工程化并引入细胞中的方法包括例如国际专利申请公开号WO 200014257、WO 2013126726、WO 2012/129514、WO 2014031687、WO
2013/166321、WO 2013/071154、WO 2013/123061、美国专利申请公开号US 2002131960、US
2013287748、US 20130149337、美国专利号：6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、
8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,
353和8,479,118以及欧洲专利申请号EP2537416中描述的那些抗原受体，和/或Sadelain等
人,Cancer Discov.2013年4月；3(4):388-398；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338；
Turtle等人,Curr.Opin.Immunol.,2012年10月；24(5):633-39；Wu等人,Cancer,2012年3月
18(2):160-75描述的那些抗原受体。在一些方面，抗原受体包括如美国专利号7,446,190中
描述的CAR，以及国际专利申请公开号WO/2014055668 A1中描述的那些。CAR的实例包括如
在任何上述出版物中披露的CAR，所述出版物例如WO 2014031687、US 8,339,645、US 7,
446,179、US 2013/0149337、美国专利号7,446,190、美国专利号8,389,282；Kochenderfer
等人,2013,Nature Reviews Clinical Oncology,10,267-276(2013)；Wang等人(2012)
J.Immunother.35(9):689-701；以及Brentjens等人,Sci Transl Med.2013 5(177)。还参
见WO 2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US 2013/0149337、美国专利号：7,446,
190和美国专利号：8,389,282。
2013/166321、WO 2013/071154、WO 2013/123061、美国专利申请公开号US 2002131960、US
2013287748、US 20130149337、美国专利号：6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、
8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,
353和8,479,118以及欧洲专利申请号EP2537416中描述的那些抗原受体，和/或Sadelain等
人,Cancer Discov.2013年4月；3(4):388-398；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338；
Turtle等人,Curr.Opin.Immunol.,2012年10月；24(5):633-39；Wu等人,Cancer,2012年3月
18(2):160-75描述的那些抗原受体。在一些方面，抗原受体包括如美国专利号7,446,190中
描述的CAR，以及国际专利申请公开号WO/2014055668 A1中描述的那些。CAR的实例包括如
在任何上述出版物中披露的CAR，所述出版物例如WO 2014031687、US 8,339,645、US 7,
446,179、US 2013/0149337、美国专利号7,446,190、美国专利号8,389,282；Kochenderfer
等人,2013,Nature Reviews Clinical Oncology,10,267-276(2013)；Wang等人(2012)
J.Immunother.35(9):689-701；以及Brentjens等人,Sci Transl Med.2013 5(177)。还参
见WO 2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US 2013/0149337、美国专利号：7,446,
190和美国专利号：8,389,282。
[0236] 在一些实施方案中，CAR被构建为具有对特定抗原(或标记或配体)的特异性，所述特定抗原例如为在过继疗法靶向的特定细胞类型中表达的抗原(例如癌症标记)和/或旨在
诱导衰减应答的抗原(例如在正常或未患病细胞类型上表达的抗原)。因此，CAR通常在其细
胞外部分中包括一种或多种抗原结合分子，例如一种或多种抗原结合片段、结构域或部分，
或一种或多种抗体可变结构域，和/或抗体分子。在一些实施方案中，所述CAR包括抗体分子
的一个或多个抗原结合部分，如源自单克隆抗体(mAb)的可变重链(VH)和可变轻链(VL)的
单链抗体片段(scFv)。
诱导衰减应答的抗原(例如在正常或未患病细胞类型上表达的抗原)。因此，CAR通常在其细
胞外部分中包括一种或多种抗原结合分子，例如一种或多种抗原结合片段、结构域或部分，
或一种或多种抗体可变结构域，和/或抗体分子。在一些实施方案中，所述CAR包括抗体分子
的一个或多个抗原结合部分，如源自单克隆抗体(mAb)的可变重链(VH)和可变轻链(VL)的
单链抗体片段(scFv)。
[0237] 在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分作为重组受体(例如抗原受体)的部分在细胞上表达。所述抗原受体包括功能性非TCR抗原受体，如嵌合抗原受体(CAR)。通常，含
有针对肽-MHC复合物展现TCR样特异性的抗体或抗原结合片段的CAR也可以称为TCR样CAR。
在一些实施方案中，在一些方面，对TCR样CAR的MHC-肽复合物具有特异性的细胞外抗原结
合结构域通过接头和/或一个或多个跨膜结构域与一个或多个细胞内信号传导组分连接。
在一些实施方案中，此类分子通常可以通过天然抗原受体(如TCR)模拟或接近信号，并且任
选地通过这种受体与共刺激受体组合模拟或接近信号。
有针对肽-MHC复合物展现TCR样特异性的抗体或抗原结合片段的CAR也可以称为TCR样CAR。
在一些实施方案中，在一些方面，对TCR样CAR的MHC-肽复合物具有特异性的细胞外抗原结
合结构域通过接头和/或一个或多个跨膜结构域与一个或多个细胞内信号传导组分连接。
在一些实施方案中，此类分子通常可以通过天然抗原受体(如TCR)模拟或接近信号，并且任
选地通过这种受体与共刺激受体组合模拟或接近信号。
[0238] 在一些实施方案中，重组受体(例如嵌合受体，例如CAR)包括与抗原(或配体)结合(例如特异性结合)的配体结合结构域。嵌合受体靶向的抗原包括在通过过继细胞疗法靶向
的疾病、病症或细胞类型的情况下表达的抗原。所述疾病和病症包括增殖性、肿瘤性和恶性
疾病和障碍，包括癌症和肿瘤，包括血液癌、免疫系统癌症，如淋巴瘤、白血病和/或骨髓瘤，如B型白血病、T型白血病和骨髓性白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。
的疾病、病症或细胞类型的情况下表达的抗原。所述疾病和病症包括增殖性、肿瘤性和恶性
疾病和障碍，包括癌症和肿瘤，包括血液癌、免疫系统癌症，如淋巴瘤、白血病和/或骨髓瘤，如B型白血病、T型白血病和骨髓性白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。
[0239] 在一些实施方案中，所述抗原(或配体)是多肽。在一些实施方案中，它是碳水化合物或其他分子。在一些实施方案中，如与正常或非靶向细胞或组织相比，抗原(或配体)在疾
病或病症的细胞(例如肿瘤或致病细胞)上选择性表达或过表达。在其他实施方案中，抗原
在正常细胞上表达和/或在工程化细胞上表达。
病或病症的细胞(例如肿瘤或致病细胞)上选择性表达或过表达。在其他实施方案中，抗原
在正常细胞上表达和/或在工程化细胞上表达。
[0240] 在一些实施方案中，CAR含有抗体或抗原结合片段(例如scFv)，其特异性识别在细胞表面上表达的抗原(如完整抗原)。
[0241] 在一些实施方案中，所述抗原(或配体)是肿瘤抗原或癌症标记。在一些实施方案中，所述抗原(或配体)是或包括αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、
B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称
为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、CC基序趋化因子
配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、表皮生长因子蛋白(EGFR)、截短的表皮生长因子蛋白(tEGFR)、III型
表皮生长因子受体突变(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配
蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或
FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、
O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、G蛋白偶联受体5D(GPCR5D)、
Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子
量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞
抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Ra)、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、激酶插入结构域受体
(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的8家
族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、间皮素、c-
Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、天然杀伤组2成员D(NKG2D)配体、黑色
素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕
酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体
酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋
白72(TAG72)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Wilms肿
瘤1(WT-1)、病原体特异性抗原或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由
HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞
恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知B细胞标记中的任何一种。在一些实施方案中，所述抗原
是或包括CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。
B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称
为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、CC基序趋化因子
配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、表皮生长因子蛋白(EGFR)、截短的表皮生长因子蛋白(tEGFR)、III型
表皮生长因子受体突变(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配
蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或
FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、
O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、G蛋白偶联受体5D(GPCR5D)、
Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子
量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞
抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Ra)、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、激酶插入结构域受体
(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的8家
族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、间皮素、c-
Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、天然杀伤组2成员D(NKG2D)配体、黑色
素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕
酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体
酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋
白72(TAG72)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Wilms肿
瘤1(WT-1)、病原体特异性抗原或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由
HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞
恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知B细胞标记中的任何一种。在一些实施方案中，所述抗原
是或包括CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。
[0242] 在一些实施方案中，所述抗原(或配体)是肿瘤抗原或癌症标记。在一些实施方案中，所述抗原(或配体)是或包括孤儿酪氨酸激酶受体RORl、tEGFR、Her2、Ll-CAM、CD19、
CD20、CD22、BCMA、间皮素、CEA、和乙型肝炎表面抗原、抗叶酸受体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP-2、EGP-4、EPHa2、ErbB2、3或4、FBP、胎儿乙酰胆碱e受体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、kdr、κ轻链、路易斯Y、L1-细胞粘附分子、MAGE-A1、间皮素、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2D配体、NY-ESO-1、MART-1、gp100、癌胚胎抗原(oncofetal
antigen)、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原、PSMA、Her2/neu、雌激素受体、孕酮受体、肝配蛋白B2、CD123、CS-1、c-Met、GD-2、和MAGE A3、CE7、Wilms肿瘤1(WT-1)、细胞周期蛋白(如细胞周期蛋白A1(CCNA1))、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或
其他病原体表达的分子。在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的
抗原，如许多已知B细胞标记中的任何一种。在一些实施方案中，受体靶向的抗原是CD20、
CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。
CD20、CD22、BCMA、间皮素、CEA、和乙型肝炎表面抗原、抗叶酸受体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP-2、EGP-4、EPHa2、ErbB2、3或4、FBP、胎儿乙酰胆碱e受体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、kdr、κ轻链、路易斯Y、L1-细胞粘附分子、MAGE-A1、间皮素、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2D配体、NY-ESO-1、MART-1、gp100、癌胚胎抗原(oncofetal
antigen)、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原、PSMA、Her2/neu、雌激素受体、孕酮受体、肝配蛋白B2、CD123、CS-1、c-Met、GD-2、和MAGE A3、CE7、Wilms肿瘤1(WT-1)、细胞周期蛋白(如细胞周期蛋白A1(CCNA1))、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或
其他病原体表达的分子。在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的
抗原，如许多已知B细胞标记中的任何一种。在一些实施方案中，受体靶向的抗原是CD20、
CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。
[0243] 在一些实施方案中，所述抗原是病原体特异性抗原或病原体表达的抗原。在一些实施方案中，抗原是病毒抗原(例如来自HIV、HCV、HBV等的病毒抗原)、细菌抗原和/或寄生
虫抗原。
虫抗原。
[0244] 在一些实施方案中，CAR含有TCR样抗体，例如抗体或抗原结合片段(例如scFv)，其特异性识别作为MHC-肽复合物存在于细胞表面上的细胞内抗原(例如肿瘤相关抗原)。在一
些实施方案中，识别MHC-肽复合物的抗体或其抗原结合部分可以作为重组受体的部分(例
如抗原受体)在细胞上表达。所述抗原受体包括功能性非TCR抗原受体，如嵌合抗原受体
(CAR)。通常，含有针对肽-MHC复合物展现TCR样特异性的抗体或抗原结合片段的CAR也可以
称为TCR样CAR。
些实施方案中，识别MHC-肽复合物的抗体或其抗原结合部分可以作为重组受体的部分(例
如抗原受体)在细胞上表达。所述抗原受体包括功能性非TCR抗原受体，如嵌合抗原受体
(CAR)。通常，含有针对肽-MHC复合物展现TCR样特异性的抗体或抗原结合片段的CAR也可以
称为TCR样CAR。
[0245] 提及“主要组织相容性复合物”(MHC)是指含有多态性肽结合位点或结合沟的蛋白质，通常是糖蛋白，在一些情况下，所述蛋白质可以与多肽的肽抗原(包括由细胞机构处理
的肽抗原)复合。在一些情况下，MHC分子可以在细胞表面上展示或表达，包括作为与肽的复
合物，即MHC-肽复合物，用于呈现具有T细胞上的抗原受体(例如TCR或TCR样抗体)可识别的
构象的抗原。通常，MHC I类分子是异二聚体，其具有跨越α链的膜，在一些情况下具有三个α结构域和非共价缔合的β2微球蛋白。通常，MHC II类分子由两种跨膜糖蛋白α和β组成，两者通常都跨越膜。MHC分子可以包括MHC的有效部分，其含有抗原结合位点或用于结合肽的位
点以及由适当抗原受体识别所需的序列。在一些实施方案中，MHC I类分子将源自胞质溶胶
+
的肽递送至细胞表面，其中MHC-肽复合物由T细胞(例如通常CD8T细胞，但在一些情况下是
CD4+T细胞)识别。在一些实施方案中，MHC II类分子将源自囊泡系统的肽递送至细胞表面，
其中所述肽通常由CD4+T细胞识别。通常，MHC分子由一组连锁基因座编码，其在小鼠中统称
为H-2并且在人中统称为人白细胞抗原(HLA)。因此，通常人MHC也以可称为人白细胞抗原
(HLA)。
的肽抗原)复合。在一些情况下，MHC分子可以在细胞表面上展示或表达，包括作为与肽的复
合物，即MHC-肽复合物，用于呈现具有T细胞上的抗原受体(例如TCR或TCR样抗体)可识别的
构象的抗原。通常，MHC I类分子是异二聚体，其具有跨越α链的膜，在一些情况下具有三个α结构域和非共价缔合的β2微球蛋白。通常，MHC II类分子由两种跨膜糖蛋白α和β组成，两者通常都跨越膜。MHC分子可以包括MHC的有效部分，其含有抗原结合位点或用于结合肽的位
点以及由适当抗原受体识别所需的序列。在一些实施方案中，MHC I类分子将源自胞质溶胶
+
的肽递送至细胞表面，其中MHC-肽复合物由T细胞(例如通常CD8T细胞，但在一些情况下是
CD4+T细胞)识别。在一些实施方案中，MHC II类分子将源自囊泡系统的肽递送至细胞表面，
其中所述肽通常由CD4+T细胞识别。通常，MHC分子由一组连锁基因座编码，其在小鼠中统称
为H-2并且在人中统称为人白细胞抗原(HLA)。因此，通常人MHC也以可称为人白细胞抗原
(HLA)。
[0246] 术语“MHC-肽复合物”或“肽-MHC复合物”或其变体是指肽抗原与MHC分子的复合物或缔合物，例如通常通过所述肽在MHC分子的结合沟或裂缝中的非共价相互作用来形成。在
一些实施方案中，MHC-肽复合物存在或展示于细胞表面上。在一些实施方案中，MHC-肽复合
物可由抗原受体(例如TCR、TCR样CAR或其抗原结合部分)特异性地识别。
一些实施方案中，MHC-肽复合物存在或展示于细胞表面上。在一些实施方案中，MHC-肽复合
物可由抗原受体(例如TCR、TCR样CAR或其抗原结合部分)特异性地识别。
[0247] 在一些实施方案中，多肽的肽(例如肽抗原或表位)可以与MHC分子缔合，例如用于由抗原受体识别。通常，所述肽源自或基于较长生物分子(例如多肽或蛋白质)的片段。在一
些实施方案中，所述肽的长度通常为约8至约24个氨基酸。在一些实施方案中，肽的长度为
或为约9至22个氨基酸，用于在MHC II类复合物中识别。在一些实施方案中，肽的长度为或
为约8至13个氨基酸，用于在MHC I类复合物中识别。在一些实施方案中，在识别MHC分子(例
如MHC-肽复合物)背景中的肽后，抗原受体(例如TCR或TCR样CAR)产生或触发激活信号至T
细胞，诱导T细胞应答，如T细胞增殖、细胞因子产生、细胞毒性T细胞应答或其他应答。
些实施方案中，所述肽的长度通常为约8至约24个氨基酸。在一些实施方案中，肽的长度为
或为约9至22个氨基酸，用于在MHC II类复合物中识别。在一些实施方案中，肽的长度为或
为约8至13个氨基酸，用于在MHC I类复合物中识别。在一些实施方案中，在识别MHC分子(例
如MHC-肽复合物)背景中的肽后，抗原受体(例如TCR或TCR样CAR)产生或触发激活信号至T
细胞，诱导T细胞应答，如T细胞增殖、细胞因子产生、细胞毒性T细胞应答或其他应答。
[0248] 在一些实施方案中，TCR样抗体或抗原结合部分是已知的或者可以通过在本领域中已知方法产生(参见例如美国公开申请号US 2002/0150914；US 2003/0223994；US 2004/
0191260；US 2006/0034850；US 2007/00992530；US 20090226474；US 20090304679；和国际
PCT公开号WO 03/068201)。
0191260；US 2006/0034850；US 2007/00992530；US 20090226474；US 20090304679；和国际
PCT公开号WO 03/068201)。
[0249] 在一些实施方案中，特异性地结合至MHC-肽复合物的抗体或其抗原结合部分可以通过用有效量的含有特定MHC-肽复合物的免疫原对宿主进行免疫来产生。在一些情况下，
MHC-肽复合物的肽是能够结合至MHC的抗原的表位，例如肿瘤抗原，例如通用肿瘤抗原、骨
髓瘤抗原或如下文所述的其他抗原。在一些实施方案中，然后向宿主给予有效量的免疫原
以用于引发免疫应答，其中所述免疫原保持其三维形式持续一段足以引发针对所述肽在所
述MHC分子的结合沟中的三维呈递的免疫应答的时间。然后测定从宿主收集的血清以确定
是否产生了识别MHC分子结合沟中的肽的三维呈现的所需抗体。在一些实施方案中，可以评
估所产生的抗体以确认所述抗体可以区分MHC-肽复合物与单独的MHC分子、单独的目标肽
以及MHC与无关肽的复合物。然后可以分离所希望的抗体。
MHC-肽复合物的肽是能够结合至MHC的抗原的表位，例如肿瘤抗原，例如通用肿瘤抗原、骨
髓瘤抗原或如下文所述的其他抗原。在一些实施方案中，然后向宿主给予有效量的免疫原
以用于引发免疫应答，其中所述免疫原保持其三维形式持续一段足以引发针对所述肽在所
述MHC分子的结合沟中的三维呈递的免疫应答的时间。然后测定从宿主收集的血清以确定
是否产生了识别MHC分子结合沟中的肽的三维呈现的所需抗体。在一些实施方案中，可以评
估所产生的抗体以确认所述抗体可以区分MHC-肽复合物与单独的MHC分子、单独的目标肽
以及MHC与无关肽的复合物。然后可以分离所希望的抗体。
[0250] 在一些实施方案中，特异性地结合至MHC-肽复合物的抗体或其抗原结合部分可以通过采用抗体文库展示方法(例如噬菌体抗体文库)来产生。在一些实施方案中，可以产生
突变型Fab、scFV或其他抗体形式的噬菌体展示文库，例如其中所述文库的成员在一个或多
个CDR的一个或多个残基处被突变。此类方法的示例在本领域是已知的(参见例如美国公开
的申请号US 20020150914、US 2014/0294841；和Cohen CJ.等人(2003)J Mol.Recogn.16:
324-332)。
突变型Fab、scFV或其他抗体形式的噬菌体展示文库，例如其中所述文库的成员在一个或多
个CDR的一个或多个残基处被突变。此类方法的示例在本领域是已知的(参见例如美国公开
的申请号US 20020150914、US 2014/0294841；和Cohen CJ.等人(2003)J Mol.Recogn.16:
324-332)。
[0251] 本文中的术语“抗体”在最广泛的意义上使用，并且包括多克隆和单克隆抗体，包括完整抗体和功能性(抗原结合)抗体片段，包括片段抗原结合(Fab)片段、F(ab')2片段、
Fab'片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、能够特异性结合抗原的可变重链(VH)区、单链抗体
片段(包括单链可变片段(scFv))以及单结构域抗体(例如，sdAb、sdFv、纳米抗体)片段。所
述术语涵盖免疫球蛋白的基因工程化的和/或以其他方式修饰的形式，如胞内抗体、肽体
(peptibody)、嵌合抗体、全人抗体、人源化抗体和异缀合抗体(heteroconjugate
antibody)、多特异性(例如，双特异性)抗体、双抗体、三抗体和四抗体、串联二-scFv、串联
三-scFv。除非另有说明，否则术语“抗体”应理解为涵盖其功能性抗体片段。所述术语还涵
盖完整或全长抗体，包括任何类别或亚类(包括IgG及其亚类、IgM、IgE、IgA和IgD)的抗体。
Fab'片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、能够特异性结合抗原的可变重链(VH)区、单链抗体
片段(包括单链可变片段(scFv))以及单结构域抗体(例如，sdAb、sdFv、纳米抗体)片段。所
述术语涵盖免疫球蛋白的基因工程化的和/或以其他方式修饰的形式，如胞内抗体、肽体
(peptibody)、嵌合抗体、全人抗体、人源化抗体和异缀合抗体(heteroconjugate
antibody)、多特异性(例如，双特异性)抗体、双抗体、三抗体和四抗体、串联二-scFv、串联
三-scFv。除非另有说明，否则术语“抗体”应理解为涵盖其功能性抗体片段。所述术语还涵
盖完整或全长抗体，包括任何类别或亚类(包括IgG及其亚类、IgM、IgE、IgA和IgD)的抗体。
[0252] 在一些实施方案中，抗原结合蛋白、抗体及其抗原结合片段特异性地识别全长抗体的抗原。在一些实施方案中，抗体的重链和轻链可以是全长的或者可以是抗原结合部分
(Fab、F(ab’)2、Fv或单链Fv片段(scFv))。在其他实施方案中，所述抗体重链恒定区选自例
如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE，特别是选自例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，更特别是IgG1(例如，人IgG1)。在另一个实施方案中，抗体轻链恒定区选自例如κ或λ，特别是κ。
(Fab、F(ab’)2、Fv或单链Fv片段(scFv))。在其他实施方案中，所述抗体重链恒定区选自例
如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE，特别是选自例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，更特别是IgG1(例如，人IgG1)。在另一个实施方案中，抗体轻链恒定区选自例如κ或λ，特别是κ。
[0253] 所提供的抗体包括抗体片段。“抗体片段”是指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体的结合完整抗体所结合的抗原的一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、
Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；可变重链(VH)区；单链抗体分子，如scFv和单结构域VH单抗体；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。在特定实施方案中，所述抗体是包含
可变重链区和/或可变轻链区的单链抗体片段，如scFv。
Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；可变重链(VH)区；单链抗体分子，如scFv和单结构域VH单抗体；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。在特定实施方案中，所述抗体是包含
可变重链区和/或可变轻链区的单链抗体片段，如scFv。
[0254] 术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原的结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每个结
构域包含四个保守的框架区(FR)和三个CDR。(参见例如，Kindt等人Kuby Immunology,第6
版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007))。单个VH或VL结构域可以足以赋予抗原结合特异
性。此外，可以使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域分离结合所述特定抗原的抗体，以
分别筛选互补的VL或VH结构域的文库。参见例如，Portolano等人,J.Immunol.150:880-887
(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。
构域包含四个保守的框架区(FR)和三个CDR。(参见例如，Kindt等人Kuby Immunology,第6
版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007))。单个VH或VL结构域可以足以赋予抗原结合特异
性。此外，可以使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域分离结合所述特定抗原的抗体，以
分别筛选互补的VL或VH结构域的文库。参见例如，Portolano等人,J.Immunol.150:880-887
(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。
[0255] 单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或者全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体。在一些实施方
案中，CAR包含特异性地结合抗原的抗体重链结构域，所述抗原例如癌症标记或待靶向的细
胞或疾病(例如肿瘤细胞或癌细胞)的细胞表面抗原，例如本文描述的或在本领域中已知的
任何靶抗原。
案中，CAR包含特异性地结合抗原的抗体重链结构域，所述抗原例如癌症标记或待靶向的细
胞或疾病(例如肿瘤细胞或癌细胞)的细胞表面抗原，例如本文描述的或在本领域中已知的
任何靶抗原。
[0256] 抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞产生。在一些实施方案中，所述抗体是重组产生的片段，如包含天然不存在
的排列的片段(如具有通过合成接头(例如，肽接头)连接的两个或更多个抗体区或链的那
些)，和/或可不通过酶消化天然存在的完整抗体产生的片段。在一些实施方案中，抗体片段
是scFv。
的排列的片段(如具有通过合成接头(例如，肽接头)连接的两个或更多个抗体区或链的那
些)，和/或可不通过酶消化天然存在的完整抗体产生的片段。在一些实施方案中，抗体片段
是scFv。
[0257] “人源化”抗体是这样的抗体，其中所有或基本上所有CDR氨基酸残基源自非人CDR并且所有或基本上所有FR氨基酸残基源自人FR。人源化抗体任选地可以包括衍生自人抗体
的抗体恒定区的至少一部分。非人抗体的“人源化形式”是指所述非人抗体的变体，其经历
人源化以通常降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。在一些实
施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，衍生出CDR残基的抗体)的相
应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
的抗体恒定区的至少一部分。非人抗体的“人源化形式”是指所述非人抗体的变体，其经历
人源化以通常降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。在一些实
施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，衍生出CDR残基的抗体)的相
应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
[0258] 因此，在一些实施方案中，嵌合抗原受体(包括TCR样CAR)包括含有抗体或抗体片段的细胞外部分。在一些实施方案中，所述抗体或片段包括scFv。在一些方面，嵌合抗原受
体包括含有抗体或片段的细胞外部分和细胞内信号传导结构域。
体包括含有抗体或片段的细胞外部分和细胞内信号传导结构域。
[0259] 在一些实施方案中，重组受体(如CAR，如其抗体部分)进一步包括间隔子，所述间隔子可以是或包括免疫球蛋白恒定区的至少一部分或其变体或经修饰形式，如铰链区(例
如，IgG4铰链区)和/或CH1/CL和/或Fc区。在一些实施方案中，恒定区或部分是人IgG(如
IgG4或IgG1)的。在一些方面，所述恒定区的部分用作抗原识别组分(例如，scFv)与跨膜结
构域之间的间隔子区。与不存在间隔子的情况下相比，间隔子的长度可以提供抗原结合后
增强的细胞反应性。在一些例子中，所述间隔子的长度为或约12个氨基酸或者长度不超过
12个氨基酸。示例性间隔子包括具有至少约10至229个氨基酸、约10至200个氨基酸、约10至
175个氨基酸、约10至150个氨基酸、约10至125个氨基酸、约10至100个氨基酸、约10至75个
氨基酸、约10至50个氨基酸，约10至40个氨基酸、约10至30个氨基酸、约10至20个氨基酸或
约10至15个氨基酸(并且包括任何列出的范围的端点之间的任何整数)的那些。在一些实施
方案中，间隔子区具有约12个或更少的氨基酸、约119个或更少的氨基酸或约229个或更少
的氨基酸。示例性间隔子包括单独的IgG4铰链、与CH2和CH3结构域连接的IgG4铰链或与CH3
结构域连接的IgG4铰链。示例性间隔子包括但不限于在Hudecek等人(2013)Clin.Cancer
Res.,19:3153，或国际专利申请公开号WO 2014031687中描述的那些。在一些实施方案中，
所述间隔子具有SEQ ID NO:70中所示的序列，并且由SEQ ID NO:71中所示的序列编码。在
一些实施方案中，所述间隔子具有SEQ ID NO:72中列出的序列。在一些实施方案中，所述间
隔子具有SEQ ID NO:73中列出的序列。
如，IgG4铰链区)和/或CH1/CL和/或Fc区。在一些实施方案中，恒定区或部分是人IgG(如
IgG4或IgG1)的。在一些方面，所述恒定区的部分用作抗原识别组分(例如，scFv)与跨膜结
构域之间的间隔子区。与不存在间隔子的情况下相比，间隔子的长度可以提供抗原结合后
增强的细胞反应性。在一些例子中，所述间隔子的长度为或约12个氨基酸或者长度不超过
12个氨基酸。示例性间隔子包括具有至少约10至229个氨基酸、约10至200个氨基酸、约10至
175个氨基酸、约10至150个氨基酸、约10至125个氨基酸、约10至100个氨基酸、约10至75个
氨基酸、约10至50个氨基酸，约10至40个氨基酸、约10至30个氨基酸、约10至20个氨基酸或
约10至15个氨基酸(并且包括任何列出的范围的端点之间的任何整数)的那些。在一些实施
方案中，间隔子区具有约12个或更少的氨基酸、约119个或更少的氨基酸或约229个或更少
的氨基酸。示例性间隔子包括单独的IgG4铰链、与CH2和CH3结构域连接的IgG4铰链或与CH3
结构域连接的IgG4铰链。示例性间隔子包括但不限于在Hudecek等人(2013)Clin.Cancer
Res.,19:3153，或国际专利申请公开号WO 2014031687中描述的那些。在一些实施方案中，
所述间隔子具有SEQ ID NO:70中所示的序列，并且由SEQ ID NO:71中所示的序列编码。在
一些实施方案中，所述间隔子具有SEQ ID NO:72中列出的序列。在一些实施方案中，所述间
隔子具有SEQ ID NO:73中列出的序列。
[0260] 在一些实施方案中，所述恒定区或部分是IgD的。在一些实施方案中，所述间隔子具有SEQ ID NO:74中列出的序列。在一些实施方案中，间隔子具有展现与SEQ ID NO:70、
72、73和74中任一个至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
72、73和74中任一个至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
[0261] 所述抗原识别结构域通常与一种或多种细胞内信号传导组分(如通过抗原受体复合物(如TCR复合物)(在CAR的情况下)模拟激活和/或经由另一种细胞表面受体模拟信号的
信号传导组分)连接。因此，在一些实施方案中，抗原结合组分(例如，抗体)与一个或多个跨
膜和细胞内信号传导结构域连接。在一些实施方案中，所述跨膜结构域与细胞外结构域融
合。在一个实施方案中，使用天然与所述受体(例如，CAR)中的一个结构域缔合的跨膜结构
域。在一些情形中，通过氨基酸取代选择或修饰所述跨膜结构域以避免此类结构域与相同
或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以最小化与所述受体复合物的其他成员的相互作
用。
信号传导组分)连接。因此，在一些实施方案中，抗原结合组分(例如，抗体)与一个或多个跨
膜和细胞内信号传导结构域连接。在一些实施方案中，所述跨膜结构域与细胞外结构域融
合。在一个实施方案中，使用天然与所述受体(例如，CAR)中的一个结构域缔合的跨膜结构
域。在一些情形中，通过氨基酸取代选择或修饰所述跨膜结构域以避免此类结构域与相同
或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以最小化与所述受体复合物的其他成员的相互作
用。
[0262] 在一些实施方案中，所述跨膜结构域源自天然或合成来源。当来源是天然的时，在一些方面，所述结构域可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜区包括源自以下项的那
些跨膜区(即，包括以下项的至少一个或多个跨膜区)：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137，CD154。可替代地，在一些实施方案中，跨膜结构域是合成的。在一些方面，合成跨膜结构域主要包含
疏水性残基，例如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面，将在合成跨膜结构域的每个末端发现苯丙
氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。在一些实施方案中，连接是通过接头、间隔子和/或一个或
多个跨膜结构域。
些跨膜区(即，包括以下项的至少一个或多个跨膜区)：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137，CD154。可替代地，在一些实施方案中，跨膜结构域是合成的。在一些方面，合成跨膜结构域主要包含
疏水性残基，例如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面，将在合成跨膜结构域的每个末端发现苯丙
氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。在一些实施方案中，连接是通过接头、间隔子和/或一个或
多个跨膜结构域。
[0263] 细胞内信号传导结构域包括通过天然抗原受体模拟或接近信号、通过这种受体与共刺激受体组合模拟或接近信号和/或仅通过共刺激受体模拟或接近信号的那些。在一些
实施方案中，存在短的寡肽或多肽接头例如长度为2至10个氨基酸的接头(如含有甘氨酸和
丝氨酸的接头，例如甘氨酸-丝氨酸双联体)，并在CAR的跨膜结构域与细胞质信号传导结构
域之间形成连接。
实施方案中，存在短的寡肽或多肽接头例如长度为2至10个氨基酸的接头(如含有甘氨酸和
丝氨酸的接头，例如甘氨酸-丝氨酸双联体)，并在CAR的跨膜结构域与细胞质信号传导结构
域之间形成连接。
[0264] 受体例如CAR通常包括至少一种细胞内信号传导组分或多种细胞内信号传导组分。在一些实施方案中，受体包括TCR复合物的细胞内组分，如介导T细胞激活和细胞毒性的
TCR CD3链例如CD3ζ链。因此，在一些方面，所述ROR1结合抗体与一个或多个细胞信号传导
模块连接。在一些实施方案中，细胞信号传导模块包括CD3跨膜结构域、CD3细胞内信号传导
结构域和/或其他CD跨膜结构域。在一些实施方案中，受体(例如CAR)进一步包括一种或多
种另外的分子(如Fc受体γ、CD8、CD4、CD25或CD16)的一部分。例如，在一些方面，所述CAR包括在CD3-zeta(CD3-ζ)或Fc受体γ与CD8、CD4、CD25或CD16之间的嵌合分子。
TCR CD3链例如CD3ζ链。因此，在一些方面，所述ROR1结合抗体与一个或多个细胞信号传导
模块连接。在一些实施方案中，细胞信号传导模块包括CD3跨膜结构域、CD3细胞内信号传导
结构域和/或其他CD跨膜结构域。在一些实施方案中，受体(例如CAR)进一步包括一种或多
种另外的分子(如Fc受体γ、CD8、CD4、CD25或CD16)的一部分。例如，在一些方面，所述CAR包括在CD3-zeta(CD3-ζ)或Fc受体γ与CD8、CD4、CD25或CD16之间的嵌合分子。
[0265] 在一些实施方案中，在连接所述CAR后，所述CAR的胞质结构域或细胞内信号传导结构域激活免疫细胞(例如，工程化以表达所述CAR的T细胞)的正常效应子功能或应答中的
至少一种。例如，在一些情境下，CAR诱导T细胞的功能,如细胞溶解活性或T辅助活性，如细
胞因子或其他因子的分泌。在一些实施方案中，使用抗原受体组分或共刺激分子的细胞内
信号传导结构域的截短部分(例如，如果其转导效应子功能信号的话)代替完整的免疫刺激
链。在一些实施方案中，所述一个或多个细胞内信号传导结构域包括T细胞受体(TCR)的胞
质序列，并且在一些方面还包括共受体(其在天然背景下与这种受体并行起作用以在抗原
受体接合后启动信号转导)和/或此类分子的任何衍生物或变体的那些，和/或具有相同功
能能力的任何合成序列。
至少一种。例如，在一些情境下，CAR诱导T细胞的功能,如细胞溶解活性或T辅助活性，如细
胞因子或其他因子的分泌。在一些实施方案中，使用抗原受体组分或共刺激分子的细胞内
信号传导结构域的截短部分(例如，如果其转导效应子功能信号的话)代替完整的免疫刺激
链。在一些实施方案中，所述一个或多个细胞内信号传导结构域包括T细胞受体(TCR)的胞
质序列，并且在一些方面还包括共受体(其在天然背景下与这种受体并行起作用以在抗原
受体接合后启动信号转导)和/或此类分子的任何衍生物或变体的那些，和/或具有相同功
能能力的任何合成序列。
[0266] 在天然TCR的背景下，完全激活通常不仅需要通过TCR进行信号传导，还需要共刺激信号。因此，在一些实施方案中，为了促进完全激活，用于生成次级或共刺激信号的组分
也被包括在所述CAR中。在其他实施方案中，所述CAR不包括用于生成共刺激信号的组分。在
一些方面，另外的CAR在同一细胞中表达，并且提供用于生成次级或共刺激信号的组分。
也被包括在所述CAR中。在其他实施方案中，所述CAR不包括用于生成共刺激信号的组分。在
一些方面，另外的CAR在同一细胞中表达，并且提供用于生成次级或共刺激信号的组分。
[0267] 在一些方面，将T细胞激活描述为由两个类别的细胞质信号传导序列来介导：通过TCR启动抗原依赖性初级激活的那些序列(初级细胞质信号传导序列)以及以非抗原依赖性
方式作用以提供刺激或共刺激信号的那些序列(次级细胞质信号传导序列)。在一些方面，
CAR包括此类信号传导组分中的一种或两种。
方式作用以提供刺激或共刺激信号的那些序列(次级细胞质信号传导序列)。在一些方面，
CAR包括此类信号传导组分中的一种或两种。
[0268] 在一些方面，所述CAR包括调节所述TCR复合物的初级激活的初级胞质信号传导序列。以刺激方式起作用的初级胞质信号传导序列可以含有信号传导基序(其被称为基于免
疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM)。含有初级细胞质信号传导序列的ITAM的例子包括源自
TCR或CD3ζ、FcRγ或FcRβ的那些。在一些实施方案中，所述CAR中的胞质信号传导分子含有
源自CD3ζ的胞质信号传导结构域、其部分或序列。
疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM)。含有初级细胞质信号传导序列的ITAM的例子包括源自
TCR或CD3ζ、FcRγ或FcRβ的那些。在一些实施方案中，所述CAR中的胞质信号传导分子含有
源自CD3ζ的胞质信号传导结构域、其部分或序列。
[0269] 在一些实施方案中，所述CAR包括共刺激受体(如CD28、4-1BB、OX40、DAP10和ICOS)的信号传导结构域和/或跨膜部分。在一些方面，同一CAR同时包括激活和共刺激组分。
[0270] 在一些实施方案中，激活结构域包括于一个CAR内，然而共刺激组分是由识别另一种抗原的另一种CAR提供。在一些实施方案中，所述CAR包括在同一细胞上表达的激活或刺
激CAR和共刺激CAR(参见WO 2014/055668)。
激CAR和共刺激CAR(参见WO 2014/055668)。
[0271] 在某些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含连接至CD3(例如，CD3-ζ)细胞内结构域的CD28跨膜和信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含连
接至CD3ζ细胞内结构域的嵌合CD28和CD137(4-1BB，TNFRSF9)共刺激结构域。
接至CD3ζ细胞内结构域的嵌合CD28和CD137(4-1BB，TNFRSF9)共刺激结构域。
[0272] 在一些实施方案中，CAR在细胞质部分中包含一个或多个，例如两个或更多个共刺激结构域和激活结构域，例如主激活结构域。示例性CAR包括CD3-ζ、CD28和4-1BB的细胞内
组分。
组分。
[0273] 在一些情况下，CAR被称为第一代、第二代和/或第三代CAR。在一些方面，第一代CAR是在抗原结合后仅提供CD3链诱导的信号的CAR；在一些方面，第二代CAR是提供这种信
号和共刺激信号的CAR，例如包括来自共刺激受体(如CD28或CD137)的细胞内信号传导结构
域的CAR；在一些方面，第三代CAR在一些方面包含不同共刺激受体的多个共刺激结构域的
CAR。
号和共刺激信号的CAR，例如包括来自共刺激受体(如CD28或CD137)的细胞内信号传导结构
域的CAR；在一些方面，第三代CAR在一些方面包含不同共刺激受体的多个共刺激结构域的
CAR。
[0274] 在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括含有本文描述的抗体或抗体片段的细胞外部分。在一些方面，嵌合抗原受体包括含有本文描述的抗体或片段的细胞外部分和细胞内
信号传导结构域。在一些实施方案中，所述抗体或片段包括scFv或单一结构域VH抗体，并且
细胞内结构域含有ITAM。在一些方面，细胞内信号传导结构域包括CD3-zeta(CD3ζ)链的ζ链
的信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括连接细胞外结构域和细胞内信
号传导结构域的跨膜结构域。
信号传导结构域。在一些实施方案中，所述抗体或片段包括scFv或单一结构域VH抗体，并且
细胞内结构域含有ITAM。在一些方面，细胞内信号传导结构域包括CD3-zeta(CD3ζ)链的ζ链
的信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括连接细胞外结构域和细胞内信
号传导结构域的跨膜结构域。
[0275] 在一些方面，跨膜结构域含有CD28的跨膜部分。可以直接或间接地连接细胞外结构域和跨膜结构域。在一些实施方案中，细胞外结构域和跨膜结构域通过间隔子(如本文描
述的任何间隔子)连接。在一些实施方案中，嵌合抗原受体含有T细胞共刺激分子的细胞内
结构域，如在跨膜结构域与细胞内信号传导结构域之间。在一些方面，所述T细胞共刺激分
子是CD28或41BB。
述的任何间隔子)连接。在一些实施方案中，嵌合抗原受体含有T细胞共刺激分子的细胞内
结构域，如在跨膜结构域与细胞内信号传导结构域之间。在一些方面，所述T细胞共刺激分
子是CD28或41BB。
[0276] 在一些实施方案中，CAR含有抗体(例如抗体片段)、是或含有CD28或其功能变体的跨膜部分的跨膜结构域，以及含有CD28或其功能变体的信号传导部分和CD3ζ或其功能变体
的信号传导部分的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR含有抗体例如抗体片
段，跨膜结构域(其是CD28的跨膜部分或其功能变体或含有CD28的跨膜部分或其功能变体)
以及含有4-1BB的信号传导部分或其功能变体和CD3ζ的信号传导部分或其功能变体的细胞
内信号传导结构域。在一些此类实施方案中，所述受体进一步包括含有Ig分子(如人Ig分
子，如Ig铰链，例如IgG4铰链)的一部分的间隔子如仅含铰链的间隔子。
的信号传导部分的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR含有抗体例如抗体片
段，跨膜结构域(其是CD28的跨膜部分或其功能变体或含有CD28的跨膜部分或其功能变体)
以及含有4-1BB的信号传导部分或其功能变体和CD3ζ的信号传导部分或其功能变体的细胞
内信号传导结构域。在一些此类实施方案中，所述受体进一步包括含有Ig分子(如人Ig分
子，如Ig铰链，例如IgG4铰链)的一部分的间隔子如仅含铰链的间隔子。
[0277] 在一些实施方案中，受体(例如CAR)的跨膜结构域是人CD28或其变体的跨膜结构域，例如人CD28(登录号：P10747.1)的27个氨基酸的跨膜结构域，或者是包含SEQ ID NO:77
中所示氨基酸序列或展现与SEQ ID NO:77至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的跨膜结构域；在一些实施方案中，含有重组受体的部分的跨膜结构域包含SEQ ID NO:78
中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:78至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
中所示氨基酸序列或展现与SEQ ID NO:77至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的跨膜结构域；在一些实施方案中，含有重组受体的部分的跨膜结构域包含SEQ ID NO:78
中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:78至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
[0278] 在一些实施方案中，嵌合抗原受体含有T细胞共刺激分子的细胞内结构域。在一些方面，所述T细胞共刺激分子是CD28或41BB。
[0279] 在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含人CD28或其功能变体或部分的细胞内共刺激信号传导结构域，例如其41个氨基酸的结构域，和/或在天然CD28蛋白的位置
186-187处具有LL至GG取代的这种结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域可以
包含SEQ ID NO:79或80中所示的氨基酸序列，或展现与SEQ ID NO:79或80至少或至少约
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞内结构域包含4-1BB或其功能变体
或部分的细胞内共刺激信号传导结构域，如人4-1BB(登录号Q07011.1)或其功能变体或部
分的42个氨基酸的细胞质结构域，例如SEQ ID NO:81中所示的氨基酸序列或展现与SEQ ID
NO:81至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
186-187处具有LL至GG取代的这种结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域可以
包含SEQ ID NO:79或80中所示的氨基酸序列，或展现与SEQ ID NO:79或80至少或至少约
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞内结构域包含4-1BB或其功能变体
或部分的细胞内共刺激信号传导结构域，如人4-1BB(登录号Q07011.1)或其功能变体或部
分的42个氨基酸的细胞质结构域，例如SEQ ID NO:81中所示的氨基酸序列或展现与SEQ ID
NO:81至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
[0280] 在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含人CD3ζ刺激性信号传导结构域或其功能变体，例如人CD3ζ(登录号：P20963.2)的同种型3的112个AA的细胞质结构域或如美
国专利号7,446,190或美国专利号8,911,993中所述的CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方
案中，细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:82、83或84中所示的氨基酸序列或展现与SEQ
ID NO:82、83或84至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
国专利号7,446,190或美国专利号8,911,993中所述的CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方
案中，细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:82、83或84中所示的氨基酸序列或展现与SEQ
ID NO:82、83或84至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
[0281] 在一些方面，所述间隔子仅含有IgG的铰链区，如仅IgG4或IgG1的铰链，如SEQ ID NO:70中所示的仅铰链间隔子。在其他实施方案中，所述间隔子是与CH2和/或CH3结构域连
接的Ig铰链，例如IgG4铰链。在一些实施方案中，所述间隔子是与CH2和CH3结构域连接的Ig
铰链，例如IgG4铰链，如SEQ ID NO:73中所列出。在一些实施方案中，所述间隔子是仅与CH3
结构域连接的Ig铰链，例如IgG4铰链，如SEQ ID NO:72中所列出。在一些实施方案中，所述
间隔子是或包含富甘氨酸-丝氨酸的序列或其他柔性接头，如已知的柔性接头。
接的Ig铰链，例如IgG4铰链。在一些实施方案中，所述间隔子是与CH2和CH3结构域连接的Ig
铰链，例如IgG4铰链，如SEQ ID NO:73中所列出。在一些实施方案中，所述间隔子是仅与CH3
结构域连接的Ig铰链，例如IgG4铰链，如SEQ ID NO:72中所列出。在一些实施方案中，所述
间隔子是或包含富甘氨酸-丝氨酸的序列或其他柔性接头，如已知的柔性接头。
[0282] 2.T细胞受体
[0283] 在一些实施方案中，提供了工程化细胞(如T细胞)，其表达识别靶多肽(如肿瘤、病毒或自身免疫蛋白的抗原)的肽表位或T细胞表位的T细胞受体(TCR)或其抗原结合部分。
[0284] 在一些实施方案中，“T细胞受体”或“TCR”是含有可变α和β链(也分别称为TCRα和TCRβ)或可变γ和δ链(也分别称为TCRα和TCRβ)的分子或其抗原结合部分，并且其能够特异性结合至与MHC分子结合的肽。在一些实施方案中，所述TCR呈αβ形式。通常，以αβ和γδ形式存在的TCR一般在结构上相似，但是表达它们的T细胞可以具有不同的解剖位置或功能。TCR
可以在细胞的表面上发现或以可溶形式发现。通常，发现TCR在T细胞(或T淋巴细胞)的表面
上，在此处它通常负责识别与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的抗原。
可以在细胞的表面上发现或以可溶形式发现。通常，发现TCR在T细胞(或T淋巴细胞)的表面
上，在此处它通常负责识别与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的抗原。
[0285] 除非另有说明，否则术语“TCR”应理解为涵盖完整的TCR以及其抗原结合部分或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述TCR是完整或全长TCR，包括呈αβ形式或γδ形式的
TCR。在一些实施方案中，所述TCR是这样的抗原结合部分，其少于全长TCR但与在MHC分子中
结合的特定肽结合(如与MHC-肽复合物结合)。在一些情况下，TCR的抗原结合部分或片段可
以仅含有全长或完整TCR的结构性结构域的一部分，但是仍能够结合与完整TCR结合的肽表
位(如MHC-肽复合物)。在一些情况下，抗原结合部分含有TCR的可变结构域(如TCR的可变α
链和可变β链)，足以形成用于与特定MHC-肽复合物结合的结合位点。通常，TCR的可变链含
有参与肽、MHC和/或MHC-肽复合物的识别的互补决定区。
TCR。在一些实施方案中，所述TCR是这样的抗原结合部分，其少于全长TCR但与在MHC分子中
结合的特定肽结合(如与MHC-肽复合物结合)。在一些情况下，TCR的抗原结合部分或片段可
以仅含有全长或完整TCR的结构性结构域的一部分，但是仍能够结合与完整TCR结合的肽表
位(如MHC-肽复合物)。在一些情况下，抗原结合部分含有TCR的可变结构域(如TCR的可变α
链和可变β链)，足以形成用于与特定MHC-肽复合物结合的结合位点。通常，TCR的可变链含
有参与肽、MHC和/或MHC-肽复合物的识别的互补决定区。
[0286] 在一些实施方案中，TCR的可变结构域含有超变环或互补决定区(CDR)，其通常是抗原识别和结合能力和特异性的主要贡献者。在一些实施方案中，TCR的CDR或其组合形成
给定TCR分子的全部或基本上全部的抗原结合位点。TCR链的可变区内的各个CDR通常由框
架区(FR)隔开，与CDR相比，所述框架区通常在TCR分子之间展示较低可变性(参见，例如，
Jores等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.U.S.A.87:9138,1990；Chothia等人,EMBO J.7:3745,
1988；还参见Lefranc等人,Dev.Comp.Immunol.27:55,2003)。在一些实施方案中，CDR3是负
责抗原结合或特异性的主要CDR，或者是在给定TCR可变区的用于所述肽-MHC复合物的加工
肽部分的抗原识别和/或用于与其相互作用的三个CDR中最重要的CDR。在一些情境下，所述
α链的CDR1可以与某些抗原肽的N末端部分相互作用。在一些情境下，所述β链的CDR1可以与
所述肽的C末端部分相互作用。在一些情境下，CDR2对与所述MHC-肽复合物的MHC部分的相
互作用或识别具有最强的作用或者是主要的负责CDR。在一些实施方案中，所述β-链的可变
区可以含有另外的高变区(CDR4或HVR4)，其通常参与超抗原结合而非抗原识别(Kotb
(1995)Clinical Microbiology Reviews,8:411-426)。
给定TCR分子的全部或基本上全部的抗原结合位点。TCR链的可变区内的各个CDR通常由框
架区(FR)隔开，与CDR相比，所述框架区通常在TCR分子之间展示较低可变性(参见，例如，
Jores等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.U.S.A.87:9138,1990；Chothia等人,EMBO J.7:3745,
1988；还参见Lefranc等人,Dev.Comp.Immunol.27:55,2003)。在一些实施方案中，CDR3是负
责抗原结合或特异性的主要CDR，或者是在给定TCR可变区的用于所述肽-MHC复合物的加工
肽部分的抗原识别和/或用于与其相互作用的三个CDR中最重要的CDR。在一些情境下，所述
α链的CDR1可以与某些抗原肽的N末端部分相互作用。在一些情境下，所述β链的CDR1可以与
所述肽的C末端部分相互作用。在一些情境下，CDR2对与所述MHC-肽复合物的MHC部分的相
互作用或识别具有最强的作用或者是主要的负责CDR。在一些实施方案中，所述β-链的可变
区可以含有另外的高变区(CDR4或HVR4)，其通常参与超抗原结合而非抗原识别(Kotb
(1995)Clinical Microbiology Reviews,8:411-426)。
[0287] 在一些实施方案中，TCR还可以含有恒定结构域、跨膜结构域和/或短细胞质尾(参见，例如，Janeway等人,Immunobiology:The Immune System in Health and Disease,第3
版,Current Biology Publications,p.4:33,1997)。在一些方面，TCR的每条链可以具有一
个N末端免疫球蛋白可变结构域、一个免疫球蛋白恒定结构域、跨膜区和位于C末端的短细
胞质尾。在一些实施方案中，TCR与参与介导信号转导的CD3复合物的不变蛋白质缔合。
版,Current Biology Publications,p.4:33,1997)。在一些方面，TCR的每条链可以具有一
个N末端免疫球蛋白可变结构域、一个免疫球蛋白恒定结构域、跨膜区和位于C末端的短细
胞质尾。在一些实施方案中，TCR与参与介导信号转导的CD3复合物的不变蛋白质缔合。
[0288] 在一些实施方案中，TCR链含有一个或多个恒定结构域。例如，给定TCR链的细胞外部分(例如，α链或β链)可以含有与细胞膜相邻的两个免疫球蛋白样结构域，例如可变结构
域(例如，Vα或Vβ；通常基于Kabat编号的氨基酸1至116，Kabat等人,“Sequences of
Proteins of Immunological Interest”,US Dept.Health and Human Services,Public
Health Service National Institutes of Health,1991,第5版)和恒定结构域(例如，α链
恒定域或Cα，通常基于Kabat编号的位置117至259，或β链恒定结构域或Cβ，通常基于Kabat
的链的位置117至295)。例如，在一些情况下，由两条链形成的TCR的细胞外部分含有两个膜
近端恒定结构域和两个膜远端可变结构域，其中可变结构域各自含有CDR。TCR的恒定结构
域可含有短连接序列，其中半胱氨酸残基形成二硫键，由此连接TCR的两条链。在一些实施
方案中，TCR可在每条α和β链中具有另外的半胱氨酸残基，使得TCR在恒定结构域中含有两
个二硫键。
域(例如，Vα或Vβ；通常基于Kabat编号的氨基酸1至116，Kabat等人,“Sequences of
Proteins of Immunological Interest”,US Dept.Health and Human Services,Public
Health Service National Institutes of Health,1991,第5版)和恒定结构域(例如，α链
恒定域或Cα，通常基于Kabat编号的位置117至259，或β链恒定结构域或Cβ，通常基于Kabat
的链的位置117至295)。例如，在一些情况下，由两条链形成的TCR的细胞外部分含有两个膜
近端恒定结构域和两个膜远端可变结构域，其中可变结构域各自含有CDR。TCR的恒定结构
域可含有短连接序列，其中半胱氨酸残基形成二硫键，由此连接TCR的两条链。在一些实施
方案中，TCR可在每条α和β链中具有另外的半胱氨酸残基，使得TCR在恒定结构域中含有两
个二硫键。
[0289] 在一些实施方案中，所述TCR链含有跨膜结构域。在一些实施方案中，所述跨膜结构域带正电荷。在一些情况下，所述TCR链含有胞质尾。在一些情况下，结构允许TCR与其他
分子(如CD3和其亚基)缔合。例如，含有恒定结构域与跨膜区的TCR可以将所述蛋白质锚定
在细胞膜中并与所述CD3信号传导装置或复合物的不变亚基缔合。CD3信号传导亚基(例如，
CD3γ、CD3δ、CD3ε和CD3ζ链)的细胞内尾含有TCR复合物的信号传导能力中所涉及的一个或
多个基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM。
分子(如CD3和其亚基)缔合。例如，含有恒定结构域与跨膜区的TCR可以将所述蛋白质锚定
在细胞膜中并与所述CD3信号传导装置或复合物的不变亚基缔合。CD3信号传导亚基(例如，
CD3γ、CD3δ、CD3ε和CD3ζ链)的细胞内尾含有TCR复合物的信号传导能力中所涉及的一个或
多个基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM。
[0290] 在一些实施方案中，TCR可以是两条链α和β(或者任选地γ和δ)的异二聚体，或者其可以是单链TCR构建体。在一些实施方案中，TCR是含有两条单独链(α和β链或γ和δ链)的
异二聚体，所述链是通过例如一个或多个二硫键连接。
异二聚体，所述链是通过例如一个或多个二硫键连接。
[0291] 在一些实施方案中，TCR可以从一个或多个已知的TCR序列(如Vα,β链的序列)产生，所述一个或多个已知的TCR序列的基本上全长的编码序列是易于获得的。用于从细胞来
源获得全长TCR序列(包括V链序列)的方法是熟知的。在一些实施方案中，编码TCR的核酸可
以从多种来源获得，如通过一种或多种给定细胞内的或从所述一种或多种给定细胞分离的
编码TCR的核酸的聚合酶链式反应(PCR)扩增获得，或者通过公众可获得的TCR DNA序列的
合成获得。
源获得全长TCR序列(包括V链序列)的方法是熟知的。在一些实施方案中，编码TCR的核酸可
以从多种来源获得，如通过一种或多种给定细胞内的或从所述一种或多种给定细胞分离的
编码TCR的核酸的聚合酶链式反应(PCR)扩增获得，或者通过公众可获得的TCR DNA序列的
合成获得。
[0292] 在一些实施方案中，TCR是从生物来源获得，如来自细胞(如来自T细胞，例如细胞毒性T细胞)、T细胞杂交瘤或其他公众可获得的来源。在一些实施方案中，T细胞可以从体内
分离的细胞获得。在一些实施方案中，TCR是胸腺选择的TCR。在一些实施方案中，TCR是新表
位限制性TCR。在一些实施方案中，T细胞可以是培养的T细胞杂交瘤或克隆。在一些实施方
案中，TCR或其抗原结合部分可以从TCR序列的知识合成地产生。
分离的细胞获得。在一些实施方案中，TCR是胸腺选择的TCR。在一些实施方案中，TCR是新表
位限制性TCR。在一些实施方案中，T细胞可以是培养的T细胞杂交瘤或克隆。在一些实施方
案中，TCR或其抗原结合部分可以从TCR序列的知识合成地产生。
[0293] 在一些实施方案中，TCR是从通过针对靶多肽抗原或其靶T细胞表位筛选候选TCR文库而鉴定或选择的TCR产生的。TCR文库可以通过扩增来自T细胞的Vα和Vβ库来产生，所述
T细胞是从受试者分离，包括存在于PBMC、脾或其他淋巴器官中的细胞。在一些情况下，T细
胞可以从肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增。在一些实施方案中，可以从CD4+或CD8+细胞产生
TCR文库。在一些实施方案中，所述TCR可以从正常或健康受试者的T细胞来源扩增，即正常
TCR文库。在一些实施方案中，所述TCR可以从患病受试者的T细胞来源扩增，即患病TCR文
库。在一些实施方案中，使用简并引物扩增Vα和Vβ的基因库，如通过在从人获得的样品(如T
细胞)中进行RT-PCR。在一些实施方案中，scTv文库可以从天然Vα和Vβ文库组装，其中扩增
的产物被克隆或组装以通过接头分开。取决于受试者和细胞的来源，所述文库可以是HLA等
位基因特异性的。可替代地，在一些实施方案中，TCR文库可以通过亲本或支架TCR分子的诱
变或多样化产生。在一些方面，所述TCR经受定向进化，如通过诱变例如所述α或β链。在一些方面，所述TCR的CDR内的特定残基被改变。在一些实施方案中，可以通过亲和力成熟来修饰
选择的TCR。在一些实施方案中，可以选择抗原特异性T细胞，如通过筛选以评估针对所述肽
的CTL活性。在一些方面，可以选择例如存在于抗原特异性T细胞上的TCR，如通过结合活性，
例如对所述抗原的特定亲和力或亲合力。
T细胞是从受试者分离，包括存在于PBMC、脾或其他淋巴器官中的细胞。在一些情况下，T细
胞可以从肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增。在一些实施方案中，可以从CD4+或CD8+细胞产生
TCR文库。在一些实施方案中，所述TCR可以从正常或健康受试者的T细胞来源扩增，即正常
TCR文库。在一些实施方案中，所述TCR可以从患病受试者的T细胞来源扩增，即患病TCR文
库。在一些实施方案中，使用简并引物扩增Vα和Vβ的基因库，如通过在从人获得的样品(如T
细胞)中进行RT-PCR。在一些实施方案中，scTv文库可以从天然Vα和Vβ文库组装，其中扩增
的产物被克隆或组装以通过接头分开。取决于受试者和细胞的来源，所述文库可以是HLA等
位基因特异性的。可替代地，在一些实施方案中，TCR文库可以通过亲本或支架TCR分子的诱
变或多样化产生。在一些方面，所述TCR经受定向进化，如通过诱变例如所述α或β链。在一些方面，所述TCR的CDR内的特定残基被改变。在一些实施方案中，可以通过亲和力成熟来修饰
选择的TCR。在一些实施方案中，可以选择抗原特异性T细胞，如通过筛选以评估针对所述肽
的CTL活性。在一些方面，可以选择例如存在于抗原特异性T细胞上的TCR，如通过结合活性，
例如对所述抗原的特定亲和力或亲合力。
[0294] 在一些实施方案中，TCR或其抗原结合部分是已经修饰或工程化的。在一些实施方案中，使用定向进化方法来产生具有改变的特性如具有较高的对特定MHC-肽复合物的亲和
力的TCR。在一些实施方案中，通过展示方法来实现定向进化，所述展示方法包括但不限于
酵母展示(Holler等人，(2003)Nat Immunol,4,55-62；Holler等人(2000)Proc Natl Acad
Sci U S A,97,5387-92)、噬菌体展示(Li等人(2005)Nat Biotechnol,23,349-54)、或T细
胞展示(Chervin等人(2008)J Immunol Methods,339,175-84)。在一些实施方案中，展示途
径涉及工程化或修饰已知的亲本或参考TCR。例如，在一些情况下，野生型TCR可以用作模板
以用于产生诱变的TCR，其中CDR的一个或多个残基被突变，并且选择具有所需改变的特性
(如对所需靶抗原具有更高的亲和力)的突变体。
力的TCR。在一些实施方案中，通过展示方法来实现定向进化，所述展示方法包括但不限于
酵母展示(Holler等人，(2003)Nat Immunol,4,55-62；Holler等人(2000)Proc Natl Acad
Sci U S A,97,5387-92)、噬菌体展示(Li等人(2005)Nat Biotechnol,23,349-54)、或T细
胞展示(Chervin等人(2008)J Immunol Methods,339,175-84)。在一些实施方案中，展示途
径涉及工程化或修饰已知的亲本或参考TCR。例如，在一些情况下，野生型TCR可以用作模板
以用于产生诱变的TCR，其中CDR的一个或多个残基被突变，并且选择具有所需改变的特性
(如对所需靶抗原具有更高的亲和力)的突变体。
[0295] 在一些实施方案中，用于产生或生成目标TCR的靶多肽的肽是已知的或可以由熟练技术人员容易地鉴定。在一些实施方案中，适用于产生TCR或抗原结合部分的肽可以基于
目标靶多肽(如下文所述的靶多肽)中HLA限制性基序的存在来确定。在一些实施方案中，使
用本领域技术人员已知的计算机预测模型鉴定肽。在一些实施方案中，对于预测MHC I类结
合位点，此类模型包括但不限于ProPred1(Singh和Raghava(2001)Bioinformatics17(12):
1236-1237)和SYFPEITHI(参见Schuler等人(2007)Immunoinformatics Methods in
Molecular Biology,409(1):75-93 2007)。在一些实施方案中，MHC限制性表位是HLA-
A0201，其在所有高加索人的约39％-46％中表达，并因此代表用于制备TCR或其他MHC-肽结
合分子的MHC抗原的合适选择。
目标靶多肽(如下文所述的靶多肽)中HLA限制性基序的存在来确定。在一些实施方案中，使
用本领域技术人员已知的计算机预测模型鉴定肽。在一些实施方案中，对于预测MHC I类结
合位点，此类模型包括但不限于ProPred1(Singh和Raghava(2001)Bioinformatics17(12):
1236-1237)和SYFPEITHI(参见Schuler等人(2007)Immunoinformatics Methods in
Molecular Biology,409(1):75-93 2007)。在一些实施方案中，MHC限制性表位是HLA-
A0201，其在所有高加索人的约39％-46％中表达，并因此代表用于制备TCR或其他MHC-肽结
合分子的MHC抗原的合适选择。
[0296] 使用计算机预测模型的HLA-A0201结合基序以及蛋白酶体和免疫蛋白酶体的切割位点是本领域技术人员已知的。对于预测MHC I类结合位点，此类模型包括但不限于
ProPred1(更详细地描述于Singh和Raghava,ProPred:prediction of HLA-DR binding
sites.BIOINFORMATICS 17(12):1236-12372001中)和SYFPEITHI(参见Schuler等人
SYFPEITHI,Database for Searching and T-Cell Epitope Prediction.于
Immunoinformatics Methods in Molecular Biology,第409(1)卷:75-93 2007)。
ProPred1(更详细地描述于Singh和Raghava,ProPred:prediction of HLA-DR binding
sites.BIOINFORMATICS 17(12):1236-12372001中)和SYFPEITHI(参见Schuler等人
SYFPEITHI,Database for Searching and T-Cell Epitope Prediction.于
Immunoinformatics Methods in Molecular Biology,第409(1)卷:75-93 2007)。
[0297] 在一些实施方案中，所述TCR或其抗原结合部分可以是重组产生的天然蛋白质或其突变形式(其中一种或多种特性(如结合特征)已经被改变)。在一些实施方案中，TCR可以
来源于各种动物物种之一，如人、小鼠、大鼠或其他哺乳动物。TCR可以是细胞结合的或呈可
溶形式。在一些实施方案中，出于所提供的方法的目的，所述TCR呈在细胞的表面上表达的
细胞结合形式。
来源于各种动物物种之一，如人、小鼠、大鼠或其他哺乳动物。TCR可以是细胞结合的或呈可
溶形式。在一些实施方案中，出于所提供的方法的目的，所述TCR呈在细胞的表面上表达的
细胞结合形式。
[0298] 在一些实施方案中，所述TCR是全长TCR。在一些实施方案中，所述TCR是抗原结合部分。在一些实施方案中，所述TCR是二聚体TCR(dTCR)。在一些实施方案中，所述TCR是单链
TCR(sc-TCR)。在一些实施方案中，dTCR或scTCR具有如WO 03/020763、WO 04/033685、WO
2011/044186中所述的结构。
TCR(sc-TCR)。在一些实施方案中，dTCR或scTCR具有如WO 03/020763、WO 04/033685、WO
2011/044186中所述的结构。
[0299] 在一些实施方案中，TCR含有对应于跨膜序列的序列。在一些实施方案中，所述TCR确实含有对应于胞质序列的序列。在一些实施方案中，所述TCR能够与CD3形成TCR复合物。
在一些实施方案中，任何TCR(包括dTCR或scTCR)可以与在T细胞的表面上产生活性TCR的信
号传导结构域连接。在一些实施方案中，所述TCR在细胞的表面上表达。
在一些实施方案中，任何TCR(包括dTCR或scTCR)可以与在T细胞的表面上产生活性TCR的信
号传导结构域连接。在一些实施方案中，所述TCR在细胞的表面上表达。
[0300] 在一些实施方案中，dTCR含有第一多肽(其中对应于TCRα链可变区序列的序列与对应于TCRα链恒定区细胞外序列的序列的N末端融合)和第二多肽(其中对应于TCRβ链可变
区序列的序列与对应于TCRβ链恒定区细胞外序列的序列的N末端融合)，所述第一和第二多
肽通过二硫键连接。在一些实施方案中，所述键可以对应于天然二聚αβTCR中存在的天然链
间二硫键。在一些实施方案中，所述链间二硫键不存在于天然TCR中。例如，在一些实施方案
中，可以将一个或多个半胱氨酸掺入dTCR多肽对的恒定区细胞外序列中。在一些情况下，可
能需要天然和非天然二硫键。在一些实施方案中，所述TCR含有跨膜序列以锚定至膜。
区序列的序列与对应于TCRβ链恒定区细胞外序列的序列的N末端融合)，所述第一和第二多
肽通过二硫键连接。在一些实施方案中，所述键可以对应于天然二聚αβTCR中存在的天然链
间二硫键。在一些实施方案中，所述链间二硫键不存在于天然TCR中。例如，在一些实施方案
中，可以将一个或多个半胱氨酸掺入dTCR多肽对的恒定区细胞外序列中。在一些情况下，可
能需要天然和非天然二硫键。在一些实施方案中，所述TCR含有跨膜序列以锚定至膜。
[0301] 在一些实施方案中，dTCR含有TCRα链(含有可变α结构域、恒定α结构域和附接至恒定α结构域C末端的第一二聚化基序)和TCRβ链(包含可变β结构域、恒定β结构域和附接至恒
定β结构域C末端的第一二聚化基序)，其中所述第一和第二二聚化基序易于相互作用以在
第一二聚化基序的氨基酸与第二二聚化基序的氨基酸之间形成共价键，从而将TCRα链与
TCRβ链连接在一起。
定β结构域C末端的第一二聚化基序)，其中所述第一和第二二聚化基序易于相互作用以在
第一二聚化基序的氨基酸与第二二聚化基序的氨基酸之间形成共价键，从而将TCRα链与
TCRβ链连接在一起。
[0302] 在一些实施方案中，TCR是scTCR。通常，可以使用本领域技术人员已知的方法来生成scTCR，参见例如，Soo Hoo,W.F.等人PNAS(USA)89,4759(1992)；Wülfing,C.和Plü
ckthun,A.,J.Mol.Biol.242,655(1994)；Kurucz,I.等人PNAS(USA)90 3830(1993)；国际公
开的PCT号WO 96/13593、WO 96/18105、WO 99/60120、WO 99/18129、WO 03/020763、WO
2011/044186；以及Schlueter,C.J.等人J.Mol.Biol.256,859(1996)。在一些实施方案中，
scTCR含有引入的非天然链间二硫键以促进TCR链的缔合(参见，例如，国际公开PCT号WO
03/020763)。在一些实施方案中，scTCR是非二硫键连接的截短的TCR，其中与其C末端融合
的异源亮氨酸拉链促进链缔合(参见例如国际公开的PCT号WO 99/60120)。在一些实施方案
中，scTCR含有经由肽接头与TCRβ可变结构域共价连接的TCRα可变结构域(参见例如，国际
公开的PCT号WO 99/18129)。
ckthun,A.,J.Mol.Biol.242,655(1994)；Kurucz,I.等人PNAS(USA)90 3830(1993)；国际公
开的PCT号WO 96/13593、WO 96/18105、WO 99/60120、WO 99/18129、WO 03/020763、WO
2011/044186；以及Schlueter,C.J.等人J.Mol.Biol.256,859(1996)。在一些实施方案中，
scTCR含有引入的非天然链间二硫键以促进TCR链的缔合(参见，例如，国际公开PCT号WO
03/020763)。在一些实施方案中，scTCR是非二硫键连接的截短的TCR，其中与其C末端融合
的异源亮氨酸拉链促进链缔合(参见例如国际公开的PCT号WO 99/60120)。在一些实施方案
中，scTCR含有经由肽接头与TCRβ可变结构域共价连接的TCRα可变结构域(参见例如，国际
公开的PCT号WO 99/18129)。
[0303] 在一些实施方案中，scTCR含有由对应于TCRα链可变区的氨基酸序列构成的第一区段、由对应于TCRβ链可变区序列的氨基酸序列构成的第二区段(融合至对应于TCRβ链恒
定结构域细胞外序列的氨基酸序列的N末端)和将第一区段的C末端连接至第二区段的N末
端的接头序列。
定结构域细胞外序列的氨基酸序列的N末端)和将第一区段的C末端连接至第二区段的N末
端的接头序列。
[0304] 在一些实施方案中，scTCR含有第一区段(其由与α链细胞外恒定结构域序列的N末端融合的α链可变区序列构成)和第二区段(其由与序列β链细胞外恒定和跨膜序列的N末端
融合的β链可变区序列构成)以及任选地接头序列(其将所述第一区段的C末端连接至所述
第二区段的N末端)。
融合的β链可变区序列构成)以及任选地接头序列(其将所述第一区段的C末端连接至所述
第二区段的N末端)。
[0305] 在一些实施方案中，scTCR含有第一区段(其由与β链细胞外恒定结构域序列的N末端融合的TCRβ链可变区序列构成)和第二区段(其由与序列α链细胞外恒定和跨膜序列的N
末端融合的α链可变区序列构成)以及任选地接头序列(其将所述第一区段的C末端连接至
所述第二区段的N末端)。
末端融合的α链可变区序列构成)以及任选地接头序列(其将所述第一区段的C末端连接至
所述第二区段的N末端)。
[0306] 在一些实施方案中，scTCR的连接所述第一和第二TCR区段的接头可以是能够形成单多肽链同时保留TCR结合特异性的任何接头。在一些实施方案中，接头序列可例如具有
式-P-AA-P-，其中P是脯氨酸并且AA代表氨基酸序列，其中所述氨基酸是甘氨酸和丝氨酸。
在一些实施方案中，所述第一和第二区段配对，使得其可变区序列定向用于这种结合。因
此，在一些情况下，所述接头具有足够的长度以跨越所述第一区段的C末端与所述第二区段
的N末端之间的距离，或反之亦然，但是不能太长以阻断或减少所述scTCR与所述靶配体的
结合。在一些实施方案中，所述接头可以含有为或为约10至45个氨基酸，如10至30个氨基酸
或26至41个氨基酸残基，例如29、30、31或32个氨基酸。在一些实施方案中，所述接头具有
式-PGGG-(SGGGG)5-P-，其中P是脯氨酸，G是甘氨酸，并且S是丝氨酸(SEQ ID NO:89)。在一
些实施方案中，所述接头具有序列GSADDAKKDAAKKDGKS(SEQ ID NO:90)
式-P-AA-P-，其中P是脯氨酸并且AA代表氨基酸序列，其中所述氨基酸是甘氨酸和丝氨酸。
在一些实施方案中，所述第一和第二区段配对，使得其可变区序列定向用于这种结合。因
此，在一些情况下，所述接头具有足够的长度以跨越所述第一区段的C末端与所述第二区段
的N末端之间的距离，或反之亦然，但是不能太长以阻断或减少所述scTCR与所述靶配体的
结合。在一些实施方案中，所述接头可以含有为或为约10至45个氨基酸，如10至30个氨基酸
或26至41个氨基酸残基，例如29、30、31或32个氨基酸。在一些实施方案中，所述接头具有
式-PGGG-(SGGGG)5-P-，其中P是脯氨酸，G是甘氨酸，并且S是丝氨酸(SEQ ID NO:89)。在一
些实施方案中，所述接头具有序列GSADDAKKDAAKKDGKS(SEQ ID NO:90)
[0307] 在一些实施方案中，scTCR含有共价二硫键，其将α链的恒定结构域的免疫球蛋白区域的残基连接至β链的恒定结构域的免疫球蛋白区域的残基。在一些实施方案中，天然
TCR中不存在链间二硫键。例如，在一些实施方案中，可以将一个或多个半胱氨酸掺入scTCR
多肽的第一和第二区段的恒定区细胞外序列中。在一些情况下，可能需要天然和非天然二
硫键。
TCR中不存在链间二硫键。例如，在一些实施方案中，可以将一个或多个半胱氨酸掺入scTCR
多肽的第一和第二区段的恒定区细胞外序列中。在一些情况下，可能需要天然和非天然二
硫键。
[0308] 在含有引入的链间二硫键的dTCR或scTCR的一些实施方案中，不存在天然二硫键。在一些实施方案中，用形成天然链间二硫键的一个或多个天然半胱氨酸取代另一残基，如
取代丝氨酸或丙氨酸。在一些实施方案中，可以通过使第一和第二区段上的非半胱氨酸残
基突变为半胱氨酸来形成引入的二硫键。TCR的示例性非天然二硫键描述于已公开的国际
PCT号WO 2006/000830中。
取代丝氨酸或丙氨酸。在一些实施方案中，可以通过使第一和第二区段上的非半胱氨酸残
基突变为半胱氨酸来形成引入的二硫键。TCR的示例性非天然二硫键描述于已公开的国际
PCT号WO 2006/000830中。
[0309] 在一些实施方案中，TCR或其抗原结合片段对靶抗原以平衡结合常数展现亲和力，所述平衡结合常数是在或在约10-5M与10-12M之间以及其中的所有单独值和范围。在一些
实施方案中，靶抗原是MHC-肽复合物或配体。
实施方案中，靶抗原是MHC-肽复合物或配体。
[0310] 在一些实施方案中，编码TCR(如α和β链)的一种或多种核酸可以通过PCR、克隆或其他合适的方法扩增，并且克隆到合适的表达载体中。所述表达载体可以是任何合适的重
组表达载体，并且可以用于转化或转染任何合适的宿主。合适的载体包括设计用于繁殖和
扩增或用于表达或用于两者的那些，如质粒和病毒。
组表达载体，并且可以用于转化或转染任何合适的宿主。合适的载体包括设计用于繁殖和
扩增或用于表达或用于两者的那些，如质粒和病毒。
[0311] 在一些实施方案中，载体可以是以下系列的载体：pUC系列(Fermentas Life Sciences)、pBluescript系列(Stratagene，加利福尼亚州拉霍亚)、pET系列(Novagen，威斯
康星州麦迪逊)、pGEX系列(Pharmacia Biotech，瑞典乌普萨拉)或pEX系列(Clontech，加利
福尼亚州帕罗奥图)。在一些情况下，也可以使用噬菌体载体，如λG10、λGT11、λZapII
(Stratagene)、λEMBL4和λNM1149。在一些实施方案中，可以使用植物表达载体，并且包括
pBI01、pBI101.2、pBI101.3、pBI121和pBIN19(Clontech)。在一些实施方案中，动物表达载
体包括pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo(Clontech)。在一些实施方案中，使用病毒载体，如逆转录
病毒载体。
康星州麦迪逊)、pGEX系列(Pharmacia Biotech，瑞典乌普萨拉)或pEX系列(Clontech，加利
福尼亚州帕罗奥图)。在一些情况下，也可以使用噬菌体载体，如λG10、λGT11、λZapII
(Stratagene)、λEMBL4和λNM1149。在一些实施方案中，可以使用植物表达载体，并且包括
pBI01、pBI101.2、pBI101.3、pBI121和pBIN19(Clontech)。在一些实施方案中，动物表达载
体包括pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo(Clontech)。在一些实施方案中，使用病毒载体，如逆转录
病毒载体。
[0312] 在一些实施方案中，可以使用标准重组DNA技术来制备所述重组表达载体。在一些实施方案中，载体可以含有调节序列，如转录和翻译起始和终止密码子，其对引入载体的宿
主(例如，细菌、真菌，植物或动物)的类型具特异性，酌情并考虑所述载体是基于DNA还是基
于RNA。在一些实施方案中，载体可以含有非天然启动子，其可操作地连接至编码TCR或抗原
结合部分(或其他MHC-肽结合分子)的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述启动子可以是
非病毒启动子或病毒启动子，如巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子和在鼠干
细胞病毒的长末端重复序列中发现的启动子。还考虑了熟练技术人员已知的其他启动子。
主(例如，细菌、真菌，植物或动物)的类型具特异性，酌情并考虑所述载体是基于DNA还是基
于RNA。在一些实施方案中，载体可以含有非天然启动子，其可操作地连接至编码TCR或抗原
结合部分(或其他MHC-肽结合分子)的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述启动子可以是
非病毒启动子或病毒启动子，如巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子和在鼠干
细胞病毒的长末端重复序列中发现的启动子。还考虑了熟练技术人员已知的其他启动子。
[0313] 在一些实施方案中，为了产生编码TCR的载体，将α和β链从表达目标TCR的T细胞克隆分离的总cDNA进行PCR扩增，并将其克隆到表达载体中。在一些实施方案中，将所述α和β
链克隆到同一载体中。在一些实施方案中，将所述α和β链克隆到不同的载体中。在一些实施
方案中，将所产生的α和β链掺入逆转录病毒(例如慢病毒)载体中。
链克隆到同一载体中。在一些实施方案中，将所述α和β链克隆到不同的载体中。在一些实施
方案中，将所产生的α和β链掺入逆转录病毒(例如慢病毒)载体中。
[0314] 3.嵌合自身抗体受体(CAAR)
[0315] 在一些实施方案中，重组受体是嵌合自身抗体受体(CAAR)。在一些实施方案中，CAAR对自身抗体具有特异性。在一些实施方案中，表达CAAR的细胞(例如工程化以表达CAAR
的T细胞)可以用于特异性地结合至并杀伤表达自身抗体的细胞，而不是表达正常抗体的细
胞。在一些实施方案中，表达CAAR的细胞可以用于治疗与自身抗原的表达相关的自身免疫
性疾病，例如自身免疫性疾病。在一些实施方案中，表达CAAR的细胞可以靶向最终产生自身
抗体并在其细胞表面上展示所述自身抗体的B细胞，将这些B细胞标记为治疗干预的疾病特
异性靶标。在一些实施方案中，CAAR表达细胞可以用于通过使用抗原特异性嵌合自身抗体
受体靶向引起疾病的B细胞，有效靶向和杀伤自身免疫性疾病中的致病性B细胞。在一些实
施方案中，重组受体是CAAR，例如美国专利申请公开号US 2017/0051035中所述的任何一
种。
的T细胞)可以用于特异性地结合至并杀伤表达自身抗体的细胞，而不是表达正常抗体的细
胞。在一些实施方案中，表达CAAR的细胞可以用于治疗与自身抗原的表达相关的自身免疫
性疾病，例如自身免疫性疾病。在一些实施方案中，表达CAAR的细胞可以靶向最终产生自身
抗体并在其细胞表面上展示所述自身抗体的B细胞，将这些B细胞标记为治疗干预的疾病特
异性靶标。在一些实施方案中，CAAR表达细胞可以用于通过使用抗原特异性嵌合自身抗体
受体靶向引起疾病的B细胞，有效靶向和杀伤自身免疫性疾病中的致病性B细胞。在一些实
施方案中，重组受体是CAAR，例如美国专利申请公开号US 2017/0051035中所述的任何一
种。
[0316] 在一些实施方案中，CAAR包含自身抗体结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导区域。在一些实施方案中，细胞内信号传导区域包含细胞内信号传导结构域。在一些实施
方案中，细胞内信号传导结构域是或包含主要信号传导结构域、能够在T细胞中诱导初级激
活信号的信号传导结构域、T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域和/或包含基于免疫受
体酪氨酸的激活基序(ITAM)的信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导区域
包含次级或共刺激信号传导区域(次级细胞内信号传导区域)。
方案中，细胞内信号传导结构域是或包含主要信号传导结构域、能够在T细胞中诱导初级激
活信号的信号传导结构域、T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域和/或包含基于免疫受
体酪氨酸的激活基序(ITAM)的信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导区域
包含次级或共刺激信号传导区域(次级细胞内信号传导区域)。
[0317] 在一些实施方案中，自身抗体结合结构域包含自身抗原或其片段。自身抗原的选择可以取决于所靶向的自身抗体的类型。例如，所述自身抗原的选择可能是由于其识别与
特定疾病状态(例如自身免疫性疾病，例如自身抗体介导的自身免疫性疾病)相关的靶细胞
(例如B细胞)上的自身抗体。在一些实施方案中，自身免疫性疾病包括寻常型天疱疮(PV)。
示例性自身抗原包括桥粒芯糖蛋白1(Dsg1)和Dsg3。
特定疾病状态(例如自身免疫性疾病，例如自身抗体介导的自身免疫性疾病)相关的靶细胞
(例如B细胞)上的自身抗体。在一些实施方案中，自身免疫性疾病包括寻常型天疱疮(PV)。
示例性自身抗原包括桥粒芯糖蛋白1(Dsg1)和Dsg3。
[0318] B.核酸和载体
[0319] 提供了编码细胞表面缀合物和重组受体的多核苷酸(核酸分子)、用于将细胞基因工程化以表达此类缀合物和受体的载体、以及用于产生所述工程化细胞的方法。
[0320] 在一些实施方案中，提供了编码本文提供的任何细胞表面缀合物的多核苷酸。在一些方面，所述多核苷酸含有单一编码序列，如仅编码细胞表面缀合物的编码序列。在其他
情形中，所述多核苷酸含有至少两个不同的编码序列，如编码细胞表面缀合物的第一核酸
序列和编码重组受体的第二核酸序列。在一些方面，所述重组受体是或含有嵌合抗原受体
(CAR)。在一些方面，所述重组受体是或含有T细胞受体(TCR)，例如转基因TCR。在一些方面，
所述重组受体是或含有嵌合自身抗体受体(CAAR)。在一些实施方案中，所述多核苷酸和载
体用于在细胞中共表达所述细胞表面缀合物和所述重组受体。在一些实施方案中，所述多
核苷酸编码能够在细胞表面上表达的细胞表面缀合物。在一些实施方案中，编码所述细胞
表面缀合物的核酸编码包含细胞外部分和跨膜部分的细胞表面分子。
情形中，所述多核苷酸含有至少两个不同的编码序列，如编码细胞表面缀合物的第一核酸
序列和编码重组受体的第二核酸序列。在一些方面，所述重组受体是或含有嵌合抗原受体
(CAR)。在一些方面，所述重组受体是或含有T细胞受体(TCR)，例如转基因TCR。在一些方面，
所述重组受体是或含有嵌合自身抗体受体(CAAR)。在一些实施方案中，所述多核苷酸和载
体用于在细胞中共表达所述细胞表面缀合物和所述重组受体。在一些实施方案中，所述多
核苷酸编码能够在细胞表面上表达的细胞表面缀合物。在一些实施方案中，编码所述细胞
表面缀合物的核酸编码包含细胞外部分和跨膜部分的细胞表面分子。
[0321] 在一些情况下，编码所述缀合物的核酸序列含有编码信号肽的信号序列。在一些方面，所述信号序列可以编码衍生自天然细胞表面分子的信号肽。在其他方面，所述信号序
列可以编码异源或非天然信号肽，例如SEQ ID NO:48中所示并且由SEQ ID NO:47中所示核
苷酸序列编码的GMCSFRα链的示例性信号肽。
列可以编码异源或非天然信号肽，例如SEQ ID NO:48中所示并且由SEQ ID NO:47中所示核
苷酸序列编码的GMCSFRα链的示例性信号肽。
[0322] 在一些情况下，编码所述嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列含有编码信号肽的信号序列。信号肽的非限制性示例性例子包括，例如，在SEQ ID NO:48中所示的GMCSFRα链信号
肽或在SEQ ID NO:75中所示的CD8α信号肽。
肽或在SEQ ID NO:75中所示的CD8α信号肽。
[0323] 在一些实施方案中，编码细胞表面缀合物和/或重组受体的多核苷酸含有至少一个启动子，所述至少一个启动子可操作地连接以控制细胞表面缀合物和/或重组受体的表
达。在一些例子中，所述多核苷酸含有两个、三个或更多个启动子，所述启动子可操作地连
接以控制细胞表面缀合物和/或重组受体的表达。
达。在一些例子中，所述多核苷酸含有两个、三个或更多个启动子，所述启动子可操作地连
接以控制细胞表面缀合物和/或重组受体的表达。
[0324] 在其中核酸分子编码两条或更多条不同多肽链的某些情况下，多肽链中的每一条可以由单独的核酸分子编码。例如，提供了两个单独的核酸，并且每一个可以单独转移到或
引入细胞中以在细胞中表达。
引入细胞中以在细胞中表达。
[0325] 在一些实施方案中，例如在多核苷酸含有第一和第二核酸序列的那些实施方案中，编码每种不同多肽链的编码序列可以与启动子可操作地连接，所述启动子可以是相同
的或不同的。在一些实施方案中，所述核酸分子可以含有驱动两条或更多条不同多肽链表
达的启动子。在一些实施方案中，此类核酸分子可以是多顺反子的(双顺反子的或三顺反子
的，参见例如，美国专利号6,060,273)。在一些实施方案中，可以将转录单位工程化为含有
IRES(内部核糖体进入位点)的双顺反子单元，其允许通过来自单一启动子的信息共表达基
因产物(例如其编码所述缀合物和编码所述重组受体)。可替代地，在一些情况下，单一启动
子可引导RNA的表达，所述RNA在单一开放阅读框(ORF)中含有两个或三个基因(例如编码所
述缀合物和编码所述重组受体)，所述基因通过编码自切割肽(例如，2A序列)的序列或蛋白
酶识别位点(例如，弗林蛋白酶(furin))彼此分开。因此，所述ORF编码单个多肽，其在翻译
期间(在2A的情况下)或翻译后被加工成单个蛋白质。在一些情况下，所述肽(如T2A)可以导
致核糖体跳过(核糖体跳跃)2A元件C末端处的肽键的合成，这导致2A序列末端与下游的下
一个肽之间的分离(参见例如，de Felipe.Genetic Vaccines and Ther.2:13(2004)和
deFelipe等人Traffic 5:616-626(2004))。许多2A元件在本领域是已知的。可以用于本文
所公开的方法和系统中的2A序列的例子包括但不限于来自以下病毒的2A序列：口蹄疫病毒
(F2A，例如，SEQ ID NO:88)、马鼻炎A病毒(E2A，例如，SEQ ID NO:87)、明脉扁刺蛾β四体病毒(T2A，例如，SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:76)和猪捷申病毒-1(P2A，例如，SEQ ID NO:85或
86)，如美国专利公开号20070116690中所述。
的或不同的。在一些实施方案中，所述核酸分子可以含有驱动两条或更多条不同多肽链表
达的启动子。在一些实施方案中，此类核酸分子可以是多顺反子的(双顺反子的或三顺反子
的，参见例如，美国专利号6,060,273)。在一些实施方案中，可以将转录单位工程化为含有
IRES(内部核糖体进入位点)的双顺反子单元，其允许通过来自单一启动子的信息共表达基
因产物(例如其编码所述缀合物和编码所述重组受体)。可替代地，在一些情况下，单一启动
子可引导RNA的表达，所述RNA在单一开放阅读框(ORF)中含有两个或三个基因(例如编码所
述缀合物和编码所述重组受体)，所述基因通过编码自切割肽(例如，2A序列)的序列或蛋白
酶识别位点(例如，弗林蛋白酶(furin))彼此分开。因此，所述ORF编码单个多肽，其在翻译
期间(在2A的情况下)或翻译后被加工成单个蛋白质。在一些情况下，所述肽(如T2A)可以导
致核糖体跳过(核糖体跳跃)2A元件C末端处的肽键的合成，这导致2A序列末端与下游的下
一个肽之间的分离(参见例如，de Felipe.Genetic Vaccines and Ther.2:13(2004)和
deFelipe等人Traffic 5:616-626(2004))。许多2A元件在本领域是已知的。可以用于本文
所公开的方法和系统中的2A序列的例子包括但不限于来自以下病毒的2A序列：口蹄疫病毒
(F2A，例如，SEQ ID NO:88)、马鼻炎A病毒(E2A，例如，SEQ ID NO:87)、明脉扁刺蛾β四体病毒(T2A，例如，SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:76)和猪捷申病毒-1(P2A，例如，SEQ ID NO:85或
86)，如美国专利公开号20070116690中所述。
[0326] 在一些实施方案中，例如通过逆转录病毒转导、转染或转化将编码细胞表面缀合物和/或重组受体的多核苷酸引入含有培养细胞的组合物中。
[0327] 还提供了多核苷酸的集合或组合。在一些实施方案中，所述集合或组合包含第一多核苷酸和第二多核苷酸，所述第一多核苷酸包含编码细胞表面缀合物(如本文描述的任
何一种)的核酸，所述第二多核苷酸包含编码重组受体的核酸。还提供了含有多核苷酸的这
种集合或组合的组合物。在一些实施方案中，多核苷酸的所述集合或组合一起用于细胞的
工程化。在一些实施方案中，将所述集合中的第一和第二多核苷酸同时或顺序地以任何顺
序引入用于工程化的细胞中。在一些实施方案中，存在包含第一多核苷酸和第二多核苷酸
的多核苷酸的集合，所述第一多核苷酸包含编码细胞表面缀合物(如本文描述的任何一种)
的核酸，所述第二多核苷酸包含编码嵌合受体和/或重组抗原受体的核酸。
何一种)的核酸，所述第二多核苷酸包含编码重组受体的核酸。还提供了含有多核苷酸的这
种集合或组合的组合物。在一些实施方案中，多核苷酸的所述集合或组合一起用于细胞的
工程化。在一些实施方案中，将所述集合中的第一和第二多核苷酸同时或顺序地以任何顺
序引入用于工程化的细胞中。在一些实施方案中，存在包含第一多核苷酸和第二多核苷酸
的多核苷酸的集合，所述第一多核苷酸包含编码细胞表面缀合物(如本文描述的任何一种)
的核酸，所述第二多核苷酸包含编码嵌合受体和/或重组抗原受体的核酸。
[0328] 还提供了含有此类核酸分子的载体或构建体。在一些实施方案中，所述载体或构建体含有一个或多个启动子，所述一个或多个启动子与编码所述多肽或受体的核苷酸可操
作地连接以驱动所述核苷酸的表达。在一些实施方案中，所述启动子可操作地连接至一个
或多于一个核酸分子。因此，还提供了载体，如含有本文所提供的任何多核苷酸的那些。在
一些情况下，所述载体是病毒载体，如逆转录病毒载体，例如慢病毒载体或γ逆转录病毒载
体。
作地连接以驱动所述核苷酸的表达。在一些实施方案中，所述启动子可操作地连接至一个
或多于一个核酸分子。因此，还提供了载体，如含有本文所提供的任何多核苷酸的那些。在
一些情况下，所述载体是病毒载体，如逆转录病毒载体，例如慢病毒载体或γ逆转录病毒载
体。
[0329] 还提供了载体的集合或组合。在一些实施方案中，载体的所述集合或组合包含第一载体和第二载体，其中所述第一载体包含第一多核苷酸，例如编码细胞表面缀合物的第
一多核苷酸，并且所述第二载体包含编码重组受体(例如CAR)的第二多核苷酸。还提供了含
有载体的这种集合或组合的组合物。在一些实施方案中，所述载体的所述集合或组合一起
用于细胞的工程化。在一些实施方案中，将所述集合中的第一载体和第二载体同时或顺序
地以任何顺序引入用于工程化的细胞中。
一多核苷酸，并且所述第二载体包含编码重组受体(例如CAR)的第二多核苷酸。还提供了含
有载体的这种集合或组合的组合物。在一些实施方案中，所述载体的所述集合或组合一起
用于细胞的工程化。在一些实施方案中，将所述集合中的第一载体和第二载体同时或顺序
地以任何顺序引入用于工程化的细胞中。
[0330] 在一些实施方案中，所述载体包括病毒载体，例如逆转录病毒或慢病毒、非病毒载体或转座子，例如睡美人(Sleeping Beauty)转座子系统；源自猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、
腺相关病毒(AAV)的载体；慢病毒载体或逆转录病毒载体，如γ-逆转录病毒载体；源自莫洛
尼(Moloney)鼠白血病病毒(MoMLV)、骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)、鼠胚胎干细胞病毒
(MESV)、鼠干细胞病毒(MSCV)、脾病灶形成病毒(SFFV)或腺相关病毒(AAV)的逆转录病毒载
体。
腺相关病毒(AAV)的载体；慢病毒载体或逆转录病毒载体，如γ-逆转录病毒载体；源自莫洛
尼(Moloney)鼠白血病病毒(MoMLV)、骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)、鼠胚胎干细胞病毒
(MESV)、鼠干细胞病毒(MSCV)、脾病灶形成病毒(SFFV)或腺相关病毒(AAV)的逆转录病毒载
体。
[0331] 本文描述的任何细胞表面缀合物和/或重组受体可以由呈任何组合或排列的含有编码细胞表面缀合物和/或重组受体的一种或多种核酸序列的多核苷酸编码。例如，一种、
两种、三种或更多种多核苷酸可以编码一种、两种、三种或更多种不同的多肽，例如细胞表
面缀合物和/或重组受体。在一些实施方案中，一种载体或构建体含有编码细胞表面缀合物
的核酸序列，并且单独的载体或构建体含有编码重组受体(例如CAR)的核酸序列。在一些实
施方案中，编码细胞表面缀合物的核酸和编码重组受体的核酸可操作地连接至两个不同的
启动子。在一些实施方案中，编码重组受体的核酸存在于编码细胞表面缀合物的核酸的下
游。
两种、三种或更多种多核苷酸可以编码一种、两种、三种或更多种不同的多肽，例如细胞表
面缀合物和/或重组受体。在一些实施方案中，一种载体或构建体含有编码细胞表面缀合物
的核酸序列，并且单独的载体或构建体含有编码重组受体(例如CAR)的核酸序列。在一些实
施方案中，编码细胞表面缀合物的核酸和编码重组受体的核酸可操作地连接至两个不同的
启动子。在一些实施方案中，编码重组受体的核酸存在于编码细胞表面缀合物的核酸的下
游。
[0332] C.用于工程化的细胞和细胞的制备
[0333] 还提供了细胞，如含有细胞表面缀合物和/或工程化重组受体的细胞，如本文描述的。还提供了此类细胞的群体、含有此类细胞和/或富含此类细胞的组合物，例如其中表达
细胞表面缀合物和/或重组受体(例如嵌合受体)的细胞构成组合物中总细胞的或某种类型
的细胞(如T细胞或CD8+或CD4+细胞)的至少50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、
99或更高百分比。所述组合物包括用于给予(如用于过继细胞疗法)的药物组合物和配制
品。还提供了用于向受试者(例如，患者)给予所述细胞和组合物的治疗方法。
细胞表面缀合物和/或重组受体(例如嵌合受体)的细胞构成组合物中总细胞的或某种类型
的细胞(如T细胞或CD8+或CD4+细胞)的至少50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、
99或更高百分比。所述组合物包括用于给予(如用于过继细胞疗法)的药物组合物和配制
品。还提供了用于向受试者(例如，患者)给予所述细胞和组合物的治疗方法。
[0334] 因此，还提供了表达细胞表面缀合物和/或重组受体(例如CAR)的基因工程化细胞。细胞通常是真核细胞，例如哺乳动物细胞，并且通常是人细胞。在一些实施方案中，所述
细胞源自血液、骨髓、淋巴或淋巴器官，是免疫系统的细胞，如先天免疫或适应性免疫的细
胞，例如骨髓或淋巴细胞，包括淋巴细胞，通常为T细胞和/或NK细胞。其他示例性细胞包括
干细胞，如多潜能干细胞和多能干细胞，包括诱导多能干细胞(iPSC)。细胞通常是原代细胞
如直接从受试者分离和/或从受试者分离并冷冻的那些原代细胞。在一些实施方案中，细胞
包括T细胞或其他细胞类型的一个或多个亚组，如整个T细胞群、CD4+细胞、CD8+细胞及其亚
群，如由以下各项所定义的那些亚群：功能、激活状态、成熟度、分化的可能性、扩增、再循
环、定位和/或持久能力、抗原特异性、抗原受体类型、在特定器官或区室中的存在、标记或
细胞因子分泌特征和/或分化程度。关于待治疗的受试者，细胞可以是同种异体的和/或自
体的。所述方法包括现成的方法。在一些方面，如对于现有技术，所述细胞是多能和/或多潜
能的，如干细胞，如诱导多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，所述方法包括从所述受试
者中分离细胞，如本文描述的制备、加工、培养和/或工程化它们，并且在冷冻保存之前或之
后将它们重新引入同一患者体内。
细胞源自血液、骨髓、淋巴或淋巴器官，是免疫系统的细胞，如先天免疫或适应性免疫的细
胞，例如骨髓或淋巴细胞，包括淋巴细胞，通常为T细胞和/或NK细胞。其他示例性细胞包括
干细胞，如多潜能干细胞和多能干细胞，包括诱导多能干细胞(iPSC)。细胞通常是原代细胞
如直接从受试者分离和/或从受试者分离并冷冻的那些原代细胞。在一些实施方案中，细胞
包括T细胞或其他细胞类型的一个或多个亚组，如整个T细胞群、CD4+细胞、CD8+细胞及其亚
群，如由以下各项所定义的那些亚群：功能、激活状态、成熟度、分化的可能性、扩增、再循
环、定位和/或持久能力、抗原特异性、抗原受体类型、在特定器官或区室中的存在、标记或
细胞因子分泌特征和/或分化程度。关于待治疗的受试者，细胞可以是同种异体的和/或自
体的。所述方法包括现成的方法。在一些方面，如对于现有技术，所述细胞是多能和/或多潜
能的，如干细胞，如诱导多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，所述方法包括从所述受试
者中分离细胞，如本文描述的制备、加工、培养和/或工程化它们，并且在冷冻保存之前或之
后将它们重新引入同一患者体内。
[0335] T细胞和/或CD4+和/或CD8+T细胞的亚型和亚群包括幼稚T(TN)细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆T细胞及其亚型(如干细胞记忆T(TSCM)、中枢记忆T(TCM)，效应记忆T(TEM)或终末分化效应记忆T细胞)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、未成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞
毒性T细胞、粘膜相关不变T(MAIT)细胞、天然存在和适应性调节T(Treg)细胞、辅助T细胞
(如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助细胞T细胞)、α/βT细胞和δ/γT细胞。
毒性T细胞、粘膜相关不变T(MAIT)细胞、天然存在和适应性调节T(Treg)细胞、辅助T细胞
(如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助细胞T细胞)、α/βT细胞和δ/γT细胞。
[0336] 在一些实施方案中，所述细胞是天然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，所述细胞是单核细胞或粒细胞，例如骨髓细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜酸
性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞。
性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞。
[0337] 在一些实施方案中，所述细胞包括经由基因工程引入的一种或多种核酸，从而表达此类核酸的重组或基因工程化产物。在一些实施方案中，核酸是异源的，即通常不存在于
细胞或从细胞获得的样品中，如从另一种生物或细胞获得的核酸，例如，所述核酸通常不在
被工程化的细胞和/或这种细胞所来源的生物中发现。在一些实施方案中，核酸不是天然存
在的如自然界中未发现的核酸，包括包含编码来自多种不同细胞类型的各种结构域的核酸
的嵌合组合的核酸。
细胞或从细胞获得的样品中，如从另一种生物或细胞获得的核酸，例如，所述核酸通常不在
被工程化的细胞和/或这种细胞所来源的生物中发现。在一些实施方案中，核酸不是天然存
在的如自然界中未发现的核酸，包括包含编码来自多种不同细胞类型的各种结构域的核酸
的嵌合组合的核酸。
[0338] 在一些实施方案中，工程化细胞的制备包括一个或多个培养和/或制备步骤。用于引入细胞表面缀合物和/或重组受体(例如CAR)的细胞可以从样品(如生物样品，例如获自
或源自受试者的一种样品)中分离。在一些实施方案中，分离出细胞的受试者是患有疾病或
病症或需要细胞疗法或将对其给予细胞疗法的受试者。在一些实施方案中，所述受试者是
需要特定治疗性干预(如过继细胞疗法，其中细胞被分离、加工和/或工程化)的人。
或源自受试者的一种样品)中分离。在一些实施方案中，分离出细胞的受试者是患有疾病或
病症或需要细胞疗法或将对其给予细胞疗法的受试者。在一些实施方案中，所述受试者是
需要特定治疗性干预(如过继细胞疗法，其中细胞被分离、加工和/或工程化)的人。
[0339] 因此，在一些实施方案中，细胞是原代细胞，例如原代人细胞。样品包括直接取自受试者的组织、流体和其他样品，以及来自一个或多个加工步骤(如分离、离心、基因工程化
(例如用病毒载体转导)、洗涤和/或孵育)的样品。所述生物样品可以是直接从生物来源获
得的样品或经过加工的样品。生物样品包括但不限于体液(如血液、血浆、血清、脑脊液、滑
液、尿液和汗液)、组织和器官样品，包括由其衍生的加工样品。
(例如用病毒载体转导)、洗涤和/或孵育)的样品。所述生物样品可以是直接从生物来源获
得的样品或经过加工的样品。生物样品包括但不限于体液(如血液、血浆、血清、脑脊液、滑
液、尿液和汗液)、组织和器官样品，包括由其衍生的加工样品。
[0340] 在一些方面，细胞从其中衍生或分离的样品是血液或血液衍生的样品，或者是或源自单采术或白细胞分离术产物。示例性样品包括全血、外周血单核细胞(PBMC)、白细胞、
骨髓、胸腺、组织活检、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关淋巴组织、粘膜相关淋巴组织、脾、其他淋巴组织、肝、肺、胃、肠、结肠、肾、胰腺、乳房、骨、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其他器官和/或由其衍生的细胞。在细胞疗法例如过继细胞疗法的背景下，样品包括来
自自体同源和同种异体来源的样品。
骨髓、胸腺、组织活检、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关淋巴组织、粘膜相关淋巴组织、脾、其他淋巴组织、肝、肺、胃、肠、结肠、肾、胰腺、乳房、骨、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其他器官和/或由其衍生的细胞。在细胞疗法例如过继细胞疗法的背景下，样品包括来
自自体同源和同种异体来源的样品。
[0341] 在一些实施方案中，细胞源自细胞系，例如，T细胞系。在一些实施方案中，细胞获得自异种来源，例如获得自小鼠、大鼠、非人灵长类动物或猪。
[0342] 在一些实施方案中，细胞的分离包括一个或多个制备和/或基于非亲和力的细胞分离步骤。在一些例子中，将细胞在存在一种或多种试剂的情况下洗涤、离心和/或孵育，例
如以去除不需要的组分、针对所需组分进行富集、裂解或去除对特定试剂敏感的细胞。在一
些例子中，基于一种或多种特性(如密度、粘附特性、尺寸、对特定组分的敏感性和/或抗性)
分离细胞。
如以去除不需要的组分、针对所需组分进行富集、裂解或去除对特定试剂敏感的细胞。在一
些例子中，基于一种或多种特性(如密度、粘附特性、尺寸、对特定组分的敏感性和/或抗性)
分离细胞。
[0343] 在一些例子中，来自受试者的循环血液的细胞例如通过单采术或白细胞分离术获得。在一些方面，所述样品含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和/或血小板，并且在一些方面含有除红细胞和血小板之外的细胞。
[0344] 在一些实施方案中，洗涤从受试者收集的血细胞，例如以去除血浆级分并将细胞置于适当的缓冲液或介质中以用于随后的加工步骤。在一些实施方案中，用磷酸盐缓冲盐
水(PBS)洗涤所述细胞。在一些实施方案中，洗涤溶液缺乏钙和/或镁和/或许多或所有二价
阳离子。在一些方面，根据制造商的说明书通过半自动“流通”离心机(例如，Cobe 2991细胞
处理器，Baxter)完成洗涤步骤。在一些方面，根据制造商的说明书通过切向流过滤(TFF)完
成洗涤步骤。在一些实施方案中，洗涤后将所述细胞重悬于多种生物相容性缓冲液(例如像
不含Ca++/Mg++的PBS)中。在某些实施方案中，去除血细胞样品的组分并将所述细胞直接重
悬于培养基中。
水(PBS)洗涤所述细胞。在一些实施方案中，洗涤溶液缺乏钙和/或镁和/或许多或所有二价
阳离子。在一些方面，根据制造商的说明书通过半自动“流通”离心机(例如，Cobe 2991细胞
处理器，Baxter)完成洗涤步骤。在一些方面，根据制造商的说明书通过切向流过滤(TFF)完
成洗涤步骤。在一些实施方案中，洗涤后将所述细胞重悬于多种生物相容性缓冲液(例如像
不含Ca++/Mg++的PBS)中。在某些实施方案中，去除血细胞样品的组分并将所述细胞直接重
悬于培养基中。
[0345] 在一些实施方案中，所述方法包括基于密度的细胞分离方法，如通过裂解红细胞并通过Percoll或Ficoll梯度离心而从外周血制备白细胞。
[0346] 在一些实施方案中，分离方法包括基于细胞中一种或多种特定分子(如表面标记，例如表面分子或表面蛋白、细胞内标记或核酸)的表达或存在来分离不同细胞类型。在一些
实施方案中，可以使用任何已知的基于此类标记的用于分离的方法。在一些实施方案中，所
述分离是基于亲和力或免疫亲和力的分离。例如，在一些方面，所述分离包括基于所述细胞
的一种或多种标记(通常为细胞表面标记、表面分子或表面蛋白)的表达或表达水平来分离
细胞和细胞群，例如通过和与此类标记特异性结合的抗体或结合配偶体一起孵育，然后通
常是洗涤步骤和从那些未与所述抗体或结合配偶体结合的细胞中分离已结合所述抗体或
结合配偶体的细胞。
实施方案中，可以使用任何已知的基于此类标记的用于分离的方法。在一些实施方案中，所
述分离是基于亲和力或免疫亲和力的分离。例如，在一些方面，所述分离包括基于所述细胞
的一种或多种标记(通常为细胞表面标记、表面分子或表面蛋白)的表达或表达水平来分离
细胞和细胞群，例如通过和与此类标记特异性结合的抗体或结合配偶体一起孵育，然后通
常是洗涤步骤和从那些未与所述抗体或结合配偶体结合的细胞中分离已结合所述抗体或
结合配偶体的细胞。
[0347] 此类分离步骤可以基于阳性选择(其中保留已经结合所述试剂的细胞以供进一步使用)和/或阴性选择(其中保留未与所述抗体或结合配偶体结合的细胞)。在一些例子中，
保留两种级分以供进一步使用。在一些方面，在没有可用于特异性鉴定异质群体中的细胞
类型的抗体的情况下，阴性选择可能特别有用，使得最好基于由除所需群体之外的细胞表
达的标记进行分离。
保留两种级分以供进一步使用。在一些方面，在没有可用于特异性鉴定异质群体中的细胞
类型的抗体的情况下，阴性选择可能特别有用，使得最好基于由除所需群体之外的细胞表
达的标记进行分离。
[0348] 所述分离不需要导致100％富集或去除特定细胞群或表达特定标记的细胞。例如，针对特定类型的细胞(如表达标记的那些)的阳性选择或富集是指增加此类细胞的数量或
百分比，但不需要导致不表达所述标记的细胞的完全不存在。同样地，特定类型的细胞(如
表达标记的那些)的阴性选择、去除或耗尽是指减少此类细胞的数量或百分比，但不需要导
致所有此类细胞的完全去除。
百分比，但不需要导致不表达所述标记的细胞的完全不存在。同样地，特定类型的细胞(如
表达标记的那些)的阴性选择、去除或耗尽是指减少此类细胞的数量或百分比，但不需要导
致所有此类细胞的完全去除。
[0349] 在一些例子中，进行多轮分离步骤，其中来自一个步骤的阳性或阴性选择的级分经受另一个分离步骤，如随后的阳性或阴性选择。在一些例子中，单个分离步骤可以同时耗
尽表达多种标记的细胞，如通过将细胞与多种抗体或结合配偶体(每种抗体或结合配偶体
对被靶向用于阴性选择的标记具特异性)一起孵育。同样地，通过将细胞与在各种细胞类型
上表达的多种抗体或结合配偶体一起孵育，可以同时阳性选择多种细胞类型。
尽表达多种标记的细胞，如通过将细胞与多种抗体或结合配偶体(每种抗体或结合配偶体
对被靶向用于阴性选择的标记具特异性)一起孵育。同样地，通过将细胞与在各种细胞类型
上表达的多种抗体或结合配偶体一起孵育，可以同时阳性选择多种细胞类型。
[0350] 例如，在一些方面，T细胞的特定亚群，如对一种或多种表面标记呈阳性或高水平表达的细胞(例如CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+T细胞)通过阳性或阴性选择技术来分离。
[0351] 例如，可以使用抗CD3/抗CD28缀合的磁珠(例如， M-450 CD3/CD28 T Cell Expander)阳性选择CD3+、CD28+T细胞。
[0352] 在一些实施方案中，通过阳性选择针对特定细胞群富集或者通过阴性选择针对特定细胞群耗尽来进行分离。在一些实施方案中，通过将细胞与一种或多种抗体或其他结合
剂一起孵育来完成阳性或阴性选择，所述一种或多种抗体或其他结合剂与分别在阳性或阴
性选择的细胞上表达或以相对较高水平(标记高)(标记+)的一种或多种表面标记特异性结
合。
剂一起孵育来完成阳性或阴性选择，所述一种或多种抗体或其他结合剂与分别在阳性或阴
性选择的细胞上表达或以相对较高水平(标记高)(标记+)的一种或多种表面标记特异性结
合。
[0353] 在一些实施方案中，通过阴性选择在非T细胞(如B细胞、单核细胞或其他白细胞，如CD14)上表达的标记，将T细胞与PBMC样品分离。在一些方面，CD4+或CD8+选择步骤用于分
离CD4+辅助细胞和CD8+细胞毒性T细胞。此类CD4+和CD8+群体可以通过针对在一种或多种
幼稚T细胞、记忆T细胞和/或效应T细胞子群体上表达或表达至相对较高程度的标记进行阳
性或阴性选择来进一步分选为子群体。
离CD4+辅助细胞和CD8+细胞毒性T细胞。此类CD4+和CD8+群体可以通过针对在一种或多种
幼稚T细胞、记忆T细胞和/或效应T细胞子群体上表达或表达至相对较高程度的标记进行阳
性或阴性选择来进一步分选为子群体。
[0354] 在一些实施方案中，如通过基于与相应子群体相关的表面抗原进行阳性或阴性选择，将CD8+细胞针对幼稚、中枢记忆、效应子记忆和/或中枢记忆干细胞进一步富集或耗尽。
在一些实施方案中，针对中枢记忆T(TCM)细胞进行富集以增加功效，如以改善给予后的长
期存活、扩增和/或移植，这在一些方面在此类亚群中特别稳健。参见Terakura等人(2012)
Blood.1:72-82；Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。在一些实施方案中，组合
富含TCM的CD8+T细胞与CD4+T细胞进一步增强功效。
在一些实施方案中，针对中枢记忆T(TCM)细胞进行富集以增加功效，如以改善给予后的长
期存活、扩增和/或移植，这在一些方面在此类亚群中特别稳健。参见Terakura等人(2012)
Blood.1:72-82；Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。在一些实施方案中，组合
富含TCM的CD8+T细胞与CD4+T细胞进一步增强功效。
[0355] 在实施方案中，记忆T细胞存在于CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+和CD62L-两个子集中。可以例如使用抗CD8和抗CD62L抗体将PBMC针对CD62L-CD8+和/或CD62L+CD8+级分进
行富集或耗尽。
行富集或耗尽。
[0356] 在一些实施方案中，中枢记忆T(TCM)细胞的富集是基于CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和/或CD 127的阳性或高表面表达；在一些方面，它是基于对表达或高度表达
CD45RA和/或颗粒酶B的细胞的阴性选择。在一些方面，通过表达CD4、CD14、CD45RA的细胞的
耗尽和表达CD62L的细胞的阳性选择或富集来进行富含TCM细胞的CD8+群体的分离。在一个
方面，中枢记忆T(TCM)细胞的富集从基于CD4表达所选择的阴性细胞级分开始进行，所述阴
性细胞级分基于CD14和CD45RA的表达进行阴性选择且基于CD62L进行阳性选择。在一些方
面这种选择是同时进行的，而在其他方面以任何顺序依次进行。在一些方面，用于制备CD8+
细胞群或亚群的相同的基于CD4表达的选择步骤也用于生成CD4+细胞群或亚群，使得来自
基于CD4的分离的阳性和阴性级分被保留并用于所述方法的后续步骤中，任选地在一个或
多个其他阳性或阴性选择步骤之后。
CD45RA和/或颗粒酶B的细胞的阴性选择。在一些方面，通过表达CD4、CD14、CD45RA的细胞的
耗尽和表达CD62L的细胞的阳性选择或富集来进行富含TCM细胞的CD8+群体的分离。在一个
方面，中枢记忆T(TCM)细胞的富集从基于CD4表达所选择的阴性细胞级分开始进行，所述阴
性细胞级分基于CD14和CD45RA的表达进行阴性选择且基于CD62L进行阳性选择。在一些方
面这种选择是同时进行的，而在其他方面以任何顺序依次进行。在一些方面，用于制备CD8+
细胞群或亚群的相同的基于CD4表达的选择步骤也用于生成CD4+细胞群或亚群，使得来自
基于CD4的分离的阳性和阴性级分被保留并用于所述方法的后续步骤中，任选地在一个或
多个其他阳性或阴性选择步骤之后。
[0357] 在特定例子中，PBMC样品或其他白细胞样品进行CD4+细胞的选择，其中保留了阴性和阳性级分。然后所述阴性级分基于CD14和CD45RA或ROR1的表达进行阴性选择，并基于
中枢记忆T细胞(如CD62L或CCR7)的标记特征进行阳性选择，其中以任何顺序进行所述阳性
和阴性选择。
中枢记忆T细胞(如CD62L或CCR7)的标记特征进行阳性选择，其中以任何顺序进行所述阳性
和阴性选择。
[0358] 通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群，将CD4+T辅助细胞分类为幼稚、中枢记忆和效应细胞。CD4+淋巴细胞可通过标准方法获得。在一些实施方案中，幼稚CD4+T淋巴细胞是
CD45RO-、CD45RA+、CD62L+、CD4+T细胞。在一些实施方案中，中枢记忆CD4+细胞是CD62L+和
CD45RO+。在一些实施方案中，效应CD4+细胞是CD62L-和CD45RO-。
CD45RO-、CD45RA+、CD62L+、CD4+T细胞。在一些实施方案中，中枢记忆CD4+细胞是CD62L+和
CD45RO+。在一些实施方案中，效应CD4+细胞是CD62L-和CD45RO-。
[0359] 在一个例子中，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合剂通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在一些实施方案中，所述抗体或结合配偶
体与固体支撑物或基质(如磁珠或顺磁珠)结合，以允许细胞分离以用于阳性和/或阴性选
择。例如，在一些实施方案中，使用免疫磁性(或亲和磁性)分开技术来分开或分离细胞和细
胞群(综述于Methods in Molecular Medicine,第58卷:Metastasis Research
Protocols,第2卷:Cell Behavior In Vitro and In Vivo,第17-25页S.A.Brooks和
U.Schumacher编辑 Humana Press Inc.,新泽西州托托瓦)。
体与固体支撑物或基质(如磁珠或顺磁珠)结合，以允许细胞分离以用于阳性和/或阴性选
择。例如，在一些实施方案中，使用免疫磁性(或亲和磁性)分开技术来分开或分离细胞和细
胞群(综述于Methods in Molecular Medicine,第58卷:Metastasis Research
Protocols,第2卷:Cell Behavior In Vitro and In Vivo,第17-25页S.A.Brooks和
U.Schumacher编辑 Humana Press Inc.,新泽西州托托瓦)。
[0360] 在一些方面，将待分离的细胞的样品或组合物与小的可磁化或磁响应材料(如磁响应颗粒或微粒，如顺磁珠(例如像 或 珠))一起孵育。磁响应材料
(例如，颗粒)通常直接或间接地附着于结合配偶体(例如，抗体)，所述结合配偶体与希望分
离(例如，希望阴性地或阳性地选择)的一个细胞、多个细胞或细胞群上存在的分子(例如，
表面标记)特异性结合。
(例如，颗粒)通常直接或间接地附着于结合配偶体(例如，抗体)，所述结合配偶体与希望分
离(例如，希望阴性地或阳性地选择)的一个细胞、多个细胞或细胞群上存在的分子(例如，
表面标记)特异性结合。
[0361] 在一些实施方案中，所述磁性颗粒或珠包含与特异性结合成员(如抗体或其他结合配偶体)结合的磁响应材料。有许多在磁分离方法中使用的熟知的磁响应材料。合适的磁
性颗粒包括在Molday,美国专利号4,452,773和在欧洲专利说明书EP 452342 B(将其通过
引用特此并入)中描述的那些。胶体大小的颗粒，如在Owen美国专利号4,795,698以及
Liberti等人,美国专利号5,200,084中描述的那些是其他例子。
性颗粒包括在Molday,美国专利号4,452,773和在欧洲专利说明书EP 452342 B(将其通过
引用特此并入)中描述的那些。胶体大小的颗粒，如在Owen美国专利号4,795,698以及
Liberti等人,美国专利号5,200,084中描述的那些是其他例子。
[0362] 所述孵育通常在这样的条件下进行，由此抗体或结合配偶体或者与附着于磁性颗粒或珠的此类抗体或结合配偶体特异性结合的分子(如二抗或其他试剂)与细胞表面分子
(如果存在于所述样品内的细胞上的话)特异性结合。
(如果存在于所述样品内的细胞上的话)特异性结合。
[0363] 在一些方面，将所述样品置于磁场中，并且具有附着于其上的磁响应或可磁化颗粒的那些细胞将被吸引到磁体并与未标记的细胞分离。对于阳性选择，保留被磁铁吸引的
细胞；对于阴性选择，保留未被吸引的细胞(未标记的细胞)。在一些方面，在同一选择步骤
期间进行阳性和阴性选择的组合，其中保留阳性和阴性级分并进一步加工或经受另外的分
离步骤。
细胞；对于阴性选择，保留未被吸引的细胞(未标记的细胞)。在一些方面，在同一选择步骤
期间进行阳性和阴性选择的组合，其中保留阳性和阴性级分并进一步加工或经受另外的分
离步骤。
[0364] 在某些实施方案中，该磁响应颗粒被包被在一抗或其他结合伴侣、二抗、凝集素、酶或链霉亲和素中。在某些实施方案中，所述磁性颗粒通过对一种或多种标记具特异性的
一抗的包被而附着于细胞。在某些实施方案中，用一抗或结合配偶体标记所述细胞而不是
珠，并且然后添加细胞类型特异性二抗或其他结合配偶体(例如链霉亲和素)包被的磁性颗
粒。在某些实施方案中，将链霉亲和素包被的磁性颗粒与生物素化的一抗或二抗结合使用。
一抗的包被而附着于细胞。在某些实施方案中，用一抗或结合配偶体标记所述细胞而不是
珠，并且然后添加细胞类型特异性二抗或其他结合配偶体(例如链霉亲和素)包被的磁性颗
粒。在某些实施方案中，将链霉亲和素包被的磁性颗粒与生物素化的一抗或二抗结合使用。
[0365] 在一些实施方案中，所述磁响应颗粒保持附着于所述细胞，所述细胞随后被孵育，培养和/或工程化；在一些方面，所述颗粒保持附着于所述细胞以用于给予患者。在一些实
施方案中，从所述细胞中去除可磁化或磁响应颗粒。用于从细胞中去除可磁化颗粒的方法
是已知的，并且包括例如使用竞争性非标记抗体、可磁化颗粒或与可切割接头缀合的抗体
等。在一些实施方案中，可磁化颗粒是可生物降解的。
施方案中，从所述细胞中去除可磁化或磁响应颗粒。用于从细胞中去除可磁化颗粒的方法
是已知的，并且包括例如使用竞争性非标记抗体、可磁化颗粒或与可切割接头缀合的抗体
等。在一些实施方案中，可磁化颗粒是可生物降解的。
[0366] 在一些实施方案中，基于亲和力的选择是经由磁激活细胞分选(MACS)(Miltenyi Biotec，加利福尼亚州奥本)。磁激活细胞分选(MACS)系统能够高纯度选择附着有磁化颗粒
的细胞。在某些实施方案中，MACS以这样的模式操作，其中在施加外部磁场之后依次洗脱非
靶标和靶标种类。也就是说，附着于磁化颗粒的细胞保持在适当的位置，而未附着的种类被
洗脱。然后，在完成第一次洗脱步骤之后，以某种方式释放被捕获在磁场中并被阻止洗脱的
种类，使得它们可以被洗脱和回收。在某些实施方案中，所述非靶细胞被标记并从异质细胞
群中耗尽。
的细胞。在某些实施方案中，MACS以这样的模式操作，其中在施加外部磁场之后依次洗脱非
靶标和靶标种类。也就是说，附着于磁化颗粒的细胞保持在适当的位置，而未附着的种类被
洗脱。然后，在完成第一次洗脱步骤之后，以某种方式释放被捕获在磁场中并被阻止洗脱的
种类，使得它们可以被洗脱和回收。在某些实施方案中，所述非靶细胞被标记并从异质细胞
群中耗尽。
[0367] 在某些实施方案中，使用这样的系统、设备或装置进行分离或分开，所述系统、设备或装置进行所述方法的分离、细胞制备、分开、加工、孵育、培养和/或制备步骤中的一种
或多种。在一些方面，所述系统用于在封闭或无菌环境中进行这些步骤中的每一个，例如以
最小化错误、用户操作和/或污染。在一个例子中，所述系统是如国际专利申请公开号WO
2009/072003或US 20110003380 A1中所述的系统。
或多种。在一些方面，所述系统用于在封闭或无菌环境中进行这些步骤中的每一个，例如以
最小化错误、用户操作和/或污染。在一个例子中，所述系统是如国际专利申请公开号WO
2009/072003或US 20110003380 A1中所述的系统。
[0368] 在一些实施方案中，所述系统或装置在集成或独立系统中和/或以自动或可编程方式进行分离、加工、工程化和配制步骤中的一个或多个(例如，全部)。在一些方面，所述系
统或装置包括与所述系统或装置通信的计算机和/或计算机程序，其允许用户对加工、分
离、工程化和配制步骤的各个方面进行编程、控制、评估其结果和/或调整。
统或装置包括与所述系统或装置通信的计算机和/或计算机程序，其允许用户对加工、分
离、工程化和配制步骤的各个方面进行编程、控制、评估其结果和/或调整。
[0369] 在一些方面，使用CliniMACS系统(Miltenyi Biotec)进行所述分离和/或其他步骤，例如以用于在封闭和无菌系统中在临床规模水平上自动分离细胞。部件可以包括集成
微计算机、磁分离单元、蠕动泵和各种夹管阀。在一些方面，所述集成计算机控制所述仪器
的所有部件并指示所述系统以标准化顺序执行重复程序。在一些方面，所述磁分离单元包
括可移动的永磁体和用于选择柱的支架。所述蠕动泵控制整个管组的流速，并与夹管阀一
起确保缓冲液通过所述系统的受控流动和细胞的连续悬浮。
微计算机、磁分离单元、蠕动泵和各种夹管阀。在一些方面，所述集成计算机控制所述仪器
的所有部件并指示所述系统以标准化顺序执行重复程序。在一些方面，所述磁分离单元包
括可移动的永磁体和用于选择柱的支架。所述蠕动泵控制整个管组的流速，并与夹管阀一
起确保缓冲液通过所述系统的受控流动和细胞的连续悬浮。
[0370] 在一些方面，所述CliniMACS系统使用抗体偶联的可磁化颗粒，其在无菌，无热原的溶液中提供。在一些实施方案中，在用磁性颗粒标记细胞后，洗涤所述细胞以去除过量的
颗粒。然后将细胞制备袋连接到管组，所述管组又连接到含有缓冲液的袋和细胞收集袋。所
述管组由预装配的无菌管(包括预柱和分离柱)组成，并且仅供一次性使用。在启动分离程
序后，所述系统自动将细胞样品施加到分离柱。标记的细胞保留在柱内，而未标记的细胞通
过一系列洗涤步骤去除。在一些实施方案中，用于与本文描述的方法一起使用的细胞群是
未标记的并且不保留在柱中。在一些实施方案中，用于与本文描述的方法一起使用的细胞
群被标记并保留在柱中。在一些实施方案中，用于与本文描述的方法一起使用的细胞群在
去除磁场后从柱中洗脱，并且收集在细胞收集袋内。
颗粒。然后将细胞制备袋连接到管组，所述管组又连接到含有缓冲液的袋和细胞收集袋。所
述管组由预装配的无菌管(包括预柱和分离柱)组成，并且仅供一次性使用。在启动分离程
序后，所述系统自动将细胞样品施加到分离柱。标记的细胞保留在柱内，而未标记的细胞通
过一系列洗涤步骤去除。在一些实施方案中，用于与本文描述的方法一起使用的细胞群是
未标记的并且不保留在柱中。在一些实施方案中，用于与本文描述的方法一起使用的细胞
群被标记并保留在柱中。在一些实施方案中，用于与本文描述的方法一起使用的细胞群在
去除磁场后从柱中洗脱，并且收集在细胞收集袋内。
[0371] 在某些实施方案中，使用CliniMACS Prodigy系统(Miltenyi Biotec)进行分离和/或其他步骤。在一些方面，CliniMACS Prodigy系统配备有细胞加工联合体，其允许通过
离心自动化洗涤和分级分离细胞。CliniMACS Prodigy系统还可以包括机载相机和图像识
别软件，其通过辨别源细胞产物的宏观层来确定最佳的细胞分级分离终点。例如，可以将外
周血自动分离成红细胞、白细胞和血浆层。所述CliniMACS Prodigy系统还可以包括集成的
细胞培养室，其实现细胞培养方案，例如像细胞分化和扩增、抗原加载和长期细胞培养。输
入端口可以允许无菌移除和补充培养基，并且可以使用集成显微镜监测细胞。参见例如，
Klebanoff等人(2012)J Immunother.35(9):651-660，Terakura等人(2012)Blood.1:72-
82；和Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。
离心自动化洗涤和分级分离细胞。CliniMACS Prodigy系统还可以包括机载相机和图像识
别软件，其通过辨别源细胞产物的宏观层来确定最佳的细胞分级分离终点。例如，可以将外
周血自动分离成红细胞、白细胞和血浆层。所述CliniMACS Prodigy系统还可以包括集成的
细胞培养室，其实现细胞培养方案，例如像细胞分化和扩增、抗原加载和长期细胞培养。输
入端口可以允许无菌移除和补充培养基，并且可以使用集成显微镜监测细胞。参见例如，
Klebanoff等人(2012)J Immunother.35(9):651-660，Terakura等人(2012)Blood.1:72-
82；和Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。
[0372] 在一些实施方案中，通过流式细胞术收集和富集(或耗尽)本文描述的细胞群，其中针对多种细胞表面标记染色的细胞在流体流中载携。在一些实施方案中，通过制备规模
(FACS)分类收集和富集(或耗尽)本文描述的细胞群。在某些实施方案中，通过使用微机电
系统(MEMS)芯片结合基于FACS的检测系统来收集和富集(或耗竭)本文描述的细胞群(参见
例如，WO 2010/033140，Cho等人(2010)Lab Chip 10,1567-1573；和Godin等人(2008)J
Biophoton.1(5):355–376)。在两种情况下，细胞可以用多种标记来标记，允许以高纯度分
离明确定义的T细胞子集。
(FACS)分类收集和富集(或耗尽)本文描述的细胞群。在某些实施方案中，通过使用微机电
系统(MEMS)芯片结合基于FACS的检测系统来收集和富集(或耗竭)本文描述的细胞群(参见
例如，WO 2010/033140，Cho等人(2010)Lab Chip 10,1567-1573；和Godin等人(2008)J
Biophoton.1(5):355–376)。在两种情况下，细胞可以用多种标记来标记，允许以高纯度分
离明确定义的T细胞子集。
[0373] 在一些实施方案中，用一种或多种可检测标记来标记抗体或结合配偶体，以促进分离供阳性和/或阴性选择。例如，分离可以基于与荧光标记的抗体的结合。在一些例子中，
基于对一种或多种细胞表面标记具特异性的抗体或其他结合配偶体的结合来分离细胞在
流体流中载携，如通过荧光激活细胞分选(FACS)，包括制备规模(FACS)和/或微机电系统
(MEMS)芯片，例如与流式细胞检测系统组合。此类方法允许基于多种标记同时进行阳性和
阴性选择。
基于对一种或多种细胞表面标记具特异性的抗体或其他结合配偶体的结合来分离细胞在
流体流中载携，如通过荧光激活细胞分选(FACS)，包括制备规模(FACS)和/或微机电系统
(MEMS)芯片，例如与流式细胞检测系统组合。此类方法允许基于多种标记同时进行阳性和
阴性选择。
[0374] 在一些实施方案中，所述制备方法包括在分离、孵育和/或工程化之前或之后冷冻(例如，冷冻保存)所述细胞的步骤。在一些实施方案中，所述冷冻和后续解冻步骤去除所述
细胞群中的粒细胞，并且在一定程度上去除单核细胞。在一些实施方案中，例如在洗涤步骤
之后将所述细胞悬浮在冷冻溶液中以去除血浆和血小板。在一些方面，可以使用多种已知
的冷冻溶液和参数中的任何一种。一个例子涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白
(HSA)的PBS，或其他合适的细胞冷冻培养基。然后将其用培养基1:1稀释，使得DMSO和HSA的
最终浓度分别为10％和4％。然后将所述细胞以1°/分钟的速率冷冻至-80℃并储存在液氮
储罐的气相中。
细胞群中的粒细胞，并且在一定程度上去除单核细胞。在一些实施方案中，例如在洗涤步骤
之后将所述细胞悬浮在冷冻溶液中以去除血浆和血小板。在一些方面，可以使用多种已知
的冷冻溶液和参数中的任何一种。一个例子涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白
(HSA)的PBS，或其他合适的细胞冷冻培养基。然后将其用培养基1:1稀释，使得DMSO和HSA的
最终浓度分别为10％和4％。然后将所述细胞以1°/分钟的速率冷冻至-80℃并储存在液氮
储罐的气相中。
[0375] 在一些实施方案中，所提供的方法包括养殖、孵育、培养和/或基因工程步骤。例如，在一些实施方案中，提供了用于孵育耗尽的细胞群和培养起始组合物和/或将它们工程
化的方法。
化的方法。
[0376] 因此，在一些实施方案中，在培养起始组合物中孵育细胞群。孵育和/或工程化可以在培养容器中进行，所述培养容器是如单元、室、孔、柱、管、管组、阀、小瓶、培养皿、袋或其他用于培养或培育细胞的容器。
[0377] 在一些实施方案中，在基因工程化之前或与其相连地孵育和/或培养细胞。所述孵育步骤可以包括培养、培育、刺激、激活和/或繁殖。在一些实施方案中，在刺激条件或刺激
剂的存在下孵育所述组合物或细胞。这些条件包括针对以下而设计的那些条件：用于诱导
群体中细胞的增殖、扩增、激活和/或存活的条件，用于模拟抗原暴露和/或用于引发细胞进
行基因工程化，如以引入重组抗原受体。
剂的存在下孵育所述组合物或细胞。这些条件包括针对以下而设计的那些条件：用于诱导
群体中细胞的增殖、扩增、激活和/或存活的条件，用于模拟抗原暴露和/或用于引发细胞进
行基因工程化，如以引入重组抗原受体。
[0378] 条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和任何其他旨在激活细胞的药剂))。
[0379] 在一些实施方案中，刺激条件或药剂包括一种或多种药剂(例如配体)，其能够激活TCR复合物的细胞内信号传导结构域。在一些方面，所述药剂在T细胞中开启或启动TCR/
CD3细胞内信号传导级联。此类药剂可以包括例如结合至固体支撑物(如珠)的抗体，如对
TCR组分和/或共刺激受体具有特异性的抗体(例如抗CD3、抗CD28)；和/或一种或多种细胞
因子。任选地，所述扩增方法还可以包括向培养基中(例如，以至少约0.5ng/ml的浓度)添加
抗CD3和/或抗CD28抗体的步骤。在一些实施方案中，刺激剂包括IL-2和/或IL-15，例如，IL-
2浓度为至少约10单位/mL。
CD3细胞内信号传导级联。此类药剂可以包括例如结合至固体支撑物(如珠)的抗体，如对
TCR组分和/或共刺激受体具有特异性的抗体(例如抗CD3、抗CD28)；和/或一种或多种细胞
因子。任选地，所述扩增方法还可以包括向培养基中(例如，以至少约0.5ng/ml的浓度)添加
抗CD3和/或抗CD28抗体的步骤。在一些实施方案中，刺激剂包括IL-2和/或IL-15，例如，IL-
2浓度为至少约10单位/mL。
[0380] 在一些方面，孵育是根据多种技术来进行，例如以下文献中所述的那些技术：授予Riddell等人的美国专利号6,040,177；Klebanoff等人(2012)J Immunother.35(9):651-
660,Terakura等人(2012)Blood.1:72-82；和/或Wang等人(2012)J Immunother.35(9):
689-701。
660,Terakura等人(2012)Blood.1:72-82；和/或Wang等人(2012)J Immunother.35(9):
689-701。
[0381] 在一些实施方案中，通过以下方法扩增T细胞：向培养起始组合物中加入饲养细胞(如非分裂外周血单核细胞(PBMC))(例如，使得所得细胞群含有至少约5、10、20或40种或更
多种PBMC饲养细胞，以使初始群体中的每种T淋巴细胞进行扩增)；以及孵育培养物(例如，
持续足以扩增T细胞数量的时间)。在一些方面，非分裂饲养细胞可包含γ辐射的PBMC饲养
细胞。在一些实施方案中，用约3000至3600拉德范围内的γ射线照射PBMC以防止细胞分裂。
在一些方面，在添加T细胞群之前将饲养细胞加入到培养基中。
多种PBMC饲养细胞，以使初始群体中的每种T淋巴细胞进行扩增)；以及孵育培养物(例如，
持续足以扩增T细胞数量的时间)。在一些方面，非分裂饲养细胞可包含γ辐射的PBMC饲养
细胞。在一些实施方案中，用约3000至3600拉德范围内的γ射线照射PBMC以防止细胞分裂。
在一些方面，在添加T细胞群之前将饲养细胞加入到培养基中。
[0382] 在一些实施方案中，所述刺激条件包括适合于人T淋巴细胞生长的温度，例如至少约25摄氏度，通常为至少约30摄氏度，并且通常在或约在37摄氏度。任选地，所述孵育还可
以包括添加非分裂EBV转化的类淋巴母细胞(LCL)作为饲养细胞。可以用在约6000至10,000
拉德范围内的γ射线照射LCL。在一些方面，所述LCL饲养细胞以任何合适的量(如LCL饲养
细胞与初始T淋巴细胞的比率为至少约10:1)提供。
以包括添加非分裂EBV转化的类淋巴母细胞(LCL)作为饲养细胞。可以用在约6000至10,000
拉德范围内的γ射线照射LCL。在一些方面，所述LCL饲养细胞以任何合适的量(如LCL饲养
细胞与初始T淋巴细胞的比率为至少约10:1)提供。
[0383] 在实施方案中，通过用抗原刺激幼稚或抗原特异性T淋巴细胞获得抗原特异性T细胞如抗原特异性CD4+和/或CD8+T细胞。例如，可通过从感染的受试者分离T细胞并用相同的
抗原在体外刺激细胞，针对巨细胞病毒抗原生成抗原特异性T细胞系或克隆。
抗原在体外刺激细胞，针对巨细胞病毒抗原生成抗原特异性T细胞系或克隆。
[0384] D.用于基因工程的载体和方法
[0385] 用于引入基因工程化组分例如细胞表面缀合物和重组受体(例如CAR或TCR)的各种方法是熟知的，并且可以与所提供的方法和组合物一起使用。示例性方法包括用于转移
编码多肽或受体的核酸的那些方法，包括经由病毒载体，例如逆转录病毒或慢病毒、非病毒
载体或转座子(例如睡美人(Sleeping Beauty)转座子系统)。基因转移的方法可以包括转
导、电穿孔或导致基因转移到细胞中的其他方法。
编码多肽或受体的核酸的那些方法，包括经由病毒载体，例如逆转录病毒或慢病毒、非病毒
载体或转座子(例如睡美人(Sleeping Beauty)转座子系统)。基因转移的方法可以包括转
导、电穿孔或导致基因转移到细胞中的其他方法。
[0386] 在一些实施方案中，通过以下方式完成基因转移：首先刺激细胞，如通过将其与诱导反应(如增殖、存活和/或激活)的刺激物进行组合，例如如通过细胞因子或激活标记的表
达测量的，然后转导激活的细胞，并且在培养物中扩增至足以用于临床应用的数量。
达测量的，然后转导激活的细胞，并且在培养物中扩增至足以用于临床应用的数量。
[0387] 在一些背景下，可能需要防止刺激因子(例如，淋巴因子或细胞因子)的过表达可能潜在地导致受试者中不希望的结果或较低的疗效(例如受试者中与毒性相关的因素)的
可能性。因此，在一些情境下，经工程化的细胞包括导致所述细胞在体内(如在过继免疫疗
法中给予时)对阴性选择易感的基因区段。例如，在一些方面，将细胞工程化，使得它们可以
由于给予它们的患者的体内状况的改变而被消除。阴性选择性表型可以由赋予对所给予的
药剂(例如，化合物)的敏感性的基因的插入而产生。阴性选择性基因包括单纯疱疹病毒I型
胸苷激酶(HSV-I TK)基因(Wigler等人,Cell 2:223,1977)，其赋予更昔洛韦敏感性；细胞
次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)基因；细胞腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(APRT)基因；细菌
胞嘧啶脱氨酶(Mullen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:33(1992))。
可能性。因此，在一些情境下，经工程化的细胞包括导致所述细胞在体内(如在过继免疫疗
法中给予时)对阴性选择易感的基因区段。例如，在一些方面，将细胞工程化，使得它们可以
由于给予它们的患者的体内状况的改变而被消除。阴性选择性表型可以由赋予对所给予的
药剂(例如，化合物)的敏感性的基因的插入而产生。阴性选择性基因包括单纯疱疹病毒I型
胸苷激酶(HSV-I TK)基因(Wigler等人,Cell 2:223,1977)，其赋予更昔洛韦敏感性；细胞
次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)基因；细胞腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(APRT)基因；细菌
胞嘧啶脱氨酶(Mullen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:33(1992))。
[0388] 在一些实施方案中，使用重组感染性病毒粒子(例如像源自猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体)将重组核酸转移至细胞中。在一些实施方案中，使用重组慢
病毒载体或逆转录病毒载体(如γ-逆转录病毒载体)将重组核酸转移到T细胞中(参见例
如，Koste等人(2014)Gene Therapy 2014年4月3日.doi:10.1038/gt.2014.25；Carlens等
人(2000)Exp Hematol 28(10):1137-46；Alonso-Camino等人(2013)Mol Ther Nucl Acids
2,e93；Park等人,Trends Biotechnol.2011年11月29日(11):550–557。
病毒载体或逆转录病毒载体(如γ-逆转录病毒载体)将重组核酸转移到T细胞中(参见例
如，Koste等人(2014)Gene Therapy 2014年4月3日.doi:10.1038/gt.2014.25；Carlens等
人(2000)Exp Hematol 28(10):1137-46；Alonso-Camino等人(2013)Mol Ther Nucl Acids
2,e93；Park等人,Trends Biotechnol.2011年11月29日(11):550–557。
[0389] 在一些实施方案中，所述逆转录病毒载体具有长末端重复序列(LTR)，例如源自莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)、鼠胚胎干细胞病毒(MESV)、鼠干
细胞病毒(MSCV)、脾病灶形成病毒(SFFV)或腺相关病毒(AAV)的逆转录病毒载体。大多数逆
转录病毒载体衍生自鼠逆转录病毒。在一些实施方案中，所述逆转录病毒包括源自任何禽
类或哺乳动物细胞来源的那些。所述逆转录病毒通常是双嗜性的，这意味着它们能够感染
包括人在内的若干种物种的宿主细胞。在一个实施方案中，待表达的基因替代逆转录病毒
gag、pol和/或env序列。已经描述了许多说明性逆转录病毒系统(例如，美国专利号5,219,
740；6,207,453；5,219,740；Miller和Rosman(1989)BioTechniques 7:980-990；Miller,
A.D.(1990)Human Gene Therapy 1:5-14；Scarpa等人(1991)Virology 180:849-852；
Burns等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8033-8037；以及Boris-Lawrie和Temin
(1993)Cur.Opin.Genet.Develop.3:102-109。
细胞病毒(MSCV)、脾病灶形成病毒(SFFV)或腺相关病毒(AAV)的逆转录病毒载体。大多数逆
转录病毒载体衍生自鼠逆转录病毒。在一些实施方案中，所述逆转录病毒包括源自任何禽
类或哺乳动物细胞来源的那些。所述逆转录病毒通常是双嗜性的，这意味着它们能够感染
包括人在内的若干种物种的宿主细胞。在一个实施方案中，待表达的基因替代逆转录病毒
gag、pol和/或env序列。已经描述了许多说明性逆转录病毒系统(例如，美国专利号5,219,
740；6,207,453；5,219,740；Miller和Rosman(1989)BioTechniques 7:980-990；Miller,
A.D.(1990)Human Gene Therapy 1:5-14；Scarpa等人(1991)Virology 180:849-852；
Burns等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8033-8037；以及Boris-Lawrie和Temin
(1993)Cur.Opin.Genet.Develop.3:102-109。
[0390] 慢病毒转导的方法是已知的。示例性方法描述于例如Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；Cooper等人(2003)Blood.101:1637-1644；Verhoeyen等人
(2009)Methods Mol Biol.506:97-114；以及Cavalieri等人(2003)Blood.102(2):497-505
中。
(2009)Methods Mol Biol.506:97-114；以及Cavalieri等人(2003)Blood.102(2):497-505
中。
[0391] 在一些实施方案中，经由电穿孔将重组核酸转移到T细胞中(参见例如，Chicaybam等人,(2013)PLoS ONE 8(3):e60298和Van Tedeloo等人(2000)Gene Therapy 7(16):
1431-1437)。在一些实施方案中，经由转座将重组核酸转移到T细胞中(参见例如，Manuri等
人(2010)Hum Gene Ther 21(4):427-437；Sharma等人(2013)Molec Ther Nucl Acids 2,
e74；以及Huang等人(2009)Methods Mol Biol 506:115-126)。在免疫细胞中引入和表达遗
传物质的其他方法包括磷酸钙转染(例如，如在Current Protocols in Molecular
Biology,John Wiley&Sons,New York.N.Y.中所述)、原生质体融合、阳离子脂质体介导的
转染；钨粒子促进的微粒轰击(Johnston,Nature,346:776-777(1990))；以及磷酸锶DNA共
沉淀(Brash等人,Mol.Cell Biol.,7:2031-2034(1987))。
1431-1437)。在一些实施方案中，经由转座将重组核酸转移到T细胞中(参见例如，Manuri等
人(2010)Hum Gene Ther 21(4):427-437；Sharma等人(2013)Molec Ther Nucl Acids 2,
e74；以及Huang等人(2009)Methods Mol Biol 506:115-126)。在免疫细胞中引入和表达遗
传物质的其他方法包括磷酸钙转染(例如，如在Current Protocols in Molecular
Biology,John Wiley&Sons,New York.N.Y.中所述)、原生质体融合、阳离子脂质体介导的
转染；钨粒子促进的微粒轰击(Johnston,Nature,346:776-777(1990))；以及磷酸锶DNA共
沉淀(Brash等人,Mol.Cell Biol.,7:2031-2034(1987))。
[0392] 用于转移编码所述重组产物的核酸的其他方法和载体是例如在国际专利申请公开号WO 2014055668和美国专利号7,446,190中所述的那些。
[0393] 在一些实施方案中，细胞(例如，T细胞)可以在扩增期间或之后例如用细胞表面缀合物、T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)进行转染。例如，这种用于引入所需多肽或受
体的基因的转染可以用任何合适的逆转录病毒载体进行。然后可以使遗传修饰的细胞群摆
脱初始刺激物(例如CD3/CD28刺激物)，并随后用第二种类型的刺激物例如经由从头引入的
受体进行刺激。所述第二种类型的刺激物可包括肽/MHC分子形式的抗原刺激物、遗传引入
的受体的同源(交联)配体(例如CAR的天然配体)或在新受体的框架内直接结合(例如通过
识别受体内的恒定区)的任何配体(如抗体)。参见例如，Cheadle等人,“Chimeric antigen
receptors for T-cell based therapy”Methods Mol Biol.2012；907:645-66；或Barrett
等人,Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine第
65卷:333-347(2014)。
体的基因的转染可以用任何合适的逆转录病毒载体进行。然后可以使遗传修饰的细胞群摆
脱初始刺激物(例如CD3/CD28刺激物)，并随后用第二种类型的刺激物例如经由从头引入的
受体进行刺激。所述第二种类型的刺激物可包括肽/MHC分子形式的抗原刺激物、遗传引入
的受体的同源(交联)配体(例如CAR的天然配体)或在新受体的框架内直接结合(例如通过
识别受体内的恒定区)的任何配体(如抗体)。参见例如，Cheadle等人,“Chimeric antigen
receptors for T-cell based therapy”Methods Mol Biol.2012；907:645-66；或Barrett
等人,Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine第
65卷:333-347(2014)。
[0394] 另外的核酸(例如，用于引入的基因)包括用于改善治疗功效的那些，如通过促进转移细胞的活力和/或功能；用于提供选择和/或评估细胞的遗传标记的基因，如以评估体
内存活或定位；改善安全性的基因，例如通过使细胞在体内对阴性选择易感，如Lupton
S.D.等人,Mol.and Cell Biol.,11:6(1991)和Riddell等人,Human Gene Therapy 3:319-
338(1992)所述；还参见Lupton等人的PCT/US 91/08442和PCT/US 94/05601的出版物，其描
述了使用由将显性阳性选择性标记与阴性选择性标记融合而得到的双功能选择性融合基
因。参见例如，Riddell等人,美国专利号6,040,177,第14-17栏。
内存活或定位；改善安全性的基因，例如通过使细胞在体内对阴性选择易感，如Lupton
S.D.等人,Mol.and Cell Biol.,11:6(1991)和Riddell等人,Human Gene Therapy 3:319-
338(1992)所述；还参见Lupton等人的PCT/US 91/08442和PCT/US 94/05601的出版物，其描
述了使用由将显性阳性选择性标记与阴性选择性标记融合而得到的双功能选择性融合基
因。参见例如，Riddell等人,美国专利号6,040,177,第14-17栏。
[0395] 在一些实施方案中，在基因工程化之前或与其相连地孵育和/或培养细胞。所述孵育步骤可以包括培养、培育、刺激、激活和/或繁殖。孵育和/或工程化可以在培养容器中进
行，所述培养容器是如单元、室、孔、柱、管、管组、阀、小瓶、培养皿、袋或其他用于培养或培育细胞的容器。在一些实施方案中，在刺激条件或刺激剂的存在下孵育所述组合物或细胞。
这些条件包括针对以下而设计的那些条件：用于诱导群体中细胞的增殖、扩增、激活和/或
存活的条件，用于模拟抗原暴露和/或用于引发细胞进行基因工程化，如以引入重组抗原受
体。
行，所述培养容器是如单元、室、孔、柱、管、管组、阀、小瓶、培养皿、袋或其他用于培养或培育细胞的容器。在一些实施方案中，在刺激条件或刺激剂的存在下孵育所述组合物或细胞。
这些条件包括针对以下而设计的那些条件：用于诱导群体中细胞的增殖、扩增、激活和/或
存活的条件，用于模拟抗原暴露和/或用于引发细胞进行基因工程化，如以引入重组抗原受
体。
[0396] 条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和任何其他旨在激活细胞的药剂))。
[0397] 在一些实施方案中，刺激条件或药剂包括一种或多种药剂(例如配体)，其能够激活TCR复合物的细胞内信号传导结构域。在一些方面，所述药剂在T细胞中开启或启动TCR/
CD3细胞内信号传导级联。此类药剂可包括抗体如对于TCR具有特异性的抗体，例如抗CD3。
在一些实施方案中，刺激条件包括一种或多种药剂例如配体，其能够刺激共刺激受体，例如
抗CD28。在一些实施方案中，这种药剂和/或配体可结合至固体支撑物如珠和/或一种或多
种细胞因子。任选地，所述扩增方法还可以包括向培养基中(例如，以至少约0.5ng/ml的浓
度)添加抗CD3和/或抗CD28抗体的步骤。在一些实施方案中，所述刺激剂包括IL-2、IL-15
和/或IL-7。在一些方面，IL-2浓度为至少约10单位/mL。
CD3细胞内信号传导级联。此类药剂可包括抗体如对于TCR具有特异性的抗体，例如抗CD3。
在一些实施方案中，刺激条件包括一种或多种药剂例如配体，其能够刺激共刺激受体，例如
抗CD28。在一些实施方案中，这种药剂和/或配体可结合至固体支撑物如珠和/或一种或多
种细胞因子。任选地，所述扩增方法还可以包括向培养基中(例如，以至少约0.5ng/ml的浓
度)添加抗CD3和/或抗CD28抗体的步骤。在一些实施方案中，所述刺激剂包括IL-2、IL-15
和/或IL-7。在一些方面，IL-2浓度为至少约10单位/mL。
[0398] 在一些方面，孵育是根据多种技术来进行，例如以下文献中所述的那些技术：授予Riddell等人的美国专利号6,040,177；Klebanoff等人(2012)J Immunother.35(9):651-
660,Terakura等人(2012)Blood.1:72-82；和/或Wang等人(2012)J Immunother.35(9):
689-701。
660,Terakura等人(2012)Blood.1:72-82；和/或Wang等人(2012)J Immunother.35(9):
689-701。
[0399] 在一些实施方案中，通过以下方法扩增T细胞：向培养起始组合物中加入饲养细胞(如非分裂外周血单核细胞(PBMC))(例如，使得所得细胞群含有至少约5、10、20或40种或更
多种PBMC饲养细胞，以使初始群体中的每种T淋巴细胞进行扩增)；以及孵育培养物(例如，
持续足以扩增T细胞数量的时间)。在一些方面，非分裂饲养细胞可包含γ辐射的PBMC饲养
细胞。在一些实施方案中，用约3000至3600拉德范围内的γ射线照射PBMC以防止细胞分裂。
在一些方面，在添加T细胞群之前将饲养细胞加入到培养基中。
多种PBMC饲养细胞，以使初始群体中的每种T淋巴细胞进行扩增)；以及孵育培养物(例如，
持续足以扩增T细胞数量的时间)。在一些方面，非分裂饲养细胞可包含γ辐射的PBMC饲养
细胞。在一些实施方案中，用约3000至3600拉德范围内的γ射线照射PBMC以防止细胞分裂。
在一些方面，在添加T细胞群之前将饲养细胞加入到培养基中。
[0400] 在一些实施方案中，所述刺激条件包括适合于人T淋巴细胞生长的温度，例如至少约25摄氏度，通常为至少约30摄氏度，并且通常在或约在37摄氏度。任选地，所述孵育还可
以包括添加非分裂EBV转化的类淋巴母细胞(LCL)作为饲养细胞。可以用在约6000至10,000
拉德范围内的γ射线照射LCL。在一些方面，所述LCL饲养细胞以任何合适的量(如LCL饲养
细胞与初始T淋巴细胞的比率为至少约10:1)提供。
以包括添加非分裂EBV转化的类淋巴母细胞(LCL)作为饲养细胞。可以用在约6000至10,000
拉德范围内的γ射线照射LCL。在一些方面，所述LCL饲养细胞以任何合适的量(如LCL饲养
细胞与初始T淋巴细胞的比率为至少约10:1)提供。
[0401] 在一些实施方案中，所述制备方法包括在分离、孵育和/或工程化之前或之后冷冻(例如，冷冻保存)所述细胞的步骤。在一些实施方案中，所述冷冻和后续解冻步骤去除所述
细胞群中的粒细胞，并且在一定程度上去除单核细胞。在一些实施方案中，例如在洗涤步骤
之后将所述细胞悬浮在冷冻溶液中以去除血浆和血小板。在一些方面，可以使用多种已知
的冷冻溶液和参数中的任何一种。一个例子涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白
(HSA)的PBS，或其他合适的细胞冷冻培养基。然后将其用培养基1:1稀释，使得DMSO和HSA的
最终浓度分别为10％和4％。然后通常将细胞以1°/分钟的速率冷冻至-80℃并储存在液氮
储罐的气相中。
细胞群中的粒细胞，并且在一定程度上去除单核细胞。在一些实施方案中，例如在洗涤步骤
之后将所述细胞悬浮在冷冻溶液中以去除血浆和血小板。在一些方面，可以使用多种已知
的冷冻溶液和参数中的任何一种。一个例子涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白
(HSA)的PBS，或其他合适的细胞冷冻培养基。然后将其用培养基1:1稀释，使得DMSO和HSA的
最终浓度分别为10％和4％。然后通常将细胞以1°/分钟的速率冷冻至-80℃并储存在液氮
储罐的气相中。
[0402] IV.选择或检测转导细胞的方法
[0403] 提供了结合制造(例如制备和加工)基因工程化的细胞靶向细胞表面缀合物的药剂(例如亲和标签，如Strep-标签)的方法。在一些实施方案中，将含有细胞表面分子和至少
一种药剂的细胞表面缀合物用于检测用细胞表面缀合物转导的细胞。在另外的实施方案
中，细胞检测用细胞表面缀合物转导的细胞之后是分离和鉴定用细胞表面缀合物转导的细
胞。
一种药剂的细胞表面缀合物用于检测用细胞表面缀合物转导的细胞。在另外的实施方案
中，细胞检测用细胞表面缀合物转导的细胞之后是分离和鉴定用细胞表面缀合物转导的细
胞。
[0404] 在一些方面，提供了在将细胞工程化的方法的基因转移、细胞加工、孵育、培养和/或配制步骤的一个或多个步骤之前、期间或之后(例如在如上所述的任何处理步骤期间)检
测、选择或分离基因修饰的细胞的方法。在一些方面，在基因修饰的细胞(例如T细胞)的生
产和进一步加工期间，仅明确选择并进一步加工对转基因呈阳性的那些细胞是有意义的。
在所提供的方法中，通过检测细胞表面缀合物的药剂(例如肽)(如亲和标签)，例如通过检
测链霉亲和素结合蛋白(例如Strep-标签)来进行基因修饰的细胞的检测和选择。在一些方
面，细胞表面缀合物的检测是与细胞表面缀合物共同引入和/或共表达的重组受体的替代
标记。
测、选择或分离基因修饰的细胞的方法。在一些方面，在基因修饰的细胞(例如T细胞)的生
产和进一步加工期间，仅明确选择并进一步加工对转基因呈阳性的那些细胞是有意义的。
在所提供的方法中，通过检测细胞表面缀合物的药剂(例如肽)(如亲和标签)，例如通过检
测链霉亲和素结合蛋白(例如Strep-标签)来进行基因修饰的细胞的检测和选择。在一些方
面，细胞表面缀合物的检测是与细胞表面缀合物共同引入和/或共表达的重组受体的替代
标记。
[0405] 在一些方面，含有用于检测的细胞的组合物包括由一个或多个加工步骤(例如分离、离心、基因工程化(例如用病毒载体转导)、洗涤和/或孵育)产生的样品。在一些实施方
案中，将细胞或细胞的组合物与对所述缀合物的药剂具特异性的结合分子接触，所述细胞
或细胞的组合物在将细胞工程化的方法的基因转移(例如用病毒载体转导)、细胞加工、孵
育、培养、洗涤和/或配制步骤中的一个或多个步骤(例如本文描述的任何步骤)之前、期间
或之后获得。在某些实施方案中，接触是在允许结合分子与组合物的细胞中存在的细胞表
面缀合物的药剂结合的条件下进行的。在某些实施方案中，所述方法进一步包括检测在结
合分子与样品中缀合物的药剂之间是否形成复合物，和/或检测这种结合的存在或不存在
或水平。在一些实施方案中，结合分子是可检测地标记的，例如用荧光部分标记的。
案中，将细胞或细胞的组合物与对所述缀合物的药剂具特异性的结合分子接触，所述细胞
或细胞的组合物在将细胞工程化的方法的基因转移(例如用病毒载体转导)、细胞加工、孵
育、培养、洗涤和/或配制步骤中的一个或多个步骤(例如本文描述的任何步骤)之前、期间
或之后获得。在某些实施方案中，接触是在允许结合分子与组合物的细胞中存在的细胞表
面缀合物的药剂结合的条件下进行的。在某些实施方案中，所述方法进一步包括检测在结
合分子与样品中缀合物的药剂之间是否形成复合物，和/或检测这种结合的存在或不存在
或水平。在一些实施方案中，结合分子是可检测地标记的，例如用荧光部分标记的。
[0406] 在所提供方法的一些方面，使用能够特异性结合细胞表面缀合物的药剂(例如肽)(如亲和标签)的抗体或抗原结合片段进行检测。可以使用针对细胞表面缀合物的亲和标签
的任何已知抗体或抗原结合片段，例如如上所述的任何抗体或抗原结合片段。在一些实施
方案中，细胞表面缀合物含有如所描述的链霉亲和素结合肽，例如Strep-标签(例如Strep-
II或双-strep标签)，并且所述抗体或抗原结合片段特异性结合链霉亲和素结合
肽。在一些实施方案中，所述抗体是可检测地标记的，例如荧光标记的。
的任何已知抗体或抗原结合片段，例如如上所述的任何抗体或抗原结合片段。在一些实施
方案中，细胞表面缀合物含有如所描述的链霉亲和素结合肽，例如Strep-标签(例如Strep-
II或双-strep标签)，并且所述抗体或抗原结合片段特异性结合链霉亲和素结合
肽。在一些实施方案中，所述抗体是可检测地标记的，例如荧光标记的。
[0407] 在所提供方法的一些方面，使用非抗体结合分子试剂进行检测。在一些实施方案中，细胞表面缀合物含有如所描述的链霉亲和素结合肽，例如Strep-标签(例如Strep-
II或双-strep标签)，并且所述试剂是或包含链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白、
或者链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白的寡聚物。在一些实施方案中，结合分子试剂是或
包含SEQ ID NO:3、4、5、6、27或28中任一个中所示的链霉亲和素突变蛋白，或者是链霉亲和
素突变蛋白的寡聚物。在一些实施方案中，结合分子试剂是可商购获得的试剂，称为Strep-
或Strep- XT。在一些实施方案中，非抗体结合分子试剂是可检测地标记
的，例如荧光标记的。
II或双-strep标签)，并且所述试剂是或包含链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白、
或者链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白的寡聚物。在一些实施方案中，结合分子试剂是或
包含SEQ ID NO:3、4、5、6、27或28中任一个中所示的链霉亲和素突变蛋白，或者是链霉亲和
素突变蛋白的寡聚物。在一些实施方案中，结合分子试剂是可商购获得的试剂，称为Strep-
或Strep- XT。在一些实施方案中，非抗体结合分子试剂是可检测地标记
的，例如荧光标记的。
[0408] 在一些实施方案中，结合分子可以用于鉴定、分选、富集或分离表达本公开文本的细胞表面缀合物的细胞，例如用于分离对细胞表面缀合物(例如ST-EGFRt或ST-PSMA)呈阳
性的并且因此对重组受体也呈阳性的基因修饰的细胞。在一些实施方案中，所提供的方法
包括使在基因转移(例如，用病毒载体转导)、洗涤、细胞加工、孵育、培养和/或配制步骤中
的一个或多个步骤之前、期间或之后获得的细胞或细胞的组合物与对缀合物的药剂具特异
性的结合分子接触，并且选择或分离对结合分子的结合呈阳性的细胞。在一些实施方案中，
结合分子是特异性结合所述药剂的抗体或抗原结合片段(例如，抗药剂抗体，如抗Strep-
抗体)。在一些实施方案中，结合分子是特异性结合所述药剂的非抗体蛋白质试剂
(例如，与Strep-标签结合的Strep- )。在一些方面，可以使用基质，例如磁珠、琼脂
糖颗粒、细胞培养皿或其他固体表面基质，其中已经固定、缀合或结合了对所述缀合物的药
剂具特异性的(例如对亲和标签具特异性的)结合分子。在一些实施方案中，所述试剂被包
含在支撑物，如固体支撑物或表面，例如珠、或固定相(色谱基质)上。在某些实施方案中，使
用磁珠或基于顺磁珠的分离或通过使用亲和柱对此类细胞进行分选、富集或分离。
性的并且因此对重组受体也呈阳性的基因修饰的细胞。在一些实施方案中，所提供的方法
包括使在基因转移(例如，用病毒载体转导)、洗涤、细胞加工、孵育、培养和/或配制步骤中
的一个或多个步骤之前、期间或之后获得的细胞或细胞的组合物与对缀合物的药剂具特异
性的结合分子接触，并且选择或分离对结合分子的结合呈阳性的细胞。在一些实施方案中，
结合分子是特异性结合所述药剂的抗体或抗原结合片段(例如，抗药剂抗体，如抗Strep-
抗体)。在一些实施方案中，结合分子是特异性结合所述药剂的非抗体蛋白质试剂
(例如，与Strep-标签结合的Strep- )。在一些方面，可以使用基质，例如磁珠、琼脂
糖颗粒、细胞培养皿或其他固体表面基质，其中已经固定、缀合或结合了对所述缀合物的药
剂具特异性的(例如对亲和标签具特异性的)结合分子。在一些实施方案中，所述试剂被包
含在支撑物，如固体支撑物或表面，例如珠、或固定相(色谱基质)上。在某些实施方案中，使
用磁珠或基于顺磁珠的分离或通过使用亲和柱对此类细胞进行分选、富集或分离。
[0409] 在一些实施方案中，对所述药剂具特异性的结合分子(如任何抗体或非抗体试剂(例如链霉亲和素突变蛋白，如Strept-tacin))被包含在支撑物，如固体支撑物或表面，例
如珠、或固定相(色谱基质)上。在一些此类实施方案中，所述试剂被可逆地固定在支撑物
上。在一些情况下，所述试剂经由共价键被固定在支撑物上。在一些方面，所述试剂被非共
价地可逆地固定在支撑物上。
如珠、或固定相(色谱基质)上。在一些此类实施方案中，所述试剂被可逆地固定在支撑物
上。在一些情况下，所述试剂经由共价键被固定在支撑物上。在一些方面，所述试剂被非共
价地可逆地固定在支撑物上。
[0410] 在一些实施方案中，所述支撑物是固体支撑物。可以将任何固体支撑物(表面)用于固定结合分子，包括抗体或非抗体试剂。其上可以固定结合分子的固体支撑物的说明性
例子包括磁珠、聚合物珠、细胞培养板、微量滴定板、膜或中空纤维。在一些方面，中空纤维
可以用作 细胞扩增系统(可获自TerumoBCT Inc.(Lakewood,CO,USA))中的生
物反应器。在一些实施方案中，结合分子共价地附接到固体支撑物上。在其他实施方案中，
非共价相互作用也可以用于固定，例如在塑料基底上。
例子包括磁珠、聚合物珠、细胞培养板、微量滴定板、膜或中空纤维。在一些方面，中空纤维
可以用作 细胞扩增系统(可获自TerumoBCT Inc.(Lakewood,CO,USA))中的生
物反应器。在一些实施方案中，结合分子共价地附接到固体支撑物上。在其他实施方案中，
非共价相互作用也可以用于固定，例如在塑料基底上。
[0411] 在一些实施方案中，结合分子可以是例如包含结合所描述的链霉亲和素结合肽的链霉亲和素或抗生物素蛋白突变蛋白的非抗体试剂。此类链霉亲和素突变蛋白可以共价地
附接到任何表面(例如，用于色谱纯化的树脂(珠))上，并且可以以例如Strep- 琼
脂糖凝胶、Strep- Strep- 大容量、或
Strep- 等形式从IBA GmbH, 商购获得。
附接到任何表面(例如，用于色谱纯化的树脂(珠))上，并且可以以例如Strep- 琼
脂糖凝胶、Strep- Strep- 大容量、或
Strep- 等形式从IBA GmbH, 商购获得。
[0412] 容易商购获得的其他说明性例子是固定化金属亲和色谱(IMAC)树脂，如树脂(Westburg,Leusden,The Netherlands)，其可以用于固定寡聚组氨酸标记
的(his-标记的)蛋白质，例如用于结合诸如五组氨酸或六组氨酸标签等寡聚组氨酸标签。
其他例子包括可获自GE Life Sciences的钙调蛋白琼脂糖凝胶，其可以用于结合其中药剂
(亲和标签)是钙调蛋白结合肽的缀合物。另外的例子包括与谷胱甘肽偶联的琼脂糖凝胶，
其可以用于结合其中药剂(亲和标签)是谷胱甘肽-S-转移酶的缀合物。
的(his-标记的)蛋白质，例如用于结合诸如五组氨酸或六组氨酸标签等寡聚组氨酸标签。
其他例子包括可获自GE Life Sciences的钙调蛋白琼脂糖凝胶，其可以用于结合其中药剂
(亲和标签)是钙调蛋白结合肽的缀合物。另外的例子包括与谷胱甘肽偶联的琼脂糖凝胶，
其可以用于结合其中药剂(亲和标签)是谷胱甘肽-S-转移酶的缀合物。
[0413] 在一些实施方案中，本发明方法中使用的固体支撑物可以包括磁性可吸引物质如一种或多种磁性可吸引颗粒或铁磁流体。相应的磁性可吸引颗粒可以包含具有能够结合靶
细胞的结合位点的试剂。在一些情况下，磁性可吸引颗粒可以含有反磁性、铁磁性、顺磁性
或超顺磁性材料。通常，超顺磁性材料响应于具有感应磁场而不会产生永久磁化的磁场。基
于氧化铁的磁性颗粒例如可以以 从Dynal Biotech、以磁性MicroBeads从
Miltenyi Biotec、以磁性多孔玻璃珠从CPG Inc.、以及从各种其他来源(如Roche Applied
Science、BIOCLON、BioSource International Inc.、micromod、AMBION、Merck、Bangs
Laboratories、Polysciences、or Novagen Inc.，仅举几例)商购获得。例如Hutten,A.等人
(J.Biotech.(2004),112,47-63)已经描述了基于超顺磁性Co和FeCo的磁性纳米颗粒，以及
铁磁性Co纳米晶体。在一些实施方案中，使用免疫磁性(或亲和磁性)分开技术来分开或分
离细胞和细胞群(综述于Methods in Molecular Medicine,第58卷:Metastasis Research
Protocols,第2卷:Cell Behavior In Vitro and In Vivo,第17-25页S.A.Brooks和
U.Schumacher编辑 Humana Press Inc.,新泽西州托托瓦)。
细胞的结合位点的试剂。在一些情况下，磁性可吸引颗粒可以含有反磁性、铁磁性、顺磁性
或超顺磁性材料。通常，超顺磁性材料响应于具有感应磁场而不会产生永久磁化的磁场。基
于氧化铁的磁性颗粒例如可以以 从Dynal Biotech、以磁性MicroBeads从
Miltenyi Biotec、以磁性多孔玻璃珠从CPG Inc.、以及从各种其他来源(如Roche Applied
Science、BIOCLON、BioSource International Inc.、micromod、AMBION、Merck、Bangs
Laboratories、Polysciences、or Novagen Inc.，仅举几例)商购获得。例如Hutten,A.等人
(J.Biotech.(2004),112,47-63)已经描述了基于超顺磁性Co和FeCo的磁性纳米颗粒，以及
铁磁性Co纳米晶体。在一些实施方案中，使用免疫磁性(或亲和磁性)分开技术来分开或分
离细胞和细胞群(综述于Methods in Molecular Medicine,第58卷:Metastasis Research
Protocols,第2卷:Cell Behavior In Vitro and In Vivo,第17-25页S.A.Brooks和
U.Schumacher编辑 Humana Press Inc.,新泽西州托托瓦)。
[0414] 在一些实施方案中，所述支撑物含有固定相。因此，在一些实施方案中，结合分子被包含在固定相(也称为色谱基质)上。在一些此类实施方案中，结合分子被可逆地固定在
固定相上。在一些情况下，结合分子经由共价键被可逆地固定在固定相上。在一些方面，结
合分子被非共价地可逆地固定在固定相上。
固定相上。在一些情况下，结合分子经由共价键被可逆地固定在固定相上。在一些方面，结
合分子被非共价地可逆地固定在固定相上。
[0415] 可以使用任何材料作为色谱基质。通常，合适的色谱材料是基本上无害的，即对细胞活力无害，例如当在所希望的条件下用于填充色谱柱时。在一些实施方案中，固定相保持
在预定位置，例如预定方向，然而样品的位置是改变的。因此，在一些实施方案中，固定相是
流动相流过(通过流过或以分批模式流动)并且出现在液相中包含的组分在各相之间分布
(溶解或分散)的色谱系统的一部分。
在预定位置，例如预定方向，然而样品的位置是改变的。因此，在一些实施方案中，固定相是
流动相流过(通过流过或以分批模式流动)并且出现在液相中包含的组分在各相之间分布
(溶解或分散)的色谱系统的一部分。
[0416] 在一些实施方案中，色谱基质具有固体相或半固体相的形式，然而含有待分离/分开的靶细胞的样品是流体相。色谱基质可以是颗粒材料(具有任何合适的大小和形状)或单
片色谱材料，包括纸基底或膜。因此，在一些方面，色谱可以是柱色谱以及平面色谱。在一些
实施方案中，除了标准色谱柱之外，允许双向流动的柱(如可获自PhyNexus,Inc.San Jose,
CA,U.S.A.的 柱)、或微量移液枪头可以用于基于柱/基于流过模式的方法。因此，
在一些情况下，可用于本发明方法中的色谱柱也包含微量移液枪头或允许双向流动的柱。
在一些情况下，例如在使用颗粒基质材料的情况下，颗粒基质材料可以例如具有约5μm至约
200μm、或从约5μm至约400μm、或从约5μm至约600μm的平均粒度。在一些方面，色谱基质可以是例如是或包括聚合物树脂或金属氧化物或非金属氧化物。在一些方面，例如在使用平面
色谱的情况下，基质材料可以是适合用于平面色谱的任何材料，例如基于常规纤维素的或
基于有机聚合物的膜(例如，纸膜、硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯(PVDF)膜)或二氧化硅涂
覆的玻璃板。在一个实施方案中，色谱基质/固定相是非磁性材料或不可磁化材料。在其他
实施方案中，本发明方法中使用的色谱基质没有任何磁性可吸引物质。
片色谱材料，包括纸基底或膜。因此，在一些方面，色谱可以是柱色谱以及平面色谱。在一些
实施方案中，除了标准色谱柱之外，允许双向流动的柱(如可获自PhyNexus,Inc.San Jose,
CA,U.S.A.的 柱)、或微量移液枪头可以用于基于柱/基于流过模式的方法。因此，
在一些情况下，可用于本发明方法中的色谱柱也包含微量移液枪头或允许双向流动的柱。
在一些情况下，例如在使用颗粒基质材料的情况下，颗粒基质材料可以例如具有约5μm至约
200μm、或从约5μm至约400μm、或从约5μm至约600μm的平均粒度。在一些方面，色谱基质可以是例如是或包括聚合物树脂或金属氧化物或非金属氧化物。在一些方面，例如在使用平面
色谱的情况下，基质材料可以是适合用于平面色谱的任何材料，例如基于常规纤维素的或
基于有机聚合物的膜(例如，纸膜、硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯(PVDF)膜)或二氧化硅涂
覆的玻璃板。在一个实施方案中，色谱基质/固定相是非磁性材料或不可磁化材料。在其他
实施方案中，本发明方法中使用的色谱基质没有任何磁性可吸引物质。
[0417] 在一些实施方案中，适合于本发明方法的非磁性或不可磁化色谱固定相包括衍生化二氧化硅或交联凝胶。在一些方面，交联凝胶可以是基于天然聚合物，例如基于在自然界
中存在的聚合物类别。例如，色谱固定相可以基于的天然聚合物是多糖。在一些情况下，相
应的多糖通常是交联的。多糖基质的例子包括但不限于琼脂糖凝胶(例如，可以以不同的珠
尺寸和孔径商购获得的SuperflowTM琼脂糖或 材料如SuperflowTM
)或交联葡聚糖的凝胶。另外的说明性例子是可商购获得(以各种珠尺寸和具
有各种孔径)的葡聚糖共价键合的颗粒状交联琼脂糖基质，如 或
两者均可获自GE Healthcare。这样的色谱材料的另一个说明性例子是 其也
可以不同的珠尺寸和孔径从GE Healthcare获得。
中存在的聚合物类别。例如，色谱固定相可以基于的天然聚合物是多糖。在一些情况下，相
应的多糖通常是交联的。多糖基质的例子包括但不限于琼脂糖凝胶(例如，可以以不同的珠
尺寸和孔径商购获得的SuperflowTM琼脂糖或 材料如SuperflowTM
)或交联葡聚糖的凝胶。另外的说明性例子是可商购获得(以各种珠尺寸和具
有各种孔径)的葡聚糖共价键合的颗粒状交联琼脂糖基质，如 或
两者均可获自GE Healthcare。这样的色谱材料的另一个说明性例子是 其也
可以不同的珠尺寸和孔径从GE Healthcare获得。
[0418] 在一些实施方案中，交联凝胶也可以基于合成聚合物，例如基于在自然界中不存在的聚合物类别。在一些方面，色谱固定相基于的这样的合成聚合物是具有极性单体单元
的聚合物，并且因此其本身是极性的。因此，在一些情况下，这样的极性聚合物是亲水性的。
在一些方面，亲水性分子(也称为疏脂性)含有可以与水分子形成偶极-偶极相互作用的部
分。通常，疏水性分子(也称为亲脂性)具有与水分离的倾向。
的聚合物，并且因此其本身是极性的。因此，在一些情况下，这样的极性聚合物是亲水性的。
在一些方面，亲水性分子(也称为疏脂性)含有可以与水分子形成偶极-偶极相互作用的部
分。通常，疏水性分子(也称为亲脂性)具有与水分离的倾向。
[0419] 合适的合成聚合物的说明性例子是聚丙烯酰胺、苯乙烯-二乙烯基苯凝胶、以及丙烯酸酯和二醇的共聚物或丙烯酰胺和二醇的共聚物。说明性例子是聚甲基丙烯酸酯凝胶，
可作为 商购获得。另外的例子是乙二醇和甲基丙烯酸酯的共聚物，可作为
商购获得。在一些实施方案中，色谱固定相还可以包括天然和合成的聚合物组
分，例如复合基质、或多糖和琼脂糖的复合物或共聚物(例如聚丙烯酰胺/琼脂糖复合物)、
或多糖和Ν,Ν'-亚甲基双丙烯酰胺的复合物或共聚物。葡聚糖和Ν,Ν'-亚甲基双丙烯酰
胺的共聚物的说明性例子是上述 系列的材料。在一些实施方案中，衍生化二氧
化硅可以包括与合成或天然聚合物偶联的二氧化硅颗粒。此类实施方案的例子包括但不限
于多糖枝接的二氧化硅、聚乙烯吡咯烷酮枝接的二氧化硅、聚环氧乙烷枝接的二氧化硅、聚
(2-羟基乙基天冬酰胺)二氧化硅和聚(N-异丙基丙烯酰胺)枝接的二氧化硅。
可作为 商购获得。另外的例子是乙二醇和甲基丙烯酸酯的共聚物，可作为
商购获得。在一些实施方案中，色谱固定相还可以包括天然和合成的聚合物组
分，例如复合基质、或多糖和琼脂糖的复合物或共聚物(例如聚丙烯酰胺/琼脂糖复合物)、
或多糖和Ν,Ν'-亚甲基双丙烯酰胺的复合物或共聚物。葡聚糖和Ν,Ν'-亚甲基双丙烯酰
胺的共聚物的说明性例子是上述 系列的材料。在一些实施方案中，衍生化二氧
化硅可以包括与合成或天然聚合物偶联的二氧化硅颗粒。此类实施方案的例子包括但不限
于多糖枝接的二氧化硅、聚乙烯吡咯烷酮枝接的二氧化硅、聚环氧乙烷枝接的二氧化硅、聚
(2-羟基乙基天冬酰胺)二氧化硅和聚(N-异丙基丙烯酰胺)枝接的二氧化硅。
[0420] 在一些实施方案中，可以通过使所述固体支撑物(例如基质)与含有如所描述进行富集或选择的细胞的样品接触而将固体支撑物(如珠或色谱基质)用于如本文描述的富集
和选择方法中。在一些实施方案中，通过破坏结合分子与药剂(例如亲和标签)的相互作用，
从固体支撑物(例如基质)中洗脱或释放所选择的细胞。
和选择方法中。在一些实施方案中，通过破坏结合分子与药剂(例如亲和标签)的相互作用，
从固体支撑物(例如基质)中洗脱或释放所选择的细胞。
[0421] 在一些实施方案中，结合分子与细胞表面缀合物的药剂的结合是可逆的。在一些实施方案中，通过使细胞与包含能够逆转结合分子与药剂之间的键的物质的组合物接触来
实现破坏结合分子与药剂的可逆结合。例如，所述物质是游离结合配偶体和/或是竞争剂
(例如生物素、生物素类似物、其生物活性片段)。在一些实施方案中，所述方法包括在将样
品中的细胞与含有与其结合的结合分子的固体支撑物接触之后，应用竞争物质以破坏在缀
合物的药剂(例如亲和标签)与结合分子之间的键，从而从固体表面回收所选择的细胞。上
面描述了用于在所提供的方法中使用的示例性竞争物质，并且竞争物质的选择取决于特定
的药剂和结合分子。在一些实施方案中，结合分子是用于识别链霉亲和素结合肽(例如
Strep-标签)药剂的链霉亲和素突变蛋白(例如Strep-Tactin)，并且竞争物质是生物素或
生物素类似物。
实现破坏结合分子与药剂的可逆结合。例如，所述物质是游离结合配偶体和/或是竞争剂
(例如生物素、生物素类似物、其生物活性片段)。在一些实施方案中，所述方法包括在将样
品中的细胞与含有与其结合的结合分子的固体支撑物接触之后，应用竞争物质以破坏在缀
合物的药剂(例如亲和标签)与结合分子之间的键，从而从固体表面回收所选择的细胞。上
面描述了用于在所提供的方法中使用的示例性竞争物质，并且竞争物质的选择取决于特定
的药剂和结合分子。在一些实施方案中，结合分子是用于识别链霉亲和素结合肽(例如
Strep-标签)药剂的链霉亲和素突变蛋白(例如Strep-Tactin)，并且竞争物质是生物素或
生物素类似物。
[0422] 在所提供的实施方案中，在制造过程中使用结合分子(例如链霉亲和素突变蛋白试剂，如Strep-Tactin)和细胞表面缀合物的药剂(例如Strep-标签)之间的可逆结合对转
导细胞的选择优于使用对细胞表面缀合物具有更高亲和力的抗体，所述抗体可能保持附着
于给予至受试者的产品中的细胞上。在一些实施方案中，使用Strep- 作为试剂。在
一些实施方案中，用所述试剂检测细胞表面缀合物的药剂部分是可逆的，并且向样品中添
加生物素可以温和地释放转导的细胞。
导细胞的选择优于使用对细胞表面缀合物具有更高亲和力的抗体，所述抗体可能保持附着
于给予至受试者的产品中的细胞上。在一些实施方案中，使用Strep- 作为试剂。在
一些实施方案中，用所述试剂检测细胞表面缀合物的药剂部分是可逆的，并且向样品中添
加生物素可以温和地释放转导的细胞。
[0423] 在一些方面，可以实现可逆性，因为链霉亲和素结合肽(例如Strep-标签)与链霉亲和素突变蛋白结合试剂之间的键是高的，但是小于链霉亲和素结合试剂对生物素或生物
素类似物的结合亲和力。因此，在一些实施方案中，可以添加生物素(维生素H)或生物素类
似物以竞争结合来破坏在固体支撑物(例如珠或色谱基质)上的链霉亲和素突变蛋白结合
试剂与缀合物的链霉亲和素结合肽(例如Strep标签)之间的结合相互作用。在一些实施方
案中，可以在低浓度的生物素或类似物的存在下(例如在0.1mM至10mM、0.5mM至5mM、或1mM
至3mM的存在下，例如通常至少或至少约1mM或至少2mM，例如为或约2.5mM)逆转相互作用。
在一些实施方案中，在竞争剂(如生物素或生物素类似物)的存在下孵育从固体支撑物(如
色谱基质或珠)释放所选择的细胞。
素类似物的结合亲和力。因此，在一些实施方案中，可以添加生物素(维生素H)或生物素类
似物以竞争结合来破坏在固体支撑物(例如珠或色谱基质)上的链霉亲和素突变蛋白结合
试剂与缀合物的链霉亲和素结合肽(例如Strep标签)之间的结合相互作用。在一些实施方
案中，可以在低浓度的生物素或类似物的存在下(例如在0.1mM至10mM、0.5mM至5mM、或1mM
至3mM的存在下，例如通常至少或至少约1mM或至少2mM，例如为或约2.5mM)逆转相互作用。
在一些实施方案中，在竞争剂(如生物素或生物素类似物)的存在下孵育从固体支撑物(如
色谱基质或珠)释放所选择的细胞。
[0424] 在一些实施方案中，所述方法进一步包括在组分的可逆解离之后分离或去除剩余的一种或多种组分。在一些实施方案中，可以分离或去除靶细胞(例如基因修饰的，如转导
的，T细胞)中的任何未结合或残留的生物素。在一些实施方案中，从靶细胞组合物中的细胞
中去除或分离结合分子试剂。在一些实施方案中，由于可逆结合的结合分子(例如含有链霉
亲和素突变蛋白的试剂，如Strep-Tactin试剂)从细胞表面缀合物的解离，所提供的方法具
有额外的优点，即在接触或孵育期结束时分离的细胞不含结合分子。在一些实施方案中，含
有靶细胞的组合物不含任何反应物，这在一些方面有利于与诊断应用(例如，进一步的
FACSTM分选)结合使用或有利于任何基于细胞的治疗应用。
的，T细胞)中的任何未结合或残留的生物素。在一些实施方案中，从靶细胞组合物中的细胞
中去除或分离结合分子试剂。在一些实施方案中，由于可逆结合的结合分子(例如含有链霉
亲和素突变蛋白的试剂，如Strep-Tactin试剂)从细胞表面缀合物的解离，所提供的方法具
有额外的优点，即在接触或孵育期结束时分离的细胞不含结合分子。在一些实施方案中，含
有靶细胞的组合物不含任何反应物，这在一些方面有利于与诊断应用(例如，进一步的
FACSTM分选)结合使用或有利于任何基于细胞的治疗应用。
[0425] 在一些实施方案中，可以使用第二固定相进行结合分子的分离/去除。出于这一目的，在应用到上面描述的第一固定相之前或之后，将包含靶细胞和一种或多种剩余组分的
混合物暴露于在合适的第二固定相上的色谱。这种第二固定相可以是凝胶过滤基质和/或
亲和色谱基质，其中所述凝胶过滤和/或亲和色谱基质包含亲和试剂。包含在色谱树脂上的
亲和试剂包括结合配偶体D，所述结合配偶体D(特异性地)与结合分子试剂(例如链霉亲和
素突变蛋白，如Strep-Tactin)的结合位点Z结合，从而将结合分子试剂固定在固定相上。如
果使用基于链霉亲和素的结合分子试剂(如Strep-Tactin)并且缀合物的药剂是或包含链
霉亲和素结合肽(例如Strep-标签)，则在这种第二固定相的亲和试剂中包含的结合配偶体
D可以是生物素。然后，组合物中任何剩余的链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白与生物素结
合，所述生物素通常与可商购获得的色谱基质(如biotin-sepharoseTM)共价偶联。在一些此
类实施方案中，靶细胞(例如基因修饰的，如转导的，T细胞)可以从结合分子试剂中回收。
混合物暴露于在合适的第二固定相上的色谱。这种第二固定相可以是凝胶过滤基质和/或
亲和色谱基质，其中所述凝胶过滤和/或亲和色谱基质包含亲和试剂。包含在色谱树脂上的
亲和试剂包括结合配偶体D，所述结合配偶体D(特异性地)与结合分子试剂(例如链霉亲和
素突变蛋白，如Strep-Tactin)的结合位点Z结合，从而将结合分子试剂固定在固定相上。如
果使用基于链霉亲和素的结合分子试剂(如Strep-Tactin)并且缀合物的药剂是或包含链
霉亲和素结合肽(例如Strep-标签)，则在这种第二固定相的亲和试剂中包含的结合配偶体
D可以是生物素。然后，组合物中任何剩余的链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白与生物素结
合，所述生物素通常与可商购获得的色谱基质(如biotin-sepharoseTM)共价偶联。在一些此
类实施方案中，靶细胞(例如基因修饰的，如转导的，T细胞)可以从结合分子试剂中回收。
[0426] 在一些实施方案中，用于破坏或逆转药剂与结合分子之间的结合的竞争物质可以经由“去除筒”容易地从刺激的细胞群中去除(参见例如，在国际专利申请WO 2013/124474
中所描述的)。在一些情况下，例如其中结合分子被固定在固体支撑物(如生物反应器表面
或磁珠)上，所述结合分子被抑制。因此，使用去除筒用于去除游离药剂和竞争试剂，可以包
括将洗脱样品(例如在破坏可逆结合之后获得的样品)加载到第二色谱柱上。在一些实施方
案中，这种色谱柱具有合适的固定相，所述固定相既是亲和色谱基质又同时可以充当凝胶
渗透基质。在一些方面，这种亲和色谱基质具有固定在其上的亲和试剂。在一些实施方案
中，亲和试剂可以是例如链霉亲和素、链霉亲和素突变蛋白、抗生物素蛋白、抗生物素蛋白
突变蛋白或其混合物。
中所描述的)。在一些情况下，例如其中结合分子被固定在固体支撑物(如生物反应器表面
或磁珠)上，所述结合分子被抑制。因此，使用去除筒用于去除游离药剂和竞争试剂，可以包
括将洗脱样品(例如在破坏可逆结合之后获得的样品)加载到第二色谱柱上。在一些实施方
案中，这种色谱柱具有合适的固定相，所述固定相既是亲和色谱基质又同时可以充当凝胶
渗透基质。在一些方面，这种亲和色谱基质具有固定在其上的亲和试剂。在一些实施方案
中，亲和试剂可以是例如链霉亲和素、链霉亲和素突变蛋白、抗生物素蛋白、抗生物素蛋白
突变蛋白或其混合物。
[0427] 在一些实施方案中，色谱基质是凝胶过滤基质，例如，当用于如本文描述的去除筒中时。通常，凝胶过滤的特征在于其被设计以经历的特性。因此，在一些方面，凝胶过滤基质
允许在很大程度上基于它们的尺寸分离细胞或其他生物实体。在一些此类方面，相应的色
谱基质通常是如上所述的颗粒状多孔材料。色谱基质可以具有一定的排阻极限，其通常依
据分子量来定义，高于所述分子量时分子完全被排除不能进入孔中。在一些实施方案中，可
以将限定尺寸排阻极限的相应分子量选择为低于与靶细胞重量对应的重量。在这样的实施
方案中，阻止了靶细胞进入尺寸排阻色谱基质的孔中。同样地，固定相可以具有尺寸小于所
选靶细胞的尺寸的孔。在说明性实施方案中，色谱基质的平均孔径为0至约500nm。
允许在很大程度上基于它们的尺寸分离细胞或其他生物实体。在一些此类方面，相应的色
谱基质通常是如上所述的颗粒状多孔材料。色谱基质可以具有一定的排阻极限，其通常依
据分子量来定义，高于所述分子量时分子完全被排除不能进入孔中。在一些实施方案中，可
以将限定尺寸排阻极限的相应分子量选择为低于与靶细胞重量对应的重量。在这样的实施
方案中，阻止了靶细胞进入尺寸排阻色谱基质的孔中。同样地，固定相可以具有尺寸小于所
选靶细胞的尺寸的孔。在说明性实施方案中，色谱基质的平均孔径为0至约500nm。
[0428] 在一些实施方案中，存在于样品中的组分(如竞争物质)可以具有低于孔的排阻极限的尺寸，并且因此可以进入色谱基质的孔中。在一些方面，在能够部分或完全进入孔体积
的此类组分中，较少进入孔体积的较大分子可以首先洗脱，然而最小的分子通常最后洗脱。
在一些实施方案中，将色谱基质的排阻极限选择为低于靶细胞的最大宽度。因此，在一些方
面，可进入孔体积的组分可以在色谱基质中/上保持比靶细胞更长的时间。因此，在一些情
况下，靶细胞可以与样品的其他物质/组分分离地收集在色谱柱的洗脱液中。因此，在一些
方面，诸如竞争物质等组分可以在比靶细胞稍后的时间点从凝胶过滤基质中洗脱。在一些
实施方案中，可以进一步增加这种效果，例如如果凝胶渗透基质含有亲和试剂(如共价结合
于其上)，所述亲和试剂含有能够结合样品中存在的竞争物质的结合位点Z。在一些情况下，
竞争物质可以被试剂的结合位点Z结合，并且从而被固定在基质上。在一些方面，这种方法
在去除筒中实施。
的此类组分中，较少进入孔体积的较大分子可以首先洗脱，然而最小的分子通常最后洗脱。
在一些实施方案中，将色谱基质的排阻极限选择为低于靶细胞的最大宽度。因此，在一些方
面，可进入孔体积的组分可以在色谱基质中/上保持比靶细胞更长的时间。因此，在一些情
况下，靶细胞可以与样品的其他物质/组分分离地收集在色谱柱的洗脱液中。因此，在一些
方面，诸如竞争物质等组分可以在比靶细胞稍后的时间点从凝胶过滤基质中洗脱。在一些
实施方案中，可以进一步增加这种效果，例如如果凝胶渗透基质含有亲和试剂(如共价结合
于其上)，所述亲和试剂含有能够结合样品中存在的竞争物质的结合位点Z。在一些情况下，
竞争物质可以被试剂的结合位点Z结合，并且从而被固定在基质上。在一些方面，这种方法
在去除筒中实施。
[0429] 在一些实施方案中，提供了装置，所述装置包含第一固定相和第二固定相(例如用于选择靶细胞的色谱柱(选择筒)和用于去除试剂的第二色谱柱(去除筒))的至少一种布
置。所述装置可以包含串联流体连接的第一固定相和第二固定相(色谱柱)的多种布置。所
述装置可以包含样品入口，所述样品入口与第一固定相和第二固定相的第一布置的第一固
定相流体连接。在一些实施方案中，所述装置还可以包含用于细胞的样品出口，所述样品出
口与用于色谱法的第一固定相和第二固定相的至少一种布置的最后一种的第二固定相流
体连接。在一些方面，所述装置还可以包含竞争试剂容器，所述竞争试剂容器与第一固定相
和第二固定相的布置的至少一个第一固定相流体连接。
置。所述装置可以包含串联流体连接的第一固定相和第二固定相(色谱柱)的多种布置。所
述装置可以包含样品入口，所述样品入口与第一固定相和第二固定相的第一布置的第一固
定相流体连接。在一些实施方案中，所述装置还可以包含用于细胞的样品出口，所述样品出
口与用于色谱法的第一固定相和第二固定相的至少一种布置的最后一种的第二固定相流
体连接。在一些方面，所述装置还可以包含竞争试剂容器，所述竞争试剂容器与第一固定相
和第二固定相的布置的至少一个第一固定相流体连接。
[0430] 在一些实施方案中，从组合物中去除试剂和其他组分的能力具有另外的优点：即能够避免任何固体支撑物如磁珠。在一些实施方案中，这意味着没有靶细胞(例如基因修饰
的，如转导的，T细胞)被此类磁珠污染的风险或具有靶细胞(例如基因修饰的，如转导的，T
细胞)被此类磁珠污染的最小风险。在一些实施方案中，这也意味着与其他方法相比，可以
更容易地建立符合GMP标准的过程，例如使用 其中必须采取额外措施以确保
最终的T细胞群不含磁珠。
的，如转导的，T细胞)被此类磁珠污染的风险或具有靶细胞(例如基因修饰的，如转导的，T
细胞)被此类磁珠污染的最小风险。在一些实施方案中，这也意味着与其他方法相比，可以
更容易地建立符合GMP标准的过程，例如使用 其中必须采取额外措施以确保
最终的T细胞群不含磁珠。
[0431] 在一些实施方案中，由于不存在固相(例如磁珠)，本发明还提供用于细胞扩增的自动闭合系统，所述自动关闭系统可以整合到已知的细胞扩增系统中，所述细胞扩增系统
例如为可获自GE Healthcare(HYPERLINK“http://en.wikipedia.org/wiki/Little_
Chalfont”\o“Little Chalfont”Little Chalfont,Buckinghamshire,United Kingdom)的
Xuri细胞扩增系统W25和WAVE生物反应器2/10系统、或可获自TerumoBCT Inc.(Lakewood,
CO,USA)的 细胞扩增系统。
例如为可获自GE Healthcare(HYPERLINK“http://en.wikipedia.org/wiki/Little_
Chalfont”\o“Little Chalfont”Little Chalfont,Buckinghamshire,United Kingdom)的
Xuri细胞扩增系统W25和WAVE生物反应器2/10系统、或可获自TerumoBCT Inc.(Lakewood,
CO,USA)的 细胞扩增系统。
[0432] 在一些实施方案中，所述关闭系统是自动化的。在一些实施方案中，与所述系统相关联的组件可以包括集成微型计算机、蠕动泵和各种阀(如夹管阀或旋塞阀)，以控制所述
系统的各个部件之间的流体流动。在一些方面，所述集成计算机控制所述仪器的所有部件
并指示所述系统以标准化顺序执行重复程序。在一些实施方案中，所述蠕动泵控制整个管
组的流速，并与夹管阀一起确保缓冲液通过所述系统的受控流动。
系统的各个部件之间的流体流动。在一些方面，所述集成计算机控制所述仪器的所有部件
并指示所述系统以标准化顺序执行重复程序。在一些实施方案中，所述蠕动泵控制整个管
组的流速，并与夹管阀一起确保缓冲液通过所述系统的受控流动。
[0433] 在一些实施方案中，实施所述方法以基于对缀合物的药剂(例如亲和标签)(如链霉亲和素结合肽)的检测来选择、分离或富集表达细胞表面缀合物的细胞。在一些方面，分
离的、富集的或选择的细胞代表已经例如通过转导用编码细胞表面缀合物和任选地共表达
的重组受体(如CAR)的核酸分子基因工程化的细胞。在一些实施方案中，所提供的方法产生
或导致含有如下细胞的细胞组合物，所述细胞富集表达细胞表面缀合物的细胞，并且因此
还富集表达重组受体的细胞。
离的、富集的或选择的细胞代表已经例如通过转导用编码细胞表面缀合物和任选地共表达
的重组受体(如CAR)的核酸分子基因工程化的细胞。在一些实施方案中，所提供的方法产生
或导致含有如下细胞的细胞组合物，所述细胞富集表达细胞表面缀合物的细胞，并且因此
还富集表达重组受体的细胞。
[0434] 在一些实施方案中，在富集的组合物中的表达细胞表面缀合物的细胞的产量，即与起始样品中同一细胞群的数量相比在群体中富集细胞的数量，是10％至100％，如20％至
80％、20％至60％、20％至40％、40％至80％、40％至60％、或60％至80％。
80％、20％至60％、20％至40％、40％至80％、40％至60％、或60％至80％。
[0435] 在一些实施方案中，在富集或分离的组合物中的表达细胞表面缀合物的细胞的百分比，即对所选择的细胞表面缀合物呈阳性的细胞与富集或分离细胞群体中的总细胞的百
分比，是至少或至少约70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％，并且通常是至少或至少约95％、96％、97％、98％、99％或更高。
分比，是至少或至少约70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％，并且通常是至少或至少约95％、96％、97％、98％、99％或更高。
[0436] V.组合物和配制品
[0437] 提供了用于给予的组合物，所述组合物包括细胞，如含有细胞表面缀合物和/或另外的重组受体(例如CAR)的工程化细胞。在一些方面，药物组合物和配制品作为单位剂型组
合物提供，所述单位剂型组合物包括用于以给定剂量或其部分给予的细胞数量。药物组合
物和配制品通常包括一种或多种任选的药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案
中，所述组合物包括至少一种另外的治疗剂。
合物提供，所述单位剂型组合物包括用于以给定剂量或其部分给予的细胞数量。药物组合
物和配制品通常包括一种或多种任选的药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案
中，所述组合物包括至少一种另外的治疗剂。
[0438] 术语“药物配制品”是指这样的制剂，其处于使得其中所含活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对给予配制品的受试者具有不可接受的毒性的另外的组分。
[0439] “药学上可接受的载体”是指药物配制品中除了活性成分以外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
[0440] 在一些方面，载体的选择部分取决于特定细胞和/或给予方法。因此，存在多种合适的制剂。例如，所述药物组合物可以含有防腐剂。合适的防腐剂可以包括例如对羟基苯甲
酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面，使用两种或更多种防腐剂
的混合物。所述防腐剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.0001％至约2％的量存
在。载体描述于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编辑(1980)。
药学上可接受的载体在所用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲
剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十
八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基对羟基
苯甲酸酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；
和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；
亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖
类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质
络合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。
酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面，使用两种或更多种防腐剂
的混合物。所述防腐剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.0001％至约2％的量存
在。载体描述于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编辑(1980)。
药学上可接受的载体在所用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲
剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十
八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基对羟基
苯甲酸酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；
和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；
亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖
类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质
络合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。
[0441] 在一些方面，在所述组合物中包括缓冲剂。合适的缓冲剂包括例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和各种其他酸和盐。在一些方面，使用两种或更多种缓冲剂的混合物。所述
缓冲剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.001％至约4％的量存在。用于制备可给
予的药物组合物的方法是已知的。示例性方法更详细地描述于例如Remington:The
Science and Practice of Pharmacy,Lippincott Williams&Wilkins；第21版(2005年5月
1日)中。
缓冲剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.001％至约4％的量存在。用于制备可给
予的药物组合物的方法是已知的。示例性方法更详细地描述于例如Remington:The
Science and Practice of Pharmacy,Lippincott Williams&Wilkins；第21版(2005年5月
1日)中。
[0442] 所述配制品或组合物还可含有可用于用细胞治疗的特定适应症、疾病或病症的多于一种活性成分，优选具有与所述细胞互补的活性的那些成分，其中各自的活性不会相互
产生不利影响。此类活性成分以有效用于既定目的量以合适的方式组合存在。因此，在一些
实施方案中，药物组合物进一步包含其他药物活性剂或药物如化学治疗剂，例如天冬酰胺
酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春碱、长春新碱等。在一些实施方案中，所述细胞或抗体以盐(例如药学
上可接受的盐)的形式给予。合适的药学上可接受的酸加成盐包括源自无机酸(如盐酸、氢
溴酸、磷酸、偏磷酸，硝酸和硫酸)和有机酸(如酒石酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸、苯甲酸、乙醇酸、葡萄糖酸、琥珀酸和芳基磺酸，例如对甲苯磺酸)的那些盐。
产生不利影响。此类活性成分以有效用于既定目的量以合适的方式组合存在。因此，在一些
实施方案中，药物组合物进一步包含其他药物活性剂或药物如化学治疗剂，例如天冬酰胺
酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春碱、长春新碱等。在一些实施方案中，所述细胞或抗体以盐(例如药学
上可接受的盐)的形式给予。合适的药学上可接受的酸加成盐包括源自无机酸(如盐酸、氢
溴酸、磷酸、偏磷酸，硝酸和硫酸)和有机酸(如酒石酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸、苯甲酸、乙醇酸、葡萄糖酸、琥珀酸和芳基磺酸，例如对甲苯磺酸)的那些盐。
[0443] 可以将活性成分包埋在微胶囊、胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或粗乳液中。在某些实施方案中，将所述药物组合物配制为包
合物(如环糊精包合物)或配制成脂质体。脂质体可以用于将所述宿主细胞(例如，T细胞或
NK细胞)靶向特定组织。许多方法可用于制备脂质体，例如在例如Szoka等人,
Ann.Rev.Biophys.Bioeng.,9:467(1980),以及美国专利4,235,871、4,501,728、4,837,028
和5,019,369中描述的那些。
合物(如环糊精包合物)或配制成脂质体。脂质体可以用于将所述宿主细胞(例如，T细胞或
NK细胞)靶向特定组织。许多方法可用于制备脂质体，例如在例如Szoka等人,
Ann.Rev.Biophys.Bioeng.,9:467(1980),以及美国专利4,235,871、4,501,728、4,837,028
和5,019,369中描述的那些。
[0444] 在一些方面，所述药物组合物可以利用定时释放、延迟释放和持续释放递送系统，使得所述组合物的递送发生在待治疗部位的致敏之前并且有足够的时间引起致敏。许多类
型的释放递送系统是可用的并且是已知的。此类系统可以避免重复给予所述组合物，从而
增加对受试者和医师的便利性。
型的释放递送系统是可用的并且是已知的。此类系统可以避免重复给予所述组合物，从而
增加对受试者和医师的便利性。
[0445] 在一些实施方案中，药物组合物包含有效治疗或预防疾病或病症的量(例如治疗有效量或预防有效量)的工程化细胞。在一些实施方案中，通过定期评估所治疗的受试者来
监测治疗或预防功效。对于数天或更长时间的重复给予，取决于病症，重复所述治疗直至出
现所需疾病症状的抑制。然而，其他剂量方案可能是有用的并且可以被确定。所需剂量可以
通过单次推注给予所述组合物、通过多次推注给予所述组合物或通过连续输注给予所述组
合物来递送。
监测治疗或预防功效。对于数天或更长时间的重复给予，取决于病症，重复所述治疗直至出
现所需疾病症状的抑制。然而，其他剂量方案可能是有用的并且可以被确定。所需剂量可以
通过单次推注给予所述组合物、通过多次推注给予所述组合物或通过连续输注给予所述组
合物来递送。
[0446] 药物组合物，例如含有工程化细胞的那些药物组合物，可以使用标准给予技术、配制品和/或设备进行给予。提供了用于储存和给予所述组合物的配制品和设备(如注射器和
小瓶)。所述工程化细胞的给予可以是自体的或异源的。例如，免疫应答细胞或祖细胞可以
获得自一名受试者，并且给予至同一受试者或不同的相容受试者。外周血衍生的免疫应答
细胞或其后代(例如，体内、离体或体外衍生的)可以经由局部注射给予，包括导管给药、全
身注射、局部注射、静脉内注射或肠胃外给药。在给予治疗性组合物(例如，含有遗传修饰的
免疫应答细胞的药物组合物)时，通常将其配制成单位剂量可注射形式(溶液、悬浮液、乳
液)。
小瓶)。所述工程化细胞的给予可以是自体的或异源的。例如，免疫应答细胞或祖细胞可以
获得自一名受试者，并且给予至同一受试者或不同的相容受试者。外周血衍生的免疫应答
细胞或其后代(例如，体内、离体或体外衍生的)可以经由局部注射给予，包括导管给药、全
身注射、局部注射、静脉内注射或肠胃外给药。在给予治疗性组合物(例如，含有遗传修饰的
免疫应答细胞的药物组合物)时，通常将其配制成单位剂量可注射形式(溶液、悬浮液、乳
液)。
[0447] 配制品包括用于口服、静脉内、腹膜内、皮下、经肺、透皮、肌内、鼻内、经颊、舌下或栓剂给予的那些。在一些实施方案中，肠胃外给予所述细胞群。如本文所用术语“肠胃外”包括静脉内、肌内、皮下、直肠、阴道和腹膜内给予。在一些实施方案中，使用通过静脉内、腹膜内或皮下注射的外周全身递送将所述细胞群给予受试者。
[0448] 在一些实施方案中，组合物作为无菌液体制剂提供，例如等渗水溶液、悬浮液、乳液、分散体或粘性组合物，其在一些方面可以缓冲至选择的pH。液体制剂一般比凝胶、其他
粘性组合物和固体组合物制备起来更容易。另外地，液体组合物稍微更方便给予，特别是通
过注射。在另一方面，粘性组合物可以配制在适当的黏度范围内，以提供与特定组织的更长
的接触时间。液体或粘性组合物可以包含载体，其可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、
盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适的混合物。
粘性组合物和固体组合物制备起来更容易。另外地，液体组合物稍微更方便给予，特别是通
过注射。在另一方面，粘性组合物可以配制在适当的黏度范围内，以提供与特定组织的更长
的接触时间。液体或粘性组合物可以包含载体，其可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、
盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适的混合物。
[0449] 无菌可注射溶液可以通过将细胞掺入溶剂中来制备，例如与合适的载体、稀释剂或赋形剂(如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等)掺合。所述组合物也可以是冻干的。所述
组合物可以含有辅助物质，如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如，甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝
或粘度增强添加剂、防腐剂、调味剂、颜料等，这取决于给予途径和所需的制剂。在一些方
面，可以参考标准文本来制备合适的制剂。
组合物可以含有辅助物质，如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如，甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝
或粘度增强添加剂、防腐剂、调味剂、颜料等，这取决于给予途径和所需的制剂。在一些方
面，可以参考标准文本来制备合适的制剂。
[0450] 可以加入各种增强组合物稳定性和无菌性的添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲液。防止微生物的作用可以通过不同的抗细菌和抗真菌剂(例如，对羟
基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸等)来确保。通过使用延迟吸收的药剂(例如单硬
脂酸铝和明胶)可以实现可注射药物形式的延长吸收。
基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸等)来确保。通过使用延迟吸收的药剂(例如单硬
脂酸铝和明胶)可以实现可注射药物形式的延长吸收。
[0452] 用于体内给予的制剂通常是无菌的。可以例如通过经无菌滤膜过滤容易地实现无菌。
[0453] VI.给予和治疗方法及相关方法
[0454] 还提供了在治疗疾病、病症和障碍(其中表达由重组受体(例如CAR)识别的抗原)中使用所述分子和组合物(例如含有工程化细胞)的方法，以及所述分子和组合物在治疗疾
病、病症和障碍(其中表达由重组受体(例如CAR)识别的抗原)中的用途。还提供了通过识别
由工程化细胞表达的细胞表面缀合物来鉴定、检测或选择所述分子和组合物(例如含有工
程化细胞)的方法和用途。在一些实施方案中，此类方法包括诊断和预后方法，以及在一些
情况下，工程化细胞的自杀或删减方法。此类方法包括监测给予的工程化细胞的方法和调
节工程化细胞的方法，例如结合过继细胞疗法。
病、病症和障碍(其中表达由重组受体(例如CAR)识别的抗原)中的用途。还提供了通过识别
由工程化细胞表达的细胞表面缀合物来鉴定、检测或选择所述分子和组合物(例如含有工
程化细胞)的方法和用途。在一些实施方案中，此类方法包括诊断和预后方法，以及在一些
情况下，工程化细胞的自杀或删减方法。此类方法包括监测给予的工程化细胞的方法和调
节工程化细胞的方法，例如结合过继细胞疗法。
[0455] 在一些实施方案中，将含有细胞表面分子和至少一种药剂的细胞表面缀合物用于检测用细胞表面缀合物转导的细胞。在一些实施方案中，所述检测是在体内或离体的。在一
些实施方案中，将细胞表面受体缀合物用于靶向工程化细胞以自杀杀伤工程化细胞。在一
些方面，杀伤被转导以表达细胞表面缀合物的细胞使用对所表达的细胞表面缀合物的细胞
表面分子具特异性的结合分子。在其他方面，提供了通过使用如下分子靶向细胞表面缀合
物的药剂来杀伤细胞的方法，所述分子包含对与细胞毒性剂(如毒素)连接的缀合物的药剂
具特异性的结合分子。
些实施方案中，将细胞表面受体缀合物用于靶向工程化细胞以自杀杀伤工程化细胞。在一
些方面，杀伤被转导以表达细胞表面缀合物的细胞使用对所表达的细胞表面缀合物的细胞
表面分子具特异性的结合分子。在其他方面，提供了通过使用如下分子靶向细胞表面缀合
物的药剂来杀伤细胞的方法，所述分子包含对与细胞毒性剂(如毒素)连接的缀合物的药剂
具特异性的结合分子。
[0456] A.过继细胞疗法方法
[0457] 提供了给予工程化细胞和组合物的方法，以及此类工程化细胞和组合物用于治疗或预防疾病、病症和障碍(包括癌症)的用途。在一些实施方案中，将工程化细胞和组合物给
予至受试者或患者，所述受试者或患者患有要例如经由过继细胞疗法(如过继T细胞疗法)
治疗的特定疾病或病症。在一些实施方案中，将所提供的细胞或组合物给予至受试者，如患
有或有风险患上所述疾病或病症的受试者。在一些方面，所述方法由此治疗疾病或病症(例
如，改善其一种或多种症状)，例如通过减轻表达由工程化T细胞识别的抗原的癌症中的肿
瘤负荷来治疗。
予至受试者或患者，所述受试者或患者患有要例如经由过继细胞疗法(如过继T细胞疗法)
治疗的特定疾病或病症。在一些实施方案中，将所提供的细胞或组合物给予至受试者，如患
有或有风险患上所述疾病或病症的受试者。在一些方面，所述方法由此治疗疾病或病症(例
如，改善其一种或多种症状)，例如通过减轻表达由工程化T细胞识别的抗原的癌症中的肿
瘤负荷来治疗。
[0458] 用于过继细胞疗法的工程化细胞的给予方法是已知的，并且可以与所提供的方法和组合物结合使用。例如，过继T细胞治疗方法描述于例如Gruenberg等人的美国专利申请
公开号2003/0170238；Rosenberg的美国专利号4,690,915；Rosenberg(2011)Nat Rev Clin
Oncol.8(10):577-85。参见例如，Themeli等人(2013)Nat Biotechnol.31(10):928-933；
Tsukahara等人(2013)Biochem Biophys Res Commun 438(1):84-9；Davila等人(2013)
PLoS ONE 8(4):e61338。
公开号2003/0170238；Rosenberg的美国专利号4,690,915；Rosenberg(2011)Nat Rev Clin
Oncol.8(10):577-85。参见例如，Themeli等人(2013)Nat Biotechnol.31(10):928-933；
Tsukahara等人(2013)Biochem Biophys Res Commun 438(1):84-9；Davila等人(2013)
PLoS ONE 8(4):e61338。
[0459] 如本文所用，“受试者”是哺乳动物，如人或其他动物，并且通常是人。在一些实施方案中，向其给予免疫调节多肽、工程化细胞或组合物的受试者(例如，患者)是哺乳动物，
通常是灵长类动物，如人。在一些实施方案中，所述灵长类动物是猴或猿。所述受试者可以
是雄性或雌性，并且可以处于任何合适的年龄，包括婴儿、幼年、青春期、成年和老年受试
者。在一些实施方案中，所述受试者是非灵长类哺乳动物，如啮齿动物。
通常是灵长类动物，如人。在一些实施方案中，所述灵长类动物是猴或猿。所述受试者可以
是雄性或雌性，并且可以处于任何合适的年龄，包括婴儿、幼年、青春期、成年和老年受试
者。在一些实施方案中，所述受试者是非灵长类哺乳动物，如啮齿动物。
[0460] 如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变体如“治疗”(“treat”或“treating”))是指疾病或病症或障碍、或者与之相关的症状、不良效果或结果或表型的完
全或部分改善或减轻。理想的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、症状的缓解、
疾病的任何直接或间接病理后果的减少、预防转移、降低疾病进展的速度、改善或缓解疾病
状态以及缓解或改善预后。所述术语并不暗示完全治愈疾病或完全消除任何症状或对所有
症状或结果的影响。
全或部分改善或减轻。理想的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、症状的缓解、
疾病的任何直接或间接病理后果的减少、预防转移、降低疾病进展的速度、改善或缓解疾病
状态以及缓解或改善预后。所述术语并不暗示完全治愈疾病或完全消除任何症状或对所有
症状或结果的影响。
[0461] 如本文所用，“延迟疾病的发展”意指推迟、阻碍、减慢、延缓、稳定、抑制和/或延期疾病(如癌症)的发展。此延迟可以具有不同的时间长度，这取决于病史和/或所治疗的个体。对于本领域技术人员显而易见的是，足够或显著的延迟实际上可以涵盖预防，因为个体
不会患上疾病。例如，可能延迟晚期癌症，如转移的发展。
不会患上疾病。例如，可能延迟晚期癌症，如转移的发展。
[0462] 如本文所用，“预防”包括提供关于受试者的疾病的发生或复发的预防，所述受试者可能易患所述疾病但尚未被诊断患有所述疾病。在一些实施方案中，所提供的细胞和组
合物用于延迟疾病的发展或延缓疾病的进展。
合物用于延迟疾病的发展或延缓疾病的进展。
[0463] 如本文所用，“抑制”功能或活性是当与除了目标条件或参数以外的原本相同的条件相比时，或者与另一种条件相比时，减少功能或活性。例如，与不存在所述细胞的情况下
的肿瘤生长速率相比，抑制肿瘤生长的细胞降低了肿瘤的生长速率。
的肿瘤生长速率相比，抑制肿瘤生长的细胞降低了肿瘤的生长速率。
[0464] 在给药的情况下，药剂(例如药物配制品、细胞或组合物)的“有效量”是指在必要的剂量/量下和必要的时间段内有效实现所需结果(例如治疗或预防结果)的量。
[0465] 药剂(例如药物配制品或工程化细胞)的“治疗有效量”是指在必要的剂量下和必要的时间段内有效实现所需治疗结果(如针对治疗疾病、病症或障碍)和/或治疗的药代动
力学或药效动力学作用的量。治疗有效量可根据诸如以下等因素而变化：疾病状态、受试者
的年龄、性别和体重、以及所给予的免疫调节多肽或工程化细胞。在一些实施方案中，所提
供的方法涉及以有效量(例如，治疗有效量)给予免疫调节多肽、工程化细胞或组合物。
力学或药效动力学作用的量。治疗有效量可根据诸如以下等因素而变化：疾病状态、受试者
的年龄、性别和体重、以及所给予的免疫调节多肽或工程化细胞。在一些实施方案中，所提
供的方法涉及以有效量(例如，治疗有效量)给予免疫调节多肽、工程化细胞或组合物。
[0466] “预防有效量”是指在必要的剂量下和必要的时间段内有效实现所需预防结果的量。通常但不是必要地，因为在疾病之前或疾病的早期阶段在受试者中使用预防剂量，所以
预防有效量将小于治疗有效量。
预防有效量将小于治疗有效量。
[0467] 所治疗的疾病或病症可以是任何疾病或病症，其中抗原的表达与疾病状况或障碍的病因学相关和/或参与其中，例如导致、加剧这种疾病、病症或障碍或以其他方式参与其
中。示例性疾病和病症可以包括与恶性肿瘤或细胞转化(例如癌症)、自身免疫性疾病或炎
性疾病或例如由细菌、病毒或其他病原体引起的感染性疾病相关的疾病或病症。上文描述
了示例性抗原，其包括与可以治疗的各种疾病和病症相关的抗原。在具体实施方案中，免疫
调节多肽和/或重组受体(例如嵌合抗原受体或转基因TCR)特异性结合与所述疾病或病症
相关的抗原。
中。示例性疾病和病症可以包括与恶性肿瘤或细胞转化(例如癌症)、自身免疫性疾病或炎
性疾病或例如由细菌、病毒或其他病原体引起的感染性疾病相关的疾病或病症。上文描述
了示例性抗原，其包括与可以治疗的各种疾病和病症相关的抗原。在具体实施方案中，免疫
调节多肽和/或重组受体(例如嵌合抗原受体或转基因TCR)特异性结合与所述疾病或病症
相关的抗原。
[0468] 在一些实施方案中，疾病或病症是肿瘤，如实体瘤、淋巴瘤、白血病、血液肿瘤、转移性肿瘤或其他癌症或肿瘤类型。
[0469] 在一些实施方案中，疾病或病症是感染性疾病或病症，例如但不限于病毒、逆转录病毒、细菌和原生动物感染、免疫缺陷、巨细胞病毒(CMV)、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr
virus，EBV)、腺病毒、BK多瘤病毒。在一些实施方案中，所述疾病或病症是自身免疫性或炎
性疾病或病症，如关节炎(例如类风湿性关节炎(RA))、I型糖尿病、系统性红斑狼疮(SLE)、
炎性肠病、银屑病、硬皮病、自身免疫性甲状腺疾病、格雷夫斯病、克罗恩病、多发性硬化症、哮喘和/或与移植相关的疾病或病症。
virus，EBV)、腺病毒、BK多瘤病毒。在一些实施方案中，所述疾病或病症是自身免疫性或炎
性疾病或病症，如关节炎(例如类风湿性关节炎(RA))、I型糖尿病、系统性红斑狼疮(SLE)、
炎性肠病、银屑病、硬皮病、自身免疫性甲状腺疾病、格雷夫斯病、克罗恩病、多发性硬化症、哮喘和/或与移植相关的疾病或病症。
[0470] 在一些实施方案中，与疾病或障碍相关的抗原选自αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周
期蛋白A2、CC基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、表皮生长因子蛋白(EGFR)、截短的表皮生长因子蛋白(tEGFR)、III型表皮生长因子受体突变(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮
糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样5(FCRL5；
也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸
受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、G蛋白偶
联受体5D(GPCR5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、
erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原
A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Ra)、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、
激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮
氨酸重复序列的8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、
MAGE-A6、间皮素、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、天然杀伤组2成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表
达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜
抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG也称为
5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体
2(VEGFR2)、Wilms肿瘤1(WT-1)、病原体特异性抗原或与通用标签相关的抗原、和/或生物素
化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。在一些实施方案中，受体靶向的抗
原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知B细胞标记中的任何一种。在一些实施方
案中，所述抗原是或包括CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。
期蛋白A2、CC基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、表皮生长因子蛋白(EGFR)、截短的表皮生长因子蛋白(tEGFR)、III型表皮生长因子受体突变(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮
糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样5(FCRL5；
也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸
受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、G蛋白偶
联受体5D(GPCR5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、
erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原
A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Ra)、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、
激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮
氨酸重复序列的8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、
MAGE-A6、间皮素、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、天然杀伤组2成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表
达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜
抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG也称为
5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体
2(VEGFR2)、Wilms肿瘤1(WT-1)、病原体特异性抗原或与通用标签相关的抗原、和/或生物素
化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。在一些实施方案中，受体靶向的抗
原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知B细胞标记中的任何一种。在一些实施方
案中，所述抗原是或包括CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。
[0471] 在一些实施方案中，抗原是或包括病原体特异性抗原或病原体表达的抗原。在一些实施方案中，抗原是病毒抗原(例如来自HIV、HCV、HBV等的病毒抗原)、细菌抗原和/或寄
生虫抗原。
生虫抗原。
[0472] 在一些实施方案中，与疾病或障碍相关的抗原选自孤儿酪氨酸激酶受体RORl、tEGFR、HER2、Ll-CAM、CD19、CD20、CD22、间皮素、CEA、和乙型肝炎表面抗原、抗叶酸受体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP-2、EGP-4、0EPHa2、ErbB2、3或4、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、kdr、κ轻链、路易斯Y、L1细胞粘附分子、MAGE-A1、间皮素、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2D配体、NY-ESO-1、MART-1、gp100、癌胚胎抗原、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原、PSMA、HER2/neu、雌激素受体、孕酮受体、肝配蛋白B2、CD123、CS-1、c-Met、GD-2和MAGE A3、CE7、Wilms肿瘤1(WT-1)、细胞周期蛋白(如细胞周期蛋白A1(CCNA1))和/或生物素化分子，和/或由HIV、HCV、HBV表达的分子或其
他病原体。
他病原体。
[0473] 所提供的方法和用途包括用于过继细胞疗法的方法和用途。在一些实施方案中，所述方法包括将所述细胞或含有所述细胞的组合物给予至受试者、组织或细胞，如患有、有
风险患上或怀疑患有所述疾病、病症或障碍的受试者、组织或细胞。在一些实施方案中，将
所述细胞、群体和组合物给予至患有有待例如经由过继细胞疗法如过继T细胞疗法治疗的
特定疾病或病症的受试者。在一些实施方案中，将所述细胞或组合物给予至所述受试者，如
患有或有风险患上所述疾病或病症的受试者，改善所述疾病或病症的一个或多个症状。
风险患上或怀疑患有所述疾病、病症或障碍的受试者、组织或细胞。在一些实施方案中，将
所述细胞、群体和组合物给予至患有有待例如经由过继细胞疗法如过继T细胞疗法治疗的
特定疾病或病症的受试者。在一些实施方案中，将所述细胞或组合物给予至所述受试者，如
患有或有风险患上所述疾病或病症的受试者，改善所述疾病或病症的一个或多个症状。
[0474] 在一些实施方案中，细胞疗法(例如，过继T细胞疗法)通过自体转移进行，其中从接受细胞疗法的受试者或从来源于这种受试者的样品中分离和/或以其他方式制备细胞。
因此，在一些方面，所述细胞来源于需要治疗的受试者(例如，患者)，并且在分离和加工后
将所述细胞给予同一受试者。
因此，在一些方面，所述细胞来源于需要治疗的受试者(例如，患者)，并且在分离和加工后
将所述细胞给予同一受试者。
[0475] 在一些实施方案中，细胞疗法(例如，过继T细胞疗法)通过同种异体转移进行，其中从将要接受或最终接受细胞疗法的受试者以外的受试者(例如，第一受试者)分离和/或
以其他方式制备细胞。在此类实施方案中，然后将所述细胞给予至相同物种的不同受试者，
例如第二受试者。在一些实施方案中，所述第一和第二受试者在遗传上是相同的。在一些实
施方案中，所述第一和第二受试者在遗传上是相似的。在一些实施方案中，所述第二受试者
与所述第一受试者表达相同的HLA类别或超类型。细胞可以通过任何合适的方式给予。给药
和给予可以部分取决于给予是短暂的还是长期的。各种给药方案包括但不限于在不同时间
点的单次或多次给予、推注给予和脉冲输注。
以其他方式制备细胞。在此类实施方案中，然后将所述细胞给予至相同物种的不同受试者，
例如第二受试者。在一些实施方案中，所述第一和第二受试者在遗传上是相同的。在一些实
施方案中，所述第一和第二受试者在遗传上是相似的。在一些实施方案中，所述第二受试者
与所述第一受试者表达相同的HLA类别或超类型。细胞可以通过任何合适的方式给予。给药
和给予可以部分取决于给予是短暂的还是长期的。各种给药方案包括但不限于在不同时间
点的单次或多次给予、推注给予和脉冲输注。
[0476] 在某些实施方案中，所述细胞或单独的细胞亚型群体以约100万至约1000亿个细胞和/或按每公斤体重所述细胞量的范围给予受试者，例如，100万至约500亿个细胞(例如，
约500万个细胞、约2500万个细胞、约5亿个细胞、约10亿个细胞、约50亿个细胞、约200亿个
细胞、约300亿个细胞、约400亿个细胞或由任两个前述值定义的范围)，如约1000万至约
1000亿个细胞(例如，约2000万个细胞、约3000万个细胞、约4000万个细胞、约6000万个细
胞、约7000万个细胞、约8000万个细胞、约9000万个细胞、约100亿个细胞、约250亿个细胞、
约500亿个细胞、约750亿个细胞、约900亿个细胞或由任两个前述值定义的范围)，并且在一
些情况下约1亿个细胞至约500亿个细胞(例如，约1.2亿个细胞、约2.5亿个细胞、约3.5亿个
细胞、约4.5亿个细胞、约6.5亿个细胞、约8亿个细胞、约9亿个细胞、约30亿个细胞、约300亿个细胞、约450亿个细胞)或在这些范围和/或每公斤体重的范围之间的任何值。剂量可以根
据疾病或障碍和/或患者和/或其他治疗特有的属性而变化。
约500万个细胞、约2500万个细胞、约5亿个细胞、约10亿个细胞、约50亿个细胞、约200亿个
细胞、约300亿个细胞、约400亿个细胞或由任两个前述值定义的范围)，如约1000万至约
1000亿个细胞(例如，约2000万个细胞、约3000万个细胞、约4000万个细胞、约6000万个细
胞、约7000万个细胞、约8000万个细胞、约9000万个细胞、约100亿个细胞、约250亿个细胞、
约500亿个细胞、约750亿个细胞、约900亿个细胞或由任两个前述值定义的范围)，并且在一
些情况下约1亿个细胞至约500亿个细胞(例如，约1.2亿个细胞、约2.5亿个细胞、约3.5亿个
细胞、约4.5亿个细胞、约6.5亿个细胞、约8亿个细胞、约9亿个细胞、约30亿个细胞、约300亿个细胞、约450亿个细胞)或在这些范围和/或每公斤体重的范围之间的任何值。剂量可以根
据疾病或障碍和/或患者和/或其他治疗特有的属性而变化。
[0477] 例如，在一些实施方案中，如果受试者是人，那么剂量包括少于约5 x 108个总重组受体(例如CAR)表达细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)，例如，在约1 x 106到5 x 108
个此类细胞的范围内，例如2 x 106、5 x 106、1 x 107、5 x 107、1 x 108或5 x 108个或全部此类细胞，或任两个前述值之间的范围。
个此类细胞的范围内，例如2 x 106、5 x 106、1 x 107、5 x 107、1 x 108或5 x 108个或全部此类细胞，或任两个前述值之间的范围。
[0478] 在一些实施方案中，细胞疗法包括给予一定剂量，所述剂量包含以下细胞数量：为或为约1 x 105至1 x 108个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单核细胞(PBMC)，为
或为约5 x 105至1 x 107个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单核细胞(PBMC)，或
者为或为约1 x 106至1 x 107个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单核细胞
(PBMC)，每个都包含端值。在一些实施方案中，细胞疗法包括给予一定剂量的细胞，所述剂
量包含以下细胞数量：至少或至少约1 x 105个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血
单核细胞(PBMC)，如至少或至少1 x 106、至少或至少约1 x 107、至少或至少约1 x 108个此
类细胞。在一些实施方案中，所述数量是关于CD3+或CD8+的总数，在一些情况下也是关于重
组受体表达(例如CAR+)细胞。在一些实施方案中，细胞疗法包括给予一定剂量，所述剂量包
含以下细胞数量：为或为约1 x 105至1 x 108个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+重组受体
表达细胞、为或为约5 x 105至1 x 107个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+重组受体表达细
胞、或者为或为约1 x 106至1 x 107个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+重组受体表达细
胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，细胞疗法包含给予一定剂量，所述剂量包含以下
细胞数量：从或从约1 x 105至5 x 108个总CD3+/CAR+或CD8+/CAR+细胞、从或从约5 x 105
至1 x 107个总CD3+/CAR+或CD8+/CAR+细胞、或者从或从约1 x 106至1 x 107个总CD3+/CAR
+或CD8+/CAR+细胞，每个都包含端值。
或为约5 x 105至1 x 107个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单核细胞(PBMC)，或
者为或为约1 x 106至1 x 107个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单核细胞
(PBMC)，每个都包含端值。在一些实施方案中，细胞疗法包括给予一定剂量的细胞，所述剂
量包含以下细胞数量：至少或至少约1 x 105个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血
单核细胞(PBMC)，如至少或至少1 x 106、至少或至少约1 x 107、至少或至少约1 x 108个此
类细胞。在一些实施方案中，所述数量是关于CD3+或CD8+的总数，在一些情况下也是关于重
组受体表达(例如CAR+)细胞。在一些实施方案中，细胞疗法包括给予一定剂量，所述剂量包
含以下细胞数量：为或为约1 x 105至1 x 108个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+重组受体
表达细胞、为或为约5 x 105至1 x 107个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+重组受体表达细
胞、或者为或为约1 x 106至1 x 107个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+重组受体表达细
胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，细胞疗法包含给予一定剂量，所述剂量包含以下
细胞数量：从或从约1 x 105至5 x 108个总CD3+/CAR+或CD8+/CAR+细胞、从或从约5 x 105
至1 x 107个总CD3+/CAR+或CD8+/CAR+细胞、或者从或从约1 x 106至1 x 107个总CD3+/CAR
+或CD8+/CAR+细胞，每个都包含端值。
[0479] 在一些实施方案中，剂量的T细胞包括CD4+T细胞、CD8+T细胞或CD4+和CD8+T细胞。
[0480] 在一些实施方案中，例如，如果受试者是人，那么所述剂量的CD8+T细胞(包括在剂6 8
量中包括CD4+和CD8+T细胞)包括在约1 x 10 与5 x 10个之间的总重组受体(例如CAR)表
达CD8+细胞，例如，在约5 x 106至1 x 108个此类细胞的范围内，例如1 x 107、2.5 x 107、5 x 107、7.5 x 107、1 x 108或5 x 108个总此类细胞，或在任两个前述值之间的范围。在一些
实施方案中，给予患者多个剂量，并且每个剂量或总剂量可以在任何前述值内。在一些实施
7 8
方案中，细胞剂量包括给予从或从约1 x 10至0.75 x 10个表达重组受体的总CD8+T细胞、
1 x 107至2.5 x 107个表达重组受体的总CD8+T细胞、从或从约1 x 107至0.75 x 108个表
达重组受体的总CD8+T细胞(每个都包含端值)。在一些实施方案中，细胞的剂量包含给予或
给予约1 x 107、2.5 x 107、5 x 107、7.5 x 107、1 x 108或5 x 108个总重组受体表达CD8+T细胞。
量中包括CD4+和CD8+T细胞)包括在约1 x 10 与5 x 10个之间的总重组受体(例如CAR)表
达CD8+细胞，例如，在约5 x 106至1 x 108个此类细胞的范围内，例如1 x 107、2.5 x 107、5 x 107、7.5 x 107、1 x 108或5 x 108个总此类细胞，或在任两个前述值之间的范围。在一些
实施方案中，给予患者多个剂量，并且每个剂量或总剂量可以在任何前述值内。在一些实施
7 8
方案中，细胞剂量包括给予从或从约1 x 10至0.75 x 10个表达重组受体的总CD8+T细胞、
1 x 107至2.5 x 107个表达重组受体的总CD8+T细胞、从或从约1 x 107至0.75 x 108个表
达重组受体的总CD8+T细胞(每个都包含端值)。在一些实施方案中，细胞的剂量包含给予或
给予约1 x 107、2.5 x 107、5 x 107、7.5 x 107、1 x 108或5 x 108个总重组受体表达CD8+T细胞。
[0481] 在一些实施方案中，细胞(例如，表达重组受体的T细胞)的剂量作为单一剂量给予受试者，或者在两周、一个月、三个月、六个月、1年或更长的时间段内仅给予一次。
[0482] 在一些实施方案中，所述细胞作为组合治疗的一部分给予，如与另一种治疗性干预如抗体或工程化细胞或受体或其他药剂(如细胞毒性剂或治疗剂)同时给予或以任何顺
序依次给予。在一些实施方案中，所述细胞与一种或多种另外的治疗剂共同给予或与另一
种治疗性干预联合给予(同时或以任何顺序依次给予)。在一些情境下，将所述细胞与另一
种疗法在时间上足够接近地共同给予，使得所述细胞群增强一种或多种另外的治疗剂的效
果，或反之亦然。在一些实施方案中，所述细胞在一种或多种另外的治疗剂之前给予。在一
些实施方案中，所述细胞在一种或多种另外的治疗剂之后给予。在一些实施方案中，一种或
多种另外的药剂包括细胞因子(例如IL-2)以例如增强持久性。在一些实施方案中，所述方
法包括给予化学治疗剂。
序依次给予。在一些实施方案中，所述细胞与一种或多种另外的治疗剂共同给予或与另一
种治疗性干预联合给予(同时或以任何顺序依次给予)。在一些情境下，将所述细胞与另一
种疗法在时间上足够接近地共同给予，使得所述细胞群增强一种或多种另外的治疗剂的效
果，或反之亦然。在一些实施方案中，所述细胞在一种或多种另外的治疗剂之前给予。在一
些实施方案中，所述细胞在一种或多种另外的治疗剂之后给予。在一些实施方案中，一种或
多种另外的药剂包括细胞因子(例如IL-2)以例如增强持久性。在一些实施方案中，所述方
法包括给予化学治疗剂。
[0483] 在一些实施方案中，在给予细胞后，例如通过许多已知方法中的任一种测量工程化细胞群的生物学活性。待评估的参数包括工程化或天然T细胞或其他免疫细胞与抗原的
特异性结合，其在体内例如通过成像进行评估，或离体例如通过ELISA或流式细胞术进行评
估。在某些实施方案中，可以使用本领域已知的任何合适的方法(如描述于例如
Kochenderfer等人,J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009)和Herman等人
J.Immunological Methods,285(1):25-40(2004)中的细胞毒性测定)测量工程化细胞破坏
靶细胞的能力。在一些实施方案中，通过测定一种或多种细胞因子(例如CD107a、IFNγ、IL-
2和TNF)的表达和/或分泌来测量细胞的生物学活性。在一些方面，通过评估临床结果(如肿
瘤负荷或负担的减少)来测量生物活性。
特异性结合，其在体内例如通过成像进行评估，或离体例如通过ELISA或流式细胞术进行评
估。在某些实施方案中，可以使用本领域已知的任何合适的方法(如描述于例如
Kochenderfer等人,J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009)和Herman等人
J.Immunological Methods,285(1):25-40(2004)中的细胞毒性测定)测量工程化细胞破坏
靶细胞的能力。在一些实施方案中，通过测定一种或多种细胞因子(例如CD107a、IFNγ、IL-
2和TNF)的表达和/或分泌来测量细胞的生物学活性。在一些方面，通过评估临床结果(如肿
瘤负荷或负担的减少)来测量生物活性。
[0484] 在一些实施方案中，将工程化细胞以任何数量的方式进一步修饰，从而增加其治疗或预防功效。例如，可以将所述群体表达的工程化重组受体(如CAR或TCR)直接或通过接
头间接缀合至靶向部分。将化合物(例如，CAR或TCR)与靶向部分缀合的实践在本领域是已
知的。参见例如，Wadwa等人,J.Drug Targeting 3:1 1 1(1995)和美国专利5,087,616。
头间接缀合至靶向部分。将化合物(例如，CAR或TCR)与靶向部分缀合的实践在本领域是已
知的。参见例如，Wadwa等人,J.Drug Targeting 3:1 1 1(1995)和美国专利5,087,616。
[0485] B.检测和监测
[0486] 在一些实施方案中，提供了用于监测(例如检测或鉴定)给予至受试者的细胞的方法，例如用于确定或评估受试者中此类细胞的存在、数量或位置的方法。在一些实施方案
中，从来自受试者的样品离体进行检测。在一些实施方案中，检测在体内进行。
中，从来自受试者的样品离体进行检测。在一些实施方案中，检测在体内进行。
[0487] 在一些实施方案中，监测方法是离体进行的，并且包括通过使含有表达或可能表达细胞表面缀合物的细胞的组合物与能够识别细胞表面缀合物的药剂的结合分子接触来
检测表达细胞表面缀合物的细胞。在一些方面，从受试者获得样品并将所述样品与结合所
述缀合物的药剂的结合分子(如抗体或非抗体试剂，包括所描述的任何一种)接触。例如，生
物样品包括但不限于体液(如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿液和汗液)、组织和器官样
品，包括由其衍生的加工样品。
检测表达细胞表面缀合物的细胞。在一些方面，从受试者获得样品并将所述样品与结合所
述缀合物的药剂的结合分子(如抗体或非抗体试剂，包括所描述的任何一种)接触。例如，生
物样品包括但不限于体液(如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿液和汗液)、组织和器官样
品，包括由其衍生的加工样品。
[0488] 在一些实施方案中，可以使用如上所述的任何方法来检测或鉴定从受试者的样品获得的表达细胞表面缀合物的细胞。在某些实施方案中，可以通过使用与药剂特异性结合
的抗体或通过使用非抗体试剂(例如，与Strep- 结合的Strep- )离体检测或
跟踪表达所述缀合物的重组细胞。在一些实施方案中，所述药剂是链霉亲和素结合肽，如
Strep-标签，包括如所描述的Strep- II或双-Strep-标签。在一些实施方案中，识别
所述药剂的结合分子是能够可逆地结合所述药剂的试剂，如链霉亲和素突变蛋白，包括
Strep-Tactin或特异性结合所述药剂的其他链霉亲和素突变蛋白。在一些实施方案中，识
别所述药剂的结合分子是抗体，如抗Strep-标签抗体。
的抗体或通过使用非抗体试剂(例如，与Strep- 结合的Strep- )离体检测或
跟踪表达所述缀合物的重组细胞。在一些实施方案中，所述药剂是链霉亲和素结合肽，如
Strep-标签，包括如所描述的Strep- II或双-Strep-标签。在一些实施方案中，识别
所述药剂的结合分子是能够可逆地结合所述药剂的试剂，如链霉亲和素突变蛋白，包括
Strep-Tactin或特异性结合所述药剂的其他链霉亲和素突变蛋白。在一些实施方案中，识
别所述药剂的结合分子是抗体，如抗Strep-标签抗体。
[0489] 在一些方面，检测表达细胞表面缀合物的细胞之后是分离或选择与结合分子结合的细胞的步骤。在一些实施方案中，可以进一步对细胞分析或评估一种或多种特性或活性，
如细胞表面表型(基于细胞表面标记(例如激活标记)的表达)、重组受体(例如CAR)的表
达)；或一种或多种抗原特异性活性，包括细胞毒性活性、分泌细胞因子的能力或增殖能力。
如细胞表面表型(基于细胞表面标记(例如激活标记)的表达)、重组受体(例如CAR)的表
达)；或一种或多种抗原特异性活性，包括细胞毒性活性、分泌细胞因子的能力或增殖能力。
[0490] 在一些实施方案中，通过向受试者给予特异性结合所述缀合物的药剂的结合分子，在体内执行监测方法。在一些实施方案中，给予至受试者的结合分子是识别所述药剂
(如本文描述的任何一种)的一种结合分子。在一些实施方案中，所述药剂是链霉亲和素结
合肽，如Strep-标签，包括如所描述的Strep- II或双-Strep-标签。在一些实施方案
中，结合分子是能够可逆地结合所述药剂的非抗体剂，如链霉亲和素突变蛋白，包括Strep-
Tactin或特异性结合所述药剂的其他链霉亲和素突变蛋白。在一些实施方案中，识别所述
药剂的结合分子是抗体，如抗Strep-标签抗体。在一些实施方案中，细胞(如表达缀合物并
因此重组受体的细胞)的成像，实时地揭示转导细胞在体内的位置。
(如本文描述的任何一种)的一种结合分子。在一些实施方案中，所述药剂是链霉亲和素结
合肽，如Strep-标签，包括如所描述的Strep- II或双-Strep-标签。在一些实施方案
中，结合分子是能够可逆地结合所述药剂的非抗体剂，如链霉亲和素突变蛋白，包括Strep-
Tactin或特异性结合所述药剂的其他链霉亲和素突变蛋白。在一些实施方案中，识别所述
药剂的结合分子是抗体，如抗Strep-标签抗体。在一些实施方案中，细胞(如表达缀合物并
因此重组受体的细胞)的成像，实时地揭示转导细胞在体内的位置。
[0491] 在此类方法的方面，给予至受试者的结合分子是可溶性的。在实施方案中，结合分子是抗体或是抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含完整抗体的一部分，所述部分
结合完整抗体结合的药剂(例如Strep-标签)。在其他实施方案中，结合分子是能够与所述
缀合物的药剂结合的非抗体试剂。
结合完整抗体结合的药剂(例如Strep-标签)。在其他实施方案中，结合分子是能够与所述
缀合物的药剂结合的非抗体试剂。
[0492] 在非抗体试剂(如链霉亲和素突变蛋白，包括Strep-Tactin或其他链霉亲和素突变蛋白)的情况下，结合分子不与固体支撑物结合，即它以可溶形式存在或是可溶性的。原
则上，可以使用与在被固定在支撑物(如固体支撑物或固定相，如上面所述)上的试剂的情
况相同的试剂。例如，可以使用上面描述的任何示例性试剂而不将这种试剂固定或附接到
支撑物上，例如，不附着固体支撑物或固定相。在一些情况下，试剂是单个分子的寡聚物或
聚合物、或构成单个分子的亚基的复合物的寡聚物或聚合物(例如二聚体、三聚体或四聚体
蛋白质的寡聚物或聚合物)。在一些实施方案中，试剂可以是例如链霉亲和素突变蛋白寡聚
物、钙调蛋白寡聚物、提供至少两个螯合基团K的化合物(寡聚物)，其中所述至少两个螯合
基团能够结合过渡金属离子，从而使得所述试剂能够结合寡聚组氨酸亲和标签、多聚体谷
胱甘肽-S-转移酶、或生物素化的载体蛋白。
则上，可以使用与在被固定在支撑物(如固体支撑物或固定相，如上面所述)上的试剂的情
况相同的试剂。例如，可以使用上面描述的任何示例性试剂而不将这种试剂固定或附接到
支撑物上，例如，不附着固体支撑物或固定相。在一些情况下，试剂是单个分子的寡聚物或
聚合物、或构成单个分子的亚基的复合物的寡聚物或聚合物(例如二聚体、三聚体或四聚体
蛋白质的寡聚物或聚合物)。在一些实施方案中，试剂可以是例如链霉亲和素突变蛋白寡聚
物、钙调蛋白寡聚物、提供至少两个螯合基团K的化合物(寡聚物)，其中所述至少两个螯合
基团能够结合过渡金属离子，从而使得所述试剂能够结合寡聚组氨酸亲和标签、多聚体谷
胱甘肽-S-转移酶、或生物素化的载体蛋白。
[0493] 在一些实施方案中，结合分子如非抗体试剂(例如链霉亲和素或突变蛋白，如四聚体链霉亲和素突变蛋白)的特征在于不存在与所述试剂附接的固体支撑物(表面)。例如，在
一些实施方案中，试剂不包含或不(直接或间接地)附着于颗粒、珠、纳米颗粒、微球体或其
他固体支撑物上。在一些实施方案中，试剂不是刚性的、非柔性的或坚硬的，或者不包含或
不附接到刚性的、非柔性的或坚硬的表面上。在一些实施方案中，试剂是柔性的或基本上柔
性的。在一些情况下，试剂能够调节或适应细胞表面的形式。在一些实施方案中，试剂不具
有或不包含球形或基本上球形的形状。
一些实施方案中，试剂不包含或不(直接或间接地)附着于颗粒、珠、纳米颗粒、微球体或其
他固体支撑物上。在一些实施方案中，试剂不是刚性的、非柔性的或坚硬的，或者不包含或
不附接到刚性的、非柔性的或坚硬的表面上。在一些实施方案中，试剂是柔性的或基本上柔
性的。在一些情况下，试剂能够调节或适应细胞表面的形式。在一些实施方案中，试剂不具
有或不包含球形或基本上球形的形状。
[0494] 在一些实施方案中，基本上全部，即超过80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的结合分子如非抗体试剂(例如链霉亲和素或突变蛋
白，如四聚体链霉亲和素突变蛋白)由有机材料构成或含有有机材料。例如，在一些实施方
案中，超过80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的试剂是脂质、碳水化合物、蛋白质、肽或其混合物、由它们构成或含有它们。在一些实施方案
中，结合分子如非抗体试剂(例如链霉亲和素或突变蛋白，如四聚体链霉亲和素突变蛋白)
基本上不由无机材料、无机芯(例如金属，例如铁)、合成或无机聚合物(如苯乙烯聚合物，例
如聚苯乙烯)、乳胶、二氧化硅或磁芯构成，或基本上不含有它们。例如，在一些实施方案中，试剂的无机材料的相对百分比或作为试剂的一部分包含的相对百分比为小于20％、15％、
10％、5％或更少。
白，如四聚体链霉亲和素突变蛋白)由有机材料构成或含有有机材料。例如，在一些实施方
案中，超过80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的试剂是脂质、碳水化合物、蛋白质、肽或其混合物、由它们构成或含有它们。在一些实施方案
中，结合分子如非抗体试剂(例如链霉亲和素或突变蛋白，如四聚体链霉亲和素突变蛋白)
基本上不由无机材料、无机芯(例如金属，例如铁)、合成或无机聚合物(如苯乙烯聚合物，例
如聚苯乙烯)、乳胶、二氧化硅或磁芯构成，或基本上不含有它们。例如，在一些实施方案中，试剂的无机材料的相对百分比或作为试剂的一部分包含的相对百分比为小于20％、15％、
10％、5％或更少。
[0495] 在一些实施方案中，结合分子((例如链霉亲和素或突变蛋白，如四聚体链霉亲和素突变蛋白)如非抗体试剂)的总体积的大部分(即超过50％)如超过的60％、70％、80％、
90％、95％、99％或更多在水性溶液中由包含所述试剂的单个蛋白质分子(如单个分子或构
成单个分子的亚基的复合物的寡聚物或聚合物(例如四聚体分子))组成。在一些实施方案
中，可溶性试剂的总密度为小于1.2g/cm3、1.1g/cm3、1.0g/cm3或更小。
90％、95％、99％或更多在水性溶液中由包含所述试剂的单个蛋白质分子(如单个分子或构
成单个分子的亚基的复合物的寡聚物或聚合物(例如四聚体分子))组成。在一些实施方案
中，可溶性试剂的总密度为小于1.2g/cm3、1.1g/cm3、1.0g/cm3或更小。
[0496] 在一些实施方案中，可溶性试剂(例如，没有附接到支撑物或固体支撑物上(例如没有附接到珠上))具有相对小的尺寸，如通常小于或约小于20nM的尺寸、如小于或约小于
15nM、小于或约小于10nM、小于或约小于5nM或更小。
15nM、小于或约小于10nM、小于或约小于5nM或更小。
[0497] 在一些实施方案中，可溶性试剂(例如，没有附接到支撑物或固体支撑物上(例如没有附接到珠上))是生物学上惰性的，即它对活细胞无毒。在一些实施方案中，试剂可以是
生物可降解的，例如，它可以通过酶促活性降解或被吞噬细胞清除。
生物可降解的，例如，它可以通过酶促活性降解或被吞噬细胞清除。
[0498] 在一些实施方案中，使结合分子(如非抗体试剂(例如链霉亲和素突变蛋白或其寡聚物))与载体(如有机载体)反应是有可能的。在一些方面，除了与多糖的反应之外，还可以
使用生理学上或药学上可接受的蛋白质如血清白蛋白(例如人血清白蛋白(HSA)或牛血清
白蛋白(BSA))作为载体蛋白。在这样的情况下，试剂如链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白
(作为单独的四聚体或还以寡聚物的形式)可以经由非共价相互作用与载体蛋白偶联。在一
些此类实施方案中，生物素化的BSA(其可从多个供应商商购获得，例如ThermoFisher
Scientific、Sigma Aldrich或Vectorlabs，仅举几例)可以与试剂(例如链霉亲和素突变蛋
白)反应。在一些方面，一些药剂寡聚物(例如链霉亲和素寡聚物)可以经由一个或多个结合
位点Z与生物素化的载体蛋白非共价结合，使得寡聚物的大部分结合位点Z可用于结合药剂
(例如，受体结合剂或选择剂)和如本文描述的任何其他药剂。因此，通过这样的方法，可以
制备具有多个结合位点Z的可溶性试剂。
使用生理学上或药学上可接受的蛋白质如血清白蛋白(例如人血清白蛋白(HSA)或牛血清
白蛋白(BSA))作为载体蛋白。在这样的情况下，试剂如链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白
(作为单独的四聚体或还以寡聚物的形式)可以经由非共价相互作用与载体蛋白偶联。在一
些此类实施方案中，生物素化的BSA(其可从多个供应商商购获得，例如ThermoFisher
Scientific、Sigma Aldrich或Vectorlabs，仅举几例)可以与试剂(例如链霉亲和素突变蛋
白)反应。在一些方面，一些药剂寡聚物(例如链霉亲和素寡聚物)可以经由一个或多个结合
位点Z与生物素化的载体蛋白非共价结合，使得寡聚物的大部分结合位点Z可用于结合药剂
(例如，受体结合剂或选择剂)和如本文描述的任何其他药剂。因此，通过这样的方法，可以
制备具有多个结合位点Z的可溶性试剂。
[0499] 在其他实施方案中，试剂如链霉亲和素突变蛋白(作为单独的四聚体或还以寡聚物的形式)可以与合成的载体(如聚乙二醇(PEG)分子)共价偶联。例如，任何合适的PEG分子
都可以用于此目的，并且所述PEG分子和相应的试剂可以是可溶性的。通常，高达1000Da分
子量的PEG分子可溶于水或可以用于本发明方法的培养基中。在一些情况下，这种基于PEG
的试剂可以使用可商购获得的激活PEG分子(例如，可从NOF North America Corporation,
Irvine,California,USA获得的PEG-NHS衍生物，或可从Creative PEGWorks,Chapel
Hills,North Carolina,USA获得的激活的PEG衍生物)与链霉亲和素突变蛋白的氨基基团
来制备。
都可以用于此目的，并且所述PEG分子和相应的试剂可以是可溶性的。通常，高达1000Da分
子量的PEG分子可溶于水或可以用于本发明方法的培养基中。在一些情况下，这种基于PEG
的试剂可以使用可商购获得的激活PEG分子(例如，可从NOF North America Corporation,
Irvine,California,USA获得的PEG-NHS衍生物，或可从Creative PEGWorks,Chapel
Hills,North Carolina,USA获得的激活的PEG衍生物)与链霉亲和素突变蛋白的氨基基团
来制备。
[0500] 在一些方面，使用结合分子(例如与提供信号或诱导在体内可检测的信号的部分缀合的抗体或非抗体试剂(例如链霉亲和素或突变蛋白，如四聚体链霉亲和素突变蛋白))
进行体内检测。在一些实施方案中，结合分子与成像模式缀合。在一些方面，成像模式包括
但不限于用于通过X射线、CT扫描、MRI扫描、PET扫描、超声波、流式细胞术、近红外成像系统或其他成像模式检测的荧光化合物、放射性同位素、生物发光化合物、化学发光化合物、金
属螯合物、酶、氧化铁纳米颗粒、或本领域已知的其他成像剂(参见例如，Yu等人,
Theranostics 2:3,2012)。
进行体内检测。在一些实施方案中，结合分子与成像模式缀合。在一些方面，成像模式包括
但不限于用于通过X射线、CT扫描、MRI扫描、PET扫描、超声波、流式细胞术、近红外成像系统或其他成像模式检测的荧光化合物、放射性同位素、生物发光化合物、化学发光化合物、金
属螯合物、酶、氧化铁纳米颗粒、或本领域已知的其他成像剂(参见例如，Yu等人,
Theranostics 2:3,2012)。
[0501] 在一些实施方案中，试剂用可检测标记来进行标记，所述可检测标记例如为生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合物、酶、氧化铁纳米颗粒、纳米颗粒、荧光化合物、荧光标记和酶。可检测标记/标签的例子包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材
料和放射性材料。合适的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰
胆碱酯酶。合适的辅基复合物的例子包括链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素。合
适的荧光材料的例子包括伞形酮、荧光素、荧光素异硫氰酸盐、罗丹明、二氯三嗪基氨基荧
光素、丹磺酰氯或藻红蛋白。发光材料的例子包括鲁米诺。生物发光材料的例子包括萤光素
酶、萤光素和水母发光蛋白。在本文描述的诊断方法的某些实施方案中，可检测部分是放射
性核素。在某些实施方案，放射性核素选自47Sc、64Cu、67Cu、89Sr、86Y、87Y、90Y、105Rh、108Ag、
111In、117mSn、149Pm、153Sm、166Ho、177Lu、186Re、188Re、211At、212Bi、18F、124I、125I、131I、55Co、60Cu、
61 62 64 66 67 67 68 82 86 87 90 111 99 201
Cu、Cu、Cu、Ga、Cu、Ga、Ga、Rb、Y、Y、Y、 In、Tc和 Tl。
料和放射性材料。合适的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰
胆碱酯酶。合适的辅基复合物的例子包括链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素。合
适的荧光材料的例子包括伞形酮、荧光素、荧光素异硫氰酸盐、罗丹明、二氯三嗪基氨基荧
光素、丹磺酰氯或藻红蛋白。发光材料的例子包括鲁米诺。生物发光材料的例子包括萤光素
酶、萤光素和水母发光蛋白。在本文描述的诊断方法的某些实施方案中，可检测部分是放射
性核素。在某些实施方案，放射性核素选自47Sc、64Cu、67Cu、89Sr、86Y、87Y、90Y、105Rh、108Ag、
111In、117mSn、149Pm、153Sm、166Ho、177Lu、186Re、188Re、211At、212Bi、18F、124I、125I、131I、55Co、60Cu、
61 62 64 66 67 67 68 82 86 87 90 111 99 201
Cu、Cu、Cu、Ga、Cu、Ga、Ga、Rb、Y、Y、Y、 In、Tc和 Tl。
[0502] 在一些实施方案中，用于检测细胞的体内成像方法可以是磁共振成像(MRI)、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)、计算机断层扫描(CT)、计算机轴向断层扫描(CAT)、电子束
计算机断层扫描(EBCT)、高分辨率计算机断层扫描(HRCT)、内摆线断层扫描、正电子发射断
层扫描(PET)、闪烁扫描、γ照相机、β+检测器、γ检测器、荧光成像、低光成像、X射线、生物发光成像和其他成像模式。
计算机断层扫描(EBCT)、高分辨率计算机断层扫描(HRCT)、内摆线断层扫描、正电子发射断
层扫描(PET)、闪烁扫描、γ照相机、β+检测器、γ检测器、荧光成像、低光成像、X射线、生物发光成像和其他成像模式。
[0503] 在一些实施方案中，可以通过检测和/或监测所述缀合物的细胞表面分子部分来进行检测和/或监测。例如，在一些实施方案中，可以通过与结合分子或靶向分子接触来检
测和/或监测经修饰的细胞表面分子，所述结合分子或靶向分子可以结合或靶向细胞表面
分子并且可以被检测，例如含有可检测的标记。在一些实施方案中，可以使用对应的抗体或
其抗原结合片段或其他细胞表面分子靶向分子(如表1中所描述的任何抗体或其抗原结合
片段)来检测细胞表面缀合物。在一些实施方案中，此类抗体或其抗原结合片段或其他靶向
分子可以用于本文提供的任何检测或监测方法中。
测和/或监测经修饰的细胞表面分子，所述结合分子或靶向分子可以结合或靶向细胞表面
分子并且可以被检测，例如含有可检测的标记。在一些实施方案中，可以使用对应的抗体或
其抗原结合片段或其他细胞表面分子靶向分子(如表1中所描述的任何抗体或其抗原结合
片段)来检测细胞表面缀合物。在一些实施方案中，此类抗体或其抗原结合片段或其他靶向
分子可以用于本文提供的任何检测或监测方法中。
[0504] 在一些实施方案中，靶向、检测和/或监测细胞表面缀合物的细胞表面分子部分的靶向分子可以包括例如抗体，所述抗体包括但不限于3F8、阿巴伏单抗(abagovomab)、阿昔
单抗、阿德木单抗(adecatumumab)、阿夫土珠(afutuzumab)、阿仑单抗、喷替酸阿妥莫单抗
(altumomab pentetate)、麻安莫单抗(anatumomab mafenatox)、阿泊珠单抗
(apolizumab)、阿西莫单抗、阿塞珠单抗(aselizumab)、阿特珠单抗(atlizumab)(＝托西珠
单抗(tocilizumab))、巴利昔单抗、贝妥莫单抗(bectumomab)、贝那利珠单抗
(benralizumab)、贝索单抗(besilesomab)、莫比伐珠单抗(bivatuzumab mertansine)、博
纳吐单抗、本妥昔单抗(brentuximab vedotin)、莫坎妥珠单抗(cantuzumab mertansine)、
卡罗单抗喷地肽(capromab pendetide)、卡妥索单抗(catumaxomab)、CC49、西利珠单抗
(cedelizumab)、西莫白介素(celmoleukin)、泊西他珠单抗(citatuzumab bogatox)、克立
昔单抗(clenoliximab)、泰坦-克利妥珠单抗(clivatuzumab tetraxetan)、CNTO-95、可那
木单抗(conatumumab)、达西珠单抗(dacetuzumab)、达利珠单抗(daclizumab)、达雷木单抗
(daratumumab)、地莫单抗(detumomab)、依美昔单抗(ecromeximab)、依决洛单抗
(edrecolomab)、依法利珠单抗(efalizumab)、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)、PEG化恩莫单抗
(enlimomab pegol)、西依匹莫单抗(epitumomab cituxetan)、依帕珠单抗(epratuzumab)、
厄利珠单抗(erlizumab)、埃达珠单抗(etaracizumab)、法索单抗(fanolesomab)、法拉莫单
抗(faralimomab)、法勒珠单抗(farletuzumab)、加利昔单抗(galiximab)、加维莫单抗
(gavilimomab)、吉妥单抗(gemtuzumab ozogamicin)、维汀-格仑妥木单抗、戈利昔单抗
(gomiliximab)、伊巴利珠单抗(ibalizumab)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、伊戈
伏单抗(igovomab)、英妥木单抗(intetumumab)、伊妥木单抗(iratumumab)、伊诺莫单抗
(inolimomab)、奥英妥珠单抗(inotuzumab ozogamicin)、伊匹木单抗(ipilimumab)、凯利
昔单抗(keliximab)、拉贝珠单抗(labetuzumab)、林妥珠单抗(lintuzumab)、来沙木单抗
(lexatumumab)、鲁卡木单抗(lucatumumab)、鲁昔单抗(lumiliximab)、马帕木单抗
(mapatumumab)、马司莫单抗(maslimomab)、米拉妥珠单抗(milatuzumab)、明瑞莫单抗
(minretumomab)、米妥莫单抗(mitumomab)、莫罗单抗(muromonab)-CD3、他那莫单抗
(naptumomab estafenatox)、那他株单抗(natalizumab)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥度
莫单抗(odulimomab)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥拉单抗(olaratumab)、莫奥珠单抗
(oportuzumab monatox)、奥戈伏单抗(oregovomab)、奥昔珠单抗(otelixizumab)、喷妥莫
单抗(pemtumomab)、普立昔单抗(priliximab)、PRO 140、利妥昔单抗(rituximab)、罗维珠
单抗(rovelizumab)、鲁利单抗(ruplizumab)、沙妥莫单抗喷地肽(satumomab pendetide)、
西利珠单抗(siplizumab)、索土珠单抗(sontuzumab)、他多赛珠单抗(tadocizumab)、帕他
普莫单抗(taplitumomab paptox)、替奈昔单抗(teneliximab)、特普利珠单抗
(teplizumab)、TGN1412、替西木单抗(ticilimumab)(＝曲美木单抗(tremelimumab))、替加
珠单抗(tigatuzumab)、托西珠单抗(tocilizumab)(＝atlizumab)、托利珠单抗
(toralizumab)、托西莫单抗(tositumomab)、曲美木单抗(tremelimumab)、妥考妥珠单抗、
维多株单抗(vedolizumab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、维西珠单抗(visilizumab)、
vitaxin、伏洛昔单抗(volociximab)、伏妥莫单抗(votumumab)、扎木单抗(zanolimumab)、
齐拉木单抗(ziralimumab)、阿佐莫单抗(zolimomab aritox)。阿特珠单抗
(Atezolizumab)、贝伐珠单抗(bevacizumab) 地诺单抗(denosumab)、地努图
希单抗(dinutuximab)、纳武单抗(nivolumab)、奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab)、派姆单抗
(pembrolizumab)、皮地利珠单抗(pidilizumab)(CT-011)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、司
妥昔单抗(siltuximab)、曲妥珠单抗-美坦新偶联物(ado-trastuzumab emtansine)、CEA-
scan Fab片段、OC125单克隆抗体、ab75705、B72.3、MPDL3280A、MSB001078C、MEDI4736、或其抗原结合片段、其类似物或衍生物、或选自以下的抗原结合抗体片段：Fab片段、Fab'片段、F
(ab)’2片段、单链Fv(scFv)或二硫化物稳定的Fv(dsFv)。在一些实施方案中，经修饰的细胞
表面分子包含由上述抗体或其抗原结合片段中任何一种识别的表位。
单抗、阿德木单抗(adecatumumab)、阿夫土珠(afutuzumab)、阿仑单抗、喷替酸阿妥莫单抗
(altumomab pentetate)、麻安莫单抗(anatumomab mafenatox)、阿泊珠单抗
(apolizumab)、阿西莫单抗、阿塞珠单抗(aselizumab)、阿特珠单抗(atlizumab)(＝托西珠
单抗(tocilizumab))、巴利昔单抗、贝妥莫单抗(bectumomab)、贝那利珠单抗
(benralizumab)、贝索单抗(besilesomab)、莫比伐珠单抗(bivatuzumab mertansine)、博
纳吐单抗、本妥昔单抗(brentuximab vedotin)、莫坎妥珠单抗(cantuzumab mertansine)、
卡罗单抗喷地肽(capromab pendetide)、卡妥索单抗(catumaxomab)、CC49、西利珠单抗
(cedelizumab)、西莫白介素(celmoleukin)、泊西他珠单抗(citatuzumab bogatox)、克立
昔单抗(clenoliximab)、泰坦-克利妥珠单抗(clivatuzumab tetraxetan)、CNTO-95、可那
木单抗(conatumumab)、达西珠单抗(dacetuzumab)、达利珠单抗(daclizumab)、达雷木单抗
(daratumumab)、地莫单抗(detumomab)、依美昔单抗(ecromeximab)、依决洛单抗
(edrecolomab)、依法利珠单抗(efalizumab)、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)、PEG化恩莫单抗
(enlimomab pegol)、西依匹莫单抗(epitumomab cituxetan)、依帕珠单抗(epratuzumab)、
厄利珠单抗(erlizumab)、埃达珠单抗(etaracizumab)、法索单抗(fanolesomab)、法拉莫单
抗(faralimomab)、法勒珠单抗(farletuzumab)、加利昔单抗(galiximab)、加维莫单抗
(gavilimomab)、吉妥单抗(gemtuzumab ozogamicin)、维汀-格仑妥木单抗、戈利昔单抗
(gomiliximab)、伊巴利珠单抗(ibalizumab)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、伊戈
伏单抗(igovomab)、英妥木单抗(intetumumab)、伊妥木单抗(iratumumab)、伊诺莫单抗
(inolimomab)、奥英妥珠单抗(inotuzumab ozogamicin)、伊匹木单抗(ipilimumab)、凯利
昔单抗(keliximab)、拉贝珠单抗(labetuzumab)、林妥珠单抗(lintuzumab)、来沙木单抗
(lexatumumab)、鲁卡木单抗(lucatumumab)、鲁昔单抗(lumiliximab)、马帕木单抗
(mapatumumab)、马司莫单抗(maslimomab)、米拉妥珠单抗(milatuzumab)、明瑞莫单抗
(minretumomab)、米妥莫单抗(mitumomab)、莫罗单抗(muromonab)-CD3、他那莫单抗
(naptumomab estafenatox)、那他株单抗(natalizumab)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥度
莫单抗(odulimomab)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥拉单抗(olaratumab)、莫奥珠单抗
(oportuzumab monatox)、奥戈伏单抗(oregovomab)、奥昔珠单抗(otelixizumab)、喷妥莫
单抗(pemtumomab)、普立昔单抗(priliximab)、PRO 140、利妥昔单抗(rituximab)、罗维珠
单抗(rovelizumab)、鲁利单抗(ruplizumab)、沙妥莫单抗喷地肽(satumomab pendetide)、
西利珠单抗(siplizumab)、索土珠单抗(sontuzumab)、他多赛珠单抗(tadocizumab)、帕他
普莫单抗(taplitumomab paptox)、替奈昔单抗(teneliximab)、特普利珠单抗
(teplizumab)、TGN1412、替西木单抗(ticilimumab)(＝曲美木单抗(tremelimumab))、替加
珠单抗(tigatuzumab)、托西珠单抗(tocilizumab)(＝atlizumab)、托利珠单抗
(toralizumab)、托西莫单抗(tositumomab)、曲美木单抗(tremelimumab)、妥考妥珠单抗、
维多株单抗(vedolizumab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、维西珠单抗(visilizumab)、
vitaxin、伏洛昔单抗(volociximab)、伏妥莫单抗(votumumab)、扎木单抗(zanolimumab)、
齐拉木单抗(ziralimumab)、阿佐莫单抗(zolimomab aritox)。阿特珠单抗
(Atezolizumab)、贝伐珠单抗(bevacizumab) 地诺单抗(denosumab)、地努图
希单抗(dinutuximab)、纳武单抗(nivolumab)、奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab)、派姆单抗
(pembrolizumab)、皮地利珠单抗(pidilizumab)(CT-011)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、司
妥昔单抗(siltuximab)、曲妥珠单抗-美坦新偶联物(ado-trastuzumab emtansine)、CEA-
scan Fab片段、OC125单克隆抗体、ab75705、B72.3、MPDL3280A、MSB001078C、MEDI4736、或其抗原结合片段、其类似物或衍生物、或选自以下的抗原结合抗体片段：Fab片段、Fab'片段、F
(ab)’2片段、单链Fv(scFv)或二硫化物稳定的Fv(dsFv)。在一些实施方案中，经修饰的细胞
表面分子包含由上述抗体或其抗原结合片段中任何一种识别的表位。
[0505] 在一些实施方案中，细胞表面分子是PSMA或其修饰形式。在一些实施方案中，结合分子或靶向分子是或包含抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，结合分子或靶向分
子是或包含配体和/或小分子。在一些实施方案中，结合分子是或包含能够结合PSMA的活性
位点或底物结合位点的小分子。在一些实施方案中，结合分子是或包含PSMA和/或其修饰形
式的拮抗剂、选择性拮抗剂、反向激动剂、选择性反向激动剂、激动剂、选择性激动剂、抑制
剂和/或选择性抑制剂。在一些实施方案中，结合分子是或包含PSMA的抑制剂。在一些实施
方案中，结合分子是或包含小分子、和/或低分子量分子和/或低分子量抑制剂。在一些实施
方案中，结合分子是或包含能够结合PSMA或其修饰形式的部分，所述部分是小分子和/或可
检测部分。在一些实施方案中，可检测部分能够产生可检测的信号。在一些情形中，可检测
部分含有荧光蛋白和/或放射性核素。在一些实施方案中，结合分子或靶向分子是或包括适
体、肽或其缀合物。
子是或包含配体和/或小分子。在一些实施方案中，结合分子是或包含能够结合PSMA的活性
位点或底物结合位点的小分子。在一些实施方案中，结合分子是或包含PSMA和/或其修饰形
式的拮抗剂、选择性拮抗剂、反向激动剂、选择性反向激动剂、激动剂、选择性激动剂、抑制
剂和/或选择性抑制剂。在一些实施方案中，结合分子是或包含PSMA的抑制剂。在一些实施
方案中，结合分子是或包含小分子、和/或低分子量分子和/或低分子量抑制剂。在一些实施
方案中，结合分子是或包含能够结合PSMA或其修饰形式的部分，所述部分是小分子和/或可
检测部分。在一些实施方案中，可检测部分能够产生可检测的信号。在一些情形中，可检测
部分含有荧光蛋白和/或放射性核素。在一些实施方案中，结合分子或靶向分子是或包括适
体、肽或其缀合物。
[0506] 在一些实施方案中，结合分子或靶向分子是或包括抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段选自J591、DFO-J591、CYT-356、J415、3/A12、3/F11、3/E7、D2B、107-
1A4、YPSMA-1、YPSMA-2、3E6、2G7、24.4E6、GCP-02、GCP-04、GCP-05、J533、E99、1G9、3C6、
4.40、026、D7-Fc、D7-CH3、4D4、A5、或其抗原结合片段、其类似物或衍生物、或选自以下的抗原结合抗体片段：Fab片段、Fab'片段、F(ab)'2片段、单链Fv(scFv)或二硫化物稳定的Fv
(dsFv)。在一些实施方案中，经修饰的细胞表面分子包含由上述抗体或其抗原结合片段中
任何一种识别的表位。
1A4、YPSMA-1、YPSMA-2、3E6、2G7、24.4E6、GCP-02、GCP-04、GCP-05、J533、E99、1G9、3C6、
4.40、026、D7-Fc、D7-CH3、4D4、A5、或其抗原结合片段、其类似物或衍生物、或选自以下的抗原结合抗体片段：Fab片段、Fab'片段、F(ab)'2片段、单链Fv(scFv)或二硫化物稳定的Fv
(dsFv)。在一些实施方案中，经修饰的细胞表面分子包含由上述抗体或其抗原结合片段中
任何一种识别的表位。
[0507] 在一些实施方案中，结合分子或靶向分子是或包括在以下文献中描述的那些、或其片段、其缀合物或其衍生物：US 2002/0049712；US 2002/0147312；US 2003/0082187；US
2004/0136998；US 2005/0202020；US 2006/0088539；US 2007/0071759；US 2010/0297653；
US 2011/0020273；US 2013/0225541；US 2013/0315830；US 2014/0099257；US 2014/
0227180；US 2015/0168413；US 2016/0303253；US 2017/0051074；US 6572856；US
7476513；US 8470330；US 8986655；WO 2006/078892；WO 2010/135431；WO 2014/198223；WO
2015/177360；WO 2016/057917；WO 2016/130819；WO 2016/145139；WO 2016/201300；WO
2017/004144；WO 2017/023761；AU 2002/356844；AU 2006/204913；AU 2006/235421；AU
2006/262231；AU 2006/315500；AU 2010/325969；AU 2013/328619；AU 2015/205574；CA
2353267；EP 1390069；EP 1520588；EP 1581794；EP 1599228；EP 1610818；EP 2906250；
Banerjee等人(2011)Angew Chem Int Ed Engl.50(39):9167-9170；Maurer等人(2016)
Nature Reviews Urology 13:226-235；Rowe等人(2016)Prostate Cancer Prostatic
Dis.19(3):223-230；Mease等人,(2013)Curr Top Med Chem.13(8):951-962；Osborne等
人,(2013)Urol Oncol.31(2):144-154；Philipp Wolf(2011),Prostate Specific
Membrane Antigen as Biomarker and Therapeutic Target for Prostate Cancer,
Prostate Cancer-Diagnostic and Therapeutic Advances,Dr.Philippe E.Spiess(编
辑),Intech,第81-100页；Ruggiero等人,(2011)J Nucl Med.52(10):1608-1615；Liu等人,
(1997)Cancer Research 57:3629-3634；Regino等人,(2009)Curr Radiopharm.January；2
(1):9-17；Kampmeier等人(2014)EJNMMI Research 4:13；Wolf等人,(2010)The Prostate
70:562-569；Tykvart等人(2014)The Prostate 74:1674-1690；Jin等人,(2016)EMJ
Urol.4(1):62-69以及Tino等人(2000)Hybridoma 19(3):24957。
2004/0136998；US 2005/0202020；US 2006/0088539；US 2007/0071759；US 2010/0297653；
US 2011/0020273；US 2013/0225541；US 2013/0315830；US 2014/0099257；US 2014/
0227180；US 2015/0168413；US 2016/0303253；US 2017/0051074；US 6572856；US
7476513；US 8470330；US 8986655；WO 2006/078892；WO 2010/135431；WO 2014/198223；WO
2015/177360；WO 2016/057917；WO 2016/130819；WO 2016/145139；WO 2016/201300；WO
2017/004144；WO 2017/023761；AU 2002/356844；AU 2006/204913；AU 2006/235421；AU
2006/262231；AU 2006/315500；AU 2010/325969；AU 2013/328619；AU 2015/205574；CA
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人,(2013)Urol Oncol.31(2):144-154；Philipp Wolf(2011),Prostate Specific
Membrane Antigen as Biomarker and Therapeutic Target for Prostate Cancer,
Prostate Cancer-Diagnostic and Therapeutic Advances,Dr.Philippe E.Spiess(编
辑),Intech,第81-100页；Ruggiero等人,(2011)J Nucl Med.52(10):1608-1615；Liu等人,
(1997)Cancer Research 57:3629-3634；Regino等人,(2009)Curr Radiopharm.January；2
(1):9-17；Kampmeier等人(2014)EJNMMI Research 4:13；Wolf等人,(2010)The Prostate
70:562-569；Tykvart等人(2014)The Prostate 74:1674-1690；Jin等人,(2016)EMJ
Urol.4(1):62-69以及Tino等人(2000)Hybridoma 19(3):24957。
[0508] C.自杀杀伤
[0510] 1.ADCC
[0511] 在一些实施方案中，细胞表面缀合物可以用于诱导细胞自杀。例如，细胞表面分子(例如本文描述的经修饰的细胞表面分子)可以经由抗体依赖性细胞介导的细胞毒性
(ADCC)途径用作自杀基因。ADCC是指细胞介导的反应，其中表达Fc受体的非特异性细胞毒
性细胞(如天然杀伤细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体并导致靶细
胞的裂解。可以使用诸如在美国专利号5,821,337中所描述的那些方法来评估ADCC活性。
(ADCC)途径用作自杀基因。ADCC是指细胞介导的反应，其中表达Fc受体的非特异性细胞毒
性细胞(如天然杀伤细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体并导致靶细
胞的裂解。可以使用诸如在美国专利号5,821,337中所描述的那些方法来评估ADCC活性。
[0512] 在一些实施方案中，ADCC可以通过向受试者给予靶向所述缀合物的细胞表面分子的任何抗体来介导。在一些实施方案中，表1中提供的示例性经修饰的细胞表面分子可以通
过由向受试者给予表1中提供的对应抗体介导的ADCC激活而用作自杀基因。在一些方面，经
修饰的EGFR细胞表面分子可以经由西妥昔单抗介导的ADCC激活而用作自杀基因。在一些方
面，由西妥昔单抗或ADCC途径介导的自杀杀伤不受利用与细胞表面分子连接的药剂
(Strep- )的选择过程的影响。在一些方面，被工程化以在细胞表面上表达的PSMA或
其修饰形式可以经由给予结合分子或靶向分子(其是抗PSMA抗体，如本文描述的任何一
种)，通过ADCC激活而用作自杀基因。在另一个实施方案中，消除表达本文提供的细胞表面
缀合物的工程化T细胞可以通过给予对缀合物的药剂(例如亲和标签)具特异性的抗体来实
现。对亲和标签具特异性的示例性抗体药剂(包括本文描述的那些)是已知的。在一些实施
方案中，如果使用链霉亲和素结合肽(如Strep- )作为药剂，则可以使用抗Strep-
抗体或抗Strep- scFv来激活ADCC途径。示例性的抗Strep-标签抗体包括可商
购获得的StrepMAB-Classic、单克隆抗体StrepMAB-Immo(IBA)、抗Strep标签II抗体
(Genscript)或Strep-标签抗体(Qiagen)。
过由向受试者给予表1中提供的对应抗体介导的ADCC激活而用作自杀基因。在一些方面，经
修饰的EGFR细胞表面分子可以经由西妥昔单抗介导的ADCC激活而用作自杀基因。在一些方
面，由西妥昔单抗或ADCC途径介导的自杀杀伤不受利用与细胞表面分子连接的药剂
(Strep- )的选择过程的影响。在一些方面，被工程化以在细胞表面上表达的PSMA或
其修饰形式可以经由给予结合分子或靶向分子(其是抗PSMA抗体，如本文描述的任何一
种)，通过ADCC激活而用作自杀基因。在另一个实施方案中，消除表达本文提供的细胞表面
缀合物的工程化T细胞可以通过给予对缀合物的药剂(例如亲和标签)具特异性的抗体来实
现。对亲和标签具特异性的示例性抗体药剂(包括本文描述的那些)是已知的。在一些实施
方案中，如果使用链霉亲和素结合肽(如Strep- )作为药剂，则可以使用抗Strep-
抗体或抗Strep- scFv来激活ADCC途径。示例性的抗Strep-标签抗体包括可商
购获得的StrepMAB-Classic、单克隆抗体StrepMAB-Immo(IBA)、抗Strep标签II抗体
(Genscript)或Strep-标签抗体(Qiagen)。
[0513] 2.由细胞毒性分子靶向的药剂
[0514] 在一些实施方案中，通过向受试者给予对所述缀合物的药剂(例如亲和标签)具特异性的细胞毒性分子来实现自杀杀伤。在一些实施方案中，此类细胞毒性分子包括其中对
所述药剂具特异性的结合分子(包括抗体或非抗体试剂)与细胞毒性剂缀合的那些。在此类
方法的方面，当受试者已知或怀疑具有或可能具有或发生对给予的细胞的不良副作用(如
与工程化细胞的毒性或免疫原性相关的不良副作用)时，将细胞毒性分子给予至受试者。
所述药剂具特异性的结合分子(包括抗体或非抗体试剂)与细胞毒性剂缀合的那些。在此类
方法的方面，当受试者已知或怀疑具有或可能具有或发生对给予的细胞的不良副作用(如
与工程化细胞的毒性或免疫原性相关的不良副作用)时，将细胞毒性分子给予至受试者。
[0515] 在一些实施方案中，结合分子是链霉亲和素突变蛋白(如所描述的任何一种，包括Strept-Tactin或其他链霉亲和素突变蛋白)，或是其寡聚物。本文还提供了与细胞毒性剂
连接或缀合的链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白、或链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白的
寡聚物，如本文描述的任何一种。在一些方面，结合分子试剂包含SEQ ID NO:3-6、27或28中
任一个中所示的链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白或展现与SEQ ID NO:3-6、27或28中任
一个至少或至少约85％、86％,87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列，并且结合链霉亲和素结合肽药剂(例如
Strep-标签)。在一些实施方案中，结合分子是对所述药剂具特异性的抗体或抗原结合片
段。
连接或缀合的链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白、或链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白的
寡聚物，如本文描述的任何一种。在一些方面，结合分子试剂包含SEQ ID NO:3-6、27或28中
任一个中所示的链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白或展现与SEQ ID NO:3-6、27或28中任
一个至少或至少约85％、86％,87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列，并且结合链霉亲和素结合肽药剂(例如
Strep-标签)。在一些实施方案中，结合分子是对所述药剂具特异性的抗体或抗原结合片
段。
[0516] 在一些情况下，细胞毒性剂可以是毒素或放射性金属。其他细胞毒性剂包括但不限于细胞毒性组分(例如，化学治疗药物如抗有丝分裂剂(例如长春地辛)、抗叶酸剂、烷化
剂(例如替莫唑胺)、细菌毒素、蓖麻毒素、抗病毒剂、放射性同位素、放射性金属)。当靶向特定细胞时，此类细胞毒性剂可以用于特异性杀伤工程化细胞或使工程化细胞失能，例如，当
不需要重组受体的活性时。
剂(例如替莫唑胺)、细菌毒素、蓖麻毒素、抗病毒剂、放射性同位素、放射性金属)。当靶向特定细胞时，此类细胞毒性剂可以用于特异性杀伤工程化细胞或使工程化细胞失能，例如，当
不需要重组受体的活性时。
[0517] 在一些实施方案中，细胞毒性试剂是细菌毒素，所述细菌毒素属于细菌毒素(称为AB毒素)的主要类别，其使用将酶(A单元)活跃地转移到细胞中的转运蛋白(B或结合单元)。
AB毒素的例子包括肉毒杆菌神经毒素、炭疽毒素、白喉毒素、志贺毒素、志贺样毒素、外毒素
A和霍乱毒素。由于所有这些毒素之间的类似作用机制，所有这些毒素都被认为在本发明的
各个方面中起作用。这些和各种其他毒素的A和B组分是熟知的。
AB毒素的例子包括肉毒杆菌神经毒素、炭疽毒素、白喉毒素、志贺毒素、志贺样毒素、外毒素
A和霍乱毒素。由于所有这些毒素之间的类似作用机制，所有这些毒素都被认为在本发明的
各个方面中起作用。这些和各种其他毒素的A和B组分是熟知的。
[0518] 细菌毒素通常具有两个功能不同的部分，称为A和B。“A”组分通常是“活性”部分，并且“B”组分通常是“结合”部分。因此，A部分或组分含有催化活性，而B部分或组分拥有将A部分细胞质递送到靶细胞中所需的决定簇。这些递送决定簇包括受体结合活性，并且通常
但不总是包括膜穿透活性。许多细菌毒素如白喉毒素在单一多肽内含有两个部分。相比之
下，炭疽毒素是所谓的二元毒素的成员，这是A和B功能位于不同的蛋白质中的一种类别。虽
然是不同的，但是具有A和B功能的蛋白质在细胞中毒期间相互作用。炭疽毒素使用单一B部
分(保护性抗原(PA；83kDa))来将两个替代性A部分(水肿因子(EF；89kDa)和致死因子(LF；
89kDa))递送到细胞质中(关于细菌毒素的例子，参见国际专利申请公开号WO
2012096926)。
但不总是包括膜穿透活性。许多细菌毒素如白喉毒素在单一多肽内含有两个部分。相比之
下，炭疽毒素是所谓的二元毒素的成员，这是A和B功能位于不同的蛋白质中的一种类别。虽
然是不同的，但是具有A和B功能的蛋白质在细胞中毒期间相互作用。炭疽毒素使用单一B部
分(保护性抗原(PA；83kDa))来将两个替代性A部分(水肿因子(EF；89kDa)和致死因子(LF；
89kDa))递送到细胞质中(关于细菌毒素的例子，参见国际专利申请公开号WO
2012096926)。
[0519] 在一些方面，所述毒素是肽毒素、蓖麻毒素A链毒素、相思豆毒素A链、白喉毒素(DT)A链、假单胞菌外毒素、志贺毒素A链、白树毒素、苦瓜毒蛋白(Momordin)、美洲商陆抗病
毒蛋白、皂草素、天花粉蛋白或大麦毒素。在一些方面，所述毒素是光毒素。在一些实施方案
中，所述肽毒素包含在SEQ ID NO:100中所示的氨基酸序列。
毒蛋白、皂草素、天花粉蛋白或大麦毒素。在一些方面，所述毒素是光毒素。在一些实施方案
中，所述肽毒素包含在SEQ ID NO:100中所示的氨基酸序列。
[0520] 在一些实施方案中，细胞毒性剂的给予不会或基本上不会诱导健康组织或健康细胞的、不含工程化细胞和/或不表达所述抗原的细胞或组织的杀伤或破坏。
[0521] 3.二聚化介导的杀伤
[0522] 在一些实施方案中，通过使用具有细胞内信号传导结构域的细胞表面缀合物来实现表达细胞表面缀合物的细胞的自杀杀伤，所述细胞内信号传导结构域能够例如在二聚化
时介导细胞的杀伤。在一些实施方案中，杀伤是经由半胱天冬酶活性介导的，所述半胱天冬
酶活性启动导致细胞凋亡的细胞破坏。在一些方面，细胞表面缀合物包含半胱天冬酶-9的
信号传导结构域，其是细胞凋亡途径的一部分。
时介导细胞的杀伤。在一些实施方案中，杀伤是经由半胱天冬酶活性介导的，所述半胱天冬
酶活性启动导致细胞凋亡的细胞破坏。在一些方面，细胞表面缀合物包含半胱天冬酶-9的
信号传导结构域，其是细胞凋亡途径的一部分。
[0523] 在一些实施方案中，通过向受试者给予与所述缀合物的药剂特异性结合的结合分子来进行二聚化。在一些实施方案中，结合分子与所述缀合物的药剂的结合诱导半胱天冬
酶亚基的二聚化，并且通过信号传导结构域诱导、调节、激活、介导和/或促进信号传导。在
一些实施方案中，二聚化可能导致细胞的半胱天冬酶-9依赖性细胞死亡。
酶亚基的二聚化，并且通过信号传导结构域诱导、调节、激活、介导和/或促进信号传导。在
一些实施方案中，二聚化可能导致细胞的半胱天冬酶-9依赖性细胞死亡。
[0524] 在一些实施方案中，给予至受试者的结合分子是识别所述药剂(如本文描述的任何一种)的一种结合分子。在一些实施方案中，所述药剂是链霉亲和素结合肽，如Strep-标
签，包括如所描述的Strep- II或双-Strep-标签。在一些实施方案中，结合分子是非
抗体剂，所述非抗体剂能够特异性地并且在一些情况下可逆地结合所述药剂如链霉亲和素
突变蛋白(包括Strep-Tactin或其他链霉亲和素突变蛋白及其寡聚物)。在一些实施方案
中，识别所述药剂的结合分子是抗体，如抗Strep-标签抗体。
签，包括如所描述的Strep- II或双-Strep-标签。在一些实施方案中，结合分子是非
抗体剂，所述非抗体剂能够特异性地并且在一些情况下可逆地结合所述药剂如链霉亲和素
突变蛋白(包括Strep-Tactin或其他链霉亲和素突变蛋白及其寡聚物)。在一些实施方案
中，识别所述药剂的结合分子是抗体，如抗Strep-标签抗体。
[0525] VII.定义
[0526] 如本文所用，叙述核苷酸或氨基酸位置“对应于”所公开序列中的核苷酸或氨基酸位置(例如序列表中所示)是指，在使用标准比对算法(例如GAP算法)与所公开序列比对以
使同一性最大化之后，所鉴定的核苷酸或氨基酸位置。通过比对序列，本领域技术人员可以
例如使用保守和相同的氨基酸残基作为指导来鉴定相应的残基。通常，为了鉴定对应位置，
比对氨基酸序列使得获得最高阶匹配(参见，例如：Computational Molecular Biology,
Lesk,A.M.编辑,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics
and Genome Projects,Smith,D.W.编辑,Academic Press,New York,1993；Computer
Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑,Humana Press,
New.Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic
Press,1987；和Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.编辑,M Stockton
Press,New York,1991；Carrillo等人(1988)SIAM J Applied Math 48:1073)。
使同一性最大化之后，所鉴定的核苷酸或氨基酸位置。通过比对序列，本领域技术人员可以
例如使用保守和相同的氨基酸残基作为指导来鉴定相应的残基。通常，为了鉴定对应位置，
比对氨基酸序列使得获得最高阶匹配(参见，例如：Computational Molecular Biology,
Lesk,A.M.编辑,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics
and Genome Projects,Smith,D.W.编辑,Academic Press,New York,1993；Computer
Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑,Humana Press,
New.Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic
Press,1987；和Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.编辑,M Stockton
Press,New York,1991；Carrillo等人(1988)SIAM J Applied Math 48:1073)。
[0527] 如本文所用的术语“载体”是指能传播其所连接的另一核酸分子的核酸分子。所述术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入已引入其的宿主细胞基因组中的载体。某
些载体能够指导它们可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。载
体包括病毒载体，例如逆转录病毒(例如γ逆转录病毒和慢病毒)载体。
些载体能够指导它们可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。载
体包括病毒载体，例如逆转录病毒(例如γ逆转录病毒和慢病毒)载体。
[0528] 术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和源自其的后代，不考虑传代次数。后代的核酸含量可能与亲代细胞不完全相同，但可能含有突变。本文包括如在初始转化细胞中所筛选或选择的，具有相同功能或生物
活性的突变体后代。
活性的突变体后代。
[0529] 如本文所用，细胞或细胞群对特定标记呈“阳性”的陈述是指特定标记(通常为表面标记)在细胞上或细胞中的可检测的存在。当提及表面标记时，所述术语是指如通过流式
细胞术检测到的，表面表达的存在，例如通过用与所述标记特异性结合的抗体进行染色并
检测所述抗体，其中所述染色通过流式细胞术以如下水平是可检测的，所述水平基本上高
于在其他方面相同的条件下用同种型匹配对照进行相同程序检测到的染色，和/或所述水
平基本上与已知对所述标记呈阳性的细胞的水平相似，和/或所述水平基本上高于已知对
所述标记呈阴性的细胞的水平。
细胞术检测到的，表面表达的存在，例如通过用与所述标记特异性结合的抗体进行染色并
检测所述抗体，其中所述染色通过流式细胞术以如下水平是可检测的，所述水平基本上高
于在其他方面相同的条件下用同种型匹配对照进行相同程序检测到的染色，和/或所述水
平基本上与已知对所述标记呈阳性的细胞的水平相似，和/或所述水平基本上高于已知对
所述标记呈阴性的细胞的水平。
[0530] 如本文所用，细胞或细胞群对特定标记呈“阴性”的陈述是指特定标记(通常为表面标记)在细胞上或细胞中不存在实质上可检测的存在。当提及表面标记时，所述术语是指
如通过流式细胞术检测到的，表面表达的不存在，例如通过用与所述标记特异性结合的抗
体进行染色并检测所述抗体，其中所述染色通过流式细胞术以如下水平没有检测到，所述
水平基本上高于在其他方面相同的条件下用同种型匹配对照进行相同程序检测到的染色，
和/或所述水平基本上低于已知对所述标记呈阳性的细胞的水平，和/或所述水平与已知对
所述标记呈阴性的细胞的水平相比是基本上相似的。
如通过流式细胞术检测到的，表面表达的不存在，例如通过用与所述标记特异性结合的抗
体进行染色并检测所述抗体，其中所述染色通过流式细胞术以如下水平没有检测到，所述
水平基本上高于在其他方面相同的条件下用同种型匹配对照进行相同程序检测到的染色，
和/或所述水平基本上低于已知对所述标记呈阳性的细胞的水平，和/或所述水平与已知对
所述标记呈阴性的细胞的水平相比是基本上相似的。
[0531] 如本文所用，在关于氨基酸序列(参考多肽序列)使用时，“氨基酸序列同一性百分比(％)”和“同一性百分比”定义为，在比对序列并在必要时引入空位以实现最大序列同一
性百分比并且不将任何保守取代视作序列同一性的一部分之后，候选序列(例如，主题抗体
或片段)中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸
序列同一性百分比的比对可以以本领域熟知的多种方式来实现，例如，使用公众可获得的
计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确
定用于比对序列的适当参数，包括在所比较序列的全长中实现最大比对所需的任何算法。
性百分比并且不将任何保守取代视作序列同一性的一部分之后，候选序列(例如，主题抗体
或片段)中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸
序列同一性百分比的比对可以以本领域熟知的多种方式来实现，例如，使用公众可获得的
计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确
定用于比对序列的适当参数，包括在所比较序列的全长中实现最大比对所需的任何算法。
[0532] 如本文所用的，单数形式“一种/个(a/an)”和“所述(the)”包括复数种/个指示物，除非上下文另外明确说明。例如，“一种/个(a或an)”意指“至少一种/个”或“一种/个或多
种/个”。应理解，本文描述的方面和变化包括“由方面和变化组成”和/或“基本上由方面和
变化组成”。
种/个”。应理解，本文描述的方面和变化包括“由方面和变化组成”和/或“基本上由方面和
变化组成”。
[0533] 贯穿本公开文本，所要求保护的主题的各个方面以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被解释为对所要求保护的主题的范围的僵硬
限制。因此，应当认为范围的描述具体公开了所有可能的子范围以及所述范围内的各个数
值。例如，在提供一系列值的情况下，应当理解，在所述范围的上限和下限之间的每个中间
值以及在所述范围内的任何其他所述或中间值包含在所要求保护的主题内。这些较小范围
的上限和下限可以独立地被包括在所述较小范围内，并且也涵盖在所要求保护的主题内，
受制于在所陈述范围内任何确切排除的限制。在所陈述范围包括限制中的一者或两者的情
况下，排除了那些包括的限制中的任一者或两者的范围也包括在所要求保护的主题内。无
论范围的广度如何，这都适用。
限制。因此，应当认为范围的描述具体公开了所有可能的子范围以及所述范围内的各个数
值。例如，在提供一系列值的情况下，应当理解，在所述范围的上限和下限之间的每个中间
值以及在所述范围内的任何其他所述或中间值包含在所要求保护的主题内。这些较小范围
的上限和下限可以独立地被包括在所述较小范围内，并且也涵盖在所要求保护的主题内，
受制于在所陈述范围内任何确切排除的限制。在所陈述范围包括限制中的一者或两者的情
况下，排除了那些包括的限制中的任一者或两者的范围也包括在所要求保护的主题内。无
论范围的广度如何，这都适用。
[0534] 如本文所用术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的通常误差范围。本文对“约”某一值或参数的提及包括(并描述)针对所述值或参数本身的实施方案。
例如，涉及“约X”的描述包括“X”的描述。
例如，涉及“约X”的描述包括“X”的描述。
[0535] 如本文所用的，组合物是指两种或更多种产物、物质或化合物(包括细胞)的任何混合物。其可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水性、非水性或其任何组合。
[0536] 如本文所用，“受试者”是哺乳动物，如人或其他动物，并且通常是人。
[0537] 除非另外定义，否则本文使用的所有领域术语、符号和其他技术和科学术语或命名旨在具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在
一些情况下，为了清楚和/或为了便于参考而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并
且本文中包含的此类定义不应被解释为表示与本领域通常理解的实质性差异。
一些情况下，为了清楚和/或为了便于参考而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并
且本文中包含的此类定义不应被解释为表示与本领域通常理解的实质性差异。
[0538] 本申请中提及的所有出版物(包括专利文献、科学文章和数据库)出于所有目的通过引用以其整体并入，在程度上如同每个单独的出版物通过引用单独并入。如果本文所述
的定义与通过引用并入本文的专利、申请、公开的申请和其他出版物中所述的定义相反或
在其他方面不一致，则本文所述的定义优先于通过引用并入本文的定义。
的定义与通过引用并入本文的专利、申请、公开的申请和其他出版物中所述的定义相反或
在其他方面不一致，则本文所述的定义优先于通过引用并入本文的定义。
[0539] 本文使用的章节标题仅用于组织目的，而不应解释为限制所描述的主题。
[0540] VIII.示例性实施方案
[0541] 所提供的实施方案包括：
[0542] 1.一种细胞表面缀合物，其包含：
[0543] (a)细胞表面分子，所述细胞表面分子缺乏功能性细胞内信号传导结构域和/或不能介导细胞内信号传导；以及
[0544] (b)与所述细胞表面分子连接的至少一种药剂，所述药剂能够结合链霉亲和素、链霉亲和素类似物或链霉亲和素突变蛋白。
[0545] 2.实施方案1的细胞表面缀合物，其中所述药剂展现平衡解离常数(KD)为从或从约10-4M至或至约10-10M的对链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白的结合亲和力。
[0546] 3.一种细胞表面缀合物，其包含：
[0547] (a)细胞表面分子，所述细胞表面分子缺乏功能性细胞内信号传导结构域和/或不能介导细胞内信号传导；以及
[0548] (b)至少一种药剂，所述至少一种药剂被连接至所述细胞表面分子并且能够可逆地结合试剂和/或能够在竞争物质的存在下被竞争，其中所述药剂是长度为小于50个氨基
酸的肽。
酸的肽。
[0549] 4.实施方案3的细胞表面缀合物，其中所述药剂展现平衡解离常数(KD)为从或从约10-4M至或至约10-10M的对所述试剂的结合亲和力。
[0550] 5.实施方案3或实施方案4的细胞表面缀合物，其中所述试剂是链霉亲和素、链霉亲和素类似物或链霉亲和素突变蛋白。
[0551] 6.一种细胞表面缀合物，其包含：
[0552] (a)细胞表面分子，所述细胞表面分子缺乏功能性细胞内信号传导结构域和/或不能介导细胞内信号传导；以及
[0553] (b)与所述细胞表面分子连接的至少一种药剂，所述药剂具有平衡解离常数(KD)为大于10-7M或平衡缔合常数(KA)为小于107M-1的对试剂的结合亲和力。
[0554] 7.实施方案6的细胞表面缀合物，其中所述试剂是链霉亲和素、链霉亲和素类似物或链霉亲和素突变蛋白。
[0555] 8.实施方案1-7中任一项的细胞表面缀合物，其中所述细胞表面分子包含跨膜结构域和/或能够在所述细胞的表面上表达。
[0556] 9.实施方案1-8中任一项的细胞表面缀合物，其中与参考细胞表面分子相比，所述细胞表面分子是经修饰的，任选地其中所述参考细胞表面分子是包含细胞内信号传导结构
域的细胞表面受体。
域的细胞表面受体。
[0557] 10.实施方案9的细胞表面缀合物，其中与所述参考细胞表面分子相比，所述经修饰的细胞表面分子展现改变的细胞内化、酶促活性和/或配体结合。
[0558] 11.一种细胞表面缀合物，其包含：
[0559] (a)与参考细胞表面分子相比被修饰的细胞表面分子，其中与所述参考细胞表面分子相比，所述经修饰的细胞表面分子展现改变的细胞内化、酶促活性和/或配体结合；以
及
及
[0560] (b)与所述细胞表面分子连接的至少一种药剂，所述药剂能够结合链霉亲和素、链霉亲和素类似物或链霉亲和素突变蛋白。
[0561] 12.实施方案11的细胞表面缀合物，其中所述细胞表面分子缺乏功能性细胞内信号传导结构域和/或不能介导细胞内信号传导。
[0562] 13.一种细胞表面缀合物，其包含：
[0563] (a)包含前列腺特异性膜抗原(PSMA)的细胞表面分子或其经修饰的细胞表面分子；以及
[0564] (b)与所述细胞表面分子连接的至少一种药剂，所述药剂能够结合链霉亲和素、链霉亲和素类似物或链霉亲和素突变蛋白。
[0565] 14.实施方案13的细胞表面缀合物，其中：
[0566] 所述经修饰的细胞表面分子缺乏功能性细胞内信号传导结构域和/或不能介导细胞内信号传导；和/或
[0567] 所述经修饰的细胞表面分子与参考细胞表面分子相比被修饰，其中与所述参考细胞表面分子相比，所述经修饰的细胞表面分子展现改变的细胞内化、酶促活性和/或配体结
合。
合。
[0568] 15.实施方案11-14中任一项的细胞表面缀合物，其中所述细胞表面分子包含跨膜结构域和/或能够在所述细胞的表面上表达。
[0569] 16.实施方案11-15中任一项的细胞表面缀合物，其中所述药剂展现平衡解离常数(KD)为从或从约10-4M至或至约10-10M的对链霉亲和素、链霉亲和素类似物或链霉亲和素突
变蛋白的结合亲和力。
变蛋白的结合亲和力。
[0570] 17.实施方案1-16中任一项的细胞表面缀合物，其中所述药剂与所述试剂的结合是可逆的和/或能够在竞争物质的存在下被竞争。
[0571] 18.实施方案17的细胞表面缀合物，其中所述竞争物质对所述试剂展现的结合亲和力高于所述药剂对所述试剂展现的结合亲和力。
[0572] 19.实施方案18的细胞表面缀合物，其中：
[0573] 所述竞争物质展现平衡解离常数(KD)为在或约在10-10M与10-14M之间的对所述试剂的结合亲和力；和/或
[0574] 所述药剂展现平衡解离常数(KD)为大于10-10M的对所述试剂的结合亲和力。
[0575] 20.实施方案1、2、5、7-20中任一项的细胞表面缀合物，其中所述药剂与所述链霉亲和素、链霉亲和素类似物或链霉亲和素突变蛋白的结合是可逆的和/或能够在生物素、生
物素类似物或其生物活性片段的存在下被竞争。
物素类似物或其生物活性片段的存在下被竞争。
[0576] 21.实施方案1-20中任一项的细胞表面缀合物，其中所述至少一种药剂直接与所述细胞表面分子连接。
[0577] 22.实施方案1-20中任一项的细胞表面缀合物，其中所述至少一种药剂经由至少一个接头间接与所述细胞表面分子连接。
[0578] 23.实施方案1-22中任一项的细胞表面缀合物，其中所述至少一种药剂包含从或从约1种至4种、或1种至2种药剂。
[0579] 24.实施方案1-23中任一项的细胞表面缀合物，其中所述至少一种药剂仅包含一种药剂。
[0580] 25.实施方案1-24中任一项的细胞表面缀合物，其中所述药剂与所述细胞表面分子的细胞外部分或区域连接，任选地其中所述细胞外部分或区域位于所述细胞表面分子的
N末端或C末端。
N末端或C末端。
[0581] 26.实施方案1-25中任一项的细胞表面缀合物，其中所述药剂被连接在所述细胞表面分子的N末端。
[0582] 27.实施方案1-26中任一项的细胞表面缀合物，其中所述药剂被连接在所述细胞表面分子的C末端。
[0583] 28.一种细胞表面缀合物，所述细胞表面缀合物包含在所述细胞表面分子的细胞外部分或区域与药剂连接的细胞表面分子，所述药剂能够结合作为或包含链霉亲和素或链
霉亲和素突变蛋白的试剂，任选地其中所述细胞外部分或区域位于所述细胞表面分子的N
末端或C末端。
霉亲和素突变蛋白的试剂，任选地其中所述细胞外部分或区域位于所述细胞表面分子的N
末端或C末端。
[0584] 29.一种细胞表面缀合物，所述细胞表面缀合物包含在所述细胞表面分子的细胞外部分或区域与药剂连接的细胞表面分子，所述药剂能够可逆地结合试剂，其中所述药剂
是长度为小于50个氨基酸的肽，任选地其中所述细胞外部分或区域位于所述细胞表面分子
的N末端或C末端。
是长度为小于50个氨基酸的肽，任选地其中所述细胞外部分或区域位于所述细胞表面分子
的N末端或C末端。
[0585] 30.实施方案28或实施方案29的细胞表面缀合物，其中所述药剂展现平衡解离常数(KD)为从或从约10-4M至或至约10-10M的结合亲和力。
[0586] 31.一种细胞表面缀合物，所述细胞表面缀合物包含在所述细胞表面分子的细胞外部分或区域与药剂连接的细胞表面分子，其中所述药剂展现平衡解离常数(KD)为大于10
-7M或平衡缔合常数(KA)为小于107M-1的对试剂的结合亲和力，任选地其中所述细胞外部分
或区域位于所述细胞表面分子的N末端或C末端。
-7M或平衡缔合常数(KA)为小于107M-1的对试剂的结合亲和力，任选地其中所述细胞外部分
或区域位于所述细胞表面分子的N末端或C末端。
[0587] 32.实施方案28-31中任一项的细胞表面缀合物，其中所述药剂被连接在所述细胞表面分子的N末端。
[0588] 33.实施方案28-31中任一项的细胞表面缀合物，其中所述药剂被连接在所述细胞表面分子的C末端。
[0589] 34.实施方案28-33中任一项的细胞表面缀合物，其中所述试剂是或包含链霉亲和素、链霉亲和素类似物或链霉亲和素突变蛋白。
[0590] 35.实施方案28-34中任一项的细胞表面缀合物，其中所述药剂与所述试剂的结合是可逆的和/或能够在竞争物质的存在下被竞争。
[0591] 36.实施方案35的细胞表面缀合物，其中所述竞争物质对所述试剂展现的结合亲和力高于所述药剂对所述试剂展现的结合亲和力。
[0592] 37.实施方案36的细胞表面缀合物，其中：
[0593] 所述竞争物质展现平衡解离常数(KD)为在或约在10-10M与10-14M之间的对所述试剂的结合亲和力；和/或
[0594] 所述药剂展现平衡解离常数(KD)为大于10-10M的对所述试剂的结合亲和力。
[0595] 38.实施方案28、34-37中任一项的细胞表面缀合物，其中所述药剂与所述链霉亲和素、链霉亲和素类似物或链霉亲和素突变蛋白的结合是可逆的和/或能够在生物素或生
物素类似物的存在下被竞争。
物素类似物的存在下被竞争。
[0596] 39.实施方案28-38中任一项的细胞表面缀合物，其中所述药剂直接与所述细胞表面分子连接。
[0597] 40.实施方案28-38中任一项的细胞表面缀合物，其中所述药剂经由至少一个接头间接与所述细胞表面分子连接。
[0598] 41.实施方案28-40中任一项的细胞表面缀合物，其中所述细胞表面分子仅与一种药剂连接。
[0599] 42.实施方案1-41中任一项的细胞表面缀合物，其中所述细胞表面分子不是嵌合抗原受体(CAR)。
[0600] 43.实施方案28-30中任一项的细胞表面缀合物，其中所述细胞表面分子与参考细胞表面分子相比是经修饰的。
[0601] 44.实施方案43的细胞表面缀合物，其中所述经修饰的细胞表面分子缺乏功能性细胞内信号传导结构域和/或不能介导细胞内信号传导；和/或与所述参考细胞表面分子相
比，所述经修饰的细胞表面分子展现改变的细胞内化、酶促活性和/或配体结合。
比，所述经修饰的细胞表面分子展现改变的细胞内化、酶促活性和/或配体结合。
[0602] 45.实施方案43或实施方案44的细胞表面缀合物，其中所述参考细胞表面分子是天然哺乳动物细胞表面分子。
[0603] 46.实施方案1-45中任一项的细胞表面缀合物，其中所述细胞表面分子包含能够由抗体或其抗原结合片段识别的表位。
[0604] 47.实施方案1-33中任一项的细胞表面缀合物，其是融合蛋白。
[0605] 48.实施方案1、2、5、7-28和34-47中任一项的细胞表面缀合物，其中参考在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列中的链霉亲和素中的位置，在与位置44至47对应的序列位置处，
所述链霉亲和素类似物或突变蛋白包含氨基酸序列Val44-Thr45-Ala46-Arg47或Ile44-Gly45-
Ala46-Arg47。
所述链霉亲和素类似物或突变蛋白包含氨基酸序列Val44-Thr45-Ala46-Arg47或Ile44-Gly45-
Ala46-Arg47。
[0606] 49.实施方案1、2、5、7-28和34-48中任一项的细胞表面缀合物，其中所述链霉亲和素类似物或突变蛋白包含：
[0607] a)在SEQ ID NO:3-6、27和28中任一个中所示的氨基酸序列；
[0608] b)如下氨基酸序列，所述氨基酸序列展现与SEQ ID NO:3-6、27和28中任一个至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
44 45 46 47 44 45
97％、98％、99％或更高序列同一性并且含有与Val -Thr -Ala -Arg 或Ile -Gly -
Ala46-Arg47对应的氨基酸序列并且可逆地结合所述药剂；或
44 45 46 47 44 45
97％、98％、99％或更高序列同一性并且含有与Val -Thr -Ala -Arg 或Ile -Gly -
Ala46-Arg47对应的氨基酸序列并且可逆地结合所述药剂；或
[0609] c)a)或b)的功能片段，所述功能片段结合所述药剂。
[0610] 50.实施方案48或实施方案49的细胞表面缀合物，其中参考在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列中的链霉亲和素中的位置，在与117、120和/或121对应的位置处，所述链霉亲
和素类似物或突变蛋白进一步包含一个或多个氨基酸置换。
和素类似物或突变蛋白进一步包含一个或多个氨基酸置换。
[0611] 51.实施方案50的细胞表面缀合物，其中：
[0612] 所述一个或多个氨基酸置换选自Glu117、Asp117、Arg117、Ser120、Ala120、Gly120、Trp121、Tyr121或Phe121；或
[0613] 所述一个或多个氨基酸置换选自Glu117、Gly120或Tyr121中的一个或多个；或
[0614] 所述氨基酸置换选自Glu117、Gly120或Tyr121。
[0615] 52.实施方案1、2、5、7-28和34-51中任一项的细胞表面缀合物，其中所述链霉亲和素类似物或突变蛋白包含：
[0616] a)在SEQ ID NO:27或28中所示的氨基酸序列；
[0617] b)如下氨基酸序列，所述氨基酸序列展现与SEQ ID NO:27或28至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、
99％或更高序列同一性并且含有与Val44、Thr45、Ala46、Arg47、Glu117、Gly120和Tyr121对应的氨基酸序列并且可逆地结合所述药剂；或
99％或更高序列同一性并且含有与Val44、Thr45、Ala46、Arg47、Glu117、Gly120和Tyr121对应的氨基酸序列并且可逆地结合所述药剂；或
[0618] c)a)或b)的功能片段，所述功能片段结合所述药剂。
[0619] 53.实施方案3-5、17-19和35-37中任一项的细胞表面缀合物，其中所述竞争物质是或包含生物素、生物素类似物或其生物活性片段。
[0620] 54.实施方案1-53中任一项的细胞表面缀合物，其中所述药剂是亲和标签。
[0621] 55.实施方案3、4、6、8-10、17-19、21-27、29-33、35-37、39-47和54中任一项的细胞表面缀合物，其中所述药剂是或包含Strep标签、His标签、Flag标签、Xpress标签、Avi标签、钙调蛋白(Calmodulin)标签、聚谷氨酸盐(Polyglutamate)标签、HA标签、Myc标签、Nus标签、S标签、X标签、SBP标签、Softag、V5标签、CBP、GST、MBP、GFP、硫氧还蛋白(Thioredoxin)标签或其任何组合。
[0622] 56.实施方案1-55中任一项的细胞表面缀合物，其中所述药剂是或包含一种或多种链霉亲和素结合肽，其任选地是Strep标签。
[0623] 57.实施方案56的细胞表面缀合物，其中所述链霉亲和素结合肽包含序列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:8)或Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(SEQ
ID NO:7)。
ID NO:7)。
[0624] 58.实施方案56或实施方案57的细胞表面缀合物，其中所述药剂包含序列
[0625] Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:17)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-
Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:18)和Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-
Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:
19)。
Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:18)和Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-
Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:
19)。
[0626] 59.实施方案9-58中任一项的细胞表面缀合物，其中所述参考细胞表面分子是细胞表面受体、配体、糖蛋白、细胞粘附分子、抗原、整合素或分化簇(CD)。
[0627] 60.实施方案59的细胞表面缀合物，其中所述参考细胞表面分子是细胞表面受体。
[0628] 61.实施方案9-60中任一项的细胞表面缀合物，其中所述参考细胞表面分子选自EpCAM；VEGFR；整合素，任选地整合素αvβ3、α4、αIIbβ3、α4β7、α5β1、αvβ3或αv；TNF受体超家族的成员，任选地TRAIL-R1或TRAIL-R2；表皮生长因子受体家族的成员；PDGF受体；干扰素
受体；叶酸受体；GPNMB；ICAM-1；HLA-DR；CEA；CA-125；MUC1；TAG-72；IL-6受体；5T4；GD2；
GD3；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；或分化簇细胞表面分子，任选地CD2、CD3、CD4、CD5、CD11、CD11a/LFA-1、CD15、CD18/ITGB2、CD19、CD20、CD22、CD23/IgE受体、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD41、CD44、CD51、CD52、CD62L、CD74、CD80、CD125、CD147/基础免疫球蛋白、CD152/CTLA-4、CD154/CD40L、CD195/CCR5和CD319/SLAMF7。
受体；叶酸受体；GPNMB；ICAM-1；HLA-DR；CEA；CA-125；MUC1；TAG-72；IL-6受体；5T4；GD2；
GD3；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；或分化簇细胞表面分子，任选地CD2、CD3、CD4、CD5、CD11、CD11a/LFA-1、CD15、CD18/ITGB2、CD19、CD20、CD22、CD23/IgE受体、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD41、CD44、CD51、CD52、CD62L、CD74、CD80、CD125、CD147/基础免疫球蛋白、CD152/CTLA-4、CD154/CD40L、CD195/CCR5和CD319/SLAMF7。
[0629] 62.实施方案9-61中任一项的细胞表面缀合物，其中所述参考细胞表面分子是表皮生长因子受体家族的成员。
[0630] 63.实施方案9-62中任一项的细胞表面缀合物，其中所述参考细胞表面分子是表皮生长因子受体(EGFR)、erbB-2受体酪氨酸蛋白激酶(errb2，HER2)、erbB-3受体酪氨酸蛋
白激酶、erbB-4受体酪氨酸蛋白激酶、肝细胞生长因子受体(HGFR/c-MET)或胰岛素样生长
因子受体-1(IGF-1R)。
白激酶、erbB-4受体酪氨酸蛋白激酶、肝细胞生长因子受体(HGFR/c-MET)或胰岛素样生长
因子受体-1(IGF-1R)。
[0631] 64.实施方案9-63中任一项的细胞表面缀合物，其中所述参考细胞表面分子是人的。
[0632] 65.实施方案9-64中任一项的细胞表面缀合物，其中所述经修饰的细胞表面分子缺乏功能性细胞内信号传导结构域和/或不能介导细胞内信号传导。
[0633] 66.实施方案9-65中任一项的细胞表面缀合物，其中与所述参考细胞表面分子相比，所述经修饰的细胞表面分子被截短以缺乏所述细胞内信号传导结构域或运输结构域的
全部或一部分。
全部或一部分。
[0634] 67.实施方案9-66中任一项的细胞表面缀合物，其中与所述参考细胞表面分子相比，所述经修饰的细胞表面分子展现改变的细胞内化、酶促活性和/或配体结合。
[0635] 68.实施方案9-67中任一项的细胞表面缀合物，其中所述经修饰的细胞表面分子包含所述参考细胞表面分子的一个或多个细胞外结构域。
[0636] 69.实施方案9-68中任一项的细胞表面缀合物，其中所述经修饰的细胞表面分子能够结合所述参考细胞表面分子的天然配体和/或底物。
[0637] 70.实施方案9-68中任一项的细胞表面缀合物，其中所述经修饰的细胞表面分子与所述参考细胞表面分子的天然配体和/或底物的结合减少，或所述经修饰的细胞表面分
子不结合所述参考细胞表面分子的天然配体和/或底物。
子不结合所述参考细胞表面分子的天然配体和/或底物。
[0638] 71.实施方案70的细胞表面缀合物，其中所述经修饰的细胞表面分子包含所述参考细胞表面分子的至少一个细胞外结构域，但缺乏由所述参考细胞表面分子的天然配体
和/或底物识别的一个或多个其他细胞外结构域。
和/或底物识别的一个或多个其他细胞外结构域。
[0639] 72.实施方案71的细胞表面缀合物，其中所述至少一个细胞外结构域包含由特异性地结合所述参考细胞表面分子的抗体或其抗原结合片段识别的表位。
[0640] 73.实施方案46-72中任一项的细胞表面缀合物，其中所述抗体或抗原结合片段选自AMG-102、AMG-479、BIIB022OA-5D5、CP-751,871、IMC-Al2、R1507、3F8、阿巴伏单抗
(abagovomab)、阿昔单抗、阿德木单抗(adecatumumab)、阿夫土珠(afutuzumab)、阿仑单抗、
喷替酸阿妥莫单抗(altumomab pentetate)、麻安莫单抗(anatumomab mafenatox)、阿泊珠
单抗(apolizumab)、阿西莫单抗、阿塞珠单抗(aselizumab)、阿特珠单抗(atlizumab)(＝托
西珠单抗(tocilizumab))、巴利昔单抗、贝妥莫单抗(bectumomab)、贝那利珠单抗
(benralizumab)、贝索单抗(besilesomab)、莫比伐珠单抗(bivatuzumab mertansine)、博
纳吐单抗、本妥昔单抗(brentuximab vedotin)、莫坎妥珠单抗(cantuzumab mertansine)、
卡罗单抗喷地肽(capromab pendetide)、卡妥索单抗(catumaxomab)、CC49、西利珠单抗
(cedelizumab)、西莫白介素(celmoleukin)、西妥昔单抗、西妥木单抗(cixutumumab)、克立
昔单抗(clenoliximab)、泰坦-克利妥珠单抗(clivatuzumab tetraxetan)、CNTO-95、可那
木单抗(conatumumab)、达西珠单抗(dacetuzumab)、达利珠单抗(daclizumab)、达雷木单抗
(daratumumab)、地莫单抗(detumomab)、依美昔单抗(ecromeximab)、厄妥索单抗
(ertumaxomab)、依决洛单抗(edrecolomab)、依法利珠单抗(efalizumab)、埃罗妥珠单抗
(elotuzumab)、PEG化恩莫单抗(enlimomab pegol)、西依匹莫单抗(epitumomab
cituxetan)、依帕珠单抗(epratuzumab)、厄利珠单抗(erlizumab)、埃达珠单抗
(etaracizumab)、法索单抗(fanolesomab)、法拉莫单抗(faralimomab)、法勒珠单抗
(farletuzumab)、芬妥木单抗(figitumumab)、加利昔单抗(galiximab)、加维莫单抗
(gavilimomab)、吉妥单抗(gemtuzumab ozogamicin)、维汀-格仑妥木单抗、戈利昔单抗
(gomiliximab)、伊巴利珠单抗(ibalizumab)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、伊戈
伏单抗(igovomab)、英妥木单抗(intetumumab)、伊妥木单抗(iratumumab)、伊诺莫单抗
(inolimomab)、奥英妥珠单抗(inotuzumab ozogamicin)、伊匹木单抗(ipilimumab)、凯利
昔单抗(keliximab)、拉贝珠单抗(labetuzumab)、林妥珠单抗(lintuzumab)、来沙木单抗
(lexatumumab)、鲁卡木单抗(lucatumumab)、鲁昔单抗(lumiliximab)、马帕木单抗
(mapatumumab)、马司莫单抗(maslimomab)、马妥珠单抗(matuzumab)、米拉妥珠单抗
(milatuzumab)、明瑞莫单抗(minretumomab)、米妥莫单抗(mitumomab)、莫罗单抗
(muromonab)-CD3、他那莫单抗(naptumomab estafenatox)、那他株单抗(natalizumab)、耐
昔妥珠单抗(necitumumab)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥度莫单抗(odulimomab)、奥法木
单抗(ofatumumab)、奥拉单抗(olaratumab)、莫奥珠单抗(oportuzumab monatox)、奥戈伏
单抗(oregovomab)、奥昔珠单抗(otelixizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、帕妥珠单抗
(pertuzumab)、喷妥莫单抗(pemtumomab)、普立昔单抗(priliximab)、PRO 140、尼妥珠单抗
(nimotuzumab)、罗妥木单抗(robatumumab)、利妥昔单抗(rituximab)、罗维珠单抗
(rovelizumab)、鲁利单抗(ruplizumab)、沙妥莫单抗喷地肽(satumomab pendetide)、西利
珠单抗(siplizumab)、索土珠单抗(sontuzumab)、他多赛珠单抗(tadocizumab)、帕他普莫
单抗(taplitumomab paptox)、替奈昔单抗(teneliximab)、特普利珠单抗(teplizumab)、
TGN1412、替西木单抗(ticilimumab)(＝曲美木单抗(tremelimumab))、替加珠单抗
(tigatuzumab)、托西珠单抗(tocilizumab)(＝atlizumab)、托利珠单抗(toralizumab)、托
西莫单抗(tositumomab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、曲美木单抗(tremelimumab)、妥考妥
珠单抗、维多株单抗(vedolizumab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、维西珠单抗
(visilizumab)、vitaxin、伏洛昔单抗(volociximab)、伏妥莫单抗(votumumab)、扎鲁木单
抗(zalutumumab)、扎木单抗(zanolimumab)、齐拉木单抗(ziralimumab)、阿佐莫单抗
(zolimomab aritox)、阿特珠单抗(Atezolizumab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)
地诺单抗(denosumab)、地努图希单抗(dinutuximab)、纳武单抗
(nivolumab)、奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、皮地利珠单抗
(pidilizumab)(CT-011)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、司妥昔单抗(siltuximab)、曲妥珠单
抗-美坦新偶联物(ado-trastuzumab emtansine)、CEA-scan Fab片段、OC125单克隆抗体、
ab75705、B72.3、MPDL3280A、MSB001078C、MEDI4736、或其抗原结合片段。
(abagovomab)、阿昔单抗、阿德木单抗(adecatumumab)、阿夫土珠(afutuzumab)、阿仑单抗、
喷替酸阿妥莫单抗(altumomab pentetate)、麻安莫单抗(anatumomab mafenatox)、阿泊珠
单抗(apolizumab)、阿西莫单抗、阿塞珠单抗(aselizumab)、阿特珠单抗(atlizumab)(＝托
西珠单抗(tocilizumab))、巴利昔单抗、贝妥莫单抗(bectumomab)、贝那利珠单抗
(benralizumab)、贝索单抗(besilesomab)、莫比伐珠单抗(bivatuzumab mertansine)、博
纳吐单抗、本妥昔单抗(brentuximab vedotin)、莫坎妥珠单抗(cantuzumab mertansine)、
卡罗单抗喷地肽(capromab pendetide)、卡妥索单抗(catumaxomab)、CC49、西利珠单抗
(cedelizumab)、西莫白介素(celmoleukin)、西妥昔单抗、西妥木单抗(cixutumumab)、克立
昔单抗(clenoliximab)、泰坦-克利妥珠单抗(clivatuzumab tetraxetan)、CNTO-95、可那
木单抗(conatumumab)、达西珠单抗(dacetuzumab)、达利珠单抗(daclizumab)、达雷木单抗
(daratumumab)、地莫单抗(detumomab)、依美昔单抗(ecromeximab)、厄妥索单抗
(ertumaxomab)、依决洛单抗(edrecolomab)、依法利珠单抗(efalizumab)、埃罗妥珠单抗
(elotuzumab)、PEG化恩莫单抗(enlimomab pegol)、西依匹莫单抗(epitumomab
cituxetan)、依帕珠单抗(epratuzumab)、厄利珠单抗(erlizumab)、埃达珠单抗
(etaracizumab)、法索单抗(fanolesomab)、法拉莫单抗(faralimomab)、法勒珠单抗
(farletuzumab)、芬妥木单抗(figitumumab)、加利昔单抗(galiximab)、加维莫单抗
(gavilimomab)、吉妥单抗(gemtuzumab ozogamicin)、维汀-格仑妥木单抗、戈利昔单抗
(gomiliximab)、伊巴利珠单抗(ibalizumab)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、伊戈
伏单抗(igovomab)、英妥木单抗(intetumumab)、伊妥木单抗(iratumumab)、伊诺莫单抗
(inolimomab)、奥英妥珠单抗(inotuzumab ozogamicin)、伊匹木单抗(ipilimumab)、凯利
昔单抗(keliximab)、拉贝珠单抗(labetuzumab)、林妥珠单抗(lintuzumab)、来沙木单抗
(lexatumumab)、鲁卡木单抗(lucatumumab)、鲁昔单抗(lumiliximab)、马帕木单抗
(mapatumumab)、马司莫单抗(maslimomab)、马妥珠单抗(matuzumab)、米拉妥珠单抗
(milatuzumab)、明瑞莫单抗(minretumomab)、米妥莫单抗(mitumomab)、莫罗单抗
(muromonab)-CD3、他那莫单抗(naptumomab estafenatox)、那他株单抗(natalizumab)、耐
昔妥珠单抗(necitumumab)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥度莫单抗(odulimomab)、奥法木
单抗(ofatumumab)、奥拉单抗(olaratumab)、莫奥珠单抗(oportuzumab monatox)、奥戈伏
单抗(oregovomab)、奥昔珠单抗(otelixizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、帕妥珠单抗
(pertuzumab)、喷妥莫单抗(pemtumomab)、普立昔单抗(priliximab)、PRO 140、尼妥珠单抗
(nimotuzumab)、罗妥木单抗(robatumumab)、利妥昔单抗(rituximab)、罗维珠单抗
(rovelizumab)、鲁利单抗(ruplizumab)、沙妥莫单抗喷地肽(satumomab pendetide)、西利
珠单抗(siplizumab)、索土珠单抗(sontuzumab)、他多赛珠单抗(tadocizumab)、帕他普莫
单抗(taplitumomab paptox)、替奈昔单抗(teneliximab)、特普利珠单抗(teplizumab)、
TGN1412、替西木单抗(ticilimumab)(＝曲美木单抗(tremelimumab))、替加珠单抗
(tigatuzumab)、托西珠单抗(tocilizumab)(＝atlizumab)、托利珠单抗(toralizumab)、托
西莫单抗(tositumomab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、曲美木单抗(tremelimumab)、妥考妥
珠单抗、维多株单抗(vedolizumab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、维西珠单抗
(visilizumab)、vitaxin、伏洛昔单抗(volociximab)、伏妥莫单抗(votumumab)、扎鲁木单
抗(zalutumumab)、扎木单抗(zanolimumab)、齐拉木单抗(ziralimumab)、阿佐莫单抗
(zolimomab aritox)、阿特珠单抗(Atezolizumab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)
地诺单抗(denosumab)、地努图希单抗(dinutuximab)、纳武单抗
(nivolumab)、奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、皮地利珠单抗
(pidilizumab)(CT-011)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、司妥昔单抗(siltuximab)、曲妥珠单
抗-美坦新偶联物(ado-trastuzumab emtansine)、CEA-scan Fab片段、OC125单克隆抗体、
ab75705、B72.3、MPDL3280A、MSB001078C、MEDI4736、或其抗原结合片段。
[0641] 74.实施方案9-73中任一项的细胞表面缀合物，其中所述参考细胞表面分子是参考EGFR，并且所述经修饰的细胞表面分子是经修饰的EGFR。
[0642] 75.实施方案74的细胞表面缀合物，其中所述经修饰的EGFR包含由西妥昔单抗或其抗原结合片段特异性识别的表位。
[0643] 76.实施方案74或实施方案75的细胞表面缀合物，其中所述经修饰的EGFR缺乏所述参考EGFR的EGFR结构域I、EGFR结构域II、EGFR近膜结构域和EGFR酪氨酸激酶结构域中的
一个或多个。
一个或多个。
[0644] 77.实施方案74-76中任一项的细胞表面缀合物，其中所述经修饰的EGFR缺乏所述参考EGFR的EGFR结构域I、EGFR结构域II、EGFR近膜结构域和EGFR酪氨酸激酶结构域中的全
部结构域。
部结构域。
[0645] 78.实施方案74-77中任一项的细胞表面缀合物，其中所述经修饰的EGFR包含细胞外结构域，所述细胞外结构域由所述参考EGFR的亚结构域III和亚结构域IV组成或基本上
由其组成。
由其组成。
[0646] 79.实施方案74-78中任一项的细胞表面缀合物，其中所述经修饰的EGFR包含在SEQ ID NO:44或46中所示的氨基酸序列或展现与SEQ ID NO:44或46至少或至少约85％、
90％或95％序列同一性的氨基酸序列。
90％或95％序列同一性的氨基酸序列。
[0647] 80.实施方案9-73中任一项的细胞表面缀合物，其中所述参考细胞表面分子是参考HER2，并且所述经修饰的细胞表面分子是经修饰的HER2。
[0648] 81.实施方案80的细胞表面缀合物，其中所述经修饰的HER2包含由曲妥珠单抗或其抗原结合片段特异性识别的表位。
[0649] 82.实施方案80或实施方案81的细胞表面缀合物，其中所述经修饰的HER2缺乏所述参考HER2的HER2结构域I、HER2结构域II、HER2结构域III中的一个或多个。
[0650] 83.实施方案80-82中任一项的细胞表面缀合物，其中所述经修饰的HER2缺乏所述参考HER2的HER2结构域I、HER2结构域II和HER2结构域III中的全部结构域。
[0651] 84.实施方案80-83中任一项的细胞表面缀合物，其中所述经修饰的HER2包含细胞外结构域，所述细胞外结构域由所述参考HER2的结构域IV组成或基本上由其组成。
[0652] 85.实施方案80-84中任一项的细胞表面缀合物，其中所述经修饰的HER2包含在SEQ ID NO:92中所示的氨基酸序列或展现与SEQ ID NO:92至少或至少约85％、90％或95％
序列同一性的氨基酸序列。
序列同一性的氨基酸序列。
[0653] 86.实施方案9-72中任一项的细胞表面缀合物，其中所述参考细胞表面分子是参考PSMA，并且所述经修饰的细胞表面分子是经修饰的PSMA。
[0654] 87.实施方案86的细胞表面缀合物，其中所述参考PSMA是野生型PSMA，任选地野生型人PSMA。
[0655] 88.实施方案87的细胞表面缀合物，其中所述参考PSMA是人PSMA和/或包含SEQ ID NO:94中所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO:96或97中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序
列。
列。
[0656] 89.实施方案86-88中任一项的细胞表面缀合物，其中所述经修饰的PSMA包含所述参考PSMA的细胞外部分和跨膜结构域。
[0657] 90.实施方案86-89中任一项的细胞表面缀合物，其中与所述参考PSMA相比，所述经修饰的PSMA在所述细胞内区域中包含一个或多个氨基酸修饰。
[0658] 91.实施方案86-90中任一项的细胞表面缀合物，其中所述一个或多个氨基酸修饰包含一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。
[0659] 92.实施方案86-91中任一项的细胞表面缀合物，其中与所述参考PSMA相比，所述经修饰的PSMA展现改变的细胞内化。
[0660] 93.实施方案86-92中任一项的细胞表面缀合物，其中参考在SEQ ID NO:94中所示的氨基酸序列中的位置，所述经修饰的PSMA包含与W2G对应的氨基酸取代或者不包含W2或
者不包含在位置2处的任何残基。
者不包含在位置2处的任何残基。
[0661] 94.实施方案86-93中任一项的细胞表面缀合物，其中与所述参考PSMA相比，所述经修饰的PSMA包含11个N末端氨基酸的缺失或截短。
[0662] 95.实施方案86-94中任一项的细胞表面缀合物，其中所述经修饰的PSMA包含能够由抗体或其抗原结合片段识别的表位。
[0663] 96.实施方案95的细胞表面缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段选自J591、DFO-J591、CYT-356、J415、3/A12、3/F11、3/E7、D2B、107-1A4、YPSMA-1、YPSMA-2、3E6、2G7、
24.4E6、GCP-02、GCP-04、GCP-05、J533、E99、1G9、3C6、4.40、026、D7-Fc、D7-CH3、4D4、A5、及其抗原结合片段。
24.4E6、GCP-02、GCP-04、GCP-05、J533、E99、1G9、3C6、4.40、026、D7-Fc、D7-CH3、4D4、A5、及其抗原结合片段。
[0664] 97.实施方案1-96中任一项的细胞表面缀合物，其中所述细胞表面缀合物不是免疫原性的和/或在给予它的受试者中不诱导免疫应答。
[0665] 98.一种多核苷酸，其包含编码实施方案1-97中任一项的细胞表面缀合物的核酸序列。
[0666] 99.实施方案98的多核苷酸，其中所述核酸序列进一步包含信号序列。
[0667] 100.实施方案99的多核苷酸，其中所述信号序列编码源自GMCSFRα链的信号肽。
[0668] 101.实施方案98-100中任一项的多核苷酸，其中所述核酸序列是第一核酸序列，并且所述多核苷酸进一步包含编码重组受体的第二核酸序列。
[0669] 102.实施方案101的多核苷酸，其中所述重组受体是或包含嵌合抗原受体(CAR)。
[0670] 103.实施方案101或实施方案102的多核苷酸，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列被内部核糖体进入位点(IRES)或编码自切割肽或导致核糖体跳跃的肽的核苷酸
序列分开，所述自切割肽或导致核糖体跳跃的肽任选地是T2A、P2A、E2A或F2A。
序列分开，所述自切割肽或导致核糖体跳跃的肽任选地是T2A、P2A、E2A或F2A。
[0671] 104.实施方案101-103中任一项的多核苷酸，其中所述第一核酸序列在所述第二核酸序列的上游。
[0672] 105.实施方案101-103中任一项的多核苷酸，其中所述第一核酸序列在所述第二核酸序列的下游。
[0673] 106.一种载体，其包含实施方案98-105中任一项的多核苷酸。
[0674] 107.实施方案106的载体，其是病毒载体。
[0675] 108.实施方案106或实施方案107的载体，其是逆转录病毒载体。
[0676] 109.实施方案106-108中任一项的载体，其是慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。
[0677] 110.一种产生工程化细胞的方法，所述方法包括将实施方案96-105中任一项的多核苷酸或实施方案106-109中任一项的载体引入细胞中。
[0678] 111.一种工程化细胞，其通过实施方案110的方法产生。
[0679] 112.一种工程化细胞，其包含实施方案98-105中任一项的多核苷酸或实施方案106-109中任一项的载体。
[0680] 113.一种工程化细胞，其包含实施方案1-97中任一项的细胞表面缀合物。
[0681] 114.实施方案113的工程化细胞，其进一步包含重组受体。
[0682] 115.实施方案114的工程化细胞，其中所述重组受体能够结合靶抗原，所述靶抗原与疾病或障碍的细胞或组织相关、对疾病或障碍的细胞或组织是特异的和/或在疾病或障
碍的细胞或组织上表达。
碍的细胞或组织上表达。
[0683] 116.实施方案115的工程化细胞，其中所述疾病或障碍是感染性疾病或障碍、自身免疫性疾病、炎性疾病、或肿瘤或癌症。
[0684] 117.实施方案115或实施方案116的工程化细胞，其中所述靶抗原是肿瘤抗原。
[0685] 118.实施方案115-117中任一项的工程化细胞，其中所述靶抗原选自αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞
周期蛋白、细胞周期蛋白A2、CC基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、表皮生长因子蛋白(EGFR)、截短的表皮生长因子蛋白(tEGFR)、III型表皮生长因子受体突变(EGFR vIII)、上皮糖蛋白
2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc
受体样5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合
蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100
(gp100)、G蛋白偶联受体5D(GPCR5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、
Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、
人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Ra)、IL-13受体α2
(IL-13Ra2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表
位、含有富亮氨酸重复序列的8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-
A1、MAGE-A3、MAGE-A6、间皮素、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、天然杀伤组2成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑
色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前
列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白
(TPBG也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮
生长因子受体2(VEGFR2)、Wilms肿瘤1(WT-1)。
周期蛋白、细胞周期蛋白A2、CC基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、表皮生长因子蛋白(EGFR)、截短的表皮生长因子蛋白(tEGFR)、III型表皮生长因子受体突变(EGFR vIII)、上皮糖蛋白
2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc
受体样5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合
蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100
(gp100)、G蛋白偶联受体5D(GPCR5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、
Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、
人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Ra)、IL-13受体α2
(IL-13Ra2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表
位、含有富亮氨酸重复序列的8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-
A1、MAGE-A3、MAGE-A6、间皮素、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、天然杀伤组2成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑
色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前
列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白
(TPBG也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮
生长因子受体2(VEGFR2)、Wilms肿瘤1(WT-1)。
[0686] 119.实施方案115-118中任一项的工程化细胞，其中所述靶抗原选自ROR1、HER2、L1-CAM、CD19、CD20、CD22、间皮素、CEA、乙型肝炎表面抗原、抗叶酸受体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP-2、EGP-4、EPHa2、ErbB2、ErbB3、ErbB4、FBP、胎儿乙酰胆碱e受体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、kdr、κ轻链、路易斯Y、L1-细胞粘附分子、MAGE-A1、间皮素、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2D配体、NY-ESO-1、MART-1、gp100、癌胚胎抗原、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原、PSMA、雌激素受体、孕酮受体、肝配蛋白B2、
CD123、CS-1、c-Met、GD-2、MAGE A3、CE7、Wilms肿瘤1(WT-1)和细胞周期蛋白A1(CCNA1)。
CD123、CS-1、c-Met、GD-2、MAGE A3、CE7、Wilms肿瘤1(WT-1)和细胞周期蛋白A1(CCNA1)。
[0687] 120.实施方案114-119中任一项的工程化细胞，其中所述重组受体是功能性非TCR抗原受体或转基因TCR。
[0688] 121.实施方案114-120中任一项的工程化细胞，其中所述重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。
[0689] 122.实施方案114-121中任一项的工程化细胞，其中所述重组受体包含含有抗原结合结构域的细胞外部分。
[0690] 123.实施方案122的工程化细胞，其中所述抗原结合结构域是或包含抗体或抗体片段。
[0691] 124.实施方案123的工程化细胞，其中所述抗体片段是单链片段。
[0692] 125.实施方案123或实施方案124的工程化细胞，其中所述片段包含通过柔性接头连接的抗体可变区。
[0693] 126.实施方案123-125中任一项的工程化细胞，其中所述片段包含scFv。
[0694] 127.实施方案114-126中任一项的工程化细胞，其中所述重组受体包含细胞内信号传导区域。
[0695] 128.实施方案127的工程化细胞，其中所述细胞内信号传导区域包含细胞内信号传导结构域。
[0696] 129.实施方案128的工程化细胞，其中所述细胞内信号传导结构域是或包含主要信号传导结构域、能够在T细胞中诱导初级激活信号的信号传导结构域、T细胞受体(TCR)组
分的信号传导结构域和/或包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的信号传导结构
域。
分的信号传导结构域和/或包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的信号传导结构
域。
[0697] 130.实施方案128或实施方案129的工程化细胞，其中所述细胞内信号传导结构域是或包含CD3链的细胞内信号传导结构域，任选地CD3-zeta(CD3ζ)链或其信号传导部分。
[0698] 131.实施方案127-130中任一项的工程化细胞，其进一步包含设置在所述细胞外结构域与所述细胞内信号传导区域之间的跨膜结构域。
[0699] 132.实施方案127-131中任一项的工程化细胞，其中所述细胞内信号传导区域进一步包含共刺激信号传导结构域。
[0700] 133.实施方案132的工程化细胞，其中所述共刺激信号传导结构域包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
[0701] 134.实施方案132或实施方案133的工程化细胞，其中所述共刺激信号传导结构域包含CD28、4-1BB或ICOS的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
[0702] 135.实施方案132-134中任一项的工程化细胞，其中所述共刺激信号传导结构域位于所述跨膜结构域与所述细胞内信号传导结构域之间。
[0703] 136.实施方案111-135中任一项的工程化细胞，其中所述细胞是免疫细胞。
[0704] 137.实施方案136的工程化细胞，其中所述细胞是淋巴细胞。
[0705] 138.实施方案111至137中任一项的工程化细胞，其中所述细胞是T细胞或NK细胞。
[0706] 139.实施方案138的工程化细胞，其中所述细胞是T细胞，所述T细胞是CD8+T细胞或CD4+T细胞。
[0707] 140.一种组合物，其包含实施方案111-139中任一项的工程化细胞。
[0708] 141.实施方案140的组合物，其进一步包含药学上可接受的赋形剂。
[0709] 142.一种治疗方法，其包括将实施方案111-139中任一项的工程化细胞或实施方案140或实施方案141的组合物给予至患有疾病或障碍的受试者。
[0710] 143.实施方案142的方法，其中所述疾病或障碍是癌症、肿瘤、自身免疫性疾病或障碍、或感染性疾病。
[0711] 144.实施方案142或实施方案143的方法，其进一步包括向所述受试者给予结合分子，所述结合分子能够识别在所述工程化细胞上表达的所述细胞表面缀合物的所述药剂；
并且检测表达所述细胞表面缀合物的细胞。
并且检测表达所述细胞表面缀合物的细胞。
[0712] 145.实施方案144的方法，其中检测包括体内成像。
[0713] 146.一种鉴定表达细胞表面缀合物的细胞的方法，所述方法包括使包含表达或可能表达实施方案1-97中任一项的细胞表面缀合物的细胞或实施方案111-139中任一项的工
程化细胞的组合物、或实施方案140或实施方案141的组合物与能够识别所述细胞表面缀合
物的所述药剂的结合分子接触。
程化细胞的组合物、或实施方案140或实施方案141的组合物与能够识别所述细胞表面缀合
物的所述药剂的结合分子接触。
[0714] 147.实施方案146的方法，其在体外、离体或在体内进行。
[0715] 148.实施方案146或实施方案147中任一项的方法，其中经由体内成像来检测表达所述细胞表面分子的所述细胞。
[0716] 149.实施方案145或实施方案148的方法，其中所述体内成像方法选自磁共振成像(MRI)、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)、计算机断层扫描(CT)、计算机轴向断层扫描
(CAT)、电子束计算机断层扫描(EBCT)、高分辨率计算机断层扫描(HRCT)、内摆线断层扫描、
正电子发射断层扫描(PET)、闪烁扫描、γ照相机、β+检测器、γ检测器、荧光成像、低光成
像、X射线和生物发光成像。
(CAT)、电子束计算机断层扫描(EBCT)、高分辨率计算机断层扫描(HRCT)、内摆线断层扫描、
正电子发射断层扫描(PET)、闪烁扫描、γ照相机、β+检测器、γ检测器、荧光成像、低光成
像、X射线和生物发光成像。
[0717] 150.实施方案145、实施方案148或实施方案149的方法，其中所述结合分子与提供信号或诱导在体内可检测的信号的部分缀合。
[0718] 151.实施方案150的方法，其中所述部分是放射性同位素、生物发光化合物、化学发光化合物、荧光化合物、金属螯合物或酶。
[0719] 152.一种鉴定用细胞表面缀合物转导的细胞的方法，所述方法包括：
[0720] (a)使得用编码所述细胞表面缀合物的实施方案98-105中任一项的多核苷酸或实施方案106-109中任一项的载体转导的组合物、或实施方案111-139中任一项的工程化细
胞、或实施方案140或实施方案141的组合物与能够识别所述细胞表面缀合物的药剂的结合
分子接触；并且
胞、或实施方案140或实施方案141的组合物与能够识别所述细胞表面缀合物的药剂的结合
分子接触；并且
[0721] (b)鉴定与所述结合分子结合的细胞。
[0722] 153.一种鉴定用细胞表面缀合物转导的细胞的方法，所述方法包括：
[0723] (a)将编码所述细胞表面缀合物的实施方案98-105中任一项的多核苷酸或实施方案106-109中任一项的载体引入细胞中；
[0724] (b)使包含(a)的所述细胞的组合物与能够识别所述细胞表面缀合物的所述药剂的结合分子接触；并且
[0725] (c)鉴定所述组合物的与所述结合分子结合的细胞。
[0726] 154.一种选择用细胞表面缀合物转导的细胞的方法，所述方法包括：
[0727] (a)使得用编码所述细胞表面缀合物的实施方案98-105中任一项的多核苷酸或实施方案106-109中任一项的载体转导的组合物、或实施方案111-139中任一项的工程化细
胞、或实施方案140或实施方案141的组合物与能够识别所述细胞表面缀合物的药剂的结合
分子接触；并且
胞、或实施方案140或实施方案141的组合物与能够识别所述细胞表面缀合物的药剂的结合
分子接触；并且
[0728] (b)分离与所述结合分子结合的细胞。
[0729] 155.一种选择用细胞表面缀合物转导的细胞的方法，所述方法包括：
[0730] (a)将编码所述细胞表面缀合物的实施方案98-105中任一项的多核苷酸或实施方案106-109中任一项的载体引入细胞中；
[0731] (b)使包含(a)的所述细胞的组合物与能够识别所述细胞表面缀合物的所述药剂的结合分子接触；并且
[0732] (c)分离所述组合物的与所述结合分子结合的细胞。
[0733] 156.实施方案154或实施方案155的方法，其中所述结合分子与可检测部分缀合或能够产生可检测的信号。
[0734] 157.实施方案156的方法，其中所述可检测部分包含荧光蛋白。
[0735] 158.实施方案144-157中任一项的方法，其中所述药剂是链霉亲和素结合肽。
[0736] 159.实施方案158的方法，其中所述链霉亲和素结合肽是或包含序列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:8)或Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(SEQ ID
NO:7)。
NO:7)。
[0737] 160.实施方案159的方法，其中所述链霉亲和素结合肽是或包含序列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ
ID NO:17)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-
Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:18)和Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-
(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:19)。
ID NO:17)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-
Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:18)和Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-
(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:19)。
[0738] 161.实施方案144-160中任一项的方法，其中所述结合分子是能够可逆地结合所述药剂和/或能够在竞争物质的存在下被竞争的试剂。
[0739] 162.实施方案161的方法，其中所述试剂是链霉亲和素、链霉亲和素类似物或突变蛋白。
[0740] 163.实施方案162的方法，其中参考在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列中的链霉亲和素中的位置，在与位置44至47对应的序列位置处，所述链霉亲和素类似物或突变蛋白
包含氨基酸序列Val44-Thr45-Ala46-Arg47或Ile44-Gly45-Ala46-Arg47。
包含氨基酸序列Val44-Thr45-Ala46-Arg47或Ile44-Gly45-Ala46-Arg47。
[0741] 164.实施方案162或实施方案163的方法，其中所述链霉亲和素类似物或突变蛋白包含：
[0742] a)在SEQ ID NO:3-6、27和28中任一个中所示的氨基酸序列；
[0743] b)如下氨基酸序列，所述氨基酸序列展现与SEQ ID NO:3-6、27和28中任一个至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或更高序列同一性并且含有与Val44-Thr45-Ala46-Arg47或Ile44-Gly45-
Ala46-Arg47对应的氨基酸序列并且可逆地结合所述药剂；或
97％、98％、99％或更高序列同一性并且含有与Val44-Thr45-Ala46-Arg47或Ile44-Gly45-
Ala46-Arg47对应的氨基酸序列并且可逆地结合所述药剂；或
[0744] c)a)或b)的功能片段，所述功能片段结合所述药剂。
[0745] 165.实施方案163或实施方案164的方法，其中参考在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列中的链霉亲和素中的位置，在与117、120和/或121对应的位置处，所述链霉亲和素类
似物或突变蛋白进一步包含一个或多个氨基酸置换。
似物或突变蛋白进一步包含一个或多个氨基酸置换。
[0746] 166.实施方案165的方法，其中：
[0747] 所述一个或多个氨基酸置换选自Glu117、Asp117、Arg117、Ser120、Ala120、Gly120、Trp121、Tyr121或Phe121；或
[0748] 所述一个或多个氨基酸置换选自Glu117、Gly120或Tyr121中的一个或多个；或
[0749] 所述氨基酸置换选自Glu117、Gly120或Tyr121。
[0750] 167.实施方案162-166中任一项的方法，其中所述链霉亲和素类似物或突变蛋白包含：
[0751] a)在SEQ ID NO:27或28中所示的氨基酸序列；
[0752] b)如下氨基酸序列，所述氨基酸序列展现与SEQ ID NO:27或28至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、
44 45 46 47 117 120 121
99％或更高序列同一性并且含有与Val 、Thr 、Ala 、Arg 、Glu 、Gly 和Tyr 对应的氨
基酸序列并且可逆地结合所述药剂；或
44 45 46 47 117 120 121
99％或更高序列同一性并且含有与Val 、Thr 、Ala 、Arg 、Glu 、Gly 和Tyr 对应的氨
基酸序列并且可逆地结合所述药剂；或
[0753] c)a)或b)的功能片段，所述功能片段结合所述药剂。
[0754] 168.实施方案161-167中任一项的方法，其进一步包括破坏所述结合分子与所述药剂的可逆结合。
[0755] 169.实施方案168的方法，其中所述破坏包括使所述细胞与包含能够逆转所述结合分子与所述药剂之间的键的竞争物质的组合物接触。
[0756] 170.实施方案169的方法，其中所述竞争物质是游离结合配偶体和/或是竞争剂。
[0757] 171.实施方案169或实施方案170的方法，其中所述竞争物质是或包含生物素、生物素类似物或其生物活性片段。
[0758] 172.实施方案144-171中任一项的方法，其中所述结合分子是特异性结合所述药剂的抗体或抗原结合片段。
[0759] 173.实施方案172的方法，其中所述结合分子是抗Strep标签抗体。
[0760] 174.一种分子，其包含与细胞毒性剂缀合的链霉亲和素或链霉亲和素类似物或突变蛋白。
[0761] 175.实施方案174的分子，其包含链霉亲和素类似物或突变蛋白。
[0762] 176.实施方案174或实施方案175的分子，其中所述链霉亲和素或链霉亲和素类似物或突变蛋白与链霉亲和素结合肽结合。
[0763] 177.实施方案176的分子，其中所述链霉亲和素结合肽是或包含序列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:8)或Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(SEQ ID
NO:7)。
NO:7)。
[0764] 178.实施方案176或实施方案177的分子，其中所述链霉亲和素结合肽是或包含序列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-
Glu-Lys((SEQ ID NO:17)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-
Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:18)和Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-
(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:19)。
Glu-Lys((SEQ ID NO:17)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-
Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:18)和Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-
(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:19)。
[0765] 179.实施方案176-178中任一项的分子，其中所述链霉亲和素或链霉亲和素类似物或突变蛋白展现平衡解离常数(KD)为从或从约10-4M至或至约10-10M的对所述链霉亲和素
结合肽的结合亲和力。
结合肽的结合亲和力。
[0766] 180.实施方案174-179中任一项的分子，其中参考在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列中的链霉亲和素中的位置，在与位置44至47对应的序列位置处，所述链霉亲和素类似
物或突变蛋白包含氨基酸序列Val44-Thr45-Ala46-Arg47或Ile44-Gly45-Ala46-Arg47。
物或突变蛋白包含氨基酸序列Val44-Thr45-Ala46-Arg47或Ile44-Gly45-Ala46-Arg47。
[0767] 181.实施方案174-180中任一项的分子，其中所述链霉亲和素类似物或突变蛋白包含：
[0768] a)在SEQ ID NO:3-6、27和28中任一个中所示的氨基酸序列；
[0769] b)如下氨基酸序列，所述氨基酸序列展现与SEQ ID NO:3-6、27和28中任一个至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或更高序列同一性并且含有与Val44-Thr45-Ala46-Arg47或Ile44-Gly45-
Ala46-Arg47对应的氨基酸序列并且可逆地结合所述药剂；或
97％、98％、99％或更高序列同一性并且含有与Val44-Thr45-Ala46-Arg47或Ile44-Gly45-
Ala46-Arg47对应的氨基酸序列并且可逆地结合所述药剂；或
[0770] c)a)或b)的功能片段，所述功能片段结合所述链霉亲和素结合肽。
[0771] 182.实施方案180或实施方案181的分子，其中参考在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列中的在链霉亲和素中的位置，在与117、120和/或121对应的位置处，所述链霉亲和素
类似物或突变蛋白进一步包含一个或多个氨基酸置换。
类似物或突变蛋白进一步包含一个或多个氨基酸置换。
[0772] 183.实施方案182的分子，其中：
[0773] 所述一个或多个氨基酸置换选自Glu117、Asp117、Arg117、Ser120、Ala120、Gly120、Trp121、Tyr121或Phe121；或
[0774] 所述一个或多个氨基酸置换选自Glu117、Gly120或Tyr121中的一个或多个；或
[0775] 所述氨基酸置换选自Glu117、Gly120或Tyr121。
[0776] 184.实施方案174-183中任一项的分子，其中所述链霉亲和素类似物或突变蛋白包含：
[0777] a)在SEQ ID NO:27或28中所示的氨基酸序列；
[0778] b)如下氨基酸序列，所述氨基酸序列展现与SEQ ID NO:27或28至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、
99％或更高序列同一性并且含有与Val44、Thr45、Ala46、Arg47、Glu117、Gly120和Tyr121对应的氨基酸序列并且可逆地结合所述药剂；或
99％或更高序列同一性并且含有与Val44、Thr45、Ala46、Arg47、Glu117、Gly120和Tyr121对应的氨基酸序列并且可逆地结合所述药剂；或
[0779] c)a)或b)的功能片段，所述功能片段可逆地结合所述链霉亲和素结合肽。
[0780] 185.实施方案174-184中任一项的分子，其中所述细胞毒性剂是毒素。
[0781] 186.实施方案185的分子，其中所述毒素是肽毒素、蓖麻毒素A链毒素、相思豆毒素A链、白喉毒素(DT)A链、假单胞菌外毒素、志贺毒素A链、白树毒素、苦瓜毒蛋白(Momordin)、美洲商陆抗病毒蛋白、皂草素、天花粉蛋白或大麦毒素。
[0782] 187.实施方案185的分子，其中所述毒素是光毒素。
[0783] 188.一种杀伤细胞的方法，所述方法包括将实施方案174-187中任一项的分子给予至先前给予过实施方案111-139中任一项的细胞、或实施方案140或实施方案141的组合
物的受试者。
物的受试者。
[0784] 189.实施方案188的方法，其中在所述受试者展现与所给予的细胞相关的毒性结果的时候或在所述受试者展现针对所给予的细胞的可检测的和/或细胞介导的免疫应答的
时候给予所述分子。
时候给予所述分子。
[0785] 190.实施方案189的方法，其中所述毒性结果与神经毒性或细胞因子释放综合征(CRS)相关。
[0786] 本发明不限于本文所公开的实施方案的范围，所述实施方案旨在作为本发明的各个方面的单个说明，并且在功能上等同的任何实施方案都在本发明的范围内。除了本文描
述的那些之外，对本发明的组合物和方法的各种修改对于本领域技术人员而言从前面的描
述和传授中将变得清楚，并且类似地旨在落入本发明的范围内。在不偏离本发明的真实范
围和精神的情况下，可以实施此类修改或其他实施方案。
述的那些之外，对本发明的组合物和方法的各种修改对于本领域技术人员而言从前面的描
述和传授中将变得清楚，并且类似地旨在落入本发明的范围内。在不偏离本发明的真实范
围和精神的情况下，可以实施此类修改或其他实施方案。
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