技术领域
[0001] 本
发明涉及充当犬神经生长因子的拮抗剂抗体及其
片段。本发明还涉及制备这些抗体的方法以及这些抗体和片段在
治疗犬的与神经生长因子相关的病症中的
治疗用途，例如
疼痛、疼痛相关病症以及与导致慢性疼痛发作的病症。
背景技术
[0002] 神经生长因子（NGF）是天然存在的分泌蛋白，其由α多肽链、β多肽链和γ多肽链构成。NGF是神经营养因子家族的成员，其参与许多不同的作用。NGF促进感觉神经元和交感神经元的生存和分化，并且通过两类膜结合受体即低
亲和性NGF受体p75和高亲和性NGF受体跨膜酪
氨酸激酶TrkA来传达
信号。NGF与TrkA或p75的结合导致感觉神经元中神经肽的上调。
[0003] 已经描述了使用NGF拮抗剂治疗人类的疼痛和疼痛敏感(Cattaneo A.、Curr.Op.Mol.Ther.201012(1):94-106)。例如，国际
专利申请WO2006/131951描述了人源化形式的大鼠αD11(aD11)单克隆抗体。αD11抗体对小鼠NGF具有结合特异性，但已知也与人类和大鼠形式的NGF结合。在施用至人之前，需要对αD11大鼠衍生单克隆抗体进行人源化，从而使产生的中和抗体最少，该中和抗体是由人类对啮齿类衍生抗体的抗大鼠抗体(HAMA)反应产生的。而且，用人恒定结构域取代小鼠恒定结构域允许选择下游效应子功能。
[0004] 目前，通过施用数种
镇痛剂包括局部和全身麻醉剂、麻醉性镇痛剂、α2拮抗剂、非类固醇抗炎药(NSAIDs)和类固醇来进行犬的疼痛管理。这些药物中的每一种都需要频繁地施用并且在功效和安全性方面也有局限性。因此，对于患有慢性疼痛例如患有癌痛或关节炎的犬，需要不频繁施用且持久有效的疼痛缓解。
[0005] 虽然NGF在犬组织中表达，并且已经表征了犬NGF分子(Eisele I.WoodIS.German AJ.Hunter L.Trayhurn P.”Adipokine gene expression in dog
adipose tissues and dog white adipocytes differentiated in primary
culture”Hormone&Metabolic Research.37(8):474-81、2005Genbank XP_540250)，但该文章既没有描述犬NGF的拮抗剂，也没有在犬中使用阻塞NGF介导的信号传导以防止或缓解疼痛。由于中和抗体的产生，因此在犬中使用在其他物种中充当抗NGF拮抗剂的已知抗体并不可行。而且，包含犬衍生恒定结构域和衍生自已知的抗NGF抗体例如αD11的可变结构域的
嵌合抗体的产生，并不能保证与犬NGF结合。此外，这样的抗体可以显示出与犬中可能存在但最初衍生该抗体的物种中不存在的其他靶表位的交叉反应。另外，中和抗体的产生将限制该抗体的长期治疗施用，当治疗与慢性疼痛相关的病症或癌病症况时，这是特别重要的条件。同样，使用CDR移植或相关的技术产生犬源化形式的抗NGF抗体可能导致中和抗体的产生，并且可能进一步显示
抗原结合亲和性与亲合
力的降低。因此，迫切需要用于犬疼痛治疗中充当犬NGF拮抗剂的结合成员(binding member)，其中该结合成员保持高
水平的结合亲和性与亲合力，同时避免了针对其的中和抗体的产生。
[0006] 发明概述
[0007] 经过大量的努力，本
发明人意外地发现了一种制备抗体的方法，该抗体产生特异性结合犬NGF且中和犬NGF
生物活性的非免疫原性抗体及其结合片段。特别是，出乎意料地，本文表明，本发明的抗体及其结合片段与犬NGF的结合，通过抑制犬NGF与高亲和性TrkA受体或与p75受体的结合，隔绝了犬NGF的生物活性。这反过来阻止了
感知神经元中神经肽的上调，结果减轻或消除了痛觉。使用重组DNA方法生产抗体，并且出乎意料地该抗体是非免疫原性的，也就是说，在施用至犬个体之后，针对该抗体的中和抗体并未产生。由于使用标准方法例如CDR移植等并未产生抗体，因此这样的发现是令人惊讶且完全出乎意料的。
[0008] 根据本发明的第一方面，提供了制备适用于犬中的抗体的方法，其包括或基本上由以下步骤组成：
[0009] 从犬之外的物种提供供体抗体，其中所述供体抗体对犬中存在的靶抗原有结合特异性；
[0010] 将所述供体抗体
框架区氨基酸序列的每一氨基酸残基与一个或多个犬抗体的框架区的氨基酸序列中对应
位置的每一氨基酸残基比较，以
鉴别出所述供体受体框架区氨基酸序列内与所述一个或多个犬抗体的框架区的氨基酸序列的对应位置的一个或多个氨基酸残基不同的一个或多个氨基酸残基；以及
[0011] 用存在于一个或多个犬抗体中对应位置的一个或多个氨基酸残基来取代所述供体抗体中一个或多个鉴别出的氨基酸残基。
[0012] 本发明的方法修饰了犬中使用的供体抗体，这样的方法使得修饰的抗体的框架区内的任何位置不含有在犬中的该位置将是外来的任何氨基酸。因此，修饰的抗体保持了供体抗体对靶抗原的特异性和亲和性，但重要的是修饰并没有产生潜在的外来表位。因此，在犬中，修饰的抗体不被看做外来的，并且尤其是在长期施用后，也没有在犬中引起可能导致抗体功效的中和的免疫反应。
[0013] 在某些实施方案中，取代所述一个或多个鉴别出的氨基酸残基的步骤包括，用存在于对应位置的与所述一个或多个取代的氨基酸残基具有最高同源性的一个或多个氨基酸残基来取代所述一个或多个鉴别出的氨基酸残基。
[0014] 在某些实施方案中，该方法还包括用衍生自犬抗体的重链和/或轻链的恒定结构域取代所述供体抗体的重链和/或轻链的恒定结构域的步骤。通常，该重链的恒定结构域被HCA或HCD犬恒定结构域取代。
[0015] 在某些实施方案中，靶抗原是神经生长因子(NGF)。
[0016] 本发明第一方面的方法并不包括CDR移植。根据本发明第一方面的方法制备的抗体包含供体抗体的CDR、根据本发明的第一方面的方法制备的犬源化框架区，以及犬的恒定结构域。
[0017] 本发明延及根据本发明的第一方面例如以下的描述制备的抗体。
[0018] 因此，根据本发明的另一方面，提供了特异性结合犬神经生长因子(NGF)的犬源化抗体或其结合片段。通常，当与NGF结合时，犬源化抗体或其结合片段中和NGF生物功能。也就是说，犬源化抗体或结合片段与NGF的结合隔绝了NGF与TrkA受体或与p75受体结合的能力。在某些实施方案中，犬源化抗体或其结合片段与NGF结合的结合亲和力KD为-81x10 或更小。
[0019] 在本发明的另一或相关方面，提供了中和抗体或其抗原结合片段，其能够与犬神经生长因子(NGF)特异性结合，该抗体或抗体结合片段包含、组成为或基本组成为：包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或与其具有至少85、90、95或99%同一性的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方案中，所述同一性是在至少约15个氨基酸，优选约20个氨基酸，更优选为约25个氨基酸的长度上。
[0020] 在一些实施方案中，中和抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体是嵌合抗体。在一些实施方案中，抗体是犬源化抗体，即具有已经去免疫的氨基酸序列的抗体，从而，当施用至犬后，并不产生针对所述抗体的中和抗体。在某些实施方案中，根据本发明第一方面的制备抗体的方法来制备犬源化抗体。通常通过氨基酸取代或缺失的方式来选择或修饰抗体的重链恒定结构域，从而使得恒定结构域并不介导下游的效应子功能。
[0021] 在一些实施方案中，抗体或抗体结合片段包含、组成为或基本组成为：包含氨基酸序列SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:10或与其具有至少85、90、95或99%序列同源性的氨基酸序列的轻链。在某些实施方案中，所述同一性是在至少约15个氨基酸，优选约20个氨基酸，更优选约25个氨基酸的长度上。
[0022] 在本发明的另一或相关方面，提供了中和抗体或其抗原结合片段，其能够与犬神经生长因子(NGF)特异性结合，该抗体或抗体结合片段包含、组成为或基本组成为：包含氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或与其具有至少85、90、95或99%同一性的氨基酸序列的重链可变区。在某些实施方案中，所述同一性是在至少约15个氨基酸，优选约20个氨基酸，更优选约25个氨基酸的长度。
[0023] 通常，重链(VH)的可变区与包含至少一个免疫球蛋白恒定结构域的另一氨基酸序列结合。在某些实施方案中，免疫球蛋白恒定结构域衍生自子类IgG(免疫球蛋白G)抗体，以形成本发明的犬源化抗体的完整重链。已知四种不同的犬恒定结构域。通常，所述恒定结构域包含CH1、CH2和CH3以及位于CH1和CH2结构域之间的合适的连接体（或
铰链“hinge”）。通常，本发明的抗犬NGF抗体包含与恒定结构域结合的重链可变结构域，其中该恒定结构域并不介导下游的效应子功能例如补体结合、ADCC、Fc受体结合等。通常，所述重链具有犬重链同种型A或D。
[0024] 在某些实施方案中，抗体或抗体结合片段包含、组成为或基本组成为：包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85、90、95或99%同一性的氨基酸序列的重链。在某些实施方案中，所述同一性是在至少约15个氨基酸，优选约20个氨基酸，更优选约25个氨基酸的长度上。
[0025] 在某些另外的实施方案中，抗体或结合片段可以包含其中恒定结构域中的至少一个氨基酸残基被取代或缺失以阻止该氨基酸残基糖基化的重链。因此，在某些另外的实施方案中，抗体或抗体结合片段包含、组成为或基本组成为：包含选自SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85、90、95或99%序列同一性的氨基酸序列的重链。在某些实施方案中，所述同一性是在至少约15个氨基酸，优选约20个氨基酸，更优选约25个氨基酸的长度上。
[0026] 在一些实施方案中，优选不介导下游效应子功能例如补体结合、ADCC、Fc受体结合等且具有重链恒定结构域的抗体或片段。这样的重链可以包含犬来源的亚型IgG-A的重链并且可以具有氨基酸序列SEQ ID NO:6、11、15或19。而且，这样的重链可以包含犬来源的亚型IgG-D并且可以具有氨基酸序列SEQ ID NO:9、14、18或22。
[0027] 在另一个或相关的方面，本发明延及中和抗体或其抗原结合片段，其能够与犬神经生长因子(NGF)特异性结合，所述抗体或抗体结合片段包含、组成为或基本组成为：轻链和重链，其中轻链(VL)的可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或与所述氨基酸序列具有至少85、90、95或99%序列同一性的氨基酸序列，并且其中重链(VH)的可变区包含、组成为或基本组成为：与氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4相同或基本上同源的氨基酸序列或与其具有至少85、90、95或99%序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述同一性是在至少约15个氨基酸，优选约20个氨基酸，更优选约25个氨基酸的长度上。
[0028] 在某些实施方案中，抗体或结合成员(binding member)包含轻链，所述轻链包含、组成为或基本组成为：氨基酸序列SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:10或与其具有至少85%、优选为95%、更优选为至少98%氨基酸同一性的序列。在某些实施方案中，所述同一性是在至少约15个氨基酸，优选约20个氨基酸，更优选约25个氨基酸的长度上。
[0029] 在某些实施方案中，抗体或结合成员包含重链，所述重链包含、组成为或基本组成为：选自SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有至少85%、优选95%、更优选至少98%序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述同一性是在至少约15个氨基酸，优选约20个氨基酸，更优选约25个氨基酸的长度上。
[0030] 在某些实施方案中，抗体可以与至少受体分子缀合。
[0031] 在某些另外的实施方案中，可以取代或缺失恒定结构域中的至少一个残基，以防止该残基的糖基化。因此，在某些另外的实施方案中，抗体或抗体结合片段包含、组成为或基本组成为：重链，其中该重链包含选自SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有至少85%、优选95%、更优选至少98%同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述同一性是在至少约15个氨基酸，优选约20个氨基酸，更优选约25个氨基酸的长度上。
[0032] 本发明人进一步限定了一系列可以与互补性决定区(CDRs)结合以形成犬源化重链可变结构域和犬源化轻链可变结构域的框架区(FR)。每一个重链结构域和轻链结构域都具有4个框架区，称为FR1、FR2、FR3和FR4。
[0033] 抗体分子可以包含重链可变结构域，其包含CDR1、CDR2和CDR3区以及相关的插入框架区。重链可变结构域(VH)CDR称为HCDRs，根据Kabat编号系统在下列位置可以找到这些CDRs:VHCDR1–Kabat残基31-35、VHCDR2–Kabat残基50-65、VHCDR3–Kabat残基95-102(Kabat EA et al.(1991)Sequences of proteins of immunological interest(具th
有免疫学重要性的
蛋白质序列),5 edition.Bethesda:US Department of Health and Human Services，)。
[0034] 而且，抗体进一步包含轻链可变结构域，其包含CDR1、CDR2和CDR3区以及相关的插入框架区。轻链可变结构域(VL)CDR称为VLCDR，根据Kabat编号系统在下列氨基酸残基位置可以找到这些CDRs:VLCDR1–Kabat残基24-34、VLCDR2–Kabat残基50-56、VLCDR3–Kabat残基89-97。
[0035] 轻链可变结构域或重链可变结构域包含四个框架区，FR1、FR2、FR3和FR4，以FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4排列插入CDR。
[0036] 在另一方面，本发明延及抗NGF抗体或其NGF结合片段，所述抗体或抗体结合片段包含轻链可变区和/或重链可变区，所述轻链可变区包含以下中的至少一个：
[0037] 包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24组成的FR1框架区；
[0038] 包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:25组成的FR2框架区；
[0039] 包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27组成的FR3框架区；
[0040] 包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:28组成的FR4框架区；
[0041] 所述重链可变区，包含以下中的至少一个：
[0042] 包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:29组成的FR1框架区；
[0043] 包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:30组成的FR2框架区；
[0044] 包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32组成的FR3框架区；
[0045] 包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:33组成的FR4框架区。
[0046] 通常，轻链CDR和重链CDR衍生自对犬NGF具有结合特异性的抗体。
[0047] 通常，本发明犬源化抗犬NGF抗体的产生不需要待引入轻链可变结构域或重链可变结构域的框架区内的回复突变。
[0048] 在某些实施方案中，包含以上描述的所述至少一个框架区的轻链可变结构域与犬来源的轻链恒定结构域结合，犬衍生轻链恒定结构域通常为轻链κ恒定结构域，但任选地为λ轻链。在某些实施方案中，所述轻链包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24的FR1区，具有氨基酸序列SEQ ID NO:25的FR2区，具有氨基酸序列SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27的FR3区，具有氨基酸序列SEQ ID NO:28的FR4区，或与前述氨基酸序列具有至少85、90、95或98%序列同一性的氨基酸序列的框架区。在某些实施方案中，所述同一性是在至少于5个氨基酸，优选约10个氨基酸的长度上。
[0049] 在某些另外的实施方案中，包含以上描述的至少一个框架区的重链可变区与犬衍生重链恒定结构域结合。在某些实施方案中，恒定结构域的氨基酸序列没有任何翻译后修饰，或者可以被修饰以除去可能经历N-连接或O-连接糖基化的任何残基或全部残基，这样使得恒定结构域未被糖基化。在某些实施方案中，重链包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:29的FR1区，具有氨基酸序列SEQ ID NO:30的FR2区，具有氨基酸序列SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32的FR3区和具有氨基酸序列SEQ ID NO:33的FR4区，或具有与前述氨基酸序列有至少85、90、95或98%序列同一性的氨基酸序列的框架区。在某些实施方案中，所述同一性是在至少约5个氨基酸，优选约10个氨基酸的长度上。
[0050] 在某些另外的实施方案中，可以对本文描述的框架区进行修饰。也就是说，发明者确认，对于每一框架区中的一些残基来说，可以为
指定位置选择氨基酸。重要的是，这些框架区修饰不会导致互补性决定区的构象改变，这是由于这可以改变所得抗体的结合特异性和/或亲和性。在某些实施方案中，本发明延及将2个或以上氨基酸取代引入到轻链可变区和/或重链可变区的框架区的氨基酸残基。
[0051] 因此，在某些另外的实施方案中，本发明延及多肽，例如包含具有FR1区的轻链可变结构域的抗体或其抗原结合片段，所述FR1区包含被以下氨基酸取代（其中氨基酸用其单字母代码表示）中的一个或多个修饰的氨基酸序列SEQ ID NO:23，即位置3的氨基酸残基Q(Q3)被氨基酸残基V取代，T5被M取代，S7被T取代，A9被L取代，L13被V取代，Q15被P或R取代，E16被G取代，K18被T或P取代，V19被A取代，T20被S取代，以及T22被S取代。此外，还可以提供一个或多个以下取代：T5被I取代，A9被P取代，S12被A取代，S14被R或T取代，E16被D取代，E17被D取代，K18被A、E或L取代，T22被Y取代，以及C23被Y取代。
[0052] 在某些另外的实施方案中，其中轻链可变区具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:24的FR1区，其可以被一个或多个以下氨基酸取代来修饰：位置3的氨基酸残基V(V3)被氨基酸残基Q取代，T5被M取代，S7被T取代，A9被L取代，L13被V取代，Q15被P或R取代，E16被G取代，K18被T或P取代，V19被A取代，T20被S取代，以及T22被S取代。此外，还可以提供一个或多个以下取代：T5被I取代，A9被P取代，S12被A取代，S14被R或T取代，E16被D取代，E17被D取代，K18被A、E或L取代，T22被Y取代，以及C23被Y取代。
[0053] 在某些另外的实施方案中，具有氨基酸序列SEQ ID NO:25的轻链FR2区可以通过被一个或多个以下氨基酸取代进行修饰：Y2被F取代，Q3被R取代，A9被S取代，K11被Q取代，以及L12被R取代。此外，Y2可以被I或L取代，Q3可以被I或L取代，Q4可以被H取代，K5可以被R取代，P6可以被A或S取代，G7可以被D取代，A9可以被P或T取代，K11可以被E或R取代，L12可以被A、G、P或S取代，I14可以被L取代，以及Y15可以被E、F、N、S或V取代。
[0054] 在某些另外的实施方案中，具有氨基酸序列SEQ ID NO:26的轻链FR3区可以通过被一个或多个以下氨基酸取代进行修饰：S4被D取代，E14被D取代，Y15被F取代，S16被T取代，L17被F取代，T18被K取代，N20被S取代，L22被V取代，S24被P取代，V27被A取代，以及F31被Y取代。此外，G1可以被A取代，V2可以被A取代，P3可以被S取代，F6可以被L或V取代，S7可以被I取代，G8可以被A取代，T13可以被A取代，S16可以被R取代，T18可以被R取代，S24可以被A取代，E25可以被D、G、I或N取代，V27可以被G、S或T取代，A28可以被G取代，以及V29可以被I或L取代。
[0055] 在某些另外的实施方案中，其中轻链可变区具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:27的FR3区，其可以被一个或多个以下氨基酸取代修饰：S4被D取代，E14被D取代，F15被Y取代，S16被T取代，L17被F取代，T18被K取代，S20被N取代，L22被V取代，P24被S取代，V27被A取代，以及Y31被F取代。此外，G1可以被A取代，V2可以被A取代，P3可以被S取代，F6可以被L或V取代，S7可以被I取代，G8可以被A取代，T13可以被A取代，S16可以被R取代，T18可以被R取代，S24可以被A取代，E25可以被D、G、I或N取代，V27可以被G、S或T取代，A28可以被G取代，以及V29可以被I或L取代。
[0056] 在某些另外的实施方案中，具有氨基酸序列SEQ ID NO:28的轻链FR4区可以通过被一个或多个以下氨基酸取代进行修饰：E8被D取代。此外，G2可以被S取代，A3可以被P、Q或T取代，G4可以被E取代，T5可以被P取代，K6可以被Q或S取代，V7可以被L或W取代，E8可以被R取代，或L9可以被I取代。
[0057] 在某些另外的实施方案中，具有氨基酸序列SEQ ID NO:29的重链FR1区可以被一个或多个以下氨基酸取代修饰：D10被G取代，N13被Q取代，G15被T取代，G16被E取代，T17被S取代，T19被R取代，V24被A取代，S28被T取代，L29被F取代，以及T30被S取代。此外，E1可以被D或G取代，V2可以被E、G、I、L或M取代，Q3可以被A、E、H、K、L、P、R、S或V取代，L4可以被P或V取代，V5可以被A、E、L或M取代，E6可以被A或Q取代，S7可以被F、L或T取代，G9可以被E取代，D10可以被A、E、N或T取代，L11可以被Q、R、V或W取代，V12可以被A、I或M取代，N13可以被K或R取代，P14可以被F或T取代，G15可以被A或E取代，G16可以被A取代，T17可以被P取代，L18可以被R取代，T19可以被G、K或V取代，L20可以被I或V取代，S21可以被Y取代，V23可以被A、E、I或L取代，V24可以被G、I、S或T取代，S25可以被G、P或T取代，G26可以被D、R或T取代，F27可以被D、I、L、S、T或V取代，S28可以被A、D、I、L、M、N、P或R取代，L29可以被I、M或V取代，T30可以被D、G、H、I、K、N、R、V取代。
[0058] 在某些另外的实施方案中，具有氨基酸序列SEQ ID NO:30的重链FR2区可以通过被一个或多个以下氨基酸取代进行修饰：L6被P取代，R8被K取代，E11被Q取代，G14被A取代。此外，W1可以被C取代，V2可以被A、F、I或L取代，Q4可以被H或L取代，A5可以被D、G、P、S、T或V取代，G7可以被E、L或R取代，R8可以被A、E、G、M或Q取代，G9可以被D、E、R、T或V取代，L10可以被F、M或P取代，E11可以被D、H、L、P或R取代，W12可以被C、F、L、M、S或Y取代，V13可以被F、I或L取代，G14可以被L、S或T取代。
[0059] 在某些另外的实施方案中，具有氨基酸序列SEQ ID NO:31的重链FR3区可以通过被一个或多个以下氨基酸取代进行修饰：L2被F取代，T5被S取代，T8被N取代，S9被A取代，S11被N取代，V13被L取代，F14被Y取代，K16被Q取代，H18被N取代，Q21被R取代，S22被A取代，T27被V取代，R32被K取代。此外，R1可以被Q取代，L2可以被V取代，T3可以被A、I或S取代，I4可以被L、M、T或V取代，T5可以被A或F取代，R6可以被K取代，D7可以被E或N取代，T8可以被D、G、I或S取代，S9可以被D、G、P、T或V取代，K10可以被E、G、M、N、Q或R取代，S11可以被D、H、K或R取代，T12可以被A、I、M或S取代，V13可以被A、I或M取代，F14可以被H、S或T取代，L15可以被I取代，K16可以被A、D、E、H或R取代，M17可以被L取代，H18可以被D、K、P、R、S或T取代，S19可以被D、G、N、R或T取代，L20可以被V取代，Q21可以被G、I、K、S或T取代，S22可以被D、G、P、T或V取代，E23可以被A、D或V取代，T25可以被A、M或S取代，A26可以被G或V取代，T27可以被F、I、K、L、M或Q取代，Y28可以被H取代，Y29可以被F或H取代，A31可以被C、G、L、M、R、S、T或V取代，R32被A、D、E、G、I、L、M、N、P、Q、S、T或V取代。
[0060] 在某些另外的实施方案中，其中重链可变结构域具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:32的FR3区，其可以通过被一个或多个以下氨基酸取代进行修饰：L2被F取代，T5被S取代，T8被N取代，S9被A取代，S11被N取代，V13被L取代，F14被Y取代，Q16被K取代，H18被N取代，R21被Q取代，S22被A取代，T27被V取代，R32被K取代。此外，R1可以被Q取代，L2可以被V取代，T3可以被A、I或S取代，I4可以被L、M、T或V取代，T5可以被A或F取代，R6可以被K取代，D7可以被E或N取代，T8可以被D、G、I或S取代，S9可以被D、G、P、T或V取代，K10可以被E、G、M、N、Q或R取代，S11可以被D、H、K或R取代，T12可以被A、I、M或S取代，V13可以被A、I或M取代，F14可以被H、S或T取代，L15可以被I取代，K16可以被A、D、E、H或R取代，M17可以被L取代，H18可以被D、K、P、R、S或T取代，S19可以被D、G、N、R或T取代，L20可以被V取代，Q21可以被G、I、K、S或T取代，S22可以被D、G、P、T或V取代，E23可以被A、D或V取代，T25可以被A、M或S取代，A26可以被G或V取代，T27可以被F、I、K、L、M或Q取代，Y28可以被H取代，Y29可以被F或H取代，A31可以被C、G、L、M、R、S、T或V取代，R32被A、D、E、G、I、L、M、N、P、Q、S、T或V取代。
[0061] 在某些另外的实施方案中，具有氨基酸序列SEQ ID NO:33的重链FR4区可以通过被一个或多个以下氨基酸取代进行修饰：L6被S取代。此外，W1可以被L取代，G2可以被A或S取代，Q3可以被D、H、P或R取代，T5可以被A、I、N或S取代，L6可以被P、Q或R取代，V7可以被I、L或P取代，T8可以被A、F、I、L、P、S或Y取代，V9可以被A取代，S10可以被A、C、P或T取代，S11可以被A、L或P取代。
[0062] 在本发明以上方面的某些实施方案中，抗体是单克隆抗体。通常，所述抗体是犬源化抗体。
[0063] 在本发明以上方面的某些实施方案中，本发明的犬源化NGF中和抗体或由其衍生的结合片段与犬NGF（神经生长因子）特异性结合且其结合亲和性的平衡解离常数(KD)为-81x10 或更小。而且，优选该犬源化抗体不与犬内存在的任何其他表位交叉反应，并且进一步，当将本发明的抗体施用于犬时，不产生针对本发明的抗体的中和抗体。此外，优选抗体的恒定结构域不介导任何下游的效应子功能，包括但不限于补体结合和激活、ADCC以及Fc受体结合和激活。
[0064] 在本发明的以上方面的某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段在犬中的血清
半衰期为至少一周。通常，血清半衰期是至少8天。通常，该抗体在犬中不是免疫原性的。
[0065] 在本发明的以上方面的某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是纯化的或通过包括阴离子交换层析、疏水作用层析和尺寸排阻层析等方法被纯化。在可选的实施方案中，抗体或其抗原结合片段是纯化的或通过包括Captoadhere亲和层析之后进行阴离子交换层析的方法纯化。
[0066] 在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段并不介导下游的效应子功能。通常，该抗体或结合片段具有犬重链同种型A或D。
[0067] 在某些实施方案中，根据本发明第一方面制备抗体的方法来制备犬源化抗体。在某些另外的实施方案中，可以对本发明的抗体进行重链的恒定结构域的氨基酸序列修饰。所述修饰可以包括一个或多个氨基酸残基的添加、取代或缺失。通常为了改变抗体的功能特性而进行这些氨基酸改变。例如，可以进行氨基酸修饰以防止被抗体恒定结构域介导的下游效应子功能，例如通过防止抗体结合Fc受体、激活补体或诱导ADCC的能力。此外，为了改变当施用于犬时抗体的循环半衰期，可以对重链恒定结构域铰链区(hinge region)的氨基酸残基进行修饰。
[0068] 本发明延及结合犬NGF并且隔绝其结合p75或TrkA受体的能力的抗体片段。
[0069] 在某些实施方案中，抗体结合片段可以包括被柔性连接体连接以形成单链抗体的本发明的重链和轻链序列。
[0070] 单链Fv(scFv)包含VH结构域和VL结构域。VH结构域和VL结构域结合形成靶结合位点。这两个结构域通过肽连接体共价连接。scFv分子在N末端需要轻链可变结构域的情况下可以具有VL-连接体-VH的形式，或在N末端需要VH结构域的情况下为VH-连接体-VL。因此，在某些另外的实施方案中，抗原结合片段是单链Fv(scFv)抗体片段。在某些另外的实施方案中，抗体结合片段选自Fab抗体片段、Fab’抗体片段、F(ab’)2抗体片段、Fv抗体片段、scFV抗体片段等，但并不限于此。
[0071] 在一些实施方案中，本发明提供了用于联合疗法的多特异性或多价抗体，其包含以不同的结合特异性与其他抗体偶联或结合的本发明的抗NGF抗体或结合片段。多特异性抗体包含对第一NGF表位有特异性的至少一个抗体或结合片段，和对NGF上存在的另一表位或对不同的抗原有特异性的至少一个结合位点。多价抗体包含对同一NGF表位有结合特异性的抗体或抗体结合片段。因此，在某些实施方案中，本发明延及包含本发明的犬源化抗体的四个或更多Fv区或Fab区的抗体融合蛋白。另外的实施方案还延及抗体融合蛋白，其包含衍生自本文描述的抗体的一个或多个Fab区与来自对NGF有特异性的抗体的一个或多个Fab区或Fv区。在某些另外的实施方案中，本发明延及双特异性抗体，其中本发明的抗体或其结合片段与对第二靶标有结合特异性的第二抗体或其结合片段连接，所述第二靶标不是NGF。优选地，所述第二靶标通过p75或TrkA受体有助于阻止NGF介导的信号传导。可以通过本领域技术人员熟知的多种方法或重组方法来制得这样的多价抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
[0072] 本发明的另一方面提供了抗神经营养因子中和抗体，其包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的轻链可变结构域，和/或具有氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的重链可变结构域。在某些实施方案中，神经营养因子是犬神经生长因子(NGF)。
[0073] 本发明的又一方面提供了治疗、抑制或减轻犬的疼痛的方法，该方法包括以下步骤：
[0074] 提供
治疗有效量的抗犬NGF抗体或其抗原结合片段；以及
[0075] 将所述抗犬NGF抗体或其抗原结合片段施用至有需要的犬。
[0076] 在某些实施方案中，该抗体是犬源化抗体。
[0077] 在某些实施方案中，该抗体包含轻链可变结构域和/或重链可变结构域，所述轻链可变结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQID NO:3或与所述氨基酸序列具有至少85%同一性的序列，所述重链可变结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或与所述氨基酸序列具有至少85%序列同源性的氨基酸序列。
[0078] 在某些实施方案中，该抗体包括轻链和/或重链，所述轻链具有氨基酸序列SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:10或与所述氨基酸序列具有至少85%序列同一性的序列，所述重链包含、组成为或基本组成为：选自SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有至少85%、更优选为至少98氨基酸同一性的序列。
[0079] 在某些实施方案中，抗犬NGF抗体或其抗原结合片段是本发明的前述方面提供的任何抗犬NGF抗体或其抗原结合片段。
[0080] 在某些实施方案中，疼痛是指神经病理性疼痛(neuropathic pain)。特别是，疼痛可以是围手术期、手术后或外科手术后疼痛。手术后疼痛(post-operative pain)可能在犬的以下任何手术程序后发生，其包括但不限于矫形外科手术、软组织外科手术、卵巢子宫
切除术、阉割手术等。在某些另外的实施方案中，疼痛是与癌症或癌性病症相关的慢性疼痛（
肿瘤疼痛）。在某些另外的实施方案中，疼痛与
风湿性关节炎或骨关节炎相关或由它们导致。在某些实施方案中，疼痛是炎性疼痛或
瘙痒疼痛。
[0081] 根据本发明的另一方面，提供了治疗犬个体的关节炎或关节炎病症的方法，所述方法包括以下步骤：
[0082] 提供治疗有效量的本发明的抗犬NGF抗体或其抗原结合片段；以及
[0083] 将所述抗犬NGF抗体或其抗原结合片段施用至有需要的犬。
[0084] 在某些实施方案中，该抗体是犬源化抗体。在某些实施方案中，该抗体包含轻链可变结构域和/或重链可变结构域，所述轻链可变结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或与所述氨基酸序列具有至少85%同一性的序列，所述重链可变结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或与所述氨基酸序列具有至少85%序列同源性的氨基酸序列。
[0085] 在某些实施方案中，关节炎或关节炎病症包括选自免疫介导的多发性关节炎、风湿性关节炎、骨关节炎和相关病症。
[0086] 通常，关节炎或关节炎病症的治疗包括减轻、抑制、降低、压制或延迟与关节炎病症相关的或由其引起的疼痛的发作。
[0087] 本发明的又一方面提供了治疗犬个体中由犬NGF表达增加或对NGF敏感性增加引起的或与其相关的或导致其的病症的方法，所述方法包括以下步骤：
[0088] 提供治疗有效量的本发明的犬源化抗犬NGF抗体或其抗原结合片段；以及[0089] 将所述犬源化抗犬NGF抗体或其抗原结合片段施用至有需要的犬。
[0090] 根据本发明的又一方面，提供了治疗犬中被NGF诱发增殖的肿瘤和与其相关的病症的方法，所述方法包括以下步骤：
[0091] 提供治疗有效量的本发明的抗犬NGF抗体或其抗原结合片段；以及
[0092] 将所述抗犬NGF抗体或其抗原结合片段施用至有需要的犬。
[0093] 在某些实施方案中，肿瘤是骨肉瘤。在某些实施方案中，自分泌或旁分泌NGF诱导肿瘤增殖。
[0094] 在某些实施方案中，本发明的前述方法进一步包括共施用至少一种另外的药剂的步骤，该药剂可以提高和/或补足本发明的抗NGF抗体的功效。例如，该抗体或其抗原结合片段可以与至少一种镇痛剂、NSAID、阿片样物质、皮质类固醇或类固醇共施用。
[0095] 合适的镇痛剂的实例包括但不限于布托啡喏、丁丙诺啡、芬太尼、氟尼辛葡甲胺(flunixin meglumine)、哌替啶、吗啡、纳布啡及其衍生物。合适的NSAIDS包括但不限于对乙酰氨基酚、乙酰水杨酸、卡洛芬、依托度酸、酪洛芬、美洛昔康、非罗考昔、罗贝考昔(robenacoxib)、德拉昔布等。
[0096] 在某些另外的实施方案中，所述至少一种另外的药剂可以是活性治疗剂，其可以是选自抗生素、抗
真菌剂、抗
原生动物剂、抗病毒剂或类似药剂中的一组或多组。而且，所述至少一种另外的药剂可以是
炎症介质(mediator)的
抑制剂，例如PGE受体拮抗剂，免疫抑制剂例如环孢霉素，或抗炎糖皮质
激素。在某些另外的实施方案中，所述至少一种另外的药剂可以是用于治疗认知功能障碍或损伤的药剂，例如老龄犬中日益普遍的失忆或相关病症。而且，所述至少一种另外的药剂可以是用于治疗心
血管疾病的抗
高血压药剂或者其他化合物，例如以治疗高血压、心肌缺血、充血性心力衰竭等。此外，所述至少一种另外的药剂可以是利尿剂、血管扩张剂、β肾上腺素受体拮抗剂、血管紧张肽II转化酶抑制剂、
钙通道阻滞剂或HMG-CoA还原酶抑制剂。
[0097] 在某些实施方案中，作为前述方法的一部分，将抗体或抗原结合片段以从约0.01mg/kg体重至约3mg/kg体重，特别是从约0.03mg/kg体重至约3mg/kg体重的剂量施用至犬。
[0098] 在各种其它方面，本发明延及包含本发明任何前述方面的抗体或其结合片段的组合物。在某些实施方案中，所述组合物进一步包含至少一种药学上可接受的载体。
[0099] 本发明的另一方面提供了用于治疗导致犬慢性疼痛或由犬的慢性疼痛引起的疼痛或病症或通过NGF诱导增殖的肿瘤的药物组合物，其包含药学有效量的本发明的抗体，以及至少一种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
[0100] 在某些实施方案中，所述组合物可以进一步包括至少一种镇痛剂、NSAID、阿片样物质、皮质类固醇或类固醇。
[0101] 在各种其它方面，本发明延及编码本发明的抗体或抗体结合片段的分离核酸。
[0102] 因此，本发明的另一方面提供了编码根据本发明任意前述方面的抗体或抗原结合片段的分离核酸。
[0103] 在某些实施方案中，多核苷酸编码具有氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的抗犬NGF抗体或抗体片段的轻链可变结构域或具有氨基酸序列SEQ ID NO:5或10的轻链。
[0104] 在某些另外的实施方案中，多核苷酸编码具有氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的抗犬NGF抗体或抗体片段的重链可变结构域或具有选自SEQ ID NO:6-9、SEQ ID NO:11-14、SEQ ID NO:15-18和SEQ ID NO:19-22的氨基酸序列的重链。
[0105] 在某些实施方案中，所述分离核酸进一步编码与其可操作地连接的一个或多个
调控序列。
[0106] 在另一方面，本方面提供了包含多核苷酸的表达载体，该多核苷酸包含编码本发明的重链可变结构域和/或轻链可变结构域，或重链恒定结构域和/或轻链恒定结构域的多核苷酸。在某些实施方案中，所述表达载体进一步包含一个或多个调控序列。在某些实施方案中，所述载体是质粒或逆转录病毒载体。
[0107] 本发明的另一方面提供了并入本发明的前述方面的表达载体的宿主细胞。本发明的又一方面提供了产生本发明的任意前述方面的抗体的宿主细胞。
[0108] 本发明的又一方面提供了产生抗犬NGF中和抗体的方法，该方法包括以下步骤：培养本发明前述方面的宿主细胞以允许该细胞表达抗犬NGF中和抗体。
[0109] 本发明的另一方面提供了纯化本发明的抗犬NGF抗体的方法，包括以下步骤：
[0110] (i)阴离子交换层析；
[0111] (ii)疏水作用层析；以及
[0112] (iii)尺寸排阻层析。
[0113] 本发明的另一方面提供了纯化本发明的抗犬NGF抗体的方法，包括以下步骤：
[0114] (i)Captoadhere亲和层析；以及
[0115] (ii)阴离子交换层析。
[0116] 本发明的又一方面提供了产生本发明的抗犬NGF犬源化抗体的方法，包括以下步骤：在合适的宿主细胞内表达本发明前述方面的一个或多个多核苷酸/核酸或载体，其表达本发明抗体的轻链和/或重链；回收表达的多肽，其可以在一个宿主细胞内一起表达或者在不同的宿主细胞内单独表达；以及分离抗体。
[0117] 本发明的又一方面提供了治疗、减轻或抑制犬的疼痛或者治疗通过NGF诱导增殖的肿瘤的方法，所述方法包括：将有效量的本发明任意前述方面的多核苷酸施用至犬。
[0118] 本发明的又一方面提供了本发明的任意前述方面的抗体或抗体结合片段，或者本发明前述方面的药物组合物，或者包含本发明任意前述方面的抗体或抗体结合片段的核酸或载体，用于治疗或
预防犬的疼痛。
[0119] 在某些实施方案中，疼痛是急性疼痛。在某些另外的实施方案中，疼痛是慢性疼痛。而且，疼痛可以是手术后疼痛或者由犬的任何手术程序造成的疼痛，其包括但不限于矫形外科手术、软组织外科手术、卵巢子宫切除术、阉割手术等。在某些另外的实施方案中，疼痛是与癌症或癌性病症相关的慢性疼痛。在某些另外的实施方案中，疼痛与风湿性关节炎相关或由其引起。在某些实施方案中，疼痛是炎性疼痛或瘙痒疼痛。
[0120] 本发明的另一方面提供了本发明任意前述方面的抗体或抗体结合片段，或者本发明前述方面的药物组合物，或者包含本发明任意前述方面的抗体或抗体结合片段的核酸或载体，用于治疗关节炎尤其是骨关节炎和/或风湿性关节炎。
[0121] 本发明的另一方面提供了本发明任意前述方面的抗体或抗体结合片段，或者本发明前述方面的药物组合物，或者包含本发明任意前述方面的抗体或抗体结合片段的核酸或载体，用于治疗患病犬个体的通过NGF诱导增殖的肿瘤及其相关的病症、尤其是骨肉瘤。在某些实施方案中，自分泌或旁分泌NGF诱导肿瘤增殖。
[0122] 本发明的另一方面提供了本发明任意前述方面的抗体或抗体结合片段、或者本发明前述方面的药物组合物、或者包含本发明任意前述方面的抗体或抗体结合片段的核酸或载体，在制备用于治疗或预防犬的疼痛的药物中的用途。
[0123] 通常，疼痛是慢性疼痛。而且，疼痛可以是手术后疼痛或者由犬的任何手术程序造成的疼痛，其包括但不限于矫形外科手术、软组织外科手术、卵巢子宫切除术、阉割手术等。在某些另外的实施方案中，疼痛是与癌症或癌性病症相关的慢性疼痛。在某些另外的实施方案中，疼痛与风湿性关节炎相关或由其引起。在某些实施方案中，疼痛是炎性疼痛或瘙痒疼痛。
[0124] 本发明的另一方面提供了本发明任意前述方面的抗体或抗体结合片段，或者本发明前述方面的药物组合物，或者包含本发明任意前述方面的抗体或抗体结合片段的核酸或载体，在制备用于治疗、抑制、减轻或预防犬的风湿性关节炎或骨关节炎的药物中的用途。
[0125] 本发明的另一方面提供了本发明任意前述方面的抗体或抗体结合片段、或者本发明前述方面的药物组合物、或者包含本发明任意前述方面的抗体或抗体结合片段的核酸或载体，在制备用于治疗犬的通过NGF诱导增殖的肿瘤及其相关病症、尤其是骨肉瘤的药物中的用途。在某些实施方案中，自分泌或旁分泌NGF诱导肿瘤增殖。
[0126] 本发明的另一方面提供了产生本发明的抗犬NGF中和单克隆抗体或其片段的细胞系或其衍生细胞或后代细胞。
[0127] 本发明的又一方面提供了用于治疗犬的疼痛、或者用于治疗与疼痛相关的病症、或者用于治疗、减轻或抑制与骨关节炎或风湿性关节炎相关的疼痛的
试剂盒，所述试剂盒包含本发明任意前述方面的抗犬NGF抗体或结合片段以及其使用说明。
[0128] 本发明的又一方面提供了体外、离体和体内检测
流体中抗犬NGF单克隆抗体的
诊断试剂盒，用于确定所述抗体的浓度。该试剂盒可以包含本发明任意抗体或其结合片段。该试剂盒可以包含使用说明。
附图说明
[0129] 图1示出根据本发明产生的犬源化抗体与鼠NGF和犬NGF结合的图表。
[0130] 图2A-2D示出一系列显示本发明的犬源化抗体的蛋白A纯化的凝胶。
[0131] 图3示出显示使用SDS-Page纯化犬源化抗体的结果的凝胶。
[0132] 图4示出显示犬源化抗体抑制TF-1细胞的NGF诱导的增殖的曲线图。
[0133] 图5示出显示抗原捕获的犬源化抗体诱导的补体沉积(complement deposition)的图表。
[0134] 图6示出犬源化抗NGF轻链可变结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。下划线标注根据Kabat编号识别的三个CDR区。特定残基上方的星号表明犬源化序列与大鼠αD11抗鼠NGF单克隆抗体的氨基酸序列之间序列上的区别。
[0135] 图7示出犬源化抗NGF重链可变结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。下划线标注根据Kabat编号识别的三个CDR区。特定残基上方的星号表明犬源化序列与大鼠αD11抗鼠NGF单克隆抗体的氨基酸序列之间序列上的区别。
[0136] 图8示出犬κ轻链(caN-kLC)抗体的犬源化抗NGF轻链可变结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)。用
黑体表示可变结构域。
[0137] 图9示出犬IgG-A重链(caN-HCA)的犬源化抗NGF重链可变结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)。用黑体表示可变结构域。
[0138] 图10示出犬IgG-B重链(caN-HCB)的犬源化抗NGF重链可变结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)。用黑体表示可变结构域。
[0139] 图11示出犬IgG-C重链(caN-HCC)的犬源化抗NGF重链可变结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)。用黑体表示可变结构域。
[0140] 图12示出犬IgG-D重链(caN-HCD)的犬源化抗NGF重链可变结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:9)。用黑体表示可变结构域。
[0141] 图13A示出显示使用不同稀释度的SEQ ID No:5和SEQ ID No:7与SEQ ID No:10和SEQ ID No:11比较抗犬NGF单克隆抗体与NGF结合的图表。
[0142] 图14A示出显示具有HCB和HCC重链同种型的抗犬NGF单克隆抗体的N-糖基化和非糖基化(aglycosylated)与NGF结合比较的图表。图14B示出显示来自图14A的上清液的补体沉积的图表。
[0143] 图15A和15B示出使用三步法（方法I）定量纯化本发明的抗犬NGF抗体，包括(1)阴离子交换层析，(2)疏水作用层析，以及(3)尺寸排阻层析。图15A示出通过尺寸排阻HPLC分级的结果。图15B示出每一步骤后级分的还原性SDS-PAGE凝胶。图15C和15D示出使用两步法（方法II）定量纯化本发明的抗犬NGF抗体，包括(1)Captoadhere层析，(2)阴离子交换层析。图15C是非还原条件和还原条件下的SDS-PAGE分析。泳道1是MWS,泳道2是2μg/mL3450样品和0μl还原剂，泳道3是4μg/mL3450样品和0μl还原剂，泳道4是6μg/mL3450样品和0μl还原剂，泳道5是MWS，泳道6是2μg/mL3450样品和3μl还原剂，泳道7是4μg/mL3450样品和3μl还原剂，泳道8是6μg/mL3450样品和3μl还原剂，以及泳道9是MWS。图15D是尺寸排阻色谱。
[0144] 图16A示出方法I和方法II纯化的抗NGF单克隆抗体的比较。图16A是通过非还原SDS-PAGE和还原SDS-PAGE进行比较。图16B是通过抗NGF ELISA进行比较。
[0145] 图17示出将抗犬NGF抗体静脉内
给药至狗后，体重（上组）和
温度（下组）是稳定的。
[0146] 图18示出静脉注射至狗后，抗犬NGF单克隆抗体
血浆浓度的动力学分析。静脉注射2mg/kg抗NGF抗体至小猎犬，在指示的时间采集血浆样品并且通过NGF ELISA检测抗NGF单克隆抗体。抗犬NGF单克隆抗体具有出人意料的约9天的长消除(β)阶段半衰期。
[0147] 图19示出抗犬NGF单克隆抗体减低狗的炎性疼痛。在-1天时将瓷土注射到小猎犬的垫脚中，在0天时注射抗体或或媒介对照，并且通过视觉评分量表估算跛度。
[0148] 发明详述
[0149] 通过大量的试验，发明人获得了大鼠抗-小鼠NGF单克隆抗体(MAb)αD11氨基酸序列，并且出乎意料地用其产生了非免疫原性抗-犬NGF抗体。所得到的非免疫原性抗体，其并不是使用标准CDR移植技术产生的，经证明，其显示了结合犬NGF的高亲和性。抗体中和了犬NGF生物功能，特别是通过抑制NGF基于细胞的受体TrkA和p75的结合。而且，还意外地发现，当施用至犬时，并不在犬中产生针对它的中和抗体。因此，本发明的犬源化抗体适合于长期缓解狗的慢性疼痛。
[0150] 发明人利用的产生本发明抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域的方法，导致轻链可变结构域和重链可变结构域的框架区内存在的特定大鼠（供体）氨基酸残基被这样的残基取代，基于本发明人的分析，所述残基会保留CDR区的构象，并因此保持结合特异性和亲合力，同时如果将抗体以不变的形式施用至犬，降低可能导致针对该抗体产生的中和抗体的免疫原性表位的存在。具体而言，制备本发明(被称为PETisation)抗体的方法包括：通过将供体抗体框架区的序列与衍生自犬的一个抗体或抗体库的序列进行比较，评价供体（例如大鼠）抗体框架区的序列施用至犬的适宜性。尽管该比较是在供体序列与靶序列的单个成员之间进行，但是显而易见的是，与靶序列库进行比较是优选的，因为这将扩展靶标种类中每一Kabat位置的自然选择的数目。这不但将增加供体与靶标之间匹配的可能性，而且还将扩展不存在匹配的取代的选择。因此，将能够选择与供体尽可能紧密的特征的取代。当供体序列与犬序列在任何Kabat数目或对应的位置不同时，修饰供体序列以用犬中该位置的自然的氨基酸残基来取代正在讨论的氨基酸残基。
[0151] 如果需要取代供体免疫球蛋白中存在的氨基酸残基，通常采用保守取代的原则，其中该氨基酸残基天然位于犬Kabat位置并且在大小、电荷、疏水性方面与供体序列中被取代的氨基酸尽可能密切相关的氨基酸残基取代。目的是选择不引起供体抗体的三维结构扰动或破坏或引起最低程度的扰动或破坏。在某些情况下，将没有清楚的选择，并且每一选择都有利弊。最终的决定可能要求各种可选序列的
三维建模甚至表达。然而，通常利用明显的偏好。作为该步骤的结果，当残基在靶中是外来的并且该取代氨基酸与被取代的氨基酸尽可能密切相关时，仅对供体序列作出改变。因而，避免了外来表位的产生，但是由于维持了整个三位结构，因此，还维持了亲和性和特异性。
[0152] 轻链恒定结构域和重链恒定结构域通常衍生自犬（靶）衍生的抗体。选择或修饰重链恒定结构域，从而使得它们不介导下游的效应子功能。非常意外的是，由于发现并没有产生针对本发明产生的抗体的中和抗体或者产生了最少的所述抗体，因此惊人地发现该抗体具有长循环半衰期和重复剂量给药的相关益处。而且，由于以不影响CDR区的三位构造的方式进行框架残基取代，使得其，与期望的靶标的结合特异性没有变化。
[0153] 在人类和小鼠中存在四种主要的IgG同种型，虽然术语是类似的，但它们在行为和功能上是不同的，其包括对细菌产物例如蛋白A和蛋白G的亲和性，激活补体依赖性细胞溶解(CDC)的能力以及通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)诱导杀死靶细胞的能力。当将抗体设计为清除具有它们的同源抗原的靶细胞时，用CDC和ADCC活性或“防护的”恒定结构域选择IgG同种型在临床上被认为是有益的，例如在肿瘤控制或感染控制方面（例如，为了上述目的，在
人类医学应用中优选人IgG1同种型）。相比之下，在其他情况中，例如缓解炎症、疼痛或自身免疫中，激活免疫系统被认为是不可取的，因此优选具有最小CDC和ADCC活性的人IgG同种型（例如，在这样的人类医学应用中，常常优选IgG4同种型）。已经描述了犬免疫系统中的四个不同的免疫球蛋白γ(IgG)重链恒定结构域同型（美国专利号5852183，Tang L.et al.2001.Veterinary Immunology and Immunopathology,80.259-270）以及单个κ和λ恒定结构域序列。并没有按照由其介导的功能活性来表征四个犬重链恒定结构域A、B、C和D。不管与IgG家族的总体同源性如何，与来自其它物种的家族成员相比，编码犬IgG的蛋白彼此更接近，因此如果将任一种认为是四种犬同种型的的每一种，那么仅通过同源来限定上述功能是不合适的。当将抗体设计为例如在肿瘤控制或感染控制中清除具有同源抗原的靶细胞时，用CDC和ADCC活性恒定结构域选择IgG同种型是有利的，例如在人类医学应用中优选人IgG1同型。相比之下，在其他情况中，例如缓解炎症、疼痛或自身免疫中，激活免疫系统被认为是不可取的，因此优选具有最小或“非防卫”的CDC和ADCC活性的人IgG同型，例如在人类医疗用途中，选择IgG4同种型。
[0154] 本发明的抗体包含犬来源的重链恒定结构域和犬来源的轻链恒定结构域。而且，互补性决定区衍生自大鼠αD11抗-小鼠NGF抗体。αD11抗体首先描述于Cattaneo et al.(Cattaneo A,Rapposelli B,Calissano P.(1988)“Three distinct types of monoclonal antibodies after long-term immunization of rats with mouse nerve growth factor”.J Neurochem50(4):1003-1010，)。随后Ruberti et al.(Ruberti,F.et al.(1993)“Cloning and Expression of an Anti-Nerve Growth Factor(NGF)Antibody for Studies Using the Neuroantibody Approach”.Cellular and Molecular Neurobiology.13(5):559-568)克隆了αD11抗体。
[0155] 将衍生自αD11抗体的CDR区与本发明人确定的框架区序列组合来维持CDR的三级结构，因此维持了结合特异性，同时当将抗体施用至犬时，阻止针对所述抗体产生中和抗体。
[0156] 每一轻链可变结构域和重链可变结构域都包含四个框架区，称为FR1-FR4。对于这些框架区中的每一个，本发明人已经确定了每一特
定位置的优选氨基残基（所谓的优选残基），和还可能在该位置提供的可选的氨基酸残基。以下表1至表8示出每一重链和轻链的四个框架区。这些表相对特定框架区，并且进一步根据用于沿完整的重链可变结构域或轻链可变结构域的长度识别特定残基位置的编号系统，提供了氨基酸位置。组1示出的一个残基或多个残基是优选的残基，而组2的残基是可选的残基。然而，对于涉及该特定位置的组1所示的残基来说，这些残基通常不是优选的。使用单字母系统确定氨基酸残基。
[0157] 表1–轻链可变结构域FR1残基
[0158]
[0159] 表2–轻链可变结构域FR2残基
[0160]
[0161] 表3–轻链可变结构域FR3残基
[0162]
[0163]
[0164] 表4–轻链可变结构域FR4残基
[0165]
[0166] 表5–重链可变结构域FR1残基
[0167]
[0168]
[0169] 表6–重链可变结构域FR2残基
[0170]
[0171] 表7–重链可变结构域FR3残基
[0172]
[0173]
[0174] 表8–重链可变结构域FR4残基
[0175]
[0176] 因此，本发明的犬源化抗体不同于例如由衍生自第一物种的完整的可变区和衍生自第二物种的恒定结构域组成的嵌合单克隆抗体，或者不同于CDR移植的犬源化抗体，其中重链可变区和轻链可变区的互补性决定区(CDRs)包含衍生自供体抗体并被引入衍生自靶抗体或犬生殖系序列的框架区(FR)和恒定区(CR)的氨基酸残基。
[0177] 优选，犬源化抗体基本上保留了衍生CDR的母体（供体）抗体的结合特异性。这意味着，该犬源化抗体将显示与衍生CDR的供体抗体相同或基本上相同的抗原结合亲和性和亲合力。理想的是，该犬源化抗体的亲和性将不小于供体抗体对靶表位亲和性的10%，更优选不小于约30%，最优选是不小于该母（供体）抗体的亲和性的50%。测定抗原结合亲和性的方法是本领域已知的，并且包括半-最大结合测定(half-maximal binding assays)、竞争测定和斯卡查德分析(Scatchard analysis)。
[0178] 如前文所限定的，本发明延及衍生自本发明的犬源化抗体的结合成员或抗原结合片段。这样的抗原结合片段指保留与犬NGF特异性结合能力的抗体的一个或多个片段。已经证明，可以通过全长抗体来执行抗体的抗原结合功能。在某些实施方案中，结合成员或抗原结合片段可以是分离的结合成员。本发明的结合成员或抗原结合片段可以包含本发明的抗体的片段，例如完整的犬源化抗体分子的片段，诸如重链或轻链，例如重链和/或轻链的可变结构域。在某些实施方案中，结合成员通常包含、组成为或基本组成为：抗体VH和/或VL结构域。还提供了结合成员的VH结构域，也作为本发明的一部分。3个互补性决定区("CDRs")，以及4个相关的框架区("FRs")位于每一VH和/或VL结构域内。VH结构域通常包含3个HCDR（重链互补性决定区），并且VL结构域通常包含3个LCDR（轻链互补性决定区）。因此，结合成员可以包含VH结构域，其依次包含VH CDR1(或HCDR1)、CDR2(HCDR2)和CDR3(HCDR3)以及多个相关的框架区。结合成员可以额外地或可选地包含VL结构域，其依次包含VLCDR1、CDR2和CDR3以及相关的框架区。VH或VL结构域通常包含四个框架区，FR1、FR2、FR3和FR4。如本文所用的，术语“框架区”或“框架序列”指可变区减去CDR后剩余的序列。由于可以通过不同的系统（Kabat、Chothia等）确定CDR序列的准确定义，因此框架序列的含义有相应的不同解释。六个CDR（轻链的VL-CDR1、CDR2和CDR3和重链的VH-CDR1、CDR2和CDR3）将轻链和重链上的框架区划分为四个子区，即每一链上的FR1、FR2、FR3和FR4。
[0179] 图6示出根据本发明抗NGF抗体轻链可变结构域的氨基酸序列。用下划线标注CDR1、CDR2和CDR3区。因此，如图6所示，VL-CDR1位于FR1框架区和FR2框架区之间，VL-CDR2位于FR2框架区和FR3框架区之间，VL-CDR3位于FR3框架区和FR4框架区之间。图7示出根据本发明抗NGF抗体重链可变结构域的氨基酸序列。用下划线标注CDR1、CDR2和CDR3区。如同图6所示的轻链可变结构域，VH-CDR1位于FR1框架区和FR2框架区之间，VH-CDR2位于FR2框架区和FR3框架区之间，VH-CDR3位于FR3框架区和FR4框架区之间。
[0180] 在 图6和 图7中，根 据Kabat等 设 计 的 编 号 系 统 (Kabat,E.A.,Wu,T.T.,Perry,H.,Gottesman,K.and Foeller,C.(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Fifth Edition.NIH Publication No.91-3242,Kabat et al.(1971)Ann.NY Acad,Sci.190:382-391)对轻链可变结构域（图6）和重链可变结构域（图
7）的残基进行常规编号。Kabat编号系统指对比抗体或其抗原结合片段的重链可变结构域和轻链可变结构域中的其他氨基酸残基更易变的氨基酸残基进行编号的系统。因此，当提及可变结构域中的残基（大概是轻链的残基1-104和重链的残基1-113）时，通常使用Kabat编号系统。在本发明阐明的情况下，可以使用该编号系统。Kabat残基名称并不总是与本文列举的相关序列中给出的本发明重链可变结构域和轻链可变结构域的氨基酸残基的线性编号直接对应。特别是，与缩短或被插入的结构组成对应的严格Kabat编号的氨基酸相比，不论是重链或轻链的基本可变结构域结构的框架区还是互补性决定区(CDR)，实际的线性氨基酸序列可能含有较少的或额外的氨基酸。用应用了Kabat编号的标准序列校准抗体序列的残基，来确定任何给定抗体的残基的正确Kabat编号。
[0181] 而且，图7示出重链可变结构域氨基酸序列。其同样在SEQ ID NO:2中示出。然而，在图7中，编号考虑到氨基酸残基80、80A、80B和80C，而在SEQ ID NO:2中连续编号，依次是80、81、82和83。对图7中的Kabat残基100、100A、100B、100C、100D、100E和100F，也同样如此。
[0182] 如上文所述，抗体结合片段可以选自但不限于Fab片段、Fab’片段和scFv(单链可变片段)或者选自拟肽物、双特异抗体或相关的多价衍生物。
[0183] 在某些实施方案中，抗体结合片段是Fab或F(ab’)2片段，其由抗体的VL、VH、CL和CH1结构域组成。在某些实施方案中，VL结构域具有氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3，并且VH结构域具有氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4。在某些实施方案中，CL和CH1结构域基于犬免疫球蛋白CL和CH1结构域的氨基酸序列。
[0184] 用于重组产生Fab、Fab’和F(ab’)2片段的方法是本领域技术人员熟知的，并且其包括国际PCT专利公开WO92/22324所公开的方法和Sawai et al.(“Direct Production of the Fab Fragment Derived From the Sperm Immobilizing Antibody Using Polymerase Chain Reaction and cDNA Expression Vectors”,1995,AJRI34:26-34)中 所 公 开 的 方 法。Huston et al.（“Protein Engineering of Single-Chain Fv Analogs and Fusion Proteins”,单链Fv类似物和融合蛋白的蛋白质工程，Methods in Enzymology,vol.203:46-88(1991)）中公开了可以用于产生scFv（单链Fv片段）的技术的实例。
[0185] 在 某 些 实 施 方 案 中，根 据 Morimoto(Morimoto et al.,"Single-step purification of F(ab')2fragments of mouse monoclonal antibodies(immunoglobulins G1)by hydrophobic interaction high performance liquid chromatography using TSKgel Phenyl-5PW"Journal of Biochemical and Biophysical Methods24:107-117(1992))的方法，通过蛋白
水解消化，可以从全长抗体衍生抗体片段。还可以通过宿主细胞直接产生抗体片段（Carter et al.,"High level Escherichia coli expression and production of a bivalent humanized antibody fragment"Bio/Technology10:163-167(1992)）。
[0186] 除了提供对犬NGF具有结合特异性且抵消犬NGF功能的犬源化单克隆抗体之外，本发明进一步延及除了包含基于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3限定的VL（轻链可变）区的氨基酸序列和SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4限定的VH（重链可变）区的氨基酸序列的一对结合域之外的结合成员。特别是，本发明延及基于本发明抗体的犬源化抗体的VL或VH区的单个结合结构域。
[0187] 因此，在本发明的某些另外的实施方案中，提供了结合成员，其包含、组成为或基本组成为：衍生自本发明的人源化抗体的单个结合结构域。在某些实施方案中，单个结合结构域衍生自SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4限定的VH（重链可变结构域）的氨基酸序列。这样的结合结构域可以用作犬NGF的寻靶剂。
[0188] 在某些实施方案中，可以用另外的工程技术修饰本发明的抗体，例如通过包括可以改变血清半衰期、补体结合、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性的修饰。而且，在某些实施方案中，可以产生糖基化模式改变的抗体或抗体片段。在某些实施方案中，改变本发明的抗体，以增加或降低该抗体糖基化的程度。多肽的糖基化通常是N连接或O连接。N连接指
碳水化合物部分与天冬酰胺残基的
侧链连接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸是用于碳水化合物部分与天冬酰胺酶连接的识别序列，其中X是除脯氨酸外的任一氨基酸。因此，多肽中的这两个三肽序列任一个的存在产生潜在的糖基化位点。O连接的糖基化指糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的任一种与羟基氨基酸的连接，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但是还可以使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。本发明人提供了非糖基化的犬恒定结构域，其在本文中限定为SEQ ID NO:15、16、17、18、19、20、21和22。
[0189] 在某些另外的实施方案中，通过将本发明的抗犬NGF抗体与聚乙二醇(PEG)反应使其
聚乙二醇化(PEGylated)。
[0190] 在某些实施方案中，可以通过选择影响(a)取代区域中多肽主链的结构例如，
片层或螺旋构象；(b)靶位点的分子的电荷或疏水性；或者(c)侧链的大部分来完成抗体生物学特性的修饰。根据侧链性质的相似性可以将氨基酸分组(A.L.Lehninger,in ndBiochemistry,2 Ed.,73-75,Worth Publishers,New York(1975))：(1) 非 极 性 的：
Ala(A)、VaI(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)；(2)无电荷极性的：
GIy(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)；(3)酸性的：Asp(D)、GIu(E)；(4)
碱性的：Lys(K)、Arg(R)、His(H)。可选地，基于共同的侧链的性质，可以将天然存在的残基分组：(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、VaI、Leu、Ile；(2)中性亲水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、GIn;(3)酸性的：Asp、GIu；(4)碱性的：His、Lys、Arg；(5)影响链方向的残基：GIy、Pro；(6)芳香的：Trp、Tyr、Phe。非保守取代将使得这些类之一的一种取代为另一种。还可以将这类取代的残基引入到保守取代位点或者引入到剩余的（例如，非保守的）位点。
[0191] 在各种另外的方面，本发明延及包含连接至分子伴侣的本发明的抗犬NGF抗体或其抗原结合部分的免疫缀合物。在某些实施方案中，这样的抗体-伴侣分子缀合物是通过化学连接体的方式缀合的，例如肽连接体、肼连接体或二硫化物连接体。在某些实施方案中，偶联伴侣是效应分子、标记、药物或载体分子。将本发明的抗体与肽基和非肽基偶联伴侣偶联的合适技术是本领域技术人员已知的。合适的标记的实例包括可检测标记例如
放射性标记，或酶标记例如辣根过
氧化物酶，或化学部分例如生物素。可选地，标记可以是功能标记，例如蓖麻毒素或能够在抗体结合位点将前药(prodrugs)转化为活性药物的前药(pro-drugs)。
[0192] 在各种另外的方面，本发明延及编码本发明的犬源化抗体、抗体片段和结合成员的多核苷酸，特别是分离的多核苷酸。如本文所限定的，“多核苷酸”包括任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的RNA或DNA，或者修饰的RNA或DNA，包括但不限于单链和双链RNA以及单链和双链区的混合物的RNA。本发明的多核苷酸，例如编码本发明的多肽的多核甘酸，包括其等位基因变体和/或它们的补体，其包括在中等或严格条件下与这类核苷酸序列杂交的多核苷酸。
[0193] 本发明进一步延及基于本发明的犬NGF抗体的抗
体模拟物，例如域抗体、纳米抗体、单抗体(unibody)、万能抗体(versabody)以及duocalin。很多抗体模拟技术是本领域技术人员已知的。例如，所谓的域抗体(Domantis,UK)是抗体的小的功能结合单元，其对应于人抗体轻链或重链的可变区。用于产生这样的域抗体的说明可以在美国专利第6291158号、美国专利第6582915号和美国专利第6593081号中找到。纳米抗体是抗体来源的治疗蛋白，其含有骆驼(camelids)中发现的天然存在的重链抗体的结构特性和功能特性。单抗体是进一步的抗体片段技术，以除去IgG4抗体的铰链区为
基础。铰链区的缺失导致大小大约为传统IgG4抗体的一半且具有单价结合区的分子。单抗体保留了IgG4抗体的惰性特性，因此不引起免疫反应。
[0194] 而且，结合分子包括亲和体分子(US专利5,831,012)、DARPins(设计的锚定重复蛋白)(国际PCT专利申请公开WO02/20565)和anticalins(US专利7,250,297和WO99/16873)。万能抗体是另一种抗体模拟技术。万能抗体(Amunix,US专利2007/0191272)是3-5kDa的称为微蛋白的小蛋白，，其半胱氨酸残基大于15%，这些残基形成取代蛋白质通常显示的疏水核心的高
密度二硫键
支架。
[0195] Avimer是另一种抗体模拟物。Avimer起源于人血清蛋白家族的重组。它们是由调控结合结构域组成的单一蛋白链，每一结合结构域经设计结合特定的靶位点。Avimer能同时结合单蛋白靶标上的位点和/或多蛋白靶标上的位点。被称为多点连接或亲和力，这种结合机
制模拟体内细胞和分子相互作用的方式，支持拮抗剂和激动剂的产生，并且导致具有多重功能和强活性的药物。根据通过引用并入本文的WO2004/044011和且例如US2005/0053973，可以生产Avimer文库。Avimer文库也可以从Avidia Inc(Mountain View,California,USA)商业获得。
[0196] 抗体的产生
[0197] 可以通过化学合成来完全或部分地产生本发明的抗体和结合成员。例如，可以通过本领域技术人员已知的方法来制备本发明的抗体和结合体成员，例如标准液肽合成或固相肽合成方法。可选地，使用液相肽合成方法或者进一步通过液相、固相和溶
液化学的组合可以在溶液中制备抗体和结合成员。
[0198] 本发明进一步延及通过在合适的表达系统中表达编码含有本发明抗体的至少一个氨基酸的核酸来产生本发明的抗体或结合体，使得可以编码期望的肽或多肽。例如，可以表达编码氨基酸轻链的核酸和编码氨基酸重链的第二核酸以提供本发明的抗体。
[0199] 因此，在本发明的某些另外的方面，提供了编码形成本发明的抗体或结合成员的氨基酸序列的核酸。
[0200] 通常，可以以分离的或纯化的形式提供编码形成本发明的抗体或结合成员的氨基酸序列的核酸，或者以基本上没有可以与其天然联系的材料的形式，除了一个或多个调控序列之外，提供编码形成本发明的抗体或结合成员的氨基酸序列的核酸。表达本发明的抗体或结合成员的核酸可以是完全或部分合成的，并且其可以包括但不限于DNA、cDNA和RNA。
[0201] 熟练技术人员可以利用本领域技术人员熟知的方法容易地制备编码本发明的抗体或结合体的核酸序列，例如Sambrook et al.（Molecular Cloning”,A laboratory manual(分子克隆:实验室手册),cold Spring Harbor Laboratory Press,Volumes1-3,2001(ISBN-0879695773)，）和Ausubel et al.（Short Protocols in Molecular Biology(分th
子生物学中的小方法).John Wiley and Sons,4 Edition,1999(ISBN–0471250929)）中描述的方法。所述技术包括(i)使用
聚合酶链反应(PCR)扩增核酸样品，(ii)化学合成；
或(iii)制备cDNA序列。可以以本领域技术人员已知的任何合适的方式合成和使用编码本发明的抗体或结合成员的DNA，包括对编码DNA取样、确定待表达的部分的任一侧的合适的限制酶识别位点和从DNA切离该部分。然后将切离的部分可操作地连接至合适的启动子并在合适的表达系统中表达，例如可商购获得的表达系统。可选地，可以通过使用合适的PCR引物扩增DNA的相关部分。可以通过定点突变对DNA序列进行修饰。
[0202] 可以以含有如上所述的至少一个核酸的质粒、载体、转录盒或表达盒形式的构建体，提供编码本发明的抗体或结合成员的核酸序列。构建体可以包含在包含一个或多个如上的构建体的重组宿主细胞内。可以通过在合适的条件下培养含有合适的核酸序列的重组宿主细胞来便利地实现表达。表达后，可以使用任何合适的方法将抗体或抗体片段分离和/或纯化，然后视情况使用。
[0203] 用于在各种不同的宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是熟知的。合适的宿主细胞包括细菌、
哺乳动物细胞、
酵母、昆虫和杆状病毒系统。本领域用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、海拉细胞(HeLa cells)、仓鼠崽肾细胞和NSO小鼠骨髓瘤细胞。普通的优选细菌宿主是E.coli.。在原核细胞例如E.coli.中表达抗体和抗体片段，在本领域中被良好地建立。作为产生结合成员的选项，在培养的真核细胞中表达对本领域技术人员而言也是可用的。
[0204] 用于生产抗体的常用技术是本领域人员熟知的，这样的方法讨论于例如Kohler and Milstein(1975，Nature256:495-497)、美 国 专 利 第 4,376,110 号、Harlow and Lane,Antibodies:a Laboratory Manual(抗体：实验室手册)，1988，Cold Spring Harbor)中。用于制备重组抗体分子的方法在上述文献中也有描述，并且在例如欧洲专利0,368,684中也有描述。
[0205] 在本发明的某些实施方案中，使用包含编码抗体或结合成员的重链可变结构域和/或轻链可变结构域的插入物的重组核酸。按照定义，这样的核酸包含编码单链核酸、由所述编码核酸和由其互补核酸组成的双链核酸或者这些互补（单链）核酸本身。
[0206] 而且，编码抗体的重链可变结构域和/或轻链可变结构域的核酸可以是酶促或化学合成的具有编码用于天然存在的重链可变结构域和/或用于轻链可变结构域或其突变体的真实序列的核酸。
[0207] 本发明的抗体不但通过重组直接产生而且可以作为与异源多肽的融合多肽产生，异源多肽优选为信号序列或在成熟蛋白或多肽的N末端具有特异性切割位点的其他多肽。所选的异源信号序列优选为可被宿主细胞识别和加工的（即被信号肽酶切割）序列。对于不识别和加工天然抗体信号序列的原核宿主细胞，该信号序列被选自例如碱性
磷酸酶、青霉素酶、lpp(复合天然氨基酸)或热稳定肠毒素II前导序列(heat-stable enterotoxin II leaders)的原核信号序列取代。
[0208] 当用于提及本发明的犬源化抗体或由其衍生的结合成员或编码其的多肽时，术语“分离的”指所述抗体、结合成员或核酸（多核苷酸）以分离的和/或纯化的形式提供的状态，也就是说将它们从其天生环境中隔离、分离或纯化，并且它们以基本纯或均质的形式提供，或者在有核酸或没有或基本上没有除了编码具有所需功能的多肽的序列外的起源的核酸或基因的情况下提供。因此，这类分离的抗体、结合成员和分离的核酸将没有或基本上没有与其天然联系的材料，例如当这些制备是在体外或体内通过重组DNA技术进行时，在它们的天生环境或制备环境（例如细胞培养物）中找到的其他多肽或核酸。
[0209] 抗体、结合成员和核酸可以与稀释剂或佐剂一起配制并且实际上其仍可以视为以分离的形式提供。例如，如果用于在
免疫测定中
覆盖微量滴定板，可以将抗体和结合成员与明胶或其他载体混合，或者当用于诊断或治疗时，将抗体和结合成员与药学上可接受的载体或稀释剂混合。可以自然地或通过异源真核细胞（例如，CHO或NSO细胞）使抗体或结合成员糖基化，或者抗体或结合成员（例如，如果通过在原核细胞中表达来生产）也可以不被糖基化（非糖基化）。
[0210] 包含抗犬NGF犬源化抗体分子的异源制剂也构成本发明的一部分。例如，这样的制剂可以是具有全长重链的抗体和具有缺少C端赖氨酸的重链的抗体和具有不同糖基化程度的抗体和/或具有衍生氨基酸（例如N端谷氨酸环化以形成焦谷氨酸残基）的抗体的混合物。
[0211] 抗体的纯化
[0212] 犬抗NGF单克隆抗体(MAbs)同种型A、B、C和D是等效的。犬IgG同种型A和D可以优选用于本发明中，由于这些同种型期望可不与补体结合。然而，这些同种型并不结合葡萄球菌蛋白A或链球菌蛋白G，并且因此其不能使用这些常规工具来纯化。本发明的发明人确定了可以用于纯化同种型A和/或D的两种可选方法。第一种方法包括阴离子交换层析、疏水作用层析和尺寸排阻层析的组合。第二种方法包括captoadhere亲和色谱和阴离子交换层析的组合。
[0213] 药物组合物
[0214] 通常可以将本发明的药物组合物制备成液体制剂、
冻干制剂，可以作为液体或气雾制剂重构的冻干制剂。在某些实施方案中，制剂中抗体的浓度为约0.5mg/ml至约250mg/ml，约0.5mg/ml至约45mg/ml，约0.5mg/ml至约100mg/ml，约100mg/ml至约200mg/ml，或者约50mg/ml至约250mg/ml。
[0215] 在某些实施方案中，制剂还包含缓冲剂。通常，制剂的pH为约pH5.5至约pH6.5。在某些实施方案中，缓冲剂可以包含约4mM至约60mM的组氨酸缓冲剂，约5mM至约25mM的
琥珀酸盐缓冲剂，或者约5mM至25mM的
醋酸盐缓冲剂。在某些实施方案中，缓冲剂包含浓度为约10mM至300mM、典型地为约125mM的
氯化钠，和浓度为约5mM至50mM、典型地为约
25mM的
柠檬酸钠。在某些实施方案中，制剂还可以包含浓度为大于0%至约0.2%的
表面活性剂。在某些实施方案中，表面活性剂选自由以下组成的组，但不限于：聚山梨醇酯-20、聚山梨醇酯-40、聚山梨醇酯-60、聚山梨醇酯-65、聚山梨醇酯-80、聚山梨醇酯-85以及其组合。在优选的实施方案中，表面活性剂是聚山梨醇酯-20并且可以进一步包含浓度为125mM的氯化钠和浓度为25mM的柠檬酸钠。
[0216] 施用
[0217] 本发明的抗体或结合成员可以单独施用，但是优选作为药物组合物施用，药物组合物通常将包含根据既定的给药途径选择的合适的药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。合适的药学载体包括水、甘油、
乙醇等。
[0218] 可以将本发明的单克隆抗体或结合成员通过任何合适的途径施用至需要治疗的患病犬中。通常，可以将组合物通过注射或输液肠道外给药。用于肠道外给药的优选的实例包括但不限于：静脉内、心脏内、动脉内、腹膜内、肌肉内、腔内、皮下、跨粘膜、吸入或经
皮肤给药。给药途径还可以包括局部给药和
肠内给药，例如粘膜（包括
肺粘膜）给药、口服给药、鼻部给药、直肠给药。
[0219] 在组合物作为可注射组合物递送的实施方案中，例如静脉内、皮肤内或皮下的应用中，活性成分可以是无热原的并且具有合适的pH、等渗性和
稳定性的胃肠外可接受的水溶液形式。本领域技术相关人员完全能使
用例如等渗媒介例如氯化钠注射液、林格氏注射液(Ringer’s injection)或乳酸林格氏注射液(Lactated Ringer’s injection)制备合适的溶液。根据需要，可以包括
防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗
氧化剂和/或其他添加剂。
[0220] 还可以通过微球、脂质体、其他微粒物递送系统或置于某些组织包括血液中的持续释放剂来施用组合物。
[0221] 以上所述的方法和方案(protocols)以及根据本发明可以使用的其他方法和方案的实例可以在Remington’s Pharmaceutical Sciences（霍明顿药物学，第18版,Gennaro,A.R.,Lippincott Williams&Wilkins）、Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems（药物剂型和药物递送系统，第20版ISBN0-912734-04-3）和Ansel,H.C.et al.（第7版ISBN0-683305-72-7）中找到，其全部内容通过引用并入本文。
[0222] 通常将治疗有效量的本发明的抗体和组合物施用至个体，该治疗有效量是对施用了该组合物的个体足以显示益处的量。施用的实际剂量、给药
频率(rate)和时长将根据被治疗的病症的性质和严重性、被治疗的病患的诸如年龄、性别和体重的因素以及使用的途径来确定。应当进一步考虑组合物的性质，例如结合活性和或体内血浆寿命、制剂中抗体或结合体的浓度，以及递送的途径、位置和频率。
[0223] 剂量给药方案可以包括本发明的抗体或组合物的单一给药，或者抗体或组合物的多剂量给药。抗体或含有抗体的组合物可以进一步顺序地或单独地与其他治疗剂和药物施用，所述其他疗法和药物用于治疗施用本发明的抗体或结合体以治疗的病症。
[0224] 可以施用至个体的剂量给药方案的实例选自但不限于：1μg/kg/天至20mg/kg/天、1μg/kg/天至10mg/kg/天、10μg/kg/天至1mg/kg/天。在某些实施方案中，剂量是这样的，其使得获得血浆浓度为1μg/ml至100μg/ml的抗体。然而，所施用的组合物的实际剂量、频率和时长将取决于被治疗的病症的性质和严重性。治疗的药方例如剂量决定等最终属于兽医从业人员和其他兽医的责任并听凭他们处理，通常考虑待治疗的病症、个别患者的病症、递送的位置、给药方法和从业人员已知的其他因素。
[0225] 定义
[0226] 除非另有限定，本文使用的所有技术术语和科学术语具有本领域技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清楚，然而，在发生歧义的情况下，本文给出的定义优先于任何字典或外在的定义。
[0227] 在全文中，除非上下文另有要求，术语“包含(comprise)”或“包括(include)”或其他变体例如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”、“包括(includes)”或“包括(including)”应理解为表示包含所述整数或整数组，但并不排除任何其他的整数或整数组。
[0228] 如本文所使用的，除非文中明确要求，诸如“a(一个/种)”、“an(一个/种)”以及“the(该/所述)”的术语包括单数个或复数个参照物。因此，例如，提到“一种活性剂(an active agent)”或“一种药学活性剂”包括一种单一的活性剂和两种或以上不同的活性剂组合，而提到“载体”，其包括两种或以上载体以及单一载体的混合物等。而且，除非文中另有要求，单数的术语包括复数并且复数的术语也包括单数。
[0229] 如本文所限定的，术语“疼痛”指与实际的或潜在的组织损伤相关的或按照这样的损伤描述的不愉快的感觉和情感体验。
[0230] 关于手术或手术后疼痛，US动物福利法(Animal Welfare Act2002.AWAregulations,CFR,Title9(Animals and Animal Products),Chapter1(Animal and Plant Health Inspection Service,Department of Agriculture).Subchapter A(Animal Welfare),Parts1–4)将疼痛的过程规定为合理地预期将引起应用该过程的人类超过轻微或短暂疼痛或悲痛的任何过程，也就是说，超过通过注射或其他小的手术引起的疼痛。因此，如果犬经历疼痛的外科手术，则该动物应该施用术后镇痛剂。
[0231] 在另外的情况下，由于有关的医疗状况例如风湿性关节炎、骨关节炎、炎症或癌或恶性病症，犬可能经历严重的疼痛或慢性痛。
[0232] 术语“伤害性感受”指伤害刺激的感觉。本文限定的“神经病理性疼痛”（也被称为神经痛）指来自有神经信号问题的疼痛。其可能由于影响躯体感觉系统的损害或疾病而发生。存在数种神经疼痛的原因并且其可能与自发发生的、被称为感觉迟钝的感觉异常有关。可选地，其可能与触摸痛有关，当正常不发生疼痛的
接触或刺激使得疼痛发生或转坏时，将引起触摸痛。例如，如果有三叉神经痛，则轻微地触碰脸将引发疼痛，或者如果有糖尿病性神经病，则床上用品的压迫可能引发疼痛。神经病理性疼痛也可以由触摸痛造成，其中当正常不发生疼痛的接触或刺激使得疼痛发生或转坏时，将引起疼痛。例如，如果个体患有三叉神经痛，则轻微地触碰脸将引发疼痛。与痛觉有关的神经病理性疼痛指正常只引起轻微的不适的刺激或接触所产生的严重的疼痛，而感觉异常指，即使当没有任何东西与引起疼痛的区域接触时发生的不舒服的或痛苦的感觉，例如四肢发麻。神经病理性疼痛的其他形式包括瘙痒或发痒，其可以与皮肤中的过敏反应或炎症反应以及由组织损伤和修复过程产生的炎性疼痛有关。
[0233] 如本文所限定的，术语“NGF中和抗体”或类似的术语描述了能够中和NGF的生物活化和信号传导的抗体。中和抗体也可以称为拮抗性抗体或阻断抗体，特别是，其优选选择性地结合NGF并抑制NGF的一种或多种生物活性。例如，中和抗体可以抑制NGF与其靶配体的结合，例如细胞膜结合TrkA或p75受体。
[0234] 如本文所使用的，术语“生物活性”指分子的任何一种或多种内在的生物学特性（不管是体内发现天然存在的还是通过重组方法给予或激活的）。生物学特性包括但不限于受体结合和/或激活、诱导细胞信号传导或
细胞增殖、抑制细胞生长、诱导细胞因子产生、诱导细胞凋亡和酶活性。
[0235] 如本文使用的，术语“互补性决定区(CDR)”指一起限定天然免疫球蛋白结合位点的天然Fv区的结合亲和性和特异性的氨基酸序列，如同Kabat et al.(Kabat,E.A.,Wu,T.T.,Perry,H.,Gottesman,K.and Foeller,C.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition.NIH Publication No.91-3242，免疫学研究的蛋白质的序列)中所述的。如本文所使用的，术语“框架区(FR)”指插入在CDR之间的氨基酸序列。抗体的这些部分用来将CDR保持在合适的方向（允许CDR结合抗原）。
[0236] 如本文所使用的，术语“恒定区(CR)”指抗体分子赋予效应子功能的部分。在本发明中，恒定区通常指犬的恒定区，也就是说，主题犬源化抗体的恒定区来源于犬免疫球蛋白。重链恒定区可以选自四种同种型A、B、C或D中的任何一种。
[0237] 本文所用的术语“嵌合抗体”指含有衍生自两种不同抗体的序列的抗体，所述不同抗体通常为不同物种的。最典型的是，嵌合抗体包含衍生自供体物种且特异性结合靶表位的可变结构域和从施用该抗体的靶物种获得的抗体衍生的恒定结构域。
[0238] 本文所用的术语“免疫原性”指当施用至接受者时引起免疫反应（体液的或细胞的）的寻靶蛋白或治疗部分的能力的估量。本发明涉及主题犬源化抗体的免疫原性。优选本发明的抗体不具有免疫原性，也就是说，当施用至犬时，将不会产生针对它们的中和抗体，并且进一步，没有通过抗体的Fc区介导的效应子功能。
[0239] 本文所用的术语“同一性”或“序列同一性”指在比对的序列中任何特定的氨基酸残基位置处，氨基酸残基在比对的序列间是相同的。本文所用的术语“相似性”或“序列相似性”表示，在比对的序列的任何特定的位置，氨基酸残基在这些序列之间具有相似的类型。例如，亮氨酸可以被异亮氨酸或缬氨酸取代。这可以被称为保守取代。优选地，当本发明的氨基酸序列通过其中包含的任一氨基酸的保守取代来修饰时，与未修饰的抗体相比，这些变化对所产生的抗体的结合特异性或功能活性没有影响。
[0240] 本发明的（天然）多肽及其功能衍生物的序列同一性涉及，在比对序列并且在必要时引入缺口以实现最大百分比同源性且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分之后，候选序列中与对应的天然多肽的残基相同的氨基酸残基的百分比。不管是N端或C端的延长，还是插入，都不应该解释为降低序列同一性或同源性。用于实施两个或以上氨基酸序列的比对和用于确定它们的序列同一性或同源性的方法和
计算机程序，是本领域技术人员熟知的。例如，使用
算法例如BLAST(Altschul et al.1990)、FASTA(Pearson&Lipman1988)或Smith-Waterman algorithm(史密斯-沃特曼算法，Smith&Waterman1981)可以容易地计算2个氨基酸序列的同一性或相似性的百分比。
[0241] 如本文所用的，提到与第二氨基酸残基具有最高同源性的氨基酸残基，指与第二氨基酸残基共有最多的特征和特性的氨基酸残基。在确定氨基酸残基与第二氨基酸残基是否具有最高同源性时，评定通常可以由各种因素组成，例如但不限于电荷、极性、疏水性、侧臂
质量和侧臂尺寸。
[0242] 术语“对应的位置”在本文中用来表示存在于第二序列的与第一序列中的特定氨基酸对应的某位置的氨基酸残基，，且该术语用于表示，当比对两条序列以允许两条序列之间的最大序列同一性时，与第一序列的位置相同的第二序列中的位置。对应位置处的氨基酸残基具有相同的Kabat编号。
[0243] 本文所用的术语“基本上由…组成”或“基本上由…组成”表示，多肽可以含有除所描述的以外的其他要素或元素，条件是这样的要素或元素并不会实质地影响抗体或抗体片段特异性结合犬NGF的能力。也就是说，包含多肽的抗体或抗体片段可以具有不干扰抗体或抗体片段结合犬NGF的能力和不抵消犬NGF功能活性的能力的其他要素或元素。可以将这样的修饰引入氨基酸序列中，从而降低抗体的免疫原性。例如，基本上由特定序列组成的多肽在该序列的一端或两端可以含有一个、两个、三个、四个、五个或以上额外缺失或取代的氨基酸，条件是这些氨基酸并不干扰、抑制、阻断或中断抗体或片段结合犬NGF和隔离其生物功能的作用。同样，有助于抵消本发明的抗体的犬NGF的多肽分子可以被一个或多个官能团化学修饰，条件是这类官能团不干扰(interfere)抗体或抗体片段结合犬NGF和抵消其功能的能力。
[0244] 本文所用的术语“有效量”或“治疗有效量”指抑制犬NGF结合p75和/或TrkA受体所需的本发明的药物、结合化合物、小分子、融合蛋白或药物筛选化合物(peptidomimetic)的量。
[0245] 本文中术语“多肽”、“肽”或“蛋白”可交换地用来表示通过相邻残基的α氨基和羰基之间的肽键连接的线性氨基酸残基。氨基酸残基通常是天然的“L”同分异构形式。然而，只要通过多肽保留期望的功能特性，“D”同分异构形式的残基可以取代任何L-氨基酸残基。
[0246] 如本文所限定的，“抗体”包含特异性结合目的靶抗原的抗原-结合蛋白，所述靶抗原具有可以被重组制备或通过免疫球蛋白基因编码的一个或多个多肽，在本文中该靶抗原是犬神经生长因子。术语“抗体”包含单克隆抗体和嵌合抗体，特别是犬源化抗体，并且进一步包含多克隆抗体或任何类或子类的抗体。“抗体”进一步延及杂合抗体、双特异性抗体、异种抗体以及其保留抗原结合的功能片段。
[0247] 短语“特异性结合”指抗体与存在于异源蛋白群中的特定蛋白或靶的结合。因此，当存在于免疫测定条件时，抗体结合特定蛋白而并不大量地结合样品中存在的其他蛋白，在本文中该特定蛋白指犬NGF。
[0248] 如本文所限定的，“犬”还可以指“狗”。犬可以被归类为学名家犬(Canis familiaris domesticus)或澳洲野犬(Canis lupus dingo)的亚种。犬包括任何种类的狗，并且包括野生品种和宠物品种，宠物品种还被称为伴侣动物。
[0249] 现将参考以下
实施例描述本发明，所提供的实施例用于说明的目的并非意图用于限制本发明。除非另有指明，通常根据本领域熟知的常规方法和如本发明引用和讨论的各种一般文献和详细文献中所描述的方法来实施本发明的方法和技术。实施例
[0250] 实施例1-抗体的生产
[0251] 通过将犬可变结构域序列与C末端犬恒定重链或恒定轻链序列组合来产生完整的抗体序列。描述了犬免疫系统中的四种不同的免疫球蛋白γ(IgG)重链恒定结构域同型，以及单一的κ和λ恒定结构域序列(the canine immune system,Tang L.et al.2001.Veterinary Immunology and Immunopathology,80.259-270)。
[0252] 将犬源化αD11VH结构域与四种IgG重链同种型A、B、C和D的每一种组合，并且将犬源化αD11VL结构域与犬κ轻链恒定结构域组合。全长成熟抗体链(caN)的序列显示于SEQ ID No:5(VL1和犬κ恒定结构域)、6(VH1和重链同种型A)、7(VH1和重链同种型B)、8(VH1和重链同种型C)和9(VH1和重链同种型D)。变体抗体(caN2)轻链的序列显示于SEQ ID No:10(轻链变体(VL2)和犬κ恒定结构域)。变体抗体(caN2)重链的氨基酸序列在SEQ ID NO:11(HCA变体–VH2和重链同种型A)、SEQ ID NO:12(HCB变体–VH2和重链同种型B)、SEQ ID NO:13(HCC变体–VH2和重链同种型C)和SEQ ID NO:14(HCD变体–VH2和重链同种型D)中给出。
[0253] 通过密码子的优选和完整化学基因合成并克隆到哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1+中，将组合的氨基酸序列转化为哺乳动物细胞中可表达的形式。
[0254] 在实施例2中，将得到的cDNA
转染到CHO细胞，并且分析来自具有序列SEQ ID NO:6-9的重链的上清液。在实施例11中，纯化具有轻链序列SEQ ID NO:10和重链序列SEQ ID NO:11的抗体。
[0255] 实施例2-确定抗体与鼠NGF和犬NGF的结合
[0256] 将犬源化重链cDNA和轻链cDNA的组合物转染到CHO细胞中，收集上清液并以ELISA模式使其与犬NGF或鼠NGF反应。在孵育和清洗步骤后，通过与连接辣根过氧化物酶(HRP)的山羊-抗犬IgG特异性多克隆抗体的
反应性来检测结合的犬抗体并使用TMB使其显影。在450nm下测量所得的产物的光密度，并将其与来自模拟空白载体转染的上清液（图1中表示为“模拟”）的光密度进行比较。
[0257] 图1的图表示出该结果。示出四种犬源化抗体与小鼠NGF的结合。这些抗体的每一种都具有相同的轻链(caN-kLC-1)，即为包含犬κ恒定结构域的轻链。每一种抗体都具有不同的重链恒定结构域。因此，将一种特定的重链可变结构域与四种不同的恒定结构域(caN-HCA、caN-HCB、caN-HCC或caN-HCD)之一组合。在图表的第二部分，示出由caN-kLC-1轻链和caN-HCB恒定链组成的单个抗体与犬NGF的结合。
[0258] 实施例3-犬源化抗体的纯化
[0259] 使用蛋白A柱纯化从实施例2获得的上清液，通过SDS-PAGE使其分开，并且测试其与抗犬IgG多克隆抗体HRP的反应活性。该多克隆抗体优先识别重链。
[0260] 图2A-D示出该结果。说明：A-HCA是包含caN-HCA重链和caN-kLC轻链的犬源化抗体；HCB是包含caN-HCB重链和caN-kLC轻链的犬源化抗体；C–HCC是包含caN-HCC重链和caN-kLC轻链的犬源化抗体；D–HCD是包含caN-HCA重链和caN-kLC轻链的犬源化抗体。在图2A-2D中，L指加载，W指洗涤，P指峰级分，以及F指流通(flow through)。
[0261] 由此可知，蛋白A优先结合HCB同种型（即包含caN-HCB重链的犬源化抗体），但并不保留重要的材料并通过HCA、HCC和HCD同种型将其从蛋白A上洗掉。
[0262] 实施例4-使用SDS-PAGE分析纯化的犬源化抗体
[0263] 通过SDS-PAGE将实施例2（图2A-2D）中示出的来自凝胶的峰值的代表级分，并且用考
马斯蓝
染色。
[0264] 图3示出的凝胶显示了该结果。该凝胶显示，重链和轻链清晰可见。泳道的顺序从左起为：泳道1–尺寸标准,泳道2-HCA caN-HCA+caN-kLC1,泳道3-HCBcaN-HCB+caN-kLC1,泳道4-HCCcaN-HCC+caN-kLC1,泳道5-HCD caN-HCA+caN-kLC。
[0265] 实施例5-犬源化抗体抑制NGF诱导的TF-1细胞增殖
[0266] 在存在0.3ng/mL NGF的情况下，孵育来自实施例2的连续稀释的CHO转染上清液（“拮抗剂”）和TF-1细胞。
[0267] 图4示出该结果。在计算的0.75-1.5ng/mL的单克隆抗体(MAb)时，观察到50%的抑制。
[0268] 实施例6-抗原捕获犬源化抗体诱导的补体沉积
[0269] 用涂有0.1ng/mL NGF的板孵育实施例2的CHO
细胞转染上清液，以捕获抗体。洗涤这些板然后用人血清孵育，并且通过抗人C1q多克隆抗体HRP的结合测量结合的补体C1q，并如上述进行显影。
[0270] 补体结合方法
[0271] 用100μl/孔的5μg/ml小鼠NGF涂覆板，并用5%BSA/PBS封阻该板。于室温下用细胞培养物上清液将涂覆的孔孵育1小时，并且将其在PBS/1%BSA(100μl/孔)中稀释，其中该细胞培养物上清液含有重组的犬源化抗NGF IgG。洗涤该板，并在室温下用在含有0.5mMMgCl2、2mM CaCl2、0.05%吐温-20、0.1%明胶和0.5%BSA的弗罗那缓冲盐水中1/100稀释的100μl/孔的人血清孵育该板1小时。洗涤后，用100μl的在PBS/1%BSA中1/800稀释的
绵羊抗-C1q-HRP(抗体)孵育该板。洗涤后，通过加入100l TMB底物(Thermo Scientifi)使该板显影。通过加入100μl的2N H2SO4停止显影并在450nm处读出吸光度。
[0272] 图5的图表示出该结果。这些结果显示了C1q与固定的犬源化HCB和HCC型抗体的结合，且没有C1q与犬源化的HCA和HCD型抗体结合。因而，该结果出乎意料地表明，不同的犬衍生的重链显示出不同的补体结合和激活特征，并且出乎意料地证明，具有HCA和HCD型重链的犬源化抗体优选用于抵消犬NGF。由于NGF是可溶的介质，因此鉴别出了不介导补体结合的犬衍生重链，是特别有利的发现。
[0273] 实施例7-抗犬NGF单克隆抗体与NGF结合的比较
[0274] 使用框架VL1和VH1(SEQ ID NO:1和2)相比可选的框架VL2和VH2(SEQ ID NO:3和4)来进行抗犬NGF单克隆抗体与NGF结合的比较。合成编码SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11描述的轻链和重链的DNA，并将其克隆到分泌信号序列肽的pcDNA3.1+下游。使该DNA共转染CHO细胞，并且通过ELISA比较该上清液和来自SEQ ID NO:5加上SEQ ID NO:7共表达的CHO上清液与小鼠NGF的结合。
[0275] 图13A示出该结果。泳道A-D示出来自SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7的上清液（分别是：未稀释的、1/10、1/100、1/1000）。泳道E-H示出来自SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11的上清液（分别是：未稀释的、1/10、1/100、1/1000）。泳道I示出未稀释的阴性对照上清液。
[0276] 实施例8-NGF捕获的犬源化抗体诱导的补体结合
[0277] 使用C1q ELISA测定（使用图5描述的方法）测试来自实施例7的CHO细胞转染上清液的募集补体的能力。
[0278] 图13B示出该结果。尽管在图板A中观察到与NGF的结合和与MAb(SEQ ID5+7)中HCB型重链的结合是等同的，但是VL2(SEQ ID10中)和VH2框架加上HCA型恒定结构域(SEQ ID11)的组合在募集补体方面是不活跃的。采用稀释系列4、2和1ug/ml来测试MAbs。C是阴性对照。
[0279] 实施例9-将具有HCB和HCC重链同种型的抗犬NGF单克隆抗体的N糖基化(N-glycosylated)变体和非糖基化(aglycosylated)变体与NGF结合比较
[0280] 将具 有HCB和HCC重 链同 种型 的抗 犬NGF单克 隆抗 体的N 糖基 化(N-glycosylated)变体和非糖基化(aglycosylated)变体与NGF的结合进行比较。使编码SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7(HCB)、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:16(HCB*)、SEQ ID NO:5和EQ ID NO:8(HCC)、或SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:17(HCC*)描述的轻链和重链对的表达载体共转染到CHO细胞，并通过与小鼠NGF的结合ELISA比较上清液。
[0281] 图14A示出该结果。白色框表示未稀释的上清液，阴影框表示1/100的稀释液，并且C表示未稀释的阴性对照上清液。观察到与NGF等同结合。
[0282] 实施例10-NGF捕获的犬源化抗体诱导的补体沉积
[0283] 使用C1qELISA测定（使用图5描述的方法），测试来自实施例9的CHO细胞转染上清液募集补体的能力。
[0284] 图14B示出该结果。通过除去B型重链(HCB*)中的N-连接糖基化位点，废除募集补体C1q的能力，并且通过C型重链(HCC*)中的类似突变削弱该能力。
[0285] 因此，本文出乎意料地证明，当本发明的抗体具有HCA或HCD亚型的犬衍生的重链时，抗体与犬NGF的结合并不引起补体激活或其他下游的效应子功能，例如ADCC。因此，在通过防止犬NGF与膜结合TrkA或p75受体结合抵消犬NGF的生物功能活性时，所述抗体抑制相关的下游细胞内的信号级联。而且，由于NGF表达频繁地发生在神经等的附近，本发明的NGF抵消或中和抗体，其具有HCA或HCD亚型的犬衍生的重链，能够在没有募集更宽泛的免疫反应的情况下隔绝犬NGF的生物活性。这样的功能特性是意想不到的，也是非常期望的。
[0286] 实施例11-在CHO细胞中表达后抗NGF单克隆抗体的纯化
[0287] 由于HCA和HCO亚型的犬抗NGF单克隆抗体期望地不与补体（图5）结合，但却与葡萄球菌蛋白A（图2）较结合，因此研发了可选的纯化方法。在CHO细胞中表达衍生自表达SEQ ID NO:10(轻链变体(VL2)和犬κ恒定结构域)和SEQ ID NO:11(HCA变体–VH2和重链同种型A)的表达载体的抗犬NGF单克隆抗体，并且在大量的实验后发现，通过两种可选的纯化方法可以将犬抗NGF抗体分级为高纯度。
[0288] 在第一种方法中，通过阴离子交换层析、疏水作用层析和尺寸排阻层析（方法I-图15A和图15B）来纯化抗犬NGF单克隆抗体。在第二种方法中，可以通过Captoadhere亲和层析之后通过阴离子交换层析来纯化抗NGF抗体（方法II-图15C和图15D）。
[0289] 通过这两种方法中的任一种纯化的抗NGF单克隆抗体的主峰对应于约150kDa的分子量。利用SDS-PAGE和ELISA（图16）进行的比较表明，方法I和方法II产生了具有相似纯度和生物活性的抗体制剂。采用TF-1NGF中和测定（图4中描述）测试通过这些方法产生的纯化的抗NGF单克隆抗体，并且证明其具有高效能(IC5013pM抗NGF中和的37pM NGF；未示出)。
[0290] 实施例12-抗犬NGF单克隆个抗体能够通过静脉注射安全地施用至犬并且不引起发热
[0291] 在CHO细胞中表达衍生自表达SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11(犬HCA型重链)的表达载体的抗犬NGF单克隆抗体，并且通过离子交换层析、疏水作用层析和尺寸排阻层析的组合（方法I，图15A和图15B）使其纯化，并且将缓冲液更换为
磷酸盐缓冲液。通过静脉注射以每千克体重2mg将抗体注射入比格犬内，并且由兽医通过目测来评定毒性体征、体重变化、体温变化和血浆生物化学变化。图17示出对体重和温度的测量结果。在所测量的这些或任何血浆生物化学分析物（包括钠、
钾、氯化物、钙、磷酸盐、尿素、肌酸酐、
葡萄糖、胆固醇、胆红素、丙氨酸转氨酶、碱性磷酸酶、
淀粉酶、脂肪酶、总蛋白或
白蛋白：未示出）中没有观察到变化。
[0292] 实施例13-体内抗犬NGF单克隆个抗体的药物动力学表明长血清半衰期和缺乏免疫原性
[0293] 在CHO细胞中表达衍生自表达SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11(犬HCA型重链)的表达载体的抗犬NGF单克隆抗体，并且通过离子交换层析、疏水作用层析和尺寸排阻层析的组合（方法I，图15A和图15B）使其纯化，并且将缓冲液更换为磷酸盐缓冲液。通过静脉注射以每千克体重2mg将抗体注射入比格犬内，在其次的2周内的不同时间采集血浆样品。通过ELISA，使用作为靶的NGF和抗犬多克隆抗体-辣根过氧化物酶第二试剂，评价稀释的血浆样品的抗犬NGF抗体浓度，并如图1显影。图18示出该结果。测得的血浆浓度与二相动力学一致，具有约33小时的组织分布(α)相半衰期和约9天的出奇长的消除(β)相。
[0294] 在100至300小时之间抗犬NGF抗体血浆浓度没有急剧下降，这表明在狗血液中既没有已有的中和抗体导致的重组抗NGF单克隆抗体，注入后也没有生成任何这样的中和抗体。通过比较，在注入后200小时时，狗血液中的抗体中和了基于蛋白的重组人免疫球蛋白(Richter et al,Drug Metabolism and Disposition27:21,1998)。因此，这些结果表明，本发明的抗犬NGF抗体在静脉注射后在体内具有长的血清半衰期（9天），并且随时间的过去，不存在中和注射的抗NGF抗体的已有抗体或新产生的抗体。
[0295] 实施例14-抗犬NGF单克隆个抗体对降低体内炎性疼痛的影响
[0296] 抗体疗法
[0297] 在CHO细胞中表达衍生自表达SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11(犬HCA型重链)的表达载体的抗犬NGF单克隆抗体，并且通过离子交换层析、疏水作用层析和尺寸排阻层析的组合（方法I）使其纯化，并且将缓冲液更换为磷酸盐缓冲液。
[0298] 有炎症的犬模型：
[0299] 在机构伦理委员会（Institutional Ethics Committee，CRL,爱尔兰）的预先批准下进行所有的实验。将
高岭土(kaolin)注入（-1天时）比格犬的一条后腿的垫脚中，从而在约24小时后开始自身化解炎症，这导致狗暂时性跛足。在该模型中，一旦对高岭土的起初始炎性反应减弱，在约1-2周内该狗的跛足程度将稳定地减小，然后全部恢复。
[0300] 通过静脉注射将抗犬NGF单克隆抗体以每千克体重200μg或作为媒介对照的磷酸盐缓冲液注入（0天时）到3只狗的组中。7天后，通过目测评分方法评价狗的跛足程度：0分，没有跛足（全负重）；1分，轻微跛足（非全负重但行走正常）；2分，中等跛足（轻微负重且行走不正常）；3分，严重跛足（无负重）。观察者不了解哪只狗接受了注射。
[0301] 图19示出了该结果。与对照组相比，注射3天后，接受抗NGF单克隆个抗体的狗的跛足评分减小，这表明与仅用媒介相比，抗NGF单克隆抗体具有降低狗的疼痛的效果。延迟的活性与抗犬NGF单克隆个抗体的血浆药物动力学一致，这表明约30小时的慢的组织分布相和垫脚区相对差的血管形成。图19示出的结果表明，本发明的抗犬NGF抗体在降低跛足的同时降低了狗的炎性疼痛。
[0302] 通过引用将本发明提及的所有文献并入本文中。在不背离本发明的范围的情况下，对本发明的实施方案进行各种修饰和变化对本领域技术人员是显而易见的。虽然就具体优选的实施方案进行了描述本发明，但是应该理解，
请求保护的本发明不应该不适当地限制为这些具体的实施方案。事实上，本发明意图涵盖对本领域技术人员显而易见的实施本发明的方式的各种
修改。
