技术领域
[0001] 本
发明属于细胞
生物学技术领域，涉及一种哺乳动物肌内脂肪细胞和骨骼肌细胞分层共培养方法。
背景技术
[0002] 动物胴体肌肉和脂肪组织的比例及其结构与分布，是决定肉用动物生产性能和肉品质的主要因素。一般来说肌肉组织主要由骨骼肌细胞组成。脂肪组织又可分为皮下脂肪、内脏脂肪和肌内脂肪，不同部位脂肪沉积主要依赖于脂肪前
体细胞的增殖、分化和聚脂成熟。其中肌内脂肪是有益脂肪，是形成大理石纹肉的物质
基础，直接参与了肉质嫩度、多汁性和肉品
风味的形成，是影响肉质风味的重要因素。过去20年里，国内外学者利用细胞系如3T3-L1前脂肪细胞系和不同动物如鼠、人、猪等皮下脂肪在细胞
水平上对脂肪细胞分化过程进行了研究并已取得了一定成果。但由于肌内脂肪是夹杂在肌肉组织中的少量组织，以难和肌肉组织分离，数量少等原因而很少得到分离和研究。而有关骨骼肌细胞的研究则主要以小鼠肌细胞系C2C12为实验材料，大型哺乳类动物骨骼肌细胞的分离和研究也相对较少。
[0003] 随着对动物发育规律的不断研究和认识，人们发现动物体内的肌肉和脂肪其实在动物发育过程中处于一个动态平衡状态。前体脂肪细胞可以分化为成熟脂肪，而成熟脂肪也可以去分化为前体脂肪甚至可以向肌肉细胞转分化；同样，在某些特殊的条件下肌肉祖细胞也可以分化为脂肪细胞。另外，脂肪细胞分泌的细胞因子可以通过旁分泌和自分泌作用影响肌细胞的成长，而肌细胞分泌因子也影响脂肪细胞。因此，将脂肪细胞和肌细胞单独培养只能观察到各自的独立事件，而无法研究它们之间的相互作用。
[0004] 以上阐述可以得出，和皮下脂肪相比，肌内脂肪细胞的分子事件更值得研究，这就需要一个纯度高的肌内脂肪细胞模型，同时，要想了解肌内脂肪细胞和肌细胞之间的关系，则需要将两种细胞在相同环境条件下同培养，使其分泌的细胞因子相互作用，这样，才能更好的模拟动物体内环境。所以本发明创新的将动物同一肌肉组织的肌内脂肪细胞和骨骼肌细胞在同一培养液中单独而又共培养，既可以单独分析脂肪细胞分化去分化事件，或肌细胞发育机制，又可以研究两种细胞之间的相互作用，加之方法简单可操作，培养设备要求低，是一种很好的细胞培养模型，具有一定的研究推广价值。
发明内容
[0005] 本发明的目的是解决哺乳动物肌内前体脂肪细胞难分离、杂细胞多等问题，同时解决两种细胞分层独立而又共培养的难题，提供一种哺乳动物肌内脂肪细胞和骨骼肌细胞分层共培养方法，为研究细胞间的相互作用提供细胞模型。
[0006] 一种哺乳动物肌内脂肪细胞和骨骼肌细胞分层共培养方法，包括以下步骤： [0007] 1）取动物背最长肌，肌内脂肪丰富的肌肉样组织，除去可见的血管和结缔组织，用PBS缓冲液冲洗；
[0008] 2）在无菌条件下将组织剪成小
块，加入浓度为1g/LⅠ型胶原酶消化液消化； [0009] 3）消化结束后，用含10%胎
牛血清的DMEM/F12培养基等体积中和消化液，用孔径为250μm的尼龙网筛过滤细胞悬液；
[0010] 4）步骤3）的滤液经900～1200r/m离心8～15min，取离心后的顶层悬浮成熟脂2 2
肪细胞液加入25cm 培养瓶中，在37℃、5％CO2
培养箱中静置培养；所述的25cm 培养瓶需预先灌满含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，在37℃、5％CO2培养箱中静置孵育4～6小时，使培养瓶内保持均衡；
[0011] 5）取上一步离心的下层细胞加红细胞裂解液洗涤，轻轻吹打以裂解红细胞，作用3～8min后900～1200r/m离心3～8min；倒掉上层离心液，加无血清DMEM/F12培养基稀释洗涤下层细胞，再用孔径为80μm的尼龙网筛过滤，收集滤液，1000r/min离心5min；倒掉上层离心液，加入500μL含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，吹打分散细胞后接种于装有含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基的直径为3.5cm培养皿中,置含37℃、5％CO2培养箱中静置培养；
[0012] 6）接种后2～3小时，取出细胞培养皿，轻轻吹打培养皿的底部,吸出含肌细胞的2
培养液,转移到步骤入4）中的25cm 培养瓶中，在37℃、5％CO2培养箱中培养细胞；这一步骤的原理是脂肪前体细胞贴壁比骨骼肌细胞快，所以2～3小时后脂肪前体细胞会贴壁在培养皿底部生长，不用胰酶消化是不会下来的，而轻轻吹打培养皿的底部,吸出来的培养液中几乎只含骨骼肌细胞；
[0013] 7）成熟脂肪细胞由于浮
力小将漂浮贴壁到“
天花板”面，而骨骼肌细胞会下沉到瓶底生长，从而24小时后就能够实现在同一培养瓶中获得来自同一动物同一组织的分层共培养的骨骼肌细胞和肌内脂肪细胞。
[0014] 本发明所述的哺乳动物肌内脂肪细胞和骨骼肌细胞分层共培养方法，优选包括以下步骤：
[0015] 1）取动物背最长肌，肌内脂肪丰富的肌肉样组织，剪去可见的血管和结缔组织，用PBS缓冲液冲洗三次；
[0016] 2）在无菌条件下将组织剪成1mm3左右的小块，加入1g/LⅠ型胶原酶消化液37℃，水 浴锅中振荡消化90min；
[0017] 3）消化结束后，用含10%胎牛血清DMEM/F12培养基等体积中和消化液，用孔径为250μm的尼龙网筛过滤细胞悬液；
[0018] 4）1000r/m离心10min，取500μL4×105顶层悬浮成熟脂肪细胞液加入25cm2培2
养瓶中，在37℃、5％CO2培养箱中静置培养；所述的25cm 培养瓶需预先灌满含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，在37℃、5％CO2培养箱中静置孵育4～6小时，使培养瓶内保持均衡；
[0019] 5）倒掉上一步离心的上层离心液，取下层细胞加红细胞裂解液洗涤，轻轻吹打作用3～5min以裂解红细胞，1000r/min离心5min；
[0020] 6）倒掉上层离心液，加适量无血清培养基稀释洗涤下层细胞，再用孔径为80μm的尼龙网筛过滤，收集滤液，1000r/min离心5min；
[0021] 7）倒掉上层离心液，加入500μL含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，吹打分散细胞后接种于直径为3.5cm培养皿中,置含37℃、5％CO2培养箱中静置培养； [0022] 8）接种后2～3小时，取出细胞培养皿，轻轻吹打培养皿的底部,吸出含肌细胞的2
培养液,转移到步骤入4）中的25cm 培养瓶中，在37℃、5％CO2培养箱中培养细胞； [0023] 9）成熟脂肪细胞由于
浮力小将漂浮贴壁到“
天花板”面，而骨骼肌细胞会下沉到瓶底生长，从而24小时后就能够实现在同一培养瓶中获得来自同一动物同一组织的分层共培养的骨骼肌细胞和肌内脂肪细胞。
[0024] 所述的浓度为1g/LⅠ型胶原酶消化液为在无血清DMEM培养液中加入20g/L牛血清
白蛋白和1g/L胶原酶Ⅰ型制得。
[0025] 按照本发明所述的方法获得的分层共培养的哺乳动物肌内脂肪细胞和骨骼肌细胞。
[0026] 有益效果：
[0027] 本发明与现有的细胞培养技术相比，其优点表现在：
[0028] （1）本发明相比胶原酶消化法单独培养骨骼肌细胞和单独培养前体脂肪细胞，步骤更少、技术更简单，可一次性获得两种细胞。
[0029] （2）本发明与独立培养肌细胞和独立培养前体脂肪细胞相比，可节省试验花费一半。
[0030] （3）本发明利用成熟脂肪细胞浮力小的特点，获得99%以上纯度的去分化前体脂肪细胞，解决了哺乳动物肌内前体脂肪细胞难分离、细胞纯度不高等问题。 [0031] （4）本发明解决了同一动物同一组织两种细胞（脂肪细胞和肌细胞）分层独立而又共培养的技术难题。
[0032] （5）本发明培养的细胞成活效率高，经多次观察证实用这种方法培养的脂肪细胞和骨骼 肌细胞活力好、细胞特征明显，与两种独立培养的细胞形态一致，并且均表达各自的标志基因。同时，可以用来研究共同培养时不同细胞分泌因子对细胞分化、发育、基因表达的改变和影响，是一种很好的研究脂肪细胞和肌细胞间互作的细胞模型，弥补了体外不能很好模拟动物
机体脂肪组织和肌肉组织相互影响的试验
缺陷，为进一步探索哺乳动物脂肪和肌肉平衡发育机制提供了有益的试验材料。
附图说明
[0033] 图1成熟脂肪细胞漂浮到培养瓶“顶部”贴壁生长并逐渐去分化为前体脂肪细胞 [0034] 图2去分化的肌内前体脂肪细胞再分化为脂肪细胞
[0035] 图3分化中的前体脂肪细胞表达脂肪标志基因
[0036] 注：1,2,3,4分别表示分化第2天，第4天,第6天,第8天PPARγ表达情况；5,6,7,8分别表示分化第2天,第4天,第6天,第8天C/EBPα表达情况。
[0037] 图4前体脂肪细胞标志基因Pref‐1琼脂糖凝胶
电泳结果
[0038] 图5培养瓶“底部“骨骼肌细胞形态
[0039] 图6骨骼肌细胞标志基因MyoD和Myf5的RT‐PCR电泳图
[0040] 注：1,2分别表示顶部脂肪细胞组和底部
成纤维细胞组。
[0041] 图7本发明方法示意图。图8肌内前体脂肪细胞和肌细胞细胞总RNA提取图
具体实施方式
[0043] 肉品质主要取决于肌细胞类型和肌内脂肪含量。3T3‐L1前体脂肪细胞系及原代培养的各种动物的脂肪基质微管细胞(SVF)是目前研究脂肪
细胞增殖、分化的主要细胞模型。但这些细胞模型各有缺点：如3T3‐L1细胞系来源于17～19日龄小鼠胚胎细胞，
染色体非整倍体，不能很好的反映动物体内环境；原代培养的SVF虽然能够较好的模拟动物体内环境，但这种细胞纯度不高，不利于精细研究。鉴于以上问题，人们正在寻找一种能够较准确的反映肌内脂肪细胞分化过程的前体脂肪细胞模型。而骨骼肌占动物体重的40%‐50%，是重要的畜产品，建立骨骼肌细胞模型对了解肌细胞类型的形成有至关重要的作用。 [0044] 猪在中国是最主要的肉用哺乳类
家畜之一，其肉品质的形成机理一直是众多学者关注的焦点。另外，猪的各种生理过程与人类较相近，并且其蓄积脂肪的能力最强，是一种很好的研究人类肥胖和畜禽体脂过渡沉积的模式动物。为此，我们用“天花板”培养法建立了猪肌内脂肪 细胞和肌细胞体外分层共培养模型。
[0045] 1试验材料
[0046] 1.1实验动物和组织
[0047] 实验动物为肥育出栏猪，经临床检查健康无病，屠宰后30min内取背最长肌肌肉。 [0048] 1.2仪器与器械
[0049] 空气
层流过滤室、CO2细胞培养箱、倒置相差
显微镜、超净
工作台、
电子分析天平、普通
冰箱、自动双重纯水蒸馏器、全自动压力
蒸汽消毒器、DK‐8D电热恒温水槽、普通离心机、烧杯，量筒，酒精灯，眼科弯镊，不锈
钢细胞筛及尼龙筛网，离心管，移液器，细胞计数板，培养板及培养皿等。
[0051] DMEM/F12培养基、10%胎牛血清的DMEM/F12培养基、Ⅰ型胶原酶、胎牛血清、TRIzol总RNA提取
试剂盒、反转录试剂盒及PCR反应试剂盒、Oil Red‐O染液等。 [0052] Ⅰ型胶原酶消化液：无血清DMEM/F12培养基，20g/L牛血清白蛋白，1g/L胶原酶Ⅰ型（临用时加入，过滤后使用）。
[0053] 红细胞裂解液：154mmol/L NH4Cl，10mmol/L KHCO3，0.1mmol/L EDTA，三蒸水。 [0054] 油红O染液：0.5g油红O，加入100mL98%的异丙醇，置60℃恒温箱中过夜，使油红O充分溶解。临用时取4mL双蒸水加6mL原液，静置30min后过滤使用。
[0055] 本发明使用的DMEM/F12培养基可以通过市售途径购买，也可以自行配制，为DMEM培养基和F12培养基1:1混合而成。含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基是在DMEM/F12培养基中添加10%的胎牛血清。
[0056] 2试验方法
[0057] 2.1操作流程
[0058] 1）取动物背最长肌，肌内脂肪丰富的肌肉样组织，剪去可见的血管和结缔组织，用PBS缓冲液冲洗三次；
[0059] 2）在无菌条件下将组织剪成1mm3左右的小块，加入Ⅰ型胶原酶（1g/L）消化液消化90min(37℃，水浴锅中振荡)；
[0060] 3）消化结束后，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基等体积中和消化液，用孔径为250μm的尼龙网筛过滤细胞悬液；
[0061] 4）1000r/m离心10min，取500μL4×105顶层悬浮成熟脂肪细胞液加入25cm2培2
养瓶中，在37℃、5％CO2培养箱中静置培养；所述的25cm 培养瓶需预先灌满含10％胎牛血清的 DMEM/F12培养基，在37℃、5％CO2培养箱中静置孵育4～6小时，使培养瓶内保持均衡；
[0062] 5）倒掉上一步离心的上层离心液，取下层细胞加红细胞裂解液洗涤，轻轻吹打作用3～5min以裂解红细胞，1000r/min离心5min；
[0063] 6）倒掉上层离心液，加适量无血清DMEM/F12培养基稀释洗涤下层细胞，再用孔径为80μm的尼龙网筛过滤，收集滤液，1000r/min离心5min；
[0064] 7）倒掉上层离心液，加入500μL含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，吹打分散细胞后接种于装有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基的直径为3.5cm培养皿中,置含37℃、5％CO2培养箱中静置培养；
[0065] 8）由于脂肪前体细胞贴壁速度比骨骼肌细胞快，接种后3小时，取出细胞培养皿，轻轻吹打培养皿的底部，利用差速贴壁原理吸出含骨骼肌细胞的培养液,转移到步骤入4）2
中的25cm 培养瓶中，在37℃、5％CO2培养箱中培养细胞；
[0066] 9）成熟脂肪细胞由于浮力小将漂浮贴壁到“天花板”面，而骨骼肌细胞会下沉到瓶底生长，24小时后就能够实现在同一培养瓶中获得来自同一动物同一组织的骨骼肌细胞和肌内脂肪细胞，并能够分层共培养。这样为研究肌内脂肪细胞分泌物对骨骼肌细胞分化的影响或骨骼肌细胞和肌内脂肪细胞的相互作用提供模型。
[0067] 2.2细胞形态学观察和鉴定
[0068] 2.2.1形态学观察
[0069] 每天在倒置显微镜下，分别观察培养瓶“顶部”和“底部”细胞，观察细胞生长情况，特别注意其形态的改变，记录可见变化特征及其出现时间，拍照。
[0070] 2.2.2油红O染色鉴定肌内成熟脂肪细胞
[0071] PBS洗涤细胞2次，10%甲
醛固定30min，PBS洗2次，油红O染色20min，PBS洗1次，显微镜下观察细胞内脂质呈红色。
[0072] 2.2.3去分化肌内前体脂肪细胞、骨骼肌细胞鉴定
[0073] 观察细胞，待成熟脂肪细胞完全去分化后，用RT‐PCR技术分别检测前体脂肪细胞和骨骼肌细胞标志基因，具体操作步骤如下：
[0074] （1）肌内前体脂肪细胞和肌细胞细胞总RNA提取，步骤见图8。
[0075] （2）细胞总RNA检测
[0076]
[0077]
[0078]
[0079] 提取的RNA溶解在适量无RNAse的DEPC水中。1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外光下观察RNA完整性和有无降解及基因组DNA污染；以500倍DEPC水稀释，用紫外分光光度计测定
波长260、280处OD值，计算OD260/OD280值和RNA浓度。提取的无污染、无降解RNA OD260/OD280值为1.8～2.0。如有DNA污染，用DNAseⅠ处理。
[0080] （3）PCR引物
[0081] 应用Primer Premier5.0
软件，按照引物设计的基本要求，设计脂肪细胞标志基因C/EBPα和PPARγ，骨骼肌标志基因MyoD和Myf5，β‐actin基因PCR扩增引物，引物长度18～22bp。由上海生工合成。
[0082] 表1脂肪细胞和肌细胞标志基因RT‐PCR引物
[0083]
[0084]
[0085] （4）RT‐PCR体系和反应按产品
说明书操作即可。
[0086] 3结果
[0087] 3.1肌内成熟脂肪细胞观察结果
[0088] 根据成熟脂肪细胞内含有大量脂肪、
密度小而漂浮在液体的上层这一特点，通过普通离心法分离到了成熟脂肪细胞，并采用“天花板”培养法培养细胞。显微镜下观察到成熟脂肪细胞漂浮到培养瓶的顶层贴壁生长（图1‐A）。油红O染色后细胞完全呈阳性（图1‐B）；贴壁72h内细胞为单室脂滴成熟脂肪细胞形态，并观察到正在分裂成2个细胞的脂肪细胞；72h后出现多脂滴细胞，开始呈现梭型细胞形态（图1‐C）；14d后细胞中脂滴完全消失，去分化为成纤维细胞形态的前体脂肪细胞（图1‐D）
[0089] 3.2去分化的肌内前体脂肪细胞可以再分化为脂肪细胞
[0090] 将去分化的肌内前体脂肪细胞（图2‐A）从培养瓶中传代到培养皿中独立培养7天后，发现去分化的肌内前体脂肪细胞可以重新分化为含脂滴的脂肪细胞（图2‐B）。 [0091] 3.3分化的前体脂肪细胞表达脂肪标志基因
[0092] 去分化的前体脂肪细胞表达脂肪前体标志基因Pref‐1，而不表达肌细胞标志MyoD，如图4。在去分化的肌内前体脂肪细胞向脂肪细胞再分化过程中，用RT‐PCR方法检测脂肪细胞标志基因PPARγ和C/EBPα的表达变化情况，结果在细胞分化的2,4,6,8天均有脂肪细胞标志基因PPARγ和C/EBPα的表达，如图3；
[0093] 3.4骨骼肌细胞培养、观察和鉴定结果
[0094] 由于骨骼肌细胞贴壁速度比脂肪前体细胞慢，首先根据“差速贴壁法”原理，将离心下层的细胞接种到培养皿中培养，3小时后将未贴壁的骨骼肌细胞从培养皿中吸出来，加入充满培养基的培养瓶时；再根据骨骼肌细胞浮力比成熟脂肪细胞小的特点，推测会下沉到培养瓶底部贴壁生长。结果在培养24小时后显微镜下观察到培养瓶底部确实有成纤维状细胞生长（图5‐A），4天时显微镜下观察，发现没有杂细胞纯度很高（图5‐B），并可向含有肌管状的肌细胞分化（图 5‐C）
[0095] 3.5成纤维状的细胞表达骨骼肌标志基因
[0096] 以“顶部”脂肪细胞为对照，用RT‐PCR方法检测肌细胞标志基因MyoD和Myf5表达情况，结果“顶部”脂肪细胞不表达MyoD和Myf5，而底部成纤维细胞表达MyoD和Myf5，说明底部成纤维细胞为骨骼肌细胞，如图6。
[0097] 4结论
[0098] 本方法成功在24小时后在同一培养瓶中获得高纯度的肌内成熟脂肪细胞和骨骼肌细胞。继续培养到14天，使肌内成熟脂肪细胞完全去分化为不含脂滴的纤维状细胞形态。这种细胞表达前体脂肪细胞标志基因Pref‐1，而不表达其他细胞如骨骼肌标志MyoD；将这种前体脂肪培养至汇合状态，传代后置于成脂诱导剂下培养，结果99％的细胞油红O染色阳性；分化过程中表达脂肪细胞分化关键转录因子PPARγ和C/EBPα，与3T3‐L1等前体脂肪细胞系分化过程一致，说明去分化的前体脂肪细胞可重新分化为成熟脂肪细胞，证明是前体脂肪细胞；而下层的成纤维细胞表达骨骼肌标志基因MyoD和Myf5，并且可以形成肌管状形态的细胞，证明为骨骼肌细胞。
[0099] 并且，这两种细胞来源清楚（来源于哺乳动物猪的背最长肌大理石纹肉组织），可在同一培养体系中共同生长发育。冻存前后细胞形态和活力良好；染色体数目和核型正常，遗传性能良好；无细菌、病毒和支原体污染。证明用这种方法是可行的，是一种高纯度、高分化率、低成本的哺乳动物肌内脂肪细胞和肌细胞分层共培养方法，为进一步研究哺乳类动物肉质形成机制提供了有益的试验材料。
