PSA的ELISA试剂盒及其应用
阅读：311发布：2020-05-16
专利汇可以提供PSA的ELISA试剂盒及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 生物 医药领域，具体涉及一种检测游离PSA的酶联免疫 试剂 盒 ，其由PSA标准品、对照液、游离PSA单克隆 抗体 包被的酶标板、辣根过 氧 化物酶(HRP)标记的游离PSA单克隆抗体溶液和辅助试剂组成。，下面是PSA的ELISA试剂盒及其应用专利的具体信息内容。
1.一种检测游离PSA的酶联免疫试剂盒，其由PSA标准品、对照液、游离PSA单克隆抗体包被的酶标板、辣根过氧化物酶HRP标记的游离PSA单克隆抗体溶液和辅助试剂组成；
所述包被酶标板的制备过程为：将包被用游离PSA单克隆抗体用0.05M pH值为9.5碳酸盐缓冲液稀释后加入酶标板各孔，每孔100μl，吸附过夜，用0.05M pH值为9.5磷酸盐缓冲液洗板，再用封闭液封闭过夜，甩干后晾干，即获得单克隆抗体包被酶标板；
所述封闭液为含1g/L的BSA、0.1g/L的蔗糖和0.5g/L的酪蛋白的15mmol/L PBS缓冲液，pH值为9.5；
所述HRP标记的游离PSA单克隆抗体溶液为含0.5mg/L的HRP标记的游离PSA单克隆抗体和0.2mg/L的PEG200的15mmol/L PBS缓冲液，pH值为8.5；
对照缓冲液为15mmol/L pH7.4的PBS缓冲液；
底物溶液为pH7.4磷酸-柠檬酸缓冲液配制的3％过氧化氢溶液，并且溶液中0.1mg/L的焦磷酸二氢钠。
2.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，显色液为四甲基联苯胺TMB的甲醇溶液，浓度为0.1mg/ml。
3.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，反应终止液为3mol/L硫酸；清洗缓冲液为15mmol/L pH7.4的PBS配制的0.05％吐温20溶液。
PSA的ELISA试剂盒及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 前列腺特异抗原(prostate specific antigen，PSA)是与前列腺癌相关的一种抗原，属糖蛋白类物质，分子量约为34KD，pH为6.8～7.5，等电点为6.9，半衰期为2.2士0.8天。PSA存在于前列腺内质网和前列腺上皮细胞及分泌物当中，正常前列腺及病变前列腺组织内均含有PSA。它是公认的诊断前列腺癌的较好的肿瘤标志物，其诊断前列腺癌的特异性为
82％-97％。前列腺癌在男性所有类型癌中占10％～20％，是男性最常见的癌肿。该病进展缓慢，是威胁50岁以上男性生命的主要癌症，在西方国家占男性死亡率的第二位。流行病学调查表明，随着我国居民生活水平的改善，环境污染的加剧以及饮食结构的改变，前列腺癌的发病率日趋上升，已引起临床上的高度重视。美国FDA已批准将PSA检测作为50岁以上男性的普查指标。研究显示，PSA测定在早期诊断前列腺癌上要优于直肠指检。正常男性的PSA值<4ug/L。
82％-97％。前列腺癌在男性所有类型癌中占10％～20％，是男性最常见的癌肿。该病进展缓慢，是威胁50岁以上男性生命的主要癌症，在西方国家占男性死亡率的第二位。流行病学调查表明，随着我国居民生活水平的改善，环境污染的加剧以及饮食结构的改变，前列腺癌的发病率日趋上升，已引起临床上的高度重视。美国FDA已批准将PSA检测作为50岁以上男性的普查指标。研究显示，PSA测定在早期诊断前列腺癌上要优于直肠指检。正常男性的PSA值<4ug/L。
[0003] PSA在血液中以游离和结合两种形式存在。其中游离PSA(free PSA，F-PSA)只占小部分，结合型(comlexed PSA，C-PSA)占大部分，即与内源性蛋白酶抑制物前列腺癌α1-抗糜蛋白酶(αl-antichymotrysin，ACT)结合成PSA-ACT复合物，以及与另一种蛋白抑制物α2-巨球蛋白(α2-macroglobulin，α2M)结合成PSA-α2M。在精液中，PSA还与C蛋白抑制物构成复合物。由于PSA-α2M不具有免疫活性，不能被现有的PSA检测法检测到。所以目前可定量检测到的PSA有3种：T-PSA(总PSA)，F-PSA,PSA-ACT。
[0004] 测量血清中总PSA可以用于筛选和早期诊断前列腺癌，它是公认的诊断前列腺癌的较好的肿瘤标志物。研究显示,总PSA测定在早期诊断前列腺癌上要优于直肠指检。美国FDA已批准将总PSA检测作为50岁以上男性的普查指标。使用总PSA作为诊断前列腺癌的诊断标准是：总PSA：0～4ng/ml正常；4～10ng/mL，21～25％的患癌几率；>10ng/ml癌症。在4.0～10ng/ml的灰色区域，单独检测总PSA无法区分癌症和良性增生。游离PSA可提供更好的生化指标，用于区分总PSA 4～10ng/ml的前列腺癌和良性增生。
发明内容
[0005] 本发明的一个目的是提供一种检测游离PSA的酶联免疫试剂盒，其由PSA标准品、对照液、游离PSA单克隆抗体包被的酶标板、辣根过氧化物酶(HRP)标记的游离PSA单克隆抗体溶液和辅助试剂组成。
[0006] 在本发明中，包被酶标板的游离PSA单克隆抗体和HRP标记的游离PSA单克隆抗体为配对抗体，并且可通过商业渠道获得。
[0007] 在本发明的一个实施方案中，所述包被酶标板的制备过程为：将包被用游离PSA单克隆抗体用0.05M碳酸盐缓冲液(pH值为9.5)稀释后加入酶标板各孔，每孔100μl，吸附过夜，用0.05M磷酸盐缓冲液(pH值为9.5)洗板，再用封闭液封闭过夜，甩干后晾干，即获得单克隆抗体包被酶标板。所述封闭液为含1g/L的BSA、0.1g/L的蔗糖和0.5g/L的酪蛋白(Casein)的15mmol/L PBS缓冲液，pH值为9.5。
[0008] 所述HRP标记的游离PSA单克隆抗体溶液为含0.5mg/L的HRP标记的游离PSA单克隆抗体和0.2mg/L的PEG200的15mmol/L PBS缓冲液，pH值为8.5。
[0009] 所述辅助试剂包括对照缓冲液、底物溶液、显色液、反应终止液和清洗缓冲液，各试剂具体为：
[0010] 对照缓冲液为15mmol/L的PBS(pH7.4)缓冲液；
[0011] 底物溶液为磷酸-柠檬酸缓冲液(pH7.4)配制的3％过氧化氢溶液，并且溶液中0.1mg/L的焦磷酸二氢钠；
[0012] 显色液为四甲基联苯胺(TMB)的甲醇溶液，浓度为0.1mg/ml；
[0013] 反应终止液为3mol/L硫酸；
[0014] 清洗缓冲液为15mmol/L的PBS(pH7.4)配制的0.05％吐温20溶液。
具体实施方式
[0017] 实施例1
[0018] 试剂盒组成：游离PSA单克隆抗体包被酶标板(96孔)；辣根过氧化物酶(HRP)标记的游离PSA单克隆抗体溶液1瓶，6ml/瓶；对照缓冲液1瓶；游离PSA标准品1瓶，底物溶液、显色液各1瓶，各5ml/瓶；反应终止液1瓶，5ml/瓶；清洗缓冲液(20X浓缩)1瓶，30ml/瓶。
[0019] 游离PSA单克隆抗体包被酶标板的制备过程为：将包被用游离PSA单克隆抗体用0.05M碳酸盐缓冲液(pH值为9.5)稀释后加入酶标板各孔，每孔100μl，吸附过夜，用0.05M磷酸盐缓冲液(pH值为9.5)洗板，再用封闭液封闭过夜，甩干后晾干，即获得单克隆抗体包被酶标板。所述封闭液为含1g/L的BSA、0.1g/L的蔗糖和0.5g/L的酪蛋白(Casein)的15mmol/L PBS缓冲液，pH值为9.5。
[0020] HRP标记的游离PSA单克隆抗体溶液为含0.5mg/L的HRP标记的游离PSA单克隆抗体和0.2mg/L的PEG200的15mmol/L PBS缓冲液，pH值为8.5。具体过程为：以NaIO4-乙二醇法进行HRP的氧化，达到终浓度15mg/ml。单克隆抗体和HRP在碱性碳酸盐缓冲液中透析9小时，实现HRP对单克隆抗体的标记，反应结束后用NaBH4溶液终止反应，再对PBS透析过夜。用饱和硫酸铵沉淀，获得纯化的HRP酶标抗游离PSA单克隆抗体。再用含0.2mg/L的PEG200的15mmol/L PBS缓冲液溶解至抗体终浓度0.5mg/L。
[0021] 对照缓冲液为15mmol/L的PBS(pH7.4)缓冲液；
[0022] 底物溶液为磷酸-柠檬酸缓冲液(pH7.4)配制的3％过氧化氢溶液，并且溶液中0.1mg/L的焦磷酸二氢钠；
[0023] 显色液为四甲基联苯胺(TMB)的甲醇溶液，浓度为0.1mg/ml；
[0024] 反应终止液为3mol/L硫酸；
[0025] 清洗缓冲液(1X)组成为15mmol/L的PBS(pH7.4)配制的0.05％吐温20溶液。
[0026] 实施例2试剂盒灵敏度考察
[0027] 分别配制PSA标准品不同浓度的PBS缓冲液，浓度分别为0.1ng/ml，0.5ng/ml，1ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，采用实施例1制备的试剂盒进行检测，以对照缓冲液作为空白对照，具体检测方法如下：
[0028] a)抗原-抗体反应：在包被酶标板的微孔中分别加入50μl PSA标准品溶液和对照缓冲液，37℃水浴保温50分钟。清洗缓冲液洗板操作5次。
[0029] b)将HRP标记的PSA单克隆抗体溶液加入各孔，每孔100μl，37℃水浴保温50分钟。重复洗板操作5次。
[0030] c)显色反应：每孔依次加入底物溶液，显色液各50μl，37℃水浴保温20分钟，每孔再加入50μl反应终止液结束反应。
[0031] d)比色：用酶标仪在450nm测定OD值并记录。
[0032] e)制作标准曲线：以标准品浓度为横坐标，标准品测定的OD值为纵坐标，作出标准曲线；计算标准曲线回归系数R2，当R2＞0.99时本次测定有效；
[0033] 计算PSA标准品与空白对照的比值，当比值大于2时，说明试剂盒可以测定该浓度的PSA标准品，最低浓度即为试剂盒的灵敏度，平行试验五次取平均值，具体结果如下：
[0034] 0.1ng/ml PSA标准品及对照缓冲液OD450吸光度值
[0035] 0.1ng/ml PSA标准品 空白对照缓冲液 OD比值
OD450吸光度值 0.012 0.003 4.0
OD450吸光度值 0.012 0.003 4.0
[0036] 根据不同浓度标准品获得吸光度数据进行回归，得回归方程为y＝0.106x+0.0086；R2＝0.98。上表数据表明本发明试剂盒在0.1ng/ml浓度下，灵敏度良好，并且线性极佳。
[0037] 实施例3试剂盒稳定性考察
[0038] 将实施例1制备的试剂盒在20℃分别放置6个月和12个月后，按照实施例2的方法测定试剂盒的灵敏度，并对数据进行回归分析，计算R2值。
[0039] 本实施例中对比例设定如下：
[0040] 对比例1：试剂盒的制备方法同实施例1，区别仅在于HRP标记的游离PSA单克隆抗体溶液中不添加PEG200。
[0041] 对比例2：试剂盒的制备方法同实施例1，区别仅在于HRP标记的游离PSA单克隆抗体溶液中PEG200替换为胎牛血清(FBS)，浓度同PEG200。
[0042] 对比例3：试剂盒的制备方法同实施例1，区别仅在于包被酶标板制备中使用的封闭液为含1g/L的BSA的15mmol/L PBS缓冲液，pH值为9.5。
[0043] 对比例4：试剂盒的制备方法同实施例1，区别仅在于包被酶标板制备中使用的封闭液为含1g/L的BSA和0.5g/L的酪蛋白(Casein)的15mmol/L PBS缓冲液，pH值为9.5。
[0044] 对比例5：试剂盒的制备方法同实施例1，区别仅在于包被酶标板制备中使用的封闭液为含1g/L的BSA、0.1g/L的蔗糖和0.5g/L的酪蛋白(Casein)的15mmol/L PBS缓冲液，pH值为8.5。
[0045] 具体结果如下：
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