一种人急性B淋巴细胞白血病细胞株及其应用专利检索-血培养诊断设备和程序专利检索查询-专利查询网

一种人急性B淋巴细胞白血病细胞株及其应用

阅读：5发布：2021-02-12

专利汇可以提供一种人急性B淋巴细胞白血病细胞株及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供一种人急性B淋巴细胞白血病细胞株HXEX‑ALL1，于2017年10月25日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2017232。该细胞株为原代建株的人急性B淋巴细胞白血病细胞株，是具高致瘤性的人急性B淋巴细胞白血病细胞株。该细胞株为复发难治人急性淋巴细胞白血病的研究和生物医药研发提供新的细胞模型，可用于建立人源化急性淋巴细胞白血病动物模型、急性淋巴细胞白血病发生机制及复发难治机制研究平台、急性淋巴细胞白血病新药研发和筛选平台和急性淋巴细胞白血病免疫学及微生物学研究平台等。在探索人急性淋巴细胞白血病发病机制、复发难治机制和药物研发应用中有广阔的前景和较大的实用价值。，下面是一种人急性B淋巴细胞白血病细胞株及其应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种人急性B淋巴细胞白血病细胞株，其细胞名称是人急性B淋巴细胞白血病细胞株HXEX-ALL1，保藏编号为：CCTCC NO：C2017232。
2.权利要求1所述的人急性B淋巴细胞白血病细胞株在建立人源化急性B淋巴细胞白血病动物模型中的应用。

说明书全文

一种人急性B淋巴细胞白血病细胞株及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于微生物动物细胞系领域，特别涉及一种人急性B淋巴细胞白血病细胞株及其应用。

背景技术

[0002] 急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia, ALL）是一组源于B系或T系淋巴前体细胞或淋巴母细胞的恶性克隆性疾病，是儿童期最常见的恶性肿瘤，严重威胁儿童健康，甚至生命。近年来，儿童急性淋巴细胞白血病的发病呈上升趋势。急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）约占儿童ALL的85%。虽然，近50年，儿童急性淋巴细胞白血病的预后取得了飞跃式的进展，5年生存率从1960s的10%提高到90%，5年无事件生存率超过80%，但仍有10～20%的患者难治、复发，预后差，且5年后仍有患者因急性淋巴细胞白血病复发或第二肿瘤而死亡，而白血病复发难治的机制尚不清楚。因此，难治复发白血病的治疗是目前临床关注的重点。

[0003] 白血病细胞株在白血病的基础和临床研究中具有重要作用。源于患者的永生化白血病细胞株可以长期保存、稳定增殖，供世界各国研究者使用，采用细胞株可进行体外分子免疫、分子遗传学研究并构建动物模型进行体内研究，能深入探索白血病发生、发展和转归的机制，辅助临床早期诊断、治疗并进行药物筛选，有重要的临床和研究价值。目前，国际通用的白血病和淋巴瘤细胞株有637株，源自中国的仅4株。需要更多的能用于急性B淋巴细胞白血病相关研究的细胞株。

发明内容

[0004] 本发明旨在为急性B淋巴细胞白血病的相关研究提供一种人急性B淋巴细胞白血病细胞株HXEX-ALL1，于2017年10月25日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：C2017232。

[0005] 该细胞株为原代建株的人急性B淋巴细胞白血病细胞株，该细胞株的原代细胞分离自一位急性B淋巴细胞白血病的6岁男性患儿（就诊于四川大学华西第二医院儿童血液肿瘤科），二次复发时的骨髓单个核细胞，体外接种后，通过条件培养，筛选扩增得到，形态比较均一、悬浮生长，在体外稳定无限传代，与患者白血病细胞同一来源，具高致瘤性的人急性B淋巴细胞白血病细胞株HXEX-ALL1。

[0006] 该急性B淋巴细胞白血病细胞株可用于建立人源化急性B淋巴细胞白血病动物模型。急性B淋巴细胞白血病细胞株在筛选或评估治疗急性B淋巴细胞白血病药物中的应用。在急性B淋巴细胞白血病发生机制研究中的应用。复发难治急性淋巴细胞白血病发生机制研究中的应用。在建立急性淋巴细胞白血病免疫学及微生物学研究平台中的应用。

[0007] 该细胞株具有以下生物学特性：

[0008] 经STR检测和细胞免疫表型分析，其结果如下表1和表2所示，通过表1和表2结果证实：HXEX-ALL1细胞与患者白血病细胞为同一来源，免疫分型为Pro-B。

[0009] 表1

[0010] 患者骨髓 HXEX-ALL1
Amelogenin X，Y X，Y
CSF1PO 11，13 11，13
D13S317 11，11 11，11
D16S539 10，11 10，11
D5S818 7，10 7，10
D7S820 10，12 10，12
TH01 9，9 9，9
TPOX 8，9 8，9
vWA 16，17 16，17
Penta E 5，19 5，19
Penta D 9，11 9，11
D2S441 11，11.3 11，11.3
D2S1338 18，24 18，24
D3S1358 15，15 15，15
D6S1043 12，19 12，19
D8S1179 13，15 13，15
D10S1248 13，14 13，14
D12S391 18，20 18，20
D18S51 13，23 13，23
D19S433 14，15 14，15
D21S11 29，33 29，33
FGA 24，26 24，26

[0011] 表2：

[0012]抗原（CD）患者初诊 HXEX-ALL1
B系标记
CD10 阳性阳性
CD19 阳性阳性
CD20 阴性阴性
CD22 阳性阳性
cCD79a 阳性阳性
cIgM 阴性阴性
sIgM 阴性阴性
T系标记
CD2 阴性阴性
CD3 阴性阴性
CD5 阳性阳性
CD7 阴性阴性
cCD3 阴性阴性
髓系标记
CD13 阴性阴性
CD33 阴性阴性
CD117 阴性阴性
其他
CD34 部分阳性阴性
HLA-DR 阳性阳性

[0013] HXEX-ALL1细胞在RPMI 1640完全培养基中悬浮生长，可形成集落，轻吹散开，多数5
细胞呈单细胞生长，圆形，形态比较均一，体外培养生长良好，按5×10/ml密度接种，2～3天传代一次，已经体外连续培养超过8个月，传代超过90代，群体倍增超过180代，连续传代过程中细胞形态比较均一、增殖动力学稳定、遗传学特征稳定，状态良好；经液氮或超低温冻存、复苏后性状不变，为一株永生化细胞株。

[0014] 采用MTT和台盼蓝染色细胞计数法绘制HXEX-ALL1细胞的生长曲线，计算细胞倍增时间为26～32小时，增殖速率稳定，可见分裂相，分裂后细胞仍呈圆形、悬浮生长；证实细胞株具有增殖动力学稳定性。

[0015] 采用PI染色法证实，HXEX-ALL1具有细胞周期稳定性，多次检测细胞免疫分型证实细胞具有免疫学稳定性。

[0016] 采用甲基纤维素半固体培养实验证实HXEX-ALL1细胞株具有高半固体克隆形成能力。

[0017] HXEX-ALL1细胞全基因组测序显示，在HXEX-ALL1细胞标本发现 3,357,771 个单核苷酸多态性， 847,741 个插入缺失，3,093 个拷贝数变异， 6,896 个结构变异；全基因组测序证实HXEX-ALL1细胞与患者白血病细胞为同一克隆来源，具有del(9)(p22)遗传学异常。

[0018] 本发明可应用于建立人源化急性B淋巴细胞白血病动物模型：细胞株HXEX-ALL1具有高致瘤性，将HXEX-ALL1细胞接种NOD/SCID小鼠，接种NOD/SCID小鼠后5天即可在皮下触及肿块，11天后肿块迅速生长，致瘤率100%，且成瘤细胞与体外培养的HXEX-ALL1细胞来源一致。

[0019] 本发明可应用于筛选或评估治疗急性B淋巴细胞白血病药物，通过向HXEX-ALL1细胞培养基中添加不同化疗药物，观察细胞生长增殖、死亡、周期等改变，获得初步有效的候选药物，再将候选药物用于上述急性B淋巴细胞白血病动物模型，检测药物的体内作用，观察动物的一般情况、存活时间、肿瘤大小改变以及药物作用后机体内凋亡、坏死及其它相关信号通路的改变等情况，从而对候选药物进行疗效评估和机制分析。

[0020] 本发明可应用于急性B淋巴细胞白血病发生机制研究，采用蛋白组学、全基因组学以及代谢组学的方法对HXEX-ALL1细胞进行分析，试图寻找特异的致病基因、蛋白或代谢物质，从而深入探讨白血病发病机制。

[0021] 本发明可应用于复发难治急性淋巴细胞白血病发生机制研究，HXEX-ALL1细胞源于一名男性急性B淋巴细胞白血病患儿第二次复发的骨髓白血病细胞，该患儿初诊时危险度分级为低危，可采用蛋白组学和全基因组学方法对HXEX-ALL1细胞和患儿初诊时的白血病细胞进行分析，比较其差异蛋白和基因的表达，探索其复发、难治的发生机制。

[0022] 本发明可应用于建立急性淋巴细胞白血病免疫学研究平台，将NK细胞、CAR-T或者其它免疫抗体、配体等应用于HXEX-ALL1细胞及其人源化动物模型，探讨免疫治疗对白血病细胞生长、机体免疫和白血病发展和转归的影响。

[0023] 本发明具有以下有益效果：

[0024] 本发明提供了一种中国汉族儿童急性B淋巴细胞白血病细胞株HXEX-ALL1。该细胞株的建立丰富了血液肿瘤细胞系的种类，尤其是中国汉族来源细胞系的种类，为复发难治人急性淋巴细胞白血病的研究和生物医药研发提供新的细胞模型，可用于建立人源化急性淋巴细胞白血病动物模型；建立急性淋巴细胞白血病发生机制及复发难治机制研究平台；建立急性淋巴细胞白血病新药研发和筛选平台；建立急性淋巴细胞白血病免疫学及微生物学研究平台等。在探索人急性淋巴细胞白血病发病机制、复发难治机制和药物研发的应用中将有广阔的前景和较大的实用价值。
附图说明

[0025] 图1为倒置相差显微镜下HXEX-ALL1细胞观察图（×400）；

[0026] 图2 为普通光学显微镜下HXEX-ALL1细胞瑞士-吉木萨染色图（×1000）；

[0027] 图3为透射电镜下HXEX-ALL1细胞超微结构图（×8000）；

[0028] 图4为HXEX-ALL1细胞生长曲线和细胞增殖动力学稳定性监测图，其中，A为30 代PDL；B为60 代PDL；C为120 代PDL；PDL：细胞群体倍增次数（population doubling level）；

[0029] 图5为HXEX-ALL1细胞周期稳定性监测图，其中，A为30代 PDL；B为60代 PDL；C为120 代PDL；PDL：细胞群体倍增次数（population doubling level）；

[0030] 图6为HXEX-ALL1细胞NOD/SCID小鼠皮下肿瘤形成实验图。

[0031] 人急性B淋巴细胞白血病细胞株HXEX-ALL1，保藏编号：CCTCC NO：C2017232，保藏日期： 2017年10月25日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保存单位地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内（武汉大学第一附小对面），武汉大学保藏中心。

具体实施方式

[0032] 本发明结合具体实施例对发明做进一步说明，但本发明的实施并不仅限于此。

[0033] 下述实施例如无特殊说明所用方法均为常规方法。

[0034] 实施例1：人急性B淋巴细胞白血病细胞株HXEX-ALL1的分离和建株

[0035] 1）患者骨髓幼稚B淋巴细胞分离和接种

[0036] 抽取患者骨髓3ml，肝素抗凝，Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液（TBD天津灏洋生物制品公司）分离患者骨髓单个核细胞；按6×106个/ml 密度将细胞重悬在含10ng/ml IL-3（Sigma公司）、20%胎牛血清（Thermo公司）的RPMI 1640培养基（Gibco公司）中，置37℃、饱和湿度、5% CO2培养箱培养。

[0037] 接种后的骨髓单个核细胞于48小时换液，去除细胞碎片。隔天计数细胞，7天后细胞数开始稳定增加，死细胞减少，建立原代培养细胞。

[0038] 根据细胞密度3～4天1:2或1:3换液，调整细胞密度为1×106个/ml，1～2周更换培养瓶以去除细胞碎片和成纤维细胞。原代培养细胞在接种21天后增殖加快，细胞碎片减少，调整传代时的初始密度为5×105个/ml，当细胞增殖到2×106个/ml时1:4换液传代，细胞稳定增殖，形态比较均一，悬浮生长。

[0039] 接种39天后调整培养条件，撤去IL-3，接种48天后调整血清浓度，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养，细胞仍能稳定增殖，形态比较均一，圆形，悬浮生长。

[0040] 接种60天后，第一次检测细胞倍增时间为30～35小时。

[0041] 2）HXEX-ALL1细胞传代时的初始密度为5×105个/ml，当细胞增殖到2×106个/ml时1:4换液传代。

[0042] 3）HXEX-ALL1细胞冻存前24小时换液，使细胞处于对数生长期，计数细胞，无菌条件下，将细胞转入离心管，1200转/分离心5分钟，弃上清，加入冻存液，

[0043] 调整细胞浓度为5×106个/ml，充分混匀，移入无菌冻存管，4℃，30min； -20℃，60min；-80℃过夜，次日移入液氮。

[0044] 4）复苏时，从液氮中取出冻存管，迅速置于37℃温水中，待冻存物融化后，将细胞悬液移入加入5ml RPMI 1640培养基的离心管中，轻柔混匀，1200转/分，离心5分钟，弃上清，细胞沉淀中加入RPMI 1640完全培养基，混匀，转移入培养皿/瓶，置37℃、饱和湿度、5% CO2培养箱培养。

[0045] 5）HXEX-ALL1细胞经反复如上述方法3）和方法4）冻存复苏，稳定生长，不影响细胞的生物学特征，显微镜下见细胞形态比较均一，圆形，悬浮生长，细胞倍增时间维持在26～32小时。

[0046] 6）所述RPMI 1640完全培养基的配方为：90% RPMI 1640培养基，10%胎牛血清。

[0047] 7）所述冻存液的配方为：60% RPMI 1640培养基，30%胎牛血清，10% DMSO（Sigma公司）。

[0048] 实施例2：人急性B淋巴细胞白血病细胞株HXEX-ALL1的生长和生物学特性鉴定[0049] 1) 细胞形态学观察

[0050] 取对数生长期的HXEX-ALL1细胞于倒置显微镜下观察活细胞形态，如图1所示，见细胞悬浮生长，圆形，形态比较均一，取对数生长期的HXEX-ALL1细胞，常规涂片固定，瑞士-吉木萨染色，于正置显微镜下观察细胞形态，如图2所示，见细胞圆形，直径11～15µm，核浆比大，可见分裂相，核圆形，可见核仁。

[0051] 取对数生长期的HXEX-ALL1细胞，常规固定包埋，透射电镜观察细胞超微结构，如图3所示，可见细胞核呈圆形或不规则形，有切迹，核内以常染色质为主，分布均匀，核膜清晰，胞浆内线粒体沿核周分布，部分有肿胀嵴断裂或消失，核糖体丰富，内质网大多发育欠佳，核浆比大，部分胞浆凸起呈为足样。

[0052] 2) 生长曲线和倍增时间测定：离心收集对数生长期的细胞，调整细胞浓度为2×105个/ml，接种于6孔板中，置37℃、5%CO2、21% O2培养箱中培养7天，每天用台盼蓝染色计数细胞，并用MTT法检测细胞增殖情况，96孔板中加入细胞悬液，每孔100µl，每组3复孔，设置空白对照，加入5mg/ml MTT （Sigma公司）10µl/孔，充分混匀，37℃孵育4小时后加入酸化的SDS（10%SDS含 0.01M HCl）， 100μl/孔，混匀。37℃孵育过夜，次日用多功能酶标仪测570nm 波长的吸光度值（OD）。以时间为横坐标，细胞数为纵坐标，绘制细胞生长曲线，如图4所示，计算细胞倍增时间为26～32小时，可见细胞株经反复传代，群体倍增次数到120代，仍然保持增殖动力学稳定性。

[0053] 3） PI染色法监测细胞周期：收获1×106个细胞，4℃预冷PBS洗2次，4℃ 70% 乙醇固定过夜，4℃ PBS洗2次，PI室温避光染色10min，流式细胞仪检测细胞的G1/G0、S及G2/M期的比率，结果如图5所示，HXEX-ALL1细胞株经反复传代，能保持细胞周期稳定性。

[0054] 4）STR检测证实HXEX-ALL1细胞与患者白血病细胞为同一来源。

[0055] 5）流式检测细胞免疫分型证实HXEX-ALL1细胞与患者白血病细胞为同一来源，免疫分型为pro-B。

[0056] 6）全基因组测序证实HXEX-ALL1细胞与患者白血病细胞为同一克隆来源，具有del(9)(p22)遗传学异常。

[0057] 实施例3

[0058] 细胞株HXEX-ALL1建立人源化急性B淋巴细胞白血病动物模型

[0059] NOD/SCID小鼠成瘤实验：将处于对数生长期的HXEX-ALL1细胞按5×106个/100µl/只，接种于雌性 Balb/c (nu/nu) 小鼠（6周龄，体重14～16g）裸区皮下；隔日观察接种部位肿瘤生成情况，结果如图6所示，接种5天后可在裸鼠皮下触及米粒大小肿块，接种11天后肿3
瘤迅速生长，每3天测量肿块大小，可见肿块体积从第11天的248 mm 生长到第20天的1707 mm3，14天后取瘤块制成细胞悬液，免疫分型和STR检测证实瘤块分离细胞与HXEX-ALL1细胞为同一来源。

标题	发布/更新时间	阅读量
一种富含细胞因子的冻干粉制备方法	2021-09-13	3
一种白薇石血叶营养腐乳的加工方法	2021-10-13	4
一种两歧双歧杆菌抗冻培养基及其应用方法	2021-10-28	4
鳜鱼弹状病毒毒株及制备方法和应用	2021-08-02	3
无血清培养基及其制备方法和间充质干细胞的培养方法	2020-06-06	2
一种罗非鱼鱼皮液态发酵活性产物的制备方法	2022-06-05	5
一种以蛹虫草培养基残基为原料的保健酒及其制备方法	2021-06-12	3
一种含血浆沉淀物的培养基及其应用	2020-05-28	2
抗α-抗胰蛋白酶多克隆抗体的杂交瘤细胞株	2021-08-11	3
粗毛韧革菌菌丝体多糖的制备方法及其应用	2021-01-03	1

一种人急性B淋巴细胞白血病细胞株及其应用

一种人急性B淋巴细胞白血病细胞株及其应用

技术领域

背景技术

发明内容

具体实施方式

该功能需要专业版企业版VIP权限，您可以：