治疗肺腺癌的方法
阅读：97发布：2021-09-18
专利汇可以提供治疗肺腺癌的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及在患者，具体来说是患有 肺 腺癌的患者且更具体来说是患有SLC34A2-ROS1、CD74-ROS1或FIG-ROS1融合阳性非小细胞肺癌的患者中用MET、VEGFR2和ROS1 抑制剂 治疗 癌症，所述抑制剂是式(I)化合物：或其药学上可接受的盐。，下面是治疗肺腺癌的方法专利的具体信息内容。
1.一种治疗肺腺癌的方法，其包括向需要所述治疗的患者施用式I化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
R1是卤基；
R2是卤基；
3
R是(C1-C6)烷基；
R4是(C1-C6)烷基；且
Q是CH或N。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述肺腺癌是非小细胞肺癌。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述肺腺癌是SLC34A2-ROS1、CD74-ROS1或FIG-ROS1融合阳性非小细胞肺癌。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述式I化合物是式Ia的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
R1是卤基；
R2是卤基；且
Q是CH或N。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述式I化合物是化合物1：
或其药学上可接受的盐。
6.如权利要求5所述的方法，其中化合物1是N-(4-{[6,7-双(甲氧基)喹啉-4-基]氧}苯基)-N'-(4-氟苯基)环丙烷-1,1-二甲酰胺，或其药学上可接受的盐。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述式(I)化合物、式I(a)化合物和化合物1是(L)-苹果酸盐或(D)-苹果酸盐。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述式(I)化合物呈所述(L)苹果酸盐
和/或所述(D)苹果酸盐的结晶N-1形式或N-2形式。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述式I化合物、式I(a)化合物或化合物
1，或其药学上可接受的盐是作为另外包含药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂的药物组合物来施用。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述式I化合物或其药学上可接受的盐是在另一种治疗形式之后施用。
11.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述式I化合物或其药学上可接受的盐是在顺铂和/或吉西他滨治疗后施用。
12.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述式I化合物或其药学上可接受的盐是在卡铂治疗后施用。
13.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述式I化合物或其药学上可接受的盐是在卡铂和/或吉西他滨治疗后施用。
14.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述式I化合物是在顺铂和/或卡铂治疗后施用。
15.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述式I化合物或其药学上可接受的盐是在多烯紫杉醇治疗后施用。
16.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述式I化合物或其药学上可接受的盐是在克唑替尼治疗后施用。
17.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述式I化合物或其药学上可接受的盐是在克唑替尼和/或吉西他滨治疗后施用。
18.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述式I化合物或其药学上可接受的盐是在克唑替尼和/或吉西他滨和/或多烯紫杉醇治疗后施用。
19.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述式I化合物或其药学上可接受的盐是在顺铂和/或吉西他滨和/或多烯紫杉醇治疗后施用。
20.一种在需要治疗的患者中治疗ROS1融合阳性非小细胞肺癌的方法，其包括施用治疗有效量的化合物1或其药学上可接受的盐。
21.一种在哺乳动物中抑制异常细胞生长或逆转异常细胞生长的进展的方法，其包括施用化合物1或其药学上可接受的盐，其中所述异常细胞生长是由ROS1激酶介导的癌症。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述癌症是肺腺癌。
23.如权利要求21所述的方法，其中所述肺腺癌是非小细胞肺癌。
24.如权利要求21所述的方法，其中所述肺腺癌是SLC34A2-ROS1、CD74-ROS1或FIG-
ROS1融合阳性非小细胞肺癌。
25.如权利要求24所述的方法，其中化合物1或其药学上可接受的盐是作为包含化合物
1或其药学上可接受的盐和至少一种药学上可接受的载剂的药物组合物来施用。
26.如权利要求24所述的方法，其中化合物1或其药学上可接受的盐是作为包含化合物
1或其药学上可接受的盐和至少一种药学上可接受的载剂的药物组合物来施用；其中每天施用所述药物组合物，持续3个月以上。
27.如权利要求24所述的方法，其中化合物1或其药学上可接受的盐是作为包含化合物
1或其药学上可接受的盐和至少一种药学上可接受的载剂的药物组合物来施用；其中药物组合物以每天5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、65、70、75、80、85、90或95mg的剂量来施用所述药物组合物。
28.如权利要求24所述的方法，其中所述SLC34A2-ROS1、CD74-ROS1或FIG-ROS1融合阳性非小细胞肺癌的检测是使用FISH、CISH或SISH测定法来进行。
29.如权利要求24所述的方法，其中所述SLC34A2-ROS1、CD74-ROS1或FIG-ROS1融合阳性非小细胞肺癌的检测是使用任何形式的基因组PCR、直接测序、PCR测序、RT-PCR或类似测定法来进行。
30.如权利要求24所述的方法，其中所述SLC34A2-ROS1、CD74-ROS1或FIG-ROS1融合阳性非小细胞肺癌的检测是使用特异性结合SLC34A2-ROS1、CD74-ROS1或FIG-ROS1融合多肽或其片段的抗体来进行。
31.一种诊断并治疗患者的方法，其中所述患者患有NSCLC肿瘤且所述肿瘤被鉴别为
SLC34A2-ROS1、CD74-ROS1或FIG-ROS1融合阳性NSCLC，并且所述治疗包括施用治疗有效量的式I化合物或其药学上可接受的盐，和至少一种药学上可接受的载剂。
32.一种在需要治疗的患者中治疗肺腺癌的方法，所述肺腺癌是SLC34A2-ROS1、CD74-ROS1或FIG-ROS1融合阳性非小细胞肺癌，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的化合物1：
或其药学上可接受的盐。
33.如权利要求1至32中任一项所述的方法，其中所述有效量的式I化合物、式Ia化合物或化合物1产生选自由以下各项组成的群组的至少一种治疗效果：减小肿瘤尺寸、减少转移、完全缓解、部分缓解、稳定疾病、增加总体反应率或病理性完全反应。
34.一种抑制癌细胞中的ROS1融合激酶活性的方法，所述方法包括使所述细胞与有效量的式I化合物：
或其药学上可接受的盐接触，其中：
1
R是卤基；
R2是卤基；
R3是(C1-C6)烷基；
R4是(C1-C6)烷基；且
Q是CH或N。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述癌细胞是非小细胞肺癌腺癌细胞。
36.如权利要求34所述的方法，其中所述癌细胞是SLC34A2-ROS1、CD74-ROS1或FIG-
ROS1融合阳性非小细胞肺癌腺癌细胞。
37.如权利要求34至36中任一项所述的方法，其中所述式I化合物是式Ia的化合物
或其药学上可接受的盐，其中：
R1是卤基；
R2是卤基；且
Q是CH或N。
38.如权利要求34至37中任一项所述的方法，其中所述式I化合物是化合物1：
或其药学上可接受的盐。
39.如权利要求38所述的方法，其中化合物1是N-(4-{[6,7-双(甲氧基)喹啉-4-基]氧}苯基)-N'-(4-氟苯基)环丙烷-1,1-二甲酰胺或其药学上可接受的盐。
40.如权利要求34至39中任一项所述的方法，其中所述式(I)化合物、式I(a)化合物和化合物I是(L)-苹果酸盐或(D)-苹果酸盐。
41.如权利要求34至40中任一项所述的方法，其中所述式(I)化合物呈所述(L)苹果酸盐和/或所述(D)苹果酸盐的结晶N-1形式或N-2形式。
42.如权利要求34至41中任一项所述的方法，其中所述式I化合物、式I(a)化合物或化合物1，或其药学上可接受的盐是作为另外包含药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂的药物组合物而施用至所述癌细胞。
治疗肺腺癌的方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本PCT申请要求2014年4月25日提交的美国临时申请序号61/984,599的权益，所述美国临时申请的公开内容以全文引用的方式并入本文中。
[0004] 本申请以全文引用的方式并入2015年4月27日12:54pm创建的名为“EX14-003C-PC_2015_04_20_SEQUENCE_LISTING_ST25.txt”的序列表，所述文件有26KB且与本文一起以电子形式提交。
技术领域
[0006] 发明背景
[0007] 在全世界范围内，肺癌是癌症相关的死亡的主要原因。靶向疗法的最近发展已经引起非小细胞肺癌(NSCLC)的治疗模式变化。Mok TS,Wu YL,Thongprasert S,Yang CH,Chu DT,Saijo N,Sunpaweravong P,Han B,Margono B,Ichinose Y,Nishiwaki Y,Ohe Y,Yang JJ,Chewaskulyong B,Jiang H,Duffield EL,Watkins CL,Armour AA,Fukuoka M.Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma.N Engl J Med.2009年9月3日；361(10):947-57。Maemondo M,Inoue A,Kobayashi K,Sugawara S,Oizumi S,Isobe H,Gemma A,Harada M,Yoshizawa H,Kinoshita I,Fujita Y,Okinaga S,Hirano H,Yoshimori K,Harada T,Ogura T,Ando M,Miyazawa H,Tanaka T,Saijo Y,Hagiwara K,Morita S,Nukiwa T；North-East Japan Study Group.Gefitinib or
chemotherapy for non-small-cell lung cancer with mutated EGFR.N Engl J
Med.2010年6月24日；362(25):2380-8。表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(TKI)吉非替尼和埃罗替尼以及间变性淋巴瘤激酶(ALK)TKI克唑替尼已经在具有EGFR突变或ALK基因重排的NSCLC患者中表达出了临床活性。Kwak EL,Bang YJ,Camidge DR,Shaw AT,Solomon B,Maki RG,Ou SH,Dezube BJ, PA,Costa DB,Varella-Garcia M,Kim WH,
Lynch TJ,Fidias P,Stubbs H,Engelman JA,Sequist LV,Tan W,Gandhi L,Mino-
Kenudson M,Wei GC,Shreeve SM,Ratain MJ,Settleman J,Christensen JG,Haber DA,Wilner K,Salgia R,Shapiro GI,Clark JW,Iafrate AJ.Anaplastic lymphoma kinase inhibition in non-small-cell lung cancer.N Engl J Med.2010年10月28日；363(18):
1693-703。Shaw AT,Camidge,Engelman JA,Solomon BJ,Kwak EL,Clark JW,Salgia R,Shapiro,Bang YJ,Tan W,Tye L,Wilner KD,Stephenson P,Varella-Garcia M,Bergethon K,Iafrate AJ,Ou SH.Clinical activity of crizotinib in advanced non-small cell lung cancer(NSCLC)harboring ROS1gene rearrangement.J Clin Oncol.201230(增刊；
摘要7508)。最近报告了KIF5B(驱动蛋白家族5B)基因与RET致癌基因的融合在1％至2％的NSCLC患者中是驱动突变，并且作为治疗标靶而受到关注。Kohno T,Ichikawa H,Totoki Y,Yasuda K,Hiramoto M,Nammo T,Sakamoto H,Tsuta K,Furuta K,Shimada Y,Iwakawa R,Ogiwara H,Oike T,Enari M,Schetter AJ,Okayama H,Haugen A,Skaug V,Chiku S,
Yamanaka I,Arai Y,Watanabe S,Sekine I,Ogawa S,Harris CC,Tsuda H,Yoshida T,Yokota J,Shibata T.KIF5B-RET fusions in lung adenocarcinoma.Nat Med.2012年2月
12日；18(3):375-7。Takeuchi K,Soda M,Togashi Y,Suzuki R,Sakata S,Hatano S,Asaka R,Hamanaka W,Ninomiya H,Uehara H,Lim Choi Y,Satoh Y,Okumura S,Nakagawa K,Mano H,Ishikawa Y.RET,ROS1and ALK fusions in lung cancer.Nat Med.2012年2月12日；18(3):378-81。Lipson D,Capelletti M,Yelensky R,Otto G,Parker A,Jarosz M,Curran JA,Balasubramanian S,Bloom T,Brennan KW,Donahue A,Downing SR,Frampton GM,Garcia L,Juhn F,Mitchell KC,White E,White J,Zwirko Z,Peretz T,Nechushtan H,Soussan-Gutman L,Kim J,Sasaki H,Kim HR,Park SI,Ercan D,Sheehan CE,Ross JS,Cronin MT, PA,Stephens PJ.Identification of new ALK and RET gene fusions from colorectal and lung cancer biopsies.Nat Med.2012年2月12日；18(3):382-4。因此，鉴别NSCLC中的关键驱动基因并且开发针对患者的各基因组子集的疗法正变得越来越重要。
发明概要
chemotherapy for non-small-cell lung cancer with mutated EGFR.N Engl J
Med.2010年6月24日；362(25):2380-8。表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(TKI)吉非替尼和埃罗替尼以及间变性淋巴瘤激酶(ALK)TKI克唑替尼已经在具有EGFR突变或ALK基因重排的NSCLC患者中表达出了临床活性。Kwak EL,Bang YJ,Camidge DR,Shaw AT,Solomon B,Maki RG,Ou SH,Dezube BJ, PA,Costa DB,Varella-Garcia M,Kim WH,
Lynch TJ,Fidias P,Stubbs H,Engelman JA,Sequist LV,Tan W,Gandhi L,Mino-
Kenudson M,Wei GC,Shreeve SM,Ratain MJ,Settleman J,Christensen JG,Haber DA,Wilner K,Salgia R,Shapiro GI,Clark JW,Iafrate AJ.Anaplastic lymphoma kinase inhibition in non-small-cell lung cancer.N Engl J Med.2010年10月28日；363(18):
1693-703。Shaw AT,Camidge,Engelman JA,Solomon BJ,Kwak EL,Clark JW,Salgia R,Shapiro,Bang YJ,Tan W,Tye L,Wilner KD,Stephenson P,Varella-Garcia M,Bergethon K,Iafrate AJ,Ou SH.Clinical activity of crizotinib in advanced non-small cell lung cancer(NSCLC)harboring ROS1gene rearrangement.J Clin Oncol.201230(增刊；
摘要7508)。最近报告了KIF5B(驱动蛋白家族5B)基因与RET致癌基因的融合在1％至2％的NSCLC患者中是驱动突变，并且作为治疗标靶而受到关注。Kohno T,Ichikawa H,Totoki Y,Yasuda K,Hiramoto M,Nammo T,Sakamoto H,Tsuta K,Furuta K,Shimada Y,Iwakawa R,Ogiwara H,Oike T,Enari M,Schetter AJ,Okayama H,Haugen A,Skaug V,Chiku S,
Yamanaka I,Arai Y,Watanabe S,Sekine I,Ogawa S,Harris CC,Tsuda H,Yoshida T,Yokota J,Shibata T.KIF5B-RET fusions in lung adenocarcinoma.Nat Med.2012年2月
12日；18(3):375-7。Takeuchi K,Soda M,Togashi Y,Suzuki R,Sakata S,Hatano S,Asaka R,Hamanaka W,Ninomiya H,Uehara H,Lim Choi Y,Satoh Y,Okumura S,Nakagawa K,Mano H,Ishikawa Y.RET,ROS1and ALK fusions in lung cancer.Nat Med.2012年2月12日；18(3):378-81。Lipson D,Capelletti M,Yelensky R,Otto G,Parker A,Jarosz M,Curran JA,Balasubramanian S,Bloom T,Brennan KW,Donahue A,Downing SR,Frampton GM,Garcia L,Juhn F,Mitchell KC,White E,White J,Zwirko Z,Peretz T,Nechushtan H,Soussan-Gutman L,Kim J,Sasaki H,Kim HR,Park SI,Ercan D,Sheehan CE,Ross JS,Cronin MT, PA,Stephens PJ.Identification of new ALK and RET gene fusions from colorectal and lung cancer biopsies.Nat Med.2012年2月12日；18(3):382-4。因此，鉴别NSCLC中的关键驱动基因并且开发针对患者的各基因组子集的疗法正变得越来越重要。
发明概要
[0008] 本发明满足了这些和其他需要，本发明涉及一种使用酪氨酸激酶活性，具体来说是ROS1激酶活性的抑制剂来治疗肺腺癌的方法。所述方法包括向需要所述治疗的患者施用治疗有效量的能调节ROS1激酶和/或ROS1融合蛋白的化合物或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，所述肺腺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。更具体来说，肺腺癌最通常是SLC34A2-ROS1融合阳性NSCLC、CD74-ROS1融合阳性NSCLC、FIG-ROS1融合阳性NSCLC(例如CD74-ROS1、FIG-ROS1、FIG-ROS1(L)、FIG-ROS1(S)和FIG-ROS1(VL))和存在其他已知ROS1融合蛋白的NSCLC。ROS1激酶是由人染色体6上的ROS1基因(6q22)编码。
[0009] 在一个方面，本发明涉及一种在有治疗需要的患者中治疗NSCLC的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的能同时调节ROS1和/或ROS1融合蛋白的化合物或其药学上可接受的盐。
[0010] 在这个方面和其他方面的一个实施方案中，所述ROS1激酶抑制剂或ROS1融合激酶抑制剂是式I化合物：
[0011]
[0012] 或其药学上可接受的盐，其中：
[0013] R1是卤基；
[0014] R2是卤基；
[0015] R3是(C1-C6)烷基；
[0016] R4是(C1-C6)烷基；且
[0017] Q是CH或N。
[0018] 在另一个实施方案中，所述式I化合物是式Ia的化合物
[0019]
[0020] 或其药学上可接受的盐，其中：
[0021] R1是卤基；
[0022] R2是卤基；且
[0023] Q是CH或N。
[0024] 在另一个实施方案中，所述式I化合物是化合物1：
[0025]
[0026] 或其药学上可接受的盐。已知化合物1是N-(4-{[6,7-双(甲氧基)喹啉-4-基]氧}苯基)-N'-(4-氟苯基)环丙烷-1,1-二甲酰胺且名为卡博替尼。2012年11月29日，美国食品与药品管理局批准N-{4-[(6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧]苯基}-N'-(4-氟苯基)环丙烷-1,1-二甲酰胺的S-苹果酸盐(即，L-苹果酸盐)(也称为卡博替尼或 )用于治疗
进行性转移性甲状腺髓样癌(MTC)。2013年12月，欧洲人用药品委员会(the European Committee for Medicinal Products for Human Use，CHMP)对市场授权应用(MAA)发表积极意见，向欧洲药品管理局或EMA提出COMETRIQ用于进行性、不可切除性、局部晚期或转移性MTC的所提议适应症。正在一项广泛开发计划中评估卡博替尼，包括正在进行的转移性肾细胞癌(RCC)和晚期肝细胞癌(HCC)的3期关键性试验。
进行性转移性甲状腺髓样癌(MTC)。2013年12月，欧洲人用药品委员会(the European Committee for Medicinal Products for Human Use，CHMP)对市场授权应用(MAA)发表积极意见，向欧洲药品管理局或EMA提出COMETRIQ用于进行性、不可切除性、局部晚期或转移性MTC的所提议适应症。正在一项广泛开发计划中评估卡博替尼，包括正在进行的转移性肾细胞癌(RCC)和晚期肝细胞癌(HCC)的3期关键性试验。
[0027] 化合物1是c-MET、RET和VEGFR2的蛋白抑制剂。Yakes FM,Chen J,Tan J,Yamaguchi K,Shi Y,Yu P,Qian F,Chu F,Bentzien F,Cancilla B,Orf J,You A,Laird AD,Engst S,Lee L,Lesch J,Chou YC,Joly AH.Cabozantinib(XL184),a novel MET and VEGFR2inhibitor,simultaneously suppresses metastasis,angiogenesis,and tumor growth.Mol Cancer Ther.2011年12月10日(12):2298-308；Bentzien,F.,Zuzow,M.,Heald,N.,Gibson,A.,Shi,Y.,Goon,L.,Yu,P.,Engst,S.,Zhang,W.,Huang,S.,Zhao,L.,Vysotskaia,V.,Chu,F.,Bautista,R.,Cancilla,B.,Lamb,P.,Joly,A.和Yakes,M.In vitro and in vivo activity of cabozantinib(XL184),an inhibitor of RET,MET,and VEGFR2,in a model of medullary thyroid cancer.Thyroid,2013(23)1569-1577。在临床前研究中，化合物1介导的激酶活性抑制使肿瘤血管结构快速而又稳定地退化、减少肿瘤侵袭和转移，并且延长存活时间。Sennino B.,Ishiguro-Oonuma T,Wei Y,Naylor RM,Williamson CW,Bhagwandin V,Tabruyn SP,You WK,Chapman HA,Christensen JG,Aftab DT,McDonald DM.(2012),“Suppression of tumor invasion and metastasis by
concurrent inhibition of c-Met and VEGF signaling in pancreatic
neuroendocrine tumors.”,Cancer Discovery,2(3):270-87(Epublished,02/24/2012)。
concurrent inhibition of c-Met and VEGF signaling in pancreatic
neuroendocrine tumors.”,Cancer Discovery,2(3):270-87(Epublished,02/24/2012)。
[0028] 在另一个实施方案中，式I化合物、式Ia化合物、化合物1或其药学上可接受的盐是呈包含药学上可接受的添加剂、稀释剂或赋形剂的药物组合物的形式来施用。
[0029] 在一个实施方案中，式I化合物、式Ia化合物或化合物1或其药学上可接受的盐是呈包含药学上可接受的添加剂、稀释剂或赋形剂的药物组合物的形式来施用，以便抑制由会导致ROS1激酶活性组成性激活的染色体重排产生的致癌性融合激酶，包括孤儿受体酪氨酸激酶ROS1。使用式I化合物、式Ia化合物或化合物1或其药学上可接受的盐来靶向这些ROS1融合激酶以便抑制。这些化合物可以呈包含药学上可接受的添加剂、稀释剂或赋形剂的药物组合物的形式施用以治疗肺腺癌，例如存在一种或多种致癌性ROS1融合激酶的非小细胞肺癌。
[0030] 在另一个方面，本发明提供了一种在一种或多种非小细胞肺癌或NSCLC细胞系中抑制ROS1激酶和/或ROS1融合激酶活性的方法，所述方法包括向所述存在ROS1激酶和/或ROS1融合多肽的非小细胞肺癌或NSCLC细胞系施用治疗有效量的包含式I化合物或式I化合物的苹果酸盐或式I化合物的另一种药学上可接受的盐的药物组合物。
[0031] 在另一个方面，本发明提供了一种检测、诊断和治疗ROS1融合阳性NSCLC的方法，例如SLC34A2-ROS1融合阳性NSCLC和其他已知的ROS1融合阳性NSCLC(包括ROS1融合CD74-ROS1、FIG-ROS1、FIG-ROS1(L)、FIG-ROS1(S)和FIG-ROS1(VL))以及人染色体6上的ROS1基因所编码的其他ROS1融合蛋白(参见：Bergethon K,Shaw AT,Ou SH,Katayama R,Lovly CM,McDonald NT,Massion PP,Siwak-Tapp C,Gonzalez A,Fang R,Mark EJ,Batten JM,Chen H,Wilner KD,Kwak EL,Clark JW,Carbone DP,Ji H,Engelman JA,Mino-Kenudson M,Pao W,Iafrate AJ.ROS1rearrangements define a unique molecular class of lung cancers.J Clin Oncol.2012年3月10日；30(8):863-70)，所述方法包括向需要所述治疗的患者施用治疗有效量的包含式I化合物或式I化合物的苹果酸盐或式I化合物的另一种药学上可接受的盐的药物组合物。在一个特定实施方案中，式I化合物是化合物1或化合物1的苹果酸盐，具体来说是化合物1的S-苹果酸盐。
[0032] 在另一个方面，本发明提供了一种在需要治疗的患者中治疗肺腺癌的方法，所述肺腺癌是SLC34A2-ROS1融合阳性非小细胞肺癌，所述方法包括向所述患者施用有效量的化合物1：
[0033]
[0034] 或其药学上可接受的盐。
[0035] 在另一个方面，本发明提供了一种在需要治疗的患者中治疗肺腺癌的方法，所述肺腺癌是CD74-ROS1融合阳性非小细胞肺癌，所述方法包括向所述患者施用有效量的化合物1：
[0036]
[0037] 或其药学上可接受的盐。
[0038] 在另一个方面，本发明提供了一种在需要治疗的患者中治疗肺腺癌的方法，所述肺腺癌是FIG-ROS1融合阳性非小细胞肺癌，所述方法包括向所述患者施用有效量的化合物1：
[0039]
[0040] 或其药学上可接受的盐。
[0041] 在另一个方面，本发明提供了一种抑制NSCLC细胞中的ROS1融合激酶活性的方法，所述方法包括使所述细胞与有效量的式I化合物：
[0042]
[0043] 或其药学上可接受的盐接触，其中：
[0044] R1是卤基；
[0045] R2是卤基；
[0046] R3是(C1-C6)烷基；
[0047] R4是(C1-C6)烷基；且
[0048] Q是CH或N。
[0050] 图1描绘了已知存在于非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤样品中的ROS1融合蛋白的图示。ROS1在NSCLC、成胶质细胞瘤和胆管癌中重排。CD74(L)/(S)，分化簇74，长/短同种型；EZR，埃兹蛋白；FIG，融合于成胶质细胞瘤中；LRIG3，富亮氨酸重复序列和免疫球蛋白样结构域
3；ROS1TK，具有融合搭配物的ROS1酪氨酸激酶域；SDC4，肝素硫酸蛋白醣-4；SLC34A2(L)/(S)，溶质载体家族34(磷酸钠)，成员2，长/短同种型；SDC4，肝素硫酸蛋白醣-4；TPM3，原肌球蛋白3。外显子编号E32、E34、E35或E36指示ROS1的断裂点。红框表示保留在ROS1中的跨膜域。
3；ROS1TK，具有融合搭配物的ROS1酪氨酸激酶域；SDC4，肝素硫酸蛋白醣-4；SLC34A2(L)/(S)，溶质载体家族34(磷酸钠)，成员2，长/短同种型；SDC4，肝素硫酸蛋白醣-4；TPM3，原肌球蛋白3。外显子编号E32、E34、E35或E36指示ROS1的断裂点。红框表示保留在ROS1中的跨膜域。
[0051] 图2描绘了已施用单次递增剂量的化合物1或3-[(1R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-(1-哌啶-4-基吡唑-4-基)吡啶-2-胺(克唑替尼； )的HCC-78 NSCLC细胞中对活体外SLC34A2-ROS1融合磷酸化的抑制。
[0052] 图3是本文中表示为SEQ ID NO:1的示例性人ROS1蛋白的氨基酸序列。
[0053] 图4是本文中表示为SEQ ID NO:2的人ROS1激酶域的示例性氨基酸序列。
[0054] 发明详述
[0055] 缩写和定义
[0056] 贯穿本申请，以下缩写和术语具有所指示的含义。
[0057]
[0058]
[0059] 符号“-”意指单键；“＝”意指双键。
[0060] 当描绘或描述化学结构时，除非另外明确陈述，否则就假定所有碳都具有氢取代以符合4价。举例来说，在以下示意图的左手侧的结构中，隐含9个氢。在右手侧的结构中描绘了所述9个氢。有时在文本化学式中将结构中的具体原子描述为有一个或多个氢(明确定义的氢)被取代，例如-CH2CH2-。本领域技术人员应该理解，上述描述性技术在化学技术中通常用于提供复杂结构的简要和简单描述。
[0061]
[0062] 如果基团“R”被描绘为“浮”在环系统上，例如，如以下化学式中：
[0063]
[0064] 则除非另外定义，否则取代基“R”可以驻留在所述环系统的任何原子上，从而呈置换来自环原子之一的描绘的氢、隐含的氢或明确定义的氢的形式，只要形成稳定结构即可。
[0065] 如果基团“R”被描绘为浮在稠合环系统上，例如，如以下化学式中：
[0066]
[0067] 则除非另外定义，否则取代基“R”可以驻留在所述稠合环系统的任何原子上，从而呈置换来自环原子之一的描绘的氢(例如以上化学式中的-NH-)、隐含的氢(例如，如在以上化学式中，其中并未示出但应理解为存在氢)或明确定义的氢(例如在以上化学式的情况下，“Z”等于＝CH-)的形式，只要形成稳定结构即可。在所描绘的实例中，“R”基团可以驻留在稠合环系统的5元或6元环上。当基团“R”被描绘为存在于含有饱和碳的环系统上时，例如，如以下化学式中：
[0068]
[0069] 其中在此实例中，“y”可以大于1，从而呈各自置换所述环上的当前描绘、隐含或明确定义的氢；则除非另外定义，否则在所得结构稳定的情况下，两个“R”可以驻留在同一个碳上。一个简单的实例为当R是甲基时，所描绘的环的碳(“环”碳)上可以存在偕二甲基。在另一个实例中，同一个碳上的两个R，包括所述碳，可以形成环，因此与所描绘的环产生螺环状环(“螺环基”)结构，例如，如以下化学式中：
[0070]
[0071] “卤素”或“卤基”是指氟、氯、溴或碘。
[0072] 如本文中所使用，“ROS1”蛋白或多肽包括哺乳动物ROS1，例如，人ROS1激酶蛋白(由ROS1基因编码)，这是一种容易异常表达从而导致癌症的2347个氨基酸长的受体酪氨酸激酶。全长人ROS1激酶(具有人ROS1蛋白的氨基酸序列)的描述可见于UniProt登记号P08922。另外，ROS1存在多种天然存在的已知变体(参见例如Greenman等,Nature 446:153-158,2007)。鼠类全长ROS1的核苷酸和氨基酸序列是已知的(参见例如UniProt登记号Q78DX7)。使用常规实验，一般熟练的生物学家将能够容易地确定非人哺乳动物ROS1同系物中的相应序列。
[0073] “野生型”ROS1意指正常个体(例如，未罹患癌症的正常个体)的健康(或正常)组织(例如，非癌组织)中的全长ROS1激酶(即，对于人ROS1而言，去除信号肽序列之后的2347个氨基酸长的多肽(SEQ ID NO:1)或2320个氨基酸长的多肽(成熟序列))的表达和/或激活。ROS1激酶(全长或截短)不像会表达于人的正常肺组织中。然而，使用下文所描述的方法，诸位发明人已作出如下令人惊讶的发现：使用本文中所描述的化合物会特异性抑制肺癌细胞中的ROS1激酶。典型细胞(例如非癌肺细胞)中未见表达的此种非典型细胞(在这种情况下为癌细胞)中表达是异常的。
[0074] 已经报告了成胶质细胞瘤中(参见Charest等,Charest等,Genes Chromosomes Cancer 37:58-71,2003；Charest等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100:916-921,2003)、肝癌中(参见例如PCT公开案No.WO2010/093928)、胆管癌中(参见Gu等,PLOS one 2011年6月6日；6(1):e15640.doi:10.1371/journal.pone.0015640)和NSCLC腺癌中(参见Kurtis D.Davies等,Identifying and Targeting ROS1Gene Fusions in Non-Small Cell Lung Cancer,Clin Cancer Res.2012年9月1日；18(17):4570-4579)存在呈与另一种蛋白质(例如SLC34A2、CD74或FIG)融合形式的异常表达的ROS1激酶。
[0075] 如本文中所使用，术语“ROS1融合”是指ROS1多肽中包含ROS1蛋白(或编码其的多肽)的激酶域的部分与另一种多肽(或编码其的聚核苷酸)的整体或部分融合，其中在融合物中指定该第二多肽或聚核苷酸的名称。(术语“融合”单纯意指来自第一基因的多肽或聚核苷酸的整体或部分与来自第二基因的多肽或聚核苷酸的整体或部分融合)。举例来说，SLC34A2-ROS1融合物是SLC34A2多肽(或编码其的聚核苷酸)的部分与ROS1多肽(或编码其的聚核苷酸)中包含激酶域ROS1的部分之间的融合物。ROS1融合通常由染色体易位或逆位造成。有许多种已知的ROS1融合，其全部是本发明的ROS1融合且包括而不限于：SLC34A2-ROS1融合蛋白，其成员包括SLC34A2-ROS1(VS)、SLC34A2-ROS1(S)、SLC34A2-ROS1(L)(参见美国专利申请No.20100143918)；CD74-ROS1(参见美国专利申请No.20100221737)；以及FIG-ROS1融合蛋白，其成员包括FIG-ROS1(S)、FIG-ROS1(L)和FIG-ROS1(XL)(参见PCT公布No.WO2010/093928)，所述文献的公开内容各自以全文引用的方式并入本文中。在ROS1多肽或ROS1融合后指出(L)、(S)、(VS)、(VL)、(XS)或(XL)一般分别是指长、短、极短、极长、超短和超长ROS1多肽或聚核苷酸。
[0076] 所有已知的ROS1融合蛋白都包含全长ROS1的完整激酶域。因此，如本文中所使用，“有ROS1激酶活性的多肽”(或“具有ROS1激酶活性的多肽”)意指包括全长ROS1蛋白的完整激酶域且因此保留ROS1激酶活性的蛋白质(或多肽)。有ROS1激酶活性的蛋白质的非限制性实例包括而不限于全长ROS1蛋白；SLC34A2-ROS1融合蛋白，其成员包括SLC34A2-ROS1(VS)、SLC34A2-ROS1(S)、SLC34A2-ROS1(L)(参见美国专利公布No.20100143918)、CD74-ROS1(参见美国专利公布No.20100221737)；以及FIG-ROS1融合蛋白，其成员包括FIG-ROS1(S)、FIG-ROS1(L)和FIG-ROS1(XL)(参见PCT公布No.WO2010/093928)；以及保留全长ROS1激酶蛋白的激酶域的任何截短或突变形式的ROS1激酶。示例性ROS1的激酶域阐述于SEQ ID NO:2中，故“有ROS1激酶活性的多肽”是氨基酸序列包含SEQ ID NO:2的多肽，或其激酶活性部分。
[0077] 如本文中所使用，“多肽”(或“氨基酸序列”或“蛋白质”)是指优选地由a-氨基酸、D-氨基酸、L-氨基酸和其组合按限定顺序连接而形成的聚合物。一个氨基酸残基与下一个氨基酸残基之间的连接称为酰胺键或肽键。多肽的非限制性实例包括是指寡肽、肽、多肽或蛋白质序列和其片段或部分以及天然存在的或合成的分子。多肽还包括衍生的分子，诸如糖蛋白和脂蛋白以及较低分子量多肽。“氨基酸序列”和类似术语，诸如“多肽”或“蛋白质”，不意味着所指示的氨基酸序列局限于与所述蛋白质分子相关的完整天然氨基酸序列。
[0078] 本领域中应该认识到，可以改变本发明多肽的一些氨基酸序列而不显著影响突变蛋白质的结构或功能。如果涵盖所述序列差异，则应该能想到蛋白质上应存在能决定活性的重要区域(例如，ROS1的激酶域)。一般来说，有可能置换会形成三级结构的残基，条件是使用执行类似功能的残基。在其他情况下，如果改变发生在蛋白质的非重要区域，则残基类型可能完全不重要。
[0079] 因此，本发明的有ROS1活性的多肽进一步包括本文中所描述的全长ROS1蛋白或各种ROS1融合多肽的显示出实质性ROS1激酶活性的变体。一些非限制性保守取代包括脂肪族氨基酸Ala、Val、Leu和Ile之间彼此交换；羟基残基Ser与Thr交换；酸性残基Asp与Glu交换；酰胺残基Asn与Gln交换；碱性残基Lys与Arg交换；以及芳香族残基Phe与Tyr交换。本领域技术人员已知的保守氨基酸取代的其他实例有：芳香族：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸(例如，以苯丙氨酸置换色氨酸残基)；疏水性：亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸；极性：谷氨酰胺、天冬酰胺；
碱性：精氨酸、赖氨酸、组氨酸；酸性：天冬氨酸、谷氨酸；小型：丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸。如上文详细指示，关于氨基酸变化可能呈表达型沉默型(即，不可能对功能具有显著不利影响)的进一步指导可见于以下文献中：Bowie等,Science 247,同上。
碱性：精氨酸、赖氨酸、组氨酸；酸性：天冬氨酸、谷氨酸；小型：丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸。如上文详细指示，关于氨基酸变化可能呈表达型沉默型(即，不可能对功能具有显著不利影响)的进一步指导可见于以下文献中：Bowie等,Science 247,同上。
[0080] “SLC34A2”可能是指由人SLC34A2基因蛋白或SLC34A2基因编码的钠依赖性磷酸盐转运蛋白2B。人SLC34A2蛋白(同种型A，其NCBI登记号是NP_001171469)是689个氨基酸的蛋白质。本文中进一步描述了SLC34A2。
[0081] CD74也称为HLA II类组织相容性抗原γ链，也称为HLA-DR抗原相关不变链或CD74(分化簇74)，其是由CD74基因编码的人蛋白质。说明性人CD74蛋白的NCBI登记号是NP_001020329且mRNA登记号是NM_001025158。CD74具有160个氨基酸并且是由位于染色体5上的CD74基因(5q32)编码。CD74具有9个外显子。本文中进一步描述了CD74。
[0082] FIG(融合在成胶质细胞瘤中)也称为“含有高尔基体相关PDZ和卷曲螺旋基元”的或“GOPC”蛋白，其是由位于染色体6上6q21处的基因编码。这种人蛋白质具有462个氨基酸。FIG具有由交替剪接产生的3种同种型。本发明中所提到的示例性人FIG蛋白的UniProtKB识别号是Q9HD26-1。
[0083] “SLC34A2-ROS1融合蛋白或基因”是指搭配物SLC34A2与ROS1的体细胞基因融合物。在一些实施方案中，SLC34A2-ROS1融合蛋白包括诸如SLC34A2之类的融合搭配物的N末端结构域和ROS1蛋白的C末端激酶域。融合搭配物的N末端结构域可以位于融合蛋白质的N末端，且ROS1蛋白的C末端激酶域可以位于融合蛋白质的C末端。融合搭配物可以是位于融合蛋白质N末端的SLC34A2蛋白N末端结构域。在这种情况下，融合蛋白质可以表示为包括处于N末端的SLC34A2蛋白N末端结构域和处于C末端的ROS1蛋白C末端激酶域的SLC34A2-ROS1蛋白。另一个实施方案提供了一种编码融合蛋白质的融合基因，其中编码融合搭配物N末端结构域的基因位于5'端，且编码ROS1蛋白C末端激酶域的基因位于3'端。在一些实施方案中，SLC34A2蛋白的部分与ROS1蛋白中包含功能激酶域的部分由于在SLC34A2存在下产生ROS1染色体重排的异常染色体易位而同框融合。在一些实施方案中，SLC34A2-ROS1融合蛋白可以包括融合SLC34A2外显子4-ROS1外显子32。在一些实施方案中，SLC34A2-ROS1融合蛋白可以包括融合SLC34A2外显子4-ROS1外显子34。如本发明中所使用的具有功能ROS1激酶域的SLC34A2-ROS1融合蛋白或基因可以含有涉及两种易位搭配物SLC34A2和ROS1的其他断裂点。示例性SLC34A2-ROS1融合蛋白可见于COSMIC，即癌症数据库v.68中的体细胞突变目录(cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/)下，其内容以全文引用的方式并入本文中。
[0084] “CD74-ROS1融合蛋白或基因”是指搭配物CD74与ROS1的体细胞基因融合。示例性CD74-ROS1融合蛋白可见于COSMIC，即癌症数据库v.68中的体细胞突变目录(cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/)下，其内容以全文引用的方式并入本文中。
[0085] “FIG-ROS1融合蛋白或基因”是指搭配物FIG与ROS1的体细胞基因融合。在一些实施方案中，人染色体6上位置6q21处240千碱基的染色体内纯合子缺失负责形成FIG-ROS1基因座。在一些实施方案中，FIG-ROS1转录物由7个FIG外显子和9个ROS1衍生的外显子编码。在一些实施方案中，FIG-ROS1基因编码具有组成活性和功能性ROS1激酶域的同框融合蛋白质。示例性FIG-ROS1融合蛋白可见于COSMIC，即癌症数据库v.68中的体细胞突变目录(cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic//)下，其内容以全文引用的方式并入本文中。
[0086] 出于本发明的目的，“患者”包括人和其他动物，尤其是哺乳动物，和其他生物体。因此，所述方法适用于人用疗法和兽医应用两者。在另一个实施方案中，患者是哺乳动物，而在另一个实施方案中，患者是人。
[0087] 化合物的“药学上可接受的盐”意指在药学上可接受且具有母体化合物的所需药理学活性的盐。应理解，药学上可接受的盐是无毒的。关于合适的药学上可接受的盐的其他信息可见于以下文献中：Remington's Pharmaceutical Sciences,第17版,Mack Publishing Company,Easton,PA,1985，其以引用的方式并入本文中；或S.M.Berge等,“Pharmaceutical Salts,”J.Pharm.Sci.,1977；66:1-19，两者均以引用的方式并入本文中。
[0088] 药学上可接受的酸加成盐的实例包括与以下诸酸形成的盐：无机酸，诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等等；和有机酸，诸如乙酸、三氟乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、草酸、马来酸、丙二酸、丁二酸、富马酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、3-(4-羟基苯甲酰)苯甲酸、杏仁酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑磺酸、葡糖庚酸、4,4'-亚甲基双-(3-羟基-2-烯-1-甲酸)、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡萄糖酸、谷氨酸、羟基萘酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸、对甲苯磺酸和水杨酸等等。
[0089] “前药”是指经活体内转化(典型地很快)，例如通过在血液中水解而产生具有上述化学式的母体化合物的化合物。常见实例包括但不限于具有携带甲酸部分的活性形式的化合物的酯和酰胺形式。本发明化合物的药学上可接受的酯的实例包括但不限于烷基酯(例如具有介于约1个与约6个之间的碳)，所述烷基是直链或支链。可接受的酯还包括环烷基酯和芳基烷基酯，诸如但不限于苯甲基。本发明化合物的药学上可接受的酰胺的实例包括但不限于伯酰胺以及仲烷基酰胺和叔烷基酰胺(例如具有介于约1个与约6个之间的碳)。本发明化合物的酰胺和酯可以根据常规方法来制备。前药的详尽论述提供于以下文献中：T.Higuchi和V.Stella“,Pro-drugs as Novel Delivery Systems”,A.C.S.专题论文系列第14卷；和Bioreversible Carriers in Drug Design,Edward B.Roche编,American Pharmaceutical Association and Pergamon Press,1987，两者均出于所有目的以引用的方式并入本文中。
[0090] “ROS1”或“ROS1蛋白”是跨膜受体酪氨酸激酶且进一步描述于本文中。
[0091] “治疗有效量”是指当施用至患者时可以改善疾病症状的本发明化合物的量。治疗有效量意在包括能有效地调节c-Met和/或VEGFR2或者有效地治疗或预防癌症的单独或与其他活性成分组合的化合物的量。构成“治疗有效量”的本发明化合物的量将视化合物、疾病状态和其严重程度、欲治疗的患者的年龄等等而变化。治疗有效量可以由本领域技术人员考虑其知识和本发明来决定。
[0092] 如本文中所使用的“治疗”疾病、病症或症候群包括：(i)预防人类中出现所述疾病、病症或症候群，即，使所述疾病、病症或、症候群的临床症状不会在可能曝露于或易感染所述疾病、病症或症候群但尚未经历或显示所述疾病、病症或症候群的症状的动物中发展；(ii)逆转或抑制所述疾病、病症或症候群，即，阻止其发展；和(iii)减轻所述疾病、病症或症候群，即，使所述疾病、病症或症候群消退。如本领域中已知，调节全身与局部递送、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、药物相互作用和病状严重程度可能是必需的，并且将可以利用常规经验来确定。
[0093] 本文中所描述的各反应的“产率”表示为理论产量的百分比。
[0094] 实施方案
[0095] 在一个实施方案中，式I化合物是式Ia的化合物：
[0096]
[0097] 或其药学上可接受的盐，其中：
[0098] R1是卤基；
[0099] R2是卤基；且
[0100] Q是CH或N。
[0101] 在另一个实施方案中，式I化合物是化合物1：
[0102]
[0103] 或其药学上可接受的盐。如先前所指示，化合物1在本文中称为N-(4-{[6,7-双(甲氧基)喹啉-4-基]氧}苯基)-N'-(4-氟苯基)环丙烷-1,1-二甲酰胺。以全文引用的方式并入本文中的WO 2005/030140公开了化合物1且描述了如何制造所述化合物(WO 2005/030140，实施例12、实施例37、实施例38和实施例48)，并且还公开了这种化合物抑制、调控和/或调节激酶的信号传导的治疗活性(WO 2005/030140，测定法，表4，表值289)。实施例48是基于WO 2005/030140中的第[0353]段。
[0104] 在其他实施方案中，式I化合物、式Ia化合物或化合物1或其药学上可接受的盐是作为药物组合物施用，其中所述药物组合物另外包含药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。在一个具体实施方案中，式I化合物是化合物1。
[0105] 如本文中所描述的式I化合物、式Ia化合物和化合物I包括所述化合物以及个别异构体和异构体混合物。在各情况下，式I化合物包括所述化合物的药学上可接受的盐、水合物和/或溶剂合物以及其任何个别异构体或异构体混合物。
[0106] 在其他实施方案中，式I化合物、式Ia化合物或化合物1可以是(L)-苹果酸盐。式I化合物和化合物1的苹果酸盐公开于PCT/US2010/021194和USSN 61/325095中，两者都以全文引用的方式并入本文中。
[0107] 在其他实施方案中，式I化合物是(D)-苹果酸盐，其也称为R-苹果酸盐。
[0108] 在其他实施方案中，式Ia化合物是苹果酸盐。
[0109] 在其他实施方案中，式Ia化合物是(L)-苹果酸盐，其也称为S-苹果酸盐。
[0110] 在其他实施方案中，化合物1是(D)-苹果酸盐，其也称为S-苹果酸盐。
[0111] 在其他实施方案中，化合物1是苹果酸盐。
[0112] 在其他实施方案中，化合物1是(L)-苹果酸盐，其也称为S-苹果酸盐。
[0113] 在另一个实施方案中，苹果酸盐呈如美国专利申请序号61/325095中所公开的化合物1的(L)苹果酸盐和/或(D)苹果酸盐的结晶N-1形式或N-2形式。关于结晶对映异构体(包括化合物1的苹果酸盐的N-1和/或N-2结晶形式)的性质，还参见WO 2008/083319，所述文献以全文引用的方式并入。制造和表征所述形式的方法充分描述于PCT/US10/021194中，所述文献以全文引用的方式并入本文中。
[0114] 在另一个实施方案中，本发明涉及一种用于逆转或抑制NSCLC的方法，在本文中所公开的任何实施方案中，所述方法包括向需要所述治疗的患者施用治疗有效量的式I化合物或其药学上可接受的盐。在一个具体实施方案中，式I化合物是化合物1或其药学上可接受的盐。
[0115] 在另一个实施方案中，本发明涉及一种用于逆转或抑制SLC34A2-ROS1融合阳性NSCLC的方法，在本文中所公开的任何实施方案中，所述方法包括向需要所述治疗的患者施用治疗有效量的式I化合物或其药学上可接受的盐。在一个具体实施方案中，式I化合物是化合物1或其药学上可接受的盐。
[0116] 在另一个实施方案中，本发明涉及一种用于逆转或抑制CD74-ROS1融合阳性NSCLC的方法，在本文中所公开的任何实施方案中，所述方法包括向需要所述治疗的患者施用治疗有效量的式I化合物或其药学上可接受的盐。在一个具体实施方案中，式I化合物是化合物1或其药学上可接受的盐。
[0117] 在另一个实施方案中，本发明涉及一种用于逆转或抑制FIG-ROS1融合阳性NSCLC的方法，在本文中所公开的任何实施方案中，所述方法包括向需要所述治疗的患者施用治疗有效量的式I化合物或其药学上可接受的盐。在一个具体实施方案中，式I化合物是化合物1或其药学上可接受的盐。
[0118] 在另一个实施方案中，式I化合物或其药学上可接受的盐是在一种或多种其他治疗之前、同时或之后施用。在另一个实施方案中，式I化合物或其药学上可接受的盐是在一种或多种治疗之后施用。“治疗”意指本领域技术人员可利用的治疗选项中的任一项，包括手术、化学治疗剂、激素疗法、抗体、免疫疗法、放射性碘疗法和辐射。具体来说，“治疗”意指另一种化学治疗剂或抗体。
[0119] 因此，在另一个实施方案中，式I化合物或其药学上可接受的盐是在顺铂和/或吉西他滨治疗后施用。
[0120] 在另一个实施方案中，式I化合物或其药学上可接受的盐是在多烯紫杉醇治疗后施用。
[0121] 在另一个实施方案中，式I化合物或其药学上可接受的盐是在HER-2抗体治疗后施用。在另一个实施方案中，所述HER-2抗体是曲妥珠单抗。
[0122] 在另一个实施方案中，式I化合物或其药学上可接受的盐是在顺铂和/或吉西他滨和/或多烯紫杉醇治疗后施用。
[0123] 在另一个实施方案中，式I化合物、式Ia化合物、化合物1或其药学上可接受的盐是以片剂或胶囊形式每日一次口服施用。在这些和其他实施方案中，式I化合物或其药学上可接受的盐是化合物1或其药学上可接受的盐。
[0124] 在另一个实施方案中，化合物1是以其游离碱形式或以苹果酸盐形式作为胶囊或片剂口服施用。
[0125] 在另一个实施方案中，化合物1是以其游离碱形式或以苹果酸盐形式作为含有至多100mg化合物1的胶囊或片剂每日一次口服施用。
[0126] 在另一个实施方案中，化合物1是以其游离碱形式或以苹果酸盐形式作为含有100mg化合物1的胶囊或片剂每日一次口服施用。
[0127] 在另一个实施方案中，化合物1是以其游离碱形式或以苹果酸盐形式作为含有95mg化合物1的胶囊或片剂每日一次口服施用。
[0128] 在另一个实施方案中，化合物1是以其游离碱形式或以苹果酸盐形式作为含有90mg化合物1的胶囊或片剂每日一次口服施用。
[0129] 在另一个实施方案中，化合物1是以其游离碱形式或以苹果酸盐形式作为含有85mg化合物1的胶囊或片剂每日一次口服施用。
[0130] 在另一个实施方案中，化合物1是以其游离碱形式或以苹果酸盐形式作为含有80mg化合物1的胶囊或片剂每日一次口服施用。
[0131] 在另一个实施方案中，化合物1是以其游离碱形式或以苹果酸盐形式作为含有75mg化合物1的胶囊或片剂每日一次口服施用。
[0132] 在另一个实施方案中，化合物1是以其游离碱形式或以苹果酸盐形式作为含有70mg化合物1的胶囊或片剂每日一次口服施用。
[0133] 在另一个实施方案中，化合物1是以其游离碱形式或以苹果酸盐形式作为含有65mg化合物1的胶囊或片剂每日一次口服施用。
[0134] 在另一个实施方案中，化合物1是以其游离碱形式或以苹果酸盐形式作为含有60mg化合物1的胶囊或片剂每日一次口服施用。
[0135] 在另一个实施方案中，化合物1是以其游离碱形式或以苹果酸盐形式作为含有55mg化合物1的胶囊或片剂每日一次口服施用。
[0136] 在另一个实施方案中，化合物1是以其游离碱形式或以苹果酸盐形式作为含有50mg化合物1的胶囊或片剂每日一次口服施用。
[0137] 在另一个实施方案中，化合物1是以其游离碱形式或以苹果酸盐形式作为含有45mg化合物1的胶囊或片剂每日一次口服施用。
[0138] 在另一个实施方案中，化合物1是以其游离碱形式或以苹果酸盐形式作为含有40mg化合物1的胶囊或片剂每日一次口服施用。
[0139] 在另一个实施方案中，化合物1是以其游离碱形式或以苹果酸盐形式作为含有35mg化合物1的胶囊或片剂每日一次口服施用。
[0140] 在另一个实施方案中，化合物1是以其游离碱形式或以苹果酸盐形式作为含有30mg化合物1的胶囊或片剂每日一次口服施用。
[0141] 在另一个实施方案中，化合物1是以其游离碱形式或以苹果酸盐形式作为含有25mg化合物1的胶囊或片剂每日一次口服施用。
[0142] 在另一个实施方案中，化合物1是以其游离碱形式或以苹果酸盐形式作为含有20mg化合物1的胶囊或片剂每日一次口服施用。
[0143] 在另一个实施方案中，化合物1是以其游离碱形式或以苹果酸盐形式作为含有15mg化合物1的胶囊或片剂每日一次口服施用。
[0144] 在另一个实施方案中，化合物1是以其游离碱形式或以苹果酸盐形式作为含有10mg化合物1的胶囊或片剂每日一次口服施用。
[0145] 在另一个实施方案中，化合物1是以其游离碱形式或以苹果酸盐形式作为含有5mg化合物1的胶囊或片剂每日一次口服施用。
[0146] 在另一个实施方案中，化合物1是以其游离碱或苹果酸盐形式作为如下表中所提供的片剂每日一次口服施用。
[0147]成分 (％w/w)
化合物1 31.68
微晶纤维素 38.85
无水乳糖 19.42
羟丙基纤维素 3.00
交联羧甲基纤维素钠 3.00
颗粒内总计 95.95
胶质二氧化硅 0.30
交联羧甲基纤维素钠 3.00
硬脂酸镁 0.75
总计 100.00
化合物1 31.68
微晶纤维素 38.85
无水乳糖 19.42
羟丙基纤维素 3.00
交联羧甲基纤维素钠 3.00
颗粒内总计 95.95
胶质二氧化硅 0.30
交联羧甲基纤维素钠 3.00
硬脂酸镁 0.75
总计 100.00
[0148] 在另一个实施方案中，化合物1是以其游离碱或苹果酸盐形式作为如下表中所提供的片剂每日一次口服施用。
[0150] 在另一个实施方案中，化合物1是以其游离碱或苹果酸盐形式作为如下表中所提供的片剂每日一次口服施用。
[0151]成分 理论量(mg/单位剂量)
化合物1 100.0
微晶纤维素PH-102 155.4
无水乳糖60M 77.7
羟丙基纤维素，EXF 12.0
交联羧甲基纤维素钠 24
胶质二氧化硅 1.2
硬脂酸镁(非牛) 3.0
Opadry黄 16.0
总计 416
化合物1 100.0
微晶纤维素PH-102 155.4
无水乳糖60M 77.7
羟丙基纤维素，EXF 12.0
交联羧甲基纤维素钠 24
胶质二氧化硅 1.2
硬脂酸镁(非牛) 3.0
Opadry黄 16.0
总计 416
[0152] 可以根据化合物1或其药学上可接受的盐的所需剂量来调节上文所提供的任何片剂调配物。因此，可按比例调节各调配物成分的量以提供如先前段落中所提供的含有不同量的化合物1的片剂调配物。在另一个实施方案中，调配物可以含有20、40、60或80mg化合物1或其药学上可接受的盐。
[0153] 在一些实施方案中，本发明提供了一种用于在哺乳动物中抑制或逆转异常细胞生长的进展的方法，所述方法包括施用式I化合物或其药学上可接受的盐，其中所述异常细胞生长是由ROS1融合蛋白质，例如SLC34A2-ROS1融合蛋白质、CD74-ROS1融合蛋白质、FIG-ROS1融合蛋白质、FIG-ROS1(L)融合蛋白质、FIG-ROS1(S)融合蛋白质和FIG-ROS1(VL)融合蛋白质以及包含如由人染色体6上的ROS1基因(6q22)所编码的功能C末端ROS1激酶域的其他ROS1融合蛋白质所介导的癌症。在一个实施方案中，癌症是肺腺癌。在另一个实施方案中，肺腺癌是非小细胞肺癌。在另一个实施方案中，肺腺癌是SLC34A2-ROS1融合阳性非小细胞肺癌。在另一个实施方案中，肺腺癌是CD74-ROS1融合阳性非小细胞肺癌。在另一个实施方案中，肺腺癌是FIG-ROS1融合阳性非小细胞肺癌。在另一个实施方案中，肺腺癌是ROS1融合阳性非小细胞肺癌。在另一个实施方案中，式I化合物或其药学上可接受的盐是作为包含式I化合物或其药学上可接受的盐和至少一种药学上可接受的载剂的药物组合物施用。在另一个实施方案中，式I化合物是在另一治疗形式之后施用。在另一个实施方案中，式I化合物或其药学上可接受的盐是在顺铂和/或吉西他滨治疗后施用。在另一个实施方案中，式I化合物或其药学上可接受的盐是在卡铂和/或吉西他滨治疗后施用。在另一个实施方案中，式I化合物是在克唑替尼治疗后施用。在另一个实施方案中，式I化合物或其药学上可接受的盐是在克唑替尼和/或吉西他滨治疗后施用。在另一个实施方案中，式I化合物或其药学上可接受的盐是在多烯紫杉醇治疗后施用。在另一个实施方案中，式I化合物是在卡铂治疗后施用。在另一个实施方案中，式I化合物是在顺铂和/或吉西他滨和/或多烯紫杉醇治疗后施用。在另一个实施方案中，式I化合物或其药学上可接受的盐是在卡铂和/或吉西他滨和/或多烯紫杉醇治疗后施用。在另一个实施方案中，式I化合物或其药学上可接受的盐是在克唑替尼和/或吉西他滨和/或多烯紫杉醇治疗后施用。
[0154] 在一些实施方案中，本发明提供了一种用于在哺乳动物中抑制或逆转异常细胞生长的进展的方法，所述方法包括施用式Ia化合物或其药学上可接受的盐，其中所述异常细胞生长是由ROS1融合蛋白质，例如SLC34A2-ROS1融合蛋白质、CD74-ROS1融合蛋白质、FIG-ROS1融合蛋白质、FIG-ROS1(L)融合蛋白质、FIG-ROS1(S)融合蛋白质和FIG-ROS1(VL)融合蛋白质以及包含如由人染色体6上的ROS1基因(6q22)所编码的功能C末端ROS1激酶域的其他ROS1融合蛋白质所介导的癌症。在一个实施方案中，癌症是肺腺癌。在另一个实施方案中，肺腺癌是非小细胞肺癌。在另一个实施方案中，肺腺癌是SLC34A2-ROS1融合阳性非小细胞肺癌。在另一个实施方案中，肺腺癌是CD74-ROS1融合阳性非小细胞肺癌。在另一个实施方案中，肺腺癌是FIG-ROS1融合阳性非小细胞肺癌。在另一个实施方案中，肺腺癌是ROS1融合阳性非小细胞肺癌。在另一个实施方案中，式Ia化合物或其药学上可接受的盐是作为包含式Ia化合物或其药学上可接受的盐和至少一种药学上可接受的载剂的药物组合物施用。在另一个实施方案中，式Ia化合物是在另一治疗形式之后施用。在另一个实施方案中，式Ia化合物或其药学上可接受的盐是在顺铂和/或吉西他滨治疗后施用。在另一个实施方案中，式Ia化合物是在多烯紫杉醇治疗后施用。在另一个实施方案中，式Ia化合物是在顺铂和/或吉西他滨和/或多烯紫杉醇治疗后施用。在另一个实施方案中，式Ia化合物或其药学上可接受的盐是在卡铂和/或吉西他滨治疗后施用。在另一个实施方案中，式Ia化合物或其药学上可接受的盐是在克唑替尼治疗后施用。在另一个实施方案中，式Ia化合物或其药学上可接受的盐是在克唑替尼和/或吉西他滨治疗后施用。在另一个实施方案中，式Ia化合物或其药学上可接受的盐是在多烯紫杉醇治疗后施用。在另一个实施方案中，式Ia化合物是在克唑替尼治疗后施用。在另一个实施方案中，式Ia化合物或其药学上可接受的盐是在顺铂和/或吉西他滨和/或多烯紫杉醇治疗后施用。在另一个实施方案中，式Ia化合物或其药学上可接受的盐是在卡铂和/或吉西他滨和/或多烯紫杉醇治疗后施用。在另一个实施方案中，式Ia化合物或其药学上可接受的盐是在克唑替尼和/或吉西他滨和/或多烯紫杉醇治疗后施用。
[0155] 在其他实施方案中，本发明提供了一种用于在哺乳动物中抑制或逆转异常细胞生长的进展的方法，所述方法包括施用化合物1或其药学上可接受的盐，其中所述异常细胞生长是由ROS1融合蛋白质，例如SLC34A2-ROS1融合蛋白质、CD74-ROS1融合蛋白质、FIG-ROS1融合蛋白质、FIG-ROS1(L)融合蛋白质、FIG-ROS1(S)融合蛋白质和FIG-ROS1(VL)融合蛋白质以及包含如由人染色体6上的ROS1基因(6q22)所编码的功能C末端ROS1激酶域的其他ROS1融合蛋白质所介导的癌症。在一个实施方案中，癌症是肺腺癌。在另一个实施方案中，肺腺癌是非小细胞肺癌。在另一个实施方案中，肺腺癌是SLC34A2-ROS1融合阳性非小细胞肺癌。在另一个实施方案中，肺腺癌是CD74-ROS1融合阳性非小细胞肺癌。在另一个实施方案中，肺腺癌是FIG-ROS1融合阳性非小细胞肺癌。在另一个实施方案中，肺腺癌是ROS1融合阳性非小细胞肺癌。在另一个实施方案中，化合物1或其药学上可接受的盐是作为包含化合物1或其药学上可接受的盐和至少一种药学上可接受的载剂的药物组合物施用。在另一个实施方案中，化合物1是在另一治疗形式之后施用。在另一个实施方案中，化合物1或其药学上可接受的盐是在顺铂和/或吉西他滨治疗后施用。在另一个实施方案中，化合物1或其药学上可接受的盐是在多烯紫杉醇治疗后施用。在另一个实施方案中，化合物1或其药学上可接受的盐是在顺铂和/或吉西他滨和/或多烯紫杉醇治疗后施用。在另一个实施方案中，化合物1或其药学上可接受的盐是在卡铂和/或吉西他滨治疗后施用。在另一个实施方案中，化合物1或其药学上可接受的盐是在克唑替尼治疗后施用。在另一个实施方案中，化合物1或其药学上可接受的盐是在克唑替尼和/或吉西他滨治疗后施用。在另一个实施方案中，化合物1或其药学上可接受的盐是在多烯紫杉醇治疗后施用。在另一个实施方案中，化合物1或其药学上可接受的盐是在卡铂治疗后施用。在另一个实施方案中，化合物1或其药学上可接受的盐是在顺铂和/或吉西他滨和/或多烯紫杉醇治疗后施用。在另一个实施方案中，化合物1或其药学上可接受的盐是在卡铂和/或吉西他滨和/或多烯紫杉醇治疗后施用。在另一个实施方案中，化合物1或其药学上可接受的盐是在克唑替尼和/或吉西他滨和/或多烯紫杉醇治疗后施用。在另一个实施方案中，化合物1或其药学上可接受的盐是在克唑替尼和/或卡铂治疗后施用。
[0156] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于在哺乳动物中预防、治疗、抑制或逆转异常细胞生长的进展的方法，所述方法包括施用化合物1或其药学上可接受的盐，其中所述异常细胞生长是由ROS1融合蛋白质，例如SLC34A2-ROS1融合蛋白质、CD74-ROS1融合蛋白质、FIG-ROS1融合蛋白质、FIG-ROS1(L)融合蛋白质、FIG-ROS1(S)融合蛋白质和FIG-ROS1(VL)融合蛋白质或其他ROS1融合蛋白质所介导之癌症，其中所述癌症先前已用克唑替尼和/或卡铂治疗方案加以治疗且因此具有抗克唑替尼和/或卡铂性。在一些实施方案中，抗克唑替尼和/或卡铂性癌症携带一种或多种选自以下的ROS1融合蛋白质：SLC34A2-ROS1融合蛋白质、CD74-ROS1融合蛋白质、FIG-ROS1融合蛋白质、FIG-ROS1(L)融合蛋白质、FIG-ROS1(S)融合蛋白质和FIG-ROS1(VL)融合蛋白质，和/或在SLC34A2-ROS1融合蛋白质、CD74-ROS1融合蛋白质、FIG-ROS1融合蛋白质、FIG-ROS1(L)融合蛋白质、FIG-ROS1(S)融合蛋白质或FIG-ROS1(VL)融合蛋白质的ROS1激酶域中含有突变。在一个实施方案中，抗克唑替尼和/或卡铂性癌症是在CD74-ROS1融合蛋白质的ROS1激酶域中具有突变的癌症。在一个相关实施方案中，所述癌症是克唑替尼难治性CD74-ROS1融合阳性肺腺癌，例如在ROS1激酶域中携带突变的克唑替尼难治性CD74-ROS1融合阳性NSCLC。在另一个实施方案中，抗克唑替尼和/或卡铂性癌症是癌症，例如抗克唑替尼性肺腺癌，例如在CD74-ROS1融合蛋白的ROS1激酶域中携带选自E1990G、G2032R、L2026M、L1951R、M2128V、K2003I和其组合的突变的抗克唑替尼性NSCLC。
[0157] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于在哺乳动物哺乳动物中预防、治疗、抑制或逆转的异常细胞生长(例如癌症)的进展的方法，所述方法包括施用式I化合物或其药学上可接受的盐，其中所述异常细胞生长是由ROS1融合蛋白质，例如SLC34A2-ROS1融合蛋白质、CD74-ROS1融合蛋白质、FIG-ROS1融合蛋白质、FIG-ROS1(L)融合蛋白质、FIG-ROS1(S)融合蛋白质、FIG-ROS1(VL)融合蛋白质或其他ROS1融合蛋白质所介导的癌症，其中所述癌症先前已用克唑替尼和/或卡铂治疗方案加以治疗且因此具有抗克唑替尼和/或卡铂性。在一些实施方案中，抗克唑替尼和/或卡铂性癌症携带一种或多种选自以下的ROS1融合蛋白质：SLC34A2-ROS1融合蛋白质、CD74-ROS1融合蛋白质、FIG-ROS1融合蛋白质、FIG-ROS1(L)融合蛋白质、FIG-ROS1(S)融合蛋白质和FIG-ROS1(VL)融合蛋白质，和/或在SLC34A2-ROS1融合蛋白质、CD74-ROS1融合蛋白质、FIG-ROS1融合蛋白质、FIG-ROS1(L)融合蛋白质、FIG-ROS1(S)融合蛋白质或FIG-ROS1(VL)融合蛋白质的ROS1激酶域中含有突变。在一个实施方案中，抗克唑替尼性癌症是在CD74-ROS1融合蛋白质的ROS1激酶域中具有突变的癌症。
在一个相关实施方案中，所述癌症是克唑替尼难治性CD74-ROS1融合阳性肺腺癌，例如在ROS1激酶域中携带突变的克唑替尼难治性CD74-ROS1融合阳性NSCLC。在另一个实施方案中，抗克唑替尼性癌症是癌症，例如抗克唑替尼性肺腺癌，例如在CD74-ROS1融合蛋白的ROS1激酶域中携带选自E1990G、G2032R、L2026M、L1951R、M2128V、K2003I和其组合的突变的抗克唑替尼性NSCLC。在上述各种实施方案中，用于在哺乳动物中预防、治疗、抑制或逆转异常细胞生长的进展的方法包括向需要其的患者施用式I化合物或式Ia化合物或化合物1或其药学上可接受的盐，示例性治疗有效剂量在以下范围内：约0.01mg/kg至约100mg/kg、或约0.1mg/kg至约75mg/kg、或约0.1mg/kg至约50mg/kg、或约0.1mg/kg至约40mg/kg、或约
0.1mg/kg至约30mg/kg、或约0.1mg/kg至约20mg/kg、或约0.1mg/kg至约15mg/kg、或约
0.1mg/kg至约10mg/kg、或约0.1mg/kg至约5mg/kg、或约0.1mg/kg至约1mg/kg，其中所述异常细胞生长是由ROS1融合蛋白，例如SLC34A2-ROS1融合蛋白、CD74-ROS1融合蛋白、FIG-ROS1融合蛋白、FIG-ROS1(L)融合蛋白、FIG-ROS1(S)融合蛋白、FIG-ROS1(VL)融合蛋白或其他ROS1融合蛋白介导的癌症；或在ROS1融合蛋白中携带一个或多个突变，例如SLC34A2-ROS1融合蛋白、CD74-ROS1融合蛋白、FIG-ROS1融合蛋白、FIG-ROS1(L)融合蛋白、FIG-ROS1(S)融合蛋白、FIG-ROS1(VL)融合蛋白或其他ROS1融合蛋白中的ROS1激酶域中的突变的癌症，在一些实施方案中，包括先前已用克唑替尼和/或卡铂治疗方案加以治疗且具有抗克唑替尼和/或卡铂性的癌症，例如抗克唑替尼性癌症，例如抗克唑替尼性肺腺癌，例如抗克唑替尼性NSCLC。
在一个相关实施方案中，所述癌症是克唑替尼难治性CD74-ROS1融合阳性肺腺癌，例如在ROS1激酶域中携带突变的克唑替尼难治性CD74-ROS1融合阳性NSCLC。在另一个实施方案中，抗克唑替尼性癌症是癌症，例如抗克唑替尼性肺腺癌，例如在CD74-ROS1融合蛋白的ROS1激酶域中携带选自E1990G、G2032R、L2026M、L1951R、M2128V、K2003I和其组合的突变的抗克唑替尼性NSCLC。在上述各种实施方案中，用于在哺乳动物中预防、治疗、抑制或逆转异常细胞生长的进展的方法包括向需要其的患者施用式I化合物或式Ia化合物或化合物1或其药学上可接受的盐，示例性治疗有效剂量在以下范围内：约0.01mg/kg至约100mg/kg、或约0.1mg/kg至约75mg/kg、或约0.1mg/kg至约50mg/kg、或约0.1mg/kg至约40mg/kg、或约
0.1mg/kg至约30mg/kg、或约0.1mg/kg至约20mg/kg、或约0.1mg/kg至约15mg/kg、或约
0.1mg/kg至约10mg/kg、或约0.1mg/kg至约5mg/kg、或约0.1mg/kg至约1mg/kg，其中所述异常细胞生长是由ROS1融合蛋白，例如SLC34A2-ROS1融合蛋白、CD74-ROS1融合蛋白、FIG-ROS1融合蛋白、FIG-ROS1(L)融合蛋白、FIG-ROS1(S)融合蛋白、FIG-ROS1(VL)融合蛋白或其他ROS1融合蛋白介导的癌症；或在ROS1融合蛋白中携带一个或多个突变，例如SLC34A2-ROS1融合蛋白、CD74-ROS1融合蛋白、FIG-ROS1融合蛋白、FIG-ROS1(L)融合蛋白、FIG-ROS1(S)融合蛋白、FIG-ROS1(VL)融合蛋白或其他ROS1融合蛋白中的ROS1激酶域中的突变的癌症，在一些实施方案中，包括先前已用克唑替尼和/或卡铂治疗方案加以治疗且具有抗克唑替尼和/或卡铂性的癌症，例如抗克唑替尼性癌症，例如抗克唑替尼性肺腺癌，例如抗克唑替尼性NSCLC。
[0158] 施用
[0159] 呈纯形式或呈适当药物组合物形式的式I化合物、式Ia化合物或化合物1或其药学上可接受的盐的施用可以通过任何接受的施用模式或用于提供类似效用的药剂来进行。因此，施用可以是例如口服、经鼻、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、局部、经皮、阴道内、膀胱内、脑池内或直肠，呈固体、半固体、冻干粉末或液体剂型，诸如片剂、栓剂、丸剂、软弹性和硬明胶剂型(其可以呈胶囊或片剂形式)、粉剂、溶液、悬浮液或气雾剂等等形式，具体来说，呈适合于简单施用精确剂量的单位剂型。
[0160] 组合物将包括常规药物载剂或赋形剂和作为活性剂的式I化合物，且另外可以包括载剂和佐剂等。
[0161] 佐剂包括防腐剂、润湿剂、悬浮剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、乳化剂和分散剂。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸、氯丁醇、苯酚、山梨酸等等来确保防止微生物活动。还可能需要包括等张剂，例如糖、氯化钠等等。可以通过使用能延迟吸收的药剂，例如单硬脂酸铝和明胶来实现可注射药物形式的长期吸收。
[0162] 如果需要，则式I化合物的药物组合物还可以含有微量辅助物质，诸如润湿或乳化剂、pH值缓冲剂、抗氧化剂等等，诸如柠檬酸、去水山梨醇单硬脂酸酯、三乙醇胺油酸酯、丁基化羟基甲苯等。
[0163] 组合物的选择视多种因素而定，诸如药物施用模式(例如，对于口服施用，呈片剂、丸剂或胶囊形式的组合物)和药品物质的生物利用率。最近，已基于可以通过增加表面积，即降低粒度来增加生物利用率的原理开发出了药物组合物，尤其是对于显示出不良生物利用率的药物。举例来说，美国专利No.4,107,288描述了一种具有粒度在10至1,000nm范围内的颗粒的药物组合物，其中活性物质是负载在大分子交联基质上。美国专利No.5,145,684描述了药物组合物的制造，其中在表面改质剂存在下将药品物质粉碎成纳米颗粒(平均粒度是400nm)，然后分散在液体介质中，以得到表达出相当高的生物利用率的药物组合物。
[0164] 适合于肠胃外注射的组合物可以包含生理学上可接受的无菌水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于复原成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。合适的水性和非水性载剂、稀释剂、溶剂或媒剂的实例包括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油等等)、其合适的混合物、植物油(诸如橄榄油)和可注射的有机酯，诸如油酸乙酯。可以例如通过使用诸如卵磷脂之类的包衣、通过维持所需粒度(在分散液的情况下)和通过使用介面活性剂来维持适当流动性。
[0165] 一种具体施用途径是使用可以根据欲治疗的疾病状态的严重程度加以调节的适宜每日剂量方案口服施用。
[0166] 用于口服施用的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉剂和颗粒。在所述固体剂型中，将活性化合物与至少一种惰性惯用赋形剂(或载剂)混合，诸如柠檬酸钠或磷酸二钙或(a)填充剂或增量剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如纤维素衍生物、淀粉、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)湿润剂，例如甘油；(d)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、交联羧甲基纤维素钠、复合硅酸盐和碳酸钠；(e)溶解延迟剂，例如石蜡；(f)吸收促进剂，例如季铵化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯、硬脂酸镁等等；(h)吸附剂，例如高岭土和膨润土；以及(i)润滑剂，例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠或其混合物。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，所述剂型还可以包含缓冲剂。
[0167] 如上文所描述的固体剂型可以制备有包衣和外壳，诸如肠溶衣以及本领域中众所周知的其他包衣和外壳。其还可以含有镇静剂，且还可以具有使其在肠道的某一部分中以延迟方式释放活性化合物的组成。可以使用的包埋组合物的实例是聚合物质和蜡。活性化合物还可以呈微囊封形式，在适当时含一种或多种上述赋形剂。
[0168] 用于口服施用的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。所述剂型是例如通过在以下各物中对式I化合物或其药学上可接受的盐和可选药物佐剂进行溶解、分散等操作来制备：载剂，诸如水、生理盐水、右旋糖水溶液、甘油、乙醇等等；增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺；油剂，具体来说，棉籽油、花生油、玉米胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和去水山梨醇脂肪酸酯；或这些物质的混合物等等，从而形成溶液或悬浮液。
[0169] 除活性化合物以外，悬浮液还可以含有悬浮剂，例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧化乙烯山梨醇酯和聚氧化乙烯去水山梨醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄芪胶或这些物质的混合物等等。
[0170] 用于经直肠施用的组合物是例如栓剂，其可以通过将式I化合物或其药学上可接受的盐与例如合适的无刺激赋形剂或载剂(诸如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡)混合来制备，所述赋形剂或载剂在常温下是固体但在体温下是液体且因此当处于合适的体腔中时会熔融并在其中释放活性组分。
[0171] 用于局部施用式I化合物或其药学上可接受的盐的剂型包括软膏、粉剂、喷雾和吸入剂。在可能需要时，在无菌条件下将活性成分与生理学上可接受的载剂和任何防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。还涵盖处于本公开案范围内的眼用组合物、眼用软膏、粉剂和溶液。
[0172] 可以使用压缩气体来分散式I化合物或其药学上可接受的盐，呈气雾剂形式。适用于此目的的惰性气体是氮气、二氧化碳等。
[0173] 一般来说，视预定施用模式而定，药学上可接受的组合物将含有以重量计约1％至约99％的式I化合物或其药学上可接受的盐和以重量计99％至1％的合适药物赋形剂。在一个实例中，所述组合物将是以重量计介于约5％与约75％之间的式I化合物、式Ia化合物或化合物1或其药学上可接受的盐，其余是合适的药物赋形剂。
[0174] 制备所述剂型的实际方法对于本领域技术人员是已知的，或将显而易见；例如参见Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版,(Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1990)。欲施用的组合物在任何情况下都将含有治疗有效量的式I化合物或其药学上可接受的盐，以便根据本公开的教授内容来治疗疾病状态。
[0175] 本公开的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物是以治疗有效量施用，所述治疗有效量将视多种因素而变化，包括所用特定化合物的活性、化合物的代谢稳定性和作用时长、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用模式和时间、排泄速率、药物组合、特定疾病状态的严重程度和主体正在经历的疗法。式I化合物、式Ia化合物或化合物1或其药学上可接受的盐可以在每天约0.1至约1,000mg范围内的剂量水平下施用至患者。对于体重是约70公斤的正常成人，在每天每公斤体重约0.01至约100mg范围内的剂量是一个实例。然而，所使用的特定剂量可以变化。举例来说，剂量可以取决于许多因素，包括患者的要求、正在治疗的病状的严重程度和所使用的化合物的药理学活性。针对特定患者确定最佳剂量对于本领域技术人员是众所周知的。
[0176] 在其他实施方案中，式I化合物、式Ia化合物或化合物1或其药学上可接受的盐可以与其他癌症治疗同时施用至患者。所述治疗尤其包括其他癌症化学治疗剂、激素替代疗法、放射疗法或免疫疗法。其他疗法的选择将视许多因素而定，包括化合物的代谢稳定性和作用时长、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用模式和时间、排泄速率、药物组合、特定疾病状态的严重程度和主体正在经历的疗法。
[0177] 在另一个方面，本发明提供了一种用于检测、诊断和治疗诸如SLC34A2-ROS1融合阳性NSCLC、CD74-ROS1融合阳性NSCLC和FIG-ROS1融合阳性NSCLC以及其他ROS1融合阳性NSCLC的ROS1融合相关疾病的方法。吾等在此更详细地描述用于检测和诊断所述病症的方法。可以通过向已鉴定或诊断为患有诸如SLC34A2-ROS1融合阳性NSCLC、CD74-ROS1融合阳性NSCLC和FIG-ROS1融合阳性NSCLC的ROS1融合相关疾病的患者施用治疗有效量的包含式I化合物或式I化合物的苹果酸盐或式I化合物的另一药学上可接受的盐(包括在一个具体实施方案中，式I化合物是化合物1或化合物1的苹果酸盐)的药物组合物来更好地实现治疗这些病症。
[0178] 在另一个方面，式I化合物或其药学上可接受的盐是施用至患者以用于预防或治疗肺癌。在这些实施方案中的一些中，所述方法包括向需要其的患者施用包含至少一种针对ROS1融合蛋白质的抑制剂、至少一种针对编码所述融合蛋白质的ROS1融合基因的抑制剂、至少一种针对ROS1编码基因的抑制剂或其组合作为活性成分的组合物。
[0179] ROS1与融合搭配物SLC34A2、CD74和FIG
[0180] 下文描述ROS1蛋白、SLC34A2蛋白、CD74蛋白和FIG蛋白、SLC34A2-ROS1融合或CD74-ROS1融合或FIG-ROS1融合或有时简称为“ROS1融合蛋白质和核酸”，包括检测方法、诊断方法、用于检测和诊断的试剂盒、筛选方法、用于肺癌患者的治疗和预防方法以及各种疗法、用于测量治疗有效性的方法和可以与各种治疗组合使用的其他药物成分。
[0181] ROS1蛋白是孤儿跨膜受体酪氨酸激酶。人ROS1激酶蛋白(由ROS1基因编码)是2347个氨基酸长的受体酪氨酸激酶，其倾向于异常表达，从而导致癌症。全长人ROS1激酶(具有人ROS1蛋白的氨基酸序列)的描述可见于UniProt登记号P08922(E.C.-2.7.10.1)。如表1中所示，ROS1的信号肽、细胞外域、跨膜域和激酶域见于SEQ ID NO:1中的以下氨基酸残基处。
[0182] 表1.SEQ ID NO:1中的ROS1蛋白氨基酸残基和结构域(信号肽1-27；细胞外域28-1859；跨膜域1860-1882；激酶域1945-2222)
[0183] 蛋白质
[0184]
[0185]
[0186] 人ROS1蛋白可以由位于人染色体6上的人ROS1基因编码。ROS1蛋白的C末端结构域可以包括由ROS1基因中从第31个或第32个或第34个外显子至最后一个外显子(例如第32个或第34个外显子)的聚核苷酸或其片段编码的氨基酸序列。ROS1蛋白的C末端结构域可以包括从第31个或第32个外显子的起始位置开始的连续至少约100个氨基酸。举例来说，ROS1蛋白的C末端结构域可以包括从第32个外显子(长形式)或第34个外显子(短形式)的起始位置至ROS1蛋白的C末端的连续约100至约700个氨基酸、连续约200至约600个氨基酸或连续约250至约500个氨基酸或连续约270至约425个氨基酸或连续约270至约450个氨基酸或连续约475至约625个氨基酸。ROS1蛋白的推定断裂点是1750或1852-1853aa(对于SLC34A2-ROS1融合蛋白质和CD74-ROS1融合蛋白质)和1880-1881aa(对于FIG-ROS1融合蛋白质)。
[0187] 在一个示例性实施方案中，编码人SLC34A2蛋白的人SLC34A2基因(mRNA NM_001177998)定位于人染色体4(4p15.2)且含有13个外显子和约690个氨基酸的氨基酸长度。
由这个基因编码的蛋白质是pH值敏感性钠依赖性磷酸盐转运蛋白。缺乏这个基因是肺泡微小结石症的一个诱因。对于这个基因，已经发现了编码两种不同的同种型的三种转录变体。
SLC34A2蛋白可以源自于哺乳动物，诸如人。SLC34A2-ROS1融合蛋白质的N末端结构域可以包括由从SLC34A2基因的第1个外显子至第12个外显子或从第1个外显子至第4个外显子或从第1个外显子至第2个外显子的聚核苷酸编码的氨基酸序列。SLC34A2基因结构中的这些最后观测到的外显子具有推定断裂点429和2076。SLC34A2-ROS1融合蛋白质的N末端结构域可以包括从SLC34A2蛋白的第1个位置开始的连续至少约30至250个氨基酸(即，至少从第1个至第250个位置的氨基酸序列或其片段)。SLC34A2-ROS1融合蛋白质的N末端结构域可以包括从SLC34A2蛋白的第1个氨基酸位置开始的连续约30至250个氨基酸、连续约30至225个氨基酸、连续约40至200个氨基酸或连续约40至175个氨基酸。
由这个基因编码的蛋白质是pH值敏感性钠依赖性磷酸盐转运蛋白。缺乏这个基因是肺泡微小结石症的一个诱因。对于这个基因，已经发现了编码两种不同的同种型的三种转录变体。
SLC34A2蛋白可以源自于哺乳动物，诸如人。SLC34A2-ROS1融合蛋白质的N末端结构域可以包括由从SLC34A2基因的第1个外显子至第12个外显子或从第1个外显子至第4个外显子或从第1个外显子至第2个外显子的聚核苷酸编码的氨基酸序列。SLC34A2基因结构中的这些最后观测到的外显子具有推定断裂点429和2076。SLC34A2-ROS1融合蛋白质的N末端结构域可以包括从SLC34A2蛋白的第1个位置开始的连续至少约30至250个氨基酸(即，至少从第1个至第250个位置的氨基酸序列或其片段)。SLC34A2-ROS1融合蛋白质的N末端结构域可以包括从SLC34A2蛋白的第1个氨基酸位置开始的连续约30至250个氨基酸、连续约30至225个氨基酸、连续约40至200个氨基酸或连续约40至175个氨基酸。
[0188] 在一个示例性实施方案中，SLC34A2-ROS1融合是人染色体6与人染色体4之间涉及ROS1且使ROS1的3'区域与SLC34A2的5'区域融合的染色体易位。使用本领域技术人员已知和或如本文中所描述的各种方法来检测并验证融合蛋白质。在一些实施方案中，然后向有需要的患者施用式I化合物或其药学上可接受的盐以用于预防或治疗肺癌。在一些实施方案中，向有需要的患者施用包含至少一种针对SLC34A2-ROS1融合蛋白质的抑制剂、至少一种针对编码所述融合蛋白质的SLC34A2-ROS1融合基因的抑制剂、至少一种针对ROS1编码基因的抑制剂或其组合作为活性成分的组合物。
[0189] 在SLC34A2-ROS1融合蛋白质中，融合或融合区可以存在于SLC34A2基因与ROS1基因的不同的外显子之间。许多融合是本领域技术人员已知的。所述融合的实例包括SLC34A2基因的第2个和/或第4个外显子与ROS1基因的第32个(长，L)和/或第34个外显子(短，S)，其被称为融合点或断裂点。其他ROS1和SLC34A2融合或断裂点是已知的，且可见于COSMIC，即癌症数据库v.68中的体细胞突变目录(cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/)下。术语“融合区”可能是指融合点周围的聚核苷酸片段(约10至30个核苷酸)或多肽(约5至30个氨基酸)片段。
[0190] CD74-ROS1融合是人染色体5与人染色体6之间涉及ROS1且使ROS1的3'区域与CD74的5'区域融合的染色体易位元。使用本领域技术人员已知和或如本文中所描述的各种方法来检测并验证融合蛋白质。CD74-ROS1融合蛋白质的N末端结构域可以包括由从CD74基因的第1个外显子至第12个外显子或第1个外显子至第4个外显子或从第1个外显子至第2个外显子的聚核苷酸编码的氨基酸序列。CD74-ROS1融合蛋白质的N末端结构域可以包括从CD74蛋白的第1个位置开始的连续至少约30至250个氨基酸(即，至少从第1个至第250个位置的氨基酸序列或其片段)。CD74-ROS1融合蛋白质的N末端结构域可以包括从CD74蛋白的第1个氨基酸位置开始的连续约30至250个氨基酸、连续约30至225个氨基酸、连续约40至200个氨基酸或连续约40至210个氨基酸或其片段。
[0191] 在融合蛋白质中，融合或融合区可以存在于CD74基因与ROS1基因的不同的外显子之间。许多融合是本领域技术人员已知的。所述CD74-ROS1融合的实例包括CD74基因的第6个外显子与ROS1基因的第32个或第34个外显子融合，其被称为融合点或断裂点。其他ROS1与CD74融合或断裂点是已知的，且可见于COSMIC，即癌症数据库v.68中的体细胞突变目录(cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/)下。术语“融合区”可能是指融合点周围的聚核苷酸片段(约10至30个核苷酸)或多肽(约5至30个氨基酸)片段。
[0192] 融合蛋白质FIG-ROS1由人染色体6融合FIG的5'区(aka GOPC)与ROS1的3'区的染色体内缺失产生。已在得自于胆管癌和卵巢癌患者的样品中鉴别出FIG-ROS1融合，频率分别是8.7％和0.5％。可以使用本领域技术人员已知和或如本文中所描述的各种方法来检测并验证FIG-ROS1融合蛋白质。FIG-ROS1融合蛋白质的N末端结构域可以包括从FIG蛋白的第1个位置开始的连续至少约150至500个氨基酸(即，至少从第1个至第500个位置的氨基酸序列或其片段)。FIG-ROS1融合蛋白质的N末端结构域可以包括从FIG蛋白的第1个氨基酸位置开始的连续约150至500个氨基酸、连续约200至450个氨基酸、连续约220至425个氨基酸或连续约220至约420个氨基酸或其片段。
[0193] 在FIG-ROS1融合蛋白质中，融合或融合区域可以存在于FIG基因与ROS1基因的不同的外显子之间。若干种FIG-ROS1融合是本领域技术人员已知的。所述融合的实例包括FIG基因的第4个或第8个外显子与ROS1基因的第35个或第36个外显子融合，其被称为融合点或断裂点。其他ROS1与FIG融合或断裂点是已知的，且可见于COSMIC，即癌症数据库v.68中的体细胞突变目录(cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/)下。术语“融合区”可能是指融合点周围的聚核苷酸片段(约10至30个核苷酸)或多肽(约5至30个氨基酸)片段。
[0194] 其他ROS1融合搭配物可以包括TPM3、SDC4、EZR和LRIG3，以及本文中详细描述的SLC34A2、CD74和FIG融合。(参见本文中的图1以及例如Takeuchi K,Soda M,Togashi Y,Suzuki R,Sakata S,Hatano S等,RET,ROS1and ALK fusions in lung cancer.Nat Med.2012；和Kurtis D.Davies,Anh T.Le,Mariana F.Theodoro,Margaret C.Skokan,Dara L.Aisner,Eamon M.Berge,Luigi M.Terracciano,Matteo Incarbone,Massimo Roncalli,Federico Cappuzzo,D.Ross Camidge,Marileila Varella-Garcia和Robert C.Doebelet,Identifying and Targeting ROS1Gene Fusions in Non-Small Cell Lung Cancer,(2012),Clin Cancer Res.2012年9月1日；18(17):4570-4579，这些关于ROS1融合蛋白质的公开内容以全文引用的方式并入本文中。
[0195] 在一个实施方案中，本发明的ROS1融合蛋白质包含提供功能激酶域的人ROS1蛋白(例如，如SEQ ID NO.1中所提供的人ROS1)的C末端结构域，其基本上由从对应于ROS1蛋白的第32个外显子的起始位置的氨基酸开始然后到ROS1蛋白的C末端的连续约50至300个氨基酸组成。
[0196] 如本文中所使用，外显子编号是根据由国家卫生研究院(Bethesda，Maryland，USA)所辖国家生物技术信息中心(the National Center for Biotechnology Information，NCBI)分配的外显子编号进行编号。在一些示例性实施方案中，融合蛋白质SLC34A2-ROS1可以具有由NCBI鉴别的任何氨基酸序列。DNA分子的核苷酸序列和由DNA分子编码的蛋白质的氨基酸序列可以通过自动化DNA测序器或自动化肽测序器来测定。与实际序列相比，通过所述自动化测序手段测定的(核苷酸或氨基酸)序列可以包括部分误差。一般来说，与实际序列相比，通过自动化测序测定的序列可以具有至少约90％、至少20约
95％、至少约99％或至少约99.9％的序列同一性。因此，与NCBI鉴定的序列相比，融合蛋白质、融合基因或融合区所具有的氨基酸序列或核苷酸序列可以具有至少约90％、至少约
95％、至少约99％或至少约99.9％的序列同一性。
95％、至少约99％或至少约99.9％的序列同一性。因此，与NCBI鉴定的序列相比，融合蛋白质、融合基因或融合区所具有的氨基酸序列或核苷酸序列可以具有至少约90％、至少约
95％、至少约99％或至少约99.9％的序列同一性。
[0197] 出于简便的目的，以下公开内容是指ROS1融合蛋白质SLC34A2-ROS1，但也可能可用于本文中所描述的其他ROS1融合蛋白质。在一些实施方案中，所例示的SLC34A2-ROS1融合蛋白质可以由SLC34A2的80至200个N末端氨基酸残基和ROS1的至少300个C末端残基(优选地在300至500个C末端氨基酸残基范围内)组成。融合基因具有蛋白质酪氨酸激酶域以及螺旋状结构域。不希望受任何理论束缚，相信SLC34A2-ROS1融合蛋白质的三级构形诱导同源二聚，此举将通过自磷酸化来激活致癌蛋白质酪氨酸激酶域。综上所述，由于SLC34A2，故SLC34A2-ROS1融合基因可以在翻译之后得以高度表达，然后二聚。然后，二聚的ROS1蛋白质酪氨酸激酶域可能受到异常刺激，因此促进对致癌途径的刺激，例如，如ROS1融合相关的NSCLC肺癌中所见。
[0198] 在检测到融合后，其将被称为编码SLC34A2-ROS1融合蛋白质的SLC34A2-ROS1融合基因。一种提供关于诊断肺癌的信息的方法，所述方法包括在获自受试者的测试样品中检测如本文中所描述的融合的步骤。诊断将比较编码融合蛋白质的融合基因和ROS1的过度表达，与得自未患癌症的个体的标准样品相比，其中当选择至少一个要素并在测试样品中检测到时，允许将所述受试者鉴定为任何或所有以下各项：癌症患者、肺癌患者、NSCLC肺癌患者、ROS1融合相关的NSCLC患者和/或SLC34A2-ROS1融合相关的NSCLC患者。
[0199] 染色体6的缺失、逆位或易位可以通过检测使用能够与人染色体6中的缺失、逆位或易位区杂交(互补结合)的聚核苷酸(探针)和/或能够检测人染色体6的缺失、逆位或易位，例如能够产生具有连续100至200个核苷酸且包括人染色体6中的逆位区的聚核苷酸片段的引物对来检测。本文中描述了融合蛋白质、融合基因和融合区。在一个示例性实施方案中，还可以通过检测融合蛋白质或融合基因或对应于融合基因的mRNA的存在，例如通过使用本领域中已知的和本文中所描述的ROS1特异性或ROS1融合特异性抗体来检测融合蛋白质。
[0200] 融合蛋白质的存在可以通过测量融合蛋白质与特异性结合融合蛋白质的物质(例如抗体或衔接子)之间的相互作用的一般测定法来检测。所述一般测定法可以是免疫色谱、免疫组织化学染色、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)、酶免疫测定法(EIA)、荧光免疫测定法(FIA)、发光免疫测定法(LIA)、免疫印迹、FACS等等。
[0201] 另外，融合基因或mRNA的存在可以使用能够与所述融合基因或mRNA杂交(互补结合)的聚核苷酸，通过诸如PCR、FISH(荧光原位杂交)等一般测定法来进行检测。下文更详细地描述了FISH。融合基因可以通过使用全转录组(RNA)和/或全基因组DNA测序的简并技术，通过大规模平行测序技术进行检测和/或验证。能够与融合基因或mRNA杂交的聚核苷酸可以是siRNA、寡核苷酸、DNA探针或DNA引物，其可以通过与测试样品中融合或截短的基因或转录物直接杂交来检测融合基因或mRNA。
[0202] 在其他实施方案中，本发明的方法中采用荧光原位杂交(FISH)(如Verma等,Human Chromosomes:A Manual Of Basic Techniques,Pergamon Press,New York,N.Y.(1988)中所描述)。可以使用一个或多个探针组进行FISH测定，从而提供诸多实施方案，诸如：(1)第一探针组，其是靶向含有ROS1基因的染色体位点(第一染色体位点)的第一探针组；其由经过第一荧光物质标记的探针1A和经过第二荧光物质标记的探针1B组成；探针1A与第一区互补，所述第一区是上述第一染色体位点中的5'区，探针1B与第二区互补，所述第二区存在于与上述第一区相距一定距离处并且是上述第一染色体位点中的3'区，且当通过SLC34A2与ROS1基因之间的易位产生SLC34A2-ROS1融合基因时，ROS1基因中的断裂点位于上述第一区的3'尾部、上述第一区与第二区之间或上述第二区的5'尾部；(2)第二探针组，其是靶向含有SLC34A2基因的染色体位点(第二染色体位点)的第二探针组；其由经过第一荧光物质标记的探针2A和经过第二荧光物质标记的探针2B组成；探针2A与第一区互补，所述第一区是上述第二染色体位点中的5'区，探针2B与第二区互补，所述第二区存在于与上述第一区相距一定距离处并且是上述第二染色体位点中的3'区，而且当通过SLC34A2与ROS1基因之间的易位产生SLC34A2-ROS1融合基因时，SLC34A2基因中的断裂点位于上述第一区的3'尾部、上述第一区与第二区之间或上述第二区的5'尾部；(3)第三探针组，其由上述探针2A和上述探针1B组成；以及(4)第四探针组，其由与含有ROS1基因的染色体位点(第三染色体位点)互补的探针4A和与含有SLC34A2基因的染色体位点(第四染色体位点)互补的探针4B组成。
[0203] 上述第一染色体位点的长度可以是0.5-2.0Mb。上述第二染色体位点的长度可以是0.5-2.0Mb。上述第三染色体位点的长度可以是0.5-2.0Mb。上述第四染色体位点的长度可以是0.5-2.0Mb。
[0204] 在一些实施方案中，可以将FISH测定法与其他物理染色体定位技术和基因图数据相关联。FISH技术是众所周知的(参见例如美国专利No.5,756,696、5,447,841、5,776,688和5,663,319)。基因图数据的实例可见于1994Genome Issue of Science(265:1981f)中。编码ROS1蛋白的基因和/或在ROS1融合多肽的情况下编码ROS1融合蛋白质的融合搭配物(例如FIG基因、SLC34A2基因或CD74基因)的基因在物理染色体图上的位置与特定疾病或特定疾病的素因之间的相关性可能有助于确定与所述遗传疾病相关的DNA区域。本发明的核苷酸序列可以用于检测正常个体、携带者或受影响个体之间的基因序列差异。
[0205] 染色体制剂的原位杂交和使用已确定的染色体标记物的物理定位技术(诸如键联分析)可以用于扩展基因图。通常，将基因置放在另一个哺乳动物物种(诸如小鼠)的染色体上可以公开相关标记物，即使并不知晓特定人染色体的编号或臂。可以通过物理定位将新序列指派至染色体臂或其部分。这就给使用定位克隆或其他基因发现技术来寻找疾病基因的研究者提供了有价值的信息。在已经通过遗传连锁将疾病或症候群大致定位至特定基因组区域后，例如将AT大致定位至11q22-23(Gatti等,Nature 336:577-580(1988))，定位至所述区域的任何序列都可以表示相关或调控基因以进行进一步研究。编码本发明的ROS1融合的核苷酸序列或其部分还可以用于检测正常个体、携带者或受影响个体之间由于易位、逆位等所致的染色体位置差异。
[0206] 应理解，检测编码具有ROS1激酶活性的多肽的聚核苷酸(例如，全长ROS1或ROS1融合聚核苷酸，诸如SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1(S))的所有方法(例如PCR和FISH)都可以与检测具有ROS1激酶活性的多肽或编码具有ROS1激酶活性的多肽的聚核苷酸的其他方法组合。举例来说，如果FIG-ROS1聚核苷酸在生物样品中实际上表达为FIG-ROS1融合多肽，则检测生物样品的遗传物质中的FIG-ROS1融合聚核苷酸(例如循环肿瘤细胞中的FIG-ROS1)之后可以对欲测定样品的蛋白质进行免疫印迹分析或免疫组织化学(IHC)分析。所述免疫印迹或IHC分析可以使用特异性结合由所检测的FIG-ROS1聚核苷酸编码的多肽的抗体来进行，或所述分析可以使用特异性结合全长FIG(例如，结合于所述蛋白质的N末端)或全长ROS1(例如，结合ROS1的激酶域中的表位)的抗体来进行。所述测定法在本领域中是已知的(参见例如美国专利No.7,468,252)。
[0207] 在另一个实例中，Dako的CISH技术允许对同一组织切片进行显色原位杂交与免疫组织化学。关于CISH与FISH的比较，参见Elliot等,Br J Biomed Sci 2008；65(4):167-171,2008。
[0208] 本发明的另一个方面提供了一种用于将患者诊断为患有由ROS1激酶驱动的肺癌或疑似肺癌的方法。所述方法包括使所述肺癌或疑似肺癌的生物样品(其中所述生物样品包含至少一种核酸分子)与能在严格条件下与编码具有ROS1激酶活性的多肽的核酸分子杂交的探针接触，所述核酸分子是诸如全长ROS1聚核苷酸或ROS1融合聚核苷酸(例如FIG-ROS1融合聚核苷酸、SLC34A2-ROS1融合聚核苷酸或CD74-ROS1融合聚核苷酸)，且其中所述探针与所述生物样品中的至少一种核酸分子杂交可以将所述患者鉴定为患有由ROS1激酶驱动的肺癌或疑似肺癌。
[0209] 本发明的另一个方面提供了一种用于将患者诊断为患有由ROS1激酶驱动的肺癌或疑似患有肺癌的方法。所述方法包括使所述肺癌或疑似肺癌的生物样品(其中所述生物样品包含至少一种核酸分子)与特异性结合具有ROS1激酶活性的多肽(例如FIG-ROS1融合多肽、SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1融合多肽)的试剂接触，其中所述试剂与所述生物样品中的至少一种融合多肽特异性结合可以将所述患者鉴定为患有由ROS1激酶驱动的肺癌或疑似肺癌。
[0210] 在各种实施方案中，鉴别由ROS1激酶驱动的肺癌或疑似肺癌将鉴定所述患者患有可能响应于ROS1抑制性治疗剂的肺癌或疑似肺癌。
[0211] 用于检测SLC34A2与ROS1基因之间的易位的试剂盒可以包括一个或多个探针组。(1)第一探针组包括经第一荧光物质标记的探针1A和经第二荧光物质标记的探针1B；探针
1A与第一区互补，所述第一区是上述第一染色体位点中的5'区，探针1B与第二区互补，所述第二区存在于与上述第一区相距一定距离处并且是上述第一染色体位点中的3'区，而且当通过SLC32A2与ROS1基因之间的易位产生SLC34A2-ROS1融合基因时，ROS1基因中的断裂点位于上述第一区的3'尾部、上述第一区与第二区之间或上述第二区的5'尾部；(2)第二探针组，其是靶向含有SLC32A2基因的染色体位点(第二染色体位点)的第二探针组；其由经第一荧光物质标记的探针2A和经第二荧光物质标记的探针2B组成；探针2A与第一区互补，所述第一区是上述第二染色体位点中的5'区，探针2B与第二区互补，所述第二区存在于与上述第一区相距一定距离处并且是上述第二染色体位点中的3'区，而且当通过SLC32A2与ROS1基因之间的易位产生SLC34A2-ROS1融合基因时，SLC32A2基因中的断裂点位于上述第一区的3'尾部、上述第一区与第二区之间或上述第二区的5'尾部；(3)第三探针组，其由上述探针2A和上述探针1B组成；以及第四探针组，其由与含有ROS1基因的染色体位点(第三染色体位点)互补的探针4A和与含有SLC32A2基因的染色体位点(第四染色体位点)互补的探针4B组成。
1A与第一区互补，所述第一区是上述第一染色体位点中的5'区，探针1B与第二区互补，所述第二区存在于与上述第一区相距一定距离处并且是上述第一染色体位点中的3'区，而且当通过SLC32A2与ROS1基因之间的易位产生SLC34A2-ROS1融合基因时，ROS1基因中的断裂点位于上述第一区的3'尾部、上述第一区与第二区之间或上述第二区的5'尾部；(2)第二探针组，其是靶向含有SLC32A2基因的染色体位点(第二染色体位点)的第二探针组；其由经第一荧光物质标记的探针2A和经第二荧光物质标记的探针2B组成；探针2A与第一区互补，所述第一区是上述第二染色体位点中的5'区，探针2B与第二区互补，所述第二区存在于与上述第一区相距一定距离处并且是上述第二染色体位点中的3'区，而且当通过SLC32A2与ROS1基因之间的易位产生SLC34A2-ROS1融合基因时，SLC32A2基因中的断裂点位于上述第一区的3'尾部、上述第一区与第二区之间或上述第二区的5'尾部；(3)第三探针组，其由上述探针2A和上述探针1B组成；以及第四探针组，其由与含有ROS1基因的染色体位点(第三染色体位点)互补的探针4A和与含有SLC32A2基因的染色体位点(第四染色体位点)互补的探针4B组成。
[0212] 适用于鉴别易于发生SLC34A2-ROS1易位的患者的试剂盒包括选自包括以下各项的群组的一个或多个要素：探针使用说明、DNA对比染色、杂交用缓冲液、密封剂和对照载玻片。所述试剂盒使得有可能便利而有效地实施本发明的检测方法。所述试剂盒可以包括上述第一探针组、第二探针组、第三探针组或第四探针组作为所需要素(基本成分)。所述试剂盒中还可以包括两种或更多种类型的探针组。举例来说，所述试剂盒可以并入第一探针组和第三探针组。由于上文已经描述了各探针组的细节，故此处将不对其进行重复。
[0213] “检测SLC34A2-ROS1融合聚核苷酸的存在或不存在”可以使用编码上述融合多肽的基因组DNA或得自所述基因组DNA的转录物直接进行，但其还可以使用得自所述转录物的翻译产物(上述融合多肽)间接地进行。
[0214] 因为编码融合多肽的基因组DNA是通过染色体6的117.61-117.75Mb区域(6q22)之间的逆位来形成，故可以在“检测SLC34A2-ROS1融合聚核苷酸的存在或不存在”时检测本到发明的现象。在对逆位进行的这种检测中，举例来说，可以检测到ROS1基因的激酶域编码区上游的5'侧区域与ROS1基因的所述编码区下游的3'侧区域之间的裂缝，或可以检测到SLC32A2基因的部分或所有螺旋状结构域的编码区和所述编码区上游的5'侧区域与SLC34A2基因的螺旋状结构域的编码区下游的3'侧区域之间的裂缝。
[0215] 本发明中可以使用本领域技术人员知道而且可利用的技术来“检测SLC34A2-ROS1融合聚核苷酸的存在或不存在”。如果“编码上述融合多肽的基因组DNA”是目标，则可以使用例如使用荧光等的原位杂交(ISH)、基因组PCR、直接测序、南方印迹或基因组微阵列分析。如果“来自于上述基因组DNA的转录物”是目标，则可以使用例如RT-PCR、直接测序、北方印迹、点印迹或cDNA微阵列分析。
[0216] 本发明的试剂盒还可以包括其他要素。这些其他要素的实例有探针使用说明书、DNA对比染色(诸如DAPI)、杂交缓冲液、洗涤缓冲液、溶剂、固定介质、对照载玻片、反应容器和其他设备。还可以包括用于诊断目的的说明书。此外，还可以包括显示如何使用ROS1激酶抑制剂在癌症患者中建立对来自于这些患者的染色体样品中的SLC34A2-ROS1易位进行检测(阳性鉴定)的说明书。此外，还可以包括确定治疗过程的计划和这个计划的说明。
[0217] 涵盖约200kb(探针1A)至约1,370kb(探针4B)的相对较长探针。因此，探针与靶序列之间的互补不需要具有高度限制性，达到可实现本发明所希望的特异性杂交的程度即可。靶序列之间的相似性的实例是至少90％，优选地是至少95％且更优选地是至少98％。
[0218] 在使用第一探针组和第二探针组的情况下，在SLC34A2基因与ROS1基因之间发生易位的染色体样品中分离且个别地检测到两个荧光信号；在未发生易位的染色体样品中，典型地观测到两个荧光信号彼此相邻或观测到呈两个荧光信号的组合形式的信号(黄色)。因此，SLC34A2基因与ROS1基因之间存在或不存在易位体现在荧光信号的图案上。因此，可以通过荧光信号的图案来确定SLC34A2基因与ROS1基因之间的易位。
[0219] 上文得出的判断优选地且典型地基于对结果与对照(测试样品)进行比较而作出。在此，对照是来源于患有非小细胞肺癌的患者的染色体样品或来源于表现出癌前病变的患者的染色体样品。另外，还可以将得自于无癌前病变的患者的染色体样品、得自于未患癌症的患者的染色体样品或获自正常健康受试者的染色体样品用作对照。还可以将来源于细胞系的染色体样品用作对照。
[0220] 当融合基因是编码融合蛋白质SLC34A2-ROS1的融合基因SLC34A2-ROS1时，融合基因SLC34A2-ROS1(或任何其他ROS1融合基因，例如CD74-ROS1和FIG-ROS1)可以通过使用能够与融合区杂交(互补结合)的聚核苷酸(探针)和/或能够产生具有连续100至200个核苷酸且包括融合区的聚核苷酸片段的引物对进行检测。另外，在一个示例性实施方案中，融合蛋白质SLC34A2-ROS1可以使用特异性结合融合蛋白质SLC34A2-ROS1的融合区的抗体或衔接子进行检测。
[0221] 另外，可以通过呈显色原位杂交(CISH)方法与银原位杂交(SISH)方法的组合形式的融合测定法进行检测。本说明书中的“融合点”是指来源于个别SLC34A2基因的部分与来源于ROS1基因的部分融合的点。
[0222] 术语“能够与融合区(或逆位区)杂交”可能是指具有互补序列或与融合区(或逆位区)的序列具有至少90％序列同一性的序列。另一个实施方案提供了一种用于诊断癌症的组合物，其包括选自由以下各项组成的群组中的一者或多者：能够与融合区杂交的聚核苷酸、能够产生具有连续100至200个核苷酸且包括融合区的聚核苷酸片段的一对引物。还包括能够与人染色体6中的逆位区杂交的聚核苷酸、能够产生具有连续100至200个核苷酸且包括人染色体6的逆位区的聚核苷酸片段的一对引物和结合融合区的抗体或衔接子。另一个实施方案提供了融合蛋白质和/或融合基因用于诊断癌症的用途。所述患者可以是任何哺乳动物，例如灵长类动物，诸如人或猴子；啮齿动物，诸如小鼠或大鼠；具体来说，人。适用于所提到的任何测定法的测试样品可以是细胞(例如肺细胞)；组织(例如肺组织)；体液(例如血液)；循环肿瘤DNA、循环肿瘤细胞。样品可以用本领域技术人员已知的任何方式加以收集，包括从肿瘤的手术活组织切片、肿瘤的核心活组织切片、肿瘤的细针吸出物、肋膜积液收集以及从患者分离细胞和组织的其他已知方法。举例来说，可以对循环肿瘤细胞进行FISH测定法(描述于本文中)。
[0223] 患者可能正在接受治疗或计划用激酶抑制剂进行治疗。测试样品可以包括来源于人癌细胞或其提取物的细胞。
[0224] 另一个实施方案提供了一种编码融合蛋白质的融合基因，其中编码融合搭配物N末端结构域的基因位于5'端，且编码ROS1蛋白C末端结构域的基因位于3'端。在一个示例性实施方案中，当融合蛋白质是SLC34A2-ROS1蛋白时，融合基因可以表示为SLC34A2-ROS1基因，其中编码SLC34A2的N末端结构域的基因位于5'端，且编码ROS1蛋白的C末端结构域的基因位于3'端。
[0225] 另一个实施方案提供了一种表达载体，其包括融合基因和可操作地连接于所述融合基因的任选转录元件(例如启动子等等)。另一个实施方案提供了一种经表达载体转化的转化细胞。
[0226] 在治疗或诊断过程中获得的生物样本(活组织切片样品等)通常经过福尔马林固定，但在这种情况下，宜使用原位杂交，因为作为检测目标的DNA基因组在福尔马林固定下稳定而且因为检测灵敏度较高。
[0227] 在原位杂交中，生物样本中编码SLC34A2-ROS1融合多肽的基因组DNA可以通过使以下(a)或(b)所述的具有至少15个核苷酸碱基的链长度的聚核苷酸杂交进行检测：
[0228] (a)呈选自由可以与编码SLC34A2蛋白的聚核苷酸杂交的探针和可以与编码ROS1蛋白的聚核苷酸杂交的探针组成的群组的至少一个探针形式的聚核苷酸；
[0229] (b)呈可以与编码SLC34A2蛋白的聚核苷酸与编码ROS1蛋白的聚核苷酸的融合位点杂交的探针形式的聚核苷酸。
[0230] 在原位杂交中，生物样本中编码CD74-ROS1融合多肽的基因组DNA可以通过使以下(a)或(b)所述的具有至少15个碱基的链长度的聚核苷酸杂交进行检测：
[0231] (a)呈选自由可以与编码CD74蛋白的聚核苷酸杂交的探针和可以与编码ROS1蛋白的聚核苷酸杂交的探针组成的群组的至少一个探针形式的聚核苷酸；
[0232] (b)呈可以与编码CD74蛋白的聚核苷酸与编码ROS1蛋白的聚核苷酸的融合位点杂交的探针形式的聚核苷酸。
[0233] 在原位杂交中，生物样本中编码FIG-ROS1融合多肽的基因组DNA可以通过使以下(a)或(b)所述的具有至少15个碱基的链长度的聚核苷酸杂交进行检测：
[0234] (a)呈选自由可以与编码FIG蛋白的聚核苷酸杂交的探针和可以与编码ROS1蛋白的聚核苷酸杂交的探针组成的群组的至少一个探针形式的聚核苷酸；
[0235] (b)呈可以与编码FIG蛋白的聚核苷酸与编码ROS1蛋白的聚核苷酸的融合位点杂交的探针形式的聚核苷酸。
[0236] 然而，在自然界中(即，非人为)，基因的DNA序列可能突变。因此，所述天然变体也可以是本发明的目标(类似于下文中)。
[0237] 本发明的(a)中所述的聚核苷酸可以是任何聚核苷酸，条件是其可以通过与编码ROS1结合搭配物(即，SLC34A2、CD74或FIG蛋白)的聚核苷酸或编码ROS1蛋白的聚核苷酸杂交来检测生物样本中编码上述ROS1融合蛋白质的基因组DNA的存在，所述聚核苷酸是所述聚核苷酸的靶碱基序列。其优选地为以下(a1)至(a4)中所述的聚核苷酸。
[0238] (a1)与SLC34A2基因外显子1-2的部分或所有螺旋状结构域的编码区和所述编码区上游的5'侧区域杂交的聚核苷酸(在下文中也称为“5'SLC34A2探针1”)跟与ROS1基因激酶域编码区和所述编码区下游的3'侧区域杂交的聚核苷酸(在下文中也称为“3'ROS1探针1”)的组合。
[0239] (a2)与ROS1基因激酶域编码区上游的5'侧区域杂交的聚核苷酸(在下文中也称为“5'ROS1探针1”)跟与ROS1基因激酶域编码区和所述编码区下游的3'侧区域杂交的聚核苷酸(在下文中也称为“3'ROS1探针1”)的组合。
[0240] (a3)与ROS1基因纤连蛋白III型9的编码区和所述区域上游的5'侧区域杂交的聚核苷酸(在下文中也称为“5'ROS1探针2”)跟与ROS1基因跨膜域编码区和所述编码区下游的3'侧区域杂交的聚核苷酸(在下文中也称为“3'ROS1探针2”)的组合。
[0241] (a4)与SLC34A2基因的部分或所有螺旋状结构域的编码区和所述编码区上游的5'侧区域杂交的聚核苷酸(在下文中也称为“5'SLC34A2探针1”)跟与SLC34A2基因的卷曲螺旋结构域的编码区和所述编码区下游的3'侧区域杂交的聚核苷酸(在下文中也称为“3'SLC34A2探针1”)的组合。
[0242] 由于对靶碱基序列的特异性和检测灵敏度，与原位杂交中所使用的聚核苷酸(a1)杂交的区域(靶碱基序列)优选地为从SLC34A2基因与ROS1基因的融合位点开始1,000,000个碱基以内的区域，且出于相同原因，与原位杂交中所使用的聚核苷酸(a2)至(a4)杂交的区域优选地为从SLC34A2基因或ROS1基因中的断裂点开始1,000,000个碱基以内的区域。
[0243] 由于对靶碱基序列的特异性和检测灵敏度，原位杂交中所使用的以上(a)或(b)中所述的聚核苷酸优选地为由可以涵盖所有上述靶碱基序列的多种类型多肽组成的集合。在这种情况下，构成所述集合的聚核苷酸的长度是至少15个碱基且优选地为100至1000个碱基。
[0244] 原位杂交中所使用的以上(a)或(b)中所述的聚核苷酸优选地通过荧光染料或类似物进行标记以便检测。所述荧光染料的实例包括DEAC、FITC、R6G、TexRed和Cy5，但不限于这些。除荧光染料以外，还可以用诸如DAB之类的染料(色素原)或银和基于酶促金属沉积的类似物来标记上述聚核苷酸。
[0245] 在原位杂交中，如果使用5'SLC34A2探针1和3'ROS1探针1，或如果使用5'ROS1探针1和3'ROS1探针1，或如果使用5'ROS1探针2和3'ROS1探针2，或如果使用5'SLC34A2探针1和
3'SLC34A2探针1，则优选地用互相不同的染料来标记这些探针。当使用经不同染料以这种方式标记的探针的组合进行原位杂交时，当由5'SLC34A2探针1标记产生的信号(例如荧光)和由3'ROS1探针1标记产生的信号重叠时，可以确定已经检测到编码SLC34A2-ROS1融合多肽的基因组DNA。另一方面，当由5'ROS1探针1标记产生的信号与由3'ROS1探针1标记产生的信号分开，或由5'ROS1探针2标记产生的信号与由3'ROS1探针2标记产生的信号分开，或由
5'SLC34A2探针1标记产生的信号与由3'SLC34A2探针1标记产生的信号分开时，可以确定已经检测到编码SLC34A2-ROS1融合多肽的基因组DNA。
3'SLC34A2探针1，则优选地用互相不同的染料来标记这些探针。当使用经不同染料以这种方式标记的探针的组合进行原位杂交时，当由5'SLC34A2探针1标记产生的信号(例如荧光)和由3'ROS1探针1标记产生的信号重叠时，可以确定已经检测到编码SLC34A2-ROS1融合多肽的基因组DNA。另一方面，当由5'ROS1探针1标记产生的信号与由3'ROS1探针1标记产生的信号分开，或由5'ROS1探针2标记产生的信号与由3'ROS1探针2标记产生的信号分开，或由
5'SLC34A2探针1标记产生的信号与由3'SLC34A2探针1标记产生的信号分开时，可以确定已经检测到编码SLC34A2-ROS1融合多肽的基因组DNA。
[0246] 聚核苷酸标记可以通过已知技术来进行。举例来说，可以将通过缺口平移或随机诱发以荧光染料或类似物标记的基质碱基并入聚核苷酸中，从而标记所述聚核苷酸。在原位杂交中，当使以上(a)或(b)和上述生物样本中所述的聚核苷酸杂交时所使用的条件可以视多种因素而变化，诸如相关聚核苷酸的长度，但高严格度杂交条件的实例是0.2×SSC、65℃，而低严格度杂交条件的实例是2.0×SSC、50℃。应注意，与上述条件具有相同严格度的杂交条件可以由本领域技术人员适当地选择各种条件，诸如盐浓度(SSC的稀释比)和温度以及表面活性剂(NP-40等)的浓度、甲酰胺的浓度和pH值来实现。举例来说，对于用于筛选的一般杂交条件，提供了能够在中等严格度至高严格度条件下与本文中所提供的聚核苷酸序列或其片段或其互补序列杂交的聚核苷酸组合物。杂交技术是分子生物学技术中众所周知的。出于说明的目的，适用于测试本发明聚核苷酸与其他聚核苷酸的杂交的中等严格度条件包括在5倍SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA的溶液(pH 8.0)中预洗；在50℃至60℃、5×SSC下杂交过夜；随后在65℃下洗涤两次20分钟，每次用含有0.1％SDS的2×、0.5×和0.2×SSC。本领域技术人员应该理解，可以容易地控制杂交严格度，诸如通过改变杂交溶液的盐含量和/或进行杂交的温度。举例来说，在另一个实施方案中，合适的高严格度杂交条件包括上述杂交条件，但杂交温度增至例如60℃至65℃或65℃至70℃。
[0247] 除上述原位杂交以外，使用以上(a)或(b)中所述的聚核苷酸检测编码SLC34A2-ROS1融合多肽的基因组DNA的方法的实例是南方印迹、北方印迹和点印迹。在这些方法中，通过在中等严格度至高严格度条件下使以上(a)或(b)中所述的聚核苷酸与已经将获自上述生物样本的核酸提取物转录在上面的膜进行杂交来检测上述融合基因。当使用聚核苷酸(a)时，当可以与编码SLC34A2蛋白的聚核苷酸杂交的多肽和可以与编码ROS1蛋白的聚核苷酸杂交的多肽识别所述膜上所显露的同一谱带时，可以确定已经检测到编码SLC34A2-ROS1融合多肽的基因组DNA。
[0248] 基因组微阵列分析和DNA微阵列分析是使用以上聚核苷酸(b)检测编码SLC34A2-ROS1融合多肽的基因组DNA的其他方法。在这些方法中，将聚核苷酸(b)的阵列固定至基质上，且通过使生物标本与所述阵列上的聚核苷酸接触来检测相关基因组DNA。在PCR或测序中，可以使用由生物样本制备的DNA(基因组DNA、cDNA)或RNA作为模板，将下文所述的聚核苷酸(c)用于特异性扩增部分或所有SLC34A2-ROS1融合聚核苷酸。(c)呈经过设计以便将编码SLC34A2蛋白的聚核苷酸与编码ROS1蛋白的聚核苷酸的融合位点夹在中间的一对引物形式的聚核苷酸。“呈一对引物形式的聚核苷酸”是在碱基序列中，一个引物与编码SLC34A2蛋白的聚核苷酸杂交，且另一个引物与编码ROS1蛋白的聚核苷酸杂交的引物组，诸如充当靶标的上述融合聚核苷酸。这些聚核苷酸的长度正常是15至100个碱基，且优选地为17至30个碱基。
[0249] 从PCR检测精确度和灵敏度的观点来看，本发明的(c)中所述的聚核苷酸优选地为上述融合聚核苷酸中从编码SLC34A2蛋白的聚核苷酸与编码ROS1蛋白的聚核苷酸的融合位点开始5000个碱基以内的碱基序列的互补序列。
[0250] 可以基于充当标靶的SLC34A2-ROS1融合聚核苷酸的碱基序列，通过已知技术适当地设计“呈一对引物形式的聚核苷酸”。“呈一对引物形式的聚核苷酸”的有利实例是由选自由SLC34A2-ROS1-F1、SLC34A2-int15-F1、SLC34A2-int15-F2、SLC34A2-ex16-F1、SLC34A2-ex23-F1、SLC34A2-ex24-F1、SLC34A2-F-orf2438和SLC34A2-int15-F3.5组成的群组的一个引物与选自由SLC34A2-ROS1-R1、ROS1-int11-R3、ROS1-int7-R1、ROS1-int11-R0.5、ROS1-int11-R1、ROS1-int7-R2和ROS1-R-orf2364组成的群组的一个引物组成的引物组。更优选地，其是SLC34A2-ROS1-F1和SLC34A2-ROS1-R1、SLC34A2-int15-F1和SLC34A2-ROS1-R1、SLC34A2-int15-F2和ROS1-int11-R3、SLC34A2-ex16-F1和SLC34A2-ROS1-R1、SLC34A2-ex23-F1和SLC34A2-ROS1-R1或SLC34A2-ex24-F1引物和ROS1-int7-R1引物。
[0251] 在一些实施方案中，本发明提供鉴别、评定或检测SLC34A2-ROS1融合的方法；鉴别、评定、评估和/或治疗患有癌症的受试者的方法，例如具有SLC34A2-ROS1、CD74-ROS1或FIG-ROS1融合的癌症；分离SLC34A2-ROS1、CD74-ROS1或FIG-ROS1核酸分子、核酸构筑体、含有所述核酸分子的宿主细胞；经过纯化的SLC34A2-ROS1、CD74-ROS1或FIG-ROS1多肽和结合剂；检测试剂(例如，能够特异性检测SLC34A2-ROS1、CD74-ROS1或FIG-ROS1核酸或蛋白质的探针、引物、抗体、试剂盒)；用于鉴别与5'SLC34A2-3'ROS1、5'CD74-3'ROS1或5'FIG-3'ROS1融合相互作用(例如抑制)的分子(例如新颖激酶抑制剂)的筛选测定法；以及用于评估、鉴别、评定和/或治疗患有癌症(例如具有SLC34A2-ROS1、CD74-ROS1或FIG-ROS1融合中的一者或多者的癌症)的受试者的测定法和试剂盒。本文中所鉴别的组合物和方法可以用于例如鉴别新的SLC34A2-ROS1、CD74-ROS1或FIG-ROS1抑制剂；评估、鉴别或选择受试者，例如患有癌症的患者；以及治疗或预防癌症。
[0252] SLC34A2-ROS1、CD74-ROS1和FIG-ROS1核酸分子。在一个方面，本发明提供了一种核酸分子(例如，经过分离或纯化的核酸分子)，其包括SLC34A2或CD74或FIG基因的片段和ROS1原癌基因的片段。在一个实施方案中，核酸分子包括SLC34A2、CD74或FIG的至少一个外显子与ROS1的外显子(例如，一个或多个编码ROS1酪氨酸激酶域或其片段的外显子)的融合，例如同框融合。
[0253] 在一个说明性实施方案中，5'SLC34A2-3'ROS1核酸分子包含足以使所编码的5'SLC34A2-3'ROS1融合具有组成性激酶活性，例如与野生型ROS1相比具有升高的活性(例如激酶活性)的SLC34A2和ROS1序列，例如在本文中所提到的癌症的细胞中。在一个实施方案中，所编码的5'SLC34A2-3'ROS1融合包含至少1、2、3、4、5、6、7、9、10或11个SLC34A2外显子和至少1、2、3、4、5、6、7、9、10、11、12或13个ROS1外显子。在一个实施方案中，所编码的5'SLC34A2-3'ROS1融合多肽包括螺旋状结构域或其功能片段和ROS1酪氨酸激酶域或其功能片段。
[0254] 在一个说明性实施方案中，5'CD74-3'ROS1核酸分子包含足以使所编码的5'CD74-3'ROS1融合具有组成性激酶活性，例如与野生型ROS1相比具有升高的活性(例如激酶活性)的CD74和ROS1序列，例如在本文中所提到的癌症的细胞中。在一个实施方案中，所编码的5'CD74-3'ROS1融合包含至少1、2、3、4、5、6个CD74外显子和至少1、2、3、4、5、6、7、9、10、11、12或13个ROS1外显子。在一个实施方案中，所编码的5'CD74-3'ROS1融合多肽包括II型膜蛋白结构域的螺旋状信号锚或其功能片段和ROS1酪氨酸激酶域或其功能片段。
[0255] 在一个说明性实施方案中，5'FIG-3'ROS1核酸分子包含足以使所编码的5'FIG-3'ROS1融合具有组成性激酶活性，例如与野生型ROS1相比具有升高的活性(例如激酶活性)的FIG和ROS1序列，例如在本文中所提到的癌症的细胞中。在一个实施方案中，所编码的5'FIG-3'ROS1融合包含至少1、2、3、4、5、6、7或8个FIG外显子和至少1、2、3、4、5、6、7、9、10、11、12或13个ROS1外显子。在一个实施方案中，所编码的5'FIG-3'ROS1融合多肽包括卷曲螺旋结构域或其功能片段和ROS1酪氨酸激酶域或其功能片段。
[0256] 在一个实施方案中，SLC34A2-ROS1融合核酸分子包括具有SLC34A2的外显子2和/或4与ROS1的外显子32和/或34和/或35的同框融合的核苷酸序列。在另一个实施方案中，核酸分子包括有包括断裂点的核苷酸序列。举例来说，SLC34A2-ROS1融合可以包括SLC34A2的至少外显子4或其片段(例如SLC34A2的外显子1至4或其片段)与ROS1的至少外显子32和/或34或其片段(例如ROS1的外显子30至43或其片段)的同框融合。在某些实施方案中，
SLC34A2-ROS1融合呈5'-SLC34A2至3'-ROS1构形。在一个实施方案中，核酸分子包括SLC34A2基因的外显子1-4的核苷酸序列或其片段。在另一个实施方案中，核酸分子包括ROS1基因的外显子30-43(例如32和/或34和/或35)的核苷酸序列或其片段或基本上与其同一的序列。
SLC34A2-ROS1融合呈5'-SLC34A2至3'-ROS1构形。在一个实施方案中，核酸分子包括SLC34A2基因的外显子1-4的核苷酸序列或其片段。在另一个实施方案中，核酸分子包括ROS1基因的外显子30-43(例如32和/或34和/或35)的核苷酸序列或其片段或基本上与其同一的序列。
[0257] 在一个实施方案中，CD74-ROS1融合核酸分子包括具有CD74的外显子1至6与ROS1的外显子32和/或34的同框融合的核苷酸序列。在另一个实施方案中，核酸分子包括有包括断裂点的核苷酸序列。举例来说，CD74-ROS1融合可以包括CD74的至少外显子6或其片段(例如CD74的外显子1至6或其片段)与ROS1的至少外显子32和/或34和/或35或其片段(例如ROS1的外显子30至43或其片段)的同框融合。在某些实施方案中，CD74-ROS1融合呈5'-CD74至3'-ROS1构形。在一个实施方案中，核酸分子包括CD74基因的外显子1-6的核苷酸序列或其片段。在另一个实施方案中，核酸分子包括ROS1基因的外显子30-43(例如32和/或34和/或35)的核苷酸序列或其片段或基本上与其同一的序列。
[0258] 在一个实施方案中，FIG-ROS1融合核酸分子包括具有FIG的外显子1至8(例如1至4或1至8)与ROS1的外显子32和/或34和/或35的同框融合的核苷酸序列。在另一个实施方案中，核酸分子包括有包括断裂点的核苷酸序列。举例来说，FIG-ROS1融合可以包括FIG的至少外显子4和/或外显子8或其片段(例如FIG的外显子1至4或1至8或其片段)与ROS1的至少外显子32和/或34和/或35或其片段(例如ROS1的外显子30至43或其片段)的同框融合。在某些实施方案中，FIG-ROS1融合呈5'-CD74至3'-ROS1构形。在一个实施方案中，核酸分子包括CD74基因的外显子1-6的核苷酸序列或其片段。在另一个实施方案中，核酸分子包括ROS1基因的外显子30-43(例如32和/或34和/或35)的核苷酸序列或其片段或基本上与其同一的序列。
[0259] 在其他实施方案中，SLC34A2-ROS1融合核酸分子包括编码SLC34A2-ROS1融合多肽的核苷酸序列，所述融合多肽包括SLC34A2基因的片段和ROS1原癌基因的片段。在一个实施方案中，核苷酸序列编码包括螺旋状结构域或其功能片段和ROS1酪氨酸激酶域或其功能片段的SLC34A2-ROS1融合多肽。
[0260] 在另一个实施方案中，CD74-ROS1融合核酸分子包括CD74-ROS1融合，所述融合包括ROS1转录物与CD74转录物之间的融合接点。在另一个实施方案中，核酸分子包括ROS1的至少外显子32或34或35或其片段(例如ROS1的外显子30至43或其片段)与至少外显子1或其片段(例如CD74的外显子1至6或其片段)的融合，例如同框融合。在某些实施方案中，CD74-ROS1融合呈5'-CD74至3'-ROS1构形。在一个实施方案中，核酸分子包括对应于ROS1基因的外显子30-43(例如外显子32、34或35)的核苷酸或其片段或基本上与其同一的序列。
[0261] 在另一个实施方案中，FIG-ROS1融合核酸分子包括FIG-ROS1融合，所述融合包括ROS1转录物与FIG转录物之间的融合接点。在另一个实施方案中，核酸分子包括ROS1的至少外显子32或34或35或其片段(例如ROS1的外显子30至43或其片段)与至少外显子4或8或其片段(例如FIG的外显子1至8或其片段)的融合，例如同框融合。在某些实施方案中，FIG-ROS1融合呈5'-FIG至3'-ROS1构形。在一个实施方案中，核酸分子包括对应于ROS1基因的外显子30-43(例如外显子32、34或35)的核苷酸或其片段或基本上与其同一的序列。
[0262] 在一个相关态样中，本发明提供包括本文中所描述的SLC34A2-ROS1、CD74-ROS1和FIG-ROS1融合核酸分子的核酸构筑体。在某些实施方案中，核酸分子可操作地连接于天然或异源调控序列。还包括了包括本文中所描述的SLC34A2-ROS1核酸分子的载体和宿主细胞，例如适用于产生本文中所描述的核酸分子和多肽的载体和宿主细胞。
[0263] 在另一个方面，本发明提供能减少或抑制编码本文中所描述的SLC34A2-ROS1融合的核酸分子的表达的核酸分子。所述核酸分子的实例包括例如与编码SLC34A2-ROS1、CD74-ROS1和FIG-ROS1或SLC34A2-ROS1、CD74-ROS1和FIG-ROS1的转录调控区的核酸杂交且阻断或减少SLC34A2-ROS1、CD74-ROS1或FIG-ROS1的mRNA表达的反义分子、核糖酶、RNAi、三螺旋分子。
[0264] 本发明还提供了一种适用作探针、引物、诱饵或库成员的核酸分子，例如核酸片段，其包括、侧接、杂交、适用于鉴别或者基于本文中所描述的ROS1融合。在某些实施方案中，探针、引物或诱饵分子是允许俘获、检测或分离本文中所描述的ROS1融合核酸分子的寡核苷酸。寡核苷酸可以包含基本上与本文中所描述的ROS1融合核酸分子的片段互补的核苷酸序列。核酸片段(例如寡核苷酸)与靶ROS1融合序列之间的序列同一性不必是准确的，只要序列互补性足以俘获、检测或分离靶序列即可。在一个实施方案中，核酸片段是在长度上包括约5至25个，例如10至20个或10至15个核苷酸的寡核苷酸的探针或引物。在其他实施方案中，核酸片段是包括约100至300个核苷酸、130至230个核苷酸、150至200个核苷酸、200至350个、350至950个、300至600个、500至1000个、750至2000个核苷酸长的寡核苷酸的诱饵，且未必包括ROS1融合核酸。
[0265] 在一个实施方案中，核酸片段可以用于鉴别或俘获(例如通过在中等严格度至高严格度条件下杂交)SLC34A2-ROS1融合或CD74-ROS1融合或FIG-ROS1融合。在一个说明性实例中，核酸片段可以是用于鉴别或俘获(例如通过杂交)本文中所描述的SLC34A2-ROS1融合或CD74-ROS1融合或FIG-ROS1融合的探针、引物。在一个实施方案中，核酸片段可用于鉴别或俘获SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1断裂点。在一个示例性实施方案中，核酸片段在可以产生SLC34A2的外显子4或13与ROS1的外显子32、34或35的同框融合的染色体重排内与核苷酸序列(例如，染色体6上的易位内的序列)杂交。
[0266] 本文中所描述的探针或引物可以用于例如FISH检测或PCR扩增或用于ROS1重排的RT-PCT证实和结合搭配物的鉴别。在检测是基于PCR的一个示例性实施方案中，SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合接合的扩增可以使用一个引物或一对引物来进行，例如用于扩增侧接有本文中所描述的SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合接合的序列，例如本文中所描述的染色体重排的突变或接合。在一个实施方案中，一对分离的寡核苷酸引物可以扩增含有SLC34A2-ROS1融合中的位置或与其相邻的区域。举例来说，可以设计正向引物以便与SLC34A2、CD74或FIG基因组或mRNA序列内的核苷酸序列杂交。在各种实施方案中，针对ROS1、SLC34A2和FIG(各种物种，包括人)的引物可以购自Qiagen(目录号QF0018545、QF00449078和QF00278992，Qiagen，Gaithersburg，MD，USA)。在其他实施方案中，可以使用一组PCR引物(包括SLC34A2外显子4和CD74外显子6正向引物，各自与ROS1外显子32和外显子34反向引物配对)在患者的肿瘤样品上证实ROS1融合聚核苷酸的存在。可以使用Agencourt Formapure方法(Agencourt Biosciences，Beverly，MA，USA)从FFPE组织提取肿瘤样品的RNA，并且使用可购自Invitrogen(Carlsbad，CA，USA)的Superscript III cDNA合成试剂盒进行反转录。以下引物可以用于测定SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1断裂点：SLC34A2外显子4正向引物，TCGGATTTCTCTACTTTTTCGTG(SEQ ID NO:3)；CD74外显子6正向引物，CTCCTGTTTGAAATGAGCAGG(SEQ ID NO:4)；ROS1外显子32反向引物，
GGAATGCCTGGTTTATTTGG(SEQ ID NO:5)；和ROS1外显子34反向引物，
TGAAACTTGTTTCTGGTATCCAA(SEQ ID NO:6)。可以在任何PCR热循环仪，例如Eppendorf Mastercycler Gradient(Eppendorf，Hamburg，Germany)中使用Platinum Taq聚合酶(Invitrogen)在标准条件下利用40ng cDNA进行PCR扩增。使用BigDye 3.0试剂盒(Life Technologies，Carlsbad，CA)对cDNA进行测序。
GGAATGCCTGGTTTATTTGG(SEQ ID NO:5)；和ROS1外显子34反向引物，
TGAAACTTGTTTCTGGTATCCAA(SEQ ID NO:6)。可以在任何PCR热循环仪，例如Eppendorf Mastercycler Gradient(Eppendorf，Hamburg，Germany)中使用Platinum Taq聚合酶(Invitrogen)在标准条件下利用40ng cDNA进行PCR扩增。使用BigDye 3.0试剂盒(Life Technologies，Carlsbad，CA)对cDNA进行测序。
[0268] 在另一个示例性实施方案中，一种确定SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合的存在的方法包括：直接获取来自于受试者的样品中存在SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合核酸分子或多肽的知识。样品可以是包含体液、细胞、组织(例如肿瘤组织)的样品，其可以包括核酸样品、蛋白质样品、肿瘤活组织切片或循环肿瘤细胞或核酸，其可以选自肺癌，包括NSCLC、SCLC、SCC或其组合，和腺癌或黑素瘤。
[0269] 所述方法检测核酸分子中的SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合且使用以下方法中的任一种：核酸杂交测定法、基于扩增的测定法、PCR-RFLP测定法、实时PCR、测序、筛选分析、FISH、光谱核型分析或MFISH、比较基因组杂交、原位杂交、SSP、HPLC或质谱基因型分析。
[0270] 描述了检测SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合多肽或蛋白质的方法，包括使蛋白质样品与特异性结合SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合多肽的试剂接触且检测SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合多肽与所述试剂的复合物的形成的方法。多肽检测的方法包括使用经可检测基团标记的试剂来促进对已结合和未结合试剂的检测，其中所述试剂是抗体分子，其中评估SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合的含量或活性，其中在治疗受试者开始之前、期间或之后检测SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合，其中在诊断有癌症时检测SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合，其中在预定间隔(例如第一时间点和至少一个后续时间点)检测SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合。
[0271] 还包括对治疗的反应，具体来说，在响应于确定存在SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合的情况下，使用以下各项中的一项或多项：(1)对患者群体进行层选；(2)将受试者鉴别或选择为可能或不可能对治疗作出反应；(3)选择治疗选项；和/或(4)预测受试者的疾病的时程。
[0272] 编码SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合或包含其片段的断裂点的经分离或纯化的核酸分子可以用于证实目的和使用本发明化合物进行的NSCLC以及肺腺癌ROS1融合阳性癌症的定向特异性治疗。其他构筑体可以用于ROS1融合阳性癌症(例如ROS1重排型NSCLC)的定向特异性治疗，包括：可操作地连接于天然或异源调控序列的经分离或纯化的核SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合核酸分子。一种经分离或纯化的载体，其包含编码SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合或包含其片段的断裂点的核酸分子。一种宿主细胞，其包含载体。一种核酸分子，其特异性减少或抑制编码SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合的核酸分子的表达，其可选自反义分子、核糖酶、siRNA或三螺旋分子。一种经分离或纯化的SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合多肽或含有其片段的断裂点。经分离或纯化的SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合多肽具有ROS1激酶活性和/或二聚或多聚活性。一种经分离或纯化的抗体分子，其特异性结合SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合多肽。如所描述的抗体分子，其中所述抗体分子是针对SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合多肽的单特异性抗体分子。
[0273] 用于检测本发明中的SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合聚核苷酸的翻译产物的方法的实例是免疫染色、免疫印迹、ELISA、流式细胞术、免疫沉淀和抗体阵列分析。在这些方法中，使用可以结合SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合多肽的抗体。所述抗体的实例是对含有SLC34A2或CD74或FIG蛋白与ROS1蛋白的融合位点的多肽具有特异性的抗体(在下文中也称为“融合位点特异性抗体”)、结合由ROS1蛋白的上述融合位点的C末端侧上的区域组成的多肽的抗体(在下文中也称为“ROS1-C末端抗体”)和结合由SLC34A2或CD74或FIG蛋白的上述融合位点的N末端侧上的区域组成的多肽的抗体(在下文中也称为“SLC34A2或CD74或FIG-N末端抗体”)。在此，“融合位点特异性抗体”意指特异性结合含有上述融合位点的多肽但不结合野生型(正常型)SLC34A2或CD74或FIG蛋白或野生型(正常型)ROS1蛋白的抗体。
[0274] 可以通过上述融合位点特异性抗体或上述ROS1-C末端抗体与SLC34A2或CD74或FIG-N末端抗体的组合来检测SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合多肽。然而，因为在正常肺细胞中几乎未检测到例如ROS1蛋白的表达，故即使ROS1-C末端抗体单独用于免疫染色，也可以在肺腺癌组织中检测到SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合多肽的存在。
[0275] 在各种实施方案中，用于鉴别本发明的ROS1融合多肽的免疫组织化学染色(IHC)和免疫印迹应用可以使用可购自Cell Signaling Technology(Danvers，MA，USA)的ROS1抗体磷酸化ROS1来进行。在一个实施方案中，ROS1融合阳性癌细胞(例如NSCLC ROS1重排型肺癌细胞)的鉴别可以利用兔抗ROS1单克隆抗体D4D6(目录号3287；Cell Signaling Technology，Danvers，MA，USA)进行。
[0276] 在一些实施方案中，“结合SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合多肽的抗体”可以由本领域技术人员选择适当的已知方法来制备。所述已知方法的一个实例是用由ROS1蛋白、SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合多肽的C末端部分组成的上述多肽、由SLC34A2或CD74或FIG蛋白的N末端部分组成的上述多肽等对免疫动物进行接种，从而激活所述动物的免疫系统，然后回收所述动物的血清(多克隆抗体)的方法；以及用于产生单克隆抗体的方法，诸如杂交瘤法、重组DNA法和噬菌体呈现法。如果使用与经标记的物质结合的抗体，则可以通过检测所述标记来直接检测靶蛋白质。经标记的物质不受具体限制，条件是其可以结合所述抗体而且可以检测。实例包括过氧化物酶、β-D-半乳糖苷酶、微过氧化物酶、辣根过氧化物酶(HRP)、异硫氰酸荧光素(FITC)、异硫氰酸若丹明(RITC)、碱性磷酸酶、生物素和放射性物质。此外，除使用与经标记的物质结合的抗体直接检测靶蛋白质的方法以外，还可以使用利用与经标记的物质结合的蛋白G、蛋白A或二次抗体间接检测靶蛋白质的方法。
[0277] 如果通过上述方法在从受试者分离的样本中检测到SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合聚核苷酸或多肽的存在，则判断ROS1酪氨酸激酶抑制剂(诸如式I化合物、式Ia化合物或化合物1或其药学上可接受的盐)的癌症治疗效力在所述患者中应该较高，而如果未检测到SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合聚核苷酸的存在，则判断ROS1酪氨酸激酶抑制剂的癌症治疗效力在所述患者中应该较低。
[0278] 如上文所描述，以下(a)至(c)中所述的具有至少15个碱基的链长度的任何聚核苷酸都宜用于检测SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合聚核苷酸的存在或不存在：
[0279] (a)呈选自由可以与编码SLC34A2或CD74或FIG蛋白的聚核苷酸杂交的探针和可以与编码ROS1蛋白的聚核苷酸杂交的探针组成的群组的至少一个探针形式的聚核苷酸；
[0280] (b)呈可以与编码SLC34A2或CD74或FIG蛋白的聚核苷酸与编码ROS1蛋白的聚核苷酸的融合位点杂交的探针形式的聚核苷酸；
[0281] (c)呈经过设计以便将编码SLC34A2或CD74或FIG蛋白的聚核苷酸与编码ROS1蛋白的聚核苷酸的融合位点夹在中间的一对引物形式的聚核苷酸。
[0282] 这些聚核苷酸具有与靶基因的特定碱基序列互补的碱基序列。在此，“互补”可能意指不完全互补，条件是其可以例如在中等严格度至高严格度条件下杂交。举例来说，这些多肽与指定碱基序列具有80％或更高、优选地90％或更高、更优选地95％或更高且最优选地100％同源性。
[0283] 在聚核苷酸(a)至(c)中，在部分或所有DNA或RNA中，核苷酸可以经诸如PNA(聚酰胺核酸、肽核酸)、LNA(商标，锁核酸、桥接核酸)、ENA(商标，2'-O,4'-C-亚乙基桥接核酸)、GNA(甘油核酸)和TNA(异赤藻糖核酸)之类的人造核酸取代。
[0284] 此外，如上文所描述，结合SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合多肽的抗体宜用于检测SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合聚核苷酸的翻译产物。因此，本发明提供了一种用于测定ROS1酪氨酸激酶抑制剂的癌症治疗有效性的有效的药物，其包含此抗体。
[0285] 本发明的融合基因的检测方法包括在获自测试受试者的样品中检测本说明书的聚核苷酸的存在的步骤。作为获自测试受试者的样品，使用从测试受试者收集的物质(从活体分离的样品)，具体来说，所收集的任何类型体液(优选地为血液)、肺泡和支气管洗涤物、已经历了活组织检查的样品和痰液样品。优选地，使用得自于测试受试者的肺部受影响区域的活组织检查样品或痰液样品。可以从所述样品提取基因组DNA并加以使用。另外，可以使用其转录物(由于基因组的转录和翻译而产生的产物；例如mRNA、cDNA和蛋白质)。具体来说，优选地制备并使用mRNA或cDNA。
[0286] 可以通过已知方法提取基因组DNA，而且可以使用市售DNA提取试剂盒容易地进行提取。
[0287] 检测步骤可以根据已知的基因分析方法进行(例如，通常用作基因检测方法的已知方法，诸如PCR、LCR(连接酶链反应)、SDA(链置换扩增)、NASBA(基于核酸序列的扩增)、ICAN(等温和嵌合引物引发的核酸扩增)、LAMP(环介导的等温扩增)方法、TMA(Gen-Probe的TMA系统)方法、原位杂交法和微阵列)。举例来说，使用将与欲检测的聚核苷酸杂交的核酸用作探针的杂交技术，将与欲检测的聚核苷酸杂交的DNA用作引物的基因扩增技术等等。
[0288] 具体来说，使用来源于获自测试受试者的样品的核酸(例如mRNA等等)进行检测。通过使用经设计以便能够特异性扩增欲检测的聚核苷酸的序列的引物，通过基因扩增反应法来测量mRNA的量。本发明的检测方法中所使用的引物或检测试剂盒中所包括的引物不受具体限制，只要所述引物可以特异性扩增欲检测的聚核苷酸的序列即可，而且是基于欲检测的聚核苷酸的碱基序列进行设计。可以使用引物设计软件(例如由PE Biosystems制作的Primer Express)等等来设计PCR扩增监测法中所使用的引物。另外，因为PCR产物的尺寸越大，扩增效率越恶化，故设计有义引物和反义引物以使得当扩增mRNA或cDNA时所获得的扩增产物的尺寸变成1kb或更小是适当的。
[0289] 更具体来说，由编码SLC34A2的部分设计有义引物(5'引物)，且由编码ROS1的部分设计反义引物(3'引物)。优选地使用本发明的检测试剂盒中所包括的引物，且更优选地使用最适合于包括在所述检测试剂盒中的引物。在PCR扩增监测法中，还有可能设计多路PCR用于通过混合对应于个别基因的以上有义引物来检测单一反应液体中的所有融合聚核苷酸。通过适合于各扩增技术的方法，有可能证实靶基因(整个基因或其特定部分)是否已经被扩增。举例来说，在PCR方法中，通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物且进行溴化乙菲锭染色等等，借此有可能证实是否已经获得了具有目标尺寸的扩增片段。当已经获得了具有目标尺寸的扩增片段时，这表明获自测试受试者的样品中存在欲检测的聚核苷酸。
[0290] 本发明的融合基因的检测方法优选地包括通过基因扩增反应在获自测试受试者的样品中检测具体聚核苷酸的存在的步骤和检测是否已经获得了具有目标尺寸的扩增片段的步骤。
[0291] 使用例如北方杂交、点印迹法、DNA微阵列法和RNA保护法来进行使用杂交技术的检测。作为用于杂交的探针，有可能使用包含由分别在作为由至少32个连续碱基组成的核酸分子的中心的融合点上游和下游的16个碱基组成且在中等严格度至高严格度条件下(优选地在高严格度条件下)与欲检测的聚核苷酸或与其互补链杂交的序列或包含其互补链的探针。
[0292] 还有可能使用诸如RT-PCR的基因扩增技术。在RT-PCR方法中，PCR扩增监测(实时PCR)方法是在基因扩增过程中进行，借此可以更定量地分析欲检测的聚核苷酸的存在。可以使用PCR扩增监测法。实时PCR是一种已知的方法，并且可以使用针对此方法的市售仪器和试剂盒简单地进行。
[0293] 本发明的一些实施方案的融合蛋白质的检测方法包括在获自于测试受试者的样品中检测具体多肽(即，由欲检测的聚核苷酸编码的多肽，在下文中称为多肽欲检测的多肽)的存在的步骤。所述检测步骤可以通过免疫测定法或酶活性测定法来进行，所述方法是通过以下方式来进行：制备来源于获自测试受试者的样品(例如获自测试受试者的癌症组织或细胞)的溶解液体，并且将所述液体中所含有的欲检测多肽与抗SLC34A2或抗CD74或抗FIG抗体和抗ROS1抗体组合。优选地，有可能使用利用对欲检测的多肽具有特异性的单克隆抗体或多克隆抗体的技术，诸如酶免疫测定法、双抗体夹心ELISA方法、荧光免疫测定法、放射免疫测定法和免疫印迹法。
[0294] 当从获自测试受试者的样品中检测到本发明的检测方法中欲检测的聚核苷酸或欲检测的多肽时，所述测试受试者是患有聚核苷酸阳性癌症的受试者(患者)并且将使用ROS1抑制剂提供治疗。
[0295] 本发明的检测试剂盒至少包含经过设计以便能够特异性扩增本发明的检测方法中欲检测的聚核苷酸的有义引物和反义引物。有义引物和反义引物组是充当用于扩增欲检测的聚核苷酸的引物的一组聚核苷酸。
[0296] 在一个实施方案中，本发明的用于检测融合基因的引物组包括(1)包含由编码SLC34A2或CD74或FIG的部分设计的有义引物和由编码ROS1的部分设计的反义引物且用于检测SLC34A2或CD74或FIG与ROS1基因的融合基因的引物组，其中所述反义引物由在中等严格度至高严格度条件下(优选地在高严格度条件下)与“欲检测的聚核苷酸”杂交的核酸分子(优选地为由至少16个碱基组成的核酸分子)组成，且所述有义引物由在严格条件下(优选地在高严格度条件下)与“欲检测的聚核苷酸”的互补链杂交的核酸分子(优选地为由至少16个碱基组成的核酸分子)组成。
[0297] 以下引物组(2)和(3)作为引物组(1)的更具体变体包括在引物组中。
[0298] (2)由至少任何16个连续碱基组成的寡核苷酸组成的有义引物的引物组。
[0299] (3)由至少任何16个连续碱基组成的寡核苷酸组成的有义引物的引物组。
[0300] 在这些引物组(1)至(3)中，选择有义引物与反义引物的位置之间的间隔优选地为1kb或更小，或由有义引物和反义引物扩增的扩增产物的尺寸优选地为1kb或更小。
[0301] 另外，引物的链长度一般由15至40个碱基组成，优选地由16至24个碱基组成，更优选地由18至24个碱基组成，且特别优选地由20至24个碱基组成。
[0302] 引物组可以用于对欲检测的聚核苷酸进行扩增和检测。此外，尽管不受具体限制，但本发明的引物组中所包括的个别引物可以通过例如化学合成来制备。
[0303] 可以用于检测ROS1融合聚核苷酸的示例性ROS1、SLC34A2或CD74引物提供于表2中。
[0304] 表2.用于鉴别根据本发明的各种ROS1融合蛋白质的示例性引物组。
[0305]
[0306] 筛选抗癌药物的方法包括：使样品化合物与表达所述融合蛋白质的细胞接触；和测量所述细胞中的融合蛋白质表达量，其中经过样品化合物处理的细胞中的融合蛋白质表达量与用样品化合物处理之前的融合蛋白质表达量或未经处理的细胞中的融合蛋白质表达量相比有所降低，将所述样品化合物确定为抗癌药物的候选化合物。
[0307] 筛选抗癌药物的方法可以进一步包括在样品化合物处理之前测量细胞中的融合蛋白质表达量的步骤。在这种情况下，当样品化合物处理之后的融合蛋白质表达量与同一细胞中在样品化合物处理之前的融合蛋白质表达量相比有所降低时，可以将样品化合物确定为抗癌药物的候选化合物。替代地，筛选抗癌药物的方法可以包括提供表达所述融合蛋白质的细胞和使样品化合物与所提供的细胞的一部分接触。在这种情况下，当与样品化合物接触的细胞中的融合蛋白质表达量与未跟样品化合物接触的细胞中的融合蛋白质表达量相比有所降低时，可以将样品化合物确定为抗癌药物的候选化合物。
[0308] 筛选方法中所使用的细胞可以是来源于表达和/或激活融合基因或融合蛋白质的癌细胞、细胞提取物或细胞培养物的细胞。癌细胞可以是实性癌细胞，具体来说，肺癌，例如非小细胞肺癌，诸如上文所述的肺腺癌。
[0309] 另一个实施方案提供了一种筛选针对肺癌的抗癌药物的方法，包括：用样品化合物处理表达所述融合蛋白质的细胞；测量所述细胞中的融合蛋白质表达量，其中经样品化合物处理的细胞中的融合蛋白质表达量与用样品化合物处理之前的融合蛋白质表达量或未经处理的细胞中的融合蛋白质表达量相比有所降低，将所述样品化合物确定为针对肺癌的抗癌药物的候选化合物。
[0310] ROS1融合蛋白质(即，SLC34A2-ROS1、CD74-ROS1和FIG-ROS1)可以用作标记物以用于诊断肺癌或用于治疗或预防或治疗肺癌。治疗或预防肺癌包括向需要其的患者施用治疗有效量的至少一种针对融合蛋白质的抑制剂、至少一种针对编码所述融合蛋白质的融合基因的抑制剂、至少一种针对ROS1编码基因的抑制剂或其组合的步骤。所述抑制剂可以是诸如式I化合物、式Ia化合物或化合物1或其药学上可接受的盐。
[0311] 另一个实施方案提供了一种预防和/或治疗癌症的方法，包括向需要其的患者施用药学上(治疗)有效量的至少一种针对所述融合蛋白质的抑制剂、至少一种针对编码所述融合蛋白质的融合基因的抑制剂、至少一种针对ROS1编码基因的抑制剂或其组合，其中任一者都可以是本文中所公开的式1化合物和其他特定化合物。所述方法可进一步包括在施用所述治疗的步骤之前鉴别出需要预防和/或治疗癌症的患者的步骤。另一个实施方案提供了用于预防和/或治疗癌症的组合物，包括施用至少一种针对所述融合蛋白质的抑制剂(包括式1)单独或与至少一种针对编码所述融合蛋白质的融合基因的抑制剂、至少一种针对ROS1编码基因的抑制剂和/或其组合一起。另一个实施方案提供了针对所述融合蛋白质的抑制剂、针对编码所述融合蛋白质的融合基因的抑制剂、针对ROS1编码基因的抑制剂和/或其组合的用途，其用于预防和/或治疗癌症。所述抑制剂可以是诸如式I化合物、式Ia化合物或化合物1或其药学上可接受的盐。
[0312] 在本发明中，所述癌症可以是肺癌，具体来说，小细胞肺癌(SCLC)或非小细胞肺癌(NSCLC)，诸如肺腺癌、鳞状细胞肺癌或大细胞肺癌。
[0313] 如所描述的组合物，其中针对ROS1融合蛋白质的抑制剂是选自由特异性结合所述融合蛋白质的衔接子、特异性结合所述融合蛋白质的抗体组成的群组的至少一者，且针对所述融合基因或ROS1编码基因的抑制剂是选自由siRNA、shRNA、miRNA和能够特异性结合所述融合基因或ROS1编码基因的衔接子组成的群组的至少一者。
[0314] 抑制ROS1表达和/或ROS1激酶活性(例如转录、翻译或稳定性)的任何ROS1激酶抑制剂都可以单独或与式I化合物、式Ia化合物或式1化合物或其药学上可接受的盐组合使用。
[0315] 抑制剂可以是ROS1特异性抑制剂，或其可以是非特异性抑制剂(例如非特异性激酶抑制剂、多靶抑制剂)。已经开发出若干种ROS1激酶抑制剂，且正在研究其临床应用。在ROS1激酶活性下游，存在诸如磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)和细胞外信号激酶1/2(ERK)(Wixted JH等,J Biol Chem 2011)和STAT3(Hwang JH等,Mol Endocrinol 2003；17:1155-1166)之类的激酶。抑制所述下游信号传递途径的药物也可以单独或与式1化合物组合用作ROS1激酶抑制剂的替代物或作为佐剂。
[0316] 在一种模式中，被判断为具有SLC34A2-ROS1或CD74-FIG易位或FIG-ROS1缺失的受试者亦被判断为在除所述易位位点以外的位点上具有ROS1突变。ROS1突变的实例是激活突变，其使得能够具有组成性激酶活性。ROS1激活突变是与野生型突变相比引起激活增加的任意突变。举例来说，ROS1激活突变可以引起永久性ROS1激活。甚至可能存在与使用ROS1抑制剂相关或由于使用ROS1抑制剂所致的二次ROS1激活突变变体。引起ROS1信号活性增加的突变是由于例如激酶域点突变、缺失、插入、复制或逆位或其中两项或更多项的组合而存在，由此引起ROS1信号增加。对于被判断为具有如本文中所提供的ROS1融合易位或缺失和ROS1突变的受试者，还可以作出用ROS1激酶抑制剂对其进行治疗的决定。另外，可以基于所述决定对其进行治疗/疗法。
[0317] 如上文所描述，在通过本发明的方法检测到SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合聚核苷酸的患者中，认为ROS1酪氨酸激酶抑制剂的癌症治疗有效性较高。为此，可以通过选择性地向具有SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合基因和ROS1基因的癌症患者施用ROS1酪氨酸激酶抑制剂而有效地进行癌症治疗。因此，本发明提供了一种用于治疗癌症的方法，包括将呈式I化合物、式Ia化合物或化合物1或其药学上可接受的盐形式的ROS1酪氨酸激酶抑制剂施用至被本文中所描述的上述诊断方法确定所述ROS1酪氨酸激酶抑制剂在其中的癌症治疗有效性较高的患者的步骤。
[0318] 在本发明中，“样本”不仅是生物样本(例如细胞、组织、器官、体液(血液、淋巴液等)、胃液、痰液、肺泡/支气管灌洗液、尿液、大便)，而且包括获自这些生物样本的核酸提取物(基因组DNA提取物、mRNA提取物或由mRNA提取物制备的cDNA制剂或cRNA制剂)或蛋白质提取物。这种样本还可以是已经过福尔马林固定处理、醇固定处理、冷冻处理或石蜡包埋处理的样本。
[0319] 此外，可以由本领域技术人员在考虑样本的类型、状态等而选择合适的已知技术之后制备基因组DNA、mRNA、cDNA或蛋白质。
[0320] 除作为活性成分的上述物质(聚核苷酸、抗体)以外，本发明的药物还可以含有其他药学上可接受的成分。所述成分的实例包括缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、稳定剂、防腐剂、生理盐水等。作为缓冲剂，可以使用磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐等。作为乳化剂，可以使用阿拉伯胶、海藻酸钠、黄芪胶等。作为悬浮剂，可以使用单硬脂酸甘油酯、单硬脂酸铝、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、月桂基硫酸钠等。作为稳定剂，可以使用丙二醇、亚硫酸二乙酯、抗坏血酸等。作为防腐剂，可以使用叠氮化钠、氯化芐二甲烃铵、对羟基苯甲酸、氯丁醇等。
[0321] 此外，除含有聚核苷酸和抗体的制剂以外，诸如检测附接于所述聚核苷酸和抗体的标记所必须的基质、正对照(例如SLC34A2-ROS1、CD74-ROS1或FIG-ROS1融合聚核苷酸、SLC34A2-ROS1、CD74-ROS1或FIG-ROS1融合多肽或具有其的细胞等)和负对照之类的制剂、原位杂交等所使用的对比染色试剂(DAPI等)、检测抗体所需的分子(例如二次抗体、蛋白G、蛋白A)和用于稀释或洗涤抗体的缓冲溶液可以组合为试剂盒以用于本发明的方法中。此试剂盒可以包括所述试剂盒的使用说明书。本发明还提供了上述试剂盒以便用于本发明的方法中。
[0322] 当检测基本上由融合搭配物的N末端结构域和编码激酶域的ROS1蛋白质的C末端结构域组成的融合蛋白质时，本文中所描述的检测方法特别有用。融合蛋白质可以是基本上由SLC34A2蛋白的N末端结构域或其片段和编码激酶结构域的ROS1蛋白的C末端结构域组成的SLC34A2-ROS1融合蛋白质。融合蛋白质可以是基本上由CD74蛋白的N末端结构域或其片段和编码激酶结构域的ROS1蛋白的C末端结构域组成的CD74-ROS1融合蛋白质。融合蛋白质可以是基本上由FIG蛋白的N末端结构域或其片段和编码激酶结构域的ROS1蛋白的C末端结构域组成的FIG-ROS1融合蛋白质。所述方法可以用于诊断肺癌，特别是非小细胞肺癌，且包括：检测涉及ROS1的染色体重排(包括染色体6中的逆位、易位或缺失)、蛋白质与另一种蛋白质融合的融合蛋白质、编码所述融合蛋白质的融合基因和与得自未患癌症的个体的标准样品相比ROS1被过度表达中的至少一项。当在测试样品中检测到选自以上群组的上述染色体重排之一时，个体可以用诸如式I化合物、式Ia化合物或化合物1或其药学上可接受的盐的ROS1抑制剂加以治疗。
[0323] 化合物1的制备
[0324] N-(4-{[6,7-双(甲氧基)喹啉-4-基]氧}苯基)-N'-(4-氟苯基)环丙烷-1,1-二甲酰胺和其(L)-苹果酸盐的制备。
[0325] 用于制备N-(4-[6,7-双(甲氧基)喹啉-4-基]氧}苯基)-N'-(4-氟苯基)环丙烷-1,1-二甲酰胺和其(L)-苹果酸盐的合成途径描绘于流程1中：
[0326] 流程1
[0327]
[0328] 4-氯-6，7-二甲氧基-喹啉的制备
[0329] 在反应器中依次馈入6,7-二甲氧基-喹啉-4-酚(10.0kg)和乙腈(64.0L)。将所得混合物加热至约65℃且加入氧氯化磷(POCl3，50.0kg)。在加入POCl3之后，将反应混合物的温度升至约80℃。当剩余少于2％起始物质(过程中高效液相色谱[HPLC]分析)时认为反应完毕(约9.0小时)。使反应混合物冷却至约10℃，然后在二氯甲烷(DCM，238.0kg)、30％NH4OH(135.0kg)和冰(440.0kg)的冷却溶液中淬灭。使所得混合物升温至约14℃并且进行相分离。用水(40.0kg)洗涤有机相且通过真空蒸馏加以浓缩以去除溶剂(约190.0kg)。将甲基叔丁基醚(MTBE，50.0kg)加入至批料中，并且使混合物冷却至约10℃，在此期间产物结晶析出。通过离心回收固体，用正庚烷(20.0kg)洗涤并且在约40℃下干燥，得到标题化合物(8.0kg)。
[0330] 6,7-二甲基-4-(4-硝基-苯氧基)-喹啉的制备
[0331] 在反应器中依次馈入4-氯-6,7-二甲氧基-喹啉(8.0kg)、4-硝基苯酚(7.0kg)、4-二甲基氨基吡啶(0.9kg)和2,6-二甲基吡啶(40.0kg)。将反应器内容物加热至约147℃。当反应完毕时(如通过过程中HPLC分析所测定，剩余少于5％起始物质，约20小时)，允许反应器内容物冷却至约25℃。加入甲醇(26.0kg)，随后加入溶解于水(50.0kg)中的碳酸钾(3.0kg)。将反应器内容物搅拌约2小时。对所产生的固体沉淀物进行过滤，用水(67.0kg)洗涤，且在25℃下干燥约12小时，得到标题化合物(4.0kg)。
[0332] 4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯胺的制备
[0333] 将含有甲酸钾(5.0kg)、甲酸(3.0kg)和水(16.0kg)的溶液加入至6,7-二甲氧基-4-(4-硝基-苯氧基)-喹啉(4.0kg)、10％钯/碳(50％水润湿，0.4kg)于四氢呋喃(THF，
40.0kg)中的已加热至约60℃的混合物中。进行所述加入以使反应混合物的温度保持约60℃。当认为反应完毕时(如使用过程中HPLC分析所测定，剩余少于2％起始物质，典型地15小时)，对反应器内容物进行过滤。在约35℃下通过真空蒸馏将滤液浓缩至其原始体积的一半，由此使产物沉淀。通过过滤回收产物，用水(12.0kg)洗涤且在约50℃下在真空下干燥，得到标题化合物(3.0kg；97％曲线下面积(AUC))。
40.0kg)中的已加热至约60℃的混合物中。进行所述加入以使反应混合物的温度保持约60℃。当认为反应完毕时(如使用过程中HPLC分析所测定，剩余少于2％起始物质，典型地15小时)，对反应器内容物进行过滤。在约35℃下通过真空蒸馏将滤液浓缩至其原始体积的一半，由此使产物沉淀。通过过滤回收产物，用水(12.0kg)洗涤且在约50℃下在真空下干燥，得到标题化合物(3.0kg；97％曲线下面积(AUC))。
[0334] 1-(4-氟-苯基氨甲酰基)-环丙烷甲酸的制备
[0335] 将三乙胺(8.0kg)以使得批料温度不超过10℃的速率加入至市售环丙烷-1,1-二甲酸(2l，10.0kg)于THF(63.0kg)中的冷却(约4℃)溶液中。将溶液搅拌约30分钟，然后加入亚硫酰氯(9.0kg)，保持批料温度低于10℃。当加入完毕时，以使得批料温度不超过10℃的速率加入4-氟苯胺(9.0kg)于THF(25.0kg)中的溶液。将混合物搅拌约4小时，然后用乙酸异丙酯(87.0kg)稀释。依次用氢氧化钠水溶液(2.0kg溶解于50.0L水中)、水(40.0L)和氯化钠水溶液(10.0kg溶解于40.0L水中)洗涤该溶液。通过真空蒸馏浓缩有机溶液，随后加入庚烷，由此使固体沉淀。通过离心回收固体，然后在约35℃下在真空下干燥，得到标题化合物(10.0kg)。
[0336] 1-(4-氟-苯基氨甲酰基)-环丙烷羰基氯的制备
[0337] 将草酰氯(1.0kg)以使得批料温度不超过30℃的速率加入至1-(4-氟-苯基氨甲酰基)-环丙烷甲酸(2.0kg)于THF(11kg)与N,N-二甲基甲酰胺(DMF；0.02kg)的混合物中的溶液中。该溶液不经过进一步处理便用于下一个步骤中。
[0338] N-(4-{[6,7-双(甲氧基)喹啉-4-基]氧}苯基)-N'-(4-氟苯基)环丙烷-1,1-二甲酰胺的制备
[0339] 将得自于先前步骤的含有1-(4-氟-苯基氨甲酰基)-环丙烷羰基氯的溶液以使得批料温度不超过30℃的速率加入至4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧)-苯胺(3.0kg)和碳酸钾(4.0kg)于THF(27.0kg)和水(13.0kg)中的混合物中。当反应完毕时(典型地在10分钟内)，加入水(74.0kg)。在15℃至30℃下将混合物搅拌约10小时，由此使产物沉淀。通过过滤移出产物，用THF(11.0kg)和水(24.0kg)的预制溶液洗涤，且在约65℃下在真空下干燥约12小时，得到标题化合物(游离碱，5.0kg)。1H NMR(400MHz,d6-DMSO):δ10.2(s,1H),10.05(s,1H),8.4(s,1H),7.8(m,2H),7.65(m,2H),7.5(s,1H),7.35(s,1H),7.25(m,2H),7.15(m,
2H),6.4(s,1H),4.0(d,6H),1.5(s,4H)。LC/MS:M+H＝502。
2H),6.4(s,1H),4.0(d,6H),1.5(s,4H)。LC/MS:M+H＝502。
[0340] N-(4-{[6,7-双(甲氧基)喹啉-4-基]氧}苯基)-N'-(4-氟苯基)环丙烷-1,1-二甲酰胺(L)苹果酸盐的制备
[0341] 将L-苹果酸(2.0kg)于水(2.0kg)中的溶液加入至环丙烷-1,1-二甲酸[4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯基]-酰胺(4-氟-苯基)-酰胺游离碱(1 5，5.0kg)于乙醇中的溶液中，维持批料温度为约25℃。然后加入碳(0.5kg)和硫醇二氧化硅(0.1kg)，并且将所得混合物加热至约78℃，此时加入水(6.0kg)。然后过滤反应混合物，随后加入异丙醇(38.0kg)并且允许冷却至约25℃。通过过滤回收产物且用异丙醇(20.0kg)洗涤，并且在约65℃下干燥，得到标题化合物(5.0kg)。
[0342] N-(4-{[6,7-双(甲氧基)喹啉-4-基]氧}苯基)-N’-(4-氟苯基)环丙烷-1,1-二甲酰胺和其(L)-苹果酸盐的替代制备
[0343] 流程2中描绘了可以用于制备N-(4-{[6,7-双(甲氧基)喹啉-4-基]氧}苯基)-N'-(4-氟苯基)环丙烷-1,1-二甲酰胺和其(L)-苹果酸盐的替代合成途径，如PCT/US2012/024591中所描述，所述文献的全部内容以引用的方式并入。
[0344] 流程2
[0345]
[0346] 4-氯-6，7-二甲氧基-喹啉的制备
[0347] 在反应器中依次馈入6,7-二甲氧基-喹啉-4-酚(47.0kg)和乙腈(318.8kg)。将所得混合物加热至约60℃且加入氧氯化磷(POCl3，130.6kg)。在加入POCl3之后，使反应混合物的温度升至约77℃。当剩余少于3％起始物质(过程中高效液相色谱[HPLC]分析)时认为反应完毕(约13小时)。使反应混合物冷却至约2℃至7℃，然后在二氯甲烷(DCM，482.8kg)、26％NH4OH(251.3kg)和水(900L)的冷却溶液中淬灭。使所得混合物升温至约20℃至25℃并且进行相分离。使有机相通过AW hyflo super-cel NF(硅藻土；5.4kg)的床层进行过滤，且用DCM(118.9kg)洗涤滤床。用盐水(282.9kg)洗涤所合并的有机相并且与水(120L)混合。进行相分离，且通过真空蒸馏与去除溶剂来浓缩有机相(约95L残余体积)。将DCM(686.5kg)馈入含有有机相的反应器且通过真空蒸馏与去除溶剂来进行浓缩(约90L残余体积)。然后馈入甲基叔丁基醚(MTBE，226.0kg)，并且将混合物的温度调节至-20℃至-25℃且保持2.5小时，产生固体沉淀物，然后过滤且用正庚烷(92.0kg)洗涤，并且在约25℃下在氮气下在过滤器上进行干燥，得到标题化合物(35.6kg)。
[0348] 4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯胺的制备
[0349] 在20℃至25℃下将溶解于N,N-二甲基乙酰胺(DMA，184.3kg)中的4-氨基苯酚(24.4kg)馈入含有4-氯-6,7-二甲氧基喹啉(35.3kg)、叔丁醇钠(21.4kg)和DMA(167.2kg)的反应器中。然后将此混合物加热至100℃至105℃后维持约13小时。在认为反应完毕(如使用过程中HPLC分析所测定，剩余少于2％起始物质)之后，在15℃至20℃下冷却反应器内容物且以维持15℃至30℃温度的速率馈入水(经预冷却，2℃至7℃，587L)。过滤所产生的固体沉淀物，用水(47L)与DMA(89.1kg)的混合物洗涤，且最后用水(214L)洗涤。然后在约25℃下在过滤器上干燥滤饼，产生粗4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯胺(59.4kg湿重，41.6kg干重，基于LOD进行计算)。使粗4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯胺在四氢呋喃(THF，211.4kg)与DMA(108.8kg)的混合物中回流(约75℃)约1小时，然后冷却至0℃至5℃，并且老化约1小时，此后过滤固体，用THF(147.6kg)洗涤且在约25℃下在真空下在过滤器上干燥，产生4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯胺(34.0kg)。
[0350] 4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯胺的替代制备
[0351] 将4-氯-6,7-二甲氧基喹啉(34.8kg)和4-氨基苯酚(30.8kg)和叔戊醇钠(1.8当量，88.7kg，35重量％THF溶液)馈入反应器中，随后馈入N,N-二甲基乙酰胺(DMA，293.3kg)。然后将该混合物加热至105℃至115℃后维持约9小时。在认为反应完毕(如使用过程中HPLC分析所测定，剩余少于2％起始物质)之后，在15℃至25℃下冷却反应器内容物且在2小时内加入水(315kg)，同时将温度维持在20℃至30℃之间。然后在20℃至25℃下将反应混合物再搅拌1小时。通过过滤收集粗产物，且依次用88kg水与82.1kg DMA的混合物和175kg水进行洗涤。在过滤干燥器上将产物干燥53小时。LOD显示小于1％w/w。
[0352] 在一个替代程序中，使用1.6当量叔戊醇钠并且使反应温度从110℃增至120℃。另外，使冷却温度增至35℃至40℃，并且将水加入的起始温度调节至35℃至40℃，允许放热温升至45℃。
[0353] 1-(4-氟-苯基氨甲酰基)-环丙烷甲酸的制备
[0354] 将三乙胺(19.5kg)以使得批料温度不超过5℃的速率加入至环丙烷-1,1-二甲酸(24.7kg)于THF(89.6kg)中的冷却(约5℃)溶液中。将溶液搅拌约1.3小时，然后加入亚硫酰氯(23.1kg)，保持批料温度低于10℃。当加入完毕时，将溶液搅拌约4小时，从而保持温度低于10℃。然后以使得批料温度不超过10℃的速率加入4-氟苯胺(18.0kg)于THF(33.1kg)中的溶液。将混合物搅拌约10小时，此后认为反应完毕。然后用乙酸异丙酯(218.1kg)稀释反应混合物。依次用氢氧化钠水溶液(10.4kg，50％，溶解于119L水中)洗涤该溶液，用水(415L)进一步稀释，然后用水(100L)洗涤且最终用氯化钠水溶液(20.0kg，溶解于100L水中)洗涤。在低于40℃下通过真空蒸馏来浓缩有机溶液(100L残余体积)，随后加入正庚烷(171.4kg)，由此使固体沉淀。通过过滤回收固体且用正庚烷(102.4kg)洗涤，产生湿润粗1-(4-氟-苯基氨甲酰基)-环丙烷甲酸(29.0kg)。在约25℃下将粗1-(4-氟-苯基氨甲酰基)-环丙烷甲酸溶解于甲醇(139.7kg)中，随后加入水(320L)，产生浆液，通过过滤进行回收，依次用水(20L)和正庚烷(103.1kg)洗涤，然后在约25℃下在氮气下在过滤器上干燥，得到标题化合物(25.4kg)。
[0355] 1-(4-氟-苯基氨甲酰基)-环丙烷羰基氯的制备
[0356] 将草酰氯(12.6kg)以使得批料温度不超过25℃的速率加入至1-(4-氟-苯基氨甲酰基)-环丙烷甲酸(22.8kg)于THF(96.1kg)与N,N-二甲基甲酰胺(DMF；0.23kg)的混合物中的溶液中。该溶液不经过进一步处理便用于下一个步骤中。
[0357] 1-(4-氟-苯基氨甲酰基)-环丙烷羰基氯的替代制备
[0358] 将反应器中馈入1-(4-氟-苯基氨甲酰基)-环丙烷甲酸(35kg)、344g DMF和175kg THF。将反应混合物调节至12℃至17℃，然后经过1小时的时间段向反应混合物中馈入19.9kg草酰氯。在12℃至17℃下将反应混合物搅拌3至8小时。该溶液不经过进一步处理便用于下一个步骤中。
[0359] 环丙烷-1,1-二甲酸[4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯基]-酰胺(4-氟-苯基)-酰胺的制备
[0360] 将得于先前步骤的含有1-(4-氟-苯基氨甲酰基)-环丙烷羰基氯的溶液以使得批料温度不超过30℃的速率加入化合物4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯胺(23.5kg)和碳酸钾(31.9kg)于THF(245.7kg)和水(116L)中的混合物中。当反应完毕时(在约20分钟内)，加入水(653L)。在20℃至25℃下将混合物搅拌约10小时，由此使产物沉淀。通过过滤回收产物，用THF(68.6kg)和水(256L)的预制溶液洗涤，并且在过滤器上首先在约25℃下在氮气下然后在约45℃下在真空下进行干燥，得到标题化合物(41.0kg，38.1kg，基于LOD进行计算)。
[0361] 环丙烷-1,1-二甲酸[4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯基]-酰胺(4-氟-苯基)-酰胺的替代制备
[0362] 在反应器中依次馈入4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯胺(35.7kg，1当量)和412.9kg THF。向反应混合物中馈入48.3K2CO3于169kg水中的溶液。经过最少2小时将以上1-(4-氟-苯基氨甲酰基)-环丙烷羰基氯的替代制备中所描述的酸氯化物溶液转移至含有4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯胺的反应器中，同时将温度维持在20℃与30℃之间。在
20℃至25℃下将反应混合物搅拌最少3小时。然后将反应温度调节至30℃至25℃，并且搅拌混合物。停止搅拌并且允许对混合物进行相分离。移出下部水相并且丢弃。向剩余上部有机相中加入804kg水。在15℃至25℃下将反应物搅拌最少16小时。
20℃至25℃下将反应混合物搅拌最少3小时。然后将反应温度调节至30℃至25℃，并且搅拌混合物。停止搅拌并且允许对混合物进行相分离。移出下部水相并且丢弃。向剩余上部有机相中加入804kg水。在15℃至25℃下将反应物搅拌最少16小时。
[0363] 使产物沉淀。过滤产物且用179kg水与157.9kg THF的混合物分两份进行洗涤。在真空下将粗产物干燥至少2小时。然后将干燥了的产物溶解于285.1kg THF中。将所得悬浮液转移至反应容器中并且搅拌，直至悬浮液变成澄清(溶解)溶液，这需要加热至30℃至35℃后维持约30分钟。然后经过2小时向溶液中加入456kg水，以及20kg SDAG-1乙醇(含甲醇的变性乙醇)。在15℃至25℃下将混合物搅拌至少16小时。过滤产物且用143kg水与126.7kg THF的混合物分两份进行洗涤。在40℃的最高温度设定点下干燥产物。
[0364] 在一个替代程序中，将酸氯化物形成期间的反应温度调节至10℃至15℃。将再结晶温度从15℃至25℃变成45℃至50℃后维持1小时，然后经过2小时冷却至15℃至25℃。
[0365] 环丙烷-1,1-二甲酸[4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯基]-酰胺(4-氟-苯基)-酰胺苹果酸盐的制备
[0366] 将环丙烷-1,1-二甲酸[4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯基]-酰胺(4-氟-苯基)-酰胺(1-5；13.3kg)、L-苹果酸(4.96kg)、甲基乙基酮(MEK；188.6kg)和水(37.3kg)馈入反应器中并且将混合物加热至回流(约74℃)后维持约2小时。使反应器温度降至50℃至55℃，并且过滤反应器内容物。将这些上述顺序步骤再重复两次，以类似量的起始物质(13.3kg)、L-苹果酸(4.96kg)、MEK(198.6kg)和水(37.2kg)为起始物。在约74℃下，在大气压下使用MEK(1133.2kg)对所合并的滤液进行共沸干燥(近似残余体积711L；KF≤0.5％w/w)。将反应器内容物的温度降至20℃至25℃并且保持约4小时，产生固体沉淀物，进行过滤，用MEK(448kg)洗涤且在50℃下在真空下干燥，得到标题化合物(45.5kg)。
[0367] 环丙烷-1,1-二甲酸[4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯基]-酰胺(4-氟-苯基)-酰胺(L)苹果酸盐的替代制备
[0368] 将环丙烷-1,1-二甲酸[4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯基]-酰胺(4-氟-苯基)-酰胺(47.9kg)、L-苹果酸(17.2kg)、658.2kg甲基乙基酮和129.1kg水(37.3kg)馈入反应器中并且将混合物加热至50℃至55℃后维持约1至3小时，然后在55℃至60℃下再维持4至5小时。通过1μm滤筒进行过滤使混合物澄清。将反应器温度调节至20℃至25℃，并且在150-200mm Hg真空下在最高夹套温度为55℃的情况下真空蒸馏至558至731L的体积范围。
[0369] 分别在馈入380kg和380.2kg甲基乙基酮的情况下再进行两次真空蒸馏。在第三次真空蒸馏之后，通过馈入159.9kg甲基乙基酮将批料的体积调节至18v/w环丙烷-1,1-二甲酸[4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧)-苯基]-酰胺(4-氟-苯基)-酰胺，得到880L的总体积。通过调节245.7甲基乙基酮再进行真空蒸馏。在20℃至25℃下将反应混合物适度搅拌至少
24小时。过滤产物且用415.1kg甲基乙基酮分三份进行洗涤。在45℃的夹套温度设定点下在真空下干燥产物。
24小时。过滤产物且用415.1kg甲基乙基酮分三份进行洗涤。在45℃的夹套温度设定点下在真空下干燥产物。
[0370] 在一个替代程序中，改变加入顺序以便将17.7kg L-苹果酸溶解于129.9kg水中的溶液加入含环丙烷-1,1-二甲酸[4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧)-苯基]-酰胺(4-氟-苯基)-酰胺(48.7kg)的甲基乙基酮(673.3kg)中。
[0371] 生物学实施例
[0372] HCC-78和NCI-H2228细胞的生长
[0373] 分别从DSMZ和ATCC收到呈冷冻生物样品形式的HCC-78和NCI-H2228细胞，在T-75烧瓶(Nunc)中解冻并且生长直至80％至90％汇合(对于粘附的细胞)或直至细胞的密度为1-2×106个细胞/毫升(对于悬浮细胞)。
[0374] 将带有激活的EML4-ALK融合的人肺NSCLC腺癌细胞系NCI-H2228(ATCC，CRL 5935)分别以3.5×104个细胞/孔和2.5×104个细胞/孔的密度接种于黑色96孔板(Costar，3904)上含10％FBS、1％青霉素-链霉素的0.1ml RPMI 1640(ATCC 30-2001)中，历经48小时或72小时。
[0375] 将带有激活的SLC34A2-ROS1融合和磷光体-Met的人肺NSCLC腺癌细胞系HCC-78(DSMZ，ACC 563)分别以2.5×104个细胞/孔和2×104个细胞/孔的密度接种于黑色96孔板(Costar，3904)上含10％FBS(热灭活，Cellgro)、1％青霉素-链霉素的0.1ml RPMI 1640(ATCC 30-2001)中，历经48小时或72小时。
[0376] 使细胞在37℃下在湿润5％CO2氛围中生长16小时。将DMSO或化合物1的连续稀释于新鲜无血清培养基或含血清培养基中加入至细胞中且在37℃下在湿润5％CO2氛围中孵育48小时或72小时，随后加入5'-溴-2'-去氧尿苷(BrdU)标记溶液(Roche)后维持2至4小时。将悬浮细胞转移至滤板(Corning，3504)，随后进行测定。通过监测BrdU并入来测定细胞的增殖。得自Cell Proliferation ELISA，BrdU(化学发光)试剂盒(Roche Biosciences，11 669 915 001)的试剂是根据制造商的说明书加以使用。在BrdU标记之后，用FixDenat溶液固定细胞。加入抗BrdU过氧化物酶(POD)结合物且用1×PBS对板进行洗涤。加入基质溶液，且在Victor Wallac V培养板读数器(Perkin Elmer)上进行荧光测量。通过比较化合物1处理下的细胞增殖与经DMSO处理的样品来计算对增殖的抑制百分比。使用5至8种化合物1浓度下的抑制百分比值来计算IC50值。
[0377] 生物学实施例
[0378] 对ROS1磷酸化的抑制
[0379] 将带有激活的SLC34A2-ROS1融合和磷光体-Met的人肺NSCLC腺癌细胞系HCC-78细5
胞(DSMZ，ACC 563)以3×10 个细胞/孔接种于6孔板(Nunclon，152795)上含10％FBS(热灭活，Cellgro)和1％青霉素-链霉素(Cellgro)的RPMI 1640(ATCC，30-2001)中。将DMSO或化合物1的连续稀释于含10％FBS的新鲜培养基中(最终浓度0.3％DMSO(媒剂))加入细胞中且孵育3小时。在处理之后，收集细胞且用冷PBS洗涤并且立即用0.15mL冷溶解缓冲液(50mM Tris HCl pH 8.0、150mM NaCl、1％NP 40、0.1％SDS、0.5％去氧胆酸钠、1mM EDTA、50mM NaF、1mM焦磷酸钠、1mM Na3VO4、2mM PMSF、10μg/mL蛋白酶抑素、5μg/mL亮肽素和5μg/mL胃酶抑素A)溶解。收集溶解物，且通过BCA方法(Pierce)测量蛋白质浓度。收集溶解物，且通过BCA方法(Pierce)测量蛋白质浓度。将溶解物与NuPage LDS样品缓冲液(Invitrogen NP0007)和还原剂(Invitrogen#NP0004)混合，然后在70℃下加热10min。将20μg蛋白质装载至NuPage 10％Bis Tris凝胶(Invitrogen，NP0302)上。将蛋白质转移至硝化纤维膜(Invitrogen，LC2001)，在Odyssey阻断缓冲液(Li-Cor，927 40000)中阻断1小时，且在4℃下与稀释在含0.1％Tween 20的Odyssey阻断缓冲液中的抗ROS1小鼠单克隆抗体(1:1000)(Cell Signaling Technology，3266)和抗磷酸ROS1(Y2274)兔抗体(1:1000)(Cell
Signaling Technology，3077)一起孵育过夜。将膜洗涤四次，历经10min，每次利用TBS T缓冲液(50mM Tris HCl，pH7.2；150mM NaCl；0.1％Tween 20)，并且在室温下与山羊抗小鼠IRDye680(Li-Cor，926 32220)和山羊抗兔IRDye800(Li-Cor，926 32211)二次抗体一起在含0.1％Tween 20和0.01％SDS的Odyssey阻断缓冲液中印迹60分钟。将膜洗涤四次，历经
10min，每次利用TBS-T缓冲液，并且用PBS冲洗两次。使用Odyssey扫描器(Li-Cor)对膜进行扫描，且使用ImageQuant(Molecular Devices)对各谱带的信号强度进行定量。基于化合物处理对比媒剂(DMSO)对照的信号来计算IC50值。
胞(DSMZ，ACC 563)以3×10 个细胞/孔接种于6孔板(Nunclon，152795)上含10％FBS(热灭活，Cellgro)和1％青霉素-链霉素(Cellgro)的RPMI 1640(ATCC，30-2001)中。将DMSO或化合物1的连续稀释于含10％FBS的新鲜培养基中(最终浓度0.3％DMSO(媒剂))加入细胞中且孵育3小时。在处理之后，收集细胞且用冷PBS洗涤并且立即用0.15mL冷溶解缓冲液(50mM Tris HCl pH 8.0、150mM NaCl、1％NP 40、0.1％SDS、0.5％去氧胆酸钠、1mM EDTA、50mM NaF、1mM焦磷酸钠、1mM Na3VO4、2mM PMSF、10μg/mL蛋白酶抑素、5μg/mL亮肽素和5μg/mL胃酶抑素A)溶解。收集溶解物，且通过BCA方法(Pierce)测量蛋白质浓度。收集溶解物，且通过BCA方法(Pierce)测量蛋白质浓度。将溶解物与NuPage LDS样品缓冲液(Invitrogen NP0007)和还原剂(Invitrogen#NP0004)混合，然后在70℃下加热10min。将20μg蛋白质装载至NuPage 10％Bis Tris凝胶(Invitrogen，NP0302)上。将蛋白质转移至硝化纤维膜(Invitrogen，LC2001)，在Odyssey阻断缓冲液(Li-Cor，927 40000)中阻断1小时，且在4℃下与稀释在含0.1％Tween 20的Odyssey阻断缓冲液中的抗ROS1小鼠单克隆抗体(1:1000)(Cell Signaling Technology，3266)和抗磷酸ROS1(Y2274)兔抗体(1:1000)(Cell
Signaling Technology，3077)一起孵育过夜。将膜洗涤四次，历经10min，每次利用TBS T缓冲液(50mM Tris HCl，pH7.2；150mM NaCl；0.1％Tween 20)，并且在室温下与山羊抗小鼠IRDye680(Li-Cor，926 32220)和山羊抗兔IRDye800(Li-Cor，926 32211)二次抗体一起在含0.1％Tween 20和0.01％SDS的Odyssey阻断缓冲液中印迹60分钟。将膜洗涤四次，历经
10min，每次利用TBS-T缓冲液，并且用PBS冲洗两次。使用Odyssey扫描器(Li-Cor)对膜进行扫描，且使用ImageQuant(Molecular Devices)对各谱带的信号强度进行定量。基于化合物处理对比媒剂(DMSO)对照的信号来计算IC50值。
[0380] 图1中示出了对施用单次递增剂量的化合物1或3-[(1R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-(1-哌啶-4-基吡唑-4-基)吡啶-2-胺(克唑替尼； )的HCC-78 NSCLC细胞中SLC34A2-ROS1介导的激酶活性的抑制。图1明确说明化合物1对ROS1融合激酶的有效抑制活性，且在活体外测试浓度下与比较对照3-[(1R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-(1-哌啶-4-基吡唑-4-基)吡啶-2-胺(克唑替尼)相比更有效。
[0381] 生物学实施例
[0382] HCC-78 NSCLC细胞的ROS1依赖性增殖
[0383] 在将活性剂与HCC-78 NSCLC细胞以不同的浓度孵育48或72小时之后，计算化合物1和比较对照物3-[(1R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-(1-哌啶-4-基吡唑-4-基)吡啶-2-胺(克唑替尼)的IC50值。使用BrdU ELISA(化学发光，Roche Biosciences，目录号11
669 915 001)根据制造商的推荐对HCC-78 NSCLC细胞的增殖进行定量。如上文所提供来确定IC50值(A至E)(50％抑制时的浓度)的测定，且使用GraphPad Prism软件由计算机确定。
669 915 001)根据制造商的推荐对HCC-78 NSCLC细胞的增殖进行定量。如上文所提供来确定IC50值(A至E)(50％抑制时的浓度)的测定，且使用GraphPad Prism软件由计算机确定。
[0384] 表3.HCC-78 NSCLC细胞在本发明的化合物1和3-[(1R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-(1-哌啶-4-基吡唑-4-基)吡啶-2-胺(克唑替尼)存在下的ROS1依赖性增殖。
[0385]
[0386]
[0387] IC50数据提供：E-5,000-10,000nM；D-1,000-5,000nM；C-500-1000nM；B-100-500nM；A-10-100nM。
[0388] 其他实施方案
[0389] 出于明确性和理解的目的，已经通过说明和实例方式在一定程度上详细描述了上述公开内容。已经参考各种具体的和优选的实施方案和技术描述了本发明。然而，应所述理解，可以进行许多变化和修改而仍在本发明的精神和范围内。本领域技术人员应所述显而易见，可以在所附权利要求书的范围内实施变化和修改。因此，应所述理解，以上描述意在为说明性的而不是限制性的。
[0390] 因此，不应所述参考以上描述来确定本发明的范围，而是应所述替代地参考以下所附权利要求书以及所述权利要求书所授权的等效物的完整范围来确定。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 适于采用诊断适当性标准来确定用于识别病变的诊断试验的最佳顺序的医疗鉴别诊断装置 | 2020-05-15 | 367 |
| 猪繁殖与呼吸综合征血清学鉴别诊断试剂盒 | 2020-05-13 | 59 |
| 鉴别诊断不同类型痴呆的方法 | 2020-05-11 | 887 |
| 一种心肌肥厚基因鉴别诊断试剂盒 | 2020-05-12 | 630 |
| 心力衰竭恶化的自动鉴别诊断 | 2020-05-13 | 988 |
| 心电多相信息鉴别诊断仪 | 2020-05-13 | 76 |
| 用于自身免疫疾病的鉴别诊断的方法 | 2020-05-12 | 246 |
| 用于鉴别诊断不同牛泰勒虫的试剂盒及方法 | 2020-05-14 | 91 |
| 改良细菌鉴别诊断剂 | 2020-05-11 | 80 |
| 组合式定位鉴别诊断培养盒 | 2020-05-14 | 994 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈