一种观察植物叶部真菌病害组织病理学过程的染色方法
阅读：379发布：2020-05-13
专利汇可以提供一种观察植物叶部真菌病害组织病理学过程的染色方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种观察 植物 叶部 真菌 病害 组织病理学 过程的 染色 方法，所述方法包括下述步骤；1)样品 块 的制备：选择受到真菌病害的植物 叶片 作为处理材料，并制作成样品块；2)固定脱色：将样品块浸泡在固定脱色液中，固定脱色4～6h后，更换固定脱色液，固定脱色4～6h；3)透明染色：将固定脱色的样品块浸入透明染色剂中，40～60℃加 热处理 4～6h；4)制片观察。同其他的叶部病害的组织病理学观察方法相比，本发明染色方法简捷而且效果非常好，能够清楚地观察到致病真菌在叶片细胞内部形成的菌丝体，并获得该领域中高 质量 的观察结果。，下面是一种观察植物叶部真菌病害组织病理学过程的染色方法专利的具体信息内容。
1.一种观察植物叶部真菌病害组织病理学过程的染色方法，所述方法包括下述步骤；
1)样品块的制备：
选择被致病真菌入侵发病的植物叶片作为处理材料，并制作成样品块；
2)固定脱色：
将样品块浸泡在固定脱色液中，固定脱色4～6h后，更换固定脱色液，固定脱色4～6h；
3)透明染色：
将固定脱色的样品块浸入透明染色剂中，40～60℃加热处理4～6h；
4)制片观察。
2.根据权利要求1所述的一种观察植物叶部真菌病害组织病理学过程的染色方法，其特征在于，所述真菌病害为包括杨树黑斑病、杨树炭疽病、月季黑斑病、牡丹白粉病或炫富草叶斑病在内的植物叶部病害。
3.根据权利要求1所述的一种观察植物叶部真菌病害组织病理学过程的染色方法，其特征在于，所述固定脱色液为100％三氯乙酸溶液/乙醇/氯仿＝3/150/50的混合溶液或乙醇。
4.根据权利要求1所述的一种观察植物叶部真菌病害组织病理学过程的染色方法，其特征在于，所述透明染色剂采用包括以下步骤的方法配制：
将水合氯醛溶液与染色液以6/1～4/1的比例混合均匀。
5.根据权利要求4所述的一种观察植物叶部真菌病害组织病理学过程的染色方法，其特征在于，所述水合氯醛溶液采用包括以下步骤的方法配制：20g水合氯醛加4～5ml甘油和
5～6ml水，充分溶解后，保存在玻璃广口瓶中。
6.根据权利要求4所述的一种观察植物叶部真菌病害组织病理学过程的染色方法，其特征在于，所述染色液为乳酸酚棉蓝染色液或苯胺蓝染色液。
7.根据权利要求1所述的一种观察植物叶部真菌病害组织病理学过程的染色方法，其特征在于，在制片观察时，使用甘油或者透明染色剂作为浮载剂，进行观察拍照。
一种观察植物叶部真菌病害组织病理学过程的染色方法
技术领域
[0001] 本发明涉及植物显微技术领域，具体是一种观察植物叶部真菌病害组织病理学过程的染色方法
背景技术
[0002] 植物的叶部真菌病害对植物的健康和美观损害极大，往往造成植物提早落叶，甚至导致植物的死亡，对国家的农林经济造成非常严重的影响。
[0003] 杨树是我国的主要种植树种，在全国各个地区都有一定的分布。杨树黑斑病是杨树的一种重要病害，该病发生范围广泛，几乎所有栽培杨树的地方都有分布。该病害一般在六月底前后发生，造成受害杨树提早落叶，光合速率明显下降，严重影响了其木材品质和生长量，特别是在一些林分简单的苗圃，发病特别严重，甚至能够造成杨树幼苗的死亡。该病害由子囊菌杨盘二孢(Marssonina brunnea)引起，该真菌能够侵入寄主杨树的叶片造成病害，该病原真菌在生活史后期能产生大量的分生孢子，扩张非常快。在杨树的抗病基因和育种的研究中，为测验品种的抗病性等，也经常将杨树黑斑病作为研究对象。此外，在林业病原菌和寄主互作的领域，杨树黑斑病的研究价值很高。然而，尽管杨树黑斑病在杨树的病害研究中占有重要的地位，但是有关该病害的组织病理学还不清楚，这就严重地阻碍了其致病机理的研究工作，制约着有关杨树黑斑病其他研究的开展，包括分子植物病理学。本发明为包括杨树黑斑病在内的植物叶部病害组织病理学的研究直接提供了行之有效的可靠方法，为解决病理学中的关键内容提供技术支持。
[0004] 对于叶部真菌病害的组织病理学入侵过程的研究，传统的研究方法有很多，包括透明胶带粘贴、漂白观察和组织整体透明等方法。但是，这些方法在杨树叶片真菌病害研究中，有一定的局限性，在杨树黑斑病的研究过程中，通过传统方法只能获得一些寄主表面的病原菌结构，不能够清晰地展现植物组织内部的真菌结构特征并对其进行染色，无法完成预期结果，没能解决实际科研问题。本发明能够很好地弥补这些不足，在技术层面解决科研难题。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一种观察植物叶部真菌病害组织病理学过程的染色方法，通过本发明中所述的染色方法能够清楚地观察到叶片内部的真菌结构，成功地解决了技术问题。并且，在杨树的其他叶部病害以及其他的植物的叶部病害中也有很好的通用性。此外，本发明的染色过程快捷方便，效果质量好，能够为相关科学研究提供技术支持。
[0006] 为达到上述目的，本发明的技术方案是：
[0007] 一种观察植物叶部真菌病害组织病理学过程的染色方法，所述方法包括下述步骤；
[0008] 1)样品块的制备：
[0009] 选择被致病真菌入侵发病的植物叶片作为处理材料，并制作成样品块；
[0010] 2)固定脱色：
[0011] 将样品块浸泡在固定脱色液中，固定脱色4～6h后，更换固定脱色液，固定脱色4～6h；
[0012] 3)透明染色：
[0014] 4)制片观察。
[0015] 本发明中样品块的制作采用75％的酒精消毒的刀片或者手术刀，将处理材料切成1cm×1cm左右的小块样品。
[0017] 本发明中，所述透明染色剂采用包括以下步骤的方法配制：
[0019] 优选地，所述水合氯醛溶液采用包括以下步骤的方法配制：20g水合氯醛加4～5ml甘油和5～6ml水，充分溶解后，保存在玻璃广口瓶中。
[0020] 优选地，所述染色液为乳酸酚棉蓝染色液或苯胺蓝染色液。
[0021] 本发明，在制片观察时，将处理好的样品压片，片子不要有气泡，使用甘油或者透明染色剂作为浮载剂，在普通光学显微镜下压片观察。
[0022] 本发明涉及的试剂配方：
[0023] (1)固定脱色液的配制：100％三氯乙酸配制是用500g的三氯乙酸加水227ml，然后，以比例3/150/50将100％三氯乙酸溶液、乙醇、氯仿混合，保存在棕色瓶内；
[0024] (2)水合氯醛饱和溶液：20g水合氯醛加4～5ml甘油和5～6ml水，充分溶解后，保存在玻璃广口瓶中；
[0025] (3)乳酸酚棉蓝染色液：石炭酸10g，乳酸10ml，甘油20ml，棉蓝0.02g，蒸馏水10ml。
[0026] 本发明中的染色方法能够有效地应用于杨树黑斑病组织病理学研究，将寄主组织内部的真菌结构清晰地着色显示，能通过染色明显地区分开寄主同病原菌的结构。
[0027] 本发明中的染色方法有广泛的通用性，可以应用在大部分叶部真菌病害的组织病理学过程的研究工作中，如采用本发明中的染色方案对杨树炭疽病、月季黑斑病、海棠叶斑病、牡丹白粉病和炫富花叶斑病的病斑进行了处理观察，均有较好的效果。
[0028] 本发明将透明与染色结合在一个步骤中，简化了传统的操作步骤，节约了时间，对叶片内部的真菌有特异的染色效果。
[0029] 本发明针对传统方法无法解决的科研问题，以常规试剂为基础，反复试验，通过自主创新研究，将透明与染色结合在一起，成功完成了清晰度高和对比效果强的染色工作。本发明具有便捷高通用性强的特点，在植物叶部病害的研究领域提供有效的技术支持，具有很好的应用前景。附图说明
[0030] 图1是不同染色方法应用在杨树黑斑病上的染色效果；
[0031] 图2是不同染色时间对染色效果的影响；
[0032] 图3是不同温度对染色效果的影响；
[0033] 图4是不同染色透明剂配制比例对染色效果的影响；
[0034] 图5是本发明在其它叶部病害中应用的染色效果，其中：A、B是本发明对杨树炭疽病的染色效果；C是本发明对月季黑斑病的染色效果；D是本发明对牡丹白粉病的染色效果；E是本发明对旋覆花叶斑病的染色效果。
具体实施方式
[0036] 实施例1：不同透明染色方法在杨树黑斑病中应用比较
[0037] 从室外采集杨树黑斑病病原菌杨盘二孢，进行分离培养。采集干净的杨树叶片，先用自来水冲洗干净，再用75％的乙醇进行表面消毒30s，无菌水漂洗3次。将杨盘二孢的分生孢子以105个/ml的浓度接种到叶片上，在光照培养箱中培养4～5d，培养条件为：湿度100％，温度25℃，光照12h/12h(光照/黑暗)。用75％的酒精消毒的刀片或者手术刀，将接种的叶片切成1cm×1cm左右的小块样品。分别对材料进行以下处理：
[0038] 方法(1)三氯乙酸脱色：
[0039] 将材料放入100％三氯乙酸溶液/乙醇/氯仿(3/150/50)固定脱色液中，12h后更换固定脱色液，再进过1d的固定脱色观察，观察时以苯胺蓝为染色剂染色，以乙醇为浮载剂。
[0040] 方法(2)水合氯醛透明法：
[0042] 方法(3)甘油乳酸液水合氯醛透明法：
[0043] 将材料放入酒精冰醋酸混合液中固定脱色，样品褪色后，移到载玻片上，滴两滴1％酸性品红的甘油乳酸液染色，徐徐加热到发烟为止。然后，除去残余的甘油乳酸液，加几滴不含染料的甘油乳酸液，加热，洗去多余的染色剂，饱和水合氯醛溶液透明后镜检。
[0044] 方法(4)采用本发明的方法：
[0045] 将样品块浸泡在固定脱色液(100％三氯乙酸溶液/乙醇/氯仿＝3/150/50的混合溶液)中，固定脱色6h后，更换固定脱色液，固定脱色6h；将固定脱色的样品块浸入透明染色剂中，55℃加热处理5h；将处理好的样品压片，片子不要有气泡，使用甘油或者透明染色剂作为浮载剂，在普通光学显微镜下压片观察。
[0046] 所述透明染色剂采用包括以下步骤的方法配制：
[0047] 将水合氯醛溶液与乳酸酚棉蓝染色液以6/1的比例混合均匀，可60℃预热处理1min。
[0048] 所述水合氯醛溶液采用包括以下步骤的方法配制：20g水合氯醛加4～5ml甘油和5～6ml水，充分溶解后，保存在玻璃广口瓶中。
[0049] 附图1中的A～D依次为以上四种处理的结果照片，从图中的A、B、C可以看出经过方法(1)、(2)、(3)的处理，叶片组织内部的真菌结构轮廓不清楚，没有层次感，只能够对叶片表面的分生孢子有效着色(如图1B、1C中左上角区域)，真菌的结构都没有有效的染上色，分辨结构时很容易跟叶片细胞的结构混淆，而且，在观察的过程中，这几张图片已为最好，而且观察过程比较辛苦，找这样的视野已经非常困难。图D为本发明的染色效果，植物细胞中的真菌结构被乳酸酚棉蓝染色液有效地染色，跟背景的对比非常明显，能够清晰地展示完整的真菌结构特征，图片质量很高，很好地解决了传统方法不能解决的问题。
[0050] 实施例2：不同的处理条件对染色效果的影响
[0051] 前期处理同实施例1，将接种的叶片切成1cm×1cm左右的小块样品后，将样品浸泡在100％三氯乙酸溶液/乙醇/氯仿(3/150/50)固定脱色液中，固定脱色6h后，更换固定脱色液，继续固定脱色6h，随后，将脱色固定后的样品放入不同比例配制的透明染色液中进行透明染色，具体的配制比例如下表1所示。通过不同的梯度处理温度与处理时间进行透明染色，具体的处理温度和处理时间，如下表1所示。最后，将各个处理的样品放到载玻片上，以甘油为浮载剂进行压片观察，结果分别如图2、图3和图4所示。
[0052] 表1不同处理时间、不同处理温度和不同染色液比例
[0053]
[0054] 图2中的A～F分别是处理时间1h、2h、3h、4h、5h和6h的染色结果，从图中可以看出前三个小时着色效果不怎么好，染色进行4h后，开始深度着色(图2D)，在第5h达到很好的染色效果(图2E)，染色6h以后，着色没有明显的变化，说明在5h时，染色效果已达最佳状态。附图3中的A～D的处理温度分别为30℃、40℃、50℃、60℃，在染色温度低于40℃度时，样品的着色比较浅(图3A)，真丝与寄主之间没有明显的色差，但是到40℃以上，菌丝的着色效果就开始明显(图3B)，50℃以后着色效果不在增强，所以50℃是比较好的选择。附图4中的A～D的使用的染色液比例(水合氯醛溶液/乳酸酚棉蓝染色液)分别为7/1、6/1、5/1、4/1，该比例大于7/1时，菌丝的着色效果比较差(图4A)，比例小于6/1时，染色效果非常好，而且基本保持一致(图4B、图4C、图4D)。综合考虑到，操作的简便、时间成本和金钱成本，在杨树黑斑病的组织病理学研究中，本发明的几个主要变量，即处理时间、处理温度以及染色液的配制比例，分别优选在6h、50℃和6/1。
[0055] 实施例3：利用本发明中的染色方法对多种叶部病害进行染色观察[0056] 在北京采集一些常见的叶部病害的病叶，包括杨树炭疽病、月季黑斑病、牡丹白粉病和旋覆花叶斑病，采集后装入密封袋中，保存在4度冰箱中以待使用。
[0057] 用自来水冲洗采集的病叶，然后用滤纸擦干叶面，用75％乙醇消毒的刀片或者手术刀将叶片切成1cm×1cm左右的小块样品，将样品浸泡在100％三氯乙酸溶液/乙醇/氯仿(3/150/50)固定脱色液中，固定脱色6h后，更换固定脱色液，继续固定脱色6h，随后，将脱色固定后的样品放入透明染色液(水合氯醛溶液/乳酸酚棉蓝染色液＝6/1)中，50℃染色5～6h，然后将各病害的样品放到载玻片上，以甘油为浮载剂进行压片观察，结果如图5所示。
[0058] 从图5A和图5B可以看出，本发明的染色方法在杨树的其他叶部病害杨树炭疽病的应用中，取得了非常好的染色效果，可以很好的观察到该病原菌在杨树叶片中的形态特征，染色质量高，图片中的色差大，将寄主同病原菌很明显的区分开，说明本染色方法的通用质量很高。在月季黑斑病的应用中，本发明所述的染色方案也能够将月季黑斑病病原菌在寄主体内形成的吸器结构很好的染色(图5C)。同样，对于牡丹白粉病菌的吸器结构的着色效果也非常好，能够清晰的展示这些内部结构的形态特征(图5D)。从图5E中，可以看到旋覆花叶斑病病斑处的内部菌丝结构也可被染色液染为蓝色，背景色稍杂，可能时由于选取的材料太后，或者病斑发展到了后期的缘故，但是，并不阻碍对于内部真菌结构的观察。
[0059] 综上述结果，可以看出，本发明的染色方案实际应用的效果非常好，最终获得的图片质量很高，而且本发明的通用性很广泛，一般情况下，任何叶部病害都可采用本方法进行病原真菌组织病理学研究的染色观察，能够为相关领域的科研工作提供很大的便利。
[0060] 前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，本发明在具体实施过程中，可以进行很多的改变，上述实例是为了阐述本发明在实际应用中的具体实施步骤，从帮助领域内的工作人员能够更好的应用本发明进行科学研究。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
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