含RGD的拟肽和其用途
阅读：109发布：2020-09-02
专利汇可以提供含RGD的拟肽和其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供含RGD的环状拟肽；所述拟肽与选自 荧光 探针、 光敏剂 、螯合剂或细胞毒性剂的有效 载荷 部分的结合物；和包含这些结合物的医药组合物。本发明的结合物可用于各种 疾病 、病症和病状的诊断目的和 治疗 。更具体地说，包含荧光探针的结合物可用于诊断目的，例如器官和组织显像和 肿瘤 诊断；包含光敏剂的结合物可用于肿瘤和非肿瘤组织的光动 力 疗法；包含螯合剂的结合物可用于放射成像或放射疗法；且包含细胞毒性剂的结合物可用于靶向型化疗。，下面是含RGD的拟肽和其用途专利的具体信息内容。
1.一种含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）的环状拟肽，其具有通式I：
其中
精氨酸残基通过其α-氨基与骨架C=O连接；
X是-NH-R-、-O-R-或-S-R-，R是衍生自以下的亚烃基：乙烷、乙烯或环丙烷；且A1是侧链具有氨基的氨基酸残基，其通过其α-羧基与骨架NH连接且通过其侧链氨基与天冬氨酸残基的α-羧基连接，所述氨基酸选自二氨基丙酸（Dap）、鸟氨酸（Orn）或赖氨酸(Lys)。
2.根据权利要求1所述的含RGD的环状拟肽，其中:X是-NH-R-、-O-R-或-S-R-，且R是衍生自乙烷的亚烃基。
3.根据权利要求1或2所述的含RGD的环状拟肽，其中：
(i)X是-NH-R-，R是衍生自乙烷的亚烃基，且A1是Dap、Orn或Lys;
(ii)或者X是-O-R-，R是衍生自乙烷的亚烃基，且A1是Dap或Lys。
4.一种根据权利要求1至3中任一权利要求所述的含RGD的环状拟肽和选自荧光探针、光敏剂、螯合剂或细胞毒性剂的有效载荷部分的结合物，所述有效载荷部分任选地通过间隔子与所述拟肽中的氨基酸残基A1的α-氨基连接。
5.根据权利要求4所述的结合物，其中所述间隔子选自天然或非天然氨基酸部分、具有不超过8个氨基酸的小肽部分、二胺残基、C1-C25亚烃基或可溶性聚合物。
6.根据权利要求5所述的结合物，其中所述氨基酸是甘氨酸（Gly）、β-丙氨酸（β-Ala）、苯丙氨酸（Phe）、D-苯丙氨酸（D-Phe）、1-萘基丙氨酸（1-Nal）、D-1-萘基丙氨酸（D-1-Nal）、γ-氨基丁酸（GABA）或3-(氨基甲基)苯甲酸；所述二胺残基是-HN-(CH2)2-NH-或-HN-(CH2)4-NH-；所述C1-C25亚烃基是C1-C10亚烷基或亚苯基，其经2个选自OH、COOH、SO3H、COSH或NH2取代，从而形成醚、酯、酰胺、硫代酰胺或磺酰胺基团的末端官能团；且所述可溶性聚合物选自直链或支链聚乙二醇（PEG）或其共聚物、聚丙交酯（PLA）或其共聚物、具有合适官能团的基于PLA、聚乙交酯（PGA）、聚己内酯（PCL）的聚酯或其共聚物、或基于聚甲基丙烯酰胺的聚酰胺或其共聚物，所述聚合物具有合适官能团。
7.根据权利要求4至6中任一权利要求所述的结合物，其中所述有效载荷是荧光探针；
光敏剂；螯合剂或者细胞毒性剂。
8.根据权利要求7所述的结合物，其中所述荧光探针是细菌脱镁叶绿酸牛磺酸酰胺（BTA）、异硫氰酸芴酯（FITC）、丹磺酰、罗丹明、曙红或赤藓红；所述光敏剂是卟啉、叶绿素或细菌叶绿素；所述螯合剂是DTPA或DOTA；或者所述细胞毒性剂是蒽环类化疗剂，选自多柔比星、道诺霉素、表柔比星、伊达比星或米托蒽醌、有丝分裂抑制剂、拓扑异构酶I抑制剂或拓扑异构酶II抑制剂。
9.根据权利要求8所述的结合物，其中所述光敏剂是叶绿素或细菌叶绿素；所述蒽环类化疗剂是多柔比星；所述有丝分裂抑制剂是紫杉醇；所述拓扑异构酶I抑制剂是喜树碱；
或拓扑异构酶II抑制剂是椭圆玫瑰树碱。
10.根据权利要求4所述的结合物，其中：
(i)所述有效载荷是与A1直接连接的BTA，X是-NH-R-，
R是衍生自乙烷的亚烃基，且A1是Dap、Orn或Lys；
(ii)所述有效载荷是与A1直接连接的丹磺酰，X是-NH-R-，R是衍生自乙烷的亚烃基，且A1是Dap、Orn或Lys；
(iii)所述有效载荷是与A1直接连接的BTA，X是-O-R-，R是衍生自乙烷的亚烃基，且A1是Dap或Lys；
(iv)所述有效载荷是通过间隔子与A1连接的BTA，X是-NH-R-，R是衍生自乙烷的亚烃基，A1是Dap，且所述间隔子是GABA或Phe或1,4-二氨基丁烷的残基；
(v)所述有效载荷是通过间隔子与A1连接的FITC，X是-NH-R-，R是衍生自乙烷的亚烃基，且：
(a)A1是Dap，且所述间隔子是β-Ala部分；或
(b)A1是Lys，且所述间隔子是β-Ala或GABA部分；
(vi)所述有效载荷是通过间隔子与A1连接的丹磺酰，X是-NH-R-，R是衍生自乙烷的亚烃基，A1是Dap或Lys，且所述间隔子是Gly部分；
(vii)所述有效载荷是与A1直接连接的细菌叶绿素衍生物Pd-BTA，X是-NH-R-，R是衍生自乙烷的亚烃基，且A1是Dap；
(viii)所述有效载荷是与A1直接连接的DTPA或DOTA，X是-NH-R-，R是衍生自乙烷的亚烃基，且A1是Dap；
(ix)所述有效载荷是经取代的BTA，其中牛磺酸残基被-NH-(CH2)2-NH2取代，所述经取代的BTA与A1直接连接，X是-NH-R-，R是衍生自乙烷的亚烃基，且A1是Dap或Orn；或(x)所述有效载荷是经取代的BTA，其中牛磺酸残基被-NH-(CH2)2-NH-CH3取代，所述经取代的BTA与A1直接连接，X是-NH-R-，R是衍生自乙烷的亚烃基，且A1是Dap或Orn。
11.一种医药组合物，其包含如权利要求4至10中任一权利要求所定义的结合物或其药学上可接受的盐，和药学上可接受的载剂。
12.根据权利要求11所述的医药组合物，其中所述有效载荷是荧光探针。
13.根据权利要求12所述的医药组合物，其包含结合物，其中
(i)所述有效载荷是与A1直接连接的BTA，X是-NH-R-，R是衍生自乙烷的亚烃基，且A1是Dap、Orn或Lys;
(ii)所述有效载荷是与A1直接连接的丹磺酰，X是-NH-R-，R是衍生自乙烷的亚烃基，且A1是Dap、Orn或Lys;
(iii)所述有效载荷是与A1直接连接的BTA，X是-O-R-，R是衍生自乙烷的亚烃基，且A1是Dap或Lys;
(iv)所述有效载荷是通过间隔子与A1连接的BTA，X是-NH-R-，R是衍生自乙烷的亚烃基，A1是Dap，且所述间隔子是GABA或Phe或1,4-二氨基丁烷的残基;
(v)所述有效载荷是通过间隔子与A1连接的FITC，X是-NH-R-，R是衍生自乙烷的亚烃基，且：
(a)A1是Dap，且所述间隔子是β-Ala部分；或
(b)A1是Lys，且所述间隔子是β-Ala或GABA部分；
(vi)所述有效载荷是通过间隔子与A1连接的丹磺酰，X是-NH-R-，R是衍生自乙烷的亚烃基，A1是Dap或Lys，且所述间隔子是Gly部分。
14.根据权利要求12或13所述的医药组合物，其用于诊断目的。
15.根据权利要求14所述的医药组合物，其中所述诊断目的是用于器官和组织显像或者肿瘤诊断。
16.根据权利要求15所述的医药组合物，其中所述肿瘤诊断利用动态荧光成像、放射诊断技术或分子磁共振成像（MRI）。
17.根据权利要求16所述的医药组合物，其中所述放射诊断技术是正电子发射成像（PET）或单光子发射成像（SPET）。
18.根据权利要求11所述的医药组合物，其中所述有效载荷是光敏剂。
19.根据权利要求18所述的医药组合物，其包含结合物，其中
(i)所述有效载荷是与A1直接连接的细菌叶绿素衍生物Pd-BTA，X是-NH-R-，R是衍生自乙烷的亚烃基，且A1是Dap
(ii)所述有效载荷是经取代的BTA，其中牛磺酸残基被-NH-(CH2)2-NH2取代，所述经取代的BTA与A1直接连接，X是-NH-R-，R是衍生自乙烷的亚烃基，且A1是Dap或Orn；或(iii)所述有效载荷是经取代的BTA，其中牛磺酸残基被-NH-(CH2)2-NH-CH3取代，所述经取代的BTA与A1直接连接，X是-NH-R-，R是衍生自乙烷的亚烃基，且A1是Dap或Orn。
20.根据权利要求18或19所述的医药组合物，其用于光动力疗法（PDT）。
21.根据权利要求20所述的医药组合物，其用于肿瘤或非肿瘤组织的PDT。
22.根据权利要求21所述的医药组合物，其用于黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、脑癌或头颈癌的原发性肿瘤或转移的PDT；或者用于治疗老年性黄斑变性，或用于通过限制对脂肪组织的血管供应来治疗肥胖症。
23.根据权利要求11所述的医药组合物，其中所述有效载荷是螯合剂。
24.根据权利要求23所述的医药组合物，所述组合物包含结合物，其中所述有效载荷是与A1直接连接的DTPA或DOTA，X是-NH-R-，R是衍生自乙烷的亚烃基，且A1是Dap。
25.根据权利要求23或24所述的医药组合物，其用于放射成像或放射疗法中。
26.根据权利要求11所述的医药组合物，其中所述有效载荷是细胞毒性剂。
27.根据权利要求26所述的医药组合物，用于靶向型化疗中。
28.如权利要求4至10中任一权利要求所定义的结合物或其药学上可接受的盐在用于制备用于诊断目的、光动力疗法（PDT）、放射成像或放射疗法或靶向型化疗的医药组合物中的用途。
含RGD的拟肽和其用途
技术领域
[0002] 缩写：AcOH，乙酸；Alloc，烯丙氧基羰基；Bpheide，细菌脱镁叶绿酸；BTA(细菌脱1 1
镁叶绿酸牛磺酸酰胺)，3-氧代-15-甲氧基羰基甲基-红细菌绿素13-(2-磺乙基)酰胺；BTC，双(三氯甲基)碳酸酯；Dab，二氨基丁酸；Dap，二氨基丙酸；DCM，二氯甲烷；Dde，
1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己基)乙基；DIC，二异丙基碳二亚胺；DIEA，二异丙基乙胺；DMBA，二甲基巴比妥酸；DMF，N，N-二甲基甲酰胺；DMSO，二甲亚砜；DOTA，1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸；DTPA，二亚乙基三胺五乙酸；Et2O，乙醚；FITC，异硫氰酸荧光素；Fmoc，芴甲氧羰基；GABA，γ-氨基丁酸；HATU，0-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，
3-四甲基-脲六氟磷酸盐；HOAt，1-羟基-7-氮杂苯并三唑；HOBt，N-羟基苯并三唑；Lys，赖氨酸；MeOH，甲醇；Nal，萘基丙氨酸；Orn，鸟氨酸；Pbf，2，2，4，6，7-五甲基-二氢苯并呋喃-5-磺酰基；PyBOP，苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷基-磷六氟磷酸盐；RP-HPLC，反相高效液相色谱；RT，室温；TFA，三氟乙酸；TFE，三氟乙醇；TIS，三异丙基硅烷。
镁叶绿酸牛磺酸酰胺)，3-氧代-15-甲氧基羰基甲基-红细菌绿素13-(2-磺乙基)酰胺；BTC，双(三氯甲基)碳酸酯；Dab，二氨基丁酸；Dap，二氨基丙酸；DCM，二氯甲烷；Dde，
1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己基)乙基；DIC，二异丙基碳二亚胺；DIEA，二异丙基乙胺；DMBA，二甲基巴比妥酸；DMF，N，N-二甲基甲酰胺；DMSO，二甲亚砜；DOTA，1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸；DTPA，二亚乙基三胺五乙酸；Et2O，乙醚；FITC，异硫氰酸荧光素；Fmoc，芴甲氧羰基；GABA，γ-氨基丁酸；HATU，0-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，
3-四甲基-脲六氟磷酸盐；HOAt，1-羟基-7-氮杂苯并三唑；HOBt，N-羟基苯并三唑；Lys，赖氨酸；MeOH，甲醇；Nal，萘基丙氨酸；Orn，鸟氨酸；Pbf，2，2，4，6，7-五甲基-二氢苯并呋喃-5-磺酰基；PyBOP，苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷基-磷六氟磷酸盐；RP-HPLC，反相高效液相色谱；RT，室温；TFA，三氟乙酸；TFE，三氟乙醇；TIS，三异丙基硅烷。
背景技术
[0003] 例如纤维粘连蛋白(fibronectin)(Pierschbacher和Ruoslahti，1984)和玻璃粘连蛋白(vitronectin)等胞外基质(ECM)组分的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp；RGD)基序可与整合素结合(Ruoslahti和Pierschbacher，1987；D′Souza SE等人，1991；
Joshi等人，1993；Koivunen等人，1994)。由整合素介导的粘附引起调控细胞存活、增殖和迁移的胞内信号传导事件。已知约25种整合素，且其中至少有8种结合作为其配体中主要识别序列的RGD基序。
Joshi等人，1993；Koivunen等人，1994)。由整合素介导的粘附引起调控细胞存活、增殖和迁移的胞内信号传导事件。已知约25种整合素，且其中至少有8种结合作为其配体中主要识别序列的RGD基序。
[0004] 用于筛检含RGD肽的噬菌体展示方法(Pasqualini和Ruoslahti，1996)所获得的数据已经显示所述肽与肿瘤血管内皮层的选择性结合(Ruoslahti，1996；Pasqualini等人，1997)。
[0005] 因为据报道整合素的表达在活化内皮细胞(EC)上很高，但在休眠内皮细胞上比较有限，所以已经提出小型合成含RGD肽作为抑制血管内皮和肿瘤细胞生长的拮抗剂。RGD肽还延迟信号传输，影响细胞迁移并诱导肿瘤细胞衰退或细胞凋亡(Su等人，2002)。RGD类似物用于肿瘤成像(Haubner等人，2001)中、抗血管生成方法(Kawaguchi等人，2001；Pasqualini等人，2000)中以及放射性核素(van Hagen等人，2000)和化疗药物(Arap等人，1998；Zitzmann等人，2002)的肿瘤靶向中。
[0006] 整合素也在癌细胞上表达，且在癌细胞的侵入、转移、增殖和凋亡中起重要作用。肿瘤细胞转移侵入优选器官可能代表着细胞归巢现象(cell-homing phenomena)，其取决于肿瘤细胞与器官特异性内皮标志物之间的粘附相互作用(Ruoslahti和Rajotte，2000)。
通过与内皮或肿瘤细胞的整合素结合，RGD肽能通过抑制转移过程必需的肿瘤细胞-ECM和肿瘤细胞-EC连接来调节体内细胞交通。一些研究已经表明了含RGD的化合物可干扰体外(Goligorsky等人，1998；Romanov和Goligorsky 1999)和体内(Saiki等人，1989；Hardan等人，1993)肿瘤细胞转移过程。
通过与内皮或肿瘤细胞的整合素结合，RGD肽能通过抑制转移过程必需的肿瘤细胞-ECM和肿瘤细胞-EC连接来调节体内细胞交通。一些研究已经表明了含RGD的化合物可干扰体外(Goligorsky等人，1998；Romanov和Goligorsky 1999)和体内(Saiki等人，1989；Hardan等人，1993)肿瘤细胞转移过程。
[0007] 对个别整合素具有特异性的肽受到非常多的关注且在医学上可能很重要。αvβ3整合素是显示与肿瘤血管生成有关的第一种整合素。特异性地阻断αvβ3整合素的RGD肽有希望成为肿瘤和视网膜血管生成的抑制剂、骨质疏松的抑制剂和肿瘤血管系统的靶向药物(Assa-Munt等人，2001)。抗癌药多柔比星(doxorubicin)或促凋亡肽与αvβ3整合素结合RGD肽的偶合会产生在针对小鼠异种移植肿瘤测试时活性大于且毒性小于未经修饰的药物的化合物(Ruoslahti，2000；Arap等人，1998；Arap等人，2002；Ellerby等人，1999)。因此，已经在设计和制造整合素结合肽和拟肽方面进行了大量工作(Haubner等人，
1996；Locardi等人，1999；Lark等人，1999；Raboisson等人，2006；Belvisi等人，2005；
Dijkgraaf等人，2006；Banfi等人，2007；US 5,849,692)。
1996；Locardi等人，1999；Lark等人，1999；Raboisson等人，2006；Belvisi等人，2005；
Dijkgraaf等人，2006；Banfi等人，2007；US 5,849,692)。
[0008] US 6,576,239、EP 0927045和WO 98/010795公开了一种包含含氨基酸序列RGD或NGR的肿瘤归巢肽的结合物，所述肽与治疗或诊断部分连接，前提是所述部分不是噬菌体粒子。治疗部分可以是细胞毒性剂或癌症化疗剂，如多柔比星。结合物在体内给药时选择性地归巢于血管生成性血管系统。肿瘤归巢肽可以是长度长达20或30个氨基酸或50-100* *个氨基酸的线性或环状肽。一种优选的肽是环状九肽CDCRGDCFC或H-Cys-Asp-Cys-Arg-* *
Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-NH2。
Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-NH2。
[0009] WO 2008/023378公开了一种含RGD肽或RGD拟肽与选自卟啉、叶绿素或细菌叶绿素的光敏剂的结合物。
发明内容
[0010] 在一方面，本发明涉及含RGD的环状拟肽，其具有通式I：
[0011]
[0012] 其中
[0013] 精氨酸残基通过其α-氨基与骨架C＝O连接；
[0014] X是-NH-、-NH-R-、-O-R-、-S-或-S-R-，R是衍生自以下基团的亚烃基：C1-C6烷烃、C2-C6烯烃、C2-C6炔烃、C3-C10环烷烃、C3-C10环烯烃、C6-C14单环或多环芳香族烃、或经一个或两个C1-C2烷基、C2烯基或C2炔基取代的C6-C14单环或多环芳香族烃，或R与其连接的氮原子一起形成5或6元饱和或不饱和杂环，所述杂环任选地含有1-2个选自氧、氮或硫的其它杂原子；且
[0015] A1是侧链具有氨基或羧基的天然或非天然氨基酸残基，其通过其α-或侧链羧基与骨架NH连接且通过其α-或侧链氨基与天冬氨酸残基的α-羧基连接，
[0016] 或具有通式II：
[0017]
[0018] 其中
[0019] A1是侧链具有氨基或羧基的天然或非天然氨基酸残基，其通过其α-或侧链羧基与精氨酸残基的α-氨基连接且通过其α-或侧链氨基与骨架C＝O连接；
[0020] A2是天然或非天然氨基酸残基，其通过其α-氨基与骨架C＝O连接且通过其α-羧基与A3的α-或侧链氨基连接；且
[0021] A3是侧链具有氨基且C端经酰胺化的天然或非天然氨基酸残基，其通过其α-或侧链氨基中的一个与A2的羧基连接且通过其α-或侧链氨基中的另一个与天冬氨酸残基的α-羧基连接。
[0022] 在另一方面，本发明涉及如上定义的含RGD的环状拟肽和选自荧光探针、光敏剂、螯合剂或细胞毒性剂的有效载荷部分的结合物，所述有效载荷部分与拟肽中的氨基酸残基A1连接，前提是当A1具有侧链氨基时，所述有效载荷部分任选地通过间隔子与A1的α-或侧链氨基连接，且当A1是二羧酸氨基酸残基时，所述有效载荷部分任选地通过间隔子与A1的α-或侧链羧基连接。
[0023] 在另一方面，本发明提供医药组合物，其包含如上定义的含RGD的环状拟肽和有效载荷部分的结合物或其药学上可接受的盐，和药学上可接受的载剂。
[0024] 本发明的医药组合物可用于各种目的，例如(i)当有效载荷是荧光探针时，用于诊断目的，尤其用于器官和组织显像和用于肿瘤诊断；(ii)当有效载荷是光敏剂时，用于光动力疗法(PDT)，尤其用于肿瘤或非肿瘤组织的PDT；(iii)当有效载荷是螯合剂时，用于放射成像或放射疗法；和(iv)当有效载荷是细胞毒性剂时，用于靶向型化疗。
[0025] 在另一方面，本发明因此涉及如上定义的含RGD的环状拟肽和有效载荷部分的结合物或其药学上可接受的盐的用途，其用于制备用于诊断目的、光动力疗法(PDT)、放射成像或放射疗法或靶向型化疗的医药组合物。
[0027] 图1A-1C显 示CD-1裸 小 鼠 乳 房 垫 (mammary pad)的 原 位 人 类 乳 腺MDA-MB-231-RFP原发性大肿瘤中结合物1、4和41的积累模式(分别是1A、1B和1C)。如材料和方法章节中所述来处理小鼠，并使用Xenograph IVIS 系统从第1天至第7天监测2
肿瘤细胞和结合物的荧光(色标以光子单位/sec/cm/立体弧度计算)。上图显示肿瘤所产生的荧光信号(红色荧光成像)，且下图显示结合物所产生的荧光信号(近红外荧光成像)。肿瘤所产生的信号与结合物所产生的信号的匹配表明结合物在肿瘤中积累。
肿瘤细胞和结合物的荧光(色标以光子单位/sec/cm/立体弧度计算)。上图显示肿瘤所产生的荧光信号(红色荧光成像)，且下图显示结合物所产生的荧光信号(近红外荧光成像)。肿瘤所产生的信号与结合物所产生的信号的匹配表明结合物在肿瘤中积累。
[0028] 图2A-2C显示乳腺癌肿瘤的坏死区域中结合物1、4和41的积累(分别是2A、2B和2C)。如材料和方法章节中所述来处理小鼠，并使用Xenograph IVIS 系统在注射后6天时监测荧光(色标以光子单位/sec/cm2/立体弧度计算)。如显示的，肿瘤中央部分中的坏死区域消除红色荧光(左图)，但显示结合物的积聚(右图)。
[0029] 图3A-3C显示与MLS卵巢肿瘤相比，LNCaP前列腺癌肿瘤中结合物1、4和41的积累(分别是3A、3B和3C)。如材料和方法章节中所述来处理小鼠，并使用Xenograph IVIS系统在注射后的某些时间点(对于结合物1，8、11、14、24和48小时；对于结合物4，8、14、24和48小时；和对于结合物41，8、12和24小时)监测植入的肿瘤中结合物的积累。结合物在前列腺(上图)和卵巢(下图)肿瘤中的积累概况几乎相同，其中在两种情况下，在注射后8-11(结合物1)、8-14(结合物4)或8-12(结合物41)小时时观测到最高的荧光水平，且结合物1和4在肿瘤中停留长达48小时，或结合物41在肿瘤中停留长达24小时。左上照片中的箭头指示前列腺肿瘤的位置。每组图中的右侧照片显示在注射后14小时时的被激发器官，其中在肝和肾中观测到高荧光水平，表明结合物经由这些器官清除。
具体实施方式
[0030] 在一方面，本发明提供如上定义的新颖的含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp；RGD)的环状拟肽，其是αvβ3和αvβ5整合素配体。
[0031] 本文中互换使用的术语“含RGD的环状拟肽”、“环状拟肽”和“αvβ3和αvβ5整合素配体”是指含RGD序列(也称为RGD基序)的环状非肽化合物，其模拟具有RGD基序的肽。本发明的环状拟肽可以是如上定义的具有通式I或通式II的任何环状化合物。
[0032] 如下文方案1中详细显示，通式I的含RGD的环状拟肽是含RGD基序的环状化合物，其中二羧酸氨基酸或具有侧链氨基的氨基酸的残基(A1)在一侧通过酰胺键与RGD基序中的天冬氨酸残基的α-羧基连接，且在另一侧与骨架NH连接，且所述骨架NH通过各种可能的桥接单元与RGD基序中的精氨酸残基的α-氨基连接。如进一步显示，通式II的含RGD的环状拟肽是含RGD基序的环状化合物，其中二羧酸氨基酸或具有侧链氨基的氨基酸的残基(A1)在一侧通过酰胺键与RGD基序中的精氨酸残基的α-氨基连接，且在另一侧通过其氨基与骨架C＝O连接，其中骨架C＝O与另一个氨基酸残基(A2)的α-氨基连接，A2通过酰胺键与具有侧链氨基且在C端经酰胺化的另一个氨基酸残基(A3)连接，A3通过酰胺键与RGD基序中的天冬氨酸残基的α-羧基连接。
[0033] 术语“亚烃基”是指只含有碳和氢原子的二价基团，其可以是饱和或不饱和、直链或支链、环状或非环状、或芳香族，可衍生自C1-C6烷烃、C2-C6烯烃、C2-C6炔烃、C3-C10环烷烃、C3-C10环烯烃、C6-C14单环或多环芳香族烃、或经一个或两个C1-C2烷基、C2烯基或C2炔基取代的C6-C14单环或多环芳香族烃。
[0034] 方案1：通式I(左边)和II(右边)的环状拟肽的详细结构
[0035]
[0036] 术语“C1-C6烷烃”典型地意谓具有1-6个碳原子的直链或支链烃，且包括例如甲烷、乙烷、正丙烷、异丙烷、正丁烷、异丁烷、正庚烷、2，2-二甲基丙烷、正己烷等。优选C1-C4烷烃，更优选乙烷。术语“C2-C6烯烃”和“C2-C6炔烃”典型地意谓分别具有2-6个碳原子和1个双键或三键的直链和支链烃，且包括乙烯、3-丁烯、2-乙烯基丁烯等，和丙炔、2-丁炔、
3-戊炔等。术语“C3-C10环烷烃”意谓环状或双环烃，例如环丙烷、环丁烷、环戊烷、环己烷等，且术语“C6-C14单环或多环芳香族烃”表示碳环芳香族分子，例如苯、萘和蒽。
3-戊炔等。术语“C3-C10环烷烃”意谓环状或双环烃，例如环丙烷、环丁烷、环戊烷、环己烷等，且术语“C6-C14单环或多环芳香族烃”表示碳环芳香族分子，例如苯、萘和蒽。
[0037] 在基团NHR中，R是如上定义的亚烃基，或R与其连接的氮原子一起形成饱和(优选5或6元)杂环，其任选地含有1或2个选自氧、氮或硫的其它杂原子。所述环可经取代，例如经1或2个C1-C6烷基取代，或在环的第二氮原子上(例如在哌嗪环中)经1个烷基或羟烷基取代。
[0038] 术语“氨基酸”是指呈L和D立体异构体形式的天然和非天然氨基酸，且尤其包括具有侧链氨基的氨基酸以及二羧酸氨基酸。具有侧链氨基的氨基酸的非限制性实例包括赖氨酸(Lys)、二氨基丙酸(Dap)、二氨基丁酸(Dab)和鸟氨酸(Orn)，且二羧酸的实例包括(不限于)谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)和氨基己二酸。
[0039] 在一个实施方案中，本发明的含RGD的环状拟肽是通式I的环状化合物，其中X是-NH-或-NH-R-，即与精氨酸残基的α-氨基形成脲部分，且R是衍生自直链C2-C6烷烃、C2-C6烯烃或C2-C6炔烃、优选衍生自C2-C4烷烃、C2-C4烯烃或C2-C4炔烃、更优选衍生自乙烷的亚烃基。
[0040] 在另一个实施方案中，本发明的含RGD的环状拟肽是通式I的环状化合物，其中X是-NH-R-且R是衍生自经2个C1-C2烷基取代的C6-C14单环或多环芳香族烃的亚烃基，优选1，3-二甲基苯-1，3-二基，即通过甲基连接的间二甲苯。
[0041] 在另一个实施方案中，本发明的含RGD的环状拟肽是通式I的环状化合物，其中X是-NH-R-且R与其连接的氮原子一起形成5或6元饱和或不饱和杂环，优选哌啶-1，4-二基，即通过1和4位连接的哌啶。
[0042] 在另一个实施方案中，本发明的含RGD的环状拟肽是通式I的环状化合物，其中X是-O-R-，即与精氨酸残基的α-氨基形成氨基甲酸酯部分，且R是衍生自直链C2-C6烷烃、C2-C6烯烃或C2-C6炔烃、优选衍生自C2-C4烷烃、C2-C4烯烃或C2-C4炔烃、更优选衍生自乙烷的亚烃基。
[0043] 在另一个实施方案中，本发明的含RGD的环状拟肽是通式I的环状化合物，其中X是-S-或-S-R-，即与精氨酸残基的α-氨基形成硫代甲胺(carbamothio)部分，且R是衍生自直链C2-C6烷烃、C2-C6烯烃或C2-C6炔烃、优选衍生自C2-C4烷烃、C2-C4烯烃或C2-C4炔烃、更优选衍生自乙烷的亚烃基。
[0044] 在另一个实施方案中，本发明的含RGD的环状拟肽是通式II的环状化合物，其中A1是具有侧链氨基的氨基酸残基，例如Lys、Dap、Dab和Orn，优选Lys，或二羧酸氨基酸残基，例如Glu、Asp和氨基己二酸。
[0045] 在另一个实施方案中，本发明的含RGD的环状拟肽是通式II的环状化合物，其中A2是例如苯丙氨酸(Phe)、D-苯丙氨酸(D-Phe)、缬氨酸(Val)、Gly和Asp等氨基酸残基。
[0046] 在另一个实施方案中，本发明的含RGD的环状拟肽是通式II的环状化合物，其中A3是在C端经酰胺化的具有侧链氨基的氨基酸残基，例如Lys、Dap、Dab和Orn。
[0047] 本发明的含RGD的环状拟肽可通过所属领域中已知的任何方法，例如如下文材料和方法章节中所述来制备。
[0048] 在一个优选实施方案中，本发明的含RGD的环状拟肽是通式I的环状化合物，其中X是-NH-且A1是Dap。
[0049] 在其它优选实施方案中，本发明的含RGD的环状拟肽是通式I的环状化合物，其中X是-NH-R-，R是衍生自乙烷的亚烃基，且A1是Dap、Dab、Orn或Lys。
[0050] 在其它优选实施方案中，本发明的含RGD的环状拟肽是通式I的环状化合物，其中X是-NH-R-，R是衍生自丙烷、正丁烷或正己烷的亚烃基，且A1是Orn。
[0051] 在其它优选实施方案中，本发明的含RGD的环状拟肽是通式I的环状化合物，其中X是-O-R-，R是衍生自乙烷的亚烃基，且A1是Dap或Lys。
[0052] 在其它优选实施方案中，本发明的含RGD的环状拟肽是通式II的环状化合物，其中A1是Lys，A2是Phe、Val、D-Phe或Asp，且A3是在C端经酰胺化的Dap。
[0053] 在其它优选实施方案中，本发明的含RGD的环状拟肽是通式II的环状化合物，其中A1是Lys，A2是Phe，且A3是在C端经酰胺化的Dab、Orn或Lys。
[0054] 本发明的αvβ3和αvβ5整合素配体在表达αvβ3和αvβ5的肿瘤(例如卵巢癌、结肠癌、乳腺癌和前列腺癌)中积累，且因此可通过与各种“有效载荷”部分结合而用于诊断和治疗方法中。
[0055] 在另一方面，本发明因此涉及如上定义的含RGD的环状拟肽(即通式I或II的环状拟肽)和选自荧光探针、光敏剂、螯合剂或细胞毒性剂的有效载荷部分的结合物，所述有效载荷部分与拟肽中的氨基酸残基A1连接，前提是当A1具有侧链氨基时，所述有效载荷部分任选地通过间隔子与A1的α-或侧链氨基连接，且当A1是二羧酸氨基酸残基时，所述有效载荷部分任选地通过间隔子与A1的α-或侧链羧基连接。
[0056] 在一个实施方案中，结合物的有效载荷部分与环状拟肽的氨基酸残基A1直接连接。
[0057] 在另一个实施方案中，有效载荷部分通过间隔子与环状拟肽的氨基酸残基A1连接。
[0058] 连接有效载荷部分与本发明的环状拟肽中的氨基酸残基A1的间隔子可选自天然或非天然氨基酸部分、具有不超过8个氨基酸的小肽部分、二胺残基、C1-C25亚烃基或可溶性聚合物。
[0059] 在一个实施方案中，间隔子是天然或非天然氨基酸部分，例如(不限于)Gly、β-丙氨酸(β-Ala)、Phe、D-Phe、1-萘基丙氨酸(1-Nal)、D-1-萘基丙氨酸(D-1-Nal)、γ-氨基丁酸(GABA)和3-(氨基甲基)苯甲酸。在环状拟肽的A1是具有侧链氨基的氨基酸残基的情况下，这些间隔子通过其α-羧基与A1的α-或侧链氨基连接且通过其α-氨基与有效载荷的羧基连接。或者，在A1是二羧酸氨基酸残基的情况下，间隔子通过其α-氨基与A1的α-或侧链羧基连接且通过其α-羧基与有效载荷的氨基连接。
[0060] 在另一个实施方案中，间隔子是具有不超过8个氨基酸的小肽部分。在环状拟肽的A1是具有侧链氨基的氨基酸残基的情况下，这些间隔子通过其C端羧基与A1的α-或侧链氨基连接且通过其N端氨基与有效载荷的羧基连接。或者，在A1是二羧酸氨基酸残基的情况下，间隔子通过其N端氨基与A1的α-或侧链羧基连接且通过其C端羧基与有效载荷的氨基连接。
[0061] 在另一个实施方案中，间隔子是通式-HN-R’-NH-的二胺残基，其中R’不存在或是只含有碳和氢原子的二价基团，其可以是饱和或不饱和、直链或支链、环状或非环状、或芳香族，可衍生自C1-C12烷烃、C2-C12烯烃、C2-C12炔烃、C3-C10环烷烃、C3-C10环烯烃、C6-C14单环或多环芳香族烃、或经一个或两个C1-C2烷基、C2烯基或C2炔基取代的C6-C14单环或多环芳香族烃。可衍生所述残基的二胺的非限制性实例包括肼、1，2-乙二胺、1，3-丙二胺、1，4-二氨基丁烷、1，5-二氨基戊烷、1，6-二氨基己烷、1，7-二氨基庚烷、1，8-二氨基辛烷、1，
9-二氨基壬烷、1，10-二氨基癸烷、1，11-二氨基十一烷、1，12-二氨基十二烷、对苯二胺、环戊烷1，3-二胺、环己烷1，4-二胺、环庚烷1，4-二胺、环辛烷1，5-二胺、萘-2，6-二胺和
9H-芴-3-6-二胺。
9-二氨基壬烷、1，10-二氨基癸烷、1，11-二氨基十一烷、1，12-二氨基十二烷、对苯二胺、环戊烷1，3-二胺、环己烷1，4-二胺、环庚烷1，4-二胺、环辛烷1，5-二胺、萘-2，6-二胺和
9H-芴-3-6-二胺。
[0062] 在另一个实施方案中，间隔子是经两个末端官能团取代的C1-C25亚烃基，优选C1-C10亚烷基或亚苯基，所述间隔子通过所述末端官能团在一端与环状拟肽的氨基酸A1的α-或侧链氨基或羧基结合，且在另一端与有效载荷部分结合。所述末端官能团可选自OH、COOH、SO3H、COSH或NH2，从而形成醚、酯、酰胺、脲、硫代酰胺或磺酰胺基团。
[0063] 在另一个实施方案中，间隔子是可溶性聚合物，例如(不限于)直链或支链聚乙二醇(PEG)或其共聚物、聚丙交酯(PLA)或其共聚物、具有合适官能团的基于PLA、聚乙交酯(PGA)、聚己内酯(PCL)的聚酯或其共聚物、或基于聚甲基丙烯酰胺的聚酰胺或其共聚物，所述聚合物具有用于与环状拟肽的氨基酸残基A1和有效载荷部分连接的合适官能团，所述官能团是例如羟基、氨基、羧基、巯基、磺酸基等。
[0064] 下文实施例1描述本文以粗体阿拉伯数字1-36标识的各种结合物的合成，其中不同的通式I的αvβ3和αvβ5整合素配体与以下物质直接连接或通过间隔子连接：荧光探针，尤其BTA、FITC或丹磺酰；细菌叶绿素衍生物，尤其Pd-BTA；或螯合剂，尤其DTPA或DOTA。制备的结合物以及其结构特征的清单总结于表1中。实施例2描述本文以粗体阿拉伯数字41-48标识的各种结合物的合成，其中不同的通式II的αvβ3和αvβ5整合素配体与作为模型有效载荷的荧光探针BTA部分直接连接。制备的结合物以及其结构特征的清单总结于表2中。与环状拟肽连接的所用各种有效载荷部分的化学结构描绘于方案2中。
[0065] 使用体外整合素结合分析和体内卵巢癌模型来测试结合物1-36与MLS人类卵巢癌细胞的结合。另外也在体内和体外测试这些结合物中的一些与HT29人类结肠癌细胞的结合，并在体外和体内另外测试结合物1和4与LNCaP前列腺癌细胞的结合。使用体外整合素结合分析来测试结合物41-48与MLS人类卵巢癌细胞的结合，并使用体内卵巢癌模型来测试活性结合物。在体内和体外测试结合物41和42与HT29人类结肠癌细胞的结合，并在体外和体内另外测试结合物41与LNCaP前列腺癌细胞的结合。
[0066] 当筛检基于通式I的含RGD的环状拟肽的不同结合物的生物活性时，已经发现了环状拟肽的某些结构特征(即环状化合物的环大小，和一些环状化合物中存在的二胺残基的大小和结构，以及连接环状化合物和有效载荷部分的间隔子)可影响如下文所述的结合物的生物活性。
[0067] 以下实施例3显示各种荧光探针-结合物的生物活性，所述结合物包含具有不同环大小的通式I的环状拟肽。环状拟肽的环大小可通过改变环状化合物的两个结构参数来改变，特定地说，(i)通过α-或侧链羧基与骨架NH连接且通过α-或侧链氨基与天冬氨酸残基的α-羧基连接的氨基酸残基，即通式I中的A1；和(ii)桥接骨架羰基和骨架NH的基团，即通式I中的基团X。所用的特定氨基酸残基A1是在侧链中分别具有1到4个亚甲基单元的Dap、Dab、Orn或Lys残基，且所用的不同基团X是-NH-、-NH(CH2)2-4-和-NH(CH2)6-，其与骨架NH一起形成肼或特定烷基二胺的部分。如特定显示，测试的结合物的生物活性随环状拟肽的环大小从16个原子增至19-20个原子而增加，然而，所述活性随环大小的进一步增加却降低。这些结果表明，虽然桥接精氨酸残基的α-氨基和基团X的脲键使环状化合物的刚性更强，但具有多达19-20个原子的较大环的挠性更好，以便采用便于结合整合素的期望构形。另一方面，在环状拟肽的环大小高于20个原子的情况下，环状化合物可能无法采用便于结合整合素的期望构形。
[0068] 实施例4显示包含通式I的环状拟肽的各种BTA-结合物的生物活性，所述环状拟肽具有通过酰胺键与氨基酸残基A1的α-或侧链羧基连接且通过骨架C＝O与精氨酸残基的α-氨基连接的不同二胺残基。在测试的特定结合物中，氨基酸残基A1是Orn，BTA部分与拟肽环的N端直接连接，且命名为X的基团是式-NH(CH2)2-4-、1，3-二甲基苯-1，3-二基或哌啶-1，4-二基的基团。如特定显示，其中烷基二胺残基桥接A1和骨架C＝O的结合物的生物活性随烷基链长度的增加而降低。此外，在命名为X的基团衍生自间二甲苯或哌啶的情况下，没有测量到生物活性，表明所述结合物中的拟肽环是刚性的且采用不能与整合素相互作用的构形。
[0069] 实施例5显示包含通式I的环状拟肽的各种荧光探针-结合物的生物活性，所述环状拟肽具有连接环状拟肽N端和荧光探针部分的不同间隔子。所用的特定间隔子是不同的天然或非天然氨基酸、尤其Gly、β-Ala、Phe、D-Phe、1-Nal、D-1-Nal、GABA和3-(氨基甲基)苯甲酸的部分，或不同二胺、尤其1，2-乙二胺和1，4-二氨基丁烷的残基。如显示的，其中荧光探针部分与环状拟肽直接连接的BTA结合物显示高生物活性，这很可能是因为BTA部分不干扰环状化合物与整合素的结合。与此相反，使用Gly或β-Ala部分作为间隔子从而导致环状拟肽与BTA部分之间的距离增大的结合物显示较低活性，这很可能是因为BTA部分很庞大。有趣的是，当使用GABA部分作为间隔子进一步增大环状拟肽与BTA部分之间的距离时，结合物的生物活性高于使用Gly或β-Ala部分作为间隔子的结合物，可能表明GABA的长度足以为环状拟肽与整合素结合提供更大自由度，然而，却不会引起BTA部分在拟肽环上折叠。在使用小于BTA的FITC和丹磺酰的情况下，荧光探针部分与环状拟肽N端之间的距离对于结合物的生物活性无影响。如进一步显示，使用Phe、1-Nal、D-Phe或D-1-Nal部分作为间隔子的BTA-结合物比使用Gly部分的对应结合物更具活性，这很可能是因为苯丙氨酸或萘基丙氨酸的芳香族侧链提供与整合素疏水性口袋的相互作用。值得注意的是，使用D-Phe部分作为间隔子的结合物的生物活性高于使用Phe或1-Nal部分的结合物，表明D构形可能比L构形更好地配合整合素的疏水性口袋。D-1-Nal的反应性比D-Phe低，表明苯环比萘基更好地配合疏水性口袋。应注意其中分别使用1，2-乙二胺或1，4-二氨基丁烷残基作为间隔子且在环状拟肽与间隔子之间形成脲键的结合物32和33具有类似于结合物10和11的生物活性，表明脲键具有与酰胺键几乎相同的活性且不会影响拟肽的构形。与结合物32相比，结合物33的强生物活性可能是因为拟肽环与有效载荷部分之间的四个亚甲基单元的距离为拟肽环与整合素结合位点的相互作用提供更大自由度。
[0070] 另一方面，实施例6显示包含通式I的环状拟肽的BTA-结合物(其中与精氨酸残基的α-氨基形成脲部分)具有与对应结合物(其中形成氨基甲酸酯部分)类似的生物活性，表明与精氨酸残基的α-氨基形成的部分的性质对结合物的生物活性无影响。
[0071] 实施例7描述本文标识为阿拉伯数字37-40的四种未经金属化的细菌叶绿素衍生物-结合物的合成，所述结合物由不同的通式I的αvβ3和αvβ5整合素配体直接连接于其中牛磺酸由不同亲核基团取代的BTA衍生物部分而组成。如显示的，使用体外整合素结合分析测量到，这些结合物的生物活性类似，表明在这些情况下，氨基对生物活性无影响且其表现与牛磺酸中的磺酸根几乎相同。
[0072] 当筛检基于通式II的含RGD的环状拟肽的不同结合物的生物活性时，已经发现了环状拟肽的某些结构特征(即环状化合物的环大小，和氨基酸残基A2的特征)可影响如下文所述的结合物的生物活性。
[0073] 以下实施例8-9显示各种BTA-结合物的生物活性，所述结合物包含具有不同环大小的通式II的环状拟肽。环状拟肽的环大小可通过改变环状化合物的两个结构参数来改变，特定地说，(i)与天冬氨酸残基的α-羧基连接且与A2的羧基连接的氨基酸残基，即氨基酸残基A3；和(ii)通过α-氨基与骨架C＝O连接且通过α-羧基与氨基酸残基A3连接的氨基酸残基，即氨基酸残基A2。为了研究A3对结合物活性的影响，测试具有相同氨基酸残基A1和A2但具有不同氨基酸残基A3(尤其是在侧链中分别具有1到4个亚甲基单元的Dap、Dab、Orn和Lys)的BTA-结合物。类似地，为了研究A2对结合物活性的影响，测试具有相同氨基酸残基A1和A3但具有不同氨基酸残基A2(尤其是Phe、Val、D-Phe、Gly和Asp)的BTA-结合物。如实施例8所示，测试的结合物的生物活性随环状拟肽的环大小从20个原子增至23个原子而降低，表明最佳环大小是20个原子且更大的环大小无法配合整合素的结合位点。实施例9显示具有疏水性氨基酸残基A2的结合物的生物活性高于极性更高的结合物，这很可能是因为与整合素结合位点中的疏水性口袋的疏水性相互作用，且进一步暗示D构形无法完全配合疏水性口袋。
[0074] 使用体外分析，实施例10显示本发明的某些结合物与人类αvβ5整合素的竞争结合水平，且明确地证实具有数量上相同的体外结合的结合物1、4、7、28和41比结合物5和11的活性更高。
[0075] 实施例11描述从注射后第1天到第7天监测大乳腺癌肿瘤中的结合物1、4和41的积累模式的研究。如显示的，这些结合物在肿瘤坏死区域积累，表明本发明的结合物可用于诊断用途，这是因为坏死核心的检测是各种癌症(例如乳腺癌)中的重要预后标志，且肿瘤边缘的检测对于肿瘤的完全去除至关重要。
[0076] 实施例12描述在注射后长达2天内监测表达αvβ3整合素的前列腺癌细胞中的结合物1、4和41的积累模式的研究。如显示的，在注射后8到11-14小时在肿瘤区域中观察到最高的荧光水平，结合物1和4在肿瘤中停留长达48小时，而结合物41在肿瘤中停留长达24小时。如进一步显示，这些结合物在前列腺和卵巢肿瘤中的积累概况几乎相同。
[0077] 实施例13描述结合物1、4和41的毒性研究，显示在以50mg/kg的剂量注射所述结合物后第5天，在肝脏或肾脏中未观察到坏死或炎症迹象，暗示这些结合物在测试的剂量下无毒。
[0078] 鉴于所有上述内容，在一个实施方案中，本发明的结合物的有效载荷部分是荧光探针部分，例如(不限于)BTA、FITC、丹磺酰、罗丹明(rhodamine)、曙红(eosin)和赤藓红(erythrosine)。
[0079] 在一个优选实施方案中，本发明的结合物是通式I的含RGD的环状拟肽与荧光探针部分的结合物，其中所述荧光探针是与氨基酸残基A1直接(即无间隔子)连接的BTA，X是-NH-且A1是Dap(本文标识为结合物2)。
[0080] 在其它优选实施方案中，本发明的结合物是通式I的含RGD的环状拟肽与荧光探针部分的结合物，其中所述荧光探针是与A1直接连接的BTA，X是-NH-R-，且(i)R是衍生自乙烷的亚烃基，且A1是通过α-或侧链氨基与BTA连接的Dap、Dab、Orn或Lys(本文分别标识为结合物1、3、4、5和6)；(ii)R是衍生自丙烷、正丁烷或正己烷的亚烃基，且A1是Orn(本文分别标识为结合物24、25和26)；或(iii)R是1，3-二甲基苯-1，3-二基或哌啶-1，4-二基，且A1是Orn(本文分别标识为结合物15和23)。
[0081] 在其它优选实施方案中，本发明的结合物是通式I的含RGD的环状拟肽与荧光探针部分的结合物，其中所述荧光探针是与A1直接连接的丹磺酰，X是-NH-R-，且(i)R是衍生自乙烷的亚烃基，且A1是Dap、Orn或Lys(本文分别标识为结合物19、18和16)；或(ii)R是衍生自正丁烷的亚烃基，且A1是Orn(本文标识为结合物21)。
[0082] 在其它优选实施方案中，本发明的结合物是通式I的含RGD的环状拟肽与荧光探针部分的结合物，其中所述荧光探针是与A1直接连接的BTA，X是-O-R-，R是衍生自乙烷的亚烃基，且A1是Dap或Lys(本文分别标识为结合物7和8)。
[0083] 在其它优选实施方案中，本发明的结合物是通式I的含RGD的环状拟肽与荧光探针部分的结合物，其中所述荧光探针是通过间隔子与A1连接的BTA，X是-NH-R-，R是衍生自乙烷的亚烃基，A1是Dap，且间隔子是Gly、β-Ala、GABA、Phe、D-Phe、1-Nal、D-1-Nal或3-(氨基甲基)苯甲酸部分，或1，2-乙二胺或1，4-二氨基丁烷残基(本文分别标识为结合物9、10、11、27、28、29、30、31、32和33)。
[0084] 在其它优选实施方案中，本发明的结合物是通式I的含RGD的环状拟肽与荧光探针部分的结合物，其中所述荧光探针是通过间隔子与A1连接的FITC，X是-NH-R-，R是衍生自乙烷的亚烃基，且(i)A1是Dap，且间隔子是β-Ala部分(本文标识为结合物12)；或(ii)A1是Lys，且间隔子是β-Ala或GABA部分(本文分别标识为结合物13和14)。
[0085] 在其它优选实施方案中，本发明的结合物是通式I的含RGD的环状拟肽与荧光探针部分的结合物，其中所述荧光探针是通过间隔子与A1连接的丹磺酰，X是-NH-R-，且(i)R是衍生自乙烷的亚烃基，A1是Dap或Lys，且间隔子是Gly部分(本文分别标识为结合物20和17)；或(ii)R是衍生自正丁烷的亚烃基，A1是Orn，且间隔子是β-Ala部分(本文标识为结合物22)。
[0086] 在其它优选实施方案中，本发明的结合物是通式II的含RGD的环状拟肽与荧光探针部分的结合物，其中所述荧光探针是与A1直接连接的BTA，A1是Lys，A2是Phe、Val、D-Phe、Gly或Asp，且A3是在C端经酰胺化的Dap(本文分别标识为结合物41、42、43、44和45)。
[0087] 在其它优选实施方案中，本发明的结合物是通式II的含RGD的环状拟肽与荧光探针部分的结合物，其中所述荧光探针是与A1直接连接的BTA，A1是Lys，A2是Phe，且A3是在C端经酰胺化的Dab、Orn或Lys(本文分别标识为结合物46、47和48)。
[0088] 光动力疗法(PDT)是肿瘤的非手术治疗，其中与光一同施用被称为光敏剂的无毒药物以便当场产生细胞毒性活性氧物质，其可使细胞失活。与常用化疗或放射疗法相比，作为二元治疗模态的PDT允许更大的特异性且具有选择性更高但破坏性更低的潜力。
[0089] 卟啉已经用作临床上的主要光敏剂。光对组织的最佳穿透明显发生在650-800nm之间。卟吩姆钠(Porfimer sodium)(Photofrin Axcan Pharma Inc.)是通过用酸处理而从血卟啉-IX(hematoporphyrin-IX)获得的单体、二聚体和更高级寡聚物的复杂且不可分离的混合物，其已经通过FDA批准用于治疗食道和支气管内非小细胞肺癌。
[0090] 由于叶绿素和细菌叶绿素衍生物在有利光谱区(650-850nm)中被强烈吸收且在治疗后容易降解，因此它们已被确认为肿瘤PDT的极佳敏化剂，且与卟啉相比具有更佳特性。特定地说，细菌叶绿素与叶绿素相比具有潜在优势，这是因为其显示密集近红外波段，即比叶绿素衍生物长得多的波长。
[0091] 用于破坏肿瘤血管系统而不是肿瘤细胞本身的靶向光动力试剂可提供治疗优势，这是因为肿瘤细胞生长和发育决定性地依赖于连续的氧和养分供应。此外，预期以肿瘤血管内皮细胞(EC)层为目标可避免治疗大分子对肿瘤基质的不良渗透。虽然肿瘤血管可能受肿瘤微环境影响并获得肿瘤相关“标志”，但其不是恶性的且不太可能发展耐药性。此外，当靶向型抗血管剂对肿瘤细胞也具有活性时，可预期额外功效收益。因此，通过在一种药物中组合抗血管性质与抗肿瘤细胞毒性活性，预期其功效可增加且必需的有效细胞毒性剂量因此可降低。
[0092] 选择性血管靶向可依赖于肿瘤和正常血管对治疗剂的差别敏感性和随之发生的反应。或者，差别内吞作用可促进细胞毒性剂或其它治疗剂的选择性吸收。在与例如肿瘤相关的血管生成血管内皮细胞的典型表达模式中已经鉴别了整合素αvβ3、αvβ5和α5β1。
[0093] 已经利用不同的策略来实现此目标。靶向血管系统中的特定位点的循环肽、拟肽或抗体作为治疗剂和诊断剂的载体很有吸引力，其与直接靶向大多位于生理屏障(例如血管壁)以外的肿瘤细胞的所述结合物相比提供理论优势。
[0094] Chaleix等人(2003)公开了作为PDT应用的潜在候选物的RGD-卟啉结合物的合成，其中未金属化的卟啉大分子在10、15、20位中的每个位置经4-甲基苯基或乙酰化葡萄糖基氧基苯基取代且在5位经通过间隔子臂与所述大分子连接的含RGD线性肽的残基取代。
[0095] 在另一个实施方案中，本发明的结合物的有效载荷部分因此是例如(不限于)卟啉、叶绿素或细菌叶绿素等光敏剂的部分。
[0096] 本发明的目的是提供将敏化剂特异性地靶向于肿瘤血管系统的光敏剂结合物。血管光敏剂靶向法与使用常规化疗的血管靶向法相比存在一些优势。首先，在靶向型常规药物的积累期间，除非其是前药，否则通常具有活性，而靶向的光敏剂直到被局部照射时才有活性。其次，靶向型常规药物将在呈现归巢地址(homing address)的不合需要的靶标处结合并发挥作用，而靶向的光敏剂只在相关照射位点被活化。此外，具有靶向于肿瘤中的新生血管内皮标志的光敏剂的PDT可能在诱导光动力内皮细胞损伤方面具有很高的选择性。
[0097] 因为整合素αvβ3已被报道可在肿瘤转移和血管生成(其涉及在肿瘤生长期间从预先存在的血管系统生长新血管)中起重要作用，所以其可以是肿瘤生长和扩散的可用标志。因此，用于实时视觉监控αvβ3整合素表达的非侵入性成像方法提供评定治疗干预以及检测转移的可能性。
[0098] 整合素通过识别RGD基序来连接细胞的胞内细胞骨架和胞外基质。RGD肽与整合素受体位点相互作用，这可引发细胞信号传导过程并影响许多不同疾病。因此，整合素RGD结合位点是有吸引力的医药靶标。整合素αvβ3具有RGD结合位点，且含RGD序列的肽或拟肽归巢于αvβ3整合素并用作其拮抗剂。
[0099] 在本发明的双功能结合物中，归巢性质由含RGD的环状拟肽提供，而PDT作用则由光敏剂提供。这些结合物应能够将敏化剂靶向于原发性实体肿瘤和可能的对应转移的新生血管，以用于诊断和光动力破坏目的。它们可进一步用作抗血管生成剂，并引发新生内皮肿瘤细胞和暴露于血液的肿瘤细胞的凋亡性破坏。
[0100] 在优选实施方案中，有效载荷部分是卟啉、叶绿素或细菌叶绿素衍生物，其可经金属化或未经金属化且视情况在周围经例如烷基、芳基、杂芳基和/或官能团等不同取代基取代。这些官能团可选自带正电基团、带负电基团、在生理条件下转换为带正电基团的碱性基团和在生理条件下转换为带负电基团的酸性基团。
[0101] 术语“带正电基团”是指衍生自含N基团或不含N的鎓基团的阳离子。因为肿瘤内皮的特征为阴离子位点的数目增多，所以带正电基团或在生理条件下可转换为带正电基团的碱性基团可提高本发明结合物的靶向效率。
[0102] 术语“带负电基团”是指衍生自酸的阴离子，包括羧酸根(COO-)、硫代羧酸根- - 2-(COS)、磺酸根(SO3)和膦酸根(PO3 )，且“在生理条件下转换为带负电基团的酸性基团”包括羧酸(-COOH)、硫代羧酸(-COSH)、磺酸(-SO3H)和膦酸(-PO3H2)基团。
[0103] 在更优选实施方案中，有效载荷部分是叶绿素，或最优选是细菌叶绿素衍生物，其可能是叶绿素或细菌叶绿素的天然或合成非天然衍生物，包括大环和/或周围已经修饰和/或中央Mg原子可能缺失或经适用于诊断目的和/或PDT目的的其它金属原子取代的化合物。所述金属的实例包括(但不限于)Pd、Pt、Co、Ni、Sn、Cu、Zn、Mn、In、Eu、Fe、Au、Al、Gd、Er、Yb、Lu、Ga、Y、Rh、Ru、Si、Ge、Cr、Mo、Re、Tl和Tc和其同位素。
[0104] 在一个尤其优选的实施方案中，本发明的结合物是通式I的含RGD的环状拟肽与细菌叶绿素衍生物部分的结合物，其中所述细菌叶绿素衍生物是与A1直接连接的Pd-BTA，X是-NH-R-，R是衍生自乙烷的亚烃基，且A1是Dap(本文标识为结合物34)。
[0105] 在另一个实施方案中，本发明结合物的有效载荷部分是螯合剂，即能螯合放射性99m
核素如锝-99m( Tc)的试剂。所述螯合剂的非限制性实例包括DTPA和DOTA。所述结合物可用作放射成像剂和放射治疗剂。
核素如锝-99m( Tc)的试剂。所述螯合剂的非限制性实例包括DTPA和DOTA。所述结合物可用作放射成像剂和放射治疗剂。
[0106] 在优选实施方案中，本发明的结合物是通式I的含RGD的环状拟肽与螯合剂部分的结合物，其中所述螯合剂是与A1直接连接的DTPA或DOTA，X是-NH-R-，R是衍生自乙烷的亚烃基，且A1是Dap(本文分别标识为结合物35和36)。
[0107] 因为大多数当前使用的化疗剂对正常细胞也有毒性，所以靶向型化疗(即特异性地靶向于肿瘤细胞的化疗药物)的开发非常重要。靶向型细胞毒性肽结合物是由结合肿瘤细胞上的受体的肽载体与细胞毒性部分构成的杂合分子。此方法有效增加化疗中细胞毒性剂的特异性和功效，同时也减少毒性副作用。
[0108] 因此，在另一个实施方案中，本发明结合物的有效载荷部分是细胞毒性剂。
[0109] 在一个优选实施方案中，本发明的细胞毒性剂是蒽环类(anthracycline)化疗剂。蒽环类化疗剂可以是蒽环家族的任何化疗剂，包括多柔比星(也称为阿霉素(adriamycin))、道诺霉素(daunorubicin)、表柔比星(epirubicin)、伊达比星(idarubicin)和米托蒽醌(mitoxantrone)。在一个更优选实施方案中，蒽环类化疗剂是多柔比星，其是含奎宁的蒽环类且是肿瘤学上应用最广的有效化疗剂。多柔比星适用于多种人类恶性肿瘤，包括膀胱、胃、卵巢、肺和甲状腺肿瘤，并且是可用于治疗乳腺癌和其它适应症的活性最强的药剂中的一种，所述其它适应症包括急性淋巴细胞和粒细胞白血病、霍奇金和非霍奇金淋巴瘤、尤文氏瘤和成骨性骨瘤、软组织肉瘤和小儿科癌症(例如神经母细胞瘤和肾母细胞瘤)。
[0110] 在其它优选实施方案中，细胞毒性剂是有丝分裂抑制剂如紫杉醇(paclitaxel)，其目前用于治疗肺癌、卵巢癌、乳腺癌、头颈癌和卡波西肉瘤晚期形式的患者，以及用于预防再狭窄；拓扑异构酶I抑制剂如喜树碱(camptothecin)；或拓扑异构酶II抑制剂如椭圆玫瑰树碱(ellipticine)。
[0111] 在另一方面，本发明提供医药组合物，其包含如上定义的含RGD的环状拟肽和有效载荷部分的结合物或其药学上可接受的盐，和药学上可接受的载剂。
[0112] 在一个实施方案中，医药组合物包含如上定义的环状拟肽(即通式I或II的环状拟肽)和荧光探针部分的结合物。在优选实施方案中，医药组合物包含选自由如上定义的结合物1-33和41-48组成的结合物群组的结合物。所述医药组合物可用于诊断目的，优选用于器官和组织显像，例如在血管靶向成像(VTI)方法中，更优选用于肿瘤诊断。
[0113] 在另一个实施方案中，医药组合物包含如上定义的环状拟肽(即通式I或II的环状拟肽)和如上定义的光敏剂部分的结合物。在一个优选实施方案中，医药组合物包含选自由如上定义的结合物34和37-40组成的结合物群组的结合物。所述组合物可用于光动力疗法(PDT)中。在一个实施方案中，医药组合物用于肿瘤学中，尤其用于肿瘤PDT。本发明涵盖任何合适的实体肿瘤，包括选自(但不限于)黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、脑癌或头颈癌的肿瘤的原发性肿瘤和转移。在另一个实施方案中，医药组合物用于非肿瘤疾病中，用于非肿瘤组织或器官的PDT。在一个实施方案中，医药组合物用于治疗例如老年性黄斑变性(AMD)等血管疾病，或通过限制对脂肪组织的血管供应且因此抑制其生长来治疗例如肥胖症等病症。
[0114] 在另一个实施方案中，医药组合物包含如上定义的环状拟肽(即通式I或II的环状拟肽)和能螯合放射性核素的试剂的部分的结合物。在一个优选实施方案中，医药组合物包含如上定义的结合物35或36。所述组合物当用合适放射性核素标记时可用于放射成像或放射疗法。
[0115] 在另一个实施方案中，医药组合物包含如上定义的环状拟肽(即通式I或II的环状拟肽)和如上定义的细胞毒性剂部分的结合物。所述组合物可用于靶向型化疗。
[0116] 本发明提供的医药组合物可通过例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995中所述的常规技术来制备。组合物可以是固体、半固体或液体形式，且可进一步包含药学上可接受的填充剂、载剂或稀释剂和其它惰性成分和赋形剂。此外，医药组合物可经设计用于结合物的缓慢释放。组合物可通过任何合适途径施用，例如静脉内、经口、不经肠、经直肠或透皮。剂量将取决于患者状态，且由执业医生判断是否适当。
[0117] 给药途径可以是有效地将活性化合物输送到适当或期望作用部位的任何途径，优选静脉内途径。如果在口服给药中使用固体载剂，那么制剂可经制片，以粉末或颗粒形式放置于硬明胶胶囊中，或可采用锭剂形式。如果使用液体载剂，那么制剂可采用糖浆、乳液或软明胶胶囊的形式。具有滑石粉和/或碳水化合物载剂或粘合剂等的片剂、糖锭或胶囊尤其适用于口服应用。片剂、糖锭或胶囊的优选载剂包括乳糖、玉米淀粉和/或马铃薯淀粉。
[0118] 在另一方面，本发明因此涉及如上定义的含RGD的环状拟肽和有效载荷部分的结合物或其药学上可接受的盐的用途，其用于制备用于诊断目的、光动力疗法(PDT)、放射成像或放射疗法或靶向型化疗的医药组合物。
[0119] 在另一方面，本发明涉及如上定义的含RGD的环状拟肽和有效载荷部分的结合物或其药学上可接受的盐，其用于诊断目的、光动力疗法(PDT)、放射成像或放射疗法或靶向型化疗。
[0120] 本发明现将通过以下非限制性实施例来说明。
[0121] 实施例
[0122] 材料和方法
[0123] (i)材 料.2- 氯 三 苯 甲 基 氯 树 脂、Fmoc-Asp-O-烯 丙 基、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-GABA-OH、单 Fmoc-二 胺、HOBt、PyBOP、HATU和 HOAt 是 购 自 Novabiochem(USA)。Fmoc-Dap(Alloc)-OH、Fmoc-Dab(Alloc)-OH 和Fmoc-Lys(Alloc)-OH是购自Bachem(Switzerland)。Fmoc-Orn(Alloc)-OH、1-Fmoc-4-氨基哌啶盐酸盐和4-(Boc-氨基甲基)-苯胺是购自NeoMPS(France)。FITC、丹磺酰氯、DIEA、DIC、DMBA、二乙基二硫代氨基甲酸钠、TFE、TIS、TFA、无水DCM和MeOH是购自Sigma(USA)。四(三苯膦)钯是购自Acros(Belgium)。DMF、DCM和乙腈是购自J.T.Baker(USA)。DTPA和DOTA是购自Macrocyclics(USA)。
[0124] UV-Vis光谱是使用Shimadzu 1240UV-Vis分光光度计获得。HPLC MS分析是使用配备有连接于Applied Biosystems 150EX单四极杆质谱仪的YMC Pro-RP-C18反相柱的Agilent 1100HPLC获得。HPLC分析是在以下标准条件下进行(除非另外说明)：20-95％乙腈水溶液(pH＝4.5，由乙酸维持)梯度，历时30分钟，流速为0.2ml/min。制备型HPLC是使用配备有Waters 486UV-VIS可调式吸光率检测器和Waters馏分收集器并由Millenium v3.05程序控制的Waters Delta Prep 4000系统进行。流速被设定为75ml/min，其中使用制备柱(Vydac C18，218TP101550，50×250mm，10-15μm)。HPLC纯化中所用的试剂是溶剂A(50mM乙酸铵水溶液)和溶剂B(乙腈)。ELISA平板是在Thermo Labsystems全波长酶标仪(Multiscan Spectrum instrument)上读数。荧光成像是使用Xenogen IVIS 100系列成像系统(Alameda，California)进行。
[0125] (ii)偶合单Fmoc-二胺与H-Arg(Pbf)-Gly-Asp(αO-烯丙基)-2-氯三甲苯基树脂的一般程序 将单Fmoc-二胺盐酸盐(1.05mmol)溶解于DCM(10ml)中。向溶液中加入DIEA(1.26mmol)并搅拌1分钟，随后加入BTC(0.35mmol)和DIEA(3.15mmol)。将获得的溶液加入用DCM预洗涤的0.21mmol肽基-树脂中，并使其反应1小时。偶合后，用DCM(3×6ml，每次1分钟)和DMF(6×6ml，每次1分钟)洗涤树脂。通过定性茚三酮(ninhydrin)测试(Kaiser Test)来监测偶合完成情况。
[0126] (iii)偶合BTA或Pd-BTA与肽基-树脂的一般程序 将BTA(0.42mmol)、PyBOP(0.42mmol)和HOBt(0.42mmol)溶解于DMF(10ml)中，然后将DIEA(1.89mmol)加入溶液中并搅拌5分钟。将获得的溶液加入0.21mmol肽基-树脂中并在氩气下振荡2小时。偶合后，用DMF(6-8×6ml，1分钟)洗涤树脂。通过定性茚三酮测试来监测偶合完成情况。
在对于BTA所述的相同偶合条件下进行Pd-BTA与环状肽基树脂的偶合。
在对于BTA所述的相同偶合条件下进行Pd-BTA与环状肽基树脂的偶合。
[0127] (iv)偶合FITC与肽基-树脂的一般程序 将FITC(0.63mmol)于DMF(5ml)中的溶液加入0.21mmol肽基-树脂中并振荡1.5小时。偶合后，用DMF(6×6ml，每次1分钟)洗涤树脂。通过定性茚三酮测试来监测偶合完成情况。
[0128] (v)偶合丹磺酰氯与肽基-树脂的一般程序 将丹磺酰氯(1.05mmol)和DIEA(1.47mmol)于DCM(5ml)中的溶液加入用DCM预洗涤的0.21mmol肽基-树脂中，并使其反应1小时。偶合后，用DCM(5×5ml，1分钟)和DMF(2×5ml，1分钟)洗涤树脂。通过定性茚三酮测试来监测偶合完成情况。
[0129] (vi)制备经保护的二肽Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH，其是用于肽合成的组成部分 将Fmoc-Gly-OH(4.162gr；14mmol)和DIEA(9.755gr；56mmol)于无水DCM(100ml)中的溶液与10gr 2-氯三苯甲基氯树脂(取代度1.4mmol/gr)在室温下搅拌1小时。将混合物转移到配备有烧结玻璃底的反应器中，并用DCM/MeOH/DIEA(17∶2∶1)(3×100ml)、DCM(3×100ml)、DMF(3×100ml)、DCM(2×100ml)、MeOH(2×100ml) 和 DMF/DCM(1 ∶ 1)(3×100ml)洗涤树脂。通过用含5％哌啶的DMF/DCM(1∶1)(100ml，10分钟)和含20％哌啶的DMF(100ml，5分钟和2×15分钟)依次处理并用DMF(7×100ml)洗涤树脂来去除Fmoc基团。在室温下用DIC(4.34ml；28mmol)和HOBt(4.29gr；28mmol)活化Fmoc-Arg(Pbf)-OH(18.17gr；28mmol)的DMF(130ml)溶液15分钟，并将其加入反应容器中。将混合物在室温下振荡2小时。用DMF(5×100ml)、DCM(3×100ml)、MeOH(2×100ml)和DCM(3×100ml)洗涤肽基-树脂，并真空干燥3小时。通过在室温下将树脂与AcOH/TFE/DCM(1∶1∶3)溶液(250ml)一起搅拌1小时而从树脂裂解经保护的二肽。过滤树脂并用相同溶液(3×50ml)洗涤。将合并的滤液与正己烷混合以去除作为共沸混合物的AcOH，并蒸发以得到油性残余物，其在用冷乙醚(1l)处理时凝固。过滤并用冷乙醚(150ml)洗涤，得到白色粉末(8.64g；87.5％)，均匀性为约99％(HPLC)。C36H43N5O8S.MS(LC-MS)计算值m/z＝705.84；实验值706.30(M+H)。产物不经进一步纯化即可使用。
[0130] (vii)从树脂裂解肽结合物的一般程序 结合后，用DMF(5×3ml)和DCM(5×3ml)洗涤肽基-树脂，然后减压干燥3小时。使用TFA/硫代苯甲醚/H2O/TIS(85∶5∶5∶5)裂解混合液(6ml)在0℃下使肽结合物从树脂裂解5分钟，然后在室温下裂解1小时。过滤树脂并用相同的裂解混合液(4ml)洗涤。用N2流将合并的滤液蒸发到约一般体积，并通过加入冷乙醚(25ml)来沉淀肽。离心并倾析乙醚层，并用冷乙醚(2×25ml)另外处理，得到未经保护的肽，将其真空干燥6小时。通过RP-HPLC纯化粗产物。
[0131] (viii)利用ELISA的整合素结合测试 用溶解于0.06M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中的2μg/ml人类整合素αVβ3(Chemicon，Cat#CC1020，Biotest，Israel)涂布Nunc免疫模块条带(Nunclon，Cat#167008，DanielBiotech，Israel)一整夜。在室温下用2％牛血清白蛋白(BSA)(Sigma，Cat#A-9647，Israel)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)(Biological -3 -2Industries，Israel)溶液封闭条带2小时。c[RGDfK]-生物素(10 M)与以不同浓度(10 、-3 -4 -5
10 、10 和10 M)稀释于分析缓冲液(50mM Tris HCl(pH＝7.7)、0.5％BSA、0.15M NaCl、
0.01％Tween 20)中的测试化合物的混合物加入经涂布的条带中，并在室温下于振荡下培养一整夜。用PBS洗涤后，加入经碱性磷酸酶(1∶200)标记的抗生物素抗体(Miltenyi Biotec，Almog，Israel)并在室温下培养1小时。将样品与磷酸对硝基苯酯底物(p-NPP，Calbiochem，Mercury，Israel)一起培养并在405nm下读数。
10 、10 和10 M)稀释于分析缓冲液(50mM Tris HCl(pH＝7.7)、0.5％BSA、0.15M NaCl、
0.01％Tween 20)中的测试化合物的混合物加入经涂布的条带中，并在室温下于振荡下培养一整夜。用PBS洗涤后，加入经碱性磷酸酶(1∶200)标记的抗生物素抗体(Miltenyi Biotec，Almog，Israel)并在室温下培养1小时。将样品与磷酸对硝基苯酯底物(p-NPP，Calbiochem，Mercury，Israel)一起培养并在405nm下读数。
[0132] (ix)体内卵巢癌模型 麻醉雌性CD-1裸小鼠(7-9周大，23-28gr)，并皮下(SC)植入MLS人类卵巢癌细胞(从Prof.M.Neeman，the Weizmann Institute of Science，Israel6
获得)悬浮液(2-3×10 个细胞/小鼠)。肿瘤在2-3周内达到治疗大小，直径6-8mm。
获得)悬浮液(2-3×10 个细胞/小鼠)。肿瘤在2-3周内达到治疗大小，直径6-8mm。
[0133] 用含2％异氟烷(isofluorane)(Medeva，Bethlehem，PA)的7∶3 N2O∶O2混合气体或通过腹膜内(IP)注射5mg/kg氯胺酮(ketamine)(Rhone Merieux，Lyon，France)与1mg/kg pompun(Bayer，Leverkusen，Germany)(85∶15，v∶v)的混合物麻醉动物。
[0134] (x)体内结肠癌模型 此模型类似于上文(ix)所述的体内卵巢癌模型，除了使用6
HT29人类结肠癌细胞(ATCC，USA，2-3×10 个细胞/小鼠)代替MLS人类卵巢癌细胞。
HT29人类结肠癌细胞(ATCC，USA，2-3×10 个细胞/小鼠)代替MLS人类卵巢癌细胞。
[0135] (xi)体内前列腺癌模型 在严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠背部皮下植入LNCaP细6 3
胞(3×10 个细胞/小鼠)。使肿瘤生长60-70天。当肿瘤达到治疗大小(0.7-0.8cm)时，麻醉动物并静脉内(IV)注射测试化合物溶液。在注射后8、11、14、24和48小时获得IVIS影像。
胞(3×10 个细胞/小鼠)。使肿瘤生长60-70天。当肿瘤达到治疗大小(0.7-0.8cm)时，麻醉动物并静脉内(IV)注射测试化合物溶液。在注射后8、11、14、24和48小时获得IVIS影像。
[0136] (xii)体内乳腺癌模型 对雌性CD-1裸小鼠(6-8周大，20-25g，从Harlan Biotech6
Israel，Rehovot，Israel获得)植入MDA-MB-231-RFP人类乳腺癌细胞(4×10 个细胞/小鼠)。事实上，这些细胞是经红色荧光蛋白(RFP)基因转染的MDA-MB-231人类乳腺癌细胞
3
(ATCC，USA)，因此具有红色荧光。当肿瘤达到坏死性肿瘤的大小1-1.5cm 时，通过腹膜内注射30μl的85∶15氯胺酮∶赛拉嗪(xylazine)混合物来麻醉小鼠，然后将测试结合物(15mg/kg)注射到尾静脉中。
Israel，Rehovot，Israel获得)植入MDA-MB-231-RFP人类乳腺癌细胞(4×10 个细胞/小鼠)。事实上，这些细胞是经红色荧光蛋白(RFP)基因转染的MDA-MB-231人类乳腺癌细胞
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(ATCC，USA)，因此具有红色荧光。当肿瘤达到坏死性肿瘤的大小1-1.5cm 时，通过腹膜内注射30μl的85∶15氯胺酮∶赛拉嗪(xylazine)混合物来麻醉小鼠，然后将测试结合物(15mg/kg)注射到尾静脉中。
[0137] (xiii)BTA-RGD结合物的荧光成像方案 将测试化合物(8mg/kg)注入腹膜内麻醉的荷瘤小鼠的尾静脉。在注射后6、8、10、12、14和24小时(在一些情况下也在48和72小时)，使用IVIS 100系列成像系统获得气体麻醉动物的影像。IVIS中的激发和发射滤光片分别设定为710-760nm和810-860nm。在IVIS标准配置下在可用滤光片中选择具有最接近化合物发射峰的波长的发射滤光片。
[0138] (xiv)FITC-RGD结合物的荧光成像程序 将测试化合物(8mg/kg)注入腹膜内麻醉的荷瘤小鼠的尾静脉。在注射后6和8小时获得气体麻醉动物的影像。在8小时时处死动物，刺激器官(肿瘤、肾、肝)并使用IVIS 100系列成像系统获得器官影像。IVIS中的激发和发射滤光片分别设定为445-490nm和515-575nm。在IVIS标准配置下在可用滤光片中选择具有最接近FITC发射峰的波长的发射滤光片。
[0139] (xv)体外结合分析 在含有1g/l D-葡萄糖(pH 7.4)、10％胎牛血清(FCS)、谷氨酰胺(2mM)、青霉素(0.06mg/ml)和链霉素(0.1mg/ml)的极限必需培养基(MEM-α)中以单层形式培养MLS人类卵巢癌细胞，并使其在37℃下在5％CO2-潮湿气氛下生长。在实验前5
48小时，将细胞接种于6孔板中(3×10 个细胞/孔)。
48小时，将细胞接种于6孔板中(3×10 个细胞/孔)。
[0140] αVβ3整合素在MLS细胞上的表达细胞在盖玻片上生长。在血清饥饿一整夜、用4％多聚甲醛(Sigma，Israel)固定和用0.2％Triton X-100(Sigma，Israel)透化之后，将细胞在室温下在封闭液(10％马血清)(BiologicalIndustries，Israel)中培养1小时。然后将细胞与小鼠抗人类αVβ3整合素抗体(1∶100)(Chemicon，Biotest，Israel)在室温下一起培养1小时。在室温下将经FITC标记的二级兔抗小鼠IgG(1∶200)(Sigma，Israel)应用于细胞，持续1小时。用配备有数码相机(DVC Company，Inc.，Austin，TX)的荧光显微镜(Nikon Optiphot2，Japan)进行成像。
[0141] 体外结合分析 起初将RGD-结合物溶解于DMSO中以得到4×10-3M。然后在培养基中1∶40稀释储备溶液，并加入MLS或HT29细胞中(100μM/孔)。细胞在37℃下在5％CO2-潮湿气氛中培养3小时。细胞然后用PBS洗涤3次，并在Xenogen IVIS 100系列成像系统上进行成像。IVIS中的激发和发射滤光片对于BTA-RGD分别设定为710-760nm和810-860nm，且对于FITC-RGD分别设定为445-490nm和515-575nm。
[0142] (xvi)竞争结合实验(确定IC50)用50μl/孔的2μg/ml人类αVβ3整合素(Chemicon，USA)将免疫模块条带MAXISORP(Nunc，Danyel Biotech，Israel)涂布一整夜，并用2％BSA(Sigma，Israel)在室温下封闭2小时。用Tris缓冲盐水-Tween(TBST)缓冲-3 -2 -3 -4液洗涤后，一式三份地加入RGD肽c[RGDfK]-生物素(10 M)和不同浓度(10 、10 、10 和-5
10 M)的测试RGD-结合物的混合物，并在室温下培养一整夜并振荡。用PBS缓冲液洗涤后，加入经碱性磷酸酶(1∶200)标记的抗生物素抗体(Miltenyi Biotec，Germany)并在室温下培养1小时。样品与p-NPP底物一起培养，并在全波长酶标仪(Multiscan Spectrum)(Labotal，Israel)上于405nm下读数。将数据与RGD-结合物浓度的结合百分比的依赖性图表作图，且确定IC50值。
10 M)的测试RGD-结合物的混合物，并在室温下培养一整夜并振荡。用PBS缓冲液洗涤后，加入经碱性磷酸酶(1∶200)标记的抗生物素抗体(Miltenyi Biotec，Germany)并在室温下培养1小时。样品与p-NPP底物一起培养，并在全波长酶标仪(Multiscan Spectrum)(Labotal，Israel)上于405nm下读数。将数据与RGD-结合物浓度的结合百分比的依赖性图表作图，且确定IC50值。
[0143] 实施例1.合成基于通式I的含RGD环状拟肽的结合物
[0144] 1(i)合成本文标识为结合物1、3-6、15、23-26和34的BTA-和Pd-BTA-环状拟肽结合物-方法A
[0145] 通过偶合Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH与结合于树脂的H-Asp-O-烯丙基残基来固相制α备三肽Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-Asp( O-烯丙基)-2-氯三苯甲基树脂。
[0146] 通过将2-氯三苯甲基氯树脂(300mg，取代度1.4mmol/gr)与Fmoc-Asp-O-烯丙基(83mg，0.21mmol)和DIEA(147μl，0.84mmol)于5ml无水DCM中的溶液在室温下一起搅拌1小时以得到约0.7mmol/g的负荷来连接第一氨基酸。在偶合完成后，如材料和方法章节中所述用相应体积的溶剂和试剂溶液处理(洗涤和Fmoc去除)树脂。将 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH(223mg，0.315mmol)、HOBt(48mg，0.315mmol) 和 DIC(49μl，
0.315mmol)溶解于5ml DMF中并在室温下搅拌20分钟。将所得溶液加入经洗涤的H-Asp-O-烯丙基-树脂中，并在室温下振荡混合物2小时。用DMF(5×5ml)洗涤肽基-树脂。通过加入20％哌啶(5ml)的DMF溶液(2×15分钟)，随后进行DMF洗涤(7×5ml，
1分钟)来去除Fmoc基团。如材料和方法章节中所述进行单Fmoc-二胺的偶合，随后去除Fmoc和用DMF洗涤。通过加入用HOBt(0.63mmol)和DIC(0.63mmol)预先活化(15分钟)的Fmoc-Lys(Alloc)-OH(0.63mmol)的DMF溶液(5ml)来使Fmoc-Lys(Alloc)-OH以及Fmoc-Dap(Alloc)-OH、Fmoc-Dab(Alloc)-OH和Fmoc-Orn(Alloc)-OH与四肽偶合，偶合时间为1小时。偶合后，用DMF(6×5ml，1分钟)洗涤树脂。通过定性茚三酮测试(Kaiser Test)
0
来监测偶合完成情况。通过将肽基-树脂与[(C6H5)3P]4Pd(0.252mmol)和DMBA(3.57mmol)于DCM(5ml)中的溶液在室温和氩气下一起搅拌2小时来去除烯丙基和Alloc。用DCM(3×5ml，1分钟)、DMF(3×5ml，1分钟)、二乙基二硫代氨基甲酸钠(0.5％DMF溶液，
4×5ml，2分钟)和DMF(5×5ml，1分钟)洗涤树脂。通过在室温下使用PyBOP(0.63mmol)和DIEA(1.26mmol)于DMF(4ml)中的溶液来进行树脂上环化(On-resin cyclization)，历时2小时。去除Fmoc后，如材料和方法章节中所述使BTA与未经保护的肽基-树脂结合，并使肽从树脂裂解下来。通过RP-HPLC纯化产物。
0.315mmol)溶解于5ml DMF中并在室温下搅拌20分钟。将所得溶液加入经洗涤的H-Asp-O-烯丙基-树脂中，并在室温下振荡混合物2小时。用DMF(5×5ml)洗涤肽基-树脂。通过加入20％哌啶(5ml)的DMF溶液(2×15分钟)，随后进行DMF洗涤(7×5ml，
1分钟)来去除Fmoc基团。如材料和方法章节中所述进行单Fmoc-二胺的偶合，随后去除Fmoc和用DMF洗涤。通过加入用HOBt(0.63mmol)和DIC(0.63mmol)预先活化(15分钟)的Fmoc-Lys(Alloc)-OH(0.63mmol)的DMF溶液(5ml)来使Fmoc-Lys(Alloc)-OH以及Fmoc-Dap(Alloc)-OH、Fmoc-Dab(Alloc)-OH和Fmoc-Orn(Alloc)-OH与四肽偶合，偶合时间为1小时。偶合后，用DMF(6×5ml，1分钟)洗涤树脂。通过定性茚三酮测试(Kaiser Test)
0
来监测偶合完成情况。通过将肽基-树脂与[(C6H5)3P]4Pd(0.252mmol)和DMBA(3.57mmol)于DCM(5ml)中的溶液在室温和氩气下一起搅拌2小时来去除烯丙基和Alloc。用DCM(3×5ml，1分钟)、DMF(3×5ml，1分钟)、二乙基二硫代氨基甲酸钠(0.5％DMF溶液，
4×5ml，2分钟)和DMF(5×5ml，1分钟)洗涤树脂。通过在室温下使用PyBOP(0.63mmol)和DIEA(1.26mmol)于DMF(4ml)中的溶液来进行树脂上环化(On-resin cyclization)，历时2小时。去除Fmoc后，如材料和方法章节中所述使BTA与未经保护的肽基-树脂结合，并使肽从树脂裂解下来。通过RP-HPLC纯化产物。
[0147] 1(ii)合成本文标识为结合物2的BTA-环状拟肽结合物-方法B
[0148] 如上文针对方法A所述来合成H-Arg(Pbf)-Gly-Asp(αO-烯丙基)-2-氯三苯甲基树脂。
[0149] 偶合Fmoc-NH-NH2盐酸盐与未经保护的三肽将单Fmoc-肼盐酸盐(1.05mmol)溶解于二恶烷与1，3-二氯丙烷的1∶1混合物(10ml)中。向此溶液中加入DIEA(1.26mmol)并搅拌1分钟，随后加入BTC(0.35mmol)和DIEA(3.15mmol)。将溶液加入肽基-树脂(0.21mmol)(用1∶1二恶烷∶1，3-二氯丙烷预洗涤)中并使其在55℃下反应1小时。偶合后，用DCM(3×6ml，1分钟)和DMF(6×6ml，1分钟)洗涤树脂。通过定性茚三酮测试(Kaiser Test)来监测偶合完成情况。如针对方法A所述来进行剩余的合成。通过RP-HPLC纯化产物。
[0150] 1(iii)合成本文标识为结合物9-11和27-33的BTA-环状拟肽结合物-方法C[0151] 如上文针对方法A所述来合成环五肽。
[0152] 偶合氨基酸间隔子与环五肽 将Fmoc氨基酸(0.63mmol的Fmoc-Gly-OH、Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-GABA-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-D-Phe-OH、Fmoc-1-Nal-OH、Fmoc-D-1-Nal-OH或Fmoc-3-氨基 甲基苯 甲酸)溶 解于DMF(5ml)中，然后加 入HOBt(0.63mmol)和DIC(0.63mmol)，并使其反应15分钟。将溶液加入到去除Fmoc的环五肽-2-氯三苯甲基树脂(0.21mmol)中并振荡1小时。用DMF(6×5ml，1分钟)洗涤树脂，随后去除Fmoc。如材料和方法章节中所述来偶合BTA并使肽自树脂裂解下来。通过RP-HPLC纯化产物。
[0153] 偶合二胺间隔子与环五肽 将单Fmoc-二胺盐酸盐(1.05mmol Fmoc-乙二胺盐酸盐或Fmoc-二氨基丁烷盐酸盐)溶解于DCM(10ml)中。向溶液中加入DIEA(1.26mmol)并搅拌1分钟，随后加入BTC(0.35mmol)和DIEA(3.15mmol)。将获得的溶液加入用DCM预洗涤的0.21mmol肽基-树脂中，并使其反应1小时。偶合后，用DCM(3×6ml，每次1分钟)和DMF(6×6ml，每次1分钟)洗涤树脂。通过定性茚三酮测试(Kaiser Test)来监测偶合完成情况。如材料和方法章节中所述来偶合BTA并使肽自树脂裂解下来。通过RP-HPLC纯化产物。
[0154] 1(iv)合成本文标识为结合物7和8的BTA-环状拟肽结合物-方法D
[0155] 如上文针对方法A所述来合成H-Arg(Pbf)-Gly-Asp(αO-烯丙基)-2-氯三苯甲基树脂。
[0156] 偶合Fmoc-甘氨醇与去除Fmoc的三肽将Fmoc-甘氨醇(1.05mmol)溶解于DCM(10ml)中，然后向此溶液中依次加入BTC(0.35mmol)和DIEA(3.15mmol)。在搅拌5分钟后，将获得的溶液加入用DCM预洗涤的肽基-树脂(0.21mmol)中并使其在室温下反应1小时。用DCM(3×6ml，1分钟)和DMF(6×6ml，1分钟)洗涤树脂。通过定性茚三酮测试(Kaiser Test)来监测偶合完成情况。如针对方法A所述来进行剩余的合成。利用含15％DCM+5％TIS和5％硫代苯甲醚的TFA溶液(6ml)使肽结合物自树脂裂解下来。通过RP-HPLC纯化产物。
[0157] 1(v)合成本文标识为结合物12-14的FITC-环状拟肽结合物-方法E
[0158] 如上文针对方法A所述来合成环五肽。在去除Fmoc后，将Fmoc-β-Ala-OH或Fmoc-GABA-OH(0.63mmol)、HOBt(0.63mmol)和DIC(063mmol)于DMF(5ml)中的溶液混合15分钟，加入肽基-树脂(0.21mmol)中并使其反应1小时。用DMF(6×5ml，1分钟)洗涤树脂。通过加入20％哌啶(5ml)的DMF溶液(2×15ml，15分钟)，随后进行DMF洗涤(6×5ml，1分钟)来去除Fmoc基团。如材料和方法章节中所述来偶合FITC与未经保护的肽基-树脂并使肽自树脂裂解下来。通过RP-HPLC纯化产物。
[0159] 1(vi)合成本文标识为结合物16-22的丹磺酰-环状拟肽结合物-方法F[0160] 如上文针对方法A所述来合成环肽，并在去除Fmoc后，如材料和方法章节中所述使化合物与丹磺酰氯直接反应。
[0161] 如针对方法E所述在相同条件下，使含间隔子的化合物首先与Fmoc-Gly-OH或者Fmoc-β-Ala-OH反应，然后与丹磺酰氯偶合。如材料和方法章节中所述使肽自树脂裂解下来。通过RP-HPLC纯化产物。
[0162] 1(vii)合成本文标识为结合物35的DTPA-环状拟肽结合物-方法G
[0163] 如上文针对方法A所述来合成环肽。在去除Fmoc后，将用HATU(0.42mmol)、HOAt(0.42mmol)和DIEA(0.42mmol)活化的DTPA-四(叔丁酯)(0.42mmol)于DMF(3ml)中的溶液加入肽基树脂(0.14mmol)中并在室温下振荡2小时。用DMF(4ml，5次，每次1分钟)洗涤树脂。如材料和方法章节中所述使肽自树脂裂解下来。
[0164] 1(viii)合成本文标识为结合物36的DOTA-环状拟肽结合物-方法H
[0165] 如上文针对方法A所述来合成环肽。在去除Fmoc后，将用HATU(0.42mmol)、HOAt(0.42mmol)和DIEA(0.42mmol)活化的DOTA-四(叔丁酯)(0.42mmol)于DMF(3ml)中的溶液加入肽基树脂(0.14mmol)中并在60℃下振荡3小时。用DMF(4ml，5×1分钟)洗涤树脂。如材料和方法章节中所述使肽自树脂裂解下来。
[0166] 表1列举了所合成的结合物和其结构特征。
[0167] 表1：所合成的基于通式I的环状拟肽的结合物和合成方法
[0168]
[0169]*
[0170] X、R和A1是根据通式I的定义来定义。**
[0171] R连同其连接的氮原子一起形成饱和杂环。
[0172] 实施例2.合成基于通式II的含RGD环状拟肽的BTA-结合物
[0173] 在配备有烧结玻璃底的反应容器中，通过搅拌一整夜使rink amide MBHA树脂(300mg，取代度0.58mmol/g)于DMF中溶胀。在用20％哌啶的DMF溶液处理15分钟(3ml)时，Fmoc基团自树脂去除。此步骤重复两次。用DMF(4ml，2分钟，5次)洗涤树脂。通过加入用HOBt(0.52mmol)和DIC(0.52mmol)预先活化(15分钟)的Fmoc-Dap(Alloc)-OH(0.52mmol)的DMF 溶 液(2.5ml)来 使Fmoc-Dap(Alloc)-OH 以 及Fmoc-Dab(Alloc)-OH、Fmoc-Orn(Alloc)-OH和Fmoc-Lys(Alloc)-OH与树脂偶合，偶合时间为1小时。偶合后，用DMF(4ml，2分钟，5次)洗涤树脂。通过定性茚三酮测试(Kaiser Test)来监测偶合完成情况。如上文所述去除Fmoc，并在去除Fmoc后用DMF洗涤。如针对Fmoc-Dap(Alloc)-OH所述在相同条件下使Fmoc-Asp(O-tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH和Fmoc-Lys(Dde)-OH偶合，并在每次偶合之间去除Fmoc。
[0174] 偶合氨基酸烯丙酯与五肽Lys(Dde)-Arg(Pbf)-Gly-Asp(O-tBu)-X-rink amide树脂的一般程序
[0175] 将TsOH盐形式的氨基酸烯丙酯(0.87mmol)溶解于DCM(7ml)中。向溶液中加入DIEA(1.05mmol)并搅拌1分钟，随后加入BTC(0.29mmol)和DIEA(2.6mmol)。将获得的溶液加入用DCM预洗涤的0.174mmol肽基-树脂中，并使其反应1小时。偶合后，用DCM(3×6ml，每次1分钟)和DMF(6×6ml，每次1分钟)洗涤树脂。通过定性茚三酮测试来监测偶合完成情况。
[0176] 在氨基酸烯丙酯偶合和DMF洗涤后，用DCM(4次，4ml，每次1分钟)洗涤树脂。通0
过将肽基-树脂与[(C6H5)3P]4Pd(0.21mmol)和DMBA(2.61mmol)于DCM(5ml)中的溶液在室温和氩气下一起搅拌2小时来去除烯丙基和Alloc。用DCM(3×5ml，1分钟)、DMF(3×5ml，
1分钟)、二乙基二硫代氨基甲酸钠(0.5％DMF溶液，4×5ml，2分钟)和DMF(5×5ml，1分钟)洗涤树脂。通过在室温下使用PyBOP(0.52mmol)和DIEA(1.04mmol)于DMF(4ml)中的溶液来进行树脂上环化，历时2小时。在环化后，通过加入2％肼单水合物的DMF溶液(3次，每次3分钟)，随后用DMF洗涤(4ml，6次，每次2分钟)来去除Dde基团。如材料和方法章节中所述使BTA与未经保护的肽基-树脂结合，并使肽从树脂裂解下来。通过RP-HPLC纯化产物。
过将肽基-树脂与[(C6H5)3P]4Pd(0.21mmol)和DMBA(2.61mmol)于DCM(5ml)中的溶液在室温和氩气下一起搅拌2小时来去除烯丙基和Alloc。用DCM(3×5ml，1分钟)、DMF(3×5ml，
1分钟)、二乙基二硫代氨基甲酸钠(0.5％DMF溶液，4×5ml，2分钟)和DMF(5×5ml，1分钟)洗涤树脂。通过在室温下使用PyBOP(0.52mmol)和DIEA(1.04mmol)于DMF(4ml)中的溶液来进行树脂上环化，历时2小时。在环化后，通过加入2％肼单水合物的DMF溶液(3次，每次3分钟)，随后用DMF洗涤(4ml，6次，每次2分钟)来去除Dde基团。如材料和方法章节中所述使BTA与未经保护的肽基-树脂结合，并使肽从树脂裂解下来。通过RP-HPLC纯化产物。
[0177] 表2列举了所合成的结合物和其结构特征。
[0178] 表2：所合成的基于通式II的环状拟肽的结合物
[0179]
[0180] *A1、A2和A3是根据通式II的定义来定义。
[0181] 实施例3.通式I的环状拟肽的环大小影响基于其的结合物的生物活性[0182] 为了检验通式I的含RGD环状拟肽的环大小是否影响结合物的生物活性，如材料和方法章节中所述，使用人类卵巢癌细胞在体内卵巢癌模型和体外结合分析中测试基于具有不同环大小的通式I环状拟肽的各种荧光探针-结合物的活性。
[0183] 含RGD环状拟肽的环大小可通过改变环状化合物的两个结构参数来改变，特定地说，(i)通过α-或侧链羧基与骨架NH连接且通过α-或侧链氨基与天冬氨酸残基的α-羧基连接的氨基酸残基，即通式I中的基团A1；和(ii)桥接骨架羰基和骨架NH的基团，即通式I中的基团X。使用的特定氨基酸残基是在侧链中分别具有1到4个亚甲基单元的二氨基丙酸(Dap)、二氨基丁酸(Dab)、鸟氨酸(Orn)和赖氨酸(Lys)的残基，且使用的不同基团X是NH、NH(CH2)2、NH(CH2)3、NH(CH2)4和NH(CH2)6，其与骨架NH一起形成分别桥接A1和骨架羰基的肼、二氨基乙烷、二氨基丙烷、二氨基丁烷和二氨基己烷。
[0184] 表3显示测试的各种荧光探针-结合物和其生物活性。如显示的，测试的结合物的活性随环状拟肽的环大小从16个原子增至18-20个原子而增加，然而，所述活性随环大小的进一步增加却降低。这些结果表明，虽然桥接精氨酸残基的α-氨基和基团X的脲键使环状拟肽的刚性更强，但具有多达18-20个原子的较大环的挠性更好，以便采用便于结合整合素的期望构形。另一方面，在环状拟肽的环大小高于20个原子的情况下，环状拟肽可能无法采用便于结合整合素的期望构形。
[0185] 表3：基于具有不同环大小的通式I环状拟肽的荧光探针-结合物的生物活性[0186]
[0187]
[0188]
[0189] *每种结合物的表征呈现于上文表1中。
[0190] 实施例4.通式I的环状拟肽的二胺残基的大小和结构影响基于其的结合物的生物活性
[0191] 为了检验通过酰胺键与通式I的氨基酸残基A1的α-或侧链羧基连接且通过骨架羰基与精氨酸残基的α-氨基连接的二胺残基的大小和结构是否影响结合物的生物活性，如材料和方法章节中所述，使用人类卵巢癌细胞在体内卵巢癌模型和体外结合分析中测试基于通式I环状拟肽的各种BTA-结合物的活性，所述环状拟肽具有如上文定义的不同二胺残基。
[0192] 测试的特定结合物是结合物4、24、25、15和23，其中氨基酸残基A1是鸟氨酸，BTA分子在无间隔子的情况下与拟肽环的N端连接，且通式I中命名为X的基团分别是-NH(CH2)2-4-、1，3-二甲基苯-1，3-二基或哌啶-1，4-二基。
[0193] 表4显示测试的各种结合物和其生物活性。如显示的，在其中烷基二胺残基桥接A1和骨架C＝O的结合物中，结合物4的生物活性最高，表明这些结合物的生物活性随着烷基链长度的增加而降低。此外，当拟肽环变为刚性时，如其中使用非烷基二胺残基的基团的结合物15和23的情况中，没有测量到生物活性，表明所述结合物中的拟肽环采用不适合与整合素相互作用的构形。
[0194] 表4：基于通式I的环状拟肽的BTA-结合物的生物活性，所述环状拟肽具有通过酰胺键连接精氨酸残基和命名为A1的氨基酸残基的不同二胺单元
[0195]
[0196] *每种结合物的表征呈现于上文表1中。
[0197] 实施例5.连接有效载荷部分与通式I的环状拟肽的间隔子影响结合物的生物活性
[0198] 在此项实验中，如材料和方法章节中所述，使用人类卵巢癌细胞在体内卵巢癌模型和体外结合分析中测试基于通式I的环状拟肽的各种荧光探针-结合物的生物活性，所述环状拟肽具有连接荧光探针部分与环状拟肽的N端(即氨基酸残基A1的α-或侧链氨基)的不同间隔子。使用的特定间隔子是各种天然或合成氨基酸、尤其是甘氨酸、β-丙氨酸、苯丙氨酸、D-苯丙氨酸、1-萘基丙氨酸(1-Nal)、D-1-萘基丙氨酸(D-1-Nal)、γ-氨基丁酸(GABA)和3-(氨基甲基)苯甲酸的部分。
[0199] 表5显示测试的各种结合物和其生物活性。如显示的，在BTA分子与环状拟肽之间无间隔子的结合物1显示高生物活性，这很可能是因为BTA分子并不干扰环状拟肽与整合素的结合。与此相反，其中使用甘氨酸或β-丙氨酸部分作为间隔子从而导致环状拟肽与BTA分子之间的距离增大的结合物显示较低的生物活性，这很可能是因为BTA部分很庞大。在其中使用GABA部分作为间隔子的结合物11(即环状拟肽与BTA分子之间的距离进一步增大)的情况下，体外和体内结果显示高荧光，可能表明GABA的长度足以为拟肽环与整合素结合提供更大自由度，然而，却不会引起BTA分子在拟肽环上折叠。
[0200] 在使用较小荧光探针(即FITC或丹磺酰)的情况下，荧光探针与拟肽环N端之间的距离对于结合物的生物活性无影响。
[0201] 其中分别使用苯丙氨酸和D-苯丙氨酸部分作为间隔子的结合物27和28的活性高于其中使用甘氨酸部分作为间隔子的结合物9，这很可能是因为苯丙氨酸的芳香族侧链与整合素的疏水性口袋相互作用。结合物28的生物活性高于结合物27，进一步表明苯丙氨酸的D构形可能比L构形更好地配合整合素的疏水性口袋，从而促进结合。
[0202] 其中分别使用1，2-乙二胺和1，4-二氨基丁烷残基作为间隔子且在拟肽环与BTA部分之间形成脲键的结合物32和33的生物活性与结合物10和11几乎相同，表明脲键的活性与酰胺键几乎相同且脲键不影响拟肽的构形。
[0203] 表5：基于具有不同间隔子的通式I环状拟肽的荧光探针-结合物的生物活性[0204]
[0205]
[0206] *每种结合物的表征呈现于上文表1中。
[0207] 实施例6.其中与精氨酸残基的α-氨基形成脲部分的基于通式I环状拟肽的结合物的生物活性与其中形成氨基甲酸酯部分的结合物类似
[0208] 在此项实验中，其中与精氨酸残基的α-氨基形成脲部分的基于通式I环状拟肽的结合物、尤其BTA-结合物的生物活性与其中形成氨基甲酸酯部分的结合物的生物活性相比较。
[0209] 测试的特定结合物是结合物1和5，其中通式I中的氨基酸残基A1分别是二氨基丙酸或赖氨酸残基；BTA分子在无间隔子的情况下与环状拟肽N端连接；且通式I中命名为X的基团是-NH(CH2)2-；且具有类似结构的结合物7和8中命名为X的基团是-O(CH2)2-而不是-NH(CH2)2-。如材料和方法章节中所述，使用人类卵巢癌细胞在体内和体外结合分析中，在结肠癌模型以及卵巢癌中测试结合物的生物活性。
[0210] 表3描述结合物1和5在卵巢癌模型中的生物活性。如表6所示，其中与精氨酸残基的α-氨基形成脲部分的结合物的活性与其中形成氨基甲酸酯部分的对应结合物类似，表明与精氨酸残基的α-氨基形成的部分的性质不会影响结合物的生物活性。
[0211] 表6：其中与精氨酸残基的α-氨基形成脲和氨基甲酸酯部分的基于通式I环状拟肽的BTA-结合物的生物活性
[0212]
[0213]
[0214] *每种结合物的表征呈现于上文表1中。
[0215] 实施例7.其中BTA的牛磺酸残基经不同二胺取代的基于通式I的环状拟肽的BTA衍生物-结合物的生物活性与对应的非衍生化结合物类似
[0216] 合成本文标识为结合物37-40的四种不同的基于通式I环状拟肽的细菌叶绿素衍生物-结合物，并使用整合素结合分析来测试所述结合物于MLS人类卵巢癌细胞中的生物活性。这些结合物是基于其中BTA部分中的牛磺酸残基(-NH-(CH2)2-SO3H)经不同亲核基团、尤其-NH-(CH2)2-NH2和-NH-(CH2)2-NH-CH3取代的结合物1和4。
[0217] 这些结合物中的环状拟肽是根据上文所述的方法A来合成。在环化和去除Dde后，将用PyBoP(2eq)、HOBt(2eq)、DIEA(6eq)活化的细菌脱镁叶绿酸(2eq)的DMF溶液加入肽基树脂中并在氩气下振荡2小时。用DMF洗涤树脂8次(通过茚三酮测试来监测)。将二胺(30eq)的DMF溶液加入肽基树脂中并在氩气下振荡1小时，然后用DMF洗涤。如材料和方法章节中所述使肽自树脂裂解下来，并通过RP-HPLC纯化粗结合物。如表7中所示，所有这些结合物的生物活性相似，表明在这些情况下，氨基对生物活性无影响且其表现与牛磺酸中磺酸根的表现几乎相同。
[0218] 表7：基于通式I环状拟肽的各种经取代的BTA--结合物的生物活性
[0219]
[0220] *X和A1是根据通式I的定义来定义。
[0221] *J代表取代BTA中牛磺酸的特定亲核基团。
[0222] 实施例8.通式II的环状拟肽的环大小影响基于其的结合物的生物活性[0223] 为了检验通式II的环状拟肽的环大小是否影响结合物的生物活性，如材料和方法章节中所述，使用人类卵巢癌细胞在体内卵巢癌模型和体外结合分析中测试基于通式II的环状拟肽的各种BTA-结合物的活性，所述环状拟肽具有相同的氨基酸残基A1(Lys)和A2(Phe)，但具有不同的氨基酸残基A3，尤其是在侧链中分别具有1到4个亚甲基单元的Dap、Dab、Orn和Lys。
[0224] 表8显示测试的各种BTA-结合物和其生物活性。如显示的，测试的结合物的生物活性随环状拟肽的环大小从20个原子增至23个原子而降低，表明大于20个原子的环大小无法配合整合素的结合位点。
[0225] 表8：基于具有不同环大小的通式II环状拟肽的BTA-结合物的生物活性[0226]
[0227] *每种结合物的表征呈现于上文表2中。
[0228] 实施例9.通式II的环状拟肽中的氨基酸残基A2的特征影响基于其的结合物的生物活性
[0229] 为了检验通式II的环状拟肽中通过α-氨基与骨架C＝O连接且通过α-羧基与氨基酸残基A3连接的氨基酸残基A2的大小和结构是否影响结合物的生物活性，如材料和方法章节中所述，使用人类卵巢癌细胞在体内卵巢癌模型和体外结合分析中测试基于通式II的环状拟肽的各种BTA-结合物的活性，所述环状拟肽具有相同的氨基酸残基A1(Lys)和A3(Dap)，但具有不同的氨基酸残基A2，尤其是Phe、Val、D-Phe、Gly和Asp。
[0230] 表9显示测试的各种BTA-结合物和其生物活性。如显示的，具有疏水性氨基酸残基A2的结合物41、42和43的生物活性高于极性更高的结合物44和45，这可能是因为与整合素结合位点中的疏水性口袋发生疏水性相互作用。结合物43的活性低于结合物41，这可能是因为前者的构形，表明D构形不完全配合疏水性口袋。
[0231] 表9：基于具有不同氨基酸残基A2的通式II环状拟肽的BTA-结合物的生物活性[0232]
[0233] *每种结合物的表征呈现于上文表2中。
[0234] 实施例10.本发明的各种BTA-结合物与人类αVβ3整合素的竞争结合[0235] 在此项研究中，如材料和方法章节中所述，测试本发明的各种BTA-结合物与人类αVβ3整合素针对生物素-c[RGDfK]的竞争结合水平，即IC50。测试的特定结合物是结合物1、4、5、7、11和28(基于通式I的含RGD环状拟肽，参看实施例1)以及结合物41(基于通式II的含RGD环状拟肽，参看实施例2)，且针对这些结合物测量的IC50值呈现于表10。
[0236] 如显示的，结合物1、7、28和41显示最低的IC50(10-4M)，即最高的生物活性；结合-4 -3物4的IC50略高(3×10 M)；且结合物5和11的IC50最低(3×10 M)。
[0237] 表10：本发明的各种BTA-结合物与人类αVβ3整合素的竞争结合水平(IC50)[0238]*
[0239] 结合物1、4、5、7、11和28中的每一种和结合物41的表征分别呈现于上文表1和表2。
[0240] 实施例11.结合物1、4和41在MDA坏死肿瘤的坏死核心中积累
[0241] 在此项研究中，检验乳腺癌模型的原位原发病变中结合物1、4和41的特定积累模式(通过由肿瘤产生的荧光信号来监测)以及由这些结合物产生的荧光信号。还测定随时间前进结合物在肿瘤中的定位。如材料和方法章节中所述处理动物，并从第1天到第7天用IVIS 100成像系统监测肿瘤细胞和结合物1、4和41的荧光。
[0242] 图1A、1B和1C显示如使用Xenogen IVIS 系统所测量的，CD-1裸雌性小鼠的乳房垫中的原位人类乳腺MDA-MB-231-RFP原发性大肿瘤中结合物1、4和41的相应积累模式。使用包含激发滤光片500-550nm和发射滤光片575-650nm的滤光片组(filter sets)同时记录全动物影像。用于减去组织自动荧光的背景滤光片组是激发滤光片460-490nm和发射滤光片575-650nm。光敏剂成像主滤光片组是激发滤光片665-695nm和发射滤光片810-875nm。
[0243] 所有结合物在肿瘤中积累，同时从肝脏完全清除，从而提供在≥3天至注射后7天时的随访期结束时的选择性肿瘤成像和其后极低的清除率。如红色体内全部身体影像所显示，肿瘤大小和位置在整个实验期间并不改变。如图2A、2B和2C所显示，这些结合物的位置在注射后6天时位于肿瘤的坏死区域。
[0244] 实施例12.结合物1、4和41对前列腺癌细胞的生物活性
[0245] 在此项研究中，检验结合物1、4和41对表达αvβ3整合素的LNCaP前列腺癌细胞的生物活性。如上文所示，这些特定结合物对卵巢癌、结肠癌和乳腺癌细胞显示活性。
[0246] 在注射后8、11、14、24和48小时时监测植入的肿瘤中结合物的积累，且如分别涉及结合物1、4和41的图3A、3B和3C所示，在注射后8到11-14小时时在肿瘤区域中观察到最高的荧光水平，且结合物1和4在肿瘤中停留长达48小时，而结合物41在肿瘤中停留长达24小时。如进一步显示，这些结合物在前列腺和卵巢肿瘤中的积累概况几乎相同。
[0247] 实施例13.结合物1、4和41对大鼠的毒性
[0248] 对Wistar大鼠(5只雌性，170-190g；和5只雄性，288-315g)执行结合物1、4和41的毒性研究。将50mg/kg剂量的各种结合物在1-2分钟内注入尾静脉。动物存活且并未显示任何行动或运动问题。5天后，在这些动物的肝或肾中没有发现坏死或炎症迹象，暗示这些结合物在测试剂量下无毒。
[0249] 方案2：与本发明的环状拟肽(标记为“肽”)连接的所用各种有效载荷部分的化学结构
[0250]
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