对HSP90-抑制剂的易感性
阅读：614发布：2021-09-16
专利汇可以提供对HSP90-抑制剂的易感性专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本项 发明 涉及一种挑选对HSP90 抑制剂 具有易感性的细胞、组织或者培养细胞的方法。另外还描述了一种测定 哺乳动物 的 肿瘤 细胞或者癌细胞对HSP90抑制剂 治疗 的反应情况的方法。尤其是，本项发明提供了一种体外诊断方法以筛选出那些对HSP90抑制剂具有易感性的患者，其中包括应用可以用于检测KRAS基因中激活性突变的寡核苷酸或者多聚核苷酸。本项发明还涉及对一种癌症的疗效进行检测评估或监测的方法，此类癌症以KRAS基因中至少出现一处激酶激活性突变为特征，也可能但非必须在EGFR和/或者BRAF基因中也至少出现一处激活性突变。此外，还介绍了一种对癌症尤其是具有上述基因突变特征的癌症的疗效进行预测的方法。最后，应用具有上述基因突变特征的(转基因)非人类动物模型或者(转基因)细胞模型对抗癌药物进行筛选和/或者验证，并提供了一套可以实现上述各种检测功能的 试剂 盒 。，下面是对HSP90-抑制剂的易感性专利的具体信息内容。
1.一种可以鉴定出对HSP90抑制剂具有易感性的细胞、组织或是培养的细胞的方法，包括如下步骤：
(a)确定待测细胞、组织或培养细胞是否在KRAS基因中至少有一处激活突变；
(b)挑选出在KRAS基因中至少有一个激活突变的细胞、组织或培养细胞。
2.如权利要求1所述的方法，此外还包括如下步骤：
(i)将上述待测细胞、组织或培养细胞用某种HSP90抑制剂进行处理；
(ii)测定上述经某种HSP90抑制剂处理的待测细胞、组织或培养细胞的存活率。
3.一种测定某种哺乳动物肿瘤细胞或癌细胞对某种HSP90抑制剂处理的响应性的方法，该方法包括测定上述肿瘤细胞中至少一处KRAS基因的激活性突变，该突变预示着此细胞是否会对上述处理发生响应或者具有响应性。
4.如权利要求1至3中任意一项所述的方法，此外还需测定EGFR基因和/或者BRAF
基因中的激活性突变。
5.一种体外鉴别某种HSP90抑制剂的响应者或者对其具有易感性的患者的方法，包括如下步骤：
(a)从疑似患有或者易患某种癌症的患者处获得样品，此种癌症以在KRAS基因中、同时在EGFR基因和/或者BRAF基因中至少有一处激激活性突变为特征；
(b)鉴定上述KRAS基因、以及EGFR基因和/或BRAF基因中的至少一处激激活性突变；
其中，仅仅在KRAS基因中有一个激激活性突变、或者在EGFR基因和/或BRAF基因中也有激激活性突变，将标志着某个响应性患者，或者表示该患者对某种HSP90抑制剂具有敏感性。
6.如权利要求1至5中任意一项所述的方法，其中所说的HSP90抑制剂为格尔德霉素或其某种衍生物。
7.如权利要求6所述的方法，所说的格尔德霉素衍生物为17-AAG或者IPI-504。
8.如权利要求1至5中任意一项所述的方法，其中所说的HSP90抑制剂为NVP-AUY922。
9.如权利要求1至8中任意一项所述的方法，其中所说的KRAS基因突变选自以下一
组突变情况：KRAS_G12C，KRAS_G12R，KRAS_G12D，KRAS_G12A，KRAS_G12S，KRAS_G12V，KRAS_G13D，KRAS_G13S，KRAS_G13C，KRAS_G13V，KRAS_Q61H，KRAS_Q61R，KRAS_Q61P，KRAS_Q61L，KRAS_Q61K，KRAS_Q61E，KRAS_A59T以及KRAS_G12F。
10.如权利要求4至9中任意一项所述的方法，其中所说的EGFR基因突变选自以
下一组突变情况：EGFR_D770_N771＞AGG；EGFR_D770_N771insG；EGFR_D770_N771insG；
EGFR_D770_N771insN；EGFR_E709A；EGFR_E709G；EGFR_E709H；EGFR_E709K；EGFR_E709V；
EGFR_E746_A750del；EGFR_E746_A750del，T751A；EGFR_E746_A750del，V ins；EGFR_E746_T751del，I ins；EGFR_E746_T751del，S752A；EGFR_E746_T751del，S752D；EGFR_E746_T751del，V ins；EGFR_G719A；EGFR_G719C；EGFR_G719S；EGFR_H773_V774insH；EGFR_H773_V774insNPH；EGFR_H773_V774insPH；EGFR_H773 ＞ NPY；EGFR_L747_E749del；EGFR_L747_E749del，A750P；EGFR_L747_S752del；EGFR_L747_S752del，P753S；EGFR_L747_S752del，Q ins；EGFR_L747_T750del，P ins；EGFR_L747_T751del；EGFR_L858R；EGFR_L861Q；EGFR_M766_A767insAI；EGFR_P772_H773insV；EGFR_S752_I759del；EGFR_S768I；EGFR_T790M；
EGFR_V769_D770insASV；EGFR_V769_D770insASV；以及EGFR_V774_C775insHV。
11.如权利要求4至10中任意一项所述的方法，其中所说的BRAF基因突变选自以下一组突变情况：BRAF_D594G，BRAF_D594V，BRAF_F468C，BRAF_F595L，BRAF_G464E，BRAF_G464R，BRAF_G464V，BRAF_G466A，BRAF_G466E，BRAF_G466R，BRAF_G466V，BRAF_G469A，BRAF_G469E，BRAF_G469R，BRAF_G469R，BRAF_G469S，BRAF_G469V，BRAF_G596R，BRAF_K601E，BRAF_K601N，BRAF_L597Q，BRAF_L597R，BRAF_L597S，BRAF_L597V，BRAF_T599I，BRAF_V600E，BRAF_V600K，BRAF_V600L和BRAF_V600R。
12.如权利要求4至11中任意一项所述的方法，其中所说的KRAS基因、以及EGFR基因和/或者BRAF基因的突变可以通过SSP、PCR-RFLP、实时定量PCR、测序、HPLC或质谱基因型鉴定等方法来进行检测。
13.如权利要求5至12中任意一项所述的方法，其中所说的样品取自疑似患有或者易患癌症的患者。
14.一种使用能检测至少一种KRAS基因激活性突变、以及(可有可无地)EGFR或者
BRAF基因激活性突变的寡聚或多聚核苷酸用于对条目6到8中的定义的HSP90抑制剂敏感度进行诊断的用途。
15.应用权利要求14，其中所说的寡聚核苷酸长度大约为15至100个核苷酸。
16.一种监测针对患有上述疾病或者易患上述疾病的患者所进行的抗癌治疗的疗效的方法，此类癌症以在KRAS基因中、同时选择性地在EGFR基因和/或者BRAF基因中至少具有一处激激活性突变为特征；该方法包括如下步骤：
a)在取自上述受治疗者/患者的细胞或者组织样品中，测定KRAS基因的表达或者活性，同时选择性地测定EGFR基因的活性或表达水平、以及/或者BRAF基因的说性或表达水平；
b)将a)步骤中测得的至少一种上述标记基因的活性、与KRAS基因的参考或对照表达水平或者参考或对照活性进行比较，同时选择性地与EGFR基因的参考或对照表达水平以及/或者BRAF基因的参考或对照表达水平进行比较，
在a)步骤中测得的活性或表达水平、与上述参考表达水平或参考活性之间的差异程度标志着针对上述癌症所进行的治疗的疗效。
17.一种预测针对患有上述疾病或者易患上述疾病的患者所进行的抗癌治疗的疗效的方法，此类癌症以在KRAS基因中、同时选择性地在EGFR基因和/或者BRAF基因中至少具有一处激激活性突变为特征；该方法包括如下步骤：
a)在取自上述受治疗者/患者的细胞或者组织样品中，测定KRAS基因、EGFR基因以及/或者BRAF基因中至少一种标记基因的活性或表达水平；
b)将a)步骤中测得的至少一种上述标记基因的活性、与至少一种上述标记基因的参考活性或参考表达水平进行比较；该参考活性或参考表达水平是从取自某一对照受治疗者/患者(响应者/非响应者)的细胞或者组织样品中选择性地测得，
在a)步骤中测得的活性或表达水平、与上述参考或对照活性或者是参考或对照表达水平之间的差异程度，标志着针对癌症所进行的治疗的预期疗效。
18.如权利要求16或17所述的方法，其中针对以在KRAS基因中、同时在EGFR基因和/或者BRAF基因中至少有一处激激活性突变为特征的癌症所进行的治疗过程，包括施用权利要求6至8中任何一项所定义的某种HSP90抑制剂。
19.应用一种在KRAS基因中、同时在EGFR基因和/或者BRAF基因中至少有一处激激
活性突变的(转基因)细胞或者(转基因)非人类动物，来对用来治疗以在KRAS基因中至少有一处激激活性突变为特征的癌症的某种药物进行筛选和/或者验证。
20.如权利要求5至19中任意一项所述的方法，其中所说的癌症选自下列一组癌症：
非小细胞肺癌、肺腺癌、胰腺癌、结肠癌、乳腺癌、头颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胃肠癌(包括胃癌和食道癌)、肾细胞癌、尿道癌、白血病、前列腺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、脑瘤、小儿肿瘤以及肉瘤。
21.一种可以用来实现权利要求1至12、16、17以及20当中任何一项所述方法的试剂盒，该试剂盒包括可用来测定KRAS基因中至少一处激活性突变的寡聚核苷酸或者多聚核苷酸，也可以包括但不一定包括可用来测定EGFR基因和/或者BRAF基因中至少一处激活性突变的寡聚核苷酸或者多聚核苷酸。
22.应用权利要求6至8中任何一项所定义的HSP90抑制剂来制备用来治疗、改善以及/或者预防癌症的药物制剂；此类癌症以在KRAS基因中至少有一处激活性突变为特征。
23.应用权利要求6至8中任何一项所定义的某种HSP90抑制剂，来治疗、改善以及/或者预防以KRAS基因中至少有一处突变为特征的癌症。
24.一种选自以下各种细胞系的细胞系组合：A427、A549、Calu-1、Calu-3、Calu-6、H1299、H1355、H1395、H1437、H1563、H1568、H1648、H1650、H1666、H1734、H1755、H1770、H1781、H1792、H1819、H1838、H1915、H1944、H1975、H1993、H2009、H2030、H2052、H2087、H2110、H2122、H2126、H2172、H2228、H23、H2347、H2444、H28、H358、H441、H460、H520、H522、H596、H647、H661、H820、HCC2935、HCC4006、HCC827、SK-LU-1、EKVX、H322M、HOP-62、HOP-92、Colo699、DV-90、HCC15、HCC366、HCC44、HCC78、LCLC103H、LCLC97TM1以及LouNH91。
25.应用权利要求24所定义的细胞系组合来预测对某种药物的易感性。
26.应用权利要求25，其中所说的药物是指某种HSP90抑制剂。
对HSP90-抑制剂的易感性
[0001] 本项发明涉及一种挑选对HSP90抑制剂具有易感性的细胞、组织或者培养细胞的方法。另外还描述了一种测定哺乳动物的肿瘤细胞或者癌细胞对HSP90抑制剂治疗的反应情况的方法。尤其是，本项发明提供了一种体外诊断方法以筛选出那些对HSP90抑制剂具有易感性的患者，其中包括应用可以用于检测KRAS基因中激活性突变的寡核苷酸或者多聚核苷酸。本项发明还涉及对一种癌症的疗效进行检测评估或监测的方法，此类癌症以KRAS基因中至少出现一处激酶激活性突变为特征，也可能但非必须在EGFR和/或者BRAF基因中也至少出现一处激活性突变。此外，还介绍了一种对癌症尤其是具有上述基因突变特征的癌症的疗效进行预测的方法。最后，应用具有上述基因突变特征的(转基因)非人类动物模型或者(转基因)细胞模型对抗癌药物进行筛选和/或者验证，并提供了一套可以实现上述各种检测功能的试剂盒。
[0002] 现阶段，人们正试图对各种主要癌症类型的基因组进行完全注释标记，而这正与“人类基因组计划”的工作有所关联；因此在不久的将来，分析体细胞的基因拷贝数变化和与癌症有关的基因突变(这里两者统称为病变)可以为我们提供与人类癌症相关的遗传图谱。在治疗遗传学定义的肿瘤方面，分子靶向的治疗方法已经取得了不少成功：以ERBB2/Her2基因为靶点的曲妥珠单抗可以缩小因ERBB2基因扩增而罹患乳腺癌的妇女体内的肿瘤(Slamon等，2001)；在携带BCR/ABL转位的慢性粒细胞白血病患者(Druker等，2001a；Druker等，2001b)和带有KIT基因突变或者PDGFRA基因突变(Heinrich等，2003)的胃肠道间质瘤和黑色素瘤患者(见Hodi等，NEJM，2008)体内，ABL/KIT/PDGFR基因抑制剂伊马替尼可以诱导有效的药物反应；最后，由EGFR基因突变导致的肺癌对EGFR基因抑制剂吉非替尼和埃罗替尼具有高度敏感性(Lynch等，2004；Paez等，2004；Pao等，2004)；这些成功的例子足以说明前述遗传标记工作在临床治疗方面的意义。在绝大多数情况下，此类抑制剂的疗效都是在临床试验完成后被发现的，然而目前尚无固定的机制可以依循，于是人们无法在对患者进行临床试验之前系统性地鉴定出导致特定原癌基因依赖性的“损伤”。另一方面，靶点导向疗法常常依赖于某个癌基因激活的信号通路，因此被认为与癌症当中发生的体细胞遗传背景改变(损伤)具有因果效应。然而，目前还没有办法可以系统性地将此类“损伤”与治疗靶点联系起来。
[0003] K-Ras蛋白是一个与细胞分裂调节有关的GTP酶。携带KRAS基因突变的癌症患者(例如，非小细胞肺癌、胰腺癌、结直肠癌、乳腺癌、白血病、前列腺癌、淋巴瘤、脑瘤、小儿肿瘤、肉瘤等)不仅预后发展很差，而且生存率极低。由于无法有效地治疗这些病症，鉴定出携带KRAS基因突变的肿瘤/肿瘤细胞对之具有易感性的药物/化合物便成了当务之急，尤其是迫切需要在临床试验开始/完成之前鉴定出来以避免用人体试验。本说明所说的“KRAS”指的是K-Ras、k-ras以及类似的字母组合，并且它们都被作为同义词使用。然而，“KRAS”多数情况下是指编码K-Ras GTP酶的基因，而词组“K-ras”、“K-Ras”或者“K-RAS”多数情况下是指该基因编码的蛋白。
[0004] 为了鉴定携带上述KRAS基因突变的肿瘤/肿瘤细胞对之具有易感性的药物/化合物，相应的癌细胞系经常被用在鉴定试验当中；但是这些广为使用的细胞模型其可靠性和临床适用性受到了一些质疑。另外，细胞系的遗传背景不稳定并且经常发生改变，因此对各种原发肿瘤的代表性可能会差一些。再一点，组织病理学定义的各类肿瘤其遗传多样性通常较为复杂；例如临床诊断的肿瘤“非小细胞肺癌”(NSCLC)包括携带EGFR基因或者KRAS基因突变的肺腺癌和携带KRAS基因突变的鳞状上皮细胞肺癌。因此，任何一个代表性的临床前模型都需要把握原发肿瘤病变的本质以及这些病变在以组织病理学定义的人群里的分布。
[0005] 最近有文献报道证明了癌细胞系在临床前药物靶点验证试验中的作用(Lin等，2008；McDermott等，2007；Neve等，2006；Solit等，2006)。但是，这些研究均有不足之处，它们或者使用了多个肿瘤来源的癌细胞系(Solit等，2006)，或者只着力于对癌细胞系进行大尺度上的基因组分析(Lin等，2008)，又或者仅仅通过建立高通量细胞系谱来寻找对肿瘤抑制剂具有强烈易感性的细胞系而忽视了对细胞系进行基因组分析(McDermott等，
2007)。另一方面，由于具有抗癌作用的化合物/药物往往只能在临床试验结束后才能被鉴定出来，因此不仅费时，而且成本很高。同时，一个特定的肿瘤体(例如“肺癌”)可能是由具有不同遗传谱和/或者转录谱特征的多种肿瘤组成；所以，即便是“同一个”肿瘤(来自同一个肿瘤体的不同肿瘤，例如肺癌)也不一定能用同一种药物/化合物进行治疗。因此，找出特定类型的肿瘤对特定药物/化合物的易感性的“标记”或者“预测器”，将会使患有同一种癌症的更多患者从中受益。
2007)。另一方面，由于具有抗癌作用的化合物/药物往往只能在临床试验结束后才能被鉴定出来，因此不仅费时，而且成本很高。同时，一个特定的肿瘤体(例如“肺癌”)可能是由具有不同遗传谱和/或者转录谱特征的多种肿瘤组成；所以，即便是“同一个”肿瘤(来自同一个肿瘤体的不同肿瘤，例如肺癌)也不一定能用同一种药物/化合物进行治疗。因此，找出特定类型的肿瘤对特定药物/化合物的易感性的“标记”或者“预测器”，将会使患有同一种癌症的更多患者从中受益。
[0006] 因此，本项发明所要解决的技术问题在于提供用于评价细胞尤其是肿瘤细胞对于抗肿瘤治疗的敏感性和反应性的手段和方法。
[0008] 因此，本项发明涉及一种挑选对HSP90抑制剂具有易感性的细胞、组织或者培养细胞的方法，主要步骤有：(a)在待检测细胞、组织或者培养细胞中确认至少存在一处KRAS基因突变；(b)挑选出这些携带有至少一处KRAS基因突变的细胞、组织或者培养细胞。本方法还可以包括其他步骤：(i)用HSP90抑制剂接触待测细胞、组织或者培养细胞；(ii)检测这些接触了HSP90抑制剂的细胞、组织或者培养细胞的存活率。需要注意的是，步骤(i)和(ii)可以在步骤(a)之前进行，也可以在步骤(a)之后或者步骤(b)之后进行。以上步骤(i)和(ii)尤其可作为证明挑选出的携带有KRAS基因突变的细胞、组织或者培养细胞在存活率上对HSP90抑制剂具有易感性的进一步实验证据。这些KRAS基因突变最好是“激活性基因突变“。
[0009] 本文所指的“细胞、组织和培养细胞”不仅限于分离的细胞、组织和培养细胞，也包括使用的各种样品，亦即由含有这些细胞、组织或者培养细胞的液体所构成的生物学的、医学的或者病理学的液体样品。另外，此种样品液体可能是体液或者排出物，也可以是一种培养物，例如取自细胞培养或者组织培养的培养基。体液可以包括血液、血清、血浆、尿液、唾液、关节液、脊髓液、脑脊液、泪液、粪便以及其他类似物但不仅限于以上各项。
[0010] 因此，本项发明的关键点在于提供一种测定特定的细胞、组织或者组织细胞(或者培养细胞或者培养细胞中的单个细胞，或者如下所述来自某一生物学/医学/病理学样品的细胞)对于HSP90抑制剂抗癌或抗增生处理的敏感性的方法。正如在附加例子中所描述的，我们很意外地发现，在KRAS基因中带有一处激活性突变的细胞对HSP90抑制剂的处理格外敏感。同时，我们的在体实验例子也表明HSP90抑制剂能成功地用于治疗与KRAS基因相关的或者由其引发的癌症，例如KRAS基因驱动的肺腺癌，即在KRAS基因中带有一处激活性突变的癌症。
[0011] 所以，本项发明不仅解决了挑选出对HSP90抑制剂具有易感性的细胞/组织/培养细胞的问题，还提供了一种方法来评估一个患病的人或者动物个体在用HSP90抑制剂进行抗癌或者抗增生治疗时可能的药物反应。本项发明不仅为挑选出对HSP90抑制剂处理具有易感性的细胞、组织和培养细胞提供了可能性(也就是说，本项发明所使用的研究手段可以用于新型HSP90抑制剂的性能测试，或者用于筛选与HSP90抑制剂具有相同功能的其他化合物)，也可以用于评价HSP90抑制剂疗法对一个需要治疗和预防增生性疾病的特定(人类)患者是否有效。在最优化方案中，患者对以下几种HSP90抑制剂的药物反应得到了检测：格尔德霉素(geldanamycin)或者其衍生物，尤其是17-AAG或者IPI-504。这些连同其他一些可以被检测的HSP90抑制剂将在后文给予详细说明。
[0012] 在挑选出对HSP90抑制剂有响应性的细胞或者患者的过程中，需要先找出在KRAS基因中至少带有一处突变的细胞、组织或者培养细胞。这些细胞/组织可以取自某一人的样品或者是含有至少一个这样的细胞(例如癌细胞)的体液样品；如这样的细胞、组织或者培养细胞中KRAS基因含有激活性突变，则表明此细胞、组织或者培养细胞对HSP90抑制剂有易感性，即能够被HSP90抑制剂有效地杀死。这里所说的“激活性突变”是指某一基因(尤其是KRAS基因)中的一处突变，而这个突变导致了该基因的相应产物、也就是蛋白(尤其是KRAS蛋白)的活性提高。检测蛋白尤其是KRAS蛋白(提高的)活性的方法在相关技术领域中已广为人知，后文也将予以阐述。另外，后文还将介绍KRAS基因中典型的(激活性)突变；再重复一次，本发明的方法中优先使用“(激活性)突变”。
[0013] 正如上文以及备选实施方案所指的，本项发明主要涉及一种测定哺乳动物肿瘤细胞或者癌细胞对HSP90抑制剂处理的药物反应情况的方法，此方法需要在相应的肿瘤细胞中鉴别出KRAS基因至少一处突变，并且以这种突变来标示该细胞是否可能对抑制剂处理有所响应。这样一个测定的过程可以在分离的单一肿瘤细胞上实现，也可用于检测诸如体液、分离的机体组织样品以及与之类似的各类生物学/医学/病理学样品，并且这些样品往往含有待分析的细胞或者细胞成分。
[0014] 正如在上文涉及的技术问题时指出的，本领域急迫需要一个有效标志物，用于在治疗前和治疗过程中预测使用HSP90抑制剂进行抗癌治疗的结果；同时，我们也需要将接受HSP90抑制剂抗癌治疗的患者或考虑接受HSP90抑制剂抗癌治疗的患者加以分类，以区别HSP90抑制剂的“敏感者”患者和“非敏感者”患者。
[0015] 本项发明的主要目的是为即将接受或者正在接受某种抗癌或者抗增生治疗的个体提供一种诊断方法，此方法可评测患者在接受HSP90抑制剂治疗前、治疗过程中和/或者治疗后对HSP90抑制剂疗法的反应情况。此过程的主要步骤包括(a)在生物学/医学/病理学样品中鉴定出KRAS基因至少一处(激活性)突变，并且以这种突变作为在接受HSP90抑制剂治疗前、治疗过程中以及治疗后对HSP90抑制剂具有药物反应的标志，如KRAS基因含有激活性突变则表明此患者对HSP90抑制剂有易感性，即HSP90抑制剂治疗会有效；(b)根据患者样品中发现的KRAS基因的不同突变情况将其分为“响应者”和“非响应者”。在优选方案中，所依据的KRAS基因突变是激活性突变。
[0016] 因此，本项发明的意义在于首次发现和提供了能够在用HSP90抑制剂进行抗癌/抗增生治疗前、治疗过程中以及治疗后准确预测治疗的效果。
[0017] 本项发明之所以能解决上述技术性问题，其原因正如后文以及附加案例中所提到的，我们很意外地发现，在那些细胞(群)、组织(群)或者培养的细胞(群)当中(或者在某种由细胞或者细胞成分组成的生物学样品中)所发现的KRAS基因至少一处突变，可以准确预测这些这些细胞、组织或者培养细胞(或者提供上述生物学样品的个体)对HSP90抑制剂的易感性。目前，由于缺少相应的治疗手段，以KRAS基因发生至少一处突变为特征的这些癌症尚无法得到有效治疗；因此，患有此类癌症或者肿瘤性疾病的患者的预后发展很不乐观(详见Eberhardt(2005a)，J.Clin.Oncol.)。这类肿瘤性疾病或者癌症可包括非小细胞肺癌、肺腺癌、胰腺癌、结直肠癌、乳腺癌、头颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胃肠癌(包括胃癌和食道癌)、肾细胞癌、尿道癌、白血病、前列腺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、脑瘤、小儿肿瘤以及肉瘤等等，并且所有这些疾病都是相关领域内所熟知的。一般而言，除了上述各种肿瘤病之外，一个相关领域内的专业人员还会注意到本发明适用于其他一些典型的肿瘤性疾病，例如神经内分泌瘤、畸胎瘤等等。本项发明不仅着力于评测HSP90抑制剂治疗恶性肿瘤疾病的成功率，也可用于评测HSP90抑制剂对良性肿瘤疾病的疗效，例如脂肪瘤、纤维瘤、肌瘤、息肉、疣、扁平湿疣以及其他类似的疾病。但是，对恶性肿瘤/癌症的HSP90抑制剂疗效进行评测仍然是本项发明的首要关注点。
[0018] 在本项发明中，KRAS基因的突变可作为对HSP90抑制剂处理具有响应性或者易感性的标记物/预测标记，这使我们深感意外。这里所指的“标记物”和“预测标记”可以交叉使用，都是指基因的某一种等位突变型，这里的“基因”是指KRAS基因，也可以是EGFR基因和/或者BRAF基因。这些基因典型的突变类型将在后文给予说明。实验数据表明，我们所定义的“标记物”/“预测标记”与HSP90抑制剂处理的响应性/易感性显著相关(p＜0.05)。在具体实施方案中，任何一个KRAS基因激活性突变都预示着用HSP90抑制剂对恶性增生(例如癌症)进行治疗(或者预防)的成功。
[0019] KRAS基因突变可作为肿瘤细胞对HSP90抑制剂尤其是17-AAG具有易感性的标记，这第一次为此类癌症(KRAS基因发生突变)患者提供了一条治疗途径。患者接受HSP90抑制剂治疗后，临床有效率可在原有基础上提高80％，并且存活率可大约提高100％。在之前用EGFR抑制剂埃罗替尼和吉非替尼治疗含EGFR基因突变的肺癌时，也得到过类似的临床有效率和患者存活率提高的结果。
[0020] HSP90与发生突变后的原癌基因的成熟过程有关，例如变异的BRAF基因和EGFR基因(Shimamura(2005)Cancer Res；Grbovic(2005)PNAS)。在此研究领域内有假说认为，在RAS-RAF通路上的某些基因发生突变的肿瘤细胞依赖于Hsp90的分子伴侣作用，也有人试图通过研究来证实这一假说(Banerji等，2008；Hostein等，2001)。在BRAF基因和EGFR基因中带有突变的肿瘤对HSP90抑制剂具有高度易感性，这是因为此类肿瘤的生长和发展需要有HSP90在这些发生了突变的BRAF和EGFR蛋白的成熟过程中发挥其作用。因此，有关这方面的研究者推测，BRAF基因和EGFR基因的突变可以作为对HSP90抑制剂的易感性的一个预测性标记。
[0021] 有人进行过一个临床试验(NCT00431015)来探究HSP90抑制剂IPI-504在治疗非小细胞肺癌患者过程中的安全性和有效性问题(Smith，Drug Discovery Today：Therapeutic Strategies，2008)。然而，相关研究既没有提及KRAS基因的突变，也未提出此基因突变作为肿瘤细胞/肿瘤对HSP90抑制剂的易感性标记的可能性。相反，在对癌症进行单一化疗或者联合了EGFR抑制剂例如埃罗替尼(Eberhard(2005)J Clin Oncol 23，
59005909)的化疗时，KRAS基因突变被认为是抗疗性的预测性标记(Pao等，2005b)，也就是说，研究者普遍将KRAS基因的突变视作EGFR抑制剂易感性的负标记。换句话说，业内普遍认为带有KRAS基因突变特征的肿瘤细胞/肿瘤对EGFR抑制剂(例如埃罗替尼或者吉非替尼)处理具有抗性。
59005909)的化疗时，KRAS基因突变被认为是抗疗性的预测性标记(Pao等，2005b)，也就是说，研究者普遍将KRAS基因的突变视作EGFR抑制剂易感性的负标记。换句话说，业内普遍认为带有KRAS基因突变特征的肿瘤细胞/肿瘤对EGFR抑制剂(例如埃罗替尼或者吉非替尼)处理具有抗性。
[0022] HSP90甚至不被认为与发生变异的KRAS蛋白的成熟过程有关，人们只知道HSP90分子可能是通过其受质蛋白BRAF(受质蛋白是指HSP90使之稳定的蛋白)来调节依赖于K-RAS的信号通路激活过程。但是，HSP90可以使之稳定的“受质蛋白”还有很多。
[0023] 早前始于黑色素瘤患者的一些研究(Banerji等；Mol Cancer Ther，Apr；7(4)：737-9 2008)认为，NRAS基因突变和BRAF基因突变有可能是HSP90抑制剂的生物响应标记物。但是，由于仅有六名患者参与了此项研究，其数据所代表的意义便非常有限。具体地说，两位患有转移性黑色素瘤的病人对HSP抑制剂有药物反应；并且其中一位带有BRAF基因突变而另一位则是NRAS基因发生了突变(Banerji等；Mol Cancer Ther，Apr；7(4)：
737-9 2008)。然而考虑到在所有黑色素瘤患者中约有45-60％的患者带有BRAF基因突变，约有20-30％的患者带有NRAS基因突变，并且这两种基因的突变在人群中分布广泛，仅仅两名患者在此种疗法中有效的事实，还不足以证明此类癌症都集中发生在那些对HSP90抑制剂有响应的患者身上。与之形成对照的是，本发明中的研究则是在分析了一批近似于自然分布状态下的肺癌患者病例的基础上，得出带有KRAS基因突变的肿瘤对HSP90抑制剂具有显著的易感性。在这一批肿瘤患者里，带有KRAS基因突变的肿瘤都集中分布在对HSP90抑制剂有易感性的癌症患者范围内。
737-9 2008)。然而考虑到在所有黑色素瘤患者中约有45-60％的患者带有BRAF基因突变，约有20-30％的患者带有NRAS基因突变，并且这两种基因的突变在人群中分布广泛，仅仅两名患者在此种疗法中有效的事实，还不足以证明此类癌症都集中发生在那些对HSP90抑制剂有响应的患者身上。与之形成对照的是，本发明中的研究则是在分析了一批近似于自然分布状态下的肺癌患者病例的基础上，得出带有KRAS基因突变的肿瘤对HSP90抑制剂具有显著的易感性。在这一批肿瘤患者里，带有KRAS基因突变的肿瘤都集中分布在对HSP90抑制剂有易感性的癌症患者范围内。
[0024] 另外，KRAS蛋白作为HSP90的一个新型受质蛋白，这本身也是一个意料之外的惊人发现。通常，典型的HSP90受质蛋白是具有复杂四级结构的大蛋白，需要进行充分的折叠和加工；变异的BRAF激酶就是这样一个典型的例子。相反，KRAS蛋白是一个非常小的蛋白，不需要充分的结构重构来实现活化。需要注意的是，尽管KRAS和NRAS在结构上具有相似性，它们是不同的蛋白。实际上，这些变异蛋白的任何一种致癌性转变，都离不开特定的细胞内环境。例如，BRAF、EGFR和HER2(这些都是结构高度复杂的蛋白)都是分子伴侣的作用对象，而分子伴侣则在复杂大蛋白的正确折叠过程中起着必不可少的作用。但是，像KRAS这样一个四级结构相对简单的小蛋白，却未被业内研究者认为(甚至是根本想不到)是HSP90可能的受质蛋白/底物。
[0025] 我们将在后文解释为什么变异的KRAS蛋白不能与变异的BRAF或者EGFR蛋白一同归类为HSP90的受质蛋白，因此不可能被业内研究人员考虑到有可能是HSP90受质蛋白。
[0026] 有文献表明，变异的KRAS与变异的BRAF或者EGFR(Shimamura T等，Can Res2005；Grbovic OM等，PANS 2006)之间存在显著的差别；这表明变异的KRAS不能同变异的BRAF或者EGFR一起归类为HSP90的受质蛋白。相反，本发明者发现KRAS显然是一个新型的、非典型的Hsp90受质蛋白。在后面附上的实验说明中可以看到，变异的KRAS蛋白结合到Hsp90上面，并且用HSP90抑制剂(17-AAG)也不能将变异的KRAS从复合体中去除。在附加案例中还可以看到，突变型和野生型KRAS都能与Hsp90结合，并且这种结合过程不会受到像17-AAG这样的HSP90抑制剂的抑制。然而在相同的实验条件下，我们发现用17-AAG处理可以将变异的EGFR从复合体中去除掉，这也与早先研究发现的结果一致(Shimamura T等；Can Res 2005)。此外，复合体之外的KRAS水平也不会受到影响。
[0027] 然而，用HSP90抑制剂进行处理后，c-Raf和AKT的水平都发生了变化；倘若不受现有理论限制，这个现象也许可以说明抑制HSP90的功能可以杀死KRAS基因发生突变的细胞，因为抑制HSP90的功能阻断了KRAS下游的两条主要的信号通路(c-Raf和AKT通路)。
[0028] 在不考虑现有理论的情况下，我们认为，KRAS蛋白(尤其是此文中提及的发生激活性突变的KRAS蛋白)是HSP90的一个受质蛋白/底物，HSP90协助完成(被激活的)KRAS蛋白的折叠过程。可以想见，HSP90是通过其分子伴侣的功能阻止变异的KRAS蛋白(也就是带有激活性突变的KRAS蛋白)被降解掉；因此，有活性的KRAS蛋白水平会提高并且得以保持，而这样一种高水平的活性KRAS蛋白则有可能促成了本文提及的各种癌症的发展和/或者恶化(例如肿瘤发生或者肿瘤生长)。我们还可以确信，本文提及的各种HSP90抑制剂是通过干扰HSP90的分子伴侣功能来阻止激活的/变异的KRAS蛋白的正确折叠，从而导致其水平降低。因此，一个显而易见的事实是，HSP90抑制剂在治疗本文提及的各种癌症以及在本项发明提供的各种方法手段中都是很有用的。
[0029] 我们还需要注意到，变异的KRAS蛋白一直未被视作KSP90的受质蛋白，同样与之相关的激活性KRAS基因突变也未被认为或者未被推测可能与肿瘤/癌细胞对HSP90抑制剂的易感性有关。例如，Smith(Drug Discovery Today：The Strategies，2008)认为，由于HSP90的受质蛋白种类多样并且HSP90具有多种细胞功能，因此相应的抑制剂也会起到各种不同的作用。尽管先前的研究都将精力集中在分析依赖于HSP90的原癌基因Akt的成熟过程，却没有一项研究系统性地分析过带有KRAS基因突变的细胞对HSP90抑制剂作用的易感性。此外，由于缺乏具有完整遗传标记的大批量细胞系，针对“基因型-表现型”相互关系的大规模临床前研究也难以进行。而本项发明所创立的各种方法和手段都有针对大量肿瘤细胞系的研究作为基础，并且这些细胞系都是属于某一特定类型的肿瘤，因此使得鉴定出对HSP90抑制剂处理具有易感性/响应性的标记物成为可能。
[0030] 例如，Smith(Drug Discovery Today：Therapeutic Strategies，2008)指出了NQO1基因表达与17-AAG易感性之间的相关性。Solit(2008)Drug Discovery Today 13，8-43页也说明了在HSP90抑制剂试验的设计过程中需要考虑病人的选择性。Solit进一步认为，到目前为止，对于HSP90抑制剂只进行过有限的动物实验，因此关于17-AAG或者其他HSP90抑制剂可以降解经典HSP90受质蛋白的能力，尚需通过在体试验加以证实。
[0031] 因此，相关文献从未提及KRAS基因突变与HSP90抑制剂易感性的关系，并且人们也不知道变异的KRAS蛋白可作为HSP90的作用靶点。所以，关于KRAS突变作为HSP90抑制剂的敏感性的标记物的发现是始料未及的也是现有技术领域里没有预见到的。
[0032] 如前文所述，罹患携带有KRAS基因突变的癌症的病人存活率非常低、预后发展很糟糕，并且已知的各种疗法都不太有效。因此，将KRAS基因的突变作为对HSP90抑制剂易感性的标记物鉴定出来，将使这些患者从中大为受益。另外，此处提及的诊疗方法还可以在对患者进行临床试验之前鉴定出HSP90的“响应者”(对HSP90敏感的患者)。
[0033] 附加案例所记述的实验对本项发明进行了详细阐述。这些实验意外地发现，对于HSP90抑制剂尤其是格尔德霉素(geldanamycin)衍生物例如17-AGG的易感性，KRAS基因的突变可作为这种易感性的预测信号。在附加案例中可以看到，研究人员是通过使用具有代表性的NSCLC(非小细胞肺癌)细胞系系列来发现KRAS基因突变可作为HSP抑制剂易感性的预测物/标记物。这些研究结果在另一个基于NCI-60细胞系列的研究中得到了进一步证实(Garraway等，2005；Shoemaker，2006)(p值＜0.05)。而NCI-60细胞系系列由来自多种肿瘤的细胞系组成，代表了绝大多数人类肿瘤类型；因此可以说，KRAS基因突变是对HSP90抑制剂具有易感性(对HSP90处理有响应性)的通用预测物/标记物。所以，根据本项发明的设计，除了NSCLC癌症，任何一种以KRAS基因发生突变为标志的癌症(例如含有KRAS基因突变的非小细胞肺癌、肺腺癌、胰腺癌、结直肠癌、乳腺癌、白血病、前列腺癌、淋巴瘤、脑瘤、小儿肿瘤、肉瘤等等)都能得到治疗。当然，这里所提的KRAS基因突变最好是激活性的突变。因此在这里所述实施方案中，优先对激活的KRAS基因突变进行寻找、识别或者评估。
[0034] 附加例子中也提供了动物实验数据，表明激活性突变确实预示着对HSP90抑制剂的易感性。这些动物实验应用了一种转基因老鼠模型；这种带有lox-stop-loxKRASG12D的转基因老鼠由于在肺部表达了一个突变型的KRAS等位基因，因此患有侵入性的肺腺癌(Jackson EL等；Genes Dev 2001)。接下来，研究人员用一种典型的HSP90抑制剂——17-DMAG(文中给予其描述和定义)来处理这种患有肺部肿瘤的老鼠，这种17-AAG衍生物具有更好的可溶性。值得注意的是，处理一周之后，患有肿瘤的四只老鼠有三只的肿瘤发生了消退。尽管这种消退反应是短时的，但明显证实了带有激活性KRAS基因突变的肿瘤对HSP90抑制剂具有药物反应；这也从在体实验方面确证了针对带有遗传标记细胞系的大规模筛选实验的结果。
[0035] 本项发明所具有的一个优势是，可以离体筛选出那些对HSP90抑制剂敏感或者对HSP90抑制剂处理有响应性的细胞(群)、组织(群)或者培养细胞。正如文中所指出的，我们使用的是带有基因组标记的NSCLC细胞系，这种细胞系在遗传多样性、转录谱以及表型特征等方面都具有原发NSCLC(非小细胞肺癌)肿瘤的代表性。一项全范围的基因组集成谱系分析表明，非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系的基因组在基因拷贝数、原癌基因突变以及基因表达空间等方面，对在外科手术中从患者身上分离出来的原发性NSCLC肿瘤具有高度代表性。因此，用这样一种NSCLC细胞系便可以避免使用动物或者患有癌症的志愿者进行活体试验。同时，与业内现有技术不同的是，使用这类细胞系还可以使得鉴定出KRAS基因突变作为HSP90抑制剂易感性标记物的结果可靠。我们的构想是，其他的细胞系只要能够高度模拟原发性NSCLC肿瘤，尤其是在基因拷贝数、原癌基因突变以及基因表达空间等方面进行模拟，同样可以用在此处。此外，文中说明过的并在附加案例中得以使用的算法也可用到本项发明当中，尤其是用于评测实验数据，以及/或者鉴定代表着(肿瘤)细胞、(肿瘤)组织、或者(肿瘤)培养细胞对HSP90抑制剂易感性的预测物/标记物。这些算法在相关领域内已广为使用，主要有K-邻近算法以及统计学检验，例如Fisher精确检验。业内专业人员会知晓如何在本项发明中使用这些算法，并且可以根据发明的需要和自身的知识背景采用更多的算法。后文的阐述以及附加案例说明了如何选择细胞系或者细胞系组合，以便在药物敏感性标记物的评测实验中合理地设计实验组合。
[0036] 为了确认这样一种细胞系是否反映了原发性NSCLC肿瘤的遗传多样性，我们对一大组NSCLC细胞系的基因组进行了系统的分析标注。正如附加案例中所显示的，这些细胞系的表型很稳定，因而证明了非小细胞肺癌(NSCLC)的细胞系对原发性NSCLC肿瘤具有高度代表性。同时，这些细胞系还可以用在针对基因组损伤的药物疗效的系统性分析当中。
[0037] 在附加案例中，研究人员通过使用系统性相似谱系分析证实了EGFR基因突变可用来预测对EGFR抑制剂的易感性(埃罗替尼，PDI68393，凡德他尼)(Arao等，2004；Lynch等，2004；Paez等，2004；Pao等，2004；Sos等，2008)，而这个结果与业内已有的观测结果相一致。同时，已有研究发现在带有EGFR-基因突变的NSCLC细胞系中具有很高的EGFR抑制剂活性(McDermott等，2007；Paez等，2004；Tracy等，2004)。这些发现都是使用无偏差算法对遗传性损伤进行系统性全局测量而得到的。此外，EGFR基因突变作为EGFR抑制剂易感性的预测物/标记物这一业内已有发现，在本项发明中也得到了证实；因此，这也说明在发现KRAS基因突变作为HSP90抑制剂易感性预测物/标记物的案例实验中，所使用的算法具有全局功能性的生物学可靠性。例如，通过基于细胞的系统性化合物筛选发现EGFR基因突变作为EGFR抑制作用易感性的标记物/预测物(p＜0.0001)，随后根据损伤谱系分析对易感性强弱进行预测。然而出人意料的是，不仅是EGFR基因突变被发现并且证实作为对EGFR抑制剂易感性的预测物/标记物，KRAS基因突变也被发现并且证实作为对HSP90抑制剂易感性的预测物/标记物。不难理解，在对针对肿瘤细胞的抗癌治疗效果进行深度临床前分析时，不仅需要对取自某一肿瘤体的足量细胞系进行详尽的基因组分析，还需要进行高通量细胞系谱分析，然后根据本文所述对化合物活性进行预测。
[0038] 类似于附加案例所述的凡德他尼/埃罗替尼结合于EGFR激酶结构域，化合物结合于HSP90这个过程的结构模型可以进一步证明发现KRAS基因突变作为对HSP90抑制剂易感性预测物/标记物的准确性。在表达有T790M抗性等位基因的Ba/F3细胞中，相应化合物活性的缺失确证了凡德他尼(Vandatinib)/埃罗替尼(Erlotinib)是EGFR抑制剂。EGFR基因突变也被发现可作为对SRC/ABL抑制剂达沙替尼(dasatinib)易感性的预测物/标记物。在不受现有理论限制的情况下，这一发现证明了突变的EGFR基因是达沙替尼的确切作用靶点(Song等，2006)。
[0039] 在本项发明中，词组“对HSP90抑制剂的易感性”和“对HSP90抑制剂处理的响应性”可以相互交叉使用。任何关于“对HSP抑制剂的易感性”的解释都适用于“对HSP90抑制剂处理的响应性”，反之亦然。
[0040] 确定药物易感性的技术手段和方法在业内已较为成熟，此类方法主要包括细胞或者组织培养实验。一个非最优选但仍应予以考虑的情况是，应该同时测定两种或者多种HSP90抑制剂(也就是说，HSP90拥有各种具有不同化学式、有时甚至不具结构相关性的抑制剂)。然而，一次最好只测定一种HSP90抑制剂。后文将对本项发明中优先使用和测定的HSP90抑制剂予以陈述说明。
[0041] 在此文中，对HSP90抑制剂处理的响应性的测定包括一个接触步骤，后文将对此步骤进行更为细致的说明。这里所说的“HSP90抑制剂处理”是指让一种细胞例如哺乳动物肿瘤细胞或者癌细胞与相应的抑制剂相接触。当然，后文提及的其他各种细胞也可用HSP90抑制剂进行处理。
[0042] 上述方法还可以包括一个评测/测定步骤，例如，测量用HSP90抑制剂处理过的细胞、组织或者培养细胞或者哺乳动物细胞的存活率。例如，上面提及的各种细胞、组织或者培养细胞在用HSP90抑制剂处理后，存活率可能会下降。理想情况下，这些细胞、组织或者培养细胞相对于未经处理的对照组细胞、组织或者培养细胞而言，存活率可能下降至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％，最多可达到90％。除去不用HSP90抑制剂进行处理这一点，对照组细胞、组织或者培养细胞最好与实验组细胞、组织或者培养细胞完全相同。
[0043] 因此，如上文所述，这些经过了HSP90抑制剂处理并且增殖减少的细胞、组织或者培养细胞，就可被视作对HSP90抑制剂具有易感性。同样地，经过HSP90抑制剂处理并且出现增殖减少的哺乳动物细胞，也被认为对HSP90抑制剂处理具有响应性。后文将阐述测定KRAS基因中至少一处突变以及相应各种突变的步骤。如前文所述，我们意外地发现，KRAS基因中这样一个突变可以预示着用HSP90抑制剂处理的细胞、组织或者培养细胞是否会对HSP90抑制剂具有易感性或者对HSP90抑制剂处理具有响应性。存活率的降低可能反映在细胞增殖的减少，例如相对于未经HSP90抑制剂处理的对照组细胞、组织或者培养细胞，实验组细胞、组织或者培养细胞的增殖减少了10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％，最多可达到90％。这种增殖的减少程度可通过使用标准技术测量总细胞体积、组织体积或者培养细胞体积来进行定量。
[0044] 如上所述，经处理和对照组细胞、组织或者培养细胞的增殖差异，可通过使用标准技术测量细胞、组织或者培养细胞的体积来警醒测定/估计。这种测定可在不同的时间点进行，例如在用HSP90抑制剂处理相应细胞、组织或者培养细胞15分钟、30分钟、60分钟、2小时、5小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天以及/或者7天之后进行测定。同时，还应进行重复测定，例如，在处理15分钟、30分钟和60分钟后进行测定。需要注意的是，这些细胞、组织或者培养细胞可在不同的条件下(例如，相同浓度的抑制剂，不同浓度的抑制剂，含有不同稳定剂、稀释剂以及/或者载体的抑制剂等等)进行多次测定(例如2次、3次、5次、10次或者20次)，而不是只测一次。相应地，重复测定可以在最后一次用HSP90抑制剂处理之后进行，或者在上述不同处理次数之间进行。上述典型的测定/评测步骤，包括测定经HSP90抑制剂处理的细胞、组织或者培养细胞的增殖情况的步骤，可用于此文提及的以及更多其他测定/评测过程(例如测定HSP90基因的表达水平)。业内技术人员应该知晓此类检测方法，这类方法可对细胞凋亡、衰老或者其他细胞生物学表型进行定量，而这些表型都与肿瘤细胞存活率或者增殖数降低的现象有关。
[0045] 测定对HSP90抑制剂处理的响应性的方法还包括测定HSP90的活性水平，这一活性预示着细胞、组织或者培养细胞是否对HSP90抑制剂具有易感性或者是否对HSP90抑制剂处理具有响应性。正如后文关于测定KRAS以及EGFR和/或者BRAF基因活性的说明，这里所指的“活性”是指例如在蛋白水平测定酶活力以及/或者测定其表达水平(例如mRNA或者蛋白质)。文中提及的活性测定方法在相关研究领域已较为成熟，后文也将给予更多的说明。
[0046] 本项发明所说的“HSP90”(“热休克蛋白90”)是指一种真核生物不可缺少的分子伴侣。作为一种分子伴侣，热休克蛋白90起着修正错误折叠的蛋白的作用，因此在健康细胞中发挥着重要的分子控制机能作用。人们发现，在肿瘤细胞中，由于发生突变而激活的原癌基因例如BRAF或者EGFR都需要借助HSP90实现其熟化过程。尽管HSP90本身的功能是保护细胞，肿瘤细胞却也能借助这种保护功能稳定原癌基因，促使致癌性转变的发生。
[0047] 人类HSP90基因的各种转录子序列见SEQ ID第137、139、141、143以及145号；同时相应的各种同型HSP90蛋白的氨基酸序列见SEQ ID第138、140、142、144以及146号。业内有人怀疑编码HSP90AA2蛋白(SEQ ID第145号)的核酸序列可能是个假基因。总体而言，这里提及的HSP90可以指任何一个带有(部分)HSP90活性的氨基酸序列以及编码相应氨基酸序列的核酸序列。
[0048] 除了这里提及的人类HSP90序列，业内技术人员也可以使用已有的手段鉴定出其他哺乳动物或者非哺乳动物(尤其是老鼠、黑猩猩、猕猴、线虫、果蝇)的HSP90核酸序列；这些鉴定手段包括例如核酸测序、杂交检测、使用人工或者后文将予以说明的计算机程序进行序列比对，在上述计算机程序中对“杂交”和同源度进行了定义。在一项实施案例中，编码人类HSP90同源物的核酸序列与SEQ ID第137、139、141、143以及145号核酸序列具有至少40％的同源性；在其他更好的情况下，此同源性可达到至少45％、50％、55％、60％、
65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或者98％，并优先选取较高值；而在极端情况下，上述同源性可达到99％以上。
65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或者98％，并优先选取较高值；而在极端情况下，上述同源性可达到99％以上。
[0049] 对已知核酸序列/启动子的同源序列进行杂交检测的方法在业内已较为成熟；相关技术可以参见Sambrook、Russell“Molecular Cloning，A Laboratory Manual”，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.(2001)；Ausubel，“Current Protocols in Molecular Biology”，Green Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.(1989)。这里所说的“杂交过程”或者“杂交”可以在严苛的或者非严苛条件下进行；如果没有特别要求，一般使用非严苛的反应条件。这些反应体系可以根据常规的实验方案来建立，例如上面提及的Sambrook(2001)；Ausubel(1989)；以及Higgins and Hames(Eds.)“Nucleic acid hybridization，a practical approach”IRL Press Oxford，Washington DC，(1985)。反应条件的设置应为技术人员所熟知，并且可以根据已有的实验方案进行安排调整。因此，当我们要检测特异性的杂交序列时，就需要使用严格的杂交反应和洗脱条件，例如0.1x的SSC、0.1％的SDS、反应温度65摄氏度或者2x的SSC、60摄氏度、0.1％的SDS。对于检测一般同源性或者非严格匹配的序列，则可以使用较为宽松的杂交反应条件，例如6x的SSC、1％的SDS、反应温度65摄氏度。此外，探针长度和待检测核酸的化学组成都应在设计反应条件时予以考虑。
[0050] 在本项发明中，涉及到两条或者多条核酸序列时所说的“同源性”“百分比同源性”“一致”“百分比一致”“百分之几一致”或者“序列一致性”，是指这两条或者多条序列或者子序列完全相同、或者某一百分比的核苷酸完全相同(理想情况下至少有40％的一致性，更好的情况下可至少有45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或者98％的一致性，最好时可达到99％以上的一致性)；
这些比对结果可通过使用比对窗口进行最大匹配比较或者比对获得，也可使用已有的序列比对算法对指定区域进行比对获得，或者进行人工比对和肉眼检查。举例来讲，具有75％到
90％或者更高的序列一致性的序列，便可被认为是基本相同的。这种定义同样适用于检测序列的互补性。理想情况下，某一段含有至少15-20个核苷酸的序列是完全一致的；更好的情况是至少50到100个核苷酸的序列一致；最好时可至少有800到1200个核苷酸完全一致。业内技术人员将会熟知如何使用各种算法，例如基于CLUSTALW计算机程序(Thompson Nucl.Acids Res.2(1994)，4673-4680)或者FASTDB(Brutlag Comp.App.Biosci.6(1990)，
237-245)的算法来测定序列之间的一致性百分比。
这些比对结果可通过使用比对窗口进行最大匹配比较或者比对获得，也可使用已有的序列比对算法对指定区域进行比对获得，或者进行人工比对和肉眼检查。举例来讲，具有75％到
90％或者更高的序列一致性的序列，便可被认为是基本相同的。这种定义同样适用于检测序列的互补性。理想情况下，某一段含有至少15-20个核苷酸的序列是完全一致的；更好的情况是至少50到100个核苷酸的序列一致；最好时可至少有800到1200个核苷酸完全一致。业内技术人员将会熟知如何使用各种算法，例如基于CLUSTALW计算机程序(Thompson Nucl.Acids Res.2(1994)，4673-4680)或者FASTDB(Brutlag Comp.App.Biosci.6(1990)，
237-245)的算法来测定序列之间的一致性百分比。
[0051] 虽然FASTDB算法通常不会考虑序列当中不能匹配的核苷酸缺失或者添加(也就是空缺)，但是在其计算过程中，可以人工修正这种偏差以免过高估计序列的一致性百分比。然而，CLUSTALW程序则将序列空缺纳入了一致性计算的考虑范围。此外，还有其他算法可供此领域的技术人员选择，例如BLAST和BLAST2.0算法(Altschul，(1997)Nucl.Acids Res.25：3389-3402；Altschul(1993)J.Mol.Evol.36：290-300；Altschul(1990)J.Mol.Biol.215：403-410)。进行核酸序列比对时，BLASTN程序预设字长(W)为11，期望值(E)为10，M＝5，N＝4，并且比对核酸的两条链。BLOSUM62打分矩阵(Henikoff(1989)PNAS 89：
10915)设置比对值(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝4，并且比对核酸的两条链。
10915)设置比对值(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝4，并且比对核酸的两条链。
[0052] 为了确定一条核酸序列中的某一个核苷酸残基是否对应着该核苷酸序列(例如SEQ ID第137、139、141、143和145号序列)中的某一个位置，技术人员可采用已知的各种方法和手段，比如人工比对或者使用上述各种计算机程序进行比对。比如BLAST2.0，全称是Basic Local Alignment Search Tool(见上文提及的Altschul(1997)；Altschul(1993)；Altschul(1990))，可用来进行局部序列比对。如上所述，BLAST可以生成核苷酸序列的比对，以此来确定序列的相似性。由于其比对的“局部”性特征，BLAST在确定精确匹配或者鉴别相似序列方面特别有用。BLAST算法结果输出的基本单位是“高分匹配片段”(HSP)。
一个HSP结果由两条序列片段构成，这两条片段是任意选取的，长度相同，并且在局部比对中得分最高或者其比对得分达到或者超过了用户设置的阈值或者临界分值。因此可以说，BLAST方法就是用来在一条待查询序列和一条数据库序列之间寻找HSP，然后对找到的任意一种匹配情况的统计学显著性进行测算，然后将那些达到了用户设置的显著性标准的匹配结果报告出来。参数E确定统计学显著性阈值，该阈值决定着是否报告某一条数据库序列匹配情况。因此，E值也可以理解为在整个数据库中搜索到一个HSP(或者一批HSP)的概率期望值的上限。任何一个数据库的序列只要匹配值满足E，都将输出到程序结果当中。
一个HSP结果由两条序列片段构成，这两条片段是任意选取的，长度相同，并且在局部比对中得分最高或者其比对得分达到或者超过了用户设置的阈值或者临界分值。因此可以说，BLAST方法就是用来在一条待查询序列和一条数据库序列之间寻找HSP，然后对找到的任意一种匹配情况的统计学显著性进行测算，然后将那些达到了用户设置的显著性标准的匹配结果报告出来。参数E确定统计学显著性阈值，该阈值决定着是否报告某一条数据库序列匹配情况。因此，E值也可以理解为在整个数据库中搜索到一个HSP(或者一批HSP)的概率期望值的上限。任何一个数据库的序列只要匹配值满足E，都将输出到程序结果当中。
[0053] 基于BLAST(见上文提及的Altschul(1997)；Altschul(1993)；Altschul(1990))的类似计算机技术也可用来在核苷酸数据库中搜索相同的或者有关联的分子，例如GenBank或者EMBL。这种分析方法比需要使用多层膜的杂交方法快速得多，而且计算机搜索的敏感度可以进行修正，以便确定某一个匹配应当归类于“精确一致”还是“相似”。搜索结果以下列算式的得分为基础：
[0054]
[0055] 同时，还综合考虑了两条序列之间的相似度和匹配序列的长度。例如，一个得分为40分的匹配结果可能有1-2％的错配；而一个70分的匹配就会很精确。通常情况下，得分在15分到40分之间的匹配会被认为是相似的分子，而更低的分数则有可能会鉴别出有关联的分子。另一个可用作序列比对程序的例子是CLUSTALW计算机程序(Thompson(1994)Nucl.Acids Res.2：4673-4680) 或 者 FASTDB(Brutlag(1990)Comp.App.Biosci.6：
237-245)，这些都是业内熟知的例子。
237-245)，这些都是业内熟知的例子。
[0056] “HSP90抑制剂”一词在本文中是指某种可以抑制上述提及的“HSP90”的表达或者活性的化合物。例如，某种HSP90抑制剂可以是干扰HSP90基因的转录、基因产物(未剪切或者部分剪切的mRNA)的加工(例如剪切、从细胞核向外转运等类似过程)和/或者基因产物(成熟mRNA)的翻译的化合物。HSP90抑制剂还可以是干扰对HSP90基因编码的多肽/蛋白的修饰过程(例如糖基化)，从而完全或者部分抑制前述HSP90蛋白的活性的化合物。更进一步地，HSP90抑制剂也可以是干扰HSP90蛋白与其他蛋白的相互作用，尤其是那些通过HSP90活性来得到稳定的变异蛋白的化合物。
[0057] 此外，针对编码HSP90的核酸分子而设计的siRNAs/RNAis、反义核酸分子以及核酶都被纳入了本项发明所使用的HSP90抑制剂的范围。同时，上面提及的HSP90拮抗剂/抑制剂还可能是一种辅助抑制性的核酸。
[0058] siRNA方法在诸如Elbashir((2001)，Nature411，494-498)的文献中有所记载。根据本项发明的设计需要，像短发夹RNA(shRNAs)这样的RNA也会作为药物组分被使用在本项发明当中。使基因静默的shRNA方法在业内已广为人知，同时也可能会涉及到st(small temporal)RNAs的使用，可参见Paddison(2002)Genes Dev.16，948-958。
[0059] 如前文所述，业内已有的使基因静默的途径有利用“RNA”的方法，例如RNAi(iRNA)或者siRNA。成功应用这些方法的例子可参见前文提及的Paddison(2002)，以 及 Elbashir(2002)Methods26，199-213；Novina(2002)Mat.Med.June 3，2002；Donze(2002)Nucl.Acids Res.30，e46；Paul(2002)Nat.Biotech 20，505-508；Lee(2002)Nat.Biotech.20，500-505；Miyagashi(2002)Nat.Biotech.20，497-500；Yu(2002)PNAS
99，6047-6052或者Brummelkamp(2002)，Science 296，550-553。这些方法可能使用了遗传载体比如pSUPER载体，或者使用了RNA聚合酶III载体，可参见前文提及的Yu(2002)；
Miyagishi(2002)或者Brummelkamp(2002)。
99，6047-6052或者Brummelkamp(2002)，Science 296，550-553。这些方法可能使用了遗传载体比如pSUPER载体，或者使用了RNA聚合酶III载体，可参见前文提及的Yu(2002)；
Miyagishi(2002)或者Brummelkamp(2002)。
[0060] 业内研究还使用过更多种类的HSP90抑制剂，相关例子可参见(Sharp and Workman，2006；Solit and Rosen，2006)。然而，本项发明所使用的HSP90抑制剂却不仅限于已知的各种类型；也就是说，本项发明也可以用于对今后发现的HSP90抑制剂抗癌疗效的预测。这些抑制剂可通过本文介绍的各种方法或者业内已有的手段鉴定出来，例如针对HSP90抑制作用的高通量生化检测手段(Sharp and Workman，2006；Solit and Rosen，2006)。以已有的知识背景为基础，业内技术人员可以很容易地鉴定出这类抑制剂，或者检测出疑似HSP90抑制剂化合物的抑制活性。这些检测过程可能需要使用到附加案例中描述过的各种细胞或者培养细胞，还可能会用到其他各种细胞/组织/培养细胞，例如从活组织检查中获得的细胞/组织/培养细胞。
[0061] 本项发明的优选案例所使用的HSP90抑制剂是格尔德霉素或者其衍生物。格尔德* * * * * *霉素(IUPAC命名为([18S-(4E，5Z，8R，9R，10E，12R，13S，14R，16S，)]-9-[(氨基羧基)氧]-13-羟基-8，14，19-三甲氧基-4，10，12，16-四甲基-2-氮杂双环[16.3.1.]二十二碳-4，6，10，18，21-戊烷-3，20，22trion)是一种由吸水链霉菌产生的苯醌安莎霉素类抗生素。格尔德霉素能特异性地与HSP90(热休克蛋白90)结合并且影响其功能。通常情况下，Hsp90能够使蛋白的折叠趋于稳定，尤其是肿瘤细胞中过量表达/变异的蛋白，例如v-Src、Bcr-Abl以及p53等等；而Hsp90抑制剂格尔德霉素则可以引起这些蛋白的降解。
[0062] 以下是格尔德霉素的化学式：
[0063]
[0064] 尽管格尔德霉素可作为一种潜在的抗肿瘤药剂，用药过程中仍可能出现一些副作用(例如肝脏毒性)，这就促使人们研发出格尔德霉素的类似物/衍生物，尤其是在第17位碳含有衍生化的类似物/衍生物。除去现有理论的观点，研究发现，对格尔德霉素第17号位置进行修饰有可能降低用药过程中的肝脏毒性。因此，本项发明中优先使用这些在第17位带有修饰的格尔德霉素类似物/衍生物，例如17-AAG(17-N-丙烯胺基-17-去甲氧基格尔德霉素)。同时，具有水溶性的或者能够在水中完全溶解(至少溶解90％，或者更好的情况下溶解95％、96％、97％、98％，最多时溶解99％)的格尔德霉素衍生物在本项发明研究中也得以优先考虑。
[0065] 如 前 文 所 述，17-AAG([(3S，5S，6R，7S，8E，10R，11S，12E，14E)-21-( 丙 烯 胺基)-6-羟基-5，11-二甲氧基-3，7，9，15-四甲基-16，20，22-三氧-17-氮杂双环[16.3.1.]二十二碳-8，12，14，18，21-pentaen-10-基]氨基甲酸盐)是一种被优先考虑使用的格尔德霉素衍生物。17-AAG的商业名称是“坦螺旋霉素”(也叫作KOS-953)，可从Kosan Biosciences Incorporated(被Bristol-Myers Squibb Company公司并购)等处购买到。坦螺旋霉素目前正处于二期临床试验阶段，主要通过静脉注射的方式对多发性骨髓瘤和乳腺癌进行治疗。
[0066] 以下是17-AAG的化学式：
[0067]
[0068] 本项发明中优先使用的其他格尔德霉素衍生物(HSP90抑制剂)还有IPI-504(也叫作瑞他霉素或者Medi-561；Infinity Pharmaceuticals(MedImmune/Astra Zeneca))，用IPI-504(通常为静脉注射)治疗非小细胞肺癌(NSCLC)以及乳腺癌的临床试验目前正在进行中。此外，盐酸阿螺旋霉素(柯山生物学公司已由施贵宝公司并购)是一种高效能、水溶性的并且口服有效的格尔德霉素衍生物，在本项发明中也可以优先应用。
[0069]
[0070] 另外一些可能用在本项发明中的格尔德霉素衍生物主要有ABI010(Abraxis BioScience，Inc.(ABII))，这是一种借助nab技术研发出来的nab-17AAG化合物。还有盐酸瑞他霉素，这是一种17-AAG的高度可溶性对苯二酚盐酸盐(因非尼提公司(INFI))。
[0071] 另外可以适用在本项发明中的格尔德霉素典型衍生物是17-DMAG(17-NN-二甲基乙烯二胺-格尔德霉素)和CNF1010(一种基于安莎霉素的半合成格尔德霉素类似物(Biogen Idec Inc(BIIB)/Conforma)。17-DMAG的抗肿瘤活性在Hollingshead(2005)Cancer Chemother Pharmacol 56，115-125处有详细记载。17-DMAG(也叫作阿螺旋霉素)的化学式如下：
[0072]
[0073] 还有一种本项发明适用的类格尔德霉素HSP90抑制剂是IPI-493(可口服的HSP90抑制剂(Infinity Pharmaceuticals(Medimmune/AstraZeneca))。IPI-493的一期临床试验将安排在2010年进行。
[0074] 另一方面，非格尔德霉素类HSP90抑制剂(也就是指非上述格尔德霉素衍生物的HSP90抑制剂)在本项发明也有所涉及。一种是异恶唑类化合物，尤其是4，5-二芳基异恶唑类HSP90抑制剂例如NVP-AUY922.异恶唑类化合物是常见的热休克蛋白抑制剂；可参见WO 2004/072051和WO 2008/104595。NVP-AUY922(诺华公司(NVS))，同时也叫作VER-52296(Vemalis公司)或者AUY922，是一种潜在的HSP90抑制剂；关于其抗肿瘤活性(例如在乳腺癌模型或者人结肠癌移植模型中)也有详细的文献记载；参见Brough(2008)J.Med.Chem(2008)51(2)，196-218以及Jensen(2008)Breast Cancer Res 10：R33。最近，NVP-AUY922也被纳入了治疗乳腺癌的一期临床试验。
[0075]
[0076] NVP-AUY922可以通过静脉注射给予，也可以通过口服给予。
[0077] 此外，还有HSP90抑制剂的例子可以用在本项发明中，例如：XL888(口服的ATP竞争型抑制剂(Exelexis))，ARQ250RP(ArQule Inc(ARQL)，AT13387(一种可口服或者静脉注射的非安莎霉素类抑制剂；Astex Therapeutics(私有))，BHI001(一种水溶性聚酮化合物；Biotica Technology Limited(私有))，BIIB021(CNF2024)(一种口服型HSP90抑制剂，目前正处于治疗胃肠道间质瘤(GIST)的二期临床试验；Biogen Idec Inc(BIIB)/Conforma)，HBP-347(可口服，含有活性成分金丝桃素，正处于治疗脑癌和血癌的一/二期临床试验阶段；Hy BioPharma Inc.(私有))，KW-2478(静脉注射，正处于治疗B细胞恶性肿瘤的一期临床试验阶段；Kirin/Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd)，MPC3100(Myriad Genetics Inc(MYGN))，MPC3160(口服，处于一期临床试验阶段；Myriad Genetics Inc.)，SAR567530(Sanofi-Aventis(SNY))，SNX-5542(口服，处于治疗乳腺癌的一期临床试验阶段；前体药物；是一种水溶性的具有口服活性的小分子；其活性形式是SNX-2122；fizer/Serenex，Inc.(私有))，SRN005(KeyNeurotekAG(私有))以及STA-9090(静脉注射；一种可注射的、与格尔德霉素或其家族无关的小分子化合物；处于治疗血癌的一期临床试验阶段；Synta Pharmaceuticals Corp.(SNTA))。本项发明也考虑使用抗体作为HSP抑制剂，例如可用作HSP90抑制剂的“Mycograb”，本身是一种人类遗传重组型抗体，可以与真菌的免疫显性抗原热休克蛋白90发生结合(诺华公司(NVS))。
[0078] 如前文所述，我们很意外地发现KRAS基因的突变可以预示对HSP90抑制剂的易感性或者对HSP90抑制剂处理的响应性。对于KRAS基因的各种突变情况业内研究已经较为熟悉，在COSMIC数据库(www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/)中也有详细说明。常见的KRAS基因突变情况有如下这些：KRAS_G12C，KRAS_G12R，KRAS_G12D，KRAS_G12A，KRAS_G12S，KRAS_G12V，KRAS_G13D，KRAS_G13S，KRAS_G13C，KRAS_G13V，KRAS_Q61H，KRAS_Q61R，KRAS_Q61P，KRAS_Q61L，KRAS_Q61K，KRAS_Q61E，KRAS_A59T以及KRAS_G12F。这些突变类型以及相应的带有这种KRAS基因突变的/以这种KRAS基因突变为特征的细胞系在图18中也有说明。上述突变型KRAS基因的核苷酸序列和氨基酸序列在SEQ ID第3到78号序列中标示，同时“野生型”(即没有发生突变的)KRAS基因的核酸序列在SEQ ID第1、157号序列中标示(两种同型KRAS基因)。根据这些信息，业内技术人员可以轻易地推断出在KRAS基因产物中发生的上述各种突变情况。(两种同型KRAS基因的)氨基酸序列在SEQ ID第2、158号序列中标示，根据这两条野生型序列信息同样可以推断出上述各种突变情况。需要特别指出的是，在我们提供的实施方案中，KRAS基因的激激活性突变具有重要意义。
[0079] 在本项发明的一个实施方案中，我们不仅检测在KRAS基因中发生的突变(尤其是激活性突变)，同时也检测EGFR基因或者BRAF基因或者EGFR基因和BRAF基因中的突变。EGFR基因发生的突变情况可能有如下这些：EGFR_D770_N771＞AGG；EGFR_D770_N771insG；EGFR_D770_N771insG；EGFR_D770_N771insN；EGFR_E709A；EGFR_E709G；EGFR_E709H；EGFR_E709K；EGFR_E709V；EGFR_E746_A750del；EGFR_E746_A750del，T751A；EGFR_E746_A750del，V ins；EGFR_E746_T751del，I ins；EGFR_E746_T751del，S752A；EGFR_E746_T751del，S752D；EGFR_E746_T751del，V ins；EGFR_G719A；EGFR_G719C；EGFR_G719S；EGFR_H773_V774insH；EGFR_H773_V774insNPH；EGFR_H773_V774insPH；EGFR_H773 ＞NPY；EGFR_L747_E749del；EGFR_L747_E749del，A750P；EGFR_L747_S752del；EGFR_L747_S752del，P753S；EGFR_L747_S752del，Q ins；EGFR_L747_T750del，P ins；EGFR_L747_T751del；EGFR_L858R；EGFR_L861Q；EGFR_M766_A767insAI；EGFR_P772_H773insV；EGFR_S752_I759del；EGFR_S768I；EGFR_T790M；EGFR_V769_D770insASV；EGFR_V769_D770insASV；and EGFR_V774_C775insHV。需要注意的是，EGFR基因的突变情况较为复杂，因为涉及到氨基酸的插入或者缺失。在某些情况下，在发生插入或者缺失的同时还伴有替换突变。在发生缺失的情况下，突变公式当中从第二个下划线(“”)之前的氨基酸一直到该下划线之后的氨基酸都缺失掉了(例如，“EGFR_E746_A750del”是指在EGFR基因中缺失掉746号到750号氨基酸)。在发生插入的情况下，插入发生在由下划线隔开的两个氨基酸之间(例如，“EGFR_P772_H773insV”表示在野生型EGFR基因的772号P(脯氨酸，译者注)和773号H(组氨酸，译者注)之间插入了一个V(缬氨酸，译者注))。假如在一个插入或者缺失突变之后又发生了替换或者插入突变，则在公式的逗号(“，”)后面写上被替换的或者插入的氨基酸，接着在后面具体说明是发生了插入突变还是替换突变。例如，“EGFR_E746_T751del，V ins”表示在EGFR基因中缺失掉746号E(谷氨酸，译者注)到751号T(苏氨酸，译者注)氨基酸，同时在缺失部分之后紧接着插入了一个V。同样地，“EGFR_E746_A750del，T751A”表示在EGFR基因中缺失掉746号到750号氨基酸之后紧接的751号T被替换成了A(丙氨酸)。
[0080] “野生型”(即没有发生突变的)EGFR基因的核酸序列在SEQ ID第149、151、153和155号序列中给予标示(四种同型EGFR基因)。根据这些信息，业内技术人员可以轻易地推断出在EGFR基因产物中发生的上述各种突变情况。“野生型”EGFR基因的氨基酸序列在SEQ ID第150、152、154和156号序列中标示，根据这些野生型序列信息同样可以推断出上述各种突变情况。
[0081] BRAF基因发生突变的情况主要有：BRAF_D594G，BRAF_D594V，BRAF_F468C，BRAF_F595L，BRAF_G464E，BRAF_G464R，BRAF_G464V，BRAF_G466A，BRAF_G466E，BRAF_G466R，BRAF_G466V，BRAF_G469A，BRAF_G469E，BRAF_G469R，BRAF_G469R，BRAF_G469S，BRAF_G469V，BRAF_G596R，BRAF_K601E，BRAF_K601N，BRAF_L597Q，BRAF_L597R，BRAF_L597S，BRAF_L597V，BRAF_T599I，BRAF_V600E，BRAF_V600K，BRAF_V600L，BRAF_V600R。
[0082] 上述突变型BRAF基因的核苷酸序列和氨基酸序列在SEQ ID第79到136号序列中标示，同时“野生型”(即没有发生突变的)BRAF基因的核酸序列在SEQ ID第147号序列中标示。根据这些信息，业内技术人员可以轻易地推断出在BRAF基因产物中发生的上述各种突变情况。BRAF基因的氨基酸序列在SEQ ID第148号序列中标示，根据这条野生型序列信息同样可以推断出上述各种突变情况。
[0083] 用来标记上述(突变的)KRAS、EGFR和BRAF基因产物氨基酸序列突变情况的单字母(或者三字母)符号在学术领域内已广为人知，这些符号在标准教科书(例如《细胞》，Garland Publishing，Inc.第三版)中也可查找到。下面列出的是基本氨基酸名称及其各自的单字母(或者三字母)缩写符号的详细列表：
[0084]Alanine丙氨酸 A Ala
Cysteine半胱氨酸 C Cys
Aspartic acid天冬氨酸 D Asp
Glutamic acid谷氨酸 E Glu
Phenylalanine苯丙氨酸 F Phe
Glycine甘氨酸 G Gly
Histidine组氨酸 H His
Isoleucine异亮氨酸 I Ile
Lysine赖氨酸 K Lys
Leucine亮氨酸 L Leu
Methionine甲硫氨酸 M Met
Asparagine天冬酰胺 N Asn
Proline脯氨酸 P Pro
Glutamine谷氨酰胺 Q Gln
Arginine精氨酸 R Arg
Serine丝氨酸 S Ser
Threonine苏氨酸 T Thr
Valine缬氨酸 V Val
Tryptophan色氨酸 W Trp
Tyrosine酪氨酸 Y Tyr
Cysteine半胱氨酸 C Cys
Aspartic acid天冬氨酸 D Asp
Glutamic acid谷氨酸 E Glu
Phenylalanine苯丙氨酸 F Phe
Glycine甘氨酸 G Gly
Histidine组氨酸 H His
Isoleucine异亮氨酸 I Ile
Lysine赖氨酸 K Lys
Leucine亮氨酸 L Leu
Methionine甲硫氨酸 M Met
Asparagine天冬酰胺 N Asn
Proline脯氨酸 P Pro
Glutamine谷氨酰胺 Q Gln
Arginine精氨酸 R Arg
Serine丝氨酸 S Ser
Threonine苏氨酸 T Thr
Valine缬氨酸 V Val
Tryptophan色氨酸 W Trp
Tyrosine酪氨酸 Y Tyr
[0085] 如前文所述，带有EGFR基因以及/或者BRAF基因突变的肿瘤细胞/肿瘤对HSP90抑制剂处理具有易感性。因此可以想见，既在KRAS基因中有突变、同时在EGFR基因和/或者BRAF基因中也有突变的肿瘤细胞/肿瘤将有可能对HSP90抑制剂处理特别敏感。也就是说，按照本项发明提供的方法所鉴定出的那些在KRAS基因中至少有一处突变、同时在EGFR基因和/或者BRAF基因中也有突变的细胞、组织或者培养细胞，将有可能对HSP90抑制剂特别有易感性。因此，使用HSP90抑制剂对癌症(以在KRAS基因中至少有一处突变、同时在EGFR基因和/或者BRAF基因也有突变为特征)患者进行治疗，将有可能在预后发展或者患者生存率方面具有特别的成效。
[0086] 除了KRAS基因的突变以及(作为次要选择的)EGFR基因和/或者BRAF基因的突变，我们还设想找到其他可作为HSP90抑制剂易感性的标记物。当然，按照我们提供的方法也可能还会找到其他化合物/药物(例如EGFR抑制剂等等)易感性的标记物。这对筛选出某种特定的细胞、组织或者培养细胞，或者是对鉴别出那些不仅对HSP90抑制剂同时对其他化合物/药物(例如EGFR抑制剂)也有易感性的患者/响应者而言，都具有重要价值。这些被筛选出来的细胞/组织/培养细胞/患者/响应者便可以接受一种HSP90抑制剂与另一种化合物/药物(例如某种EGFR抑制剂)的联合治疗。
[0087] 有时会发现，在筛选出来的某些细胞、组织、培养细胞或者患者/响应者当中，只有KRAS基因发生了突变，而EGFR基因和/或者BRAF基因以及其他一些上文提及的可能的基因并没有发生突变。例如，对于一个已被发现其KRAS基因至少有一处突变、同时在另一个基因(例如EGFR基因)中也有突变的此类癌症患者而言，假如已知该患者对EGFR抑制剂有抗性，便不能再用EGFR抑制剂和HSP90抑制剂进行联合治疗，而只能用HSP90抑制剂进行单独治疗。当然，本项发明所涉及的各种联合疗法/联合治疗方案还可能包括放疗、传统化疗以及其他治疗手段。
[0088] 使用业内已有的各种方法可以检测出KRAS基因、EGFR基因和/或者BRAF基因以及其他可能的基因中的突变，关于这些方法的描述可以参考(Papadopoulos等，2006；Shendure等，2004)。技术人员可以将用来检测上述基因突变的方法应用到检测本文提及或者未提及的KRAS基因、EGFR基因和/或者BRAF基因的突变当中；同时他们将认识到，本项发明的内容还会涉及到本文未曾给予描述的但已为人所知的相关基因的各种突变情况，或者是尚待发现的各种突变情况。用来检测KRAS基因以及EGFR基因和/或者BRAF基因的突变的方法包括但不限于：核酸测序(例如Sanger双脱氧测序)、“下一代”法、单分子测序，以及那些能够检测出变异等位基因/突变的各种方法，例如实时PCR、PCR-RFLP检验(详见Cancer Research 59(1999)，5169-5175)、质谱基因型分析(例如MALDI-TOF)、HPLC、酶学方法以及SSPC(单链构象多态性分析；详见Pathol Int(1996)46，801-804)。
[0089] 特别地，以上这些方法还可以包括对DNA或者cDNA片段进行酶扩增，这需要使用可以与KRAS基因的外显子或者内含子区域发生特异性杂交的寡聚核苷酸，并通过PCR来完成扩增。考虑到KRAS基因的绝大多数(＞95％)突变都发生在2号或者3号外显子上，因此使用基因组DNA进行扩增时需要两轮循环反应，而使用cDNA时则只需要进行一轮扩增反应。得到的PCR产物可以用传统的Sanger双脱氧核苷酸测序法进行测序，或者采用新型的平行测序法(“下一代测序法”)，这些方法在Roche(454技术)、Illumina(Solexa技术)或者ABI(Solid技术)中都有相关说明。然后，可以通过与公共基因序列数据库数据进行比对来发现序列中的突变，或者通过等位基因的特异性探针结合来检测出突变，探针信号可以通过酶检测反应、荧光、质谱或者其他手段检测出来；具体可参见Vogeser(2007)Dtsch Arztebl 104(31-32)，A2194-200。
[0090] 石蜡包埋的临床材料也可能被用在KRAS基因突变的检测过程中，检测过程中需要对待检样品进行组织学观察以确认有肿瘤组织存在。在检测方法中可用到的一种特殊TM的检测手段是DxS Ltd Therascreen KRAS基因突变检测试剂盒，该试剂盒被设计用来检测KRAS基因中最常见的七个激活性突变。另一个可使用的商业化产品是DxS KRAS基因突变检测试剂盒。按照制造商的说法，该试剂盒的检测范围覆盖了在COSMIC有记录的发生于大肠癌中的突变的98.5％，即以下这些K-RAS突变：12Asp(GGT＞GAT)，12Val(GGT＞GTT)，12Cys(GGT＞TGT)，12Ser(GGT＞AGT)，12Ala(GGT＞GCT)，12Arg(GGT＞CGT)以及
13Asp(GGC＞GAC)。这些突变都是发生在KRAS基因中的激活性突变，并且预示着对HSP90抑制剂的易感性或者对HSP90抑制剂处理的响应性。关于上述K-RAS突变情况的试剂盒描述与本文描述之间的相互对应关系见下表：
13Asp(GGC＞GAC)。这些突变都是发生在KRAS基因中的激活性突变，并且预示着对HSP90抑制剂的易感性或者对HSP90抑制剂处理的响应性。关于上述K-RAS突变情况的试剂盒描述与本文描述之间的相互对应关系见下表：
[0091]12Asp(GGT＞GAT) KRAS_G12D
12Val(GGT＞GTT) KRAS_G12V
12Cys(GGT＞TGT) KRAS_G12C
12Ser(GGT＞AGT) KRAS_G12S
12Ala(GGT＞GCT) KRAS_G12A
12Arg(GGT＞CGT) KRAS_G12R
13Asp(GGC＞GAC) KRAS_G13D
12Val(GGT＞GTT) KRAS_G12V
12Cys(GGT＞TGT) KRAS_G12C
12Ser(GGT＞AGT) KRAS_G12S
12Ala(GGT＞GCT) KRAS_G12A
12Arg(GGT＞CGT) KRAS_G12R
13Asp(GGC＞GAC) KRAS_G13D
[0092] 一个典型的KRAS基因突变检测过程可按以下步骤进行：对样品进行石蜡包埋切TM TM片并提取DNA。然后联合使用Scorpions and ARMS (等位基因特异性PCR)技术扩增DNA，以便检测出七个最常见的核苷酸替换突变；这七个突变都发生在KRAS基因的第12位和13位密码子上。在理想情况下，该检测过程能够在野生型基因组DNA背景下检测出1％的突变型DNA。
[0093] 在上述检测过程中，一个阳性结果预示着KRAS基因中存在着一个激激活性突变(另见Mitsudomi T and Yatabe Y(2007)Cancer Sci 98：1817-24；Massarelli E et al(2007)Clin Cancer Res 13：2890-96；Finocchiaro G et al(2007)J Clin Oncol，ASCO年会纪要25(18S)：4021)。
[0094] 此外，还有其他各种可用作检测KRAS基因突变的商业化产品，例如DxS Ltd、48Graffon Street、Manchester、UK的相关产品。这些试剂盒也可用来检测原癌基因中的突变，尤其是TheraScreen产品可用来检测EGFR基因和KRAS基因中发生的突变。针对EGFR、RAS、RAF、BCR-ABL以及其他基因的可靠的生物学标记物也有相应的商业化产品可供选择。
[0095] 如后文以及附加案例所述，这些检测对HSP90抑制剂的易感性/对HSP90抑制剂处理的响应性的方法都含有第一个步骤，即让细胞、组织或者培养细胞接触某种HSP90抑制剂或者使其暴露于含有某种HSP90抑制剂的环境中。业内技术人员知晓如何进行这样一个接触/暴露的过程。例如，可以将这些细胞、组织或者培养细胞置于含有某种HSP90抑制剂的环境中进行孵育，而此环境中包含有合适的稀释剂、稳定剂以及/或者载体。当然，在接触/处理步骤(例如将细胞、组织或者培养细胞连同HSP90抑制剂一起孵育)中所使用的HSP90抑制剂的摩尔浓度需要根据HSP90抑制剂本身的性质来决定；同样，HSP90抑制剂的性质也决定了此步骤中将被选择性添加的稀释剂、稳定剂以及/或者载体。然而，在进行本项发明的抑制剂响应活性的测定时，技术人员将会知道需要添加哪些稀释剂、稳定剂和/或者载体以及类似的试剂，也会清楚这些稀释剂、稳定剂和/或者载体的合适浓度，还会知晓应使用何种HSP90抑制剂。用HSP90抑制剂处理细胞的其他方法还包括使用细胞矩阵或者复合阵。在这种方法中，细胞以阵列形式被固定在基质上，因此可以同时用多种抑制剂或者不同浓度的抑制剂进行处理；也有可能是备选的化合物以阵列形式被固定在基质上，而同时加入各种不同类型的细胞或者多份同种细胞进行处理。
[0096] 在本项发明中，尤其是涉及筛选对HSP90抑制剂具有响应性/易感性的细胞、组织和/或者培养细胞的方面，我们也设想可使用高通量筛选(HTS)的方法。合适的(HTS)方法已为业内熟知，附加案例中也提供了一个典型的高通量筛选方法的例子；业内技术人员可以将这个例子以及业内已有的HTS方法应用到本项发明的实施过程当中。
[0097] 阵列式筛选通常在液相中进行，并对每一种待测的细胞/组织/培养细胞至少进行一批次检测反应。常用的典型反应容器是微滴板，例如含有384个、1536个或者3456个孔的微滴板(相当于多个“原初”96孔板的组合)。
[0098] 此外，机器人技术、数据处理和控制软件以及灵敏检测器也是一台HTS设备普遍具有的组件。在很多时候，机器人系统是用来完成微滴板在不同操作平台之间的传送任务，从而实现样品和反应物的添加和混合、反应物的孵育以及最终的示值读出(检测)。通常，HTS系统可以同时完成很多个微孔板的样品制备、孵育以及检测分析过程。
[0099] 阵列检测可以通过一步反应来完成(通常情况下优先考虑这种方式)，也可以包括洗脱和/或者转移步骤。对信号的检测则可利用放射性以及荧光技术，例如荧光能量共振转移技术(FRET)、荧光偏振光普法(FP)以及类似的技术。本文提及的各种生物学样品也可用这种检测手段进行处理。需要特别指出的是，细胞检验和活体检验也可被用到HTS当中。细胞检验需要有细胞提取物，也就是从细胞、组织以及类似来源处获得的提取物。然而，我们在这里推荐使用细胞或者组织作为生物学样品(尤其是从某一患者或者易患癌症的个体上获得的样品)；而活体检验(可以使用合适的动物模型，例如本文描述的老鼠模型)则在验证/监测用HSP90抑制剂进行的治疗的过程中尤为有用。根据第一次检测的结果，在后续的检测中可以安排重复实验以便在缩小的条件设置范围内(例如在第一次检测中结果呈“阳性”的样品当中)获取更多的数据，并对观察到的现象进行确认和修正。
[0100] HTS不仅可以用来鉴定对HSP90抑制剂具有易感性/响应性的细胞、组织和/或者培养细胞，或者用来监测本文中对各种癌症疗法的疗效，还能用来鉴定可用在本项发明中的更多的HSP90抑制剂。通常情况下，对一个含有几十万种物质的化合物文库进行筛选需要花费几天到几个星期的时间。模拟筛选可以用来补充(或者是代替)实验性高通量筛选。例如，假如已知目标分子(例如HSP90)的结构，便可以采用“接合”类的方法；假如已知可与目标结合的分子的结构(例如此文提及的HSP90抑制剂)，便可以采用药物建模来设计新的可与目标分子发生结合的新物质。在动物模型(活体)中，一个合适的示值是肿瘤的生长情况(或者对肿瘤生长的完全抑制或者部分抑制以及/或者病情的缓解)。用来检测基因(例如KRAS基因)突变的高通量方法涉及到大量的平行测序手段，比如“皮滴板焦磷酸测序法”。这个方法需要将某一DNA文库的片段固定在微米级的小珠上，接着进行PCR扩增，然后对皮滴板中每一个被扩增的模板进行焦磷酸测序反应(Thomas RK等，Nature Med2007)，一次实验便可得到超过200000个独立的克隆测序结果。此外，还有质谱基因型分析方法(Thomas RK等；Nat Gen2007)以及其他诸如“下一代测序”(Marguerat S等；Biochem Soc Trans 2008)等方法可供选择。
[0101] 本文提及的“细胞”“组织”以及“培养细胞”等词组在业内已有约定俗成的含义，也可在《细胞》(Garland Publishing，Inc.，第三版)一书中查找到。一般来讲，本文所指的“细胞”是指一个单一细胞或者一个细胞群。而“细胞群”在本项发明中是指由多个细胞组成的一群细胞。因此，在这样的一个细胞群内的细胞可能具有相似的功能，并且这些细胞可能是相互联结的或者是相互独立的。本项发明中提及的“组织”专指具有类似功能的一群细胞，“培养细胞”则是指在一定条件下培养/生长起来的具有上述定义的各种细胞。培养细胞包括多种细胞，尤其是从多细胞真核生物上(提取/获得)来的细胞，一般是从动物身上获得。需要注意的是，本文所说的“培养细胞”也可以是“组织培养”以及/或者“器官培养”；在这里，“器官”是指完成共同功能的多种组织集合。
[0102] 在理想情况下，用HSP90抑制剂处理的细胞、组织或者培养细胞应当取自或者本身就是肿瘤细胞。这些肿瘤细胞可通过活组织检查获得，尤其是通过对以下病症患者/个体的活检获得：非小细胞肺癌、肺腺癌、胰腺癌、结肠癌、乳腺癌、白血病、前列腺癌、淋巴瘤、脑瘤、小儿肿瘤以及肉瘤等等；或者也可以从易患上述癌症的病人/个体处获得。作为细胞来源的患病个体优先选择人类。本文所指的“哺乳动物肿瘤细胞”是指从哺乳动物身上获取的或者本身即为哺乳动物肿瘤细胞；下文还将对“哺乳动物”这一词进行说明。因此结合前文对“细胞”“组织”以及“培养细胞”的说明，“哺乳动物肿瘤细胞”则可以理解为是通过活组织检查、尤其是对以下癌症患者/个体的活检而得到的，包括：非小细胞肺癌、肺腺癌、胰腺癌、结肠癌、乳腺癌、白血病、前列腺癌、淋巴瘤、脑瘤、小儿肿瘤以及肉瘤等等；此外也可能是从易患上述疾病的患者/个体处获得。本文所说的“肿瘤细胞”也指“癌细胞”。
[0103] 一般而言，前文提及的这些肿瘤细胞或者癌细胞可能取自任何一种生物来源/有机体，尤其是患有上述各种病症的生物来源/有机体，如非小细胞肺癌、肺腺癌、胰腺癌、结肠癌、乳腺癌、白血病、前列腺癌、淋巴瘤、脑瘤、小儿肿瘤以及肉瘤等等。
[0104] 通常情况下，用来进行抑制剂处理的(肿瘤)细胞或者(癌)细胞最好是取自动物体；假如能从哺乳动物身上获得这些(肿瘤)/(癌)细胞则更好。关于这里所指的“动物”或者“哺乳动物”，业内已有相关的定义，也可以在Wehner and Gehring(1995；Thieme Verlag)中查找到。代表性的哺乳动物有偶蹄类动物比如羊、牛以及猪，奇蹄类动物比如马，还包括肉食动物例如猫和狗。在本项发明中，我们特别推荐使用取自那些具有经济学、农学或者科学重要性的生物的DNA样品。具有科学或者实验价值的生物包括但不仅限于小鼠、大鼠、兔子、豚鼠以及猪。
[0105] 肿瘤细胞还可以取自灵长类动物，包括狐猴、猴以及猿。这里提及的“灵长类”“狐猴”“猴”“猿”的含义在Wehner and Gehring(1995；Thieme Verlag)中都能查找到。如上文所述，肿瘤或者癌细胞最好是取自患有非小细胞肺癌、肺腺癌、胰腺癌、结肠癌、乳腺癌、白血病等疾病的患者。在本项发明中特别有用的细胞，尤其是肿瘤或者癌细胞都是人类细胞。这些细胞可以通过活组织检查或者从生物学样品中获取，但是这里提及的“细胞”也可以指离体培养的细胞。
[0106] 附图18展示了在附加案例中优先使用的细胞或者培养细胞，这些细胞/细胞系包括但不仅限于H2030、H358、SKLU1、HCC44、H1944、H157、H1355、H2122、H441、HCC461、A427、H1734、H1792、H460、DV-90、Calu1、H2009、A549、LCLC97TM1、HCC515、HOP62、Calu6、H647、HCC1171、H2444以及H2887细胞系。这些细胞系已为业内所熟知，并且可以从ATCC公司和/或者DSMZ公司获得；作为NCI60癌细胞库的一部分，美国国家癌症研究所(U.S.National Cancer Institute)也可提供以上个细胞系(www.lgcpromochem-atcc.com/；www.dsmz.de/；dtp.nci.nih.gov/docs/misc/common_files/cell_list.html)。
[0107] 用来检测对HSP90抑制剂处理的响应性的方法还包括测定HSP90的活性/表达水平，而此活性/表达水平则预示着细胞、组织或者培养细胞是否会对某种HSP90抑制剂具有易感性或者说对HSP90抑制剂处理具有响应性。这里所说的“HSP90的活性”是指某种HSP90蛋白(由hsp90基因编码的蛋白)的活性；“HSP90的表达”则同“HSP90基因的表达”一样，都是指hsp90基因的表达。上述关于“HSP90的活性”/“HSP90的表达”的定义方式同样适用于“KRAS的活性”/“KRAS的表达”、“EGFR的活性”/“EGFR的表达”以及“BRAF的活性”/“BRAF的表达”，只需对基因名字稍加改变即可。需要指明的是，在经过某种HSP90抑制剂处理的细胞、组织或者培养细胞当中检测出来的HSP90的活性/表达水平，需要与在对照细胞、组织或者培养细胞中检测出来的活性/表达水平进行比较，对照组即为未经某种HSP90抑制剂处理的细胞、组织或者培养细胞。相关技术人员将会知晓有关此类检测的方法和手段，并安排合理的实验对照。理想情况是，对照组细胞、组织或者培养细胞与实验组细胞、组织或者培养细胞完全相同，不同之处仅仅在于对照组细胞、组织或者培养细胞不用HSP90抑制剂进行处理。
[0108] 一般而言，HSP90蛋白/多肽以及/或者HSP90多聚核苷酸/核酸分子的活性/表达水平降低，预示着对某种HSP90抑制剂的易感性或者对HSP90抑制剂处理的响应性。在理想的情况下，与对照组细胞、组织或者培养细胞相比，经过某种HSP90抑制剂处理的细胞、组织或者培养细胞的HSP90的活性/表达水平可降低至少10％、20％、30％、40％、50％、
60％、70％、80％，最高时可降低90％。需要注意的是，HSP90活性并非一定与其表达水平相关。因此，也可能出现HSP90表达水平提高、但由于HSP90抑制剂的存在而导致其活性降低的情况。但是，业内技术人员会注意到这类“矛盾”现象，并且在测定对HSP90抑制剂的易感性或者对HSP90抑制剂处理的响应性时，合理地评测HSP90的活性(亦即HSP90蛋白的活性/功能)。
60％、70％、80％，最高时可降低90％。需要注意的是，HSP90活性并非一定与其表达水平相关。因此，也可能出现HSP90表达水平提高、但由于HSP90抑制剂的存在而导致其活性降低的情况。但是，业内技术人员会注意到这类“矛盾”现象，并且在测定对HSP90抑制剂的易感性或者对HSP90抑制剂处理的响应性时，合理地评测HSP90的活性(亦即HSP90蛋白的活性/功能)。
[0109] 如前所述，业内技术人员会对检测和评估HSP90活性/表达水平的相关手段和方法有所了解。可应用的典型方法包括但不限于各种分子生物学方法例如蛋白质印迹(Western Blots)、RNA杂交(Northern Blots)、实时PCR等等。
[0110] 假如基因产物是某种RNA，尤其是mRNA(例如未剪切的、部分剪切的或者完全剪切的mRNA)，则可以采用Northern杂交技术、微阵列杂交技术或者DNA芯片进行检测，这些方法都需要用到一种或者多种甚至是成套的针对mRNA的特异性探针；或者可以采用上述定量PCR技术，例如实时PCR(Rea-Time PCR)技术。这些以及其他适宜用来结合(特异性的)mRNA的方法在业内已经很成熟，在Sambrook and Russell(2001，见前文引述)中也有相应的描述。技术人员还可以根据检测信号的强度与基因产物量之间的关系、尤其是线性关系，对某一特定成分、尤其是上述基因产物进行定量。
[0111] 假如待检成分是某种多肽/蛋白质，则可以采用上述技术、尤其是蛋白质印迹(Western Blots)技术进行定量。技术人员普遍熟悉对多肽/蛋白质进行定量的方法。溶解的纯化多肽可用物理学方法例如光度测定法进行定量。对混合物中某一特定多肽进行定量，则需要依靠诸如抗体等的特异性结合。利用抗体的特异性进行特异性检测和定量的一个例子是(在体)免疫组化方法。蛋白质印迹技术则结合了电泳分离混合蛋白以及用抗体进行特异性检测两方面的内容。电泳可以是多维的例如二维电泳。通常情况下，二维电泳是在一个方向上根据多肽的表观分子量、另一个方向上根据其等电点对多肽进行分离。此外，蛋白质定量方法还包括但不限于质谱或者酶结合免疫吸附测定等方法。
[0112] 在一项具体实施方案中，本项发明涉及到离体鉴定某种HSP90抑制剂响应者或者易感性患者的方法，此方法包括以下步骤：(a)从疑似患有或者易患某种癌症的患者身上获得样品，此种癌症的特点是在KRAS基因中至少有一处突变(尤其是激活性突变)，同时选择性地在EGFR基因和/或者BRAF基因中也有突变(再次指出，KRAS基因的激活性突变尤其重要)；(b)对于发生在KRAS基因以及EGFR基因和/或者BRAF基因中的突变进行检测。仅有KRAS基因发生突变、或者同时在EGFR和/或者BRAF基因中也发生突变，都预示着该患者对某种HSP90抑制剂具有响应性或者易感性。正如本文所指出的，KRAS基因的激活性突变在实施方案中有着至关重要的意义。
[0113] 上述样品可以通过活组织检查获得，最好是取自疑似患有或者易患癌症的患者。这里所指的癌症最好是以KRAS基因中至少有一处突变为特征，同时也还可能以EGFR基因和/或者BRAF基因中至少有一处突变为特征。上述样品最好是取自肿瘤体的肿瘤细胞或者肿瘤组织，可优先考虑从中提取样品的肿瘤包括前文已给予说明的非小细胞肺癌、肺腺癌、胰腺癌、结肠癌、乳腺癌、白血病、前列腺癌、淋巴瘤、脑瘤、小儿肿瘤以及肉瘤等等。通过使用相关领域的标准技术以及本文提供的各种方法，技术人员可以很容易地鉴别出这些以KRAS基因中至少有一处突变为特征的癌症类型。
[0114] 本项发明的另一个实施方案涉及到一种寡聚或者多聚核苷酸，这种核苷酸可用来检测KRAS基因中的突变，从而对上文所定义的对HSP90抑制剂的易感性进行预测诊断。通常情况下，这种寡聚核苷酸链长度为大约15到100个核苷酸。根据个人知识背景以及本文提供的技术方法，业内技术人员可以很容易地鉴别并且/或者制备这种可用来检测KRAS基因以及EGFR和/或者BRAF基因突变的寡聚或者多聚核苷酸。这些寡聚或者多聚核苷酸尤其是可以作为探针在本文提及的检测方法中得到应用。技术人员应该对可用来协助鉴别相应探针的计算机程序有所了解。例如，为了找到可用来检测KRAS基因突变的探针，可以参考KRAS基因的核酸序列(SEQ ID第1或者157号序列)。同样地，参考EGFR基因的序列(SEQ ID第149、151、153、155号序列)和BRAF基因的序列(SEQ ID第147号序列)，便可找出各自相应的探针。标准的KRAS、EGFR以及BRAF基因核酸序列在相应的数据库上也可找到，例如NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez)。在这个数据库中，根据编号“Gene ID：3845”便可找到KRAS基因的核酸序列；同样地，根据编号“Gene ID：1956”以及“Gene ID：673”，就可以分别找到EGFR基因和BRAF基因的序列。如前文所述，除了数据库信息之外，KRAS、EGFR以及BRAF基因的标准核酸序列在本文的SEQ ID第1、157号序列、SEQ ID第149、151、153、155号序列以及SEQ ID第147号序列中分别予以标示。
[0115] 在一项特别的实施方案中，提供了一种用于监测癌症治疗的疗效的方法；在这些患有或者易患此类癌症的个体/病人当中，所提及的癌症都以在KRAS基因中以及选择性地在EGFR基因和/或者BRAF基因中至少有一处突变为特征。此方法包括如下步骤：
[0116] a)在取自上述受治疗者/患者的细胞或者组织样品中，检测KRAS以及EGFR和/或者BRAF基因的活性/表达水平；
[0117] b)将a)步骤中检测出的至少一种标记基因的活性/表达水平与参考或者对照组基因(KRAS基因以及EGFR和/或者BRAF基因)的活性/表达水平进行比较，两者的差异程度表明治疗癌症的效果。
[0118] 按照本文别处的定义，这里所说的“活性”是指某种蛋白的活性；而“表达水平”是指在蛋白层次(例如可用蛋白质印迹等方法进行检测)上的表达水平或者转录水平(例如剪切的、未剪切的或者部分剪切的mRNA，可用RNA杂交、实时PCR等手段进行检测)。在监测或者预测疗效的方法中所提及的标记基因主要是指KRAS基因，以及EGFR基因和/或者BRAF基因。再次说明，KRAS基因的激活性突变在本文的实施方案中尤为重要。
[0119] 对治疗癌症的疗效进行监测的方法可能还包括一步，即在(例如通过活检)取自患有上述癌症的个体/患者的细胞或者组织样品中检测出KRAS基因中的至少一处突变；此外，还可能需要对EGFR基因和/或者BRAF基因中的突变进行检测。例如，在对癌症开始进行治疗之前，某个样品中可能含有KRAS基因(以及EGFR基因和/或者BRAF基因)的突变。在治疗过程中或者治疗结束后，带有KRAS基因(以及EGFR基因和/或者BRAF基因)突变的肿瘤细胞被清除掉或者消失了。于是，在癌症治疗过程中或者治疗结束后消失的这些取自受治疗者/患者的样品(细胞样品/活检样品等等)中的基因突变，便可说明治疗的疗效。
[0120] 本项发明还涉及到一种用于预测癌症治疗的疗效的方法；同样地，在这些患有或者易患此类癌症的个体/病人当中，所提及的癌症都以在KRAS基因中以及选择性地在EGFR基因和/或者BRAF基因中至少有一处突变为特征。此方法的步骤包括：a)在取自上述受治疗者/患者的细胞或者组织样品中，检测KRAS基因以及EGFR基因和/或者BRAF基因的活性、或者是由KRAS、EGFR和/或者BRAF基因组成的基因群中至少一种标记基因的表达水平；b)将a)步骤中检测出的KRAS基因以及EGFR基因和/或者BRAF基因的活性、或者是至少一种上述标记基因的表达水平，与KRAS基因以及EGFR基因和/或者BRAF基因的参考活性或者参考表达水平进行比较(参考活性或者参考表达水平可通过对对照组个体/患者(响应者以及/或者非响应者)的细胞或者组织样品进行检测而获得)，两者的差异程度表明可预期的治疗效果。同样需要指出的是，激活性KRAS基因突变在这一实施方案中尤其受到关注。
[0121] 此外，对于以KRAS基因中至少有一处突变、同时在EGFR基因和/或者BRAF基因中也至少有一处突变为特征的癌症，相关的治疗过程还包括对上述HSP90抑制剂进行管理。
[0122] 本项发明对KRAS基因的突变作为对HSP90抑制剂易感性的标记物/预测物进行了说明；按照我们提供的方法，可以鉴别出HSP90抑制剂的响应者或者对其敏感的患者。相应地，本项发明还提供了这样一种可能性，即KRAS活性一旦发生(异常)变化，便可以通过测定相应标记基因的活性来发现这些变化。在其他情况下，也可以检测到HSP90活性的(异常)变化。
[0123] (发生突变的)KRAS基因以及(发生突变的)EGFR基因、(发生突变的)BRAF基因和/或者HSP90基因的活性，不仅可以通过测量其表达水平来进行检测，对HSP90或者EGFR基因而言，也可以测量其底物转化率；对KRAS基因而言，则可以测量其GTP酶活性或者通过测量诸如磷酸-Akt或者磷酸-Erk的水平来检测下游信号通路成员的激活情况；对BRAF基因而言，则还可以测量BRAF或者Erk的磷酸化水平。检测上述蛋白活性的手段和方法在业内已较为成熟，也可参考Lottspeich(Spektrum Akademischer Verlag，1998)。如前文所述，检测蛋白的活性包括检测其表达水平。相应地，我们可以用标准技术来检测(发生突变的)KRAS基因以及(发生突变的)EGFR基因、(发生突变的)BRAF基因和/或者HSP90基因的表达情况(亦即基因产物的表达，例如mRNA和/或者蛋白质)。发生在KRAS基因以及EGFR基因和/或者BRAF基因中的突变，并不一定与这些基因表达水平的改变相关。因此在本项发明中，我们并不推荐使用测量基因表达情况的途径来检测(发生突变的)KRAS基因以及(发生突变的)EGFR基因和/或者(发生突变的)BRAF基因的活性，而是采用可以反映相应蛋白酶活力的方法来进行检测。需要注意的是，与野生型基因编码的蛋白的活性(即参考活性)相比，突变的KRAS基因以及突变的EGFR基因和/或者突变的BRAF基因编码的变异蛋白其活性可能会有所改变，但是其表达水平却没有变化。在理想的情况下，与野生型KRAS以及野生型EGFR和/或者野生型BRAF(对照)相比，突变的KRAS以及突变的EGFR和/或者突变的BRAF的活性会提高，尤其是前文提及的酶活力和/或者表达水平会升高。相对于“正常”活性(即野生型KRAS以及野生型EGFR和/或者野生型BRAF的活性)的标准活性变化范围将在后文给予说明。这里所说的“野生型”是指“原始的”核酸序列和氨基酸序列，或者是由不含有前文所述的诸如“KRAS突变”“EGFR突变”以及“BRAF突变”等突变的核酸序列所编码的蛋白质。本项发明中所指的“提高的活性”是指一种更高的活性，尤其是指相对于野生型(KRAS)基因而言，发生激激活性突变的KRAS基因所具有的更高的活性。
[0124] 除了测定上述这些“标记基因”KRAS、EGFR和/或者BRAF所编码的蛋白的活性之外，还可以检测c-RAF基因和/或者Aktin基因的活性/表达水平。C-RAF基因和Aktin基因以及相应的蛋白已广为人知，附加案例中对这些蛋白的表达情况进行了测定。在本项发明中，C-RAF基因和/或者Aktin基因也可被用作“标记基因”。在后文中，所有关于KRAS、EGFR和/或者BRAF基因在疗效监测或者疗效预测中的作用的说明和解释，同样适用于C-RAF基因和/或者Aktin基因。
[0125] 基于以上这些发现，本项发明所具有的一个特别的优势是，可以按照我们提供的方法，通过测定KRAS基因以及EGFR基因和/或者BRAF基因的活性、或者是测定至少一种上述标记基因的表达水平，来尽早发现突变的KRAS基因以及突变的EGFR基因、突变的BRAF基因和/或者HSP90基因活性/表达水平的(异常)变化情况；也就是说，对这类以KRAS基因中至少有一处突变、同时在EGFR基因和/或者BRAF基因中也有突变为特征的癌症的治疗效果，可以尽早地进行监测和预估。因此，利用本项发明提供的方法手段，也可以尽早发现治疗过程中可能出现的治疗抗性。
[0126] 在一项特别的实施方案中，本项发明用到了尽早发现突变的KRAS基因以及突变的EGFR基因、突变的BRAF基因和/或者HSP90基因活性/表达水平(异常)变化的相关方法和手段。对这些(异常)变化的早发现，能够带来很多益处，例如受治疗者/患者的寿命预期得到延长/存活的可能性得以提高(因为及时发现可能出现的治疗失败并相应地调整治疗策略)，患者能得到更为有效的治疗(因为可以尽早避免/发现治疗失败的情况，所以在治疗策略上尽早地进行相应的调整，也就是说，及时换用另一种更合适的抑制剂，在确诊治疗失败之后尽快停止费用高昂而又无效的治疗手段，并采用其它备选的治疗手段)。
[0127] 在上述本项发明的实施方案中，“尽早”意味着在(完全或者部分)细胞遗传的或者血液病学的反应(发作)之前，或者是指在用任何一种成像技术可以检测出治疗反应之前，也/或者还指在以KRAS基因中至少有一处突变、同时在EGFR基因和/或者BRAF基因中也至少有一处突变为特征的癌症发病之前。
[0128] 例如，对治疗上述癌症的疗效的“尽早”监测，可能比(部分)细胞遗传的或者血液病学的反应(发作)、或者是比用任何一种成像技术可以检测出治疗反应提前了至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少10天或者至少14天，也/或者可能比完全出现细胞遗传的或者血液病学的反应、或者是比用任何一种成像技术可以检测出(针对患者或者对照患者(响应者)的)治疗反应提前了至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少10个月、至少12个月、至少15个月或者至少18个月，提前的时间越长越好。
[0129] 同样地，对治疗上述癌症的疗效的“尽早”监测，也可能是在治疗(开始)之后至多1天、至多2天、至多3天、至多4天、至多5天、至多6天、至多7天、至多10天或者至多14天的时候进行，滞后的时间越短越好。最理想的情况是，从治疗开始的当天便开始对癌症治疗疗效进行监测，也就是说，从突变的KRAS基因以及突变的EGFR基因、突变的BRAF基因和/或者HSP90基因的活性/表达水平在相应治疗的作用下发生变化时起，便进行疗效监测。
[0130] 以下是根据本项发明的内容、对治疗本文定义的各种癌症的疗效进行(尽早)监测的流程的一个开放性例子：
[0131] ●在监测上述癌症的治疗过程时(例如使用本文提及的某种HSP90抑制剂(如17-AAG)进行治疗)，对于KRAS基因以及EGFR基因和/或者BRAF基因的活性/标记基因(即突变的KRAS基因以及突变的EGFR基因、突变的BRAF基因和/或者HSP90基因)的表达水平，需要在治疗开始后的第一周内每天进行测定，并在治疗开始后的第一个月内每周进行测定，再往后每个月进行测定。
[0132] ●参考活性/表达水平可以在治疗开始的当天进行测定，测定对象是接受治疗的受治疗者/患者或者是相应的对照个体/患者(响应者/非响应者)；见下述。
[0133] ●如果连续在两个样品中观测到标记基因表达水平上升，或者标记基因表达水平下降得不够快(例如，比响应者的表达水平下降得慢，或者并不显著快于非响应者表达水平的下降速度)，则需要考虑改变治疗策略。
[0134] 需要注意的是，上述例子是开放性的。在本文的指导以及个人知识背景基础上，技术人员可以根据每一个患者的特殊情况，按照相关的特殊治疗要求对上述流程进行合理调整和应用。
[0135] 例如，对治疗本文所述癌症的疗效的“尽早”预测，可能比由于治疗用药而(出现)(部分)细胞遗传的或者血液病学的反应提前了至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少10天或者至少14天，也/或者可能比完全出现细胞遗传的或者血液病学的反应、或者是比用任何一种成像技术可以检测出治疗反应提前了至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少
10个月、至少12个月、至少15个月或者至少18个月，提前的时间越长越好。
10个月、至少12个月、至少15个月或者至少18个月，提前的时间越长越好。
[0136] 同样地，对治疗本文所述癌症的疗效的“尽早”预测，也可能是在治疗(开始)之后至多1天、至多2天、至多3天、至多4天、至多5天、至多6天、至多7天、至多10天或者至多14天的时候进行，滞后的时间越短越好。最理想的情况是，从治疗开始的当天便开始对癌症治疗疗效进行预测，也就是说，从突变的KRAS基因以及突变的EGFR基因、突变的BRAF基因和/或者HSP90基因的活性/表达水平在相应治疗的作用下发生变化时起，便进行疗效预测。
[0137] 此外，对治疗本文所述癌症的疗效的“尽早”预测，还可能是在病情得到确诊之后之多1天、至多2天、至多3天、至多4天、至多5天、至多6天、至多7天、至多10天或者至多14天的时候开始，滞后的时间越短越好。最好是能够在确诊当天便开始对疗效进行预测。
[0138] 如前文所述，本项发明在监测治疗相关癌症的疗效方面非常有用，本文也提供了相应的各种手段、用法和方法。一般而言，对某种特定的疗法/治疗手段的疗效进行监测已经成为一种临床常规。因此，相关人员应熟知对某种疗法/治疗手段的疗效进行监测的含义。在本项发明中，术语“监测”的含义包括诸如“追踪”“发现”等意思。特别地，本文所说的“监测针对以KRAS基因中至少有一处突变、同时在EGFR基因和/或者BRAF基因中也至少有一处突变为特征的癌症的疗法/治疗手段的疗效”，是指观测患有(或者易患)上述癌症的受治疗者/患者是否会对相应的疗法/治疗手段产生反应，以及/或者是这种反应的情况如何(例如，反应有多快/慢，以及/或者反应的程度如何)。
[0139] 如本文所述，本项发明还可以用来预测对癌症的疗法/治疗手段的疗效，本文也提供了相应的各种手段、用法和方法。一般而言，在临床常规中对某种特定疗法/治疗手段的疗效进行预测是非常有必要的，因为这可以预防相关疾病的发生以及/或者提高相应疗法/治疗手段的疗效，从而节约成本和时间，并延长患者的寿命预期/提高其存活的可能性/促进其康复过程。关于“针对以KRAS基因中至少有一处突变、同时在EGFR基因和/或者BRAF基因中也至少有一处突变为特征的癌症的疗法/治疗手段的疗效”的定义也适用于此处，稍作相应改动即可。在本项发明中，所说的“预测在受治疗者/患者身上进行的、针对以KRAS基因中至少有一处突变、同时在EGFR基因和/或者BRAF基因中也至少有一处突变为特征的癌症的疗法/治疗手段的疗效”，相当于观测某一受治疗者/患者是否会对相应疗法/治疗手段产生易感性，或者产生易感性的程度如何；也就是说，观测上述受治疗者/患者是否会对针对上述病症的某种疗法/治疗手段产生反应，以及/或者这种反应的情况如何(例如反应有多快/慢，以及/或者反应的程度如何)。特别地，根据本项发明的设计，当某一受治疗者/患者的突变KRAS基因以及突变的EGFR基因、突变的BRAF基因和/或者HSP90基因活性/表达水平出现异常时，该受治疗者/患者便会表现出对上述癌症的易感性。
[0140] 在一项实施方案中，按照本项发明所进行的“对上述癌症的疗法/治疗手段的疗效的预测”，可能是在治疗开始之后进行，亦即在治疗过程中进行疗效预测。特别地，所说的“预测”可以在监测针对上述癌症的疗法/治疗手段的疗效的过程中进行，最好是在监测开始之后尽早开始预测。因此，疗效预测可能需要以治疗过程中在某个时间点监测到的结果为依据。这个时间点要尽可能地早，例如在获得第一个监测结果的时候。在一个正在进行的治疗过程中，“预测针对本文定义的癌症的疗法/治疗手段的疗效”，是指上述疗法/治疗手段在接下来的治疗过程中的/在后续治疗过程中的疗效。
[0141] 在另一项实施方案中，按照本项发明所进行的“对上述癌症的疗法/治疗手段的疗效的预测”，可能是(紧接)在确诊之后但是在治疗开始之前进行。在这种情况下，“预测针对上述癌症的疗法/治疗手段的疗效”，则是指对尚未开始的治疗的疗效进行预测(或者是刚好在进行预测的同时开始进行治疗)。
[0142] 在本项发明的一个实施案例中，一个健康的对照受治疗者/患者的开放性例子是带有野生型KRAS基因的受治疗者/患者，尤其是对于导致KRAS基因异常活性/异常表达水平的突变而言。也就是说，上述健康的对照受治疗者/患者的KRAS基因中不带有导致其异常活性/异常表达水平的突变(例如KRAS_G12C，KRAS_G12R，KRAS_G12D，KRAS_G12A，KRAS_G12S，KRAS_G12V，KRAS_G13D，KRAS_G13S，KRAS_G13C，KRAS_G13V，KRAS_Q61H，KRAS_Q61R，KRAS_Q61P，KRAS_Q61L，KRAS_Q61K，KRAS_Q61E，KRAS_A59T以及KRAS_G12F)。这些突变也显示在附属SEQ ID第3到78号序列中。
[0143] 根据本文所定义的用来监测治疗癌症的疗效的手段、方法和用法，上述KRAS基因的参考活性或者表达水平，以及(也就是说除了测定KRAS基因的活性/表达水平之外)EGFR基因和/或者BRAF基因的参考活性或者参考表达水平，是指在相应的健康的对照受治疗者(的样品)中测得的活性/表达水平，亦即“正常的”活性/表达水平。
[0144] 需要指明的是，当本文所指的标记基因出现异常活性或者表达水平时，便意味着KRAS基因的活性或表达水平、以及(也就是说除了KRAS基因的活性/表达水平之外)本文所述的EGFR基因和/或BRAF基因的活性/表达水平，与上述KRAS基因的参考活性或者参考表达水平、以及EGFR基因活性/表达水平和/或者BRAF基因活性/表达水平有所不同。在本文中，这些标记基因的参考活性或者参考表达水平是指“正常的”活性/表达水平。而具体到本文中对治疗相关癌症的疗效进行监测/预测的手段、方法和用法时，在一项实施方案中，对照受治疗者/患者则是指患有或者易患上述癌症的受治疗者/患者，亦即KRAS基因活性/表达水平发生异常的受治疗者/患者；所以，这里的参考活性/表达水平不再是本项发明所定义的KRAS基因的“正常活性”或者正常表达水平。
[0145] 因此很明显地，“不同的”活性或者表达水平意味着升高或者降低；而具体是升高还是降低，则需要视本文提及的癌症是导致KRAS基因以及(也就是说除了KRAS基因的活性/表达水平之外)EGFR基因和/或者BRAF基因的活性或表达水平上调还是下调的情况而定。
[0146] 在本文中，“不同的”“升高的”或者“降低的”意味着不同于、高于或者低于KRAS基因以及(也就是说除了KRAS基因的活性/表达水平之外)EGFR基因和/或者BRAF基因的正常活性或者表达水平(变化范围)。例如，不同于、高于或者低于可能意味着相差、高出或者低了至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少7倍、至少10倍、至少15倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍、或者至少200倍；这里优先考虑高出的情况。
[0147] 在本文的指导以及个人知识背景基础上，技术人员可以很容易地检测出KRAS基因的活性或者表达水平是否发生变化(亦即在某一方向上变化，如“升高”或者“降低”)以及变化的程度如何。需要指出的是，除了KRAS基因的变化以外，还可以测定EGFR基因和/或者BRAF基因的表达水平和/或者活性。在本文的指导以及个人知识背景基础上，技术人员也可以很容易地选择性测量或者评估EGFR基因和/或者BRAF基因的活性和/或者表达水平。
[0148] 在这里尤其需要注意的是，对照受治疗者/患者也需要接受与实验组受治疗者/患者相同的针对相关癌症的治疗，以便确认该对照受治疗者/患者在治疗过程中是响应者还是非响应者。
[0149] 在本文的指导以及/或者个人知识背景基础上，技术人员可以鉴别出某一个受治疗者/患者是否是针对相应癌症的疗法/治疗手段的“响应者”或者“非响应者”。相应地，如果患者的KRAS基因、以及EGFR基因和/或者BRAF基因的表达/活性在治疗作用下发生了下降，则可以认为该患者对这种疗法/治疗手段有响应。在理想情况下，KRAS基因以及EGFR基因和/或者BRAF基因的表达/活性可以恢复到对照表达/活性水平(例如在取自未患上述癌症的人的样品中测得的活性)。换句话说，KRAS基因以及EGFR基因和/或者BRAF基因的表达水平或者活性下降，预示着一个成功的疗法/治疗手段。技术人员可以通过检测KRAS基因以及EGFR基因和/或者BRAF基因的表达水平或者活性来确定某一患者是否会对癌症疗法/治疗手段有响应。除了测量上述基因表达水平或者活性，技术人员还可以通过检测某一特定癌症的细胞学/血液病学的特征参数来预估某一患者是否对癌症疗法/治疗手段有响应。
[0150] 相反地，对抗癌治疗没有响应的患者在接受治疗时，不会出现KRAS基因以及EGFR基因和/或者BRAF基因表达水平或者活性的降低，这正好与那些出现了表达水平以及/或者活性降低的“响应者/响应性患者”相反。
[0151] 特别地，对一个“响应性”受治疗者/患者而言，其细胞学/血液病学的参数和/或者(异常的)KRAS基因活性或表达水平(以及相应标记性基因的表达水平、KRAS基因以及EGFR基因和/或者BRAF基因的活性)在抗癌治疗的作用下，会朝着其“正常”活性/(蛋白或者mRNA表达)水平方向发生(显著的)变化。在某一具体的实施方案中，“响应者”可能是那些不会出现某种抗性的受治疗者/患者。相应地，对一个“非响应性”受治疗者/患者而言，其细胞学/血液病学的参数和/或者(异常的)KRAS基因以及EGFR基因和/或者BRAF基因的活性或表达水平(以及相应标记性基因的表达水平)在抗癌治疗的作用下，不会朝着其“正常”表达水平的方向发生(显著的)变化。在某个具体的实施方案中，“非响应者”可能是那些出现了某种抗性的受治疗者/患者。
[0152] 在本项发明的实施方案中，对于患有或者易患某种癌症的对照受治疗者/患者(响应者和/或者非响应者)而言，一个开放性的代表是那些带有变异KRAS基因的受治疗者/患者，该突变导致KRAS基因活性/表达发生异常。
[0153] 技术人员将会知道，对于患有一种已知的以在KRAS基因中至少有一处突变为特征的癌症(例如非小细胞肺癌、肺腺癌、胰腺癌、结肠癌)的患者而言，当其接受某种疗法/治疗手段的治疗时，一种典型的/预期的反应将要或者应该如何发生。此外，技术人员还可考量，对于患有某种(未知的)以在KRAS基因中至少有一处突变为特征的癌症的患者而言，当其接受某种(未知的)疗法/治疗手段的治疗时，一种典型的/预期的反应将要或者应该如何发生。以这样一种认知为基础，便可以在没有某种对照受治疗者/患者(的样品)的情况下，应用本项发明中涉及到保证此类癌症治疗的疗效的各种手段、方法和用法；也就是说，不用再将“KRAS基因以及EGFR基因和/或者BRAF基因的活性、或者至少一种标记基因的表达水平”与“KRAS基因以及EGFR基因和/或者BRAF基因的参考活性、或者从对照受治疗者/患者(样品)中测得的参考表达水平”进行比较。在治疗某种癌症的过程中，只需要简单地将测得的“KRAS活性”以及“EGFR活性”和/或者“BRAF”活性、或者是“KRAS表达水平”以及“EGFR表达水平”和/或者“BRAF表达水平”与上述已知的“典型的/预期的反应”相比较，技术人员便可以考察所监测/预测的疗法/治疗手段的疗效。假如某个受治疗者/患者的治疗反应与“典型的/预期的反应”同样迅速(或者甚至更快)，该受治疗者/患者即为“响应者”。如果某个受治疗者/患者的治疗反应比“典型的/预期的反应”更慢，该受治疗者/患者即为“非响应者”(不能观察到显著的反应)或者“弱响应者”。
[0154] 一般而言，对本文提及的或者对之具有易感性的癌症进行治疗的(预期)疗效是可以预见/预测的；在这种情况下，KRAS以及EGFR和/或者BRAF等“标记基因”的异常的(即增强的或者减弱的)活性或者表达水平，会由于上述抗癌治疗的作用而朝着(健康的)对照受治疗者/患者的“正常水平”发生转变。
[0155] 在本项发明中，当(将要)接受治疗的受治者/患者出现与“响应者”同样迅速(或者甚至更快的)并且同样完全的治疗反应，亦即出现了“典型的/预期的反应”时，即认为该治疗方法的效果很好。这意味着该受治者/患者在相应的细胞学/血液病学参数以及/或者KRAS基因活性(以及相应标记基因表达水平)等方面，与“响应者”同样迅速地达到了健康受治疗者/患者的“正常”水平，也就是说，以“典型的/预期的反应”的形式恢复到正常水平。
[0156] 在本项发明中，当(将要)接受治疗的受治者/患者出现的治疗反应不如“响应者”迅速或者不如后者完全，亦即没有出现“典型的/预期的反应”时，即认为该治疗方法的效验中等/低下。这意味着该受治者/患者在相应的细胞学/血液病学参数、以及/或者KRAS基因以及EGFR基因和/或者BRAF基因的活性或表达水平(以及相应标记基因的表达水平)等方面，并未达到相应的“正常”水平。此外，中等/低下的疗效也意味着KRAS基因以及EGFR基因和/或者BRAF基因的活性/表达水平恢复到健康受治疗者/患者的水平的过程，并不像“响应者”那样完全以及/或者迅速，也就是说，是以一种不同于“典型的/预期的反应”的形式恢复到正常水平。
[0157] 在本项发明中，当(将要)接受治疗的受治者/患者完全没有相应时，即认为该治疗方法完全没有效果。
[0158] 特别地，当对本项发明予以监测/预测的抗癌治疗手段的疗效为中等/低下、或者完全没有疗效时，可能需要考虑改变(计划的)疗法/治疗手段。
[0159] 在一项备选实施方案中，在涉及到监测/预测疗效的手段、方法和用法中，对照组受治疗者/患者的KRAS基因以及EGFR基因和/或者BRAF基因的参考活性或者参考表达水平可用将要接受治疗的受治者/患者自身的KRAS以及EGFR和/或者BRAF基因的参考活性或者表达水平来代替，此活性/表达水平可在治疗开始之前(或者刚开始时)测得。因此，要对抗癌治疗的疗效进行评测，便需要按照本项发明的指导来观测在治疗过程中、与上述KRAS以及EGFR和/或者BRAF基因的特殊参考活性或表达水平相比，KRAS以及EGFR和/或者BRAF基因的活性、或者至少一种标记基因的表达水平是如何发生变化的。上述变化越明显以及/或者越快，该疗法/治疗手段便越有效。
[0160] 如上文所述，在本项发明的特殊方案中对抗癌治疗的疗效进行了评测，该评测是基于上述KRAS以及EGFR和/或者BRAF基因活性或者至少一种标记基因的表达水平与某种作为参照的KRAS以及EGFR和/或者BRAF基因的参考活性或表达水平之间的差异来进行的。因此很明显地，“不同”即意味着升高或者降低；而具体是升高还是降低，则需要视癌症是导致KRAS基因以及EGFR基因和/或者BRAF基因的活性或表达水平上调还是下调的情况而定。
[0161] 在本文中，“不同的”“升高的”或者“降低的”意味着不同于、高于或者低于KRAS基因以及EGFR基因和/或者BRAF基因的正常活性、或者至少一种上述标记基因的正常表达水平(变化范围)。例如，不同于、高于或者低于可能意味着相差、高出或者低了至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少7倍、至少10倍、至少15倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍、或者至少200倍；这里优先考虑高出的情况。
[0162] 如果实在有必要的话，在本文的指导和基本知识背景基础上，技术人员也可以很容易地鉴别出KRAS基因的活性或表达水平、以及EGFR基因和/或者BRAF基因活性或者至少一种上述标记基因的表达水平，是在何种性质(即升高还是降低)以及何种程度上与相应的参考表达水平有所不同。对本文特别予以说明的各种标记基因而言，KRAS基因的参考活性或表达水平、以及EGFR基因和/或者BRAF基因的活性或表达水平，与将要接受诊断评估的受治疗者/患者的KRAS基因活性或表达水平、以及EGFR基因和/或者BRAF基因的活性或表达水平之间会存在差异；而这种差异对于以至少携带有一处KRAS基因突变为特征的癌症、或者针对它的疗法的疗效是否具有诊断性意义，我们可以对其进行评估。
[0163] 正如在关于监测/预测癌症治疗疗效的手段、方法和用法等说明中提及的，在按照本项发明将要对其进行评估或监测的样品或者患者中的KRAS基因活性或表达水平、以及EGFR基因和/或者BRAF基因活性或表达水平，与相应的KRAS基因的“参考活性/参考表达水平”、以及EGFR基因和/或者BRAF基因的“参考活性/参考表达水平”之间的差异程度，预示着将要进行的针对某种癌症的疗法/治疗手段的(预测性)疗效。
[0164] 例如，假如对照组受治疗者/患者是一名“响应者”(例如“阳性对照”)，那么KRAS基因的活性/表达水平、以及EGFR基因和/或者BRAF基因的活性或表达水平，在其“参考值”和将要对其进行评估或者监测的样品/患者之间，将有一个最小差异或者最低程度的差异来定义“高效”的疗法/治疗手段。同样也可以通过比对“典型的/预期的反应”来对这种差异进行评估，(在某一时间点的)一个相对于“对照”而言程度较低的差异也预示着较高的疗效。类似地，当“对照受治疗者/患者”是非响应者(例如“阴性对照”)或者是患者接受治疗之前获得的样品时，那么在针对某种以至少有一处KRAS基因突变为特征的癌症的治疗开始之前/开始时，所测得的KRAS基因的参考活性或参考表达水平、以及EGFR基因和/或者BRAF基因参考活性或参考表达水平的一个较高程度的差异也将预示着较高的疗效。在本文中(在某一特定时间点上)，某个“非响应者样品”或者取自某个患者“治疗前或者治疗开始时的自体样品”、与治疗过程中或者结束后进行评测的样品之间的一个较高程度的、因而是“阳性”的差异将预示着较高的疗效。
[0165] 从上文叙述中可得知，本文所指的KRAS基因的参考活性或参考表达水平、以及EGFR基因和/或者BRAF基因的参考活性或参考表达水平，可以在确诊当天开始检测；当治疗开始后，则需要在治疗过程中进行检测；可以对将要接受治疗的受治疗者/患者本身进行检测，或者对某个相应的对照受治疗者/患者(健康的/响应者/非响应者)进行检测。在治疗过程中，KRAS基因、以及EGFR基因和/或者BRAF基因的参考活性或者参考表达水平可以与KRAS基因活性、以及EGFR基因和/或者BRAF基因的活性或者至少一种标记基因的表达水平同时进行检测或者不同时进行。
[0166] 特别地，如果KRAS基因的参考活性或表达水平、以及EGFR基因和/或者BRAF基因的活性或者表达水平是从不同于将要接受治疗的受治疗者/患者的某一对照组受治疗者/患者身上测得，那么在治疗过程中，最好是同时对KRAS基因的参考活性或参考表达水平、以及EGFR基因和/或者BRAF基因的参考活性或者参考表达水平进行检测。如果KRAS基因的参考活性或表达水平、以及EGFR基因和/或者BRAF基因的参考活性或者参考表达水平是从将要接受治疗的受治者/患者本身测得，那么在治疗过程中，需要在一个不同的时间点对KRAS基因的参考活性或参考表达水平、以及EGFR基因和/或者BRAF基因的参考活性或者参考表达水平进行检测，以便与治疗刚开始时(或者开始之前)的结果进行比较。
[0167] 一般而言，本文提及的KRAS基因的活性或表达水平、以及EGFR基因和/或者BRAF基因的活性或表达水平，可以测定一次，或者最好是测定多次。例如，在治疗过程中，可以每天、每周、每月或者每年对KRAS基因的活性或表达水平、以及EGFR基因和/或者BRAF基因的活性或表达水平进行检测。通常情况下，降低对KRAS基因的活性或表达水平、以及EGFR基因和/或者BRAF基因的活性或表达水平进行检测的频率，治疗过程中相应的研究要求也能得到满足。本文也给出了根据本项发明对KRAS基因的活性或表达水平、以及EGFR基因和/或者BRAF基因的活性或表达水平进行测定的开放性示例。
[0168] 需要注意的是，技术人员应该能够挑选合适的对照患者/受治疗者，并且根据本文提供的手段、方法和用法在恰当的时间点对KRAS基因的(参考)活性或(参考)表达水平、以及EGFR基因和/或者BRAF基因的(参考)活性或(参考)表达水平进行检测。
[0169] 在一项实施方案中，本项发明涉及到使用某种(转基因)细胞或者(转基因)非人类动物来筛选并且/或者验证可用来治疗以KRAS基因中至少有一处突变为特征的癌症的药物；该(转基因)细胞或者(转基因)非人类动物在KRAS基因中至少有一处突变，并且在EGFR基因和/或者BRAF基因中也至少有一处突变。本文此处所指的“细胞”可包含多个细胞以及包含于某个组织中的细胞。所用的细胞也可能是某种原发性肿瘤细胞。在筛选和验证过程中所用的肿瘤细胞或者细胞可能是取自患有下述肿瘤的(转基因)非人类动物的样品：非小细胞肺癌、肺腺癌、胰腺癌、结肠癌、乳腺癌、白血病、前列腺癌、淋巴瘤、脑瘤、小儿肿瘤或者肉瘤。肿瘤细胞或者细胞也可能是取自患者的样品(例如活组织检查)，尤其是通过下述肿瘤患者/受治疗者的活检获得的样品：非小细胞肺癌、肺腺癌、胰腺癌、结肠癌、乳腺癌、白血病、前列腺癌、淋巴瘤、脑瘤、小儿肿瘤或者肉瘤。因此，肿瘤细胞或者细胞可能是某种人类肿瘤细胞或者人类细胞。再次重申，用在本文提及的筛选或者验证实验中的细胞可能来自某种组织或者组织样品，例如活组织检查的样品。
[0170] 所使用的非人类动物或者细胞可以是转基因的或者非转基因的。在本文中，“转基因”一词尤其是指至少一种本文提及的标记基因被过量表达或者低表达。例如，假如需要对某种HSP90抑制剂进行筛选以及/或者验证，那么这一标记基因最好能得到过量表达，此时，KRAS基因的活性或表达水平、以及EGFR基因和/或者BRAF基因的活性或表达水平得到提高，从而相应地增强了KRAS基因的活性或表达水平、以及EGFR基因和/或者BRAF基因的活性或表达水平；这些标记基因也可能被低表达，此时KRAS基因的活性或表达水平、以及EGFR基因和/或者BRAF基因的活性或表达水平降低，从而减弱了KRAS基因的活性或表达水平、以及EGFR基因和/或者BRAF基因的活性或表达水平。
[0171] 本文所指的“转基因”可以指KRAS基因被过量表达或者低表达，以及/或者在相应的转基因非人类动物或者转基因细胞中KRAS活性得到了增强或者减弱。在本项发明中，(转基因)非人类动物或者(转基因)细胞最好是患有以KRAS基因中带有突变为特征的癌症，尤其是那些将要对其治疗的药物进行筛选以及/或者验证的癌症。例如，假如要筛选以及/或者验证治疗非小细胞肺癌的某种药物，相应的(转基因)非人类动物或者(转基因)细胞就最好也患有非小细胞肺癌，即具有升高的KRAS基因活性和/或者表达水平。本文所指的“转基因非人类动物”或“转基因细胞”是指含有与相应野生型动物/细胞不同的遗传物质的非人类动物或者细胞，而不是人类。这里所说的“遗传物质”可以是任何一种核酸分子或者其类似物，例如某种核酸分子或者如本文所定义的其衍生的类似物。“不同的”则是指相对于野生型动物/细胞的基因组而言遗传物质发生了添加或者缺失、以及/或者发生了重组，也就是说，相对于野生型动物/细胞基因组而言，转基因动物/细胞基因组的遗传物质出现在了不同的位点上。关于常用来产生转基因细胞/动物的各种不同表达系统的例子，在以下文献中有所涉及：Methods in Enzymology 153(1987)，385-516，Bitter 等 (Methods in Enzymology 153(1987)，516-544) 以 及 Sawers 等 (Applied Microbiology and Biotechnology 46(1996)，1-9)，Billman-Jacobe(Current Opinion in Biotechnology 7(1996)，500-4)，Hockney(Trends in Biotechnology 12(1994)，
456-463)，Griffiths等(Methods in Molecular Biology 75(1997)，427-440)。
456-463)，Griffiths等(Methods in Molecular Biology 75(1997)，427-440)。
[0172] 在一项优选实施方案中，(转基因)非人类动物或者(转基因)细胞是哺乳动物细胞或者取自哺乳动物。(转基因)非人类动物或者相应提取的(转基因)细胞的非限制性例子可以选自以下各种动物如小鼠、大鼠、兔子、豚鼠以及果蝇。
[0173] 根据本项发明的要求，所用的(转基因)细胞最好是某种动物细胞，例如某种非人类动物细胞。然而，人类细胞也可以被用到本项发明中。这种细胞的开放性例子包括胚胎干细胞(ES cell)，尤其是某种非人类动物的胚胎干细胞，例如小鼠或者大鼠的胚胎干细胞。上述(转基因)细胞尤其是胚胎干细胞也可能被用来产生上述各种(转基因)非人类动物。制造转基因动物的胚胎干细胞技术在业内已广为人知，在Pirity(Methods Cell Biol，1998，57：279)中也有相关说明。
[0174] 一般而言，(转基因)细胞可以是某种原核细胞或者真核细胞；例如某种(转基因)细胞可以是细菌、酵母、真菌、植物或者动物细胞。通常情况下，可以采用标准方法来使用某种构建核酸或者载体对细胞进行转化或者遗传操作，相关方法可参考Sambrook and Russell(2001)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，CSH Press，Cold Spring Harbor，NY，USA；Methods in Yeast Genetics，A Laboratory Course Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1990。
[0175] 在对用来治疗本文所定义的各种癌症的药物进行筛选以及/或验证的过程中，本项发明所提及的(转基因)非人类动物或者(转基因)细胞将会非常有用。
[0176] 特别地，这些筛选过程可以在体完成，并且可使用上述(转基因)动物(例如小鼠、大鼠等等)和/或者其细胞、组织或者培养细胞中在KRAS基因里至少有一处突变、同时在EGFR基因和/或者BRAF基因中也有突变的各种动物。上述细胞、组织或培养细胞可能取自/来自以在KRAS基因里至少有一处突变、同时在EGFR基因和/或者BRAF基因中也有突变为特征的肿瘤细胞/肿瘤。特别地，上述细胞、组织或培养细胞可能取自患有以在KRAS基因里至少有一处突变、同时在EGFR基因和/或者BRAF基因中也有突变为特征的癌症患者。典型的这类癌症包括有非小细胞肺癌、胰腺癌、结肠癌、乳腺癌以及白血病。以上这些在体筛选方法还可能包括对上述(转基因)动物体内的肿瘤体积差异进行测量和鉴定。
[0177] 相应地，本项发明还涉及到这样一种对用来治疗癌症的药物进行筛选和/或者验证的方法。此方法包括如下步骤：
[0178] a)用待筛选/验证的药物对上述(转基因)非人类动物或者(转基因)细胞进行给药处理；
[0179] b)根据本项发明的方法，测定上述动物或者细胞(样品)的KRAS基因活性或表达水平、以及EGFR基因和/或者BRAF基因活性或表达水平；
[0180] c)将在b)步骤中测得的活性或表达水平与KRAS基因的参考活性或者参考表达水平、以及EGFR基因和/或者BRAF基因的活性或表达水平进行比较；该参考活性或参考表达水平是从没有经过待筛选药物处理的对照(转基因)非人类动物或(转基因)细胞(样品)中测得；
[0181] d)挑选出那些经过其处理后，b)步骤中测得的KRAS基因活性或者表达水平、以及EGFR基因和/或者BRAF基因活性或表达水平与c)步骤中测得的参考活性/表达水平相比有所变化的药物。
[0182] 在上文中，关于“标记基因”、“疗法/治疗手段”、“疗效”、“以KRAS基因中至少有一处突变为特征的癌症”或者对这些癌症的“易感性”、“(对照)受治疗者/患者”、“(转基因)非人类动物”或者“(转基因)细胞”、“表达水平”、“参考表达水平”等等的定义和描述，在此处同样适用，稍加必要的改动即可。尤其是前面关于“对照受治疗者/患者”的相关定义和描述也适用于“对照(转基因)非人类动物”或者“(转基因)细胞”，只需加以必要改动即可。
[0183] 在本项发明中，“筛选以及/或者验证某种药物”，一方面是指判断某种含有一种或者多种化合物的复合物是否能起到药物的作用，另一方面是判断某种化合物是否能起到药物的作用。在本项发明中，用来进行筛选以及/或者验证的药物是特别用来对本文定义的各种癌症进行治疗、预防以及/或者改善的药物。
[0184] 技术人员可以很容易地将本项发明的实施方案应用到实践当中。例如，通过这样一个应用过程，待筛选和/或者验证的药物/化合物便可以被用在本文所述的非人类(转基因)动物或者细胞上面，然后在一段时间之后(例如，在某一段长到足以使某种化合物对相关癌症产生影响的时间之后)，分析上述动物/细胞的癌症或者其症状是否有所好转。
[0185] 本项发明还提供了一套用来实现该发明的相关方法或者用法的试剂盒。在一项优选实施方案中，上述用来实现这些相关方法或者用法的试剂盒包括了寡聚核苷酸或者多聚核苷酸，该核苷酸可以用来检测KRAS基因中的突变，也可以包括或者不包括用来检测EGFR基因或者BRAF基因中的突变。
[0186] 例如，上述试剂盒还可以含有用来特异性检测本文定义的KRAS基因的活性或表达水平、以及EGFR基因和/或者BRAF基因的活性或表达水平的化合物。此外，本项发明也提供了这种可用来测定基因活性或表达水平的化合物，用来制备可实现该发明的相关方法或者用法的试剂盒。根据本项发明的指导，技术人员可以知道需要用到哪些化合物来特异性检测本文定义的KRAS基因的活性或表达水平、以及EGFR基因和/或者BRAF基因的活性或表达水平。例如，这种化合物可能是一种“结合分子”，就如上文所定义的“结合分子”。特别地，这种化合物可能是(一种)(核苷酸)探针、引物(对)、抗体以及/或者针对至少一种上述标记基因或其产物的适配子。在一项优选实施方案中，本项发明(将要进行制备)的试剂盒是一种诊断试剂盒。
[0187] 在本项发明的一个特别优选实施方案中，本项发明(将要进行制备)的试剂盒或者相关方法和用法中还可能包含有或者提供有(一份)操作说明书。例如，该操作说明书可以指导技术人员根据本项发明，(如何)对KRAS基因、以及(可有可无地)EGFR基因和/或者BRAF基因的(参考)活性或(参考)表达水平进行检测，也就是说，(如何)诊断本文提及的癌症或者对其易感性，(如何)监测对上述癌症或其易感性进行治疗的疗效，或者是(如何)预测对上述癌症或其易感性进行治疗的疗效。特别地，上述操作说明书还可能包含有针对本文所提供的各种方法或者用法的使用或者应用说明。
[0188] 本项发明(将要进行制备)的试剂盒还可能包含有各种材料/化学药品以及/或者设备，这些东西都是实现本项发明的方法和用法较为合适的/所需要的。例如，这些材料/化学药品以及/或者设备包括溶剂、稀释剂、以及/或者用来起稳定作用和/或者起储存某种化合物作用的缓冲液，这些都是对KRAS基因的活性或表达水平、以及EGFR基因和/或者BRAF基因的活性或表达水平进行检测所必需的。
[0189] 在一项实施方案中，本项发明涉及到将上文定义的HSP90抑制剂用来制备一种药物用于对以KRAS基因中至少有一处激活性突变为特征的癌症进行治疗、改善以及/或者预防的。同时，本项发明也可能将本文定义的HSP90抑制剂用在对以KRAS基因中至少有一处激活性突变为特征的癌症所进行治疗、改善以及/或者预防当中。相应地，本项发明涉及到对以KRAS基因中至少有一处激活性突变为特征的癌症进行预防、治疗或者改善的方法，该方法包括对需要进行此种预防、治疗或者改善的受治疗者施以有效剂量的上述某种HSP90抑制剂。需要进行此种预防、治疗或者改善的受治疗者最好是人类。
[0190] 这种药物可以根据良好的医学实践案例来进行制定和给药，这需要综合考虑患者个体的临床情况、药物组合物的给药位置、给药方式、给药时间表以及医师所知的其他各种因素。药物组合物所能达到目的的“有效剂量”也是根据以上这些考虑来确定的。
[0191] 技术人员知道，给予某个患者的药物组合物的有效剂量还需要根据化合物的性质来确定。例如，假如该化合物是上述某种HSP90抑制剂，那么根据患者体重，通过肠道外给药的药物组合物总的有效剂量范围将是1微克HSP90抑制剂/公斤/天到10毫克HSP90抑制剂/公斤/天；当然如上所述，具体用量多少还需按照相关治疗指导来确定。更理想的情况下，该剂量至少为0.01毫克HSP90抑制剂/公斤/天；对人类而言，最优剂量则是在0.01到10毫克HSP90抑制剂/公斤/天。如果需要连续给药，那么一般按照大约1微克/公斤/小时到大约50微克/公斤/小时的剂量，每天注射一到四次或者通过使用小型泵来进行连续皮下灌注。也可以采用静脉输液的方式。根据所期望观察到的药效不同，足以观察到病情变化所用的治疗时间长度以及用来等待治疗反应出现的治疗后时间间隔也可能会有所不同。具体的治疗用量需要相关技术人员根据常规测试的结果来确定。
[0193] 本项发明的药物组合物最好还应包含有某种药理学上可接受的载体。这种“药理学上可接受的载体”是指任何一种无毒的固体、半固体或者液体填充物、稀释剂、胶囊密封材料或者化学助剂。本文所指的“非肠道”给药方式是指包括静脉、肌肉、腹腔、胸骨、皮下以及关节内注射和灌注等给药方式。
[0194] 药物组合物还可以通过持续释放系统来进行适当的给药。持续释放组分的适当例子包括特型制品中的半透性高分子化合物基质，例如胶片或者微型胶囊。可持续性释放的基质包括聚乳酸(U.S.Pat.No.3,773,919，EP 58,481)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酰胺的共聚物(Sidman，U.等，Biopolymers 22：547-556(1983))、聚(2-羟乙基甲基丙 烯 酸 盐)(R.Langer 等，J.Biomed.Mater.Res.15：167-277(1981)，R.Langer，Chem.Tech.12：98-105(1982))、乙烯醋酸乙烯酯(R.Langer等，Id.)或者聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP133，988)。持续释放的药物组分还包括包埋在脂质体中的化合物。包含有药物组合物的脂质体可以按照以下方法进行制备：DE 3,218,121；Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)82：3688-3692(1985)；Hwang 等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)77：4030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；EP 142,641；Japanese Pat.Appl.83-118008；U.S.Pat.Nos.4,485,045以及4,544,545；EP 102,324。通常情况下，所用的脂质体是小的(大约200到800埃)单层类型脂质体，其脂类含量在30个摩尔百分比胆固醇以上，并且这个比例可以根据最佳疗法的需要进行调整。
[0195] 进行非肠道给药时，药物组合物通常采用单位剂量的可注射形式(溶液、悬浊液或者乳浊液)、用某种药理学上可接受的载体混合至某一所需的纯度；相应的载体在所用剂量和浓度下对受药者没有毒性，并且可以与药物剂型中的其他组分配伍。
[0196] 通常情况下，制备某种剂型的药物需要将该药物组合物的成分与液相载体和/或者精细分离的固相载体进行均匀的紧密的接触。然后，如果有必要的话，产物将被制成所需要的形态。所使用的载体最好是某种肠道外载体，如果是某种与受药者血液等渗的溶液则更好。这类载体的例子包括水、盐溶液、Ringer溶液以及葡萄糖溶液。也可使用非水性载体，例如非挥发性油、油酸乙酯以及脂质体。载体中还可适当地含有少量添加剂，例如用来增强等渗性和化学稳定性的各种物质。这些物质在所用剂量和浓度下对受药者没有毒性，包括各种缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、乙酸以及其他有机酸或者相应的盐类；抗氧化剂，例如抗坏血酸；低分子量(少于十个残基的)(多)肽类化合物，例如多聚精氨酸或者三肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或者免疫球蛋白；疏水聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或者精氨酸；单糖、双糖、以及其他糖类包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或者糊精；螯合剂例如EDTA；糖醇类物质例如甘露醇或者山梨醇；平衡离子例如钠离子；以及/或者非离子型表面活性剂，例如聚山梨醇酯、聚醚或者聚乙二醇。
[0197] 药物组合物中用来进行治疗性给药的组分必须是无菌的。可以通过使用消毒滤膜(例如0.2微孔膜)进行过滤来达到无菌要求。药物组合物的治疗性成分通常分装在带有无菌存取口的容器中，例如带有瓶塞的静脉注射溶液袋或者玻璃瓶，瓶塞上穿刺有皮下注射用的针头。
[0198] 药物组合物的组分通常贮存在单位剂量或者多剂量的容器中，例如在密封的安瓿瓶或者玻璃瓶中以水溶液或者冻干待复苏的形式进行贮存。一个冻干的例子是，在10毫升的玻璃瓶中装入5毫升无菌过滤的1％(w/v)水溶液，然后将所剩的混合物进行冻干即可。制备注射溶液时，用抑菌的注射用水对冻干化合物进行复苏操作即可。
[0199] 本项发明还涉及到以下细胞系的各种组合：A427、A549、Calu-1、Calu-3、Calu-6、H1299、H1355、H1395、H1437、H1563、H1568、H1648、H1650、H1666、H1734、H1755、H1770、H1781、H1792、H1819、H1838、H1915、H1944、H1975、H1993、H2009、H2030、H2052、H2087、H2110、H2122、H2126、H2172、H2228、H23、H2347、H2444、H28、H358、H441、H460、H520、H522、H596、H647、H661、H820、HCC2935、HCC4006、HCC827、SK-LU-1、EKVX、H322M、HOP-62、HOP-92、Colo699、DV-90、HCC15、HCC366、HCC44、HCC78、LCLC103H、LCLC97TM1以及LouNH91。
[0200] 这些细胞系组合应当含有至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55或者60种上述细胞系，尤其是应当至少含有60种上述细胞系。作为模式系统，这些细胞系尤其是其各种组合在对任何一种潜在药物的易感性进行评估中特别有用。在附加案例中，对这些特别挑选出来的细胞系(组合)在药物易感性评估中的作用进行了详细说明。对业内技术人员和公众而言，所有上述细胞系都可通过细胞保藏机构获得，尤其是ATCC公司或者DMSZ公司；图19对其进行了详细说明，并提供了相应细胞系的序列号。
[0201] 同样，本文对使用上述细胞系组合来预测对某种药物、尤其是对某种HSP90抑制剂的易感性进行了说明。在预测对某种药物的易感性、尤其是对某种HSP90抑制剂的易感性，或者是预测某种(哺乳动物)肿瘤细胞对某种药物、尤其是某种HSP90抑制剂处理的响应性时，这些细胞系组合都是很有用的。在预测某个患者是否会对某种药物、尤其是某种HSP90抑制剂发生反应，或者是否对其具有易感性时，这些细胞系组合仍然可以发挥作用。相应的预测易感性/响应性等等的手段和方法在业内已为人所知，本文也给予了说明。因此，技术人员将会知道如何使用本文提及的这种细胞系组合。
[0203] 总之，本专利关系到以下详细列出的条目，这些条目同时也反映在附录权利要求书中。
[0204] 1.一种用于筛选对HSP90抑制剂敏感的细胞、组织或者培养细胞的方法，包含以下步骤：
[0205] (a)确认在上述细胞、组织或培养细胞中，至少存在一种KRAS基因中的激活性突变，并且
[0206] (b)筛选出至少含有一种KRAS基因中激活性突变的细胞、组织或者培养细胞。
[0207] 2.条目1中的方法同时还进一步包含了以下步骤：
[0208] (i)使上述细胞、组织或者培养细胞与HSP90抑制剂接触，同时
[0209] (ii)评价上述细胞、组织或者培养细胞与HSP90抑制剂接触后的存活率。
[0210] 3.一种用于决定哺乳动物肿瘤细胞或者癌细胞对HSP90抑制剂治疗的药效反应的方法，包括测定上述肿瘤细胞中的KRAS基因是否含有至少一种激活性突变，如果存在这种突变则预示肿瘤细胞对HSP90抑制剂治疗很可能有敏感性。
[0211] 4.条目1至3中的任何一种方法都可以额外或者选择性地检测EGFR或BRAF基因中是否具有激活性突变。
[0212] 5.用于在体外检测响应剂或者病人对于HSP90抑制剂的敏感程度，该方法包含了以下步骤：
[0213] (a)从病人处取得样本。该病人被怀疑患有或易于患有以KRAS基因，以及(可有可无地)EGFR或BRAF基因中具有至少一种激活性突变为特征的癌症。并且，
[0214] (b)评价KRAS基因，以及(可有可无地)EGFR或BRAF基因中是否具有至少一种激活性突变，如果KRAS基因单独具有激活性突变，或者在KRAS突变之外还有EGFR或BRAF基因激活性突变，都可以用于指示病人对于HSP90抑制剂在疗效上敏感。
[0215] 6.上述条目1至5中提到的HSP90抑制剂是格尔德霉素或其衍生物。
[0216] 7.条目6中提及的格尔德霉素衍生物是17-AAG或者IPI-504。
[0217] 8.条目1至5中提到的HSP90抑制剂是NVP-AUY922。
[0218] 9.条目1至8中提到的KRAS基因突变是从以下突变中挑选的：KRAS_G12C、KRAS_G12R、KRAS_G12D、KRAS_G12A、KRAS_G12S、KRAS_G12V、RAS_G13D、KRAS_G13S、KRAS_G13C、KRAS_G13V、KRAS_Q61H、KRAS_Q61R、KRAS_Q61P、KRAS_Q61L、KRAS_Q61K、KRAS_Q61E、KRAS_A59T和KRAS_G12F。
[0219] 10.条目4至9中提到的EGFR基因突变时从以下突变中挑选的：EGFR_D770_N771 ＞ AGG、EGFR_D770_N771insG、EGFR_D770_N771insG、EGFR_D770_N771insN、EGFR_E709A、EGFR_E709G、EGFR_E709H、EGFR_E709K、EGFR_E709V、EGFR_E746_A750del、EGFR_E746_A750del、T751A、EGFR_E746_A750del、V ins、EGFR_E746_T751del、I ins、EGFR_E746_T751del、S752A、EGFR_E746_T751del、S752D、EGFR_E746_T751del、V ins、EGFR_G719A、EGFR_G719C、EGFR_G719S、EGFR_H773_V774insH、EGFR_H773_V774insNPH、EGFR_H773_V774insPH、EGFR_H773 ＞ NPY、EGFR_L747_E749del、EGFR_L747_E749del、A750P、EGFR_L747_S752del、EGFR_L747_S752del、P753S、EGFR_L747_S752del、Q ins、EGFR_L747_T750del、P ins、EGFR_L747_T751del、EGFR_L858R、EGFR_L861Q、EGFR_M766_A767insAI、EGFR_P772_H773insV、EGFR_S752_I759del、EGFR_S768I、EGFR_T790M、EGFRV_769_D770insASV、EGFR_V769_D770insASV和EGFR_V774_C775insHV。
[0220] 11.条目4至10中提到的BRAF基因突变是从以下突变中挑选的：BRAF_D594G、BRAF_D594V、BRAF_F468C、BRAF_F595L、BRAF_G464E、BRAF_G464R、BRAF_G464V、BRAF_G466A、BRAF_G466E、BRAF_G466R、BRAF_G466V、BRAF_G469A、BRAF_G469E、BRAF_G469R、BRAF_G469R、BRAF_G469S、BRAF_G469V、BRAF_G596R、BRAF_K601E、BRAF_K601N、BRAF_L597Q、BRAF_L597R、BRAF_L597S、BRAF_L597V、BRAF_T599I、BRAF_V600E、BRAF_V600K、BRAF_V600L 和 BRAF_V600R。
[0221] 12.条目4至11中提到的KRAS、EGFR以及BRAF基因的突变是通过SSP、PCR-RFLP检测法、实时PCR、基因测序、HPLC或者质谱方法检测基因型。
[0222] 13.条目5到12中提到的样本来自已经患有或者易于患有癌症的病人。
[0223] 14.一种使用能检测至少一种KRAS基因激活性突变、以及(可有可无地)EGFR或者BRAF基因激活性突变的寡聚或多聚核苷酸用于对条目6到8中的定义的HSP90抑制剂敏感度进行诊断的用途。
[0224] 15.条目14中提到的寡聚核苷酸长度大约15至100个核苷酸。
[0225] 16.一种方法可以监测针对由KRAS，或者EGFR以及BRAF基因中至少一种激活性突变引起的癌症的治法对病人或潜在病人治疗效果。该方法包括如下步骤：
[0226] a)鉴定从病人处得到的细胞或组织样本中，KRAS，或者EGFR以及BRAF基因的活性和表达水平。
[0227] b)将a)中提到的至少一种标记基因的活性与对照或参考组的KRAS，或者EGFR以及BRAF基因活性进行对比。
[0228] 上述a)中基因的表达活性与对照或者参考组活性的差异可以指示对于上述癌症的治疗效果。
[0229] 17.一种方法可以预测针对由KRAS，或者EGFR以及BRAF基因中至少一种激活性突变引起的癌症的治法对病人或潜在病人治疗效果。该方法包括如下步骤：
[0230] a)鉴定从病人处得到的细胞或组织样本中，KRAS，或者EGFR以及BRAF基因中至少一种的活性或表达水平，同时
[0231] b)将a)中提到的至少一种标记基因的活性与至少一个基因的对照或参考组活性进行对比，对照或参考组活性通过对照组病人的细胞或组织样本决定(响应者或非响应者)。
[0232] 上述a)中基因的活性和表达水平与对照或者参考组活性和表达水平的差异可以指示对于上述癌症的预期治疗效果。
[0233] 18.条目16和17中提到的，针对由KRAS，或者EGFR以及BRAF基因中至少一种激活性突变引起的癌症的治疗方案包含了与条目6到8定义相同的使用HSP90抑制剂的方法。
[0234] 19.一种在KRAS基因中存在至少一种激活性突变、以及(可有可无地)在EGFR以及BRAF基因存在激活性突变的(转基因)细胞或者(转基因)非人类动物的用途，用于筛选或者验证针对由至少一种KRAS基因激活性突变引起的肿瘤的治疗方法的有效性。
[0235] 20.条目5至19中提到的癌症是从以下癌症组中挑选的：非小细胞肺癌、肺腺癌、胰腺癌、大肠癌、乳腺癌、头颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胃肠道癌(包括胃癌和食道癌)、肾细胞癌、尿道癌、白血病、前列腺癌、淋巴癌、黑色素瘤、脑瘤、小儿肿瘤和肉瘤。
[0236] 21.能够完成条目1至12以及条目16、17、20中所描述的方法的试剂盒，包含有能够用于检测至少一种KRAS基因激活性突变的寡聚或多聚核苷酸，也可以含但不一定含能够用于检测EGFR以及BRAF基因激活性突变的寡聚或多聚核苷酸。
[0237] 22.一种条目6至8中提及的HSP90抑制剂的用途，用于制备应用于治疗、缓解或预防具有KRAS基因中至少一个激活性突变特征的肿瘤的药物制剂。
[0238] 23.条目6至8中描述的HSP90抑制剂，用于治疗、缓解或预防具有KRAS基因中至少一个激活性突变特征的肿瘤。
[0239] 24.一种细胞系组合其中细胞系选自以下细胞系：A427、A549、Calu-1、Calu-3、Calu-6、H1299、H1355、H1395、H1437、H1563、H1568、H1648、H1650、H1666、H1734、H1755、H1770、H1781、H1792、H1819、H1838、H1915、H1944、H1975、H1993、H2009、H2030、H2052、H2087、H2110、H2122、H2126、H2172、H2228、H23、H2347、H2444、H28、H358、H441、H460、H520、H522、H596、H647、H661、H820、HCC2935、HCC4006、HCC827、SK-LU-1、EKVX、H322M、HOP-62、HOP-92、Colo699、DV-90、HCC15、HCC366、HCC44、HCC78、LCLC103H、LCLC97TM1和LouNH91。
[0240] 25.应用条目24中提到的细胞系预测对于某种药物的敏感性。
[0241] 26.条目25中提到的药物是一种HSP90抑制剂。
[0242] 图片显示：
[0243] 图1.NSCLC细胞系集合
[0244] 对NSCLC细胞系的概述。该细胞系用于包括提供者和形态病理学细节在内的研究。
[0245] 图2.肺癌中的严重损伤
[0246] 对细胞系组合和一种原发性肺癌组中具有大量拷贝数变化的区域的总结，这种变化由GISTIC定义。
[0247] 图3.对84个NSCLC细胞系的基因组鉴定
[0248] (A)用NSCLC细胞系中染色体数量的变化对于371个原发性NSCLC肿瘤中染色体数量的变化作图。X轴表示每一种变化，y轴表示基因组位置，并且标有反应假阳性概率的q值。图3A1，染色体丢失(细胞系，灰色；原发性肿瘤，黑色)；图3A2，右侧，染色体增加(细胞系，灰色曲线；原发性肿瘤，黑色曲线)。与偶数个染色体相对应的基因组位置被加以阴影，带点的线条标注着丝粒；浅灰色线表示q值(0.25)以显示显著性。用粗体标记的基因表示肺腺癌中已知的突变靶标。括号中是峰值附近的假定靶标。星号标记了由GISTIC确定的基因，其峰值边缘的确定使用了严格过滤标准。(B)NSCLC细胞系中原癌基因突变(黑色)的相对频率与原发性肺癌(空白)相比较的图。(Aviel-Ronen et al.，2006；Bamford et al.，2004；Sharma et al.，2007；Thomas et al.，2007)。(C)由GISTIC确定的重度损伤和原癌基因突变的分层聚集，由互惠发生率作为度量聚集的距离和平均连锁情况的方法。分支的长度反应了聚集的距离。注意，EGFR和KRAS中的突变是互斥的模式，而且EGFR的突变和增加在同样的聚集中都有所发现。(D)通过对分层聚集的分析得到的肾原始组织(灰色)和细胞系(黑色)，肺癌原始组织(深灰色)和细胞系(浅黑色)，淋巴瘤原始组织(浅黑色)和细胞系(浅灰色)中的转录情况。为了降低噪音，探针在用于聚集团之前经过了过滤(差异系数在1.0到10.0之间，目前位点得率是20％，在超过20％的样品中绝对表达量大于100)。
[0249] 图4.神经胶质瘤、黑色素瘤和肺癌中偏差情况
[0250] (A)NSCLC细胞系中染色体拷贝数对原发性神经胶质瘤中染色体拷贝数作图。缺失(左图，NSCLC细胞系为黑色，神经胶质瘤为灰色)和增加(右图，NSCLC细胞系为浅黑色，神经胶质瘤为深灰色)分别由两个图标显示。(B)NSCLC细胞系中染色体拷贝数对原发性黑色素瘤中染色体拷贝数作图(NSCLC细胞系如上图分别为红色和蓝色，短期培养的黑色素瘤为紫色)。(C)基因组相似性通过GISTIC的q值的计算相关性进行分析，每一个NSCLC细胞系的SNP都和以下癌症个体进行了比较，包括肺癌、卵巢癌、神经胶质瘤、黑色素瘤细胞培养样品，正常组织以及随即分出的NSCLC细胞系。
[0251] 图5.体内EGFR突变的肺癌细胞表现型特性的强度
[0252] (A)EGFR突变诱导产生基因表达的后续变化，通过主成分分析测量。前两个主成分分析清楚地区分了具有突变型(白色方块)和野生型(黑色圆点)EGFR的细胞系(PC，总量为54，两次分析累计方差＝24.1％，log10|特征向量|以给出)。(B)EGFR突变细胞系的特点(倍数变化＞2，绝对差异＞FC2，100，p＜0.01)被用于123个被标明具有(EGFR mt)或不具有(EGFR wt)EGFR突变的原发性腺癌的分层聚集(Bhattacharjee et al.，2001)。所有EGFR突变的样品都分在同一个聚集团里。(C)所有EGFR突变状态已知的123个原发性腺癌通过在突变EGFR组和野生组之间不同的RNA转录本被分组。EGFR突变肿瘤不参与存活率实验。(D)基因损伤的出现(增加，绿色；突变，红色；缺失，黄色)与埃罗替尼敏感度的关系通过t-检验和Fisher精确检验进行分析。如果使用平常的p值检验，只有EGFR突变和增加可以得到显著性差异(数据没有提供)。
[0253] 图6.原发性肿瘤的表现型特点被保留在埃罗替尼敏感型肺癌细胞中
[0254] (A)利用在埃罗替尼敏感型和不敏感型NSCLC细胞系中表达有差异的基因进行肺腺癌的分层聚集。白杠代表EGFR突变的肿瘤。(B)Choi等人发表的EGFR突变特性(PLoS ONE 2：e1226(2007))被用于原发性肺腺癌的分层聚集。红杠表示EGFR突变肿瘤。
[0255] 图7.被筛选的化合物的原始敏感性数据
[0256] 对半最大抑制浓度的总结(IC50值，[μM])。该值由以细胞系为基础，并针对各个细胞系和化合物在杀伤曲线中的独立原始图像的高通量筛选分析方法推算得到。
[0257] 图8.多损伤的敏感性预测
[0258] 以下列出了通过KNN方法、Fisher精确测量和t检验对多损伤敏感性预测值的测量结果。只有对两种不同GLAD阈值具有显著性的预报器才在表中列出。
[0259] 图9.对筛选中所使用的化合物的描述
[0260] 表中列出所有筛选试验中使用到的化合物的化学结构、发展状态以及主要已知的作用靶点。
[0261] 图10.通过高通量细胞系筛选得到的化合物的敏感性数据
[0262] 11种化合物对于全部NSCLC细胞系(独立细胞系，x轴)的半最大抑制浓度(y轴，IC50值)如图所示。由于雷帕霉素不能彻底抑制细胞增殖(O′Reilly等.，2006)，这种化合物给出的是25％的抑制浓度。全部细胞系(x轴)中分别代表IC50和IC25的线(y轴)按照敏感度排列。最大浓度被分配给了所有的提供IC50的细胞系。对于有抗性的细胞系，则给出IC25值(17-AAG、埃罗替尼、凡德他尼、舒尼替尼和PD168393的浓度为10μM，SU-11274和达沙替尼浓度为30μM，VX-680为60μM，purvalanol和UO126的浓度是90μM)。
[0263] 图11.化合物活性的分层聚集情况表明，突变的EGFR是达沙替尼活性靶点[0264] (A)如图是所有化合物(x轴)和所有细胞系(y轴)的各自平均经过对数转化和归一化处理后的IC50值(红色-高化合物活性。白色-低化合物活性)。相关损伤的有(黑点)或无(灰点)在右侧标出。EGFR抑制剂是单独的亚集团，而EGFR突变的样本表现出最高的敏感度。(B)经过对数转化后的IC50与染色体增加(amp)或者丢失(del)，以及原癌基2
因突变(mut)、GISTIC定义区域拷贝数变化等的相关系数(r ；红色-高相关性；白色-低相关性)被对分，并且与二元突变数据相融合。在GISTIC决定区域内(#)和边缘地带(*)的假想目标基因被标出。EGFR抑制剂再次被分在另外的集团中。(C)上图：由晶体形态学决定的埃罗替尼(灰色棍状)与野生型EGFR的结合模式。达沙替尼由白色和深灰色的球棍模型表示，结合在EGFR的ATP结合位点上。下图：处于ATP口袋门口位置的T790M突变与病人对二级EGFR抑制剂抗性相关，使埃罗替尼和达沙替尼都不能正常的与ATP口袋中的激酶位点结合。(D)上图：使用所示浓度的埃罗替尼或者达沙替尼处理表达突变EGFR(del Ex19或者Ex19/T790M)的Ba/F3细胞系12小时。使用免疫印迹发在全细胞破碎液中标记磷酸化EGFR和EGFR。下图：用达沙替尼或者埃罗替尼处理96小时之后，剂量依赖的生长抑制通过细胞ATP含量进行测试。
因突变(mut)、GISTIC定义区域拷贝数变化等的相关系数(r ；红色-高相关性；白色-低相关性)被对分，并且与二元突变数据相融合。在GISTIC决定区域内(#)和边缘地带(*)的假想目标基因被标出。EGFR抑制剂再次被分在另外的集团中。(C)上图：由晶体形态学决定的埃罗替尼(灰色棍状)与野生型EGFR的结合模式。达沙替尼由白色和深灰色的球棍模型表示，结合在EGFR的ATP结合位点上。下图：处于ATP口袋门口位置的T790M突变与病人对二级EGFR抑制剂抗性相关，使埃罗替尼和达沙替尼都不能正常的与ATP口袋中的激酶位点结合。(D)上图：使用所示浓度的埃罗替尼或者达沙替尼处理表达突变EGFR(del Ex19或者Ex19/T790M)的Ba/F3细胞系12小时。使用免疫印迹发在全细胞破碎液中标记磷酸化EGFR和EGFR。下图：用达沙替尼或者埃罗替尼处理96小时之后，剂量依赖的生长抑制通过细胞ATP含量进行测试。
[0265] 图12.EGFR突变作为凡德他尼活性靶点
[0266] (A)左图：通过与RET激酶结合的晶体图像确定的凡德他尼与EGFR的ATP结合位点相作用的模型。凡德他尼由球棍模型表示。右图：处于ATP口袋门口位置的T790M突变与病人对二级EGFR抑制剂抗性相关，使药物不能正常的与ATP口袋中的激酶位点结合。两图中都展示了晶体图像决定的埃罗替尼球棍模型的结合模型，作为旁置参考。(B)使用所示浓度的凡德他尼或者埃罗替尼处理表达突变EGFR(del Ex19或者Ex19/T790M)的Ba/F3细胞系12小时。使用免疫印迹发在全细胞破碎液中标记磷酸化EGFR和EGFR。(C)用达沙替尼或者埃罗替尼处理96小时之后，剂量依赖的生长抑制通过细胞ATP含量进行测试。
[0267] 图13.以病变为基础的17-AAG、U0126和达沙替尼活性的预测
[0268] (A)在NSCLC细胞系系列和NCI-60细胞系组合中，KRAS突变(黑色柱)在17-AAG敏感性分布图(IC50值)中的分布状况。两套数据中，KRAS突变和17-AAG敏感出现的概率通过Fisher精确检测得到。(B)通过免疫印迹在经过不同浓度17-AAG处理的KRAS野生型(wt)和突变型(G12C)细胞系破碎液中标记c-RAF、KRAS、细胞周期蛋白D1和Akt。(C)1q21.3(黑色柱)处拷贝数的增加在NSCLC细胞系UO126敏感性分布图(IC50值)中的分布情况，以及在NCI-60细胞系寄端霉素敏感性分布图中的分布情况。两套数据中，1q21.3处拷贝数的增加和17-AAG敏感出现的概率通过Fisher精确检测得到。(D)细胞系是根据它们对达沙替尼的敏感度挑选出来的(IC50＜1μM；浅灰色)。令人惊异的是，大部分达沙替尼敏感型的NSCLC细胞系都具有最高的SRC和Ephrin受体激酶家族基因拷贝数。
[0269] 图14.对可从基因组层面预测达沙替尼敏感度的目标富集敏感度预测方法的验证
[0270] 所有细胞系根据它们对埃罗替尼的敏感度(IC50＜1μM；灰色杠)挑选而得。具有高埃罗替尼敏感度的细胞同时具有EGFR基因的最大拷贝数。右图显示了EGFR增加和埃罗替尼敏感度的偶然误差，以及通过fisher精确测量得到的p值。
[0271] 图15.使用Huang等人在2007年发表的6个基因标记得到的NSCLC细胞系对达沙替尼的集团图像
[0272] 为了验证Huang提出的6个基因标记的预测价值(2007，CancerRes 67，2226-2238)，每个基因的表达水平通过分层聚集进行了分析，期中达沙替尼的敏感性用0和1表示。同一个亚聚集单位中的样品具有相似的表达谱。亮点代表与平均mRNA表达量相比被抑制的基因，暗点代表过量表达的基因。
[0273] 图16.前列腺/乳腺癌中与达沙替尼敏感性相关的基因标记
[0274] 为了验证Huang提出的基因标记的预测价值(2007，Cancer Res 67，2226-2238)，每个基因的表达水平通过分层聚集进行了分析，期中达沙替尼的敏感性用0和1表示。同一个亚聚集单位中的样品具有相似的表达谱。亮点代表与平均mRNA表达量相比被抑制的基因，暗点代表过量表达的基因。
[0275] 图17.前列腺癌中所有与达沙替尼敏感性相关的基因
[0276] 为了验证Huang提出的全部基因标记的预测价值(2007，Cancer Res 67，2226-2238)，每个基因的表达水平通过分层聚集进行了分析，期中达沙替尼的敏感性用0和1表示。同一个亚聚集单位中的样品具有相似的表达谱。亮点代表与平均mRNA表达量相比被抑制的基因，暗点代表过量表达的基因。
[0277] 图18.NSCLC细胞系
[0278] 图18展示了初始被测试的NSCLC细胞系中的一系列细胞系列表，以及它们各自的KRAS突变和相应的半最大抑制浓度(IC50)。
[0279] 图19.细胞系
[0280] 图19展示了一组用于根据之前提供的筛选方法鉴定药物的细胞系，这些药物可以被用于抗肿瘤治疗或者抗增殖治疗。
[0281] 图20.KRAS突变型肺癌的转基因小鼠模型
[0282] 通过在Lox-Stop-LoxKRASG12D小鼠鼻端使用腺病毒Cre重组酶，人们建立了再肺部特异性表达KRAS的G12D突变的转基因小鼠(上图，从左至右)。这一方法在文献中已有描述(Jackson，E.L.et al.，Genes Dev 15：3243-3248(2001)；Johnson L.et al.，Nature.410(6832)：1111-6(2001)和Ji H.et al.，Nature.448(7155)：807-10(2007))。这些小鼠极易患致死性肺腺癌(下图，从左至右)。注意，图像均从早期文献中获得，并且仅用于说明。
[0283] 图21.使用HSP90抑制剂治疗Lox-Stop-LoxKRASG12D小鼠
[0284] 使用HSP90抑制剂17-DMAG治疗具有KRAS突变型肺癌的转基因小鼠(如图20所示)7天。肿瘤体积通过核磁共振成像测定，并且以透胸影像的形式展现(左图)。与治疗前影像相比，肿瘤体积的量化改变以百分比形式表示。
[0285] 以下实例阐释了这项发明。
[0286] 实例1：方法和结果
[0287] 细胞
[0288] 细胞通过以下途径获得：ATCC(www.atcc.org)、DSMZ(www.dsmz.de)、本体或其他细胞培养组。图1中包含了所有细胞系的细节信息。这同时包括提供者和培养条件的信息。按照例行规则，细胞通过MycoAlert(www.cambrex.com)控制支原体感染，并且根据之前发表的实验方案(Uphoff and Drexler，2005)使用抗生素，以防止感染。
[0289] SNP阵列筛选
[0290] 使用PureGene kit(www.gentra.com)从细胞系中提取全基因组DNA，将之与高密度寡聚核苷酸阵列杂交(Affymetrix，Santa Clara，CA)，以检测所以Y染色体之外的238000个SNP，标记间距的中间值是5.2kb(平均值12.2kb；www.affymetrix.com)。阵列筛选实验根据制造说明书进行。使用Affymetrix Genotyping Tools 2.0版本软件对SNP进行基因分型。SNP阵列筛选的原始样品从Tumor Sequencing Project(http://www.genome.gov/cancersequencing/)处得到。我们使用了一种新的综合型方法进行癌症中的显著靶点基因鉴定(Genomic Identification of Significant Targets in Cancer；GISTIC)(Beroukhim et al.，2007)来分析数据。每一个基因组标记根据综合测量的拷贝数增加的倾向性和增加程度打分(在LOH中只有倾向性)，每个分数的统计学意义通过与背景差异率预期结果单独对比得到评价。GISTIC算法通过2中不同拷贝数阈值在SNP数据中分配基因组片段，具体而言指Gain and Loss Analysis of DNA(GLAD)片段算法(Hupe et al.，
2004)，两个阈值分别为4个拷贝数(GLAD阈值1.0)和2.14个拷贝数(GLAD阈值0.1)。
2004)，两个阈值分别为4个拷贝数(GLAD阈值1.0)和2.14个拷贝数(GLAD阈值0.1)。
[0291] 纯合体缺失的探测
[0292] 为了鉴定纯和的缺失突变，人们在SNP数据中搜寻拷贝数损失小于0.5的连续5个SNP。分析被聚焦在局部缺失上，不包括整段染色体臂。有关基因处于某个纯和缺失区域的信息基于加利福尼亚大学圣克鲁斯分校的人类基因组序列hg17平台(http://genome.ucsc.edu)。
[0293] 对于共同发生的损伤的分析
[0294] 这项分析利用电脑来计算个体损伤共同发生率的观察值与预期值。利用相互之间共同发生率作为距离度量，再使用平均连锁方法，以实现突变数据的分层聚集与拷贝数量化变化的二分版本的相互结合。由于拷贝数损伤发生的充分阈值依赖于该损伤引起的拷贝数变化的总体水平，此处使用三种不同阈值的这些比例的总和。
[0295] 突变检测
[0296] 以下基因中已知的原癌基因突变状态已经通过质谱基因分型测定(Thomas et al.，2007)：EGFR、BRAF、ERBB2、PIK3CA、NRAS、KRAS、ABL1、AKT2、CDK4、FGFR1、FGFR3、FLT3、HRAS、JAK2、KIT、PDGFRA以及RET。在此之前，所有细胞系中这些基因的突变状态已经被发表(Thomas et al.，2007)。另外，以下基因的双向测序在所有编码蛋白的外显子被PCR扩增后完成：EGFR、BRAF、ERBB2、PIK3CA、KRAS、TP53、STK11、PTEN以及CDKN2A。
[0297] 以选择恰当治疗方法为目的、依赖于独立突变的突变检测有了更深层次的发展，以弥补与肿瘤细胞测序相关方法学问题，这些肿瘤细胞是与大量非肿瘤细胞相混合的。由此，我们在实验室中开发了如下算法：如果，根据传统组织形态学方法估算发现，肿瘤样品中的肿瘤成分超过或等于70％，我们发现Sanger双脱氧链终结测序法可以在成本和敏感度上实现最优化。但是，当肿瘤成分在70％到20％之间，我们发现，传统的焦磷酸测序，例如Biotage仪器，在可接受的成本内提高敏感度和特异性。如果肿瘤成分小于20％，我们发现下一代大批量平行测序，例如Roche-454测序系统(Thomas et al.，Nature Medicine Jul；12(7)：852-52006)，可以实现这一环境下的最大敏感度和准确性。总之，这种算法可以在各种情况下，同时具备高敏感度和最高成本效益。
[0298] 表达谱阵列筛选
[0299] 54个细胞系的表达量数据通过Affymetrix U133A阵列获得。RNA的抽提、杂交和阵列筛选通过标准步骤进行(Bhattacharjee et al.，2001)。由U133A阵列得到的CEL谱图通过dChip软件进行预处理。我们将细胞系与原发性肺癌、肾细胞癌和淋巴癌样本比较，也通过分层聚集在独立细胞系间相互比较。为了以后与其他个体的表达谱比较，我们使用了肺癌(Lu et al.，2006)、肾细胞癌(Lenburg et al.，2003)(Shankavaram et al.，2007)和淋巴癌(Hummel et al.，2006；Rinaldi et al.，2006)样本发表在GEO阵列上的数据集(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。数据均使用标准化方法处理，并且使用dChip(http://biosun1.harvard.edu/complab/dchip/)进行归一化处理。为比较NSCLC细胞系(U133A)和原发性肿瘤，我们使用了Bhattacharjee等人利用U95Av2阵列得到的腺癌数据。在突变EGFR细胞系和野生EGFR细胞系之间表达有差异(两组间倍数变化＞2[90％CI]，绝对差别＞100并且p＜0.005)，以及埃罗替尼敏感和不敏感细胞系间有差异(埃罗替尼敏感(IC50＜0.5μM)vs埃罗替尼不敏感(IC50＞2μM)，倍数变化＞1.5[90％CI]，绝对差别＞100并且p＜0.005)的基因都被挑选出来。使用R语言进行数据电脑处理，以分析主要成分。如下过滤标准鉴定了很多转录谱：变异系数在[1.9；10]，现位点得率在40％，第一主要成分占总方差的14.5％，第二者占9.6％以及第三者占8.2％。使用1400这一标准，样本根据第一主要成分被分组。
[0300] 以细胞为基础的筛选
[0301] 埃罗替尼、凡德他尼和舒尼替尼从商业提供者处购得，使用DMSO溶解，并根据说明书的指导保存。细胞用Multidrop工具(www.thermo.com)分盘到无菌的微孔板中，并隔夜培养。随后按照系列浓度梯度加入化合物。96小时之后，使用CellTiter-Glo检测法(www.promega.com)测量细胞内ATP成分，以衡量细胞的存活能力。使用Mithras LB940培养盘扫描仪器(www.bertholdtech.com)测量微孔板。半最大抑制浓度由杀伤曲线下各自的预图像决定，其中杀伤曲线通过对数方程和恰当选取的参数进行平滑化。
[0302] 以损伤为基础的化合物敏感性预测
[0303] 三种不同的方法被用来预测以损伤为基础的化合物敏感性。第一，根据化合物的敏感谱选出最敏感和最不敏感的样品。如果相应化合物的敏感谱无法明确区分敏感和不敏感的细胞系，则选用25％或者75％来分组。我们使用Fisher精确测量法评价化合物活性与GISTIC所定义的显著损伤存在性之间的联系。为此，细胞系被按照每一个损伤的存在与否分组。每组对数化之后的IC50值通过双样品t检验进行比较。为了避免人为降低误差，t检验以固定的方差为基础，这由与0有显著差异(＞0.1)的所有方差的平均值决定。
[0304] 下一步，多损伤敏感性预测值通过KNN算法计算，并且使用了留一法(Golub et al.，1999)，计算所用样品与上述Fisher精确测量的样品相同。除一例以外，所有样品中基因损伤在敏感和不敏感细胞系中都有明显差别，KNN算法也是以这些样本为基础。剩余的样品用于检验预测值。检验结果最好的一系列特征被作为各个化合物的最佳预报集合。
[0305] 为了鉴定最佳埃罗替尼单基因预报，我们使用二分法(阈值0.7)处理了损伤数据。具有IC50＜0.07μM特征的细胞系被定义为敏感。对预报者使用了同样的阈值。15个特征、k＝3群体和余弦度量共同决定了留一法验证中表现最佳者。鉴于多假设测量中的问题，上述t检验和Fisher精确测量的显著性应该用探索的眼光，而非验证的视角，来看待。
[0306] 为了验证单一损伤与某一特异抑制剂的敏感性相关，我们利用了NCI-60癌症细胞系(http://dtp.nci.nih.gov/mtargets/mt_index.html)。鉴于MEK抑制剂UO126和Hsp90抑制剂17-AAG没有被包括在药物数据中，我们改为分析寄端霉素(MEK抑制剂)和格尔德霉素(Hsp90抑制剂)与各个损伤的关联。为了对比损伤与敏感度之间的关联程度，针对各种化合物，被鉴定为敏感或不敏感的肺癌细胞系数目分别按照NCI-60细胞系做了转化。联系的显著性通过Fisher精确测量进行分析。由于细胞系HOP62和A549的IC50值不合适，这两个细胞系没有进行针对Hsp-90抑制剂的分析。1q21.3扩增的阈值由各个数据集中总体拷贝数变化分布情况决定(2.7与33％的NSCLC细胞系对应；2.4与33％的NCI-60细胞系对应)。
[0307] 为了评价Huang等人2007年提出的6个基因标记，我们使用分层聚集实验分析了各个基因的表达水平，其中达沙替尼的敏感度用0和1表示。对于这些基因，同一个亚集团中的样本具有相似的基因表达谱。但是，对达沙替尼敏感的样本并没有集中在一个亚聚集中，而是随机分散，标明这几个基因标记并不适用于预测对达沙替尼的敏感性。
[0308] 制备EGFR突变的Ba/F3细胞
[0309] EGFR的cDNA通过亚克隆整合到pBabe-hygro质粒中。最常见的NSCLC衍生突变(http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/)通过定点突变(Quick-Change Mutagenesis XL kit；Stratagene，La Jolla，CA，USA)整合到逆转录病毒基因组中，病毒按照之前描述的方法被包装和复制(Greulich et al.，2005)。用这种逆转录病毒稳定转染小鼠Ba/F3细胞，在停止使用IL-3之后，能够独立生长的细胞被挑选出来，作为以后实验材料。
[0310] 化合物结合的结构建模
[0311] 利用PyMol(http://www.pymol.org)将达沙替尼、凡德他尼与RET激酶结合(pdb编码2IVU(Knowles et al.，2006))的晶体结构图和埃罗替尼与EGFR激酶结构域结合(pdb编码1M17(Stamos et al.，2002))的图像重合。鉴于Abl和EGFR的结构相似，达沙替尼与EGFR的结合模式应该与达沙替尼-Abl复合物的结合模式相同。抑制剂的哌嗪基从ATP位点伸出，并进入溶剂。同时2-氨基噻唑与激酶的交联区域形成2个氢键(噻唑环的N3与Met793，Abl中Met318的酰胺氮)，达沙替尼2-氨基的氢与Met793的氧原子(Abl中的Met318)也形成氢键。另外，看门人Thr790(Abl中的Thr315)侧链中的羟基也可以和抑制剂的酰胺氮形成额外的氢键。达沙替尼中的氯甲基苯环与Thr790和螺旋C附近的疏水口袋结合，并且明显地与抗药型EGFR-T790M的Met侧链冲突。凡德他尼中，喹唑啉支架的N1(EGFR中的Met793，RET激酶中的Ala807)形成一个重要的氢键，其溴-氯-苯丙胺基采用了与埃罗替尼中乙炔苯胺相似的构型，这一结构在EGFR中与Thr790相近，在RET激酶中与Val804靠近。这些结构的图像由PyMol制成。
[0312] Western印迹分析
[0313] 将细胞在NP40破碎缓冲液(50mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)，150mmol/L NaCl，1％NP40)中破碎，缓冲液中混合有蛋白酶和磷酸酶抑制剂I和II(www.merckbiosciences.co.uk/g.asp？f＝CBC/home.html)，经过离心使缓冲液澄清。用Bicinchoninic Acid Protein测试试剂盒(www.piercenet.com)度量全细胞破碎液中蛋白质浓度。在12％的胶的各个位置加等量的蛋白(40-60μg)做SDS-PAGE，只有特别指出的位置除外。按照之前描1068
述的方法进行Western印迹(Shimamura et al.，2006)。抗EGFR、抗磷酸化EGFR(Tyr )和抗pAkt的抗体从Cell Signaling Technology(Beverly，MA)处购买。抗c-raf和抗细胞周期蛋白D1抗体从圣克鲁斯购买。抗KRAS抗体从默克购买。
述的方法进行Western印迹(Shimamura et al.，2006)。抗EGFR、抗磷酸化EGFR(Tyr )和抗pAkt的抗体从Cell Signaling Technology(Beverly，MA)处购买。抗c-raf和抗细胞周期蛋白D1抗体从圣克鲁斯购买。抗KRAS抗体从默克购买。
[0314] 结果
[0315] 一组经过基因型鉴定的NSCLC细胞系
[0316] 从多个来源收集了84个NSCLC细胞系(图1)，并作为后续所有试验的基础。上述细胞系由代表各种主要NSCLC亚型肿瘤的肿瘤细胞衍生而来，这些肿瘤包括腺癌、鳞状细胞癌和大细胞癌。
[0317] 上述细胞的基因组全景由高通量单核苷酸多态(SNP)阵列(250K Sty1；www.affymetrix.com)分析基因拷贝数变化得到。我们使用了一种名为Genomic
Identification of Significant Targets in Cancer(GISTIC)的新算法，在统计学层面上区分生物学损伤和背景噪音(Beroukhim et al.，2007)。这种方法为每一个染色体标记给出一个统计学分数，同时反映一个数据组中某一特定位点的平均扩增程度和变异频率。
使用GISTIC发现了16个经常性、高水平的拷贝数累积(推测拷贝数＞2.14)的区域，和
20个经常性拷贝数减小(推测拷贝数＜1.86)区域(图2)。总而言之，我们识别了中位宽度为1.45Mb的扩增焦峰(中位13.5基因/区域)和中位宽度为0.45Mb的缺失焦峰(中
位1基因/区域)。这些区域包含了NSCLC中已知的损伤(例如，LRP1B(2q)、FHIT(3p)和CDKN2A(9p)的缺失，以及MYC(8q)、EGFR(7p)和ERBB2(17q)的增加(图3A和图2))。更进一步，在拷贝数积累的广泛区域内，我们同时鉴别了T1TF1(14q)和TERT(5p)的积累(图3A和图2)，他们最近刚刚通过大规模基因组分析在肺腺癌中被发现(Kendall et al.，2007；
Lockwood et al.，2008；Weir et al.，2007)。
Identification of Significant Targets in Cancer(GISTIC)的新算法，在统计学层面上区分生物学损伤和背景噪音(Beroukhim et al.，2007)。这种方法为每一个染色体标记给出一个统计学分数，同时反映一个数据组中某一特定位点的平均扩增程度和变异频率。
使用GISTIC发现了16个经常性、高水平的拷贝数累积(推测拷贝数＞2.14)的区域，和
20个经常性拷贝数减小(推测拷贝数＜1.86)区域(图2)。总而言之，我们识别了中位宽度为1.45Mb的扩增焦峰(中位13.5基因/区域)和中位宽度为0.45Mb的缺失焦峰(中
位1基因/区域)。这些区域包含了NSCLC中已知的损伤(例如，LRP1B(2q)、FHIT(3p)和CDKN2A(9p)的缺失，以及MYC(8q)、EGFR(7p)和ERBB2(17q)的增加(图3A和图2))。更进一步，在拷贝数积累的广泛区域内，我们同时鉴别了T1TF1(14q)和TERT(5p)的积累(图3A和图2)，他们最近刚刚通过大规模基因组分析在肺腺癌中被发现(Kendall et al.，2007；
Lockwood et al.，2008；Weir et al.，2007)。
[0318] 原发性肿瘤中混杂的非肿瘤细胞严重影响了对纯和缺失型突变(HD)和杂合损失突变(LOH)的分析。细胞系DNA的纯度决定了对未知HD和LOH区域的鉴别，其中包括由单亲二倍体(例如，中性复制事件)造成的LOH。被LOH标定的区域涵盖了多种基因，包括在其他肿瘤类型中被LOH影响的基因和之前未识别的LOH靶标基因，例如TSPAN5(4q)、LRDD(11p)、SIRT3(11p)、NLRP6(11p)、BCL2L14(12p)、CDK8(13q)、BCL2L12(18q)、DAPK3(19p) 或 者UHRF1(19p)。在这次分析中，像MTAP(9p)和LATS2(13q)这样的已知基因被HD改变(Chen et al.，2005；Schmid et al.，1998)，我们同时又发现了TUBA2或FRK基因中的新HD。请注意，这些区域中的绝大部分也可以在原发性NSCLC肿瘤中被鉴定为缺失(Weir et al.，2007)，然而，推测的拷贝数对LOH或者HD的指示很不稳定，表明有正常的二倍体DNA混入。
因此，虽然近期一项大规模癌症分析研究(Weir et al.，2007)提供了肺腺癌基因组的全景视角，我们仍然需要纯的肿瘤细胞群体以发现更多的HD和LOH区域。
因此，虽然近期一项大规模癌症分析研究(Weir et al.，2007)提供了肺腺癌基因组的全景视角，我们仍然需要纯的肿瘤细胞群体以发现更多的HD和LOH区域。
[0319] 下一步，我们将这个细胞系群体中显著扩增和缺失缺失突变的谱图与一组371个原发性肺腺癌的相应谱图(Weir et al.，2007)做了对比。这一比较揭示了两组数据之间的惊人相似，但是这种相似不存在与NSCLC细胞系与胶质瘤和黑色素瘤之间(图4A和4B)。通过电脑计算q值相关性对这种相似进行的量化分析确认了原发性肺癌和肺癌细胞系之
2 2
间的相似性(r ＝0.77)，以及肺癌细胞系和原发性胶质瘤(Beroukhim et al.，2007)(r
2
＝0.44)或者黑色素瘤(Lin et al.，2008)(r ＝0.44；图4C)之间的不相似性。对肺细胞系数据重复的随机分割和内部相似性的电脑处理显示出在0.82到0.86之间的相关性，但
2
是和正常组织没有相关性(r ＝0.0195；图4C)。这些结果表明，NSCLC细胞系的基因组拷贝数全景可以反映原发性NSCLC肿瘤的情况，而其他类型的肿瘤或者细胞系的相似度要低得多(Greshock et al.，2007；Jong et al.，2007)。更进一步，细胞系中原癌基因突变的分布情况与原发性NSCLC肿瘤中的情况相似，都对KRAS和EGFR基因突变有很高的倾向性(Aviel-Ronen et al.，2006；Bamford et al.，2004；Sharma et al.，2007；Thomas et al.，
2007)，同时PIK3CA和BRAF突变的发生率很低(图3B)。这些结果进一步从遗传层面验证了我们的细胞系。
2 2
间的相似性(r ＝0.77)，以及肺癌细胞系和原发性胶质瘤(Beroukhim et al.，2007)(r
2
＝0.44)或者黑色素瘤(Lin et al.，2008)(r ＝0.44；图4C)之间的不相似性。对肺细胞系数据重复的随机分割和内部相似性的电脑处理显示出在0.82到0.86之间的相关性，但
2
是和正常组织没有相关性(r ＝0.0195；图4C)。这些结果表明，NSCLC细胞系的基因组拷贝数全景可以反映原发性NSCLC肿瘤的情况，而其他类型的肿瘤或者细胞系的相似度要低得多(Greshock et al.，2007；Jong et al.，2007)。更进一步，细胞系中原癌基因突变的分布情况与原发性NSCLC肿瘤中的情况相似，都对KRAS和EGFR基因突变有很高的倾向性(Aviel-Ronen et al.，2006；Bamford et al.，2004；Sharma et al.，2007；Thomas et al.，
2007)，同时PIK3CA和BRAF突变的发生率很低(图3B)。这些结果进一步从遗传层面验证了我们的细胞系。
[0320] NSCLC细胞系的二维遗传学信息(染色体拷贝数变化和突变)使我们能够分析两种损伤的相互作用(图3C)。对损伤的分层聚集明确地将EGFR的突变和扩增放入同一个亚集团(用Q表示共发生率的观察值与预期值的比较结果：Q＝4.38，p＝0.001)，而KRAS突变稳定地存在于另外一个完全不同的聚集中。这些发现与之前的体内观察结果相一致，即，KRAS和EGFR突变相互排斥，而EGFR突变和扩增通常共同发生(Kaye，2005；Pao et al.，2005b；Sharma et al.，2007)。另外，这些结果明显表明，每一种突变都用其特有的方式作用于更大规模的基因组变化。
[0321] 最后，在基因表达聚集分析数据中，原发性肺癌样本(Lu et al.，2006)和肺癌细胞系共同具有同一个聚集(图3D)，而肾细胞癌(Lenburg et al.，2003)和淋巴癌(Hummel et al.，2006)聚集在不同的组中。总之，对大量NSCLC细胞系和原发性肿瘤的正交基因组数据库的深入比较分析表明，这些细胞系可以反映原发性NSCLC肿瘤的基因和转录总体状态。
[0322] EGFR突变在体内和体外均定义了肺癌的表现型特点
[0323] 激活的原癌基因通常导致转录标记的产生，该标记可被用于鉴定携带有此类原癌基因的肿瘤(Bild et al.，2006；Lamb et al.，2003)。然而，我们一直未能在提到的123个原发性肺腺癌基因表达数据集(Bhattacharjee et al.，2001)中鉴定出EGFR突变肿瘤特异性的基因表达标记(数据没有显示)。于是，我们推断我们细胞系的细胞纯度可以用于提取这种标记以及其在原发性肿瘤中的翻译产物。我们加将主要成分分析法用于多个基因，并发现了一个令人赞叹的EGFR突变细胞系分组，该分组在第一主要成分就已经具有显著的离解量(p＝0.0005)，占总体方差的14.5％(图5A)。分层聚集也得到了类似的结果(数据没有显示)。如果把在EGFR突变细胞系中表达有差异的基因作为替代特征，所有的EGFR突变型原发肿瘤在分层聚集处理后都分在了另一个不同的聚集中(图5B)这一结果同样出现在埃罗替尼敏感型细胞系的特异性表达基因中(图6A)。另外，带有表达EGFR突变细胞系标记基因肿瘤的病人与不带的病人相比总体存活率更高，即使排除体内观察到EGFR突变肿瘤这种情况，结果也是这样(图5C)(Eberhard et al.，2005b)。这些数据同时指出一个事实，即体外提取的表达标记可被用于在体内鉴定肿瘤的生物多样性，这一概念是近期才得到发展和验证的(Nevins and Potti，2007)。
[0324] 其他人最近使用另外一组数量较少的细胞系鉴定了EGFR突变NSCLC的一个转录标记(Choi et al.，2007)。但是，当分析原发性肺腺癌中这一标记的情况时，EGFR突变样本在数据集中呈现随即分散状态(图6B)这一发现进一步强调了使用大细胞系群体的必要性—以代表原发性肿瘤的整体基因组多样性。
[0325] 在病人中，肿瘤的消退或对EGFR抑制剂，例如埃罗替尼，的“响应”与EGFR的突变相关(Lynch et al.，2004；Paez et al.，2004；Pao et al.，2004)。为了系统地鉴定与埃罗替尼敏感度相关的基因损伤，我们在所有细胞系中都测试了埃罗替尼敏感性。之后，我们分析了敏感型细胞系和不敏感型细胞系之间基因损伤分布的差别(图7)，并进一步比较了有无基因损伤时细胞系敏感性的平均值。在两个测试中，EGFR突变提供了最佳的单损伤埃罗替尼敏感性预测(图5D，p＜0.0001)。另外，我们发现EGFR积累也具有较弱的联系。但是，在使用Bonferroni或者FDR方法调整到多假设验证的时候，只有EGFR突变才能提供埃罗替尼敏感性的显著预测(数据没有给出)。
[0326] 我们继而使用了信号-噪音为基础的特征筛选与KNN算法(Golub et al.，1999；Reich et al.，2006)相结合的方式，建立了对多损伤埃罗替尼敏感度的预测体系。最佳的预测体系是EGFR突变、EGFR累计和KRAS突变缺乏的综合体(图8)，这些元素都与鉴定NSCLC病人对EGFR抑制剂响应能力有关(Cappuzzo et al.，2005；Hirsch et al.，2005；
Lynch et al.，2004；Paez et al.，2004；Pao et al.，2004；Pao et al.，2005b；Tsao et al.，2005)。上述结果强调了EGFR突变在赋予埃罗替尼敏感性中的角色，其中对敏感性的测定包含了全体基因损伤情况，并使用系统计算分析。这项发现进一步暗示，原始肿瘤的必要转录特点和细胞生物表型都被保留在细胞系中，这是将这些细胞系用作前期临床药物靶点验证的必要保证。NSCLC细胞系临床发展中化合物的活性差别
Lynch et al.，2004；Paez et al.，2004；Pao et al.，2004；Pao et al.，2005b；Tsao et al.，2005)。上述结果强调了EGFR突变在赋予埃罗替尼敏感性中的角色，其中对敏感性的测定包含了全体基因损伤情况，并使用系统计算分析。这项发现进一步暗示，原始肿瘤的必要转录特点和细胞生物表型都被保留在细胞系中，这是将这些细胞系用作前期临床药物靶点验证的必要保证。NSCLC细胞系临床发展中化合物的活性差别
[0327] 在验证了细胞系与原发性NSCLC肿瘤在基因型和表现型上的相似性之后，我们推断，附加的复杂表现型数据可能会消除对于癌症基因型如何影响细胞表现型的更进一步信息。于是，我们建立了一套高通量细胞系筛选平台，以便系统地再所有细胞系中进行短时间的化学物质扰动。在我们最初设计的筛选试验中，我们用10种抑制剂测试了所有细胞系，这10种抑制剂部分处于临床评估阶段，其他则是在前期临床模型中表现出很高的活性。这些化合物以很多相关的癌症蛋白为靶点(图9)。我们使用这些化合物处理了所有细胞系，并且测定IC50值(图7)。得到的敏感度图像(图10)揭示，部分化合物对于一小部分细胞系具有明显的细胞毒性(例如埃罗替尼、凡德他尼和VX-680)，其他在大部分细胞系中均有活性，只有极少数细胞系表现出抵抗(例如17-AAG)。只有两个细胞系(＜2％)对所有化合物都有抵抗(图7)，表明大部分NSCLC肿瘤都适用于靶向治疗。总之，上述观察所得很容易令人联想到病人在临床试验中的反应：一部分病人表现出部分或者全部的药物反应，而大部分表现稳定的病情，没有变化或进一步发展。因此，高通量细胞系筛选可以帮助估计对某种正在开发的新化合物敏感的肿瘤的比例。
[0328] 通过相似度筛选鉴定相互关联的化合物靶点
[0329] 正如原先用于鉴定抑制剂共同靶点的方法，我们以敏感度相似性(图11A)和敏感度与基因损伤间关联情况(图11B)作为基础，进行分层聚集实验。埃罗替尼和凡德他尼在针对EGFR突变的作用上表现出了最高度的相似性，而EGFR突变时NSCLC肿瘤细胞中凡德2
他尼的重要靶点(图11A和11B)。对于两种化合物，细胞系IC50值之间的高相关性(r ＝
0.91；p＜0.001；)和在EGFR激酶结构域结合模式上的相似性进一步证实了这一论断(图
12A)。值得注意的是。这个模型预测，两种化合物与EGFR的结合都会被T790M这种抗性突变阻止。同样的，同时表达EFGR埃罗替尼敏化突变和T790M突变的Ba/F3细胞也对埃罗替尼和凡德他尼由完全的抗性(图12A和11D)。
他尼的重要靶点(图11A和11B)。对于两种化合物，细胞系IC50值之间的高相关性(r ＝
0.91；p＜0.001；)和在EGFR激酶结构域结合模式上的相似性进一步证实了这一论断(图
12A)。值得注意的是。这个模型预测，两种化合物与EGFR的结合都会被T790M这种抗性突变阻止。同样的，同时表达EFGR埃罗替尼敏化突变和T790M突变的Ba/F3细胞也对埃罗替尼和凡德他尼由完全的抗性(图12A和11D)。
[0330] 除了凡德他尼，PD168393，一种已知的不可逆EGFR抑制剂(Sos et al.，2008)，和SRC/ABL抑制剂达沙替尼(Shah et al.，2004)与埃罗替尼处于同一集团(图11A和B)。达沙替尼与EGFR结合的分子模型预测了一种与埃罗替尼相似的结合模式(图11C)，与埃罗替尼抗性突变T790M存在构型上的冲突(Kobayashi et al.，2005；Pao et al.，2005a；Yun et al.，2007)(图11C)。我们通过证明该化合物具有细胞毒性、能够诱发局部表达EGFR突变的Ba/F3细胞EGFR去磷酸化但对同时表达Y790M抗性突变基因没有作用，正式验证通过EGFR为达沙替尼的相关肿瘤细胞靶点(图11D)。由此，我们使用系统的、无偏差的方法鉴定了一种FDA验证通过的药物的相关肿瘤细胞靶点。对于具有获得性埃罗替尼抗性的病人，达沙替尼的测试仍在继续(trial-Id：NCT00570401，http://clinicaltrials.gov/ct2/home)。我们预计，对于因T790M突变而获得埃罗替尼抗药性的病人，达沙替尼的药效非常有限。使用监督式学习的方法鉴定抑制剂响应能力
[0331] 作为从全体损伤数据中系统性预测抑制剂响应能力的另外一种方法，我们使用了监督式学习方法(Golub et al.，1999)，正如我们对埃罗替尼做的那样(见上文)。使用这种方法，我们鉴定出了一种表现明显的、且以基因损伤为基础的预测者，用于对埃罗替尼(见上文)、凡德他尼、PD168393、达沙替尼、VX-680、17-AAG和UO126(图8)的预测。EGFR突变是埃罗替尼、PD168393、凡德他尼和达沙替尼活性最好的预测者(图8)，这一结论支持了我们通过集团分析和结构建模得到的结果。
[0332] 在我们初始的集团分析中，我们发现，KRAS突变与个体对Hsp90抑制剂(17-AAG，一种格尔德霉素衍生物)的敏感性相关(图13A)。使用我们以KNN为基础的预测方法，KRAS突变对于17-AAG的敏感性也有预测作用(p＝0.0307，图13A)。使用另一套独立的数据集对上述观察结果进行验证时，我们发现，NCI-60细胞系中格尔德霉素敏感性和KRAS突变的分布情况与在我们的细胞系中观察到的情形惊人得相似(p＝0.049，图13A)。在敏感型细胞系中，17-AAG治疗可以降低c-RAF和Akt的蛋白水平，但是不能降低KRAS水平(图13B)。鉴于c-RAF和Akt都是已知的Hsp90蛋白的顾客蛋白(Basso et al.，2002；Grbovic et al.，2006)，而KRAS突变可能引起对Akt激活和RAF-MEK-ERK通路激活的依赖，由此导致细胞对Hsp90抑制剂敏感。
[0333] UO126是一种MEK抑制剂，它在一组肺癌细胞系中也表现出增强的活性。这里，通过KNN预测法鉴定出的影响ARNT和RAB13基因的1q21.3染色体积累与UO126敏感性有很强的联系(Fisher精确测量，p＝0.0442，图13C和14A)。为了在另一个独立的数据集中验证这一发现，我们再一次使用了NCI-60癌细胞系(Shoemaker，2006)，并使用寄端霉素作为MEK抑制剂(Solit et al.，2006)。这一交叉平台检验表明，1q21.3累计在两个数据集中都可以预测对MEK抑制剂的敏感性(Fisher精确检测，p＝0.042，NSCLC细胞系；p＝0.035，NCI-60细胞系)。由此，细胞系检测与系统性、以损伤为基础的药物敏感性预测相结合，实现了在一个独立数据集中可以被验证的预测。
[0334] 富集化合物靶标基因，以预测敏感性
[0335] 靶标基因的扩增被指出能够预测靶标特异性化合物的杀伤力，这在ERBB2扩增的乳腺癌和EGFR扩增的肺癌中都得到了验证。于是我们预期，从生化角度定义的药物靶标的染色体拷贝数变化可以被用于预测其他酪氨酸激酶抑制剂的敏感性。此处我们使用了通过量化解离常数决定的相关酪氨酸激酶抑制剂靶标，其中量化解离常数由量化激酶测试得到(Karaman et al.，2008)。作为理论的证明，我们测试了EGFR拷贝数增加与埃罗替尼敏感度的关联。在我们系统验证中，埃罗替尼敏感型细胞系具有高度富集的EGFR拷贝数累积现象(cn＞3，p＝0.000082)(图14)。我们随后对拉帕替尼做了有限细胞系筛选(30个细胞系)。拉帕替尼是EGFR和ERBB2的特异性抑制剂。再一次，我们观察到了如下现象：拉帕替尼敏感的细胞系具有显著富集的EGFR或者ERBB2基因的扩增现象(p＝0.0265，数据没有给出)。
[0336] 受到这些发现的鼓舞，我们继续将我们的方法应用于其他一系列化合物，它们包括了多种激酶抑制剂，例如达沙替尼(Karaman et al.，2008)。我们根据细胞系染色体组中对两个达沙替尼最敏感的靶点的拷贝数累积情况排列细胞系(Kd＜1nM)。上述细胞系对于这一化合物具有显著的敏感性(p＝0.003，图13D)。尤其重要的是，这个预测者包含了Ephrin受体和Src激酶基因家族成员的拷贝数增加，说明具有这些损伤的NSCLC细胞可能对于它们编码的蛋白的抑制治疗格外敏感。相比之下，那些达沙替尼敏感性稍差的靶点的编码基因的扩增未能显示出敏感型细胞系的富集现象(数据没有给出)。由此，我们得到结论，在NSCLC细胞中，Ephrin受体或者SRC家族成员拷贝数的增加可以使细胞对这些激酶更加依赖，从而对达沙替尼的治疗性抑制更加敏感。
[0337] 实例2.动物实验数据显示，具有KRAS引起的肺腺癌的小鼠对于HSP90抑制剂的治疗敏感
[0338] 这一体内实验证明，通过基因工程使患有KRAS引起的肺腺癌的小鼠对于HSP90抑制剂的治疗敏感。
[0339] 这些小鼠带有Lox-Stop-Lox-KRAS_G12D基因。在通过鼻呼吸摄入腺病毒Cre之后，这些小鼠患上了高表现率肺癌，并导致快速死亡。因此，这个小鼠模型代表了最严格和最优的KRAS突变型人肺癌，从而被选为体内实验对象，见图20。按照20mg/kg/d的用量对小鼠施用17-DMAG。17-DMAG是一种格尔德霉素HSP90抑制剂，具有与17-AAG几乎相同的结构。体外实验证实，17-AAG在细胞系中的效果与17-DAMG的相同(数据没有给出)。
[0340] 仅一周治疗之后，MRI成像显示，3只小鼠中的2只肿瘤显著缩小，见图21。第三只小鼠的肿瘤负担表现出轻微的减轻，相当于病情稳定。相比之下，未治疗的小鼠无一例外地表现出快速的肿瘤生长，并且很快因此死亡。
[0341] 本项发明以下列核苷酸序列为参考：
[0342] 此处列出的序列在NCBI数据库中均可获得，也可以在www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝gene上面提取。这些序列同时也与注释出的和修改了的序列相关。这项发明也提供了实验技术和方法，用于纯和序列、等位基因变异以及提到的精简序列。上述“变异”最好为基因变异。
[0343] SEQ ID No.1
[0344] 编码智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的核苷酸序列，包括转录本变异b(异构体b)和mRNA(＞gi|34485723|ref|NM_004985.3|)。编码区是核苷酸182到核苷酸748。
[0345] SEQ ID No.2：
[0346] 智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的氨基酸序列。
[0347] SEQ ID No.3：
[0348] 编码突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的核苷酸序列，包括转录本变异a和KRAS_G12V突变。编码区是核苷酸182到核苷酸751。
[0349] SEQ ID No.4：
[0350] 突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的氨基酸序列，突变为KRAS_G12V。
[0351] SEQ ID No.5：
[0352] 编码突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的核苷酸序列，包括转录本变异a和KRAS_G12S突变。编码区是核苷酸182到核苷酸751。
[0353] SEQ ID No.6：
[0354] 突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的氨基酸序列，突变为KRAS_G12S。
[0355] SEQ ID No.7：
[0356] 编码突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的核苷酸序列，包括转录本变异a和KRAS_G12A突变。编码区是核苷酸182到核苷酸751。
[0357] SEQ ID No.8：
[0358] 突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的氨基酸序列，突变为KRAS_G12A。
[0359] SEQ ID No.9：
[0360] 编码突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的核苷酸序列，包括转录本变异a和KRAS_G12D突变。编码区是核苷酸182到核苷酸751。
[0361] SEQ ID No.10：
[0362] 突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的氨基酸序列，突变为KRAS_G12D。
[0363] SEQ ID No.11：
[0364] 编码突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的核苷酸序列，包括转录本变异a和KRAS_G12C突变。编码区是核苷酸182到核苷酸751。
[0365] SEQ ID No.12：
[0366] 突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的氨基酸序列，突变为KRAS_G12C。
[0367] SEQ ID No.13：
[0368] 编码突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的核苷酸序列，包括转录本变异a和KRAS_G12R突变。编码区是核苷酸182到核苷酸751。
[0369] SEQ ID No.14
[0370] 突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的氨基酸序列，突变为KRAS_G12R。
[0371] SEQ ID No.15：
[0372] 编码突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的核苷酸序列，包括转录本变异a和KRAS_G12F突变。编码区是核苷酸182到核苷酸751。
[0373] SEQ ID No.16：
[0374] 突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的氨基酸序列，突变为KRAS_G12F。
[0375] SEQ ID No.17：
[0376] 编码突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的核苷酸序列，包括转录本变异a和KRAS_G13C突变。编码区是核苷酸182到核苷酸751。
[0377] SEQ ID No.18：
[0378] 突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的氨基酸序列，突变为KRAS_G13C。
[0379] SEQ ID No.19：
[0380] 编码突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的核苷酸序列，包括转录本变异a和KRAS_G13D突变。编码区是核苷酸182到核苷酸751。
[0381] SEQ ID No.20：
[0382] 突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的氨基酸序列，突变为KRAS_G13D。
[0383] SEQ ID No.21：
[0384] 编码突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的核苷酸序列，包括转录本变异a和KRAS_G13S突变。编码区是核苷酸182到核苷酸751。
[0385] SEQ ID No.22：
[0386] 突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的氨基酸序列，突变为KRAS_G13S。
[0387] SEQ ID No.23：
[0388] 编码突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的核苷酸序列，包括转录本变异a和KRAS_G13V突变。编码区是核苷酸182到核苷酸751。
[0389] SEQ ID No.24：
[0390] 突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的氨基酸序列，突变为KRAS_G13V。
[0391] SEQ ID No.25：
[0392] 编码突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的核苷酸序列，包括转录本变异a和KRAS_A59T突变。编码区是核苷酸182到核苷酸751。
[0393] SEQ ID No.26：
[0394] 突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的氨基酸序列，突变为KRAS_A59T。
[0395] SEQ ID No.27：
[0396] 编码突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的核苷酸序列，包括转录本变异a和KRAS_Q61E突变。编码区是核苷酸182到核苷酸751。
[0397] SEQ ID No.28：
[0398] 突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的氨基酸序列，突变为KRAS_Q61E。编码区是核苷酸182到核苷酸751。
[0399] SEQ ID No.29：
[0400] 编码突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的核苷酸序列，包括转录本变异a和KRAS_Q61H突变。编码区是核苷酸182到核苷酸751。
[0401] SEQ ID No.30：
[0402] 突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的氨基酸序列，突变为KRAS_Q61H。
[0403] SEQ ID No.31：
[0404] 编码突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的核苷酸序列，包括转录本变异a和KRAS_Q61H突变。编码区是核苷酸182到核苷酸751。
[0405] SEQ ID No.32：
[0406] 突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的氨基酸序列，突变为KRAS_Q61H。
[0407] SEQ ID No.33：
[0408] 编码突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的核苷酸序列，包括转录本变异a和KRAS_Q61K突变。编码区是核苷酸182到核苷酸751。
[0409] SEQ ID No.34：
[0410] 突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的氨基酸序列，突变为KRAS_Q61K。
[0411] SEQ ID No.35：
[0412] 编码突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的核苷酸序列，包括转录本变异a和KRAS_Q61L突变。编码区是核苷酸182到核苷酸751。
[0413] SEQ ID No.36：
[0414] 突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的氨基酸序列，突变为KRAS_Q61L。
[0415] SEQ ID No.37：
[0416] 编码突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的核苷酸序列，包括转录本变异a和KRAS_Q61R突变。编码区是核苷酸182到核苷酸751。
[0417] SEQ ID No.38：
[0418] 突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的氨基酸序列，突变为KRAS_Q61R。
[0419] SEQ ID No.39：
[0420] 编码突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的核苷酸序列，包括转录本变异a和KRAS_Q61P突变。编码区是核苷酸182到核苷酸751。
[0421] SEQ ID No.40：
[0422] 突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的氨基酸序列，突变为KRAS_Q61P。
[0423] SEQ ID No.41：
[0424] 编码突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的核苷酸序列，包括转录本变异b和KRAS_G12V突变。编码区是核苷酸182到核苷酸748。
[0425] SEQ ID No.42：
[0426] 突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的氨基酸序列，突变为KRAS_G12V。
[0427] SEQ ID No.43：
[0428] 编码突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的核苷酸序列，包括转录本变异b和KRAS_G12S突变。编码区是核苷酸182到核苷酸748。
[0429] SEQ ID No.44：
[0430] 突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的氨基酸序列，突变为KRAS_G12S。
[0431] SEQ ID No.45：
[0432] 编码突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的核苷酸序列，包括转录本变异b和KRAS_G12A突变。编码区是核苷酸182到核苷酸748。
[0433] SEQ ID No.46：
[0434] 突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的氨基酸序列，突变为KRAS_G12A。
[0435] SEQ ID No.47：
[0436] 编码突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的核苷酸序列，包括转录本变异b和KRAS_G12D突变。编码区是核苷酸182到核苷酸748。
[0437] SEQ ID No.48：
[0438] 突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的氨基酸序列，突变为KRAS_G12D。
[0439] SEQ ID No.49：
[0440] 编码突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的核苷酸序列，包括转录本变异b和KRAS_G12C突变。编码区是核苷酸182到核苷酸748。
[0441] SEQ ID No.50：
[0442] 突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的氨基酸序列，突变为KRAS_G12C。
[0443] SEQ ID No.51：
[0444] 编码突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的核苷酸序列，包括转录本变异b和KRAS_G12R突变。编码区是核苷酸182到核苷酸748。
[0445] SEQ ID No.52：
[0446] 突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的氨基酸序列，突变为KRAS_G12R。
[0447] SEQ ID No.53：
[0448] 编码突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的核苷酸序列，包括转录本变异b和KRAS_G12F突变。编码区是核苷酸182到核苷酸748。
[0449] SEQ ID No.54：
[0450] 突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的氨基酸序列，突变为KRAS_G12F。
[0451] SEQ ID No.55：
[0452] 编码突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的核苷酸序列，包括转录本变异b和KRAS_G13C突变。编码区是核苷酸182到核苷酸748。
[0453] SEQ ID No.56：
[0454] 突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的氨基酸序列，突变为KRAS_G13C。
[0455] SEQ ID No.57：
[0456] 编码突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的核苷酸序列，包括转录本变异b和KRAS_G13D突变。编码区是核苷酸182到核苷酸748。
[0457] SEQ ID No.58：
[0458] 突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的氨基酸序列，突变为KRAS_G13D。
[0459] SEQ ID No.59：
[0460] 编码突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的核苷酸序列，包括转录本变异b和KRAS_G13S突变。编码区是核苷酸182到核苷酸748。
[0461] SEQ ID No.60：
[0462] 突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的氨基酸序列，突变为KRAS_G13S。
[0463] SEQ ID No.61：
[0464] 编码突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的核苷酸序列，包括转录本变异b和KRAS_G13V突变。编码区是核苷酸182到核苷酸748。
[0465] SEQ ID No.62：
[0466] 突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的氨基酸序列，突变为KRAS_G13V。
[0467] SEQ ID No.63：
[0468] 编码突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的核苷酸序列，包括转录本变异b和KRAS_A59T突变。编码区是核苷酸182到核苷酸748。
[0469] SEQ ID No.64：
[0470] 突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的氨基酸序列，突变为KRAS_A59T。
[0471] SEQ ID No.65：
[0472] 编码突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的核苷酸序列，包括转录本变异b和KRAs_Q61E突变。编码区是核苷酸182到核苷酸748。
[0473] SEQ ID No.66：
[0474] 突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的氨基酸序列，突变为KRAS_Q61E。
[0475] SEQ ID No.67：
[0476] 编码突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的核苷酸序列，包括转录本变异b和KRAS_Q61H突变。编码区是核苷酸182到核苷酸748。
[0477] SEQ ID No.68：
[0478] 突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的氨基酸序列，突变为KRAS_Q61H。
[0479] SEQ ID No.69：
[0480] 编码突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的核苷酸序列，包括转录本变异b和KRAS_Q61H突变。编码区是核苷酸182到核苷酸748。
[0481] SEQ ID No.70：
[0482] 突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的氨基酸序列，突变为KRAS_Q61H。
[0483] SEQ ID No.71：
[0484] 编码突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的核苷酸序列，包括转录本变异b和KRAS_Q61K突变。编码区是核苷酸182到核苷酸748。
[0485] SEQ ID No.72：
[0486] 突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的氨基酸序列，突变为KRAS_Q61K。
[0487] SEQ ID No.73：
[0488] 编码突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的核苷酸序列，包括转录本变异b和KRAS_Q61L突变。编码区是核苷酸182到核苷酸748。
[0489] SEQ ID No.74：
[0490] 突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的氨基酸序列，突变为KRAS_Q61L。
[0491] SEQ ID No.75：
[0492] 编码突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的核苷酸序列，包括转录本变异b和KRAS_Q61R突变。编码区是核苷酸182到核苷酸748。
[0493] SEQ ID No.76：
[0494] 突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的氨基酸序列，突变为KRAS_Q61R。
[0495] SEQ ID No.77：
[0496] 编码突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的核苷酸序列，包括转录本变异b和KRAS_Q61P突变。编码区是核苷酸182到核苷酸748。
[0497] SEQ ID No.78：
[0498] 突变的智人v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的氨基酸序列，突变为KRAS_Q61P。
[0499] SEQ ID No.79：
[0500] 编码突变智人BRAF基因的核苷酸序列。突变为BRAF_G464R。编码区从核苷酸62到核苷酸2362。
[0501] SEQ ID No.80：
[0502] 突变智人BRAF基因的氨基酸序列。突变为BRAF_G464R。
[0503] SEQ ID No.81：
[0504] 编码突变智人BRAF基因的核苷酸序列。突变为BRAF_G464V。编码区从核苷酸62到核苷酸2362。
[0505] SEQ ID No.82：
[0506] 突变智人BRAF基因的氨基酸序列。突变为BRAF_G464V。
[0507] SEQ ID No.83：
[0508] 编码突变智人BRAF基因的核苷酸序列。突变为BRAF_G466A。编码区从核苷酸62到核苷酸2362。
[0509] SEQ ID No.84：
[0510] 突变智人BRAF基因的氨基酸序列。突变为BRAF_G466A。
[0511] SEQ ID No.85：
[0512] 编码突变智人BRAF基因的核苷酸序列。突变为BRAF_G466R。编码区从核苷酸62到核苷酸2362。
[0513] SEQ ID No.86：
[0514] 突变智人BRAF基因的氨基酸序列。突变为BRAF_G466R。
[0515] SEQ ID No.87：
[0516] 编码突变智人BRAF基因的核苷酸序列。突变为BRAF_G468C。编码区从核苷酸62到核苷酸2362。
[0517] SEQ ID No.88：
[0518] 突变智人BRAF基因的氨基酸序列。突变为BRAF_G468C。
[0519] SEQ ID No.89：
[0520] 编码突变智人BRAF基因的核苷酸序列。突变为BRAF_G469R。编码区从核苷酸62到核苷酸2362。
[0521] SEQ ID No.90：
[0522] 突变智人BRAF基因的氨基酸序列。突变为BRAF_G469R。
[0523] SEQ ID No.91：
[0524] 编码突变智人BRAF基因的核苷酸序列。突变为BRAF_G469R。编码区从核苷酸62到核苷酸2362。
[0525] SEQ ID No.92：
[0526] 突变智人BRAF基因的氨基酸序列。突变为BRAF_G469R。
[0527] SEQ ID No.93：
[0528] 编码突变智人BRAF基因的核苷酸序列。突变为BRAF_G469S。编码区从核苷酸62到核苷酸2362。
[0529] SEQ ID No.94：
[0530] 突变智人BRAF基因的氨基酸序列。突变为BRAF_G469S。
[0531] SEQ ID No.95：
[0532] 编码突变智人BRAF基因的核苷酸序列。突变为BRAF_G464E。编码区从核苷酸62到核苷酸2362。
[0533] SEQ ID No.96：
[0534] 突变智人BRAF基因的氨基酸序列。突变为BRAF_G464E。
[0535] SEQ ID No.97：
[0536] 编码突变智人BRAF基因的核苷酸序列。突变为BRAF_G466V。编码区从核苷酸62到核苷酸2362。
[0537] SEQ ID No.98：
[0538] 突变智人BRAF基因的氨基酸序列。突变为BRAF_G466V。
[0539] SEQ ID No.99：
[0540] 编码突变智人BRAF基因的核苷酸序列。突变为BRAF_G466E。编码区从核苷酸62到核苷酸2362。
[0541] SEQ ID No.100：
[0542] 突变智人BRAF基因的氨基酸序列。突变为BRAF_G466E。
[0543] SEQ ID No.101：
[0544] 编码突变智人BRAF基因的核苷酸序列。突变为BRAF_G469A。编码区从核苷酸62到核苷酸2362。
[0545] SEQ ID No.102：
[0546] 突变智人BRAF基因的氨基酸序列。突变为BRAF_G469A。
[0547] SEQ ID No.103：
[0548] 编码突变智人BRAF基因的核苷酸序列。突变为BRAF_G469E。编码区从核苷酸62到核苷酸2362。
[0549] SEQ ID No.104：
[0550] 突变智人BRAF基因的氨基酸序列。突变为BRAF_G469E。
[0551] SEQ ID No.105：
[0552] 编码突变智人BRAF基因的核苷酸序列。突变为BRAF_G469V。编码区从核苷酸62到核苷酸2362。
[0553] SEQ ID No.106：
[0554] 突变智人BRAF基因的氨基酸序列。突变为BRAF_G469V。
[0555] SEQ ID No.107：
[0556] 编码突变智人BRAF基因的核苷酸序列。突变为BRAF_F595L。编码区从核苷酸62到核苷酸2362。
[0557] SEQ ID No.108：
[0558] 突变智人BRAF基因的氨基酸序列。突变为BRAF_F595L。
[0559] SEQ ID No.109：
[0560] 编码突变智人BRAF基因的核苷酸序列。突变为BRAF_G596R。编码区从核苷酸62到核苷酸2362。
[0561] SEQ ID No.110：
[0562] 突变智人BRAF基因的氨基酸序列。突变为BRAF_G596R。
[0563] SEQ ID No.111：
[0564] 编码突变智人BRAF基因的核苷酸序列。突变为BRAF_L597V。编码区从核苷酸62到核苷酸2362。
[0565] SEQ ID No.112：
[0566] 突变智人BRAF基因的氨基酸序列。突变为BRAF_L597V。
[0567] SEQ ID No.113：
[0568] 编码突变智人BRAF基因的核苷酸序列。突变为BRAF_L597S。编码区从核苷酸62到核苷酸2362。
[0569] SEQ ID No.114：
[0570] 突变智人BRAF基因的氨基酸序列。突变为BRAF_L597S。
[0571] SEQ ID No.115：
[0572] 编码突变智人BRAF基因的核苷酸序列。突变为BRAF_V600E。编码区从核苷酸62到核苷酸2362。
[0573] SEQ ID No.116：
[0574] 突变智人BRAF基因的氨基酸序列。突变为BRAF_V600E。
[0575] SEQ ID No.117：
[0576] 编码突变智人BRAF基因的核苷酸序列。突变为BRAF_V600K。编码区从核苷酸62到核苷酸2362。
[0577] SEQ ID No.118：
[0578] 突变智人BRAF基因的氨基酸序列。突变为BRAF_V600K。
[0579] SEQ ID No.119：
[0580] 编码突变智人BRAF基因的核苷酸序列。突变为BRAF_V600R。编码区从核苷酸62到核苷酸2362。
[0581] SEQ ID No.120：
[0582] 突变智人BRAF基因的氨基酸序列。突变为BRAF_V600R。
[0583] SEQ ID No.121：
[0584] 编码突变智人BRAF基因的核苷酸序列。突变为BRAF_K601N。编码区从核苷酸62到核苷酸2362。
[0585] SEQ ID No.122：
[0586] 突变智人BRAF基因的氨基酸序列。突变为BRAF_K601N。
[0587] SEQ ID No.123：
[0588] 编码突变智人BRAF基因的核苷酸序列。突变为BRAF_K601E。编码区从核苷酸62到核苷酸2362。
[0589] SEQ ID No.124：
[0590] 突变智人BRAF基因的氨基酸序列。突变为BRAF_K601E。
[0591] SEQ ID No.125：
[0592] 编码突变智人BRAF基因的核苷酸序列。突变为BRAF_D594G。编码区从核苷酸62到核苷酸2362。
[0593] SEQ ID No.126：
[0594] 突变智人BRAF基因的氨基酸序列。突变为BRAF_D594G。
[0595] SEQ ID No.127：
[0596] 编码突变智人BRAF基因的核苷酸序列。突变为BRAF_D594V。编码区从核苷酸62到核苷酸2362。
[0597] SEQ ID No.128：
[0598] 突变智人BRAF基因的氨基酸序列。突变为BRAF_D594V。
[0599] SEQ ID No.129：
[0600] 编码突变智人BRAF基因的核苷酸序列。突变为BRAF_L597R。编码区从核苷酸62到核苷酸2362。
[0601] SEQ ID No.130：
[0602] 突变智人BRAF基因的氨基酸序列。突变为BRAF_L597R。
[0603] SEQ ID No.131：
[0604] 编码突变智人BRAF基因的核苷酸序列。突变为BRAF_L597Q。编码区从核苷酸62到核苷酸2362。
[0605] SEQ ID No.132：
[0606] 突变智人BRAF基因的氨基酸序列。突变为BRAF_L597Q。
[0607] SEQ IDNo.133：
[0608] 编码突变智人BRAF基因的核苷酸序列。突变为BRAF_T599I。编码区从核苷酸62到核苷酸2362。
[0609] SEQ ID No.134：
[0610] 突变智人BRAF基因的氨基酸序列。突变为BRAF_T599I。
[0611] SEQ ID No.135：
[0612] 编码突变智人BRAF基因的核苷酸序列。突变为BRAF_V600L。编码区从核苷酸62到核苷酸2362。
[0613] SEQ ID No.136：
[0614] 突变智人BRAF基因的氨基酸序列。突变为BRAF_V600L。
[0615] SEQ ID No.137：
[0616] 编码智人热休克90kDa蛋白alpha(细胞质中)的核苷酸序列。组A，成员1(HSP90AA1/HSP90)，转录本变异1，mRNA(＞gi|153792589|ref|NM_001017963.2|)。
[0617] SEQ ID No.138：
[0618] 智人热休克90kDa蛋白alpha(细胞质中)的氨基酸序列。组A，成员1，异构体1(HSP90AA1)(＞gi|153792589|ref|NM_001017963.2|)。
[0619] SEQ ID No.139：
[0620] 编码智人热休克90kDa蛋白alpha(细胞质中)的核苷酸序列。组A，成员1(HSP90AA1)，转录本变异2，mRNA(＞gi154146190|ref|NM_005348.3|)。
[0621] SEQ ID No.140：
[0622] 智人热休克90kDa蛋白alpha(细胞质中)的氨基酸序列。组A，成员1，异构体2，(＞gi|154146191|ref|NP_005339.3|)。
[0623] SEQ ID No.141：
[0624] 编码智人热休克90kDa蛋白alpha(细胞质中)的核苷酸序列。组B，成员1(HSP90AB1)，mRNA(＞gi|20149593|ref|NM_007355.2|)mRNA。
[0625] SEQ ID No.142：
[0626] 智 人 热 休 克 90kDa 蛋 白 1，beta 的 氨 基 酸 序 列 ( ＞gi|20149594|ref|NP_031381.2|)。
[0627] SEQ ID No.143：
[0628] 编 码 智 人 热 休 克90kDa 蛋 白 beta(Grp94)，成 员1(HSP90B1)，mRNA( ＞gi|4507676|ref|NM_003299.1|)。
[0629] SEQ ID No.144：
[0630] 智人热休克90kDa蛋白beta(Grp94)的氨基酸序列，成员1(HSP90B1)，mRNA(＞gi|4507676|ref|NM_003299.1|)。
[0631] SEQ ID No.145：
[0632] 编码智人热休克90kDa蛋白alpha(细胞质中)的核苷酸序列。组A，成员2(HSP90AA2)，mRNA(＞gi|92859629|ref|NM_001040141.1|)。
[0633] SEQ ID No.146：
[0634] 智人热休克90kDa蛋白1，alpha样3的氨基酸序列。(＞gi|92859630|ref|NP_001035231.1|)。
[0635] SEQ ID No.147：
[0636] 编码智人v-raf小鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因B1(BRAF)的核苷酸序列，mRNA＞gi|187608632|ref|NM_004333.4|)。编码区为核苷酸62至核苷酸2362。
[0637] SEQ ID No.148：
[0638] 智人v-raf小鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因B1(BRAF)的氨基酸序列，mRNA＞gi|187608632|ref|NM_004333.4|)。
[0639] SEQ ID No.149：
[0640] 编码智人上皮生长因子受体(幼红细胞白血病病毒(v-erb-b)原癌基因的同源基因，禽流感)(EGFR)的核苷酸序列。转录本变异1(异构体a)，mRNA(＞
gi|41327737|ref|NM_005228.3|)。编码区为核苷酸247至核苷酸3879。
gi|41327737|ref|NM_005228.3|)。编码区为核苷酸247至核苷酸3879。
[0641] SEQ ID No.150：
[0642] 智人上皮生长因子受体(幼红细胞白血病病毒(v-erb-b)原癌基因的同源基因，禽流感)(EGFR)的氨基酸序列(异构体a)。
[0643] SEQ ID No.151：
[0644] 编码智人上皮生长因子受体(幼红细胞白血病病毒(v-erb-b)原癌基因的同源基因，禽流感)(EGFR)的核苷酸序列。转录本变异2(异构体b)，mRNA(＞|NM_201282.1|)。编码区为核苷酸247至核苷酸2133。
[0645] SEQ ID No.152：
[0646] 智人上皮生长因子受体(幼红细胞白血病病毒(v-erb-b)原癌基因的同源基因，禽流感)(EGFR)的氨基酸序列(异构体b)。
[0647] SEQ ID No.153：
[0648] 编码智人上皮生长因子受体(幼红细胞白血病病毒(v-erb-b)原癌基因的同源基因，禽流感)(EGFR)的核苷酸序列。转录本变异3(异构体c)，mRNA(＞|NM_201283.3|。编码区为核苷酸247至核苷酸1464。
[0649] SEQ ID No.154：
[0650] 智人上皮生长因子受体(幼红细胞白血病病毒(v-erb-b)原癌基因的同源基因，禽流感)(EGFR)的氨基酸序列(异构体c)。
[0651] SEQ ID No.155：
[0652] 编码智人上皮生长因子受体(幼红细胞白血病病毒(v-erb-b)原癌基因的同源基因，禽流感)(EGFR)的核苷酸序列。转录本变异1(异构体d)，mRNA(＞|NM_201284.3|)。编码区为核苷酸247至核苷酸2364。
[0653] SEQ ID No.156：
[0654] 智人上皮生长因子受体(幼红细胞白血病病毒(v-erb-b)原癌基因的同源基因，禽流感)(EGFR)的氨基酸序列(异构体d)。
[0655] SEQ ID No.157：
[0656] 编码智人v-Ki-ras2Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的核苷酸序列。转录本变异a(异构体a)，mRNA(|NM_033360.2|)。编码区为核苷酸182至核苷酸751。
[0657] SEQ ID No.158：
[0658] 智人v-Ki-ras2Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因(KRAS)的氨基酸序列(异构体a)。
[0659] 引用的文献：
[0660] Arao T et al.，Small in-frame deletion in the epidermal growth factor receptor as a target for ZD6474.Cancer Res 64：9101-4(2004).
[0661] Aviel-Ronen S et al.，K-ras mutations in non-small-cell lung carcinoma：a review.Clin Lung Cancer 8：30-8(2006).
[0662] Bamford S et al.，The COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer)database and website.Br J Cancer 91：355-8(2004).
[0663] Banerji U et al.，BRAF and NRAS mutations in melanoma：potential relationships to clinical response to HSP90 inhibitors.Mol Cancer Ther 7：737-9(2008).
[0664] Basso AD et al.，Akt forms an intracellular complex with heat shock protein 90(Hsp90)and Cdc37 and is destabilized by inhibitors of Hsp90 function.J Biol Chem 277：39858-66(2002).
[0665] Beroukhim R et al.，Assessing the significance of chromosomalaberrations in cancer：methodology and application to glioma.Proc Natl Acad Sci U S A 104：20007-12(2007).
[0666] Bhattacharjee A et al.，Classification of human lung carcinomas by mRNA expression profiling reveals distinct adenocarcinoma subclasses.Proc Natl Acad Sci U S A 98：13790-5(2001).
[0667] Bild AH et al.，Oncogenic pathway signatures in human cancers as a guide to targeted therapies.Nature 439：353-7(2006).
[0668] Cappuzzo F et al.，Epidermal growth factor receptor gene and protein and gefitinib sensitivity in non-small-cell lung cancer.J Natl Cancer Inst 97：643-55(2005).
[0669] Chen CF et al.，Molecular genetic evidence supporting a novel human hepatocellular carcinoma tumor suppressor locus at 13q12.11.Genes Chromosomes Cancer 44：320-8(2005).
[0670] Choi K et al.，Transcriptional profiling of non-small cell lung cancer cells with activating EGFR somatic mutations.PLoS ONE 2：e 1226(2007).
[0671] Druker BJ et al.，Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome.N Engl J Med 344：1038-42(2001a).
[0672] Druker BJ et al.，Efficacy and safety of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in chronic myeloid leukemia.N Engl J Med 344：1031-7(2001b).
[0673] Eberhard DA et al.，Mutations in the Epidermal Growth Factor Receptor and in KRAS Are Predictive and Prognostic Indicators in Patients WithNon-Small-Cell Lung Cancer Treated With Chemotherapy Alone and in Combination With Erlotinib.J Clin Oncol (2005a).
[0674] Eberhard DA et al.，Mutations in the epidermal growth factor receptor and in KRAS are predictive and prognostic indicators in patients withnon-small-cell lung cancer treated with chemotherapy alone and in combination with erlotinib.J Clin Oncol 23：5900-9(2005b).
[0675] Garraway LA et al.，Integrative genomic analyses identify MITF as a lineage survival oncogene amplified in malignant melanoma.Nature 436：117-22(2005).
[0676] Golub TR et al.，Molecular classification of cancer：class discovery and class prediction by gene expression monitoring.Science 286：531-7(1999).[0677] Grbovic OM，V600E B-Raf requires the Hsp90 chaperone for stability and is degraded in response to Hsp90 inhibitors.Proc Natl Acad Sci U S A 103：57-62(2006).
[0678] Greshock J et al.，Cancer cell lines as genetic models of their parent histology：analyses based on array comparative genomic hybridization.Cancer Res67：3594-600(2007).
[0679] Greulich H et al.，Oncogenic Transformation by Inhibitor-Sensitive and -Resistant EGFR Mutants.PLoS Med2：e313(2005).
[0680] Heinrich MC et al.，Kinase mutations and imatinib response in patients with metastatic gastrointestinal stromal tumor.J Clin Oncol 21：4342-9(2003).[0681] Hirsch FR et al.，Increased epidermal growth factor receptor gene copy number detected by fluorescence in situ hybridization associates with increased sensitivity to gefitinib in patients with bronchioloalveolar carcinoma subtypes：a Southwest Oncology Group Study.J Clin Oncol 23：6838-45(2005).[0682] Hostein I et al.，Inhibition of signal transduction by the Hsp90 inhibitor 17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin results in cytostasis and apoptosis.Cancer Res 61：4003-9(2001).
[0683] Hummel M et al.，A biologic definition of Burkitt′s lymphoma from transcriptional and genomic profilingN Engl J Med 354：2419-30(2006).
[0684] Hupe P et al.，Analysis of array CGH data：from signal ratio to gain and loss of DNA regions.Bioinformatics 20：3413-22(2004).
[0685] Jong K et al.，Cross-platform array comparative genomic hybridization meta-analysis separates hematopoietic and mesenchymal from epithelial tumors.Oncogene 26：1499-506(2007).
[0686] Karaman MW et al.，Herrgard S，Treiber DK，Gallant P，Atteridge CE，Campbell BT et al (2008).A quantitative analysis of kinase inhibitor selectivity.Nat Biotechnol 26：127-32(2008).
[0687] Kaye FJ A curious link between epidermal growth factor receptor amplification and survival：effect of ″ allele dilution ″ on gefitinib sensitivity？J Natl Cancer Inst 97：621-3(2005).
[0688] Kendall J et al.，Oncogenic cooperation and coamplification of developmental transcription factor genes in lung cancer.Proc Natl Acad Sci USA104：16663-8(2007).
[0689] Knowles PP et al.，Structure and chemical inhibition of the RET tyrosine kinase domain.J Biol Chem 281：33577-87(2006).
[0690] Kobayashi S et al.，EGFR mutation and resistance of non-small-cell lung cancer to gefitinib.N Engl J Med 352：786-92(2005).
[0691] Lamb J et al.，A mechanism of cyclin D1 action encoded in the patterns of gene expression in human cancer.Cell 114：323-34(2003).
[0692] Lenburg ME et al.，Previously unidentified changes in renal cell carcinoma gene expression identified by parametric analysis of microarray data.BMC Cancer 3：31(2003).
[0693] Lin WM et al.，Modeling genomic diversity and tumor dependency in malignant melanomaCancer Res 68：664-73(2008).
[0694] Lockwood WW et al.，DNA amplification is a ubiquitous mechanism of oncogene activation in lung and other cancers.Oncogene.(2008).
[0695] Lu Y et al.，A gene expression signature predicts survival of patients with stage I non-small cell lung cancer.PLoS Med 3：e467(2006).
[0696] Lynch TJ et al.，Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib.NEngl J Med 350：2129-39(2004).
[0697] McDermott U et al.，Identification of genotype-correlated sensitivity to selective kinase inhibitors by using high-throughput tumor cell line profiling.Proc Natl Acad Sci U S A 104：19936-41(2007).
[0698] Neve RM et al.，A collection of breast cancer cell lines for the study of functionally distinct cancer subtypes.Cancer Cell 10：515-27(2006).
[0699] Nevins JR and Potti A，Mining gene expression profiles：expression signatures as cancer phenotypes.Nat Rev Genet 8：601-9(2007).
[0700] O′Reilly KE et al.，mTOR inhibition induces upstream receptor tyrosine kinase signaling and activates Akt.Cancer Res 66：1500-8(2006).
[0701] Paez JG et al.，EGFR mutations in lung cancer：correlation with clinical response to gefitinib therapy.Science 304：1497-500(2004).
[0702] Pao W et al.，EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from ″ never smokers ″ and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib.Proc Natl Acad Sci U S A 101：13306-11(2004).
[0703] Pao W et al.，Acquired resistance of lung adenocarcinomas to gefitinib or erlotinib is associated with a second mutation in the EGFR kinase domain.PLoS Med 2：e73(2005a).
[0704] Pao W et al.，KRAS mutations and primary resistance of lungadenocarcinomas to gefitinib or erlotinib.PLoS Med 2：e17(2005b).
[0705] Papadopoulos N et al.，The role of companion diagnostics in the development and use of mutation-targeted cancer therapies.Nat Biotechnol 24：985-95(2006).
[0706] Reich M et al.，GenePattern 2.0.Nat Genet 38：500-1(2006).
[0707] Rinaldi A et al.，Genomic and expression profiling identifies the B-cell associated tyrosine kinase Syk as a possible therapeutic target in mantle cell lymphoma.Br J Haematol 132：303-16(2006).
[0708] Schmid M et al.，Homozygous deletions of methylthioadenosinephosphorylase (MTAP)are more frequent than p16INK4A (CDKN2)homozygous deletions in primary non-small cell lung cancers(NSCLC).Oncogene 17：2669-75(1998).[0709] Shah NP et al.，Overriding imatinib resistance with a novel ABL kinase inhibitor.Science 305：399-401(2004).
[0710] Shankavaram UT et al.，Transcript and protein expression profiles of the NCI-60 cancer cell panel：an integromic microarray study.Mol Cancer Ther 6：820-32(2007).
[0711] Sharma SV et al.，Epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer.Nat Rev Cancer 7：169-81(2007).
[0712] Sharp S and Workman P，Inhibitors of the HSP90 molecular chaperone：current status.Adv Cancer Res 95：323-48(2006).
[0713] Shendure J et al.，Advanced sequencing technologies：methods and goals Nat Rev Genet 5：335-44(2004).
[0714] Shimamura T et al.，Non-small-cell lung cancer and Ba/F3 transformed cells harboring the ERBB2 G776insV_G/C mutation are sensitive to thedual-specific epidermal growth factor receptor and ERBB2 inhibitor HKI-272.Cancer Res 66：6487-91(2006).
[0715] Shoemaker RH The NCI60 human tumour cell line anticancer drug screen.Nat Rev Cancer 6：813-23(2006).
[0716] Slamon DJ et al.，Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2.N Engl J Med 344：783-92(2001).
[0717] Solit DB et al.，BRAF mutation predicts sensitivity to MEK inhibition.Nature 439：358-62(2006).
[0718] Solit DB and Rosen NHsp90：a novel target for cancer therapy.Curr Top Med Chem 6：1205-14(2006).
[0719] Song L et al.，Dasatinib (BMS-354825)selectively induces apoptosis in lung cancer cells dependent on epidermal growth factor receptor signaling for survival.Cancer Res 66：5542-8(2006).
[0720] Sos ML et al.，Expression of signaling mediators downstream of EGF-receptor predict sensitivity to small molecule inhibitors directed against the EGF-receptor pathway.J Thorac Oncol 3：170-3(2008).
[0721] Stamos J et al.，Structure of the epidermal growth factor receptor kinase domain alone and in complex with a 4-anilinoquinazoline inhibitor.J Biol Chem 277：46265-72(2002).
[0722] Thomas RK，et al.，High-throughput oncogene mutation profiling in human cancer.Nat Genet.(2007).
[0723] Tracy S et al.，Gefitinib induces apoptosis in the EGFRL858Rnon-small-cell lung cancer cell line H3255.Cancer Res 64：7241-4(2004).[0724] Tsao MS et al.，Erlotinib in lung cancer -molecular and clinical predictors of outcome.N Engl J Med 353：133-44(2005).
[0725] Uphoff CC and Drexler HG，Eradication of mycoplasma contaminations Methods Mol Biol 290：25-34(2005).
[0726] Weir BA et al.，Characterizing the cancer genome in lung adenocarcinoma.Nature 450：893-8(2007).
[0727] Yun CH et al.，Structures of lung cancer-derived EGFR mutants and inhibitor complexes：mechanism of activation and insights into differential inhibitor sensitivity.Cancer Cell 11：217-27(2007).
[0728] Huang F et al.，Identification of candidate molecular markers predicting sensitivity in solid tumors to dasatinib：rationale for patients selection.E.Cancer Res.Mar 1；67(5)：2226-38(2007)
[0729] Jackson，E.L.et al.，Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras.Genes Dev 15：3243-3248(2001)[0730] Johnson L et al.，Somatic activation of the K-ras oncogene causes early onset lung cancer in mice.Nature.410(6832)：1111-6(2001).
[0731] Ji H.et al.，LKB1 modulates lung cancer differentiation and metastasis.Nature.448(7155)：807-10.(2007)
[0732] Thomas RK et al.，Sensitive mutation detection in heterogeneous cancer specimens by massively parallel picoliter reactor sequencing.Nat Med.Jul；12(7)：852-5.Epub 2006 Jun 25.Erratum in：Nat Med.2006 Oct；12(10)：1220.
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 适于采用诊断适当性标准来确定用于识别病变的诊断试验的最佳顺序的医疗鉴别诊断装置 | 2020-05-15 | 367 |
| 猪繁殖与呼吸综合征血清学鉴别诊断试剂盒 | 2020-05-13 | 59 |
| 鉴别诊断不同类型痴呆的方法 | 2020-05-11 | 887 |
| 一种心肌肥厚基因鉴别诊断试剂盒 | 2020-05-12 | 630 |
| 心力衰竭恶化的自动鉴别诊断 | 2020-05-13 | 988 |
| 心电多相信息鉴别诊断仪 | 2020-05-13 | 76 |
| 用于自身免疫疾病的鉴别诊断的方法 | 2020-05-12 | 246 |
| 用于鉴别诊断不同牛泰勒虫的试剂盒及方法 | 2020-05-14 | 91 |
| 改良细菌鉴别诊断剂 | 2020-05-11 | 80 |
| 组合式定位鉴别诊断培养盒 | 2020-05-14 | 994 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈