治疗和预防心脏缺血损伤的组合物和方法
阅读：37发布：2020-05-16
专利汇可以提供治疗和预防心脏缺血损伤的组合物和方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本文公开了 治疗 和/或 预防 与心肌细胞或组织的缺血/ 再灌注 损伤和/或低 氧 损伤相关的病理学状况的组合物和方法。，下面是治疗和预防心脏缺血损伤的组合物和方法专利的具体信息内容。
1.包括药学上可接受的赋形剂和有效量的MG53或调节在心脏细胞中的MG53活性、其表达或组合的至少一种的试剂的组合物在治疗和/或预防心脏损伤的方法中的用途，所述方法包括向需要其的对象施用所述组合物，其中所述组合物有效治疗和/或预防心脏损伤。
2.权利要求1所述的用途，其中所述试剂是下述至少一种：MG53多肽；MG53受体多肽；
编码MG53多肽的核酸；编码MG53受体多肽的核酸；对编码MG53或MG53受体的核酸特异性的抑制或反义RNA。
3.权利要求1所述的用途，其中所述有效量是从0.1mg/kg至1000mg/kg体重/天。
4.权利要求1所述的用途，其中MG53活性的激动剂包括下述至少一种：磷脂酰丝氨酸、锌或锌盐、Zn-1-羟基吡啶-2-硫酮(Zn-HPT)、三七、氧化剂、硫柳汞或其组合。
5.权利要求1所述的用途，其中所述试剂是能够分化成心肌细胞的干细胞，其中所述干细胞已经被修饰，从而其展示增强的MG53的活性或表达。
6.权利要求1所述的用途，其中所述组合物进一步包括药学上可接受的载体或赋形剂。
7.权利要求1所述的用途，其中所述心脏损伤包括由于心血管疾病、心脏缺血/再灌注损伤、低氧损伤、心力衰竭或其组合的至少一种引起的心脏细胞或心肌组织损伤。
8.权利要求6所述的用途，其中所述心脏损伤包括由于心脏缺血/再灌注损伤引起的心脏细胞或心肌组织损伤。
9.权利要求2所述的用途，其中所述多肽具有SEQ ID NOs.：1、3、5、9、10、11、12、13、
14、15或16的至少一条或其生物活性部分的氨基酸序列。
10.权利要求1所述的用途，其中所述组合物结合药学上可接受的赋形剂细胞外或全身性施用，其中所述组合物有效治疗或预防心脏组织的损伤。
11.包括有效量的MG53多肽或MG53核酸和药学上可接受的赋形剂的组合物在治疗和/或预防心脏缺血/再灌注损伤的方法中的用途，其包括向需要其的对象施用包括有效量的MG53多肽或MG53核酸的组合物，其中所述组合物有效治疗心脏缺血/再灌注损伤。
12.权利要求11所述的用途，其中所述有效量是从0.1mg/kg至1000mg/kg体重/天。
13.权利要求11所述的用途，其中所述治疗性组合物进一步包括MG53活性的激动剂。
14.权利要求13所述的用途，其中所述激动剂是下述至少一种：磷脂酰丝氨酸、锌或锌盐、Zn-1-羟基吡啶-2-硫酮(Zn-HPT)、三七、氧化剂、硫柳汞或其组合。
15.筛选可用于治疗心脏缺血/再灌注损伤的化合物的方法，其包括下述步骤：提供表达编码与MG53多肽具有至少70%同源性的氨基酸序列的多肽的核酸的心肌细胞或心脏细胞；提供测试化合物库；用所述测试化合物处理细胞；诱导对所述心脏细胞的膜的缺血/再灌注损伤；测量MG53、活性或量的变化和所述细胞修复对膜损伤的能力；和比较处理的细胞和未处理的细胞，其中能够调节MG53表达、活性或量的试剂指示可用于治疗心脏缺血/再灌注损伤的试剂。
治疗和预防心脏缺血损伤的组合物和方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请是2011年3月31日提交的PCT/US2011/030703的部分继续，其是于2009年1月2日提交的美国专利申请系列号12/307,303的继续；其要求于2007年7月11日提交的PCT/US2007/015815的权益；其要求于2006年7月11日提交的美国临时申请号60/830,013的权益；和于2006年12月22日提交的60/876,871；和于2008年12月4日提交的美国专利申请系列号12/328,646；其要求于2007年12月4日提交的美国临时申请
61/005,410的权益；为了所有的目的，其内容通过引用以其整体并入本文。
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[0003] 通过引用并入
[0004] 根据37C.F.R.§1.52(e)(5)，使用Patent-In3.5和Checker4.4.0于2011年3月31日创建的电子文件名：Weisleder2011_ST25.txt中包含的序列信息通过引用以其整体并入本文。
[0006] 本发明在由国立卫生研究院(National Institutes of Health(NIH))授予Jianjie Ma博士的RO1-HL069000下由政府资助进行。美国政府享有本发明的一定权利。
技术领域
[0007] 本发明涉及用于调节心脏功能的组合物及其应用的方法。
背景技术
[0008] 为了维持细胞稳态，真核细胞通过响应各种来源损伤的活性循环和修复必须保持它们质膜的完整性。例如，响应外部损伤和内部衰退，身体的细胞必须修复围绕每个单个细胞的膜，以便保持它们的功能和有机体的健康。
[0009] 对质膜损伤的修复是活性的和动态的过程，其需要数个步骤，包括可检测质膜急性损伤的分子传感器(一个或多个)的参与、细胞内小泡在损伤位点的成核和小泡融合确保膜补片形成。已经表明细胞外钙的进入参与细胞内小泡融合至质膜，但是，还未充分解决参与感测损伤的膜信号和修复-补片形成的成核过程的分子机制。
[0010] 细胞修复外部膜能力的不足已被与广谱的疾病和病理学状况相关联，例如，神经变性疾病(例如，帕金森病、BSE和阿尔茨海默氏病)、心脏病发作、心力衰竭、肌肉萎缩症、褥疮、糖尿病性溃疡、氧化损伤和组织损伤，比如作为施用化疗剂副作用出现的鼻窦炎。而且，与各种疾病以及正常的老化过程相关的肌无力和萎缩已经与改变的膜修复相关联。为了这些细胞响应急性损伤修复它们的膜，它们利用在细胞内部称为小泡的小膜袋(membrane packet)。这些小泡通常出现在细胞内部，但是一旦细胞膜损伤，这些小泡移动至损伤位点并且形成补片以保持细胞完整性。没有该必需功能，细胞可能死亡，并且该细胞损伤的积累效果可最终导致组织或器官的功能障碍。
[0011] 冠状动脉粥样硬化造成的缺血性心脏病仍然是西方国家死亡率的单个最大原因，并且是在2020年世界范围内预测的第一位杀手1。由于动脉粥样硬化或心脏外科手术，心脏血液流动的堵塞导致急性心肌梗死，其产生两种不同类型的心肌损伤，包括由于血流的初始损失引起的缺血性损伤，和氧合血流恢复引起的再灌注损伤。尽管通过将代谢转变为无氧酵解和脂肪酸利用以及减少收缩性，心肌可耐受短暂暴露于局部缺血(约20分钟)，但是持续的局部缺血导致不可逆的心肌损伤，造成严重的肌细胞死亡和收缩量(contractile mass)的永久性损失。缺血性心脏的及时再灌注是保持心脏细胞活力的唯一途径。但是，经活性氧类(ROS)-诱导的氧化应激、线粒体通透性转变通道(MPEP)的诱导、过度收缩和凋亡的和坏死的心肌细胞死亡，再灌注可能激发对心肌的进一步损伤，即，缺血/再灌注(IR)损伤。因此，持久性的缺血性损伤和IR损伤代表重要的治疗性靶。
[0012] 尽管外科手术或药理学介入临床上用于重建心脏血流以及治疗心律不齐和与梗死相关的重塑，令人吃惊地目前不存在预防或缓解IR诱导的心肌损伤，尤其心肌细胞损伤和死亡的治疗。因为哺乳动物的心肌细胞在出生后不久自细胞周期不可逆地取出(withdraw)并且经历终末分化，所以保存心肌细胞对于MI后患者的良好结果至关重要。寻找保护心脏对抗IR损伤的介入已经吸引了生物医药研究人员超过20年，并且导致缺血预处理(IPC)的发现，即，针对心脏的非致死性缺血应激(IPC)保护免于随后的致死性心肌缺血/再灌注损伤。至今，IPC是保护包括心脏、脑、肝和肾在内的多个器官避免缺血/再灌注损伤的最有效的固有细胞机制。
[0013] 因此，现在需要开发用于治疗和/或预防与局部缺血和再灌注损伤相关的心脏损伤的药学调节剂。
发明内容
[0015] 具体地，当前描述的是核酸，和由本发明的核酸编码的多肽，其单独或结合其他组分可调节心脏功能。也描述了组合物，例如，多肽，编码细胞质的、细胞核的、膜结合的和分泌的多肽的核酸；以及载体、宿主细胞、抗体、重组蛋白、假肽、融合蛋白、化合物和生产其的方法。
[0016] 在某些方面中，本发明也涉及可用作治疗和/或预防由于心血管疾病和/或心脏缺血/再灌注损伤、低氧损伤、心力衰竭或其任意组合造成的心脏细胞和/或组织损伤的疗法的组合物。
[0017] 本发明的治疗性组合物包括MG53多肽，和编码MG53多肽的核酸，所述多肽例如，SEQ ID NO.1的蛋白质和MG53受体多肽，和突变体、同系物、片段、截短体(truncation)、假肽、肽类似物和拟肽(本文，“MG53多肽”)，以及可调节MG53的活性或MG53与MG53受体多肽例如，窖蛋白-3(SEQ ID NO.8)的分子间相互作用的蛋白质和化合物。如本文所描述，MG53用作心血管疾病和/或心脏缺血/再灌注损伤、低氧损伤、心力衰竭或其任意组合的保护性应答的重要调节剂，并且所以，靶向和调节MG53基因表达、多肽合成、活性或蛋白-蛋白相互作用代表治疗和/或预防IR损伤的新的治疗性介入。
[0018] 在进一步的方面中，本发明涉及包括本发明的多肽结合如此试剂的组合物，所述试剂与MG53多肽或MG53受体多肽的活性协同地发挥其效果。在某些实施方式中，调节试剂包括，例如，生物活性剂、磷脂酰丝氨酸(phosphotidylserine)；锌，例如，锌盐、锌载体或锌缀合物的形式；三七(notoginsing)；和氧化剂。
[0019] 在某些另外的方面中，本发明涉及与治疗和/或预防心脏组织损伤相关的组合物和方法。在某些示例性实施方式中，本发明包括，例如，施用有效量的本发明的治疗性组合物，用于预防和/或治疗细胞或组织损伤，比如在遭受心血管疾病和/或心脏缺血/再灌注损伤、低氧损伤、心力衰竭或其任意组合的对象中出现的那些。
[0020] 另外，本发明涉及包括干扰核酸在内的核酸，和编码MG53和/或MG53相互作用蛋白的多肽，例如，CSN6、驱动蛋白、窖蛋白-3(SEQ ID NO.8)、轴周蛋白、磷酸肌醇-3激酶(PI3K)，和髓磷脂碱性蛋白、突变体、截短体、片段、同系物、假肽和拟肽，以及可调节它们的活性或它们与MG53的分子间相互作用的化合物。所以，在另外的方面中，本发明包括靶向窖蛋白-3(SEQ ID NO.8)基因表达、活性和/或分子间相互作用以治疗和/或预防对象中疾病或不适，例如，心血管疾病和/或心脏缺血/再灌注损伤、低氧损伤、心力衰竭或其任意组合的方法。
[0021] 在另外的方面中，本发明涉及筛选和鉴定可用作治疗或预防心血管疾病和/或心脏缺血/再灌注损伤、低氧损伤、心力衰竭或其任意组合的疗法的试剂的方法。在某些方面中，本发明包括为至少一种MG53的表达和/或活性和/或磷酸化的激动剂的试剂、肽、核酸或化合物。
[0022] 在仍另外的方面中，本发明涉及治疗和/或预防心血管疾病和/或心脏缺血/再灌注损伤、低氧损伤、心力衰竭或其任意组合的方法，包括施用有效量的MG53、CaV3的至少一种的表达和/或活性的激动剂。
[0023] 仅通过举例的方式给出前述一般的应用领域，并且不意图限制本公开和所附权利要求的范围。本领域普通技术人员根据本权利要求、说明书和实施例将认识到本发明另外的目标和优势。例如，本发明的各个方面和实施方式可以以许多组合使用，其所有被本说明书明确考虑。这些另外的目标和优势明确包括在本发明的范围内。附图说明
[0024] 并入说明书并且构成说明书一部分的附图图解了本发明的数个实施方式并且与说明书一起用于解释本发明的原理。附图仅仅用于图解本发明实施方式的目的，而不认为限制本发明。
[0025] 图1：MG53是TRIM蛋白家族的肌肉特异性成员。来自各种生物体的MG53蛋白序列的比对(见SEQ ID NOs.：1、3、5、9-16)表明该蛋白是TRIM家族的成员。功能结构域以灰色框出，并且箭头指示结构域在序列的另一行上继续。框出的亮氨酸残基指示高度保守的亮氨酸拉链基序的位置。
[0026] 图2：图解包含MG53中存在的一个或多个保守三联基序的一些同源蛋白的示例性结构域比较。MG53的独特之处在于其易位至多种形式损伤后细胞膜处的损伤部位并介导损伤膜的修复的能力——列举的其他TRIM家族蛋白未显示的功能。尽管这些TRIM蛋白都包含类似的结构域和/或在横纹肌中表达，但是都没有充分重现MG53的结构域组织。
[0027] 图3：MG53包含独特的TRIM和SPRY基序并且主要表达在肌细胞中。A.MG53基序结构的图。从cDNA克隆和同源性搜索的结果，如所显示，在MG53中检测到数个基序序列。兔和小鼠MG53cDNA的序列已经分别以登录号AB231473和AB231474保存在数据库中。B.蛋白质印迹分析显示MG53在骨骼肌和心肌中的特异性表达。使用抗小鼠MG53多克隆抗体分析来自小鼠组织(肺、肾、骨骼肌、肝、心脏、脑)的溶胞产物(每条泳道20μg总蛋白)。
C.来自小鼠骨骼肌细胞的纵向横截面的免疫荧光染色。比例尺是125μm。
C.来自小鼠骨骼肌细胞的纵向横截面的免疫荧光染色。比例尺是125μm。
[0028] 图4：MG53敲除小鼠对心脏损伤易感。来自未运动的(unexercised)野生型小鼠的石蜡包埋的心肌切片显示正常的形态(左)并且没有伊凡斯蓝染色(右)。相反，mg53-/-小鼠展示伊凡斯蓝渗入肌细胞，这表示mg53-/-心脏中的膜完整性存在明显缺陷。
[0029] 图5：MG53的损失增加对心脏缺血/再灌注损伤的易感性。自野生型(WT)和mg53-/-小鼠分离心脏，并且在Langendorff仪器上灌注。通过停止灌注液流诱导全心缺血30分钟。通过用于(a)肌酸激酶(CK)或(b)乳酸脱氢酶(LDH)的酶检测法测量恢复灌注液流(时间0)之后心脏中产生的损伤。来自mg53-/-小鼠的心脏(虚线)显示比WT(实线)更多的损伤。对于每个列举的时间点数据以均值±S.D.表示。
[0030] 图6：MG53和窖蛋白-3之间的功能性相互作用调节骨骼肌中动态膜出芽过程。A.C2C12细胞分化期间，在分化诱导后的指定时间(0、2、5、8、10天)，MG53(上图)、窖蛋白-3(中图)和窖蛋白-1(下图)的表达水平的蛋白质印迹分析。B.来自小鼠腓肠肌骨骼肌的全细胞溶胞产物与抗MG53(兔多克隆抗体)、抗窖蛋白-3(小鼠单克隆抗体)进行co-IP，正常兔IgG作为阴性对照和细胞溶胞产物作为阳性对照。C.共聚焦图像，图解与成肌细胞(左图)相比C2C12肌管形成过程期间(右图)filapodia样结构的消失。注意到，在转染的C2C12肌管中仍然存在对GFP-MG53阳性的细胞内小泡。D.C2C12成肌细胞中窖蛋白-3的过表达防止形成MG53-诱导的filapodia样结构。CHO细胞(上图)或C2C12成肌细胞细胞(下图)与pCDNA-Cav-3和GFP-MG53(10:1)共转染(右图)，或与pcDNA载体和GFP-MG53(10:1)共转染作为对照(左图)。转染48小时后获取共聚焦图像。比例尺是
10μm。E和F.为C和D的统计分析。展示filapodia样结构的细胞与所有绿色细胞的比定义为filapodia样结构百分数。数据表示为均值和SEM。(通过t检验，*p<0.01)。
10μm。E和F.为C和D的统计分析。展示filapodia样结构的细胞与所有绿色细胞的比定义为filapodia样结构百分数。数据表示为均值和SEM。(通过t检验，*p<0.01)。
[0031] 图7：shRNA-介导的窖蛋白-3表达的抑制影响肌管形成。A.在用针对C2C12肌管的窖蛋白-3的shRNA质粒转染之后(分化后6天)通过蛋白质印迹分析窖蛋白-3的下调水平。用错义(scrambled)shRNA质粒转染的细胞用作对照。B.与对照shRNA(左图)相比，shRNA引起的窖蛋白-3下调(右图)抑制肌管形成。红色荧光指示转染细胞。在分化诱导后6天获取荧光显微图像。比例尺是20μm。C.统计分析显示与对照相比，在6天，窖蛋白-3的下调明显抑制肌管形成(通过t检验，*p<0.001)。红色荧光肌管与所有红色荧光细胞的比用作肌管的百分数。数据表示为均值和SEM。D.具有GFP-MG53和窖蛋白-3的shRNA共表达(右图)的C2C12成肌细胞的共聚焦图像显示，与对照shRNA(左图)相比，对GFP-MG53诱导的filapodia样结构没有影响或对GFP-MG53分布没有影响。比例尺是5μm。
[0032] 图8：MG53敲除小鼠对心脏损伤易感。来自未运动的野生型小鼠的石蜡包埋的心肌切片显示正常的形态(左)并且没有伊凡斯蓝染色(右)。相反，mg53-/-小鼠展示伊凡斯蓝渗入肌细胞，表示mg53-/-心脏中的膜完整性存在明显缺陷。
[0033] 图9：重组人TAT-MG53(见HIV-1TAT蛋白，SEQ ID NO.17)可渗透不同来源的细胞。HL-1心肌细胞和3T3成纤维细胞用4或8μg/mL重组人TAT-MG53在37℃下温育15分钟。在缓冲盐溶液中冲洗细胞3次并且接着裂解用于蛋白质印迹分析。蛋白质印迹显示对照细胞(对照)不包含内源性MG53，但是，用TAT-MG53温育的那些包含大量的细胞内TAT-MG53。注意到，由于向该蛋白添加了TAT细胞渗透肽，因此TAT-MG53稍微大于从骨骼肌提取物(肌肉)可见的MG53。
[0034] 图10：细胞外空间中施加的重组MG53可识别分离的心肌细胞中肌纤维膜破裂的位点。我们发现细胞膜的急性损伤导致信号暴露至细胞外空间，其可被MG53检测，这使得重组MG53当提供在细胞外空间时修复膜损伤。(A)这里我们分离重组RFP-MG53融合蛋白并且将该蛋白提取物施加至围绕培养的C2C12肌细胞的外部培养基。(B)用微电极通透细胞两次，损伤肌纤维膜(圆)。RFP-MG53和亮视野的共聚焦图像被覆盖并且是清楚的，可在肌纤维膜损伤的位点观察到FFP-MG53的进行性积累。我们也用在心肌细胞的细胞外溶液中温育RFP-MG53进行类似的实验(未显示)。这些结果指示重组MG53蛋白可在外部施加至细胞并且在靶向膜损伤位点方面仍有效。
[0035] 图11：缺血/再灌注损伤期间重组MG53的心脏保护作用。(A)野生型小鼠(C57Bl6/J)心脏在Langendorff灌注期间进行全心缺血/再灌注(I/R)损伤。用Krebs缓冲液以2mL/min的流速灌注心脏，并且允许Krebs缓冲液补充MBP-MG53(40μg/ml)或等摩尔浓度的牛血清白蛋白(BSA)作为对照之前平衡30min。添加蛋白之后灌注流停止5分钟并且心脏保持在缺血性状态30min。为了诱导I/R损伤，在心脏从仪器去除之前再灌注心脏60min并且用氯化三苯基四氮唑(TTC)染色以使用标准技术指示梗死区域。我们显示来自BSA(左)和MBP-MG53(右)处理的心脏的TTC-染色的心脏薄片的代表性图像。明显地，与作为对照用BSA处理的心脏相比，施加MG53至灌注溶液产生减少的梗死尺寸。(B)为心脏薄片照相，并且接着使用ImageJ软件分析梗死面积。当用T-检验测量时，与MBP-MBP处理的心脏(n=4)相比，MBP-MG53(n=4)处理的心脏的梗死尺寸显著降低。数据表示为均值±SEM，*指示p<0.05。(C)小鼠心脏灌注期间，从在不同时间点收集的流出物，测量释放至灌注液的肌酸激酶(CK)。当局部缺血之后恢复灌注后的第一分钟测试CK水平，我们发现局部缺血期间MG53的预温育可减少释放至灌注液的CK的量(n=4对，通过T-检验，**p<0.01)。该数据提供如此吸引人的可能性：重组MG53可对心肌细胞的局部缺血诱导的损伤具有另外的保护作用。(D)在再灌注的各个时间段，遭受30min局部缺血和在再灌注期间用BSA(黑色)或重组MBP-MG53(红色)灌注的1小时灌注的灌注液心脏中CK浓度的变化(n=4对，*p<0.05，通过ANOVA)。施加MG53的显著CK减少提供缺血-再灌注期间，MG53心脏保护功能的直接支持。(E)为图D收集的灌注液样品也显示增加水平的LDH释放，但是需要另外的重复(replicant)以达到统计显著性。
[0036] 图12：当在诱导缺血/再灌注损伤之后施加时，重组MG53具有心脏保护能力。在使用图2中描述的相同条件的一系列分开的Langendorff灌注实验中，我们检验如果在开始I/R损伤之后施加，重组MG53是否具有心脏保护作用。在这些实验中，在30分钟的局部缺血后心脏再灌注之后，仅仅添加MG53。在小鼠心脏的再灌注期间，从在不同时间点收集的流出物中，测量释放至灌注液的肌酸激酶(CK)。图表显示来自遭受30min局部缺血和在再灌注期间提供BSA(黑色)或重组MBP-MG53(红色)的1小时再灌注的心脏灌注液中CK浓度的变化。(n=4对，通过ANOVA，*p<0.05)。施加MG53的CK的显著减少显示MG53可以保护心脏的，即使当在开始I/R损伤之后施加。
[0037] 图13：I/R损伤之后，在整个心脏中重组MG53定位至膜破裂的位点。图2中描绘的I/R损伤方案之后，用MBP-MG53灌注的小鼠心脏另外用与FITC发光团连接的重组膜联蛋白V灌注。膜联蛋白-V将结合磷脂酰丝氨酸——通常仅仅出现在质膜内小叶上的磷脂。因此，在心肌细胞的肌纤维膜破裂的位点中，膜联蛋白-V获取磷脂酰丝氨酸并且能够结合损伤的位点。膜联蛋白-FITC的灌注之后，心脏固定在多聚甲醛中，冷冻切片并且然后通过免疫组织化学染色以使用抗MBP抗体定位MBP-MG53。(A)膜联蛋白-FITC标记的检测遍及心肌显示心肌细胞以无规模式的局灶性损伤(focal injury)位点。(B)MBP-MG53的免疫染色显示许多这些损伤位点也展示对MBP-MG53的染色(如在图C的这些图像的重叠中显示的)，这提示重组MG53可体内定位和修补膜破裂的位点以提供对I/R损伤的心脏保护作用。这些结果显示图1中分离的心肌细胞中看到的相同现象也出现在整个心脏中并且可提供对靶向心肌细胞的保护作用。
[0038] 图14：IV注入之后重组MG53在大鼠血清中的药物代谢动力学。(A)在IV注入之后的不同时间点大鼠血清中MBP-MG53水平的夹心ELISA分析。捕获抗体，40ug/ml的小鼠单克隆抗MG53(克隆#5257)，在37℃下50ul的PBS包被在96孔板上1hr。用PBS中1%BSA封闭抗体。封闭液中1:100稀释的处理的大鼠血清在每个孔中在37℃下温育1hr。用HRP缀合的抗MBP抗体(1:2,000稀释，BioLab)检测血清中结合的MBP-MG53，在OD488下测量OPD试剂(Thermo)。对照纯化的MBP-MG53(0、7.5、15、30、60、120和240ng/ml)用于标准化。数据表示为3只大鼠的均值±SEM。(B)对相同的大鼠血清样品中MBP-MG53的免疫印迹分析。对于每个样品，10ug的总血清上样至单个孔中，并且在SDS-PAGE凝胶上电泳。转移的膜用抗MBP抗体在室温下印迹1小时(顶)。平行上样的凝胶用考马斯亮蓝染色作为蛋白上样的对照(底)。
[0039] 图15：通过4周气管间(I.T.)施加MG53产生的抗体不阻断MG53的功能。大部分蛋白治疗剂在它们用作疗法的过程中产生一些免疫应答。为了检测重组MG53是否产生抗体应答和这些抗体是否阻断MG53功能，用每天IT施加重组MG53处理大鼠4周。(A)等量的重组MBPMG53蛋白转移到蛋白质印迹膜上，其接着切割成条带。每个条带用来自4周I.T.施加试验作为一抗的大鼠血清温育。这些血清样品被汇聚(左)或用于单个大鼠(右)。注入MBP-MG53(右)的大鼠产生对重组MBP-MG53的抗体应答，而注入盐水的那些(左)。最后的孔是与抗MBP抗体反应的条带，以作为阳性对照。具有数值的线指示分子量标记的位置。(B)IgG部分分离自汇聚的大鼠样品(1-10)并且接着通过ELISA试验检测——包被MBP-MG53或His-MG53。来自这些大鼠的分离的IgG抗体可识别MG53。(C)HEK293细胞玻璃珠损伤之后，在LDH释放试验中检测图B中检测的分离的IgG部分。通过I.T.施加MBP-MG53产生的抗体不阻断MBP-MG53在损伤之后重新包封质膜的活性。
[0040] 图16：未加标签的重组MG53蛋白是稳定的并且有效预防肌细胞膜损伤。我们继续的开发努力部分朝向使用重组MG53蛋白治疗对横纹肌组织的损伤。通过从在大肠杆菌中表达的蛋白质(MBP-MG53)去除麦芽糖结合蛋白(MBP)免疫亲和性标签，我们已经生产了大量的未加标签的MG53(MG53)。(A)未加标签的MG53可被冻干用于长期保存，并且然后在使用之前有效地重悬浮在生理盐溶液中。使用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶使蛋白质可视化，显示其有效重悬浮在溶液中并且可分离适当尺寸的蛋白质至大于95%的纯度。每条泳道包含10□g的每个蛋白样品。(B)剂量应答曲线用于测量不同蛋白制剂对预防细胞膜损伤的效力。自细胞的细胞内乳酸脱氢酶(LDH)的释放用作细胞发生的损伤的数量的指数(index)。未加标签的重组MG53蛋白(MG53，闭合三角形)证明从暴露于玻璃微珠对5
HEK293细胞(96孔盘的每个孔9.0x10 个细胞)损伤之后高效增加细胞膜重新包封。MG53好像与MBP-MG53(圆)一样有效预防细胞损伤——如果不是甚至更有效的话。通过重悬浮的蛋白保存在4℃两周(空心三角形)之后重复该试验，确认了重组MG53的稳定性。没有观察到蛋白效力的下降。n=4，误差棒(error bar)是S.E.M.(C)通过心脏毒素(CTX)与不同的蛋白制剂肌内(IM)共注入至野生型小鼠的腓肠肌确认MG53蛋白的体内效力。注入后
6小时记录血清肌酸激酶(CK)水平。MG53和MBP-MG53证明同等有效预防肌细胞膜损伤。
对于BSA组：n=5；MBP-MG53组：n=5；MG53组：n=7。(*：P<0.05vs BSA)。(D)其他野生型小鼠的腓肠肌用于IM共注入CTX、MBP-MG53和重组FITC标记的膜联蛋白V。膜联蛋白V结合当细胞膜破裂时将暴露的磷脂酰丝氨酸(PS)。通过免疫染色(右)MG53和通过共焦显微术FTIC-膜联蛋白V(左)的共定位指示MG53可结合损伤的细胞上暴露的PS以定位质膜损伤的位点。(E)其他腓肠肌共注入有CTX、MG53和伊凡斯蓝染料。为MBP-MG53免疫染色的切片的共焦显微术(左)显示用CTX损伤的纤维在肌肉纤维的外围展示MBP-MG53。不在膜上展示MBP-MG53的细胞也具有增加的伊凡斯蓝染料渗透(右，箭头)。(F)多个显微镜视野中伊凡斯蓝阳性肌肉纤维的计数显示当与CTX共注入时，MBP-MG53可防止伊凡斯蓝染料进入肌肉纤维。**：P<0.01MBP-MBP vs MBP-MG53。
HEK293细胞(96孔盘的每个孔9.0x10 个细胞)损伤之后高效增加细胞膜重新包封。MG53好像与MBP-MG53(圆)一样有效预防细胞损伤——如果不是甚至更有效的话。通过重悬浮的蛋白保存在4℃两周(空心三角形)之后重复该试验，确认了重组MG53的稳定性。没有观察到蛋白效力的下降。n=4，误差棒(error bar)是S.E.M.(C)通过心脏毒素(CTX)与不同的蛋白制剂肌内(IM)共注入至野生型小鼠的腓肠肌确认MG53蛋白的体内效力。注入后
6小时记录血清肌酸激酶(CK)水平。MG53和MBP-MG53证明同等有效预防肌细胞膜损伤。
对于BSA组：n=5；MBP-MG53组：n=5；MG53组：n=7。(*：P<0.05vs BSA)。(D)其他野生型小鼠的腓肠肌用于IM共注入CTX、MBP-MG53和重组FITC标记的膜联蛋白V。膜联蛋白V结合当细胞膜破裂时将暴露的磷脂酰丝氨酸(PS)。通过免疫染色(右)MG53和通过共焦显微术FTIC-膜联蛋白V(左)的共定位指示MG53可结合损伤的细胞上暴露的PS以定位质膜损伤的位点。(E)其他腓肠肌共注入有CTX、MG53和伊凡斯蓝染料。为MBP-MG53免疫染色的切片的共焦显微术(左)显示用CTX损伤的纤维在肌肉纤维的外围展示MBP-MG53。不在膜上展示MBP-MG53的细胞也具有增加的伊凡斯蓝染料渗透(右，箭头)。(F)多个显微镜视野中伊凡斯蓝阳性肌肉纤维的计数显示当与CTX共注入时，MBP-MG53可防止伊凡斯蓝染料进入肌肉纤维。**：P<0.01MBP-MBP vs MBP-MG53。
[0041] 图17：心肌梗死的猪模型。心肌缺血/再灌注(I/R)损伤的猪(porcine)(猪(pig))模型用于测试治疗性努力对心肌梗死(MI)也称为心脏病发作的作用。在这些实验中，经导管插入术插入血管成形术球囊，并且球囊膨胀以在冠状循环中建立阻塞。快速的再充氧导致对心脏的另外的I/R损伤和心脏细胞的死亡。该损伤可在局部缺血(左)后24小时，在心脏的大体形态中观察到，并且心脏的切片(右)显示大面积的死的心肌(显示白色的区域)，而剩余的健康心肌具有棕色外观。
[0042] 图18：局部缺血前施加rMG53保护对猪心脏的损伤。在这些实验中，rhMG53静脉内注入猪，然后血管成形术球囊膨胀以在心脏中建立局部缺血。rhMG53预防一部分与MI相关的初始缺血性损伤以及一些再灌注之后出现的I/R损伤。该心脏保护可在局部缺血后24小时心脏的大体形态(左)，以及心脏的切片(右)中观察到，其中与对照猪相比有减少面积的死心肌(显示白色的区域)。
[0043] 图19：再灌注前施加rMG53保护免于对猪心脏的损伤。为了测试当就在恢复血流之前(即再灌注之前)施加时，rhMG53预防与MI相关的损伤的效力，就在血管成形术球囊被去除以允许心脏再灌注之前，将rhMG53静脉内注入猪。用rhMG53的这种处理减少对心脏的损伤，这提示rhMG53可预防一些部分的再灌注之后心脏中出现的I/R损伤。该心脏保护可在局部缺血后24小时心脏的大体形态(左)，以及心脏的切片(右)中观察到，其中与对照猪相比有减少面积的死心肌(显示白色的区域)。
[0044] 图20：再灌注后30min施加rMG53对猪心脏的损伤具有有效的保护作用。测试在猪球囊血管成形术模型中当恢复血流(即再灌注后)后30分钟施加时，rhMG53预防与MI相关的损伤的效力。血管成形术球囊去除后30分钟，将rhMG53静脉内注入猪。再灌注后施加rhMG53减少对心脏的损伤，这提示rhMG53可预防一些部分的再灌注之后——甚至当在从冠状血管中去除阻塞后30分钟施加时——心脏中出现的I/R损伤。该心脏保护可在局部缺血后24小时心脏的大体形态(左)，以及心脏的切片(右)中观察到，其中与对照猪相比有减少面积的死心肌(显示白色的区域)。
[0045] 图21：重组MG53蛋白保护对猪心脏的急性MI。梗死面积分析显示rhMG53蛋白保护对猪心脏的急性MI。猪中诱导实验MI后24小时，移出心脏并且切成切片，以允许根据方案评估发展损伤的心脏的总面积。这些切片的染色允许确定由于心肌梗死的损伤大部分心肌已经死亡的面积。该面积可从照片图像确定并且接着除以分析切片的总表面积。该“梗死面积的百分数”确定心脏损伤的程度。与注入盐水代替rhMG53的对照动物相比(对照，n=6)，诱导局部缺血前(前，n=5)，就在恢复血流之后(之后1min，n=5)和再灌注后30分钟(30min后，n=5)静脉内施加rhMG53都可大大地减少猪心脏的梗死尺寸。
[0046] 图22：rhMG53处理后MI中血清肌钙蛋白I(TnI)水平下降。心脏肌钙蛋白是广泛使用的血液生物标记物，其表明在人患者中已经出现了MI并且可提供MI程度的一些指数。血清肌钙蛋白I水平用作rhMG53对猪中MI保护作用的指示物。局部缺血之前(处理前)或再灌注后(30mins后)通过静脉内注入递送rhMG53。蛋白质印迹分析显示MG53的处理减少心脏特异性肌钙蛋白I释放至血液循环。这指示rhMG53可预防猪中与MI相关的损伤。
[0047] 图23：随着rhMG53处理Akt磷酸化增加。为了测试rhMG53是否可具有调节Akt途径的作用，在rhMG53和诱导MI(梗死)之后收集猪心脏组织，并且然后通过蛋白质印迹分析Akt激活/磷酸化。缺血/再灌注损伤后24小时，从心脏的三个位置收集组织。收集样品，并且通过与梗死形成位置的距离标记，“远”意思是远离梗死形成位置，“近”意思是靠近梗死形成位置，“梗死”意思是来自梗死形成区域。IV递送rhMG53至细胞外空间可导致激活细胞内存活蛋白激酶途径(如由Akt表示)。
[0048] 图24：猪中MI后4周，可检测rhMG53的保护作用。为了测试rhMG53是否可预防心脏的重塑和纤维疤痕的形成，允许猪在球囊血管成形术诱导的MI之后在不同时间点注入rhMG53恢复4周。MI后4周，来自对照(盐水注入的)动物的3个不同猪心脏的代表性图像(左)显示明显的白色纤维疤痕和心室壁变薄(箭头)。就在恢复血流之前(即再灌注之前)，rhMG53静脉内注入的3个猪在MI后4周显示减少的疤痕形成并且没有心肌的变薄(箭头)(中间)。当其在血流恢复后(即再灌注之后)5分钟IV注入并且然后在MI后4周(右)收集心脏，rhMG53的心脏保护作用也是明显的。数据显示rhMG53可提供MI后心脏的结构改善，其可预期降低处理动物的心力衰竭的严重性。
[0049] 发明详述
[0050] 如本文所描述，MG53用作心血管疾病和/或心脏缺血/再灌注(IR)损伤、低氧损伤、心力衰竭或其任意组合的保护性应答的重要调节剂，并且所以，靶向和调节MG53基因表达、多肽合成、活性或蛋白-蛋白相互作用代表治疗和/或预防例如IR损伤的新的治疗性介入。
[0051] 出于所有的目的，于2009年1月2日提交的美国专利申请系列号12/307,303；其要求于2008年7月11日提交的PCT/US2007/015815的权益；其要求于2006年7月11日提交的美国临时申请号60/830,013的权益；和于2006年12月22日提交的60/876,871；和于2008年12月4日提交的美国专利申请系列号12/328,646；其要求于2007年12月4日提交的美国临时申请61/005,410的权益；其内容通过引用以它们的整体并入本文。另外，出于所有的目的，通过引用将WO2008/054561;Cai等,MG53nucleates assembly of cell membrane repair machinery.Nature Cell Biol.,11(1):p_-_(January2009); 和Cai等,MG53regulates membrane budding and exocytosis in muscle cells.Journal of Biological Chemistry.,2008年11月24在线公开，并入本文说明书。
[0052] 本发明部分涉及令人吃惊的和意料不到的发现：重组核酸序列和相关的多肽(见，SEQ ID NOs.：1-15)能够利于治疗和/或保护心脏(即，心肌)细胞和心脏组织免于心血管疾病、心脏缺血/再灌注损伤、低氧损伤、心力衰竭和/或其任意组合。之前，本发明人发现急性膜修复期间的小泡融合由mitsugumin53(MG53)(SEQ ID NO.1-15)——新的肌肉特异性三联基序(TRIM)家族蛋白——驱动。MG53表达利于细胞内小泡运输至质膜并且与质膜融合等。之前的实验结果也指示MG53功能在心脏功能中重要，并且反映缺血/再灌注和/或低氧损伤。
[0053] 迄今，抗缺血/再灌注(IR)损伤的介入法已经成为缺血预处理(IPC)研究的中2,10
心，其中严重的IR发作之前的短暂性缺血事件可减少对心肌 ，以及其他组织，比如脑、肝
11-13
和肾 中的损伤。各种信号传导分子，包括存活蛋白激酶(PI3K、Akt和GSK3β)和支架蛋白，比如窖蛋白-3(calveolin-3)(CaV3，肌肉特异性窖蛋白)已经牵扯在IPC中。一种假设是缺血应激同时开始多个信号传导途径，其在不连续的微结构域，比如胞膜窖、富含脂质的质膜内陷中，时间和空间上组织。例如，窖蛋白可用作募集多个信号传导蛋白比如PI3K、ERK1/2、Src激酶、PKC、eNOS、G-蛋白-偶联受体和G蛋白的支架，利于它们的激活，从而提供细胞信号转导的时间和空间调节。的确，胞膜窖或其结构蛋白CaV3的破裂使得心脏抵抗IPC保护(即，IPC的保护作用被抑制)。但是，负责快速连接细胞内信号传导与质膜修复和负责同时活化的IPC信号传导事件的时间和空间组织的分子机制(一种或多种)之前是未知的。
心，其中严重的IR发作之前的短暂性缺血事件可减少对心肌 ，以及其他组织，比如脑、肝
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和肾 中的损伤。各种信号传导分子，包括存活蛋白激酶(PI3K、Akt和GSK3β)和支架蛋白，比如窖蛋白-3(calveolin-3)(CaV3，肌肉特异性窖蛋白)已经牵扯在IPC中。一种假设是缺血应激同时开始多个信号传导途径，其在不连续的微结构域，比如胞膜窖、富含脂质的质膜内陷中，时间和空间上组织。例如，窖蛋白可用作募集多个信号传导蛋白比如PI3K、ERK1/2、Src激酶、PKC、eNOS、G-蛋白-偶联受体和G蛋白的支架，利于它们的激活，从而提供细胞信号转导的时间和空间调节。的确，胞膜窖或其结构蛋白CaV3的破裂使得心脏抵抗IPC保护(即，IPC的保护作用被抑制)。但是，负责快速连接细胞内信号传导与质膜修复和负责同时活化的IPC信号传导事件的时间和空间组织的分子机制(一种或多种)之前是未知的。
[0054] 令人吃惊地和意料不到地，我们已经发现mitsugumin53(MG53)——一种肌肉特异性TRIM家族蛋白(TRIM72)——与骨骼肌中CaV3形成功能复合物，并且有助于细胞内小泡运输、膜融合、胞吐作用、小泡出芽和横纹肌细胞的肌形成。值得注意，MG53专门地在心脏和骨骼肌中表达，心肌中存在最高的表达。尽管我们的研究确定了MG53在修复对骨骼肌中肌7
纤维膜的急性损伤中的功能 ，但是它们也提示响应各种损伤，尤其是缺血性损伤，MG53-介导的心脏保护作用的机制。我们的发现之前，MG53在心脏中的功能作用是未知的并且不可能已被合理地预测。
纤维膜的急性损伤中的功能 ，但是它们也提示响应各种损伤，尤其是缺血性损伤，MG53-介导的心脏保护作用的机制。我们的发现之前，MG53在心脏中的功能作用是未知的并且不可能已被合理地预测。
[0055] 目前，公开了另外的证据，显示MG53是心脏IPC机制的关键组分。令人吃惊地，我们已经发现IR导致IPC预防的MG53在mRNA和蛋白水平明显的下调，并且MG53不足使得心脏更容易遭受IR诱导的心脏损伤，并且抵抗IPC保护。明显相反，我们已经发现MG53的过表达保护心肌细胞免于低氧/局部缺血应激诱导的细胞损伤和细胞死亡。本发现将MG53定义为心脏IPC机制的主要组分，标记为MG53，并且其相关的信号传导途径，和相互作用蛋白定义为用于治疗和/或预防心血管疾病、心脏缺血/再灌注损伤、低氧损伤、心力衰竭和/或其任意组合的新的和有用的治疗性靶。
[0056] 本发明包括的生物聚合物组合物在本文统称为和互换称为“MG53核酸”或“MG53多核苷酸”或“编码利于缺血/再灌注和/或低氧保护的多肽的核酸”或和对应的编码的多肽称为“MG53多肽”或“MG53蛋白”或“利于缺血/再灌注和/或低氧保护的多肽”。除非另外指出，“MG53”通常用于指任何MG53相关的和/或MG53延伸的生物聚合物，如本文明确地、直接地或固有地描述的。
[0057] 除非另外定义，本文使用的所有的技术和科学术语具有如本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同意思。本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用以它们的整体并入。在冲突的情况下，以本说明书，包括定义为准。另外，材料、方法和实施例仅仅是示意性的并且不意图是限制性的。
[0058] 响应外部损伤和内部衰退，身体的细胞必须修复围绕每个单个细胞的膜，以便维持它们的功能和生物体的健康。细胞修复外部膜的能力的缺陷或难以氧化应激已经与许多疾病相关联，比如神经变性疾病(帕金森病)、心脏病发作、局部缺血、低氧、心力衰竭和肌肉萎缩症。另外，与各种疾病以及正常的老化过程相关的肌无力和萎缩已经与改变的膜修复和/或氧化应激相关联。而且，膜损伤和氧化应激出现在慢性疾病之外的许多其他病理学状况中，例如，在糖尿病和其他健康患者中的UV暴露、小割伤(minor cuts)、皮肤擦伤、外科切口和溃疡、局部缺血、再灌注、低氧都涉及一些细胞膜损伤和氧化应激的组分。为了这些细胞响应急性损伤修复它们的膜，它们利用细胞内部，称为小泡的小膜袋。这些小泡通常出现在细胞内，但是一旦细胞膜损伤，这些小泡移动至损伤位点并且形成补片以维持细胞完整性。如果没有该必需功能，细胞可能死亡并且该细胞损伤的积累作用可最终导致组织或器官的功能障碍。考虑到，本发明提供治疗和/或预防细胞/组织损伤尤其是心血管疾病、心脏缺血/再灌注损伤、低氧损伤、心力衰竭和/或其任意组合的有害作用的组合物和方法。
[0059] 如上述，在某些方面中，本发明涉及MG53核酸，和由本发明的核酸编码的MG53多肽，其单独或结合其他组分可调节细胞膜修复过程和保护免于心血管疾病、心脏缺血/再灌注损伤、低氧损伤、心力衰竭和/或其任意组合，以在大范围的细胞和组织类型中可作为结果出现的氧化应激。在某些实施方式中，本发明包括组合物，其包括，例如，MG53多肽、编码重组MG53多肽的MG53核酸；以及载体，和包括其的宿主细胞；抗体、假肽、融合蛋白、化合物，和生产其的方法。
[0060] 在某些方面中，本发明也涉及可用作治疗和/或预防由于心血管疾病和/或心脏缺血/再灌注损伤、低氧损伤心力衰竭或其任意组合造成的心脏细胞和/或组织损伤的疗法的组合物。在某些实施方式中，本发明的该方面包括本发明的组合物和药学上可接受的赋形剂。本文描述了适合用于本发明任何实施方式的示例性赋形剂。在某些实施方式中，本发明的组合物可另外地包括另一生物学活性试剂，其补充或协同本发明的组合物的活性。
[0061] 在某些实施方式中，本发明的治疗性组合物包括MG53多肽，和编码MG53多肽的核酸，例如，SEQ ID NO.1的蛋白和MG53多肽突变体、同系物、片段、截短体、假肽、肽类似物和拟肽(本文，“MG53多肽”)，以及可调节MG53的活性或MG53与其受体(即，直接或间接结合或相互作用蛋白)，例如，窖蛋白-3(SEQ ID NO.8)分子间相互作用的核酸(例如，小RNAs或反义RNAs)、多肽和化合物。
[0062] 在另外的方面中，本发明包括本发明的组合物结合协同调节MG53多肽活性的试剂。在某些实施方式中，调节试剂包括，例如，磷脂酰丝氨酸；锌，例如，锌盐、锌载体或锌缀合物的形式；三七；或氧化剂。
[0063] 在某些另外的方面中，本发明涉及治疗和/或预防心血管疾病和/或心脏缺血/再灌注损伤、低氧损伤、心力衰竭或其任意组合的方法。在该方面的某些示例性实施方式中，本发明包括施用有效量的本发明的治疗性组合物至个体，其中组合物有效预防和/或治疗心血管疾病和/或心脏缺血/再灌注损伤、低氧损伤、心力衰竭或其任意组合。在另外的方面中，本发明包括治疗性方法，其进一步包括在施用本发明的治疗性组合物之前，和/或大致同时，和/或之后的时刻进行缺血预处理(IPC)步骤。
[0064] 在另外的方面中，本发明包括治疗和/或预防心血管疾病和/或心脏缺血/再灌注损伤、低氧损伤、心力衰竭或其任意组合的方法，其包括在个体上进行缺血预处理和在IPC步骤之前、基本上同时或IPC步骤之后，施用有效量的本发明的治疗性组合物至个体的步骤。在本发明该方面的任何实施方式中，方法也可包括添加调节窖蛋白-3的活性或表达的试剂。
[0065] 在另外的方面中，本发明涉及调节MG53或和MG53受体表达的干扰和反义核酸。“MG53受体”包括直接和/或间接与MG53相互作用的多肽，并且包括，例如，窖蛋白-3(SEQ ID NO.8)以及可调节它们的活性或它们与MG53分子间相互作用的化合物。所以，在另外的方面中，本发明包括靶向窖蛋白-3、基因表达、活性和/或分子间相互作用的方法，用于治疗和/或预防对象中的疾病或不适，例如，心血管疾病和/或心脏缺血/再灌注损伤、低氧损伤、心力衰竭或其任意组合。
[0066] 在另外的方面中，本发明包括从可用作治疗或预防心血管疾病和/或心脏缺血/再灌注损伤、低氧损伤、心力衰竭或其任意组合的疗法的试剂文库中筛选和鉴定试剂的方法。在该方面的某些实施方式中，本发明包括提供化合物的文库和筛选结合，调节MG53、CaV3的活性和/或表达，其中试剂表示可用作治疗/预防，和/或研究心血管疾病和/或心脏缺血/再灌注损伤、低氧损伤、心力衰竭或其任意组合的治疗性或研究工具的候选物。根据本发明的方法鉴定的尤其优选的试剂包括对靶多肽高度特异性的那些，并且所以，将具有很少的“脱靶(off target)”作用。一般而言，有很少或没有非特异性作用的试剂在体内表现更少的不利副作用。在某些实施方式中，试剂是如此肽、核酸或化合物，其是MG53、CaV3的至少一种的表达、活性和/或磷酸化的激动剂。在另一方面中，本发明包括的试剂是如此肽、核酸或化合物，其是线粒体通透性转变通道(MPTP)的表达或活性的拮抗剂，例如通过磷酸化线粒体通透性转变通道(MPTP)。
[0067] 在仍另外的方面中，本发明涉及治疗和/或预防心血管疾病和/或心脏缺血/再灌注损伤、低氧损伤、心力衰竭或其任意组合的方法，其包括施用有效量的MG53、CaV3的至少一种的表达和/或活性的激动剂或线粒体通透性转变通道(MPTP)的表达或活性的拮抗剂。
[0068] 在某些方面中，本发明包括编码多肽的分离的或重组的核酸，所述多肽包括氨基酸和/或肽组分(即，结构组分或氨基酸结构域)的组合，其当结合在一起时，产生具有如本文所描述活性的多肽。在本发明该方面的一种实施方式中，组分包括RING指锌-结合结构域、B-盒结构域、亮氨酸拉链卷曲螺旋结构域、磷脂结合结构域、氧化还原敏感氨基酸、E3-连接酶结构域和SPRY结构域，其中组分在单个多肽中连续地共价连接，并且其中多肽利于治疗和/或预防心血管疾病和/或心脏缺血/再灌注损伤、低氧损伤或心力衰竭。编码各自氨基酸或肽结构域的核酸可使用标准的分子生物学技术从任何期望的亲本基因克隆并且和结合成单个连续的连续的核酸。在另外的实施方式中，本发明包括通过表达结合编码来自TRIM家族其他成员的氨基酸或肽组分的核苷酸形成的基因或cDNA构建体形成的新的多肽，所述TRIM家族是例如(登录号)TRIM1(NM_012216，NM_052817)；TRIM2(AF220018)；TRIM3(AF045239)；TRIM4(AF220023)；TRIM5(AF220025) ；TRIM6(AF220030) ；
TRIM7(AF220032) ；TRIM8(AF281046)；TRIM9(AF220036)；TRIM10(Y07829) ；
TRIM11(AF220125)；TRIM13(AF220127，NM_001007278)；TRIM14(NM_014788，NM_033221)；
TRIM15(NM_033229)；TRIM16(AF096870)；TRIM17(AF156271)；TRIM18(AF230976，AF230977)；TRIM19(NM_033244，NM_033250，NM_033240，NM_033239，NM_033247，NM_002675，NM_033246，NM_033249，NM_033238)；TRIM20(NM_000243)；TRIM21(NM_003141)；
TRIM22(NM_006074)；TRIM23(NM_033227，NM_001656，NM_033228)；TRIM24(NM_003852，NM_015905)；TRIM25(NM_005082)，TRIM26(NM_003449)；TRIM27(AF230394，AF230393)；
TRIM28(NM_005762)；TRIM29(AF230388)；TRIM31(AF230386)；TRIM32(NM_012210)；
TRIM33(AF220136)；TRIM34(NM_130390，NM_001003827，NM_130389，NM_001003819)；
TRIM35(AB029021)；TRIM36(AJ272269)；TRIM37(AB020705)；TRIM38(U90547)；
TRIM39(NM_021253，NM_172016)；TRIM40(AF489517)；TRIM41(NM_033549，NM_201627)；
TRIM42(AF521868)；TRIM43(NM_138800)；TRIM44(NM_017583)；TRIM45(NM_025188)；
TRIM46(NM_025058)；TRIM47(AY026763)；TRIM48(AF521869)；TRIM49(NM_020358)；
TRIM50(AY081948)；TRIM51(NM_032681)；TRIM52(NM_032765)；TRIM53(XR_016180)；
TRIM54(NM_032546，NM_187841)；TRIM55(NM_184087，NM_184085，NM_184086，NM_033058)；TRIM56(NM_030961)；TRIM57( 即，TRIM59)；TRIM58(NM_015431)；
TRIM59(NM_173084)；TRIM60(NM_152620)；TRIM61(XM_373038)；TRIM62(NM_018207)；
TRIM63(NM_032588)；TRIM64(XM_061890)；TRIM65(NM_173547)；TRIM66(XM_001716253)；
TRIM67(NM_001004342)；TRIM68(NM_018073)；TRIM69(AF302088)；TRIM70(DQ232882，NM_001037330)；TRIM71(NM_001039111)；TRIM72( 即，MG53；NM_001008274)；
TRIM73(AF498998)；TRIM74(NM_198853)；TRIM75(XM_939332)。
TRIM7(AF220032) ；TRIM8(AF281046)；TRIM9(AF220036)；TRIM10(Y07829) ；
TRIM11(AF220125)；TRIM13(AF220127，NM_001007278)；TRIM14(NM_014788，NM_033221)；
TRIM15(NM_033229)；TRIM16(AF096870)；TRIM17(AF156271)；TRIM18(AF230976，AF230977)；TRIM19(NM_033244，NM_033250，NM_033240，NM_033239，NM_033247，NM_002675，NM_033246，NM_033249，NM_033238)；TRIM20(NM_000243)；TRIM21(NM_003141)；
TRIM22(NM_006074)；TRIM23(NM_033227，NM_001656，NM_033228)；TRIM24(NM_003852，NM_015905)；TRIM25(NM_005082)，TRIM26(NM_003449)；TRIM27(AF230394，AF230393)；
TRIM28(NM_005762)；TRIM29(AF230388)；TRIM31(AF230386)；TRIM32(NM_012210)；
TRIM33(AF220136)；TRIM34(NM_130390，NM_001003827，NM_130389，NM_001003819)；
TRIM35(AB029021)；TRIM36(AJ272269)；TRIM37(AB020705)；TRIM38(U90547)；
TRIM39(NM_021253，NM_172016)；TRIM40(AF489517)；TRIM41(NM_033549，NM_201627)；
TRIM42(AF521868)；TRIM43(NM_138800)；TRIM44(NM_017583)；TRIM45(NM_025188)；
TRIM46(NM_025058)；TRIM47(AY026763)；TRIM48(AF521869)；TRIM49(NM_020358)；
TRIM50(AY081948)；TRIM51(NM_032681)；TRIM52(NM_032765)；TRIM53(XR_016180)；
TRIM54(NM_032546，NM_187841)；TRIM55(NM_184087，NM_184085，NM_184086，NM_033058)；TRIM56(NM_030961)；TRIM57( 即，TRIM59)；TRIM58(NM_015431)；
TRIM59(NM_173084)；TRIM60(NM_152620)；TRIM61(XM_373038)；TRIM62(NM_018207)；
TRIM63(NM_032588)；TRIM64(XM_061890)；TRIM65(NM_173547)；TRIM66(XM_001716253)；
TRIM67(NM_001004342)；TRIM68(NM_018073)；TRIM69(AF302088)；TRIM70(DQ232882，NM_001037330)；TRIM71(NM_001039111)；TRIM72( 即，MG53；NM_001008274)；
TRIM73(AF498998)；TRIM74(NM_198853)；TRIM75(XM_939332)。
[0069] 在另一实施方式中，本发明包括由本发明的核酸编码的分离的或重组的多肽，其具有RING指锌-结合结构域、B-盒结构域、亮氨酸拉链卷曲螺旋结构域、磷脂结合结构域、氧化还原敏感氨基酸、E3-连接酶结构域、SPRY结构域和任选地钙结合结构域，其中组分在单个多肽中连续地共价连接，并且其中多肽利于治疗和/或预防心血管疾病和/或心脏缺血/再灌注损伤、低氧损伤或心力衰竭。
[0070] 本说明书强调了用于建立能够利于治疗和/或预防心血管疾病和/或心脏缺血/再灌注损伤、低氧损伤或心力衰竭的多肽的重要氨基酸结构组分或特征(即，RING指锌-结合结构域、B-盒结构域、亮氨酸拉链卷曲螺旋结构域、磷脂结合结构域、氧化还原敏感氨基酸、E3-连接酶结构域、SPRY结构域)。重要地注意到，尽管RING指锌-结合结构域、B-盒结构域、亮氨酸拉链卷曲螺旋结构域、磷脂结合结构域、氧化还原敏感氨基酸、E3-连接酶结构域、SPRY结构域和钙结合结构域可在进化上相关的蛋白以及无关的蛋白之间不同，但如上面指出的，存在许多属于包括MG53在内的TRIM家族的基因，其包含一个或所有的上面结构组分或结构域。如本领域技术人员认识到的，这些结构域可容易地从TRIM家族成员的基因或cDNA克隆，并且使用分子生物学熟知的技术移植或克隆至另一TRIM家族基因(即，MG53)的框架中，以便产生新的蛋白。而且，因为一般认识到进化上保守的氨基酸序列将有类似的功能，本领域技术人员有能力根据本技术产生另外的蛋白，并且评估重组蛋白利于膜修复的能力，而不用过度的实验。因此，由TRIM家族成员的结构域组装的重组蛋白，例如上面鉴定的那些，明确考虑在本发明的范围内。
[0071] 在另一实施方式中，本发明包括编码如SEQ ID NOs.：1、3、5、7、8、9-15中列出的MG53多肽和/或其同系物或片段的分离的或重组的核酸，其中多肽利于治疗和/或预防心血管疾病和/或心脏缺血/再灌注损伤、低氧损伤或心力衰竭。
[0072] 在另外的方面中，本发明涉及包括本发明的多肽结合至少一种其他试剂的组合物，所述试剂能够利于治疗和/或预防心血管疾病和/或心脏缺血/再灌注损伤、低氧损伤或心力衰竭。在某些实施方式中，试剂经与本发明的多肽直接或间接相互作用协同作用，以利于治疗和/或预防心血管疾病和/或心脏缺血/再灌注损伤、低氧损伤或心力衰竭。例如，试剂，比如磷脂酰丝氨酸、锌、氧化剂和植物提取物可调节本发明多肽的膜修复活性。
[0073] 所以，在另外的实施方式中，本发明包括的任何包含多肽的组合物也可结合地包括有效量的磷脂；包含锌的试剂；氧化剂；植物提取物或其组合的至少一种。在某些实施方式中，磷脂是磷脂酰丝氨酸。在另外的实施方式中，包含锌的试剂是锌离子载体，例如，Zn-1-羟基吡啶-2-硫酮（Zn-l-hydroxypyridine-2-thine）(Zn-HPT)。在其他实施方式中，氧化剂是硫柳汞。在另外的实施方式中，植物提取物是三七提取物。
[0074] 在某些另外的方面中，本发明涉及包括分离的或重组的本发明的多肽结合药学上可接受的载体的组合物。在另外的实施方式中，组合物可进一步结合地包括有效量的磷脂；包含锌的试剂；氧化剂；植物提取物或其组合的至少一种。在某些实施方式中，磷脂是磷脂酰丝氨酸。在另外的实施方式中，包含锌的试剂是锌离子载体，例如，Zn-1-羟基吡啶-2-硫酮(Zn-HPT)。在其他实施方式中，氧化剂是硫柳汞。在另外的实施方式中，植物提取物是三七提取物。
[0075] 本发明也涉及令人吃惊的和意料不到的发现：本发明的多肽可治疗和/或预防对心肌细胞和/或组织的缺血/再灌注和/或低氧损伤。不被任何具体理论限制，认为修复机制通过蛋白中包含亮氨酸拉链蛋白-蛋白相互作用基序的卷曲螺旋结构域，由多肽低聚物，例如，二聚物的氧化诱导形成所介导。
[0076] 目前的结果指示本发明的多肽例如MG53的活性主要由氧化性细胞外环境进入细胞区室中的还原性环境诱导。该机制允许多肽用作细胞氧化还原态的传感器并且寡聚以在质膜处通过与细胞膜的特异性脂质组分的相互作用形成均质复合物。如在之前的申请中描述的，锌(Zn)对于MG53-介导的膜重新包封是必须的，并且另外Zn的存在可提高MG53的活性；来自植物三七的提取物也可改善MG53在膜重新包封中的功能；并且MG53需要其内源性E3-连接酶活性以在急性损伤之后产生膜修复。因此，可能一种或多种这些活性对于介导治疗和/或预防心肌细胞和/或组织的缺血/再灌注和/或低氧损伤也是重要的。
[0077] 本发明的另外方面涉及令人吃惊的发现，本发明多肽的细胞外施加或施用也是有效的。适于细胞外施用的多肽包括，例如，MG53、MG53融合蛋白，例如，与细胞穿透肽，例如，HIV-TAT蛋白融合的MG53(见WO2008/054561，其通过引用并入本文)。因此，该方面的某些实施方式包括治疗性组合物，其包括本发明的多肽，例如MG53，结合药学上可接受的载体，其中治疗性组合物全身性施用，并且其中全身性施用的组合物有效利于治疗和/或预防心血管疾病和/或心脏缺血/再灌注损伤、低氧损伤或心力衰竭。
[0078] 在某些另外的实施方式中，本发明的治疗性组合物结合本发明的多肽进一步包括一种或多种另外的成分，其包括磷脂；包含锌的试剂；氧化剂；植物提取物或其组合，其对本发明多肽的活性有协同作用。在另外的实施方式中，本发明的治疗性组合物可包括一种或多种生物学活性成分比如，止痛剂、抗酸剂、抗焦虑药物、抗心律失常药、抗菌剂、抗生素、抗凝血剂和溶栓剂、抗惊厥剂、抗抑郁剂、止泻药、止吐药、抗真菌剂、抗组胺剂、抗高血压药、抗炎药、抗肿瘤剂、抗精神病药、解热药、抗病毒剂、巴比妥盐酸类、β-阻断剂、支气管扩张药、感冒治愈剂(Cold Cures)、皮质类固醇、咳嗽抑制剂、细胞毒素、解充血药、利尿药、祛痰药、激素、降血糖药(口服)、免疫抑制剂、缓泻剂、肌肉松弛剂、镇静剂、性激素、睡眠药物(Sleeping Drug)、镇定剂、维生素或其组合。
[0079] 在另外的方面中，本发明涉及治疗或预防心血管疾病和/或心脏缺血/再灌注损伤、低氧损伤或心力衰竭的方法，其包括向个体施用有效量的编码本发明的多肽，例如MG53，其同系物、片段和衍生物的核酸，其中多肽在体外、体内或离体(先体外后体内，ex vivo)有效治疗或预防心肌细胞或组织的缺血/再灌注和/或低氧损伤。在另外的方面中，本发明涉及治疗和/或预防与心血管疾病和/或心脏缺血/再灌注损伤、低氧损伤或心力衰竭相关的疾病或病理学状况的方法，其包括向个体施用有效量的组合物，所述组合物包括编码本发明的多肽，例如MG53，其同系物、片段或衍生物的核酸，结合药学上可接受的载体，其中组合物有效治疗和/或预防细胞心肌细胞或组织损伤。在某些实施方式中，与细胞或组织损伤有关的疾病或病理学状况包括肌肉萎缩症、心脏缺血、心力衰竭、老化衰退或其任意组合。
[0080] 在本文所述的任何方法中，本发明的核酸或多肽可以以任何药学上可接受的形式，和以任何药学上可接受的途径递送或施用，如下面进一步详细描述的。例如，包括本发明的核酸和/或多肽的组合物可全身性递送或直接施用至细胞或组织用于治疗和/或预防心肌细胞或组织损伤。在某些另外的实施方式中，本发明的核酸和/或多肽包括载体部分，其改善生物利用度、药物半衰期、功效或效力。
[0081] 在另外的方面中，本发明涉及分离的或重组的膜修复多肽复合物。如下面详细介绍的，MG53多肽表明与许多其他细胞蛋白，尤其是CaV3直接或间接相互作用(例如，非共价结合)并且形成复合物的能力。在该方面的实施方式中，本发明包括重组嵌合蛋白核酸，其在单个开放阅读框中包括编码MG53多肽的多核苷酸，其在连续的核酸中连接至编码另一多肽，例如CaV3的另一多核苷酸。在另外的实施方式中，嵌合体可包括编码MG53、CaV3任何组合的连接在单个连续核酸中的多个多核苷酸，所述单个连续核酸包括在单个开放阅读框中。翻译产生包含MG53、CaV3的一个或多个的功能结构域的单个多肽，其中嵌合蛋白复合物能够利于修复或预防由于缺血/再灌注损伤和/或低氧损伤引起的心肌细胞或组织损伤。本发明进一步包括治疗或预防由于缺血/再灌注损伤和/或低氧损伤引起的心肌细胞或组织损伤的方法，其包括向细胞施用有效量的编码本发明的嵌合多肽的核酸，其中复合物能够修复或预防由于缺血/再灌注损伤和/或低氧损伤引起的心肌细胞或组织损伤。在仍另外的实施方式中，本发明包括治疗或预防与细胞或组织损伤相关的疾病或病理学状况的方法，包括向个体施用有效量的分离的本发明的嵌合多肽，其中嵌合多肽复合物能够缓解疾病或病理学状况的作用。
[0082] 在另外的方面中，本发明涉及治疗或预防由于缺血/再灌注损伤和/或低氧损伤引起的心肌细胞或组织损伤的方法，包括调节至少一种CaV3的表达水平或活性或二者。
[0083] 在仍另外的方面中，本发明涉及通过将MG53、CaV3的至少一种与测试化合物接触；和测量测试化合物的结合，和/或MG53、CaV3的活性，和/或测量对响应IR或低氧损伤的心肌细胞活力的作用，筛选有效治疗或预防由于缺血/再灌注损伤和/或低氧损伤引起的心肌细胞或组织损伤的化合物的方法。
[0084] 如下面详细描述的，并且如本领域技术人员容易认识到的，通过蛋白工程——应当产生大量功能蛋白的方法，重组膜修复多肽可在原核细胞或真核细胞，例如哺乳动物细胞中产生并且然后分泌至细胞外溶液中。
[0085] 另外，本发明涉及核酸，包括干扰核酸，其与编码MG53或CaV3，其突变体、截短体、片段或同系物的核酸杂交，用于治疗或预防由于缺血/再灌注损伤和/或低氧损伤引起的心肌细胞或组织损伤。在本文所述的任何实施方式中，治疗性组合物可以以任何适当的药物形式施用，如本文所描述或如本领域通常已知的。
[0086] 在一个方面中，本发明提供分离的编码多肽分子的核酸，例如，MG53基因杂交核酸分子，和编码MG53多肽与SEQ ID NOS：2、4和6中公开的核酸具有至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%同一性的核酸。在某些实施方式中，本发明的分离的核酸分子在严格条件下杂交至与包括MG53核酸序列的蛋白编码序列的核酸分子互补的核酸序列。本发明也包括分离的核酸，其编码MG53多肽，或其片段、同系物、类似物、融合蛋白或衍生物。例如，核酸可编码与包括SEQ ID NOS：1、3、5、7、8和9-15的氨基酸序列的多肽具有至少30%、
40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%同一性的多肽。核酸可以是例如包括SEQ ID NOS：2、4和6的任何的核酸序列的基因组DNA片段或cDNA分子。
40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%同一性的多肽。核酸可以是例如包括SEQ ID NOS：2、4和6的任何的核酸序列的基因组DNA片段或cDNA分子。
[0087] 本发明也包括寡核苷酸，例如，包括MG53核酸(例如，SEQ ID NOS：2、4和6)的至少6个连续核苷酸的寡核苷酸，或所述寡核苷酸的互补物(complement)。
[0088] 本发明也包括基本上纯化的多肽，例如，MG53多肽(SEQ ID NOS：1、3、5、7、8和9-15)。在某些实施方式中，多肽，例如MG53多肽，包括与人MG53多肽(SEQ ID NO.:1)的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列。
[0089] 另外，本发明包括治疗性组合物在制造用于治疗和/或预防心脏损伤的药物中的用途，所述治疗性组合物包括有效量的调节心脏细胞中MG53活性、MG53表达或MG53信号传导级联的至少一种的试剂。治疗性组合物的使用可包括从0.1mg/kg和1000mg/kg体重/天的有效量。
[0090] 在某些实施方式中，治疗剂是下述至少一种：MG53多肽；MG53受体多肽；编码MG53多肽的核酸；编码MG53受体多肽的核酸；对编码MG53、MG53受体、窖蛋白-3的核酸特异性的抑制或反义RNA；或MG53、MG53受体、窖蛋白-3的激动剂或拮抗剂。在某些实施方式中，MG53活性的激动剂包括下述至少一种：磷脂酰丝氨酸、锌或锌盐、Zn-1-羟基吡啶-2-硫酮(Zn-HPT)、三七、氧化剂、硫柳汞或其组合。多肽可具有SEQ ID NOs.：1、3、5、9、10、11、12、13、14、15或16的至少一条或其生物活性部分的氨基酸序列。
[0091] 在仍其他实施方式中，试剂是能够分化成心肌细胞的干细胞，并且其中干细胞已被修饰，以便其展示增强的MG53的活性或表达。治疗性组合物可进一步包括药学上可接受的载体或赋形剂。在某些实施方式中，心脏损伤包括由于心血管疾病、心脏缺血/再灌注损伤、低氧损伤、心力衰竭或其组合的至少一种引起的心脏细胞或心肌组织损伤。
[0092] 在另一实施方式中，本发明也包括治疗性组合物在制造用于治疗和/或预防心脏缺血/再灌注或低氧损伤的药物中的用途，所述治疗性组合物包括有效量的MG53多肽或MG53核酸，和药学上可接受的赋形剂。
[0093] 本发明特征也在于抗体，其免疫选择性地结合多肽，例如，MG53多肽，或其片段、同系物、类似物、假肽、拟肽或衍生物。
[0094] 在另一方面中，本发明包括药学组合物，其包括治疗上或预防上有效量的治疗剂(therapeutic)和药学上可接受的载体。治疗剂可以是核酸，例如，MG53核酸，例如，肽核酸、cDNA或RNA，比如例如，小抑制RNA；膜修复多肽，例如MG53；或对MG53多肽特异性的抗体。在进一步的方面中，本发明在一个或多个容器中包括治疗上或预防上有效量的该药学组合物。
[0095] 在进一步的方面中，本发明包括生产多肽的方法，其通过在允许由DNA编码的多肽表达的条件下，培养包括内源性或外源性表达的编码膜修复多肽的核酸，例如MG53核酸的细胞。如果需要，可接着回收多肽。
[0096] 在仍另一方面中，本发明包括生产多肽的方法，其通过培养包含布置在外源性启动子上游或下游编码多肽的内源性核酸，例如MG53核酸的细胞。在某些实施方式中，外源性启动子通过同源重组、链断裂或错配修复机制并入宿主细胞的基因组。
[0097] 在另一方面中，本发明包括检测本发明的多肽，例如MG53多肽在样品中存在的方法。在该方法中，样品与选择性结合多肽的化合物在允许在该多肽和该化合物之间形成复合物的条件下进行接触。如果存在，复合物被检测到，从而鉴定在该样品中的膜修复多肽，例如MG53多肽。
[0098] 本发明也包括基于编码本发明多肽，例如MG53多肽或其相关融合多肽的核酸的表达，鉴定特异性细胞或组织类型的方法。例如，在某些实施方式中，本发明包括融合蛋白，其包括“标签”或指示物部分和，例如MG53部分。在某些方面中，标签或指示物部分可以是适于纯化目的的肽，例如，FLAG标签、6xHis标签、麦芽糖-结合蛋白(MBP)标签或类似物。在其他方面中，标签肽包括适于提供信号的肽，比如抗体表位或荧光肽。仍其他方面包括MG53与适于介导亚细胞定位或跨细胞膜易位的肽的融合，例如，来自HIV病毒的TAT融合蛋白，以利于细胞通透性或修饰的细胞定位标签将MG53连接至具体的细胞器。
[0099] 本发明也包括检测样品中本发明核酸分子存在的方法，其通过使样品与核酸探针或引物接触，并检测核酸探针或引物是否结合编码例如MG53多肽的核酸进行。
[0100] 在进一步的方面中，本发明提供调节本发明的多肽，例如MG53多肽活性的方法，其通过使包括MG53多肽的细胞与结合MG53多肽的化合物以足以调节所述多肽的活性的量接触进行。化合物可以是，例如，小分子，比如核酸、肽、多肽、拟肽、糖、脂质或其他有机(含碳的)或无机分子，如本文进一步描述的。
[0101] 也在本发明范围内的是本发明的治疗剂在制造用于治疗或预防不适或综合征的药物中的用途，所述不适或综合征包括，例如，心血管疾病、心肌病、动脉粥样硬化、高血压、先天性心脏病、主动脉狭窄、房间隔缺损(ASD)、房室(A-V)管缺损、动脉导管、肺动脉狭窄、主动脉瓣下狭窄、室间隔缺损(VSD)、瓣膜疾病、血液高凝(hypercoagulation)、缺血/再灌注损伤、低氧损伤、氧化损伤、年龄相关的组织衰退、外科手术相关的损伤、心力衰竭、心力衰竭和高血压引起的次级病理学、高血压、心绞痛、心肌梗死、结节性硬化、心脏病发作、心力衰竭、肌肉萎缩症、中风和/或类似的其他病理学和不适。
[0102] 在某些实施方式中，本发明的治疗性组合物包括，例如，编码MG53的核酸；结合编码MG53的核酸的核酸；MG53多肽，基于其的肽类似物、假肽或拟肽；MG53或MG53蛋白-蛋白相互作用的小分子调节剂；或MG53特异性抗体或生物活性衍生物或其片段。如本文所描述，MG53介导治疗和/或预防心肌细胞或组织的缺血/再灌注损伤和/或低氧损伤。所以，靶向这些核酸、多肽和其同系物的表达和/或活性将允许各种与缺血性损伤或心脏组织相关的急性和慢性疾病和病况的新的治疗。
[0103] 在仍其他实施方式中，本发明包括可用作外科佐剂的治疗性组合物。在本文所述的任何实施方式中，本发明的外科佐剂组合物可作为单独的治疗剂直接用于或施加至外科手术位点或其可与外科或医学器械整体地结合，例如，本发明的治疗剂可缀合至基于聚合物的支架、管或其他可植入设备，从而治疗剂以可控方式扩散至作用位点以加速愈合和/或使来自侵入式外科过程的创伤最小化。在另一实施方式中，本发明的治疗性组合物作为例如薄膜或涂层施加至医学器械，从而治疗剂扩散至血流或周围组织和/或衰减(wear away)，并且从而直接递送组织损伤位点；最小化或缓解由于外科器械或过程的使用出现的损伤量。
[0104] 此外，由于内源性MG53基因表达的肌肉特异性特征，本发明包括治疗和/或预防任何类型的肌肉或血管细胞/组织损伤，例如，由于心血管疾病，例如心肌梗死；或激烈的身体活动，例如运动相关损伤而发生的组织损伤的方法，其包括向需要其的对象施用有效量的本发明的治疗剂。
[0105] 在本发明的任何方面中，本发明的治疗性组合物可为任何药学上可接受的形式并且通过任何药学上可接受的途径施用，例如，治疗性组合物可作为口服剂量——单次每日剂量或单一剂量形式施用——用于治疗由于心肌梗死、硬化性病变（sclerotic lesion）引起的肌肉损伤，或由于运动相关活动引起的肌肉撕裂，以促进损伤的肌肉组织的再生和修复。这种药学上可接受的载体和赋形剂以及施用方法对本领域技术人员容易显而易见，并且包括如USP-NF2008(美国药典/国家药品集(United States Pharmacopeia/National Formulary))中描述的组合物和方法，其通过引用以其整体并入本文。
[0106] 短语“药学上或药理学上可接受的”指当施用至动物或人时不产生不利的，变态反应或其他不适当的反应的分子实体和组合物。如本文所使用，“药学上可接受的载体”包括任何和所有的溶剂、分散介质、涂层、抗菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟试剂和类似物。这些介质和试剂用于药学活性物质是本领域熟知的。除非某种程度上任何常规的介质或试剂与活性成分不相容，考虑其在治疗性组合物中的使用。补充的活性成分也可并入组合物。
[0107] 活性化合物将通常配制为肠胃外施用，例如，配制为经静脉内、关节内(intraarthricular)、鞘内、肌内、皮下、损伤内或甚至腹膜内途径注入。鉴于本公开，包含标记抗体、缀合物、抑制剂或其他试剂作为活性组分或成分的水性组合物的制剂对本领域技术人员是已知的。典型地，这种组合物可制备为可注入的，作为液态溶液或悬液；也可制备适和当在注入之前添加液体用于制备溶液或悬液的固体形式；并且制剂也可被乳化。
[0108] 另外，本发明涉及核酸，包括干扰核酸，和编码膜修复相互作用蛋白和/或MG53相互作用蛋白的多肽，和其同系物；假肽和拟肽；以及可调节膜修复多肽或MG53的活性或它们的分子间相互作用的化合物。
[0109] 例如，本发明的组合物具有治疗遭受上面公开的疾病和不适和/或类似的其他病理学和不适的患者的效力。多肽可用作生产本发明特异性的抗体的免疫原，并且可用作疫苗。它们也可用于筛选潜在的激动剂和拮抗剂化合物。另外，当施用至需要其的对象时，编码本发明的多肽，例如MG53、CaV3的cDNA可用在基因疗法中。通过非限制性例子，本发明的组合物具有治疗遭受上面公开的疾病和不适和/或其他类似的病理学和不适的患者的效力。
[0110] 本发明进一步包括筛选对不适或综合征——包括例如上面公开的疾病和不适和/或其他类似的病理学和不适——的倾向(predisposition)的方法。方法包括使检测试剂接触编码MG53、CaV3的核酸或多肽，并且确定检测试剂是否与所述靶结合。检测试剂与编码MG53、CaV3的核酸或多肽结合，指示检测化合物是活性的调节剂，或对上面提到的不适或综合征的潜伏期或倾向的调节剂。
[0111] 本发明的范围内也包括筛选活性调节剂，或对不适或综合征——包括例如上面公开的疾病和不适和/或其他类似的病理学和不适——的潜伏期或倾向的调节剂的方法，其通过施用检测化合物至处在上述不适或综合征的增加风险下的检测动物进行。检测动物表达本发明的核酸编码的重组多肽。接着测量本发明的多肽在检测动物中的表达或活性，也测量在重组表达本发明的多肽并且没有处于该不适或综合征的增加风险下的对照动物中该蛋白质的表达或活性。接下来，比较在检测动物和对照动物二者中本发明多肽的表达。相对于对照动物，检测动物中多肽活性的变化指示检测化合物是该不适或综合征的潜伏期的调节剂。
[0112] 在仍另一方面中，本发明包括确定对象(例如，人对象)中与MG53、CaV3功能障碍或改变的核酸或多肽水平相关的疾病的存在或倾向的方法。方法包括测量来自对象的检测样品中MG53、CaV3的核酸或多肽的量，并且比较检测样品中核酸或多肽的量与对照样品中存在的核酸或多肽的量。与对照样品相比，检测样品中核酸或多肽水平的改变指示对象中疾病的存在或倾向。优选地，倾向包括，例如，上面公开的疾病和不适和/或其他类似的病理学和不适。而且，本发明的新多肽的表达水平可用于筛选各种不适以及确定具体不适阶段的方法中。
[0113] 在仍另一方面中，本发明可用于通过本领域通常采用的许多技术的任何一种鉴定本发明的MG53的细胞受体和下游效应物的方法。这些包括但不限于双杂交系统、亲和纯化、与抗体或其他特异性相互作用分子的共沉淀。
[0114] 如本文所使用，术语“拮抗剂”一般用于指能够直接或间接抑制表达、翻译和/或活性的试剂。而且，如本文所使用的“MG53受体”一般涉及能够进行与MG53蛋白结合的任何蛋白或其片段。在某些方面中，MG53活性的调节通过下述实现：例如，使用或调节，例如MG53结合伴侣，即，直接或间接结合MG53并增强或中和其生物学活性的因子，包括，例如中和结合并且破坏MG53或CaV3活性或分子间相互作用的抗MG53抗体、窖蛋白-3、抗窖蛋白-3抗体、假肽、肽类似物或拟肽；或使用源自MG53或CaV3基因的核苷酸序列，包括编码、非编码和/或调节的序列，以通过例如，反义、核酶和/或三股螺旋方法调节表达。
[0115] 在另一方面中，本发明特征在于核酸分子，比如诱饵RNA、dsRNA、siRNA、shRNA、微小RNA、适配体、反义核酸分子，其下调编码MG53蛋白和/或MG53受体，例如窖蛋白-3的序列的表达。在另一实施方式中，本发明的核酸分子具有内切核酸酶活性或是核酸酶复合物的组分，并且切割MG53和/或CaV3mRNA。
[0116] 在一种实施方式中，本发明的核酸分子包括12和100个之间的与具有编码选自MG53、CaV3的成员的核酸序列的RNA互补的碱基。在另一实施方式中，本发明的核酸分子包括14和24个之间的与具有编码选自MG53、CaV3的成员的核酸序列的RNA互补的碱基。在本文所述的任何实施方式中，核酸分子可根据本领域熟知的方法化学合成。
[0117] 在另一方面中，本发明提供试剂盒，其包括适当的容器，以药学上可接受形式放置在其中的能够抑制膜修复多肽活性、表达或结合的活性试剂，和其使用说明书。
[0118] 在另一方面中，本发明涉及用于诊断或监测不适或疾病或进展的方法，其包括通过检测选自MG53、CaV3的成员的表达水平，检测与疾病相关的膜修复基因，例如MG53基因中核苷酸多态性的存在。
[0119] 已经鉴定了与疾病严重性相关的多态性。(见，Zhong等,Simultaneous detection of microsatellite repeats and SNPs in the macrophage migration inhibitory factor gene by thin-film biosensor chips and application to rural field studies.Nucleic Acids Res.2005Aug 2;33(13):e121;Donn等,A functional promoter haplotype of macrophage migration inhibitory factor is linked and associated with juvenile idiopathic arthritis.Arthritis Rheum.2004May;50(5):1604-10;出于所有目的，其所有通过引用以它们的整体并入本文)。“MG53或MG53受体基因”包括5’UTR、3’UTR、启动子序列、增强子序列、基因的内含子和外显子DNA以及mRNA或cDNA序列。
[0120] 如普通技术人员理解的，与组织修复不适相关的和因此根据本发明的方法可用作诊断标记的MG53或MG53受体基因多态性可出现在任何之前叙述的核酸区域中。鉴定和监测多态性的技术在本领域是已知的并且在Wohlgemuth的美国专利号：6,905,827中详细讨论，其出于所有的目的通过引用以其整体并入本文。
[0121] 本发明的某些方面包括利用一个或多个DNA分子检测基因表达或多态性，其中一个或多个DNA分子具有检测与序列表中描绘的寡核苷酸对应的基因表达的核苷酸序列。在一种形式中，寡核苷酸检测差异表达的基因的表达。基因表达系统可以是候选物文库、诊断试剂、诊断寡核苷酸组或诊断探针组。DNA分子可以是基因组DNA、RNA、蛋白核酸(PNA)、cDNA或合成寡核苷酸。根据本文教导的过程，人们可鉴定感兴趣的序列用于分析基因表达或多态性。这种序列可以预测疾病状况。
[0122] 本发明的诊断寡核苷酸
[0123] 如本文所使用，术语“核酸分子”意图包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如，mRNA)、使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA类似物，和其衍生物、片段和同系物。核酸分子可以是单链的或双链的，但是优选地包括双链DNA。
[0124] 在某些方面中，本发明涉及诊断寡核苷酸和诊断寡核苷酸组(一个或多个)，对其而言，在个体的健康状态和对应核苷酸序列的该个体的RNA或蛋白产物的表达之间存在相关性。在一些情况下，仅仅一个寡核苷酸对于这种检测是必要的。诊断寡核苷酸组的成员可通过能够检测RNA或蛋白产物表达或多态性的任何手段鉴定，包括但不限于差异表达筛选、PCR、RT-PCR、SAGE分析、高通量测序、微阵列、脂质或其他阵列、基于蛋白的方法(例如，蛋白质印迹、蛋白质组学、质谱学和本文所述的其他方法)，和数据挖掘方法，如本文进一步所述的。
[0125] 在本发明的背景下，根据熟知的分子生物学技术操作核酸和/或蛋白。许多这种程序的详细方案描述在，例如，Ausubel等.Current Protocols in Molecular Biology(2000年补充)John Wiley&Sons,New York("Ausubel");Sambrook等.Molecular Cloning-ALaboratory Manual(2nd Ed.),Vol.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989("Sambrook"), 和Berger and Kimmel Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology volume152Academic Press,Inc.,San Diego,Calif.("Berger")中描述。
[0126] 参考本发明的示例性核酸，提供下面各个方面和实施方式的描述。但是，各个方面和实施方式也涉及编码其他膜修复蛋白、膜修复多肽结合蛋白的同系物、直向同源物和种内同源物的基因，，以及膜修复多肽受体基因并且包括所有的同种型、剪接变体和多态性。可使用为MG53和MG53受体蛋白和/或基因描述的方法，分析那些另外的基因的靶位点。因此，可如本文所描述，进行其他基因的抑制和这种抑制的效果。
[0127] “下调”意思是基因的表达，或编码一种或多种蛋白的RNA或等价RNA的水平，或一种或多种蛋白的活性下降低于在没有本发明的核酸分子的情况下所观察到的。在一种实施方式中，用酶核酸分子的抑制或下调优选地低于在存在能够结合靶RNA上相同的位点，但是不能切割RNA的酶失活或减弱的分子的情况下观察到的水平。在另一实施方式中，用反义寡核苷酸的抑制或下调优选地低于在存在例如具有错义(scrambled)序列或具有错配的寡核苷酸的情况下观察到的水平。在另一实施方式中，用本发明核酸分子的基因抑制或下调在存在核酸分子的情况下比在其没有的情况下更大。
[0128] “上调”意思是基因的表达，或编码一种或多种蛋白亚单元的RNA或等价RNA的水平，或一种或多种蛋白亚单元的活性大于在没有本发明核酸分子的情况下所观察到的。例如，可提高基因的表达以治疗、预防、缓解或调节由于基因表达的缺失或低水平造成的或加剧的病理学状况。在一种实施方式中，本发明涉及通过上调MG53和/或MG53受体基因的表达和/或活性，用于治疗或预防心肌组织的缺血性再灌注或低氧损伤的方法。
[0129] “调节”意思是上调或下调基因的表达，或编码一种或多种蛋白的RNA或等价RNA的水平，或一种或多种蛋白的活性，从而表达、水平或活性大于或小于在没有本发明核酸分子的情况下所观察到的。
[0130] “基因”意思是编码RNA的核酸，例如，包括但不限于编码多肽的区段的核酸序列。
[0131] “互补性”指核酸通过传统的Watson-Crick或其他非传统的类型与另一RNA序列形成氢键(一个或多个)的能力。
[0132] “RNA”意思是包括至少一个核苷酸残基的分子。“核糖核苷酸”或“2'-OH”意思是在D-呋喃核糖部分的2’位置具有羟基的核苷酸。
[0133] “核苷酸”意思是具有磷酸化糖的N-糖苷键中的杂环含氮碱基。本领域认为核苷酸包括天然碱基(标准的)，和本领域熟知的修饰碱基。这种碱基通常位于核苷酸糖部分的1'位置。核苷酸一般包括碱基、糖和磷酸基团。核苷酸在糖、磷酸和/或碱基部分可未被修饰或修饰(也互换称为核苷酸类似物、修饰的核苷酸、非天然核苷酸、非标准核苷酸等等；见例如，Usman和McSwiggen，上文；Eckstein等，国际PCT公开号WO92/07065；Usman等，国际PCT公开号WO93/15187；Uhlman&Peyman，上文所有通过引用并入本文)。本领域已知有数种修饰的核酸碱基的例子，如Limbach等，1994，Nucleic Acids Res.22,2183总结的。可引入核酸的化学修饰的和其他天然核酸碱基的一些非限制性例子包括，例如，肌苷、嘌呤、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基、假尿嘧啶、2,4,6-三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氢尿苷、萘基、氨基苯基、5-烷基胞苷(例如，5-甲基胞苷)、5-烷基尿苷(例如，胸腺嘧啶核苷)、5-卤代尿苷(例如，5-溴代尿苷)或6-氮杂嘧啶(azapyrimidine)或6-烷基嘧啶(例如6-甲基尿苷)、丙炔、Q核苷(辫苷，quesosine)、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、怀丁苷(wybutosine)、假尿苷(wybutoxosine)、4-乙酰胞苷(4-acetyltidine)、5-(羧基羟基甲基)尿苷、5′-羧基甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧基甲基氨基甲基尿苷、β-D-半乳糖基Q核苷、1-甲基腺苷、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟苷、3-甲基胞苷、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-甲基氨基甲基尿苷、5-甲基羰基甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、5-甲基-2-硫代尿苷、2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺苷、β-D-甘露糖基Q核苷、尿苷-5-氧乙酸、2-硫代胞苷、苏氨酸衍生物以及其它(Burgin等,1996,Biochemistry,35,14090；Uhlman&Peyman,上文)。
[0134] “修饰的碱基”在方面意思是1'位置腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶之外的核苷酸碱基或它们的等价物；这种碱基可用在任何位置，例如，在酶核酸分子的催化核心内和/或在核酸分子的底物结合区域中。
[0135] “反义核酸”意思是非酶核酸分子，其通过RNA--RNA或RNA-DNA或RNA-PNA(蛋白核酸；Egholm等，1993Nature365，566)相互作用结合靶RNA并且改变靶RNA的活性(对于综述，见Stein和Cheng，1993Science261,1004和Woolf等，美国专利号5,849,902)。典型地，反义分子与靶序列沿着反义分子的单个连续的序列互补。但是，在某些实施方式中，反义分子可结合底物，从而底物分子形成环或发卡，和/或和反义分子可结合，从而反义分子形成环或发卡。因此，反义分子可与两个(或甚至更多个)非连续的底物序列互补或反义分子的两个(或甚至更多个)非连续的序列部分可与靶序列互补或二者。对于目前反义策略的综述，见Schmajuk等，1999，J.Biol.Chem.，274，21783-21789，Delihas等，1997，Nature，15，751-753，Stein 等，1997，Antisense N.A.Drug Dev.，7，151，Crooke，2000，Methods Enzymol.，313，3-45；Crooke，1998，Biotech.Genet.Eng.Rev.，15，121-157，Crooke，1997，Ad.Pharmacol，40，1-49，其通过引用以它们的整体并入本文。另外，反义DNA可用于通过DNA-RNA相互作用靶向RNA，从而激活RNase H，其消化双链体中的靶RNA。反义寡核苷酸可包括一个或多个RNAse H激活区域，其能够激活RNAse H切割靶RNA。反义DNA可化学合成或通过使用单链DNA表达载体或其等价物表达。
[0136] 长双链RNAs(dsRNAs；通常>200nt)可用于沉默多种有机体和细胞类型(例如，蠕虫、果蝇和植物)中靶基因的表达。一旦引入，长的dsRNAs进入通常称为RNA干扰(RNAi)通路的细胞通路。首先，通过称为Dicer的RNase III样酶，dsRNAs加工成20-25核苷酸(nt)小干扰RNAs(siRNAs)(开始步骤)。然后，siRNAs装配成称为RNA-诱导的沉默复合物(RISCs)的包含核糖核酸内切酶的复合物，其在过程中解旋。siRNA链随后将RISC引导至互补RNA分子，在那里它们切割和破坏关联RNA(效应步骤)。关联RNA的切割发生在siRNA链结合的区域中间附近。在哺乳动物细胞中，引入长的dsRNA(>30nt)启动有力的抗病毒应答，其通过非特异性抑制蛋白合成和RNA降解例证。但是，哺乳动物的抗病毒应答可通过引入或表达siRNAs被绕过(bypass)。
[0137] 将dsRNA注入和转染至细胞和有机体已经成为递送siRNA的主要方法。并且尽管沉默效应持续数天并且好像转移至子细胞，但是其最终消失。但是，最近多个小组已经开发了表达载体以在瞬时和稳定转染的哺乳动物细胞中持续表达siRNA。(见，例如,Brummelkamp TR,Bernards R,和Agami R.(2002).A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.Science296:550-553;Lee NS,Dohjima T,Bauer G,Li H,Li M-J,Ehsani A,Salvaterra P 和 Rossi J.(2002).Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1rev transcripts in human cells.Nature Biotechnol.20:500-505;Miyagishi M,和Taira K.(2002).U6-promoter-driven siRNAs with four uridine 3'overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells.Nature Biotechnol.20:497-500;Paddison PJ,Caudy AA,Bernstein E,Hannon GJ,和Conklin DS.(2002).Short hairpin RNAs(shRNAs)induce sequence-specific silencing in mammalian cells.Genes&Dev.16:948-958;Paul CP,Good PD,Winer I 和 Engelke DR.(2002).Effective expression of small interfering RNA in human cells.Nature Biotechnol.20:505-508;Sui G,Soohoo C,Affar E-B,Gay F,Shi Y,Forrester WC,和Shi Y.(2002).ADNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA99(6):5515-5520;Yu J-Y,DeRuiter SL和Turner DL.(2002).RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA99(9):6047-6052，通过阴雨以它们的整体并入本文)。
[0138] “载体”意思是任何用于递送期望核酸的基于核酸的技术，例如，细菌质粒、病毒核酸、HAC、BAC和类似载体。
[0139] 本发明的核酸分子，单独或组合或结合其他药物，可用于治疗上面讨论的疾病或病况。例如，可处理对象，或可处理其他适当的细胞，如对本领域技术人员显而易见的，在适于处理的条件下单独或结合一种或多种药物。
[0140] “双链RNA”或“dsRNA”意思是匹配能够激活降解该基因的相应信使RNA转录体的细胞酶的预定基因序列的双链RNA。这些dsRNA称为短干扰RNA(siRNA)并且可用于抑制基因表达(见，例如Elbashir等，2001，Nature，411，494-498；和Bass，2001，Nature，411，428-429)。如本文所使用的术语“双链RNA”或“dsRNA”指能够RNA干扰“RNAi”的双链RNA分子，包括短干扰RNA“siRNA”。见，例如Bass，2001，Nature，411，428-429；Elbashir等，2001，Nature，411，494-498；和Kreutzer等，国际PCT公开号WO00/44895；Zernicka-Goetz等，国际PCT公开号WO01/36646；Fire，国际PCT公开号WO99/32619；Plaetinck等，国际PCT公开号WO00/01846；Mello和Fire，国际PCT公开号WO01/29058；Deschamps-Depaillette，国际PCT公开号WO99/07409；和Li等，国际PCT公开号WO00/44914。
[0141] 如本文所使用，“细胞”以其通常的生物学意思使用，并且不指整个的多细胞生物体。细胞可以是例如体内的、在体外的或离体的，例如，在细胞培养物中，或存在于多细胞生物体中，包括，例如，鸟类、植物和哺乳动物，比如人类、母牛、绵羊、猿、猴子、猪、狗和猫。细胞可以是原核的(例如，细菌细胞)或真核的(例如，哺乳动物细胞或植物细胞)。
[0142] “MG53”、“MG53结合蛋白”和“MG53受体”一般指肽或蛋白质，包括全长多肽，其结构域或片段，融合蛋白，和/或嵌合蛋白。
[0143] 使用本领域已知的方案合成寡核苷酸(例如；反义，GeneBlocs)，如在下述中描述：Caruthers等，1992，Methods in Enzymology211，319，Thompson等，国际PCT公开号WO99/54459，Wincott 等，1995，Nucleic Acids Res.23，26772684，Wincott等，1997，Methods Mol.Bio.，74，59，Brennan等，1998，Biotechnol Bioeng.，61，3345，和Brennan，美国专利号6,001,311。所有这些参考文献通过引用并入本文。在非限制性实例中，小规模的合成在394Applied Biosystems，Inc.合成器中进行。可选地，本发明的核酸分子可分开地合成并且在合成后通过例如连接作用结合在一起(Moore等，1992，Science256，9923；Draper等，国际PCT公开号WO93/23569；Shabarova等，1991，Nucleic Acids Research19，
4247；Bellon等，1997，Nucleosides&Necleotides，16，951；Bellon等，1997，Bioconjugate Chem.8，204)。
4247；Bellon等，1997，Nucleosides&Necleotides，16，951；Bellon等，1997，Bioconjugate Chem.8，204)。
[0144] 本发明的核酸分子可通过用核酸酶的抗性蛋白基团，例如，2'-氨基、2'-C-烯丙基、2'-氟、2'-O-甲基、2'-H的修饰而被广泛修饰以提高稳定性(对于综述，见Usman和Cedergren，1992，TIBS17，34；Usman等，1994，Nucleci Acids Symp.Ser.31,163)。
[0145] 尽管用硫代磷酸酯、硫代磷酸酯和/或5'-甲基磷酸酯连接化学修饰寡核苷酸的核苷酸间连接提高稳定性，但是过多的这些修饰可造成一些毒性。所以，当设计核酸分子时，这些核苷酸间连接应最小化。这些连接的浓度的减少应降低毒性，产生这些分子的增加的效力和更高的特异性。
[0146] 提供了具有保持或提高活性的化学修饰的核酸分子。这种核酸也通常比未修饰的核酸对核酸酶更有抗性。核酸分子优选地抗核酸酶，以便用作有效的细胞内治疗剂。RNA和DNA化学合成的改善(Wincott等，1995Nucleic Acids Res.23，2677；Caruthers等，1992，Methods in Enzymology211，3-19(通过引用并入本文)已经通过引入核苷酸修饰拓展了修饰核酸分子的能力，以增强它们的核酸酶稳定性，如上述。通过提供组合疗法(例如，靶向不同基因的多重反义或酶核酸分子、与已知的小分子抑制剂偶联的核酸分子，或用分子和/或其他化学或生物学分子组合的间歇性治疗)的可能性，本发明的基于核酸的分子的使用可产生更好的疾病进展的治疗。用核酸分子治疗对象也可包括不同类型核酸分子的组合。
[0147] 在一种实施方式中，本发明特征在于具有磷酸骨架修饰的修饰的核酸分子，其包括一种或多种硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、吗啉代、酰胺化氨基甲酸酯、羧甲基、乙酸亚胺盐(acetamidate)、聚酰胺、磺酸酯、磺酰胺、氨基磺酸盐、甲缩醛(formacetal)、硫代甲缩醛(thioformacetal)和/或烷基甲硅烷基取代基。对于寡核苷酸骨架修饰的综述，见Hunziker和Leumann，1995，Nucleic Acid Analogues:Synthesis and Properties，in Modern Synthetic Methods，VCH，331417，和Mesmaeker等，1994，Novel Backbone Replacements for Oligonucleotides，in Carbohydrate Modifications in Antisense Research，ACS，2439。通过引用将这些参考文献并入本文。可对核酸(例如，反义和核酶)结构进行各种修饰，以增强这些分子的用途。例如，这类修饰可提高货架期、体外半衰期、生物利用度、稳定性和将这类寡核苷酸引入靶位点的容易性，包括例如，提高细胞膜的通透性和赋予识别和结合靶细胞的能力。
[0148] 核酸分子的施用。递送核酸分子的方法描述在Akhtar等，1992，Trends Cell Bio.,2,139；和Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics，ed.Akhtar,1995，其二者通过引用并入本文。Sullivan等，PCT WO94/02595，进一步描述递送酶RNA分子的一般方法。这些方案可用于递送实际上任何核酸分子。核酸分子可通过本领域技术人员熟知的各种方法施用至细胞，包括，但不限于，封装入脂质体、通过离子电渗疗法、或通过并入至其他载体，比如水凝胶、环糊精、生物可降解的纳米胶囊和生物粘附性微球。可选地，核酸/载体组合通过直接注入或通过使用注入泵递送。递送的其他途径包括，但不限于口服(片剂或丸剂形式)和/或鞘内递送(Gold，1997，Neuroscience，76，1153-1158)。其他方法包括使用各种转运和载体系统，例如，通过使用缀合物和生物可降解的聚合物。对于包括CNS递送的药物递送策略的全面综述，见Ho等，1999，Curr.Opin.Mol.Ther.，1，336-343和Jain，Drug Delivery Systems:Technologies and Commercial Opportunities,Decision Resources,1998 和 Groothuis 等，1997，J.NeuroVirol.，3，
387-400。
387-400。
[0149] 本发明的分子可用作药物制剂。药物制剂预防、抑制出现或治疗(一些程度上缓解症状，优选地所有的征状)对象中的疾病状态。
[0150] 本发明带负电的多核苷酸可通过任何标准手段施用(例如，RNA、DNA或蛋白)和引入对象——有或没有稳定剂、缓冲液等——以形成药学组合物。当期望使用脂质体递送机制时，可按照形成脂质体的标准方案。本发明的组合物也可配置和用作口服施用的片剂、胶囊或酏剂；直肠施用的栓剂；无菌溶液；可注射施用的悬液；和本领域已知的其他组合物。
[0152] 药学组合物或制剂指形式适于施用，例如全身性施用至细胞或对象，优选人的组合物或制剂。“全身性施用”意思是药物在血流中体内全身性吸收或积累，然后遍及整个身体分布。适合的形式，部分取决于用途或进入的途径，例如口服、经皮或通过注入。这种形式不应防止组合物或制剂到达靶细胞(即，带负电的聚合物期望递送至的细胞)。例如，注入血流的药学组合物应当是可溶的。其他因素是本领域已知的，并且包括多个考虑因素，比如毒性和阻止组合物或制剂发挥其作用的形式。
[0153] 产生全身性吸收的施用途径包括，但不限于：静脉内、皮下、腹膜内、吸入、口服、肺内和肌内。药物进入循环的速度已经显示是分子量或分子尺寸的函数。包括本发明化合物的脂质体或其他药物载体的使用可潜在地将药物定位在，例如某些组织类型，比如网状内皮系统(RES)组织中。可利于药物与细胞，比如淋巴细胞和巨噬细胞的表面结合的脂质体制剂也是有用的。
[0154] 药学上可接受的制剂意思是允许本发明的核酸分子在最适于它们的期望活性的物理位置中有效分布的组合物或制剂。适于与本发明核酸分子一起配制的试剂的非限制性例子包括：PEG缀合的核酸、磷脂缀合的核酸、包含亲脂性部分的核酸、硫代磷酸酯、P-糖蛋白抑制剂(比如Pluronic P85)，其可增强药物进入个中组织，例如CNS(Jolliet-Riant和Tillement，1999，Fundam.Clin.Pharmacol.，13，16-26)；生物可降解的聚合物，比如聚(DL-丙交酯-共乙交酯)(poly(DL-lactide-coglycolide))微球，用于在植入之后持续释放递送(Emerich，DF等，1999，Cell Transplant，8，47-58)Alkermes，Inc.Cambridge，Mass.；和负载的(loaded)纳米颗粒，比如由聚氰基丙烯酸丁酯制造的那些，其可将药物递送跨过血脑屏障并且可改变神经元摄取机制(Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry，23，941-949，1999)。包括核酸分子的CNS递送的递送策略的其他非限制性例子包括下述中描述的材料：Boado等，1998，J.Pharm.Sci.，87，1308-1315；Tyler等，1999，FEBS Lett.，421，280-284；Pardridge 等，1995，PNAS USA.，92，5592-5596；Boado，1995，Adv.Drug Delivery Rev.，15，73-107；Aldrian-Herrada 等，1998,Nucleic Acids Res.，26，4910-4916；和Tyler等，1999，PNAS USA.，96，7053-7058。所有这些参考文献通过引用并入本文。
[0155] 本发明的特征也在于包括表面修饰的脂质体的组合物的应用，所述脂质体包含聚(乙二醇)脂质(PEG-修饰的，或长循环脂质体或隐形脂质体(stealth liposome))。本发明的核酸分子也可包括各种分子量的共价连接的PEG分子。这些制剂提供增加药物在靶组织中积累的方法。该类药物载体可低抗单核细胞吞噬系统(MPS或RES)的调理作用和消除，从而实现更长的血液循环时间和增加的组织暴露于封装药物(Lasic等,Chem.Rev.1995,95,2601-2627；Ishiwata等，Chem.Pharm.Bull.1995，43，1005-1011)。基于其避免在代谢较强的MPS组织，如肝脏和脾脏中堆积的能力，与阳离子脂质体相比，长循环脂质体还可能较大程度地保护药物不被核酸酶降解。所有这些参考文献通过引用并入本文。
[0156] 本发明也包括制备用于保存或施用的组合物，其包括药学上有效量的在药学上可接受的载体或稀释剂中的期望的化合物。治疗应用可接受的载体或稀释剂是药学领域熟知的，并且例如在Remington's Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro edit.1985)中描述，其通过引用并入本文。例如，可提供防腐剂、稳定剂、染料和调味剂。这些包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸的酯。另外，可使用抗氧化剂和悬浮剂。
[0157] 有效量、药学上有效剂量、治疗有效量或药学上有效量是预防、抑制发生或治疗(一些程度上缓解征状，优选地所有征状)疾病状态或病理学状况需要的剂量。有效量取决于疾病的类型、使用的组合物、施用的途径、治疗的哺乳动物类型、所考虑的具体哺乳动物的生理特征、协同的药物和医药领域技术人员认识的其他因素。一般而言，取决于带负电的聚合物的效力，施用0.1mg/kg和1000mg/kg体重/天之间量的活性成分。另外，有效量的本发明的组合物包括在实施例中使用的利于意图的或期望的生物学作用的那些量。
[0158] 这类化合物的毒性和治疗性功效可通过细胞培养物或实验动物中标准药学程序确定，例如，用于确定LD50(50%群体致死的剂量)和ED50(50%群体中治疗有效的剂量)。毒性和疗效之间的剂量比是治疗指数，并且其可表达为LD50/ED50比。优选展示大的治疗指数的化合物。尽管可使用展示毒副作用的化合物，但应当小心设计将这种化合物靶向感染组织的位点的递送系统，以便使对未感染细胞的潜在损伤最小化，从而减少副作用。从细胞培养试验和动物研究获得的数据可用于配制用于人的剂量范围。这类化合物的剂量优选在包括具有很小或没有毒性的ED50的循环浓度范围内。取决于采用的剂型和使用的施用途径，可在该范围内改变剂量。对于在本发明的方法中使用的任何化合物，治疗有效剂量可最初从细胞培养试验中评估。可在动物模型中配制剂量，以实现包括IC50的循环血浆浓度范围(即，实现征状半数最大抑制的检测化合物的浓度)，如在细胞培养中确定的。这种信息可用于更精确地确定人中有用的剂量。例如，可通过高效液相色谱测量血浆中的水平。
[0159] 制剂可口服、局部、肠胃外、通过吸入或喷雾或直肠，以包含常规的无毒的药学上可接受的载体、佐剂和媒介(vehicle)的剂量单位制剂施用。如本文所使用的术语肠胃外包括经皮、皮下、血管内(例如，静脉内)、肌内或鞘内注入或灌注技术和类似技术。另外，提供包括本发明的核酸分子和药学上可接受的载体的药学制剂。一种或多种本发明的核酸分子可结合一种或多种无毒的药学上可接受的载体和/或稀释剂和/或佐剂，并且如果需要结合其他活性成分而存在。本发明的药学组合物可为适于口服使用的形式，例如，作为片剂、锭剂、糖锭、水性或油性悬液，可分散型粉末或颗粒剂、乳剂、硬胶囊或软胶囊、或糖浆剂或酏剂。
[0160] 可根据制造药物组合物领域已知的任何方法制备意图用于口服使用的组合物，并且这类组合物可包含这类甜味剂、调味剂、着色剂或防腐剂的一种或多种，以便提供药学上雅致的且可口的制剂。片剂包含与适于制造片剂的无毒的药学上可接受的赋形剂混合的活性成分。这些赋形剂可以是例如，惰性稀释剂，比如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；成粒剂和崩解剂，例如，玉米淀粉或藻酸；粘合剂，例如淀粉、明胶或金合欢胶，和润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以是未包衣的或它们可通过已知的技术包衣。在一些情况下，这种包衣可通过已知的技术制造，以延迟在胃肠道中的崩裂和吸收并且从而提供长时间的持续作用。例如，可采用延时材料，比如单硬脂酸甘油酯或双硬脂酸甘油酯。口服使用的制剂也可呈现为硬明胶胶囊，其中活性成分与惰性固体稀释剂例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合；或作为软明胶胶囊存在，其中活性成分与水或油介质例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。
[0161] 水性悬液包含与适于制造水性悬液的赋形剂混合的活性材料。这类赋形剂是悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基-甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍树胶和金合欢树胶；分散剂或湿润剂可以是天然存在的磷脂，例如，卵磷脂，或环氧烷(氧化烯)与脂肪酸的缩合产物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物，例如十七烷基亚乙基氧基鲸腊醇(heptadecaethyleneoxycetanol)，或环氧乙烷与源自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物，比如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯，或环氧乙烷与源自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物，例如聚乙烯山梨聚糖单油酸酯。水性悬液也可包含一种或更多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或正丙酯、一种或更多种着色剂、一种或更多种调味试，和一种或更多种甜味剂，比如蔗糖或糖精。
[0162] 可通过将活性成分悬浮在植物油，例如花生油(arachis oil)、橄榄油、芝麻油或椰子油中，或悬浮在矿物油，比如液态石蜡中配制油性悬液。油性悬液可包含增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可添加甜味剂和调味剂以提供可口的口服制剂。这些组合物可通过添加抗氧化剂比如抗坏血酸进行防腐。
[0163] 通过添加水，适于制备水性悬液的可分散粉末和颗粒提供与分散剂或湿润剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂混合的活性成分。适当的分散剂或湿润剂或悬浮剂例子为上面已经提到的那些。也可存在另外的赋形剂，例如甜味剂、调味剂和着色剂。本发明的药学组合物也可为水包油乳剂的形式。油相可以是植物油或矿物油或这些的混合物。适当的乳化剂可以是天然存在的树胶，例如金合欢树胶或黄蓍树胶，天然存在的磷脂，例如大豆、卵磷脂和源自脂肪酸和己糖醇酐、酐的酯或偏酯，例如山梨聚糖单油酸酯，和所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯。乳剂也可包含甜味剂和调味剂。
[0164] 可用甜味剂，例如甘油、丙二醇、山梨糖醇、葡萄糖或蔗糖配制糖浆剂和酏剂。这类制剂也可包含湿润剂、防腐剂和调味剂以及着色剂。药学组合物可为无菌可注射水性悬液或油性悬液的形式。该悬液可根据已知的技术使用上面提到的那些合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂制备。无菌可注射制剂也可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬液，例如作为1,3-丁二醇中的溶液。在可接受的媒介和溶剂中，可采用的是水、林格溶液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌，不挥发油常规上用作溶剂或悬浮介质。为了该目的，可采用任何温和的不挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。另外，脂肪酸比如油酸可用于制备注射剂。
[0165] 本发明的核酸分子也可以以栓剂的形式施用，例如，用于直肠施用药物或经导管直接至膀胱本身。可通过混合药物与适当的非刺激性赋形剂制备这些组合物，所述赋形剂在常温下是固体但是在直肠温度下是液体，并且所以在直肠中熔化以释放药物。这类材料包括可可脂和聚乙二醇。
[0166] 本发明的核酸分子可在无菌介质中肠胃外施用。取决于使用的媒介和浓度，药物可悬浮或溶解在媒介中。有利地，佐剂比如局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂可溶解在媒介中。取决于处理的宿主和施用的具体模型，可改变结合载体材料以生产单个剂型的活性成分的量。剂量单位形式一般包含约1mg至约5000mg的活性成分。应理解，任何具体患者或对象的具体剂量水平取决于多种因素，包括使用的具体化合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、施用途径和排泄速度、药物组合和进行治疗的具体疾病的严重性。
[0167] 为了施用至非人动物，组合物也可添加至动物饲料或饮用水。配制动物饲料和饮用水组合物可以是方便的，从而动物连同其饮食摄入治疗适当量的组合物。也可方便提供组合物作为预混料添加至饲料或饮用水。组合物也可结合其他治疗性化合物施用至对象以增加总体疗效。使用多重化合物治疗病症可增加有益效果，同时减少副作用的存在。
[0168] 可选地，本发明的某些核酸分子可在细胞中从真核启动子表达(例如，Izant和 Weintraub,1985,Science,229,345;McGarry 和 Lindquist,1986,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA83,399;Scanlon等 ,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88,105915;Kashani-Sabet等 ,1992,Antisense Res.Dev.,2,315;Dropulic 等 ,1992,J.Virol.,66,143241;Weerasinghe 等 ,1991,J.Virol.,65,55314;Ojwang 等 ,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,108026;Chen等,1992,Nucleic Acids Res.,20,45819;Sarver等,1990Science,247,12221225;Thompson et al,1995,Nucleic Acids Res.,23,2259;Good等,1997,Gene Therapy,4,45；所有这些参考文献以它们的整体通过引用并入本文)。本领域技术人员认识到，任何核酸可在真核细胞中从适当的DNA/RNA载体表达。
[0169] 在一个方面中，本发明特征在于表达载体，其包括编码至少一种本发明的核酸分子的核酸序列。编码本发明的核酸分子的核酸序列以允许该核酸分子表达的方式可操作连接。
[0170] 核酸分子序列的转录由真核RNA聚合酶I(pol I)、RNA聚合酶II(pol II)或RNA聚合酶III(pol III)的启动子驱动。来自pol II或pol III启动子的转录体以高水平在所有细胞中表达；在给定细胞类型中给定pol II启动子的水平取决于附近存在的基因调节序列(增强子、沉默子等)的性质。也使用原核RNA聚合酶启动子，前提是原核RNA聚合酶在适当的细胞中表达(Elroy-Stein和Moss，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87,67437；Gao和Huang1993，Nuecleic Acids Res.，21，286772；Lieber等，1993，Methods Enzymol.，217，4766；Zhou等，1990，Mol.Cell.Biol.，10，452937)。所有这些参考文献通过引用并入本文。
数个研究人员已经表明核酸分子，比如从这类启动子表达的核酶，可在哺乳动物的细胞中发挥功能(例如Kashani-Sabet等，1992，Antisense Res.Dev.，2，315；Ojwang等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，108026；Chen等，1992，Nuecleic Acids Res.，20，45819；Yu等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，63404；L'Huillier 等，1992，EMBO J.，11，44118；
Lisziewicz等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，90，80004；Thompson等，1995，Nuecleic Acids Res.，23，2259；Sullenger&Cech，1993，Science，262，1566)。
数个研究人员已经表明核酸分子，比如从这类启动子表达的核酶，可在哺乳动物的细胞中发挥功能(例如Kashani-Sabet等，1992，Antisense Res.Dev.，2，315；Ojwang等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，108026；Chen等，1992，Nuecleic Acids Res.，20，45819；Yu等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，63404；L'Huillier 等，1992，EMBO J.，11，44118；
Lisziewicz等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，90，80004；Thompson等，1995，Nuecleic Acids Res.，23，2259；Sullenger&Cech，1993，Science，262，1566)。
[0171] 在另一方面中，本发明特征在于表达载体，其包括以允许该核酸分子表达的方式编码至少一种本发明的核酸分子的核酸序列。在一种实施方式中，表达载体包括；a)转录起始区；b)转录终止区；c)编码至少一种所述核酸分子的核酸序列；并且其中所述序列以允许所述核酸分子表达和/或递送的方式，可操作连接至所述起始区和所述终止区。
[0172] 本发明进一步的目标是提供试剂盒，其包括适当的容器，以药学上可接受形式放置在其中的本发明的治疗剂，和其使用说明书。
[0173] 在另一实施方式中，本发明的分离的核酸分子包括为编码MG53多肽或MG53受体多肽的核苷酸序列的互补物的核酸分子。如本文所使用，术语“互补”指核酸分子的核苷酸单位之间Watson-Crick或Hoogsteen碱基配对，并且术语“结合”意思是两个多肽或化合物或相连的多肽或化合物或其组合之间的物理或化学相互作用。结合包括离子、非离子、范德华、疏水相互作用等。物理相互作用可以是直接的或间接的。
[0174] 如本文所使用，“片段”定义为至少6个(连续的)核酸或至少4个(连续的)氨基酸——长度足以允许在核酸情况下特异性杂交或在氨基酸情况下特异性识别表位，并且至多是小于全长序列的一些部分。
[0175] 术语“宿主细胞”包括可能用于携带异源核酸，或表达由异源核酸编码的肽或蛋白的细胞。宿主细胞可包含未在该细胞的天然(非重组)形式中出现的基因，或在其中基因已被修饰并通过人工手段再引入细胞的天然形式的细胞中出现的基因，或已经被人工修饰而未从细胞中移出核酸的细胞的内源性核酸。宿主细胞可以是真核的或原核的。细菌培养必需的一般生长条件可见文本，比如BERGEY'S MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY，Vol.1，N.R.Krieg，ed.，Williams和Wilkins，Baltimore/London(1984)。“宿主细胞”也可以是其中内源性基因或启动子或二者已经被修饰以生产一种或多种本发明复合物的多肽组分的细胞。
[0176] “衍生物”是由天然化合物直接、通过修饰或通过部分取代形成的组合物。
[0177] “类似物”是具有与天然化合物类似的但不相同的结构的核酸序列或氨基酸序列。
[0178] 本发明的核酸或蛋白的衍生物或类似物包括但不限于如此分子，其包含与本发明的核酸或蛋白基本同源的区域，在各种实施方式中，其与相同尺寸的核酸或氨基酸序列，或者当与比对序列相比较时——其中通过本领域中已知的计算机同源性程序进行比对——具有至少约30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的同一性(优选80-95%的同一性)，或者其编码核酸能够在严格、中度严格或低严格条件下与编码本发明蛋白的序列的互补物杂交。见例如Ausubel，等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAE BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，N.Y.，1993。核酸衍生物和修饰包括通过基因置换、位点特异性突变、缺失、插入、重组、修复、穿梭(shuffling)、内切核酸酶消化、PCR、亚克隆和相关技术获得的那些。
[0179] “同系物”可以是天然存在的，或通过人工合成一种或多种具有相关序列的核酸而产生的，或通过修饰一种或多种核酸以生产相关的核酸而产生的。当核酸天然地或人工地源自共同祖先序列(例如，直向同源物或种内同源物)时，它们是是同系物。如果两个核酸之间的同源性未被清楚描述，同源性可通过两条或更多条序列之间的核酸比较而推断。如果序列在一级氨基酸结构水平上表现一些程度的序列类似性，例如，大于约30%、40%、50%、60%、70%、80%、或90%，则推断它们具有共同的祖先。出于本发明的目的，如果核酸序列足以类似以允许在严格条件下重组和/或杂交，那么基因是同源的。
[0180] 如本文所使用“杂交”指在低、中或高严格条件下分子仅与具体的核苷酸序列结合、双联(duplexing)或杂交，包括当该序列出现在复杂的混合物(例如，整个细胞)DNA或RNA中时。
[0181] 此外，本领域技术人员将认识到“保守突变”也包括核酸的取代、缺失或添加，其改变、添加或缺失在编码序列中的单个氨基酸或少量的氨基酸，其中核酸改变导致化学上类似氨基酸的取代。彼此可用作保守取代的氨基酸包括下列：碱性：精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；酸性：天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；亲水性：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)；疏水性：苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；含硫的：甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)。另外，通过保守变化而不同的序列通常是同源的。
[0182] 可用于实施本发明的包括诱变、PCR、克隆和类似技术在内的分子生物学技术的 描 述 包 括 Berger和 Kimmel,GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES,METHODS IN ENZYMOLOGY,152 卷 ,Academic Press,Inc.,San Diego,Calif.(Berger);Sambrook等,MOLECULAR CLONING--A LABORATORY MANUAL(2nd Ed.),Vol.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,1989,和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,F.M.Ausubel等,eds.,Current Protocols,a joint venture between Greene Publishing Associates,Inc.and John Wiley&Sons,Inc.;Berger,Sambrook,和Ausubel,以及Mullis等，美国专利号4,683,202(1987);PCR PROTOCOLS A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS(Innis et al.eds),Academic Press,Inc.,San Diego,Calif.(1990)(Innis);Arnheim&Levinson(Oct.1,1990)C&EN36-47。
[0183] 在仍另一实施方式中，本发明的核酸使用哺乳动物的表达载体在哺乳动物的细胞中表达。对于原核和真核细胞的适当的表达系统见，例如，Sambrook等，MOLECULAER CLONING:A LABORATOEY MANUAL.第二版的16和17章，Cold Spring Harbor Laboratroy，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989。
[0184] 多核苷酸可以是DNA分子、cDNA分子、基因组DNA分子或RNA分子。多核苷酸，如DNA或RNA可包括其中T(胸苷)也可以是U(尿嘧啶)的序列。如果在多核苷酸某位置上的核苷酸能够与在反平行DNA或RNA链相同位置上的核苷酸形成Watson-Crick配对，那么多核苷酸和DNA或RNA分子在该位置彼此互补。当每个分子中足够数量的相应位置被可彼此杂交以实现期望过程的核苷酸占据时，多核苷酸和DNA或RNA分子基本上彼此互补。
[0185] 可通过如本领域技术人员熟知的常规技术实施用重组DNA转化宿主细胞。“转化”意思是并入新的DNA(即，对细胞是外源性的DNA)之后诱导的永久性的或暂时的遗传改变。
[0186] 在另一实施方式中，重组哺乳动物的表达载体能够引导核酸优先在具体的细胞类型中表达(例如，组织特异性调节元件用于表达核酸)。组织特异性调节元件是本领域已知的。适当的组织特异性启动子的非限制例子包括白蛋白启动子(肝特异性的；Pinkert，等，1987.Genes Dev.1：268-277)、淋巴特异性启动子(Calame和Eaton，1988.Adv.Immunol.43：235-275)，尤其是T细胞受体的启动子(Winoto和Baltimore，1989.EMBO J.8：729-733)和免疫球蛋白的启动子(Banerji，等，1983.Cell33：729-740；Queen和Baltimore，1983.Cell33：741-748)、神经元特异性启动子(例如，神经丝启动子；Byrne和Ruddle，1989.Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：5473-5477)、胰腺特异性启动子(Edlund，等，1985.Science230：912-916)和乳腺特异性启动子(例如，乳清(milk whey)启动子；美国专利号4,873,316和欧洲申请公开号264,166)。也包括发育调节性启动子，例如，鼠科hox启动子(Kessel和Gruss，1990.Science249：374-379)和甲胎蛋白启动子(Campes和Tilghman，1989.Genes Dev.3：537-546)。
[0187] 在任何实施方式中，编码MG53多肽或MG53受体的核酸可表示为：一条或更多条裸DNA；一条或更多条布置在适当表达载体中并且游离地(episomally)保持的核酸；一条或更多条并入宿主细胞基因组的核酸；编码复合物组分的内源性基因的修饰版本；结合一条或更多条调节核酸序列的一条或更多条核酸；或其组合。核酸可任选地包括连接肽或融合蛋白组分，例如，在5’端、3’端或在ORF中的任何位置处的His-标签、FLAG-标签、麦芽糖结合蛋白(MBP)-标签、荧光蛋白、GST、TAT、抗体部分、信号肽和类似组分。
[0188] 在优选的实施方式中，本发明的核酸包括编码MG53或MG53受体的可溶性部分的多核苷酸。本文所述的任何实施方式，可使用本领域技术人员熟知的标准分子生物学和遗传方法实现。
[0189] 在宿主是原核生物，比如大肠杆菌的情况下，可从指数生长期之后收获的并随后CaCl2方法处理的细胞通过本领域熟知的过程制备能够DNA摄取的感受态细胞。可选地，可使用MgCl2、RbCl、脂质体或脂质体-蛋白缀合物。也可在形成宿主细胞的原生质体之后或通过电穿孔进行转化。这些例子不限制本发明；现有本领域技术人员熟知的多种转染宿主细胞的技术，并且其考虑在本发明的范围内。
[0190] 当宿主是真核生物时，用DNA转染的这类方法包括磷酸钙共沉淀、常规的机械方法，比如微注射、电穿孔、插入包在脂质体中的质粒或病毒载体，以及可使用本领域已知的其他方法。真核细胞可以是酵母细胞(例如，酿酒酵母)或可以是哺乳动物细胞，包括人细胞。为了长期、高产率生产重组蛋白，优选稳定的表达。
[0191] 干细胞应用
[0192] 在另一方面中，本发明包括使用宿主细胞和干细胞的治疗性方法，所述干细胞根据本发明的方法修饰，其可用于移植和/或过继细胞治疗性方法。在该方面的一种实施方式中，干细胞，例如，心脏干细胞自宿主分离，其中干细胞能够分化成心肌细胞，并且其中分离的干细胞被修饰，以便其展示调节的，例如增强的MG53活性、MG53基因表达或调节的MG53信号传导级联。在优选的实施方式中，干细胞与试剂，例如MG53多肽、MG53核苷酸或增强心脏细胞中MG53信号传导级联的试剂接触。然后，修饰的干细胞可在体外培养，并且随后施用至需要其的个体，例如，由于缺血/再灌注或低氧而具有持续心肌损伤的患者。
[0193] 分离、培养和操作能够分化成心肌细胞的干细胞的多种方法是已知的。见，例如，Guo J.等Int J Exp Pathol.2009Jun；90(3):355-64；Patel A.N.，和Sherman W.，Cell Transplant.2009；18(3):243-4；Murtuza B.等,Tissue Eng Part B Rev.2009年6月24日；Popescu L.M.等J Cell Mol Med.2009年5月；13(5):866-86.2009年4月20日电子公开；Chamuleau S.A.等.Cardiovasc Res.2009年6月1日；82(3):385-7.2009年4月8日电子公开；出于所有的目的，它们的内容通过引用以它们的整体并入本文。
[0194] 抗体
[0195] 如本文所使用术语“抗体”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即，包含特异性结合(与其免疫反应)抗原的抗原-结合位点的分子，其包括至少一个，和优选地两个重(H)链可变区(本文简称为VH)，和至少一个和优选地两个轻(L)链可变区(本文简称为VL)。这类抗体包括，但不限于，多克隆、单克隆、嵌合、单链、Fab、Fab'和F(ab')2片段，和Fab表达文库。VH和VL区可进一步细分为超变区，称为“互补决定区”(“CDR”)，其散布有更保守的称为“框架区”(FR)的区域。框架区和CDR的范围已经被精确限定(见，Kabat，E.A.，等(1991)Sequence of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242，和Chothia，C.等(1987)J.Mol.Biol.196:901-917，其通过引用并入本文)。每个VH和VL是由3个CDR和4个FR组成，从氨基-末端至羧基-末端以下列顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。一般而言，从人获得的抗体分子涉及IgG、IgM、IgA、IgE和IgD类别的任何一种，它们由于分子中存在的重链性质而彼此不同。某些类别也具有亚类，比如IgG1、IgG2等。此外，在人中，轻链可以是κ链或λ链。本文提及抗体包括提及人抗体种类的所有这种类别、亚类和类型。
[0196] 抗体可由作为免疫试剂的完整的多肽或包含感兴趣肽的片段制备。优选的抗原多肽片段是MG53或MG53受体蛋白的15-100个连续的氨基酸。在一种实施方式中，肽定位在多肽的非跨膜结构域中，例如在细胞外或细胞内结构域中。示例性抗体或抗体片段结合从细胞外环境可获取的(accessible)并且改变该蛋白功能的表位。在某些实施方式中，本发明包括识别MG53或MG53受体蛋白、其变体、部分和/或组合的一种或多种表位并且对于其特异性的抗体。在可选的实施方式中，本发明的抗体可靶向和干扰MG53/MG53受体相互作用，以抑制信号传导。
[0197] 单克隆抗体的制备是本领域熟知的；见例如，Harlow等，抗体：A Laboratory Manual，726页(Cold Spring Harbor Pub.1988)。可通过如下获得单克隆抗体：用包括抗原的组合物注射小鼠或兔，通过移出血清样品确认存在抗体产生，移出脾以获得B淋巴细胞，使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以生产杂交瘤，克隆该杂交瘤，选择产生该抗原的抗体的阳性克隆，和从杂交瘤培养物中分离抗体。单克隆抗体可通过本领域熟知的技术从杂交培养物中分离和纯化。
[0198] 在其他实施方式中，可重组生产抗体，例如，通过噬菌体展示或通过组合方法生产。噬菌体展示和组合方法可用于分离结合膜修复多肽、MG53、膜修复多肽结合蛋白、MG53结合蛋白、膜修复多肽受体和/或MG53受体蛋白或其片段的重组抗体(如在，例如，Ladner等.美国专利号5,223,409；Fuchs等.(1991)Bio/Technology 9:1370-1372；Hay等(1992)Hum Antibod Hybridomas3:81-85；Huse 等 (1989)Science246:1275-1281；Clackson 等(1991)Nature352:624-628；Gram等(1992)PNAS89:3576-3580中描述)。人单克隆抗体也可使用携带人免疫球蛋白基因而不是小鼠系统的转基因小鼠产生。来自用感兴趣的抗原免疫的这些转基因小鼠的脾细胞用于生产杂交瘤，其分泌对来自人蛋白的表位有特异亲和性的人mAbs(见，例如，Wood等国际申请WO91/00906；Lonberg，N.等1994Nature368:856-859；Green，L.L.等1994Nature Genet.7:13-21；Morrison，S.L.等1994Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855)。本发明复合物组分或复合物本身的治疗有用抗体可源自“人源化”单克隆抗体。人源化单克隆抗体通过如下生产：将来自小鼠免疫球蛋白的重链和轻链可变区的小鼠互补决定区(CDR)转移至人可变结构域，然后将人残基替换至小鼠对应物的框架区。
[0199] 源自人源化单克隆抗体的抗体组分的使用消除了潜在的与小鼠恒定区的免疫原性相关的问题。生产人源化单克隆抗体的技术可见于：Jones等，Nature321：522，1986和Singer 等，J.Immunol.150：2844，1993；Wu T.T.和Kabat,E.A.(1970)J.Exp.Med.，132:，211–250；和 Johnson G.，Wu,T.T. 和 Kabat,E.A.(1995)In Paul,S.(ed.)，Antibody Engineering Protocols.Humana Press，1–15页，其通过引用并入本文。抗体也可源自从组合的免疫球蛋白文库分离的人抗体片段；见，例如，Barbas等，Methods：A Companion to Methods in Enzymology2，119，1991。另外，可通过剪接来自具有适当抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与来自适当生物学特异性的人抗体分子的基因，获得嵌合抗体；见，例如，Takeda等，Nature314：544-546，1985。嵌合抗体是其中不同部分源自不同动物种的抗体。
[0200] 抗独特型技术可用于以生产模拟表位的单克隆抗体。为第一单克隆抗体制备的抗独特型单克隆抗体将在超变区具有结合结构域，其为第一单克隆抗体结合的表位的“影像”。可选地，用于生产单链抗体的技术可用于以生产单链抗体。经氨基酸桥连接Fv区的重链和轻链片段产生单链多肽，形成单链抗体。识别特异性表位例如细胞外表位的抗体片段可通过本领域熟知的技术产生。这类片段包括由蛋白水解消化产生的Fab片段，和通过还原二硫桥产生的Fab片段。当用于免疫疗法时，单克隆抗体、其片段或二者可不标记或用治疗剂标记。这些试剂可通过本领域熟知的技术直接或间接偶联至单克隆抗体，并且包括比如药物、放射性同位素、凝集素和毒素的试剂。
[0201] 单克隆抗体施用的剂量范围足够大以产生期望的作用，并且随着年龄、病况、体重、性别、年龄和待治疗的病况的程度而改变，并且可容易由本领域技术人员确定。剂量可为约0.1mg/kg至约2000mg/kg。单克隆抗体可静脉内、腹膜内、肌内和/或皮下施用。
[0202] 在本发明的某些实施方式中，抗原肽包括的至少一种表位是MG53或MG53受体位于蛋白表面上的区域，例如，亲水性区域。蛋白序列的疏水性分析指示多肽的哪个区域是尤其亲水的，并且所以可能编码可用于靶向抗体产生的表面残基。作为靶向抗体产生的手段，显示亲水性和疏水性区域的亲水性图(hydropathy plot)可通过本领域熟知的任何方法产生，包括，例如，Kyte Doolittle或Hopp Woods方法，用或不同傅里叶变换。见，例如，Hopp和 Woods，1981，Proc.Nat.Acad.Sci.USA78：3824-3828；Kyte 和 Doolittle1982，J.Mol.Biol.157：105-142，其每一篇通过引用以它们的整体并入本文。本文也提供了对抗原蛋白，或其衍生物、片段、类似物或同系物内的一种或多种结构域特异性的抗体。本发明的蛋白，或其衍生物、片段、类似物、同系物或直向同源物可用作免疫原，产生免疫特异性结合这些蛋白组分的抗体。
[0203] 人抗体
[0204] 完全人抗体基本上涉及其中轻链和重链二者——包括CDR——的全部序列源自人基因的抗体分子。这类抗体本文称为“人抗体”或“完全人抗体”。人单克隆抗体可通过三源杂交瘤(trioma)技术；人B-细胞杂交瘤技术(见Kozbor，等，1983Immuno Today4：72)和生产人单克隆抗体的EBV杂交瘤技术(见Cole，等，1985In：MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY，Alan R.Liss，Inc.，77-96页)来制备。人单克隆抗体可用于本发明的实践并且可通过使用人杂交瘤生产(见Cote，等，1983.Proc Natl Acad Sci USA80：2026-2030)或通过用Epstein Barr病毒在体外转化人B-细胞生产(见Cole，等，1985In：MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY，Alan R.Liss，Inc.，77-96页)。
[0205] 另外，人抗体也可使用另外的技术生产，其包括噬菌体展示文库(Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.227:381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.，222:581(1991))。类似地，人抗体可通过将人免疫球蛋白基因座导入转基因动物例如小鼠——其中内源性免疫球蛋白基因已经被部分或完全失活——中制备。一旦攻击，观察到人抗体生产，其在所有方面与在人中观察到的非常类似，包括基因重排、组装和抗体谱(antibody repertoire)。该方法描述在，例如，美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016，和 Marks 等 .(Bio/Technology，10:779-783(1992))；Lonberg 等 (Nature，
368:856-859(1994))；Morrison(Nature，368:812-13(1994))；Fishwild 等 ,(Nature Biotechnology，14:845-51(1996))；Neuberger(Nature Biotechnology，14:826(1996))；
和Lonberg和Huszar(Intern.Rev.Immunol.，13:65-93(1995))中。
368:856-859(1994))；Morrison(Nature，368:812-13(1994))；Fishwild 等 ,(Nature Biotechnology，14:845-51(1996))；Neuberger(Nature Biotechnology，14:826(1996))；
和Lonberg和Huszar(Intern.Rev.Immunol.，13:65-93(1995))中。
[0206] 人抗体可另外地使用转基因非人动物生产，对该动物进行修饰以便响应抗原的攻击生产完全人抗体而不是动物的内源性抗体。使非人宿主中编码免疫球蛋白重链和轻链的内源性基因丧失能力(incapacitated)，并且将编码人重链和轻链免疫球蛋白的活性基因座插入宿主的基因组。例如使用包含必要的人DNA区段的酵母人工染色体并入人基因。然后，通过使包含少于该修饰的完全互补物的中间转基因动物（intermediate transgenic animals)杂交育种，获得提供所有期望修饰的动物作为子代。这类非人动物的优选实施方TM
式是小鼠，并且称为Xenomouse ，如在PCT公开WO96/33735和WO96/34096中公开的。
式是小鼠，并且称为Xenomouse ，如在PCT公开WO96/33735和WO96/34096中公开的。
[0207] 本发明抗体的治疗有效量一般涉及实现治疗性目标需要的量。如上面叙述，这可以是抗体和其靶抗原之间的结合相互作用，在某些情况下，其干扰靶的功能，和在其他情况下，促进生理学应答。而且，需要施用的量将取决于抗体对其特异性抗原的结合亲和性，并且将也取决于施用的抗体从其施用的其他对象自由体积(free volume)消耗的速度。本发明的抗体或抗体片段的治疗有效给药剂量的常见范围的非限制性例子可从约0.1mg/kg体重至约500mg/kg体重。常见给药频率可，例如从每天两次至一周一次的范围。
[0208] 特异性结合本发明的蛋白的抗体，以及通过本文公开的筛选试验鉴定的其他分子可被以药学组合物的形式施用治疗各种不适。制备这类组合物涉及的原则和考虑因素，以及选择组分的指导提供在下列中：例如，Remington：The Science and Practice Of Pharmacy第19版(Alfonso R.Gennaro，等，编辑)Mack Pub.Co.，Easton，Pa.：1995；Drug Absorption Enhancement：Concepts，Possibilities，Limitations，and Trends，Harwood Academic Publishers，Langhorne，Pa.，1994；and Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences，Vol.4)，1991，M.Dekker，New York。该活性成分也可包载(entrap)在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中——例如分别羟丙基甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)中或在粗乳剂(macroemulsion)中。用于体内施用的制剂必须是无菌的。这通过过滤通过无菌滤液膜容易实现。
[0209] 可制备缓释制剂。缓释制剂的适当的例子包括含有该抗体的固体疏水性聚合物的半通透性基质，该基质为成形制品形式，例如，膜或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯基醇))、多乳酸化合物(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸与γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、TM
可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物如LUPRON DEPOT (由乳酸-羟基乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球）和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-羟基乙酸的聚合物能够释放分子超过100天，但是某些水凝胶释放蛋白质较短的时间段。
可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物如LUPRON DEPOT (由乳酸-羟基乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球）和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-羟基乙酸的聚合物能够释放分子超过100天，但是某些水凝胶释放蛋白质较短的时间段。
[0210] ELISA试验
[0211] 用于检测分析物蛋白的试剂是能够结合分析物蛋白的抗体，优选地具有可检测标记的抗体。抗体可以是多克隆抗体，或更优选地，单克隆抗体。可使用完整的抗体，或其片段(例如，Fab或F(ab)2)。术语“标记的”，就探针或抗体而言，意图包括通过将可检测物质与探针或抗体偶联(即，物理连接)直接标记探针或抗体，以及通过与被直接标记的另一反应物反应间接标记探针或抗体。间接标记的例子包括使用荧光标记的二抗检测一抗，和用生物素末端标记DNA探针，使得其可用荧光标记的链霉抗生物素检测。术语“生物学样品”意图包括从对象分离的组织、细胞和生物学流体，以及对象中存在的组织、细胞和流体。因此，术语“生物学样品”的使用包括血液以及血液的部分和组成，包括血清、血浆或淋巴。即，本发明的检测方法可用于在体外以及体内检测生物学样品中的分析物mRNA、蛋白质或基因组DNA。例如，检测分析物mRNA的体外技术包括RNA杂交和原位杂交。检测分析物蛋白的体外技术包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、蛋白质印迹、免疫沉淀和免疫荧光。检测分析物基因组DNA的体外技术包括DNA杂交。进行免疫试验的程序描述在下述中：例如"ELISA：Theory and Practice：Theory in Methods Biology"，Vol.42，J.R.Crowther(Ed.)Human Press，Totowa，N.J.，1995；"Immunoassay"，E.Diamandis 和 T.Christopoulus，Academic Press,Inc.,San Diego,Calif.,1996；and"Practice and Thory of Enzymes Immunoassays"，P.Tijssen,Elsevier Science Publishers，Amsterdam，1985。此外，检测分析物蛋白的体内技术包括将标记的抗分析物蛋白质的抗体引入对象。例如，抗体可用放射性标记物标记，所述标记物在对象中的存在和位置可单独或与效应细胞一起通过标准成像技术腔内或经皮检测。
[0212] 用于施用本发明治疗剂的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、悬液和乳剂。非水性溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油比如橄榄油和可注射有机酯，比如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳剂或悬液，包括盐水和缓冲介质。媒介包括氯化钠溶液、林格右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸化林格静脉内媒介——包括流体和营养补充物、电介质补充物和类似物。可添加防腐剂和其他添加剂，比如，例如，抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体和类似物。
[0213] 本发明的化合物、核酸分子、多肽和抗体(本文也称为“活性化合物”)，和其衍生物、片段、类似物和同系物，可并入适于施用的药学组合物。这种组合物通常包括核酸分子、蛋白质或抗体和药学上可接受的载体。如本文所使用，“药学上可接受的载体”意图包括与药学施用相容的任何的和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟试剂，和类似物。适当的载体描述在本领域标准参考文本最新版的Remington's Pharmaceutical Sciences中，其通过引用并入本文。这类载体或稀释剂的优选例子包括，但不限于水、盐水、林格溶液(finger's solutions)、右旋糖溶液和5%人血清白蛋白。也可使用脂质体和非水性媒介，比如不挥发油。药学上活性物质的这种介质和试剂的使用是本领域熟知的。除非某种程度上任何常规的介质或试剂与活性化合物不相容，否则考虑其在组合物中的使用。补充的活性化合物也可并入组合物。
[0214] 本发明的药学组合物配制为与其意图的施用途径相容。施用的途径的例子包括肠胃外例如静脉内、皮内、皮下、口服(例如，吸入)、经皮的(即，局部)、经粘液的、腹膜内和直肠施用。肠胃外、皮内或皮下施加使用的溶液或悬液可包括下列组分：无菌稀释剂比如注射用水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、丙三醇、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，比如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，比如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，比如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲液，比如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，和用于张力(tonicity)调节的试剂，比如氯化钠或右旋糖。可用酸或碱，比如盐酸或氢氧化钠调节pH。肠胃外制剂可装入安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制造的多剂量瓶中。
[0215] 适于注射用的药学组合物包括无菌水溶液(在水溶性的情况下)或分散液和用于临时配制无菌注射液或分散液的无菌粉末。为了静脉内施用，适当的载体包括生理盐水、抑TM菌水、Cremophor (BASF，Parsippany，N.J.)或磷酸缓冲盐溶液(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的并且应该是一定程度容易注射能力存在的流体。其在制造和存储条件下必须是稳定的并且必须抗比如细菌和真菌的微生物的污染作用而保存。载体可以是溶剂或分散介质，其包含，例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇和类似物)，和其适当的混合物。可例如通过使用比如卵磷脂的包衣，通过在分散液的情况下保持需要的颗粒大小和通过使用表面活性剂保持适当的流动性。可通过各种抗菌剂和抗真菌剂，例如，对羟苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞和类似物实现预防微生物作用。在许多情况下，在组合物中优选包括等渗试剂，例如，糖、多元醇比如甘露醇、山梨糖醇、氯化钠。
通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如，单硬脂酸铝和明胶可实现可注射组合物的延长吸收。
通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如，单硬脂酸铝和明胶可实现可注射组合物的延长吸收。
[0216] 对于口服施用，药学组合物可采取例如通过常规手段用药学上可接受的赋形剂制备的片剂或胶囊的形式，所述药学上可接受的赋形剂比如粘合剂(例如，预胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如，乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如，马铃薯淀粉或羟乙酸钠淀粉)；
或湿润剂(例如，月桂基硫酸钠)。片剂可通过本领域熟知的方法包衣。口服施用的液体制剂可采取例如溶液、糖浆剂或悬液的形式，或它们可作为干燥产品提供，在使用前用水或其他适当的媒介构建(constitution)。这类液体制剂可通过常规的手段用药学上可接受的添加剂制备，所述药学上可接受的添加剂比如悬浮剂(例如，山梨糖醇糖浆剂、纤维素衍生物或氢化食用脂)；乳化剂(例如，卵磷脂或金合欢胶)；非水性媒介(例如，杏仁油、油性酯、乙醇或分馏的植物油)；和防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸)。制剂也可包含适当的缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。口服施用的制剂可被适当配制，以实现活性化合物的控释。对于含服施用，组合物可采取常规方式配制的片剂或糖锭形式。对于吸入施用，根据本发明使用的化合物使用适当的推进剂，例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他适当的气体，方便地以从加压包(pressurized pack)或雾化器的气溶胶喷雾显示(presentation)的形式递送。在加压气溶胶的情况下，可通过提供阀门递送计量的量确定剂量单位。可配制用于吸入器或吹入器的例如明胶的胶囊和药筒，其包含该化合物与适当的粉末基质(power base)比如乳糖或淀粉的粉末混合物。该化合物可配制用于通过注射例如通过推注或连续灌注而进行胃肠外给药。注射用制剂可以与添加的防腐剂一起以单位剂型的形式存在，例如存在于安瓿或多剂量容器中。该组合物可采取诸如油性或水性媒介中悬液、溶液或乳剂的形式，且可包含调制剂(formulatory agent)如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。可选地，活性成分可为粉末形式，用于在使用前使用恰当的媒介例如无菌无热原水构建。化合物也可配制在直肠组合物，比如栓剂或保留灌肠剂中，例如，包含常规的栓剂基质，比如可可脂或其他甘油酯。除了之前描述的制剂之外，化合物也可配制为长效(depot)制剂。这种长时间作用的制剂可通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射施用。因此，例如，化合物可用适当的聚合物或疏水材料(例如，作为可接受油中的乳剂)或离子交换树脂进行配制，或配制为微溶性衍生物，例如，配制为微溶性盐。
或湿润剂(例如，月桂基硫酸钠)。片剂可通过本领域熟知的方法包衣。口服施用的液体制剂可采取例如溶液、糖浆剂或悬液的形式，或它们可作为干燥产品提供，在使用前用水或其他适当的媒介构建(constitution)。这类液体制剂可通过常规的手段用药学上可接受的添加剂制备，所述药学上可接受的添加剂比如悬浮剂(例如，山梨糖醇糖浆剂、纤维素衍生物或氢化食用脂)；乳化剂(例如，卵磷脂或金合欢胶)；非水性媒介(例如，杏仁油、油性酯、乙醇或分馏的植物油)；和防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸)。制剂也可包含适当的缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。口服施用的制剂可被适当配制，以实现活性化合物的控释。对于含服施用，组合物可采取常规方式配制的片剂或糖锭形式。对于吸入施用，根据本发明使用的化合物使用适当的推进剂，例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他适当的气体，方便地以从加压包(pressurized pack)或雾化器的气溶胶喷雾显示(presentation)的形式递送。在加压气溶胶的情况下，可通过提供阀门递送计量的量确定剂量单位。可配制用于吸入器或吹入器的例如明胶的胶囊和药筒，其包含该化合物与适当的粉末基质(power base)比如乳糖或淀粉的粉末混合物。该化合物可配制用于通过注射例如通过推注或连续灌注而进行胃肠外给药。注射用制剂可以与添加的防腐剂一起以单位剂型的形式存在，例如存在于安瓿或多剂量容器中。该组合物可采取诸如油性或水性媒介中悬液、溶液或乳剂的形式，且可包含调制剂(formulatory agent)如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。可选地，活性成分可为粉末形式，用于在使用前使用恰当的媒介例如无菌无热原水构建。化合物也可配制在直肠组合物，比如栓剂或保留灌肠剂中，例如，包含常规的栓剂基质，比如可可脂或其他甘油酯。除了之前描述的制剂之外，化合物也可配制为长效(depot)制剂。这种长时间作用的制剂可通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射施用。因此，例如，化合物可用适当的聚合物或疏水材料(例如，作为可接受油中的乳剂)或离子交换树脂进行配制，或配制为微溶性衍生物，例如，配制为微溶性盐。
[0217] 在一种实施方式中，用保护化合物免于从身体快速消除的载体，比如控释制剂——包括植入物和微胶囊化的递送系统，制备活性化合物。可使用生物可降解的、生物相容性聚合物，比如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚羟基乙酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这类制剂的方法对本领域技术人员而言是显而易见的。材料也可从Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals，Inc.商业上获得。脂质体悬液(包括用病毒抗原的单克隆抗体，靶向感染细胞的脂质体)也可用作药学上可接受的载体。这些可根据本领域技术人员已知的方法制备，例如，如美国专利号4,522,811中描述的。
[0218] 尤其有利地，以剂量单位形式配制口服或肠胃外组合物，易于施用和剂量的均一性。如本文所使用的剂量单位形式指物理上分散的单位，适合用作用于待治疗个体的单位剂量；每一个单位均包含经计算产生预期治疗效果的预定量的活性化合物，连同所需的药用载体。本发明剂量单位形式的规格由该活性化合物的独特性质和待实现的特定疗效以及本领域中固有的混合这类活性化合物用于个体治疗的限制所规定并直接依赖于这些因素。
[0219] 本发明的核酸分子可插入载体并且用作基因疗法载体。基因疗法载体可通过，例如静脉内注入、局部施用(见，例如，美国专利号5,328,470)或通过立体定向注入(见，例如，Chen，等，1994.Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：3054-3057)递送至对象。基因疗法载体的药学制剂可包括可接受的稀释剂中的基因疗法载体，或可包括其中包埋了基因递送媒介的缓释基质。可选地，在完全基因递送载体可从重组细胞完整生成的情况下，例如，逆转录病毒载体的情况下，药学制剂可包括一种或多种生成该基因递送系统的细胞。药学组合物可与施用说明书一起包括在容器、包或分配器中。
[0220] 鉴于本说明书和优选实施方式的实施例，本领域普通技术人员将理解本发明另外的目标和优势，并且明确包括在本发明的范围内。实施例
[0221] 肌肉特异性TRIM家族蛋白MG53的发现。使用之前建立的免疫-蛋白质组方法分2+
离MG53，所述方法允许鉴定参与肌形成、Ca 信号传导和保持横纹肌细胞中膜完整性的新蛋白。简单地，该方法使用包含～6500个克隆的单克隆抗体文库，其从用来自兔骨骼肌的富含三联体(triad)的膜免疫的小鼠生成。基于在免疫荧光显微镜下观察到的横纹肌切片的z-线染色模式，选择感兴趣的抗体。通过抗体-亲和柱纯化靶蛋白，并且获得纯化蛋白的部分氨基酸序列。基于该部分氨基酸序列，自骨骼肌cDNA文库分离编码靶基因的完整cDNA。然后使用同源基因筛选搜索鉴定的基因在其他可兴奋组织中不同同种型的存在。最后，产生转基因或敲除小鼠模型，以研究感兴趣基因的体内生理学功能。
离MG53，所述方法允许鉴定参与肌形成、Ca 信号传导和保持横纹肌细胞中膜完整性的新蛋白。简单地，该方法使用包含～6500个克隆的单克隆抗体文库，其从用来自兔骨骼肌的富含三联体(triad)的膜免疫的小鼠生成。基于在免疫荧光显微镜下观察到的横纹肌切片的z-线染色模式，选择感兴趣的抗体。通过抗体-亲和柱纯化靶蛋白，并且获得纯化蛋白的部分氨基酸序列。基于该部分氨基酸序列，自骨骼肌cDNA文库分离编码靶基因的完整cDNA。然后使用同源基因筛选搜索鉴定的基因在其他可兴奋组织中不同同种型的存在。最后，产生转基因或敲除小鼠模型，以研究感兴趣基因的体内生理学功能。
[0222] 筛选该免疫-蛋白质组文库的肌肉特异性蛋白质导致特别地利用横纹肌组织鉴定由mAb5259识别的分子大小为53千道尔顿(kDa)的抗原(图3B)。通过mAb5259免疫亲和柱从兔骨骼肌部分纯化蛋白质“MG53”，并且进行氨基酸测序。骨骼肌cDNA文库筛选和基因组数据库搜索鉴定MG53的预测的氨基酸序列和人16p11.2基因座上相应的mg53基因。mg53mRNA的RNA印迹确认骨骼肌和心肌的特异性表达(图3C)。结构域同源性分析揭示MG53包含原型三联基序，其包括环(Ring)、B-盒和卷曲螺旋(RBCC)部分，以及在羧基末端的SPRY结构域(图1、2和3A)。SPRY结构域是保守的序列，其首先在可兴奋细胞肌质网2+
的鱼尼丁(ryanodine)受体Ca 释放通道中观察到。迄今为止在各种哺乳动物基因组中鉴定的约60个TRIM家族成员中，15个成员在RBCC结构域之后携带类似的SPRY结构域，并且MG53显示与这些TRIM亚家族蛋白保守的一级结构。
的鱼尼丁(ryanodine)受体Ca 释放通道中观察到。迄今为止在各种哺乳动物基因组中鉴定的约60个TRIM家族成员中，15个成员在RBCC结构域之后携带类似的SPRY结构域，并且MG53显示与这些TRIM亚家族蛋白保守的一级结构。
[0223] MG53介导肌细胞中的小泡运输。尽管在其一级结构中没有跨膜区段或脂质-修饰基序，但是MG53好像主要限于骨骼肌中的膜结构。免疫组织化学分析揭示肌纤维膜和细胞内小泡中MG53的特异性标记(图3D)。MG53是包含TRIM和SPRY基序的肌肉特异性蛋白。在之前的研究中，我们已经建立了靶向与骨骼肌中三联体连接(junction)相关的蛋白的单克隆抗体(mAb)文库。肌肉特异性蛋白的该免疫-蛋白质组文库筛选导致鉴定分子大小为53千道尔顿(kDa)的名为MG53的抗原，其被mAb5259认识。通过缀合mAb5259的免疫亲和柱从兔骨骼肌部分纯化MG53，并且进行氨基酸测序。基于获得的部分氨基酸序列，从兔和小鼠骨骼肌文库分离编码MG53的cDNA。基因组文库搜索鉴定人16p11.2基因座上相应的MG53基因。数个物种中MG53的预测氨基酸序列显示在图1中。
[0224] 结构域同源性分析揭示MG53包含RBCC的原型TRIM签名序列加上羧基末端的SPRY结构域，并且因此属于TRIM/RBCC家族(图1)。迄今为止在哺乳动物基因组中鉴定的约60个TRIM家族成员中，15个成员在RBCC结构域之后携带类似的SPRY结构域，并且MG53显示与这些TRIM亚家族蛋白保守的一级结构(图2)。但是，令人吃惊地和意料不到地，我们的研究指出MG53是图2中那些的唯一表明膜修复功能的TRIM家族蛋白。
[0225] 蛋白质印迹试验确认小鼠组织中MG53的肌肉特异性表达(图3B)。尽管在该一级结构中没有跨膜区段或脂质-修饰基序，但是MG53好像主要限于骨骼肌中的膜结构。用mAb5259的免疫组织化学分析显示骨骼肌纤维横截面中肌纤维膜和TT膜中MG53的特异性标记(图3C)。而且，横截面揭示肌纤维膜附近MG53的局部化浓度，比肌纤维膜完整的膜蛋白通常观察到的具有更宽的染色模式。因此，MG53是肌肉特异性TRIM家族蛋白，其展示TRIM家族蛋白独特的亚细胞分布模式。
[0226] MG53的表达对于保持正常心脏膜完整性是必需的。mg53-/-小鼠中的缺陷不限于骨骼肌纤维。注入伊凡斯蓝染料期间，～50%的mg53-/-小鼠将在注入的16小时内死亡，与之相比，注入的野生型动物没有死亡。mg53-/-心脏的尸检揭示心肌纤维用伊凡斯蓝广泛标记，甚至在没有运动应激的情况下(图4)。我们也发现运动将大大加深mg53-/-心脏中伊凡斯蓝染色的程度。
[0227] MG53的损失增加心脏缺血/再灌注损伤的易感性(图5)。从野生型(WT)和mg53-/-(mg53KO)小鼠分离心脏并且在Langendorff仪器上灌注。通过停止灌注液流诱导全心缺血30分钟。通过用于(a)肌酸激酶(CK)或(b)乳酸脱氢酶(LDH)的酶检测法测量恢复灌注液流(时间0)之后心脏中产生的损伤。来自mg53-/-小鼠的心脏(虚线)显示比WT(实线)更多的损伤。对于每个列举的时间点，数据表示为均值±S.D.。
[0228] 因为窖蛋白-3被发育调节(图6A)并且可与MG53相互作用(图6B)，我们检测C2C12成肌细胞中MG53-诱导的filapodia样结构是否可受窖蛋白-3过表达的影响。如图6D中显示，任一C2C12成肌细胞中窖蛋白-3和MG53的同时过表达导致明显抑制与GFP-MG53过表达相关的filapodia样结构的出现。平均上，用窖蛋白-3和GFP-MG53(以约
10:1的比例)转染的C2C12成肌细胞分别展示filapodia样结构出现减少82±6%(图6E和F)。这些结果提示窖蛋白-3代表MG53-介导的膜融合事件的一种分子调节剂。
10:1的比例)转染的C2C12成肌细胞分别展示filapodia样结构出现减少82±6%(图6E和F)。这些结果提示窖蛋白-3代表MG53-介导的膜融合事件的一种分子调节剂。
[0229] 为进一步研究窖蛋白-3在MG53的亚细胞分布和filapodia样结构形成中的作用，构建窖蛋白-3shRNA质粒(表1)，其包括独立的红色荧光蛋白表达盒，以为shRNA转染细胞提供标记物。图7A中显示的蛋白质印迹分析揭示shRNA-cav3探针高效抑制窖蛋白-3cDNA瞬时转染的CHO细胞中的窖蛋白-3表达，而不影响窖蛋白-1的表达。
[0230] 表1.构建MG53和窖蛋白-3的shRNA的低核苷酸(oligo)。
[0231]
[0232] 尽管用非特异性shRNA转染的C2C12成肌细胞展示正常的分化模式，如图7B的左图中大量的红色-荧光标记的肌管所显示的，但是窖蛋白-3的急性抑制可显著抑制C2C12成肌细胞分化成肌管(图7B，右图)。平均上，小于约10%的红色荧光标记的shRNA-cav3转染的成肌细胞可在施加分化培养基后第6天分化成成熟的肌管(图7C)。该结果与之前其他研究人员的研究一致，其显示窖蛋白-3的表达对于C2C12肌管的分化是必需的。
[0233] 共焦显微成像显示shRNA-cav3转染至C2C12成肌细胞好像不影响在这些细胞中表达的GFP-MG53的亚细胞分布(图7D)。尤其地，GFP-MG53和filapodia样膜结构的囊状分布的不同模式仍不受shRNA-cav3或非特异性shRNA瞬时转染的影响。该结果与C2C12细胞的成肌细胞阶段中缺乏窖蛋白-3的表达一致。
[0234] MG53的表达对于维持正常心脏膜完整性是必需的。mg53-/-小鼠中的缺陷不限于骨骼肌纤维。注入伊凡斯蓝染料期间，～50%的mg53-/-小鼠将在注入的16小时内死亡，与之相比，注入的野生型动物没有死亡。mg53-/-心脏的尸检揭示心肌纤维用伊凡斯蓝广泛地标记，甚至在没有运动应激的情况下(图8)。我们也发现运动将大大加深mg53-/-心脏中伊凡斯蓝染色的程度。
[0235] 重组人TAT-MG53可穿透不同来源的细胞。为了MG53起作用，其必须细胞内存在。为了表明重组MG53可以以治疗显著量跨细胞膜易位，用约4或8μg/mL重组人TAT-MG53在约37℃下温育HL-1心肌细胞和3T3成纤维细胞约15分钟(图9)。在缓冲盐溶液中冲洗细胞3次和接着裂解用于蛋白质印迹分析。蛋白质印迹显示对照细胞(对照)不包含内源性MG53，但是，用TAT-MG53温育的那些包含大量的细胞内TAT-MG53。注意到，由于添加TAT细胞穿透(通透)肽至蛋白质，从骨骼肌提取物(肌肉)中观察，TAT-MG53稍多于MG53。通过TAT-MG53融合蛋白的细胞内处理可产生多条带。所以，在MG53多肽治疗剂的优选实施方式中，本发明包括重组多肽，其包括TAT多肽部分和MG53多肽部分，其中TAT和MG53多肽部分在单个连续的多肽链中存在。
[0236] 重组MG53蛋白治疗心脏的缺血再灌注损伤
[0237] 由冠状动脉粥样硬化引起的缺血性心脏病仍然作为西方国家中死亡率的单个最大原因。由于动脉粥样硬化或心脏外科手术，心脏血液流动的阻塞导致急性心肌梗死，其造成两种类型的心肌损伤，包括初始血流损失引起的缺血性损伤，和氧合血流的恢复引起的再灌注损伤。尽管通过将代谢转变为无氧酵解，心肌可耐受短暂暴露于局部缺血，但是持续的局部缺血产生不可逆的心肌损伤，导致严重的肌细胞死亡和收缩性的永久性损失。尽管已经假设有缺陷的细胞膜修复可能促进包括心力衰竭在内的许多类型的人类疾病，但是靶向预防心肌细胞中膜损伤的蛋白治疗剂的尝试有限。
[0238] 我们最近发现肌肉特异性的TRIM-家族蛋白MG53是横纹肌中急性膜修复机制的必要组分。MG53用作氧化的传感器以成核募集细胞内小泡至损伤位点用于膜补片形成。我们发现MG53可与dysferlin相互作用以利于其膜修复功能，并且可通过与窖蛋白-3的功能相互作用调节MG53的膜运输功能。我们的数据指示由MG53、dysferlin和窖蛋白-3形成的分子复合物对于膜损伤的修复是必需的，因此，提供治疗肌肉和心血管疾病的治疗性靶。
[0239] 进一步研究显示重组MG53蛋白甚至当施加至围绕靶细胞的外部空间时可保护避免膜损伤。这些发现可转化成治疗心肌缺血/再灌注(I/R)损伤的显著翻译方法(translational approach)。在开发MG53作为人疾病治疗性介入的尝试中，我们发现建立该重组MG53可用作治疗心脏中I/R损伤的治疗剂：
[0240] (i)我们发现肌细胞的细胞膜的急性损伤导致信号暴露至细胞外空间，其可被MG53探测，使得重组MG53当提供在细胞外空间中时修复膜损伤(图10)；(ii)我们已广泛研究显示从大肠杆菌纯化的重组MG53保持有效的膜修复功能，这支持靶向心脏损伤和其他人疾病中MG53的治疗价值；(iii)指示当无论在再灌注损伤开始之前(图11)或之后(图12、13)施加时，静脉内递送重组MG53可保护心脏避免IR损伤的数据；(iv)确定重组MG53在小鼠血清中药物代谢动力学(PK)的性质。我们发现MG53在尾静脉注射之后在血清中保持～4hrs(图14)。这些结果使得重组MG53用作心脏中I/R损伤的疗法，因为短期治疗窗口是该应用中必要的；(v)因为大部分蛋白治疗剂在用蛋白治疗的患者中产生一些免疫原应答。所以，我们测试重组MG53的施加是否导致大鼠中产生抗体和产生的任何抗体是否可阻碍重组MG53的功能(图15)。气管间(Intertracheal)施加MG53在处理的大鼠中产生抗体，但是这些抗体的纯化片段不阻碍MG53的膜修复能力；(vi)为有效使用重组MG53作为心脏I/R损伤的疗法，必须去除蛋白分离使用的免疫亲和标签，并且蛋白必须保持活性。未加标签的重组MG53蛋白是稳定的并且在预防肌细胞膜损伤方面是有效的(图16)。我们继续的开发尝试的部分朝向使用重组MG53蛋白治疗对横纹肌组织的损伤，通过从大肠杆菌中表达的蛋白质(MBP-MG53)移出麦芽糖结合蛋白(MBP)免疫亲和标签，我们已经生产了大量的未加标签的MG53(MG53)；和(vii)确定rhMG53在心脏保护中的体内治疗性功效。
[0241] 体内结果。
[0242] 参考图17-24。心肌缺血/再灌注(I/R)损伤的猪(pig)模型是用于检测治疗尝试对心肌梗死(MI)——也称为心脏病发作——的效果(impact)的黄金标准模型(图17)。这是由于猪模型和人之间心脏结构和功能的类似性。在这些实验中，经导管插入术插入血管成形术球囊，并且球囊膨胀以在冠状循环中建立阻塞。由于阻碍氧合血液流动至组织，该阻塞将制造部分的心脏缺血。这种阻塞建立初始的缺血性损伤，其中一些心脏细胞死亡，但是一旦移出球囊并且血流恢复至心脏，产生大部分的损伤。快速的再充氧导致对心脏的另外的I/R损伤和心脏细胞的死亡。该损伤可在局部缺血后24小时心脏的大体形态中观察到(图17，左)，并且心脏的切片(图17，右)显示大面积的死心肌(显示白色的区域)，而剩余的健康心肌具有棕色外观。
[0243] 为了测试重组人MG53蛋白(rhMG53)当在诱导局部缺血之前施加时预防与MI相关的损伤的效力，我们使用猪球囊血管成形术模型。在这些实验中(图18)，rhMG53静脉内注入猪，然后血管成形术球囊膨胀以在心脏中建立局部缺血。用rhMG53的该治疗可减少对心脏的损伤，这提示rhMG53可预防一些部分的与MI相关的初始缺血性损伤以及一些在再灌注之后出现的I/R损伤。该心脏保护可在局部缺血后24小时在心脏的大体形态中(图18，左)，以及心脏的切片(图18，右)中观察到，其中与对照猪相比有减少面积的死心肌(显示白色的区域)。
[0244] 针对MI损伤的有效治疗剂必须在初始缺血性事件临床上相关之后施加。因此，测试当在诱导局部缺血之后施加rhMG53是否可具有效力是重要的。为测试当就在恢复血流之前(即再灌注之前)施加时rhMG53预防与MI相关的损伤的效力，我们使用猪球囊血管成形术模型(图19)。在这些实验中，就在血管成形术球囊移出以允许心脏再灌注之前，将rhMG53静脉内注入猪。用rhMG53的该治疗可减少对心脏的损伤，这提示rhMG53可预防再灌注之后心脏中出现的一些部分的I/R损伤。该心脏保护可在局部缺血后24小时的心脏的大体形态(图19，左)中，以及心脏的切片(图19，右)中观察到，其中与对照猪相比有减少面积的死心肌(显示白色的区域)。
[0245] 尽管紧接着再灌注施加rhMG53在MI期间具有保护作用，但是如果它可在再灌注之后的延长时间窗内施加，蛋白质将是更有用的治疗剂。所以，测试猪球囊血管成形术模型中当恢复血流(即再灌注后)后30分钟施加时，rhMG53预防与MI相关的损伤的效力(图20)。对于这些研究，血管成形术球囊移出后30分钟，将rhMG53静脉内注入猪。再灌注后施加rhMG53可减少对心脏的损伤，这提示rhMG53可预防再灌注之后心脏中出现的一些部分的I/R损伤——甚至当自冠状血管移出阻塞后30分钟施加时。该心脏保护可在局部缺血后24小时的心脏的大体形态(图20，左)中，以及心脏的切片(图20，右)中观察到，其中与对照猪相比有减少面积的死心肌(显示白色的区域)。
[0246] 猪中诱导实验MI之后24小时，移出心脏并且切割成切片，以允许根据方案评估发展损伤的心脏的总面积。这些切片的染色允许测定其中大部分心肌由于心肌梗死的损伤已经死亡的面积(图21)。该面积可从照片图像确定并且然后除以分析切片的总的表面积。该“梗死面积的百分数”确定心脏损伤的程度。与注入盐水代替rhMG53的对照动物相比(对照，n=6)，诱导局部缺血之前(前，n=5)，就在恢复血流之后(后1min，n=5)和再灌注之后30分钟(后30min，n=5)静脉内施加rhMG53都可大大地减少猪心脏中的梗死尺寸。
[0247] 心脏肌钙蛋白是广泛使用的血液生物标记物，其表明MI已经出现在人患者中和可提供MI程度的一些指数。血清肌钙蛋白I水平用作rhMG53对猪中MI的保护作用的指示物(图22)。通过局部缺血之前(前-处理)或再灌注之后(后30mins)，静脉内注入递送rhMG53。蛋白质印迹分析显示MG53的治疗减少心脏特异性肌钙蛋白I释放至血液循环。这指示rhMG53可预防猪中与MI相关的损伤。
[0248] 数个模型系统中心脏保护的一个重要方面是激活Akt-依赖性信号传导轴中的存活蛋白激酶。为测试rhMG53是否可具有调节Akt途径的作用，在rhMG53和诱导MI(梗死)之后收集猪心脏组织，然后通过蛋白质印迹分析Akt激活/磷酸化(图23)。缺血/再灌注损伤之后24小时，从心脏的三个位置收集组织。收集样品并且通过与梗死形成位置的距离标记，“远”意思是远离梗死形成位置，“近”意思是靠近梗死形成位置，“梗死”意思是来自梗死形成区域。IV递送rhMG53至细胞外空间可导致激活细胞内存活蛋白激酶途径(如由Akt表示)。这可通过旁分泌或内分泌机制实现，其中rhMG53(或天然MG53)可作用在心肌细胞肌纤维膜上的受体，以活化细胞内信号传导级联(一种或多种)。rhMG53在恢复膜完整性和活化存活蛋白信号传导途径(一种或多种)作用的组合可有助于MI之后rhMG53的心脏保护作用。
[0249] 由于心肌细胞细胞)的死亡，具有MI的患者将通常损伤一些部分的心肌质量，其造成减少的心脏输出，最终导致心力衰竭。损失的心肌细胞最终被纤维疤痕形成所替代，其通常通过心脏心室壁的变薄实现。为测试rhMG53是否可预防心脏的重塑和纤维疤痕的形成，允许猪在球囊血管成形术诱导的MI之后在不同时间点注入rhMG53恢复4周(图24)。MI后4周，来自对照(盐水注入的)动物的3个不同猪心脏的代表性图像(图24，左)显示明显的白色纤维疤痕和心室壁变薄(箭头)。就在恢复血流之前(即再灌注之前)，rhMG53静脉内注入的3个猪在MI后4周显示减少的疤痕形成并且没有心肌的变薄(箭头)(图
24，中间)。当其在血流恢复后(即再灌注之后)5分钟IV注入并且然后在MI后4周收集心脏，rhMG53的心脏保护作用也是明显的(图24，右)。数据显示rhMG53可提供MI后心脏的结构改善，其可预期降低处理动物的心力衰竭的严重性。
24，中间)。当其在血流恢复后(即再灌注之后)5分钟IV注入并且然后在MI后4周收集心脏，rhMG53的心脏保护作用也是明显的(图24，右)。数据显示rhMG53可提供MI后心脏的结构改善，其可预期降低处理动物的心力衰竭的严重性。
[0250] 实验数据表明，令人吃惊地和意料不到地，外部(或全身性)施加的MG53提供对心肌细胞损伤的保护作用，并且MG53保护缺血-再灌注诱导对分离的心脏的损伤。比如，MG53具有治疗性潜能，用于治疗和/或预防心脏损伤，包括，例如，心脏损伤、梗死、心力衰竭和缺血性再灌注损伤。
[0251] 在某些方面中，本说明书提供组合物在治疗和/或预防心脏损伤的方法中的用途，所述组合物包括药学上可接受的赋形剂和有效量的MG53或调节心脏细胞中MG53活性、其量或组合的至少一种的试剂，所述方法包括向需要其的对象施用所述组合物，其中组合物有效治疗和/或预防心脏损伤。在某些实施方式中，试剂是下述至少一种：MG53多肽；MG53受体多肽；编码MG53多肽的核酸；编码MG53受体多肽的核酸；对编码MG53或MG53受体的核酸特异性的抑制或反义RNA。在另外的实施方式中，有效量是从0.1mg/kg至1000mg/kg体重/天。在某些另外的实施方式中，MG53活性的激动剂包括下述至少一种：磷脂酰丝氨酸、锌或锌盐、Zn-1-羟基吡啶-2-硫酮(Zn-HPT)、三七、氧化剂、硫柳汞或其组合。在其他实施方式中，试剂是能够分化成心肌细胞的干细胞，其中干细胞已经被修饰从而其展示增强的MG53的活性或表达。在某些实施方式中，心脏损伤包括由于下述至少一种引起的心脏细胞或心肌组织损伤：心血管疾病、心脏缺血/再灌注损伤、低氧损伤、心力衰竭或其组合。在仍另外的实施方式中，心脏损伤包括由于心脏缺血/再灌注损伤引起的心脏细胞或心肌组织损伤。在其他实施方式中，多肽具有下述至少之一的氨基酸序列：SEQ ID NOs.：1、
3、5、9、10、11、12、13、14、15或16或其生物活性部分。在其他实施方式中，组合物结合药学上可接受的赋形剂细胞外或全身性施用，其中组合物有效治疗或预防心脏组织的损伤。
3、5、9、10、11、12、13、14、15或16或其生物活性部分。在其他实施方式中，组合物结合药学上可接受的赋形剂细胞外或全身性施用，其中组合物有效治疗或预防心脏组织的损伤。
[0252] 在另外的方面中，本说明书提供组合物在治疗和/或预防心脏缺血/再灌注损伤方法中的用途，所述组合物包括有效量的MG53多肽或MG53核酸和药学上可接受的赋形剂，所述方法包括向需要其的对象施用包括有效量的MG53多肽或MG53核酸的组合物，其中所述组合物有效治疗心脏缺血/再灌注损伤。在某些实施方式中，有效量是从0.1mg/kg至1000mg/kg体重/天。在另外的实施方式中，治疗性组合物进一步包括MG53活性的激动剂。
在仍另外的实施方式中，激动剂是下述至少一种：磷脂酰丝氨酸、锌或锌盐、Zn-1-羟基吡啶-2-硫酮(Zn-HPT)、三七、氧化剂、硫柳汞或其组合。
在仍另外的实施方式中，激动剂是下述至少一种：磷脂酰丝氨酸、锌或锌盐、Zn-1-羟基吡啶-2-硫酮(Zn-HPT)、三七、氧化剂、硫柳汞或其组合。
[0253] 在另一方面中，本发明书提供筛选可用于治疗心脏缺血/再灌注损伤的化合物的方法，其包括下述步骤：提供表达编码与MG53多肽具有至少70%同源性的氨基酸序列的多肽的核酸的心肌细胞或心脏细胞；提供测试化合物库；用测试化合物处理细胞；诱导对心脏细胞膜的缺血/再灌注损伤；测量MG53、活性或量的变化和细胞修复对膜损伤的能力；和比较处理的细胞和未处理的细胞，其中能够调节MG53表达、活性或量的试剂指示可用于治疗心脏缺血/再灌注损伤的试剂。
[0254] 这里呈现的数据显示支持本发明的直接原理验证数据(proof-of-principal data)：重组人MG53蛋白可用于保护免于心脏的缺血-再灌注损伤。
[0255] 示例性方法
[0256] 如本领域技术人员理解的，某些量、数量和测量值的精确性遭受理论上和/或实践上的限制，其是一些工具和/或方法中固有的。所以，除非另外指出，考虑要求保护的量包括合理量的变化。
[0257] MG53的鉴定和克隆-之前描述了兔骨骼肌微粒体蛋白的mAb文库的制备和筛选。如之前描述(21)，进行mAb5259(IgG1亚类)的制备和免疫亲和纯化。纯化的MG53进行氨基酸序列分析和所有测定的序列编码在兔MG53cDNA中(数据未显示)。使用兔部分氨基酸序列，数据库中的同源性搜索发现小鼠和人MG53。从小鼠基因组DNA扩增小鼠MG53基因的
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外显子区域，使用 P标记的外显子片段筛选兔和小鼠骨骼肌文库以产生全长cDNA。
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外显子区域，使用 P标记的外显子片段筛选兔和小鼠骨骼肌文库以产生全长cDNA。
[0258] 免疫组织化学和免疫染色分析-如之前描述进行使用mAb5259的免疫化学分析。如之前描述进行使用缀合有15nm金颗粒的二抗的免疫电子-显微术。
[0259] 细胞培养–用于所有研究的C2C12小鼠成肌细胞细胞系购买自American Type Culture Collection(Manassas，VA)。细胞在潮湿环境、37℃和5%CO2下，在C2C12的DMEM培养基中，或补充10%胎牛血清、100单位/ml青霉素和100ug/ml链霉素的CHO细胞的Ham’s F12培养基中生长。为了诱导肌管分化，使C2C12成肌细胞生长至汇合，并且培养基转变成包含2%马血清、青霉素(100U/ml)、链霉素(100μg/ml)的DMEM。对于瞬时转染，C2C12成肌细胞或CHO细胞以70%汇合在玻璃底器皿中铺板。24小时后，使用GeneJammer反应物(Stratagene)，用上面描述的质粒转染细胞。通过活细胞共焦成像在转染后24-48小时或在单独实验指示的时间可视化细胞。在一些实验中，允许C2C12成肌细胞在可视化之前指定的时间分化成肌管。
[0260] 质粒构建–使用补充表1中描述的引物，通过PCR，产生全长小鼠MG53cDNA和相关的截短突变体。为了构建pCMS-MG53，通过适当的限制性内切酶消化之后，PCR-扩增的cDNA在Nhe I/Xba I位点插入pCMS-EGFP载体(Invitrogen)。为了构建GFP-MG53、GFP-TRIM、GFP-SPRY、MG53-GFP、TRIM-GFP和SPRY-GFP，PCR产物在XhoI/XbaI位点插入pEGFP-C1，或在XhoI/KpnI位点插入pEGFP-N1。
[0261] 活细胞成像–为了监测GFP-MG53的细胞内运输，在玻璃底器皿(Bioptechs Inc.)中培养CHO或C2C12细胞，并且用上面描述的质粒转染。使用63X1.3NA油浸物镜的BioRad2100Radiance激光扫描共焦显微镜，以3.18s/帧拍摄荧光图像(512x512)。
[0262] RNAi试验-小鼠MG53cDNA中MG53的shRNA敲除的靶序列在位置622-642(GAG CTG TCA AGC CTG AAC TCT)。对于窖蛋白-3，靶序列在位置363-380(GAC ATT CAC TGC AAG GAG ATA)。合成互补的有义和反义寡核苷酸。为了构建MG53shRNA和对照质粒，退火的寡核苷酸在Acc65I/Hind III限制性内切酶位点插入psiRNA-hH1GFPzeo G2(InvivoGene)。对于窖蛋白-3shRNA和对照质粒，退火的寡核苷酸在EcoR I/BamH I限制性酶切位点插入pRNAiDsRed载体(BD Biosciences)。每个载体具有独立的荧光蛋白表达盒(绿色或红色)，以用作细胞转染的标记物。通过用侧翼引物的直接测序确认所有的质粒，并且通过蛋白质印迹分析检查MG53和窖蛋白-3蛋白表达的下调。
[0263] 蛋白质印迹和共免疫沉淀-免疫印迹使用标准技术。简单地，收获C2C12或CHO细胞并且用冰冷的改良的RIPA缓冲液(150mM NaCl、5mM EDTA、1%NP40、20mMTris-HCl、pH7.5)在蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)存在的情况下裂解。在4-12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离20μg的总蛋白。标准方案用于MG53和相互作用蛋白，例如窖蛋白-3的共免疫沉淀研究。
简单地，骨骼肌组织或C2C12肌管在0.5ml改良的RIPA缓冲液中裂解。全细胞溶胞产物(500μg)用5μg多克隆抗MG53(多克隆抗体)或抗窖蛋白-3抗体(mAb)温育过夜。作为阴性对照，500μg全细胞溶胞产物用5μg正常兔和小鼠IgG温育，并且如上述处理。通过温育2小时并且用RIPA缓冲液冲洗4次，在G蛋白-琼脂糖珠上收集免疫复合物。
简单地，骨骼肌组织或C2C12肌管在0.5ml改良的RIPA缓冲液中裂解。全细胞溶胞产物(500μg)用5μg多克隆抗MG53(多克隆抗体)或抗窖蛋白-3抗体(mAb)温育过夜。作为阴性对照，500μg全细胞溶胞产物用5μg正常兔和小鼠IgG温育，并且如上述处理。通过温育2小时并且用RIPA缓冲液冲洗4次，在G蛋白-琼脂糖珠上收集免疫复合物。
[0264] 动物-成年雄性Sprague-Dawley大鼠、MG53缺陷小鼠和野生型对照小鼠在Robert Wood Johnson Medical School，Piscataway，NJ USA或Peking University，Beijing，China的实验动物中心(AAALAC认证的实验动物设施)中照料和圈养。涉及实验动物的所有程序按照中国北京大学动物研究委员会批准的方案，来自在National Institute on Aging of the NIH，USA的动物设施，并且符合实验室动物照看和使用指导(NIH公开号86-23，修订1985)。
[0265] 大鼠体内心肌缺血/再灌注-称重200-250g的雄性Sprague-Dawley大鼠用戊巴比妥(40mg/kg，i.p.)麻醉，并且经在Harvard啮齿动物呼吸器的气管造口术通风。进行中线胸骨切开术，并且可逆的冠状动脉勒除器咬合器(snare occluder)围绕左前降冠状动脉布置。通过拉紧勒除器45min并且然后松开它12h(对于RNA提取)或24h(对于蛋白提取和梗死尺寸测量)进行心肌IR。通过4段(episode)10min局部缺血诱导IPC，随后5min再灌注然后45-min的局部缺血。再灌注后4h收集血液样品用于LDH测量。
[0266] 测量心肌梗死尺寸-为了测量梗死尺寸，分离的灌注心脏在-80℃下冷冻10min并且切成薄片，其接着在包含1%2,3,5-三苯基-四氯化唑的磷酸钠缓冲液中温育15min，以使未染色的梗死区域可视化。通过面积法用来自NIH的Image/J软件测定梗死和LV面积。梗死尺寸计算为梗死面积除以LV面积。为了体内测量大鼠心脏的梗死尺寸，在结束时，用戊巴比妥钠(50至100mg/kg i.p.以有效)麻醉动物并肝素化(400USP U/kg，i.p.)。切除心脏并且将导管插入升主动脉(乏氏窦的远端)，然后用阿辛蓝(Alcian blue)染料(0.05%溶液)逆向灌注以使风险面积(AAR)可视化。冠状动脉在用阿辛蓝溶液灌注之前在阻塞位点再堵塞。随后的程序与离体心脏的那些相同。梗死尺寸计算为梗死面积除以AAR。
[0267] 心脏的组织学-心脏固定在4%的多聚甲醛(pH7.4)中过夜，包埋在石蜡中，和连续切片成5-μm薄片。用这些薄片进行标准的苏木精和伊红染色或免疫荧光。
[0268] 通过LDH释放确定心肌损伤-对每个5min的再灌注，积聚来自分离的灌注的心脏的流出物。再灌注后4h从遭受IR的大鼠收集血液样品，并且以3000rpm离心血液样品10min获得血清。使用来自Sigma Chemical Co.的试剂盒分光光度学检测LDH。LDH活性表达为单位每升。
[0269] 细胞凋亡和细胞活力试验-如之前描述20，通过DNA梯形试验(DNA laddering21
assay)检测心肌细胞凋亡。另外，如之前描述 ，ATP试验用作细胞活力的独立测量。使用基于发光的商用试剂盒(Promega)和发光板阅读器，我们根据操作手册的指导分析细胞ATP水平。
assay)检测心肌细胞凋亡。另外，如之前描述 ，ATP试验用作细胞活力的独立测量。使用基于发光的商用试剂盒(Promega)和发光板阅读器，我们根据操作手册的指导分析细胞ATP水平。
[0270] 心肌切片的TUNEL染色-CardioTACSTM原位细胞凋亡探测试剂盒(#TA5353；R&DSystem Inc，Minneapolis，MN)用于评估心肌切片中的DNA片段。对于每个样品，染色两个载玻片。从每个载玻片上，使16个10×视野的观察数字化，用于分析。然后，对于每个图像，计数TUNEL-阳性核和全核，对每个载玻片进行计算(tallied)，并且对于每个样品求平均。在所有的测量中研究人员不知道动物的治疗。
[0271] 新生大鼠室肌细胞的分离、培养和腺病毒感染-通过之前描述的方法20，从1-天-龄Sprague-Dawley大鼠分离室肌细胞。在包含10%FBS的DMEM中培养48h，在无血清DMEM中静置24h后，进行腺病毒-介导的基因转移。之前描述了用表达GFP-MG53或GFP
7
的腺病毒载体感染细胞 。
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的腺病毒载体感染细胞 。
[0272] 对于低氧，在用腺病毒感染24h后，心肌细胞在RPMI1640/5%FBS中培养48h。接着，培养基换成95%N2/5%CO2饱和的无血清RPMI1640，并且细胞放置在37℃的95%N2/5%CO2饱和的密封箱中3-24h。O2浓度<0.1%(Ohmeda氧监测仪，5120型)。对于含氧量正常的对照，培养基换成RPMI1640/5%FCS/10%HS，并且细胞放置在37℃/5%CO2温育器中3-24h，然后分析。
[0273] 实时PCR–在结合SYBR Green的Bio-Rad iQ5多色实时PCR检测系统(Roche Applied Science，Mannheim，德国)上进行定量的实时PCR。下列引物对用于定量的实时PCR：18S RNA，5’-GGA AGG GCA CCA CCA GGA GT-3’(正向)和5’-TGC AGC CCC GGA CAT CTA AG-3’(反向)。MG53的引物是5'-CGAGCAGGACCGCACACTT-3'(正向)和5'-CCAGGAACATCCGCATCTT-3'(反向)。如下进行扩增：94℃，30s和30个循环的94℃，30s；
55℃，30s和72℃，30s。样品的发射强度上升高于基线的循环数称为Ct(阈值循环)，并且与靶浓度成比例。呈现的的数据是至少4个独立实验的平均数。
55℃，30s和72℃，30s。样品的发射强度上升高于基线的循环数称为Ct(阈值循环)，并且与靶浓度成比例。呈现的的数据是至少4个独立实验的平均数。
[0274] 通过RNA干扰的基因沉默—对于基因沉默试验，针对小鼠MG53或大鼠CaV3的独特区域，设计包括19bp颈区(stem)和4bp环结构的shRNA，并且亚克隆至pAd/BLOCK-iTTMDEST载体(Invitrogen)。MG53-shRNA的序列 是GAGCTGTCAAGCCTGAACTCT，而 CaV3shRNA 的 序 列 是 GACATTCACTGCAAGGAGATA。 错 义 -shRNA 的 序 列 是GCCTGCCGTCCAAAGTTGTAA。使用Stratagene Adeasy系统包装表达GFP-MG53融合蛋白的腺病毒。在HEK293细胞中使用pAd/BLOCK-iTTMDEST载体腺病毒RNAi表达系统，根据制造商的方案(Invitrogen)产生表达CaV3-shRNA或错义-shRNA的腺病毒。在腺病毒shRNA转染后72h，通过蛋白质印迹和功能研究评估基因敲减法的效率。
[0275] 材料–与磷酸化Akt、总Akt、磷酸化GSK3β、总GSK3和GAPDH反应的抗体来自Cell Signaling Technology。与β-肌动蛋白和β-微管蛋白反应的抗体来自Santa Cruz。与CaV3反应的抗体来自Abcam。与p85-PI3K反应的抗体来自Upstate。之前描述7
了MG53多克隆抗体 。除非另外指出，所有的化学品来自Sigma。
了MG53多克隆抗体 。除非另外指出，所有的化学品来自Sigma。
[0276] 统计学分析-数据表达为均值±s.e.m。统计比较使用单因素方差分析，随后用于多组比较的Bonferroni的程序。p<0.05认为是统计上显著的。
[0277] MG53-缺陷小鼠或wt小鼠中心脏形态和功能的心动电流图评估—我们首先在2个或3个分开的场所通过颈背提起小鼠并且将它们牢牢地以仰卧的姿势放置在掌心上，尾部牢固地夹在最后两个手指之间训练小鼠。左半胸被剃毛，并且使用配备有13MHz线性变换器(GE i13L)的Doppler心动电流图系统(GE vivid7)进行经胸超声心动描记术。心脏首先使用胸骨旁长轴和短轴视野的二维模型成像。短轴视野，包括乳头肌，用于使M-模型指针(cursor)与室间隔和LV后壁垂直。未记录训练阶段获得的图像。一旦小鼠被训练，图像以数字形式存储在磁性光盘上用于回顾和分析。在明显最大LV舒张维度时进行LV舒张末期直径(LVEDD)的测量，而在后壁的最前收缩偏移时进行LV收缩末期直径(LVESD)3 3 3
的测量。通过立方方法计算LVEF：LVEF(%)=(LVEDD)-(LVESD)/(LVEDD)，和LVFS通过FS(%)=(LVIDED-LVIDES)/LVIDED×100计算。数据是从5个心脏循环的平均。
的测量。通过立方方法计算LVEF：LVEF(%)=(LVEDD)-(LVESD)/(LVEDD)，和LVFS通过FS(%)=(LVIDED-LVIDES)/LVIDED×100计算。数据是从5个心脏循环的平均。
[0278] 应理解，仅仅为了图解的目的给出本文所述的详细实施例和实施方式，并且绝不考虑限制本发明。就此而言，各种修饰或变化将提示给本领域技术人员并且包括在该申请的精神和范围内并且认为在所附权利要求的范围内。例如，可改变成分的相对量以优化期望的作用，可添加另外的成分，和/或类似的成分可替换一种或多种描述的成分。与本发明的系统、方法和过程相关的另外的有利特征和功能将从所附的权利要求中显而易见。
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