家蚕生产重组犬α干扰素的方法
专利汇可以提供家蚕生产重组犬α干扰素的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种家蚕表达重组犬α干扰素的方法。利用家蚕杆状病毒作为载体，构建了重组含有犬α干扰素基因的重组病毒。利用家蚕作为重组杆状病毒的宿主，表达了具有 生物 活性的重组犬α干扰素。解决了犬α干扰素在大肠杆菌中表达需要复杂的复性操作、 酵母 表达中质粒转化体不稳定和在 哺乳动物 培养细胞生产的成本太高的缺点，家蚕幼虫表达的重组犬α干扰素大部分被分泌进血淋巴中，非常有利于 蛋白质 的快速提取。实验结果证明利用重组杆状病毒以家蚕生产重组犬α干扰素方法可行。重组犬α干扰素的大量表达为α干扰素在医学和 治疗 领域上的应用开辟前景。，下面是家蚕生产重组犬α干扰素的方法专利的具体信息内容。
1、一种家蚕生产重组犬α干扰素的方法，其特征在于：(1)α干扰素基因的克隆：以浙江省当地家犬的血细胞抽提的基因组DNA为模板，利用PCR技术扩增得到犬α干扰素基因；引物设计如下：正向引物：5’ggatcctgccacctgcccgac3’，含有BamHI酶切位点，反向引物：5’aagctttcatttcctcctcctg3’，含有HindIII酶切位点；PCR反应的循环数、温度和时间的设计如下：一个循环，94℃模板变性3分钟；以下30个循环，94℃变性50秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分钟；最后1个循环，72℃延伸10分钟；利用1％琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物分析，并用Qiagene的PCR纯化试剂盒纯化，随后将目的PCR产物克隆进Invitrogen公司的TA克隆3.9kb的载体pCR2.1，利用双脱氧链终止法在核苷酸测序仪上测序确认克隆α干扰素基因顺序正确性，并已登录国际基因数据库GenBank，登录号DQ520882；(2)含有犬α干扰素基因的重组杆状病毒的构建：用限制性内切酶BamHI和HindIII消化pCR2.1-α干扰素得到α干扰素基因片段，然后克隆入然后克隆入美国Invitrogene公司的杆状病毒转移载体pBlueBacHisA；将此重组的转移载体与家蚕野生型核型多角体病毒BmNPV DNA共转染入家蚕培养细胞，通过同源重组产生重组病毒，具体的方法为在聚苯乙烯锥形管中加入1μg转移载体DNA和15μg家蚕BmNPV DNA，混匀，并加入14μl脂质体lipofectin，最后加入灭菌蒸馏水至终体积40μl；将该混合物在室温培育15分钟后共转染对数生长期的Sf21培养细胞；用无血清的TC-100培养基培养24小时后，换成含有10％胎牛血清的新鲜培养基，27℃培养5天，收集培养基上清作为病毒储存原液，用来筛选重组病毒。重组病毒通过几轮空斑筛选，最终获得高浓度纯化的病毒溶液，浓度为108pfu/ml。申请人将此重组病毒命名为含有犬α干扰素基因的家蚕重组病毒；(3)家蚕体内表达和重组α干扰素纯化：使用家蚕幼虫5龄起蚕，接种上述重组病毒进行感染表达；接种前，将幼虫浸在冰水浴中麻醉10分钟，注射用病毒悬浮液浓度为106pfu/ml，采用皮下注射的方法，每条家蚕注射20μl，注射1小时后给桑，在23-25℃下饲养；感染后的三天内，看不到明显的症状，到第四天，幼虫开始食欲减弱，渐渐地呈现出感染症状；感染后地五天或第六天，感染的幼虫大部分死亡，在此之前收集家蚕幼虫；将幼虫的血淋巴作为重组犬α干扰素纯化的起始材料，使用以下方法收集血淋巴：在15ml收集管的上方，将幼虫向背面弯曲，用一只手固定幼虫的头部和尾部，让腹部和腹足伸向外边并用25号针头刺破腹足收集血液，让血液直接滴进收集管中，为了防止血液氧化变黑，预先加入1/10体积的10mmol/L二硫苏糖醇DTT，使其终浓度为1mmol/L；由于重组蛋白N-末端带有6×His尾巴，可以用Ni-NTA亲和柱在非变性条件下进行蛋白纯化；从感染的幼虫收集的血淋巴用非变性结合缓冲液，Na3PO450mmol/L，NaCl 0.5mol/L，pH8.0，进行稀释；样品随后结合于Ni-NTA柱，最后，重组蛋白用含有250mmol/L咪唑的非变性洗脱缓冲液洗脱，通过SDS-PAGE考马斯亮蓝染色后鉴定重组蛋白；(4)重组α干扰素活性分析鉴定：将纯化的、倍比稀释的重组α干扰素添加到犬肾细胞(MDCK)单层培养细胞，作用18h，然后加入VSV病毒，同时设置阴性对照组，24h后观察细胞病变结果。根据结果分析判断重组α干扰素的抗病毒活性。
家蚕生产重组犬a干扰素的方法
技术领域
干扰素(Interferon， IFN)是由脊椎动物细胞产生的一类分泌型糖蛋白，它具 有广谱抗病毒和增强免疫应答的作用，其主要活性是抗病毒。犬的a干扰素全基 因为561个碱基，编码187个氨基酸，其中前23个氨基酸为信号肽，后164个氨基 酸为成熟蛋白，蛋白分子量约为19kDa。 Hiummler等于1987年首先开始了犬a干 扰素基因的研究。报道了犬a干扰素基因序列并专利控制了该基因的使用，而国 内这方面研究较少。 发明内容
本发明的目的在于提供一种家蚕生产重组犬a干扰素的方法。利用基因工程 表达技术，构建含有犬a干扰素基因的重组病毒，并利用家蚕作为宿主，表达生 产具有生物活性的重组犬a干扰素。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案其步骤如下：
1、 一种家蚕生产重组犬a干扰素的方法：
(1) a干扰素基因的克隆：以浙江省当地家犬的血细胞抽提的基因组DNA为 模板，利用PCR技术扩增得到犬a干扰素基因；引物设计如下：正向引物：
5 ，ggatcctgccacctgcccgac3 ，，含有5amHI酶切位点，反向引物：5 ，aagctttcatttcctcctcct g3，,含有/^mini酶切位点；PCR反应的循环数、温度和时间的设计如下： 一个 循环，94。C模板变性3分钟；以下30个循环，94°C变性50秒，55°C退火30 秒，72。C延伸2分钟；最后1个循环，72。C延伸10分钟；利用1%琼脂糖凝 胶电泳进行PCR产物分析，并用0/agwe的PCR纯化试剂盒纯化，随后将目的 PCR产物克隆进/"vz7wge"公司的TA克隆3.9kb的载体pCR2.1 ，利用双脱氧链 终止法在核苷酸测序仪上测序确认克隆a干扰素基因顺序正确性，并已登录国 际基因数据库GenBank,登录号DQ520882;
(2) 含有犬a干扰素基因的重组杆状病毒的构建：用限制性内切酶B"mffl 和/^2din消化pCR2.1-a干扰素得到a干扰素基因片段，然后克隆入然后克隆 入美国Invitrogene公司的杆状病毒转移载体pBlueBacHisA;将此重组的转移载
体与家蚕野生型核型多角体病毒BmNPV DNA共转染入家蚕培养细胞，通过同 源重组产生重组病毒，具体的方法为在聚苯乙烯锥形管中加入1昭转移载体 DNA和15吗家蚕BmNPV DNA，混匀，并加入14 pl脂质体lipofectin，最后 加入灭菌蒸馏水至终体积40 将该混合物在室温培育15分钟后共转染对数 生长期的Sf 21培养细胞；用无血清的TC-100培养基培养24小时后，换成含有 10%胎牛血清的新鲜培养基，27'C培养5天，收集培养基上清作为病毒储存原 液，用来筛选重组病毒。重组病毒通过几轮空斑筛选，最终获得高浓度纯化的 病毒溶液，浓度为108pfb/ml。申请人将此重组病毒命名为含有犬a干扰素基因 的家蚕重组病毒；
(3)家蚕体内表达和重组a干扰素纯化：使用家蚕幼虫5龄起蚕，接种上述 重组病毒进行感染表达；接种前，将幼虫浸在冰水浴中麻醉10分钟,注射用病毒 悬浮液浓度为106 pfU/ml，采用皮下注射的方法，每条家蚕注射20 pl，注射1小 时后给桑，在23-25。C下饲养；感染后的三天内，看不到明显的症状，到第四天， 幼虫开始食欲减弱，渐渐地呈现出感染症状;感染后地五天或第六天，感染的幼 虫大部分死亡，在此之前收集家蚕幼虫；
将幼虫的血淋巴作为重组犬a干扰素纯化的起始材料，使用以下方法收集血 淋巴：在15ml收集管的上方，将幼虫向背面弯曲，用一只手固定幼虫的头部 和尾部，让腹部和腹足伸向外边并用25号针头刺破腹足收集血液，让血液直接 滴进收集管中，为了防止血液氧化变黑，预先加入1/10体积的10mmol/L 二硫苏 糖醇DTT，使其终浓度为1 mmol/L;
由于重组蛋白N-末端带有6XHis尾巴，可以用Ni-NTA亲和柱在非变性条 件下进行蛋白纯化；从感染的幼虫收集的血淋巴用非变性结合缓冲液，Na3P04 50mmol/L， NaCl 0.5mol/L， pH8.0，进行稀释;样品随后结合于Ni-NTA柱,最后， 重组蛋白用含有250mmol/L咪唑的非变性洗脱缓冲液洗脱,通过SDS-PAGE考马 斯亮蓝染色后鉴定重组蛋白；
(4虔组a干扰素活性分析鉴定：将纯化的、倍比稀释的重组a干扰素添加到 犬肾细胞(MDCK)单层培养细胞，作用18h，然后加入VSV病毒，同时设置阴性 对照组,24h后观察细胞病变结果。根据结果分析判断重组犬a干扰素的抗病毒活 性。
本发明与背景技术相比，具有的有益效果是：
本发明较好地解决了 (x干扰素在大肠杆菌中表达需要复杂的复性操作、酵 母表达中质粒转化体不稳定和在哺乳动物培养细胞生产的成本太高的缺点，家 蚕幼虫表达重组犬a干扰素具有较高的生物活性，且大部分被分泌进血淋巴中， 非常有利于蛋白质的快速提取。重组a干扰素可以大量生产为犬a干扰素在医 学上的应用开辟前景。 具体实施方式
近年来，养犬业在我国发展迅速，犬作为宠物饲养已成为人们生活的一部 分，而病毒病却严重危害着犬的健康和生存。为了研制和开发犬重组干扰素生 物制剂，本申请对a干扰素基因进行了克隆.测序，并建立了利用我国的特色资 源昆虫家蚕表达重组犬a干扰素的技术，为重组犬a干扰素的应用奠定基础。
1、 材料：DNA抽提试剂盒购于^'agewe。 DNA处理和PCR扩增试剂盒购 于ra^ra (Kyoto, Japan)。 TA克隆试齐!j盒、杆状病毒转移载体 pBlueBacHisA、 lipofectin和Ni-NTA树脂均为美国/"v/Zroge"公司产品。DNA 测序试剂盒购于尸五v4/^/!'^/历o矽他ww 。胎牛血清FCS、家蚕BmN细胞培养基 TC-100均为的产品。本试验使用家蚕杂交种，品种名称为秋丰x白玉， 家蚕幼虫桑叶饲养，温度为23〜25t:。
2、 工作流程：
一种家蚕生产重组犬a干扰素的方法：
(1) a干扰素基因的克隆：以浙江省当地家犬的血细胞抽提的基因组DNA为
模板，利用PCR技术扩增得到犬（X干扰素基因；引物设计如下：正向引物：
5 ，ggatcctgccacctgcccgac3 ，，含有5a附HI酶切位点，反向引物：5 ，aagctttcatttcctcctcct §3',含有///"(1111酶切位点；PCR反应的循环数、温度和时间的设计如下： 一个 循环，94。C模板变性3分钟；以下30个循环，94°C变性50秒，55。C退火30 秒，72。C延伸2分钟；最后1个循环，72。C延伸10分钟；利用1%琼脂糖凝 胶电泳进行PCR产物分析，并用0'agewe的PCR纯化试剂盒纯化，随后将目的 PCR产物克隆进/"v!>0gew公司的TA克隆3.9kb的载体pCR2.1 ，利用双脱氧链 终止法在核苷酸测序仪上测序确认克隆a干扰素基因顺序正确性，并已登录国 际基因数据库GenBank，登录号DQ520882;
(2) 含有犬（X干扰素基因的重组杆状病毒的构建：用限制性内切酶^W2HI 和///"dill消化pCR2.1-a干扰素得到a干扰素基因片段，然后克隆入然后克隆 入美国Invitrogene公司的杆状病毒转移载体pBlueBacHisA;将此重组的转移载 体与家蚕野生型核型多角体病毒BmNPV DNA共转染入家蚕培养细胞，通过同 源重组产生重组病毒，具体的方法为在聚苯乙烯锥形管中加入1吗转移载体 DNA和15jxg家蚕BmNPV DNA，混匀，并加入14 脂质体lipofectin，最后
加入灭菌蒸馏水至终体积40 将该混合物在室温培育15分钟后共转染对数 生长期的Sf 21培养细胞；用无血清的TC-100培养基培养24小时后，换成含有 10%胎牛血清的新鲜培养基，27。C培养5天，收集培养基上清作为病毒储存原 液，用来筛选重组病毒。重组病毒通过几轮空斑筛选，最终获得高浓度纯化的 病毒溶液，浓度为108pfii/ml。申请人将此重组病毒命名为含有犬ct干扰素基因 的家蚕重组病毒；
(3) 家蚕体内表达和重组a干扰素纯化：使用家蚕幼虫5龄起蚕，接种上述 重组病毒进行感染表达；接种前，将幼虫浸在冰水浴中麻醉10分钟，注射用病毒 悬浮液浓度为106 pfli/ml，采用皮下注射的方法，每条家蚕注射20 pl,注射1小 时后给桑，在23-25。C下饲养；感染后的三天内，看不到明显的症状,到第四天， 幼虫开始食欲减弱，渐渐地呈现出感染症状；感染后地五天或第六天，感染的幼 虫大部分死亡，在此之前收集家蚕幼虫；
将幼虫的血淋巴作为重组犬a干扰素纯化的起始材料,使用以下方法收集血 淋巴：在15ml收集管的上方，将幼虫向背面弯曲，用一只手固定幼虫的头部 和尾部，让腹部和腹足伸向外边并用25号针头刺破腹足收集血液，让血液直接 滴进收集管中,为了防止血液氧化变黑，预先加入1/10体积的10mmol/L 二硫苏 糖醇DTT，使其终浓度为1 mmol/L;
由于重组蛋白N-末端带有6XHis尾巴，可以用Ni-NTA亲和柱在非变性条 件下进行蛋白纯化；从感染的幼虫收集的血淋巴用非变性结合缓冲液，Na3P04 50mmol/L， NaCl 0.5mol/L， pH8.0，进行稀释;样品随后结合于Ni-NTA柱,最后， 重组蛋白用含有250mmol/L咪唑的非变性洗脱缓冲液洗脱,通过SDS-PAGE考马 斯亮蓝染色后鉴定重组蛋白；
(4) 重组a干扰素活性分析鉴定：将纯化的、倍比稀释的重组oi干扰素添加到 犬肾细胞(MDCK)单层培养细胞，作用18h，然后加入VSV病毒，同时设置阴性 对照组,24h后观察细胞病变结果。根据结果分析判断重组犬a干扰素的抗病毒活 性。
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