代表性诊断
阅读：711发布：2021-03-04
专利汇可以提供代表性诊断专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本公开文本总体上涉及使用用以使完整的样品或其大部分均质化的机械和/或生化解离方法从临床样品例如 肿瘤 (全部或部分)、淋巴结、转移瘤、囊肿、息肉、或者其组合或部分制备代表性样品。尽管该样品内存在空间异质性，所得均质物提供了获得正确代表性样品的能 力 ，增加了低流行率亚克隆的检测可能性，并且适用于各种诊断测定以及生产 治疗 剂，尤其是“个性化”抗肿瘤 疫苗 或基于免疫细胞的疗法。，下面是代表性诊断专利的具体信息内容。
1.一种用于制备用来分析的代表性样品的方法，其包括：
a)从至少一个受试者获得手术切除组织样品；并且
b)将该手术切除组织样品均质化以获得均质化样品。
2.权利要求1的方法，其进一步包括固定该手术切除组织样品的至少部分。
3.权利要求1的方法，其进一步包括加工该手术切除样品的第一部分并且生成一个或多个固定的包埋组织块。
4.权利要求3的方法，其进一步包括将剩余的手术组织切除样品的第二部分均质化。
5.权利要求3或4的方法，其进一步包括通过显微切片术加工该一个或多个固定的包埋组织块的至少部分以产生一个或多个组织薄切片用于形态分析。
6.权利要求5的方法，其进一步包括将该一个或多个固定的包埋组织块中的至少一个脱石蜡，并将来自该一个或多个脱石蜡的固定包埋组织块的组织均质化。
7.权利要求1的方法，其中该手术切除组织样品包括一个或多个单独的组织片。
8.权利要求7的方法，其中该一个或多个单独的组织片包括为获得该手术切除样品从受试者切除的一个或多个原发实体瘤组织团块的至少部分。
9.权利要求8的方法，其中该一个或多个单独的组织片包括从该受试者切除的一个或多个淋巴结的至少部分。
10.权利要求7、8或9的方法，其进一步包括将该单独的组织片的至少部分单独均质化以产生单独的均质化样品。
11.权利要求1的方法，其中该手术切除组织样品包括单个组织团块。
12.权利要求11的方法，其中该单个组织团块被进一步分成该单个组织团块的两片或更多片。
13.权利要求12的方法，其进一步包括使该单个组织团块的该两片或更多片中的至少一片均质化并保留该单个组织团块剩余的两片或更多片中的至少一片。
14.权利要求1的方法，其中该均质化包括物理分离。
15.权利要求14的方法，其中该物理分离是通过切割、划切或切碎来进行。
16.权利要求1的方法，其中该均质化包括机械解离。
17.权利要求16的方法，其中该机械解离是通过共混或榨汁进行。
18.权利要求1的方法，其中该均质化是通过生化解离进行
19.权利要求18的方法，其中该生化解离是通过蛋白酶进行。
20.权利要求1的方法，其进一步包括从该均质物的至少部分中纯化一种或多种生物分子。
21.权利要求20的方法，其中该一种或多种生物分子选自下组，该组由以下各项组成：
DNA、RNA、蛋白质、脂质和代谢物。
22.权利要求21的方法，其进一步包括对该一种或多种生物分子进行分析。
23.权利要求22的方法，其中对该一种或多种生物分子进行该分析是通过PCR、质谱法、新一代测序、或ELISA进行。
24.权利要求22的方法，其中该分析产生至少一个数据集。
25.权利要求1的方法，其进一步包括将该均质化样品的至少部分包埋在石蜡中。
26.权利要求25的方法，其进一步包括制备该石蜡包埋的均质化样品的一个或多个薄切片。
27.权利要求26的方法，其进一步包括对该石蜡包埋的均质化样品的薄切片进行组织学分析。
28.权利要求27的方法，其中该组织学分析是通过H&E染色、IHC染色、ISH染色、以及FISH染色进行。
29.权利要求27的方法，其中对该石蜡包埋的均质化样品的薄切片的该组织学分析由人解读。
30.权利要求27的方法，其中对该石蜡包埋的均质化样品的薄切片的该组织学分析是通过自动化装置进行定量。
31.权利要求29的方法，其中该解读产生至少一个数据集。
32.权利要求30的方法，其中该定量产生至少一个数据集。
33.权利要求1的方法，其进一步包括对该均质物的至少部分进行进一步加工以生成细胞碎片。
34.权利要求32的方法，其中对该均质物的至少部分的该加工是通过物理方法、机械方法、化学方法、或酶促方法进行。
35.权利要求33的方法，其中该细胞碎片选自下组，该组由以下各项组成：细胞核、细胞膜和细胞器。
36.权利要求33的方法，其中该细胞碎片的至少部分被附着到至少一个载玻片上。
37.权利要求36的方法，其中对附着到至少一个载玻片上的该细胞碎片的该至少部分进行组织学分析。
38.权利要求37的方法，其中该组织学分析是通过H&E染色、IHC染色、ISH染色、或FISH染色进行。
39.权利要求36的方法，其中对附着到至少一个载玻片上的该细胞碎片的至少部分的该组织学分析由人解读。
40.权利要求36的方法，其中对附着到至少一个载玻片上的该细胞碎片的至少部分的该组织学分析是通过自动化装置进行定量。
41.权利要求39的方法，其中该解读产生至少一个数据集。
42.权利要求40的方法，其中该定量产生至少一个数据集。
43.权利要求33的方法，其中将该细胞碎片的至少部分通过流式细胞术、FACS、或粒子分析仪进行分析。
44.权利要求43的方法，其中该分析产生数据集。
45.权利要求33的方法，其进一步包括从该细胞碎片的至少部分中纯化至少一种细胞碎片。
46.权利要求45的方法，其中该纯化是通过FACS、亲和纯化、尺寸排阻差速离心、过滤、或电泳进行。
47.权利要求45的方法，其进一步包括由从该细胞碎片的至少部分中纯化的该至少一种细胞碎片中分离生物分子。
48.权利要求47的方法，其进一步包括对来自从该细胞碎片的该至少部分中纯化的该至少一种细胞碎片的该生物分子进行分析。
49.权利要求48的方法，其中该分析 是PCR、质谱法、新一代测序、或ELISA。
50.权利要求49的方法，其中该分析产生至少一个数据集。
51.权利要求1的方法，其进一步包括对该均质物的至少部分进行进一步加工以生成至少一个解离细胞。
52.权利要求51的方法，其中对该均质物的至少部分的该加工是物理加工、机械加工、化学加工、或酶促加工。
53.权利要求51的方法，其中该至少一个解离细胞是正常细胞、癌细胞或细菌细胞。
54.权利要求51的方法，其中将该至少一个解离细胞附着到至少一个载玻片上。
55.权利要求54的方法，其中对附着到至少一个载玻片上的该至少一个解离细胞进行组织学分析。
56.权利要求55的方法，其中该组织学分析是H&E染色、IHC染色、ISH染色、或FISH染色。
57.权利要求55的方法，其中对附着到至少一个载玻片上的该至少一个解离细胞的该组织学分析由人解读。
58.权利要求55的方法，其中对附着到至少一个载玻片上的该至少一个解离细胞的该组织学分析是通过自动化装置进行定量。
59.权利要求57的方法，其中该解读产生至少一个数据集。
60.权利要求58的方法，其中该定量产生至少一个数据集。
61.权利要求51的方法，其中对该至少一个解离细胞通过流式细胞术、FACS、或粒子分析仪进行分析。
62.权利要求61的方法，其中该分析产生数据集。
63.权利要求51的方法，其进一步包括从该至少一个解离细胞中纯化至少一个细胞。
64.权利要求63的方法，其中该纯化是FACS、亲和纯化、尺寸排阻差速离心、过滤、或电泳。
65.权利要求63的方法，其进一步包括由从该至少一个解离细胞中纯化的该至少一个细胞中分离生物分子。
66.权利要求65的方法，其进一步包括对来自从该至少一个解离细胞中纯化的该至少一个细胞的该生物分子进行分析。
67.权利要求66的方法，其中该分析是PCR、质谱法、新一代测序、或ELISA。
68.权利要求67的方法，其中该分析产生至少一个数据集。
69.权利要求63的方法，其中将从该至少一个解离细胞中纯化的该至少一个细胞附着到至少一个载玻片上。
70.权利要求69的方法，其中对附着到至少一个载玻片上的从该至少一个解离细胞中纯化的该至少一个细胞进行组织学分析。
71.权利要求70的方法，其中该组织学分析是H&E染色、IHC染色、ISH染色、或FISH染色。
72.权利要求70的方法，其中对附着到至少一个载玻片上的从该至少一个解离细胞中纯化的该至少一个细胞的该组织学分析由人解读。
73.权利要求70的方法，其中对附着到至少一个载玻片上的从该至少一个解离细胞中纯化的该至少一个细胞的该组织学分析是通过自动化装置进行定量。
74.权利要求72的方法，其中该解读产生至少一个数据集。
75.权利要求73的方法，其中该定量产生至少一个数据集。
76.权利要求24、31、32、41、42、44、50、59、60、62、68、74和75中任一项的方法，其进一步包括对来自该至少一个受试者的该至少一个数据集进行分析。
77.权利要求76的方法，其中该分析包括确定生物标记物多样性或表型多样性数据集。
78.权利要求76的方法，其中该分析包括确定至少一种不同生物标记物或表型的流行率。
79.权利要求76的方法，其中该分析包括确定至少一个临床决策。
80.权利要求79的方法，其中该临床决策是确定疾病预后、预测疾病复发、预测疾病治疗靶标、纳入临床试验受试者、或针对至少一个受试者的治疗处理策略。
81.一种由包括基本上均匀分布的细胞结构的异质组织样品衍生的加工均质物组合物，其中该均质物的每个子集中的细胞结构的比率基本上与该组织样品中的细胞结构的比率相似。
81.权利要求81的均质物，其中该组织样品选自以下项的组：肿瘤、淋巴结、转移瘤、息肉、囊肿、切除物、器官、或其部分。
82.权利要求81或82的均质物，其中该组织样品包括空间上分离的细胞结构。
83.权利要求81-83中任一项的均质物，其中该细胞结构包括细胞簇、单个细胞、细胞碎片、细胞器、肽、核酸、脂质、代谢物、或其组合。
84.权利要求81-84中任一项的均质物，其中该均质物包括高达25％的来自该组织样品的细胞结构。
85.权利要求81-84中任一项的均质物，其中该均质物包括高达50％的来自该组织样品的细胞结构。
86.权利要求81-84中任一项的均质物，其中该均质物包括高达75％的来自该组织样品的细胞结构。
87.权利要求81-84中任一项的均质物，其中该均质物包括高达100％的来自该组织样品的细胞结构。
88.权利要求81-84中任一项的均质物，其中该均质物包括100％的来自该组织样品的细胞结构。
89.权利要求81的均质物，其中该组织样品包括非液体组织样品。
90.权利要求81的均质物，其中该组织样品包括液体组织样品。
91.权利要求91的均质物，其中该液体组织样品包括通过细胞学针抽吸物、渗出物样品、或巴氏涂片中的一种或多种分离的组织。
92.权利要求81的均质物，其中该基本上同质的细胞结构包括多个单细胞或多个细胞簇。
93.权利要求81-93中任一项的均质物，其中该细胞结构是从正常组织分离。
95.权利要求81-93中任一项的均质物，其中该细胞结构是从表型正常或基因型正常的组织分离。
96.权利要求81-93中任一项的均质物，其中该细胞结构是从异常组织分离。
97.权利要求81-93中任一项的均质物，其中该细胞结构是从表型异常或基因型异常的组织分离。
98.权利要求81-97中任一项的均质物，其中该组织样品包括干细胞、上皮细胞、血细胞、脂肪细胞、皮肤细胞、内皮细胞、肿瘤细胞、或免疫细胞。
99.权利要求98的均质物，其中该肿瘤细胞衍生于选自以下项的组的癌组织：肺癌、白血病、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、脑癌、食管癌、头颈癌、膀胱癌、妇科癌症、卵巢癌、宫颈癌、脂肪肉瘤、黑素瘤、淋巴瘤、浆细胞瘤、肉瘤、神经胶质瘤、胸腺瘤、肝细胞瘤、以及骨髓瘤。
100.权利要求98的均质物，其中该免疫细胞是选自以下项的组的细胞：嗜中性粒细胞、单核细胞、树突细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、T细胞、B细胞、或自然杀伤细胞。
101.权利要求81-100中任一项的均质物，其中该组织样品未被保存或固定。
102.权利要求81-100中任一项的均质物，其中该组织样品包括活细胞。
103.权利要求81-100中任一项的均质物，其中该组织样品被保存或固定。
104.权利要求103的均质物，其中该被保存或固定的组织样品包括已经通过以下项的组中的方法进行冷冻或固定的样品：冷冻、冷冻干燥和蜡包埋。
105.权利要求81-104中任一项的均质物，其中该异质组织样品是从一种或多种组织中分离。
106.权利要求81-104中任一项的均质物，其中该组织样品是从一个受试者分离。
107.权利要求81-106中任一项的均质物，其中该组织样品包括从两个或更多个受试者分离的组织。
108.权利要求107的均质物，其中该两个或更多个受试者是遗传上同质的受试者。
109.权利要求107的均质物，其中该两个或更多个受试者是表型上同质的受试者。
110.权利要求107的均质物，其中该两个或更多个受试者是遗传上多样的受试者。
111.权利要求107的均质物，其中该两个或更多个受试者是表型上多样的受试者。
112.权利要求107的均质物，其中该两个或更多个受试者来自相同的性别。
113.权利要求107的均质物，其中该两个或更多个受试者来自不同的性别。
114.权利要求107的均质物，其中该两个或更多个受试者来自不同的族群。
115.权利要求107的均质物，其中该两个或更多个受试者来自相同的族群。
116.权利要求106-115中任一项的均质物，其中该受试者选自下组，该组由以下各项组成：动物、农场动物、宠物、人类受试者。
117.权利要求81-116中任一项的均质物，其中该均质物进一步包括非人细胞、人细胞、非天然蛋白质、核酸、或小分子、染料、病毒、细菌、寄生虫、原生动物或化学物质中的一种或多种。
118.权利要求117的组合物，其中该小分子包括半抗原、肽标签、蛋白质标签、荧光标签、核酸标签、及其组合。
119.一种用于生成代表性数据的方法，其包括对权利要求81-118中任一项的均质物组合物进行分析。
120.权利要求119的方法，其中该分析包括生成该均质物组合物中标记物的定量和/或定性数据。
121.权利要求120的方法，其中该标记物包括DNA、蛋白质、RNA、脂质、细胞器、代谢物、或细胞。
122.权利要求121的方法，其中该蛋白质包括修饰，所述修饰选自下组，该组由以下各项组成：乙酰化、ADP-核糖基化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、共价附接黄素、共价附接血红素、共价附接核苷酸或核苷酸衍生物、共价附接脂质或脂质衍生物、共价附接磷脂酰肌醇、交联、环化、二硫键形成、脱甲基、形成共价交联、形成胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、精氨酰化、以及泛素化。
123.权利要求120的方法，其中该标记物包括基因组多态性，药物基因组学单核苷酸多态性(SNP)，基因组SNP，体细胞多态性，以及蛋白质、脂质和/或细胞器的差异表达。
124.权利要求120的方法，其中该标记物包括单个核苷酸位置；基因内区域或基因间区域；外显子或内含子、或其片段；编码区或非编码区；启动子、增强子、5'非翻译区(5'UTR)、或3'非翻译区(3'UTR)、或其片段；cDNA或其片段；SNP；体细胞突变、种系突变、或两者；点突变或单一突变；缺失突变；框内缺失、基因内缺失、全基因缺失；插入突变；基因内插入；倒位突变；染色体内倒位；连锁突变；连锁插入突变；反转重复突变；串联重复；染色体内串联重复；易位；染色体易位，非相互易位；重排；基因组重排；一个或多个内含子、或其片段的重排；重排的内含子；5'-或3'-UTR、或其组合。
125.权利要求120的方法，其中与正常的健康组织或细胞相比，在癌组织或癌细胞中该标记物包括对改变的氨基酸序列进行编码的改变的核苷酸序列、染色体易位、染色体内倒位、拷贝数变化、表达水平变化、蛋白质水平变化、蛋白质活性变化、或甲基化状态变化。
126.权利要求120-125中任一项的方法，其中通过单细胞测序、单核测序、流式细胞术、免疫组织化学染色、苏木精和伊红染色、全基因组测序、高通量测序、质谱法、DNA微阵列、或其组合对该标记物进行测量。
127.权利要求119的方法，其中该组织样品包括选自以下项的组的样品：一种或多种恶变前或恶性细胞、来自实体瘤的细胞、软组织肿瘤或转移灶、来自手术边缘的组织或细胞、组织学正常组织、一种或多种循环肿瘤细胞(CTC)、正常邻近组织(NAT)、来自患肿瘤或处于患肿瘤风险的相同受试者的血液样品、或FFPE样品。
128.权利要求119的方法，其中该代表性数据包括从单个标记物生成的定性和定量数据。
129.权利要求119的方法，其中该代表性数据包括从两个或更多个不同标记物生成的定性和/或定量数据。
130.权利要求39-49中任一项的方法，其进一步包括向该定性和/或定量数据指定内部值。
131.权利要求119的方法，其进一步包括将该代表性数据与该数据的预定值进行比较。
132.权利要求131的方法，其中该预定值选自临床试验数据、受试者的数据、来自科学文献的数据、临床开发中的生物分子或小分子的数据。
133.权利要求119的方法，其中该代表性数据包括代表性肿瘤学数据，其中该代表性肿瘤学数据包括来自第一生物样品的至少一种肿瘤标记物的定量和/或定性数据，所述肿瘤标记物与肿瘤的存在相关联。
134.权利要求133的方法，其进一步包括：
a)测量该第一生物样品中的该肿瘤标记物，其中该肿瘤标记物的测量值被归一化；
b)基于该归一化的测量值获得综合得分；并且
c)将该综合得分与预定得分进行比较以确定该受试者的癌症风险值。
135.权利要求134的方法，其中该肿瘤标记物来自以下项的组：蛋白质、抗原、酶、激素、DNA、RNA、微小RNA、或碳水化合物。
136.权利要求134的方法，其中该肿瘤标记物来自以下项的组：Her2，bRaf，ERBB2，Pl3KCA，FGFR2，p53，BRCA，CCND1，MAP2K4，ATR，AFP，ALK，BCR-ABL，BRCA1/BRCA2，BRAF，V600E，Ca-125，CA19.9，EGFR，Her-2，KIT，PSA，S100，KRAS，ER/Pr，UGT1A1，CD30，CD20，F1P1L1-PDGRFα，PDGFR，TMPT，TMPRSS2；ABCB5，AFP-L3，α-甲胎蛋白，α-甲基酰基CoA消旋酶，BRCA1，BRCA2，CA 15-3，CA 242，Ca 27-29，CA-125，CA15-3，CA19-9，降钙素，癌胚抗原，癌胚抗原肽-1，脱-γ羧基凝血酶原，肌间线蛋白，早期前列腺癌抗原-2，雌激素受体，纤维蛋白降解产物，葡萄糖-6-磷酸异构酶，vE6，E7，L1，L2或p16INK4a，人绒毛膜促性腺激素，IL-6，角蛋白19，乳酸脱氢酶，亮氨酰氨基肽酶，促脂素，变肾上腺素类物质，脑啡肽酶，NMP22，去甲变肾上腺素，PCA3，前列腺特异性抗原，前列腺酸性磷酸酶，突触素，甲状腺球蛋白，TNF，选自以下项的转录因子：ERG、ETV1(ER81)、FLI1、EST1、EST2、ELK1、ETV6、ETV7、GABPα、ELF1、ETV4、ETV5、ERF、PEA3/E1AF、PU.1、ESE1/ESX、SAP1(ELK4)、ETV3(METS)、EWS/FLI1、ESE1、ESE2(ELF5)、ESE3、PDEF、NET(ELK3；SAP2)、NERF(ELF2)、或FEV.XXX，肿瘤相关糖蛋白72，c-kit，SCF，pAKT，pc-kit，波形蛋白，CTLA-4，PDL1，PDL2，PD1，B7-H3，B7-H4，BTLA，HVEM，KIR，TIM3，GAL9，GITR，LAG3，VISTA，KIR，2B4，TRPO2，CD160，CGEN-15049，CHK 1，CHK2，A2aR，TL1A，CTLA-4，PDL1，PDL2，PD1，B7-H3，B7-H4，BTLA，HVEM，TIM3，GAL9，LAG3，VISTA，KIR，2B4，CD160，CGEN-15049，CHK1，CHK2，A2aR，B-7家族，及其组合。
137.权利要求133的方法，其中该肿瘤标记物包括选自以下项的组的一种或多种标记物：基因组多态性，药物基因组学单核苷酸多态性(SNP)，基因组SNP，体细胞多态性，以及蛋白质、脂质和细胞器的差异表达。
138.权利要求133的方法，其中该肿瘤标记物选自以下项的组：单个核苷酸位置；基因内区域或基因间区域；外显子或内含子、或其片段；编码区或非编码区；启动子、增强子、5'非翻译区(5'UTR)、或3'非翻译区(3'UTR)、或其片段；cDNA或其片段；SNP；体细胞突变、种系突变或两者；点突变或单一突变；缺失突变；框内缺失、基因内缺失、全基因缺失；插入突变；
基因内插入；倒位突变；染色体内倒位；连锁突变；连锁插入突变；反转重复突变；串联重复；
染色体内串联重复；易位；染色体易位，非相互易位；重排；基因组重排；一个或多个内含子、或其片段的重排；重排的内含子；5'-或3'-UTR、及其组合。
139.权利要求133的方法，其中在癌组织或癌细胞中该肿瘤标记物包括来自以下项的组的标记物，各项与正常的健康组织或细胞相比：对改变的氨基酸序列进行编码的改变的核苷酸序列、染色体易位、染色体内倒位、拷贝数变化、表达水平变化、蛋白质水平变化、蛋白质活性变化、以及甲基化状态变化。
140.权利要求134的方法，其中该预定得分衍生自以下项的组：临床试验数据、衍生自第二生物样品的代表性肿瘤学数据、衍生自一组生物样品的代表性肿瘤学数据、临床开发生物分子或小分子的数据。
141.一种治疗受试者疾病的方法，其包括基于权利要求119的代表性数据选择适当的治疗方案，其中该代表性数据包括该受试者的第一谱。
142.权利要求141的方法，其中该第一谱包括来自以下项的组的谱：标记物谱、抗原谱、蛋白谱、突变谱、脂质谱、外泌体谱、或其组合。
143.权利要求142的方法，其中该标记物包括来自以下项的组中的一个或多个：Her2，bRaf，ERBB2，Pl3KCA，FGFR2，p53，BRCA，CCND1，MAP2K4，ATR，AFP，ALK，BCR-ABL，BRCA1/BRCA2，BRAF，V600E，Ca-125，CA19.9，EGFR，Her-2，KIT，PSA，S100，KRAS，ER/Pr，UGT1A1，CD30，CD20，F1P1L1-PDGRFα，PDGFR，TMPT，TMPRSS2；ABCB5，AFP-L3，α-甲胎蛋白，α-甲基酰基CoA消旋酶，BRCA1，BRCA2，CA 15-3，CA 242，Ca 27-29，CA-125，CA15-3，CA19-9，降钙素，癌胚抗原，癌胚抗原肽-1，脱-γ羧基凝血酶原，肌间线蛋白，早期前列腺癌抗原-2，雌激素受体，纤维蛋白降解产物，葡萄糖-6-磷酸异构酶，vE6，E7，L1，L2或p16INK4a，人绒毛膜促性腺激素，IL-6，角蛋白19，乳酸脱氢酶，亮氨酰氨基肽酶，促脂素，变肾上腺素类物质，脑啡肽酶，NMP22，去甲变肾上腺素，PCA3，前列腺特异性抗原，前列腺酸性磷酸酶，突触素，甲状腺球蛋白，TNF，选自以下项的转录因子：ERG、ETV1(ER81)、FLI1、EST1、EST2、ELK1、ETV6、ETV7、GABPα、ELF1、ETV4、ETV5、ERF、PEA3/E1AF、PU.1、ESE1/ESX、SAP1(ELK4)、ETV3(METS)、EWS/FLI1、ESE1、ESE2(ELF5)、ESE3、PDEF、NET(ELK3；SAP2)、NERF(ELF2)、或FEV.XXX，肿瘤相关糖蛋白72，c-kit，SCF，pAKT，pc-kit，波形蛋白，CTLA-4，PDL1，PDL2，PD1，B7-H3，B7-H4，BTLA，HVEM，KIR，TIM3，GAL9，GITR，LAG3，VISTA，KIR，2B4，TRPO2，CD160，CGEN-15049，CHK 1，CHK2，A2aR，TL1A，CTLA-4，PDL1，PDL2，PD1，B7-H3，B7-H4，BTLA，HVEM，TIM3，GAL9，LAG3，VISTA，KIR，2B4，CD160，CGEN-15049，CHK1，CHK2，A2aR，B-7家族，及其组合。
144.权利要求141的方法，其中该第一谱包括从以下项的组生成的谱：一种或多种标记物、一种或多种抗原、一种或多种蛋白质、一种或多种突变、一种或多种脂质、一种或多种外泌体、或其组合。
145.权利要求142的方法，其中该标记物来自以下项的组：基因组多态性，药物基因组学单核苷酸多态性(SNP)，基因组SNP，体细胞多态性，以及蛋白质、脂质和细胞器的差异表达。
146.权利要求142的方法，其中该标记物来自以下项的组：单个核苷酸位置；基因内区域或基因间区域；外显子或内含子、或其片段；编码区或非编码区；启动子、增强子、5'非翻译区(5'UTR)、或3'非翻译区(3'UTR)、或其片段；cDNA或其片段；SNP；体细胞突变、种系突变或两者；点突变或单一突变；缺失突变；框内缺失、基因内缺失、全基因缺失；插入突变；基因内插入；倒位突变；染色体内倒位；连锁突变；连锁插入突变；反转重复突变；串联重复；染色体内串联重复；易位；染色体易位，非相互易位；重排；基因组重排；一个或多个内含子、或其片段的重排；重排的内含子；5'-或3'-UTR、及其组合。
147.权利要求141的方法，其中该治疗方案包括个性化剂量方案。
148.权利要求141的方法，其中该治疗方案选自以下项的组：化学疗法、免疫疗法、放射、外科手术、基因疗法、激素疗法、干细胞疗法、输血、物理疗法、光动力疗法、及其组合。
149.权利要求141-148中任一项的方法，其进一步包括将该受试者的该第一谱与预定谱进行比较以确定该治疗方案对于该受试者是否适当。
150.权利要求149的方法，其中该预定谱是基于选自以下项的组的数据确定的：临床试验数据、受试者的第二谱、不同生物样品或一组生物样品的谱、不同受试者或一组受试者的谱、生物分子或小分子的数据、及其组合。
151.鉴定临床相关标记物的方法，其包括将权利要求19的代表性数据与预定数据进行比较。
152.权利要求151的方法，其中该标记物选自以下项的组：蛋白质、抗原、酶、激素、DNA、RNA、微小RNA、或碳水化合物。
153.权利要求151的方法，其中该标记物包括基因组多态性，药物基因组学单核苷酸多态性(SNP)，基因组SNP，体细胞多态性，以及蛋白质、脂质、蛋白质修饰和细胞器的差异表达。
154.权利要求151的方法，其中该标记物选自以下项的组：单个核苷酸位置；基因内区域或基因间区域；外显子或内含子、或其片段；编码区或非编码区；启动子、增强子、5'非翻译区(5'UTR)、或3'非翻译区(3'UTR)、或其片段；cDNA或其片段；SNP；体细胞突变、种系突变或两者；点突变或单一突变；缺失突变；框内缺失、基因内缺失、全基因缺失；插入突变；基因内插入；倒位突变；染色体内倒位；连锁突变；连锁插入突变；反转重复突变；串联重复；染色体内串联重复；易位；染色体易位，非相互易位；重排；基因组重排；一个或多个内含子、或其片段的重排；重排的内含子；5'-或3'-UTR、及其组合。
155.权利要求151的方法，其中在癌组织或癌细胞中该标记物选自以下项的组，各项与正常的健康组织或细胞相比：对改变的氨基酸序列进行编码的改变的核苷酸序列、染色体易位、染色体内倒位、拷贝数变化、表达水平变化、蛋白质水平变化、蛋白质活性变化、以及甲基化状态变化。
156.权利要求151的方法，其中该预定数据是从选自以下项的组的数据生成的：基于临床试验数据、一个受试者或一组受试者的数据、一个组织样品或一组组织样品的数据、临床开发中的生物分子或小分子的数据、或其组合来确定的数据。
157.一种确定受试者中癌症预后的方法，其包括评估来自受试者的权利要求119的代表性数据。
158.权利要求157的方法，其进一步包括计算该癌症预后的定量得分，其中基于该定量得分对该预后进行分类。
159.权利要求157的方法，其中该代表性数据包括关于该均质物中的该细胞结构的数目、类型、状态和/或百分比的信息。
160.权利要求159的方法、其中该细胞结构包括干细胞、上皮细胞、血细胞、脂肪细胞、皮肤细胞、内皮细胞、癌细胞、或免疫细胞。
161.权利要求160的方法，其中该免疫细胞包括嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、T细胞、和/或B细胞。
162.权利要求161的方法，其中该T细胞包括杀伤T细胞、辅助T细胞、调节性T细胞、全T细胞、初试T细胞、活化T细胞、和/或γδT细胞。
163.权利要求159的方法，其中细胞结构的该状态包括增殖、凋亡、坏死、迁移、上皮-间质转化(“EMT”)、有丝分裂、细胞周期停滞、S期、衰老、和/或分化。
164.权利要求157的方法，其中该代表性数据包括关于该均质物中的标记物的信息。
165.权利要求164的方法，其中该标记物选自以下项的组：DNA、蛋白质、RNA、脂质、细胞器、代谢物、或细胞。
166.权利要求164的方法，其中该标记物包括以下项中的一个或多个：Her2，bRaf，ERBB2，Pl3KCA，FGFR2，p53，BRCA，CCND1，MAP2K4，ATR，AFP，ALK，BCR-ABL，BRCA1/BRCA2，BRAF，V600E，Ca-125，CA19.9，EGFR，Her-2，KIT，PSA，S100，KRAS，ER/Pr，UGT1A1，CD30，CD20，F1P1L1-PDGRFα，PDGFR，TMPT，TMPRSS2；ABCB5，AFP-L3，α-甲胎蛋白，α-甲基酰基CoA消旋酶，BRCA1，BRCA2，CA 15-3，CA 242，Ca 27-29，CA-125，CA15-3，CA19-9，降钙素，癌胚抗原，癌胚抗原肽-1，脱-γ羧基凝血酶原，肌间线蛋白，早期前列腺癌抗原-2，雌激素受体，纤维蛋白降解产物，葡萄糖-6-磷酸异构酶，vE6，E7，L1，L2或p16INK4a，人绒毛膜促性腺激素，IL-6，角蛋白19，乳酸脱氢酶，亮氨酰氨基肽酶，促脂素，变肾上腺素类物质，脑啡肽酶，NMP22，去甲变肾上腺素，PCA3，前列腺特异性抗原，前列腺酸性磷酸酶，突触素，甲状腺球蛋白，TNF，选自以下项的转录因子：ERG、ETV1(ER81)、FLI1、EST1、EST2、ELK1、ETV6、ETV7、GABPα、ELF1、ETV4、ETV5、ERF、PEA3/E1AF、PU.1、ESE1/ESX、SAP1(ELK4)、ETV3(METS)、EWS/FLI1、ESE1、ESE2(ELF5)、ESE3、PDEF、NET(ELK3；SAP2)、NERF(ELF2)、或FEV.XXX，肿瘤相关糖蛋白72，c-kit，SCF，pAKT，pc-kit，波形蛋白，CTLA-4，PDL1，PDL2，PD1，B7-H3，B7-H4，BTLA，HVEM，KIR，TIM3，GAL9，GITR，LAG3，VISTA，KIR，2B4，TRPO2，CD160，CGEN-15049，CHK 1，CHK2，A2aR，TL1A，CTLA-4，PDL1，PDL2，PD1，B7-H3，B7-H4，BTLA，HVEM，TIM3，GAL9，LAG3，VISTA，KIR，2B4，CD160，CGEN-15049，CHK1，CHK2，A2aR，B-7家族，及其组合。
167.权利要求164的方法，其中该标记物选自蛋白质修饰的组，所述修饰选自下组，该组由以下各项组成选自下组，该组由以下各项组成：乙酰化、ADP-核糖基化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、共价附接黄素、共价附接血红素、共价附接核苷酸或核苷酸衍生物、共价附接脂质或脂质衍生物、共价附接磷脂酰肌醇、交联、环化、二硫键形成、脱甲基、形成共价交联、形成胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、精氨酰化、以及泛素化。
168.权利要求164的方法，其中该标记物选自以下项的组：基因组多态性，药物基因组学单核苷酸多态性(SNP)，基因组SNP，体细胞多态性，以及蛋白质、脂质和/或细胞器的差异表达，单个核苷酸位置；基因内区域或基因间区域；外显子或内含子、或其片段；编码区或非编码区；启动子、增强子、5'非翻译区(5'UTR)、或3'非翻译区(3'UTR)、或其片段；cDNA或其片段；SNP；体细胞突变、种系突变或两者；点突变或单一突变；缺失突变；框内缺失、基因内缺失、全基因缺失；插入突变；基因内插入；倒位突变；染色体内倒位；连锁突变；连锁插入突变；反转重复突变；串联重复；染色体内串联重复；易位；染色体易位，非相互易位；重排；基因组重排；一个或多个内含子、或其片段的重排；重排的内含子；5'-或3'-UTR，与正常的健康组织或细胞相比在癌组织或癌细胞中对改变的氨基酸序列进行编码的改变的核苷酸序列、染色体易位、染色体内倒位、拷贝数变化、表达水平变化、蛋白质水平变化、蛋白质活性变化、或甲基化状态变化。
169.确定组织样品的表型谱的方法，其包括分析权利要求81的均质物的细胞结构。
170.权利要求169的方法，其中该细胞结构包括细胞簇、单个细胞、细胞碎片、细胞器、肽、核酸、脂质、代谢物、或其组合。
171.权利要求169的方法，其中该细胞结构包括单细胞或核，其中该单细胞或核是完整的。
172.权利要求169的方法，其中该分析包括对该细胞结构的数目、类型、状态、百分比、和/或表达的分析。
173.权利要求169的方法，其中该分析包括单细胞分析、单核分析、单细胞器分析、或其组合。
174.权利要求162的方法，其中细胞结构的该状态包括增殖、凋亡、坏死、迁移、上皮-间质转化(“EMT”)、有丝分裂、细胞周期停滞、S期、衰老、和/或分化。
175.权利要求169的方法，其中该分析包括对来自该均质物的标记物的分析。
176.权利要求175的方法，其中该标记物选自以下项的组：DNA、蛋白质、RNA、脂质、细胞器、代谢物、或细胞。
177.权利要求1755的方法，其中对该标记物的该分析包括对该标记物的检测。
178.权利要求175的方法，其中对该标记物的分析包括对来自单细胞或单核的标记物的分析。
179.储存权利要求1的均质物组合物的方法，其包括将该组合物与有效量的储存试剂混合。
180.权利要求179的方法，其中该储存试剂包括以下项中的一种或多种：防腐剂、离液剂、洗涤剂、还原剂、螯合剂、缓冲剂、或其组合。
181.权利要求179的方法，其中该混合的组合物保留该组合物在与该储存试剂混合之前的表型和基因型特征。
182.权利要求189的方法，其中该保存的混合的组合物包括变性蛋白质、失活核酸酶、失活蛋白酶、失活病原体、非降解核酸、或其组合。
183.权利要求180的方法，其中该离液剂包括硫氰酸胍、异氰酸胍、盐酸胍、或其组合。
184.权利要求180的方法，其中该洗涤剂包括十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸锂、牛磺脱氧胆酸钠、牛磺胆酸钠、甘氨胆酸钠、脱氧胆酸钠、胆酸钠、烷基苯磺酸钠、N-月桂酰肌氨酸、或其组合。
185.权利要求180的方法，其中该还原剂包括巯基乙醇、三(2-羧乙基)膦、二硫苏糖醇、二甲亚砜、三(2-羧乙基)膦、或其组合。
186.权利要求180的方法，其中该螯合剂包括乙二醇四乙酸、羟乙基乙二胺三乙酸、二乙烯三胺五乙酸、N,N-双(羧甲基)甘氨酸、乙二胺四乙酸、无水柠檬酸盐、柠檬酸钠、柠檬酸钙、柠檬酸铵、柠檬酸氢铵、柠檬酸、柠檬酸二铵、柠檬酸铁铵、柠檬酸锂、或其组合。
187.权利要求180的方法，其中该缓冲剂包括三(羟甲基)氨基甲烷、柠檬酸盐、2-(N-吗啉代)乙磺酸、N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸、1,3-双(三(羟甲基)甲基氨基)丙烷、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸、3-(N-吗啉)丙磺酸、碳酸氢盐、磷酸盐、或其组合。
188.一种用于制备包括异质细胞结构的组织样品的方法，其包括：
a)将该样品均质化；
b)将该均质化样品重构为均质物，所述均质物包括基本上同质的细胞结构，
其中该均质物的子集中的细胞结构的比率与该组织样品中的细胞结构的比率基本上相似或相同。
189.权利要求188的方法，其中该均质物包括多个单细胞或多个细胞簇。
190.权利要求188的方法，其进一步包括用固定剂固定该均质物。
191.权利要求190的方法，其中该固定剂包括福尔马林、钙、乙酸、盐水、醇、尿素、溴硝丙二醇、水、或其组合。
192.权利要求190的方法，其中该固定的均质物被安装到载玻片上。
193.权利要求108-112中任一项的方法，其进一步包括从该均质物提取成分。
194.权利要求193的方法，其中该成分是DNA、RNA、蛋白质、脂质、细胞器、外泌体、细胞、或其组合。
195.权利要求108-114中任一项的方法，其进一步包括从该均质物分离细胞结构或成分。
196.权利要求195的方法，其中该细胞结构或该成分包括单细胞或单核。
197.权利要求195的方法，其中该分离包括单细胞分离或单核分离。
198.权利要求197的方法，其中该单细胞分离是通过流式细胞术、激光显微切割、手动细胞挑取、随机接种和稀释、微流体装置、芯片实验室装置、或其组合进行。
199.权利要求197的方法，其中该单核分离是通过流式细胞术进行。
200.权利要求188的方法，其中该均质化包括化学解离和/或生化解离，和/或任选地机械均质化。
201.权利要求188的方法，其中该均质化不裂解该细胞。
202.权利要求200的方法，其中该样品的该化学处理包括该样品的酶促消化，所述酶促消化包括使用选自下组的酶，该组由以下各项组成：间质胶原酶、明胶酶-A、溶基质素1、基质溶解素、嗜中性粒细胞胶原酶、明胶酶-B、溶基质素2、溶基质素3、巨噬细胞金属弹性蛋白酶、胶原酶3、MT1-MMP、MT2-MMP、MT3-MMP、MT4-MMP、胶原酶4、釉质溶解素、X-MMP、CA-MMP、MT5-MMP、MT6-MMP、基质溶解素-2、MMP-22、内切蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、内切蛋白酶Asp-N、内切蛋白酶Arg-C、内切蛋白酶Glu-C(V8蛋白酶)、内切蛋白酶Lys-C、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K、枯草杆菌蛋白酶、梭菌蛋白酶、外肽酶、羧肽酶A、羧肽酶B、羧肽酶P、羧肽酶Y、组织蛋白酶C、酰基氨基酸释放酶、以及焦谷氨酸氨基肽酶。
203.权利要求200的方法，其中该机械均质化是通过选自下组的装置进行，该组由以下各项组成：共混器、榨汁器、解离器、提取器、研钵、杵、杜恩斯均质器、组织研磨器、旋转式刀片组织均质器、以及珠磨均质器。
204.权利要求188的方法，其中在该均质化之前或之后，将该样品用激素、蛋白质、酶、脂质、洗涤剂、超声处理、其组合进行处理。
205.权利要求200的方法，其中该均质化进一步包括细胞调节，所述细胞调节包括调整pH和/热量，或用细胞调节缓冲液处理该样品。
206.权利要求188的方法，其中该均质化样品包括细胞和/或细胞簇。
207.权利要求200的方法，其中该均质化样品包括均一尺寸的细胞簇。
208.权利要求200的方法，其中该均质化样品包括非均一尺寸的细胞簇。
209.权利要求120的方法，其中该细胞簇包括1-100个细胞、或100-1,000个细胞、1,
000-10,000个细胞、或10,000-100,000个细胞。
210.权利要求120的方法，其中该细胞簇包括超过100,000个细胞。
211.权利要求108的方法，其进一步包括使该均质化样品穿过网、过滤器、或者一系列网或过滤器。
212.权利要求211的方法，其中该网或过滤器具有范围为从约1微米至约500微米的孔径。
213.权利要求211的方法，其中该网或过滤器具有小于1微米的孔径。
214.权利要求211的方法，其中该网或过滤器具有范围为从约1微米至约100微米、从约
100微米至约200微米、从约200微米至约300微米、从约300微米至约400微米、或从约400微米至约500微米的孔径。
215.权利要求211的方法，其中该网或过滤器具有超过500微米的孔径。
216.权利要求188的方法，其中该组织样品来自如下组织，该组织选自以下项的组：肿瘤、淋巴结、转移瘤、息肉、囊肿、活检切片、整个器官、及其组合。
217.权利要求188的方法，其中该组织样品是固体样品或液体样品。
218.权利要求217的方法，其中该液体样品包括细胞学针抽吸物、渗出物样品、或巴氏涂片。
219.权利要求188的方法，其中该均质物的该细胞结构包括至少一个细胞。
220.权利要求188的方法，其中该均质物的该细胞结构包括至少100个细胞。
221.权利要求188的方法，其中该均质物的该细胞结构包括约100至约200个细胞、约
200至约1,000个细胞、约1,000至约5,000个细胞、或约10,000至约100,000个细胞，
222.权利要求108的方法，其中该均质物的该细胞结构包括约100,000至约1,000,000个细胞、约1,000,000至约5,000,000个细胞、约5,000,000至约1,000,000,000个细胞、或约
1,000,000,000至约5,000,000,000个细胞。
223.权利要求188的方法，其中该均质物的该细胞结构包括超过约5,000,000,000个细胞。
224.权利要求188的方法，其中该均质物未被保存或固定。
225.权利要求188的方法，其中该均质物包括活细胞。
226.权利要求188的方法，其中该均质物被保存或固定。
227.权利要求188的方法，其中该均质物被冷冻、冷冻干燥、或包埋在包埋介质中。
228.权利要求188的方法，其中该均质物包括来自一种或多种组织和/或一个或多个受试者的细胞。
229.权利要求188的方法，其中该组织样品是从肿瘤、淋巴结、转移瘤、息肉、囊肿、切除物、整个器官、或其组合中分离。
230.权利要求188的方法，其中该均质物进一步包括非人细胞、人细胞、非天然蛋白、核酸、或小分子。
231.权利要求230的方法，其中该小分子选自下组，该组由以下各项组成：半抗原、肽标签、蛋白质标签、荧光标签、核酸标签、及其组合。
232.权利要求188的方法，其进一步包括评估该均质物内该基本上同质的细胞结构。
233.权利要求232的方法，其中该基本上同质的细胞结构是通过测量该均质物内的内部对照的分布来评估。
234.权利要求233的方法，其中该内部对照选自下组，该组由以下各项组成：非人细胞、人细胞、非天然蛋白、核酸、小分子、染料、化学物质、及其组合。
235.权利要求234的方法，其中该小分子包括半抗原、肽标签、蛋白质标签、荧光标签、核酸标签、发光标签、生物素、及其组合。
236.权利要求188的方法，其进一步包括对该均质物的分析。
237.权利要求236的方法，其中该分析包括核酸分析、蛋白质分析、脂质分析、细胞分析、代谢物分析、基因组分析、转录组学分析、蛋白质组学分析、代谢组学分析、脂质组学分析、免疫学分析、细胞化学分析、基因型分析、表型分析、或其组合。
238.权利要求237的方法，其中该核酸分析包括DNA分析或RNA分析。
239.权利要求238的方法，其中该RNA分析包括微小RNA分析。
240.权利要求236的方法，其中该均质物的分析包括纯化核酸、蛋白质、细胞器、代谢物、化学物质、非细胞组分、或其组合。
241.权利要求236的方法，其中对该均质物的该分析包括将结合剂与该均质物的组分结合。
242.权利要求241的方法，其中该结合剂包括抗体、放射性标记、荧光色素、半抗原、酶、核酸、蛋白质、化学物质、引物、配体、细胞、肽、探针、荧光染料、非荧光染料、酶、生物素、或其组合。
243.权利要求241的方法，该均质物的组分包括核酸、蛋白质、细胞器、代谢物、化学物质、非细胞组分、或其组合。
244.权利要求236的方法，其中对该均质物的该分析进一步包括检测来自该结合剂或该组分的信号。
245.权利要求244的方法，其中该信号包括放射性信号或非放射性信号。
246.权利要求245的方法，其中该非放射性信号包括荧光信号、化学荧光信号、或发光信号。
247.权利要求236的方法，其中对均质物的该分析包括测序分析、组织学分析、或图像分析。
248.权利要求247的方法，其中该测序分析包括新一代测序分析、单细胞测序分析和/或单核测序。
249.权利要求247的方法，其中该组织学分析包括新一代组织学分析。
25-.权利要求247的方法，其中该图像分析包括新一代分析。
251.权利要求188的方法，其进一步包括检测或定量该均质物的组分，其中该组分包括细胞、核酸、蛋白质、细胞器、代谢物、化学物质、非细胞组分、或其组合。
252.权利要求251的方法，其中该细胞包括免疫细胞、肿瘤细胞、干细胞、祖细胞、血细胞、生殖细胞、以及体细胞。
253.权利要求236的方法，其中对该均质物的该分析包括对从该均质物反射的偏振光的分析。
254.权利要求236的方法，其中对该均质物的该分析包括对该均质物的声学特性、机械特性、或光学特性的分析。
255.权利要求236的方法，其中将该均质物用流式细胞术、苏木精和伊红染色、或免疫组织化学进行分析。
256.一种监测患者体内的疾病的方法，其包括对权利要求151的标记物的分析，其中该临床相关标记物是基于权利要求119的代表性数据来鉴定的。
257.权利要求256的方法，其中该标记物选自以下项的组：蛋白质、抗原、酶、激素、DNA、RNA、微小RNA、或碳水化合物。
258.权利要求256的方法，其中该标记物是从选自以下项的组的样品中分离的DNA或RNA：一种或多种恶变前或恶性细胞、来自实体瘤的细胞、软组织肿瘤或转移灶、来自手术边缘的组织或细胞、组织学正常组织、一种或多种循环肿瘤细胞(CTC)、正常邻近组织(NAT)、来自患肿瘤或处于患肿瘤风险的相同受试者的血液样品、或FFPE样品。
259.权利要求256的方法，其中该疾病是癌症。
260.一种用于制备权利要求1-38中任一项的均质物组合物以用于显微镜检查的方法，其包括将该均质物组合物或其部分包埋在可膨胀材料中。
262.权利要求260的方法，其进一步包括通过使该可膨胀材料膨胀来使该均质物组合物扩大。
262.权利要求260的方法，其中该包埋过程包括用包含该可膨胀材料的前体的组合物渗透该均质物并原位形成该可膨胀材料，并将该均质物组合物锚定到该可膨胀材料。
263.权利要求260的方法，其中该可膨胀材料由该可膨胀材料的前体形成，其中该前体包括可聚合材料、聚合引发剂、或交联剂。
264.权利要求263的方法，其中该可聚合材料是单体或寡聚物。
265.权利要求264的方法，其中该单体或该寡聚物包括经取代或未经取代的甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、乙烯醇、乙烯胺、烯丙胺、烯丙醇、或其二乙烯交联剂。
代表性诊断
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2016年11月4日提交的美国临时申请序列号62/418,146；于2016年6月24日提交的美国临时申请序列号62/354,622；于2016年1月15日提交的美国临时申请序列号62/279,405以及于2015年11月6日提交的美国临时申请序列号62/252,153的申请日的权益，将它们的公开内容通过引用以其全文特此并入。
技术领域
[0003] 本公开文本总体上涉及开发一种用于生成代表性组织样品(例如，整个器官、肿瘤、淋巴结、转移瘤或其组合)以解决临床样品(尤其用于临床肿瘤学中的样品)中组织异质性问题的方法。更具体地说，本公开文本涉及将机械、化学和/或生化(例如酶促)解离方法应用于完整的经固定的(或经保存的)组织样品(例如，整个器官、肿瘤、淋巴结、发生病灶转移的组织或任何前述项的组合)，以建立提供获得正确代表性样品的能力的同质样品，这样尽管该组织(例如，肿瘤)内存在空间异质性，但增加了较小亚克隆群体和/或低流行率事件的检测可能性。代表性组织样品(例如，肿瘤样品)适用于各种诊断测定。具体地，这些代表性肿瘤样品及其部分可用在评估癌症预后(例如，肿瘤分期)的测定方法中以及适当治疗方案的选择和设计中。代表性组织样品，例如肿瘤样品及其部分，可以用作治疗剂或用以生成治疗剂，例如用作疫苗或在制造癌症疫苗中或基于免疫细胞的疗法中使用，因为该代表性样品含有由一种或多种给定肿瘤表达的各种各样的抗原。
背景技术
[0004] 用于肿瘤内科中所有诊断测试的肿瘤采样技术植根于19世纪后期解剖病理学和肿瘤外科的共同演化。在1842年发现基于醚的麻醉和在1867年发明消毒手术技术之前，病理学样品通常是从尸体解剖获取。在手术技术的这两项重大进展之前，由病理学家获得的组织样品通常来自因休克或此后不久因感染而在手术台上死亡的患者。因此，手术的高死亡率使得病理学家不能将肿瘤结构的解剖学和显微表征与患者存活统计关联起来。麻醉和消毒技术的影响使手术存活患者的数量立即剧增，并导致复杂手术程序的数量大幅增加。
[0005] 手术室中的上述进展与1869年石蜡包埋组织的出现以及1893年开始的福尔马林固定的广泛应用相吻合。有了这两项创新，解剖病理学家具有了对组织架构和显微形态的前所未有的明晰。在20世纪初期开始，就有了将组织架构和形态学的不同模式与特定肿瘤类型联系起来的见解。随着时间的推移，解剖病理学家和外科肿瘤学家能够将相同肿瘤类型中的这些特定解剖学和显微特征与总体存活率的差异联系起来。在20世纪50年代初期，肿瘤的组织学特征与患者预后之间的相关性最终被编入TNM分期系统。
[0006] TNM分期系统旨在通过评价肿瘤的形态学方面(T)、肿瘤细胞扩散到区域淋巴结的程度(N)以及肿瘤是否已经转移到远处器官(M)来确定癌症患者的预后。TNM分期分析的“T”部分所需的信息要求在肿瘤和周围正常组织的界面处取少量(典型地3-5个)极小的肿瘤样品。样品应该是一致的尺寸(约20 x 20 x 3毫米)，以使得能够进行适当的福尔马林固定和石蜡包埋。将福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)样品的四微米切片用切片机切下并置于载玻片上，由病理学家检查。大多数病理学实验室将具有能够进行肿瘤的TNM分期的基本仪器：塑料组织盒、福尔马林固定缓冲液、用以进行脱水并将组织包埋于石蜡中的组织加工器、用以切割薄切片(通常为4微米厚)的切片机和上面放置组织切片的载玻片。
[0007] TNM分期系统在1987年成为国际公认的癌症分期方法，并且现在由美国癌症联合委员会(AJCC)和国际抗癌联盟(UICC)管理。AJCC和UICC以及美国病理学家协会(CAP)审查并定期更新全球TNM分期标准指南。作为到TNM量规中的输入的组织学和解剖学特征取决于外科病理学家获取全球一致的组织样品。因此，基于19世纪后期开发的技术和方法，在肿瘤内科中已经固定了TNM分期系统所需的采样技术。
[0008] 获得用于TNM肿瘤分期的“正确”组织样品是外科病理学的主要目标，多个教材描述并说明外科病理学家如何解决手术样品的事实证明了这一点。通常，采取的切片最能展现大体检查中看到的特征。这些教材中的许多阐述了来自公认的医疗机构的AJCC、UICC和CAP批准的程序，并且含有详细描述待采样的肿瘤的确切部分的图示(参见图1A-1C)。这些教材的目标是培训全世界的外科病理学家以一致和可重复的方式取得切除的实体瘤的特定区域，以避免随机采样。参见例如Surgical Pathology Dissection:An Illustrated Guide，第二版第29页陈述：“The key to an approach that is both economical and thorough is selective sampling.Selective sampling is a strategic approach which attempts to maximize the information that can be obtained from a given tissue section.As opposed to random and indiscriminant sampling of a specimen,tissue sampling that is selective increases the information that can be obtained histologically,and it requires fewer sections to do so[既经济又透彻的途径的关键是选择性采样。选择性采样是试图使可以从给定组织切片获得的信息最大化的战略途径。与对样本的随机无区分采样相反，选择性的组织采样增加了可以在组织学上获得的信息并且需要更少的切片实现此目的]”。这些参考文献规定，实体瘤的特定区域应以一致且可重复的方式收集以辅助TNM分期。通常，所有诊断测试都使用最高等级的切片，并且剩余的样品将被丢弃。
[0009] 在从肿瘤采样的增加中不能获得进一步的信息时，外科病理学家被教导避免增加从手术样本取得的样品总数。不存在这样的认知，即在未采样的残余肿瘤内可获得更多的诊断信息。
[0010] 肿瘤向局部引流淋巴结的转移是预后的重要指标(即预后TNM分期系统的“N”)。区域淋巴结内肿瘤细胞的存在可能是关于患者是否接受辅助化疗的决定性因素。常规地，在手术移除和显微镜检查FFPE组织的单个薄切片后，在淋巴结中检测到肿瘤细胞。淋巴结转移性生长可以填充整个器官，或可以是微观的，只含少量癌细胞。可能会漏掉淋巴结中小的转移性生长，因为只检查切除的淋巴结的单个薄切片是否存在转移性肿瘤。基于淋巴结上的尺寸，单个FFPE组织切片可能只含有切除淋巴节总体积的零点几个百分点。在未采样的淋巴结区域中生长的转移性肿瘤不会被鉴定，从而导致假阴性分析。这可能导致患者接受不太积极的治疗方案，而不是患有局部晚期癌症(即淋巴结转移瘤，N阳性)的个体所需的治疗方案。
[0011] 在从切除的肿瘤材料中切除肿瘤样品后，由病理科完成病例报告并提交给肿瘤学家，并计算TNM分期。然后根据1996年健康保险流通与责任法案(HIPAA)的要求，通常通过焚烧破坏含有未用于TNM分期的残余肿瘤组织的剩余手术材料。然而，CAP建议将所有石蜡块和切割的载玻片保持10年。存在全球性系统，其中所有衍生自实体瘤的诊断信息都基于肿瘤本身的少数部分。参见例如De Petris,Proteome Science,8:9(2010)(“De Petris”)。在De Petris中，只对“[t]he biopsy from a region representative of the tumor(来自肿瘤代表性区域的活检)”进行了进一步检查，溶血和非固定要求使样品不适合随访组织学研究。
[0012] 肿瘤异质性的发现与有关肿瘤发展的常规理论相反。在20世纪50年代，普遍认为最终的临床可检测肿瘤是顺序选择肿瘤“干系”的特定亚群的产物。在这个理论中，肿瘤的大部分是由单个“干系”主导，由于自然选择，其优于其他“干系”。TNM分期系统是在与肿瘤“干系”概念相同的时期期间开发的，其中大部分肿瘤将由单一“类型”肿瘤组成。参见Peter Nowel,Science(1976)194:23-28。
[0013] 在组成上，实体瘤实际上是异质的而不是均一的。据报道，一些实体瘤由多个遗传学上不同的、空间上分离的癌细胞群组成。参见Gerlinger et al.,NEJM(2012)366:883-92；以及Yachida et al.nature(2010)467(7319):1114-1117。如本文进一步描述的，诸位发明人已经显示用于肿瘤组织学分析的常规采样方法提供了不适当的肿瘤样品(或潜在含有癌细胞的组织，如淋巴结)，并且可以对此进行改进。
[0014] 在现代病理学的指导下，医生和科学家正常不会将任何有意义的医学价值归于剩余的肿瘤组织，一旦已取得样品用于TNM分期系统，剩余的肿瘤组织将因此被破坏。组织切片的基于形态学和生物标记物的分析也受到肿瘤内或肿瘤间恶性群体展示出的表型、形态学和遗传异质性的限制。小肿瘤细胞群体可包括恶性肿瘤和转移瘤的主要来源，并且构成全肿瘤的基因组成的微不足道的量。因此，针对大块肿瘤发展的生物标记物可能无法捕获到通常由小部分肿瘤引起的癌症死亡率的重要原因。
[0015] 给定肿瘤内的异质基因组成对利用从少数肿瘤(假定肿瘤由组成上均一的细胞构成)中取得的信息的诊断肿瘤学中的治疗决策提出了重大挑战。例如，样品内遗传亚型的空间位置对临床结果有很大影响。传统的常规组织切片程序，即使基于公认文献指导的选择性采样，也无法对整个手术样本进行采样。此外，当前采样程序只能测试少数肿瘤，由此绝大多数肿瘤未以任何方式被检测到，并最终被破坏。
[0016] 根据AJCC、UICC和CAP批准的程序，病理学家将仅使用手术切除的组织样本的小部分并丢弃剩余的样品。由于肿瘤样品可能存在多个遗传上和空间上不同的肿瘤细胞群，即使是最有经验的病理学家所取得的3到5个小样品也不能代表整个样本中恶性肿瘤或转移瘤的所有遗传上多样化组。此外，任何基因组上不同的癌细胞群的位置都不能事先知道，因为肿瘤细胞的DNA序列在大体检查时不明显。事实上，正是丢弃的残留肿瘤材料含有原发性肿瘤内的所有细胞、基因组和蛋白质组异质性的绝大多数，但没有时间和成本有效的方法学或仪器实现对全肿瘤采样。
[0017] 当前的病理学实践需要针对整个肿瘤的更彻底的采样和加工方法，这有助于确保整个原发性肿瘤内的细胞、基因组和蛋白质组异质性被捕获到诊断样品中。
发明内容
[0018] 本公开文本提供了一种由包括基本上均匀分布的细胞结构的异质组织样品衍生的加工均质物组合物，其中该均质物的每个子集中的细胞结构的比率基本上与原始异质组织样品中的细胞结构的比率相似。均质物组合物是新的独特的组织样品，其代表了原始异质组织样品的关键特征。所公开的组合物解决并克服了现有技术方法未能解释临床样品(尤其用于临床肿瘤学中的样品)中的组织异质性的局限性。
[0019] 均质物组合物衍生自或来源于各种组织、器官或其样品，例如淋巴结、转移瘤、息肉、囊肿、切除物、器官或其部分，或者空间上分离的细胞。在一个方面，该均质物包括该组织样品的细胞结构的约25％至约100％。该均质物可包括存在于用于衍生其均质物的起始组织(例如全肿瘤、淋巴结或转移瘤)中的蛋白质级分、脂质、核酸或其他部分，其中此类替代品组分的相对比例代表该起始组织。基本上同质的细胞结构可以包括从正常或异常组织分离的单细胞或多个细胞簇。在某些方面，该均质物可包括液体或非液体组织样品，其通过多种方法获得，如细胞学针抽吸物、渗出物样品或巴氏涂片。
[0020] 在其他方面，该均质物可以从保存的组织中分离，例如福尔马林固定的组织。在其他方面，该组织样品未被保存或固定，和/或包括活细胞。该异质组织样品可以从自一个或多个患者获得的一种或多种组织中分离。
[0021] 该均质物适用于各种诊断、预后和临床应用，包括但不限于生成代表性数据，包括代表性肿瘤学数据、癌症分期、疾病预后的鉴定和评估(例如，肿瘤分期)、适当的治疗方案的选择和设计、临床试验匹配、标记物鉴定和表征、组织谱分析以及该均质物组合物的储存。该均质物组合物还可用于在治疗患者时筛选治疗剂或生成治疗剂，例如作为疫苗或在制造癌症疫苗中或基于免疫细胞的疗法中使用，因为该代表性样品含有由一种或多种给定肿瘤表达的各种各样的抗原。
[0022] 本公开文本还提供了用于生成代表异质组织样品的均质物组合物(例如，代表性样品)的方法。更具体地说，本公开文本包括将机械、化学和/或生化(例如酶促)解离方法应用于含有完整组织的样品(例如，整个器官、肿瘤、淋巴结、发生病灶转移的组织或任何前述项的组合(来自相同或不同患者))，以提供正确代表性样品，这样尽管该原始组织或器官(例如，肿瘤)内存在空间异质性，但增加了较小亚克隆群体和/或低流行率事件的检测可能性。
[0023] 在一个方面，本公开文本总体上涉及开发用于生成代表性组织样品(例如，整个器官、肿瘤、淋巴结、转移瘤或其组合)以解决异质性问题(例如，临床样本(尤其用于临床肿瘤学中的临床样本)中的肿瘤异质性)的方法，并且涉及这些代表性样品或其部分在各种诊断和治疗方法中的用途以及用于诊断和治疗(尤其肿瘤学)的包括此类代表性样品的组合物。
[0024] 此外，来自不同患者或者来自单个或不同患者的不同组织的代表性样品可以各自用独特鉴定标记(例如，半抗原)标记，并将不同患者或组织的标记样品组合并用于希望的测定方法中。
[0025] 不管肿瘤组织类型、位置、尺寸或体积如何，由本公开文本的示例性实施方案衍生的代表性样品可用于改进不同肿瘤类型的检测、诊断和/或分期的准确性。目前公开的方法可用于从正常组织或推定癌前组织(例如，从由于遗传风险或既往癌症而处于较高癌症发展风险的受试者获得)中产生代表性样品以鉴定罕见细胞。
[0026] 在一个方面，本公开文本提供了用于产生如下生物样品的方法，该生物样品适于评估肿瘤、淋巴结或转移瘤内细胞的异质性和/或评估受试者中特定癌症状况的预后和/或确定针对具有癌症状况的受试者的适当治疗方案。此方法包括(i)获得如下组织(如肿瘤样品或淋巴结或转移瘤)，其包括该组织的空间不同区域或包括全肿瘤或其很大部分，并且(ii)使该组织均质化，使得细胞的异质性基本上均匀地分布在所得均质物或者其部分或级分内。在将整个或基本上整个肿瘤、淋巴结、转移瘤、或甚至整个器官(如肾)均质化之前或之后，可将该一个或多个样品任选地固定和/或保存，例如福尔马林固定、乙醇固定、冷冻或冷冻干燥、储存在蜡(如石蜡)中等。
[0027] 在另一个方面，本公开文本提供了用于产生如下生物样品的方法，该生物样品适于评估样品(如肿瘤样品、淋巴结、转移瘤或其组合)内细胞的异质性和/或评估受试者中特定癌症状况的预后，其包括：(i)从实体瘤或淋巴结获得一个或多个完整样品，优选地其中每个完整样品包括至少约100至200、200至1,000、1,000至5,000、10,000至100,000、100,000至1,000,000、1,000,000至5,000,000、5,000,000至1,000,000,000、1,000,000,000至
5,000,000,0000或更多个细胞，或者可替代地至少1,000、10,000、100,000、1,000,000、5,
000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000、1,000,000,000、5,000,
000,000、10,000,000,000、50,000,000,000、100,000,000,000、500,000,000,000、1,000,
000,000,000、5,000,000,000,000、10,000,000,000,000、50,000,000,000,000、100,000,
000,000,000或更多个细胞，并且任选地将其固定或保存(如福尔马林、石蜡或乙醇固定的或保存的样品)，并且(ii)分别或组合地将该一个或多个样品均质化，其中该一种或多种均质物各自基本上均匀地表示相应的一个或多个样品的异质性。在一个实施方案中，来自实体瘤或淋巴结的一个或多个完整样品包括该实体瘤或该淋巴结的部分，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在另一个实施方案中，来自实体瘤或淋巴结的一个或多个完整样品包括该实体瘤或该淋巴结的很大部分，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在另一个实施方案中，来自实体瘤或淋巴结的一个或多个完整样品包括整个实体瘤或整个淋巴结，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。
5,000,000,0000或更多个细胞，或者可替代地至少1,000、10,000、100,000、1,000,000、5,
000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000、1,000,000,000、5,000,
000,000、10,000,000,000、50,000,000,000、100,000,000,000、500,000,000,000、1,000,
000,000,000、5,000,000,000,000、10,000,000,000,000、50,000,000,000,000、100,000,
000,000,000或更多个细胞，并且任选地将其固定或保存(如福尔马林、石蜡或乙醇固定的或保存的样品)，并且(ii)分别或组合地将该一个或多个样品均质化，其中该一种或多种均质物各自基本上均匀地表示相应的一个或多个样品的异质性。在一个实施方案中，来自实体瘤或淋巴结的一个或多个完整样品包括该实体瘤或该淋巴结的部分，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在另一个实施方案中，来自实体瘤或淋巴结的一个或多个完整样品包括该实体瘤或该淋巴结的很大部分，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在另一个实施方案中，来自实体瘤或淋巴结的一个或多个完整样品包括整个实体瘤或整个淋巴结，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。
[0028] 任选地可以将该代表性样品进一步解离和/或处理以去除或分离特定类型的分子，如特定细胞类型、蛋白质、核酸或脂质等，并且使用例如对Illumina测序输出的CAVA计算分析用于诊断和治疗方法中。
[0029] 在又另一个方面，本公开文本提供了用于产生如下生物样品的方法，该生物样品适于评估肿瘤或淋巴结或转移瘤或其组合内细胞的异质性，其包括(i)从实体瘤或淋巴结或转移瘤获得一个或多个活检样品，优选地其中每个活检样品包括至少约100-200、200-1,000、1,000-5,000、10,000-100,000、100,000-1,000,000、1,000,000-5,000,000、5,000,
000-1,000,000,000、1,000,000,000-5,000,000,0000或者可替代地至少1,000、10,000、
100,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000、1,
000,000,000、5,000,000,000、10,000,000,000、50,000,000,000、100,000,000,000、500,
000,000,000、1,000,000,000,000、5,000,000,000,000、10,000,000,000,000、50,000,
000,000,000、100,000,000,000,000或更多个细胞，并且任选地将其固定或保存(如福尔马林、石蜡或乙醇固定的或保存的样品)，并且(ii)分别或组合地将该一个或多个活检样品均质化，条件是其中所得的一种或多种均质物基本被解离成单个细胞，并且所得的一种或多种均质物基本上是同质的。
000-1,000,000,000、1,000,000,000-5,000,000,0000或者可替代地至少1,000、10,000、
100,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000、1,
000,000,000、5,000,000,000、10,000,000,000、50,000,000,000、100,000,000,000、500,
000,000,000、1,000,000,000,000、5,000,000,000,000、10,000,000,000,000、50,000,
000,000,000、100,000,000,000,000或更多个细胞，并且任选地将其固定或保存(如福尔马林、石蜡或乙醇固定的或保存的样品)，并且(ii)分别或组合地将该一个或多个活检样品均质化，条件是其中所得的一种或多种均质物基本被解离成单个细胞，并且所得的一种或多种均质物基本上是同质的。
[0030] 在另一个方面，本公开文本提供了用于产生如下生物样品的方法，该生物样品适于评估受试者是否具有特定癌症的毒性形式或处于发展特定癌症的毒性形式的风险下和/或是否具有毒性形式癌症，其包括(i)从实体瘤或淋巴结或转移瘤或癌前囊肿获得一个或多个完整活检样品，优选地其中每个活检样品包括至少约100-200、200-1,000、1,000-5,000、10,000-100,000、100,000-1,000,000、1,000,000-5,000,000、5,000,000-1,000,000,
000、1,000,000,000-5,000,000,0000或更多个细胞，或者可替代地至少1,000、10,000、
100,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000、1,
000,000,000、5,000,000,000、10,000,000,000、50,000,000,000、100,000,000,000、500,
000,000,000、1,000,000,000,000、5,000,000,000,000、10,000,000,000,000、50,000,
000,000,000、100,000,000,000,000或更多个细胞，并且任选地将其固定或保存(如福尔马林、石蜡或乙醇固定的或保存的样品)，并且(ii)分别或组合地将该一个或多个活检样品均质化，其中所得的一种或多种均质物各自基本上均匀地含有相应的一个或多个活检样品的异质性，并且任选地分离至少一种生物标记物或检测该至少一种生物标记物的存在。在此方面，该生物标记物的存在或不存在指示毒性形式的癌症，或者可替代地该生物标记物的上调或下调与特定癌症的毒性形式相关。
000、1,000,000,000-5,000,000,0000或更多个细胞，或者可替代地至少1,000、10,000、
100,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000、1,
000,000,000、5,000,000,000、10,000,000,000、50,000,000,000、100,000,000,000、500,
000,000,000、1,000,000,000,000、5,000,000,000,000、10,000,000,000,000、50,000,
000,000,000、100,000,000,000,000或更多个细胞，并且任选地将其固定或保存(如福尔马林、石蜡或乙醇固定的或保存的样品)，并且(ii)分别或组合地将该一个或多个活检样品均质化，其中所得的一种或多种均质物各自基本上均匀地含有相应的一个或多个活检样品的异质性，并且任选地分离至少一种生物标记物或检测该至少一种生物标记物的存在。在此方面，该生物标记物的存在或不存在指示毒性形式的癌症，或者可替代地该生物标记物的上调或下调与特定癌症的毒性形式相关。
[0031] 在又另一个方面，本公开文本提供了用于表征异质肿瘤、淋巴结或转移瘤或癌前囊肿内的景观和/或检测异质肿瘤淋巴结或转移瘤或癌前囊肿内遗传上不同的亚克隆和/或鉴定肿瘤淋巴结或转移瘤或癌前囊肿内的低流行率事件和/或确定肿瘤淋巴结或转移瘤或癌前囊肿内靶标的流行率的方法，其包括(i)获得涵盖肿瘤淋巴结或转移瘤或癌前囊肿的空间不同区域的一个或多个肿瘤淋巴结或转移瘤或癌前囊肿样品，在均质化前任选地将其用例如福尔马林、石蜡和/或乙醇固定或保存，并且(ii)将该一个或多个肿瘤淋巴结或转移瘤或癌前囊肿样品分别均质化，从而产生代表肿瘤、淋巴结、转移瘤或癌前囊肿内的异质性的景观的一组均质物，并且该均质物适合于表征肿瘤的景观和/或检测异质肿瘤淋巴结或转移瘤或癌前囊肿内遗传上不同的亚克隆和/或鉴定肿瘤或淋巴结或转移瘤或癌前囊肿内的低流行率事件和/或确定肿瘤淋巴结或转移瘤或癌前囊肿内靶标的流行率。这些景观涉及基因组多样性(例如肿瘤内点突变、插入和缺失的数目)，肿瘤表型的多样性(例如已经历上皮细胞向间充质细胞转变的肿瘤的量)，宿主免疫应答的多样性(例如肿瘤和免疫细胞中免疫检查点调节物表达的多样性)，所有潜在抗性机制的多样性(例如赋予对靶向疗法的抗性的肿瘤突变的数目和多样性)，组织的组织学的多样性(例如肺癌中作为鳞状细胞癌与腺癌的肿瘤的量)，肿瘤表达的新抗原的多样性，和/或跨越从受试者切除的所有受累及的或可能受累及的组织的其他复杂表型、形态学、组织学、基因组学、蛋白质组学、代谢组学景观。
[0032] 在又另一个方面，本公开文本提供了用于检测患者(例如，由于基因突变或既往癌症而处于发展癌症的风险下的患者或具有癌前囊肿或息肉的患者)的假定正常组织或推定癌前组织中的癌前细胞或癌性细胞的方法，其包括(i)获得一个或多个假定正常组织或推定癌前组织(如癌前囊肿或息肉)样品，其涵盖患者的假定正常组织或推定癌前组织的空间不同区域，在均质化之前任选地将其固定或保存，并且(ii)将该一个或多个样品均质化，从而产生代表假定正常组织或推定癌前组织的均质物，并且该均质物适于例如甚至在患者中表现出任何疾病迹象之前检测罕见癌性细胞或癌症干细胞。
[0033] 在另一个方面，本公开文本提供了使用由处于不同测定形式的任何上述方法产生的代表性样品及其部分的方法，其中这些测定可以高通量实现，同时或在不同时间或不同位置进行，和/或通过自动化(全自动或半自动)进行。
[0034] 在另一个方面，本公开文本提供了通过任何前述方法产生的代表性样品或其部分，将该代表性样品或其部分进行储存供将来使用，此类的非限制性例子包括例如冷冻、福尔马林固定、石蜡包埋、用乙醇加工、或冻干。
[0035] 在另一个方面，本公开文本提供了由任何上述方法产生的代表性样品或其部分，用于从患者样品中的癌细胞或细胞类型衍生(并任选纯化)对特定抗原为特异性的抗体或抗原，该抗体或抗原潜在地可用于个性化医学中，即用于治疗性或预防性癌症疫苗的生产中。
[0036] 在所有上述方法中的均质化步骤可以通过保留样品内细胞完整性的方法实现，即一个或多个均质化样品中的大部分细胞不被裂解，并且由此得到的均质物及其部分是该一个或多个样品的“代表”。因此，该样品或其部分内的细胞反映了该一个或多个组织样品(例如，实体瘤或淋巴结)整体内不同细胞类型的百分比。这可以通过例如肿瘤样品或其部分的机械解离(如在添加或不添加液体的情况下对该肿瘤样品或其部分进行的机械解离)和/或肿瘤样品或其部分的化学或酶促解离(与膜相关蛋白相比，如用选择性地或优先或主要作用于细胞外基质蛋白的酶进行处理)完成。可替代地，该均质化方法可导致细胞解离，同时仍生成代表起始组织(如全肿瘤)的样品。任选地可以将该均质化代表性样品进一步解离和/或处理以去除或分离特定类型的分子，如特定细胞类型、蛋白质、核酸或脂质等，从而生成可用于诊断和治疗方法中的其他代表性样品。
[0037] 任何上述方法可包括检测均质物或者其部分或级分中的至少一种生物标记物(例如，至少一种脂质、蛋白质或核酸生物标记物)的表达。另外，该方法可以进一步包括检测该均质物或者其部分或级分中的表达特定生物标记物或生物标记物组合的肿瘤细胞的百分比。任选地，将该均质物或者其部分或级分中的肿瘤干细胞和/或相对频率或百分比的肿瘤亚克隆进行检测和/或分离。另外，该方法还可以包括检测遗传靶标(如点突变、缺失、插入、易位、基因融合或基因扩增)。
[0038] 任何上述方法还可以用于检测、分离和/或定量存在于该均质物或者其部分或级分中的特定免疫细胞(如B淋巴细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞、NK细胞、单核细胞或其组合)，其提供有价值的临床信息，例如免疫状态和疾病状态，并且还便于选择合适的治疗方案，如检查点抑制剂、细胞因子或其他免疫调节剂。
[0039] 所得均质物或代表性样品可以包括约100至200、200至1,000、1,000至5,000、10,000至100,000、100,000至1,000,000、1,000,000至5,000,000、5,000,000至1,000,000,
000、1,000,000,000至5,000,000,0000个细胞或者可替代地至少1,000、10,000、100,000、
1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000、1,000,000,
000、5,000,000,000、10,000,000,000、50,000,000,000、100,000,000,000、500,000,000,
000、1,000,000,000,000、5,000,000,000,000、10,000,000,000,000、50,000,000,000,
000、100,000,000,000,000或更多个细胞，基本上由其组成，或又进一步由其组成。
000、1,000,000,000至5,000,000,0000个细胞或者可替代地至少1,000、10,000、100,000、
1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000、1,000,000,
000、5,000,000,000、10,000,000,000、50,000,000,000、100,000,000,000、500,000,000,
000、1,000,000,000,000、5,000,000,000,000、10,000,000,000,000、50,000,000,000,
000、100,000,000,000,000或更多个细胞，基本上由其组成，或又进一步由其组成。
[0040] 将所得均质物或者其级分或部分任选地冷冻或冷冻干燥，包埋在蜡(如石蜡)中，或者可替代地不经此类冷冻或冷冻干燥或蜡而用于进一步的步骤中。例如，代表性的石蜡块(即由包埋在石蜡中的均质物或者其级分或部分产生的)适合用于当前的解剖病理学工作流程，例如切片、制备载玻片、染色、显微镜检查、抗原修复等。
[0041] 该均质物可以衍生自在相同或不同时间点取自一个或多个受试者(例如，在处理之前或之后的相同受试者或在彼此相同或不同的处理之前和之后的多个受试者)的两个或更多个肿瘤，并且将每个肿瘤的所得均质物或其级分用于评估不同患者的两种或更多种肿瘤或疾病状况的相似性和/或差异。在另一个方面，出于多个受试者代表性样品的目的，可以将来自一个或多个受试者的均质物进行组合。
[0042] 该均质物可以衍生自两个或更多个推定正常或癌前组织，例如从一个受试者或多个受试者(例如具有BRCA突变的受试者)获得的乳房、子宫颈、结肠直肠或癌前囊肿或息肉，并且将所得均质物或其级分用于评估是否存在任何异常细胞或疾病生物标记物。
[0043] 另外，可以将非人类细胞(如昆虫细胞和/或小鼠细胞)或其他外来蛋白质、核酸或小分子添加到该均质物中以产生阳性蛋白质或核酸检测的内部对照。
[0044] 可将小分子(如半抗原、肽标签、蛋白质标签、荧光标签和/或核酸标签)添加到该样品中，并用于提供该代表性样品中的空间信息。例如，可以将样品(如肿瘤或淋巴结)切片，例如切成四分体，并且可以在将这些切片均质化之前将不同的半抗原(或其他合适的小分子)“掺杂”进每个切片以生成代表性样品。应该理解，可以从每个样品生成的用于在均质化之前“掺杂”的切片的数目不受限制，而是可能与样品的尺寸成比例地选择，即该样品越大，在均质化之前可以用小分子“标签化”的切片的数目越多。以这种方式，在所得均质物或其级分中可以保持空间信息。
[0045] 在一个实施方案中，还可以在将该样品与来自另一患者或相同患者的不同样品组合之前将小分子添加至该样品中，并因此提供了以多路复用测定形式运行时区分样品的手段。
[0046] 可以将经均质化的样品进行保存，例如福尔马林固定，或者可以在均质化之前或之后用乙醇处理。由于安全性考虑，在大多数诊断方法中使用之前，在病理实验室中使用Illumina测序输出进行的CAZA计算分析中，加工之前组织样品通常是福尔马林固定或以其他方式固定的。福尔马林或其他固定方法可以通过本领域通常已知的技术来完成。在这种情况下，在步骤(ii)中均质化之前，可以将福尔马林固定的肿瘤样品浸泡在水或缓冲盐溶液(如PBS)中。
[0047] 可替代地或另外，在均质化之前，可以将用于所公开的方法中的肿瘤样品保存在乙醇中。然而福尔马林固定、甲醇固定或乙醇固定或者其他保存程序对主题方法不是必需的，并且可以在不损害所得均质化代表性样品的适用性的情况下消除。
[0048] 可以利用未固定组织的均质化来产生具有代表性的活体样品。可以培养活的代表性样品以建立来自个体患者的代表性组织培养样品。这种代表性样品可以多次分裂以建立多个代表性培养物样品，其可以用于确定化疗(如抗体、核酸、小分子或多肽，其拮抗、抑制或阻断至少一种已知或未知生物标记物的表达或功能活性)的效力。此外，可以使用FACS分析来选择特定细胞类型(如免疫细胞或肿瘤细胞)。例如，可以选择和培养肿瘤浸润的免疫细胞以确定免疫系统分泌的肿瘤特异性抗体。
[0049] 此外，如本文所示，所公开的用于产生代表性样品的方法及其在诊断和治疗方法中的用途适于固定和未固定的组织样品。
[0050] 用于制备代表性样品的任何公开方法可以包括在均质化之前、期间或之后添加至少一种胶原酶(或其他合适的酶或酶组合或其他化学物质，如本身分解或促进分解细胞外基质的盐)；使用升高的温度和/或缓冲液条件(如破坏细胞交联的细胞调节缓冲液，例如CC1或CC2)；和/或使用机械剪切装置(如IKA共混器、gentleMACs解离器或功能等效物)。再次，这些方法可以或可以不在维持样品内细胞的存活力和完整性的条件下实现，例如在细胞基本上不被裂解的一些均质化条件下。
[0051] 在一个方面，均质化过程包括使用机械过程，此类的非限制性例子包括研钵&杵、杜恩斯均质器或组织研磨器、手持式电子旋转刀片组织均质器(如可从托马斯科技公司(Thomas Scientific)获得的Omni-TH)、珠磨均质器(如子弹共混器或Burton Precellys 24组织均质器或可从OMNI获得的Bead Ruptor)，任选地对于旋转均质器在约100和约75,
000RPM之间的速度或对于珠磨器在约0.5m/s至约2.5m/s的速度，并且持续约30秒到约5分钟、约5分钟至约10分钟、约10分钟至约30分钟或约30分钟至约60分钟的长度。如本文所指出，机械均质化过程可以单独使用或与其他过程组合使用。
000RPM之间的速度或对于珠磨器在约0.5m/s至约2.5m/s的速度，并且持续约30秒到约5分钟、约5分钟至约10分钟、约10分钟至约30分钟或约30分钟至约60分钟的长度。如本文所指出，机械均质化过程可以单独使用或与其他过程组合使用。
[0052] 在另一个实施方案中，均质化包括(单独或与其他过程组合)使用酶制剂，此类的非限制性例子包括例如间质胶原酶、明胶酶-A、溶基质素1、基质溶解素、嗜中性粒细胞胶原酶、明胶酶-B、溶基质素2、溶基质素3、巨噬细胞金属弹性蛋白酶、胶原酶3、MT1-MMP、MT2-MMP、MT3-MMP、MT4-MMP、胶原酶4、釉质溶解素、X-MMP、CA-MMP、MT5-MMP、MT6-MMP、基质溶解素-2、MMP-22、内切蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、内切蛋白酶Asp-N、内切蛋白酶Arg-C、内切蛋白酶Glu-C(V8蛋白酶)、内切蛋白酶Lys-C、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K、枯草杆菌蛋白酶、梭菌蛋白酶、外肽酶、羧肽酶A、羧肽酶B、羧肽酶P、羧肽酶Y、组织蛋白酶C、酰基氨基酸释放酶、焦谷氨酸氨基肽酶或其任何组合，任选地在约0.001μg/ml至约1000mg/ml的浓度，并且持续约1分钟至约120分钟的长度。
[0053] 涵盖肿瘤或其他组织的空间不同区域的公开方法中使用的肿瘤或其他样品可以包括从患者手术移除的肿瘤或组织样品的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、至少85％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或优选地整体。肿瘤样品的直径可以为至少1、5、10、20、50、100或更多毫米(mm)或厘米(cm)。
[0054] 用于主题方法中的样品通常衍生自任何适当的组织样品，例如实体瘤或肿瘤(包括原发性肿瘤和转移性肿瘤)、淋巴结、转移瘤或癌前组织(如囊肿或息肉)。可替代地或另外，该方法对于非实体瘤(例如血癌)也可以是有效的。例如，任选地可以将经均质化的组织样品或实体瘤样品与患者液体样品(例如，来自患者的血液、淋巴液、渗出物样品、脑脊液、胆汁、粘液和/或尿液样品)组合。经均质化的样品可另外或可替代地包括全部或部分样品，例如活检的“正常”或癌前组织，例如为了在疾病表现之前检测病变细胞。
[0055] 在所公开的方法中使用的此类肿瘤或其他组织样品可以衍生自任何来源，例如乳房、结肠、肺、胰腺、胆囊、皮肤、骨骼、肌肉、肝、肾脏、子宫颈、卵巢、前列腺、食管、胃或其他器官，例如乳腺癌肿瘤、肺癌肿瘤、肝肿瘤、前列腺癌肿瘤、结肠癌肿瘤、膀胱癌肿瘤或肾癌肿瘤。在一个实施方案中，所公开的方法中使用的肿瘤样品或其他组织是人源的，但可以是任何适当的组织来源。
[0056] 所公开的方法中使用的肿瘤或其他组织样品可以具有至少1cm3、至少2cm3、至少3cm3、至少4cm3、至少5cm3、至少6cm3、至少7cm3、至少8cm3、至少9cm3、至少10cm3、至少15cm3、至少20cm3、至少25cm3、至少50cm3、至少100cm3、至少250cm3、至少500cm3、至少1,000cm3、至少2,500cm3、至少5,000cm3、至少7,500cm3、至少10,000cm3或更大的体积。
[0057] 所公开的方法中使用的肿瘤或其他组织样品在最宽点处可以具有至少0.5cm、至少1cm、至少1.5cm、至少2cm、至少2.5cm、至少3cm、至少3.5cm、至少4cm、至少4.5cm、至少5cm、至少6cm、至少7cm、至少10cm、至少25cm、至少50cm或更大的宽度。
[0058] 在另外的实施方案中，代表性样品可以由之前福尔马林固定并包埋在石蜡中的组织制成。具体而言，可以将蜡熔化，将组织回收并水合，并且然后将本文描述的方法(即均质化)应用到样品上，其适用于任何数目的测定。以这种方式，所公开的方法可以用于通过熔化蜡、回收样品、再水合组织并相应地均质化，使用已经制备用于TNM分期的一个或多个样品来生成代表性样品。
[0059] 任何上述方法可以进一步包括(iii)将该均质物或者其部分或级分分布到一个或多个载玻片或其他固体支持物上，并且任选地将含有该均质物或部分或其级分的一个或多个载玻片或其他固体支持物用苏木精和伊红染色；在含有该均质物或者其部分或级分的载玻片或其他固体支持物上进行免疫组织化学染色；或在含有该均质物或其部分或其级分的载玻片或其他固体支持物上进行原位杂交，即其中任何一种将被认为是该方法中的步骤(iv)。例如，可以在用于分析的自动化平台上分析该均质物或其部分。此类平台在本领域中是已知的，并且可以从维塔纳医学系统公司(Ventana Medical Systems,Inc.)商购获得(参见Ventana.com的示例性自动化平台)。
[0060] 此外，上述方法中的任一种可以进一步包括(iii)从该均质物或者其部分或级分纯化核酸(如DNA或mRNA)。纯化的核酸可以进行Northern印迹、DNA测序、PCR、RT-PCR、微阵列谱分析、差异展示或原位杂交。可替代地，可以将纯化的核酸与纳米粒子(如量子点、顺磁纳米粒子、超顺磁纳米粒子和金属纳米粒子，优选合金化量子点，通过举例，包括例如但不限于CdSe、ZnSSe、ZnSeTe、ZnSTe、CdSSe、CdSeTe、ScSTe、HgSSe、HgSeTe、HgSTe、ZnCdS、ZnCdSe、ZnCdTe、ZnHgS、ZnHgSe、ZnHgTe、CdHgS、CdHgSe、CdHgTe、ZnCdSSe、ZnHgSSe、ZnCdSeTe、ZnHgSeTe、CdHgSSe、CdHgSeTe、InGaAs、GaAlAs和InGaN)缀合。
[0061] 还考虑的是，上述方法中的任一种可以进一步包括从该均质物或者其部分或级分纯化脂质或外泌体或其他细胞器。纯化的脂质可进行质谱或组织化学分析。
[0062] 另外，还考虑的是，上述方法中的任一种可以进一步包括从该均质物或者其部分或级分纯化蛋白质。纯化的蛋白质可以进行Western印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫沉淀、色谱、质谱、微阵列谱分析、干涉测量、电泳染色或免疫组织化学染色。可替代地或除前述之外，纯化的蛋白质可用于产生对该肿瘤或组织样品有特异性的抗血清。
[0063] 此外，考虑的是，任何上述方法进一步包括(iii)对该均质物或者其部分或级分进行基因组、表观基因组、转录组、蛋白质组学和/或代谢组学分析。
[0064] 此外，考虑的是，任何上述方法进一步包括(iii)从该均质物或者其部分或级分亲和纯化特定细胞类型。特定细胞类型可能含有感兴趣的生物标记物。感兴趣的示例性生物标记物可以包括Her2，bRaf，ERBB2扩增，Pl3KCA突变，FGFR2扩增，p53突变，BRCA突变，CCND1扩增，MAP2K4突变，ATR突变或其表达与特定癌症相关的任何其他生物标记物；以下项中的至少一个：AFP、ALK、BCR-ABL、BRCA1/BRCA2、BRAF、V600E、Ca-125、CA19.9、EGFR、Her-2、KIT、PSA、S100、KRAS、ER/Pr、UGT1A1、CD30、CD20、F1P1L1-PDGRFa、PDGFR、TMPT和TMPRSS2；或选自以下项的至少一种生物标记物：ABCB5，AFP-L3，α-甲胎蛋白，α-甲基酰基CoA消旋酶，BRCA1，BRCA2，CA 15-3，CA 242，Ca 27-29，CA-125，CA15-3，CA19-9，降钙素，癌胚抗原，癌胚抗原肽-1，脱-γ羧基凝血酶原，肌间线蛋白，早期前列腺癌抗原-2，雌激素受体，纤维蛋白降解产物，葡萄糖-6-磷酸异构酶，HPV抗原如vE6、E7、L1、L2或p16INK4a，人绒毛膜促性腺激素，IL-6，角蛋白19，乳酸脱氢酶，亮氨酰氨基肽酶，促脂素，变肾上腺素类物质，脑啡肽酶，NMP22，去甲变肾上腺素，PCA3，前列腺特异性抗原，前列腺酸性磷酸酶，突触素，甲状腺球蛋白，TNF，选自以下项的转录因子：ERG、ETV1(ER81)、FLI1、ETS1、ETS2、ELK1、ETV6(TEL1)、ETV7(TEL2)、GABPa、ELF1、ETV4(E1AF；PEA3)、ETV5(ERM)、ERF、PEA3/E1AF、PU.1、ESE1/ESX、SAP1(ELK4)、ETV3(METS)、EWS/FLI1、ESE1、ESE2(ELF5)、ESE3、PDEF、NET(ELK3；SAP2)、NERF(ELF2)或FEV，肿瘤相关糖蛋白72，c-kit，SCF，pAKT，pc-kit以及波形蛋白。
[0065] 可替代地或另外，感兴趣的生物标记物可以是免疫检查点抑制剂，例如但不限于CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、KIR、TIM3、GAL9、GITR、LAG3、VISTA、KIR、2B4、TRPO2、CD160、CGEN-15049、CHK 1、CHK2、A2aR、TL1A和B-7家族配体或其组合，或是选自下组的检查点蛋白的配体，该组由以下各项组成：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK1、CHK2、A2aR、B-7家族配体或其组合。
[0066] 本公开内容的方法还可包括(comprise或include)与以下项相关的至少一种生物标记物的检测：急性淋巴细胞白血病(etv6、am11、亲环蛋白b)、B细胞淋巴瘤(Ig-独特型)、神经胶质瘤(E-钙粘蛋白、α-连环蛋白、β-连环蛋白、γ-连环蛋白、p120ctn)、膀胱癌(p21ras)、胆管癌(p21ras)、乳腺癌(MUC家族、HER2/neu、c-erbB-2)、宫颈癌(p53、p21ras)、结肠癌(p21ras、HER2/neu、c-erbB-2、MUC家族)、结肠直肠癌(结肠直肠相关抗原(CRC)-C017-1A/GA733、APC)、绒毛膜癌(CEA)、上皮细胞癌(亲环蛋白b)、胃癌(HER2/neu、c-erbB-2、ga733糖蛋白)、肝细胞癌(α-甲胎蛋白)、霍奇金淋巴瘤(Imp-1、EBNA-1)、肺癌(CEA、MAGE-
3、NY-ESO-1)、淋巴样细胞衍生的白血病(亲环蛋白b)、黑素瘤(p5蛋白、gp75、癌胚抗原、GM2和GD2神经节苷脂、Melan-A/MART-1、cdc27、MAGE-3、p21ras、gp100.sup.Pmel117)、骨髓瘤(MUC家族、p21ras)、非小细胞肺癌(HER2/neu、c-erbB-2)、鼻咽癌(Imp-1、EBNA-1)、卵巢癌(MUC家族、HER2/neu、c-erbB-2)、前列腺癌(前列腺特异性抗原(PSA)及其抗原表位PSA-1、PSA-2和PSA-3，PSMA，HER2/neu，c-erbB-2，ga733糖蛋白)、肾癌(HER2/neu、c-erbB-2)、子宫颈和食道的鳞状细胞癌(病毒产物，如人类乳头瘤病毒蛋白)、睾丸癌(NY-ESO-1)和/或T细胞白血病(HTLV-1表位)。
3、NY-ESO-1)、淋巴样细胞衍生的白血病(亲环蛋白b)、黑素瘤(p5蛋白、gp75、癌胚抗原、GM2和GD2神经节苷脂、Melan-A/MART-1、cdc27、MAGE-3、p21ras、gp100.sup.Pmel117)、骨髓瘤(MUC家族、p21ras)、非小细胞肺癌(HER2/neu、c-erbB-2)、鼻咽癌(Imp-1、EBNA-1)、卵巢癌(MUC家族、HER2/neu、c-erbB-2)、前列腺癌(前列腺特异性抗原(PSA)及其抗原表位PSA-1、PSA-2和PSA-3，PSMA，HER2/neu，c-erbB-2，ga733糖蛋白)、肾癌(HER2/neu、c-erbB-2)、子宫颈和食道的鳞状细胞癌(病毒产物，如人类乳头瘤病毒蛋白)、睾丸癌(NY-ESO-1)和/或T细胞白血病(HTLV-1表位)。
[0067] 本发明的方法进一步包括(iii)用分解细胞外基质的胶原酶或其他的酶或化学物质或其组合处理该均质物或者其部分或级分，在高温条件下孵育该均质物或者其部分或级分，和/或机械搅动该均质物或者其部分或级分以便解离该均质物或者其部分或级分内的细胞。通常，这些方法将从该代表性样品生成单个细胞群或小细胞簇，其可用于所公开的分析或治疗方法或其组合中。
[0068] 另外，任何上述方法进一步包括(ⅲ)过滤或筛分该均质物或其部分或级分，这可能导致获得单细胞或小细胞簇(如双粘体或三粘体)。
[0069] 代表性样品的细胞组分可以通过一个或多个过滤步骤进行分离。例如，在通过物理和/或生化手段均质化和解离均质物后，可以通过1微米过滤器过滤解离的样品以除去所有完整的细胞材料。预期非细胞代表性样品将含有具有临床效用的从肿瘤和来自肿瘤内的正常基质分泌的因子，即抗体、生长因子、免疫调节剂以及其他未知因子。可通过ELISA、质谱、新一代测序和其他诊断方法分析非细胞代表性样品。在过滤后获得衍生自代表性样品的单细胞的程度上，可将此类细胞使用荧光活化细胞分选(FACS)和流式细胞术分析进行分析。
[0070] 鉴于通过所公开的方法生成的均质物的代表性质，该均质物或者其部分或级分可用于检测低流行率遗传事件(如以20％流行率、15％流行率、10％流行率、5％流行率、2％流行率、1％流行率、0.5％流行率、0.1％流行率、0.001％流行率、0.001％流行率、0.0001％流行率、0.00001％流行率、0.000001％流行率或更低流行率发生的遗传事件)。示例性的遗传事件包括点突变、缺失、添加、易位、基因融合或基因扩增。同样，该方法还可以涉及检测肿瘤样品或其部分内的遗传或表观遗传异质性和/或检测包括罕见遗传或表观遗传变异的细胞。此类细胞可以小于5％、小于1％、小于0.5％、小于0.1％、小于0.05％、或小于0.01％的频率存在于肿瘤样品中
[0071] 检测到的罕见细胞可能包括一种或多种遗传或表观遗传差异，其赋予对疗法的抗性，对一种疗法高于另一种疗法(抗癌疗法)的敏感度，和/或促进转移。因此，在一个方面，此类细胞的检测将有利于癌症预后以及适当的治疗方案如化疗、组合靶向疗法的选择和/或生物制剂的使用。
[0072] 前述方法还可以包括使用选自以下项的至少一种可检测标记：荧光分子或荧光色素例如4-乙酰氨基-4'-异硫氰酰茋-2,2'-二磺酸，吖啶和衍生物(如吖啶和异硫氰酸吖啶)，5-(2'-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)，4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘酰亚胺-3,5-二磺酸盐(萤光黄VS)，N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺，邻氨基苯甲酰胺，亮黄，香豆素及其衍生物如香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，香豆素120)、7-氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆素151)；标记红(cyanosine)；4',6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)；5',5”-二溴邻苯三酚-砜酞(溴邻苯三酚红)；7-二乙氨基-3-(4'-异硫氰酰苯基)-4-甲基香豆素；二亚乙基三胺五乙酸盐；4,4'-二异硫氰酰二氢-芪-2,2'-二磺酸；4,4'-二异硫氰酰茋-2,2'-二磺酸；5-[二甲基氨基]萘-1-磺酰氯(DNS，丹磺酰氯)；4-(4'-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸(DABCYL)；4-二甲基氨基苯基偶氮苯基-4'-异硫氰酸酯(DABITC)；伊红及其衍生物如伊红和伊红异硫氰酸酯；赤藓红和衍生物如赤藓红B和赤藓红异硫氰酸酯；溴化乙锭；荧光素和衍生物如5-羧基荧光素(FAM)、5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)、2'7'-二甲氧基-4'5'-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)和QFITC(XRITC)；2',7'-二氟荧光素(OREGON )；荧光胺；IR144；IR1446；孔雀石绿异硫氰酸盐；4-甲基伞形酮；邻甲酚酞；硝基酪氨酸；副品红；酚红；B-藻红蛋白；邻苯二甲醛；芘和衍生物如芘、丁酸芘和琥珀酰亚胺基1-芘丁酸酯；活性红4(Cibacron.RTM.亮红3B-A)；罗丹明和衍生物如6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基罗丹明(R6G)、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、罗丹明(Rhod)、罗丹明B、罗丹明123、罗丹明X异硫氰酸酯、罗丹明绿、磺酰罗丹明B、磺酰罗丹明101和磺酰罗丹明101的磺酰氯衍生物(德克萨斯红(Texas Red))；N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)；四甲基罗丹明；四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)；核黄素；蔷薇酸和铽螯合物衍生物，以大约617nm发射的巯基反应性铕螯合物
[0073] 所公开的方法可以全部或部分自动化。例如，步骤(i)和(ii)可以是自动的，但是任何后续步骤例如步骤(iii)和(iv)是手动的。可替代地，通过举例，步骤(i)和(ii)可以是手动的，而随后的步骤例如步骤(iii)和(iv)是自动的。另外，该方法所涵盖的所有步骤可以是自动的，使得该方法完全自动化。
[0074] 所公开的方法可以单独使用或与用于肿瘤分期的其他已知方法(如TNM)组合。在一个方面，该方法进一步包括通过分析切除的淋巴结的代表性样品来评价肿瘤的代表性样品的一个或多个方面以及肿瘤细胞已经扩散至区域淋巴结的程度，以预测疾病复发和/或进展的可能性。
[0075] 所公开的方法可以进一步包括采用算法来计算采样细胞(例如具有或不具有特定生物标记物的肿瘤细胞)的百分比。可以基于代表性肿瘤样品和/或代表性淋巴结样品内具有特定可检测生物标记物或生物标记物组合的细胞的百分比来确定转移(或毒性亚克隆)进展的相对风险。
[0076] 所公开的方法可以进一步包括基于代表性样品中含有的生物标记物谱、抗原谱、突变谱、脂质谱、蛋白质谱和/或外泌体谱来开发个性化剂量或治疗方案。例如，基于代表性样品中含有的信息，或者结合从代表性淋巴结样品获得的信息，可以对一种或多种药物和/或给予患者的此类药物的剂量(给药的量、给药时间长度等)的选择进行修饰以基于患者的个体组织或癌症谱来对治疗进行个性化。
[0077] 公开的方法可以进一步包括将该代表性样品的基因组谱与来自样品患者或其他患者的代表性组织样品(例如淋巴结样品)的基因组谱相比较，并进一步任选地将这些谱与来自任何远端转移瘤或代表性转移性肿瘤样品的循环肿瘤DNA相比较。
[0078] 所公开的方法可以进一步包括基于代表性样品中含有的生物标记物谱、抗原谱、突变谱、脂质谱、蛋白质谱和/或外泌体谱来开发用于临床试验的纳入标准。
[0079] 本公开内容还涵盖通过任何上述方法产生的代表性均质物组合物，单独或与其他组合物和载体组合。
[0080] 另外，可以使用前述方法的结果(如罕见遗传和/或表观遗传事件、罕见细胞等的检测)或通过任何前述方法产生的组合物(涉及样品如肿瘤样品的均质化，以制备适于使用任何数目的标准诊断测定进行的进一步分析的代表性样品)来选择针对癌症患者的适当治疗方案。该治疗方案可以包括基因疗法、化疗、靶向小分子、其他靶向疗法、免疫调节剂给予、放射、细胞因子给予、手术或其组合。
[0081] 此外，所公开的方法可用于选择至少一种治疗剂(如基因疗法(例如，CRISPR)、T细胞疗法(例如，CAR T细胞)、抗体、核酸、小分子或多肽，其拮抗、抑制或阻断至少一种检测的生物标记物的表达或功能活性)，该治疗剂适用于如下受试者，其样品或肿瘤是通过所提供的方法生成的代表性样品的来源。
[0082] 在另外的方面，本公开文本涉及用于制备一种用于分析的代表性样品的方法，其包括(1)从至少一个受试者获得手术切除组织样品；并且(2)将该手术切除组织样品均质化以获得均质化的样品。在一个实施方案中，将该手术切除组织样品的至少部分进行固定。在另外的实施方案中，该方法进一步包括加工手术切除样品的第一部分并且生成一个或多个经固定的包埋组织块，并且进一步将剩余手术组织切除样品的第二部分均质化。可以通过显微切片术加工该一个或多个固定的包埋组织块的部分以产生一个或多个组织薄切片用于形态分析。另外，可以将一个或多个经固定的包埋组织块中的至少一个均质化。在一个方面，该手术切除组织样品包括一个或多个单独的组织片。在另外的实施方案中，该一个或多个单独的组织片包括从受试者切除的一个或多个原发实体肿瘤组织团块的至少部分以获得手术切除样品。在另一个方面，该一个或多个单独的组织片包括从受试者切除的一个或多个淋巴结的至少部分。
[0083] 在另外的实施方案中，该方法进一步包括将该单独的组织片的至少部分单独均质化以产生单独的均质化样品。在另外的实施方案中，该手术切除组织样品包括单个组织团块，其可以被进一步分成该单个组织团块的两片或更多片。另外，可以将该单个组织团块的两片或更多片中的至少一片均质化并保存。在一个方面，该均质化可以包括物理分离，例如切割、划切或切碎。在另一个方面，该均质化可以包括机械解离，如共混或榨汁。在又另一个方面，该均质化是通过生化解离完成，例如用蛋白酶完成。
[0084] 在另外的方面，一种或多种生物分子可以从该均质物的至少部分中纯化，此类生物分子可以包括DNA、RNA、蛋白质、脂质和代谢物。然后可以例如通过PCR、质谱法、新一代测序或ELISA来分析该生物分子。此类分析产生至少一个数据集。
[0085] 在另外的实施方案中，可以将均质化的样品的至少部分包埋在石蜡中。在另外的方面，该方法进一步包括制备石蜡包埋的均质化样品的一个或多个薄切片并对该样品进行组织学分析。此类组织学分析可以包括H&E染色、IHC染色、ISH染色和FISH染色。该组织学分析可由人解读或在自动化装置上定量。在另外的实施方案中，解读或定量产生至少一个数据集。
[0086] 在一个方面，本公开文本还涉及进一步加工该均质物的至少部分以生成细胞碎片。此类加工可能包括物理方法、机械方法、化学方法、或酶促方法。此类细胞碎片可能包括细胞核、细胞膜和细胞器。在另一个方面，将该细胞碎片的至少部分附着到至少一个载玻片上并任选进行组织学分析。此类组织学分析可包括H&E染色、IHC染色、ISH染色或FISH染色。该分析可由人解读或由自动化装置定量。该解读或定量导致建立至少一个数据集。
[0087] 在另外的方面，将该细胞碎片的至少部分通过流式细胞术、FACS、或粒子分析仪进行分析，其中此类分析产生数据集。在一个方面，将来自至少部分细胞碎片的至少一种细胞碎片进行纯化。此类纯化可以通过例如FACS、亲和纯化、尺寸排阻差速离心、过滤或电泳发生。在另一个实施方案中，可以由从该细胞碎片的至少部分中纯化的至少一种细胞碎片中分离生物分子。可以通过PCR、质谱、新一代测序或ELISA来分析该生物分子。在一方面，该分析产生至少一个数据集。
[0088] 在又另一个实施方案中，本公开内容的方法进一步包括进一步加工该均质物的至少部分以生成至少一个解离细胞，例如物理加工、机械加工、化学加工、或酶促加工。解离细胞是正常细胞、癌细胞或细菌细胞。在一个方面，将解离细胞附着到至少一个载玻片上并进行组织学分析。此类分析可包括例如H&E染色、IHC染色、ISH染色或FISH染色。在另外的实施方案中，该分析由人解读或由自动化装置定量。在另外的实施方案中，解读或定量产生至少一个数据集。在另外的方面，通过如FACS、亲和纯化、尺寸排阻差速离心、过滤或电泳的手段纯化来自该至少一个解离细胞的至少一个细胞。在另外的实施方案中，生物分子可以由从该至少一个解离细胞中纯化的至少一个细胞中分离。在另外的方面，可以例如通过PCR、质谱法、新一代测序或ELISA来分析该生物分子。在另外的实施方案中，此类分析产生至少一个数据集。
[0089] 在另外的方面，对附着到至少一个载玻片上的从该至少一个解离细胞中纯化的至少一个细胞进行组织学分析，并任选进行组织学分析。在另外的实施方案中，该组织学分析是H&E染色、IHC染色、ISH染色、或FISH染色。此类分析可由人解读或由自动化设备定量。在另外的方面，该分析或解读产生至少一个数据集。
[0090] 在另外的实施方案中，将由上面公开的方法产生的数据集进行进一步分析。在一个方面，该分析包括生物标记物多样性或表型多样性的确定。在另外的实施方案中，该分析包括确定至少一个临床决策。在一个方面，这种临床决策包括确定疾病预后、预测疾病复发、预测疾病治疗靶标、纳入临床试验受试者或针对至少一个受试者的治疗处理策略。附图说明
[0093] 图2A和2B示出了本公开文本的均质物的示意性图示。图2A是所公开的均质化方法如何生成含有在实体瘤内存在的比例的亚克隆的代表性样品的图示。图2B是该均质物如何促进低流行率亚克隆的检测的图示。
[0094] 图3是示意性地描绘了使用物理方法、机械方法、生化方法来生成代表肿瘤内异质性的代表性肿瘤样品的公开方案的流程图。
[0095] 图4是显示代表性样品的尺寸分级的结果的图。
[0096] 图5A-C显示了对生化消化的代表性样品进行系列过滤后收集的流过级分和保留级分的H&E染色。图5A示出了保留在网(顶部)中的级分和微米网的流过物(底部)的H&E染色。图5B示出了保留在网(顶部)中的级分和微米网的流过物(底部)的H&E染色。图5C示出了保留在网(顶部)中的级分和微米网的流过物(底部)的H&E染色。
[0097] 图6A-6D显示了从通过均质化与动物组织混合随后在热和pH调节下进行生化消化的人乳腺癌细胞衍生的Her2阳性异种移植物生成的代表性样品中的蛋白质检测。图6A示出了在85℃下CC1缓冲液中的预调节。图6B示出了在85℃下CC1缓冲液中的预调节，随后胶原酶H消化至少30分钟。图6C示出了机械解离的CC1预调节的和胶原酶H消化的样品。图6D是动物组织即鸡胸肉、鱼片和鸡肝的图像，与Her2阳性异种移植物共混以生成如图6A-6C所示分析的代表性样品。
[0098] 图7A和7B显示了在机械解离后在热和pH调节下使用生化消化从人体组织生成的代表性样品。图7A显示用CC1预调节，随后用胶原酶H消化30分钟。图7B示出了延长CC1预调节后胶原酶H消化的持续时间。
[0099] 图8A-8D显示了从人肾样品生成的代表性样品中的蛋白质检测。图8A示出了机械解离、预调节和酶促消化后的代表性人肾样品的H&E染色。图8B示出了代表性人肾样品的用以检测PD-L1的DAB-IHC分析。图8C示出了代表性人肾样品的用以检测CD8的DAB-IHC分析。图8D示出了代表性人肾样品的用以检测Ep-Cam的DAB-IHC分析。左侧列显示含有代表性样品的载玻片的10倍放大，而右侧列显示含有代表性样品的载玻片的20倍放大。
[0100] 图9A-9D显示了从人肺样品生成的代表性样品中的蛋白质检测。图9A是用作生成代表性样品的源材料的大约3cm肺肿瘤样品的图像；图9B示出机械解离、预调节和酶促消化后代表性人肺样品的H&E染色；图9C示出了代表性人肺样品的用以检测PD-L1的DAB-IHC分析；图9D示出了代表性人肺样品的用以检测CD8的DAB-IHC分析；图9E为代表性人肺样品的用以检测Ep-Cam的DAB-IHC分析。
[0101] 图10示出了在步骤1-102中阐述的用于代表性样品中蛋白质检测的示例性DAB ICC方案。在这个具体实施例中，使用该方案来检测Her2。
[0102] 图11提供了用于代表性样品中蛋白质检测的示例性荧光ICC方案(在步骤1-38中阐述)。
[0103] 图12显示了使用自动化DAB ICC在从动物组织和人扁桃体样本的混合物制备的代表性样品中进行的区别B细胞的CD20检测。在来自代表性样品中含有的人扁桃体组织的细胞中检测到CD20。
[0104] 图13A和13B显示使用荧光ICC检测存在于由扁桃体组织和Her-2阳性异种移植肿瘤制备的代表性样品中的Her2阳性Calu-3细胞。图13A示出了仅与二级抗体孵育的含有Calu-3细胞(阴性对照)的代表性样品。虚线箭头指定了由二级抗体生成的Calu-3细胞中的背景信号。图13B显示了在添加二级抗体之前与Her2抗体(4B5)孵育的含有Calu-3细胞的代表性样品。
[0105] 图14提供了用于检测代表性样品中的多种蛋白质的示例性多路复用显色ICC方案(在步骤1-225中阐述)。
[0106] 图15显示了在由人扁桃体样本生成的代表性样品中使用多路复用显色IHC检测Ki-67、CD20和CD3。
[0107] 图16显示了在代表性扁桃体样品中以约0.015％流行率存在的b-Raf阳性细胞的检测。
[0108] 图17显示了均质化的扁桃体组织的5倍放大。注意比例尺指示长度为50微米。
[0109] 图18A和18B显示了剩余手术材料的图像。图18A示出了来自仍然含有八(8)厘米结肠腺癌的结肠切除物的材料；图18B示出了来自含有乳头状尿路上皮肾肿瘤的肾的肾部分切除术的残留组织。
[0110] 图19A-19C显示了从结肠腺癌获得的不同组织切片的H&E染色。图19A示出了从结肠腺癌获得的第一切片；而图19B示出了来自结肠腺癌的第二个且不同的切片。图19A和19B中的每个切片各自由病理学家获得。H&E染色的差异显示了相同肿瘤内的变化。图19C示出了从结肠腺癌制备的代表性样品的H&E染色。
[0111] 图20A-20C显示了从乳头状尿路上皮肾肿瘤获得的不同组织切片的H&E染色。图20A示出了取自乳头状尿路上皮肾肿瘤的第一切片；图20B示出了取自乳头状尿路上皮肾肿瘤的第二个不同切片。图20A和20B中所示的每个切片由病理学家获得。H&E染色的差异显示了相同肿瘤内的变化。图20C示出了从乳头状尿路上皮肾肿瘤制备的代表性样品的H&E染色。
[0112] 图21A-21C显示了从结肠腺癌获得的不同组织切片的Alk DAB染色。图21A示出了取自结肠腺癌的第一切片；图21B示出了取自结肠腺癌的第二个不同切片。图21A和21B中所示的每个切片由病理学家获得。Alk DAB染色的差异显示了相同肿瘤内的变化。图21C示出了从结肠腺癌制备的代表性样品的Alk DAB染色。
[0113] 图22A-C显示了从乳头状尿路上皮肾获得的不同组织切片的Alk DAB染色。图22A示出了取自乳头状尿路上皮肾肿瘤的第一切片；图22B示出了取自乳头状尿路上皮肾肿瘤的第二个不同切片。图22A和22B中所示的每个切片由病理学家获得。Alk DAB染色的差异显示了相同肿瘤内的变化。图22C示出了从乳头状尿路上皮肾肿瘤制备的代表性样品的Alk DAB染色。
[0114] 图23是通过离心从生化消化的代表性样品中分离的基于肿瘤血小板(tumor-educated platelet)和其他血细胞的图像。将人卵巢浆液性癌肿瘤共混并用Accumax和胶原酶H消化，随后离心，导致离心样品顶部的血小板和红细胞积聚(红线)。
[0115] 图24显示了由从石蜡块回收的组织制备的代表性样品中Caski细胞上的HPV16ISH的染色。将先前包埋在石蜡中的组织回收并在IKA中均质化以生成代表性样品。
[0116] 图25A-D显示了由切割和切碎的扁桃体制成的经H&E染色的组织学载玻片的图像。2 2
图25A和25B示出了手工切割组织(约2mm)，而图25C和25D示出了用“榨汁器”(约200um)切碎的组织。
图25A和25B示出了手工切割组织(约2mm)，而图25C和25D示出了用“榨汁器”(约200um)切碎的组织。
[0117] 图26A-26D显示了经机械共混和过滤的结肠肿瘤样品。图26A是收集物1的明视野图像；图26B是收集物2的明视野图像；图26C是收集物3的明视野图像；并且图26D是滤液的明视野图像。
[0118] 图27A-图27C显示了经机械解离和过滤的单细胞的尺寸分布。图27A显示了来自结肠肿瘤样品的细胞；图27B显示了来自扁桃体的经细胞机械解离和过滤的免疫细胞；并且图27C显示了从来自结肠肿瘤样品的经机械解离和过滤的细胞中分选的EpCAM阳性细胞(肿瘤细胞)。
[0119] 图28显示了来自结肠肿瘤样品的经机械解离和过滤并用Sony SH800细胞分选仪分选的EpCAM阳性肿瘤细胞的荧光图像。
[0120] 图29A-29F显示了用CK8/18(图29B)、CD45(图29C)、CD8(图29D)、PD-L1(图29E)和EGFR(29F)细胞标记物染色并用Attune声学聚焦流式细胞仪进行分析的经机械解离和过滤的结肠肿瘤细胞。图29A示出了FSC-A与FSC-H如何用于双粘体辨别。红色：阳性染色细胞，并且紫色：对照(没有一级Ab的染色细胞)。
[0121] 图30A-30C显示了使用Sony SH800细胞分选仪分选的EpCAM阳性细胞。图30A利用了德克萨斯红；图30B利用了DAPI；图30C利用了DAPI。基于DAPI强度图，EpCAM阳性细胞对应于具有较高DNA含量的细胞。
[0122] 图31A和图31B显示了使用磁珠进行的扁桃体解离细胞分选。图31A显示了FSC-A与FSC-H用于双粘体辨别。将超过一定阈值的荧光细胞用于比较。图31B示出了显示耗减前后总细胞群中荧光细胞(CD3或CD8阳性细胞)的百分比的条形图。
[0123] 图32显示了多细胞聚集体的超声处理。多细胞聚集体(群体尺寸在12和18微米之间)的超声处理给出单细胞(群体尺寸在5.5和9.3微米之间)。生成的单细胞的尺寸对应于肿瘤细胞的尺寸。
[0124] 图33A-33D显示了用胶原酶处理然后超声处理的多细胞聚集体。图33A显示了用超声处理的经胶原酶处理的细胞聚集体的尺寸分布；图34B显示了没有超声处理的经胶原酶处理的细胞聚集体的尺寸分布。图33C示出了图33A中展示的样品的图像；图33D示出了图33B中展示的样品的图像。
[0125] 图34显示了由代表性样品(Rep)和新鲜(Trad)扁桃体组织制成的均质物释出的RNA和DNA。
[0126] 图35A-35D显示了6个月内在不同储存条件下的RNA稳定性。图35A示出了根据需要将来自胰腺高分化神经内分泌赘生物的组织在标准细胞储存溶液中孵育；图35B示出了根据需要将来自乳头状尿路上皮癌的组织在标准细胞储存溶液中孵育；图35C示出了按指示将来自结肠腺癌的组织在标准细胞储存溶液中孵育。
[0127] 图36A和B显示了6个月内在不同储存条件下的蛋白质稳定性。图36A示出了如通过IHC针对C-met测量的，在所有储存条件和温度下，蛋白质在乳头状尿路上皮癌中是稳定的；图36B示出了如通过IHC针对C-met测量的，在所有储存条件和温度下，蛋白质在结肠腺癌中是稳定的。
[0128] 图37和37B显示了由结肠腺癌制备的代表性样品在重复冻/融循环中的细胞和蛋白质稳定性。图37A示出了通过H&E染色测定的细胞形态的稳定性；图37B示出了如通过针对C-met染色细胞所确定的蛋白质稳定性。
[0129] 图38显示了由结肠腺癌制备的代表性样品在重复冻/融循环中的核酸(DNA和RNA)稳定性。
[0130] 图39显示了Her2/Chr17检测堆栈的图示。
[0131] 图40显示了脱石蜡研究。由结肠组织制备并针对Her2(银色)和染色体17(红色)(40x)染色的分离核的图像。探索的脱石蜡选项包括A LCS脱石蜡、B EZ prep脱石蜡和C湿负荷选项(代替脱石蜡)。
[0132] 图41显示了杂交孵育研究。由结肠组织制备并针对Her2(银色)和染色体17(红色)(40x)染色的分离核的图像。探索的杂交选项是A 1小时杂交、B 2小时杂交和C 4小时杂交。
[0133] 图42A和42B显示了来自用酶促方法解离的扁桃体组织的代表性样品。图42A示出了在37℃下用5mg/ml胃蛋白酶消化30分钟(左图)或24小时(右图)的组织的H&E染色载玻片。图42B示出了在37℃下用0.25％胰蛋白酶消化30分钟(左图)或24小时(右图)的组织的H&E染色载玻片。
[0134] 图43是使用表6中列出的不同酶促方法从平行代表性扁桃体样品分离的亚100微米粒子的图。
[0135] 图44A显示了从由机械方法或蛋白酶K-胃蛋白酶方法解离的代表性扁桃体样品分离的亚100微米粒子的图。误差线代表三个独立实验的S.D.，使用不成对T检验**p＝0.0037。图44B显示了使用机械解离分离的粒子的H&E染色载玻片的明视野图像；图44C显示了使用蛋白酶K胃蛋白酶解离方法分离的粒子的H&E染色载玻片的明视野图像。
[0136] 图45A和45B显示了核分离的再现性。图45A是显示从来自结肠(N＝3)和肺肿瘤(N＝4)的代表性样品的等分试样分离的核粒子的平均产量的条形图。图45B是显示从代表性结肠肿瘤样品的等分试样制备的核粒子向一定尺寸的粒子仓中分布的图。
[0137] 图46A和46B显示了与机械处理和酶促处理相关的细胞损害的测量。图46A是显示使用机械方法(Mech)或蛋白酶K(ProtK)-胃蛋白酶方法通过代表性扁桃体样品的解离释放的DNA的平均百分比的条形图。图46B是显示代表性肿瘤样品解离释放的DNA的百分比的条形图。
[0138] 图47A和47B显示了使用蛋白酶K-胃蛋白酶方法从福尔马林固定的扁桃体组织分离的粒子的聚集的流式细胞术分析。图47A显示了使用autoMACS缓冲液制备的样品；图47B显示了使用含有1％吐温20的autoMACS制备的样品。
[0139] 图48A-48D显示了针对细胞角蛋白8/18(CK-8/18)染色的结肠腺癌(ADC)。图48A示出了使用免疫组织化学(IHC)针对CK-8/18染色的组织切片的明视野图像。CK-8/18可视化的ADC组织被染成棕色；图48B示出了机械解离，包埋在石蜡中，切片并使用IHC针对CK-8/18染色的代表性样品的明视野图像。CK-8/18阳性组织被染成棕色；图48C示出了使用蛋白酶K-胃蛋白酶方法解离并在溶液中针对DAPI和CK-8/18染色、用Alexa 488可视化的代表性样品的荧光图像。假彩色图像反映CK-8/18(绿色)和DAPI(蓝色)染色。图48D示出了图48C中描述的组织的阴性对照样品(不与CK-8/18抗体孵育)。所有样品均由相同结肠ADC肿瘤制备。
[0140] 图49A和49B显示了酪胺信号放大(TSA)改进了从代表性样品中分离的材料的染色。图49A显示了通过标准免疫荧光(IF，左上图)或TSA(右上图)方法，来自针对CD45(红色)染色的经固定的扁桃体组织的机械分离细胞的图像(20x)。DAPI染色(蓝色)标志核。两张图像均使用100ms曝光。图49B示出了从使用TSA染色的经固定的肿瘤组织分离的核的图像(40x)。左图显示了未用一级抗体染色的细胞(阴性对照)的图像，并且右图显示了用抗细胞角蛋白(红色)一级抗体染色。DAPI染色(蓝色)标志核。所有图像均使用2ms曝光。
[0141] 图50显示阳性细胞角蛋白(CK)染色区分了肿瘤核与正常细胞核。从结肠肿瘤(上图)或肺肿瘤(下图)代表性样品分离的核的流式细胞术数据的直方图。
[0142] 图51A-51C显示了肿瘤的细胞组成。图51A示出了从结肠腺癌分离的核的级分(389)；图51B示出了从肺鳞状细胞癌(528)分离的核的级分，它们被指定为正常与肿瘤(使用流式细胞术)。
[0143] 图52示出了显示从代表性样品分离的核的DNA产量的定量
[0144] 图53A和53B是取自用泛角蛋白抗体染色的完整扁桃体的组织切片的整个载玻片图像。图54A描绘了针对泛角蛋白由DAB检测的正常扁桃体的传统组织学切片。图54B描绘了针对泛角蛋白由DAB检测的来自扁桃体代表性样品的切片。
[0145] 图55A和55B是将均质化扁桃体样品包埋在石蜡中并切片的图像。图55A描绘了针对CD8由DAB检测的正常扁桃体的传统组织学切片。图55B描绘了针对CD8由DAB检测的来自扁桃体代表性样品的切片。
[0146] 图56是本公开文本的工作流程图。
具体实施方式
[0148] 除非另外限定，否则在此所使用的所有技术和科技术语均具有如本技术所属的领域中的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管在本技术的实施和测试中可以使用任何相似于或等效于本文中所述那些的方法和材料，现在描述优选的方法、装置和材料。本文所引用的全部技术和专利公开的全部内容通过引用并入本文。本文没有任何内容应解释为承认本技术因先前发明而无权早于此类披露内容。
[0149] 除非另有指示，本发明的实践将采用组织培养、免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术，这些在本领域的技能之内。参见例如Sambrook and Russell eds.(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd edition；the series Ausubel et al.eds.(2007)Current Protocols in Molecular Biology；the series Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.)；MacPherson et al.(1991)PCR 1:A Practical Approach(IRL Press at Oxford University Press)；MacPherson et al.(1995)PCR 2:A Practical Approach；Harlow and Lane eds.(1999)Antibodies,A Laboratory Manual；Freshney(2005)Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique,5th edition；Gait ed.(1984)Oligonucleotide Synthesis；
U.S.Patent No.4,683,195；Hames and Higgins eds.(1984)Nucleic Acid
Hybridization；Anderson(1999)Nucleic Acid Hybridization；Hames and Higgins eds.(1984)Transcription and Translation；Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press(1986))；Perbal(1984)A Practical Guide to Molecular Cloning；Miller and Calos eds.(1987)Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(Cold Spring Harbor Laboratory)；Makrides ed.(2003)Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells；Mayer and Walker eds.(1987)Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology(Academic Press,London)；以及Herzenberg et al.eds(1996)Weir’s Handbook of Experimental Immunology.
U.S.Patent No.4,683,195；Hames and Higgins eds.(1984)Nucleic Acid
Hybridization；Anderson(1999)Nucleic Acid Hybridization；Hames and Higgins eds.(1984)Transcription and Translation；Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press(1986))；Perbal(1984)A Practical Guide to Molecular Cloning；Miller and Calos eds.(1987)Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(Cold Spring Harbor Laboratory)；Makrides ed.(2003)Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells；Mayer and Walker eds.(1987)Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology(Academic Press,London)；以及Herzenberg et al.eds(1996)Weir’s Handbook of Experimental Immunology.
[0150] 所有数字名称，例如pH值、温度、时间、浓度和分子量(包括范围)都是近似值，适当时可以按1.0或0.1增量改变(+)或(-)，或可替代地改变+/-15％、或可替代地10％、或可替代地5％、或可替代地2％。应理解，尽管不总是明确说明，所有数字名称前面具有术语“约”。还应理解，尽管不总是明确说明，本文描述的试剂仅是示例性的并且其等效物为本领域所知。
[0151] 在没有明确叙述的情况下推断并且除非另有指示，否则当本技术涉及多肽、蛋白质、多核苷酸或抗体时，其等效物或生物学等效物在本技术的范围内。
[0155] “组合物”典型地意指活性剂(例如化合物或组合物)与天然存在的或非天然存在的载体、惰性(例如可检测试剂或标记)或活性物质如佐剂、稀释剂、粘合剂、稳定剂、缓冲液、盐、亲脂性溶剂、防腐剂、佐剂等的组合，并且包括药学上可接受的载体。载体还可以包括药物赋形剂和添加剂蛋白质、肽、氨基酸、脂质和碳水化合物(例如，糖，包括单糖，二、三、四-寡聚糖以及寡聚糖；衍生的糖如糖醇、糖醛酸、酯化的糖等；以及多糖或糖聚合物)，其可以单独或者组合存在，包括单独的或者组合的按重量或体积计1％-99.99％。示例性蛋白质赋形剂包括血清白蛋白例如人血清白蛋白(HSA)、重组人白蛋白(rHA)、明胶、酪蛋白等。也可以在缓冲容量中发挥功能的代表性氨基酸/抗体组分包括丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜等。碳水化合物赋形剂也旨在本技术的范围内，其例子包括但不限于单糖如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；以及糖醇，如甘露糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨糖醇(葡萄糖醇)和肌醇。
[0156] 除非另外定义，否则在此所使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。
[0157] 本公开文本中的术语“代表性样品”是指准确反映整体组分的样品(或其子集)，并且因该样品是整个群体的无偏差指示。样品衍生自实体器官、组织和肿瘤(“OTT”)，其最初由空间上分离的细胞结构构成，并进一步组织成空间上分离的细胞类型。代表性采样技术和方法是那些足以均质化、混合或以其他方式破坏OTT的空间分层三维结构的技术和方法，使得原始空间分层OTT的组分(细胞结构、细胞、肽、核酸、脂质、代谢物等)以存在于原始器官、组织或肿瘤中的比例存在于子样品(又名分析样品)中。在一些实施方案中，代表性样品是指如下OTT样品，其构成尽可能多的OTT，接近OTT整体或涵盖足够重大部分的OTT，以接近代表在粘附细胞簇、单个细胞、细胞碎片、细胞器、肽、核酸、脂质、代谢物等的水平上OTT的多样性的目标。该代表性样品可含有涵盖OTT的多样性所需的最小量的完整OTT。在另外的实施方案中，该代表性样品可以包括多个片段或粒子，其中这些粒子的至少部分被包埋在石蜡中并且剩余粒子的至少部分被均质化。
[0158] 多个代表性样品可能由单一OTT制成。在该实施方案中，手术移除或切除的OTT首先被加工或以其他方式操纵为单独的子单元，使得每个子单元由空间分层的细胞结构、细胞、肽、核酸等组成。然后将每个子单元充分均质化、混合或以其他方式破坏以产生该OTT亚单元的代表性样品。
[0159] 该代表性样品可以被均质化或以其他方式混合或破坏，以使得任何分析样品或该代表性样品的部分含有存在于该代表性样品中的材料的随机采样。该分析样品是该代表性样品的足够大的级分，因此它涵盖了该代表性样品相对于正应用的分析测试的预期输出(即细胞与粘附细胞的簇)的多样性。用于特定测定的任何分析样品都将在实验误差内产生与用于相同测定的另一分析样品一致的数据。另外，选择用于特定测定的任何分析样品将提供可以与使用取自相同代表性样品或来自相同患者、不同患者或者患者或受试者的组合的OTT制成的其他代表性样品的分析样品的不同测定所生成的数据交叉参考的信息。由于原始生物组分的比例存在于取自代表性样品的每个分析样品中，因此可以在患者或患者组合之间比较从分析样品产生的关于OTT的生物组分比例的数据。
[0160] 其他含有少于分析样品的多样性的样品可以取自代表性样品用于分析，例如单细胞。然而，取自OTT的代表性样品的数百万个单细胞将生成“代表性数据集”，其包括“代表性肿瘤学数据”。
[0161] 在一个实施方案中，细胞或细胞组分在代表性样品内解离，使得它们在代表性样品或其部分内的相对比例或百分比精确地反映或模拟这些细胞类型或组分在整个完整组织样本内的相对比例或百分比。在一个实施方案中，该样本可以是实体瘤、淋巴结、转移瘤、息肉、囊肿或其部分或任何前述项的组合。
[0162] 在一个实施方案中，本文公开的代表性样品是通过均质化从受试者获得的大体积完整组织或肿瘤样品(如临床肿瘤样品)或淋巴结或转移瘤或其组合而获得的。例如，全肿瘤或其实质性部分可用作生成代表性样品的输入材料，例如至少50％、至少75％、或至少95％，或优选全部肿瘤或淋巴结。该代表性样品可由来自实体瘤的完整肿瘤活检样品生成。
在一个实施方案中，该样品包括至少约100-200、200-1,000、1,000-5,000、10,000-100,
000、100,000-1,000,000、1,000,000-5,000,000、5,000,000-1,000,000,000、1,000,000,
000-5,000,000,0000或更多个细胞，任选来自肿瘤的空间不同区域。通常，具有约1cm的直径的肿瘤或其部分中有约10亿个细胞，并且对于大多数情况，这种关系以线性规模进行。例如，切除样品如具有约2cm直径的活检可包括30-50亿个细胞。在另一个实施方案中，本文公开的代表性样品是通过将一种或多种推定正常组织样本(例如衍生自由于遗传突变或既往癌症而处于发展癌症风险中的个体)或来自手术切除物的邻近正常组织(用作对照样品)均质化而获得。
在一个实施方案中，该样品包括至少约100-200、200-1,000、1,000-5,000、10,000-100,
000、100,000-1,000,000、1,000,000-5,000,000、5,000,000-1,000,000,000、1,000,000,
000-5,000,000,0000或更多个细胞，任选来自肿瘤的空间不同区域。通常，具有约1cm的直径的肿瘤或其部分中有约10亿个细胞，并且对于大多数情况，这种关系以线性规模进行。例如，切除样品如具有约2cm直径的活检可包括30-50亿个细胞。在另一个实施方案中，本文公开的代表性样品是通过将一种或多种推定正常组织样本(例如衍生自由于遗传突变或既往癌症而处于发展癌症风险中的个体)或来自手术切除物的邻近正常组织(用作对照样品)均质化而获得。
[0163] 在另外的实施方案中，术语“代表性肿瘤样品”是指由肿瘤(例如切除的肿瘤)或由可能含有癌细胞的样品或由待针对癌细胞(如淋巴结)的可能存在进行测试的样品制备的代表性样品。同样，短语“肿瘤样品”涵盖由肿瘤或由可能含有癌细胞的样品或由待针对癌细胞(如淋巴结)的可能存在进行测试的样品制备的样品。
[0164] 在另外的实施方案中，术语“代表性正常样品”是指从从患者获得的推定正常组织(例如，活检切片、息肉或囊肿)或待针对癌症或癌前细胞或暗示免疫不规则性的免疫细胞的可能存在进行测试的样品制备的代表性样品。同样，短语“正常样品”涵盖由假定正常组织(例如，可能含有癌细胞的活检切片、息肉或囊肿)制备的样品，或待针对癌细胞(如淋巴结)的可能存在进行测试的样品。在另外的实施方案中，“正常样品”还可以指可能无疾病的组织，可以将肿瘤样品与之比较以鉴定归因于疾病状态的表型变化。
[0165] 如本文所用，术语“代表性数据”是指准确反映整个数据集的任何数据集(例如，基因的表达，某些细胞类型(例如，免疫细胞)的百分比，蛋白质表达，SNP表达或其缺乏，微小RNA表达的水平、数量或组织学亚型的数目)或相对小的量的数据，其来源衍生自组织、器官或肿瘤的代表性样品。在一个实施方案中，代表性数据是指示整个组织、器官或肿瘤的多样性的无偏差数据。如本文所用，“数据集”是数据的集合。在一个实施方案中，数据集由单独的要素组成，但可以作为一个单元来操纵。在一个实施方案中，数据集可以包括关于生物标记物多样性或表型多样性的信息。
[0166] 如本文所用，术语“组织学分析”是指植物和动物的细胞和组织的显微解剖的研究。此分析有助于收集有关样品生物组分的信息，例如核酸(RNA、DNA)、蛋白质脂质或代谢物。组织学技术包括本领域技术人员已知的那些技术，一些非限制性例子包括PCR、质谱、新一代测序和ELISA。另外，组织学分析可以包括同时检测超过一种生物组分，即多路复用。
[0167] 如本文所用，“临床决策制定”是指收集信息并整合此信息以得出诊断结论并确定给予患者哪些治疗。此类诊断结论可以包括患者所患的疾病以及应该对患者进行什么测试。在一个实施方案中，临床决策还可以包括确定疾病预后、预测疾病复发、预测疾病治疗靶标、纳入临床试验受试者或确定针对至少一个受试者的治疗处理策略。
[0168] 如本文所用，术语“均质物”是指对组织进行均质化或加工后获得的生物质。均质物可含有来自组织的任何细胞组分，包括但不限于细胞、肽、核酸、脂质、代谢物等。在一个方面，均质物是代表性样品，其准确地反映了衍生它的组织的组分的部分、比率或级分。在一些实施方案中，均质物(或均质物的一些或每个子集)的细胞结构、细胞组分或任何成分(细胞、肽、核酸、脂质、代谢物等)的比率是相同的、相似的或基本上相似于原始完整组织中的细胞结构、细胞组分或任何成分的比率。与代表性样品一样，均质物可含有涵盖该器官、组织或肿瘤多样性所需的最小量的完整器官、组织或肿瘤。
[0169] 衍生均质物的一个或多个组织可能来自一个组织、两个组织或多个组织。在一些实施方案中，该均质物来自一个受试者、两个受试者或超过两个受试者。在一个方面，该两个或更多个受试者是遗传上同质的受试者。在另一个方面，该两个或更多个受试者是表型上同质的受试者。在一些方面，该两个或更多个受试者是遗传上多样的受试者。在一个方面，该两个或更多个受试者是表型上多样的受试者。在另一个方面，该两个或更多个受试者来自相同的性别。在另一个方面，该两个或更多个受试者来自不同的性别。在又另一个方面，该两个或更多个受试者来自不同的族群。在一个方面，该两个或更多个受试者来自相同的族群。在另一个方面，该受试者选自下组，该组由以下各项组成：动物或人类受试者。
[0170] 如本文所用，术语“基本上”意为质量或数量上的高度一致性，例如至少约60％，或可替代地至少约70％，或可替代地约80％，或可替代地约85％，或可替代地约90％，或可替代地约95％，或可替代地约98％。
[0171] “相似”意为小于100％一致，或者大于98％一致，或者大于95％一致，或者大于90％一致，或者大于85％一致，或者大于80％一致，或者可替代地大于75％一致。术语“均一”意指至少80％的一致性，或可替代地至少85％、或可替代地至少90％、或可替代地至少
95％、或可替代地至少98％、或可替代地至少100％一致。非均一意指少于80％一致。
95％、或可替代地至少98％、或可替代地至少100％一致。非均一意指少于80％一致。
[0172] 如本文所用，术语“加工的”意为均质物组合物至少经受物理、机械或化学加工。在一个方面，所得均质物组合物经受超过两个类型的加工。在其他方面，均质物组合物经受三个类型的加工。在又另一个方面，均质物经受四个或更多类型的加工。
[0173] 术语“衍生自”意为样品是从来源获得或收到的。
[0174] 术语“子集”意为较大组的部分或组分。“比率”是一部分的相对定量值，与组分或部分的较大组相关。
[0175] 如本文所用，术语“细胞结构”、“细胞组分”或“组分”可互换使用，指代细胞、组织或生物体内的任何物质或材料，或者在加工细胞、组织或生物体期间和之后产生的任何物质或材料。该物质或材料对于该细胞、组织或生物体来说可以是天然的或外来的。在一些方面，该“细胞结构”和“细胞组分”还可以包括被修饰或加工的任何物质或材料，例如该细胞或核酸用染料或放射性材料修饰或加工。该细胞结构或细胞组分包括但不限于细胞、受体、蛋白质、脂质、细胞器、膜、化学物质、核酸、小分子、细菌、原生动物、病毒、寄生虫和/或其部分或级分。如本文所用，“细胞碎片”包括整个细胞的部分，如细胞核、细胞膜和细胞器。
[0176] 如本文所用，术语“空间上不同”或“空间上分离”是指分布在三维空间的不同区域中的要素。在一个实施方案中，代表性样品捕获肿瘤内癌细胞的所有空间上不同的亚群。在另一个实施方案中，用于生成代表性样品的肿瘤样品取自肿瘤样品的不同区域，例如，肿瘤的近端与远端区域、肿瘤的不同面、肿瘤的不同层等，以努力捕获整个肿瘤内的多样性。
[0177] 术语“均质化(homogenizing或homogenization)”是指使生物样品处于使得该样品的所有级分在组成上相等的状态的过程(如机械过程和/或生化过程)。代表性分析样品可以通过去除已经均质化的样品的部分来制备。通常，在本公开文本的上下文中被称为“液化”的肿瘤、淋巴结或其他样品被理解为已被充分混合或共混以均质化。将均质化样品混合，使得去除一些样品(等分试样)基本上不改变剩余样品的总体组成，并且除去的等分试样的组分基本上与剩余样品的组分一致。在本公开文本中，“均质化”通常将保持样品内大部分细胞的完整性，例如样品中至少50％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或更大百分比的细胞不会由于均质化过程而破裂或裂解。均质物可以基本解离成单个细胞(或细胞群)，并且所得的一种或多种均质物基本上是同质的(由相似的要素组成或构成，或者始终均一)。在一个实施方案中，术语“均质化”是指如下过程，其中将组织或生物样品加工至一定程度，使得组织的任何子集、部分或级分在一些方面相似、基本上相似或一致。
[0178] 在一个实施方案中，术语“机械均质化”是指由机械手段产生的均质化。
[0179] 如本文所用，术语“生化解离”意指使用酶如蛋白酶解离。生化解离可能受蛋白酶浓度、孵育时间和温度的影响。
[0180] 如本文所用，术语组织样品的“物理分离”或“物理解离”是指通过机械手段(例如，通过切割、切碎或划切)将样品用尖锐物体均质化或解离。“切割”通常导致尺寸为大约1.0mm-5.0mm的组织切片。切碎通常导致尺寸为大约0.5-2.0mm的组织切片。0.1-1.0mm的组织切片。
[0181] 如本文所用，组织样品的“机械分离”或“机械解离”指用机械源如传统共混器、榨汁器或珠磨器对样品进行的均质化或解离，如本领域技术人员已知的。
[0182] 如本文所用，“解离细胞”是曾经为组织或器官的部分但未与该组织或器官分离的细胞。
[0183] 依赖于应用于该样品以生成均质物的机械和/或生化解离过程，细胞簇可包括超过一个(1)细胞至数千个细胞。通过应用进一步的加工方法，例如通过进一步的机械和/或生化解离和/或通过尺寸排阻，可以解离各簇(其中含有的细胞的尺寸和/或数目减少)，这取决于待使用代表性样品进行的随后测定(例如，需要含有数十至数千个细胞的细胞簇的IHC，或需要单细胞或细胞碎片的FACS或流式细胞术)。
[0184] 目前描述的方法在样品解离程度方面很灵活。通过进一步加工在应用第一种机械手段(如共混或等效物)后获得的细胞簇，使得簇符合采样方法的解离目标，可以控制目标细胞聚集体尺寸。在一个方面，可以使用机械剪切和尺寸排阻(例如用一系列网进行筛分)来移除处于或低于一定尺寸的细胞簇，同时保留较大的细胞簇以进一步加工以达到目标粒度。通过尺寸排阻技术确定细胞簇粒度的所得分布，以从解离过程中去除某些粒子以达到上浆平台而不是分布。
[0185] 均质化后，所得簇可含有至少1至2、2至100、100至500、500至1,000、1,000至10,000、10,000至50,000或更多个细胞。在一个方面，该簇含有单细胞、约2至10个细胞、约10至
20个细胞或约20至40个细胞。所得簇的尺寸可以变化。参见，例如图20。
20个细胞或约20至40个细胞。所得簇的尺寸可以变化。参见，例如图20。
[0186] 作为均质化该样品的结果，该样品内细胞的分布基本均匀地分布在所得均质物或者其部分或级分内，使得该均质物或其任何级分代表原始样品的异质性。尽管许多或大部分细胞保持完整，但均质化样品可以基于其流动能力被称为液体或液化样品。
[0187] 可将其他部分添加至这些均质物或代表性样品中，例如其他细胞、半抗原或标记。
[0188] 术语“异质性”是指多样性或不一致性，例如，不同或不相似部分的组成，或形式、功能和行为的变化。术语“异质组织样品”意指样品在组成或性质上不均一，例如形式、功能或行为上多样化。在癌症的背景下，术语“肿瘤异质性”描述了以下观察，即不同的肿瘤细胞可能展示出不同的形态学、表型和基因谱，包括细胞形态学、基因表达、基因突变、代谢、运动性、增殖和转移潜能。异质性可发生于肿瘤(肿瘤间异质性)和肿瘤内(肿瘤内异质性)之间。已经在多种癌症中观察到肿瘤异质性，包括但不限于肺癌、白血病、乳腺癌、肾癌、前列腺癌、结肠癌、脑癌、食管癌、头颈癌、膀胱癌、妇科癌症、脂肪肉瘤和多发性骨髓瘤。提出了两种模型来解释肿瘤细胞中的异质性：癌症干细胞模型和克隆进化模型。癌症干细胞模型提供了肿瘤细胞之间观察到的异质性，是由于肿瘤细胞起源的癌症干细胞中的差异。克隆进化模型提供了肿瘤来自单突变细胞但积累了额外的突变的(这产生了额外的亚群，每个亚群都具有进一步分裂和突变的能力)，这解释了来自相同肿瘤的癌细胞中观察到的多样性。这些模型不被认为是相互排斥的，并且因此两者都可能导致不同肿瘤类型间不同量的异质性。肿瘤异质性包括全局方差(总体方差)和该变异的空间结构(群体空间分层)，并且因此在样品设计中应考虑两种变异要素。肿瘤异质性可能源于遗传异质性(例如，由外源因素、基因组不稳定性、治疗等)、其他异质性(例如，表观遗传)和/或肿瘤微环境(例如，肿瘤中的区域差异，如氧利用率或免疫监视，对肿瘤细胞施加不同的选择压力)。
[0189] 由于肿瘤异质性而出现的不同肿瘤细胞群被称为“亚克隆”，即克隆中出现的突变细胞的后代。
[0190] 肿瘤内亚克隆的流行率可以变化。某些亚克隆包括大部分肿瘤，但随时间的推移和/或在某些治疗后会减少。其他亚克隆最初无法检测到，但后来变得丰富。多个亚克隆可以同时存在，并且随着时间(肿瘤生长到足够大到可被检测到所需的时间)的推移其流行率会发生变化。术语肿瘤内的“低流行率事件”或“低流行率遗传事件”是指以10％至1％、1％至0.1％、0.1％至0.01％、0.01％至0.001％、0.001％至0.0001％、0.0001％至0.00001％、0.00001％至0.000001％或0.000001％以下的比例发生的罕见事件或罕见遗传事件(如突变)。因为由所公开的方法生成的样品整体上是肿瘤的代表(或基本上是其代表)，所以甚至可以检测到肿瘤或生物样品中的低流行率亚克隆(如低至至少0.000001％)，除了以较高的流行率存在的所有其他亚克隆。
[0191] 术语“生物样品”或“组织样品”是指从任何生物体(包括病毒)获得的包括生物分子(如蛋白质、肽、核酸、脂质、碳水化合物或其组合)的任何样品。生物体的其他例子包括哺乳动物(如人类；兽医用动物(veterinary animal)，像猫、狗、马、牛和猪；以及实验室动物，像小鼠、大鼠和灵长类动物)、昆虫、环节动物、蛛形纲动物、有袋动物、爬行动物、两栖动物、细菌和真菌。生物样品包括组织样品(如组织切片和组织的针吸活检)，细胞样品(如细胞学涂片如巴氏涂片或血涂片或者通过显微解剖获得的细胞的样品)，或细胞级分、片段或细胞器(如通过裂解细胞并通过离心或其他方式分离它们的组分获得)。生物样品的其他例子包括血液、血清、尿、精液、粪便、脑脊液、间质液、粘液、泪液、汗液、脓液、活检组织(例如，通过手术活检或针吸活检获得)、乳头抽吸物、耳垢、乳汁、阴道液、唾液、拭子(如口腔拭子)，或从第一生物样品衍生的含有生物分子的任何材料。在某些实施方案中，如本文所用的术语“生物样品”是指从受试者获得的肿瘤或其部分制备的样品(如均质化或液化样品)。
[0192] 如本文所用，“正常组织”是指推测与疾病发病率增加相关的或在癌症恶性肿瘤背景下的没有可检测到的病变或异常的组织。这些正常样品可衍生自具有遗传突变或与疾病(遗传或其他)、癌症或恶性肿瘤发病率增加相关的状况的患者。正常组织可以是与来自相同个体或不同个体的病理组织对应的组织的相同类型；或与来自相同个体或来自其他个体的病理组织不相关(例如，来自身体的不同位置或具有不同组织类型)的正常组织。
[0193] 如本文所用，“癌前组织”是指推测与癌症或恶性肿瘤的发病率增加有关的含有一些病变或异常的组织。
[0194] 术语“肿瘤”指的是团块或赘生物，其本身被定义为细胞的异常新生长，该细胞通常比正常细胞生长更迅速且如果不治疗将继续增长有时导致相邻结构的损害。肿瘤尺寸可以广泛变化。肿瘤可以是实体或充满液体。肿瘤可以指良性(非恶性，通常无害)或恶性(能够转移)生长。一些肿瘤可能含有赘生性细胞(如原位癌)并且同时含有恶性癌细胞(如腺癌)。这应该被理解为包括位于整个身体多个位置的赘生物。因此，出于本公开文本的目的，肿瘤包括原发性肿瘤、淋巴结、淋巴组织和转移性肿瘤。癌性、癌前和癌性生长之间的界限并不总是很清楚，但每种生长都有一般性质。良性肿瘤是非恶性肿瘤。良性肿瘤通常是局部的，并且不会扩散(转移)到身体的其他部位。大多数良性肿瘤对治疗反应良好。然而，如果不及时治疗，一些良性肿瘤可能会变大并由于其尺寸而导致严重的损伤或损害。通过这种方式，良性肿瘤可以模仿恶性肿瘤，并且因此有时得到治疗。恶性肿瘤是常对治疗有抗性的癌性生长，可能扩散到身体的其他部位，并且有时在移除后复发。“癌症”是针对恶性生长(恶性肿瘤或赘生物)的另一个术语。
[0195] 肿瘤的毒力可以变化。某些癌症可能相对容易治疗和/或治愈，而其他癌症更具侵袭性。肿瘤毒力可能至少部分由差异基因表达或由基因组改变表征确定。在癌性细胞中，允许细胞活化的机制或沉默基因被破坏。因此，常存在对于其他组织和/或其他发育阶段为特异性的基因的异常活化。例如，在肺癌中，表达对于产生游动精子(应该是沉默的)为特异性的基因的肿瘤细胞是极具毒性的(高风险癌症，展现出增加的增殖能力和从机体免疫系统隐藏的便利)。已经显示，在几乎所有的癌症中，种系中的数十个特异性基因是异常活化的。参见例如Rousseaux et al.,Ectopic Activation of Germline and Placental Genes Identifies Aggressive Metastasis-Prone Lung Cancers.Science Translational Medicine(2013)5(186):186。因此，由于基因的上调或下调可能与特定癌症的毒性形式相关，因此可能能够在诊断测试后预测哪些癌症即使在肿瘤发展的早期阶段被充分治疗的情况下仍具有高复发风险和致命预后。
[0196] 术语“淋巴结”是指椭圆形或肾形的淋巴系统器官，广泛存在于整个身体，包括腋窝和胃，并通过淋巴管连接。淋巴结含有多种免疫细胞，包括但不限于B细胞和T细胞。淋巴结对于免疫系统的正常功能非常重要，并且可能充当外来粒子和癌细胞的过滤器。
[0197] 术语“息肉(一或多个)”是指从粘膜伸出的异常生物团块。息肉可能存在于许多组织中，包括但不限于结肠、胃、鼻、耳、鼻窦(一个或多个)、膀胱和子宫。
[0198] 术语“转移瘤”或“转移性肿瘤”是指肿瘤和/或其相关组分(包括但不限于血管、骨骼、脑膜)，其从一个器官或身体的部分向另一个发展或扩散。
[0199] 术语“囊肿”是指与附近组织相比具有不同的膜和分裂的圆形或椭圆形闭合囊。在一些方面，囊肿是聚集在一起形成囊的细胞簇(与水分子聚集在一起形成泡沫的方式不同)。在一些方面，形成这种囊或囊肿的“壳”的细胞与该给定位置的所有周围细胞相比明显异常。囊肿可能包括但不限于空气、流体或任何半固体材料。一些肿瘤可能含有囊肿，或被描述为“囊性”。
[0200] 术语“切除物”是指从受试者移除的器官或其他身体结构的全部或部分。
[0201] 如本文所用，术语“器官(一个或多个)”是指在动物中具有特定功能的任何解剖部位或组织。该术语包括解剖部位或组织的部分或全部，例如肺的肺叶。此类器官包括但不限于肾上腺、阑尾、膀胱、脑、耳朵、食道、眼睛、胆囊、心脏、肾脏、肠道(例如，大肠或小肠)、肝脏、肺、口腔、肌肉、鼻、胰腺、甲状旁腺、松果体、垂体、皮肤、脾、胃、胸腺、甲状腺、气管、子宫、阑尾或其部分。
[0202] 术语“细胞簇”(或“多个细胞簇”)是指细胞(例如恶性细胞、成纤维细胞、免疫细胞、干细胞或内皮细胞)的一个或多个聚集体。在一个方面，细胞簇包括1-10、10-100、100-200、200-1,000、1,000-5,000、10,000-100,000、100,000-1,000,000、1,000,000-5,000,
000、5,000,000-1,000,000,000、1,000,000,000-5,000,000,0000或更多个细胞。术语“多个细胞簇”意指超过一个细胞簇。这些细胞簇聚合或分开存在。细胞簇内的细胞通过蛋白质(如钙粘蛋白)相互粘附，并通过整联蛋白粘附于周围的细胞外基质。因此，细胞簇内的细胞最有可能相互关联，并且可能被认为是亚克隆，或从亚克隆衍生而来。
000、5,000,000-1,000,000,000、1,000,000,000-5,000,000,0000或更多个细胞。术语“多个细胞簇”意指超过一个细胞簇。这些细胞簇聚合或分开存在。细胞簇内的细胞通过蛋白质(如钙粘蛋白)相互粘附，并通过整联蛋白粘附于周围的细胞外基质。因此，细胞簇内的细胞最有可能相互关联，并且可能被认为是亚克隆，或从亚克隆衍生而来。
[0203] 如本文所用，术语“细胞器”是指细胞膜结合结构，如叶绿体、线粒体和细胞核。术语“细胞器”包括天然和合成的细胞器。
[0204] 如本文所用，术语“肽”是指通过肽键连接的氨基酸的短聚合物。所有的氨基酸可能具有L-或D-构型。
[0205] 如本文所用，术语“核酸”是指任何长度的核苷酸的聚合形式，该核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或肽核酸(PNA)，其包括嘌呤和嘧啶碱基，或其他天然的、化学或生化修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基。多核苷酸的主链可包括糖和磷酸基团(正如典型地可在RNA或DNA中所见的)或者经修饰或取代的糖或磷酸基团。在一个方面，多核苷酸包括经修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。
[0206] 术语“脂质”以其常规含义使用，为涵盖不溶于水的脂肪、脂质、原生质的醇醚可溶性成分的通称。脂质构成脂肪、脂肪油、精油、蜡、类固醇、甾醇、磷脂、糖脂、硫脂、氨基脂、脂肪色素(脂色素)和脂肪酸。该术语涵盖天然存在的和合成产生的脂质。与本公开内容相关的优选脂质是：磷脂，包括磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺以及鞘磷脂。
[0207] 术语“代谢物”是指由酶促反应产生的化合物、蛋白质或任何物质、副产物或材料，即通过酶参与的过程合成的化合物。
[0208] 术语“液体组织”是指任何为或可以处于液体形式的组织，其包括但不限于血液、血浆、血清、唾液、精液、宫颈分泌物、唾液、尿液、眼泪、汗液、母乳和羊水。术语“非液体组织”是指不为液体组织的任何组织。
[0209] 术语“细胞学针抽吸物”是指细针抽吸活检(FNAB、FNA或NAB)或细针抽吸细胞学(FNAC)的程序。
[0210] 术语“渗出物”是指从受试者收集流体的程序。在一些方面，以渗出物收集的液体可被描述为具有病理状况、障碍、异常体征或症状。在另一个方面，来自渗出物的流体可以是体腔或腹膜间隙中流体的过量累积。
[0211] 术语“巴氏涂片”是指宫颈癌的筛查程序。它测试宫颈上(子宫口)的癌前或癌性细胞的存在。
[0212] 如本文所用，术语“异常组织”意指展示与正常组织中的特征不同的限定特征的组织。例如，在一个方面，乳腺癌组织与非表型癌性的乳腺组织相比可以是“异常的”，但对于另一种特征(如特定生物标记物的基因表达)可以是“正常的”。
[0213] 术语“表型正常组织”是指具有与被认为是正常的特征相同、相似或基本上相似的物理特征(例如组织学外观)的组织。术语“表型异常组织”是指具有与被认为是异常的特征相同、相似或基本上相似的物理特征的组织。
[0214] 术语“表型上同质”意指与被鉴定为组或组织类型例如乳房、结肠、肺的其他成员的特征相同或相似或基本上相似的至少一个或多个物理特征(例如组织学外观)。
[0215] 术语“基因型正常组织”是指具有与被认为是正常的特征相同、相似或基本上相似的基因组学(例如染色体、线粒体、RNA、微小RNA和/或非编码RNA)特征(例如基因序列)的组织。术语“基因型异常组织”是指具有与被认为是异常的特征相同、相似或基本上相似的遗传特征((例如基因序列)的组织。
[0216] 当涉及细胞、组织或受试者时，术语“遗传上多样的”是指如下的受试者、组织或细胞群，其中该组的至少两个成员彼此不同或与至少另一个体、细胞或组织在基因组水平上(例如染色体、线粒体、RNA、微小RNA和/或非编码RNA)不同。当涉及两个或两个以上个体时，术语“遗传上同质的个体”是指在基因组水平(例如染色体、线粒体、RNA、微小RNA和/或非编码RNA)上展现出基本上一致的特定标记物或特征的个体。
[0217] “族群”是指具有共同的民族或文化传统的社会群体。在一个方面，该术语意指从共同或密切相关的遗传起源中衍生的组的成员。
[0218] 术语“小分子”是指可用于调节生物过程的低分子量有机材料。在一个方面，分子量范围为从0-100道尔顿、100-200道尔顿、200-300道尔顿、300-400道尔顿、400-500道尔顿、500-600道尔顿、600-700道尔顿、700-800道尔顿、800-900道尔顿或900-1000道尔顿。在另一个方面，分子量低于1000道尔顿。小分子包括但不限于有机化合物、肽、代谢物和脂质。
[0219] 术语“染料”是指可通过光的选择性吸收而将颜色赋予受试者的物质。在一些实施方案中，染料是可溶的或固体的。在另一个实施方案中，染料通过吸收、溶解和机械保留或者通过离子或共价化学键而保留在底物中。在另一个实施方案中，染料是吸收电磁放射(例如，在选择性波长下)的任何有机或无机分子或部分。
[0220] 如本文所用，术语“定量数据”意指表示与测量单位相关的特定数量、量或范围的数据。例如，肿瘤的定量数据包括但不限于肿瘤的尺寸或生物标记物的表达水平。
[0221] 如本文所用，术语“定性数据”是指描述了对象的特征、特性或其他性质的信息。例如，癌症的定性数据包括但不限于肿瘤的阶段、外观和其他物理特征。
[0222] 如本文所用，涉及测量值时，术语“归一化”旨在将于不同尺度上测量的值调整为设想的常见尺度。
[0223] 基因只是癌症生物标记物的一个类型。如本文所用，术语“生物标记物”或“标记物”是指在血液、其他体液或组织中发现的生物分子，其为正常或异常过程的体征，或者为病症或疾病(如癌症)的体征。生物标记物可用于确定身体对针对疾病或病症的治疗反应如何，或者受试者是否易患疾病或病症。在癌症的背景下，生物标记物指的是指示体内存在癌症的生物物质。生物标记物可以是由肿瘤分泌的分子或机体对癌症存在的特定反应。遗传学、表观遗传学、蛋白质组学、糖基化学和成像生物标记物可用于癌症诊断、预后和流行病学。可以在非侵入性收集的生物流体如血液或血清中测定此类生物标记物。几种基于基因和蛋白质的生物标记物已经用于患者护理，包括但不限于AFP(肝癌)、BCR-ABL(慢性粒细胞白血病)、BRCA1/BRCA2(乳腺癌/卵巢癌)、BRAF V600E(黑素瘤/结肠直肠癌)、CA-125(卵巢癌)、CA19.9(胰腺癌)、CEA(结肠直肠癌)、EGFR(非小细胞肺癌)、HER-2(乳腺癌)、KIT(胃肠道间质瘤)、PSA(前列腺特异性抗原)、S100(黑素瘤)和许多其他标记物。生物标记物可能用作诊断(鉴定早期癌症)和/或预后(预测癌症的侵袭性如何和/或预测受试者将如何对特定治疗作出反应和/或癌症复发可能性如何)。
[0224] 如本文所用，术语“临床相关标记物”意指与临床结果或病症(例如，疾病或病症(例如癌症)的存在或不存在)相关的标记物或生物标记物。
[0225] 如本文所用，术语“癌性组织”是指携带肿瘤细胞的任何组织。癌组织包括但不限于肌肉、皮肤、脑、肺、肝、脾、骨髓、胸腺、心脏、淋巴、血液、骨、软骨、胰腺、肾脏、胆囊、胃、肠、睾丸、卵巢、子宫、直肠、神经系统、眼睛、腺体或结缔组织。
[0226] “预后”意指受试者当前状况的预测或可能结果，包括患者中癌症复发和/或转移的可能性。
[0227] 如本文所用，术语“保存”或“固定”是指制备生物样品(例如组织切片)的步骤。保存或固定的方法包括但不限于化学固定、热固定、浸渍、灌注和/或冻干。因此，“经固定的样品”是如上所述加工过的样品。
[0228] 术语“活细胞”是指尚未固定或保存的任何细胞。在一些实施方案中，术语“活细胞”包括功能性细胞。出于本公开文本的目的，本领域技术人员可以容易地区分活细胞和死细胞。
[0229] 如本文所用，术语“蜡包埋”或“石蜡包埋”用于其中当使用切片机进行切片时将组织样本注入石蜡以保留其细胞结构的过程，并且具有合适用于长期储存的额外益处。
[0230] 如本文所用，术语“一种或多种组织”是指来自一个或多个受试者的组织，或来自相同受试者的一种或多种组织。术语“两种或更多种组织”用于来自两个或更多个受试者的组织，或来自相同受试者或患者的两种或更多种组织。
[0231] 如本文所用，术语“恶变前或恶性细胞”用于描述已经历恶性转化或准备经历恶性转化的任何细胞。恶变前或恶性细胞的特征包括但不限于不受控制的增殖、转移、异常细胞代谢、逃避细胞凋亡、具有生长信号的自给自足和持续的血管生成。例如，结肠息肉可能是结肠癌恶变前。
[0232] 如本文所用，术语“循环肿瘤细胞”是指在脉管系统、淋巴管或其他流体内循环的肿瘤或癌细胞。循环肿瘤细胞包括但不限于白血病细胞。
[0233] 如本文所用，术语“正常邻近组织”是指与肿瘤细胞或肿瘤组织相邻的正常组织。
[0234] 涉及重建均质化样品时，术语“重建”意指混合或组合。
[0235] 涉及均质物时，术语“提取成分”意指分离或纯化细胞结构的组分。
[0236] 如本文所用，术语“FFPE样品”意指福尔马林固定的石蜡包埋样品。FFPE样品可用于许多医学研究，包括但不限于诊断、IHC和基因表达谱分析或疾病起源分析。
[0237] 术语“预定值”在此通常代表用于计算数据变化的值。在一个方面，基于历史数据或不同组的样品或与在待研究的数据上相似的一组样品来计算预定值。
[0238] 术语“风险值”是指与风险相关的定量或定性值。例如，癌症风险值是定量或限定引起癌症的风险的值。
[0239] 术语“染色体易位”是指由非同源染色体之间的部分的重排引起的染色体异常。
[0240] 术语“染色体内倒位”是指染色体重排，其中染色体的一个区段首尾颠倒。在一个方面，当单个染色体在其自身内发生破裂和重排时发生倒位。
[0241] 术语“治疗方案”是根据本领域熟知的含义使用。例如，该术语是指针对遭受病理状态(例如慢性丙型肝炎感染或癌症)的个体的治疗计划，其指定了包括但不限于要给予该患者的一种或多种药剂、这一种或多种药剂的剂量以及治疗的时间表和持续时间。个性化剂量或治疗方案是基于精确药物概念的疗法或剂量方案，其考虑患者或受试者的个体特征，例如基因构成、药物遗传学、种族、治疗史、家族史、临床化学或其他相关特征或测量。
[0242] 术语“化疗”是指用化学药剂治疗。化疗可被定义为利用专门设计用于靶向、对抗和/或破坏患病细胞的药物。可通过化疗治疗的疾病的非限制性例子包括癌症、自身免疫疾病如系统性硬化症、红斑狼疮、类风湿性关节炎、血管炎和病毒感染。在一个方面，化疗剂通过靶向身体中快速分裂的细胞来破坏癌细胞。由于缺乏对癌细胞的特异性，化疗的毒性作用也在其他快速分裂的非癌性细胞中看到。血液细胞，口腔、肠道、鼻、指甲和头发中的细胞是身体中一些快速分裂的细胞。体内正常细胞的破坏会引起副作用，如脱发、恶病质、贫血、白细胞减少症和嗜中性粒细胞减少症。这些副作用限制了化疗的有效性，并且增加了剂量降低的风险，直接影响了患者的存活。
[0243] 术语“免疫疗法”是指涉及特异性免疫应答和/或一种或多种免疫效应功能的活化或失活的治疗。
[0244] 术语“放射”或“放射疗法”涉及如下治疗，所述治疗涉及使用高能粒子或波(包括但不限于x射线、γ射线、电子束或质子)来治疗疾病(例如，癌症)或病理状态。
[0245] 术语“手术”涉及在有或没有器械的情况下对患者的任何系统行为，以产生治愈或矫正效果。
[0246] 术语“基因疗法”是指使用基因转移过程或基因编辑过程(例如CRISPR)，优选地用于在受试者或患者中引起治疗效果的目的。
[0247] 如本文所用，术语“激素疗法”被定义为与调节激素有关的治疗。激素疗法可能包括但不限于去除合成激素或激素原的腺体，阻断或抑制激素合成，或阻止激素与其受体的结合，或下调或降解该激素受体。
[0248] 如本文所用的术语“干细胞疗法”是通过使用干细胞来治疗或预防疾病或病理状况的治疗。
[0249] 术语“输血”涉及通过静脉管线接受血液的程序。
[0250] 如本文所用，术语“物理疗法”是指通过使用治疗性运动和应用旨在恢复或促进正常功能或发育的方式来治疗物理功能障碍或损伤。
[0251] 如本文所用，术语“光动力疗法”是指如下的过程，其中特定波长的光被引导至经历治疗或研究的组织或细胞，该组织或细胞已经通过给予光反应性药剂或光敏剂而变得光敏。在一个实施方案中，目标可以是诊断性的，其中选择光的波长以引起光反应剂发荧光，由此产生关于组织的信息而不损害组织。该目标还可以是治疗性的，其中递送到在治疗中的靶组织的光的波长引起光反应剂与氧发生光化学相互作用，产生高能量种类如单线态氧，导致局部组织溶解或破坏，或触发光敏组织或细胞的免疫应答。
[0252] 如本文所用，术语“差异表达”是指两个或更多个样品的基因或蛋白质表达水平的差异。在一个方面，差异表达结果可以用于鉴定疾病、生物标记物或可能与病理状况相关的任何模式。
[0253] 如本文所用，术语“第一谱”是指受试者或受试者组的数据集。在一个方面，第一谱可以用作基线以确定一个或多个后续谱中的变化。在另一个方面，第一谱中的数据可以被并入后续分析或生成后续谱的过程中。
[0254] 如本文所用，术语“预定谱”是指与生理条件相关联的数据集或数据集组。预定谱可以衍生自受试者或受试者组。在一个方面，预定谱可以包括组织学或已知生理状况数据集。在另一个方面，预定谱被用作基线以确定生理状况(例如，肿瘤进展)的变化。
[0255] 如本文所用，术语“定量得分”是指生理条件(例如，疾病风险)的数字表示。
[0256] 如本文所用，术语“增殖”意指细胞的生长和分裂。在一些实施方案中，如本文所用，关于细胞，术语“增殖”是指一段时间内数目上可以增加的一组细胞。
[0257] 术语“细胞凋亡”是指程序性细胞死亡的过程。在一些方面，细胞凋亡伴随着细胞形态学改变和细胞活力丧失。
[0258] 术语“坏死”涵盖细胞坏死状态以及中间状态，展现出坏死和凋亡特征。
[0259] 如本文所用，术语“细胞迁移”意为由生理活性物质诱导或由生理变化(例如，转化)引起的细胞迁移。
[0260] 术语“上皮-间质转化”或“EMT”是指其中正常而言为非增殖性和非移动性的上皮细胞转变成由增殖性和移动性表型表征的间充质细胞的过程。EMT是使复杂组织中发现的细胞多样化的中心机制，因此，它是涉及制定机体计划的组织的过程(Kalluri and Nelson J Clin Invest 112(12):1776-1784,2003)。虽然上皮细胞一度被认为是终端分化的，但认识到上皮细胞具有使得能够转变为移动性间充质细胞的可塑性要素(Boyer et al.Biochem Pharmacol 60:1099,2000；Nieto Nat Rev Mol Cell Biol 3:155-166,
2002)。因此，在成人组织中为使得能够在受损组织中形成成纤维细胞(Strutz et al.J Cell Biol 130:393-405,1995；Iwano et al.J Clin Invest 110:341-350,2002)和在上皮癌的启动转移中(Kiermer et al.Oncogene 20:6679-6688,2001；Janda et al.J Cell Biol 156:299-313,2002；Xue et al.Cancer Res 63:3386-3394,2003)需要EMT。
2002)。因此，在成人组织中为使得能够在受损组织中形成成纤维细胞(Strutz et al.J Cell Biol 130:393-405,1995；Iwano et al.J Clin Invest 110:341-350,2002)和在上皮癌的启动转移中(Kiermer et al.Oncogene 20:6679-6688,2001；Janda et al.J Cell Biol 156:299-313,2002；Xue et al.Cancer Res 63:3386-3394,2003)需要EMT。
[0261] 在一个方面，EMT是形成间充质细胞中解聚上皮细胞单元和重塑上皮细胞运动的过程。该转变需要上皮细胞的分子重编程，通常被认为是通过多种细胞因子、金属蛋白酶和膜组装抑制剂进行(Kalluri and Neilson 2003supra；Yang and Liu Am J Pathol 159:1465-1475,2001；Zeisberg et al.Am J Pathol 159:1313-1321,2001；Fan Kindney Int
56:1455-1467,1999)。
56:1455-1467,1999)。
[0262] 如本文所用，术语“有丝分裂”与术语“细胞分裂”可互换使用。在一些实施方案中，有丝分裂仅指细胞分裂过程的一个阶段：姐妹染色单体在两个子细胞之间平均分配的过程。在真核细胞中，有丝分裂之后是胞质分裂，这是细胞质被切割成两个不同但遗传上一致的子细胞的过程。
[0263] 在有丝分裂开始时，被称为细胞质微管的小细胞内丝状结构，其主要成分是被称为微管蛋白的蛋白质，可分解成微管蛋白分子。然后微管蛋白重新组装成微管，形成细胞内结构，被称为“有丝分裂纺锤体”。有丝分裂纺锤体在将分裂细胞内的染色体在两个子核之间精确分配中起关键作用。癌细胞的特征在于比在大多数健康细胞中观察到的更快速的细胞分裂和增殖，并且许多抗癌剂通过抑制细胞分裂而进行操作。由于癌细胞比健康细胞分裂得更快，癌细胞优先被抑制有丝分裂的抗癌剂杀死。此类化合物被称为“抗有丝分裂剂”。
[0264] 术语“细胞周期停滞”是指细胞周期中的停止点，其中细胞不处于围绕复制和分裂的过程中。自然细胞周期包括许多检查点，其使细胞能够确定是否继续分裂或停止。这些暂停也可能由外部因素诱发，如暴露于放射或用于控制细胞生长的药物。
[0265] 细胞周期的第一个阶段是G1，此时细胞准备复制。细胞遗传材料在S期期间复制。细胞损害在G2期期间被修复，之后转至M期，进行有丝分裂。有丝分裂后，细胞可能再次进入G1期，或移动到G0期(静止期)。检查点在每个阶段临时暂停细胞周期，以使细胞决定是否应该继续。一些细胞被编程为不经常复制，而受损细胞可能需要时间进行修复或破坏。
[0266] 在一些实施方案中，细胞周期停滞先于细胞凋亡或细胞死亡。当细胞由于DNA损害而不再有功能性时，会发生这种情况。靶向细胞以破坏。对于细胞，细胞周期停滞允许细胞通过定期检查可能造成功能性问题或导致肿瘤发展的DNA破坏迹象。
[0267] 术语“S期”是指细胞周期中DNA复制的时期。S期正常发生在G1期和G2期之间。在S期中精确和准确的DNA复制对于预防遗传异常是必需的。
[0268] 如本文所用，术语“衰老”是指DNA复制和细胞生长的永久停止，其不能被生长因子逆转。这种现象可能发生在正常细胞的增殖寿命结束时，或者响应于细胞毒性药物、DNA损害而发生在正常细胞或肿瘤细胞中。衰老的特征在于某些形态学特征，包括但不限于细胞尺寸增加、细胞形态扁平化、粒度增加以及衰老相关β-半乳糖苷酶活性(SA-β-gal)的存在。
[0269] 如本文所用，术语“分化”是指细胞的结构或功能在其分裂、增殖和生长过程中被特化的过程。通常，分化指的是相对简单的系统被分成两个或更多个性质上不同的分系统的现象。
[0270] 如本文所用，术语“检测”是指鉴定特定分子的存在的行动或过程。在一个实施方案中，生物标记物的检测可以指鉴定生物标记物的表达。
[0271] 如本文所用，术语“固定剂”是指用于固定组织的药剂，用于多种目的，包括但不限于递送、储存、组织学研究和加工。
[0272] 如本文所用，术语“核酸序列”和“多核苷酸”可互换使用，以指任何长度的核苷酸的聚合形式，无论核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。因此，该术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA；基因组DNA；cDNA；DNA-RNA杂合体；或者包括嘌呤和嘧啶碱基或其他天然的、化学修饰的或生化修饰的核苷酸碱基，非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。
[0273] 当应用于核酸序列时，术语“编码”是指处于其天然状态或当通过本领域技术人员熟知的方法操作时可被转录和/或翻译以产生mRNA的多核苷酸。反义链是该核酸的互补序列，从反义链中可以推断出编码序列。
[0274] 如本文所用，术语“载体”是指设计用于在不同宿主之间转移的核酸构建体，包括但不限于质粒、病毒、黏粒、噬菌体、BAC、YAC等。在一些实施方案中，质粒载体可以由可商购载体制备。在其他实施方案中，根据本领域已知的技术，病毒载体可以由杆状病毒、逆转录病毒、腺病毒、AAV等产生。在一个实施方案中，该病毒载体是慢病毒载体。
[0275] 如本文所用的术语“启动子”是指调节编码序列如基因的表达的任何序列。例如，启动子可以是组成型的、可诱导的、可抑制的或组织特异性的。“启动子”是控制序列，其是多核苷酸序列的控制转录起始和速率的区域。它可能含有调节蛋白和分子可能结合的遗传元件，如RNA聚合酶和其他转录因子。
[0276] 如本文所用，术语“分离的细胞”通常是指与组织的其他细胞基本上分开的细胞。
[0277] “有效量(effective amount或efficacious amount)”是指当为了治疗患者、哺乳动物或其他受试者而给予时足以实现针对疾病的此类治疗的药剂的量或者两种或更多种药剂的组合量。“有效量”将根据一种或多种药剂、疾病及其严重性以及待治疗的受试者的年龄、体重等而变化。
[0278] 如本文所用，术语“可检测标记物或标记”是指能够直接或间接产生可检测信号的至少一种标记物。标记物的非详尽列表包括产生可检测信号的酶(例如通过比色法、荧光、发光)，如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；发色团，如荧光、发光染料；通过电子显微镜检查或通过其电学性质如电导率、电流分析、伏安法、阻抗检测到电子密度的基团；可检测基团，例如其分子具有足够尺寸以诱导其物理和/或化学性质上可检测的修饰，此类检测可以通过光学方法如衍射、表面等离子体共振、表面变化、接触角变化或物理方法如原子力光谱、隧道效应或放射性分子如32P、35S或125I来完成。
[0279] 如本文所用，术语“纯化标记物”是指用于纯化或鉴定的至少一种标记物。标记物的非详尽列表包括His、lacZ、GST、麦芽糖结合蛋白、NusA、BCCP、c-myc、CaM、FLAG、GFP、YFP、樱桃红(cherry)、硫氧还蛋白、聚(NANP)、V5、Snap、HA、几丁质结合蛋白、Softag 1、Softag 3、Strep或S蛋白。合适的直接或间接荧光标记物包括FLAG、GFP、YFP、RFP、dTomato、樱桃红、Cy3、Cy 5、Cy 5.5、Cy 7、DNP、AMCA、生物素、地高辛配基、Tamra、德克萨斯红、罗丹明、Alexa荧光物质、FITC、TRITC或任何其他荧光染料或半抗原。
[0280] 如本文所用，术语“表达”是指多核苷酸转录成mRNA的过程和/或转录的mRNA随后被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果该多核苷酸来源于基因组DNA，则在真核细胞中表达可以包括mRNA的剪接。基因的表达水平可以通过测量细胞或组织样品中mRNA或蛋白质的量来确定。在一个方面，可以将来自一个样品的基因的表达水平直接与来自对照或参考样品的该基因的表达水平进行比较。在另一个方面，可以将来自一个样品的基因的表达水平直接与给予化合物后来自相同样品的该基因的表达水平进行比较。
[0281] 如本文所用，当在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中使用时，“同源性”或“一致”、“一致性百分比”或“相似性”是指在指定区域相同或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基的两个或更多个序列或子序列(例如，编码本文描述的抗体的核苷酸序列或本文描述的抗体的氨基酸序列)，例如至少60％一致性，优选至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高一致性。可以通过比较在每个序列中可以用于比较目的比对的位置确定同源性。当比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，那么这些分子在该位置是同源的。序列之间的同源程度是序列共有的匹配或同源位置数目的函数。比对和百分比同源性或序列一致性可以使用本领域已知的软件程序来确定，例如Molecular Biology中Current Protocols(Ausubel et al.,eds.1987)Supplement 30,section 7.7.18,Table 7.7.1中所述的那些。优选地，将默认参数用于比对。优选的比对程序是BLAST，使用默认参数。具体而言，优选的程序是BLASTN和BLASTP，使用以下默认参数：遗传密码＝标准；过滤器＝无；链＝两条；截止值＝60；期望＝
10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；排序方式＝高得分(HIGH SCORE)；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+SwissProtein+SPupdate+PIR。这些程序的详细信息可访问以下因特网地址：ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST。术语“同源性”或“一致”、“一致性百分比”或“相似性”也指测试序列的互补序列或可以应用于测试序列的互补序列。该术语还包括具有缺失和/或添加的序列、以及具有取代的序列。如本文所述，优选的算法可以说明缺口等。优选地，一致性存在于长度至少大约25个氨基酸或核苷酸的区域或者更加优选地在长度至少50-100个氨基酸或核苷酸的区域。“不相关”或“非同源”序列与本文公开的序列之一共享小于40％一致性，或可替代地小于25％一致性。
10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；排序方式＝高得分(HIGH SCORE)；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+SwissProtein+SPupdate+PIR。这些程序的详细信息可访问以下因特网地址：ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST。术语“同源性”或“一致”、“一致性百分比”或“相似性”也指测试序列的互补序列或可以应用于测试序列的互补序列。该术语还包括具有缺失和/或添加的序列、以及具有取代的序列。如本文所述，优选的算法可以说明缺口等。优选地，一致性存在于长度至少大约25个氨基酸或核苷酸的区域或者更加优选地在长度至少50-100个氨基酸或核苷酸的区域。“不相关”或“非同源”序列与本文公开的序列之一共享小于40％一致性，或可替代地小于25％一致性。
[0282] 在一个方面，术语抗体的“等效物”或“生物学等效物”意为如通过ELISA或其他合适方法所测量的，抗体选择性结合其表位蛋白或其片段的能力。生物学等效抗体包括但不限于结合与参考抗体相同的表位的那些抗体、肽、抗体片段、抗体变体、抗体衍生物和抗体模拟物。
[0283] 在没有明确叙述的情况下推断并且除非另有指示，否则当本公开文本涉及多肽、蛋白质、多核苷酸或抗体时，其等效物或生物学等效物在本公开文本的范围内。如本文所用，当提及参考蛋白质、抗体、多肽或核酸时，术语“其生物等效物”旨在与“其等效物”同义，意指具有最低同源性同时仍保持所需结构或功能的那些。除非在本文中具体列举，否则应考虑到本文提及的任何多核苷酸、多肽或蛋白质也包括其等效物。例如，等效物意指至少约70％同源性或一致性，或至少80％同源性或一致性，并且可替代地，或至少约85％，或可替代地至少约90％，或可替代地至少约95％或可替代地98％同源性或一致性，并展示与参考蛋白质、多肽或核酸基本上等效的生物学活性。可替代地，当提及多核苷酸时，其等效物是在严格条件下与参考多核苷酸或其互补序列杂交的多核苷酸。
[0284] 多核苷酸或多核苷酸区域(多肽或多肽区域)与另一序列具有确定百分比(例如，80％、85％、90％或95％)的“序列一致性”意为，当比对时，在比较两个序列中，碱基(或氨基酸)的百分比是相同的。比对和百分比同源性或序列一致性可以使用本领域已知的软件程序来确定，例如Molecular Biology中Current Protocols(Ausubel et al.,eds.1987)Supplement 30,section 7.7.18,Table 7.7.1中所述的那些。优选地，将默认参数用于比对。优选的比对程序是BLAST，使用默认参数。具体而言，优选的程序是BLASTN和BLASTP，使用以下默认参数：遗传密码＝标准；过滤器＝无；链＝两条；截止值＝60；期望＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；排序方式＝高得分(HIGH SCORE)；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+SwissProtein+SPupdate+PIR。这些程序的详细信息可访问以下因特网地址：ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST。
[0285] “杂交”是指其中一个或多个多核苷酸反应形成经由核苷酸残基的碱基之间氢键键合而稳定的复合物的反应。氢键可以通过沃森-克里克碱基配对、Hoogstein键合或以任何其他序列特异性方式形成。该复合物可包括形成双链体结构的两条链、形成多链复合物的三条或更多条链、单一自杂交链或这些的任何组合。杂交反应可以构成更广泛步骤中的一步，如PCR反应的起始，或核酶对多核苷酸的酶切割。
[0286] 严格杂交条件的例子包括：约25℃至约37℃的孵育温度；约6x SSC至约10x SSC的杂交缓冲液浓度；约0％至约25％的甲酰胺浓度；以及从约4x SSC至约8x SSC的洗涤溶液。中等杂交条件的例子包括：约40℃至约50℃的孵育温度；约9x SSC至约2x SSC的缓冲液浓度；约30％至约50％的甲酰胺浓度；以及约5x SSC至约2x SSC的洗涤溶液。高严格条件的例子包括：约55℃至约68℃的孵育温度；约1x SSC至约0.1x SSC的缓冲液浓度；约55％至约
75％的甲酰胺浓度；以及约1x SSC、0.1x SSC的洗涤溶液或去离子水。通常，杂交孵育时间为5分钟至24小时，具有1个、2个或更多个洗涤步骤，并且洗涤孵育时间为约1、2或15分钟。
SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸盐缓冲液。可以理解，可以采用SSC的等效物，使用其他缓冲液系统。
75％的甲酰胺浓度；以及约1x SSC、0.1x SSC的洗涤溶液或去离子水。通常，杂交孵育时间为5分钟至24小时，具有1个、2个或更多个洗涤步骤，并且洗涤孵育时间为约1、2或15分钟。
SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸盐缓冲液。可以理解，可以采用SSC的等效物，使用其他缓冲液系统。
[0287] 如本文所用，术语“分离的”是指基本上不含其他材料的分子、细胞或者生物材料或细胞材料。在一个方面，术语“分离的”是指分别与存在于天然来源中的其他DNA或RNA、或者蛋白质或多肽、或者细胞或细胞器、或者组织或器官分离的核酸如DNA或RNA、或者蛋白质或多肽(例如，抗体或其衍生物)、或者细胞或细胞器、或者组织或器官。术语“分离的”还指当通过重组DNA技术产生时基本上不含细胞材料、病毒材料或培养基，或者当用化学方法合成时基本上不含化学前体或其他化学品的核酸或肽。此外，“分离的核酸”意在包括不以片段天然地存在并且不会以天然状态被发现的核酸片段。术语“分离的”在本文中也用于指从其他细胞蛋白中分离的多肽，并且意在涵盖纯化和重组的多肽。术语“分离的”在本文中也用于指从其他细胞或组织中分离的细胞或组织，并且意在涵盖培养的和工程化的。
[0288] 术语“单个细胞”或“单细胞”意指生物体的结构和/或功能单位。在一些方面，单个细胞包括但不限于细胞质、细胞核或细胞膜。
[0289] 如本文所用，术语“单克隆抗体”是指由B淋巴细胞的单个克隆或由已转染了单抗体的轻链和重链基因的细胞产生的抗体。单克隆抗体通过本领域技术人员已知的方法产生，例如通过由骨髓瘤细胞与免疫脾细胞融合制备杂交抗体形成细胞。单克隆抗体包括人源化单克隆抗体。
[0290] 术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可互换使用，并且在其最广义上指代两个或更多个亚基氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物的化合物。该亚基可以通过肽键连接。在另一个方面，该亚基可以通过其他键例如酯、醚等连接。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对蛋白质或肽的序列可以包括的氨基酸的最大数目没有限制。如本文中所用，术语“氨基酸”指天然的和/或非天然的或者合成的氨基酸，包括甘氨酸以及D和L旋光异构体、氨基酸类似物和肽模拟物。
[0291] 如本文所用，术语“纯化的”不需要绝对的纯净；更确切些，它旨在为相对性术语。因此，例如，纯化的核酸、肽、蛋白质、生物复合物或其他活性化合物是全部或部分从蛋白质或其他污染物中分离出来的。通常，在将用于本公开文本中的基本上纯化的肽、蛋白质、生物复合物或其他活性化合物与药物载体、赋形剂、缓冲液、吸收增强剂、稳定剂、防腐剂、佐剂或其他辅助成分混合或配制于用于治疗性给药的完全药物制剂中之前，该肽、蛋白质、生物复合物或其他活性化合物构成制备物中存在的所有大分子物质的多于80％。更典型地，在与其他制剂成分混合之前，纯化该肽、蛋白质、生物复合物或其他活性化合物以代表纯化制备物中存在的所有大分子物质的多于90％，通常多于95％。在其他情况下，纯化制备物可以基本上是均匀的，其中其他大分子物质不能通过常规技术检测到。
[0292] 如本文所用，术语“重组蛋白质”是指通过重组DNA技术产生的多肽，其中通常将编码多肽的DNA插入合适的表达载体中，转而将其用于转化宿主细胞以产生异源蛋白。
[0293] 如本文所用，术语“超声处理”是指施加通过液体介质传输的声波(声能)。该声波可能导致粒子(例如，细胞或细胞簇)围绕其平均位置摆动。在一个方面，超声处理导致细胞簇解离成单细胞悬液。
[0294] 如本文所用，“治疗”受试者的疾病或受试者疾病的“治疗”是指(1)预防易患疾病或尚未展现疾病症状的受试者发生该症状或疾病；和/或(2)抑制该疾病或阻滞其发展；和/或(3)改善该疾病或该疾病的症状或使该疾病或该疾病的症状退化。如在本领域中很好地理解，“治疗”是一种用于获得有益的或所希望的结果(包括临床结果)的途径。出于本技术的目的，无论是可检测的还是不可检测的，有益的或所希望的结果可以包括以下的一种或多种，但是不局限于此：一种或多种症状的减轻或缓解，病症(包括疾病)范围的缩减，病症(包括疾病)的稳定(即，不恶化)状态，病症(包括疾病)的延迟或慢化，病症(包括疾病)、状态的进展、缓解或缓和，以及减轻(无论是部分的还是全部的)。
[0295] 基本上同质的代表性样品
[0296] 本公开文本解决了现有技术临床采样方法未能提供代表性样品的局限性。代表性样品的特征与大型实体或样品的关键变量和特征相平行。选择性采样的当前做法目标在于收集组织样品，以满足TNM分期系统的要求。TNM分期系统的样品专门用于反映移除的含有肿瘤的器官的正常解剖结构。虽然对于TNM系统的预后分期很重要，但这种选择性采样方法会产生偏倚的肿瘤样品，或者不含有整个肿瘤团块中发现的遗传多样性和表型多样性的样品。
[0297] 本公开文本提供了由包括基本上均匀分布的细胞结构的异质组织样品衍生的加工均质物组合物，其中代表性样品的每个和/或任何子集中的细胞结构的比率基本上与来源异质组织样品中的细胞结构的比率相似。均质物组合物是新的独特的组织样品，其也代表了原始来源异质组织样品的关键特征。本文所述的组合物和用以制备该组合物的方法克服了现有技术方法的失败，以解决临床样品(尤其用于临床领域例如临床肿瘤学中的样品)中组织异质性的问题。
[0298] 本公开文本的代表性样品在图2A和2B示出，其显示了本公开文本的均质物的示意性图示。图2A显示了具有以不同比例存在的三个亚克隆的肿瘤。所公开的均质化方法生成含有在实体瘤内存在的比例的亚克隆的代表性样品。取自均质物的任何样品都将含有与原始肿瘤中存在的相同的比例的每个亚克隆。图2B是该均质物如何促进低流行率亚克隆的检测的图示。
[0299] 本公开文本的代表性样品克服了由组织的空间分层三维结构施加的采样挑战。在代表性样品中，原始空间分层器官、肿瘤或组织(“OTT”)的组分(细胞结构、细胞、肽、核酸、脂质、代谢物等)按原始OTT中存在的比例存在于子样品或样品子集中。在一些实施方案中，代表性样品是指如下OTT样品，其构成尽可能多的OTT，接近OTT整体或涵盖足够重大部分的OTT，以接近代表在粘附细胞簇、单个细胞、细胞碎片、细胞器、肽、核酸、脂质、代谢物等的水平上OTT的多样性的目标。该代表性样品可含有涵盖OTT的多样性所需的最小量的完整OTT。
[0300] 多个代表性样品可能由单一OTT制成。在该实施方案中，手术移除的OTT首先被加工或以其他方式操纵为单独的子单元，使得每个子单元由空间分层的细胞结构、细胞、肽、核酸等组成。然后将每个子单元充分均质化、混合或以其他方式破坏以产生该OTT亚单元的代表性样品。
[0301] 该代表性样品可以被均质化或以其他方式混合或破坏，以使得任何分析样品或该代表性样品的部分含有存在于该代表性样品中的材料的随机采样。该分析样品的特征是它是该代表性样品的足够大的级分，它涵盖了该代表性样品相对于正应用的分析测试的预期输出(即细胞与大量细胞)的多样性。在该代表性样品中，用于特定测定的任何分析样品都将产生与用于相同测定的另一分析样品一致的数据(在实验误差内)。此外，考虑的是，选择用于特定测定的代表性样品的任何子集将提供可以与使用取自相同代表性样品或来自相同患者的OTT制成的其他代表性样品的分析样品的不同测定所生成的数据交叉参考的信息。还考虑的是，由于原始生物组分的原始比例存在于每个分析子样品中，因此可以在患者之间比较从分析子样品产生的关于OTT的生物组分的比例的数据。
[0302] 在一个实施方案中，该代表性样品是衍生自异质组织样品的经加工的均质物组合物。该均质物组合物包括基本上均匀分布的细胞结构，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成，其中该均质物的每个子集中的细胞结构的比率基本上与该组织样品中的细胞结构的比率相似。在一个实施方案中，该组织样品选自以下项的组：肿瘤、淋巴结、转移瘤、息肉、囊肿、切除物、器官、或其部分。在另一个实施方案中，该组织样品包括空间上分离的细胞结构，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在另一个方面，该细胞结构包括细胞簇、单个细胞、细胞碎片、细胞器、肽、核酸、脂质、代谢物或其组合，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在一个方面，该均质物包括多达25％来自该组织样品的细胞结构，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在一个方面，该均质物包括多达50％来自该组织样品的细胞结构，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在另一个方面，该均质物包括多达75％来自该组织样品的细胞结构，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在不同的方面，该均质物包括多达100％来自该组织样品的细胞结构，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在另一个方面，该均质物包括100％来自该组织样品的细胞结构，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。
[0303] 在另一个实施方案中，该均质物包括100％来自该组织样品的细胞结构，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在一个方面，该组织样品包括非液体组织样品，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在另一个方面，该组织样品包括液体组织样品，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在一个方面，该液体组织样品包括通过手术切除、细胞学针抽吸物、渗出物样品或巴氏涂片中的一种或多种分离的组织，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。
[0304] 在又另一个实施方案中，该基本上同质的细胞结构包括多个单细胞或多个细胞簇，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在一个方面，该细胞结构是从正常组织分离。在另一个方面，该细胞结构是从表型正常或基因型正常组织分离。在又另一个方面，该细胞结构是从异常组织中分离。在一个方面，该细胞结构是从表型异常或基因型异常组织分离。
[0305] 在一个实施方案中，该组织样品包括干细胞、上皮细胞、血细胞、脂肪细胞、皮肤细胞、内皮细胞、肿瘤细胞或免疫细胞，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在一个方面，该肿瘤细胞衍生于选自以下项的组的癌组织：肺癌、白血病、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、脑癌、食管癌、头颈癌、膀胱癌、妇科癌症、卵巢癌、宫颈癌、脂肪肉瘤、黑素瘤、淋巴瘤、浆细胞瘤、肉瘤、神经胶质瘤、胸腺瘤、肝细胞瘤、以及骨髓瘤。在另一个方面，该免疫细胞是选自以下项的组的细胞：嗜中性粒细胞、单核细胞、树突细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、T细胞、B细胞、或自然杀伤细胞。
[0306] 在另一个实施方案中，该组织样品未经保存或固定。在一个方面，该组织样品包括活细胞或最近从受试者分离的细胞。在另一个实施方案中，该组织样品经保存或固定。在一个方面，经保存或固定的组织样品包括已经通过以下项的组中的方法进行冷冻或固定的样品：冷冻、冷冻干燥和蜡包埋。
[0307] 在一个实施方案中，该异质组织样品是从来自相同或不同受试者的一种或多种组织中分离。在一个方面，该组织样品是从一个受试者分离。在另一个方面，该组织样品包括从两个或更多个受试者和从相同或相似组织类型或不同组织类型分离的组织或，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在另一个方面，该两个或更多个受试者是遗传上同质的受试者。在另一个方面，该两个或更多个受试者是表型上同质的受试者。在另一个方面，该两个或更多个受试者是遗传上多样的受试者。在一个方面，该两个或更多个受试者是表型上多样的受试者。在另一个方面，该两个或更多个受试者来自相同的性别或不同的性别。
[0308] 在另一个方面，该两个或更多个受试者来自不同的性别。在又另一个方面，该两个或更多个受试者来自不同的族群。在一个方面，该两个或更多个受试者来自相同的族群。在另一个方面，该受试者选自下组，该组由以下各项组成：动物、农场动物、宠物、人类受试者。
[0309] 在一个实施方案中，该均质物进一步包括非人细胞、人细胞、可检测标记、纯化标记、非天然蛋白、核酸或多核苷酸、小分子、染料、病毒、细菌、寄生虫、原生动物或化学物质，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在一个方面，该小分子包括半抗原、肽标签、蛋白质标签、荧光标签、核酸标签、及其组合，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。
[0310] 生成代表性数据的方法
[0311] 本公开文本还涉及从本文所述的代表性样品或均质物组合物生成代表性数据。在一个方面，用于生成代表性数据的方法包括分析如本文所述的均质物组合物。在另一个方面，该分析包括生成该均质物组合物中标记物的定量和/或定性数据。可以使用任何用以获得与标记物有关的数据的适当方法，其非限制性例子包括通过单细胞测序、单核测序、流式细胞术、免疫组织化学染色、苏木精和伊红染色、全基因组测序、高通量测序、质谱法、DNA微阵列、或其组合进行测量。
[0312] 由于本公开文本的独特采样技术和组合物，目前描述的方法是用于部分生成数据集的强大工具。该代表性样品的细胞结构和/或离散组分基本准确地反映或模拟整个组织样本(通常为实体瘤、淋巴结、转移瘤、息肉、囊肿或其部分或任何前述项的组合))内的这些细胞结构的相对比例或百分比(包括但不限于类型、构成和变化)。因此，来自该代表性样品(或该均质物组合物)或其子集的分析的一组数据将准确地反映衍生该代表性样品的整个组织或生物样品的相应信息。在一些实施方案中，该代表性数据指示衍生该代表性样品的原始器官、组织或肿瘤的整个群体的所有特征。
[0313] 如上所述，用于生成代表性数据的方法包括生成针对该均质物组合物中的标记物的定量和/或定性数据，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。
[0314] 在此方法和组合物的背景下，该标记物包括多核苷酸、DNA、蛋白质、RNA、脂质、细胞器、代谢物或细胞，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在一个方面，该蛋白质包括修饰，所述修饰选自下组，该组由以下各项组成：乙酰化、ADP-核糖基化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、共价附接黄素、共价附接血红素、共价附接核苷酸或核苷酸衍生物、共价附接脂质或脂质衍生物、共价附接磷脂酰肌醇、交联、环化、二硫键形成、脱甲基、形成共价交联、形成胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、精氨酰化、以及泛素化。在另一个方面，该标记物包括基因组多态性，药物基因组学单核苷酸多态性(SNP)，基因组SNP，体细胞多态性，以及蛋白质、脂质和/或细胞器的差异表达，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在另一个方面，该标记物包括以下项或可替代地基本上由其组成或又进一步由其组成：单个核苷酸位置；基因内区域或基因间区域；外显子或内含子、或其片段；编码区或非编码区；启动子、增强子、5'非翻译区(5'UTR)、或3'非翻译区(3'UTR)、或其片段；cDNA或其片段；SNP；体细胞突变、种系突变或两者；点突变或单一突变；缺失突变；框内缺失、基因内缺失、全基因缺失；插入突变；基因内插入；倒位突变；染色体内倒位；连锁突变；连锁插入突变；反转重复突变；串联重复；染色体内串联重复；易位；染色体易位，非相互易位；重排；基因组重排；一个或多个内含子、或其片段的重排；重排的内含子；5'-或3'-UTR、或其组合。在不同的方面，该标记物包括以下项或可替代地基本上由其组成或又进一步由其组成：在癌组织或癌细胞中与正常的健康组织或细胞相比对改变的氨基酸序列进行编码的改变的核苷酸序列、染色体易位、染色体内倒位、拷贝数变化、表达水平变化、蛋白质水平变化、蛋白质活性变化、或甲基化状态变化。
[0315] 在另一个方面，该标记物是选自下组的肿瘤标记物，该组由以下各项组成：蛋白质、抗原、酶、激素、DNA、RNA、微小RNA或碳水化合物。在另一个方面，该标记物是选自下组的肿瘤标记物，该组由以下各项组成：Her2，bRaf，ERBB2，Pl3KCA，FGFR2，p53，BRCA，CCND1，MAP2K4，ATR，AFP，ALK，BCR-ABL，BRCA1/BRCA2，BRAF，V600E，Ca-125，CA19.9，EGFR，Her-2，KIT，PSA，S100，KRAS，ER/Pr，UGT1A1，CD30，CD20，F1P1L1-PDGRFα，PDGFR，TMPT，TMPRSS2；ABCB5，AFP-L3，α-甲胎蛋白，α-甲基酰基CoA消旋酶，BRCA1，BRCA2，CA 15-3，CA 242，Ca 27-
29，CA-125，CA15-3，CA19-9，降钙素，癌胚抗原，癌胚抗原肽-1，脱-γ羧基凝血酶原，肌间线蛋白，早期前列腺癌抗原-2，雌激素受体，纤维蛋白降解产物，葡萄糖-6-磷酸异构酶，vE6，E7，L1，L2或p16INK4a，人绒毛膜促性腺激素，IL-6，角蛋白19，乳酸脱氢酶，亮氨酰氨基肽酶，促脂素，变肾上腺素类物质，脑啡肽酶，NMP22，去甲变肾上腺素，PCA3，前列腺特异性抗原，前列腺酸性磷酸酶，突触素，甲状腺球蛋白，TNF，选自以下项的转录因子：ERG、ETV1(ER81)、FLI1、EST1、EST2、ELK1、ETV6、ETV7、GABPα、ELF1、ETV4、ETV5、ERF、PEA3/E1AF、PU.1、ESE1/ESX、SAP1(ELK4)、ETV3(METS)、EWS/FLI1、ESE1、ESE2(ELF5)、ESE3、PDEF、NET(ELK3；
SAP2)、NERF(ELF2)、或FEV.XXX，肿瘤相关糖蛋白72，c-kit，SCF，pAKT，pc-kit，波形蛋白，CTLA-4，PDL1，PDL2，PD1，B7-H3，B7-H4，BTLA，HVEM，KIR，TIM3，GAL9，GITR，LAG3，VISTA，KIR，
2B4，TRPO2，CD160，CGEN-15049，CHK 1，CHK2，A2aR，TL1A，CTLA-4，PDL1，PDL2，PD1，B7-H3，B7-H4，BTLA，HVEM，TIM3，GAL9，LAG3，VISTA，KIR，2B4，CD160，CGEN-15049，CHK1，CHK2，A2aR，B-7家族，或其组合。在一个方面，该标记物是肿瘤标记物，该肿瘤标记物包括选自以下项的组的一种或多种标记物或可替代地基本上由其组成或又进一步由其组成：基因组多态性，药物基因组学单核苷酸多态性(SNP)，基因组SNP，体细胞多态性，以及蛋白质、脂质和细胞器的差异表达。在另一个方面，该肿瘤标记物选自下组，该组由以下各项组成：单个核苷酸位置；基因内区域或基因间区域；外显子或内含子、或其片段；编码区或非编码区；启动子、增强子、5'非翻译区(5'UTR)、或3'非翻译区(3'UTR)、或其片段；cDNA或其片段；SNP；体细胞突变、种系突变或两者；点突变或单一突变；缺失突变；框内缺失、基因内缺失、全基因缺失；
插入突变；基因内插入；倒位突变；染色体内倒位；连锁突变；连锁插入突变；反转重复突变；
串联重复；染色体内串联重复；易位；染色体易位，非相互易位；重排；基因组重排；一个或多个内含子、或其片段的重排；重排的内含子；5'-或3'-UTR、或其组合。在不同的方面，该标记物是肿瘤标记物，该肿瘤标记物包括选自以下项的组的标记物或可替代地基本上由其组成或又进一步由其组成：在癌组织或癌细胞中，对改变的氨基酸序列进行编码的改变的核苷酸序列、染色体易位、染色体内倒位、拷贝数变化、表达水平变化、蛋白质水平变化、蛋白质活性变化、以及甲基化状态变化，与正常的健康组织或细胞相比各自为“改变的”。
29，CA-125，CA15-3，CA19-9，降钙素，癌胚抗原，癌胚抗原肽-1，脱-γ羧基凝血酶原，肌间线蛋白，早期前列腺癌抗原-2，雌激素受体，纤维蛋白降解产物，葡萄糖-6-磷酸异构酶，vE6，E7，L1，L2或p16INK4a，人绒毛膜促性腺激素，IL-6，角蛋白19，乳酸脱氢酶，亮氨酰氨基肽酶，促脂素，变肾上腺素类物质，脑啡肽酶，NMP22，去甲变肾上腺素，PCA3，前列腺特异性抗原，前列腺酸性磷酸酶，突触素，甲状腺球蛋白，TNF，选自以下项的转录因子：ERG、ETV1(ER81)、FLI1、EST1、EST2、ELK1、ETV6、ETV7、GABPα、ELF1、ETV4、ETV5、ERF、PEA3/E1AF、PU.1、ESE1/ESX、SAP1(ELK4)、ETV3(METS)、EWS/FLI1、ESE1、ESE2(ELF5)、ESE3、PDEF、NET(ELK3；
SAP2)、NERF(ELF2)、或FEV.XXX，肿瘤相关糖蛋白72，c-kit，SCF，pAKT，pc-kit，波形蛋白，CTLA-4，PDL1，PDL2，PD1，B7-H3，B7-H4，BTLA，HVEM，KIR，TIM3，GAL9，GITR，LAG3，VISTA，KIR，
2B4，TRPO2，CD160，CGEN-15049，CHK 1，CHK2，A2aR，TL1A，CTLA-4，PDL1，PDL2，PD1，B7-H3，B7-H4，BTLA，HVEM，TIM3，GAL9，LAG3，VISTA，KIR，2B4，CD160，CGEN-15049，CHK1，CHK2，A2aR，B-7家族，或其组合。在一个方面，该标记物是肿瘤标记物，该肿瘤标记物包括选自以下项的组的一种或多种标记物或可替代地基本上由其组成或又进一步由其组成：基因组多态性，药物基因组学单核苷酸多态性(SNP)，基因组SNP，体细胞多态性，以及蛋白质、脂质和细胞器的差异表达。在另一个方面，该肿瘤标记物选自下组，该组由以下各项组成：单个核苷酸位置；基因内区域或基因间区域；外显子或内含子、或其片段；编码区或非编码区；启动子、增强子、5'非翻译区(5'UTR)、或3'非翻译区(3'UTR)、或其片段；cDNA或其片段；SNP；体细胞突变、种系突变或两者；点突变或单一突变；缺失突变；框内缺失、基因内缺失、全基因缺失；
插入突变；基因内插入；倒位突变；染色体内倒位；连锁突变；连锁插入突变；反转重复突变；
串联重复；染色体内串联重复；易位；染色体易位，非相互易位；重排；基因组重排；一个或多个内含子、或其片段的重排；重排的内含子；5'-或3'-UTR、或其组合。在不同的方面，该标记物是肿瘤标记物，该肿瘤标记物包括选自以下项的组的标记物或可替代地基本上由其组成或又进一步由其组成：在癌组织或癌细胞中，对改变的氨基酸序列进行编码的改变的核苷酸序列、染色体易位、染色体内倒位、拷贝数变化、表达水平变化、蛋白质水平变化、蛋白质活性变化、以及甲基化状态变化，与正常的健康组织或细胞相比各自为“改变的”。
[0316] 通过分析本文所述的均质物组合物来生成数据。用于分析的组织的非限制性例子是选自以下项的组的样品：一种或多种恶变前或恶性细胞、来自实体瘤的细胞、软组织肿瘤或转移灶、来自手术边缘的组织或细胞、组织学正常组织、一种或多种循环肿瘤细胞(CTC)、正常邻近组织(NAT)、来自患肿瘤或处于患肿瘤风险的相同受试者的血液样品、或FFPE样品。
[0317] 在一个实施方案中，该代表性数据包括从单个标记物生成的定性和定量数据。在一个方面，该代表性数据包括从两个或更多个不同标记物生成的定性和/或定量数据。在另一个方面，该代表性数据是通过在不同时间点(例如，在疗法之前和之后)测量相同标记物或多个标记物而生成，并且在一个方面，可用于在治疗过程中监测疗法或患者状况。
[0318] 在一个实施方案中，用于生成代表性数据的方法进一步向该定性和/或定量数据分配内部值，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在另一个实施方案中，用于生成代表性数据的方法进一步包括将该代表性数据与该数据的预定值进行比较，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在另一个方面，将该标记物的测量值归一化，并基于标记物的归一化测量值获得综合得分。可以进一步将该综合得分与预定得分进行比较。在癌症的背景下，在又另一个实施方案中，用于生成代表性数据的方法进一步包括以下项或可替代地基本上由其组成或又进一步由其组成：(a)测量第一生物样品中的肿瘤标记物，其中将该肿瘤标记物的测量值归一化；(b)基于该归一化测量值获得综合得分；并且(c)将该综合得分与预定得分进行比较以确定该受试者的癌症风险值。
[0319] 在另一个实施方案中，该预定值选自临床试验数据、受试者的数据、来自科学文献的数据、以及临床开发中的生物分子或小分子的数据。在一个方面，该代表性数据包括代表性肿瘤学数据，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成，其中该代表性肿瘤学数据包括来自第一生物样品的至少一种肿瘤标记物的定量和/或定性数据或可替代地基本上由其组成或又进一步由其组成，所述肿瘤标记物与肿瘤的存在相关联。
[0320] 在一个实施方案中，该预定得分衍生自以下项的组：临床试验数据、衍生自第二生物样品的代表性肿瘤学数据、衍生自一组生物样品的代表性肿瘤学数据、临床开发生物分子或小分子的数据。
[0321] 用于确定表型谱的方法
[0322] 在一个实施方案中，本公开文本涉及测定组织样品的表型谱的方法，该方法包括分析该均质物组合物的细胞结构，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在一个方面，可以对表型谱进行分析的细胞结构包括细胞簇、单个细胞、细胞碎片、细胞器、肽、核酸、脂质、代谢物或其组合，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在另一个方面，该细胞结构包括单细胞或核，其中该单细胞或核是完整的。在一些实施方案中，该分析包括细胞结构的数目、类型、状态、百分比和/或表达的分析，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在另一个方面，该分析包括单细胞分析、单核分析、单细胞器分析或其组合，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在一个方面，细胞结构的状态包括增殖、凋亡、坏死、迁移、上皮-间质转化(“EMT”)、有丝分裂、细胞周期停滞、S期、衰老、和/或分化，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在另一个方面，该分析包括对来自该均质物的标记物的分析，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。
[0323] 在一个实施方案中，该标记物选自下组，该组由以下各项组成：DNA、蛋白质、RNA、脂质、细胞器、代谢物、或细胞。在一个方面，该标记物的分析包括对标记物的检测，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在另一个方面，该标记物的分析包括来自单细胞或单核的标记物的分析。
[0324] 治疗疾病的方法
[0325] 在另一个方面，本公开文本涉及通过基于使用本公开文本的方法生成的代表性数据选择有效的治疗方案来治疗疾病的方法。使用适当量或类型的患者信息，治疗方案可以针对最佳反应和最高安全余量进行量身定制，以实现患者预后。此外，该信息还可以使患者收到许多其他益处，例如早期诊断、风险评估和有效治疗，从而显著改进医疗质量。
[0326] 选择有效的治疗方案取决于几个因素。首先，必须实现疾病或医疗状况的可靠诊断。对于传染性疾病、癌症或其他急性威胁生命的疾病，由于时间对遭受这些疾病的患者的生存率起着至关重要的作用，因此该诊断必须快速且有效。其次，如果诊断精确，则对个体患者的治疗性处理更有效。例如，当有时用抗癌药物的标准“鸡尾酒”治疗癌症时，该鸡尾酒常常对患者展表现出严重的副作用。除非精确确定了癌症类型(或其他疾病)，否则这个类型的疾病的个体治疗方案不会比任何其他治疗方案格外有效。因此，疗效直接取决于从待治疗患者获取的数据或信息。如果将该治疗方案与已经成功应用于此患者或其他患者的方案进行交叉检查，那么基于对早期治疗方案的生理反应，将可能实现更有效的治疗。此外，对疾病的精确诊断将导致个体治疗方案的成本降低，因为避免了不必要和无效的药物治疗。然而，即使是有最新的治疗信息的患者，也需要时间来吸收该信息，并理解它与其他治疗信息的关系，以便为患者提供最佳的可用治疗。
[0327] 因此，本公开文本提供了一种治疗受试者疾病的方法，其包括基于该代表性数据选择适当的治疗方案，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成，其中该代表性数据包括该受试者的第一谱。
[0328] 在一个方面，第一谱的非限制性例子包括标记物谱、抗原谱、蛋白谱、突变谱、脂质谱、外泌体谱、或其组合，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在另一个方面，该标记物包括来自以下项的组的一个或多个，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成：Her2，bRaf，ERBB2，Pl3KCA，FGFR2，p53，BRCA，CCND1，MAP2K4，ATR，AFP，ALK，BCR-ABL，BRCA1/BRCA2，BRAF，V600E，Ca-125，CA19.9，EGFR，Her-2，KIT，PSA，S100，KRAS，ER/Pr，UGT1A1，CD30，CD20，F1P1L1-PDGRFα，PDGFR，TMPT，TMPRSS2；ABCB5，AFP-L3，α-甲胎蛋白，α-甲基酰基CoA消旋酶，BRCA1，BRCA2，CA 15-3，CA 242，Ca 27-29，CA-125，CA15-3，CA19-9，降钙素，癌胚抗原，癌胚抗原肽-1，脱-γ羧基凝血酶原，肌间线蛋白，早期前列腺癌抗原-2，雌激素受体，纤维蛋白降解产物，葡萄糖-6-磷酸异构酶，vE6，E7，L1，L2或p16INK4a，人绒毛膜促性腺激素，IL-6，角蛋白19，乳酸脱氢酶，亮氨酰氨基肽酶，促脂素，变肾上腺素类物质，脑啡肽酶，NMP22，去甲变肾上腺素，PCA3，前列腺特异性抗原，前列腺酸性磷酸酶，突触素，甲状腺球蛋白，TNF，选自以下项的转录因子：ERG、ETV1(ER81)、FLI1、EST1、EST2、ELK1、ETV6、ETV7、GABPα、ELF1、ETV4、ETV5、ERF、PEA3/E1AF、PU.1、ESE1/ESX、SAP1(ELK4)、ETV3(METS)、EWS/FLI1、ESE1、ESE2(ELF5)、ESE3、PDEF、NET(ELK3；SAP2)、NERF(ELF2)、或FEV.XXX，肿瘤相关糖蛋白72，c-kit，SCF，pAKT，pc-kit，波形蛋白，CTLA-4，PDL1，PDL2，PD1，B7-H3，B7-H4，BTLA，HVEM，KIR，TIM3，GAL9，GITR，LAG3，VISTA，KIR，2B4，TRPO2，CD160，CGEN-15049，CHK 1，CHK2，A2aR，TL1A，CTLA-4，PDL1，PDL2，PD1，B7-H3，B7-H4，BTLA，HVEM，TIM3，GAL9，LAG3，VISTA，KIR，2B4，CD160，CGEN-15049，CHK1，CHK2，A2aR，B-7家族，及其组合。在一些方面，该第一谱包括从以下项的组生成的谱：一种或多种标记物、一种或多种抗原、一种或多种蛋白质、一种或多种突变、一种或多种脂质、一种或多种外泌体、或其组合。
[0329] 在一些实施方案中，该方法的标记物选自下组，该组由以下各项组成：基因组多态性，药物基因组学单核苷酸多态性(SNP)，基因组SNP，体细胞多态性，以及蛋白质、脂质和细胞器的差异表达。在一个方面，该标记物选自下组，该组由以下各项组成：单个核苷酸位置；基因内区域或基因间区域；外显子或内含子、或其片段；编码区或非编码区；启动子、增强子、5'非翻译区(5'UTR)、或3'非翻译区(3'UTR)、或其片段；cDNA或其片段；SNP；体细胞突变、种系突变或两者；点突变或单一突变；缺失突变；框内缺失、基因内缺失、全基因缺失；插入突变；基因内插入；倒位突变；染色体内倒位；连锁突变；连锁插入突变；反转重复突变；串联重复；染色体内串联重复；易位；染色体易位，非相互易位；重排；基因组重排；一个或多个内含子、或其片段的重排；重排的内含子；5'-或3'-UTR、及其组合。
[0330] 该方法可以用于确定治疗方案的用途，该治疗方案包括个性化剂量方案，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在一个方面，该治疗方案选自下组，该组由以下各项组成：化学疗法、免疫疗法、放射、外科手术、基因疗法、激素疗法、干细胞疗法、输血、物理疗法、光动力疗法、及其组合。
[0331] 在另一个实施方案中，治疗受试者的疾病的方法进一步包括将该受试者的第一谱与预定谱进行比较以确定该治疗方案对于该受试者是否适当，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在一个方面，该预定谱是基于选自以下项的组的数据确定的：临床试验数据、受试者的第二谱、不同生物样品或一组生物样品的谱、不同受试者或一组受试者的谱、生物分子或小分子的数据、及其组合。
[0332] 在另一个方面，该治疗包括选择一种或多种药物和/或给予患者的此类药物的剂量(量、给药长度等)以基于患者的个体组织或癌症谱来对治疗进行个性化。例如，如果该代表性样品中的两种生物标记物预测了在单个代表性样品中发现的对特定药物和X不同的药物Y的反应，则可以将两种药物都给予患者。如果药物X的生物标记物以75％内存在，并且药物Y的生物标记物以25％存在，则药物X可以优先化并且首先递送，随后药物Y。可替代地，药物Y可以在药物X之前。
[0333] 该方法可以在疗法的不同时程中重复，并且基于逐渐改变的标记物表达谱进行修饰。在这方面，该方法对于监测一个患者或具有相同或相似疾病接受相同或不同疗法的多个不同患者的疗法和疾病进展是有用的。
[0334] 鉴定临床相关标记物的方法
[0335] 关于临床相关标记物或生物标记物的数据或信息可以提供病理状况可能性的指示。本公开文本中的代表性数据可用于鉴定临床相关标记物，特别是以前没有与任何病理状态相关的那些。
[0336] 因此，本公开文本的另一方面涉及鉴定临床相关标记物的方法，其包括将该代表性数据与预定数据进行比较。标记物的非限制性例子如上所述。在一个方面，该标记物选自下组，该组由以下各项组成：蛋白质、抗原、酶、激素、DNA、RNA、微小RNA或碳水化合物。在另一个方面，该标记物包括基因组多态性，药物基因组学单核苷酸多态性(SNP)，基因组SNP，体细胞多态性，以及蛋白质、脂质、蛋白质修饰和细胞器的差异表达，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在一些方面，该标记物选自下组，该组由以下各项组成：单个核苷酸位置；基因内区域或基因间区域；外显子或内含子、或其片段；编码区或非编码区；启动子、增强子、5'非翻译区(5'UTR)、或3'非翻译区(3'UTR)、或其片段；cDNA或其片段；SNP；体细胞突变、种系突变或两者；点突变或单一突变；缺失突变；框内缺失、基因内缺失、全基因缺失；插入突变；基因内插入；倒位突变；染色体内倒位；连锁突变；连锁插入突变；反转重复突变；串联重复；染色体内串联重复；易位；染色体易位，非相互易位；重排；基因组重排；
一个或多个内含子、或其片段的重排；重排的内含子；5'-或3'-UTR、及其组合。在一个方面，在癌组织或癌细胞中该标记物选自以下项的组，各项与正常的健康组织或细胞相比：对改变的氨基酸序列进行编码的改变的核苷酸序列、染色体易位、染色体内倒位、拷贝数变化、表达水平变化、蛋白质水平变化、蛋白质活性变化、以及甲基化状态变化。
一个或多个内含子、或其片段的重排；重排的内含子；5'-或3'-UTR、及其组合。在一个方面，在癌组织或癌细胞中该标记物选自以下项的组，各项与正常的健康组织或细胞相比：对改变的氨基酸序列进行编码的改变的核苷酸序列、染色体易位、染色体内倒位、拷贝数变化、表达水平变化、蛋白质水平变化、蛋白质活性变化、以及甲基化状态变化。
[0337] 在一个实施方案中，该预定数据是从选自以下项的组的数据生成的：临床试验数据、一个受试者或一组受试者的数据、一个组织样品或一组组织样品的数据、临床开发中的生物分子或小分子的数据、或其组合。
[0338] 在一些方面，提供了确定受试者中癌症预后的方法，该方法包括评估来自受试者的代表性数据。在一个实施方案中，确定癌症预后的方法进一步包括计算癌症预后的定量得分，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成，其中基于该定量得分对预后进行分类。
[0339] 在一个实施方案中，该代表性数据包括关于该均质物中的细胞结构的数目、类型、状态和/或百分比的信息。在另一个实施方案中，该细胞结构包括干细胞、上皮细胞、血细胞、脂肪细胞、皮肤细胞、内皮细胞、癌细胞或免疫细胞，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在一个实施方案中，该免疫细胞包括嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、T细胞和/或B细胞，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在一些实施方案中，该T细胞包括杀伤T细胞、辅助T细胞、调节性T细胞、全T细胞、初试T细胞、活化T细胞、和/或γδT细胞，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。
[0340] 在一个实施方案中，细胞结构状态包括增殖、凋亡、坏死、迁移、上皮-间质转化(“EMT”)、有丝分裂、细胞周期停滞、S期、衰老、和/或分化，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在一个实施方案中，该代表性数据包括关于该均质物中的标记物的信息。在另一个实施方案中，该标记物选自以下项的组：DNA、蛋白质、RNA、脂质、细胞器、代谢物、或细胞。在一些实施方案中，该标记物包括以下项中的一个或多个，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成：Her2，bRaf，ERBB2，Pl3KCA，FGFR2，p53，BRCA，CCND1，MAP2K4，ATR，AFP，ALK，BCR-ABL，BRCA1/BRCA2，BRAF，V600E，Ca-125，CA19.9，EGFR，Her-2，KIT，PSA，S100，KRAS，ER/Pr，UGT1A1，CD30，CD20，F1P1L1-PDGRFα，PDGFR，TMPT，TMPRSS2；ABCB5，AFP-L3，α-甲胎蛋白，α-甲基酰基CoA消旋酶，BRCA1，BRCA2，CA 15-3，CA 242，Ca 27-
29，CA-125，CA15-3，CA19-9，降钙素，癌胚抗原，癌胚抗原肽-1，脱-γ羧基凝血酶原，肌间线蛋白，早期前列腺癌抗原-2，雌激素受体，纤维蛋白降解产物，葡萄糖-6-磷酸异构酶，vE6，E7，L1，L2或p16INK4a，人绒毛膜促性腺激素，IL-6，角蛋白19，乳酸脱氢酶，亮氨酰氨基肽酶，促脂素，变肾上腺素类物质，脑啡肽酶，NMP22，去甲变肾上腺素，PCA3，前列腺特异性抗原，前列腺酸性磷酸酶，突触素，甲状腺球蛋白，TNF，选自以下项的转录因子：ERG、ETV1(ER81)、FLI1、EST1、EST2、ELK1、ETV6、ETV7、GABPα、ELF1、ETV4、ETV5、ERF、PEA3/E1AF、PU.1、ESE1/ESX、SAP1(ELK4)、ETV3(METS)、EWS/FLI1、ESE1、ESE2(ELF5)、ESE3、PDEF、NET(ELK3；
SAP2)、NERF(ELF2)、或FEV.XXX，肿瘤相关糖蛋白72，c-kit，SCF，pAKT，pc-kit，波形蛋白，CTLA-4，PDL1，PDL2，PD1，B7-H3，B7-H4，BTLA，HVEM，KIR，TIM3，GAL9，GITR，LAG3，VISTA，KIR，
2B4，TRPO2，CD160，CGEN-15049，CHK 1，CHK2，A2aR，TL1A，CTLA-4，PDL1，PDL2，PD1，B7-H3，B7-H4，BTLA，HVEM，TIM3，GAL9，LAG3，VISTA，KIR，2B4，CD160，CGEN-15049，CHK1，CHK2，A2aR，B-7家族，及其组合。在另一个实施方案中，该标记物选自下组，该组由以下各项组成：蛋白质修饰，所述修饰选自下组，该组由以下各项组成：乙酰化、ADP-核糖基化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、共价附接黄素、共价附接血红素、共价附接核苷酸或核苷酸衍生物、共价附接脂质或脂质衍生物、共价附接磷脂酰肌醇、交联、环化、二硫键形成、脱甲基、形成共价交联、形成胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、精氨酰化、以及泛素化。在一些方面，该标记物选自下组，该组由以下各项组成：基因组多态性，药物基因组学单核苷酸多态性(SNP)，基因组SNP，体细胞多态性，以及蛋白质、脂质和/或细胞器的差异表达，单个核苷酸位置；基因内区域或基因间区域；外显子或内含子、或其片段；编码区或非编码区；启动子、增强子、5'非翻译区(5'UTR)、或3'非翻译区(3'UTR)、或其片段；cDNA或其片段；SNP；体细胞突变、种系突变或两者；点突变或单一突变；缺失突变；框内缺失、基因内缺失、全基因缺失；插入突变；基因内插入；倒位突变；染色体内倒位；连锁突变；连锁插入突变；反转重复突变；串联重复；染色体内串联重复；易位；染色体易位，非相互易位；重排；基因组重排；一个或多个内含子、或其片段的重排；重排的内含子；5'-或3'-UTR，在癌组织或癌细胞中与正常的健康组织或细胞相比对改变的氨基酸序列进行编码的改变的核苷酸序列、染色体易位、染色体内倒位、拷贝数变化、表达水平变化、蛋白质水平变化、蛋白质活性变化、或甲基化状态变化。
29，CA-125，CA15-3，CA19-9，降钙素，癌胚抗原，癌胚抗原肽-1，脱-γ羧基凝血酶原，肌间线蛋白，早期前列腺癌抗原-2，雌激素受体，纤维蛋白降解产物，葡萄糖-6-磷酸异构酶，vE6，E7，L1，L2或p16INK4a，人绒毛膜促性腺激素，IL-6，角蛋白19，乳酸脱氢酶，亮氨酰氨基肽酶，促脂素，变肾上腺素类物质，脑啡肽酶，NMP22，去甲变肾上腺素，PCA3，前列腺特异性抗原，前列腺酸性磷酸酶，突触素，甲状腺球蛋白，TNF，选自以下项的转录因子：ERG、ETV1(ER81)、FLI1、EST1、EST2、ELK1、ETV6、ETV7、GABPα、ELF1、ETV4、ETV5、ERF、PEA3/E1AF、PU.1、ESE1/ESX、SAP1(ELK4)、ETV3(METS)、EWS/FLI1、ESE1、ESE2(ELF5)、ESE3、PDEF、NET(ELK3；
SAP2)、NERF(ELF2)、或FEV.XXX，肿瘤相关糖蛋白72，c-kit，SCF，pAKT，pc-kit，波形蛋白，CTLA-4，PDL1，PDL2，PD1，B7-H3，B7-H4，BTLA，HVEM，KIR，TIM3，GAL9，GITR，LAG3，VISTA，KIR，
2B4，TRPO2，CD160，CGEN-15049，CHK 1，CHK2，A2aR，TL1A，CTLA-4，PDL1，PDL2，PD1，B7-H3，B7-H4，BTLA，HVEM，TIM3，GAL9，LAG3，VISTA，KIR，2B4，CD160，CGEN-15049，CHK1，CHK2，A2aR，B-7家族，及其组合。在另一个实施方案中，该标记物选自下组，该组由以下各项组成：蛋白质修饰，所述修饰选自下组，该组由以下各项组成：乙酰化、ADP-核糖基化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、共价附接黄素、共价附接血红素、共价附接核苷酸或核苷酸衍生物、共价附接脂质或脂质衍生物、共价附接磷脂酰肌醇、交联、环化、二硫键形成、脱甲基、形成共价交联、形成胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、精氨酰化、以及泛素化。在一些方面，该标记物选自下组，该组由以下各项组成：基因组多态性，药物基因组学单核苷酸多态性(SNP)，基因组SNP，体细胞多态性，以及蛋白质、脂质和/或细胞器的差异表达，单个核苷酸位置；基因内区域或基因间区域；外显子或内含子、或其片段；编码区或非编码区；启动子、增强子、5'非翻译区(5'UTR)、或3'非翻译区(3'UTR)、或其片段；cDNA或其片段；SNP；体细胞突变、种系突变或两者；点突变或单一突变；缺失突变；框内缺失、基因内缺失、全基因缺失；插入突变；基因内插入；倒位突变；染色体内倒位；连锁突变；连锁插入突变；反转重复突变；串联重复；染色体内串联重复；易位；染色体易位，非相互易位；重排；基因组重排；一个或多个内含子、或其片段的重排；重排的内含子；5'-或3'-UTR，在癌组织或癌细胞中与正常的健康组织或细胞相比对改变的氨基酸序列进行编码的改变的核苷酸序列、染色体易位、染色体内倒位、拷贝数变化、表达水平变化、蛋白质水平变化、蛋白质活性变化、或甲基化状态变化。
[0341] 在另一个方面，本公开文本涉及一种监测患者疾病的方法，其包括分析临床相关标记物，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成，其中该临床相关标记物是基于该代表性数据鉴定的。在一个方面，该标记物选自以下项的组：蛋白质、抗原、酶、激素、DNA、RNA、微小RNA或碳水化合物。在另一个方面，该标记物是从如下样品中分离的DNA或RNA，该样品选自以下项的组：一种或多种恶变前或恶性细胞、来自实体瘤的细胞、软组织肿瘤或转移灶、来自手术边缘的组织或细胞、组织学正常组织、一种或多种循环肿瘤细胞(CTC)、正常邻近组织(NAT)、来自患肿瘤或处于患肿瘤风险的相同受试者的血液样品、或FFPE样品。在一个方面，该疾病是癌症。
[0342] 储存代表性样品(或均质物组合物)的方法
[0343] 一旦构建了该代表性样品，样品就可以被运输用于进一步加工和/或分析。因此，在一些实施方案中，本公开文本还涉及储存该均质物组合物的方法，该方法包括将该组合物与有效量的储存试剂(本文提供了其非限制性例子)混合，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。
[0344] 在一个实施方案中，该储存试剂包括防腐剂、离液剂、洗涤剂、还原剂、螯合剂、缓冲剂、或其组合，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在一个方面，混合的组合物保留该组合物在与该储存试剂混合之前的表型和基因型特征。在另一个方面，混合的组合物包括变性蛋白质、失活核酸酶、失活蛋白酶、失活病原体、非降解核酸、或其组合，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在一些方面，该离液剂包括硫氰酸胍、异氰酸胍、盐酸胍或其组合，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在一个方面，该洗涤剂包括十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸锂、牛磺脱氧胆酸钠、牛磺胆酸钠、甘氨胆酸钠、脱氧胆酸钠、胆酸钠、烷基苯磺酸钠、N-月桂酰肌氨酸、或其组合，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在另一个方面，该还原剂包括巯基乙醇、三(2-羧乙基)膦、二硫苏糖醇、二甲亚砜、三(2-羧乙基)膦或其组合，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在另一个方面，该螯合剂包括乙二醇四乙酸、羟乙基乙二胺三乙酸、二乙烯三胺五乙酸、N,N-双(羧甲基)甘氨酸、乙二胺四乙酸、无水柠檬酸盐、柠檬酸钠、柠檬酸钙、柠檬酸铵、柠檬酸氢铵、柠檬酸、柠檬酸二铵、柠檬酸铁铵、柠檬酸锂、或其组合，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在不同的方面，该缓冲液包括三(羟甲基)氨基甲烷、柠檬酸盐、2-(N-吗啉代)乙磺酸、N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸、1,3-双(三(羟甲基)甲基氨基)丙烷、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸、3-(N-吗啉)丙磺酸、碳酸氢盐、磷酸盐、或其组合，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。
[0345] 生成代表性样品的方法
[0346] 本公开文本总体上涉及开发用于生成代表性组织样品(例如，整个器官、肿瘤、淋巴结、转移瘤或其组合)以解决异质性问题(例如，临床样本(尤其用于临床肿瘤学中的临床样本)中的肿瘤异质性)的方法，并且涉及这些代表性样品或其部分在各种诊断和治疗方法中的用途以及用于诊断和治疗(尤其肿瘤学)的包括此类代表性样品的组合物。
[0347] 本申请显示，利用用于诊断测试的肿瘤的小样品进行癌症诊断的公认采样方法可能导致诊断病理学和肿瘤学中的严重采样偏差。使用常规方法，常在被认为“小”(即，2厘米团块)的肿瘤中使用单FFPE组织切片来制定与患者护理有关的决策，无论预后(例如，患者生存时间的预期)和预测性(例如，患者是否会对特定疗法作出反应)，所有诊断数据典型地取自肿瘤体积(即来自FFPE块的单切片)的小于0.03％。此外，来自肿瘤的这些组织样品常规地取自肿瘤的非常离散的区域，使得诊断肿瘤学未能考虑存在于肿瘤其余部分中的异质性。因此，该数据集很小(相对于群体)，并因此有偏差。
[0348] 同样，相似于实体瘤内遗传上不同的癌细胞的小亚群的检测的低概率，使用常规组织学检查可能检测不到原发性肿瘤部位周围淋巴结内的小转移瘤。淋巴结的尺寸范围为从直径一毫米到几厘米。淋巴结内肿瘤细胞的存在取决于导致肿瘤细胞运动和侵袭的DNA突变，以及赋予在新环境(即乳腺与淋巴结)中存活的能力的突变。淋巴结内转移性肿瘤的尺寸取决于肿瘤的增殖速度和转移性肿瘤在淋巴结内已经生长的时间长度。对淋巴结内肿瘤细胞的存在的诊断测试利用来自FFPE块的一个或两个薄组织切片(典型地厚度为四微米)。使用这种方法，检测的关键因素是相对于淋巴结尺寸的肿瘤尺寸。虽然直径0.1mm的转移性肿瘤可填充小淋巴结体积的10％并具有合理的检测可能性，但相同尺寸的肿瘤仅包括直径2厘米的淋巴结的0.005％，并且使用当前的组织学技术具有非常低的检测可能性。使用本文公开的方法，可以检测到使用常规技术被错误标记为淋巴结阴性的大量患者，并且更适当地治疗他们。例如，更敏感地检测淋巴结阳性患者可以更好地告知该决策是否给予辅助化疗。
[0349] 对来自淋巴结组织(例如，由手术切除的淋巴结制备)的代表性样品进行的IHC分析可通过针对上皮细胞标记物与增殖标记物组合的染色(例如细胞角蛋白8/18双重IHC与Ki67)来检测极小的微转移瘤。这可以通过使用在原发性肿瘤中呈阳性的标记物，使用转移细胞的其他标记物或其他诊断标记物来完成。转移性肿瘤细胞也可通过鉴定核酸来检测，例如通过利用新一代测序小组来鉴定癌症相关突变，包括原发性肿瘤中存在的突变。这些方法将鉴定转移性肿瘤细胞。另外，可以确定每个患者疾病的天然进化过程并将其与针对疗法可能靶定的特定突变相关联。
[0350] 当前用于评估肿瘤的临床实践涉及仅获取肿瘤组织的一小部分进行包埋和切片。在一个基本情景中，肿瘤内含有感兴趣的亚克隆的区域的位置被假定为随机事件。因此，尽管当前实践仔细地指导了对哪个区域进行采样并获得TNM分期的最相关信息，但未必能提供定位该肿瘤亚克隆区域的信息。从大体检查来确定亚克隆是否存在也是不可能的。
[0351] 本发明方法的实施方案可通过提供代表患者的整个淋巴结、肿瘤或肿瘤的细胞样品的有效和可再生产生的方法来解决临床肿瘤学设置中的肿瘤异质性。如图2A所示，根据本公开文本的“代表性”样品包括肿瘤内包括的癌细胞的不同亚群，无论其尺寸如何。可替代地，根据本公开文本的“代表性”样品可以包括正常或对照群体内的不同亚群，或者可以包括肿瘤细胞和正常细胞的混合样品。
[0352] 仍可替代地，根据本公开文本的代表性样品可以包括衍生自全肿瘤、淋巴结或转移瘤的代表性或同质生物分子，该级分包括存在于起始组织(例如用于衍生该样品或其级分的全肿瘤、淋巴结或转移瘤)中的蛋白质、脂质、核酸或其他部分，其中相对比例的此类替代品又代表该起始组织。例如，此类生物分子可以通过样品的进一步解离或者化学或酶促处理和/或通过使用分离或去除该样品的特定部分的方法(例如通过使用用以分离或去除特定尺寸或分子量的分子的尺寸排阻(例如，筛选)、从该代表性样品中分离或去除特定类型分子的亲和纯化方法等)衍生。因此，此类方法基本上导致根据本公开文本的其他类型的代表性样品，例如包括起始样品(例如全部肿瘤、淋巴结、转移瘤或器官)的所有蛋白质、核酸或脂质的同质或代表性样品，该代表性样品可以用于蛋白质、核酸和/或脂质分析方法，并且其反映整个肿瘤样品。
[0353] 因此，无论起源如何，在此类代表性样品中，一个或多个肿瘤或起始组织内存在的其他特定部分(例如肿瘤或淋巴结转移瘤或器官)内的细胞亚群的相对百分比准确地反映在该样品中。此外，与常规诊断方法获得的样品不同，这些代表性样品可用于多种测定方法中，而不损害在传统诊断测定中使用该样本的能力。此外，根据本公开文本产生的代表性样品可以分开或同时以几种不同测定形式使用(并且可能重新使用)，以便检测甚至较小亚克隆群体或样品(例如，肿瘤、淋巴结或转移瘤)内的其他部分如肿瘤抗原或核酸。
[0354] 此外，如以下所讨论的，来自不同患者或者单个患者或不同患者的不同组织的代表性样品可以各自用独特鉴定标记(例如，半抗原)标记，并将不同患者或组织的标记样品组合并用于希望的测定方法中。基本上，这提供了不同患者样品的多路复用。
[0355] 基于此，通过目前描述的方法的示例性实施方案衍生的代表性样品应当促进并显著改进不同类型的肿瘤(即不同的实体瘤)的检测、诊断和/或分期的准确性，无论肿瘤组织类型、位置、尺寸或体积如何。此外，本发明的方法可以用于从假定正常组织样品或推定癌前组织(例如，从由于遗传风险或既往癌症而处于发展癌症的高风险下的受试者获得)产生代表性样品，以鉴定罕见细胞类型如癌症干系，其甚至在疾病的任何体征显现之前可能存在其中。
[0356] 在另一个实施方案中，本公开文本涉及用于制备含有异质细胞结构的组织或生物样品的方法，其包括：(a)使该样品均质化；(b)将均质化的样品重建为均质物，所述均质物包括基本上同质的细胞结构，其中该均质物子集中的细胞结构的比率与该组织样品中的细胞结构的比率基本上相似。在一个方面，该均质物包括多个单细胞或多个细胞簇，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。
[0357] 在一个实施方案中，用于制备组织样品的方法进一步包括将该均质物用固定剂进行固定，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在另一个方面，该固定剂包括福尔马林、钙、乙酸、盐水、醇、尿素、溴硝丙二醇、水或其组合，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在另一个方面，固定的均质物被安装到载玻片上。
[0358] 在一些实施方案中，用于制备组织样品的方法进一步包括从该均质物中提取成分，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在一个方面，该成分是DNA、RNA、蛋白质、脂质、细胞器、外泌体、细胞、或其组合。在另一个实施方案中，用于制备组织样品的方法进一步包括从该均质物中分离细胞结构或组分，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在一个方面，该细胞结构或组分包括单细胞或单核，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在一个方面，该分离包括单细胞分离或单核分离，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在另一个方面，该单细胞分离是通过流式细胞术、激光显微切割、手动细胞挑取、随机接种和稀释、微流体装置、芯片实验室装置、或其组合进行。在一个方面，该单核分离是通过流式细胞术进行。
[0359] 在一个实施方案中，该均质化包括化学和/或生化解离、和/或任选地机械均质化，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在一个方面，该均质化过程不裂解细胞。在另一个方面，样品的化学处理包括样品的酶促消化，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成，所述酶促消化包括使用选自下组的酶，该组由以下各项组成：间质胶原酶、明胶酶-A、溶基质素1、基质溶解素、嗜中性粒细胞胶原酶、明胶酶-B、溶基质素2、溶基质素3、巨噬细胞金属弹性蛋白酶、胶原酶3、MT1-MMP、MT2-MMP、MT3-MMP、MT4-MMP、胶原酶4、釉质溶解素、X-MMP、CA-MMP、MT5-MMP、MT6-MMP、基质溶解素-2、MMP-22、内切蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、内切蛋白酶Asp-N、内切蛋白酶Arg-C、内切蛋白酶Glu-C(V8蛋白酶)、内切蛋白酶Lys-C、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K、枯草杆菌蛋白酶、梭菌蛋白酶、外肽酶、羧肽酶A、羧肽酶B、羧肽酶P、羧肽酶Y、组织蛋白酶C、酰基氨基酸释放酶、以及焦谷氨酸氨基肽酶。在一个方面，该机械均质化是通过选自下组的装置进行，该组由以下各项组成：共混器、解离器、提取器、研钵、杵、杜恩斯均质器、组织研磨器、旋转式刀片组织均质器、以及珠磨均质器。在另一个方面，通过使用解剖刀或刀以手动划切来建立均质物。在一个实施方案中，该均质化进一步包括细胞调节，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成，所述细胞调节包括调整pH和/热量，或用细胞调节缓冲液处理该样品。
[0360] 在一些方面，在均质化样品之前或之后，将该样品用激素、蛋白质、酶、脂质、洗涤剂、超声处理、物理搅拌或其组合(在均质化之前或之后)进行处理。
[0361] 在另一个方面，均质化的样品包括细胞和/或细胞簇，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在一些方面，均质化的样品包括具有均一尺寸的细胞簇，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在另一个方面，均质化的样品包括具有非均一尺寸的细胞簇，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在一些方面，该细胞簇包括1-100个细胞、或100-1,000个细胞、1,000-10,000个细胞或10,000-100,000个细胞，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在另外的方面，该细胞簇包括超过100,000个细胞，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。
[0362] 在一个实施方案中，用于制备组织样品的方法进一步包括使均质化的样品穿过网、过滤器或一系列网或过滤器，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在一个方面，该网或过滤器具有范围为从约1微米至约500微米的孔径。在另一个方面，该网或过滤器具有小于1微米的孔径。在一些方面，该网或过滤器具有范围为从约1微米至约100微米、约100微米至约200微米、约200微米至约300微米、约300微米至约400微米、或约400微米至约500微米的孔径。在另外的方面，网或过滤器的孔径大于500微米。
[0363] 在另外的实施方案中，该组织样品是从选自下组的组织中收集，该组由以下各项组成：肿瘤、淋巴结、转移瘤、息肉、囊肿、活检切片、整个器官、及其组合。在一个方面，该组织样品是固体样品或液体样品。在另一个方面，该液体样品包括细胞学针抽吸物、渗出物样品或巴氏涂片，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在一个方面，该均质物的细胞结构包括至少一个细胞，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在不同的方面，该均质物的细胞结构包括至少100个细胞，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在另一个方面，该均质物的细胞结构包括约100至约200个细胞、约200至约1,000个细胞、约1,000至约5,000个细胞、或约10,000至约100,000个细胞。在不同的方面，该均质物的细胞结构包括约100,000至约1,000,000个细胞、约1,000,000至约5,000,000个细胞、约5,000,000至约1,000,000,000个细胞、或约1,000,000,000至约5,000,000,000个细胞，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在另一个方面，该均质物的细胞结构包括超过约5,000,000,000个细胞，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。
[0364] 在一个实施方案中，该均质物未经保存或固定。在一个方面，该均质物包括活细胞，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在另一个方面，该均质物经保存或固定。在一个方面，该均质物被冷冻、冷冻干燥、或包埋在包埋介质中。在另一个方面，该均质物包括来自一种或多种组织和/或一个或多个受试者的细胞。
[0365] 在一个实施方案中，该组织样品是从肿瘤、淋巴结、转移瘤、息肉、囊肿、切除物、整个器官、或其组合中分离。在一个方面，该均质物进一步包括非人细胞、人细胞、非天然蛋白质、核酸或小分子，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在一个实施方案中，该小分子选自下组，该组由以下各项组成：半抗原、肽标签、蛋白质标签、荧光标签、核酸标签、及其组合。在另外的方面，该小分子包括半抗原、肽标签、蛋白质标签、荧光标签、核酸标签、发光标签、生物素、及其组合，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。
[0366] 在另外的实施方案中，用于制备组织样品的方法进一步包括评估该均质物内的基本上同质的细胞结构，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在一个方面，该基本上同质的细胞结构是通过测量该均质物内的内部对照的分布来评估。在另一个方面，该内部对照选自下组，该组由以下各项组成：非人细胞、人细胞、非天然蛋白、核酸、小分子、染料、化学物质、及其组合。
[0367] 在另一个方面，本公开文本提供了用于产生如下生物样品的方法，该生物样品适于评估样品(如肿瘤样品或淋巴结或转移瘤或其组合)内细胞的异质性和/或评估受试者中特定癌症状况的预后，其包括：(i)从实体瘤或淋巴结获得一个或多个完整活检样品，优选地其中每个活检样品包括至少约100至200、200至1,000、1,000至5,000、10,000至100,000、100,000至1,000,000、1,000,000至5,000,000、5,000,000至1,000,000,000、1,000,000,
000至5,000,000,0000或更多个细胞，并且任选地将其固定或保存(如福尔马林、石蜡或乙醇固定的或保存的样品)，并且(ii)分别或组合地将该一个或多个活检样品均质化，其中该一种或多种均质物各自基本上均匀地表示相应的一个或多个活检样品的异质性。
000至5,000,000,0000或更多个细胞，并且任选地将其固定或保存(如福尔马林、石蜡或乙醇固定的或保存的样品)，并且(ii)分别或组合地将该一个或多个活检样品均质化，其中该一种或多种均质物各自基本上均匀地表示相应的一个或多个活检样品的异质性。
[0368] 如上所述，任选地可以将这些代表性样品进一步解离和/或处理以去除或分离特定类型的分子，如特定细胞类型、蛋白质、核酸或脂质等，从而生成可用于诊断和治疗方法中的其他代表性样品。
[0369] 在又另一个方面，本公开文本提供了用于产生如下生物样品的方法，该生物样品适于评估肿瘤或淋巴结或转移瘤或其组合内细胞的异质性，其包括(i)从实体瘤或淋巴结或转移瘤获得一个或多个活检样品，优选地其中每个活检样品包括至少约100至200、200至1,000、1,000至5,000、10,000至100,000、100,000至1,000,000、1,000,000至5,000,000、5,
000,000至1,000,000,000、1,000,000,000至5,000,000,0000或更多个细胞，并且任选地将其固定或保存(如福尔马林、石蜡或乙醇固定的或保存的样品)，并且(ii)分别或组合地将该一个或多个活检样品均质化，条件是其中所得的一种或多种均质物基本被解离成单个细胞，并且所得的一种或多种均质物基本上是同质的。
000,000至1,000,000,000、1,000,000,000至5,000,000,0000或更多个细胞，并且任选地将其固定或保存(如福尔马林、石蜡或乙醇固定的或保存的样品)，并且(ii)分别或组合地将该一个或多个活检样品均质化，条件是其中所得的一种或多种均质物基本被解离成单个细胞，并且所得的一种或多种均质物基本上是同质的。
[0370] 再次，任选地可以将这些代表性样品进一步解离和/或处理以去除或分离特定类型的分子，如特定细胞类型、蛋白质、核酸或脂质等，从而生成可用于诊断和治疗方法中的其他代表性样品。
[0371] 在另一个方面，本公开文本提供了用于产生如下生物样品的方法，该生物样品适于评估受试者是否包括特定癌症的毒性形式或处于发展特定癌症的毒性形式的风险下和/或具有癌症的受试者是否包括该特定癌症的毒性形式，其包括(i)从实体瘤或淋巴结或转移瘤或癌前囊肿获得一个或多个完整活检样品，优选地其中每个活检样品包括至少约100至200、200至1,000、1,000至5,000、10,000至100,000、100,000至1,000,000、1,000,000至5,000,000、5,000,000至1,000,000,000、1,000,000,000至5,000,000,0000或更多个细胞，并且任选地将其固定或保存(如福尔马林、石蜡或乙醇固定的或保存的样品)，并且(ii)分别或组合地将该一个或多个活检样品均质化，其中所得的一种或多种均质物各自基本上均匀地表达相应的一个或多个活检样品的任何异质性，并且任选地分离至少一种生物标记物或检测该至少一种生物标记物的表达。生物标记物的上调或下调与特定癌症的毒性形式有关。
[0372] 在又另一个方面，本公开文本提供了用于表征异质肿瘤、淋巴结或转移瘤或癌前囊肿内的表型多样性和/或检测异质肿瘤淋巴结或转移瘤或癌前囊肿内遗传上不同的亚克隆和/或鉴定肿瘤淋巴结或转移瘤或癌前囊肿内的低流行率事件和/或确定肿瘤淋巴结或转移瘤或癌前囊肿内靶标的流行率的方法，其包括(i)获得涵盖肿瘤淋巴结或转移瘤或癌前囊肿的空间不同区域的一个或多个肿瘤淋巴结或转移瘤或癌前囊肿样品，在均质化前任选地将其用例如福尔马林、石蜡和/或乙醇固定或保存，并且(ii)将该一个或多个肿瘤淋巴结或转移瘤或癌前囊肿样品均质化，从而产生代表异质肿瘤淋巴结、或转移瘤或癌前囊肿内的表型多样性的均质物，并且该均质物适合于表征肿瘤的景观和/或检测异质肿瘤淋巴结或转移瘤或癌前囊肿内遗传上不同的亚克隆和/或鉴定肿瘤淋巴结或转移瘤或癌前囊肿内的低流行率事件和/或确定肿瘤淋巴结或转移瘤或癌前囊肿内靶标的流行率。
[0373] 在又另一个方面，本公开文本提供了用于检测患者(例如，由于基因突变或既往癌症而处于发展癌症的风险下的患者或具有癌前囊肿或息肉的患者)的假定正常组织或推定癌前组织中的癌前细胞或癌性细胞的方法，其包括(i)获得一个或多个假定正常组织或推定癌前组织(如癌前囊肿或息肉)样品，其涵盖患者的假定正常组织或推定癌前组织的空间不同区域，在均质化之前任选地将其固定或保存，例如用福尔马林、石蜡和/或乙醇，并且(ii)将该一个或多个样品均质化，从而产生代表假定正常组织或推定癌前组织的均质物，并且该均质物适于例如甚至在患者中表现出任何疾病迹象之前检测罕见癌性细胞或癌症干细胞。
[0374] 在另一个方面，本公开文本提供了使用由处于不同测定形式的任何上述方法产生的代表性样品及其部分的方法，其中这些测定可以高通量实现，同时或在不同时间或不同位置进行，和/或通过自动化(全自动或半自动)进行。
[0375] 在另一个方面，将通过任何前述方法产生的本公开代表性样品或其部分进行储存供将来使用，例如冷冻或冻干。
[0376] 在另一个方面，使用由任何上述方法产生的本公开代表性样品或其部分从患者样品中的癌细胞或细胞类型衍生(并任选纯化)对特定抗原有特异性的抗体或抗原，该抗体或抗原潜在地可用于个性化医学中，即用于治疗性或预防性癌症疫苗的生产中。
[0377] 在所有上述方法中的均质化步骤可以通过保留样品内细胞完整性的方法实现，即一个或多个均质化样品中的大部分细胞不被裂解，并且由此得到的均质物及其部分是该一个或多个样品的“代表”。同样这意味着该样品或其部分内的细胞反映了该一个或多个组织样品(例如，实体瘤或淋巴结)整体内不同细胞类型的百分比。这可以通过例如肿瘤样品或其部分的机械解离(如在添加或不添加液体的情况下对该肿瘤样品或其部分进行的机械解离)和/或肿瘤样品或其部分的化学或酶促解离(与膜相关蛋白相比，如用选择性地或优先或主要作用于细胞外基质蛋白的酶进行处理)实现。可替代地，该均质化方法可导致细胞解离，同时仍生成代表起始组织(例如，全肿瘤)的样品。另外，任选地可以将该均质化代表性样品进一步解离和/或处理以去除或分离特定类型的分子，如特定细胞类型、蛋白质、核酸或脂质等，从而生成可用于诊断和治疗方法中的其他代表性样品。
[0378] 任何上述方法可包括检测均质物或者其部分或级分中的至少一种生物标记物(例如，至少一种脂质、蛋白质或核酸生物标记物)的表达。另外，该方法可以进一步包括检测该均质物或者其部分或级分中的表达特定生物标记物或生物标记物组合的肿瘤细胞的百分比。任选地，将该均质物或者其部分或级分中的肿瘤干细胞和/或相对频率或百分比的肿瘤亚克隆进行检测和/或分离。另外，该方法还可以包括检测遗传靶标(如点突变、缺失、添加、易位、基因融合或基因扩增)。
[0379] 任何上述方法还可以用于检测、分离和/或定量存在于该均质物或者其部分或级分中的特定免疫细胞(如B淋巴细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞、NK细胞、单核细胞或其组合)，其提供有价值的临床信息，例如免疫状态和疾病状态，并且还便于选择合适的治疗方案，如检查点抑制剂、细胞因子或其他免疫调节剂。
[0380] 所得均质物或代表性样品可以包括至少1,000、10,000、100,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000、1,000,000,000、5,000,
000,000、10,000,000,000、50,000,000,000、100,000,000,000、1,000,000,000,000或更多个细胞。
000,000、10,000,000,000、50,000,000,000、100,000,000,000、1,000,000,000,000或更多个细胞。
[0381] 将所得均质物或者其级分或部分任选地冷冻或冷冻干燥，或包埋在蜡(如石蜡)中，或者可替代地不经此类冷冻或冷冻干燥或蜡而用于进一步的步骤(其中一些在下面讨论)中。例如，代表性的石蜡块(即包埋在石蜡中的所得均质物或者其级分或部分)适合用于当前的解剖病理学工作流程，例如切片、制备载玻片、染色、显微镜检查、抗原修复等。
[0382] 该均质物可以衍生自取自一个或多个受试者的两个或更多个肿瘤，并且将每个肿瘤的所得均质物或其级分用于评估不同患者的两种或更多种肿瘤或疾病状况的相似性和/或差异。
[0383] 另外，该均质物可以衍生自两个或更多个推定正常或癌前组织，例如从一个受试者(例如具有BRCA突变的受试者)获得的乳房、子宫颈、结肠直肠或癌前囊肿或息肉，并且将所得均质物或其级分用于评估是否存在任何异常细胞或疾病生物标记物。
[0384] 另外，可以将非人类细胞(如昆虫细胞和/或小鼠细胞)或其他外来蛋白质、核酸或小分子添加到该均质物中以产生阳性蛋白质或核酸检测的内部对照。
[0385] 另外，可将小分子(如半抗原、肽标签、蛋白质标签、荧光标签和/或核酸标签)添加到该样品中，并用于提供该代表性样品中的空间信息。例如，可以将样品(如肿瘤或淋巴结)切片，例如切成四分体，并且可以在将这些切片均质化之前将不同的半抗原(或其他合适的小分子)“掺杂”进每个切片以生成代表性样品。应该理解，可以从每个样品生成的用于在均质化之前“掺杂”的切片的数目不受限制，而是可能与样品的尺寸成比例地选择，即该样品越大，在均质化之前可以用小分子“标签化”的切片的数目越多。以这种方式，在所得均质物或其级分中可以保持空间信息。
[0386] 还可以在将该样品与来自另一患者或相同患者的不同样品组合之前将小分子添加至该样品中，并因此提供了以多路复用测定形式运行时区分样品的手段。
[0387] 可以将经均质化的样品任选地经福尔马林固定，或者可以在均质化之前或之后保存在乙醇中。由于安全考虑，在用于病理学或诊断方法之前，组织样品通常是福尔马林或以其他方式固定的。福尔马林或其他固定方法在本领域中通常是已知的。示例性方法在下文中公开。在这种情况下，在步骤(ii)中均质化之前，可以将福尔马林固定的肿瘤样品浸泡在水或缓冲盐溶液(如PBS)中。
[0388] 可替代地或另外，在均质化之前，可以将用于所公开的方法中的肿瘤样品保存在乙醇中。然而，应该强调的是，福尔马林固定或者乙醇或其他保存程序对主题方法不是必需的，并且可以在不损害所得均质化代表性样品的适用性的情况下消除。
[0389] 可以使用未固定组织的均质化来产生具有代表性的活体样品。可以培养活的代表性样品以建立来自个体患者的代表性组织培养样品。此类代表性样品可以多次分开以建立多个代表性培养物样品，其可以用于确定化疗(如抗体、核酸、小分子或多肽，其拮抗、抑制或阻断至少一种已知或未知生物标记物的表达或功能活性)的效力。此外，可以使用FACS分析来选择特定细胞类型(如免疫细胞或肿瘤细胞)。例如，可以选择和培养肿瘤浸润的免疫细胞以确定免疫系统分泌的肿瘤特异性抗体。
[0390] 此外，如本文所示，所公开的用于衍生代表性样品的方法及其在诊断和治疗方法中的用途适于固定和未固定的组织样品。
[0391] 用于制备代表性样品(如从肿瘤活检样品制备的均质物)的任何公开方法可以包括在均质化之前、期间或之后添加至少一种胶原酶或其他合适的酶或酶组合或其他化学物质(如本身分解或促进分解细胞外基质的盐)；使用升高的温度和/或缓冲液条件，如破坏细胞交联的细胞调节缓冲液，例如CC1或CC2；和/或使用机械剪切装置(如IKA共混器、gentleMACs解离器或功能等效物)。这些方法可以或可以不在维持样品内细胞的存活力和完整性的条件下进行，例如在细胞基本上不被裂解的一些均质化条件下。
[0392] 在一个方面，均质化包括使用研钵&杵、杜恩斯均质器或组织研磨器、手持式电子旋转刀片组织均质器(如可从托马斯科技公司(Thomas Scientific)获得的Omni-TH)、珠磨均质器(如子弹共混器或Burton Precellys 24组织均质器或可从OMNI获得的Bead Ruptor)，任选地对于旋转均质器在约100和约75,000RPM之间的速度或对于珠磨器在约0.5m/s至约2.5m/s的速度，并且持续约30秒到约5分钟、约5分钟至约10分钟、约10分钟至约
30分钟或约30分钟至约60分钟的长度。
30分钟或约30分钟至约60分钟的长度。
[0393] 在另一个实施方案中，均质化包括使用间质胶原酶、明胶酶-A、溶基质素1、基质溶解素、嗜中性粒细胞胶原酶、明胶酶-B、溶基质素2、溶基质素3、巨噬细胞金属弹性蛋白酶、胶原酶3、MT1-MMP、MT2-MMP、MT3-MMP、MT4-MMP、胶原酶4、釉质溶解素、X-MMP、CA-MMP、MT5-MMP、MT6-MMP、基质溶解素-2、MMP-22、内切蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、内切蛋白酶Asp-N、内切蛋白酶Arg-C、内切蛋白酶Glu-C(V8蛋白酶)、内切蛋白酶Lys-C、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K、枯草杆菌蛋白酶、梭菌蛋白酶、外肽酶、羧肽酶A、羧肽酶B、羧肽酶P、羧肽酶Y、组织蛋白酶C、酰基氨基酸释放酶、焦谷氨酸氨基肽酶或其任何组合，任选地在约0.001μg/ml至约1000mg/ml的浓度，并且持续约1分钟至约120分钟的长度。
[0394] 涵盖肿瘤或其他组织的空间不同区域的公开方法中使用的肿瘤样品可以包括从患者手术移除的肿瘤的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、至少85％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或优选地整体。肿瘤样品的直径可以为至少
1、5、10、20、50、100或更多毫米(mm)或厘米(cm)。
1、5、10、20、50、100或更多毫米(mm)或厘米(cm)。
[0395] 用于主题方法中的样品通常衍生自实体瘤或肿瘤(包括原发性肿瘤和转移性肿瘤)、淋巴结、转移瘤或癌前组织(如囊肿或息肉)。可替代地或另外，对于非实体瘤(例如血液癌)潜在地也可以实现该方法。例如，任选地可以将经均质化的实体瘤样品与患者液体样品(例如，来自患者的血液、淋巴液、渗出物样品、脑脊液、胆汁、粘液和/或尿液样品)组合。经均质化的样品可另外或可替代地包括活检的“正常”或癌前组织，例如为了在疾病表现之前检测病变细胞。
[0396] 在所公开的方法中使用的此类肿瘤或其他组织样品可以来自任何来源，例如衍生自乳房、结肠、肺、胰腺、胆囊、皮肤、骨骼、肌肉、肝、肾脏、子宫颈、卵巢、前列腺、食管、胃或其他器官，例如乳腺癌肿瘤、肺癌肿瘤、肝肿瘤、前列腺癌肿瘤、结肠癌肿瘤、膀胱癌肿瘤或肾癌肿瘤。通常，所公开的方法中使用的肿瘤样品或其他组织是人源的。
[0397] 所公开的方法中使用的肿瘤或其他组织样品可以具有至少1cm3、至少2cm3、至少3cm3、至少4cm3、至少5cm3、至少6cm3、至少7cm3、至少8cm3、至少9cm3、至少10cm3、至少15cm3、至少20cm3、至少25cm3、至少50cm3、至少100cm3、至少250cm3、至少500cm3、至少1,000cm3、至少2,500cm3、至少5,000cm3、至少7,500cm3、至少10,000cm3或更大的体积。
[0398] 所公开的方法中使用的肿瘤或其他组织样品在最宽点处可以具有至少0.5cm、至少1cm、至少1.5cm、至少2cm、至少2.5cm、至少3cm、至少3.5cm、至少4cm、至少4.5cm、至少5cm、至少6cm、至少7cm、至少10cm、至少25cm、至少50cm或更大的宽度。
[0399] 另外，在一些实施方案中，代表性样品可以由之前福尔马林固定并包埋在石蜡中的组织制成。具体而言，可以将蜡熔化，将组织回收并水合，并且然后将本文描述的方法(即均质化)应用到样品上，其适用于任何数目的测定(参见例如图24)。图24显示了由从石蜡块回收的组织制备的代表性样品中Caski细胞上的HPV16ISH的染色。将先前包埋在石蜡中的组织回收并在IKA中均质化以生成代表性样品。以这种方式，所公开的方法可以用于通过熔化蜡、回收样品、再水合组织并相应地均质化，使用已经制备用于TNM分期的一个或多个样品来生成代表性样品。
[0400] 任何上述方法可以进一步包括(iii)将该均质物或者其部分或级分分布到一个或多个载玻片或其他固体支持物上，并且任选地将含有该均质物或部分或其级分的一个或多个载玻片或其他固体支持物用苏木精和伊红染色；在含有该均质物或者其部分或级分的载玻片或其他固体支持物上进行免疫组织化学染色；或在含有该均质物或其部分或其级分的载玻片或其他固体支持物上进行原位杂交，即其中任何一种将被认为是该方法中的步骤(iv)。
[0401] 此外，上述方法中的任一种可以进一步包括(iii)从该均质物或者其部分或级分纯化核酸(如DNA或mRNA)。纯化的核酸可以进行Northern印迹、DNA测序、PCR、RT-PCR、微阵列谱分析、差异展示或原位杂交。相反，可以将纯化的核酸与纳米粒子(如量子点、顺磁纳米粒子、超顺磁纳米粒子和金属纳米粒子，优选合金化量子点，通过举例，包括例如但不限于CdSe、ZnSSe、ZnSeTe、ZnSTe、CdSSe、CdSeTe、ScSTe、HgSSe、HgSeTe、HgSTe、ZnCdS、ZnCdSe、ZnCdTe、ZnHgS、ZnHgSe、ZnHgTe、CdHgS、CdHgSe、CdHgTe、ZnCdSSe、ZnHgSSe、ZnCdSeTe、ZnHgSeTe、CdHgSSe、CdHgSeTe、InGaAs、GaAlAs和InGaN)缀合。
[0402] 还考虑的是，上述方法中的任一种可以进一步包括从该均质物或者其部分或级分纯化脂质或外泌体或其他细胞器。纯化的脂质可进行质谱或组织化学分析。
[0403] 另外，还考虑的是，上述方法中的任一种可以进一步包括从该均质物或者其部分或级分纯化蛋白质。纯化的蛋白质可以进行Western印迹、ELISA、免疫沉淀、色谱、质谱、微阵列谱分析、干涉测量、电泳染色或免疫组织化学染色。可替代地或除前述之外，纯化的蛋白质可用于产生对该肿瘤有特异性的抗血清。
[0404] 此外，考虑的是，任何上述方法进一步包括(iii)对该均质物或者其部分或级分进行基因组、转录组、蛋白质组学和/或代谢组学分析。
[0405] 此外，考虑的是，任何上述方法进一步包括(iii)从该均质物或者其部分或级分亲和纯化特定细胞类型。特定细胞类型可能含有感兴趣的生物标记物。感兴趣的示例性生物标记物可以包括Her2，bRaf，ERBB2扩增，Pl3KCA突变，FGFR2扩增，p53突变，BRCA突变，CCND1扩增，MAP2K4突变，ATR突变或其表达与特定癌症相关的任何其他生物标记物；以下项中的任何一个：AFP、ALK、BCR-ABL、BRCA1/BRCA2、BRAF、V600E、Ca-125、CA19.9、EGFR、Her-2、KIT、PSA、S100、KRAS、ER/Pr、UGT1A1、CD30、CD20、F1P1L1-PDGRFa、PDGFR、TMPT和TMPRSS2；或选自以下项的至少一种生物标记物：ABCB5，AFP-L3，α-甲胎蛋白，α-甲基酰基CoA消旋酶，BRCA1，BRCA2，CA 15-3，CA 242，Ca 27-29，CA-125，CA15-3，CA19-9，降钙素，癌胚抗原，癌胚抗原肽-1，脱-γ羧基凝血酶原，肌间线蛋白，早期前列腺癌抗原-2，雌激素受体，纤维蛋白降解产物，葡萄糖-6-磷酸异构酶，HPV抗原如vE6、E7、L1、L2或p16INK4a，人绒毛膜促性腺激素，IL-6，角蛋白19，乳酸脱氢酶，亮氨酰氨基肽酶，促脂素，变肾上腺素类物质，脑啡肽酶，NMP22，去甲变肾上腺素，PCA3，前列腺特异性抗原，前列腺酸性磷酸酶，突触素，甲状腺球蛋白，TNF，选自以下项的转录因子：ERG、ETV1(ER81)、FLI1、ETS1、ETS2、ELK1、ETV6(TEL1)、ETV7(TEL2)、GABPa、ELF1、ETV4(E1AF；PEA3)、ETV5(ERM)、ERF、PEA3/E1AF、PU.1、ESE1/ESX、SAP1(ELK4)、ETV3(METS)、EWS/FLI1、ESE1、ESE2(ELF5)、ESE3、PDEF、NET(ELK3；SAP2)、NERF(ELF2)，或肿瘤相关糖蛋白72，c-kit，SCF，pAKT，pc-kit以及波形蛋白。
[0406] 可替代地或另外，感兴趣的生物标记物可以是免疫检查点抑制剂，例如但不限于CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、KIR、TIM3、GAL9、GITR、LAG3、VISTA、KIR、2B4、TRPO2、CD160、CGEN-15049、CHK 1、CHK2、A2aR、TL1A和B-7家族配体或其组合，或是选自下组的检查点蛋白的配体，该组由以下各项组成：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK1、CHK2、A2aR、B-7家族配体或其组合。
[0407] 前述权利要求中任一项的方法，其包括与以下项相关的至少一种生物标记物的检测：急性淋巴细胞白血病(etv6、am11、亲环蛋白b)、B细胞淋巴瘤(Ig-独特型)、神经胶质瘤(E-钙粘蛋白、α-连环蛋白、β-连环蛋白、γ-连环蛋白、p120ctn)、膀胱癌(p21ras)、胆管癌(p21ras)、乳腺癌(MUC家族、HER2/neu、c-erbB-2)、宫颈癌(p53、p21ras)、结肠癌(p21ras、HER2/neu、c-erbB-2、MUC家族)、结肠直肠癌(结肠直肠相关抗原(CRC)-C017-1A/GA733、APC)、绒毛膜癌(CEA)、上皮细胞癌(亲环蛋白b)、胃癌(HER2/neu、c-erbB-2、ga733糖蛋白)、肝细胞癌(α-甲胎蛋白)、霍奇金淋巴瘤(Imp-1、EBNA-1)、肺癌(CEA、MAGE-3、NY-ESO-1)、淋巴样细胞衍生的白血病(亲环蛋白b)、黑素瘤(p5蛋白、gp75、癌胚抗原、GM2和GD2神经节苷脂、Melan-A/MART-1、cdc27、MAGE-3、p21ras、gp100.sup.Pmel117)、骨髓瘤(MUC家族、p21ras)、非小细胞肺癌(HER2/neu、c-erbB-2)、鼻咽癌(Imp-1、EBNA-1)、卵巢癌(MUC家族、HER2/neu、c-erbB-2)、前列腺癌(前列腺特异性抗原(PSA)及其抗原表位PSA-1、PSA-2和PSA-3，PSMA，HER2/neu，c-erbB-2，ga733糖蛋白)、肾癌(HER2/neu、c-erbB-2)、子宫颈和食道的鳞状细胞癌(病毒产物，如人类乳头瘤病毒蛋白)、睾丸癌(NY-ESO-1)和/或T细胞白血病(HTLV-1表位)。
[0408] 还考虑的是，任何上述方法进一步包括(iii)用分解细胞外基质的胶原酶或其他的酶或化学物质或其组合处理该均质物或者其部分或级分，在高温条件下孵育该均质物或者其部分或级分，和/或机械搅动该均质物或者其部分或级分以便解离该均质物或者其部分或级分内的细胞。通常，这些方法将生成另一个代表性样品，其可用于所公开的分析或治疗方法或其组合中。
[0409] 另外，考虑的是，任何上述方法进一步包括(ⅲ)过滤或筛分该均质物或部分或其级分，这可能导致获得单细胞或小细胞簇(如双粘体或三粘体)。
[0410] 代表性样品的细胞组分可以通过一个或多个过滤步骤进行分离。例如，在通过物理和/或生化手段均质化和解离均质物后，可以通过1微米过滤器过滤解离的样品以除去所有完整的细胞材料。预期非细胞代表性样品将含有具有临床效用的从肿瘤和来自肿瘤内的正常基质分泌的因子，即抗体、生长因子、免疫调节剂以及其他未知因子。可通过ELISA、质谱、新一代测序和其他诊断方法分析非细胞代表性样品。在过滤后获得衍生自代表性样品的单细胞的程度上，可将此类细胞使用荧光活化细胞分选(FACS)和流式细胞术分析进行分析。
[0411] 鉴于通过所公开的方法生成的均质物的代表性质，该均质物或者其部分或级分可用于检测低流行率遗传事件(如以20％流行率、15％流行率、10％流行率、5％流行率、2％流行率、1％流行率、0.5％流行率、0.1％流行率、0.001％流行率、0.0001％流行率、0.00001％流行率、0.000001％流行率或更低流行率发生的遗传事件)。示例性的遗传事件包括点突变、缺失、添加、易位、基因融合或基因扩增。同样，该方法还可以涉及检测肿瘤样品或其部分内细胞的遗传或表观遗传异质性和/或检测包括罕见遗传或表观遗传变异的细胞。此类细胞可以小于5％、小于1％、小于0.5％、小于0.1％、小于0.05％、或小于0.01％的频率存在于肿瘤样品中
[0412] 检测到的罕见细胞可能包括一种或多种遗传或表观遗传差异，其赋予对抗癌疗法的抗性和/或促进转移。因此，此类细胞的检测将有利于癌症预后以及适当的治疗方案如外科手术、化疗的选择和/或生物制剂的使用。
[0413] 前述方法还可以包括使用选自以下项的至少一种可检测标记：荧光分子或荧光色素(如由英杰公司(Invitrogen)出售的，例如参见The Handbook--A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies,Invitrogen Detection
Technologies,Molecular Probes,Eugene,Oreg，或Nazarenko等人的美国专利号5,866,
366中所披露)，例如4-乙酰氨基-4'-异硫氰酰茋-2,2'-二磺酸，吖啶和衍生物(如吖啶和异硫氰酸吖啶)，5-(2'-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)，4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘酰亚胺-3,5-二磺酸盐(萤光黄VS)，N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺，邻氨基苯甲酰胺，亮黄，香豆素及其衍生物如香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，香豆素120)、7-氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆素151)；标记红(cyanosine)；4',6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)；5',
5”-二溴邻苯三酚-砜酞(溴邻苯三酚红)；7-二乙氨基-3-(4'-异硫氰酰苯基)-4-甲基香豆素；二亚乙基三胺五乙酸盐；4,4'-二异硫氰酰二氢-芪-2,2'-二磺酸；4,4'-二异硫氰酰茋-
2,2'-二磺酸；5-[二甲基氨基]萘-1-磺酰氯(DNS，丹磺酰氯)；4-(4'-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸(DABCYL)；4-二甲基氨基苯基偶氮苯基-4'-异硫氰酸酯(DABITC)；伊红及其衍生物如伊红和伊红异硫氰酸酯；赤藓红和衍生物如赤藓红B和赤藓红异硫氰酸酯；溴化乙锭；荧光素和衍生物如5-羧基荧光素(FAM)、5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)、2'7'-二甲氧基-4'5'-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)和QFITC(XRITC)；
2',7'-二氟荧光素(OREGON )；荧光胺；IR144；IR1446；孔雀石绿异硫氰酸盐；4-甲基伞形酮；邻甲酚酞；硝基酪氨酸；副品红；酚红；B-藻红蛋白；邻苯二甲醛；芘和衍生物如芘、丁酸芘和琥珀酰亚胺基1-芘丁酸酯；活性红4(Cibacron.RTM.亮红3B-A)；罗丹明和衍生物如6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基罗丹明(R6G)、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、罗丹明(Rhod)、罗丹明B、罗丹明123、罗丹明X异硫氰酸酯、罗丹明绿、磺酰罗丹明B、磺酰罗丹明101和磺酰罗丹明101的磺酰氯衍生物(德克萨斯红(Texas Red))；N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)；四甲基罗丹明；四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)；核黄素；蔷薇酸和铽螯合物衍生物，以大约617nm发射的巯基反应性铕螯合物(Heyduk and Heyduk,
Analyt.Biochem.248:216-27,1997；J.Biol.Chem.274:3315-22,1999)，连同GFP，LissamineTM，二乙基氨基香豆素，荧光素氯三嗪基，萘并荧光素，4,7-二氯罗丹明和呫吨(如Lee等人的美国专利号5,800,996中所述)及其衍生物。也可使用本领域技术人员已知的其他荧光团，例如可从英杰检测技术公司(Invitrogen Detection Technologies)，分子探针(Molecular Probes)(俄勒冈州尤金)获得的那些，并包括ALEXA FLUORTM系列染料(例如，如美国专利号5,696,157、6,130,101和6,716,979中所述)，BODIPY系列染料(二吡咯亚甲基硼二氟化物染料，例如，如美国专利号4,774,339、5,187,288、5,248,782、5,274,113、5,338,
854、5,451,663和5,433,896中所述)，瀑布蓝(Cascade Blue)(美国专利号5,132,432中所述的磺化芘的胺反应性衍生物)和马里纳蓝(Marina Blue)(美国专利号5,830,912)，荧光纳米粒子(如半导体纳米晶体，例如，QUANTUM DOTTM(如从QuantumDot公司，英杰纳米晶体技术(Invitrogen Nanocrystal Technologies)，俄勒冈州尤金(Eugene,Oreg.)获得；另参见美国专利号6,815,064、6,682,596和6,649,138))。在例如美国专利号6,602,671，Bruchez et.al.(1998)Science 281:2013-6，Chan et al.(1998)Science 281:2016-8和美国专利号6,274,323，美国专利号6,927,069、6,914,256、6,855,202、6,709,929、6,689,338、6,
500,622、6,306,736、6,225,198、6,207,392、6,114,038、6,048,616、5,990,479、5,690,
807、5,571,018、5,505,928、5,262,357和美国专利公开号2003/0165951以及PCT公开号99/
26299(1999年5月27日公开)中描述的半导体纳米晶体，放射性同位素(如3H)，金属螯合物如放射性或顺磁性金属离子(像Gd3+)的DOTA和DPTA螯合物，以及脂质体，酶例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶或β内酰胺酶，酶与色原体组合，生成可检测信号的荧光或发光化合物(例如，由俄勒冈州尤金英杰公司(Invitrogen Corporation)出售的那些)。显色化合物的具体例子包括二氨基联苯胺(DAB)、4-硝基苯基磷酸酯(pNPP)、固红、溴氯吲哚基磷酸酯(BCIP)、硝基蓝四唑(NBT)、BCIP/NBT、固红、AP橙、AP蓝、四甲基联苯胺(TMB)、2,2'-连氮基-二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐](ABTS)、邻联茴香胺、4-氯萘酚(4-CN)、硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)、苯二胺(OPD)、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-吡喃半乳糖苷(X-Gal)、甲基伞形酮基-β-D-吡喃半乳糖苷(MU-Gal)、对硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷(PNP)、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸(X-Gluc)、3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)、品红、碘硝基四唑(INT)、四唑蓝和四唑紫等。
Technologies,Molecular Probes,Eugene,Oreg，或Nazarenko等人的美国专利号5,866,
366中所披露)，例如4-乙酰氨基-4'-异硫氰酰茋-2,2'-二磺酸，吖啶和衍生物(如吖啶和异硫氰酸吖啶)，5-(2'-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)，4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘酰亚胺-3,5-二磺酸盐(萤光黄VS)，N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺，邻氨基苯甲酰胺，亮黄，香豆素及其衍生物如香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，香豆素120)、7-氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆素151)；标记红(cyanosine)；4',6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)；5',
5”-二溴邻苯三酚-砜酞(溴邻苯三酚红)；7-二乙氨基-3-(4'-异硫氰酰苯基)-4-甲基香豆素；二亚乙基三胺五乙酸盐；4,4'-二异硫氰酰二氢-芪-2,2'-二磺酸；4,4'-二异硫氰酰茋-
2,2'-二磺酸；5-[二甲基氨基]萘-1-磺酰氯(DNS，丹磺酰氯)；4-(4'-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸(DABCYL)；4-二甲基氨基苯基偶氮苯基-4'-异硫氰酸酯(DABITC)；伊红及其衍生物如伊红和伊红异硫氰酸酯；赤藓红和衍生物如赤藓红B和赤藓红异硫氰酸酯；溴化乙锭；荧光素和衍生物如5-羧基荧光素(FAM)、5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)、2'7'-二甲氧基-4'5'-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)和QFITC(XRITC)；
2',7'-二氟荧光素(OREGON )；荧光胺；IR144；IR1446；孔雀石绿异硫氰酸盐；4-甲基伞形酮；邻甲酚酞；硝基酪氨酸；副品红；酚红；B-藻红蛋白；邻苯二甲醛；芘和衍生物如芘、丁酸芘和琥珀酰亚胺基1-芘丁酸酯；活性红4(Cibacron.RTM.亮红3B-A)；罗丹明和衍生物如6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基罗丹明(R6G)、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、罗丹明(Rhod)、罗丹明B、罗丹明123、罗丹明X异硫氰酸酯、罗丹明绿、磺酰罗丹明B、磺酰罗丹明101和磺酰罗丹明101的磺酰氯衍生物(德克萨斯红(Texas Red))；N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)；四甲基罗丹明；四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)；核黄素；蔷薇酸和铽螯合物衍生物，以大约617nm发射的巯基反应性铕螯合物(Heyduk and Heyduk,
Analyt.Biochem.248:216-27,1997；J.Biol.Chem.274:3315-22,1999)，连同GFP，LissamineTM，二乙基氨基香豆素，荧光素氯三嗪基，萘并荧光素，4,7-二氯罗丹明和呫吨(如Lee等人的美国专利号5,800,996中所述)及其衍生物。也可使用本领域技术人员已知的其他荧光团，例如可从英杰检测技术公司(Invitrogen Detection Technologies)，分子探针(Molecular Probes)(俄勒冈州尤金)获得的那些，并包括ALEXA FLUORTM系列染料(例如，如美国专利号5,696,157、6,130,101和6,716,979中所述)，BODIPY系列染料(二吡咯亚甲基硼二氟化物染料，例如，如美国专利号4,774,339、5,187,288、5,248,782、5,274,113、5,338,
854、5,451,663和5,433,896中所述)，瀑布蓝(Cascade Blue)(美国专利号5,132,432中所述的磺化芘的胺反应性衍生物)和马里纳蓝(Marina Blue)(美国专利号5,830,912)，荧光纳米粒子(如半导体纳米晶体，例如，QUANTUM DOTTM(如从QuantumDot公司，英杰纳米晶体技术(Invitrogen Nanocrystal Technologies)，俄勒冈州尤金(Eugene,Oreg.)获得；另参见美国专利号6,815,064、6,682,596和6,649,138))。在例如美国专利号6,602,671，Bruchez et.al.(1998)Science 281:2013-6，Chan et al.(1998)Science 281:2016-8和美国专利号6,274,323，美国专利号6,927,069、6,914,256、6,855,202、6,709,929、6,689,338、6,
500,622、6,306,736、6,225,198、6,207,392、6,114,038、6,048,616、5,990,479、5,690,
807、5,571,018、5,505,928、5,262,357和美国专利公开号2003/0165951以及PCT公开号99/
26299(1999年5月27日公开)中描述的半导体纳米晶体，放射性同位素(如3H)，金属螯合物如放射性或顺磁性金属离子(像Gd3+)的DOTA和DPTA螯合物，以及脂质体，酶例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶或β内酰胺酶，酶与色原体组合，生成可检测信号的荧光或发光化合物(例如，由俄勒冈州尤金英杰公司(Invitrogen Corporation)出售的那些)。显色化合物的具体例子包括二氨基联苯胺(DAB)、4-硝基苯基磷酸酯(pNPP)、固红、溴氯吲哚基磷酸酯(BCIP)、硝基蓝四唑(NBT)、BCIP/NBT、固红、AP橙、AP蓝、四甲基联苯胺(TMB)、2,2'-连氮基-二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐](ABTS)、邻联茴香胺、4-氯萘酚(4-CN)、硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)、苯二胺(OPD)、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-吡喃半乳糖苷(X-Gal)、甲基伞形酮基-β-D-吡喃半乳糖苷(MU-Gal)、对硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷(PNP)、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸(X-Gluc)、3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)、品红、碘硝基四唑(INT)、四唑蓝和四唑紫等。
[0414] 所公开的方法可以全部或部分自动化。例如，步骤(i)和(ii)可以是自动的，但是任何后续步骤例如步骤(iii)和(iv)是手动的。可替代地，通过举例，步骤(i)和(ii)可以是手动的，而随后的步骤例如步骤(iii)和(iv)是自动的。另外，这些方法涵盖的所有步骤都可以自动化。
[0415] 所公开的方法可以单独使用或与用于肿瘤分期的其他已知方法(如TNM)组合。在一个方面，该方法进一步包括评价肿瘤的一个或多个形态学方面，肿瘤细胞已扩散至区域淋巴结和/或淋巴系统的程度，以及基于代表性样品中含有的基因组学、蛋白质组学和/或脂质组学信息肿瘤是否已转移至远处的器官。
[0416] 所公开的方法可以进一步包括采用算法来计算具有或不具有特定生物标记物的肿瘤细胞的百分比。可以基于代表性肿瘤样品和/或代表性淋巴结样品内具有特定物的细胞的百分比来确定转移(或毒性亚克隆)进展的相对风险
[0417] 所公开的方法可以进一步包括基于代表性样品中含有的生物标记物谱、抗原谱、突变谱、脂质谱、蛋白质谱和/或外泌体谱来开发个性化剂量方案。例如，基于代表性样品中含有的信息(或与代表性淋巴结样品和/或循环DAN谱相比的此类信息)，可以对药物和/或给予患者的此类药物的剂量(量、给药长度等)的选择进行修饰以基于患者的个体癌症谱来对治疗进行个性化。
[0418] 公开的方法可以进一步包括将该代表性样品的基因组谱与代表性淋巴结样品的基因组谱相比较，并进一步任选地将这些谱与来自任何远端转移瘤或代表性转移性肿瘤样品的循环肿瘤DNA相比较。
[0419] 本公开文本进一步涵盖通过本公开文本中的任何方法产生的组合物。
[0420] 代表性样品的分析
[0421] 另外，本公开文本考虑了使用前述方法的结果(如罕见遗传和/或表观遗传事件、罕见细胞等的检测)或通过任何前述方法产生的组合物(涉及肿瘤样品的均质化，以制备适于使用任何数目的标准诊断测定进行的进一步分析的代表性样品)来选择用于治疗受试者的适当治疗方案。该治疗方案可以包括以下中任一项：化疗、免疫调节剂给予、放射、细胞因子给予、手术或其组合。
[0422] 此外，所公开的方法可用于选择至少一种治疗剂(如抗体、核酸、小分子或多肽，其拮抗、抑制或阻断至少一种检测的生物标记物的表达或功能活性)，该治疗剂适用于如下受试者，其肿瘤是通过所提供的方法生成的代表性样品的来源。
[0423] 癌症生物学领域的最新进展破坏了长期保有的对肿瘤生理学的信念。以前，主要的想法是肿瘤内的所有细胞彼此相似，无论癌症阶段如何。然而，随着如单细胞测序等新技术的出现，现在了解到肿瘤内的细胞可以高度多样化。参见Campbell et al.Subclonal phylogenetic structures in cancer revealed by ultra-deep sequencing.PNAS 2008；105:13081-13086；以及Navin et al.Tumor evolution inferred by single-cell sequencing.Nature.2011；472:90-94。肿瘤内异质性的发现突显了临床肿瘤学(包括癌症诊断)中需要解决的新复杂性。
[0424] 当前的病理学方法是基于从肿瘤中切下仅一些小区域，将它们放入石蜡块中，并从这些块中切下小切片以进行癌症生物标记物的检测。参见Westra et al.Surgical Pathology Dissection:An Illustrated Guide.New York:Springer.2003。这种方法可用于将癌症分期，但仅依赖于对全肿瘤的一小部分进行采样，使得诊断结果不太可能代表整体。因此，当前方法：1)不能鉴定重要的疾病特征，以及2)对轻微的疾病性状过度采样，其常常不能确定或影响疾病进展和/或结果。
[0425] 随着肿瘤尺寸的增加，这些问题会随之扩大，并且因此癌症患者的长期生存率常常会受到负面影响。例如，无论癌症分期如何，随着肿瘤尺寸的增加，五年生存率平均值下降。参见Lopez-Encuentra et al.Staging in lung cancer:is 3cm a prognostic threshold in pathological stage 1non-small cell lung cancer？A multicenter study of 1,020patients.Chest.2002；121(5):1515-1520；Miller and Grigsby.Measurement of tumor volume by PET to evaluate prognosis in patients with advanced cervical cancer treated by radiation therapy.Int J Radiat Oncol Biol Phys.2002；53(2):353-359；Elkin et al.The effect of changes in tumor size on breast carcinoma survival in the U.S.:1975-1999.Cancer.2005；104(6):1149-
1157；Brookman-May et al.Difference between clinical and pathological renal tumor size,correlation with survival,and implications for patient counseling regarding nephron-sparing surgery.AJR.2011；197(5):1137-1145；以及Kornprat et al.Value of tumor size as a prognostic variable in colorectal cancer:a critical reappraisal.Am J Clin Oncol.2011；34(1):43-49)。
1157；Brookman-May et al.Difference between clinical and pathological renal tumor size,correlation with survival,and implications for patient counseling regarding nephron-sparing surgery.AJR.2011；197(5):1137-1145；以及Kornprat et al.Value of tumor size as a prognostic variable in colorectal cancer:a critical reappraisal.Am J Clin Oncol.2011；34(1):43-49)。
[0426] 因此，需要新技术来解决临床肿瘤学中肿瘤异质性的问题，尤其对于患有大型实体瘤的那些患者。此外，需要改进的方法在疾病表现之前鉴定含有异常细胞的患者样品，以增强良好治疗结果的可能性。
[0427] 为了解决肿瘤异质性问题，肿瘤学领域的一些专家建议测试多个区域，从而增加一次采样的肿瘤量。参见例如Alizadeh et al.Toward understanding and exploiting tumor heterogeneity.Nature Medicine.2015；21:846-853。正如上述概率模型所证明的，这种技术不能完全解决肿瘤异质性的问题。负责加工此样品数目/患者的病理学实验室工作量的增加使得提出的此方法成为令人望而却步的。
[0428] 为了使样品具有代表性，起始材料的所有不同片段在样品中必须有相同的结束机会，并且这必须在所有样品中保持一致。参见Petersen et al.2005。然而，当前切片程序下，大部分肿瘤在石蜡块建立后被焚烧。参见Westra et al.2003。因此，迄今为止，不仅代表性肿瘤样品没有制成，当前病理实践阻止甚至禁止它们产生。
[0429] 在另外的方面，可使用机械方法例如剪切和/或生化方法，例如热和pH调节和细胞外基质的酶促消化来从肿瘤产生代表性样品。这些方法的偶联产生一个或多个组织样品(例如，整个肿瘤或其很大部分)的代表性样品，而不损害在传统的基于组织的测定中使用样本的能力，例如苏木精和伊红染色、免疫组织化学分析和核酸分离。事实上，每个代表性样品可以同时用于多个不同的测定。另外，器官、组织或肿瘤的均质化使其适用于另外的诊断测试，如全基因组测序，这对于未来的药理学和诊断发现以及个性化医学可能是重要的。另外，该均质物适用于与用于血液诊断测试的方法相似的自动化方法。因此，代表性样品可用于多种诊断方案，以鉴定罕见的肿瘤亚克隆，并通过延伸改进临床诊断和个性化癌症治疗。此外，所得代表性样品可用于衍生用在开发治疗性或预防性肿瘤疫苗中的抗体或抗原。
[0430] 如本文所例示的，诸位发明人已经证明了从临床样本(例如，人类肿瘤临床样本)中建立代表性样品的能力，并进一步显示可以在由本文公开的方法生成的代表性样品内检测到使用传统肿瘤切片可能无法识别的罕见表型。此外，诸位发明人已经显示，所公开的方法可用于从多种不同组织类型(经固定的或未经固定的组织)生成代表性样品，并且所得代表性样品可用于多种诊断测试，包括IHC和核酸分离。
[0431] 依赖于应用于该样品以生成均质物的机械和/或生化解离过程，细胞簇可包括超过一个(1)细胞至数千个细胞。通过应用另外的方法，例如通过进一步的机械和/或生化解离和/或通过尺寸排阻，可以解离各团簇(其中含有的细胞的尺寸和/或数目减少)，这取决于待使用代表性样品进行的随后测定(例如，FACS和流式细胞术需要单细胞)。
[0432] 该方法在样品解离程度方面很灵活。因此，例如，通过进一步加工在应用第一种机械手段(如共混或等效物)后获得的细胞簇，直到簇符合采样方法(如单细胞)的解离目标，可以控制该一个或多个机械过程以获得靶细胞聚集体尺寸。在一个方面，使用机械剪切和尺寸排阻(例如用一系列网进行筛分)来移除处于或低于一定尺寸的细胞簇，同时保留较大的细胞簇以进一步加工以达到目标粒度。以这种方式，即使尺寸范围可能看起来像正态分布，还是通过使用尺寸排阻(例如筛分尺寸)来操纵细胞簇粒度的所得分布，以从解离过程移除某些粒子，并且因此达到上浆平台而不是分布。
[0433] 均质化后，所得簇可含有至少1至2、2至100、100至500、500至1,000、1,000至10,000、10,000至50,000或更多个细胞。在一个方面，该簇含有单细胞、约2至10个细胞、约10至
20个细胞或约20至40个细胞。所得簇的尺寸可以变化。参见，例如图17。
20个细胞或约20至40个细胞。所得簇的尺寸可以变化。参见，例如图17。
[0434] 由于均质化肿瘤和/或淋巴结样品(或肿瘤样品的均质化)，该样品(例如，肿瘤或淋巴结)内细胞的任何异质性基本均匀(均一)地分布在所得均质物或者其部分或级分中，使得该均质物(或其任何级分)基本上均匀地表达作为输入的肿瘤活检样品的异质性。通过使肿瘤均质化来生成代表肿瘤整体的样品(或均质物)，可以表征该肿瘤的表型多样性(如具有特定基因突变的细胞的百分比)。尽管许多或大部分细胞保持完整，但均质化样品可以基于其流动或倾倒能力被称为液体或液化样品。在一些情况下，该代表性样品可以是液体样品(如细胞学针抽吸物、渗出物样品或巴氏涂片)。
[0435] 如上所述，可将其他部分添加至这些均质物或代表性样品中，如其他细胞、半抗原或标记。
[0436] 对代表性样品进行测序
[0437] 为了个性化医学的最终目标，肿瘤学家依靠诊断医生来检测肿瘤的关键突变，以便他们能够将靶向治疗与肿瘤内的特定变化联系起来。通过新一代测序(NGS)从实体瘤捕获序列信息是临床肿瘤学工作流程的关键组成部分，因为随着时间的推移肿瘤细胞可能总是对疗法生成抗性。所有当前临床NGS工作流程固有的最重要障碍之一是临床医生无法检测到推动肿瘤所有部位肿瘤生长的突变，临床医生也不能检测到赋予预先存在的疗法抗性的突变。此外，虽然一些突变可能在该肿瘤内高度流行，但其他突变(包括驱动突变和抗性突变)可能仅存在于该肿瘤的一小部分中。典型地，这个问题的根源在于以下事实：临床医生利用来自于取自原发性肿瘤的样品的福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织切片。虽然采样问题可以通过代表性采样的过程彻底解决，但临床NGS工作流程中仍有一些重要问题需要解决，以充分实现个性化医学。
[0438] 今天，临床中的NGS只能用于检测大部分肿瘤内存在的可靶向突变(即与靶向治疗相关的突变)。临床医生和研究人员主要关注可靶向突变，这主要归因于NGS技术产生的数据量。例如，在组织样品的整个外显子组分析中，将检查数以万计的基因，以几十到几百个小片段对每个基因进行测序。并非使用所有数据来制定临床决策，许多小组未能考虑绝大多数数据，并只报告已知与疗法相关的突变。
[0439] 然而，未满足的技术和临床需求是检测实体瘤中存在的所有突变，而不论它们是否“可靶向”。此外，临床医生确定含有特定突变的肿瘤细胞的百分比是必要的。只在有捕获绝大多数肿瘤的基因组多样性的数据的情况下，临床医生才能理解如何治疗具有多种“可靶向或可用药”突变的患者。例如，如果实体瘤含有55％流行率的EGFR基因突变、20％流行率的bRaf突变和5％流行率的KIT突变，则临床医生会希望用EGFR抑制剂(例如西妥昔单抗、帕尼单抗)靶向该肿瘤的大部分，直到通过成像或持续特定时间而看到临床反应。然后停止EGFR抑制剂，并且给予下一个最流行的治疗靶标，在这种情况下为bRaf抑制剂(例如威罗菲尼)。此时临床医生可能会或可能不会通过成像看到临床反应。将停止bRaf抑制剂，并给予最不常见的治疗靶标，即KIT抑制剂(例如伊马替尼、舒尼替尼)。然后这三种药物方案可以重复。如果这些药物可一起被耐受，则联合治疗将是另一种可能性。可替代地，这些药物可以以相反的顺序给予；KIT抑制剂，bRaf抑制剂，随后EGFR抑制剂。
[0440] 此药物时间表的关键组成部分不是NGS技术或抑制剂，而是使用代表性采样技术确定该肿瘤内所有潜在靶标的存在及其相对流行率。在上面的例子中，KIT突变和bRaf突变都会被遗漏，因为它们以低流行率存在。如果对含有高百分比的bRaf突变细胞的肿瘤区域进行了采样，那么会显现似乎该bRaf突变正驱动大部分肿瘤，并且bRaf抑制剂将作为单一药剂给予。仅靶向上述例子中的三种突变中之一会导致治疗抗性，因为含有其他两种突变的肿瘤细胞不会对该单一药剂产生应答。
[0441] 来自原发性肿瘤的NGS数据的其他用途试图确定肿瘤细胞是否可以被免疫系统靶向，即使用免疫疗法。这包括预测可能被免疫系统靶向的新抗原。肿瘤外显子组测序可以检测到预测会导致表达的蛋白变化的突变。
[0442] 确定实体瘤内突变流行率的关键因素是从肿瘤细胞和正常细胞的混合群体中富集/纯化肿瘤细胞。可用于捕获高百分比肿瘤细胞的一种技术是荧光活化细胞分选(FACS)。将这种技术应用于代表性样品，必须首先将均质化的实体瘤解离成单细胞或小的多细胞组织碎片。除了肿瘤标记物的荧光检测之外，还可以基于细胞和核尺寸对单细胞进行分选。从肿瘤细胞中阴性选择正常细胞也将产生主要由肿瘤细胞组成的样品。多细胞组织碎片分选(MTFS)可以通过肿瘤标记物的荧光检测来富集，或者在阴性选择正常标记物的情况下富集。此技术不仅可以使NGS数据更容易解读，而且使得能够检测肿瘤中极低流行率的突变。
[0443] 另外，FACS或MTFS可用于区分来自肿瘤的多个不同细胞群体，每个细胞群可作为独特的样品处理，并相互独立地进行分析。这类的例子是肿瘤细胞、正常上皮细胞、内皮细胞和免疫细胞的分化。
[0444] 代表性样品的NGS的又另一个应用是检测可能被免疫系统检测到的新抗原。为了在抗肿瘤治疗方案中有效利用新抗原，临床医师必须检测肿瘤中所有潜在的抗原性突变。与靶向疗法相似，检测用于嵌合抗原受体疗法(CAR-T)的大部分新抗原至关重要。
[0445] 此外，流式细胞术是诊断工作流程的重要组成部分，其中临床医生可以使用来自流式细胞术的数据来相对于作为肿瘤、正常、二倍体肿瘤或对特定生物标记物呈阳性的肿瘤细胞的各群体的样品的百分比确定该代表性样品的组成。此工作流程的例子是通过计算代表性样品中的肿瘤百分比，计算统计学上支持需要1000个阳性细胞的IHC测定所需的最小细胞数目。
[0446] 肿瘤或其部分的均质化
[0447] 本公开涉及均质化肿瘤或其他组织样品(例如，癌前病变或推定正常组织)，其任选地可在均质化之前或之后保存或固定，例如用福尔马林、石蜡和/或乙醇，以生成“代表性样品”，其为该组织(例如肿瘤、淋巴结、转移瘤、息肉、囊肿、活检切片、整个器官或任何前述项的组合)的整体的无偏差指示。另外，这些方法可以保持样品内细胞的完整性和/或生存力。这些代表性样品可以包括大多数克隆(具有大于50％的流行率)，一级亚克隆(具有约20％至约50％流行率)，二级亚克隆(具有约10％至约20％流行率)和较小亚克隆(具有小于
10％流行率，优选小于5％流行率，更优选小于1％流行率，并且最优选小于0.1％流行率)。
如上所述，代表性样品促进检测低流行率事件，即低至或低于0.000001％发生率。代表性样品因为反映了整个组织样品(例如实体瘤或淋巴结)，允许与其在组织(通常是肿瘤或淋巴结/淋巴组织)中发生的突变成比例地检测，其不能可靠地使用当前方法(如FFPE载玻片染色)完成。
10％流行率，优选小于5％流行率，更优选小于1％流行率，并且最优选小于0.1％流行率)。
如上所述，代表性样品促进检测低流行率事件，即低至或低于0.000001％发生率。代表性样品因为反映了整个组织样品(例如实体瘤或淋巴结)，允许与其在组织(通常是肿瘤或淋巴结/淋巴组织)中发生的突变成比例地检测，其不能可靠地使用当前方法(如FFPE载玻片染色)完成。
[0448] 均质化临床样本(例如人类肿瘤)的概念与历史上的病理学和肿瘤学采样方法相反。均质化整个人类肿瘤或甚至大部分人类肿瘤没有任何历史优先。实际上，一旦取得了用于TNM分期的样品，剩余的肿瘤材料就会被破坏(因为公认所有医学有关的信息都在从TNM分期收集的切片之内)。
[0449] 然而，诸位发明人已经鉴定，如果将所有(或基本上全部)可用肿瘤作为单个样品保存和均质化，而不是破坏残余肿瘤材料，则可以检测和分析来自癌细胞的小亚群的信息。
[0450] 在许多情况下，将样品(如肿瘤、淋巴结或转移瘤)整体作为单个块或多个块提交，取决于团块的尺寸。例如，直径小于2厘米的许多乳腺肿瘤与大部分黑素瘤一样整体提交。在2015年大概935,000例癌症估计病例中，估计至少三分之一的肿瘤样品适用于均质化。尤其适用于均质化的肿瘤包括结肠肿瘤和肾肿瘤。
[0451] 均质化的肿瘤的液体性质使得能够对肿瘤细胞群进行统计分析。例如，功效分析表明，检测低流行率亚克隆的可能性随着对增加百分比的样品的分析而增加。例如，约95个细胞的样本量允许检测具有约20％流行率的亚克隆，约200个细胞的样本量允许检测具有约0.1％流行率的亚克隆，约2,000个细胞的样本量允许检测具有约0.01％流行率的亚克隆，并且约20,000个细胞的样本量允许检测具有约0.001％流行率的亚克隆。预计如下是合理的，即来自临床的肿瘤样品包括可能来自肿瘤的空间上不同区域的至少约100至200、200至1,000、1,000至5,000、10,000至100,000、100,000至1,000,000、1,000,000至5,000,000、5,000,000至1,000,000,000、1,000,000,000至5,000,000,0000或更多个细胞(即数万亿个细胞)，并且从这些肿瘤生成的代表性样品将具有足够的细胞计数以允许充分检测亚克隆。
因此，用来自根据所公开的方法获得的代表性肿瘤样品的足够数目的细胞为每个诊断测定提供动力，使得能够检测肿瘤内的罕见亚克隆，并因此促进癌症的突变景观的无偏测定。
因此，用来自根据所公开的方法获得的代表性肿瘤样品的足够数目的细胞为每个诊断测定提供动力，使得能够检测肿瘤内的罕见亚克隆，并因此促进癌症的突变景观的无偏测定。
[0452] 所公开的用于制备代表性样品的方法不需要细胞裂解，并且在一些实施方案中维持细胞结构。因此，根据所公开的其中保持细胞完整性的方法生成的代表性样品可用于例如ICC、IHC和流式细胞术中。可替代地或另外，可以任选地处理该样品或代表性样品或其部分以破坏(溶解)细胞，并且因此允许使用例如PCR、新一代测序(NGS)和质谱来分析细胞组分。
[0453] 全肿瘤采样或鉴定推定正常组织或癌前组织中的罕见细胞类型的初始步骤是获取足够量的组织，例如肿瘤组织。通常，可用于均质化的肿瘤组织越多，检测罕见肿瘤亚群的可能性就越高。实际上，可用于建立代表性样品的肿瘤材料总量将小于100％(由于用于TNM分期系统的样品已经从该肿瘤中移除)。然而，展望未来，即一旦本方法成为护理标准，整个肿瘤(或至少更多的残余肿瘤)将可用于临床中的均质化。当前实践是在外科病理学家进行大体检查和采样之前在福尔马林中固定整个手术切除；经固定的和未经固定的组织都适用于代表性采样。然而，可以想象的是，可以消除或淘汰福尔马林固定，例如，一旦本方法成为护理标准。尽管也可以将现有的TNM分期方法与本文公开的代表性采样方法组合使用。
[0454] 一旦获取了肿瘤或其他组织，尽可能多的肿瘤或其他组织被放入共混器(或其他合适的装置)中并均质化，通常为机械剪切的结果(尽管化学解离和/或生化解离(例如酶促解离)也可能有助于均质化)。
[0455] 通过纯粹的机械手段(例如共混)进行均质化，从数千到数百个细胞产生一系列组织碎片，各自可能拟合正态分布。然而，应用单独的其他均质化方法或与机械手段组合，例如单独的生化/化学解离方法或与机械手段组合，可能使组织碎片的分布从正态分布变形。
[0456] 另外，可以使用平行或串联使用的机械手段(其将样品(例如肿瘤或淋巴结)解离并均质化为组织碎片(如单细胞和细胞簇))的组合，以在建立细胞样品过程中或之后生成生物标记物样品。例如，如上所讨论，通过共混该样品可以生成包括完整细胞的代表性样品，并且所得“细胞样品”可用于分析该完整细胞；然而，可以通过另一种机械手段(例如超声处理)进一步加工该细胞样品以生成生物标记物样品，即完整细胞的破坏(裂解)允许分析该样品中的蛋白质和/或DNA生物标记物。
[0457] 组织碎片尺寸的中值与共混器(或其他合适的装置)的能量负相关，使得在高能量时组织碎片非常小。与共混器能量最相关的组织组分是胶原蛋白内容物，因为真皮需要大量的能量用于完全解离。共混时间也很重要；然而，最有效的临床应用需要在几分钟内将全肿瘤解离。共混时间一旦确定，在希望的时间限制下达到肿瘤解离所需的能量可以很容易地确定。
[0458] 在足够机械剪切(通过共混或其他合适的力)以使全肿瘤解离之后，最初在空间上分离的所有肿瘤细胞亚群遍及新液化的肿瘤样品分布。测试样品可以取自均质化样品，并且可以使用不同的测试方式检测肿瘤亚群(包括罕见或低流行率或较小亚群)。
[0459] 例如，液化的全肿瘤样品的等分试样可以被取出，裂解以释放细胞组分，并且核酸被纯化用于通过PCR或NGS进行分析。例如，可以使用微流化器和/或通过研磨、碾磨、化学或酶促裂解和/或本领域已知的其他技术裂解细胞。可替代地或另外，肿瘤细胞的蛋白质组分可以被纯化用于蛋白质组学分析方法，如质谱(MS)。此外，该组织碎片可以被包埋在石蜡中，并使用当前的病理学工作流程进行采样。对于长期储存，包括该液化肿瘤的代表性样品可以储存在合适的缓冲液中并冷藏或冷冻或包埋在蜡(如石蜡)中储存。
[0460] 通常，可以在施加机械力(通过共混器或超声波仪或其他合适的装置诱导剪切)和无生化(酶促)加工后进行可有效地利用最始共混的全肿瘤样品(其含有细胞簇)的测定，如上面提到的那些测定(如PCR、NGS、MS、IHC、ICC等)。然而，需要较小组细胞(如2至20个细胞或甚至单细胞)的测定也可用于分析代表性样品，但需要对样品进行额外加工以去除在手术切除的组织的福尔马林固定过程中诱导的蛋白质-蛋白质交联。具体而言，需要对共混的肿瘤组织进行酶促消化来产生由适用于某些测定(例如细胞分选)的单细胞和小细胞簇组成的代表性样品。
[0461] 如上所讨论的，均质化可以仅使用机械手段(如共混，单独使用或与其他机械手段串联或并行使用)、仅使用生化/化学手段(如酶促消化)或其组合进行。将组织碎片的物理和生化(酶促)破坏组合可产生适用于需要完整细胞的诊断测定的样品。启动蛋白质交联分解的首个物理方法是将组织碎片在约80至约85摄氏度在低pH缓冲液中孵育。孵育步骤开始非特异性地“打开”组织碎片，使其准备用于该过程中的下一步骤，即保持组织碎片在一起的细胞-细胞外基质连接的生化切割。在合适的条件下可以实现用以下酶进行的孵育：如非蛋白质特异性蛋白酶，例如胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、弗林蛋白酶、内切蛋白酶(如可从NEB、西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)、赛默飞世尔公司(Thermo Fisher)、普落麦格公司(Promega)等获得的Asp-N和Glu-C)、肠激酶和枯草杆菌蛋白酶；蛋白质特异性蛋白酶，例如胶原酶(如胶原酶类型I-S、I-A、IA-S、II、II-S、IV、IV-S、VIII、V、V-S、XI、XI-S、III、VII、VII-S、S、F、H和L(可从NEB、西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)、赛默飞世尔公司(Thermo Fisher)、普落麦格公司(Promega)等获得)、明胶酶、溶基质素、基质溶解素、釉质溶解素和admats(如蛋白多糖降解酶)；和/或非哺乳动物/非细菌酶替代物，例如真菌酶，例如 和 (创新细胞技术公司(Innovative Cell Technologies)，圣地亚哥，加利福尼亚州)或任何前述项的组合，以切割这些连接。示例性的酶包括但不限于间质胶原酶、明胶酶-A、溶基质素1、基质溶解素、嗜中性粒细胞胶原酶、明胶酶-B、溶基质素2、溶基质素3、巨噬细胞金属弹性蛋白酶、胶原酶3、MT1-MMP、MT2-MMP、MT3-MMP、MT4-MMP、胶原酶4、釉质溶解素、X-MMP、CA-MMP、MT5-MMP、MT6-MMP、基质溶解素-2、MMP-22、内切蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、内切蛋白酶Asp-N、内切蛋白酶Arg-C、内切蛋白酶Glu-C(V8蛋白酶)、内切蛋白酶Lys-C、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K、枯草杆菌蛋白酶、梭菌蛋白酶、外肽酶、羧肽酶A、羧肽酶B、羧肽酶P、羧肽酶Y、组织蛋白酶C、酰基氨基酸释放酶、焦谷氨酸氨基肽酶，在合适的条件下可以实现，以切割这些连接。这些酶可以单独或组合使用，例如胶原酶(如胶原酶H)和另一种酶(如 )、多种胶原酶、多
种其他酶等。
种其他酶等。
[0462] 可替代地或另外，在该代表性样品的生化消化之前和可替代地或另外在该代表性样品的生化消化之后，将该组织碎片通过施加机械力(如研钵和杵，与在香肠生产中使用的绞肉机相似的研磨仪器，或超声处理)进行剪切。
[0463] 同样，生化消化的代表性样品可以通过进行离心进一步加工，其可以用于从样品中分离某些细胞或其他材料以进行额外的分析。例如，离心由人卵巢浆液性癌肿瘤制备的代表性样品(将其与 和胶原酶H共混并进行消化)导致基于肿瘤血小板和其他血细胞的分离(图23)。图23是通过离心从生化消化的代表性样品中分离的基于肿瘤血小板(tumor-educated platelet)和其他血细胞的图像。将人卵巢浆液性癌肿瘤共混并用Accumax和胶原酶H消化，随后离心，导致离心样品顶部的血小板和红细胞积聚(红线)。
[0464] 诸位发明人在本文中显示将使用pH和热量的细胞调节与酶促消化偶联提供了有效的解离代表性样品建立。改进对分子靶标的染色(生物或化学)可及性的过程在本文中被称为“细胞调节”。例如，在高温(70-100摄氏度)下在CC1缓冲液或CC2缓冲液(维塔纳公司(Ventana))中进行细胞调节有助于肿瘤组织的酶促消化。柠檬酸盐缓冲液的许多替代物可以用作细胞调节溶液。
[0465] 在额外的加工之后对组织碎片尺寸的一种有效测量包括评估液体样品穿过具有已知孔径的网或过滤器(或一系列此类网或过滤器)的程度，该已知孔径为例如，小于1微米(例如，约0.5微米)、约1至6微米、约6至10微米、约10至20微米、约20至30微米、约30至40微米、约40至100微米、约100至300微米、约300至500微米、或大于500微米。在一个方面，使用尺寸范围为从约1微米至约500微米的一系列过滤器来分离该均质物内的细胞。也可以使用具有更小孔径的过滤器，例如小于1微米，例如约0.45微米，以在生成代表性细胞级分后将生物标记物样品的亚细胞部分与样品的细胞部分分离。因此，可以在机械解离方法(如共混或等效方案)之后使用尺寸排阻方法(如筛分)作为从细胞样品中分离生物标记物样品的快速方法。
[0466] 代表性样品或均质物组合物的分析
[0467] 代表性样品(例如，由所公开的方法生成的肿瘤样品)提供了优于用于病理学和诊断中的传统肿瘤样品的若干优点，包括(i)将代表性样品用于几种不同诊断测定的能力，其中一些可能与实体组织不相容；(ii)加强的检测低流行率亚克隆的能力，即建立全肿瘤的代表性样品去除了抑制低流行率亚克隆发现的抽样偏差；以及(iii)消除诊断肿瘤学实验室内的样品增殖，由此建立更有效的实验室工作流程，即，当前实践规定每个肿瘤制备多达3至10个块，尽管仅测试1个块。
[0468] 因此，本公开文本还涉及该代表性样品或均质物组合物的分析方法。在一个方面，该分析包括核酸分析、蛋白质分析、脂质分析、细胞分析、代谢物分析、基因组分析、转录组学分析、蛋白质组学分析、代谢组学分析、脂质组学分析、免疫学分析、细胞化学分析、基因型分析、表型分析、或其组合，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在一个方面，该核酸分析包括DNA分析或RNA分析，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在另一个方面，该RNA分析包括微小RNA分析，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在不同的方面，该均质物的分析包括纯化核酸、蛋白质、细胞器、代谢物、化学物质、非细胞组分、或其组合，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。
[0469] 在另一个实施方案中，该均质物的分析包括将结合剂与该均质物的组分结合，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在一些方面，该结合剂包括抗体、放射性标记、荧光色素、半抗原、酶、核酸、蛋白质、化学物质、引物、配体、细胞、肽、探针、荧光染料、非荧光染料、酶、生物素、或其组合，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在一个实施方案中，该均质物的组分包括核酸、蛋白质、细胞器、代谢物、化学物质、非细胞组分、或其组合，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。
[0470] 在一个实施方案中，该均质物的分析进一步包括检测来自该结合剂或该组分的信号，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在一个方面，该信号包括放射性信号或非放射性信号，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在另一个方面，该非放射性信号包括荧光信号、化学荧光信号或发光信号，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在另一个方面，该均质物分析包括测序分析、组织学分析或图像分析，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成，在一个方面，该测序分析包括新一代测序分析、单细胞测序分析和/或单核测序，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在另一个方面，该组织学分析包括新一代组织学分析，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在一个方面，该图像分析包括新一代分析，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。
[0471] 在一个实施方案中，用于制备组织样品的方法进一步包括检测或定量该均质物的组分，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成，其中该组分包括细胞、核酸、蛋白质、细胞器、代谢物、化学物质、非细胞组分、或其组合。在一个方面，该细胞包括免疫细胞、肿瘤细胞、干细胞、祖细胞、血细胞、生殖细胞和体细胞，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在另一个方面，该均质物的分析包括对从该均质物反射的偏振光的分析，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在一个方面，该均质物的分析包括该均质物的声学性质、机械性质或光学性质的分析，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在另一个方面，将该均质物用流式细胞术、苏木精和伊红染色、或免疫组织化学进行分析。
[0472] 在一个实施方案中，当来自全肿瘤的细胞已被解离至希望的程度时，可将该代表性样品沉积在载玻片上以准备染色，例如ISH或ICC或IHC。
[0473] 有多种方法将细胞沉积到载玻片上，所有这些方法都涉及将细胞干燥到载玻片上。可将细胞沉积在载玻片上的缓冲液范围为从有机溶剂(如乙醇、甲醇、柠檬烯、福尔马林和丙酮)、非水性溶剂(丙二醇、聚乙二醇、甘油、植物油如橄榄油和可注射的有机酯如油酸乙酯)、无机非水性溶剂(如液氨、液态二氧化硫、硫酰氯和硫酰氯氟化物、磷酰氯、四氧化二氮、三氯化锑、五氟化溴、氟化氢、纯硫酸和其他无机酸)、常用缓冲剂(如PBS、HEPES、MES、PIPES、柠檬酸、TAPS、Bicine、Tris、Tricine、TAPSO、TES、MOPS、PIPES、CHES、二甲胂酸盐、碳酸、碳酸氢盐或TE)到水。例如，细胞可以被稀释到甲醇中，这会促进均一扩散在载玻片上并快速蒸发。
[0474] 另外，其他高挥发性溶剂(如乙腈、辛醇、氯丁烷或其他HPLC溶剂)和制冷剂液体(如具有接近室温沸点(例如，25℃)的四氯化碳、三氯氟甲烷、二溴二氟甲烷等)可用于在载玻片上获得基于细胞的代表性细胞而无需醇的溶剂作用。
[0475] 典型的H&E染色、ISH、原位PCR、免疫组织化学(IHC)、组织化学(HC)或酶组织化学(EHC)方法可以使用标准方法(并且优选本文阐述的方法)进行(参见图10、图11和图14)。用于根据本公开内容进行的检测反应的适用形式可以是印迹技术，如Western印迹、Southern印迹、Northern印迹、免疫细胞化学或免疫组织化学程序。印迹技术是本领域普通技术人员已知的，并且可以例如作为电印迹、半干印迹、真空印迹或斑点印迹进行。免疫细胞化学/组织化学染色程序是本领域技术人员已知的，并且可以包括结合剂介导的多肽检测以及原位杂交技术。两种不同的技术甚至可以同时应用。在某些实施方案中，核酸的杂交捕获可以用于该检测。扩增反应也可用于检测例如核酸分子。
[0476] 原位杂交(ISH)是这样的技术，其可以有利地与本公开一起采用，单独使用或与其他技术组合使用，因为ISH中的许多步骤必须将温度精确控制持续精确的时间段。在持续特定的时间段的热量的精确量对于使DNA充分变性是必要的，这样后续的杂交过程不会发生过度加热至细胞形态降解。取决于如何制备和固定该组织，可使用不同的温度对不同的样本进行变性。变性、杂交和杂交后洗涤的步骤可以在不同的温度下进行，这可能取决于正测试的探针和组织的详情。如前所讨论的，这些温度可以通过加热器的个体化控制来控制。DNA探针典型地在30摄氏度至55摄氏度之间杂交，而RNA探针典型地在更高温度下杂交，杂交时间从30分钟至24小时变化，取决于靶标拷贝数、探针尺寸和样本类型。用于细胞遗传学制备的标准变性在约72摄氏度下进行2分钟，而对于组织切片，条件可以从55摄氏度至95摄氏度变化，从2分钟到30分钟。杂交后洗涤温度可以从约37摄氏度至72摄氏度变化，持续2分钟到15分钟。盐浓度可以从0.1x到2x SSC变化。探针检测温度可以从环境温度至42摄氏度变化，持续2分钟到30分钟。
[0477] ISH可用于检测DNA、cDNA和高拷贝mRNA。它可以应用于涂片、组织、细胞系和冷冻切片，以及在本公开文本的上下文中根据所公开的方法生成的代表性样品以及包括该代表性样品的组合物。通常，样本被安装在1"x 3"载玻片上。
[0478] 基于IHC的生物标记物检测的一个优点是DAB检测的敏感度。用这种方法，可以检测混合细胞群中非常罕见的事件。例如，诸位发明人已经显示，在根据公开的方法在20倍放大下成像时生成的代表性样品中清楚可见作为整个样品的空间上不同组分(即以略超过总组织体积的0.1％存在的Her-2阳性细胞)的较小亚克隆。参见实施例1和图6A-6D。此外，诸位发明人已经显示，也明显检测到较小亚克隆(表达异种移植肿瘤的bRaf突变体，存在于解离的扁桃体组织的本体样品中，水平为总样品的0.015％)。参见实施例4和图16。
[0479] 除了基于DAB的IHC染色之外，所有标准的基于载玻片的测定都适用于均质化的肿瘤样品。例如，诸位发明人已经显示可以使用多路复用IHC(使用在单次染色运行中检测到的三种抗体)、基于RNA的ISH和DNA ISH来分析根据所公开的方法生成的代表性样品。参见实施例3以及图11和12。
[0480] 根据本公开文本的检测程序可以进一步包括使细胞或细胞区室显色或荧光染色的细胞化学染色程序。此类染色程序是本领域技术人员已知的并且可以例如包括例如，针对细胞学样本中的特定分子(染色体、脂质、糖蛋白、多糖等)的亚细胞区域(例如核、线粒体、高尔基体、细胞质等)的嗜酸性或嗜碱性结构进行染色。可以采用荧光染料如DAPI、阿的平(Quinacrin)、色霉素(Chromomycin)等。此外，还可以使用显色染料，如Azan、吖啶橙(Acridin-orange)、苏木精、伊红、苏丹红、噻嗪染料(苯胺蓝(Toluidin-blue)、硫堇(Thionin))。在其他实施方案中，可以在本文公开的方法的过程中使用染色程序如巴氏染色(Pap-staining)、吉姆萨染色、苏木精-伊红染色、范-吉姆萨(van-Gieson)染色、席夫(Schiff)染色(使用席夫试剂)，采用金属(如例如染色程序中的银，采用硝酸银)沉淀或不溶性染色剂例如滕代蓝(Turnbulls-blue)(或其他不溶性金属氰化物)的染色程序等。必须理解，指名的染料和染色方法应是适用方法的例子，并且本领域已知的任何其他方法都可应用于本文所公开的方法。
[0481] 对于光学显微镜检查或用于在荧光显微镜下检查的荧光染色，染色过程可能会产生显色染色。在本公开文本的另一个实施方案中，放射发射程序，即采用损害放射或其他造影剂传输的物质用于样品中细胞学条件的成像的程序(例如通过手段如(微)放射自显影或(微)射线照相图片生成来生成光学印模)可以用于根据本公开文本的方法。
[0482] 所有的染色和成像程序不仅可用于微观程序分析，还可用于自动分析程序，如流式细胞术、自动显微镜(计算机化或计算机辅助，如全载玻片扫描仪)分析或用于分析染色的细胞学样本的任何其他方法。“自动化”或“自动”意指基本上由计算机或机器驱动并且基本上不受人为干预的活动。
[0483] 额外的诊断方法可以应用于代表性样品和包括该代表性样品的组合物，包括但不限于基于ELISA的蛋白质检测、特定细胞类型的亲和纯化等。为了进一步说明本公开文本的许多诊断和治疗应用，以下公开内容提供了可以用本发明代表性样品和子样品或从其中分离的组分(例如细胞、核酸、蛋白质、脂质等)实现的各种技术的额外概述。
[0484] 使用代表性样品或均质物组合物的多路复用和分批方法
[0485] 在一个方面，由从单个患者获得的单个样品制备的代表性样品可以用于随后的诊断分析，使用本文公开的任何方法和/或本领域已知的其他可比较的方法。在均质化和任选的进一步加工(例如筛分)之前，可以将从患者获得的样品用小分子标记。通过向该样品中引入小分子标记，该样品现在能够与其他样品(包括来自相同患者的其他组织和/或肿瘤样品以及从不同患者获得的组织和/或肿瘤样品)区分开，并且因此，使用这种标记方法，不同代表性样品可以以多路复用测定形式使用。
[0486] 例如，第一肿瘤、第二肿瘤和第三肿瘤可以从第一个专利获得。可以用第一小分子标记第一肿瘤，用第二小分子标记第二肿瘤，并且用第三小分子标记第三肿瘤，使得每个小分子可与其他的区分开。然后可以将标记的第一肿瘤、第二肿瘤和第三肿瘤单独或组合地均质化化，并且所得“混合”均质物含有每个肿瘤的代表性样品。
[0487] 可以使用相同的“分批”方法来使用来自相同患者的多个淋巴结样品和/或来自相同患者的肿瘤和淋巴结样品的组合进行多路复用测定。
[0488] 在另一个方面，将从患者获得的样品(例如肿瘤或淋巴结)切片，并且在组合和共同均质化该切片之前用小分子处理每个切片以生成代表性样品的空间信息。例如，可以将样品(例如肿瘤或淋巴结)切成四分体，并且可以在共同均质化该切片之前将不同的半抗原(或其他合适的小分子)“掺杂”进每个四分体，例如将每个标记的切片置于共混器中并均质化，以生成代表性样品的空间信息。应该理解，可以从每个样品生成的用于在均质化之前“掺杂”的切片的数目不受限制，而是可能与样品的尺寸成比例地选择，即该样品越大，在均质化之前可以用小分子“标签化”的切片的数目越多。例如，可以将肿瘤和/或淋巴结样品切片以形成2个切片、3个切片、4个切片、5个切片、6个切片、7个切片、8个切片、10个切片、15个切片、20个切片、25个切片、30个切片、35个切片、40个切片、45个切片、50个切片、55个切片、60个切片、65个切片、70个切片、75个切片、80个切片、85个切片、90个切片、95个切片、100个切片或更多。再次，从每个样品制备的切片数目将随样品尺寸而变化。例如，可以将大概2厘米的肿瘤样品切成四分体，每个四分体用不同的小分子标记，而可以将50厘米的肿瘤(如胃肿瘤)切成100个切片，每个切片用不同的小分子标记。
[0489] 应当指出，可以将来自相同患者或不同患者的任何数目的不同样品进行组合并多路复用，允许每个样品用不同标计编址，例如至少2个标记、至少3个标记、至少4个标记、至少5个标记、至少6个标记、至少7个标记、至少8个标记、至少10个标记、至少15个标记、至少20个标记、至少25个标记、至少50个标记、至少75个标记、至少100个标记等。
[0490] 可以将样品(如从衍生自单个或多个受试者衍生的全肿瘤提供的肿瘤样品，或衍生自单个或多个受试者的肿瘤切片)与一个或多个小分子(如但不限于例如半抗原、肽标签、蛋白质标签、荧光标签或核酸标签)缀合以鉴定所研究的肿瘤样品的来源。
[0491] 如Lemus和Karol(Methods Mol Med.2008；138:167-82)(其全部内容通过引用并入本文)中详述的，通过使用各种机制可以发生缀合。此类缀合方法可以包括但不限于涉及以异氰酸酯或酸酐为特征的半抗原的自发化学反应、涉及带有羧基的半抗原的活化化学反应、涉及半抗原和碳酰亚胺或半抗原和戊二醛的交联反应。通过使用以下可发生另外的缀合方式：二异氰酸酯和以下任一反应性基团：α-NH2、ε-NH2Lys、α-COOH、SH-Cys；酸酐和以下任一反应性基团：α-NH2、ε-NH2Lys、α-COOH、SH-Cys；2,4,6三硝基苯磺酸(TNBS)和以下任一反应性基团：α-NH2和ε-NH2Lys；芳族氨基酸和酪氨酸(其中芳族氨基酸被转化为重氮基团)；碳水化合物和α-NH2或ε-NH2Lys(其中偶联可以通过还原端、酸性碳水化合物的羧基或通过羟基发生)；溴化氰和α-NH2或ε-NH2Lys(其中由溴化氰活化的碳水化合物自发与氨基偶联)；
或混合酸酐和α-NH2或ε-NH2Lys(其中将R-COOH用氯代碳酸异丁酯转化为酸酐)。
或混合酸酐和α-NH2或ε-NH2Lys(其中将R-COOH用氯代碳酸异丁酯转化为酸酐)。
[0492] 小分子与肿瘤或肿瘤切片样品的另外的形式的缀合可通过(但不限于)如下发生：化学反应如NHS-酯反应(以形成胺键)、马来酰亚胺反应(以形成硫醚键)、酰肼反应(以形成腙键)或EDC偶联反应(以形成酰胺键)。另外，小分子与肿瘤或肿瘤切片样品或淋巴结或淋巴结切片的缀合可通过使用同双功能或异双功能交联剂(其例子包括但不限于磺基-SMCC、DSS或磺基SBED)发生。
[0493] 可以用作标识符的小分子的例子可以包括半抗原。典型地使用的半抗原的例子是地高辛配基、2,4-二硝基苯基、生物素或亲和素，或是选自唑、硝基芳基化合物、苯并呋咱、三萜、脲、硫脲、鱼藤酮、噁唑、噻唑、香豆素、环木脂体、杂联芳基化合物、偶氮芳基化合物或苯并二氮杂卓的半抗原。半抗原的其他例子可以包括但不限于2,4-二硝基苯基、硝基吡唑和噻唑磺酰胺。参见WO 2014139979，其全部内容通过引用并入本文。可以使用的半抗原的另外的例子包括但不限于如下项：选自唑(例如、噁唑、吡唑、噻唑)、苯并呋咱、三萜、尿素、除罗丹明硫脲以外的硫脲、除二硝基苯基或三硝基苯基以外的硝基芳基、鱼藤酮、环木脂体、杂联芳基、偶氮芳基、苯并二氮杂卓或香豆素(例如，2,3,6,7-四氢-11-氧代-1H,5H,11H-[1]苯并吡喃并[6,7,8-ij]喹嗪-10-羧酸或7-二乙基氨基-3-羧基香豆素)。参见WO
2012003476和WO 2008063378，其全部内容均通过引用并入本文。可以使用的半抗原的其他例子包括但不限于生物素、漆酚、肼屈嗪、荧光素、地高辛配基、二硝基苯酚、2,4-二氯苯氧乙酸、2-氯-4-(乙基氨基)-6-(异丙基氨基)-s-三嗪、尼古丁、吗啡、结构相关的s-三嗪、SulcoFuron、FlucoFuron、脱碳木脂素(agatharesinol)、sequirin C、柳杉树脂酚(sugiresinol)、羟基柳杉树脂酚、异扁柏脂素(hinokiresinol)、松柏醇、对香豆酸、扁柏脂素(hinokinin)、愈创木基甘油-β-愈创木基醚、吗啡-3-葡糖苷酸(M3G)、可待因、去甲可待因、6-单乙酰吗啡、(+)甲基苯丙胺、头孢他啶、苯巴比妥、对羟基苯巴比妥、对氨基苯巴比妥、六亚甲基二异氰酸酯、环巴比妥、3'-酮环巴比妥、3'-羟基环巴比妥、司可巴比妥、巴比妥、美沙比妥、巴比妥酸、硫喷妥钠、硫代巴比妥酸、扑米酮、谷臼酰胺、戊巴比妥、二乙酰吗啡、吗啡-6-葡糖苷酸(M6G)、L-11-烯丙基-1,2,3,9,10,10a-六氢-4H-10,4a-亚氨基乙菲-
6-酚、纳洛酮、哌替啶、苯甲酰爱康宁、5-苯并咪唑羧酸、地塞米松、氟米松、倍他米松、9-α-弗泼尼龙、去氧米松、曲安西龙、泼尼松龙、氟可龙、皮质醇、泼尼松、可的松、甲泼尼龙、己曲安缩松(triamcinolone hexacetonide)、呋喃丹、BFNP(3-[[2,3-二氢-2,2-二甲基-7-苯并呋喃基氧基)羰基]氨基]丙酸)、2,3-二氢-2,2-二甲基-7-苯并呋喃醇、恶虫威
(bendiocarb)、西维因、甲硫威(methiocarb)、残杀威(propoxur)、涕灭威、灭多虫、苯霜灵(benalaxyl)、Bn-Ba(4-[2-(N-苯基乙酰基-N-2,6-甲苄胺)丙酰胺基]丁酸)、Bn-COOH(4-[2-(N-苯基乙酰基-N-2,6-甲苄基-DL-丙氨酸)、Bn-HG、呋霜灵、甲霜灵、乙草胺、二甲草胺、异丙甲草胺、乙酰甲草胺-乙基(diethathyl-ethyl)、新燕灵-乙基(benzoylprop-ethyl)、毒草胺、2,4,5-三氯苯氧基乙酸、2,4-二氯苯氧基丁酸(2,4-DB)、MCPA、滴丙酸(2,4-DP)、1-[(2-氯)苯基磺酰基]单酰氨基琥珀酸、氯磺隆、氯溴隆、酰胺磺隆、绿麦隆、异丙隆、敌草隆、利谷隆、O-甲基-O-(4-硝基苯基)-N-(4-羧丁基)-氨基硫代磷酸酯、对硫磷-甲基、对硫磷-乙基、杀螟硫磷、倍硫磷、溴磷、甲基毒死蜱、氧化对硫磷、对氧磷、二嗪磷、甲基谷硫磷、甲基嘧啶磷、杀扑磷、二乙基硫代磷酰氯、4-硝基苯酚、2-硝基苯酚、2-氯苯酚、4-氯-3-甲基苯酚、杀螟氧磷(fenitroxon)、3-甲基-4-硝基苯酚、壬基酚、HOM(3-[2-羟基-5-硝基苄硫基]丙酸、delor 103、2,4,4'-三氯联苯、2-(5-羧基戊酰氨基)-4,4'-二氯联苯、4-氯苯氧基乙酸、2-氯苯氧基乙酸、1,1,1-三氯-2,2-双-(对-氯苯基)乙烷、1,1-二氯-2,2-双(对-氯苯基)乙烯、维生素D2、维生素D3、脱乙基羟基阿嗪(DEHA)、异硫氰酸荧光素、变肾上腺素、扑灭津、特丁津、莠灭净(2-乙基氨基-4-异丙胺-6-甲硫基-1,3,5-三嗪、草净津、OH-特丁津、羟基三嗪(EQ-0027)、阿特拉通、阿特拉津巯基尿酸(AM)、N4-乙酰基-磺胺二甲嘧啶、2,4-二氯苯酚、4-溴苯酚、阿莫西林、6-氨基青霉烷酸(6-APA)、阿洛西林、巴氨西林、羧苄青霉素、青霉素、1-苄基-3-(4-硝基苯基)脲、1-(3-氯苯基)-3-(2-甲氧基-5-硝基苯基)脲、1-(3-氯苯基)-3-(4-甲氧基-3-硝基苯基)脲、1-(4-氯苯基)-3-(4-硝基苯基)脲、呋喃丹-苯酚、丁硫克百威、丙硫克百威、异狄氏剂(endrin)、安特灵(nendrin)、七氯、氯丹、硫丹、艾氏剂、狄氏剂、氰戊菊酯异构体、噻苯咪唑(thiabendazole)、噻苯咪唑衍生物、阿苯达唑、甲苯咪唑、芬苯达唑、康苯咪唑(cambendazole)、氰戊菊酯半抗原、乙基虫螨磷(pirimiphos-ethyl)、4-(甲硫基)间甲酚、氯吡硫磷一氧(chlorpyrifos-oxon)、皮蝇磷、三氯甲酸酯、二氯芬酸、对硫磷、三唑酮、除虫脲、美托拉宗、苯甲酸糠酯、百草枯、二乙基卡马嗪、2,4,6-三苯基-N-(4-羟基苯基)-吡啶鎓、o-DNCP、PCB同源物、1-2-二氯苯、倒千里光裂碱(retronecine)、三氯杀螨醇、四氟醚唑(tetraconazole)、2-(2,4-二氯苯基)-3-(1H-1,2,4-三唑-1-基)丙醇、抑霉唑(imazalyl)、氯苯嘧啶醇(fenarimol)和白羽扇豆碱代谢物。更多的例子参见Singh M.K.,Srivastava S.,Raghava G.P.S.and Varsheny G.C.(2004)HaptenDB.Nucleic Acids Research，以及Singh M.et.al.HaptenDB:a comprehensive database of haptens,carrier proteins and anti-hapten antibodies.Bioinformatics.2006,22:
253-255，这两者的全部内容通过引用包括于本文中。
2012003476和WO 2008063378，其全部内容均通过引用并入本文。可以使用的半抗原的其他例子包括但不限于生物素、漆酚、肼屈嗪、荧光素、地高辛配基、二硝基苯酚、2,4-二氯苯氧乙酸、2-氯-4-(乙基氨基)-6-(异丙基氨基)-s-三嗪、尼古丁、吗啡、结构相关的s-三嗪、SulcoFuron、FlucoFuron、脱碳木脂素(agatharesinol)、sequirin C、柳杉树脂酚(sugiresinol)、羟基柳杉树脂酚、异扁柏脂素(hinokiresinol)、松柏醇、对香豆酸、扁柏脂素(hinokinin)、愈创木基甘油-β-愈创木基醚、吗啡-3-葡糖苷酸(M3G)、可待因、去甲可待因、6-单乙酰吗啡、(+)甲基苯丙胺、头孢他啶、苯巴比妥、对羟基苯巴比妥、对氨基苯巴比妥、六亚甲基二异氰酸酯、环巴比妥、3'-酮环巴比妥、3'-羟基环巴比妥、司可巴比妥、巴比妥、美沙比妥、巴比妥酸、硫喷妥钠、硫代巴比妥酸、扑米酮、谷臼酰胺、戊巴比妥、二乙酰吗啡、吗啡-6-葡糖苷酸(M6G)、L-11-烯丙基-1,2,3,9,10,10a-六氢-4H-10,4a-亚氨基乙菲-
6-酚、纳洛酮、哌替啶、苯甲酰爱康宁、5-苯并咪唑羧酸、地塞米松、氟米松、倍他米松、9-α-弗泼尼龙、去氧米松、曲安西龙、泼尼松龙、氟可龙、皮质醇、泼尼松、可的松、甲泼尼龙、己曲安缩松(triamcinolone hexacetonide)、呋喃丹、BFNP(3-[[2,3-二氢-2,2-二甲基-7-苯并呋喃基氧基)羰基]氨基]丙酸)、2,3-二氢-2,2-二甲基-7-苯并呋喃醇、恶虫威
(bendiocarb)、西维因、甲硫威(methiocarb)、残杀威(propoxur)、涕灭威、灭多虫、苯霜灵(benalaxyl)、Bn-Ba(4-[2-(N-苯基乙酰基-N-2,6-甲苄胺)丙酰胺基]丁酸)、Bn-COOH(4-[2-(N-苯基乙酰基-N-2,6-甲苄基-DL-丙氨酸)、Bn-HG、呋霜灵、甲霜灵、乙草胺、二甲草胺、异丙甲草胺、乙酰甲草胺-乙基(diethathyl-ethyl)、新燕灵-乙基(benzoylprop-ethyl)、毒草胺、2,4,5-三氯苯氧基乙酸、2,4-二氯苯氧基丁酸(2,4-DB)、MCPA、滴丙酸(2,4-DP)、1-[(2-氯)苯基磺酰基]单酰氨基琥珀酸、氯磺隆、氯溴隆、酰胺磺隆、绿麦隆、异丙隆、敌草隆、利谷隆、O-甲基-O-(4-硝基苯基)-N-(4-羧丁基)-氨基硫代磷酸酯、对硫磷-甲基、对硫磷-乙基、杀螟硫磷、倍硫磷、溴磷、甲基毒死蜱、氧化对硫磷、对氧磷、二嗪磷、甲基谷硫磷、甲基嘧啶磷、杀扑磷、二乙基硫代磷酰氯、4-硝基苯酚、2-硝基苯酚、2-氯苯酚、4-氯-3-甲基苯酚、杀螟氧磷(fenitroxon)、3-甲基-4-硝基苯酚、壬基酚、HOM(3-[2-羟基-5-硝基苄硫基]丙酸、delor 103、2,4,4'-三氯联苯、2-(5-羧基戊酰氨基)-4,4'-二氯联苯、4-氯苯氧基乙酸、2-氯苯氧基乙酸、1,1,1-三氯-2,2-双-(对-氯苯基)乙烷、1,1-二氯-2,2-双(对-氯苯基)乙烯、维生素D2、维生素D3、脱乙基羟基阿嗪(DEHA)、异硫氰酸荧光素、变肾上腺素、扑灭津、特丁津、莠灭净(2-乙基氨基-4-异丙胺-6-甲硫基-1,3,5-三嗪、草净津、OH-特丁津、羟基三嗪(EQ-0027)、阿特拉通、阿特拉津巯基尿酸(AM)、N4-乙酰基-磺胺二甲嘧啶、2,4-二氯苯酚、4-溴苯酚、阿莫西林、6-氨基青霉烷酸(6-APA)、阿洛西林、巴氨西林、羧苄青霉素、青霉素、1-苄基-3-(4-硝基苯基)脲、1-(3-氯苯基)-3-(2-甲氧基-5-硝基苯基)脲、1-(3-氯苯基)-3-(4-甲氧基-3-硝基苯基)脲、1-(4-氯苯基)-3-(4-硝基苯基)脲、呋喃丹-苯酚、丁硫克百威、丙硫克百威、异狄氏剂(endrin)、安特灵(nendrin)、七氯、氯丹、硫丹、艾氏剂、狄氏剂、氰戊菊酯异构体、噻苯咪唑(thiabendazole)、噻苯咪唑衍生物、阿苯达唑、甲苯咪唑、芬苯达唑、康苯咪唑(cambendazole)、氰戊菊酯半抗原、乙基虫螨磷(pirimiphos-ethyl)、4-(甲硫基)间甲酚、氯吡硫磷一氧(chlorpyrifos-oxon)、皮蝇磷、三氯甲酸酯、二氯芬酸、对硫磷、三唑酮、除虫脲、美托拉宗、苯甲酸糠酯、百草枯、二乙基卡马嗪、2,4,6-三苯基-N-(4-羟基苯基)-吡啶鎓、o-DNCP、PCB同源物、1-2-二氯苯、倒千里光裂碱(retronecine)、三氯杀螨醇、四氟醚唑(tetraconazole)、2-(2,4-二氯苯基)-3-(1H-1,2,4-三唑-1-基)丙醇、抑霉唑(imazalyl)、氯苯嘧啶醇(fenarimol)和白羽扇豆碱代谢物。更多的例子参见Singh M.K.,Srivastava S.,Raghava G.P.S.and Varsheny G.C.(2004)HaptenDB.Nucleic Acids Research，以及Singh M.et.al.HaptenDB:a comprehensive database of haptens,carrier proteins and anti-hapten antibodies.Bioinformatics.2006,22:
253-255，这两者的全部内容通过引用包括于本文中。
[0494] 另外的小分子标识符可以包括但不限于荧光分子或荧光色素(如由英杰公司(Invitrogen)出售的，例如参见The Handbook--A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies,Invitrogen Detection Technologies,Molecular Probes,Eugene,Oreg，或Nazarenko等人的美国专利号5,866,366中所披露)，例如4-乙酰氨基-4'-异硫氰酰茋-2,2'-二磺酸，吖啶和衍生物(如吖啶和异硫氰酸吖啶)，5-(2'-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)，4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘酰亚胺-3,5-二磺酸盐(萤光黄VS)，N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺，邻氨基苯甲酰胺，亮黄，香豆素及其衍生物如香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，香豆素120)、7-氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆素151)；标记红(cyanosine)；4',6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)；5',5”-二溴邻苯三酚-砜酞(溴邻苯三酚红)；7-二乙氨基-3-(4'-异硫氰酰苯基)-4-甲基香豆素；二亚乙基三胺五乙酸盐；4,4'-二异硫氰酰二氢-芪-2,2'-二磺酸；4,4'-二异硫氰酰茋-2,2'-二磺酸；5-[二甲基氨基]萘-1-磺酰氯(DNS，丹磺酰氯)；4-(4'-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸(DABCYL)；4-二甲基氨基苯基偶氮苯基-4'-异硫氰酸酯(DABITC)；伊红及其衍生物如伊红和伊红异硫氰酸酯；赤藓红和衍生物如赤藓红B和赤藓红异硫氰酸酯；溴化乙锭；荧光素和衍生物如5-羧基荧光素(FAM)、5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)、2'7'-二甲氧基-4'5'-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)和QFITC(XRITC)；2',7'-二氟荧光素(OREGON)；荧光胺；IR144；IR1446；孔雀石绿异硫氰酸盐；4-甲基伞形酮；邻甲酚酞；硝基酪氨酸；副品红；酚红；B-藻红蛋白；邻苯二甲醛；芘和衍生物如芘、丁酸芘和琥珀酰亚胺基
1-芘丁酸酯；活性红4( 亮红3B-A)；罗丹明和衍生物如6-羧基-X-罗丹明(ROX)、
6-羧基罗丹明(R6G)、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、罗丹明(Rhod)、罗丹明B、罗丹明123、罗丹明X异硫氰酸酯、罗丹明绿、磺酰罗丹明B、磺酰罗丹明101和磺酰罗丹明101的磺酰氯衍生物(德克萨斯红(Texas Red))；N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)；四甲基罗丹明；四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)；核黄素；蔷薇酸和铽螯合物衍生物，以大约617nm发射的巯基反应性铕螯合物(Heyduk and Heyduk,Analyt.Biochem.248:216--27,1997；
J.Biol.Chem.274:3315-22,1999)，连同GFP，LissamineTM，二乙基氨基香豆素，荧光素氯三嗪基，萘并荧光素，4,7-二氯罗丹明和呫吨(如Lee等人的美国专利号5,800,996中所述)及其衍生物，ALEXA FLUORTM系列染料(如，如美国专利号5,696,157、6,130,101和6,716,979中所述)，BODIPY系列染料(二吡咯亚甲基硼二氟化物染料，例如，如美国专利号4,774,339、5,
187,288、5,248,782、5,274,113、5,338,854、5,451,663和5,433,896中所述)，瀑布蓝(Cascade Blue)(美国专利号5,132,432中所述的磺化芘的胺反应性衍生物)和马里纳蓝(Marina Blue)(美国专利号5,830,912)，荧光纳米粒子(如半导体纳米晶体，例如，QUANTUM DOTTM(例如，从QuantumDot公司，英杰纳米晶体技术(Invitrogen Nanocrystal
Technologies)，俄勒冈州尤金(Eugene,Oreg.)获得；另参见美国专利号6,815,064、6,682,
596和6,649,138))，纳米粒子(如量子点、顺磁纳米粒子、超顺磁纳米粒子和金属纳米粒子，优选合金化量子点，通过举例，包括例如但不限于CdSe、ZnSSe、ZnSeTe、ZnSTe、CdSSe、CdSeTe、ScSTe、HgSSe、HgSeTe、HgSTe、ZnCdS、ZnCdSe、ZnCdTe、ZnHgS、ZnHgSe、ZnHgTe、CdHgS、CdHgSe、CdHgTe、ZnCdSSe、ZnHgSSe、ZnCdSeTe、ZnHgSeTe、CdHgSSe、CdHgSeTe、InGaAs、GaAlAs和InGaN)，在例如美国专利号6,602,671，Bruchez et.al.(1998)Science281:2013-6，Chan et al.(1998)Science 281:2016-8和美国专利号6,274,323，美国专利号6,927,069、6,914,256、6,855,202、6,709,929、6,689,338、6,500,622、6,306,
736、6,225,198、6,207,392、6,114,038、6,048,616、5,990,479、5,690,807、5,571,018、5,
505,928、5,262,357和美国专利公开号2003/0165951以及PCT公开号99/26299(1999年5月
27日公开)中描述的半导体纳米晶体，放射性同位素(如3H)，金属螯合物如放射性或顺磁性金属离子(像Gd3+)的DOTA和DPTA螯合物，以及脂质体，酶例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶或β内酰胺酶，酶与色原体组合，生成可检测信号的荧光或发光化合物(例如由俄勒冈州尤金英杰公司(Invitrogen Corporation)出售的那些)，显色化合物(包括二氨基联苯胺(DAB)、4-硝基苯基磷酸酯(pNPP)、固红、溴氯吲哚基磷酸酯(BCIP)、硝基蓝四唑(NBT)、BCIP/NBT、固红、AP橙、AP蓝、四甲基联苯胺(TMB)、2,2'-连氮基-二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐](ABTS)、邻联茴香胺、4-氯萘酚(4-CN)、硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)、苯二胺(OPD)、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-吡喃半乳糖苷(X-Gal)、甲基伞形酮基-β-D-吡喃半乳糖苷(MU-Gal)、对硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷(PNP)、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸(X-Gluc)、3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)、品红、碘硝基四唑(INT)、四唑蓝和四唑紫等)。
1-芘丁酸酯；活性红4( 亮红3B-A)；罗丹明和衍生物如6-羧基-X-罗丹明(ROX)、
6-羧基罗丹明(R6G)、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、罗丹明(Rhod)、罗丹明B、罗丹明123、罗丹明X异硫氰酸酯、罗丹明绿、磺酰罗丹明B、磺酰罗丹明101和磺酰罗丹明101的磺酰氯衍生物(德克萨斯红(Texas Red))；N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)；四甲基罗丹明；四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)；核黄素；蔷薇酸和铽螯合物衍生物，以大约617nm发射的巯基反应性铕螯合物(Heyduk and Heyduk,Analyt.Biochem.248:216--27,1997；
J.Biol.Chem.274:3315-22,1999)，连同GFP，LissamineTM，二乙基氨基香豆素，荧光素氯三嗪基，萘并荧光素，4,7-二氯罗丹明和呫吨(如Lee等人的美国专利号5,800,996中所述)及其衍生物，ALEXA FLUORTM系列染料(如，如美国专利号5,696,157、6,130,101和6,716,979中所述)，BODIPY系列染料(二吡咯亚甲基硼二氟化物染料，例如，如美国专利号4,774,339、5,
187,288、5,248,782、5,274,113、5,338,854、5,451,663和5,433,896中所述)，瀑布蓝(Cascade Blue)(美国专利号5,132,432中所述的磺化芘的胺反应性衍生物)和马里纳蓝(Marina Blue)(美国专利号5,830,912)，荧光纳米粒子(如半导体纳米晶体，例如，QUANTUM DOTTM(例如，从QuantumDot公司，英杰纳米晶体技术(Invitrogen Nanocrystal
Technologies)，俄勒冈州尤金(Eugene,Oreg.)获得；另参见美国专利号6,815,064、6,682,
596和6,649,138))，纳米粒子(如量子点、顺磁纳米粒子、超顺磁纳米粒子和金属纳米粒子，优选合金化量子点，通过举例，包括例如但不限于CdSe、ZnSSe、ZnSeTe、ZnSTe、CdSSe、CdSeTe、ScSTe、HgSSe、HgSeTe、HgSTe、ZnCdS、ZnCdSe、ZnCdTe、ZnHgS、ZnHgSe、ZnHgTe、CdHgS、CdHgSe、CdHgTe、ZnCdSSe、ZnHgSSe、ZnCdSeTe、ZnHgSeTe、CdHgSSe、CdHgSeTe、InGaAs、GaAlAs和InGaN)，在例如美国专利号6,602,671，Bruchez et.al.(1998)Science281:2013-6，Chan et al.(1998)Science 281:2016-8和美国专利号6,274,323，美国专利号6,927,069、6,914,256、6,855,202、6,709,929、6,689,338、6,500,622、6,306,
736、6,225,198、6,207,392、6,114,038、6,048,616、5,990,479、5,690,807、5,571,018、5,
505,928、5,262,357和美国专利公开号2003/0165951以及PCT公开号99/26299(1999年5月
27日公开)中描述的半导体纳米晶体，放射性同位素(如3H)，金属螯合物如放射性或顺磁性金属离子(像Gd3+)的DOTA和DPTA螯合物，以及脂质体，酶例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶或β内酰胺酶，酶与色原体组合，生成可检测信号的荧光或发光化合物(例如由俄勒冈州尤金英杰公司(Invitrogen Corporation)出售的那些)，显色化合物(包括二氨基联苯胺(DAB)、4-硝基苯基磷酸酯(pNPP)、固红、溴氯吲哚基磷酸酯(BCIP)、硝基蓝四唑(NBT)、BCIP/NBT、固红、AP橙、AP蓝、四甲基联苯胺(TMB)、2,2'-连氮基-二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐](ABTS)、邻联茴香胺、4-氯萘酚(4-CN)、硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)、苯二胺(OPD)、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-吡喃半乳糖苷(X-Gal)、甲基伞形酮基-β-D-吡喃半乳糖苷(MU-Gal)、对硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷(PNP)、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸(X-Gluc)、3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)、品红、碘硝基四唑(INT)、四唑蓝和四唑紫等)。
[0495] 小分子可以进行直接检测或相互组合来检测。例如，如果半抗原与量子点缀合，则可以通过其特征波长处的荧光来检测。在其他情况下，检测半抗原包括使样品与抗半抗原抗体和可检测标记接触，并检测标记。在某些实施方案中，可检测标记与抗半抗原抗体缀合以形成抗半抗原抗体-标记缀合物，并且缀合物结合半抗原。在其他情况下，使样品与抗半抗原抗体(其与半抗原结合)接触。然后将样品与能够结合抗半抗原抗体的抗体缀合物接触，其中抗体缀合物包含可检测标记或可检测标记系统的组分。在某些情况下，可检测标记系统的组分是酶，如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶，其与显色底物或底物/色原体复合物反应，从而产生可检测的显色沉积。在其他例子中，标记是荧光标记，如量子点。参见WO 2012003476，其全部内容并入本文。
[0496] 在包括衍生自不同受试者的肿瘤样品的混合均质物中鉴定肿瘤样品来源的另外的手段可能包括使用DNA条形码。DNA条形码是分类学方法，其使用生物体的DNA中的短遗传标记物来鉴定它。组合新一代DNA测序方法，可能可以通过检测特定于来源受试者的DNA序列来确定样品与其来源受试者的一致性。另外，有可能的是，在与具有不同来源的其他肿瘤样品组合之前，不直接衍生自受试者的独特人工DNA序列可以与衍生自受试者的样品缀合，并且这种独特的人工DNA条形码可以稍后通过DNA序列分析来读取，以鉴定被调查样品的来源。
[0497] 同样，用于包括衍生自不同受试者的肿瘤样品或衍生自相同受试者的不同样品的混合均质物中的受试者鉴定的另外的手段可以包括使用与肿瘤切片样品缀合的亲和标签(如在蛋白质纯化实验室程序中通常使用的那些，可以包括但不限于肽标签和蛋白质标签)。可以在样品分析的所希望的点鉴定亲和标签，以确定所研究样品的来源，相似于DNA条形码的原理。此类亲和标签包括但不限于肽标签或蛋白质标签，如五-组氨酸、四-组氨酸、谷胱甘肽琼脂糖转移酶、CBP、CYD(共价又可解离的NorpD肽)、Strep II、FLAG、HPC(蛋白C重链)、SUMO、AviTag、钙调素-标签、聚谷氨酸标签、E-标签、HA-标签、Myc-标签、S-标签、SBP-标签、Softag 1、Softag 3、TC标签、V5标签、VSV-标签、Xpress标签、Isopeptag、MBP、SpyTag、BCCP、绿色荧光蛋白标签、卤素-标签、Nus-标签、硫氧还蛋白-标签、Fc-标签和Ty标签。
[0498] 可以使用“混合”均质物实现任何数目的分析测定，包括但不限于染色、免疫组织化学染色、流式细胞术、FACS、荧光活化液滴分选、图像分析、杂交、DASH、分子信标、引物延伸、微阵列、CISH、FISH、纤维FISH、定量FISH、流式FISH、比较基因组杂交、印迹、Western印迹、Southern印迹、Eastern印迹、Far-Western印迹、Southwestern印迹、Northwestern印迹和Northern印迹、酶测定、ELISA、配体结合测定、免疫沉淀、染色质免疫沉淀(ChIP)、ChIP-seq、ChIP-ChiP、放射免疫测定、荧光偏振、FRET、表面等离子共振、过滤结合测定、亲和色谱、免疫细胞化学、电泳测定、核酸电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、天然凝胶方法、自由流电泳、等电聚焦、免疫电泳、电泳迁移率变动测定、限制性片段长度多态性分析、酶谱法、基因表达谱分析、用PCR进行的DNA谱分析、DNA微阵列、基因表达系列分析、实时聚合酶链反应、差异展示PCR、RNA-seq、质谱、DNA甲基化检测、声能、基于脂质组学的分析、免疫细胞定量、癌症相关标记物检测、特定细胞类型亲和纯化、DNA测序、新一代测序、癌症相关融合蛋白检测以及化疗抗性相关标记物检测。
[0499] 多路复用测定通常但不一定用于高通量筛选测定。示例性的多路复用测定技术包括基于核酸的多路复用方法(如用于基因表达或SNP检测测定的DNA微阵列；用于基因表达的SAGE；高通量测序(如NGS)；多路复用PCR；多路复用连接依赖性探针扩增(MLPA)；通过连接进行的DNA测序；以及基于珠的多路复用(如Luminex/LAMP))和基于蛋白质的多路复用方法(如蛋白质微阵列、抗体微阵列、抗原微阵列、抗体谱分析和基于珠粒的多路复用(如Luminex/LAMP))以及其他多路复用方法(如组织微阵列、细胞微阵列、化学化合物微阵列、生物标记物分析和ELISA)。进一步的分析技术的概述
[0500] 本公开文本的样品(例如由本文所述的任何方法产生的)可以经受进一步的加工步骤。这些包括但不限于进一步的分析技术，如本申请中详述的那些分析技术，包括进一步的诊断测定，适用于分析代表性肿瘤样品中含有的异质材料。以下方法学可以与本公开文本的样品结合使用，其可以产生关于异质肿瘤细胞群体内含有的细胞的身份和生物学特性的信息。本公开文本提供的组合分析和下面描述的技术可以允许鉴定、检测或表征肿瘤内甚至较小的亚克隆群体。这些结果可以为诊断、治疗方法的选择和患者管理的信息。
[0501] 在示例性实施方案中，本公开文本的代表性样品可以经历以下方法或步骤中的一个或多个：染色、免疫组织化学染色、流式细胞术、FACS、荧光活化液滴分选、图像分析、杂交、DASH、分子信标、引物延伸、微阵列、CISH、FISH、纤维FISH、定量FISH、流式FISH、比较基因组杂交、印迹、Western印迹、Southern印迹、Eastern印迹、Far-Western印迹、Southwestern印迹、Northwestern印迹和Northern印迹、酶测定、ELISA、配体结合测定、免疫沉淀、ChIP、ChIP-seq、ChIP-ChiP、放射免疫测定、荧光偏振、FRET、表面等离子共振、过滤结合测定、亲和色谱、免疫细胞化学、电泳测定、核酸电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、天然凝胶方法、自由流电泳、等电聚焦、免疫电泳、电泳迁移率变动测定、限制性片段长度多态性分析、酶谱法、基因表达谱分析、用PCR进行的DNA谱分析、DNA微阵列、基因表达系列分析、实时聚合酶链反应、差异展示PCR、RNA-seq、质谱、DNA甲基化检测、声能、基于脂质组学的分析、免疫细胞定量、癌症相关标记物检测、特定细胞类型亲和纯化、热电偶上液滴剪影定量PCR(droplet-on-thermocouple silhouette quantitative PCR)、DNA测序、新一代测序、癌症相关融合蛋白检测、化疗抗性相关标记物检测以及Ki67、DNA倍性或其他基因型或表型分析。下面描述这些方法的示例性实施方案，其意在说明这些技术。然而，应该理解的是，可以利用这些方法的变体和替代方案以及其他方法。
[0502] 染色技术
[0503] 流体可应用于预处理(例如，蛋白交联、核酸暴露等)、变性、杂交、洗涤(例如，严格洗涤)、检测(例如，将视觉或标记物分子连接至探针)、扩增(例如，扩增蛋白质、基因等)、复染等。在各个实施方案中，物质包括但不限于：染色剂(例如，苏木精溶液、伊红溶液等)、润湿剂、探针、抗体(例如，单克隆抗体、多克隆抗体等)、抗原回收流体(例如，水基或非水基抗原修复溶液、抗原回收缓冲液等)、溶剂(例如，醇、柠檬烯等)等。染色剂包括但不限于染料、苏木精染色剂、伊红染色剂、抗体或核酸与可检测标记(如半抗原、酶或荧光部分)的缀合物、或其他类型的赋予颜色和/或用于增强对比度的物质。参见WO 2015197742和WO 2015150278，其全部内容通过引用并入本文。
[0504] 染色技术可以采用用于如下的系统和方法：接收多个测定信息以及针对一个或多个感兴趣的特征的查询，并将来自解剖测定的解剖信息投影到染色测定(例如，免疫组织化学(IHC)测定,其通常与解剖测定一起登记)的图像上，以定位或确定适合于分析的特征。解剖信息可用于生成掩模，投影在一个或多个通常登记的染色或IHC测定上。IHC检测中感兴趣的特征的位置可以与掩模提供的解剖背景相关联，并且与解剖掩模相匹配的任何感兴趣特征都被选择或指示为适合分析。此外，该解剖掩模可以分隔成多个区域，并且来自多个IHC测定的多个感兴趣的特征可以与这些区域中的每一个逐个相关。因此，所公开的系统和方法提供了用于综合多测定分析的系统的、定量的和直观的方法，从而克服了现有技术状态下限制的专用或主观视觉分析步骤。参见WO 2015052128，其全部内容通过引用并入本文。
[0505] 典型地，通过将细胞固定在显微镜载玻片上并使用多种染色方法(例如，形态学或细胞遗传学染色)对其进行染色来对癌症样品进行病理学检查。然后评价染色样本是否存在异常或癌性细胞和细胞形态。虽然仅提供一般信息，但组织学染色方法是当前实践用于检测生物样品中的癌性细胞的最常用方法。常用于癌症检测的其他染色方法包括免疫组织化学和活性染色。这些方法基于癌性细胞中是否存在特异性抗原或酶活性。参见WO 2012152747，其全部内容通过引用并入本文。
[0506] 公开了用于处理含有模糊颜料的样品的方法、试剂盒和系统。该方法包括将澄清剂应用到样品上，使该样品内的模糊颜料脱色。使模糊颜料脱色增强了病理学家检查样品的能力。在说明性实施方案中，公开了处理安装在基底上的样品以减轻与样品内的颜料相关的染色模糊的自动化方法。该方法包括将上面安装了样品的基底放置在自动化仪器上并且施加澄清剂，使得该澄清剂接触该样品并且该样品内的颜料脱色。该方法进一步包括施加漂洗剂，使得该澄清剂基本上从样品中除去，并施加显色剂以使样品特异性地被染色。样品内的颜料通过该澄清剂脱色，使得特别染色的样品可由合格的读取者解读。在其他说明性实施方案中，公开了用于使样品中的模糊颜料脱色的试剂盒。试剂盒包含试剂瓶和沉积在试剂瓶中的澄清剂。该澄清剂包括过氧化氢的水溶液，并且该试剂瓶被配置为可操作地连接到自动化载玻片染色设备，使得自动化载玻片染色设备控制该澄清剂的施加，使得该澄清剂接触该样品。在另外的说明性实施方案中，公开了用于减轻含颜料的组织病理学样品的特定信号模糊的系统。该系统包括自动化仪器、澄清剂和显色剂。该自动化仪器配置为接收粘附在基底上的组织病理学样品，以将澄清剂和显色剂递送到样品中，并且向递送到样品的澄清剂和显色剂提供加热和混合。该澄清剂被配置为接触该组织病理学样品并使模糊颜料脱色。该显色剂配置为接触组织病理学样品并沉积特定信号。参见WO 2014056812，其全部内容通过引用并入本文。
[0507] 免疫染色和原位DNA分析可以是组织学诊断的有用工具。免疫染色可以依赖于样品中抗体与表位的特异性结合亲和力，以及与有时仅存在于某些类型的患病细胞中的独特表位特异性结合的抗体的增加可用性。免疫染色可以包括对载玻片上的样品进行的一系列处理步骤，以选择性地突出疾病状态的某些形态指标。在一些情况下，处理步骤可以包括预处理样品以减少非特异性结合、抗体处理和孵育、酶标记的二级抗体处理和孵育、底物与酶的反应和复染。结果可产生具有与抗体的表位结合的样品的荧光或显色突出区域。在一些情况下，原位DNA分析依赖于细胞或样品中探针与核苷酸序列的特异性结合亲和力。免疫组织化学(IHC)或免疫细胞化学(ICC)可以包括通过检测特异性抗体-抗原相互作用(其中抗体已经用可视标记物标签化)来在原位可视化细胞组分。IHC有时被称为检测组织中的抗原，而ICC有时被称为检测所培养细胞中或其上的抗原(JAVOIS,Methods in Molecular Medicine,V.115:Immunocytochemical Methods and Protocols,2nd edition,(1999)Humana Press,Totowa,New Jersey，其全部内容通过引用并入本文)，然而，描述为IHC或ICC的方法可同样适用于本公开文本。可视标记物可以是荧光染料、胶体金属、半抗原、放射性标记物或酶。无论制备方法如何，最小信号强度和最小背景或非特异性染色都可合意地给出最佳的抗原可视化。参见WO2013139555，其全部内容通过引用并入本文。
[0508] 基于早期研究，miRNA在哺乳动物的发育调节和细胞分化以及心脏发生和淋巴细胞发育中发挥作用。另外，miRNA参与其他生物过程，如缺氧、细胞凋亡、干细胞分化、增殖、炎症和对感染的应答。miRNA可用于同时靶向参与细胞分化、增殖和存活(肿瘤发生的关键特征)的途径的多种效应物。几种miRNA已与癌症联系起来。因此，miRNA的原位分析可用于癌症诊断和治疗，因为miRNA显现充当致癌基因或肿瘤的抑制物。例如，与正常组织相比时，许多肿瘤细胞具有不同的miRNA表达模式。使用遗传改造产生过量c-Myc(具有牵涉到若干癌症中的突变形式的蛋白质)的小鼠进行的研究确立了miRNA会影响癌症发展。用于检测miRNA的方法以及由miRNA翻译或以其他方式调节的蛋白质是非常理想的，特别是在用于高效和快速检测的自动化方法中。用于检测miRNA的现有方法在相同样品中检测不到miRNA及其蛋白质表达靶标(可能由该miRNA调节)。示例性方法典型地使用基于蛋白酶的细胞调节来消化细胞组分以暴露核酸靶标。此外，示例性方法使用Northern和Western印迹来使miRNA水平和蛋白质水平关联。另外，可以利用“研磨和结合”该样品的分子方法。之前已经证明了基于组织的方法。这些方法通常包括酶促步骤。参见WO 2013079606，其全部内容通过引用并入本文。
[0509] 所公开的实施方案可以利用特别适用于miRNA和蛋白质的多路复用检测的自动化方法。在说明性的实施方案中，该一种或多种蛋白质的表达可以由miRNA调节。在另一个实施方案中，该方法使得能够鉴定该miRNA和该蛋白质之间的细胞背景。该方法可以包括例如使用自动化系统以应用于样品(a)适于检测miRNA靶标的试剂，(b)适于检测蛋白质靶标的试剂，以及(c)适于对miRNA靶标和蛋白质靶标进行染色的试剂。本实施方案的一个方面涉及使用非酶促细胞调节，即避免基于蛋白酶的细胞调节，来保存蛋白质靶标。细胞调节步骤可以涉及在高于环境温度的温度下，用细胞调节溶液(如具有轻微碱性pH的缓冲液，包括pH为约7.7至约9的基于Tris的缓冲液)处理该样品，例如从大约80℃到大约95℃。该自动化方法可以同时或依次检测该miRNA和蛋白质靶标，尽管典型地通过首先检测和对该miRNA进行染色并且然后检测和对该蛋白质靶标进行染色获得更好的染色结果。更具体公开的实施方案首先包括对该样品进行非酶促细胞调节。然后将样品与针对特定miRNA靶标选择的核酸特异性结合部分接触，随后检测miRNA特异性结合部分。然后将样品与针对蛋白质靶标选择的蛋白质特异性结合部分接触，随后检测该蛋白质特异性结合部分。在某些实施方案中，核酸特异性结合部分是与可检测部分(如酶、荧光团、发光团、半抗原、荧光纳米粒子或其组合)缀合的锁核酸(LNA)探针。某些合适的半抗原在本领域中是常见的，如地高辛配基、二硝基苯基、生物素、荧光素、罗丹明、溴脱氧尿苷、小鼠免疫球蛋白或其组合。其他合适的半抗原由维塔纳医学系统公司特别开发，包括选自以下项的半抗原：噁唑、吡唑、噻唑、苯并呋咱、三萜、尿素、硫脲、鱼藤酮、香豆素、环木脂素、杂联芳基、偶氮芳基、苯并二氮杂卓及其组合。可以使用抗半抗原抗体检测半抗原。在某些公开的实施方案中，通过抗物种抗体-酶缀合物检测抗半抗原抗体，其中该酶是任何合适的酶，例如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。参见WO 2013079606，其全部内容通过引用并入本文。
[0510] 复染是对样品进行后处理的方法，该后处理是在将样品用药剂染色之后，以检测一个或多个靶标，使得它们的结构在显微镜下可以更容易地可视化。例如，在加盖玻片之前任选使用复染以使免疫组织化学染色更明显。复染的颜色与原染色不同。许多复染剂是众所周知的，如苏木精、伊红、甲基绿、亚甲蓝、吉姆萨、阿尔辛蓝、DAPI和核固红。在一些例子中，可以将超过一种染色剂混合在一起以产生复染剂。这提供了灵活性和选择染色的能力。例如，可以为具有特定属性但尚未具有不同所希望属性的混合物选择第一染色。可以向该混合物中添加第二染色，以展示缺少的所希望属性。例如，甲苯胺蓝、DAPI和滂胺天蓝可混合在一起形成复染。参见WO 2012116949，其全部内容通过引用并入本文。
[0511] 苏木精是天然存在的化合物，在苏木(Hematoxylon)属的树的红色心材中发现。苏木精本身在水溶液中是无色的，并不是对组织成分进行染色的活性成分。相反，苏木精、苏木因的氧化产物成为苏木精染料溶液的活性染色组分，特别是在与媒染剂复合时。苏木因通过暴露于空气和阳光而自然生成。该自然过程被称为“成熟”，并且可以花费3个月或更多个月来提供适合于对细胞进行染色的溶液。自动染色程序和系统使用机械系统将染色溶液递送到生物样品。标准苏木因染色程序利用含有苏木精/苏木因和媒染剂的预混合原液。参见WO 2012096842，其全部内容各自通过引用并入本文。
[0512] 免疫染色典型地利用对载玻片上的样品进行的一系列处理步骤，以通过选择性染色突出疾病状态的某些形态指标。典型的步骤包括预处理该样品以减少非特异性结合、抗体处理和孵育、酶标记的二级抗体处理和孵育、底物与酶反应以产生该样品的具有与该抗体结合的表位的荧光团或发色团突出区域、复染等。这些步骤中的每一个都通过多个漂洗步骤分离，以除去之前步骤中未反应的残留试剂。孵育在升高的温度下进行，通常在40℃左右，并且该样品典型地继续免于脱水。原位DNA分析使用探针与样品中独特核苷酸序列的特异性结合亲和力，并且同样涉及多种试剂和工艺温度的情况下的一系列工艺步骤。参见WO 2011139976，其全部内容各自通过引用并入本文。
[0513] 免疫组织化学(IHC)染色
[0514] 样品的免疫组织化学或IHC染色(或免疫细胞化学，其为细胞的染色)可能是最常用的免疫染色技术。尽管IHC染色的第一例使用荧光染料(参见免疫荧光)，但现在使用其他使用酶如过氧化物酶(参见免疫过氧化物酶染色)和碱性磷酸酶的非荧光方法。这些酶能够催化反应，其给出易于通过光学显微镜检查检测的有色产物。可替代地，放射性元素可以用作标记，并且该免疫应答可以通过放射自显影可视化。制备或固定可以有助于保存细胞形态和架构。不适当的或延长的固定可能会显著降低抗体结合能力。在福尔马林固定的样品中可以成功展现许多抗原。可以通过抗原修复方法来改进对许多抗原的检测，其通过破坏由固定形成的一些蛋白质交联来揭开隐藏的抗原性位点。这可以通过加热不同时间长度(热诱导表位回收或HIER)或使用酶消化(蛋白水解诱导的表位回收或PIER)来完成。
[0515] 免疫组织化学(IHC)是指通过检测抗原与特异性结合剂如抗体的相互作用来确定样品(如胰腺癌样品)中抗原(如蛋白质)的存在或分布的方法。在允许抗体-抗原结合的条件下，将包括抗原(如靶抗原)的样品用抗体孵育。抗体-抗原结合可以通过与该抗体缀合的可检测标记进行检测(直接检测)或借助与二级抗体(针对一级抗体产生的)缀合的可检测标记进行检测(例如，间接检测)。可用于IHC的示例性可检测标记包括但不限于放射性同位素、荧光色素(如荧光素、异硫氰酸荧光素和罗丹明)、半抗原、酶(如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)和色原体(如3,3'-二氨基联苯胺或固红(Fast Red))。在一些例子中，IHC用于检测样品(例如胰腺癌样品)中一种或多种蛋白质的存在或确定该一种或多种蛋白质的量。参见WO2013019945，其全部内容通过引用并入本文。
[0516] 免疫组织化学或IHC指将样品的细胞中的抗原(如蛋白质)定位并使用抗原促进抗体与特定抗原的特异性结合的过程。这种检测技术具有能够精确显示给定蛋白质位于样品内的位置的优点。它也是检查样品本身的有效方法。使用小分子如半抗原来检测抗原和核酸已成为IHC中的重要方法。半抗原与抗半抗原抗体组合可用于检测特定的分子靶标。例如，可以用一种或多种半抗原分子标记特异性结合部分如一级抗体和核酸探针，并且一旦这些特异性结合部分与它们的分子靶标结合，就可以使用抗半抗原抗体缀合物检测它们，该抗半抗原缀合物包括作为基于显色的检测系统的部分的酶或可检测标记如荧光标记。可检测的抗半抗原缀合物与样品的结合指示样品中存在靶。地高辛配基，作为二级代谢产物专门存在于毛地黄植物中，是已用于多种分子检测的半抗原的例子。美国专利号4,469,797公开了使用免疫测定基于抗地高辛抗体与测试样品中药物的特异性结合来确定血液样品中的地高辛浓度。美国专利号5,198,537描述了多种用于免疫学测试(如免疫测定)的另外的地高辛配基衍生物。对于样品的原位测定如免疫组织化学(IHC)测定和原位杂交(ISH)测定，尤其此类样品的多路复用测定，非常希望鉴定和开发提供所希望结果而没有背景干扰的方法。一种此类方法涉及使用酪胺信号放大(TSA)，其基于获专利的催化报告物沉积(CARD)。通过引用将其全部内容并入本文的美国专利号6,593,100披露了通过使标记的苯酚缀合物与酶反应来增强CARD或酪胺信号放大(TSA)方法中的酶的催化，其中该反应在增强剂的存在下进行。参见WO 2012003476，其全部内容通过引用并入本文，如同前述出版物。
[0517] 可以利用用于使用半抗原缀合物的方法的实施方案。通常，该方法可以包括以下步骤：a)将过氧化物酶固定在样品中的靶标上，其中过氧化物酶能够与过氧化物酶可活化的芳基部分例如酪胺或酪胺衍生物反应，b)使样品与包括半抗原缀合物的溶液接触，其中该半抗原缀合物包括与如上所述的过氧化物酶可活化的芳基部分结合的半抗原，并且c)使该样品与包括过氧化物的溶液接触，由此该半抗原缀合物与过氧化物酶和过氧化物反应，与固定的过氧化物酶形成共价键或在固定的过氧化物酶的近端形成共价键；并且d)通过检测该半抗原来定位该样品中的靶标。参见WO 2012003476，其全部内容通过引用并入本文。
[0518] 扩展显微镜检查
[0519] 扩展显微镜检查(ExM)提供了对感兴趣的生物样品(包括但不限于细胞、组织、DNA、RNA或脂质)进行光学成像的方法，其分辨率与经典显微镜衍射极限相比增加了。ExM允许保存的生物样品的物理放大，其中感兴趣的生物样品被灌注组合物(例如，聚合物凝胶或水凝胶)至该组合物被包埋在感兴趣的样品中的程度。当该组合物各向同性地扩展时，该生物样品或粘附至样品的染料(或荧光团)将扩展，从而允许该生物样品或荧光团以更高分辨率光学成像。在ExM下，首先使用本领域技术人员已知的标准技术，例如FISH、免疫组织化学染色，用标签对该生物样品进行染色。然后用一种或多种明胶溶液(例如单体、交联剂或引发剂)灌注该样品。在一个实施方案中，该明胶溶液包括可膨胀材料。一旦凝胶化过程完成后，然后将该生物样品任选地用蛋白酶或其他化学处理进行消化。凝胶在膨胀时扩展，这可以通过与外部因素如水或热接触来完成。凝胶的扩展物理扩大或扩展包埋在凝胶内的样品或标签。该样品或标签的放大和/或扩展允许以更高分辨率进行光学成像(例如，纳米级)。ExM适用于大数目的生物样品，包括但不限于蛋白质、RNA、DNA、脂质，并且这些在经典显微镜检查下不能以高分辨率进行鉴定和定位。参见美国申请号14/627,310，其全部内容通过引用并入。
[0520] 本公开文本提供了制备用于显微镜检查的代表性样品的方法，其包括将该代表性样品(例如，均质物组合物)或其部分包埋在可膨胀材料中，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。如本文所用，术语“可膨胀材料”是指在物理影响下扩展的材料，该物理影响包括但不限于与水接触、温度(例如热量)、物理拉伸和湿度。该可膨胀材料可以在一维、二维或三维扩展。在一个实施方案中，该可膨胀材料是透明的，使得在扩展时，光可以穿过该样品。在一个实施方案中，该可膨胀材料是可膨胀聚合物或水凝胶。在一个实施方案中，该可膨胀材料由其前体原位形成。例如，可以使用一种或多种可聚合材料(单体或寡聚物)，如选自下组的单体，该组由以下各项组成：含有可聚合乙烯不饱和基团的水溶性基团。在一个优选实施方案中，该可膨胀聚合物是聚丙烯酸酯及其共聚物或交联共聚物。可替代地或另外，可通过化学交联水溶性寡聚物或聚合物原位形成可膨胀材料。
[0521] 术语“可聚合材料”是指能够聚合的材料，包括但不限于单体和寡聚物。术语“交联剂”是指含有能够化学连接到蛋白质或其他分子上的特定官能团(伯胺、巯基等)的两个或更多个反应性末端的分子。在一个实施方案中，交联剂引起寡聚物或单体的聚合。术语“聚合引发剂”是指与环氧乙烷以导致其聚合的方式反应的化合物或其阴离子。在某些实施方案中，该聚合引发剂是引发环氧乙烷聚合的官能团的阴离子。
[0522] 在一个实施方案中，该方法进一步包括通过使该可膨胀材料膨胀来扩大该均质物组合物，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在另一个实施方案中，包埋过程包括用包含可膨胀材料的前体的组合物渗透该均质物并且原位形成可膨胀材料并且将该均质物组合物锚定到该可膨胀材料，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。在一个方面，该可膨胀材料由该可膨胀材料的前体形成，其中该前体包括可聚合材料、聚合引发剂或交联剂。在另一个方面，该可聚合材料是单体或寡聚物。在另外的实施方案中，该单体或该寡聚物包括经取代或未经取代的甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、乙烯醇、乙烯胺、烯丙胺、烯丙醇、或其二乙烯交联剂(例如，N,N-亚烷基双丙烯酰胺)。
[0523] 流式细胞术
[0524] 流式细胞术是通过将细胞悬浮在流体流中并通过电子检测仪器传递它们的基于激光的生物物理技术，用于细胞计数、细胞分选、生物标记物检测和蛋白质工程。它允许每秒高达数千个粒子的物理和化学特征的同时多参数分析。流式细胞术常用于诊断健康障碍，尤其是血液癌症，但在基础研究、临床实践和临床试验中有许多其他应用。一个常见的变化是对粒子基于其物理属性进行物理分选，以纯化感兴趣的群体。
[0525] 荧光活化细胞分选(FACS)
[0526] 荧光活化细胞分选(FACS)是一个特殊类型的流式细胞术。它提供了用于如下的方法，基于每个细胞的特定光散射和荧光特征，将细胞异质混合物分选到两个或更多个容器中，每次一个细胞。它是有用的科学仪器，因为它提供来自单个细胞的荧光信号以及特别感兴趣的细胞的物理分离的快速、客观和定量记录。细胞悬液夹带在狭窄的、快速流动的液体流中间。流动如此排列使得细胞之间有相对于其直径的很大的分离。振动机制使细胞流破裂成单个液滴。调整系统以使每滴有超过一个细胞的可能性很低。在该细胞流破裂成液滴之前，流动通过荧光测量站，在其中测量每个细胞感兴趣的荧光特征。充电环恰放置在细胞流破裂成液滴的地方。基于就在前面的荧光强度测量将电荷置于环上，并且当液滴从该细胞流中断开时，相反的电荷被捕获在该液滴上。然后带电液滴通过静电偏转系统落下，该系统将该液滴基于其电荷转移到容器中。在一些系统中，电荷直接施加该细胞流中，并且该液滴断开保留与该细胞流相同符号的电荷。然后该细胞流在该液滴脱落后返回中性。
[0527] 单细胞的荧光活化液滴分选
[0528] 液滴中单细胞的分区能够分析由细胞释放或分泌的蛋白质，从而克服了传统流式细胞术和荧光活化细胞分选的主要限制之一。此方法的一个例子是用于检测单个小鼠杂交瘤细胞分泌的抗体的结合测定。通过在50-pl液滴中将单个小鼠杂交瘤细胞、荧光探针和涂有抗小鼠IgG抗体的单个珠共分区仅15分钟后检测分泌的抗体。该珠粒捕获分泌的抗体，并且当捕获的抗体结合该探针时，荧光可位于珠粒上，生成清晰可辨的荧光信号，使得能够在约200Hz下进行液滴分选以及细胞富集。所描述的微流体系统容易地适用于筛选其他细胞内、细胞表面或分泌的蛋白并且适用于定量催化或调节活性。为了筛选约100万个细胞，微流体操作可以在2-6小时完成；整个过程，包括微流体装置和哺乳动物细胞的准备，可以在5-7天完成。参见Mazutis et al.(2013).“Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics”.Nat.Protoc.8:870-891，其全部内容通过引用并入本文。
[0529] 图像分析
[0530] 该样品可以通过用于自动免疫细胞检测的系统和计算机实现方法进行分析，这有助于临床免疫谱研究。自动免疫细胞检测方法涉及从多通道图像如RGB图像或有生物学意义的非混合图像中检索多个图像通道。参见WO 2015177268，其全部内容通过引用并入本文。
[0531] 可以利用图像分析算法和/或系统，其自动计算来自多路复用IHC载玻片和/或荧光染色载玻片的设定图像的免疫得分。图像分析算法涉及计算机实现的方法，用于对用多路复用测定染色的单个样品中的多个细胞类型进行计数，其包括：对用多路复用测定染色的样品进行成像，该多路复用测定包括淋巴细胞标记物CD3、CD8、CD20、FoxP3和肿瘤检测标记物；将已经用多路复用测定染色的单个样品的图像解混合为用于多路复用测定的每个标记物的单独图像通道；基于每个通道中的强度信息来鉴定每个图像通道中的感兴趣的区域，其中每个通道中的低强度区域被去除，并且高强度区域代表细胞信号；生成单个替代图像，其中该替代图像是所有淋巴细胞标记物的图像通道信息的组合；应用细胞检测算法，其中该细胞检测算法是膜发现算法或核发现算法；鉴定每个图像通道或组合通道图像或者变换图像如灰度或吸光度图像或者替代图像中的淋巴细胞和淋巴细胞组合的特征；基于已知淋巴细胞和淋巴细胞组合的特征训练分类算法；将训练的算法应用于每个图像通道中或组合通道的每个图像中或者变换图像如灰度或吸光度图像中或者替代图像中的淋巴细胞和淋巴细胞组合的特征，经鉴定以将检测到的细胞分类为以下项中的至少一种：假阳性细胞、仅CD3T细胞、CD3和CD8T细胞、FP3T细胞和CD20B细胞；对分类的每个不同类型的细胞的数目进行计数；生成该样品的得分，其中该得分基于计数的每个细胞类型的数目。参见WO2015124737，其全部内容通过引用并入本文。
[0532] 本公开文本的示例性实施方案可以包括利用包括两步分类方法的系统和方法。本文公开的操作包括将WS图像分成多个块(patch)，并且首先使用“软”分类如SVM对每个块进行分类，并生成针对每个块的置信度得分和标记。每个块的位置、其特征及其类型作为分类结果获得，并且其置信度得分可以存储在数据库中。第二分类步骤包括将低置信度块与数据库中的高置信度块进行比较，并使用相似块来增强数据库中块的空间一致性。换言之，对于每个低置信度块，相邻的高置信度块对完善每个块的标记做出了更大的贡献，这改进了低置信度块的分割准确性。与现有的用于养成培训数据库的自适应/主动学习技术相比，所公开的操作不太关心发展成单个培训数据库，而是专注于独立处理每个测试图像，同时基于标记正在分析的图像的置信度信息自适应地改进分类准确度。换言之，为每个图像生成置信标记块数据库，并在该图像内执行相似性检索操作，以完善低置信度块的分类结果。参见WO 2015113895，其全部内容通过引用并入本文。
[0533] 本公开文本的示例性实施方案可以包括利用检测间皮素(MSLN)表达(如MSLN蛋白表达)并对其评分的方法。在具体例子中，该方法包括使包括肿瘤细胞的样品与MSLN蛋白特异性结合剂(如抗体)接触。表达MSLN的示例性肿瘤包括但不限于卵巢癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌，NSCLC)、胰腺癌和间皮瘤。检测或测量该肿瘤细胞中MSLN蛋白的表达，例如使用显微镜检查和免疫组织化学(IHC)。以0至3+的等级对MSLN蛋白质表达进行评分。例如，确定样品中的至少10％的肿瘤细胞(如至少约10％的肿瘤细胞)是否被蛋白质特异性结合剂(如，具有可检测的MSLN蛋白质表达)染色。如果低于10％(如小于约10％>)的肿瘤细胞被该特异性结合剂染色，则样品针对MSLN蛋白质表达的得分分配为零。如果样品中至少有10％的肿瘤细胞(如至少约10％的肿瘤细胞)被该蛋白质特异性结合剂(例如，具有可检测的MSLN蛋白质表达)染色，但少于10％>的肿瘤细胞(如小于约10％)被该特异性结合剂以2+或更高的强度染色，则该样品的MSLN蛋白质表达的得分被分配为1+。如果样品中至少有10％的肿瘤细胞(如至少约10％的肿瘤细胞)被该蛋白质特异性结合剂(例如，具有可检测的MSLN蛋白质表达)以2+或更高的强度染色，并且大部分染色的肿瘤细胞以2+强度染色，则该样品的MSLN蛋白质表达的得分被分配为2+。如果样品中至少有10％的肿瘤细胞(如至少约10％的肿瘤细胞)被该蛋白质特异性结合剂(例如，具有可检测的MSLN蛋白质表达)以2+或更高的强度染色且大部分染色的肿瘤细胞以3+强度染色，并且样品中的至少10％的肿瘤细胞(如，至少约10％的肿瘤细胞)被该蛋白质特异性结合剂(如，具有可检测的MSLN蛋白质表达)以3+强度染色，则该样品的MSLN蛋白质表达的得分被分配为3+。在WO 2015032695(其全部内容通过引用并入本文)的表13和图20中提供了概述。
[0534] 杂交
[0535] 原位杂交(ISH)涉及在中期或间期染色体制备物(如安装在载玻片上的样品)的背景下，将含有靶核酸、基因组靶核酸的样品与可特异性杂交的或对靶核酸具有特异性的标记探针(例如，本文公开的一种或多种探针)接触。该载玻片任选地被预处理，例如以去除可能干扰均一杂交的材料。该染色体样品和该探针都被处理，例如通过加热使双链核酸变性。将该探针(在合适的杂交缓冲液中配制)和该样品组合，在条件下并保持足够的时间，以允许发生杂交(典型地达到平衡)。洗涤该染色体制备物以除去多余的探针，并使用标准技术检测该靶标的特异性标记。参见WO 2015124702，其全部内容通过引用并入本文。
[0536] 其他检测癌性细胞的方法利用癌细胞中染色体畸变的存在。具体而言，整个染色体或染色体片段的拷贝的缺失或增殖以及该基因组的特定区域的更高水平的扩增是癌症中常见的现象。染色体畸变通常使用细胞遗传学方法来检测，如吉姆萨染色的染色体(G-显带)或荧光原位杂交(FISH)。参见WO 2012152747，其全部内容通过引用并入本文。
[0537] 目前公开的技术提供了用于增加分析癌症的分子机制中的特异性的改进方法。因此，在某些实施方案中，该技术涉及多变量癌症诊断方法，其中所述方法确定在单细胞或含有细胞的单个样品中细胞水平上分子标记物和表型形态标记物的存在，所述方法包括：a)从来自包括单细胞或多个细胞的受试者的单个样品获得分子标记物数据；b)从与步骤(a)中使用的相同的单细胞或多个细胞获得定量细胞形态学数据，以提供所述单个样品的多变量分析，该多变量数据集包括来自步骤(b)的定量细胞形态学数据和来自步骤(a)的分子标记物数据；并且c)将步骤(b)中获得的多变量分析数据集与通过获得来自于取自具有已知临床结果的个体的癌症和非癌细胞样品的分子标记物数据和定量细胞形态学数据而建立的参考多变量分析数据集进行比较。
[0538] 步骤(c)的比较结果提供来自受试者的临床结果的预测，其由在参考多变量分析数据集中看到的与癌症进展、发生、转移或临床结果的其他特征统计学相关的特征和标记物的特定组合所定义。参见WO 2012152747，其全部内容通过引用并入本文。
[0539] 本公开文本的示例性实施方案可以包括利用结合涉及光谱分辨检测和数据预加工的专门成像方法，通过使用分子标记物的荧光标记物来提供用于确定癌症的病理学预后状态的信息的技术。该技术提供了可以采集和分析样品上的核形态的成像方法，其被制备用来在单个数据采集周期内检测样品上的分子特异性探针。这种成像方法采用了标记、采集、预加工和分析技术的组合。收集并分析多维图像以通过发射波长分离和区分感兴趣的不同分析物通道。随后的分析物通道代表定量细胞形态和基因重排、基因表达和/或蛋白质表达的数据的不同方面。参见WO 2012152747，其全部内容通过引用并入本文。
[0540] 本公开文本的示例性实施方案可以包括利用用于可视化核的系统、方法和试剂盒。可以用蛋白酶对样品进行预处理以使核透化，并且然后用纳米粒子/DNA结合部分缀合物孵育。该DNA结合部分包括至少一个DNA结合分子。该缀合物与核内的DNA结合，并且该纳米粒子被可视化，从而可视化该核。计算机和图像分析技术用于评价核特征，如染色体分布、倍性、形状、尺寸、纹理特征和/或背景特征。该方法可以与样品上的其他多路复用测试组合使用，包括荧光原位杂交。参见WO 2012116949，其全部内容通过引用并入本文。
[0541] 荧光原位杂交(FISH)技术可用于检测和定位染色体上特定DNA序列的存在和不存在。FISH使用荧光探针，其仅与染色体上与其显示高度序列相似性的那些部分结合。FISH也可用于检测样品中特定的mRNA序列。参见WO 2012116949，其全部内容通过引用并入本文。
[0542] FISH、CISH和SISH的许多程序是本领域已知的。例如，美国专利号5,447,841、5472842和5,427,932中描述了用于执行FISH的程序；美国专利号6,942,970中描述了CISH；
并且美国专利号6,280,929中提供了另外的检测方法，其公开内容通过引用以整体并入本文。许多试剂和检测方案可与FISH、CISH和SISH程序结合采用，以改进敏感度、分辨率或其他所希望性质。如上所讨论的，用荧光团(包括荧光染料和量子点)标记的探针可以在进行FISH时直接进行光学检测。可替代地，该探针可以用非荧光分子标记，如半抗原(如以下非限制性例子：生物素、地高辛配基、DNP和各种噁唑、吡唑、噻唑、硝基芳基、苯并呋咱、三萜、尿素、硫脲、鱼藤酮、香豆素、基于香豆素的化合物、鬼臼毒素、基于鬼臼毒素的化合物及其组合)、配体或其他间接可检测的部分。然后用这种非荧光分子(以及它们结合的靶核酸序列)标记的探针可以通过使样品(例如，与探针结合的细胞样品)与标记的检测试剂(如对所选半抗原或配体有特异性的抗体(或受体，或其他特异性结合配偶体))接触来检测。检测试剂可以用荧光团(例如，量子点)或用另一个可间接检测的部分标记，或可以与一种或多种另外的特异性结合剂(例如，二级或特异性抗体)接触，其转而可以用荧光团标记。任选地，可检测标记直接与抗体、受体(或其他特异性结合剂)附接。可替代地，可检测标记通过接头(如酰肼硫醇接头、聚乙二醇接头或任何其他具有可比较反应性的柔性连接部分)附接至结合剂。例如，特异性结合剂如抗体、受体(或其他抗配体)、亲和素等可以用荧光团(或其他标记)经由异双功能聚亚烷基二醇接头如异双功能聚乙二醇(PEG)接头进行共价修饰。异双功能接头组合了两种不同的反应性基团，例如选自羰基反应性基团、胺反应性基团、硫醇反应性基团和光反应性基团的，其中第一个附接于标记，并且第二个附接于特异性结合剂。在其他例子中，用能够将荧光或显色组合物转化成可检测荧光、有色或另外的可检测信号(例如，如SISH中可检测金属粒子的沉积)的酶来标记探针或特异性结合剂(如抗体，例如一级抗体、受体或其他结合剂)。如上所示，酶可以直接或通过接头间接附接至相关的探针或检测试剂。合适的试剂(例如，结合试剂)和化学物质(例如，接头和附接化学物质)的例子描述于美国专利申请公开号2006/0246524、2006/0246523和2007/0117153中，其公开内容通过引用以整体并入本文。参见WO 2015124702，其全部内容通过引用并入本文。
并且美国专利号6,280,929中提供了另外的检测方法，其公开内容通过引用以整体并入本文。许多试剂和检测方案可与FISH、CISH和SISH程序结合采用，以改进敏感度、分辨率或其他所希望性质。如上所讨论的，用荧光团(包括荧光染料和量子点)标记的探针可以在进行FISH时直接进行光学检测。可替代地，该探针可以用非荧光分子标记，如半抗原(如以下非限制性例子：生物素、地高辛配基、DNP和各种噁唑、吡唑、噻唑、硝基芳基、苯并呋咱、三萜、尿素、硫脲、鱼藤酮、香豆素、基于香豆素的化合物、鬼臼毒素、基于鬼臼毒素的化合物及其组合)、配体或其他间接可检测的部分。然后用这种非荧光分子(以及它们结合的靶核酸序列)标记的探针可以通过使样品(例如，与探针结合的细胞样品)与标记的检测试剂(如对所选半抗原或配体有特异性的抗体(或受体，或其他特异性结合配偶体))接触来检测。检测试剂可以用荧光团(例如，量子点)或用另一个可间接检测的部分标记，或可以与一种或多种另外的特异性结合剂(例如，二级或特异性抗体)接触，其转而可以用荧光团标记。任选地，可检测标记直接与抗体、受体(或其他特异性结合剂)附接。可替代地，可检测标记通过接头(如酰肼硫醇接头、聚乙二醇接头或任何其他具有可比较反应性的柔性连接部分)附接至结合剂。例如，特异性结合剂如抗体、受体(或其他抗配体)、亲和素等可以用荧光团(或其他标记)经由异双功能聚亚烷基二醇接头如异双功能聚乙二醇(PEG)接头进行共价修饰。异双功能接头组合了两种不同的反应性基团，例如选自羰基反应性基团、胺反应性基团、硫醇反应性基团和光反应性基团的，其中第一个附接于标记，并且第二个附接于特异性结合剂。在其他例子中，用能够将荧光或显色组合物转化成可检测荧光、有色或另外的可检测信号(例如，如SISH中可检测金属粒子的沉积)的酶来标记探针或特异性结合剂(如抗体，例如一级抗体、受体或其他结合剂)。如上所示，酶可以直接或通过接头间接附接至相关的探针或检测试剂。合适的试剂(例如，结合试剂)和化学物质(例如，接头和附接化学物质)的例子描述于美国专利申请公开号2006/0246524、2006/0246523和2007/0117153中，其公开内容通过引用以整体并入本文。参见WO 2015124702，其全部内容通过引用并入本文。
[0543] 本公开文本的方法可以允许检测超过一个(例如，2、3、4等)不同靶标。在一些实施方案中，不同的可检测标记和/或检测系统可以用于每个靶标，使得每个靶标可以在单个样品中单独检测。可以使用任何适当的可检测标记和/或检测系统。更确切地说，本公开内容的特征是用于明视野原位杂交的系统。在一些实施方案中，该系统包括探针组，其包括对靶RNA有特异性的X个独特的2'-O-甲基RNA探针，其中X>2(例如，X＝2，X＝3，X＝4，X＝5等)时，该探针靶向该靶RNA内X个不同的部分。每个2'-O-甲基RNA探针可以与至少一个可检测部分缀合。可检测部分可适配于结合反应性色原体缀合体系(例如酪胺色原体缀合系统)用于信号放大。在一些实施方案中，2'-O-甲基RNA探针长度上各自包括15至30个之间的核苷酸，20至50个之间的核苷酸，40至80个之间的核苷酸，20至100个之间的核苷酸或20至200个之间的核苷酸。参见WO 2015124738，其全部内容通过引用并入本文。
[0544] 该样本可以是根据原位杂交(ISH)方案加工的乳腺细胞样品。该ISH方案可以通过将核苷酸(例如，探针)的互补链与感兴趣的序列杂交来提供细胞制备物中特定核酸序列(例如，DNA、mRNA等)的可视化。该ISH方案可以包括(不限于)双重SISH和红色ISH方案、单一红色ISH方案、单一SISH方案等。参见WO 2013113707，其全部内容通过引用并入本文。
[0545] 动态等位基因特异性杂交(DASH)
[0546] 动态等位基因特异性杂交(DASH)基因分型利用了由错配碱基对的不稳定性导致的DNA解链温度差异的优势。该过程可以大大自动化并涵盖一些简单的原理。在第一步中，扩增基因组片段，并通过与生物素化引物的PCR反应将其粘附至珠粒。在第二步中，将扩增产物附接至链霉亲和素柱上并用NaOH洗涤以除去未生物素化的链。然后在存在与双链DNA结合时发荧光的分子的情况下添加等位基因特异性寡核苷酸。然后随着温度增加测量该强度直到可以确定解链温度(Tm)。SNP将导致低于预期Tm。由于DASH基因分型测量Tm的定量变化，因此它能够测量所有类型的突变，而不仅仅是SNP。DASH的其他益处包括与无标记探针共同发挥作用的能力以及其简单的设计和性能条件。
[0547] 分子信标
[0548] 分子信标利用专门设计的单链寡核苷酸探针。该寡核苷酸的设计使得每个末端都有互补区，并且探针序列位于两个末端之间。此设计允许该探针在其自然分离状态下采用发夹结构或茎环结构。附接至探针的一端是荧光团，并且附接至另一端的是荧光淬灭剂。由于该探针的茎环结构，荧光团紧密接近淬灭剂，从而阻止该分子发出任何荧光。该分子也经工程化，使得仅该探针序列与测定中将使用的基因组DNA互补(Abravaya et al.(April 2003).“Molecular beacons as diagnostic tools:technology and applications”.Clin.Chem.Lab.Med.41(4):468–74)。如果该分子信标的探针序列在测定过程中遇到其靶基因组DNA，它将退火并杂交。由于该探针序列的长度，该探针的发夹片段将会变性，以有利于形成更长更稳定的探针-靶标杂交体。这种构象变化允许荧光团和淬灭剂由于发夹结合而不会紧密接近，从而使该分子发荧光。另一方面，如果该探针序列遇到小到只有一个非互补核苷酸的靶序列，该分子信标将优先保持其天然发夹状态，并且不会观察到荧光，因为荧光团保持淬灭。
[0549] 引物延伸
[0550] 引物延伸是两步过程，首先涉及探针与SNP核苷酸紧上游碱基的杂交，随后进行“微型测序”反应，其中DNA聚合酶通过添加与SNP核苷酸互补的碱基而延伸杂交的引物。此掺入的碱基被检测到并确定了SNP等位基因(Syvanen,Nat Rev Genet.2001Dec；2(12):930-42)。因为引物延伸基于高度准确的DNA聚合酶，所以该方法通常非常可靠。引物延伸能够在使其具有高度灵活性的极相似反应条件下对大多数SNP进行基因分型。引物延伸法用于多个测定形式。这些形式使用宽范围的检测技术，包括MALDI-TOF质谱(参见Sequenom)和类似ELISA的方法。通常，有两种主要方法使用掺入荧光标记的双脱氧核苷酸(ddNTP)或荧光标记的脱氧核苷酸(dNTP)。对于ddNTP，探针与SNP核苷酸紧上游的靶DNA杂交，并且将与SNP等位基因互补的单个ddNTP添加到探针的3'末端(二二氧核苷酸(didioxynucleotide)中缺失的3'-羟基阻止了添加另外的核苷酸)。每个ddNTP都标记有不同的荧光信号，允许检测相同反应中的所有四个等位基因。对于dNTP，等位基因特异性探针具有3'碱基，其与被询问的每个SNP等位基因互补。如果靶DNA含有与探针3'碱基互补的等位基因，则靶DNA将与探针完全杂交，从而允许DNA聚合酶从探针的3'端延伸。这是通过将荧光标记的dNTP掺入探针末端来检测。如果靶DNA不含与探针3'碱基互补的等位基因，则靶DNA会在探针的3'端产生错配，并且DNA聚合酶将无法从探针的3'端延伸。第二种方法的好处是可以将几种标记的dNTP掺入增长链中，允许增加信号。
[0551] 微阵列
[0552] 微阵列背后的核心原理是两条DNA链之间的杂交，即互补核酸序列通过在互补核苷酸碱基对之间形成氢键而彼此特异性配对的性质。核苷酸序列中的大量互补碱基对导致两条链之间的非共价键合更紧密。洗去非特异性结合序列后，只有强配对的链会保持杂交。结合至探针序列的荧光标记的靶序列生成信号，取决于杂交条件(如温度)和杂交后洗涤。
来自斑点(特征)的信号总强度取决于与该斑点上存在的探针结合的靶样品的量。微阵列使用相对定量，其中将特征的强度与不同条件下相同特征的强度进行比较，并且该特征的身份通过其位置已知。
来自斑点(特征)的信号总强度取决于与该斑点上存在的探针结合的靶样品的量。微阵列使用相对定量，其中将特征的强度与不同条件下相同特征的强度进行比较，并且该特征的身份通过其位置已知。
[0553] 核酸阵列(也称为寡核苷酸阵列、DNA微阵列、DNA芯片、基因芯片或生物芯片)已成为强大的分析工具。核酸阵列本质上是寡核苷酸在表面上的系统分布，例如按行和列。寡核苷酸可以物理或共价粘附到表面上。将寡核苷酸物理粘附到表面上的一种方法涉及将寡核苷酸溶液在接触表面时干燥。干燥或另外固定后，寡核苷酸被限制在表面上的“斑点”中。干燥方法始于称为“斑点印迹”的极低密度阵列的产生。斑点印迹可以通过在固体表面手动沉积寡核苷酸滴并干燥来完成。大多数斑点印迹涉及排列成行和列的少于约20个不同寡核苷酸斑点。斑点印迹向前，微点样(micro-spotting)法使用机械或机器人系统建立多个显微斑点。这些斑点的小尺寸使点密度更加高。例如，使用微点样将数万个斑点沉积在显微镜载玻片上。根据不同的方法，已直接在基底或支持物上合成寡核苷酸。无掩模光刻和数字光学化学技术是直接在支持物上合成核酸的技术；这些方法已被用于生成非常高密度的阵列(例如，美国专利号7,785,863，其全部内容通过引用并入本文)。相似地，无掩模光刻已被用于制造肽阵列(参见例如Singh-Gasson et al.Maskless fabrication of light-directed oligonucleotide microarrays using a digital micromirror array.Nat Biotechnol 1999,17:974-978，其全部内容通过引用并入本文)。已经使用数字光学化学，其建立具有数百万个离散区域的阵列，每个离散区域含有独特的寡核苷酸群体。核酸和肽阵列包括在基底表面上的一系列区域(在本文中称为“点”)，每个区域被指定用于特定的寡核苷酸或肽。“阵列密度”本质上是在给定区域中分布的点的行数和列数。高密度阵列在给定区域中具有更大行数和列数。随着核酸和肽阵列行业的发展，高密度阵列的可用性也有所增加。随着给定区域中的点数增加，每个点的尺寸会减小。例如，具有跨显微镜载玻片区域分布的数百万个独特的寡核苷酸或肽的阵列中的一个点大约为100 pm2。此点的小尺寸在阅读和理解使用该阵列的结果时产生技术挑战。例如，虽然可以独立视觉观察100 pm2点，但人无法在没有放大的情况下靠近视觉分辨两个或更多个100 pm2点。因此，高密度阵列的制造和使用已经发展到用户不再视觉阅读阵列的阶段。由于阵列在小区域内包括大量(数百万)紧密排列的点，所以复杂的成像设备会检测来自阵列的信号，并使用软件来解读数据。此外，可以使用高度敏感的检测方法。荧光成像技术是高度敏感的技术，已成为检测杂交事件的标准方法。这些阵列的荧光成像通常使用配备有滤光片和相机的显微镜。荧光通常不能在没有这些设备的帮助下视觉分辨。高度复杂的荧光图像使用软件进行加工，因为数据量很大，并且其表现不可识别。例如，Fiekowsky等人的美国专利号6,090,555描述了涉及从核酸阵列获取的荧光图像的计算机辅助比对和解卷积的复杂过程。尽管进行大规模平行基因组学或蛋白质组学研究的能力具有很大价值，但由于难以检测和判读结合事件，核酸和肽阵列在适用性上受到限制。此外，由于随着时间的推移荧光信号降解以及伴随的荧光检测硬件的复杂性，荧光的使用对阵列的普遍适用性产生许多障碍。本公开涉及装置和使用该装置来检测靶分子的方法，该装置包括寡核苷酸或肽阵列。该装置包括结合到基底表面的多个结合分子。该结合分子被设计为与靶分子结合。靶标和结合分子的结合可以通过设备检查来鉴定。在一些实施方案中，该装置能够检测靶核酸和经固定的寡核苷酸之间的杂交事件。在其他实施方案中，该装置能够检测靶多肽和经固定的肽之间的结合事件。
在说明性实施方案中，装置包括具有至少一个基底表面的基底和结合到该基底表面的多个经固定的寡核苷酸或肽，其中该多个经固定的寡核苷酸或肽在该基底表面上图案化以形成至少一个光学可判读的图案。参见WO 2013110574，其全部内容通过引用并入本文。
在说明性实施方案中，装置包括具有至少一个基底表面的基底和结合到该基底表面的多个经固定的寡核苷酸或肽，其中该多个经固定的寡核苷酸或肽在该基底表面上图案化以形成至少一个光学可判读的图案。参见WO 2013110574，其全部内容通过引用并入本文。
[0554] 本公开文本的示例性实施方案可以包括利用用于检测一种或多种靶化合物的装置。特别感兴趣的靶化合物的一个类型是靶核酸或靶寡核苷酸。特别感兴趣的靶化合物的另一个类型是靶多肽。对于包括经固定的寡核苷酸的本公开文本的实施方案，靶核酸将通常被理解为靶分子类型。然而，本领域普通技术人员认识到，固定的寡核苷酸提供了用于能够检测多种其他靶化合物的寡核苷酸结合部分缀合物的结合配偶体。例如，使用固定的寡核苷酸，可以将抗体-寡核苷酸缀合物固定在装置上以将该装置转化为抗体微阵列。抗体微阵列可用于检测感兴趣的蛋白质靶标。相似地，包括固定的肽的实施方案，靶分子类型可以包括抗体、蛋白质或酶。然而，潜在的肽也可以通过使用肽结合部分和分子靶向部分的缀合物进行修饰。此外，虽然本公开文本具体公开了固定的寡核苷酸和肽，但这些仅仅是示例性的固定的检测部分。在不脱离本文公开的概念的情况下，可以将许多其他有用的固定的检测部分并入到如本文所述的装置中。例如，检测部分可以包括适体、配体、螯合剂、碳水化合物和其人造等效物。参见WO 2013110574，其全部内容通过引用并入本文。
[0555] 分离CTC的方法可以包括使用对EpCAM、ERG、PSMA或其组合具有特异性的抗体。将分离的CTC施加于载玻片或其他基底并固定(例如使用本领域已知的方法)。如本文讨论的使用前列腺特异性抗体的新的扩散方法也可用于分离CTC并在固定之前将它们施加于基底，例如载玻片。然后，例如在CTC中在足以使核酸探针与它们的互补序列杂交的条件下，将安装和固定的CTC与对ERG、PTEN和CEN-10有特异性的一种或多种核酸探针接触。将核酸探针进行标记，例如用一个或多个量子点。例如，对ERG、PTEN和CEN-10有特异性的一个或多个核酸探针可以分别用不同的量子点标记，以允许将探针彼此区分。在允许核酸探针与ERG、PTEN和CEN-10杂交后，例如通过使用光谱成像来检测来自一个或多个核酸探针上的一个或多个量子点的信号。然后分析信号，以确定在分离的CTC中一个或多个ERG是否重排，一个或多个PTEN基因是否缺失，以及是否检测到CEN-10。基于一个或多个ERG是否重排、一个或多个PTEN基因是否缺失、以及是否检测到CEN-10，对前列腺癌进行了表征。参见WO2013101989，其全部内容通过引用并入本文。
[0556] 显色原位杂交(CISH)
[0557] 显色原位杂交(CISH)是将免疫组织化学(IHC)显色信号检测方法与原位杂交组合的细胞遗传学技术。它是在2000年左右开发的，作为用于检测HER-2/neu致癌基因扩增的荧光原位杂交(FISH)的替代方案。CISH与FISH相似，在于它们都是用于检测DNA特定区域存在或不存在的原位杂交技术。然而，CISH在诊断实验室中更实用，因为它使用明视野显微镜而不是FISH中使用的更昂贵和复杂的荧光显微镜。
[0558] 用于CISH的探针设计可能与FISH非常相似，在标记和检测上不同。FISH探针通常用多种不同的荧光标签标记，并且只能在荧光显微镜下检测，而CISH探针用生物素或地高辛配基标记，并且在应用其他处理步骤后可用明视野显微镜检测。CISH探针长大约20个核苷酸，并且针对DNA靶标设计。它们与靶序列互补，并在变性和杂交步骤后与之结合。只有少数CISH探针可商购，因此对于大多数应用，它们必须从细菌人工染色体(BAC)中提取、扩增、测序、标记和定位。BAC是在人类基因组计划期间开发的，因为有必要分离和扩增用于测序目的的人DNA短片段。如今，可以使用公共数据库(如UCSC基因组浏览器)来选择和定位BAC。这确保了 互补性和序列特异性。从BAC克隆中提取DNA，并使用基于聚合酶的技术扩增，如简并寡核苷酸引物(DOP)-PCR。接下来，对克隆进行测序并验证它们在基因组上的位置。探针标记可以通过使用随机引物或切口平移并入生物素或地高辛配基来进行。
[0559] 样品制备、探针杂交和检测：样品可能包含间期或中期的染色体。样品牢固地粘附至表面，如载玻片。可使样品经历胃蛋白酶消化，以确保靶标是可及的。添加10-20μL探针，将样品用盖玻片盖住，该盖玻片用橡皮泥密封，并且将该载玻片加热至97℃持续5-10分钟以使DNA变性。然后将载玻片置于37℃烘箱中过夜，以便探针可以杂交。在第二天，洗涤样品并且施加非特异性蛋白质结合位点的阻断剂。如果要使用辣根过氧化物酶(HRP)，则样品必须在过氧化氢中孵育以抑制内源性过氧化物酶活性。如果将地高辛配基用作探针标记，则施加抗地高辛配基荧光素一级抗体，随后施加HRP缀合的抗荧光素二级抗体。如果使用生物素作为探针标记，首先必须使用牛血清白蛋白(BSA)阻断非特异性结合位点。然后，使用HRP缀合的链霉亲和素进行检测。然后HRP将二氨基联苯胺(DAB)转化为不溶性棕色产物，可将其在40至60倍放大的明视野显微镜下检测。可使用复染剂如苏木精和伊红来使产品更加明显。
[0560] 分子细胞遗传学技术(如显色原位杂交(CISH))将染色体的视觉评价(核型分析)与分子技术组合。分子细胞遗传学方法基于细胞内核酸探针与其互补核酸的杂交。将识别针对特定染色体区域的探针并且它会在中期染色体上或间期核内(例如样品中)与其互补序列杂交。探针已被开发用于多种诊断和研究目的。序列探针与特定染色体区域或基因中的单拷贝DNA序列杂交。这些是用于鉴定与感兴趣的综合征或病症相关的染色体关键区域或基因的探针。在中期染色体上，这种探针与每个染色单体杂交，通常每个染色体给出两个小的离散信号。序列探针的杂交，如重复序列耗减探针或独特序列探针，可以检测与许多疾病和综合征有关的染色体异常，包括组成性遗传异常，如微缺失综合征、染色体易位、基因扩增和非整倍体综合征、肿瘤疾病以及病原体感染。最常见的是将这些技术应用于显微镜载玻片上的标准细胞遗传学制备物。另外，这些程序可用于固定的细胞或其他核分离物的载玻片上。例如，这些技术常用于针对癌症的诊断和预后而表征肿瘤细胞。许多染色体异常已与癌症的发展关联(例如，例如与某些骨髓疾病相关的非整倍性如8号染色体三体；易位如慢性骨髓性白血病中的BCR/ABL重排；以及与肿瘤转化关联的特定核酸序列的扩增)。分子技术可以在检测和表征这些获得性染色体异常时增强标准细胞遗传学测试。已经引入用于双色CISH的系统。这些包括Dako DuoCISHTM系统和Zyto Vision 2C系统。针对两种颜色检测步骤，这两种系统都使用单独的酶(碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶)。
[0561] 本公开文本涉及用于显色原位杂交(CISH)的系统和方法，并且具体涉及在单个测定中防止两个或更多个颜色检测系统之间的干扰的方法，并且进一步涉及用于利用分离探针(break-apart probe)的评分测定的方法。参见WO 2011133625，其全部内容并入本文。
[0562] 荧光原位杂交(FISH)
[0563] 荧光原位杂交(FISH)是使用荧光探针的细胞遗传学技术，其仅与染色体的具有高度序列互补性的那些部分结合。它是由生物医学研究人员在20世纪80年代初开发的，并且可用于检测和定位染色体上特定DNA序列的存在和不存在。荧光显微镜可用于找出荧光探针与染色体结合的位置。FISH通常用于发现DNA中的特定特征，用于遗传咨询、医学和物种鉴定。FISH也可用于检测和定位细胞、循环肿瘤细胞和样品中的特定RNA靶标(如mRNA、lncRNA和miRNA)。在这种背景下，它可以帮助定义细胞内基因表达的时空模式。
[0564] 探针：RNA和DNA：RNA探针可以设计用于基因内的任何基因或任何序列，以可视化细胞中的mRNA、lncRNA和miRNA。使用FISH是通过针对任何染色体异常检查细胞生殖周期，特别是核间期。此技术[FISH]允许通过建立具有吸引相似染色体的人工染色体基础的探针来更容易地分析大量的档案案例，以便鉴定精确定位的染色体。检测到核酸异常时每个探针的杂交信号。用于检测mRNA和lncRNA的每个探针由20个寡核苷酸对组成，每对覆盖40-50bp的空间。对于miRNA检测，探针使用专利保护的化学技术来特异性检测miRNA并覆盖整个miRNA序列。探针通常衍生自分离、纯化和扩增以用于人类基因组计划的DNA片段。与可直接测序的长度相比，人类基因组的尺寸非常大，因此有必要将基因组分为片段。(在最终分析中，通过使用序列特异性核酸内切酶将每个片段的拷贝消化成更小的片段，使用尺寸排阻色谱测量每个小片段的尺寸，并使用该信息确定这些大片段彼此重叠的位置)。为了保存这些片断与它们各自的DNA序列，将这些片段添加到连续复制细菌种群的系统中。细菌的克隆种群(每个种群维持单一的人工染色体)储存在世界各地的不同实验室中。该人工染色体(BAC)可以在任何实验室中生长、提取和标记。这些片段大约有10万个碱基对，并且是大多数FISH探针的基础。
[0565] 制备和杂交过程-RNA：细胞可被透化以使靶标可达。FISH也已在未固定的细胞上成功完成。由20个寡核苷酸对组成的靶特异性探针与一个或多个靶RNA杂交。独立但兼容的信号放大系统使得能够进行多路复用测定(每个测定多达两个靶标)。信号放大是通过一系列连续的杂交步骤实现的。在测定结束时，该样品在荧光显微镜下可视。
[0566] 制备和杂交过程-DNA：首先构建探针。探针必须足够大以与其靶标特异性杂交，但不能大到妨碍杂交过程。探针直接用荧光团、用抗体的靶标或用生物素标签化。标签化可以用各种方式完成，例如切口平移或使用标签化核苷酸的PCR。然后，产生间期或中期染色体制品。染色体稳固地粘附至基底(通常为玻璃)。重复性DNA序列必须通过向样品中添加短DNA片段来阻断。然后将探针应用于染色体DNA并在杂交时孵育大约12小时。几个洗涤步骤除去所有未杂交或部分杂交的探针。然后使用能够激发染料和记录图像的显微镜对结果进行可视化和定量。如果荧光信号较弱，则可能需要放大信号才能超过显微镜的检测阈值。荧光信号强度取决于很多因素，如探针标记效率、探针类型和染料类型。荧光标签化的抗体或链霉亲和素与染料分子结合。选择这些二级组分以使得它们具有强信号。
[0567] 纤维FISH
[0568] 在间期或中期制备的可选技术即纤维FISH中，间期染色体被附接至载玻片上，使得它们以直线展开，而不是像常规FISH那样紧密盘绕，或如间期FISH中那样采用染色体领域构象。这是通过沿着载玻片的长度施加机械剪切实现的，对已固定到载玻片上并且然后溶解的细胞或对纯化的DNA的溶液。称为染色体梳理的技术越来越多地用于此目的。染色体的延伸构象允许显著提高分辨率-甚至降至几千碱基。
[0569] 定量FISH(Q-FISH)
[0570] 定量荧光原位杂交(Q-FISH)是基于传统FISH方法的细胞遗传学技术。在Q-FISH中，该技术使用标记的(Cy3或FITC)合成DNA模拟物，称为肽核酸(PNA)寡核苷酸，以使用荧光显微镜和分析软件对染色体DNA中的靶序列进行定量。
[0571] 流式FISH
[0572] 流式-FISH是细胞遗传学技术，用以通过流式细胞术与细胞遗传学荧光原位杂交染色方案的组合，定量全细胞群体基因组DNA中特定重复性元件的拷贝数。Rufer等人于1998年首次刊出了流式-FISH，作为分析端粒长度的另一种技术Q-FISH的修改，其采用用荧光素荧光团标记的3'-CCCTAACCCTAACCCTAA-5'序列的肽核酸探针，以对通过甲醇/乙酸处理制备的已用秋水仙碱、低渗休克和固定至载玻片处理的细胞的中期扩散物上的端粒重复进行染色(方案可在线获得)。然后可以通过专门的计算机程序(可从Flintbox网络获得的方法和软件)分析所得荧光斑点的图像，以产生定量荧光值，其然后可用于估计实际的端粒长度。探针染色产生的荧光被认为是定量的，因为PNA在低离子盐浓度和甲酰胺存在下优先结合DNA，因此DNA双链体一旦融合并退火至PNA探针就不会重新形成，从而允许该探针饱和其靶重复序列(因为它不通过竞争互补链上的反义DNA由靶DNA置换)，因此在洗掉未结合探针后在给定染色体位点处产生可靠和可定量的PNA探针靶标的频率读数。
[0573] 比较基因组杂交
[0574] 比较基因组杂交是分子细胞遗传学方法，其用于与参考样品相比相对于测试样品的DNA倍性水平来分析拷贝数变异(CNV)，无需培养细胞。这项技术的目的是快速有效地比较起源于两个来源的基因组DNA样品，最常见的情况下它们是密切相关的，因为怀疑它们在整条染色体或子染色体区域(整个染色体的一部分)的增加或损失方面存在差异。此技术最初是开发用于评价实体瘤和正常组织样品的染色体互补序列之间的差异，并且与受所用显微镜分辨率限制的更传统的giemsa显带(g-显带)细胞遗传学分析技术和荧光原位杂交(FISH)相比，其分辨率改进了5-10兆碱基。
[0575] 印迹
[0576] 可以利用的示例性印迹技术包括Western、Southern、Eastern、Far-western、Southwestern、Northwestern和Northern印迹，如在以下部分中进一步描述的和本领域已知的。
[0577] western印迹
[0578] western印迹(有时称作蛋白质免疫印迹)是广泛使用的用来检测样品均质物或提取物中的特定蛋白质的分析技术。该技术使用凝胶电泳来根据3-D结构分离天然蛋白质或根据多肽的长度分离变性蛋白质。然后将蛋白质转移到膜(典型地硝化纤维或PVDF)上，在那里用对靶蛋白有特异性的抗体染色。把凝胶电泳步骤包括在western印迹分析中是为了解决抗体的交叉反应性的问题。
[0579] Southern印迹
[0580] Southern印迹将电泳分离的DNA片段至滤膜的转移和随后通过探针杂交进行的片段检测组合。探针与滤膜上特定DNA片段的杂交指示该片段含有与探针互补的DNA序列。DNA从电泳凝胶至膜的转移步骤允许标记的杂交探针与尺寸分级的DNA容易地结合。它也允许固定靶-探针杂交物，其可以用于通过放射自显影或其他检测方法进行分析。用限制酶消化的基因组DNA进行的Southern印迹可用于确定基因组中序列(例如，基因拷贝)的数目。只与未被限制酶切割的单一DNA片段杂交的探针将在Southern印迹上产生单一条带，而当探针与几个高度相似的序列(例如，可能是序列加倍的结果的那些)杂交时可能会观察到多条条带。杂交条件的修饰(例如，增加杂交温度或降低盐浓度)可用于增加特异性并减少探针与小于100％相似序列的杂交。
[0581] Eastern印迹
[0582] eastern印迹是用于分析蛋白质翻译后修饰(PTM)(如脂质、磷酸部分和糖缀合物)的生化技术。它最常用于检测碳水化合物表位。因此，eastern印迹可以被认为是western印迹的生化技术的延伸。术语eastern印迹描述了多种技术，大多数使用从SDS-PAGE凝胶印迹到PVDF或硝酸纤维素膜上的蛋白质。使用可能检测脂质、碳水化合物、磷酸化或任何其他蛋白质修饰的探针来分析转移的蛋白的翻译后修饰。应使用Eastern印迹来指通过PTM和探针的特异性相互作用检测其靶标的方法，将其与标准Far-western印迹区分开。原则上，eastern印迹与凝集素印迹(即检测蛋白质或脂质上的碳水化合物表位)相似。
[0583] Far-western印迹
[0584] Far-western印迹采用非抗体蛋白质来探测印迹上感兴趣的一种或多种蛋白质。以这种方式，可以鉴定探针(或印迹)蛋白质的结合配偶体。探针蛋白通常使用表达克隆载体在大肠杆菌中产生。首先通过SDS或天然PAGE分离含有猎物蛋白的细胞裂解物中的蛋白，并将其转移至膜上，如在标准WB中一样。然后使膜中的蛋白质变性并复性。然后阻断并探测该膜，通常用一种或多种纯化的诱饵蛋白。如果诱饵蛋白和猎物蛋白一起形成复合物，则诱饵蛋白在猎物蛋白所在膜中的斑点上被检测到。然后可以通过常规方法将探针蛋白质可视化-它可以被放射性标记；它可能携带特定的亲和标签，像抗体存在的His或FLAG；或者可能存在蛋白质特异性抗体(对探针蛋白质)。
[0585] Southwestern印迹
[0586] Southwestern印迹是基于Southern印迹(由Edwin Southern建立)的线路并且由B.Bowen、J.Steinberg和同事在1980年首先描述，是涉及以其与特定寡核苷酸探针结合的能力鉴定和表征DNA结合蛋白质(与DNA结合的蛋白质)的实验室技术。通过凝胶电泳分离这些蛋白质，并且随后转移到相似于其他类型印迹的硝酸纤维素膜上。进行“Southwestern印迹映射”用于快速表征DNA结合蛋白及其在基因组DNA上的特定位点。在含有十二烷基硫酸钠(SDS)的聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)上分离蛋白质，通过在尿素存在下除去SDS而复性，并通过扩散而印迹到硝酸纤维素上。通过选择的限制性内切酶消化感兴趣的基因组DNA区域以产生适当但不同尺寸的片段，随后进行末端标记并使其与分离的蛋白质结合。从每个单独的蛋白质-DNA复合物洗脱特异性结合的DNA并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。已经提出了通过这种技术可以检测到特异性DNA结合蛋白的证据。此外，它们的序列特异性结合允许纯化相应的选择性结合的DNA片段，并且可以改进DNA调节序列的蛋白质介导的克隆。
[0587] Northwestern印迹
[0588] 运行Northwestern印迹包括通过凝胶电泳分离RNA结合蛋白，其将RNA结合蛋白基于其尺寸和电荷进行分离。为了同时分析多个样品，可将单个样品装入琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶(通常为SDS-PAGE)中。凝胶电泳完成后，将凝胶和相关的RNA结合蛋白转移到硝酸纤维素转移纸上。然后将新转移的印迹浸泡在阻断溶液中；非脂乳和牛血清白蛋白是常见的阻断缓冲液。该阻断溶液有助于防止一级和/或二级抗体与硝酸纤维素膜的非特异性结合。一旦阻断溶液与印迹具有足够的接触时间，则施加特定的竞争者RNA并且给定时间在室温下孵育。在此期间，竞争者RNA与印迹上样品中的RNA结合蛋白结合。在这个过程中孵育的时间可以变化，取决于施加的竞争对手RNA的浓度；尽管孵育时间典型地是一个小时。孵育完成后，印迹通常至少洗涤3次，每次洗涤5分钟，以稀释掉溶液中的RNA。常见洗涤缓冲液包括磷酸盐缓冲液(PBS)或10％吐温20溶液。洗涤不当或不足会影响印迹发展的清晰度。一旦洗涤完成，则印迹典型地通过X射线或相似的放射自显影方法显影。
[0589] Northern印迹
[0590] 一般的Northern印迹程序开始于从均质化样品或细胞中提取总RNA。然后通过使用寡(dT)纤维素色谱来分离真核生物mRNA以仅分离具有聚(A)尾部的那些RNA。然后通过凝胶电泳分离RNA样品。由于凝胶是易碎的，并且探针不能进入基质，现在通过毛细管或真空印迹系统将现在按尺寸分离的RNA样品转移到尼龙膜上。具有正电荷的尼龙膜用于Northern印迹最有效，因为带负电荷的核酸对它们具有高亲和力。用于印迹的转移缓冲液通常含有甲酰胺，因为它降低了探针-RNA相互作用的退火温度，因此消除了对可能导致RNA降解的高温的需要。RNA一旦转移到膜上，就会通过紫外线或热量通过共价键固定到膜上。探针被标记后，它与膜上的RNA杂交。可影响杂交效率和特异性的实验条件包括离子强度、粘度、双链体长度、错配碱基对和碱基组成。洗涤该膜以确保探针被特异性结合并防止背景信号产生。然后通过X射线胶片检测杂交物信号，并可通过光密度定量。为了建立northern印迹样品中的比较对照，在通过微阵列或RT-PCR测定后，可以使用不展示感兴趣的基因产物的。
[0591] 酶促
[0592] 描述了接近检测方法，其利用酶促生物素化潜在地使用自动染色平台来检测样品中的靶标。一个公开的实施方案包括使该样品与包括生物素连接酶和结合到第一靶标近侧的第一特异性结合部分的第一缀合物接触；使该样品与包括生物素连接酶底物和结合到第二靶标近侧的第二特异性结合部分的第二缀合物接触；使该样品经受当第一靶标和第二靶标具有接近排列时允许生物素连接酶生物素化生物素连接酶底物的条件；并检测该生物素连接酶底物的生物素化。允许该底物生物素化的条件包括添加生物素和ATP。该方法还可以包括使样品与链霉亲和素-酶缀合物接触。也可以使用信号放大。参见WO 2014139980，其全部内容通过引用并入本文。
[0593] 酶联免疫吸附测定(ELISA)
[0594] 进行ELISA涉及对特定抗原具有特异性的至少一种抗体。将具有未知量抗原的样品非特异性地(通过吸附到表面)或特异性地(通过对相同抗原有特异性的另一种抗体捕获，在“夹心”ELISA中)固定在固体支持物(通常为聚苯乙烯微量滴定板)上。将该抗原固定后，添加检测抗体，与该抗原形成复合物。该检测抗体可以与酶共价连接，或者本身可以通过与酶经生物缀合连接的二级抗体检测。在每一步骤之间，典型地用温和洗涤剂溶液洗涤培养板以去除任何非特异性结合的蛋白质或抗体。在最后的洗涤步骤后，该板是通过添加酶底物产生可视信号来显色，该可视化信号指示样品中抗原的量。
[0595] 配体结合测定
[0596] 分析已知或怀疑含有循环CTC的样品的方法可以包括成像步骤。在一个例子中，成像包括CTC鉴定试剂的成像免疫荧光(例如通过检测与使用的每种抗体相关的标记)。在另一个例子中，成像包括使用多光谱带通滤波器。免疫荧光可以从直接或间接用荧光团标记的抗体发出，或免疫荧光可以通过用经过光谱过滤的可见光激发荧光团而产生。在一个实施方案中，光谱过滤的可见光包括第一选择范围以激发第一荧光团和第二选择范围以激发第二荧光团，其中第一选择范围不显著激发第二荧光团，并且第二选择范围不显著激发第一荧光团。对样品成像可以包括获取由第一选择范围激发的样品的第一免疫荧光图像，并获取由第二选择范围激发的样品的第二免疫荧光图像(并且如果使用超过两种CTC鉴定试剂则获取每个标记的额外免疫荧光图像)并且通过定位或可视化CTC鉴定试剂来定位或鉴定CTC，其可以包括比较或覆盖第一免疫荧光图像和第二免疫荧光图像(如果如此获得的话还有额外图像)。例如，对第一免疫荧光图像进行成像可以鉴定CK+细胞，并且第二免疫荧光图像可以鉴定CD45+细胞，其中比较或覆盖包括鉴定呈CK+和CD45-的细胞。在另一个实施方案中，通过定位CTC鉴定试剂来定位CTC包括使用计算机在算法上分析第一免疫荧光图像和第二免疫荧光图像(如果获得的话还有额外的免疫荧光图像)。在一个实施方案中，算法分析包括数字询问图像以测量细胞尺寸、标记物的细胞区室定位和/或标记物表达强度。参见WO 2013101989，其全部内容通过引用并入本文。
[0597] 免疫沉淀(IP)
[0598] 免疫沉淀(IP)的液相配体结合测定是用于使用来自复合物混合物中的抗体纯化或富集特定蛋白质或蛋白质组的方法。可以将破坏的细胞或样品的提取物与抗感兴趣的抗原的抗体混合，产生抗原-抗体复合物。当抗原浓度低时，抗原-抗体复合物沉淀可能花费数小时甚至数天，并且难以分离形成的少量沉淀。酶联免疫吸附测定(ELISA)或Western印迹是可获得和分析纯化的抗原(或多种抗原)的两种不同方式。此方法涉及通过在固体(珠状)支持物如琼脂糖树脂上附接的抗体的帮助来纯化抗原。经固定的蛋白质复合物可以以单一步骤或连续地完成。IP也可以与生物合成放射性同位素标记结合使用。使用这种技术组合，可以确定特定抗原是由样品还是由细胞合成。
[0599] 染色质免疫沉淀(ChIP)
[0600] 染色质免疫沉淀(ChIP)是一个类型的免疫沉淀实验技术，用于研究细胞中蛋白质和DNA之间的相互作用。目标在于确定特定的蛋白质是否与特定的基因组区域(如启动子或其他DNA结合位点上的转录因子，以及可能定义顺反子的基因组区域)相关联。ChIP目标还在于确定基因组中与各种组蛋白修饰相关联的特定位置，指示组蛋白修饰物的靶标。
[0601] 染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)
[0602] ChIP测序也称为ChIP-seq，是用于分析蛋白质与DNA相互作用的方法。ChIP-seq将染色质免疫沉淀(ChIP)与大规模平行DNA测序组合，以鉴定DNA相关蛋白的结合位点。它可以用于精确地映射针对任何感兴趣的蛋白质的全局结合位点。ChIP-seq主要用于确定转录因子和其他染色质相关蛋白如何影响表型影响机制。确定蛋白质如何与DNA相互作用以调节基因表达对于充分了解许多生物过程和疾病状态是必需的。这种表观遗传信息与基因型和表达分析是互补的。ChIP-seq技术当前主要被视为可以利用杂交阵列的ChIP芯片的替代方案。这必然会引入一些偏差，因为阵列限于固定数目的探针。相比之下，测序被认为偏差较小，但不同测序技术的测序偏差尚未完全了解。与转录因子和其他蛋白质的直接物理相互作用的特定DNA位点可通过染色质免疫沉淀分离。ChIP在体内产生与感兴趣的蛋白质结合的靶DNA位点的文库。大规模平行序列分析与全基因组序列数据库组合使用，以分析任何蛋白质与DNA的相互作用模式，或任何表观遗传染色质修饰的模式。这可以应用于能够ChIP的蛋白质和修饰的集合，如转录因子、聚合酶和转录机制、结构蛋白质、蛋白质修饰和DNA修饰。作为对特定抗体的依赖性的替代，已经开发了不同的方法来找到基因组中所有核小体耗减或核小体破坏的活性调节区的超集，如DNase-Seq和FAIRE-Seq。
[0603] ChIP芯片(ChIP-ChIP)
[0604] ChIP芯片(ChIP-on-chip)(也称为ChIP芯片)是将染色质免疫沉淀(‘ChIP’)与DNA微阵列(“芯片”)组合的技术。与常规ChIP一样，ChIP芯片用于研究蛋白质和DNA在体内的相互作用。确切来说，它允许基于全基因组范围鉴定顺反子，针对DNA结合蛋白的结合位点的总和。可以进行全基因组分析以确定几乎任何感兴趣的蛋白质的结合位点的位置。正如技术的名称所暗示的那样，这些蛋白质通常是在染色质背景下操作的那些。此类的最突出的代表是转录因子，复制相关蛋白，像起源识别复合蛋白(ORC)，组蛋白，它们的变体和组蛋白修饰。ChIP芯片的目标是定位可能有助于鉴定基因组中功能元件的蛋白质结合位点。例如，在转录因子作为感兴趣的蛋白质的情况下，可以确定其在整个基因组中的转录因子结合位点。其他蛋白质允许鉴定启动子区域、增强子、阻遏物和沉默元件、绝缘子、边界元件和控制DNA复制的序列。如果组蛋白是感兴趣的主题，相信修饰的分布及其定位可能为调节机制提供新的见解。设计ChIP芯片的长期目标之一是建立(选定)有机体的目录，列出在各种生理条件下的所有蛋白质-DNA相互作用。此知识最终有助于理解基因调控、细胞增殖和疾病进展背后的机制。因此，ChIP芯片不仅提供了用以补充我们关于核苷酸水平上基因组编排知识的巨大潜力，而且还提供了更高水平的信息和监管，因为它是通过表观遗传学研究而传播的。
[0605] 放射免疫测定
[0606] 放射免疫测定(RIA)是非常敏感的体外测定技术，通过使用抗体来测量抗原浓度(例如血液中的激素水平)。因此，它可以被看作是通过使用相应抗原来定量抗体的放射结合测定的反相。经典地，为了进行放射免疫测定，常常将已知量的抗原通过用附接至酪氨酸的碘的γ-放射性同位素如125-I进行标记来使其具有放射性。然后将这种放射性标记的抗原与已知量的该抗原的抗体混合，并且因此两者彼此特异性结合。然后，添加含有未知数量的相同抗原的患者血清样品。这导致来自该血清的未标记(或“冷”)抗原与放射性标记的抗原(“热”)竞争抗体结合位点。由于“冷”抗原的浓度增加，它更多与抗体结合，置换放射性标记的变体，并降低抗体结合的放射性标记抗原与游离放射性标记的抗原的比率。然后将结合的抗原与未结合的抗原分离，并使用γ计数器测量留在上清液中的结合的抗原的放射性。
[0607] 此方法原则上可以用于任何生物分子，并且不限于血清抗原，也不需要使用测量游离抗原(替代直接测量捕获的抗原)的间接方法。例如，如果放射性标记感兴趣的抗原或靶分子是不希望的或不可能的，如果识别该靶标的两种不同抗体可用并且该靶标足够大(例如，蛋白质)以将多个抗体表位呈递给这些抗体，则进行RIA。一种抗体如上进行放射性标记，而另一种抗体将保持未修饰。该RIA开始于“冷”未标记的抗体被允许与溶液中的靶分子相互作用并结合。优选地，这种未标记的抗体以某种方式被固定，如偶联到琼脂糖珠上，涂覆到表面上等。接下来，“热”放射性标记的抗体被允许与第一抗体-靶分子复合物相互作用。在大量洗涤后，测量结合的放射性抗体的直接量，并通过将其与同时测定的参考量进行比较来定量靶分子的量。此方法原则上与非放射性夹心ELISA方法相似。
[0608] 荧光偏振
[0609] 荧光偏振与荧光各向异性同义。此方法测量荧光标记的配体与受体结合后转速的变化。使用偏振光以激发该配体，并测量发射的光量。发射光的去极化取决于当前配体的尺寸。如果使用小配体，它将具有大的去极化，这将快速地旋转光。如果所用配体的尺寸较大，则所得去极化将会降低。此方法的优点是它可能只包含一个标记步骤。然而，如果在低纳摩尔浓度下使用此方法，结果可能会很精确。
[0610] 福斯特共振能量转移(FRET)
[0611] 福斯特共振能量转移(也称为荧光共振能量转移)利用紧密接近的供体和受体分子(例如供体和受体荧光团，或荧光团和淬灭剂)之间转移的能量。FRET使用荧光标记的配体，像FP。FRET内的能量转移从激发供体开始。供体和受体分子之间的偶极-偶极相互作用将能量从该供体转移到该受体分子。通过检测与入口转移或其不存在相关的荧光光谱，可监测供体和受体的分子之间或中间的相互作用。例如，如果配体与受体-抗体复合物结合，则该受体将发光。该能量转移取决于供体和受体之间的距离，使得转移的存在或不存在指示分子距离。典型地，小于10nm的距离允许受体和供体之间有效的能量转移，尽管可以使用更大或更小的距离，这取决于所涉及的具体分子。
[0612] 表面等离子体共振(SPR)
[0613] 表面等离子体共振(SPR)不需要标记配体。相反，它通过测量偏振光从表面反射的角度(折射率)的变化来工作。角度与质量或具有厚度的层的变化有关，如配体的固定改变共振角，这增加反射光。衍生SPR的装置包括传感器芯片、流动池、光源、棱镜和固定角度位置检测器。
[0614] 过滤器-结合测定
[0615] 过滤器测定是固相配体结合测定，其使用过滤器来测量两个分子之间的亲和力。在过滤器结合测定中，过滤器用于捕获细胞膜(通过吸取介质通过它们)。这种快方法快速发生，其中对于找到的级分可以实现过滤和回收。用缓冲液洗涤过滤器可去除残留的未结合配体和任何其他能够从结合位点洗去的配体。洗涤过滤器时存在的受体-配体复合物不会显著解离，因为它们将被过滤器完全捕获。过滤器的特征对正在进行的每项工作都很重要。较厚的过滤器可用于获得更完全的小细胞膜片回收，但可能需要更长的洗涤时间。建议预处理过滤器以帮助捕获带负电的细胞膜片。将过滤器浸泡在可使过滤器产生表面正电荷的溶液中可吸引带负电的膜碎片。
[0616] 亲和色谱
[0617] 亲和色谱是基于高特异性相互作用(如抗原与抗体，酶与底物或受体与配体之间的相互作用)分离生化混合物的方法。固定相典型地是凝胶基质，通常是琼脂糖；衍生自藻类的线性糖分子。通常，起点是溶液中分子的未定义异质组，如细胞裂解液、生长培养基或血清。感兴趣的分子将具有众所周知的和确定的性质，并且可以在亲和纯化过程中被利用。该过程本身可以被认为是夹带，其中靶分子被捕获在固相或固定相或介质上。流动相中的其他分子不会被捕获，因为它们不具备这种特性。然后可以将固定相从混合物中去除，洗涤并通过称为洗脱的过程从夹带中释放靶分子。可能最常用的亲和色谱用于纯化重组蛋白。
[0618] 免疫亲和性：该程序的另一个用途是从血清中亲和纯化抗体。如果已知血清含有针对特定抗原的抗体(例如，如果血清来自针对有关抗原被免疫的生物体)，则可以将其用于该抗原的亲和纯化。这也被称为免疫亲和色谱。例如，如果生物体针对GST融合蛋白被免疫，它将产生针对该融合蛋白的抗体，并且也可能产生针对GST标签的抗体。然后可将蛋白质共价偶联到固体支持物如琼脂糖上，并用作亲和配体，以纯化来自免疫血清的抗体。为了彻底性，GST蛋白和GST融合蛋白可以各自分别被偶联。血清最初允许与GST亲和基质结合。这将去除针对该融合蛋白的GST部分的抗体。然后将该血清与该固体支持物分离并使其与GST-融合蛋白基质结合。这允许识别被捕获在固体支持物上的抗原的任何抗体。感兴趣的抗体的洗脱通常使用低pH缓冲液如甘氨酸pH 2.8实现。将洗脱液收集到中性Tris或磷酸盐缓冲液中，以中和低pH洗脱缓冲液并暂停抗体活性的任何降解。这是很好的例子，因为亲和纯化用于纯化最初的GST-融合蛋白，从血清中除去不希望的抗GST抗体并纯化靶抗体。通常采用简化策略来纯化针对肽抗原生成的抗体。合成地产生肽抗原时，在肽的N末端或C末端添加末端半胱氨酸残基。此半胱氨酸残基含有巯基官能团，其允许该肽容易地与载体蛋白(例如钥孔戚血蓝蛋白(KLH))缀合。将含半胱氨酸的相同肽也通过半胱氨酸残基固定在琼脂糖树脂上，并且然后用于纯化该抗体。大多数单克隆抗体已经使用基于衍生自细菌的免疫球蛋白特异性蛋白A或蛋白G的亲和色谱来纯化。
[0619] 免疫细胞化学(ICC)
[0620] 免疫细胞化学(ICC)是常用的实验室技术，用于通过使用与其结合的特定一级抗体来在解剖学上可视化细胞中特定蛋白或抗原的定位。一级抗体允许当与具有缀合荧光团的二级抗体结合时在荧光显微镜下可视化该蛋白质。ICC允许研究人员评价特定样品中的细胞是否表达所讨论的抗原。在发现免疫阳性信号的情况下，ICC还允许研究人员确定哪些亚细胞区室正在表达该抗原。有许多方法来获得样品的免疫学检测，包括直接与一级抗体或抗血清相关的那些。直接方法涉及将可检测标签(例如，荧光分子、金粒子等)直接用于抗体，然后允许该抗体与细胞中的抗原(例如，蛋白质)结合。可替代地，还有许多间接方法。在一个此类方法中，该抗原被一级抗体结合，然后通过使用与该一级抗体结合的二级抗体来扩增。接下来，施加含有酶部分的三级试剂并且它与该二级抗体结合。当施加四级试剂或底物时，三级试剂的酶促末端将底物转化成颜料反应产物，其在相同位置产生颜色(许多颜色是可能的：棕色、黑色、红色等)，原始一级抗体识别该感兴趣的抗原。使用的底物(也称为色原体)的一些例子是AEC(3-氨基-9-乙基咔唑)或DAB(3,3'-二氨基联苯胺)。在暴露于必需酶(例如，缀合于抗体试剂的辣根过氧化物酶)后使用这些试剂之一产生阳性免疫反应产物。当像H&E(苏木精和伊红)那样的不太特异的染色剂不能用于要进行的诊断或提供关于治疗的额外预测信息(例如在一些癌症中)时，可以使用感兴趣的特异性抗原的免疫细胞化学可视化。可替代地，该二级抗体可以共价连接到荧光团(FITC和罗丹明是最常见的)，它可以在荧光或共聚焦显微镜中检测到。荧光的位置会根据靶分子、膜蛋白外部和细胞质蛋白内部而变化。以这种方式，当与共聚焦显微镜组合研究蛋白质的定位和动态过程(胞吐、内吞等)时，免疫荧光是一种强大的技术。
[0621] 电泳测定
[0622] 如本领域已知的和如下文进一步描述的，可以利用的示例性电泳测定包括核酸电泳、PAGE、天然凝胶方法、自由流动电泳、IEF、EMSA、RFLP分析和酶谱法，
[0623] 核酸电泳
[0624] 核酸电泳是用于根据尺寸和反应性分离DNA或RNA片段的分析技术。由于核酸链的糖-磷酸骨架的净负电荷，待分析的核酸分子被置于粘性介质即凝胶上，其中电场诱导该核酸向阳极迁移。这些片段的分离是通过利用不同尺寸的分子能够穿过凝胶的迁移率来实现的。更长的分子迁移速度更慢，因为它们在凝胶内经历更多的阻力。由于分子的尺寸影响其流动性，在给定的时间段内，较小的片段比较长的片段最终更接近阳极。在一段时间后，电压被移除并分析分段梯度。为了相似尺寸片段之间更大分开，可以增加电压或运行时间。跨低压凝胶延伸运行产生最准确的分辨率。然而，电压不是决定核酸电泳的唯一因素。
[0625] 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)
[0626] 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)描述了广泛用于生化、法医学、遗传学、分子生物学和生物技术用以根据其电泳迁移率将生物大分子(通常为蛋白质或核酸)分开的一种技术。流动性是分子长度、构象和电荷的函数。
[0627] SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠(SDS)是阴离子洗涤剂，应用于蛋白质样品以将蛋白质线性化并为线性化的蛋白质赋予负电荷。这个过程被称为SDS-PAGE。在大多数蛋白质中，SDS与多肽链的结合使得每单位质量的电荷均匀分布，从而导致在电泳期间通过粗略估计尺寸进行分级。具有更高疏水性内容物的蛋白质，例如许多膜蛋白，以及在其天然环境中与表面活性剂相互作用的那些，由于结合SDS的比率的更大变异性，使用此方法在本质上更难以准确处理。
[0628] 二维凝胶电泳：2-D电泳开始于1-D电泳，但随后将分子以第二特性分离，方向为与第一个方向呈90度。在1-D电泳中，蛋白质(或其他分子)在一个维度上分开，以便所有蛋白质/分子都沿着泳道分布，但是这些分子跨2-D凝胶扩散开。因为两种分子在两种不同特性上不可能相似，所以在2-D电泳中分子分离比在1-D电泳中更有效。使用这种技术分离蛋白质的两个维度可以是等电点、天然状态下的蛋白质复合物质量和蛋白质质量。这个的结果是蛋白质在其表面扩散开的凝胶。然后这些蛋白质可以用多种手段检测，但最常用的染色剂是银和考马斯亮蓝染色。
[0629] 天然凝胶方法
[0630] 天然凝胶，也称为非变性凝胶，分析仍处于折叠状态的蛋白质。因此，电泳迁移率不仅取决于电荷质量比，还取决于蛋白质的物理形状和尺寸。以下是不同形式的天然凝胶方法的例子。
[0631] 透明天然凝胶电泳：CN-PAGE(通常称为天然PAGE)将聚丙烯酰胺梯度凝胶中的酸性水溶性蛋白和膜蛋白分开。它不使用带电染料，因此CN-PAGE中蛋白质的电泳迁移率(与电荷转移技术BN-PAGE相反)与蛋白质的内在电荷相关。迁移距离取决于蛋白质电荷、其尺寸和凝胶的孔径。在许多情况下，这种方法的分辨率比BN-PAGE低，但CN-PAGE每当考马斯染料会干扰进一步的分析技术时都会提供优势，例如它已被描述为用于FRET分析的非常有效的微型分离技术。此外，CN-PAGE比BN-PAGE更温和，因此它可以保留在BN-PAGE条件下解离的膜蛋白复合物的不稳定超分子组装体。
[0632] 蓝色天然PAGE：BN-PAGE是天然PAGE技术，其中考马斯亮蓝染料为蛋白质复合物提供电泳分离所需的电荷。考马斯的缺点是，在与蛋白质结合时，它会像洗涤剂一样使复合物解离。另一缺点是化学发光(例如在随后的western印迹检测或活性测定中)的潜在淬灭或具有辅基(例如亚铁血红素或叶绿素)或用荧光染料标记的蛋白质的荧光。
[0633] 定量制备天然连续聚丙烯酰胺凝胶电泳：QPNC-PAGE或定量制备天然连续聚丙烯酰胺凝胶电泳是应用于生化和生物无机化学的高分辨率技术，通过等电点分离蛋白质。生物学家使用天然凝胶电泳的这种标准化变体来分离生物样品中的活性或天然金属蛋白，并解析在复杂的蛋白质混合物中正确和不正确折叠的含金属辅因子的蛋白质或蛋白质亚型。作为生物医学方法的组学平台，QPNC-PAGE有助于开发用于蛋白质错误折叠疾病的基于金属的药物，并且因此有助于生物经济。
[0634] 自由流动电泳
[0635] 自由流动电泳(FFE)，也称为无载体电泳，是连续电泳和基于液体的分离技术。它典型地用于蛋白质、肽、细胞器、细胞、DNA折纸(DNA origami)和粒子的定量和半定量分离。FFE的优势在于，分离是以快速和温和的基于液体的方式进行的，没有固体基质像凝胶电泳中的聚丙烯酰胺的任何相互作用。这确保了非常高的回收率，因为没有分析物会损失。FFE分离是连续的，这确保了制备应用中分析物的高通量。此外，分离可以在本地或变性条件下进行。在两个板之间导入均匀和层状的液体膜，在平行分级管中分开，并收集在微量滴定板中。高压电场垂直于层流施加。该层流中的分析物是通过电荷密度和等电点分开。
[0636] 等电聚焦
[0637] 等电聚焦(IEF)也称为电聚焦，是将不同分子通过其等电点(pI)差异进行分离的技术。IEF涉及将两性电解质溶液添加到固定的pH梯度(IPG)凝胶中。IPG是与pH梯度共聚的丙烯酰胺凝胶基质，除了最碱性(>12)pH值之外，其导致完全稳定的梯度。固定的pH梯度是通过连续改变固定化电解质(Immobiline)比率获得的。固定化电解质是由其pK值定义的弱酸或碱。处于低于其等电点(pI)的pH区域内的蛋白质将带正电，并且因此会向阴极(带负电的电极)迁移。随着它迁移通过渐增的pH的梯度，蛋白质的总体电荷将减少，直到该蛋白质达到对应于其pI的pH区域。此时它没有净电荷，并且因此迁移停止(因为不存在朝向任一电极的电吸引力)。结果，蛋白质变得集中在锋利的固定带上，每种蛋白质定位在与其pI相对应的pH梯度中的一个点上。该技术能够以极高的分辨率将蛋白质按单个电荷区分，分级为单独的条带。要聚焦的分子分布在具有pH梯度(通常由脂肪族两性电解质建立)的介质上。电流穿过该介质，建立“正”阳极和“负”阴极端。带负电荷的分子朝向“正”端迁移通过介质中的pH梯度，而带正电荷的分子朝向“负”端移动。随着粒子朝向与其电荷相反的极移动，它会移动通过渐变的pH梯度，直到它到达其中达到该分子等电点的pH的点。此时，该分子不再具有净电荷(由于相关官能团的质子化或去质子化)，并且因此再不会在凝胶内进一步行进。在添加感兴趣的粒子之前建立梯度，是通过首先将具有不同pI值的小分子溶液(如聚两性电解质溶液)进行电泳。
[0638] 免疫电泳
[0639] 免疫电泳是基于电泳和与抗体的反应的蛋白质分离和表征的许多生化方法的通用名称。免疫电泳的变体典型地利用免疫球蛋白(也称为抗体)与待分离或表征的蛋白质的反应。琼脂糖，作为在高pH(约8.6)下缓冲的约1mm厚的1％凝胶板，传统上优选用于电泳以及与抗体的反应。选择琼脂糖作为凝胶基质，因为它具有大孔，允许蛋白质自由穿过和分离，但为蛋白质和特异性抗体的免疫沉淀物提供锚定。选择高pH是因为抗体在高pH下几乎不能移动。正常建议使用具有水平冷却板的电泳设备进行电泳。免疫沉淀物可以在湿琼脂糖凝胶中看到，但在干燥的凝胶中用蛋白质染色剂如考马斯亮蓝进行染色。与SDS凝胶电泳不同，琼脂糖电泳允许天然条件，保留所研究蛋白质的天然结构和活性，因此除了电泳分离之外，免疫电泳允许表征酶活性和配体结合等。
[0640] 亲和免疫电泳是基于通过与其他大分子或配体的特异性相互作用或复合物形成的蛋白质电泳模式的变化。亲和免疫电泳已用于估计结合常数(如例如用凝集素)或用于表征具有特定特征(像聚糖含量或配体结合)的蛋白质。亲和免疫电泳的一些变体相似于使用固定的配体的亲和色谱。琼脂糖凝胶中免疫沉淀物的开放结构将允许放射性标记抗体的额外结合以揭示特定蛋白质。此变型已被用于通过与IgE反应鉴定过敏原。
[0641] 电泳迁移率变动测定(EMSA)
[0642] 电泳迁移率变动测定(EMSA)或迁移率变动电泳(也称为凝胶变动测定、凝胶迁移率变动测定、条带变动测定或凝胶阻滞测定)是常见的亲和电泳技术，用于研究蛋白质-DNA或蛋白质-RNA相互作用。此程序可以确定蛋白质或蛋白质混合物是否能够结合至给定的DNA或RNA序列，并且有时可以指示是否超过一个蛋白质分子涉及到结合复合物中。当研究转录起始、DNA复制、DNA修复或RNA加工和成熟时，凝胶移位测定常与DNA酶足迹法、引物延伸和启动子-探针实验在体外同时进行。虽然前体可以在早期的文献中找到，但是大多数当前的测定基于Garner和Revzin以及Fried和Crothers描述的方法。
[0643] 限制性片段长度多态性分析
[0644] RFLP分析从细胞(如血液样品)收集DNA，并用限制酶切成小片。由于不同个体的DNA序列之间的差异，这生成了数千个不同尺寸的DNA片段。然后使用凝胶电泳基于尺寸分离这些片段。然后将分离的片段转移到硝酸纤维素或尼龙过滤器；这个程序称为Southern印迹。印迹内的DNA片段永久固定在过滤器上，并且DNA链变性。然后添加放射性标记的探针分子，其与含有重复序列的基因组中的序列互补。这些重复序列倾向于在不同个体之间长度上变化，并被称为可变数目串联重复序列或VNTR。探针分子与含有重复序列的DNA片段杂交，并将多余的探针分子洗掉。然后将该印迹暴露于X射线胶片。已经与该探针分子结合的DNA片段在膜上表现为黑带。
[0645] 酶谱法
[0646] 酶谱法是基于酶底物库检测水解酶的电泳技术。在凝胶酶谱法中，在标准的非还原性上样缓冲液中制备样品用于SDS-PAGE。不需要还原剂或沸腾，因为这会干扰酶的再折叠。在制备丙烯酰胺凝胶过程中，将合适的底物(通常为明胶或酪蛋白)包埋在分离胶中。电泳后，通过在未缓冲的Triton X-100中孵育，随后在37℃在适当的消化缓冲液中孵育一个时间长度，从凝胶(或酶谱)中除去SDS。酶谱随后被染色(通常用酰胺黑或考马斯亮蓝)，并且消化区域对于底物已经被酶降解的深色染色背景显现为清晰条带。
[0647] 基因表达谱分析
[0648] 可以利用的示例性基因表达谱分析技术包括用PCR、DNA微阵列、SAGE、实时PCR、差异展示PCR和RNA-seq进行DNA谱分析，如在以下部分中进一步描述的和本领域中已知的。
[0649] 用PCR进行的DNA谱分析
[0650] 聚合酶链式反应(PCR)过程模拟DNA复制的生物过程，但将其限制在感兴趣的特定DNA序列中。随着PCR技术的公开，DNA谱分析在识别力量和从非常小的(或降解的)起始样品中恢复信息的能力方面取得了巨大的进步。PCR极大地扩增了DNA特定区域的量。在PCR过程中，DNA样品通过加热而变性成单独的单个多核苷酸链。使用两种寡核苷酸DNA引物与相对DNA链上的两个相应的附近位点杂交，以这种方式使得每种引物的活性末端(即3'末端)的正常酶促延伸朝向另一种引物。PCR使用耐高温的复制酶，如热稳定Taq聚合酶。以这种方式，生成感兴趣序列的两个新拷贝。以这种方式重复变性、杂交和延伸产生数目呈指数级增长的感兴趣DNA的拷贝。执行热循环的仪器现在可易于从商业来源获得。此过程可在2小时或更短的时间内产生所希望区域的百万倍或更多的扩增。
[0651] DNA微阵列
[0652] 微阵列背后的核心原理是两条DNA链之间的杂交，即互补核酸序列通过在互补核苷酸碱基对之间形成氢键而彼此特异性配对的性质。核苷酸序列中的大量互补碱基对意味着两条链之间的非共价键合更紧密。洗去非特异性结合序列后，只有强配对的链会保持杂交。结合至探针序列的荧光标记的靶序列生成信号，取决于杂交条件(如温度)和杂交后洗涤。来自斑点(特征)的信号总强度取决于与该斑点上存在的探针结合的靶样品的量。微阵列使用相对定量，其中将特征的强度与不同条件下相同特征的强度进行比较，并且该特征的身份通过其位置已知。
[0653] 基因表达系列分析(SAGE)
[0654] 基因表达系列分析(SAGE)是分子生物学家使用的一种技术，用以产生感兴趣的样品中信使RNA群体的快照，为小标签形式，其对应于那些转录物的片段。简而言之，SAGE实验如下进行：
[0655] 分离输入样品(例如，肿瘤)的mRNA并使用逆转录酶和生物素化引物来从mRNA合成cDNA。
[0656] 通过与附接至引物上的生物素相互作用将cDNA结合到链霉亲和素珠粒上，并且然后使用称为锚定酶(AE)的限制性内切核酸酶进行切割。切割位点的位置以及因此与珠粒结合的剩余cDNA的长度对于每个单独的cDNA(mRNA)都会有所不同。
[0657] 然后丢弃切割位点下游的切割的cDNA，并将切割位点上游的剩余的不动的cDNA片段分成两半，并按照从附接位点上游的以下顺序暴露于含有几种组分的两种衔接子寡核苷酸(A或B)中的一种：1)具有AE切割位点的粘性末端以允许与切割的cDNA附接；2)称为标签化酶(TE)的限制性内切核酸酶的识别位点，该酶切割其识别位点(在原始cDNA/mRNA序列内)下游约15个核苷酸；3)衔接子A或B特有的短引物序列，稍后将用于通过PCR进一步扩增。
[0658] 在衔接子连接后，使用TE切割cDNA以将它们从珠粒中移除，仅留下原始cDNA的约11个核苷酸(15个核苷酸减去对应于AE识别位点的4个)的短“标签”。
[0659] 然后用DNA聚合酶修复切割的cDNA标签以产生平端cDNA片段。
[0660] 将这些cDNA标签片段(具有附接的衔接子引物和AE和TE识别位点)连接在一起，将两个标签序列夹在一起，并在两端侧接衔接子A和B。然后使用锚A和B特异性引物对这些新构建体(称为双标签)进行PCR扩增。
[0661] 然后使用原始AE切割双标签，并允许将其与其他双标签连接在一起，连接以建立cDNA串联体，每个双标签由AE识别位点分开。
[0662] 然后这些串联体转化为细菌，通过细菌复制进行扩增。
[0663] 然后可以使用现代高通量DNA测序仪分离该cDNA串联体并对其进行测序，并且可以用计算机程序对这些序列进行分析，对单个标签的重现进行定量。
[0664] 实时聚合酶链式反应
[0665] 实时聚合酶链式反应是基于聚合酶链式反应(PCR)的分子生物学实验室技术。它监测PCR过程中靶向DNA分子的扩增，即实时，并且不是如常规PCR那样在末端。实时PCR可以定量(定量实时PCR)、半定量(即高于/低于一定量的DNA分子，半定量实时PCR)或定性(定性实时PCR)使用。在实时PCR中用于检测PCR产物的两种常用方法是：(1)插入任何双链DNA的非特异性荧光染料，和(2)由标记有荧光报告物的寡核苷酸组成的序列特异性DNA探针，该荧光报告物仅在该探针与其互补序列杂交后才允许检测。实时PCR在热循环仪中进行，能够用至少一个特定波长的光束照射每个样品，并检测激发荧光团发出的荧光。热循环仪还能够快速加热和冷冻样品，从而利用核酸和DNA聚合酶的物理化学性质。该PCR过程通常由重复25-50次的一系列温度变化组成。这些循环正常由三个阶段组成：第一，在95℃左右，允许分离双链；第二，在约50℃-60℃的温度下，允许引物与DNA模板结合；第三，在68℃-72℃之间，促进由DNA聚合酶进行的聚合。由于片段尺寸较小，在这种类型的PCR中通常省略最后一步，因为在比对阶段和变性阶段之间的变化期间酶能够增加它们的数目。另外，在四步PCR中，测量每个循环中持续仅几秒的短的温度阶段中的荧光，温度为例如80℃，以减少当使用非特异性染料时由引物二聚体的存在导致的信号。每个循环使用的温度和时间取决于多种参数，如：用于合成DNA的酶，反应中二价离子和脱氧核糖核苷酸(dNTP)的浓度以及引物的结合温度。
[0666] 差异展示PCR
[0667] 差异展示(也称为DDRT-PCR或DD-PCR)是如下的技术，其中研究人员可以比较和鉴定任何一对真核细胞样品之间mRNA水平的基因表达变化。如果需要，该测定可能会扩展到超过一对。成对样品将具有形态、遗传或其他实验差异，为此研究人员渴望研究基因表达模式，希望阐明受实验影响的特定差异或特定基因的根本原因。差异展示的概念是使用有限数目的短的任意引物与锚定的寡聚-dT引物组合来系统地扩增和可视化细胞中的大部分mRNA。在20世纪90年代初公开后，差异展示技术成为在mRNA水平上鉴定差异表达基因的常用技术。已经提出了不同的流线型DD-PCR方案，包括荧光DD方法以及放射性标记，其提供高精度和读出。
[0668] RNA测序(RNA-seq)
[0669] RNA测序(RNA-seq)也被称为全转录组鸟枪测序(WTSS)，是使用新一代测序功能揭示在特定时刻来自基因组的关于RNA存在和数量的快照的技术。
[0670] RNA‘聚(A)’文库RNA-seq：在高通量测序中，序列文库的建立可能会在平台间变化，其中各自都具有设计为构建不同类型的文库并根据其仪器的特定要求调整所得序列的几个试剂盒。然而，由于被分析模板的性质，每种技术内都有共同点。通常，在mRNA分析中，为了确保编码RNA与非编码RNA分开，靶向3'聚腺苷酸化(聚(A))尾。这可以简单地用共价附接至给定底物的聚(T)寡核苷酸完成。目前许多研究利用磁珠进行这一步骤。包括聚(A)RNA外部的转录组的部分的研究已经显示，当使用聚(T)磁珠时，流通RNA(非聚(A)RNA)可以产生在其他情况会被忽视的重要的非编码RNA基因发现。此外，由于核糖体RNA代表给定细胞内超过90％的RNA，研究表明，通过探针杂交除去它增加了从转录组剩余部分检索数据的能力。下一步是逆转录。归因于随机引发的逆转录的5'偏差以及影响引物结合位点的二级结构，在逆转录之前将RNA水解成200-300个核苷酸同时减少了这两个问题。然而，这种方法存在取舍，虽然转录物的整体有效地转化为DNA，但5'和3'末端并非如此。取决于研究的目标，研究人员可能会选择应用或忽略此步骤。
[0671] 小RNA/非编码RNA测序：对mRNA以外的RNA进行测序时，文库制备被修饰。基于所希望的尺寸范围选择细胞RNA。对于小RNA靶标如miRNA，通过尺寸选择来分离RNA。这可以用尺寸排阻凝胶，通过尺寸选择磁珠或用商业开发的试剂盒进行。分离后，接头添加到3'和5'端，然后纯化。最后一步是通过逆转录生成cDNA。
[0672] 直接RNA测序：使用逆转录酶将RNA转化成cDNA已显示引入可能干扰转录物的正确表征和定量的偏差和伪影，Helicos(现在破产)曾开发单分子直接RNA测序(DRSTM)技术。DRSTM以大规模平行方式直接对RNA分子进行测序，不用将RNA转换为cDNA或者其他偏差样品操作如连接和扩增。cDNA合成后，可进一步片段化以达到测序系统所希望的片段长度。
[0673] (蛋白质)质谱
[0674] 蛋白质质谱是指将质谱应用于蛋白质研究。质谱是蛋白质表征的重要新兴方法。电离全蛋白的两个主要方法是电喷射电离(ESI)和基质辅助激光解吸/电离(MALDI)。为了与可用质谱仪的性能和质量范围保持一致，有两种方法用于表征蛋白质。首先，完整的蛋白质通过上述两种技术中的任一种电离，并且然后引入质量分析仪。此方法被称为蛋白质分析的“自上而下”策略。其次，使用蛋白酶(如胰蛋白酶)将蛋白质酶促消化成更小的肽。随后将这些肽引入质谱仪并通过肽质量指纹法或串联质谱法鉴定。因此，这后一种方法(也称为“自下而上”蛋白质组学)使用肽水平的鉴定来推断蛋白质的存在。全蛋白质质量分析主要是使用飞行时间(TOF)MS或傅里叶变换离子回旋共振(FT-ICR)进行的。这两个类型的仪器由于其宽质量范围而在此处是优选的，并且在FT-ICR的情况下，其质量准确度高。蛋白水解肽的质量分析是更受欢迎的蛋白质表征方法，因为可以使用便宜的仪器设计进行表征。另外，整个蛋白质被消化成更小的肽片段后，样品制备更容易。用于肽质量分析的最广泛使用的仪器是MALDI飞行时间仪器，因为它们允许以快节奏采集肽质量指纹(PMF)(1PMF可在大约10秒内分析)。多级四极杆飞行时间和四极离子阱也可用于此应用。
[0675] 质谱CMS越已经来越多地用于生物分析的分析。质谱非常适用于多路复用，因为质量差异允许许多同时检测通道。然而，复杂的生物分子如DNA具有复杂的质谱，并且由于相对较差敏感度，可能难以在基质中检测到。MS是测量带电物质的质荷比的分析技术。它可以用于确定样品或分子的化学组成。通过质谱法分析的样品被电离以生成带电分子或原子，根据其质荷比分离并检测。该技术根据不同的应用来定性和定量使用。电感耦合等离子体(OCP)是一种等离子体源，其中能量由电磁感应产生的电流提供，即通过时变磁场提供。ICP可用作质谱分析的电离源。电感耦合等离子体和质谱的组合被称为ICP-MS。质谱成像(MSI)是一种质谱应用，涉及用空间信息分析化学信息，使得该化学信息可以作为化学图像或图谱可视化。通过生成化学图谱，可以阐明整个样品表面的组成差异。激光烧蚀是通过用激光束照射从固体表面去除材料的过程。激光烧蚀已被用作质谱分析(特别是用于质谱成像)材料采样的手段。根据一个实施方案，用于样品质谱成像的系统包括激光烧蚀取样器、电感耦合等离子体离子发生器、质谱仪和计算机。说明性地，激光烧蚀采样器包括激光器、激光烧蚀室和样品平台，其被配置成使得激光可以照射位于样品平台上的样品以形成烧蚀的样品，其中该激光和该样品平台由计算机协调。该激光烧蚀采样器和电感耦合等离子体离子发生器可操作地连接，使得烧蚀的样品可以从激光烧蚀采样器转移到电感耦合等离子体离子发生器中，从而蒸发、气化、雾化和电离该烧蚀的样品以形成具有质荷比分布的原子离子群体(atomic ion population)。该质谱仪可操作地连接到电感耦合等离子体离子发生器，以便该离子群体可以从该电感耦合等离子体离子发生器转移到该质谱仪，其中该质谱仪根据质荷比分布分离该离子群体，从而生成质荷比数据。该计算机被配置为接受位置输入并与该激光烧蚀采样器通信，以便根据位置输入烧烛该样品，并且该计算机被配置为根据该位置输入将质荷比数据与该样品上的位置相关联。在进一步的说明性实施方案中，该系统进一步包括配置用于确定样品位置的登记系统，由此使得该位置输入与配置了激光进行照射的样品上的位置的自动关系成为可能。在说明性实施方案中，用于多路复用样品LA-ICP-MS测定的组合物包括质量标签和与该质量标签缀合的特异性结合部分。该质量标签包括第一类原子群，它与样品内源的元素有可检测到的区别。在一个实施方案中，该第一类原子群是元素的非内源稳定同位素。在另一个实施方案中，该原子群被配置为胶体粒子。参见WO 2014079802，其全部内容通过引用并入本文。
[0676] 用于检测样品中的靶标的方法涉及使该样品与选择用于识别靶标的酶特异性结合部分缀合物接触。然后使该样品与质量标签前体缀合物(包括质量标签前体和酶底物)、酪胺部分或酪胺衍生物以及任选的接头接触。该质量标签前体缀合物与该酶或与该酶促反应的产物发生反应，产生沉淀的质量标签、共价结合的质量标签或非共价结合的质量标签。使该样品暴露于能量源，其提供足够的能量以从该质量标签生成质量代码。电离后，可以使用检测方法(如质谱)来检测该质量代码。在一些实施方案中，将样品暴露于包括酶特异性结合部分缀合物的第一溶液和包括质量标签前体缀合物的第二溶液。该酶特异性结合部分的酶部分可选自氧化还原酶(例如过氧化物酶)、磷酸酶(例如碱性磷酸酶)、内酰胺酶(例如β-内酰胺酶)和半乳糖苷酶(例如β-D-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶)。特异性结合部分可以选自蛋白质、多肽、寡肽、肽、核酸、DNA、RNA、寡糖、多糖及其单体。具体公开的实施方案涉及使用碱性磷酸酶-抗体缀合物和辣根过氧化物酶-抗体缀合物。在一些公开的实施方案中，特异性结合部分识别该靶标。在其他公开的实施方案中，该特异性结合部分识别与靶标结合的一级抗体。在一些实施方案中，沉积质量标签包括将酶固定在靶标上，并使该样品与酶底物部分和质量标签前体接触。该酶底物部分与该酶和该质量标签前体反应，并在靶标上产生并沉积质量标签。当样品中存在两个或更多个靶标时，如上所述，质量标签按顺序沉积在每个靶标处。沉积质量标签后，相应的酶将失活，之后在随后的靶标上沉积后续质量标签。
在其他公开的实施方案中，该酶与该质量标签前体-酪胺缀合物或质量标签前体-酪胺衍生物缀合物反应以沉积(典型地共价地)接近该靶标的质量标签。在一些实施方案中，将酶固定在靶标上包括使该样品与包括特异性结合部分和酶的缀合物接触。在某些实施方案中，该特异性结合部分是抗体。该特异性结合部分能够识别并直接结合靶标或结合先前结合到该靶标的另一特异性结合部分。在具体的实施方案中，第一种酶、第二种酶和任何额外的酶是相同的。参见WO 2012003478，其全部内容通过引用并入本文。
在其他公开的实施方案中，该酶与该质量标签前体-酪胺缀合物或质量标签前体-酪胺衍生物缀合物反应以沉积(典型地共价地)接近该靶标的质量标签。在一些实施方案中，将酶固定在靶标上包括使该样品与包括特异性结合部分和酶的缀合物接触。在某些实施方案中，该特异性结合部分是抗体。该特异性结合部分能够识别并直接结合靶标或结合先前结合到该靶标的另一特异性结合部分。在具体的实施方案中，第一种酶、第二种酶和任何额外的酶是相同的。参见WO 2012003478，其全部内容通过引用并入本文。
[0677] DNA甲基化检测
[0678] 最近，已经提出通过测量DNA甲基化来诊断癌症的方法。DNA甲基化主要发生在特定基因的启动子区域的CpG岛的胞嘧啶上，以干扰转录因子的结合，从而使该基因的表达沉默。因此，检测肿瘤抑制基因的启动子中CpG岛的甲基化极大地有助于癌症研究。最近，通过方法如甲基化特异性PCR(以下称为MSP)或自动DNA测序来诊断和筛选癌症，已经积极地尝试确定启动子甲基化。参见WO 2009069984A2，其全部内容通过引用并入本文。
[0679] 声能
[0680] 至少一些实施方案针对用于分析样本的方法和系统。可以基于样本的性质来分析该样本。这些性质包括声学性质、机械性质、光学性质等，在加工过程中可能是静态的或动态的。在一些实施方案中，在加工过程中连续或周期性地监测样本的性质以评价样本的状态和状况。基于获得的信息，可以控制加工以提高加工一致性，减少加工时间，改进加工质量等。声学可用于分析软物体，如样品。当声学信号与样品相互作用时，传输的信号取决于该样品的几种机械性质，如弹性和坚硬度。随着放入固定剂(例如，福尔马林)中的样品变得更大量交联，传输速度将根据该样品的性质而变化。在一些实施方案中，可以基于声波的飞行时间来监测生物样品的状态。该状态可以是密度状态、固定状态、染色状态等。监测可包括(不限于)测量样品密度、交联、脱钙、染色着色等的变化。该生物样品可以是非流体样品，如骨头或其他类型的样品。在一些实施方案中，方法和系统针对使用声能来监测样本。基于反射和/或透射模式中的声能之间的相互作用，可以获得关于该样本的信息。可以采取声学测量。测量的例子包括声学信号振幅、衰减、散射、吸收、样本中的飞行时间(TOF)、声波的相移或其组合。在一些实施方案中，该样本具有在加工期间变化的性质。在一些实施方案中，固定剂被施加到该样本。随着样本变得更加固定，机械性质(例如，弹性、硬度等)由于分子交联而变化。可以使用通过TOF进行的声速测量来监测这些变化。基于该测量，可以确定该样本的固定状态或其他组织学状态。为了避免固定不足或过度固定，可以监测该样品的静态特征、该样品的动态特征或两者。该样品的特征包括透射特征、反射特征、吸收特征、衰减特征等。在某些实施方案中，用于评价样品的方法包括在样品加工之前、期间和/或之后分析声波速度。这是通过如下来完成的，即通过将来自发射器的声波递送至取自受试者的样品，首先建立新的未固定样品的基线测量。使用接收器来检测基线TOF声波。在加工样品之后或期间，第二声波从发射器递送到该样品。在第二声波已经穿过该样品后使用接收器检测第二TOF声波。基于第一TOF和第二TOF比较样品中的声速，以确定速度变化。这些测量对于分析的每个样品来说都是独特的，并且因此可用于为每个样品建立基线。额外的TOF测量可用于确定归因于介质、测量通道等的TOF贡献。在一些实施方案中，当没有样本存在时测量该介质的TOF以确定该介质的基线TOF。参见WO 2011109769，其全部内容通过引用并入本文。
[0681] 脂质组学
[0682] 脂质组学研究涉及数千个细胞脂质分子种类及其与其他脂质、蛋白质和其他代谢物的相互作用的鉴定和定量。脂质组学研究人员检查细胞脂质的结构、功能、相互作用和动力学以及扰动该系统过程中发生的变化。脂质组学分析技术可以包括质谱(MS)、核磁共振(NMR)光谱、荧光光谱、双极化干涉测量和计算方法。在脂质组学研究中，定量描述不同脂质分子种类的含量和组成的空间和时间变化的数据是在通过其生理或病理学状态的变化扰乱细胞之后累积的。从这些研究中获得的信息促进了对细胞功能变化的机制性认识。
[0683] 免疫细胞的定量
[0684] 样品中的免疫细胞定量可以通过使用基于表观遗传学的定量实时PCR辅助细胞计数(qPACC)进行。活跃表达的基因或沉默基因的染色质结构的甲基化状态是基于表观遗传学的细胞鉴定和定量技术的基础。在二核苷酸胞嘧啶磷酸鸟嘌呤中从胞嘧啶碱基的5'-碳细胞类型特异性去除甲基基团(去甲基化)的发现允许从仅少量人血液或组织样品中精确和稳健地定量免疫细胞。位于基因组DNA上的这些表观遗传生物标记物与感兴趣的细胞稳定地关联。Kleen and Yuan(November 2015).“Quantitative real-time PCR assisted cell counting(qPACC)for epigenetic-based immune cell quantification in blood and tissue”.J.Immunother.Cancer 46(3).
[0685] 癌症相关标记物的检测
[0686] 使用如但不限于RNA、DNA或蛋白质测序的技术检测“肿瘤标记物”，包括但不限于蛋白质、抗原、酶、激素、DNA突变和与癌症存在相关的碳水化合物，对于正确诊断癌症类型和选择适当的治疗方法非常重要。此类标记物包括但不限于α甲胎蛋白(通常与(但不限于)生殖细胞肿瘤和肝细胞癌相关)，CA 15-3(通常与(但不限于)乳腺癌相关)，CA27-29(通常与(但不限于)乳腺癌相关)，CA19-9(通常与(但不限于)胰腺癌、结肠直肠癌和其他类型的胃肠癌相关)，CA-125(通常与(但不限于)卵巢癌、子宫内膜癌、输卵管癌症、肺癌、乳腺癌和胃肠癌相关)，降钙素(通常与(但不限于)甲状腺髓样癌相关)，钙网膜蛋白(通常与(但不限于)间皮瘤、性索-性腺间质瘤、肾上腺皮质癌、滑膜肉瘤相关)，癌胚抗原(通常与(但不限于)胃肠癌、宫颈癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、泌尿道癌相关)，CD34(通常与(但不限于)血管外皮细胞瘤/孤立性纤维瘤、多形脂肪瘤、胃肠道间质瘤、皮肤纤维肉瘤相关)，CD99MIC 2(通常与(但不限于)Ewing肉瘤、原始神经外胚层肿瘤、血管外皮细胞瘤/孤立性纤维瘤、滑膜肉瘤、淋巴瘤、白血病、性索-性腺间质瘤相关)，CD117(通常与(但不限于)胃肠道间质瘤、肥大细胞增多症、精原细胞瘤相关)，嗜铬粒蛋白(通常与(但不限于)神经内分泌肿瘤相关)，染色体3、7、17和9p21(通常与(但不限于)膀胱癌相关)，各种类型的细胞角蛋白(通常与(但不限于)许多类型的癌和某些类型的肉瘤相关)，肌间线蛋白(通常与(但不限于)平滑肌肉瘤、骨骼肌肉瘤和子宫内膜间质肉瘤相关)，上皮膜抗原(通常与(但不限于)各种类型的癌、脑膜瘤和一些类型的肉瘤相关)，因子VIII/CD31FL1(通常与(但不限于)血管肉瘤相关)，胶质原纤维酸性蛋白(通常与(但不限于)神经胶质瘤(星形细胞瘤、室管膜瘤)相关)，粗囊性病变液蛋白质(通常与(但不限于)乳腺癌、卵巢癌和唾液腺癌相关)，HMB-45(通常与(但不限于)黑素瘤、PEComa(例如血管肌脂瘤)、透明细胞癌、肾上腺皮质癌相关)，人类绒毛膜促性腺激素(通常与(但不限于)妊娠滋养细胞疾病、生殖细胞肿瘤和绒毛膜癌相关)，免疫球蛋白(通常与(但不限于)淋巴瘤、白血病相关)，抑制素(通常与(但不限于)性索-性腺间质瘤、肾上腺皮质癌、血管母细胞瘤相关)，各种类型的角蛋白(通常与(但不限于)癌、某些类型的肉瘤相关)，各种类型的淋巴细胞标记物(通常与(但不限于)淋巴瘤、白血病相关)，MART-1(Melan-A)(通常与(但不限于)黑素瘤、产类固醇肿瘤(肾上腺皮质癌、性腺肿瘤)相关)，Myo D1(通常与(但不限于)横纹肌肉瘤、小圆蓝细胞瘤)相关)，肌肉特异性肌动蛋白(MSA)(通常与(但不限于)肌肉瘤(平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤)相关)，神经丝(通常与(但不限于)神经内分泌肿瘤、肺小细胞癌相关)，神经元特异性烯醇酶(通常与(但不限于)神经内分泌肿瘤、肺小细胞癌、乳腺癌相关)，胎盘碱性磷酸酶(PLAP)(通常与(但不限于)精原细胞瘤、无性细胞瘤、胚胎性癌相关)，前列腺特异性抗原(通常与(但不限于)前列腺癌相关)，PTPRC(CD45)(通常与(但不限于)淋巴瘤、白血病、组织细胞瘤相关)，S100蛋白(通常与(但不限于)黑素瘤、肉瘤(神经肉瘤、脂肪瘤、软骨肉瘤)、星形细胞瘤、胃肠道间质瘤、唾液腺癌、某些类型的腺癌、组织细胞瘤(树突细胞、巨噬细胞)相关)，平滑肌肌动蛋白(SMA)(通常与(但不限于)胃肠道间质瘤、平滑肌肉瘤、PEComa相关)，突触素(通常与(但不限于)神经内分泌肿瘤相关)，甲状腺球蛋白(通常与(但不限于)甲状腺癌术后标记物相关)，甲状腺转录因子-1(通常与(但不限于)所有类型的甲状腺癌、肺癌相关)，肿瘤M2-PK(通常与(但不限于)结肠直肠癌、乳腺癌、肾细胞癌、肺癌、胰腺癌、食管癌、胃癌、宫颈癌、卵巢癌相关)，波形蛋白(通常与(但不限于)肉瘤、肾细胞癌、子宫内膜癌、肺癌、淋巴瘤、白血病、黑素瘤相关)，ALK基因重排(通常与(但不限于)非小细胞肺癌和间变性大细胞淋巴瘤相关)，β-2-微球蛋白(B2M)(通常与(但不限于)多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病和一些淋巴瘤相关)，β-人绒毛膜促性腺激素(β-hCG)(通常与(但不限于)绒毛膜癌和生殖细胞肿瘤相关)，BRCA1和BRCA2基因突变(通常与(但不限于)卵巢癌相关)，BCR-ABL融合基因(费城染色体)(通常与(但不限于)慢性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病和急性骨髓性白血病相关)，BRAF V600突变(通常与(但不限于)皮肤黑素瘤和结肠直肠癌相关)，CD20(通常与(但不限于)非霍奇金淋巴瘤相关)，嗜铬粒蛋白A(CgA)(通常与(但不限于)神经内分泌肿瘤相关)，上皮来源的循环肿瘤细胞 (通常与(但不限于)转移性乳腺癌、前列腺癌和结肠直肠癌相关)，细胞角蛋白片段21-1(通常与(但不限于)肺癌相关)，EGFR基因突变分析(通常与(但不限于)非小细胞肺癌相关)，雌激素受体(ER)/孕酮受体(PR)(通常与(但不限于)乳腺癌相关)，HE4(通常与(但不限于)卵巢癌相关)，KRAS基因突变分析(通常与(但不限于)结肠直肠癌和非小细胞肺癌相关)，乳酸脱氢酶(通常与(但不限于)生殖细胞肿瘤、淋巴瘤、白血病、黑素瘤和成神经细胞瘤相关)，神经元特异性烯醇酶(NSE)(通常与(但不限于)小细胞肺癌和神经母细胞瘤相关)，核基质蛋白22(通常与(但不限于)膀胱癌相关)，程序性死亡配体1(PD-L1)(通常与(但不限于)非小细胞肺癌相关)、尿激酶纤溶酶原活化剂(uPA)和纤溶酶原活化剂抑制剂(PAI-1)(通常与(但不限于)乳腺癌相关)，5-蛋白质签名 (通常与
(但不限于)卵巢癌相关)，21-基因签名(Oncotype )(通常与乳腺癌相关)，70-基因签名 (通常与(但不限于)乳腺癌相关)和HER2/neu基因扩增或过度表达
(通常与(但不限于)乳腺癌、卵巢癌、胃食管连接部腺癌、胃癌、非小细胞肺癌和子宫癌相关)。与肿瘤相关的另外的生物标记物可包括但不限于PI3KCA突变，FGFR2扩增，p53突变，BRCA突变，CCND1扩增，MAP2K4突变，ATR突变或其表达与特定癌症相关的任何其他生物标记物；以下项中的任何一个：AFP、ALK、BCR-ABL、BRCA1/BRCA2、BRAF、V600E、Ca-125、CA19.9、EGFR、Her-2、KIT、PSA、S100、KRAS、ER/Pr、UGT1A1、CD30、CD20、F1P1L1-PDGRFa、PDGFR、TMPT和TMPRSS2；或选自以下项的至少一种生物标记物：ABCB5，AFP-L3，α-甲胎蛋白，α-甲基酰基CoA消旋酶，BRCA1，BRCA2，CA 15-3，CA 242，Ca 27-29，CA-125，CA15-3，CA19-9，降钙素，癌胚抗原，癌胚抗原肽1，脱-γ羧基凝血酶原，肌间线蛋白，早期前列腺癌抗原-2，雌激素受体，纤维蛋白降解产物，葡萄糖-6-磷酸异构酶，HPV抗原如vE6、E7、L1、L2或p16INK4a，人绒毛膜促性腺激素，IL-6，角蛋白19，乳酸脱氢酶，亮氨酰氨基肽酶，促脂素，变肾上腺素类物质，脑啡肽酶，NMP22，去甲变肾上腺素，PCA3，前列腺特异性抗原，前列腺酸性磷酸酶，突触素，甲状腺球蛋白，TNF，选自以下项的转录因子：ERG、ETV1(ER81)、FLI1、ETS1、ETS2、ELK1、ETV6(TEL1)、ETV7(TEL2)、GABPa、ELF1、ETV4(E1AF；PEA3)、ETV5(ERM)、ERF、PEA3/E1AF、PU.1、ESE1/ESX、SAP1(ELK4)、ETV3(METS)、EWS/FLI1、ESE1、ESE2(ELF5)、ESE3、PDEF、NET(ELK3；SAP2)、NERF(ELF2)或FEV，肿瘤相关糖蛋白72，c-kit，SCF，pAKT，pc-kit以及波形蛋白。可替代地或另外，感兴趣的生物标记物可以是免疫检查点抑制剂，例如但不限于CTLA-
4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、KIR、TIM3、GAL9、GITR、LAG3、VISTA、KIR、2B4、TRPO2、CD160、CGEN-15049、CHK 1、CHK2、A2aR、TL1A和B-7家族配体或其组合，或是选自下组的检查点蛋白的配体，该组由以下各项组成：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK1、CHK2、A2aR、B-7家族配体或其组合。另外的标记物可包括但不限于与以下项相关的至少一种生物标记物的检测：急性淋巴细胞白血病(etv6、am11、亲环蛋白b)、B细胞淋巴瘤(Ig-独特型)、神经胶质瘤(E-钙粘蛋白、α-连环蛋白、β-连环蛋白、γ-连环蛋白、p120ctn)、膀胱癌(p21ras)、胆管癌(p21ras)、乳腺癌(MUC家族、HER2/neu、c-erbB-2)、宫颈癌(p53、p21ras)、结肠癌(p21ras、HER2/neu、c-erbB-2、MUC家族)、结肠直肠癌(结肠直肠相关抗原(CRC)-C017-1A/GA733、APC)、绒毛膜癌(CEA)、上皮细胞癌(亲环蛋白b)、胃癌(HER2/neu、c-erbB-2、ga733糖蛋白)、肝细胞癌(α-甲胎蛋白)、霍奇金淋巴瘤(Imp-1、EBNA-1)、肺癌(CEA、MAGE-3、NY-ESO-1)、淋巴样细胞衍生的白血病(亲环蛋白b)、黑素瘤(p5蛋白、gp75、癌胚抗原、GM2和GD2神经节苷脂、Melan-A/MART-1、cdc27、MAGE-3、p21ras、gp100.sup.Pmel117)、骨髓瘤(MUC家族、p21ras)、非小细胞肺癌(HER2/neu、c-erbB-2)、鼻咽癌(Imp-1、EBNA-1)、卵巢癌(MUC家族、HER2/neu、c-erbB-2)、前列腺癌(前列腺特异性抗原(PSA)及其抗原表位PSA-1、PSA-2和PSA-3，PSMA，HER2/neu，c-erbB-2，ga733糖蛋白)、肾癌(HER2/neu、c-erbB-2)、子宫颈和食道的鳞状细胞癌(病毒产物，如人类乳头瘤病毒蛋白)、睾丸癌(NY-ESO-1)和/或T细胞白血病(HTLV-1表位)。
(但不限于)卵巢癌相关)，21-基因签名(Oncotype )(通常与乳腺癌相关)，70-基因签名 (通常与(但不限于)乳腺癌相关)和HER2/neu基因扩增或过度表达
(通常与(但不限于)乳腺癌、卵巢癌、胃食管连接部腺癌、胃癌、非小细胞肺癌和子宫癌相关)。与肿瘤相关的另外的生物标记物可包括但不限于PI3KCA突变，FGFR2扩增，p53突变，BRCA突变，CCND1扩增，MAP2K4突变，ATR突变或其表达与特定癌症相关的任何其他生物标记物；以下项中的任何一个：AFP、ALK、BCR-ABL、BRCA1/BRCA2、BRAF、V600E、Ca-125、CA19.9、EGFR、Her-2、KIT、PSA、S100、KRAS、ER/Pr、UGT1A1、CD30、CD20、F1P1L1-PDGRFa、PDGFR、TMPT和TMPRSS2；或选自以下项的至少一种生物标记物：ABCB5，AFP-L3，α-甲胎蛋白，α-甲基酰基CoA消旋酶，BRCA1，BRCA2，CA 15-3，CA 242，Ca 27-29，CA-125，CA15-3，CA19-9，降钙素，癌胚抗原，癌胚抗原肽1，脱-γ羧基凝血酶原，肌间线蛋白，早期前列腺癌抗原-2，雌激素受体，纤维蛋白降解产物，葡萄糖-6-磷酸异构酶，HPV抗原如vE6、E7、L1、L2或p16INK4a，人绒毛膜促性腺激素，IL-6，角蛋白19，乳酸脱氢酶，亮氨酰氨基肽酶，促脂素，变肾上腺素类物质，脑啡肽酶，NMP22，去甲变肾上腺素，PCA3，前列腺特异性抗原，前列腺酸性磷酸酶，突触素，甲状腺球蛋白，TNF，选自以下项的转录因子：ERG、ETV1(ER81)、FLI1、ETS1、ETS2、ELK1、ETV6(TEL1)、ETV7(TEL2)、GABPa、ELF1、ETV4(E1AF；PEA3)、ETV5(ERM)、ERF、PEA3/E1AF、PU.1、ESE1/ESX、SAP1(ELK4)、ETV3(METS)、EWS/FLI1、ESE1、ESE2(ELF5)、ESE3、PDEF、NET(ELK3；SAP2)、NERF(ELF2)或FEV，肿瘤相关糖蛋白72，c-kit，SCF，pAKT，pc-kit以及波形蛋白。可替代地或另外，感兴趣的生物标记物可以是免疫检查点抑制剂，例如但不限于CTLA-
4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、KIR、TIM3、GAL9、GITR、LAG3、VISTA、KIR、2B4、TRPO2、CD160、CGEN-15049、CHK 1、CHK2、A2aR、TL1A和B-7家族配体或其组合，或是选自下组的检查点蛋白的配体，该组由以下各项组成：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK1、CHK2、A2aR、B-7家族配体或其组合。另外的标记物可包括但不限于与以下项相关的至少一种生物标记物的检测：急性淋巴细胞白血病(etv6、am11、亲环蛋白b)、B细胞淋巴瘤(Ig-独特型)、神经胶质瘤(E-钙粘蛋白、α-连环蛋白、β-连环蛋白、γ-连环蛋白、p120ctn)、膀胱癌(p21ras)、胆管癌(p21ras)、乳腺癌(MUC家族、HER2/neu、c-erbB-2)、宫颈癌(p53、p21ras)、结肠癌(p21ras、HER2/neu、c-erbB-2、MUC家族)、结肠直肠癌(结肠直肠相关抗原(CRC)-C017-1A/GA733、APC)、绒毛膜癌(CEA)、上皮细胞癌(亲环蛋白b)、胃癌(HER2/neu、c-erbB-2、ga733糖蛋白)、肝细胞癌(α-甲胎蛋白)、霍奇金淋巴瘤(Imp-1、EBNA-1)、肺癌(CEA、MAGE-3、NY-ESO-1)、淋巴样细胞衍生的白血病(亲环蛋白b)、黑素瘤(p5蛋白、gp75、癌胚抗原、GM2和GD2神经节苷脂、Melan-A/MART-1、cdc27、MAGE-3、p21ras、gp100.sup.Pmel117)、骨髓瘤(MUC家族、p21ras)、非小细胞肺癌(HER2/neu、c-erbB-2)、鼻咽癌(Imp-1、EBNA-1)、卵巢癌(MUC家族、HER2/neu、c-erbB-2)、前列腺癌(前列腺特异性抗原(PSA)及其抗原表位PSA-1、PSA-2和PSA-3，PSMA，HER2/neu，c-erbB-2，ga733糖蛋白)、肾癌(HER2/neu、c-erbB-2)、子宫颈和食道的鳞状细胞癌(病毒产物，如人类乳头瘤病毒蛋白)、睾丸癌(NY-ESO-1)和/或T细胞白血病(HTLV-1表位)。
[0687] 现在已知精确靶向激酶级联的特定方面为疾病治疗提供了以前无法实现的突破。蛋白激酶家族的重要性由激酶活性失调引起的许多疾病状态所强调。这些蛋白质和脂质激酶中许多进行的异常细胞信号传导可导致疾病，如癌症。已知几种蛋白质丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸激酶在癌细胞中被活化并驱动肿瘤生长和进展。本文描述的技术提供了利用一种或多种激酶捕获剂来富集(或分离)激酶(例如ATP依赖性激酶)的方法。激酶捕获剂的例子包括但不限于相对非选择性蛋白激酶抑制剂、底物或假底物。该方法是有用的，例如，通过串联质谱用于蛋白激酶组的谱分析。尽管之前已经鉴定了许多高度选择性和有效的小分子激酶抑制剂，如上文所述，但也已经鉴定了大量相对非选择性的小分子激酶抑制剂。对于本文所述的方法，使用相对非选择性的小分子激酶抑制剂减少了对调整用于单个激酶的纯化程序的需要，并且放大了通过富集仅在催化浓度下正常存在于细胞、组织和体液中的酶而获得的分析信号。然而，将认识到选择性小分子激酶抑制剂也可用于这些激酶分析方法。另外，非选择性和选择性小分子激酶抑制剂的组合可用于这些方法中。此外，激酶捕获剂(或超过一种激酶捕获剂)也可与磷酸酶捕获剂组合以同时富集(或分离)激酶和磷酸酶。本文所述的方法还可以应用于通过串联质谱法从单个或多个样本对蛋白激酶和/或磷酸酶进行多路复用分析。本文描述的技术提供了用于分析激酶(如蛋白激酶组)群体的方法。该方法涉及使用一种或多种激酶捕获剂从样品中分离激酶，将蛋白质样品蛋白质消化成成分肽(例如用蛋白酶如胰蛋白酶)，用涉及含有易切断天冬氨酸-脯氨酸(DP)键的特定蛋白激酶肽序列的合理设计的校准物肽补充获得的肽，并通过串联质谱法定量衍生自该激酶群体的天然肽。也描述了使用含有易裂解DP键的等比重肽标签对多个样品中的蛋白质和脂质激酶的相对丰度进行谱分析的策略。本领域技术人员将认识到，可以应用相似的方法来分析磷酸酶或者激酶和磷酸酶的组合。参见WO 2007131191，其全部内容通过引用并入本文。
[0688] 特定细胞类型的亲和纯化
[0689] 现在已经在包括AML、CML、多发性骨髓瘤、脑肿瘤、乳腺肿瘤、黑素瘤和前列腺癌、结肠癌和胃癌在内的多种人类肿瘤中报道了推定循环肿瘤细胞。原则上，循环肿瘤细胞可以通过几种实验策略来鉴定。许多循环肿瘤细胞显现表达鉴定其正常对应物的细胞表面标记物。此观察提供了利用基于流式细胞术的细胞分选或基于微珠的细胞亲和纯化的相对简单的富集程序。参见Schawb,M.Encyclopedia of Cancer,3rd edition,Springer-Verlag Berlin Heidelberg,2011。
[0690] DNA测序
[0691] 在另外的示例性实施方案中，样品或其一个或多个细胞可以进行DNA测序。DNA测序可以被靶向至例如特定基因、区域、调节序列、内含子、外显子、SNP、潜在融合体等，例如以检测与癌症相关的序列或与其诊断相关的序列。DNA测序也可以在整个基因组或其重要部分进行。可以利用的示例性测序方法包括但不限于Sanger测序和染料-终止子测序以及新一代测序(NGS)技术，如焦磷酸测序、纳米孔测序、基于微孔的测序、纳米球测序、MPSS、SOLID、Solexa、Ion Torrent、Starlite、SMRT、tSMS、合成测序、连接测序、质谱测序、聚合酶测序、RNA聚合酶(RNAP)测序、基于显微镜检查的测序、微流Sanger测序、基于显微镜检查的测序、RNAP测序、隧道电流DNA测序(tunnelling currents DNA sequencing)和体外病毒测序。参见WO 2014144478、WO 2015058093、WO 2014106076和WO 2013068528，其全部内容各自通过引用并入本文。
[0692] DNA测序技术已呈指数级前进。最近，高通量测序(或新一代测序)技术将测序过程平行化，一次生成数千或数百万个序列。在超高通量测序中，多达500,000个测序合成操作可以平行运行。新一代测序降低了成本，并大大提高了行业标准染料-终止子方法的速度。
[0693] 焦磷酸测序扩增油溶液(乳液PCR)中水滴内的DNA，每滴含有附接至单一引物涂覆的珠粒的单一DNA模板，然后形成克隆集落。测序仪含有许多皮升容积的孔，每个孔含有单一珠粒和测序酶。焦磷酸测序使用萤光素酶来生成光用以检测添加到新生DNA中的单个核苷酸，并且使用组合的数据来生成序列读出。参见Margulies,M et al.2005,Nature,437,376-380，其全部内容通过引用并入本文。焦磷酸测序是合成测序技术，其也利用焦磷酸测序技术。DNA的焦磷酸测序涉及两个步骤。在第一步，DNA被剪切为约300-800个碱基对的片段，并且这些片段以平端结束。然后将寡核苷酸适配子连接到这些片段的末端。该适配子充当片段扩增以及测序的引物。例如使用含有5'生物素标签的适配子B，可以将该片段附接至DNA捕获珠粒上，例如链霉亲和素涂覆的珠粒上。将附接于珠粒上的片段在水包油乳液滴内进行PCR扩增。结果是在各珠粒上的克隆扩增的DNA片段的多个拷贝。在第二步中，在孔(皮升尺寸的)中捕获这些珠粒。对每一DNA片段平行进行焦磷酸测序。添加一个或多个核苷酸生成光信号，该光信号在测序仪器中被CCD摄像机记录到。信号强度与掺入的核苷酸的数目成比例。焦磷酸测序利用了在核苷酸添加时释放的焦磷酸根(PPi)。PPi在腺苷5'磷酸硫酸盐存在下被ATP硫酸化酶转化为ATP。荧光素酶使用ATP将荧光素转化为氧化荧光素，并且此反应产生光，检测这个光并且加以分析。在另一个实施方案中，使用焦磷酸测序来测量基因表达。RNA的焦磷酸测序应用相似于DNA的焦磷酸测序，并且通过将部分rRNA基因测列的应用附接到微观珠粒上，并且然后将附接物放入单独的孔中来完成。然后扩增附接的部分rRNA序列以确定基因表达谱。Sharon Marsh, Protocols in Methods
in Molecular Biology,Vol.373,15-23(2007).
in Molecular Biology,Vol.373,15-23(2007).
[0694] 可以在所提供的公开文本的方法中使用的测序技术的另一个例子是纳米孔测序(Soni G V and Meller,AClin Chem 53:1996-2001,2007，其全部内容通过引用并入本文)。纳米孔是一个小孔，其级别为直径1纳米。将纳米孔浸入导电流体中并且横跨其施加电位，因离子传导通过纳米孔而产生微小电流。流动的电流量对于纳米孔的大小是敏感的。在DNA分子穿过纳米孔时，在DNA分子上的每个核苷酸以不同程度阻塞纳米孔。因此，随着DNA分子穿过纳米孔，穿过纳米孔的电流的变化代表DNA序列的读数。参见Bayley,Clin Chem.2015Jan；61(1):25-31，其全部内容通过引用并入本文。
[0695] 可用于所提供的公开内容的方法中的DNA和RNA检测技术的另一个例子是SOLiD TM技术(应用生物系统公司(Applied Biosystems))。SOLiDTM技术系统是基于连接的测序技术，可用于对DNA和RNA进行大规模并行的新一代测序。在DNA SOLiDTM测序中，将基因组DNA剪切成片段，并且将适配子附接于片段的5'端和3'端以产生片段文库。可替代地，可以通过将适配子连接到这些片段的5'和3'端上，分发这些片段，消化这些分发的片段以产生内部适配子，以及将适配子附接到生成的片段的5'和3'端上以产生配对库，来引入内部适配子。接下来，在含有珠粒、引物、模板、和PCR组分的微反应器中制备克隆珠群。继PCR之后，将模板变性并且富集珠粒以分离具有已扩增的模板的珠粒。对选出的珠粒上的模板进行3'修饰，以允许结合到载玻片上。通过顺序杂交和连接部分随机寡核苷酸与通过特定荧光团的鉴定的中央确定的碱基(或碱基对)，可以确定该序列。在记录颜色后，切割并除去连接的寡核苷酸，并且然后重复该过程。
[0696] 在其他实施方案中，使用SOLiDTM基因表达系列分析(SAGE)来测量基因表达。基因表达系列分析(SAGE)是允许同时和定量分析大量基因转录物的方法，无需为每个转录物提供单独的杂交探针。首先，生成短序列标签(约10-14 bp)，其中含有足够的信息来独特地鉴定转录物，条件是该标签是从每个转录物内的独特位置获得的。然后，许多转录物连接在一起形成长系列分子，可以对其进行测序，同时揭示多个标签的身份。通过确定单个标签的丰度并鉴定与每个标签对应的基因，可以定量评价任何转录物群体的表达模式。更多详细信息参见Velculescu et al.,Science 270:484 487(1995)；and Velculescu et al.,Cell 88:243 51(1997，其各自的内容通过引用以全文并入本文)。
[0697] 可用于所提供的公开内容的方法中的另一测序技术包括例如海里科思真正的单分子测序(Helicos True Single Molecule Sequencing)(tSMS)(Harris T.D.et al.(2008)Science 320:106-109)。在tSMS技术中，DNA样品被切割为约100至200个核苷酸的链，并且聚A序列被添加到每一DNA链的3'端。通过添加荧光标记的腺苷酸来标记每一链。这些DNA链然后被杂交至流动池，它含有被固定到流动槽表面的数百万个寡T(oligo-T)捕获位点。模板可以是在约1亿个模板/cm的密度。然后将流动池装载于仪器中，例如HeliScope测序仪，并且激光照射流动池表面，从而显示各个模板的位置。CCD相机可以绘制流动池表面上的模板的位置。然后切割并洗掉模板荧光标记。通过引入DNA聚合酶和荧光标记的核苷酸来开始测序反应。寡T核酸充当引物。聚合酶以模板引导的方式，将标记的核苷酸掺入该引物。除去聚合酶和未掺入的核苷酸。通过流动池表面成像来检测引导荧光标记的核苷酸的掺入的模板。在成像后，切割步骤除去了荧光标记，并且用其他荧光标记的核苷酸重复该过程，直至达到希望的读数长度。用每一核苷酸添加步骤收集序列信息。tSMS的进一步描述示于例如Lapidus et al.(美国专利号7,169,560)、Lapidus et al.(美国专利申请号2009/0191565)、Quake et al.(美国专利号6,818,395)、Harris(美国专利号7,282,337)、Quake et al.(美国专利申请号2002/0164629)和Braslavsky,et al.,PNAS(USA),100:
3960-3964(2003)，其各自的全部内容通过引用并入。
3960-3964(2003)，其各自的全部内容通过引用并入。
[0698] 可以用在所提供的公开内容的方法中的测序技术的另一例子包括太平洋生物科学公司(Pacific Biosciences)的用以对DNA和RNA进行测序的单分子实时(SMRT)技术。在SMRT中，四种DNA碱基中的每一种都与四种不同的荧光染料中的一种附接。这些染料是磷连接的。将单一DNA聚合酶用模板单链DNA的单分子在零模波导(ZMW)的底部固定。ZMW是封闭结构，它使能够观察通过针对迅速扩散进出ZMW(按微秒计)的荧光核苷酸的背景的DNA聚合酶，单核苷酸的掺入。用若干毫秒来将核苷酸掺入正在生长的链中。在该时段期间，激发荧光标记并且产生荧光信号，并且切掉该荧光标签。染料的相应荧光的检测指示了哪个碱基被掺入。重复该过程。为了对RNA测序，用ZMW中的逆转录酶代替DNA聚合酶，并且相应地遵循该过程。
[0699] 可以在所提供的公开内容的方法中使用的测序技术的另一个例子涉及使用化学敏感的场效应晶体管(chemFET)阵列来对DNA进行测序(例如，如美国专利申请公开号20090026082中所述)。在该技术的一个例子中，DNA分子可以被置入反应室中，并且可以将模板分子杂交到结合到聚合酶的测序引物上。可以通过用chemFET的电流中的变化来检测在测序引物3'端掺入一个或多个三磷酸盐成为新的核酸链。一个阵列可以具有多个chemFET传感器。在另一个例子中，可以使单核酸附接于珠粒，并且可以在珠粒上扩增核酸，并且可以将单独的珠粒转移到chemFET阵列上的单独反应室中，其中每个室具有chemFET传感器，并且可以对核酸进行测序。
[0700] 可以在所提供的公开文本的方法中使用的测序技术的另一个例子涉及使用电子显微镜(Moudrianakis E.N.and Beer M.Proc Natl Acad Sci USA.1965March；53:564-71)。在该技术的一个例子中，使用金属标记来标记单个DNA分子，该金属标记可使用电子显微镜区分。然后将这些分子在平坦的表面上拉伸并使用电子显微镜成像以测量序列。
[0701] DNA纳米球测序是一种高通量测序技术，用于确定生物体的整个基因组序列。该方法使用滚环复制将基因组DNA的小片段扩增成DNA纳米球。然后使用通过连接的非链接测序来确定核苷酸序列。这种DNA测序方法允许每次运行对大量的DNA纳米球进行测序。参见WO 2014122548和Drmanac et al.,Science.2010Jan 1；327(5961):78-81；Porreca,Nat Biotechnol.2010Jan；28(1):43-4，其全部内容各自通过引用并入本文。
[0702] 大规模并行签名测序(MPSS)是较早的新一代测序技术之一。MPSS使用衔接子连接、随后衔接子解码、以4个核苷酸的增量读取序列的复杂方法。
[0703] 聚合酶测序将体外配对标签文库与乳液PCR、自动显微镜和基于连接的测序化学相组合，以对大肠杆菌基因组进行测序。该技术也被并入应用生物系统公司SOLiD平台。
[0704] 在Solexa测序中，首先将DNA分子和引物附接在载玻片上并用聚合酶进行扩增，从而形成局部克隆集落，最初创造为“DNA集落”。为了确定该序列，添加四种类型的可逆终止子碱基(RT-碱基)，并且洗涤掉未掺入的核苷酸。与焦磷酸测序不同，DNA链一次延伸一个核苷酸，并且可以在延迟的时刻进行图像采集，允许通过从单个相机拍摄的连续图像捕获大的DNA集落阵列。SOLiD技术采用连接测序技术。在此，根据测序的位置标记具有固定长度的所有可能的寡核苷酸的池。
[0705] 将寡核苷酸退火并连接；通过DNA连接酶对匹配序列的优先连接得到该位置的核苷酸的信号信息。测序前，通过乳液PCR来扩增DNA。将所得珠粒(每个珠粒含有相同DNA分子的单个拷贝)沉积在载玻片上。结果是与Solexa测序相当的序列数量和长度。
[0706] 在Ion TorrentTM测序中，DNA被剪切为约300-800个碱基对的片段，并且这些片段以平端结束。然后将寡核苷酸适配子连接到这些片段的末端。该适配子充当片段扩增以及测序的引物。这些片段可以附接至一个表面，并以这样的分辨率附接，使得这些片段可逐个解析。添加一个或多个核苷酸释放质子(H+)，在测序仪器中检测该信号并记录。信号强度与掺入的核苷酸的数目成比例。Ion Torrent数据也可以作为FASTQ文件输出。参见美国公开号2009/0026082、2009/0127589、2010/0035252、2010/0137143、2010/0188073、2010/0197507、2010/0282617、2010/0300559、2010/0300895、2010/0301398、以及2010/0304982，其全部内容各自通过引用并入本文。
[0707] 癌症相关融合蛋白的检测
[0708] 融合基因可以促成肿瘤形成，因为融合基因可以产生比非融合基因更多的活性异常蛋白。通常，融合基因是可导致癌症的致癌基因；这些包括BCR-ABL、TEL-AML1(ALL与t(12；21))、AML1-ETO(M2AML与t(8；21))和TMPRSS2-ERG(具有21号染色体上的间质缺失，常在前列腺癌中发生)。在TMPRSS2-ERG的情况下，通过破坏雄激素受体(AR)信号传导和通过致癌ETS转录因子来抑制AR表达，融合产物调节该前列腺癌。大多数融合基因发现于血液癌症、肉瘤和前列腺癌。致癌融合基因可能导致具有与两个融合伴侣相比新的或不同功能的基因产物。可替代地，原癌基因与强启动子融合，并因此致癌功能被设定为通过由上游融合伴侣的强启动子引起的上调来发挥作用。后者在淋巴瘤中常见，其中致癌基因与免疫球蛋白基因的启动子并列。致癌融合转录物也可能由转剪接或通读事件引起。某些染色体畸变及其产生的融合基因的存在通常用于癌症诊断中，以便设定精确的诊断。染色体显带分析、荧光原位杂交(FISH)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和新一代测序(外显子组和/或转录组)是诊断实验室用于鉴定癌症相关融合蛋白的常用方法。
[0709] 化疗抗性标记物的检测
[0710] 抗药性是恶性肿瘤化疗失败的原因，抗性为先存的(内在抗性)抑或药物诱导的(获得性抗性)。抗性标记物的检测基于但不限于通过免疫组织化学和流式细胞术鉴定癌相关成纤维细胞，醛脱氢酶1，切割的半胱天冬酶3，环加氧酶2，磷酸化的Akt，Ki-67和H2AX蛋白质(使用免疫组织化学染色)，P-糖蛋白表达，乙酰透明质酸(细胞外基质的主要糖胺聚糖组分)，3q26.2的增加以及6q11.2-12、9p22.3、9p22.2-22.1、9p22.1-21.3、Xp22.2-22.12、Xp22.11-11.3和Xp11.23-11.1的损失(如通过全基因组阵列比较基因组杂交鉴定的)，LRP过表达(如通过免疫染色鉴定的)，HGF和c-MET(与微小RNA MiR-193a-5p相关的基因产物，使用RNA测序)，CD44过表达(通过细胞分选鉴定的)，以及曲古抑菌素A(组蛋白脱乙酰基酶的有效抑制剂)。化疗抗性标记物可能通常采取蛋白质过表达的形式，使用如但不限于DNA测序、RNA测序和蛋白质测序等技术鉴定在抑或/或DNA、RNA或蛋白质水平上的这种过表达。一些化疗抗性标记物采取表观遗传学变化的形式，并且通过DNA焦磷酸测序鉴定这些改变可能特别用于鉴定化疗抗性标记物。另外，基因突变可能直接影响基因产物的表达，可能导致癌性细胞的形成，并且通过DNA测序鉴定基因突变具有较高的实用性。目前，在治疗期间，长期给予药物后，通常会诊断出抗性。随着时间的推移，可发现特定的突变赋予对酪氨酸激酶抑制剂的抗性，例如上皮生长因子受体(EGFR)的抑制剂。使用PCR或DNA测序检测EGFR基因中的突变(如T790M)指示对EGFR酪氨酸激酶抑制的抗性，并且可以消除用这类抑制剂治疗患者的可能性，尤其是在非小细胞肺癌的情况下。目前存在快速评估抗性的方法。通常使用三类测试程序：新鲜肿瘤细胞培养测试、癌症生物标记物测试和正电子发射断层扫描(PET)测试。在用新鲜肿瘤细胞培养测试进行体外治疗之前以及在用PET测试进行短时间体内治疗之后，可以诊断抗药性。参见Lippert,T.et al.(2011).“Current status of methods to assess cancer drug resistance”.Int.J.Med.Sci.8(3):245-253。
[0711] 此外，由于引流淋巴结内的肿瘤细胞的存在指示癌症的转移潜能，因此确定已经逃脱原发性肿瘤的肿瘤细胞抗性谱是极为重要的。切除的淋巴结(或其他淋巴组织)的代表性采样随后上述评估治疗抗性的方法将具有较高的实用性。淋巴系统包括淋巴结(如颈部淋巴结、腰部淋巴结、盆腔淋巴结、腹股沟淋巴结和辅助淋巴结)以及由淋巴组织(如脾脏和胸腺)组成的其他器官，并且应被理解为还包括乳腺淋巴、乳糜池、下肢淋巴、胸导管和上肢淋巴。当前，由于样品量有限，对淋巴结和淋巴组织中的抗性标记物进行分析并不实际。然而，本文公开的代表性采样方法提供了表征此组织的基因组谱的方式。
[0712] 代表性样品用于生产肿瘤特异性抗原或肿瘤特异性抗体以及抗肿瘤疫苗的用途[0713] 如上所述，主题样品的另一个应用是用于分离肿瘤细胞和由其衍生的可用在生产肿瘤特异性抗体中或制造癌症或肿瘤疫苗中的抗原。
[0714] 癌症疫苗接种的一种方法是将蛋白质从癌细胞中分离出来，并使癌症患者免疫那些蛋白质，以期刺激可能杀死这些癌细胞的免疫反应。治疗性癌症疫苗正在开发用于治疗乳腺癌、肺癌、结肠癌、皮肤癌、肾癌、前列腺癌和其他癌症。事实上，丹德里昂公司(Dendreon)开发的用于治疗前列腺癌的一种此类疫苗在2010年4月29日受到美国食品和药物管理局(FDA)批准用于治疗晚期前列腺癌患者。此疫苗 的批准刺激了对这类疗法的新兴趣。
[0715] 例如，根据本公开文本的均质肿瘤样品中鉴定的肿瘤细胞或衍生自肿瘤细胞的蛋白水解切割的细胞表面抗原可用于开发有效的治疗性或预防性肿瘤疫苗。这些抗原可以是裸露的或多聚化的或缀合于其他部分，例如其他蛋白质、佐剂或加载到细胞上，例如树突细胞。已经显示，活的癌细胞的蛋白水解处理可以释放足以诱导超过体外未处理的癌细胞的抗癌免疫应答的抗原靶。(Lokhov et al.,J Cancer 2010 1:230-241)。
[0716] 具体而言，本公开文本中考虑了肿瘤疫苗，其含有衍生于分离自特定患者样品的肿瘤细胞的一种抗原或不同抗原的混合物，基本上产生“个性化癌症疫苗”，使得可以用对其特定肿瘤类型有特异性的免疫刺激部分来治疗患者。通常，这些疫苗将包括有效量的此类抗原以生成有效的免疫应答，例如针对表达特定抗原的肿瘤细胞的抗原特异性CTL应答。如所述的，在一些情况下，这些抗原可以加载到其他部分，例如树突细胞上。通常，此类疫苗还将包括其他免疫佐剂，例如细胞因子、TLR激动剂、TNF/R激动剂或拮抗剂，调节检查点抑制剂等的药剂。尽管在最基本的层面上，该代表性样品本身可以直接用作治疗剂。例如，根据本文公开的方法可以将从患者移除的原发性肿瘤均质化，并将该代表性样品再注入患者体内以生成针对样品中所含的肿瘤抗原的免疫应答。预期该代表性样品本身将包括最多样化的肿瘤抗原谱，因为它包括所有亚克隆(例如，大部分、一级、二级、低流行率等)。
[0717] 此外，本公开文本中进一步考虑了将此类抗原用于生产抗血清和单克隆抗体的用途。这些抗体可用于诊断目的，即用于检测样品中的肿瘤细胞或抗原。可替代地，此类抗体，特别是对此类肿瘤抗原有特异性的人抗体或人源化抗体，可治疗性地用于治疗表达这些抗原的癌症。制备可能用于疗法的抗体的方法是本领域熟知的。
[0718] 此外，本公开文本中还考虑了使用主题代表性样品来鉴定B细胞受体和/或T细胞受体群体，其转而可用于报告策略性疫苗生成。
[0719] 此外，由主题方法生成的代表性样品也可用于开发CAR-T系统。
[0720] 代表性样品用于检测新抗原的用途
[0721] 从分离的肿瘤细胞中鉴定新抗原对于治疗患有一种或多种癌症的患者至关重要。因此，使用本公开内容生成的样品可以经历任何相关的诊断方法，例如但不限于本申请中讨论的那些，用于鉴定肿瘤样品的新抗原生物标记物。
[0722] 新抗原产生于肿瘤生长期间发生的突变，并与免疫系统耐受的天然抗原不同。越来越多的证据表明，肿瘤的免疫排斥反应，例如用检查点调节剂所见的，可能是由新抗原的识别介导的。新抗原具有以下潜力：(1)通过例如免疫系统独特地标记肿瘤(相对于非肿瘤细胞)用以识别和破坏(参见See Lennerz et al.,2005,Proc Natl Acad Sci USA.102(44):16013-8，其全部内容通过引用并入本文)；并且(2)避免中心耐受和有时的外周耐受，并且因此被认为用于靶向癌症治疗(参见Gotter et al.“Medullary Epithelial Cells of the Human Thymus Express a Highly Diverse Selection of Tissue-specific Genes Colocalized in Chromosomal Clusters.”J.Exp.Med.199.2(2004):155-166，其全部内容通过引用并入本文)。参见US 20110293637 A1，其全部内容通过引用并入本文。
[0723] 最近的技术创新使得能够剖析随着肿瘤特异性突变的结果出现的患者特异性新抗原的免疫应答，并且新兴的数据表明识别这种新抗原是临床免疫疗法活性的主要因素。这些观察指示，新抗原负荷可能在癌症免疫疗法中形成生物标记物，并为开发新的治疗方法提供激励。参见Schumacher,T.N.and Schreiber,R.D.(2015)Neoantigens in cancer immunotherapy.Science 348:6230.69-74，其全部内容通过引用并入本文。
[0724] 基于过去几年获得的数据，新抗原特异性反应性形成成功癌症免疫疗法的主要“活性成分”是合理的。换言之，一方面导致致癌基因产物的遗传损害也可以被免疫系统靶定用以控制恶性肿瘤。基于这一发现，设计选择性地增强新抗原特异性反应性的治疗性干预将是重要的。由于靶定的抗原的肿瘤限制性表达，这些个性化的癌症免疫疗法提供了高特异性和安全性的前景。可以想象，用这种个性化免疫疗法可以实现的新抗原特异性反应性的加强将进一步增加对癌症免疫疗法有反应的人恶性肿瘤的范围。参见Schumacher,T.N.and Schreiber,R.D.(2015)Neoantigens in cancer immunotherapy.Science 348:6230.69-74，其全部内容通过引用并入本文。
[0725] 新抗原可能包括每个患者独特的个人突变，并且其显著超出致癌基因的突变数。改变蛋白质编码序列的那些突变的子集也建立个人的新的抗原-新抗原-其可以提供癌症免疫疗法所需的“外来”信号。参见Hacohen et al.Getting Personal with Neoantigen-based Therapeutic Cancer Vaccines.Cancer Immunol Res；1(1)；11– 2013 AACR。
[0726] 如上所述，癌症肽疫苗构成了引发和加强抗肿瘤免疫应答的另一种方法。靶向赘生物转化期间肿瘤细胞中发生的基因突变所生成的肿瘤特异性抗原的方法将有助于个性化患者治疗。对这些所谓的“癌症新抗原”的免疫应答可能不会因胸腺中的宿主中央耐受性而减弱，并且也不会引发自身免疫应答。基因组学和生物信息学最近的发展，包括大规模平行测序(MPS)和表位预测算法，已经提供了重大突破，能够更全面和更有效地鉴定靶抗原。参见Kitano,I.A.et al.(2015)Cancer Neoantigens:A Promising Source of
Immunogens for Cancer Immunotherapy.J Clin Cell Immunol 6:322，其全部内容通过引用包括在本文中。
Immunogens for Cancer Immunotherapy.J Clin Cell Immunol 6:322，其全部内容通过引用包括在本文中。
[0727] 对寻求用患者自己的免疫系统靶向癌性细胞的癌症疗法(例如，癌症疫苗)有越来越大的兴趣，因为此类疗法可以减轻/消除一些本文所述的缺点。癌症疫苗典型地由肿瘤抗原和免疫刺激分子(例如，细胞因子或TLR配体)构成，它们一起工作以诱导靶向并破坏肿瘤细胞的抗原特异性细胞毒性T细胞。当前的癌症疫苗典型地含有共有的肿瘤抗原，它们是在许多个体中发现的肿瘤中被选择性表达或过表达的天然蛋白质(即–由个体体内的所有正常细胞的DNA编码的蛋白质)。含有肿瘤特异性和患者特异性新抗原的疫苗是用于治疗患有癌症的受试者的潜在有用的治疗途径。参见WO 2015095811 A2，其全部内容通过引用并入本文。
[0728] 因此，由从癌症患者获得的组织(例如肿瘤或淋巴结)制备的代表性样品可以用于鉴定在癌症免疫疗法中形成生物标记物的新抗原负荷，并因此提供对选择性增强针对所鉴定的一类或多类抗原的T细胞反应性的新型治疗方法的开发。
[0729] 诊断病理学实验室的当前采样技术专注于从手术切除组织的特定解剖位置采取处方样品。如图56中的虚线框所示，历史标准实践是获取5-7个切除肿瘤的小区域以满足TNM分期系统的要求。将解剖的样品进一步加工成石蜡包埋的组织块，取组织块并将肿瘤分级，并且任选使用常见染色技术来分析生物标记物。一旦解剖病理学家收集并审查了所有诊断信息，包括任何剩余肿瘤组织的残余手术组织就会被焚烧而破坏。
[0730] 这项工作的发明方面涉及残余手术切除材料的利用，这是自20世纪50年代中期世界范围内接受TNM分期系统以来被普遍破坏的组织来源。在当前工作流程内的多个位置，可以通过多种组织解离方法(包括但不限于共混、切碎/划切和榨汁)进行加工来破坏手术切除的组织。如图Z所示，可在手术切除后(新鲜组织)、组织固定后、TNM样品采集后或组织样品包埋在石蜡中后立即解离组织。一旦充分均质化，解离的组织就被称为“代表性样品”。该代表性样品的独特和未曾预料的属性是它含有原始手术切除组织内存在的所有多样性，如组织、细胞和所有生物分子的多样性。
[0731] 本申请的其他发明方面包括新鲜和经固定的代表性样品的所有进一步加工，因为从20世纪50年代以来这种材料已经被破坏，因此从未在诊断肿瘤学中采样过大量的人类残余手术材料。如图56所示，在一些实施方案中，可以使用新技术从代表性样品直接分离生物分子，并使用当前和未来的分析工具进一步分析。生物分子如DNA可以使用NGS进行分离和测序，并且所得数据可用于计算含有特定靶向突变的肿瘤的百分比。此外，突变率还可进一步用于确定切除肿瘤内含有的肿瘤亚克隆的多样性。使用ELISA、免疫沉淀或质谱分析法进行的蛋白质分析可用于确定可靶向蛋白质复合物的存在或肿瘤内酪氨酸激酶的活化状态。
[0732] 在另一个实施方案中，处于均质物形式的代表性样品的部分可以被独特地加工并且包埋在石蜡中以使用当前组织学方法进行分析。包埋代表性样品的染色可以由解剖病理学家读取和解读，或使用数字成像系统成像。数字成像后，染色结果中的异质性可以定量并用于数学地代表蛋白质表达的空间异质性、基因拷贝数改变或mRNA表达。
[0733] 在另一个实施方案中，代表性样品的部分可以使用新的机械和酶促解离方法进一步加工以生成单个核的悬液。可以使用新的染色方法对从代表性样品中分离的核进行染色，以使用流式细胞术进一步分析来确定表达某些核转录因子的细胞的百分比和表型变化的其他指标。可替代地，可以使用FACS(荧光活化细胞分选)或磁珠亲和力减法来分离染色的核，随后进行DNA分离和NGS或PCR分析。可替代地，可以将分离的核铺在载玻片上并经受组织学技术如IHC和ISH。
[0734] 在又另一个实施方案中，代表性样品的部分可以使用新的机械和酶促解离方法进一步加工以生成单个细胞的群体。从切除的组织的代表性样品中生成的细胞可以通过流式细胞术进一步分析以询问细胞类型的多样性、表型和其他生物标记物如肿瘤细胞中的可靶向致癌基因和免疫调节剂，以及从肿瘤移除的免疫细胞的免疫表型。可将细胞针对FACS进一步加工以分离表达特定生物标记物的细胞。来自FACS分选细胞的生物分子可以被分离出来用于进一步的分析测试，或者可以将细胞铺在载玻片上用于组织学检测方法，包括IHC和ISH。
[0735] 作为残留手术组织，尤其在实体瘤肿瘤学中，在过去约50年中已经被破坏，衍生自新的代表性采样和分析技术的数据将生成史无前例的临床肿瘤学数据。这种“代表性肿瘤学数据”(图56)将首次使得能够计算肿瘤细胞中的突变和表型多样性以及抗肿瘤免疫应答和其他正常组织的状态。新的“代表性肿瘤学数据”将用于改进癌症患者的预后，预测手术部位或远处转移瘤的复发，检测所有可用的“可靶向”改变，选择纳入临床试验并确定联合治疗靶标、剂量和时机。
[0736] 已经详细描述了本公开内容。为了进一步说明本公开内容及其固有益处，提供了讨论由发明人进行的实验的以下实施例。
[0737] 提供以下实施例旨在说明，但不限制要求保护的公开内容。
[0738] 实施例
[0739] 实施例1：代表性组织样品的制备
[0740] 使用本文所述的并在图3中示意性描绘的均质化方法从福尔马林固定的肿瘤样品衍生代表性组织样品。通常，将肿瘤样品(即福尔马林固定的肿瘤样品)任选地从周围的相邻正常组织中移除并机械解离，产生含有原始切除肿瘤的所有组分的代表性样品。然后可以对代表性样品进行进一步加工以进行下游分析。此类加工包括在85℃在CC1缓冲液中预调节，之后转移至含有60mg/mL胶原酶H和1mM CaCl2的缓冲液(例如，PBS)中。然后将所得的经酶处理的均质化组织与胶原酶H在40℃下孵育至少约30分钟，之后返回到CC1缓冲液中并在85℃加热约10分钟以使任何剩余的胶原酶失活。然后使用该代表性样品来衍生子样品，然后将其用于各种诊断测定。
[0741] 方法
[0742] 材料：使用Hamilton Beach Single Serve共混器(沃尔玛，图森，亚利桑那州(Walmart,Tucson,AZ))或来自IKA-Works(施陶芬，布赖斯高，德国(Staufen in Breisgau,Germany))的IKA Works管磨机控制系统(Tube Mill Control System)(0004180001)并使用来自美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec)(特罗(Teterow)，德国)的gentleMACS解离器来进行组织的机械剪切。注意均质化后各种尺寸的组织碎片，范围为从几个细胞到含有数万个细胞的簇(图15)。在来自维塔纳医学系统公司(Ventana Medical Systems)(图森，亚利桑那州；目录号950-124)的细胞调节1(CC1)缓冲液中进行热量和pH细胞调节。从创新细胞技术公司(Innovative Cell Technologies)(圣地亚哥，加利福尼亚州(San Diego,CA))获得 从罗氏公司(Roche)(巴塞尔，瑞士)获得胶原酶H(11074032001)。使用来自维塔纳医学系统公司(图森，亚利桑那州)的以下抗体：抗PD-L1(SP263)兔单克隆一级抗体(790-4905)；抗Ber-EP4小鼠单克隆抗体(760-4383)；抗CD8(SP57)兔单克隆一级抗体(790-4460)；抗HER-2/neu(4B5)兔单克隆一级抗体(790-2991)。
[0743] 组织样品：在维塔纳医学系统公司，将所有组织样品和肉在10％中性缓冲福尔马林中固定24小时。在维塔纳医学系统公司生成HER2阳性异种移植物。从沃尔玛(图森，亚利桑那州)获得鸡肉和鱼肉。从西北医学中心(Northwest Medical Center)(图森，亚利桑那州)获得人扁桃体。
[0744] 消化和分析：将样品在85℃在CC1缓冲液中进行预调节，并且随后在室温下用含有1mg/ml胶原酶H的 处理1小时，然后在40℃孵育1小时。通过使消化的样品按相
继次序通过以下微米网来分析该组织的生化消化：500、300、100、40、20、10、6和1微米。对每个网称量流过和保留的级分。
继次序通过以下微米网来分析该组织的生化消化：500、300、100、40、20、10、6和1微米。对每个网称量流过和保留的级分。
[0745] 苏木精和伊红染色：将代表性样品铺在VWR plus载玻片上的70μL甲醇中。使用维塔纳医学系统公司Symphony平台(维塔纳医学系统公司，图森，亚利桑那州)和相应的H&E Symphony试剂(维塔纳医学系统公司，图森，亚利桑那州)进行苏木精和伊红(H&E)染色。
[0746] 免疫组织化学：将代表性样品铺在VWR plus载玻片上的70μL甲醇中。使用维塔纳医学系统公司BenchmarkXT平台(维塔纳医学系统公司，图森，亚利桑那州)进行基于亮视野DAB的免疫组织化学(IHC)。使用来自维塔纳公司的OptiView DAB检测试剂盒(760-700)进行生物标记物的可视化。将抗体孵育4分钟。
[0747] RNA分离：使用先前在Chen et al.2007中描述的酸酚法从人扁桃体的代表性样品分离RNA。
[0748] 结果和讨论
[0749] 使用上述方法，产生了来自不同样品类型的代表性样品，包括人肿瘤的临床组织样本和经固定的动物组织。
[0750] 在85℃在CC1缓冲液中进行的细胞预调节与细胞外基质的酶促消化结合以产生尺寸范围为从单细胞到小细胞团的样品。
[0751] 使用对细胞外基质蛋白即胶原酶H有特异性的酶代替普通的蛋白酶例如胰蛋白酶，以使在组织的生化消化期间膜相关生物标记物的损失最小化。
[0752] 大部分样品被消化成100微米尺寸的碎片和更小碎片(图4)。在这里，使用消化样品的重量百分比来表征在通过一系列微米网过滤后经生化消化的代表性样品中不同尺寸的碎片。
[0753] 通过使样品通过6微米和更小的网过滤器来过滤非肿瘤细胞，如H&E染色中所见。图5A-C显示了对生化消化的代表性样品进行系列过滤后收集的流过级分和保留级分的H&E染色。图7A示出了保留在网(顶部)中的级分以及500、300、100和40微米网的流过物(底部)的H&E染色。图7B示出了保留在网(顶部)中的级分以及30、20和10微米网的流过物(底部)的H&E染色。图7C示出了保留在网(顶部)中的级分以及6和1微米网的流过物(底部)的H&E染色。
[0754] 来自6微米和1微米过滤器(具体而言，图5C)的流过物的H&E染色显示没有指示肿瘤细胞的增大细胞核。因此，此方法可以用于富集代表性样品中的肿瘤细胞以及从样品中分离基于肿瘤血小板和其他血细胞。
[0755] 首先在由300克各种经固定的动物组织(包括鸡胸肉、鸡肝和鱼片)构成的组织样品中测试上述方法。为了对罕见的肿瘤亚克隆建模，向该组织样品中添加小的(0.4克)HER-2阳性异种移植物。在本实验中使用之前，将该组织机械解离并使用弗式压碎器过滤。然后将该组织样品在85℃下在CC1缓冲液中预调节15分钟。使用gentleMACS解离器将经预调节的组织样品均质化(图6D)，并且每5分钟收集1mL样品。使收集的每个样品都通过600pcs网来测量该组织的解离。单独预调节能促进一些消化，但10分钟后反应达到平稳期(图6A)。通过比较单独胶原酶H与胶原酶H和CC1预调节组合解离该样品的能力，确定CC1预调节能够促进胶原酶H消化。具体而言，CC1预调节随后胶原酶H消化至少30分钟给出粒度的最佳降低，如由600pcs滤器测量的(图6B)。通过铺板几个等分试样并使用DAB-IHC针对HER-2阳性细胞分析每个等分试样来测试该样品的代表性。在每个建立的载玻片上检测HER-2阳性细胞(图
6C)。考虑到重量比(0.4克HER-2阳性异种移植物比300克肉)，上述方法生成了代表性样品，其允许检测至少0.1％的流行率的亚克隆。
6C)。考虑到重量比(0.4克HER-2阳性异种移植物比300克肉)，上述方法生成了代表性样品，其允许检测至少0.1％的流行率的亚克隆。
[0756] 接下来，在人淋巴结(扁桃体)组织上测试该方案。将切除的扁桃体在IKA管磨机中机械解离以产生代表性淋巴结样品。用CC1预调节随后用胶原酶H消化30分钟使该扁桃体组织解离(图7A)。胶原酶H消化的时程延长至90分钟，并且观察到酶促反应在60分钟左右达到稳定(图7B)。因此，预期大多数人组织只需要用胶原酶H消化约30至约60分钟，但不超过约90分钟。
[0757] 接下来，使用解离的人扁桃体组织样品的四个500μL等分试样来分离核酸。将两个500μL等分试样在-20℃作为细胞沉淀物储存，而将其他两个500μL等分试样进行石蜡包埋。
从所有的等分试样中分离RNA，但非石蜡包埋的等分试样中产量要高得多(表1)。
从所有的等分试样中分离RNA，但非石蜡包埋的等分试样中产量要高得多(表1)。
[0758] 表1 从解离的人扁桃体组织样品(福尔马林固定(FF)和福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)的)中分离的总RNA。
[0759] FF FFPE
1 578μg 198μg
2 569μg 127μg
1 578μg 198μg
2 569μg 127μg
[0760] 这些结果指示代表性样品适用于诊断测试，如基因组和转录组测序，并且此外，使用本文所述方法生成的代表性样品是比传统石蜡包埋的组织样品更好的材料来源。
[0761] 实施例2：代表性肿瘤样品的制备
[0762] 从肾样品和肺样品生成代表性肿瘤样品。
[0763] 方法
[0764] 材料：使用来自IKA-Works(施陶芬，布赖斯高，德国)的IKA Works管磨机控制系统(0004180001)并使用来自美天旎生物技术公司(特罗，德国)的gentleMACS解离器来进行组织的机械剪切。在来自维塔纳医学系统公司(Ventana Medical Systems)(图森，亚利桑那州；目录号950-124)的细胞调节1(CC1)缓冲液中进行热量和pH细胞调节。从罗氏公司(Roche)(巴塞尔，瑞士)获得胶原酶H(11074032001)。使用来自维塔纳医学系统公司(图森，亚利桑那州)的以下抗体：抗PD-L1(SP263)兔单克隆一级抗体(790-4905)；抗Ber-EP4小鼠单克隆抗体(760-4383)；抗CD8(SP57)兔单克隆一级抗体(790-4460)；抗HER-2/neu(4B5)兔单克隆一级抗体(790-2991)。
[0765] 临床样品：将组织样品在图森医学中心和范德比尔特医学中心(Vanderbilt Medical Center)在10％中性缓冲福尔马林中固定24和72小时之间。从图森医学中心(图森，亚利桑那州)获得肺肿瘤活检样品。从范德堡大学(Vanderbilt University)(那什维尔，田纳西州)获得肾肿瘤活检碎片。
[0766] 消化分析：通过使1mL样品通过600pcs滤器并对收集在网上的材料进行称重来分析该组织的生化消化。
[0767] 苏木精和伊红染色：将代表性样品铺在VWR plus载玻片上的70μL甲醇中。使用维塔纳医学系统公司Symphony平台(维塔纳医学系统公司，图森，亚利桑那州)和相应的H&E Symphony试剂(维塔纳医学系统公司，图森，亚利桑那州)进行苏木精和伊红(H&E)染色。
[0768] 免疫组织化学：将代表性样品铺在VWR plus载玻片上的70μL甲醇中。使用维塔纳医学系统公司BenchmarkXT平台(维塔纳医学系统公司，图森，亚利桑那州)进行基于亮视野DAB的免疫组织化学(IHC)。使用来自维塔纳公司的OptiView DAB检测试剂盒(760-700)进行生物标记物的可视化。将抗体孵育4分钟。
[0769] RNA分离：使用先前在Chen et al.2007中描述的酸酚法从人扁桃体的代表性样品分离RNA。
[0770] 结果和讨论
[0771] 具体而言，根据本文描述并且如图3所示的方法，从来自61岁男性的棒球大小的肾肿瘤生成代表性样品。在机械解离、预调节和酶促消化后，使用标准H&E染色使肾样品中的组织碎片尺寸可视化(图8A)。然后将该样品针对三种不同的生物标记物进行DAB-IHC分析：PD-L1(图8B)、CD8(图8C)和Ep-Cam(图8D)。在代表性肾肿瘤临床样品中检测到所有三种蛋白质。
[0772] 另外，由来自87岁女性的半美元大小的肺肿瘤的一部分生成代表性样品(图9A)。从该临床组织样品中切割小切片(图9A)并根据标准病理学实践进行处理。使用剩余的组织根据本文所述并在图1中显示的方法产生代表性样品。在机械解离、预调节和酶促消化后，使用标准H&E染色使肺样品中的组织碎片尺寸可视化(图9B)。
[0773] 然后将该代表性样品和传统组织切片(“组织块”)针对三种不同的生物标记物进行DAB-IHC分析：PD-L1(图9C)、CD8(图9D)和Ep-Cam(图9E)。在该代表性样品和传统组织切片中观察到相似量的染色，指示使用本发明的方法不存在针对大流行率亚克隆的信号的损失。
[0774] 这些结果证明，将组织的机械操纵与生化消化结合可以产生代表多种肿瘤类型中的异质性和多样性的样品。此外，该代表性样品适用于各种诊断测试，如苏木精和伊红染色、免疫组织化学分析、核酸分离和测序，并促进罕见肿瘤亚克隆的检测，从而改进临床诊断和个性化癌症治疗。
[0775] 实施例3：衍生自完整的福尔马林固定样本的代表性样品中蛋白质的免疫细胞化学检测
[0776] 使用本文所述的并在图3中示意性描绘的均质化方法从经固定的组织或肿瘤样本生成代表性组织和肿瘤样品，并且使用免疫细胞化学(ICC)在代表性样品中检测感兴趣的蛋白质，例如生物学和/或医学预后或预测标记物。
[0777] 来自经固定的生物样品的组织切片的蛋白质的免疫组织化学(IHC)检测是解剖病理学中影响医疗决策的常用实践，特别是在实体瘤肿瘤学的背景下。来自经固定的样本的蛋白质的免疫细胞化学(ICC)检测也影响医疗决策，例如在来自转移癌的胸膜渗出液的细胞学检查中，并且与IHC的不同之处在于该样品最初缺乏组织学架构。针对细胞学样本保留了ICC，例如通过巴氏涂片或薄层制备法的宫颈细胞学。组织切片虽然维持了许多对于今天的实体瘤病理学实践重要的特征(如基质对肿瘤架构)，但它代表了肿瘤细胞内容物的级分，并且通过扩展生物信息内容代表整个经固定的生物样本的级分。重整完整的经固定肿瘤样本以产生代表肿瘤整体的样品和可以提供具有潜在医疗价值的统计学上有力信息的样品对于战略性个性化医学的未来至关重要。
[0778] 方法
[0779] 抗体：表2列出了本研究中使用的抗体和经固定的样本。抗体由维塔纳医学系统公司出售。
[0780] 表2：代表性样品的ICC分析中使用的抗体。
[0781]抗体 维塔纳目录号
CD3 790-4467
CD8 760-4437
CD20 760-4383
Ki-67 790-4286
Ep-CAM(Ber-EP4) 760-4383
PDL-1 790-4905
Her2 790-2991
CD3 790-4467
CD8 760-4437
CD20 760-4383
Ki-67 790-4286
Ep-CAM(Ber-EP4) 760-4383
PDL-1 790-4905
Her2 790-2991
[0782] 组织样品：在维塔纳医学系统公司，将所有组织样品在10％中性缓冲福尔马林中固定24小时。从西北医学中心(Northwest Medical Center)(图森，亚利桑那州)获得人扁桃体。动物组织从商业来源产生，例如，从商店获得鸡肝。
[0783] 材料：使用来自IKA-Works(施陶芬，布赖斯高，德国)的IKA Works管磨机控制系统(0004180001)并使用来自美天旎生物技术公司(特罗，德国)的gentleMACS解离器来进行组织的机械剪切。在来自维塔纳医学系统公司(Ventana Medical Systems)(图森，亚利桑那州；目录号950-124)的细胞调节1(CC1)缓冲液中进行热量和pH细胞调节。
[0784] 共混。将200μl矿物油添加到IKA管磨机(部件号MT 40.100)共混垫片以防止在均质化期间泄漏。将5克组织与1x组织体积的PBS一起添加到磨机中。将样品以15000pm旋转2分钟(旋转10秒，旋转间间歇2秒)。将均质化样品从磨机中除去并与双倍体积的PBS一起添加到gentleMACS解离器(部件号30-093-237)中。使用程序h_tumor_01(旋转36秒)将样品共混，重复总共三次，之后将样品倒入50mL锥形管中并以300x g离心3分钟。除去PBS水层以进行调节。
[0785] 细胞调节：添加1体积预热的细胞调节溶液(CC1)。然后将样品置于设定为85℃的加热块上持续5分钟。此后，使用gentleMACS解离器(3x程序h_tumor_02)将样品共混。将加热步骤和共混步骤各再进行两次，之后将样品以300x g离心3分钟。
[0786] 铺板：将样品的100ul等分试样重新定位到epi管(epitube)，并添加1体积当量的100％甲醇。使用70μL甲醇/样品/VWR superfrost载玻片进行铺板和石蜡包埋
[0787] 自动免疫细胞化学：使用维塔纳医学系统公司Benchmark XT平台(维塔纳医学系统公司，图森，亚利桑那州)与研究软件，对沉积在带正电的载玻片上的代表性样品进行基于亮视野DAB的免疫细胞化学(ICC)。每种抗体的DAB检测使用OptiView DAB检测试剂盒(VMSI目录号760-700)，在用和不用OptiView AMP试剂盒(VMSI目录号760-099)的情况下进行。使用扩增来在样本内产生低水平的背景，并允许减少一级抗体孵育时间。在CC1缓冲液(VMSI目录号950-124)中对样本进行细胞调节两轮4分钟后，所有检测均完全自动化并在Benchmark XT自动染色仪(VMSI)上进行。所有的一级抗体孵育均在37℃下进行4分钟(参见结果和讨论)，使总运行时间保持在2小时20分钟下。使用图10所示的方案完成单DAB ICC。图10提供了在步骤1-102中阐述的用于代表性样品中蛋白质检测的示例性DAB ICC方案。在这个具体实施例中，使用该方案来检测Her2。
[0788] 显色多路复用检测如图11所述完成，按照以下顺序：Ki-67→CD20→CD3。通过在细胞调节2(CC2)缓冲液(VMSI目录号950-123)中90℃孵育12分钟，在Ki-67和CD20以及CD20和CD3之间进行酶的热变性和一级抗体熔化，以防止交叉反应性。
[0789] 结果和讨论
[0790] 为了确定沉积在载玻片上的代表性样品是否可以使用自动化ICC进行染色，将来自动物组织和扁桃体样本的制备混合物的样品针对单个生物标记物DAB ICC进行染色(图12)。图12显示了使用自动化DAB ICC在从动物组织和人扁桃体样本的混合物制备的代表性样品中进行的区别B细胞的CD20检测。在来自代表性样品中含有的人扁桃体组织的细胞中检测到CD20。
[0791] 选择四分钟一级抗体孵育与扩增，以使背景和运行时间最小化(例如，Rep Dia-Her2DAB方案，图10)。确定测试的所有抗体(参见表2)均与本方案兼容。
[0792] 还开发了用以测试使用荧光ICC检测单个标记物的可行性的方案(参见图11)。例如，使用荧光ICC检测Her2(图13A和13B)。在这里，图13A和13B显示使用荧光ICC检测存在于由扁桃体组织和Her-2阳性异种移植肿瘤制备的代表性样品中的Her2阳性Calu-3细胞。图13A示出了仅与二级抗体孵育的含有Calu-3细胞(阴性对照)的代表性样品。虚线箭头指定了由二级抗体生成的Calu-3细胞中的背景信号。图13B显示了在添加二级抗体之前将含有Calu-3细胞的代表性样品与Her2抗体(4B5)孵育。Calu-3细胞中的Her-2信号由实线箭头指定。没有添加Her2抗体(4B5)(图13A)和添加Her2抗体(4B5)(图13B)的情况下，看到衍生自扁桃体的更小的非特异性细胞的信号。
[0793] 接下来，制备由扁桃体样本制备的代表性样品，并将其置于载玻片上以用多路复用显色ICC来测试分析。将该代表性扁桃体样本针对三个免疫标记物进行染色，每个免疫标记物根据图14所示的方案使用单独的颜色进行检测。图14提供了用于检测代表性样品中的多种蛋白质的示例性多路复用显色ICC方案(在步骤1-225中阐述)。在此具体实施例中，使用Ki-67、CD20和CD3的物种特异性抗体和抗物种-酶缀合物驱动的色原体沉积来检测该三个免疫标记物。
[0794] 例如，对代表性扁桃体样本进行显色多路复用以使用物种特异性二级抗体随后用抗物种-酶缀合物驱动的色原体沉积与用以消除酶活性的热变性步骤来检测Ki-67、CD20和CD3，如之前在Wenjun Zang et al.,“Quantum dot in situ hybridization”,WO 2014139979中所述。在进行显色多路复用的代表性扁桃体样本中观察到生物学适当的颜色检测和颜色覆盖(图15)。
[0795] 接下来，对由临床样本制备的代表性样品进行ICC。具体而言，制备由福尔马林固定的肺肿瘤或福尔马林固定的肾肿瘤制备的代表性样品并测试PDL-1(由阻断抗肿瘤免疫力的肿瘤产生的标记物和用于指定免疫疗法的靶标)、CD8(用于理解抗肿瘤免疫力水平的重要T细胞标记物)和Ep-Cam(指示上皮癌的标记物)。在由临床肿瘤样本制备的代表性样品中(参见图8A-8D和图9A-9D)，检测在不同水平的、所测试的每种测试生物标记物(PDL-1、CD8和Ep-Cam)。
[0796] 这些结果证明从完整的经福尔马林固定的组织样本衍生的代表性样品中的标记物的完全自动化的单一和多路复用ICC检测，此外，显示代表该完整的经固定的组织样本的样品提供了检测该样品内罕见细胞亚群的能力。
[0797] 实施例4：从淋巴结制备代表性样品及其用于检测罕见亚克隆的用途
[0798] 本实施例描述了从淋巴结组织生成代表性样品，其允许对可能由肿瘤转移导致的癌细胞进行敏感检测。使用本文所述的并在图3中示意性描绘的均质化方法从福尔马林固定的肿瘤样品衍生代表性组织样品。一般而言，最初将肿瘤样品(即经福尔马林固定的肿瘤样品)机械解离，并且然后在85℃在CC1缓冲液中预调节，之后转移至缓冲液1x PBS缓冲液中。
[0799] 方法
[0800] 抗体：使用抗BRAFV600E小鼠单克隆抗体(目录号790-4855，维塔纳医学系统公司)来检测b-Raf。
[0801] 组织样品：在维塔纳医学系统公司，将所有组织样品在10％中性缓冲福尔马林中固定24小时。在维塔纳医学系统公司生成HER2阳性或BRAF异种移植物。从西北医学中心(Northwest Medical Center)(图森，亚利桑那州)获得人扁桃体。
[0802] 材料：使用来自IKA-Works(施陶芬，布赖斯高，德国)的IKA Works管磨机控制系统(0004180001)并使用来自美天旎生物技术公司(特罗，德国)的gentleMACS解离器来进行组织的机械剪切。在来自维塔纳医学系统公司(Ventana Medical Systems)(图森，亚利桑那州；目录号950-124)的细胞调节1(CC1)缓冲液中进行热量和pH细胞调节。
[0803] 共混：将200μl矿物油添加到IKA管磨机(部件号MT 40.100)共混垫片以防止在均质化期间泄漏。将5克组织与1x组织体积的PBS一起添加到磨机中。将样品以15000pm旋转2分钟(旋转10秒，旋转间间歇2秒)。将均质化样品从磨机中除去并与双倍体积的PBS一起添加到gentleMACS解离器(部件号30-093-237)中。使用程序h_tumor_01(旋转36秒)将样品共混，重复总共三次，之后将样品倒入50mL锥形管中并以300x g离心3分钟。除去PBS水层以进行调节。
[0804] 细胞调节：添加1体积预热的细胞调节溶液(CC1)。然后将样品置于设定为85℃的加热块上持续5分钟。此后，使用gentleMACS解离器(3x程序h_tumor_02)将样品共混。将加热步骤和共混步骤各再进行两次，之后将样品以300x g离心3分钟。
[0805] 铺板：将样品的100ul等分试样重新定位到epi管(epitube)，并添加1体积当量的100％甲醇。使用70μL甲醇/样品/VWR superfrost载玻片进行铺板。
[0806] 自动免疫细胞化学：使用维塔纳医学系统公司Benchmark XT平台(维塔纳医学系统公司，图森，亚利桑那州)与研究软件，对沉积在带正电的载玻片上的代表性样品进行基于亮视野DAB的免疫细胞化学(ICC)。该抗体的DAB检测是使用OptiView DAB检测试剂盒(VMSI目录号760-700)在用和不用OptiView AMP试剂盒(VMSI目录号760-099)的情况下进行。使用扩增来在样本内产生低水平的背景，并允许减少一级抗体孵育时间。在CC1缓冲液(VMSI目录号950-124)中对样本进行细胞调节两轮4分钟后，所有检测均完全自动化并在Benchmark XT自动染色仪(VMSI)上进行。
[0807] 结果和讨论
[0808] 为了确定是否能够检测到来自淋巴结(如扁桃体)的代表性样品中的低流行率事件，将该代表性淋巴结样品沉积在载玻片上并使用如图10所阐述的自动化ICC染色。
[0809] 为了测试淋巴结代表性样品内肿瘤细胞的检测敏感性，将逐渐减少的量的bRaf V600E阳性人异种移植物的代表性样品掺入淋巴结均质物中。使用以下细胞百分比(样品总体积中BRAFV600E阳性细胞的流行率)：50％、25％、12.5％、6.25％、3.12％、1.5％、0.15％、0,015％、0.0015％和0.00015％。检测到bRaf阳性细胞的流行率低至0.015％(图16)，证明ICC可以用于由淋巴结制备的代表性组织样品以找到可以是治疗上能付诸实施的极其罕见的细胞亚群(例如，vemurafinib，针对BRAFV600E+)。
[0810] 也用Her2阳性细胞进行类似稀释系列实验，将其以逐渐降低的比率添加到代表性扁桃体样品中以产生以下细胞百分比：50％、25％、12.5％、6.25％、3.12％、1.5％、0.15％、0,015％、0.0015％和0.00015％。类似于b-Raf阳性细胞，Her2阳性细胞也可以以非常低的水平检测到，即约0.015％(数据未显示)，这再次表明可以使用代表性样品的ICC分析来发现治疗上能付诸实施的极其罕见的细胞亚群(例如，赫赛汀，针对Her2+)。
[0811] 实施例5：来自全肿瘤的代表性样品的制备
[0812] 本实施例描述了由手术切除的原发性肿瘤建立的代表性样品。
[0813] 方法
[0814] 代表性组织样品衍生自直径约8cm的经福尔马林固定的手术切除的结肠以及肾的部分切除物(从北卡罗来纳州温斯顿-塞勒姆GLAS组织顾问公司(GLAS Tissue Consultants)购得)(图18A和18B)。在这里，图18A示出了来自仍然含有八(8)厘米结肠腺癌的结肠切除物的材料，而图18B示出了来自含有乳头状尿路上皮肾肿瘤的肾的肾部分切除术的残留组织。
[0815] 获取肿瘤样品并进行加工用于组织学检查(即石蜡包埋、组织切片)以模拟TNM采样过程。由病理学家使用解剖刀来解剖残余肿瘤组织，并使用来自IKA-Works(施陶芬，布赖斯高，德国)的IKA Works管磨机控制系统(0004180001)或Hamilton Beach Single Serve共混器将肿瘤组织均质化。然后将均质物样品机械解离，并且然后在85℃在CC1缓冲液中预调节，之后转移到含有 的缓冲液(例如，PBS)缓冲液(具有在 缓冲液中的1mg/mL胶原酶H)中。然后将所得的经酶处理的均质化组织用胶原酶H在40℃下孵育至少约30分钟，之后返回到CC1缓冲液中并在85℃加热约10分钟以使任何剩余的胶原酶失活。然后使用该代表性样品来衍生子样品，然后将其用于各种诊断测定。
[0816] 将样品在维塔纳公司染色平台上用H&E以及ALK IHC染色。
[0817] 结果和讨论
[0818] 为了确定原始样品内含有的细胞类型的多样性，将组织切片和代表性样品都用H&E染色(图19和20以及23)。这里，图19A示出了从结肠腺癌获得的第一切片；而图19B示出了来自结肠腺癌的第二个且不同的切片。图19A和19B中的每个切片各自由病理学家获得。H&E染色的差异显示了相同肿瘤内的变化。图19C示出了从结肠腺癌制备的代表性样品的H&E染色。图20A-20C显示了从乳头状尿路上皮肾肿瘤获得的不同组织切片的H&E染色。图20A示出了取自乳头状尿路上皮肾肿瘤的第一切片；图20B示出了取自乳头状尿路上皮肾肿瘤的第二个不同切片。图10A和20B中所示的每个切片由病理学家获得。H&E染色的差异显示了相同肿瘤内的变化。图20C示出了从乳头状尿路上皮肾肿瘤制备的代表性样品的H&E染色。
[0819] 从图19和图20可以看出，尽管取自切除肿瘤不同区域的组织学切片的形态具有不同的组织学表现(A、B)，但该代表性样品(C)概括了组成每个肿瘤类型(即肿瘤，正常，免疫)的细胞中的异质性。
[0820] 为了确定组织学组织(在代表性样品中概况)中是否存在生物标记物表达的任何异质性，分析所有样品的Alk表达，可能由于EML4情况的基因组重排而产生。所有载玻片均由确定Alk DAB染色的阳性与阴性表达的病理学家复查。图21A-21C和图22A-22C显示了对于肾脏和结肠，一个组织切片证明了Alk的点状和不常见的阳性，而一个切片是阴性的。在令人惊讶的同时，这种块间染色不一致指示TNM分期系统固有的采样偏差。Alk阳性的异质性(即相对于整个肿瘤尺寸的低流行率)在用Alk IHC染色的代表性样品中是明显的，因为存在对Alk DAB呈阳性的小簇或单细胞。图21A-21C显示了从结肠腺癌获得的不同组织切片的Alk DAB染色。图21A示出了取自乳头状尿路上皮肾肿瘤的第一切片；图21B示出了取自乳头状尿路上皮肾肿瘤的第二个不同切片。图21A和21B中所示的每个切片由病理学家获得。Alk DAB染色的差异显示了相同肿瘤内的变化。图21C示出了从结肠腺癌制备的代表性样品的Alk DAB染色。
[0821] 图21C显示了对Alk呈阳性的三个结肠腺癌细胞的小簇(箭头)，并且图25C显示了6个乳头状尿路上皮癌细胞(箭头)和呈阳性的对照淋巴细胞(箭头)的小簇。图22A-C显示了从乳头状尿路上皮肾获得的不同组织切片的Alk DAB染色。图22A示出了取自乳头状尿路上皮肾肿瘤的第一切片；图22B示出了取自乳头状尿路上皮肾肿瘤的第二个不同切片。图22A和22B中所示的每个切片由病理学家获得。Alk DAB染色的差异显示了相同肿瘤内的变化。图22C示出了从乳头状尿路上皮肾肿瘤制备的代表性样品的Alk DAB染色。
[0822] 实施例6：组织样品的机械解离和均质化
[0823] 该实施例描述了用以产生代表性样品的组织样品机械解离和均质化的步骤。该方法包括切割和切碎该组织样品和单细胞解离。
[0824] 方法
[0825] 将该组织用手切割(图25A)或使用适当的食品加工工具如“榨汁器”切碎(图25B)。虽然这种方法利用了经福尔马林固定的扁桃体组织(如图25A-25B所示)，但也可以使用其他组织类型。扁桃体是新鲜订购的，在10％中性缓冲福尔马林中固定24小时，并且然后储存在纯乙醇中。将扁桃体使用解剖刀手动切块，或在榨汁器中机械解离。然后将得到的均质物脱水并在组织加工器(PROCESSOR NAME)中用石蜡灌注。取该样品的4微米切片，并且使用H&E染色来可视化组织碎片的尺寸分布。
[0826] 结果和讨论
[0827] 为了确定切碎、切割和榨汁是否产生组织碎片的均一分布，将淋巴结(扁桃体)用手切块或使用榨汁器机械解离。如在图25A和图25B中可见，将经固定的扁桃体用手划切得到具有非常均一尺寸分布的组织碎片的混合物。该组织碎片含有数万至数十万个细胞，并以组织学上可识别的方式维持器官结构。
[0828] 使用榨汁器解离淋巴结得到含有数百至数千个细胞的较小组织碎片(图25C和图25D)。由榨汁器产生的组织碎片呈现组织均质物，以此使得解剖病理学家可以评估细胞与细胞的相互作用。
[0829] 考虑的是，切碎、榨汁和共混可以独立使用或组合使用。例如，可以首先将切除的肿瘤切碎，产生均一的组织碎片群体用于石蜡包埋和组织学检查。然后可以将切碎的均质物样品榨汁或共混以进一步解离该组织，在制备中用于旨在单细胞或单核分离的进一步酶促解离。
[0830] 实施例7：均质物(或代表性样品)解离成单细胞
[0831] 本实施例描述了将衍生自器官、组织或肿瘤(通过共混、榨汁或切碎)的代表性样品进一步加工成单细胞以进行定量、分离、和生物标记物分析。方法包括机械解离、过滤、酶促解离和超声处理。
[0832] 机械解离和过滤方法：
[0833] 本实施例中使用的临床肿瘤样品是从GLAS组织顾问公司(GLAS Tissue Consultants)获得的前述大结肠腺癌。如上所述制备淋巴结(扁桃体)和结肠腺癌均质物。
使用1mm筛(研华科技制造公司(Advantech Manufacturing)，威斯康星州新柏林)过滤均质物的样品并收集无法穿过该筛的材料。然后使用20微米过滤器(Pluriselect，圣地亚哥，加利福尼亚州)对穿过1m筛的均质物样品进行过滤。收集不能穿过20微米过滤器的材料。然后将能够穿过20微米过滤器的均质物通过10微米过滤器并收集通过的单细胞。将穿过10微米过滤器的单细胞以800g离心5分钟，并重悬于具有3％BSA和0.09％叠氮化钠的PBS中，重复三次，并弃去上清液。将单细胞准备好以在4℃储存。
使用1mm筛(研华科技制造公司(Advantech Manufacturing)，威斯康星州新柏林)过滤均质物的样品并收集无法穿过该筛的材料。然后使用20微米过滤器(Pluriselect，圣地亚哥，加利福尼亚州)对穿过1m筛的均质物样品进行过滤。收集不能穿过20微米过滤器的材料。然后将能够穿过20微米过滤器的均质物通过10微米过滤器并收集通过的单细胞。将穿过10微米过滤器的单细胞以800g离心5分钟，并重悬于具有3％BSA和0.09％叠氮化钠的PBS中，重复三次，并弃去上清液。将单细胞准备好以在4℃储存。
[0834] 使用Multisizer 4e库尔特计数器(Coulter Counter)(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter)，印第安纳波利斯，印第安纳州)来表征从过滤步骤收集的单细胞的尺寸分布。使用Attune聚焦流式细胞仪(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))来表征所有单细胞，并分选和收集该单细胞。使用超声波仪将多细胞簇机械解离为单细胞。
在一些情况下，使用250单位的胶原酶(泰普公司(TYPE&COMPANY))通过在37℃在汉克斯(Hanks)平衡盐缓冲液中孵育1小时来使该多细胞簇经生化法解离。孵育后，将混合物在
800g离心1分钟，并重悬于PBS中。
在一些情况下，使用250单位的胶原酶(泰普公司(TYPE&COMPANY))通过在37℃在汉克斯(Hanks)平衡盐缓冲液中孵育1小时来使该多细胞簇经生化法解离。孵育后，将混合物在
800g离心1分钟，并重悬于PBS中。
[0835] 使用EpCam抗体(维塔纳医学系统公司，图森，亚利桑那州)来染色来自滤液的上皮细胞。将一级抗体与样品核在37℃孵育1h或在4℃孵育24h。对照样品未接受一级抗体。孵育后，将样品用EZ prep缓冲液洗涤6次，并且然后在37℃重悬于在MACS缓冲液中的山羊-抗小鼠Alexa-488抗体(1:500)中0.5-1小时。一些样品也用3μM DAPI染色10分钟。将染色的样品在4℃用反应缓冲液洗涤4次。将50μl样品铺在VWR plus载玻片上并立即通过玻璃盖玻片成像。在由内部软件控制的Zeiss Axio epifluorescent显微镜上获取染色的细胞的图像，并将图像使用ImageJ进行分析。将染色的核在4℃在MACS-T-STC中储存。
[0836] 结果和讨论
[0837] 连续过滤步骤的目标是确定包括该均质物的各种尺寸的粒子的组成。在每个步骤，通过光学显微镜仔细分析不能穿过过滤器的组织(图29)。如图26A所示，不能穿过1mm筛的材料主要由结缔组织和肌纤维构成。这种材料缺乏细胞性，并且因此被丢弃。不能穿过20微米过滤器的材料主要由大的多细胞簇构成(图26B)。不能穿过10微米过滤器的材料主要由小的多细胞肿瘤细胞簇构成(图26C)，而穿过10微米过滤器的材料是在均质化过程期间释出的单细胞(图26D)。因此，用以建立代表性样品的人类肿瘤的均质化生成了从大的多细胞簇到单个细胞的组织碎片尺寸分布。
[0838] 使用Multisizer 4e库尔特计数器(贝克曼库尔特公司，印第安纳波利斯，印第安纳州)来测量产量(每克均质化组织的单细胞数目)以及从结肠腺癌分离的解离单细胞的尺寸。将在4到10微米之间的粒子进行计数并视为单细胞。使用该过滤方法每克肿瘤均质物的产量为大约320,106个细胞/克。分离自该肿瘤均质物的细胞分布在两个不同的群体中；直径范围4-5.5微米的细胞和直径在5.5-9.3微米之间的细胞(图27A)。对从均质化的扁桃体纯化的细胞进行相同的分析，并且从扁桃体分离的大部分细胞直径在4至5.5微米之间(图27B)。
[0839] 分离自结肠肿瘤和扁桃体的单细胞中的尺寸分布表明，直径在4和5.5微米之间的细胞是免疫细胞，而5.5和9.3微米之间的细胞是肿瘤细胞。为了证实这一发现，从结肠肿瘤分离的单个肿瘤细胞对EpCam进行荧光染色以确定肿瘤细胞组分的尺寸。将荧光染色的细胞首先铺在显微镜载玻片上，并使用荧光显微镜进行成像来评价染色程序(图28)。在Attune流式分选仪上进行分选后，使用库尔特计数器重新评估分选的EpCam阳性细胞的尺寸。因此，EpCam阳性肿瘤细胞的尺寸分布与不存在于非含肿瘤扁桃体但存在于来自均质化结肠肿瘤的单细胞中的细胞群相关。
[0840] 这些数据表明，来自均质化结肠肿瘤的经机械解离和过滤的细胞由两个不同的群体组成：正常免疫细胞和肿瘤细胞。使用粒度分析仪可以容易区分这两个群体，并且使用流式细胞术和分选可以进一步分析分离的细胞。该数据进一步表明可以采用基于尺寸的分离方法(尺寸排阻柱、微流体装置、密度离心等)来分离产生富集的肿瘤或免疫细胞样品的两个群体。
[0841] 多细胞碎片的解离
[0842] 未穿过20和10微米过滤器的多细胞碎片(或簇)被进一步加工以生成单细胞。使用探头超声波仪进行超声波处理，试图将多细胞碎片物理解离成单细胞。将多细胞碎片暴露于增加量的声能，并通过使用库尔特计数器分析粒子的尺寸来评估肿瘤细胞的释出。如图35所示，增加量的声能导致直径在5.5和9.3微米之间的粒子的释放(245J图中的箭头)。物理释出的细胞与从上述实施例的均质物分离的肿瘤细胞相关，表明该多细胞碎片主要由肿瘤细胞构成。
[0843] 为了进一步增强多细胞碎片向单细胞的解离，将多细胞碎片的样品与胶原酶进行孵育。在1型胶原酶中孵育72小时后，分析胶原酶处理的多细胞碎片的尺寸分布。如图33A和33C所示，单独的胶原酶不会导致单细胞从多细胞碎片中释出。在胶原酶处理后添加超声处理时，大部分多细胞碎片解离成正常免疫细胞(直径4-5.5微米)和肿瘤细胞(直径5.5-9.3微米)的尺寸范围内的单个粒子。这些数据证明，衍生自人体器官、组织和肿瘤的代表性样品可以使用机械、物理和生化方法进一步加工成单细胞。
[0844] 来自代表性样品的单细胞的生物标记物表征
[0845] 通过荧光染色和流式细胞术分析进一步表征来自结肠肿瘤代表性样品的单细胞的生物标记物表达。流式细胞术是针对取自活检样品的活细胞的常用诊断分析方法。数千至数十万个细胞可以被询问是否存在生物标记物，同时定量细胞数目和每个细胞的生物标记物表达水平。本领域技术人员将认识到衍生自切除的器官、组织或肿瘤的经福尔马林固定的组织样品不适用于流式细胞术，因为福尔马林固定样品的当前分析方法涉及石蜡包埋和组织切片，而不是解离成单细胞。以下实施例目标在确定是否可以通过流式细胞术分析由结肠肿瘤产生的加工细胞。
[0846] 方法：
[0847] 将细胞用来自维塔纳医学系统公司的CD3、CD8、CD45、CK8/18、EGFR和PD-L1抗体染色。在一些情况下，使用酪胺信号扩增来改进荧光染色。将细胞(大约3 x 107个细胞/管)以300x g离心2分钟，之后重悬于0.3ml 3％H2O2中。孵育15分钟后，将细胞用PBS中的0.1％吐温20、0.1％BSA洗涤3次。持续5分钟添加TSA阻断缓冲液(0.3ml)，随后在37℃下在0.2ml一级抗体中孵育30分钟。然后将细胞用PBS中的0.1％吐温20、0.1％BSA洗涤3次，并且然后在
37℃重悬于与辣根过氧化物酶缀合的0.2ml山羊抗物种抗体中30分钟。接下来将细胞在
1.2ml 20μM酪胺-罗丹明101中稀释并孵育5分钟，随后在1.2ml TSA H2O2中孵育30分钟。将细胞用PBS中的0.5％葡聚糖、0.1％吐温20、0.1％BSA洗涤3次，并重悬于MACS-T-STC中以进行储存。在成像或流式细胞术前，将细胞用3μM DAPI染色10分钟。
37℃重悬于与辣根过氧化物酶缀合的0.2ml山羊抗物种抗体中30分钟。接下来将细胞在
1.2ml 20μM酪胺-罗丹明101中稀释并孵育5分钟，随后在1.2ml TSA H2O2中孵育30分钟。将细胞用PBS中的0.5％葡聚糖、0.1％吐温20、0.1％BSA洗涤3次，并重悬于MACS-T-STC中以进行储存。在成像或流式细胞术前，将细胞用3μM DAPI染色10分钟。
[0848] 通过流式细胞术进行的生物标记物分析
[0849] 使用Attune流式细胞术系统(赛默飞世尔科技公司)来定量表达各种生物标记物的细胞的百分比。对照(未用一级抗体染色的细胞)和样品(用一级抗体染色的细胞)之间荧光强度的变动与全细胞群内靶细胞的丰度成正比，并用来计算该群体中阳性细胞的百分比。如图29A-29E所示，对于测试的所有生物标记物，检测到高于背景的荧光信号。从相同的样品检测免疫系统的组分和肿瘤的组分；与CK8/18和EGFR相比，CD45和CD8(图29A-29C)。在一些情况下，免疫细胞和肿瘤细胞可以同时染色(图29E中的PD-L1)。此外，流式细胞术分析中染色阳性的细胞的百分比与来自相同临床病例的包埋代表性样品的IHC染色相似(图29A-29E)。
[0850] 用这些数据，诸位发明人证明了进一步将衍生自器官、组织和肿瘤的均质物解离成单细胞以通过流式细胞术进行生物标记物分析所需的方法和工作流程。本领域技术人员将认识到由流式细胞术生成的数据的定量性质。用此数据，现在可以通过评估每个细胞类型的相对丰度来计算来自切除肿瘤的细胞组分的百分比。例如，根据上述数据，在此实施例中分析的结肠肿瘤中33％的细胞是肿瘤细胞。此外，大约33％的肿瘤细胞为PD-L1阳性(PD-L1流式分析中的DAPI变动，图29E)，并且甚至更小百分比的细胞为EGFR阳性(EGFR阳性细胞，图29F)。在结肠肿瘤中，20％的细胞是免疫细胞(CD45阳性细胞，图29C-)，并且这些细胞仅部分是CD8阳性的(图29D)。
[0851] 单细胞的分离和捕获
[0852] 分离和捕获来自结肠肿瘤代表性样品的单细胞，以使得能够对特定细胞群体进行生物分子分析。在这个实施例中，使用了两个类型的分离和捕获，通过磁珠进行流式分选和亲和分选。
[0853] 为了鉴定和捕获来自从结肠腺癌代表性样品解离的单细胞的肿瘤细胞，使用先前描述的酪胺染色方法将细胞针对EpCAM(上皮细胞粘附分子)染色以沉积罗丹明101并用DAPI染色DNA。当在Sony SH800细胞分选仪上分析时，EpCAM阳性肿瘤细胞(图30A中的绿色群体)在反向栅控到DAPI强度曲线时显示更高的DNA含量(图30B)。具有二倍体DAPI强度的EpCAM阴性细胞是正常细胞。在这个实施例中，分选EpCAM阳性且含有高DAPI水平的细胞。当分选的细胞进而在库尔特计数器上分析尺寸时，该尺寸范围为5.5和9.3微米之间的直径(图27C)。本领域技术人员将认识到也可以分选具有二倍体DAPI染色的EpCAM阴性细胞。这些数据证明了使用流式分选仪分离和捕获来自衍生于器官、组织和肿瘤的代表性样品的不同细胞群的能力。
[0854] 分离和捕获特定细胞群的分离方法是使用磁珠通过亲和力选择去除表达特定细胞表面标记物的细胞群。在此实施例中，将来自淋巴结的单细胞与磁珠(Dynabeads，赛默飞世尔科技公司)进行孵育，偶联至CD3或CD8一级抗体。根据制造商方案将细胞与抗体缀合的磁珠进行孵育。孵育后，通过磁力将磁珠带到管的底部，并从管中移出含有未结合的细胞的液体。使用流式细胞术来证明来自该样品的CD3或CD8阳性细胞的耗减，这相似于图31A中的分析。特定细胞类型的耗减可见于图34B，其中在与相应的抗体缀合的磁珠孵育后，表达CD3或CD8的细胞的百分比降低。
[0855] 用这些数据，诸位发明人证明可以分离并捕获衍生自器官、组织和肿瘤的代表性样品生成的单细胞以进一步诊断研究。本领域技术人员将会理解，可以使用任何数目的诊断方法来分析纯化的细胞群，如PCR、NGS、流式细胞术、单细胞测序或转录组学、基于质谱的蛋白质组学分析和其他诊断方法。
[0856] 实施例8：组织样品的存活力和稳定性研究
[0857] 新鲜组织存活力
[0858] 将新鲜扁桃体在IKA共混器中以没有镁且没有钙的1:1(w:v)DPBS在3000rpm共混2分钟(Rep)，并与用解剖刀切碎组织然后胶原酶消化用于原代细胞培养(Trad)的传统方法制备的扁桃体进行比较(Donnenberg,et al.,Methods Mol Biol.,568:261-279,2009)。
[0859] 通过测量RNA(细胞质损害)和DNA(核损害)向上清液中的释放来评估组织损害(图34)。由于均质化不需要任何酶促处理，因此扁桃体组织的均质化比切碎随后胶原酶促消化的传统方法远快得多。如图37所示，新鲜扁桃体的均质化生成的损害比传统方法小，如通过DNA和RNA释出到上清液中所测量的。误差条代表两个实验的标准误差。
[0860] 来自福尔马林固定的组织的核酸、蛋白质和细胞的稳定性研究
[0861] 在指定温度下，将来自胰腺高分化神经内分泌赘生物、乳头状尿路上皮癌和结肠腺癌的组织(分别为图35A、35B和35C)在标准细胞储存溶液(20％甘油，10％DMSO，5％MeOH和100％MeOH)中孵育6个月。在安捷伦生物分析仪上分离并分析RNA。如图35A、35B和35C所示，所有存储方法都保留了RNA完整性，尽管处于不同的水平，如生物分析仪迹线中18S RNA峰强度的细微差异所示(参见图38A中的20％甘油样品)。这些数据指示，福尔马林固定的代表性样品的多种储存方法随时间保存RNA的完整性。
[0862] 如通过针对c-Met的IHC染色测量的，在整个6个月的测试期间的所有储存条件和所有温度下，蛋白质在乳头状尿路上皮癌和结肠腺癌(分别为图36A和36B)中都相当稳定。在六个月的储存期后，将样品铺在载玻片上，针对c-Met染色，并用明视野显微镜成像。虽然样品的一些聚集确实发生，并且细胞的形态可能随时间而恶化，但是在所有缓冲液组合物的整个稳定时间过程中都可以检测到阳性和阴性染色细胞。
[0863] 通过评估PBS中的“快速冷冻”来进一步研究代表性样品的储存。将30毫升结肠腺癌代表性样品在干冰/醇浴中在PB中快速冷冻并储存在-80℃下。然后将它们在37℃解冻，并在10次随后的冻融循环中取出等分试样。将所有在冻融循环后取得的样品铺在载玻片上，其中H&E染色用于评价细胞形态的稳定性，并且c-Met IHC用于评价蛋白质的稳定性。如图37A所示，当样品快速冷冻并在-80℃下储存时，细胞形态在所有的冻融循环中都非常稳定，基于蛋白质的生物标记物也如此(图37B)。
[0864] 在10次冻融循环中，在相同的样品中评估RNA和DNA的稳定性。使用标准苯酚/氯仿方法从样品中提取总DNA和RNA，并使用安捷伦生物分析仪进行分析。在冻融循环过程中DNA和RNA都是稳定的，DNA比RNA更有复原力(图38)。
[0865] 用这些数据，诸位发明人已经证明了由器官、组织和肿瘤制成的代表性样品的多种储存方法。
[0866] 实施例9：来自代表性样品的肿瘤核的富集
[0867] 本实施例描述了将衍生自器官、组织或肿瘤(通过共混、榨汁或切碎)的经福尔马林固定的代表性样品进一步加工成单个核以进行定量、分离、和生物标记物分析。方法包括机械解离、过滤和酶促解离。方法的独特之处包括：1)建立最佳方法，以从经福尔马林固定的代表性样品中提取和解聚含有核的单粒子；2)评估自相同代表性样品的不同等分试样进行的粒子分离的再现性；3)建立用于监测机械解离和核提取方法对样该品造成细胞破坏的程度的方法；4)鉴定与从代表性样品中提取的核保持相关的标记物，其将用于区分肿瘤和正常亚群；5)建立用以通过流式细胞术分析从经固定的代表性样品中提取、染色的材料的方法学；6)建立进行以下项所需要的肿瘤粒子的数目：a)获得用于测序的足够DNA，以及b)保持对低流行率亚克隆的分析灵敏度。
[0868] 方法和材料
[0869] 用来自IKA-Works(0004180001，施陶芬，布赖斯高，德国)的IKA Works管磨机控制系统和来自美天旎生物技术公司(特罗，德国)的gentleMACS解离器进行机械解离。使用的所有过滤器均来自Pluriselect(圣地亚哥，加利福尼亚州)。使用的缓冲液来自以下公司：CC1(950-124；维塔纳医学系统公司，图森，亚利桑那州)，EZ prep(950-102；维塔纳医学系统公司)，反应缓冲液(950-300；维塔纳医学系统公司)，autoMACS缓冲液(130-191-221，美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotech))，dPBS(14190，飞世尔科技公司(Fisher Scientific)，美国)。吐温20购自美国飞世尔科技公司(AC233362500)。以下试剂购自美国西格玛公司(Sigma)：NP40(74385)，DNA酶(AMPD1)，四氯化精胺(S2876)，DAPI(D9542)，胰蛋白酶(59427C)，胃蛋白酶(P7012)，链霉蛋白酶(P5147)。其他酶来自以下公司：蛋白酶K(0706，VWR，美国)，Accumax(AM105，创新细胞技术公司，圣地亚哥，加利福尼亚州)，胶原酶H(11074032001，罗氏公司，巴塞尔，瑞士)。酪胺-罗丹明101是使用购自西格玛公司的化学品在内部合成。小鼠抗细胞角蛋白8/18抗体(760-4344)、小鼠抗CD45抗体(760-2505)和山羊抗小鼠HRP缀合抗体(760-4310)来自维塔纳医学系统公司。与Alexa 488缀合的山羊抗小鼠购自英杰公司(A-11001)。
[0870] 组织模型和临床样品
[0871] 从西北医学中心(图森，亚利桑那州)获得人扁桃体，并将其在维塔纳医学系统公司在10％中性缓冲福尔马林中固定24小时。从GLAS/(温斯顿-塞勒姆，北卡罗来纳州，http://glaswpcopy.wpengine.com/)获得肿瘤样品并预先固定在福尔马林中。
[0872] 苏木精和伊红染色
[0873] 将代表性样品铺在VWR plus载玻片上的autoMACS缓冲液中。使用维塔纳医学系统公司Symphony平台(维塔纳医学系统公司，图森，亚利桑那州)和相应的H&E Symphony试剂(维塔纳医学系统公司，图森，亚利桑那州)进行苏木精和伊红(H&E)染色。
[0874] 免疫组织化学
[0875] 使用维塔纳医学系统公司Benchmark XT平台(维塔纳医学系统公司，图森，亚利桑那州)，将组织切片或石蜡包埋的代表性样品进行基于明视野DAB的免疫组织化学(IHC)。使用来自维塔纳公司的OptiView DAB检测试剂盒(760-700)进行生物标记物的可视化。将抗体孵育4分钟。在Zeiss Axio明视野显微镜上采集图像。
[0876] 流式细胞术
[0877] 对于聚集分析，将样品通过40μm过滤器过滤，之后在Attune Acoustic Focusing流式细胞仪(赛默飞世尔科技公司，美国)上进行分析。过滤前将粒子与DAPI(3μM)孵育10分钟。如果流速大于每分钟4,000个事件，则将样品稀释。
[0878] 对于流式分选，将样品在染色前通过40μm过滤器过滤(见下文)，并在Sony SH800细胞分选仪上分析。使用DAPI脉冲宽度和高度进行双粘体辨别。
[0879] 用于从代表性样品提取含单核的粒子的方法
[0880] 使用经福尔马林固定的扁桃体作为模式系统，研究了用于将代表性样品的等分试样解离成单粒子的各种酶促方法。在酶促步骤之前，将扁桃体材料首先在IKA共混器中在autoMACS缓冲液中机械解离，在已加热至85℃的CC1缓冲液中以1:1稀释，并使用gentleMACS解离器进一步在gentleMACS管中共混。将样品进行两轮85℃加热持续5分钟，随后共混。在机械解离之后，通过视觉监测已经消化和通过100μm过滤器过滤的H&E染色材料来定性评价不同的酶促条件。通过在任何灭活步骤后将材料在4℃孵育24小时，将材料铺在VWR plus载玻片上，用H&E染色并监测细胞的形态或核的完整性来测试酶失活。测试的条件概述于表3中。
[0881] 表3 针对机械和酶促消化方法测试的不同条件
[0882]
[0883] 比较来自每种解离方法的粒子产量
[0884] 从代表性扁桃体样品的连续等分试样并排比较不同的酶解和机械解离方法。在表6中总结了比较的方法。通过使用血细胞计数器对每克原料每种方法释出的粒子数目进行计数来评估每种方法的有效性。在指示处一式三份地分析生物样品。
[0885] 测量细胞破坏
[0886] 保留解离制备过程中来自每个步骤的上清液并分析释出到溶液中的DNA，作为核破坏的指标。将上清液分为三份，用于技术重复。在必要时，使用GeneVac(SP科技公司(SP Scientific))浓缩样品。根据制造商的说明书，使用罗氏公司(Roche)高纯FFPE试剂盒从剩余的残余物中提取DNA。还从0.1g等分试样中提取DNA，以及取自主体均质物的保留的加工液充当参考样品。使用Nanodrop-1000分光光度计(赛默科技公司(Thermo Scientific))评估DNA产量。从加工液提取的DNA表示为从参考样品中提取的DNA的百分比，以充当细胞核损害的替代物，假定释放的DNA的百分比与受损核的百分比成比例。
[0887] 粒子聚集的最小化
[0888] 将使用蛋白酶K-胃蛋白酶方法从代表性扁桃体样品中分离的粒子用DAPI(3μM，10分钟)染色以可视化DNA含量，并通过流式细胞术分析。通过含有双粘体、三粘体和>三粘体DNA水平的粒子证明聚集。测试以下条件以确定会有助于粒子解聚的添加剂：1％吐温20，1％NP40，DNA酶，1.5mM亚精胺四氯化物，5mM CaCl2。在每种添加剂的存在下，使用流式细胞术用来自正常扁桃体制备物的DAPI直方图来评估单一体、双粘体和>三粘体DNA水平的百分比。
[0889] 使用 蛋白酶K-胃蛋白酶消化方法从代表性样品中分离核
[0890] 如上所述使用CC1缓冲液对由扁桃体组织制备的代表性样品进行机械解离。对于肿瘤组织，首先在IKA共混器中以1:1肿瘤:MACS比率在MACS缓冲液中进行大量机械解离，并且然后取总均质物的等分试样并进一步在IKA共混器中以1g肿瘤组织:5ml溶液比率共混。将稀释的共混材料通过1mm x 1mm金属筛过滤，并将过滤的材料以如上所述的1g肿瘤组织:
5ml CC1缓冲液比率经CC1调节。对于扁桃体和肿瘤样品，通过在台式微量离心机(Eppendorf)中以300x g离心1分钟将CC1缓冲液交换成dPBS(1:1)；所有后续的液体交换都以相同的方式进行。离心后，将细胞沉淀物以1:1重悬于含有1mg/ml蛋白酶K的dPBS中，并在
50℃孵育10分钟。为了淬灭蛋白酶K并进一步解离，将样品在150mM NaCl(pH 1.5)中交换成
5mg/ml胃蛋白酶。用pH试纸条测试溶液的pH值，并根据需要用5M HCl重新调整至1.5-2。将样品在37℃孵育30分钟，每10分钟温和搅拌。
5ml CC1缓冲液比率经CC1调节。对于扁桃体和肿瘤样品，通过在台式微量离心机(Eppendorf)中以300x g离心1分钟将CC1缓冲液交换成dPBS(1:1)；所有后续的液体交换都以相同的方式进行。离心后，将细胞沉淀物以1:1重悬于含有1mg/ml蛋白酶K的dPBS中，并在
50℃孵育10分钟。为了淬灭蛋白酶K并进一步解离，将样品在150mM NaCl(pH 1.5)中交换成
5mg/ml胃蛋白酶。用pH试纸条测试溶液的pH值，并根据需要用5M HCl重新调整至1.5-2。将样品在37℃孵育30分钟，每10分钟温和搅拌。
[0891] 对于肿瘤组织，在两个酶促消化步骤期间，通过在ThermoMixer F1.5(Eppendorf)中以600rpm搅拌该管来改进产量。用5M NaOH将pH调整至高于8来使胃蛋白酶失活，并且然后将含胃蛋白酶的溶液交换为autoMACS缓冲液、1％吐温20和1.5mM四氯化亚精胺(MACS-T-STC)。将消化的样品通过40微米过滤器过滤，使用10ml MACS-T-STC，通过离心收集，并且在下游应用之前重悬于500μl MACS-T-STC中以进行储存。通过监测在Multisizer 4e(贝克曼库尔特公司)上测量的3-30微米范围内的粒子的产量(归一化至肿瘤组织的初始“干”重)来评估肿瘤核制备物在相同肿瘤的多个制备物之间的再现性。通过监测来自相同肿瘤的不同制备物的粒子的尺寸分布来进一步评估再现性。
[0892] 从代表性样品中分离的染色材料
[0893] 标准免疫荧光
[0894] 在重悬于200ul小鼠抗细胞角蛋白8/18一级抗体之前，将使用蛋白酶K-胃蛋白酶方法从1g代表性肿瘤样品制备的核通过以300x g离心1分钟来收集。将一级抗体与样品核在37℃孵育1h或在4℃孵育24h。对照样品未接受一级抗体。孵育后，将样品用EZ prep缓冲液洗涤6次，并且然后在37℃重悬于在MACS缓冲液中的山羊-抗小鼠Alexa-488抗体(1:500)中0.5-1小时。一些样品也用3μM DAPI染色10分钟。将染色的样品在4℃用反应缓冲液洗涤4次。将50μl样品铺在VWR plus载玻片上并立即通过玻璃盖玻片成像。在由内部软件控制的Zeiss Axio epifluorescent显微镜上获取染色的细胞的图像，并将图像使用ImageJ进行分析。将染色的核在4℃在MACS-T-STC中储存。
[0895] 使用酪胺信号放大(TSA)染色
[0896] 将通过机械均质化或蛋白酶k-胃蛋白酶方法(3 x 107个粒子/管)分离的粒子核以300x g离心2分钟，之后重悬于0.3ml 3％H2O2中。孵育15分钟后，将核用PBS中的0.1％吐温20、0.1％BSA洗涤3次。持续5分钟添加TSA阻断缓冲液(0.3ml)，随后在37℃下在0.2ml一级抗体中孵育30分钟。将核用PBS中的0.1％吐温20、0.1％BSA洗涤3次，并且然后在37℃重悬于与辣根过氧化物酶缀合的0.2ml山羊抗物种抗体中30分钟。将核在1.2ml 20μM酪胺-罗丹明101中稀释并孵育5分钟，随后在1.2ml TSA H2O2中孵育30分钟。将核用PBS中的0.5％葡聚糖、0.1％吐温20、0.1％BSA洗涤3次，并重悬于MACS-T-STC中以进行储存。在成像或流式细胞术之前，将核用3μM DAPI染色10分钟。在Olympus BX63epifluorescent显微镜上获取染色的核的图像，并使用ImageJ进行分析。
[0897] 校准通过机械和酶促方法分离的每个粒子数目的DNA产量
[0898] 使用如上所述的蛋白酶K-胃蛋白酶方法从扁桃体分离核。使用血细胞计数器对粒子进行计数。根据制造商的说明书，使用罗氏公司(Roche)高纯FFPE试剂盒从105、106和107个粒子制备DNA。使用Nanodrop-1000分光光度计(赛默科技公司(Thermo Scientific))评估DNA产量。
[0899] 结果
[0900] 将代表性样品进一步加工成单个核
[0901] 将代表性样品进一步加工成单个核需要去除细胞膜。当前用于新鲜细胞的核分离方法不需要酶来释出核，并且从经福尔马林固定的样品进行的核分离不是常用方法。为了有效地分离单个核，在保持使得能够区分正常核与肿瘤核的细胞骨架标记物的同时，开发了酶促方法以揭示核，而不存在从经处理的核释出DNA的不当损害。
[0902] 评价多种酶消化细胞膜(远离核)的能力，包括链霉蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶、Accumax、胶原酶H。图43显示了在不同条件下被胃蛋白酶或胰蛋白酶消化的样品的例子。右下图中存在的胀大的碎片化核指示过度消化。
[0903] 在确定每种酶的条件和淬灭后，对来自经福尔马林固定的扁桃体组织的代表性样品的平行等分试样进行每种方法的并行比较。参见表3。如方法部分所述，每种方法也与单独的机械均质化进行比较。图43显示蛋白酶K处理随后胃蛋白酶消化使得从代表性样品释出大部分粒子。尽管本实验在0.1mg/ml和1mg/ml蛋白酶K之间显示很小差异，但用肿瘤样品进行的进一步实验已经证明1mg/ml蛋白酶K产生最一致的结果(未显示)。
[0904] 与机械解离相比，酶促解离增加了粒子产量
[0905] 针对三个独立扁桃体样品，将蛋白酶K-胃蛋白酶的解离方法与单独的机械解离进行比较。图44A-44C显示蛋白酶K-胃蛋白酶方法显著改进从代表性样品释出的粒子的数目。有趣的是，H&E染色结果显示由蛋白酶K-胃蛋白酶方法释出的许多粒子由粘附或不粘附细胞质碎片的核组成，而机械分离的样品含有更完整的细胞材料(图48，下图)。
[0906] 来自肿瘤的核制备物在产率和粒度分布上是可再现的
[0907] 为了确定来自相同代表性肿瘤样品的核制备物的再现性，评估了方法的一致性和各个等分试样中存在的群体的一致性。从取自总均质物的不同等分试样(约1克)中，使用如上所述的蛋白酶K-胃蛋白酶方法制备核。图45A显示跨取自相同代表性样品的多个等分试样，从两个不同肿瘤(结肠和肺)制备的核的产率是高度一致的。进一步分析从结肠肿瘤分离的粒子的尺寸分布，以确定跨三种不同制备物的非常可再现的且具特征性的尺寸分布(图45B)。很明显，核分布为两个特征尺寸的群体(图45B)。这些数据证明相同代表性样品的不同等分试样含有一致的细胞组成，并且开发的用以提取核的方法产生两个不同核群体的一致产量。
[0908] 由于解离导致的细胞损害的估计
[0909] 将代表性样品进一步加工成单个核可导致DNA从核区室中释出。将DNA释放到上清液中是对核的损害的潜在读出。图46显示在通过机械或蛋白酶K-胃蛋白酶方法加工扁桃体材料期间释放总DNA的4％左右。三种不同肿瘤的加工导致释放的DNA少于10％(图46)。有趣的是，相似的核损害百分比出现在机械和酶促方法二者中，证明蛋白酶K-胃蛋白酶促方法分离完整的核而不损害它们。
[0910] 逐渐减少的核聚集
[0911] 初始流式细胞术实验显示约35％的粒子以聚集状态存在，这由更高DAPI染色强度的峰(图47，图(ii)，R2(绿色)和R3(粉红色))证明。当反向栅控到侧向散射与前向散射的点图(图(i)，绿色和粉红色群体)上时，落在较高DAPI强度图的峰中的这些粒子映射到具有较高向前和侧向散射的区域，指示较大尺寸。虽然常规双粘体辨别可以允许人们专门分析单一体核(R1，红色)，但样品中存在的单一体核的数目增加了。添加了几种添加剂(参见方法)以减少分离的核的聚集。发现添加1％吐温20可将聚集粒子的数目从约35％减少至约23％(比较B中曲线的R2+R3与A中相同区域)。其他添加剂对减少聚集粒子的数目无效；然而，添加1.5mM四氯化精胺随时间维持核的完整性(未显示)。值得注意的是，与新鲜组织不同，DNA酶不能用于解聚经固定的组织，因为没有功能细胞或核膜阻止DNA酶可及细胞中的核DNA并破坏它(数据未显示)。
[0912] 细胞角蛋白与从代表性肿瘤样品中分离的核仍然关联
[0913] 为了从代表性样品中分选分离的核，鉴定与核保持关联的标记物以区分肿瘤与正常细胞。中间丝(细胞角蛋白，波形蛋白)通常与该核密切关联，并且它们也常用于鉴定来自周围正常基质的癌。假设这些可能是谱系特异性标记物，其可以在使用蛋白酶K-胃蛋白酶方法收集的分离的核粒子中染色。图48A显示具有针对细胞角蛋白8/18的特征性强免疫组织化学染色的结肠腺癌的切片，并且从来自包埋于石蜡中的相同的经固定肿瘤的代表性样品取得的切片显示相似的染色(图52B)。图48C显示使用蛋白酶K-胃蛋白酶方法从此肿瘤的代表性样品分离的材料，针对CK8/18染色并用荧光缀合的二级抗体可视化。值得注意的是，当将该样品用蛋白酶K-胃蛋白酶方法解离时，该标记物被保留，并且没有与一级抗体孵育的阴性对照样品显示出很少的背景染色(图48D)。波形蛋白与从扁桃体分离的许多核仍然关联。然而，伴随蛋白酶K-胃蛋白酶处理(未显示)，机械分离的样品中染色阳性的表面标记物CD45损失。因此，细胞角蛋白和波形蛋白将充当谱系特异性核相关标记物用于流式细胞分析和细胞分选，即使表面标记物被破坏时。其他核标记物，如谱系特异性转录因子，也可针对特定肿瘤类型进行染色。这是从经福尔马林固定的样品分离核的独特特征。
[0914] 使用酪胺信号扩增进行标记物染色的改进
[0915] 常规免疫荧光(IF)染色(图48C)没有提供足够明亮且稳定的信号以通过流式细胞术一致地解析阳性染色的群体(未显示)。通过流式细胞术分析染色样品通常需要使用直接与荧光团缀合的抗体以获得更稳定信号。从代表性样品中分离的材料面临的挑战是它衍生自通常大量福尔马林固定的肿瘤。为了能够通过流式细胞术对经固定的代表性样品进行常规分析，使用酪胺信号放大(TSA)以使用在经福尔马林固定的组织上使用的抗体进行抗体染色。对于TSA，将酪胺缀合的荧光团通过缀合至与标记物特异性一级抗体结合的二级抗体的HRP进行活化。将活化的荧光染料与一级抗体识别的标记物附近的蛋白质共价连接，其产生明亮而稳定的信号。图53A显示使用常规免疫荧光与TSA，针对CD45染色的机械解离扁桃体的比较。图53B显示了由TSA扩增的两个不同肿瘤类型的细胞角蛋白染色。注意细胞角蛋白染色样品中存在DAPI染色的细胞角蛋白阴性细胞，显示溶液中TSA的特异性。
[0916] 细胞角蛋白染色允许通过流式细胞术区分肿瘤和正常核
[0917] 接下来，使用流式细胞术分析来自结肠和肺肿瘤的代表性样品的细胞角蛋白(CK)染色和DAPI染色的核(图50)。在两种情况下，CK阳性(青绿色)和CK阴性(粉红色)群体被辨别出来(图50，图i)。CK阴性群体与二倍体DNA含量关联(图50，图片ii)，证实这些是衍生自存在于肿瘤内的正常细胞(可能是免疫细胞)群体的核。对于CK阳性群体，DAPI染色揭示了具有非整倍体DNA的核的级分(图50，图iii)，证明这些可能衍生自肿瘤细胞。对于每个样品，核被成功分选为富含正常核(图50，图iv)或肿瘤核(图v)的级分。从这些收集的群体中成功提取DNA，并可通过新一代测序(NGS)、PCR、原位杂交或其他下游分析进行分析。
[0918] 另外，图51A和51B显示来自不同肿瘤的肿瘤和正常核的百分比有所不同。对于结肠肿瘤样品，整个肿瘤被分配到不同的分仓。未定义的级分(灰色)对应于通过过滤去除的材料的重量百分比(参见方法)。通过从酶促消化之前的总粒子计数中减去酶促消化(其破坏红细胞)之后的总粒子计数来估计红细胞的百分比。根据肿瘤核的流式细胞术分析，剩余的级分被指定为肿瘤和正常。细胞水平上的肿瘤组成分析可能是诊断上相关的，特别是当试图鉴定存在于肿瘤均质物中的免疫细胞群时。
[0919] 建立来自从代表性样品分离的粒子的DNA产量
[0920] 使用流式分选来收集具有特定特征的限定数目的粒子。来自不同数目粒子的DNA产量的校准将确定从代表性样品中收集多少材料用于特定的下游分析，如NGS。图52显示来自代表性扁桃体样品的机械解离和蛋白酶K-胃蛋白酶解离粒子的DNA产量。重要的是，这些数据显示，从蛋白酶K-胃蛋白酶促方法分离的粒子提供了与由单独的机械解离分离的粒子相似的DNA产量，这指示该酶促方法保持了DNA完整性。另外，计算粒子的数目来确定检测以5％流行率存在的克隆所需的数目(表8)。这些结果将引导致力于从代表性样品中收集来自特定群体的足够数目的粒子以支持下游测序应用中的变体检测。
[0921] 表4 鉴定5％流行率亚克隆所需的粒子数的计算
[0922]
[0923] 实施例10分离的核上的原位杂交
[0924] 背景
[0925] 从代表性样品中分离核使得有机会对代表全肿瘤的多样性的肿瘤样品进行原位杂交(ISH)，以自动方式在VENTANA BenchMark自动染色平台上进行。由于缺乏石蜡包埋的组织，分离的核的ISH染色的解读可能因非特异性背景更少而更容易。
[0926] 材料
[0927] 如实施例9中所述进行机械解离。
[0928] 临床样品
[0929] 临床样品描述于实施例9中。
[0930] 苏木精和伊红染色
[0931] 将代表性样品铺在VWR plus载玻片上的autoMACS缓冲液中。使用维塔纳医学系统公司Symphony平台(维塔纳医学系统公司，图森，亚利桑那州)和相应的H&E Symphony试剂(维塔纳医学系统公司，图森，亚利桑那州)进行苏木精和伊红(H&E)染色。
[0932] 原位杂交
[0933] 依据实施例8制备分离的核，以2x107个粒子/mL铺在载玻片上并使其风干过夜。使用维塔纳医学系统公司Benchmark XT平台(维塔纳医学系统公司，图森，亚利桑那州)用Her2/Chr17双原位杂交(ISH)方案测定样品。分别使用银HRP检测和碱性磷酸酶(AP)红检测进行生物标记物的可视化。将混合抗体孵育8分钟。在Zeiss Axio明视野显微镜上采集图像。
[0934] 结果
[0935] 从结肠和肺肿瘤中分离核建立用于经福尔马林固定的组织样品的ISH分析的新样品。核的分离使得基因拷贝数的快速评估成为可能，因为周围组织不会使信号采集和解读复杂化，检测方案示于图39中。如图39所示，当Her2/Chr17DNA寡核苷酸探针与从衍生自结肠肿瘤的代表性样品分离的核杂交时，容易检测到两个Her2基因和两个17号染色体α卫星区域(分别为黑色Her2SISH和红色Chr17碱性磷酸酶信号，虚箭头和箭头指示)。有趣的是，从衍生自肺肿瘤的代表性样品分离的核的级分具有Her2基因座的扩增，如按核的百分比计的充足SISH信号所证明的(图40，在虚箭头处的Her2SISH信号)。
[0936] 用这些数据，诸位发明人证明了使用ISH询问衍生自经福尔马林固定的人类肿瘤的代表性样品的单个核的能力。分离的核为ISH提供了改进的底物，因为组织中没有残留的石蜡，这是ISH程序中背景染色的常见原因。
[0937] 实施例11：代表性样品的新一代测序分析
[0938] 背景
[0939] 新一代测序(NGS)是高通量DNA测序技术，使得能够同时分析数百万至数十亿个DNA片段。在过去的十年中，NGS技术的显著进步使得研究人员和临床医师能够将DNA突变与肿瘤异质性、靶向治疗的抗性以及癌症免疫疗法的疗效联系起来。然而，在临床中用于NGS的肿瘤样品仅仅是如上所述有偏差的FFPE组织。来自肿瘤的代表性样品的NGS分析将显著改进NGS数据的临床相关性。
[0940] 材料和方法
[0941] 使用购自沃尔玛(图森，亚利桑那州)的Hamilton Beach Single Serve共混器或通过使用来自IKA-Works(施陶芬，布赖斯高，德国)的IKA Works管磨机控制系统(0004180001)来进行肿瘤的机械解离。所有文库制备物(TruSeq Amplicon Cancer Panel)和MiSeq试剂盒(MiSeq试剂盒V2)购自Illumina公司(Illumina Inc)(圣地亚哥，加利福尼亚州)。在MiSeq(Illumina公司，圣地亚哥，加利福尼亚州)上进行测序。
[0942] 从GLAS(温斯顿-塞勒姆，北卡罗来纳州)获得结肠、肺和乳头状尿路上皮癌组织样品，从西北医院(Northwest Hospital)(图森，亚利桑那州)获得透明细胞肾癌，并且从钱德勒区域医院(Chandler Regional Hospital)(钱德勒，亚利桑那州)获得易位肾癌样品。所有组织在10％中性缓冲福尔马林中抵达维塔纳医学系统公司。
[0943] 从包装材料中移出所有组织并由病理学家检查。将组织切开以将肿瘤与正常组织分开，并取块用于传统组织学检查。通过首先称量组织，并且然后在MACS PBS(美天旎生物技术公司；特罗，德国)的1:1或1:1.25(重量:体积)溶液中共混，将每个临床样品的肿瘤和正常样本机械解离。将代表性样品在4℃储存于MACS PBS中。
[0944] 使用TRIzol(赛默飞世尔公司；沃尔瑟姆，马萨诸塞州)根据具有一个修饰的标准方案从代表性样品分离DNA。将样品在60℃在具有2mg/ml蛋白酶K(VWR；拉德诺，宾夕法尼亚州)的TRIzol中孵育过夜。在一些情况下，使用取自FFPE块的组织切片来将当前的采样方法与代表性采样进行比较。对于生成FFPE组织块的情况，从结肠、肺和易位肾样本块切出五个10μM切片，以及用苏木精和伊红(H&E)染色单个4μM切片。由鉴定肿瘤区域的病理学家审查H&E染色的载玻片。使用Millisect mesodissection仪器(罗氏公司；巴塞尔，瑞士)从剩余载玻片分离肿瘤区域。然后使用高纯FFPET DNA分离试剂盒(罗氏公司；巴塞尔，瑞士)分离DNA。
[0945] 使用Quant-iT PicoGreen dsDNA试剂盒(赛默飞世尔公司；沃尔瑟姆，马萨诸塞州)测定DNA浓度。使用Illumina公司TruSeq FFPE DNA文库制备QC试剂盒(圣地亚哥，加利福尼亚州)评估DNA质量。对于每个样品，根据制造商的方案(Illumina公司；圣地亚哥，加利福尼亚州)，将400ng的DNA用作TruSeq Amplicon-Cancer Panel文库制备试剂盒的模板。扩增后，使用Qiaquick PCR纯化试剂盒(凯杰公司(Qiagen)；德国杜塞尔多夫)清洁PCR反应。然后使用Quant-iT PicoGreen dsDNA试剂盒(赛默飞世尔公司；沃尔瑟姆，马萨诸塞州)测量DNA浓度。等量混合文库以建立4nM池化的文库。然后使用等量的0.2N NaOH使文库变性，并且然后在HT1缓冲液(Illumina公司；圣地亚哥，加利福尼亚州)中稀释至20pM。然后在加载到测序盒上之前，将每个文库在HT1缓冲液中进一步稀释至15pM。
[0946] 使用MiSeq V2试剂盒(Illumina公司；圣地亚哥，加利福尼亚州)并加载600μL的15pM池化文库在MiSeq仪器上进行测序。根据制造商的方案进行配对末端测序。
[0947] 通过使用来自Illumina公司(圣地亚哥，加利福尼亚州)的TruSeq Amplicon App和通过修饰的CAVA(变体的临床注释(Clinical Annotation of Variants))(人类遗传学威康信托中心(The Wellcome Trust Center for Human Genetics)；英国牛津)数据库来分析原始测序数据。数据集中仅包括高于5％流行率的变体，因为5％突变等位基因频率是报告NGS数据的常见截止值。
[0948] 结果和讨论
[0949] 使用48个已知癌症基因的小的靶向基因组对衍生自经福尔马林固定的人类肿瘤的代表性样品进行深度测序。为了证明癌症组织突变检测的显著改进，将代表性样品与取自相同肿瘤的组织切片进行比较。在所有情况下，该代表性样品比获取小型FFPE块的当前和历史采样方法递送显著更多的肿瘤突变。
[0950] 表5：肿瘤样品列表
[0951]
[0952] 表5总结了本实施例中用于生成代表性样品以进行NGS分析的临床样品。首先使用来自Illumina公司的TRUSeq Amplicon app分析NGS数据，以鉴定变体。此程序将测序读数与智人hg19参考基因组进行比对，以鉴定以5％流行率阈值或高于5％流行率阈值存在的点突变和缺失。在最初的数据分析之后，在代表性样品中鉴定的在取自相同肿瘤的任何FFPE块中未发现的所有突变被注释为代表性样品所独有，并且针对测试的每种肿瘤在表6-11中列出。对于测试的每种肿瘤，代表性样品含有远远多于取自相同肿瘤的FFPE块所含突变的突变。
[0953] 表6：结肠腺癌的代表性样品中的独特突变
[0954]
[0955]
[0956]
[0957]
[0958] 表7：易位肾癌的代表性样品中的独特突变
[0959]
[0960]
[0961]
[0962]
[0963] 表8：肺鳞状细胞癌的代表性样品中的独特突变
[0964]
[0965]
[0966] 在FFPE块中发现了未在代表性样品中发现的突变，然而与代表性样品相比，这些块独特的突变要少得多(表9-12)。
[0967] 表9：仅结肠腺癌中突变的块
[0968]
[0969] 表10：仅易位肾细胞癌中突变的块
[0970]
[0971] 表11：肺鳞状细胞癌中独特于FFPE块的突变
[0972]
[0973] 表12：每个样品类型的独特突变的数目
[0974]
[0975] 使用CAVA数据库进一步针对结肠腺癌、易位肾细胞癌和肺鳞状细胞癌分析NGS数据，来确定导致编码区变化(例如导致氨基酸变化的错义突变)的突变的数目。表13-15显示了导致编码变化的突变，表明这些突变可能具有研究和/或临床意义。
[0976] 表13：结肠腺癌的代表性样品中的致病性突变
[0977]
[0978] 表14：易位肾癌的代表性样品中的致病性突变
[0979]
[0980]
[0981] 表15：肺鳞状细胞癌的代表性样品中的致病性突变
[0982]
[0983]
[0984] 有了这些数据，诸位发明人已经证明，代表性样品优于临床病理学和肿瘤学中的当前采样技术。此外，突变的流行率变化证明，来自代表性肿瘤样品的NGS分析使得能够检测人肿瘤内的克隆和亚克隆突变。总之，这些数据证明，来自人类切除肿瘤的代表性样品可用于询问癌症的基因组多样性。
[0985] 实施例12：将代表性样品包埋在石蜡中用于组织学分析
[0986] 背景：
[0987] 可以将衍生自器官、组织或肿瘤的代表性样品包埋在石蜡中以生成含有组织的细胞碎片的样品类型，从而保持原始器官、组织或肿瘤内含有的结构之间的解剖关系。取自包埋代表性样品的组织切片可以由解剖病理学家分析，或使用数字显微镜扫描系统分析。可以进一步询问来自数字扫描系统的数据以定量生物标记物之间或患者之间的异质性水平。此外，扫描系统的输出可以用作异质性的数学分析的输入，如下所示。
[0988] 材料与方法：
[0989] 从西北医院(奥罗谷，俄亥俄州)购买新鲜扁桃体，并在抵达后在10％中性缓冲福尔马林中固定。通过将整个扁桃体放入组织盒中，随后进行脱水和石蜡灌注，将一些扁桃体样品加工成FFPE块。扁桃体的代表性样品按前面实施例所述进行。衍生自人肺和结肠肿瘤的代表性样品是与实施例11中所述相同的样品。将来自扁桃体、结肠肿瘤和肺肿瘤的代表性样品的样品包裹在显微镜镜片纸中并置于组织盒中。将组织盒置于二甲苯中，并在组织加工器(莱卡生物系统公司(Leica Biosystems)，韦茨拉尔，德国)中脱水，并且然后包埋在蜡中。四微米切片取自分析的所有块。
[0990] 对于IHC，使用维塔纳医学系统公司Benchmark XT平台(维塔纳医学系统公司，图森，亚利桑那州)用OptiView DAB IHC方案对载玻片进行染色。使用OptiView DAB检测试剂盒进行抗体的可视化。抗体按照包装插入说明书进行孵育。
[0992] 结果和讨论
[0993] 许多组织学染色的解读需要保存组织架构，例如免疫细胞对肿瘤细胞的取向。因此，肿瘤解离成单个细胞可能不适用于所有组织学测定。为了确定衍生自完整器官的经机械解离的代表性样品是否可以包埋在蜡中、进行组织学切片并评估具体的架构特征，将整个扁桃体在IKA管磨机中进行机械解离。将扁桃体均质物样品脱水并包埋在蜡中，取4微米切片并置于载玻片上，并在维塔纳公司BenchMark XT上针对各生物标记物进行染色。
[0994] 图53A和53B是取自用泛角蛋白抗体染色的完整扁桃体的组织切片的整个载玻片图像。图53A描绘了针对泛角蛋白由DAB检测的正常扁桃体的传统组织学切片。图53B是针对泛角蛋白由DAB检测的来自扁桃体代表性样品的切片。扁桃体的组织和结构在图53A中的框中进一步突出，其中棕色的上皮组织与含有许多不同类型的淋巴细胞的多个生发中心相邻。当将均质化扁桃体样品包埋在石蜡中并切片时，保存此组织结构(图54A和54B)。图54A描绘了针对CD8由DAB检测的正常扁桃体的传统组织学切片。图54B描绘了针对CD8由DAB检测的来自扁桃体代表性样品的切片。当针对CD8阳性细胞染色时，整个扁桃体的切片和均质化扁桃体均展现围绕圆形生发中心的CD8阳性细胞。这些数据证明衍生自器官、组织和肿瘤的经石蜡包埋的代表性样品能够生成保留解剖学和组织架构的组织学样品以用于进一步分析。
[0995] 将来自实施例9的衍生自结肠和肺肿瘤的两个代表性样品包埋在石蜡中用于组织学分析。从多个肿瘤和免疫特异性生物标记物(Met、Alk、bRaf、EGFR、PD-L1、CD8和CK8/18)中切下4μm薄切片并进行染色。由解剖病理学家分析载玻片读数和强度得分。本分析中包括采取用于模拟当前TNM分期系统的由样品制成的标准FFPE块(表16中的块)如表16所示，解剖病理学家可以读取和解读来自FFPE块和代表性样品二者的染色。
[0996] 表16.IHC的病理学家评分
[0997]
[0998] 病理学家对代表性样品的解读并未显现解决了整个载玻片的信号强度和染色的异质性。为了从代表性样品中生成IHC染色异质性的数学表示，使用数字载玻片扫描仪分析IHC染色的载玻片。在整个载玻片扫描之后，使用Aperio ImageScope算法“正像素计数v9”对DAB强度进行定量。对于所有块和代表性样品，将CD8、PD-L1、EGFR和MET信号强度除以CK 8/18的信号强度以相对于肿瘤含量从数学上表达生物标记物信号的异质性。如表16-23所示，虽然来自结肠和肺肿瘤的组织学块的CD8相对于CK8/18的平均值等于代表性样品的平均值，但用PD-L1、EGFR和MET染色的样品之间的相对信号强度的平均值存在显著差异。这些数据表明，由代表性样品的样品制成的组织切片的IHC染色更好地代表了生物标记物信号的异质性，并且减少了IHC结果的变异，因为块在彼此之间显著变化。
[0999] 表17.来自结肠样品的CD8IHC的数字成像和分析
[1000]
[1001] 表18.来自结肠样品的PD-L1IHC的数字成像和分析
[1002]
[1003] 表19.来自结肠样品的EGFR IHC的数字成像和分析
[1004]
[1005] 表20.来自结肠样品的MET IHC的数字成像和分析
[1006]
[1007] 表21.来自肺样品的CD8 IHC的数字成像和分析
[1008]
[1009] 表22.来自肺样品的PD-L1 IHC的数字成像和分析
[1010]
[1011] 表23.来自肺样品的EGFR IHC的数字成像和分析
[1012]
[1013] 表24.来自肺样品的MET IHC的数字成像和分析
[1014]
[1015] 本文中引用的全部专利和非专利参考文件通过引用以其全部内容并入。
[1016] 应理解，虽然已经结合以上实施方案，对本公开文本进行了描述，但前面的描述和实施例旨在说明而非限制本公开文本的范围。其他方面，在本公开文本的范围内的优点和修改对于本公开文本所属领域的技术人员将是清楚的。
[1017] 可以在不存在本文没有明确公开的任一种要素和多种要素、任何一种限制或多种限制的情况下适当地实践本文说明性描述的公开内容。因此，例如，术语“包括(comprising)”、“包括(including)”、“含有(containing)”等应该是广义地并且没有限制地理解。另外，本文采用的术语和表达已经被用作说明的术语并且没有限制性，并且并非旨在使用此类术语以及表达而将本发明示出或描述的特征的任何等效物或其一部分排除在外，但是将认识到的是提出要求保护的公开文本的范围之内的不同修改是有可能的。
[1018] 因此，应当理解地是，虽然本公开文本已被优选实施方案和选项特性明确公开，本文公开的其中呈现的公开文本的修饰、改进和变更可以由本领域的普通技术人员采取，并且这样的修饰、改进和变更被认为是在本公开文本的范围内。本文提供的材料、方法和例子代表优选实施方案，是示例性的，并且不意欲限制本公开文本的范围。
[1019] 已经在此宽泛且概括地对本公开文本进行了说明。落在总公开文本之内的更窄的种类和亚属的分类中的每个也形成了本公开文本中的一部分。这包括本公开文本的一般描述，具有从属中除去任何主题的条件或否定式限制，无论切除的材料是否在本文中被明确地引述。
[1020] 另外，当本披露的特征或方面以马库什组(Markush group)描述时，本领域技术人员将意识到本披露还由此以马库什组的任何单独的成员或成员子组描述。
[1021] 其他实施方案
[1022] 1.一种用于制备用来分析的代表性样品的方法，其包括：
[1023] a.从至少一个受试者获得手术切除组织样品；并且
[1024] b.将该手术切除组织样品均质化以获得均质化样品。
[1025] 2.实施方案1的方法，其进一步包括固定该手术切除组织样品的至少部分。
[1026] 3.实施方案1的方法，其进一步包括加工该手术切除样品的第一部分并且生成一个或多个固定的包埋组织块。
[1027] 4.实施方案3的方法，其进一步包括将剩余的手术组织切除样品的第二部分均质化。
[1028] 5.实施方案3或4的方法，其进一步包括通过显微切片术加工该一个或多个固定的包埋组织块的至少部分以产生一个或多个组织薄切片用于形态分析。
[1029] 6.实施方案5的方法，其进一步包括将该一个或多个固定的包埋组织块中的至少一个脱石蜡，并将来自该一个或多个脱石蜡的固定包埋组织块的组织均质化。
[1030] 7.实施方案1的方法，其中该手术切除组织样品包括一个或多个单独的组织片。
[1031] 8.实施方案7的方法，其中该一个或多个单独的组织片包括为获得该手术切除样品从受试者切除的一个或多个原发实体瘤组织团块的至少部分。
[1032] 9.实施方案8的方法，其中该一个或多个单独的组织片包括从该受试者切除的一个或多个淋巴结的至少部分。
[1033] 10.实施方案7、8或9的方法，其进一步包括将该单独的组织片的至少部分单独均质化以产生单独的均质化样品。
[1034] 11.实施方案1的方法，其中该手术切除组织样品包括单个组织团块。
[1035] 12.实施方案11的方法，其中该单个组织团块被进一步分成该单个组织团块的两片或更多片。
[1036] 13.实施方案12的方法，其进一步包括使该单个组织团块的两片或更多片中的至少一片均质化并保留该单个组织团块剩余的两片或更多片中的至少一片。
[1037] 14.实施方案1的方法，其中该均质化包括物理分离。
[1038] 15.实施方案14的方法，其中该物理分离是通过切割、划切或切碎来进行。
[1039] 16.实施方案1的方法，其中该均质化包括机械解离。
[1040] 17.实施方案16的方法，其中该机械解离是通过共混或榨汁进行。
[1041] 18.实施方案1的方法，其中该均质化是通过生化解离进行。
[1042] 19.实施方案18的方法，其中该生化解离是通过蛋白酶进行。
[1043] 20.实施方案1的方法，其进一步包括从该均质物的至少部分中纯化一种或多种生物分子。
[1044] 21.实施方案20的方法，其中该一种或多种生物分子选自下组，该组由以下各项组成：DNA、RNA、蛋白质、脂质和代谢物。
[1045] 22.实施方案21的方法，其进一步包括对该一种或多种生物分子进行分析。
[1046] 23.实施方案22的方法，其中对该一种或多种生物分子进行该分析是通过PCR、质谱法、新一代测序、或ELISA进行。
[1047] 24.实施方案22的方法，其中该分析产生至少一个数据集。
[1048] 25.实施方案1的方法，其进一步包括将该均质化样品的至少部分包埋在石蜡中。
[1049] 26.实施方案25的方法，其进一步包括制备该石蜡包埋的均质化样品的一个或多个薄切片。
[1050] 27.实施方案26的方法，其进一步包括对该石蜡包埋的均质化样品的薄切片进行组织学分析。
[1051] 28.实施方案27的方法，其中该组织学分析是通过H&E染色、IHC染色、ISH染色、以及FISH染色进行。
[1052] 29.实施方案27的方法，其中对该石蜡包埋的均质化样品的薄切片的该组织学分析由人解读。
[1053] 30.实施方案27的方法，其中对该石蜡包埋的均质化样品的薄切片的该组织学分析是通过自动化装置进行定量。
[1054] 31.实施方案29的方法，其中该解读产生至少一个数据集。
[1055] 32.实施方案30的方法，其中该定量产生至少一个数据集。
[1056] 33.实施方案1的方法，其进一步包括对该均质物的至少部分进行进一步加工以生成细胞碎片。
[1057] 34.实施方案32的方法，其中对该均质物的至少部分的该加工是通过物理方法、机械方法、化学方法、或酶促方法进行。
[1058] 35.实施方案33的方法，其中该细胞碎片选自下组，该组由以下各项组成：细胞核、细胞膜和细胞器。
[1059] 36.实施方案33的方法，其中该细胞碎片的至少部分被附着到至少一个载玻片上。
[1060] 37.实施方案36的方法，其中对附着到至少一个载玻片上的该细胞碎片的该至少部分进行组织学分析。
[1061] 38.实施方案37的方法，其中该组织学分析是通过H&E染色、IHC染色、ISH染色、或FISH染色进行。
[1062] 39.实施方案36的方法，其中对附着到至少一个载玻片上的该细胞碎片的至少部分的该组织学分析由人解读。
[1063] 40.实施方案36的方法，其中对附着到至少一个载玻片上的该细胞碎片的至少部分的该组织学分析是通过自动化装置进行定量。
[1064] 41.实施方案39的方法，其中该解读产生至少一个数据集。
[1065] 42.实施方案40的方法，其中该定量产生至少一个数据集。
[1066] 43.实施方案33的方法，其中将该细胞碎片的至少部分通过流式细胞术、FACS、或粒子分析仪进行分析。
[1067] 44.实施方案43的方法，其中该分析产生数据集。
[1068] 45.实施方案33的方法，其进一步包括从该细胞碎片的至少部分中纯化至少一种细胞碎片。
[1069] 46.实施方案45的方法，其中该纯化是通过FACS、亲和纯化、尺寸排阻差速离心、过滤、或电泳进行。
[1070] 47.实施方案45的方法，其进一步包括由从该细胞碎片的至少部分中纯化的该至少一种细胞碎片中分离生物分子。
[1071] 48.实施方案47的方法，其进一步包括对来自从该细胞碎片的该至少部分中纯化的该至少一种细胞碎片的该生物分子进行分析。
[1072] 49.实施方案48的方法，其中该分析包括是PCR、质谱法、新一代测序、或ELISA。
[1073] 50.实施方案49的方法，其中该分析产生至少一个数据集。
[1074] 51.实施方案1的方法，其进一步包括对该均质物的至少部分进行进一步加工以生成至少一个解离细胞。
[1075] 52.实施方案51的方法，其中对该均质物的至少部分的该加工是物理加工、机械加工、化学加工、或酶促加工。
[1076] 53.实施方案51的方法，其中该至少一个解离细胞是正常细胞、癌细胞或细菌细胞。
[1077] 54.实施方案51的方法，其中将该至少一个解离细胞附着到至少一个载玻片上。
[1078] 55.实施方案54的方法，其中对附着到至少一个载玻片上的该至少一个解离细胞进行组织学分析。
[1079] 56.实施方案55的方法，其中该组织学分析是H&E染色、IHC染色、ISH染色、或FISH染色。
[1080] 57.实施方案55的方法，其中对附着到至少一个载玻片上的该至少一个解离细胞的该组织学分析由人解读。
[1081] 58.实施方案55的方法，其中对附着到至少一个载玻片上的该至少一个解离细胞的该组织学分析是通过自动化装置进行定量。
[1082] 59.实施方案57的方法，其中该解读产生至少一个数据集。
[1083] 60.实施方案58的方法，其中该定量产生至少一个数据集。
[1084] 61.实施方案51的方法，其中对该至少一个解离细胞通过流式细胞术、FACS、或粒子分析仪进行分析。
[1085] 62.实施方案61的方法，其中该分析产生数据集。
[1086] 63.实施方案51的方法，其进一步包括从该至少一个解离细胞中纯化至少一个细胞。
[1087] 64.实施方案63的方法，其中该纯化是FACS、亲和纯化、尺寸排阻差速离心、过滤、或电泳。
[1088] 65.实施方案63的方法，其进一步包括由从该至少一个解离细胞中纯化的该至少一个细胞中分离生物分子。
[1089] 66.实施方案65的方法，其进一步包括对来自从该至少一个解离细胞中纯化的该至少一个细胞的该生物分子进行分析。
[1090] 67.实施方案66的方法，其中该分析是PCR、质谱法、新一代测序、或ELISA。
[1091] 68.实施方案67的方法，其中该分析产生至少一个数据集。
[1092] 69.实施方案63的方法，其中将从该至少一个解离细胞中纯化的该至少一个细胞附着到至少一个载玻片上。
[1093] 70.实施方案69的方法，其中对附着到至少一个载玻片上的从该至少一个解离细胞中纯化的该至少一个细胞进行组织学分析。
[1094] 71.实施方案70的方法，其中该组织学分析是H&E染色、IHC染色、ISH染色、或FISH染色。
[1095] 72.实施方案70的方法，其中对附着到至少一个载玻片上的从该至少一个解离细胞中纯化的该至少一个细胞的该组织学分析由人解读。
[1096] 73.实施方案70的方法，其中对附着到至少一个载玻片上的从该至少一个解离细胞中纯化的该至少一个细胞的该组织学分析是通过自动化装置进行定量。
[1097] 74.实施方案72的方法，其中该解读产生至少一个数据集。
[1098] 75.实施方案73的方法，其中该定量产生至少一个数据集。
[1099] 76.实施方案24、31、32、41、42、44、50、59、60、62、68、74和75中任一项的方法，其进一步包括对来自该至少一个受试者的该至少一个数据集进行分析。
[1100] 77.权利要求76的方法，其中该分析包括确定生物标记物多样性或表型多样性数据集。
[1101] 78.实施方案76的方法，其中该分析包括确定至少一种不同生物标记物或表型的流行率。
[1102] 79.实施方案76的方法，其中该分析包括确定至少一个临床决策。
[1103] 80.实施方案79的方法，其中该临床决策是确定疾病预后、预测疾病复发、预测疾病治疗靶标、纳入临床试验受试者或针对至少一个受试者的治疗处理策略。
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