兔胚胎干细胞系及其建系方法
阅读：367发布：2023-03-07
专利汇可以提供兔胚胎干细胞系及其建系方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了获得兔胚胎干细胞(rbES)的新方法。利用无血清培养体系建立了rbES细胞系，其能够以未分化状态长期增殖(＞1.5年)，并维持正常核型。rbES表达多能标志Oct4以及多种在干细胞中表达的其他分子，包括EBAF2、FGF4和TDGF1。这些细胞在体外能够形成类胚体，并在免疫 缺陷 小鼠中形成畸胎瘤。rbES表现出高克隆形成率，可进行遗传修饰，并可用作为核供体产生克隆兔。本文还公开了rbES的潜在应用。，下面是兔胚胎干细胞系及其建系方法专利的具体信息内容。
1.一种利用无血清培养体系建立未分化的多能兔胚胎干细胞系的方 法，包括下列步骤：
(a)收集囊胚期的兔胚胎；
(b)在无血清培养基中培养从囊胚中分离出来的内细胞团；
(c)从内细胞团的生长物中挑选出未分化的兔胚胎干细胞，传至新的 培养基中；
(d)在体外长期传代兔胚胎干细胞，并使之保持未分化状态。
2.根据权利要求1的方法，其中用于培养兔胚胎干细胞系的培养基中 含有商购或自制的血清替代物。
3.根据权利要求1的方法，其中用于培养兔胚胎干细胞系的培养基中 添加了生长因子。
4.根据权利要求3的方法，其中添加的生长因子为bFGF。
5.根据权利要求1的方法，其中兔胚胎通过自然交配或体外受精获得。
6.根据权利要求1的方法，其中兔胚胎通过孤雌生殖产生。
7.根据权利要求1的方法，其中兔胚胎通过体细胞核移植(SCNT) 产生。
8.根据权利要求1的方法，其中通过机械剥离法或免疫外科手术法从 兔胚胎的囊胚中分离内细胞团。
9.根据权利要求1的方法，其中饲养细胞为：
1)任何类型的来自小鼠、兔或其他哺乳动物的体细胞；
2)任何类型的由小鼠、兔或其他哺乳动物胚胎干细胞分化而来的细胞； 或者
3)任何永生化的哺乳动物细胞系。
10.根据权利要求9的方法，其中饲养细胞来自受孕12-15天的小鼠胚 胎。
11.根据权利要求1的方法，其中通过形态观察来选择未分化的兔胚胎 干细胞。
12.一种核移植的方法，其中利用如权利要求1-11中任一项的方法中 所获得的兔胚胎干细胞系作为核供体，通过核移植技术获得兔胚胎、兔胎 儿、新生兔或成体兔。
13.根据权利要求12的方法，包括如下步骤：
(a)将rbES细胞与去核的兔卵母细胞融合；
(b)使用电脉冲和/或化学物质激活核移植单元；
(c)将处于着床前任何阶段的核移植单元移植入代孕母兔或其他代孕 哺乳动物母体的生殖系统中；
(d)使植入的胚胎在体内发育。
14.根据权利要求13的方法，其中“着床前阶段”包括1-细胞、2- 细胞、4-细胞、8-细胞桑椹和囊胚阶段。
15.根据权利要求13的方法，其中植入的胚胎在体内进一步发育成兔 胎儿、新生兔或成体兔。
16.根据权利要求12-15中任一项的方法，用于产生兔子。
17.根据权利要求16的方法，其中所述兔子生产重组蛋白。
18.根据权利要求17的方法，其中在克隆动物的乳汁中生产所述重组 蛋白。
19.根据权利要求17的方法，其中在克隆动物的血液中生产所述重组 蛋白。
20.根据权利要求12的方法，用于产生具有特定基因突变的兔子，其 中所述突变可以通过导致DNA序列变化的一个或几个碱基的插入、缺失或 自然突变产生。
21.根据权利要求12-20中任一项的方法所获得的具有商业价值的生物 学产品。
22.根据权利要求12-20中任一项的方法所获得的兔子的在生产重组蛋 白、药物筛选、研发和毒理测试以及组织工程中的用途。
发明背景
小鼠因多种优点而被广泛地应用于生物学和医学研究。一方面，业已 建立了许多具有同源遗传背景的野生型同类小鼠品系。另一方面，业已建 立和表征了许多具有遗传突变的小鼠模型，这些遗传突变体大多通过同源 重组技术获得(Robertson et al.，1986；Thompson et al.，1989；Babinet et al.，2001)。这些遗传突变小鼠的个别基因被缺失、增加或被修饰，这样的 小鼠在遗传和发育生物研究领域具有非常重要的作用。有些小鼠的遗传突 变模拟人类的疾病状况(Holschneider et al.，2001；Harada et al.，1999； Kulkarni et al.，1999)，这类小鼠为阐明人类疾病的发病机理提供了非常有 价值的动物模型。
虽然小鼠在遗传学研究方面具有重要作用，但是由于其个体较小，对 于某些需要较大个体的动物的生物学实验却并不是理想的模型动物。基于 这种原因，兔长期以来作为优选的模型动物被广泛运用于心血管、肺等器 官疾病的研究中。兔还被广泛用于生产抗体、代谢病研究和药物筛选等方 面，因为这些实验需要频繁的采取血样，较大个体的动物更适合于此类研 究(Graves et al.，1993)。兔孕期短(31天)，饲养方便，在生物、医学及药 学研究中具有重要的作用。
兔还具有重要的经济价值，譬如兔的毛皮(安哥拉长毛兔)可运用于 纺织工业。使用转基因技术，还可在兔乳汁中生产人类酶蛋白，用于治疗 由于酶蛋白遗传缺陷引起的人类疾病。利用兔或兔细胞系来生产人源化抗 体，在医药研究领域具有广泛的用途。
胚胎干细胞是一种由着床前胚胎的内细胞团在体外培养而成多能干 细胞(Evans et al.，1981；Gail et al.，1981)。这种细胞能在体外长期传代而不 影响其发育潜能，而且能保持稳定的二倍体核型。将胚胎干细胞重新引入 到早期胚胎中，它们能发育成机体的每一种细胞类型，包括生殖细胞 (Bradley et al.，1984)。
在早期的研究中，从兔囊胚中分离培养出一种“可能的”胚胎干细胞， 在体外能长期培养(Graves et al.，1993)，能分化形成类胚体。然而，这种 细胞系是在血清培养基中建立培养而成的，血清中的许多成分使得胚胎干 细胞发生很高的自发分化率。这种细胞能在体外培养多长时间并仍能保持 参与胚胎发育的潜能，仍属未知。另外，作者未能提供诸如表面标志物的 表达、畸胎瘤的形成，分化的多能性等胚胎干细胞相关的特征信息。
人胚胎干细胞于1998年首次建立(Thomson et al.，1998；Reubinoff et al.，2000)。未分化的人胚胎干细胞能在体外长期培养，表达碱性磷酸酶、 许多表面标志物及多能性相关的标志物，在体外培养中能形成类胚体，在 免疫缺陷小鼠体内能形成畸胎瘤。
虽然不同物种的胚胎干细胞具有相似的特点，比如：在饲养层细胞上 生长良好，具有高核质比，在体外在化学成分相对明确的培养基中能长期 培养，但是不同物种的胚胎干细胞在很多方面存在着固有的不同。从不同 物种的胚胎中分离干细胞的过程中，需要调整不同的影响因素至最佳状 态。例如：最适的胚胎发育时期对分离胚胎干细胞成功与否至关重要，大 多数小鼠和兔胚胎在受精后3-4天发育至囊胚期，而人胚胎发育至囊胚阶 段需5-6天。人、小鼠和兔三个物种的囊胚和内细胞团的形态和生长动态 各不相同。此外，在原代的由内细胞团、囊胚或完整胚胎生长出的细胞团 中，准确地识别出未分化胚胎干细胞、滋养层细胞和其他类型细胞至关重 要，以便能够特异性地挑选出未分化的胚胎干细胞进行传代。这依赖于对 早期不同胚胎细胞类型的形态和行为的详尽了解，不同物种早期胚胎细胞 的形态和行为是各不相同的。而且，在培养不同物种的胚胎干细胞时，培 养体系中相同组分需要调整到不同的状态，以满足特定物种的胚胎干细胞 的最适需要。比如，大多数小鼠胚胎干细胞在较厚的饲养层细胞上生长良 好，而大多数人胚胎干细胞最适宜生长在较薄的饲养层细胞上。小鼠胚胎 干细胞能用剧烈的酶消化的方式进行传代，而相同的传代方式可能增加人 胚胎干细胞染色体异常的几率(Buzzard et al.，2004)。由此可见，似乎不 太可能利用现成的人和小鼠胚胎干细胞的建系方法进行其他哺乳动物的 胚胎干细胞建系。
因此，有必要建立一种新的方法来建立兔胚胎干细胞系(rbES)，使 其能够在体外长期维持未分化状态，并保持正常的核型。
发明内容
一方面，本发明提供了一种利用无血清培养体系建立多能兔胚胎干细 胞系的方法，包括下列步骤：
(a)收集囊胚期的兔胚胎；
(b)在无血清培养基中培养从囊胚中分离出来的内细胞团；
(c)从内细胞团的生长物中挑选出未分化的兔胚胎干细胞，传至新的 培养基中；
(d)在体外长期传代兔胚胎干细胞，并使之保持未分化状态。
用以培养兔胚胎干细胞的培养基含有血清替代物，既可商购，也可自 制。培养基中优选添加生长因子，例如bFGF。
不同的品系或株系的兔子均可用作分离兔胚胎干细胞的来源。胚胎或 囊胚可通过自然交配获得，也可通过体外受精获得。兔胚胎干细胞也可从 兔体细胞核移植产生的囊胚中分离培养而来，核移植胚胎能成功地发育至 囊胚(50％-80％2-细胞胚胎能发育至囊胚)，从而可用于获得核移植胚胎 干细胞(ntES)。因为ntES的遗传背景与体细胞核供体相同，所以当分化 的ntES移植回核供体内不会被排斥，因此，兔将成为很好的治疗性克隆 的动物模型。或者，兔囊胚也能通过孤雌激活卵母细胞产生，并从中分离 出孤雌胚胎干细胞(pES)。本培养体系为研究孤雌胚胎干细胞的潜在运用 提供了模型。
从囊胚中分离内细胞团可以采用机械剥离法，也可采用免疫外科手术 法。
饲养层细胞可以是1)任何类型的来自小鼠、兔和其他哺乳动物的体 细胞；2)任何类型的由小鼠、兔和其他哺乳动物胚胎干细胞分化而来的细 胞；或者3)任何永生化的哺乳动物细胞系。例如，饲养层细胞可以来自 受孕12-15天的小鼠胚胎。
另外，可以通过形态观察来选择未分化的兔胚胎干细胞。
另一方面，本发明提供了利用上述方法建立起来的兔胚胎干细胞系。
所述rbES细胞系能够表达多能性相关的分子标志Oct3/4，在免疫缺 陷动物体内能形成畸胎瘤。
所述rbES细胞系能在无血清培养基中长期增殖(大于3个月)，保持 正常的核型，维持未分化的多能状态。
优选地，可采用许多技术对rbES细胞系进行基因改造。通过转染， 感染或电转化的方法，可将编码期望的肽的DNA导入到rbES基因组中。 在特定的内源性或外源性启动子的控制下，rbES能表达这些肽。在大多 数情况下，使用这些方法导入的DNA分子随机整合到rbES的基因组中。 或者，利用同源重组技术，能够精确和可控地敲入、敲出或改造基因(例 如，基因增加、缺失或修饰)。
通过生殖系传递或核移植技术，可以从rbES获得活的兔个体。在一 种方法中，将rbES注射入囊胚腔中(Schoonjans et al.，1996)或者与四倍 体胚胎聚集(Nagy et al.，1990；Nagy et al.，1993)。在胚胎环境中，未分化 的rbES将参与到三个胚层各种组织的发育中。或者，用rbES作为核供体， 可以通过核移植技术获得活的个体(Wilmut et al.，1997；Edwards et al.， 2003)。
因此，本发明的目的之一是：用基因改造或未改造的rbES作为核供 体，通过核移植技术，获得兔胚胎、兔胎儿、新生兔和成体兔。
在一个实施方案中，上述核移植方法包括下列步骤：
(a)将rbES细胞与去核的兔卵母细胞融合，或将rbES细胞注射到 去核的兔卵母细胞中；
(b)使用电脉冲和/或化学物质激活核移植单元；
(c)将处于着床前任何阶段的核移植单元移植入代孕母兔或其他代孕 哺乳动物母体的生殖系统中；
(d)使植入的胚胎在体内发育。
其中，“着床前阶段”包括1-细胞、2-细胞、4-细胞、8-细胞桑椹和囊 胚阶段。
优选地，植入的胚胎在体内进一步发育成兔胎儿、新生兔或成体兔。
在一个实施方案中，上述核移植方法可以产生带有特定基因突变的活 体兔，突变可以通过导致DNA序列改变的一个或几个碱基插入、缺失或 天然突变获得。
这就是说，可以将rbES技术同基因改造技术和核移植技术相结合， 构建能够产生具有特定基因型和表型的转基因兔的技术平台。例如，使用 特定的rbES细胞系作为核供体，通过核移植克隆可以产生具有相同遗传 背景的兔克隆群。这些兔品系与其同类系相似，可被广泛地用作为实验动 物。另外，用经过基因改造的rbES作为核供体，可以产生具有新基因型 的转基因兔，这种转基因兔可以在乳汁、血液或身体的其他部分产生所期 望的肽。例如，可以产生在乳汁中含溶酶体酸性α-葡萄糖苷酶(lysosomal acidα-glucosidase)(GAA)的兔基因型，这种乳汁可用作为饮食增补物治疗 遗传性的GAA缺陷患者。可以产生在乳汁或身体其他部分可以分泌生长 因子、酶或生物活性肽的特定兔基因型。可以操纵编码免疫球蛋白的兔基 因，使其产生人源化抗体。也可改造编码兔皮毛成分的基因，从而改变兔 毛的颜色、密度和直径等。
又在另一方面，本发明提供了通过上述核移植方法产生的兔突变体。 优选地，所述兔携带的突变或者引起免疫缺陷，或者诱导模拟人类疾病的 症状，或者影响或改变特定兔组织或器官的生物学特征.，从而使得所述组 织或器官表现出新的生物学特征。或者，在所述兔中，编码免疫球蛋白的 基因的DNA序列中带有变化，编码兔毛皮成分的基因的DNA序列中带有 突变，或者编码参与代谢过程的肽的基因的DNA序列中带有突变。
又在另一方面，本发明提供了利用上述转兔突变体来获得具有商业价 值的生物产品的方法。这种生物产品可以是治疗人类疾病的分子，包括但 不限于人源化抗体。本发明还涉及兔突变体在遗传、发育、生物学、药学 和医学研究中作为实验动物模型的用途，或其在药物研究、筛选、研发和 毒理测试、以及组织工程中的用途。
一旦改变rbES细胞的基因组，这种经遗传修饰的rbES就可以作为核 供体用以产生带有特定期望特征的活兔。使用这种方法，就可以产生许多 不同的兔突变体，类似于多种转基因小鼠的产生(Torres M.，1998)。可以优 先考虑创建携带参与肺和心血管疾病形成的基因突变的兔，以推进对这些 系统的研究。携带参与代谢路径的修饰基因的兔对药物筛选和毒理测试具 有重要作用。
通过干细胞技术创建兔品系将利于干细胞研究、组织工程和器官移 植。具有同源遗传背景的兔系之间的细胞或组织移植不会引起排斥反应。 突变对免疫系统功能至关重要的基因可以产生免疫缺陷的兔。而免疫缺陷 兔可以提供干细胞(比如人胚胎干细胞)在体内的行为的重要信息。通过 将人类细胞移植进入免疫缺陷兔体内，产生稳定的人兔细胞嵌合体，可以 促进药物筛选和毒理测试。如前所述，rbES同样可以从孤雌或核移植所产 生的囊胚中分离出来(Kaufman et al.，1983；Cibelli et al.，2002；Wakayama et al.，2001；Hwang et al.，2004)。这种rbES细胞及他们的亲本兔(为pES 提供卵母细胞的母兔，以及为核移植干细胞ntES提供核供体细胞的兔) 可用以研究pES和ntES在体内的行为。
所以，本发明的一个目的是通过将rbES注射入着床前的不同发育阶 段的兔胚胎中，产生嵌合体兔。这种rbES可以来自常观的兔胚胎/囊胚、 孤雌囊胚或核移植囊胚，并且可以经过基因改造或未改造。
本发明的实用性
本发明利用无血清培养体系建立的rbES细胞系能够以未分化的状态 在体外长期传代(大于100代)，并保持稳定核型。分子分析表明rbES细 胞具有许多与hES细胞相似的特性，即他们表达ES细胞典型的多能性分 子标志，还有在未分化ES细胞中高表达的分子。这些细胞在体外在成分 明确的培养条件下生长增殖，并且在体外和体内能分化成许多细胞类型。 rbES细胞具有分化为所有三个胚层的细胞和组织的潜能。
rbES表现出高克隆形成率，便于进行遗传操作。通过不同的方法，可 以对rbES进行一系列的基因改造，比如同源重组。基因改造或未改造的 rbES细胞可以作为核供体产生活的兔个体。干细胞技术、基因改造技术和 动物克隆技术相结合，将形成一个技术平台，有效地生产新的兔品系。这 些新品系的兔将为医学、生物学、药学研究提供独特的实验系统。这些新 品系兔也将产生具有经济价值的产品。
附图的简短说明
图1：rbES细胞的形态图
A.囊胚阶段的受精胚胎。B、C和D.来自rbES1、QZL2和LHR2 的rbES。在无血清培养基中，rbES细胞在辐照的小鼠饲养层上形成扁平 单层的克隆，大多数克隆有明显的边界，细胞核质比高，核仁明显。加入 血清促使rbES在凝胶包被的培养皿中贴壁和生长，但是rbES将很快分化 (E和F)。
图2：rbES细胞系长期培养后保持正常核型(rbES传代80次的核型 分析)。G带染色显示了雌性rbES细胞系的正常核型：44，XX。
图3A：兔Oct-4、TDGF1、FGF4和EBAF2基因的部分cDNA序列。 图3B：rbES表达多能分子标志及ES细胞中所富含的分子。rbES细胞系 稳定地表达Oct-4、EBAF2、FGF4和TDGF1(分别是泳道1、3、5、7)。 在逆转录步骤中未加入逆转录酶的样品作为基因组DNA污染的对照(分别 是泳道2、4、6、8和10)。β-肌动蛋白(泳道9)用作为体系内参。
图4：rbES细胞表达的标志的细胞化学和免疫组化分析。人ES细胞 (hES35a)表达抗SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81的抗体所识 别的标志，但不表达SSEA-1。小鼠ES(mES)只表达SSEA-1。相反，rbES 细胞(qzlES2)不表达这5种抗体所识别的分子。rbES表达OCT-4和高 水平的碱性磷酸酶活性。
图5：rbES分化形成的细胞和组织类型。A.由rbES细胞形成的类胚 体(EB)；B.由EB贴壁后向外长出的细胞中含有具典型神经细胞形态的 细胞，这些细胞的β-微管蛋白抗体免疫染色呈阳性；C.有些EB切片含有 肠状结构，α-胎蛋白抗体免疫染色呈阳性；D.其他EB切片CD31免疫染 色呈阳性，CD31是上皮细胞的标志，能够对血管样结构进行染色。
图6：rbES细胞形成的畸胎瘤的组织学分析。畸胎瘤含有多种分化组 织：A.角化复层扁平上皮(外胚层)；B.毛囊(外胚层)；C.肠上皮(内 胚层)；D.假复层纤毛柱状上皮(内胚层)；E.肌肉(中胚层)
图7：表达绿色荧光蛋白GFP的rbES细胞亚系(rES1-GFP2)。A和 B.稳定表达GFP的rbES细胞集落；C和D.从表达GFP的类胚体中中 长出的ES细胞。E和F.在分化后有些分化的细胞依然是GFP阳性。左 列(A、C和E)为荧光显微照片；右列(B、D和F)分别为同一视野的放大 照片。
图8：兔ntES表达的标志(免疫细胞化学染色)。兔ntES细胞不表 达SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81。兔ntES细胞表 达OCT-4和高水平的碱性磷酸酶。
图9：兔ntES细胞正常核型。G带染色显示了雄性兔ntES细胞系(第 9代)的正常核型：44，XY。
图10：pES细胞学和免疫组化染色。兔pES细胞不表达SSEA-1， SSEA-3，SSEA-4，TRA-1-60，TRA-1-81.兔ntES细胞表达OCT-4和高水 平的碱性磷酸酶。
图11：兔pES细胞的正常核型。G带染色显示了雌性pES细胞系(第 20代)的正常核型，44，XX。
图12：正常兔ES细胞(rbES)、兔ntES细胞和兔pES细胞中印迹基 因表达的RT-PCR分析。
A.正常rbES和pES细胞中H19和SNRPN的表达。pESB1，兔孤雌 胚胎干细胞B1；pESC1，兔孤雌胚胎干细胞C1；pratbitB，pESB1卵细 胞供体兔；prabbitC，pESC1卵细胞供体兔；MW表示DNA分子量标志 泳道；(-)，无逆转录酶的阴性RT对照。
B.兔ntES细胞中H19和SNRPN基因的表达。ntESA1，兔核移植胚胎 干细胞A1；ntrabbitA，ntESA1核供体兔；MW，分子量标志；(-)，无逆转 录酶的阴性RT对照。
图13：rbES，兔ntES和兔pES细胞的微卫星标志分析。
A为5L1C3基因座(位于5号染色体)的STR分析；
B为19L1A4基因座(位于19号染色体)的STR分析；
C为6L1F10基因座(位于6号染色体)的STR分析；
D为OCELAMB基因座(位于内皮细胞白细胞粘附分子1基因上)的 STR分析。
框内数字和相应的峰代表每一STR标志的PCR产物大小(bp)和多态性 的位置。5个电泳图代表5个DNA样品的分析：pESB1供体兔(1)、PESB1(2)、 ntESA1供体兔(3)、ntrESA1(4)以及作为对照的无关供体兔(5)。
图14：rbES细胞核移植到去核卵母细胞中所产生的活体小兔。实验表 明rbES细胞核在核移植实验中能支持胚胎发育至囊胚阶段。
图15：哺乳动物表达载体pQBI pgk的图谱。
pQBI pgk为在转化的哺乳动物细胞中表达GFP的表达载体，该载体 GFP-neo构建体的氨基端含GFP，以确保细胞既抗G418，又表达GFP。小 鼠pgk启动子和腺病毒的三联引导序列结合确保其在多种细胞类型尤其 是在ES细胞中长期稳定地表达。该载体的设计使得缺乏polyA信号序列的 表达盒易于切除和亚克隆。
实施例
以下将结合实施例和附图进一步阐述本发明，这些实施例绝不应当解 释为对本发明的限制。
实施例1.rbES细胞培养
在本实施例中，我们利用基本相同的分离和培养方法，从三个亚种(新 西兰，安哥拉，青紫兰)的兔囊胚中分离胚胎干细胞，其中，从新西兰白兔 获得一个细胞系，从安哥拉兔获得一个细胞系，从青紫兰兔获得三个细胞 系(图1和表1)。从三种不同的兔亚种中成功地对兔胚胎干细胞进行了建系 的结果表明本方法可同样地适用于其他兔亚种。
新西兰，安哥拉，青紫兰兔分别购自上海实验动物中心、北京市药品 检验所和南京金陵种兔场。自然交配4天后，用PBS将囊胚从子宫中冲出， 机械法或者免疫外科法(Davor et al.，1975)分离出内细胞团，接种到经55Cy γ射线照射的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层上。基本培养液含78％ DMEM/F-12，2mM L-谷氨酸，1％非必需氨基酸，0.1mM β-巯基乙醇， 20％KnockOut血清替代物(Invitrogen，Carlsbad，CA)，添加或不添加4-8 ng/ml人重组bFGF。
3-5天左右，内细胞团生长形成集落。最初长出的内细胞团通常含有异 类的细胞类型。6-8天后，机械法挑选出具有典型ES细胞形态(图1)的细胞 传代至新培养板中。
如图1所示，在无血清培养基中，rbES细胞在饲养细胞上形成扁平单 层的克隆。5个细胞系的群体倍增时间分别在大约12-16小时(表1)。细 胞核大，核质比高，这些特点与hES细胞相似。与hES细胞相比，核仁 小而不明显。大多数集落有明显的边界。在培养皿中，能观察到单个的rbES 细胞和小的新细胞集落的生长。rbES细胞早期采用机械法传代，1-2个月 后，使用胰酶消化的方法传代。即，用0.05％的胰酶消化细胞后，辅以轻 轻的吹打，使细胞成为小团块。NZ-1细胞系已使用胰酶消化的方法传代1 年以上，迄今仍保持正常核型(图2)。
所有rbES细胞系均在不合LIF的培养液中建立。因此，rbES细胞 多能性的维持不依赖于外源性的LIF。虽然rbES细胞系最初是在含bFGF 的培养液中建立的，但在随后的实验中很快就发现，在不添加外源性 bFGF的培养液中，rbES细胞也能很好的增殖并保持未分化状态。在含4 ng/ml bFGF的培养液中，rbES细胞群体倍增(PD)时间为15h，而在不 合bFGF的培养液中，rbES细胞群体倍增时间为20h(数据未显示)。所以， bFGF能够增加rbES细胞的增殖速度。也许rbES细胞依赖于内源性的 bFGF维持未分化状态的存活和增殖，这需要进一步的实验来加以证实。 在无血清培养基中，rbES已持续传代1年以上，仍保持未分化状态。在无 血清培养基中，rbES的生长似乎依赖于饲养层细胞。当传至无饲养层细胞 的凝胶包被的培养皿中时，rbES不能贴壁。在培养液中加入血清能促使 细胞贴壁和生长，但很快就会分化(图1，数据未显示)。血清中促使细胞 分化的因子仍未知。
表1.由三个兔亚种建立的rbES细胞系
亚种 囊胚数目 rbES细胞系数目 群体倍增时间(小时) 新西兰兔 5 1(rES1) 12 青紫蓝兔 7 3(qzl1，qzl2 qzl3) 15 安哥拉兔 7 2(LHR1，LHR2) 16
实施例2.rbES细胞表达的分子标志
RT-PCR
用Trizol(Invitrogen，Carlsbad，CA)提取总RNA，以DNase I于37℃ 处理20分钟以去除污染的基因组DNA。根据厂家提供的方法，使用莫洛尼 鼠白血病病毒逆转录酶(Promega，Madison，WI)和随机引物(Promega)进 行第一链的合成。引物序列如表4所示。使用下列参数进行PCR反应：94℃ 变性4分钟，随后35个扩增循环，包括94℃变性30秒，退火30秒，72℃延 伸40秒，之后在72℃进行5分钟终延伸。退火温度见表4。在逆转录步骤中 不加逆转录酶的样品用作为基因组DNA污染的对照。β-肌动蛋白用作为体 系内参。
结果
Oct-4是所有胚胎干细胞的多能性标志。TDGF1、FGF4和EBAF2在 ES细胞中高表达，而当ES分化时其表达下调。我们对兔Oct-4、TDGF1、 FGF4和EBAF2基因的部分序列进行了扩增、克隆和测序。结果示于图 3A之中。
rbES细胞表达Oct-4(图3B)。值得注意的是，在我们的培养体系中， rbES细胞能长期增殖(≥2year)，其能够保持未分化状态，并且表达Oct-4、 TDGF1、FGF4及EBAF2。
免疫组化
为了分析rbES细胞的标志物表达情况，将rbES细胞克隆在4％PFA (多聚甲醛)中室温固定15分钟。细胞以TBS-T缓冲液(20mM Tris-HCl， pH 7.4，0.15M NaCl，0.05％Tween-20)洗两遍，5-10分钟/次。0.1％Triton X-100/PBS室温处理细胞10分钟。再以TBS-T缓冲液洗两遍，5-10分钟 /次，然后以3％BSA/PBS(封闭液)孵育1h。表征rbES细胞所使用的 一抗为购自Chemicon(Temecula，CA)的anti-SSEA-1、anti-SSEA-3、 anti-SSEA-4、anti-TRA-1-60和anti-TRA-1-81以及购自Santa Cruz Biotechnology的(Santa Cruz，CA)anti-OCT-4。所有抗体以PBS稀释， 并与样品于4℃孵育过夜。次日，以TBS-T缓冲液洗三遍，5-10分钟/次。 加二抗，室温孵育1小时。所用的二抗为FITC缀合的驴抗山羊IgG、FITC 缀合的山羊抗小鼠IgG+IgM、FITC缀合的驴抗小鼠IgG和FITC缀合的 山羊抗大鼠IgG+IgM(Jackson Laboratories，West Grove，PA)。激光共聚 焦显微镜(Olympus)观察并拍照记录。为了检测碱性磷酸酶活性，将rbES 细胞以4％PFA室温固定10分钟，以缓冲液III(100mM Tris-HCl，100mM NaCl，50mM MgCl2，pH9.5)冲洗10分钟，与NBT/BCIP(缓冲液III 1∶100 稀释)室温暗反应15-30分钟。充分显色后终止反应，PBS洗一遍，观察并 拍照记录。
为了检测分化的rbES细胞的标志物表达，类胚体(EBs)悬浮培养20 天后，收集，制备冷冻切片。或者，EBs悬浮培养4-7后，转移到塑料载片 上贴壁培养。再继续培养7天，使分化细胞由EBs向外长出。载片上的细胞 4％PFA室温固定10-15分钟。加一抗4℃过夜进行抗体染色。所用的一抗为： 外胚层分子标志：β-微管蛋白III(1∶400，Sigma)、NSE(1∶5，DAKO)和波形 蛋白(1∶50，DAKO)；中胚层分子标志：anti-CD31(1∶100，DAKO)， anti-MHC(1∶100，Santa Cruz)和anti-结蛋白(1∶100，Santa Cruz)；内胚层 分子标志：anti-AFP(1∶500，Biogenex)，anti-白蛋白(1∶1000，DAKO)和 anti-c-met(1∶100，Santa Cruz)。样品与HRP缀合的二抗(1∶100，Jackson) 37℃孵育1小时。显色后，以溶于PBS之中的50％甘油封片，以配备有Spot digital camera(斑点数码相机)和软件的Olympus显微镜进行镜检分析。
结果
已知不同物种来源的ES细胞与抗SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60 和TRA-1-81的抗体的反应不同。例如，hES表达能被抗SSEA-3、SSEA-4、 TRA-1-60和TRA-1-81的抗体所识别的抗原，但不表达能被抗SSEA-1的抗 体所识别的抗原。小鼠ES细胞只表达这五种标志中的一种，即SSEA-1。 相反，rbES不表达能被这五种抗体识别的分子(图4)。尚无法确定是rbES 根本不表达类似于这些表面抗原的标志，还是rbES表达类似抗原，但不与 这些抗体交叉反应。如图4所示，rbES表达高水平的碱性磷酸酶。
实施例3.细胞克隆及群体倍增时间的计算
我们研究了三种rbES细胞系的克隆形成率。以0.05％胰蛋白酶将细 胞集落消化成单细胞。每个细胞系接种1000个细胞到培养皿中。5天后， 计算集落数量，克隆形成率以下列公式计算：克隆形成率(％)＝(克隆数 /1,000)×100％。如表2所示，三种rbES细胞系rbES1、Qzl2和LHR1 的克隆形成率分别为0.15±0.01％、0.18±0.04％和0.13+0.03％。rbES细胞 的克隆生长将会有利于遗传操作过程中rbES细胞的筛选。
表2.rbES细胞的克隆形成率
细胞系 克隆形成率(％) rbES1 0.15±0.01 Qzl2 0.18±0.04 LHR1 0.13±0.03
以记号笔在培养皿的底部标记小的(大约10个细胞左右)细胞集落， 每隔24小时照相，计算集落内的细胞数量(N)，以确定群体倍增(PD) 时间。PD时间值根据下列公式计算：PD(小时)＝时间总长/Log2(N2/N1)。 每株细胞至少计算三个PD值，然后求平均值。
在4ng/ml bFGF培养液中，5个1.bES细胞系的群体倍增时间为12至16 小时，如表1所示。而在不合bFGF培养液中，rbES细胞群体倍增时间为20 小时(数据未显示)。这表明，bFGF浓度升高能够促进rbES细胞增殖。
实施例4.体外分化
通过类胚体途径，rbES细胞能够在体外分化。以1mg/ml IV型胶原酶 37℃消化rbES细胞3-5分钟，轻轻吹打成小的细胞团，悬浮培养4-8天，培 养基包括如下成分：78％DMEM，20％FBS，2mM L-谷氨酸，1％非必需氨 基酸和0.1mM β-巯基乙醇。每两天换一次培养液。
rbES细胞在无饲养细胞、含血清的培养条件下悬浮培养，可迅速形成 外表光滑的EB(图5A)。EB经过贴壁培养后，可生长出许多形态各异的分 化细胞。免疫组化染色表明，分化的rbES细胞表达所有三个胚层的分子 标志(表3)。由EB贴壁生长出的细胞中有具典型神经细胞形态的细胞，这 种细胞呈神经丝H(神经组织相关标志，外胚层)阳性(图5B)。有些EB的 切片含有肠样结构，免疫组化染色显示呈α-胎蛋白阳性(图5C)。在其它EB 切片中可见血管状结构的周围有部分细胞呈CD31(血管内皮细胞相关标 志，中胚层)阳性。
表3.rbES细胞、兔ntES和兔pES细胞所表达的分化标志
外胚层 中胚层 内胚层 β-微管蛋白III NSE 波形蛋白 MHC 结蛋白 CD31 AFP 白蛋白 c-met 兔ES ++ ++ ++ ++ + + ++ ++ + 兔nrES ++ ++ ++ ++ + + ++ ++ + 兔pES ++ ++ ++ ++ + + ++ ++ +
实施例5.体内分化
为了检测rbES的体内分化潜能，将大约2-5×106形态上未分化的3种 rbES细胞注射进NOD-SCID小鼠后腿肌肉中(4周龄，购自中科院上海实验 动物中心)。10-12周后，所有3种rbES细胞系均形成实体畸胎瘤。
在肿瘤形成的8-10周内，对畸胎瘤取材进行切片，4％多聚甲醛固定， 苏木精和曙红染色后进行组织学分析。实体畸胎瘤含有丰富的组织类型， 如图6所示，这些畸胎瘤包含有来自三个胚层的组织，包括：角化复层扁平 鳞状上皮和毛囊(外胚层)；肌肉(中胚层)；以及肠上皮和假复层纤毛 柱状上皮(内胚层)。
从而，体内和体外实验都证实，在本发明的无血清培养体系中建立起 来的rbES细胞系具有发育的多能性，能发育成所有三个胚层的多种组织。
实施例6.遗传操作
将由CMV启动子驱动的含GFP基因的载体电转化到rbES细胞中。 新霉素抗性筛选得到数百个表达GFP基因的克隆。从中建立7个GFP+的 rbES细胞亚系，他们在体外保持未分化的增殖，并持续表达GFP(图7)。
实施例7.核型分析
将处于指数生长期的rbES细胞，加入200ng/ml终浓度的秋水仙素于 5％ CO2中于37℃孵育1.5-2小时。0.05％胰酶消化成单细胞，1,200rpm离 心5分钟(eppendorf centrifuge，5810R)，加入10ml 37℃预热的低渗液 (KCl 0.56g/100ml水+柠檬酸钠0.5g/100ml水)，37℃孵育30分钟。逐滴加 入2ml固定液(乙酸∶甲醇＝1∶3)于低渗液中，室温预固定5分钟。1,200rpm 离心5分钟。重悬于10ml固定液中，室温固定10分钟。再重复离心固定步 骤2-3次。最后一次固定后，离心，剩余适量固定液，重悬细胞，将细胞滴 加到-20℃预冷的载玻片上。室温老化2天后，65℃老化4小时。0.1％胰酶 (溶于0.8％的NaCl中)37℃消化5分钟，1％Giemsa染色15分钟，镜检，照 相，每个rbES细胞系至少计数20个中期染色体标本，并分析至少5个Giemsa 染色带的核型。
实施例8.rbES细胞的基因改造
利用哺乳动物表达载体pQBI pgk(Takara，Japan)作为转基因载体。 pQBI pgk载体结构如图15所示，GFP-NEO融合蛋白的表达在小鼠pgk启 动子和腺病毒三联引导序列的联合控制下。
Qiagen-cleaned large scale质粒DNA以限制酶SalI处理而线性化，以等 体积酚/氯仿抽提一次，以等体积氯仿抽提两次。1/10体积3M NaAc(pH 5.2)和2.5倍体积100％乙醇沉淀DNA，70％乙醇洗涤数次，重悬于灭菌 PBS中，浓度1μg/μl。
以0.05％胰酶/1ml EDTA消化细胞，1.0-1.5×107个rbES细胞重悬于10 ml培养液中。PBS洗两次，重悬于800μl PBS中，加入100μg线性化的DNA， 放置于4mm Biorad基因脉冲管中，室温静置20分钟。利用Biorad GenePulser II电转化系统，250V电压和500μF电容电转化。电转化后，将 脉冲管于室温静置15分钟。细胞重悬于培养液中，涂板到铺有饲养细胞的6 cm培养皿中，铺板密度1×106个细胞/皿。
第二天更换培养液。电转化48小时后，加入350μg/ml的G418。每天换 液，持续7天。挑选出保持未分化形态的克隆，机械划成50个细胞左右的小 块，传到3.5cm的培养皿中。
实施例9.从核移植和孤雌囊胚中建立rbES细胞系
兔孤雌囊胚的构建
新西兰成年母兔颈部皮下注射PMSG 150 IU/只(天津市华孚高新生 物技术公司，中国)以进行超数排卵。96小时后耳缘静脉注射HCG 100 IU/ 只(Zhongbao Inc.Tianjin，China)。HCG注射后15h后以冲卵液冲出M II卵母细胞，冲卵液为hRD培养液(50％RMPI 1640，50％DMEM， (Gibco)，补充有10％胎牛血清(FCS，Hyclone，Uhta，USA)，10mM HEPES)。将冲出的团状物移入600μl含100IU/ml透明质酸酶的hRD中。 置CO2培养箱38℃消化10分钟后，将分散的卵母细胞和颗粒细胞复合体 移入hRD，洗涤7次(50μl HRD液滴)。在新的hRD液滴中，用内径和透 明带外径大小相等的玻璃管吹打复合体，直至颗粒细胞完全脱落。脱颗粒 的卵母细胞洗涤6次，细胞移入mRD(10％FCS，20mM谷氨酸，223μM 丙酮酸钠，1％非必需氨基酸)，38℃，5％CO2，100％湿度培养箱中待用。
为了去除第一极体，将卵母细胞移入含7.5μg/ml松胞菌素B(Sigma) 的hHRD中37℃培养10分钟，极体以外径15-22μM的去核针吸出。
将去除极体的卵母细胞移入融合液中，洗涤三次，然后移入融合槽内 的融合液中进行电击激活。电击参数如下：直流电3.0KV/cm，时长20μs， 三次脉冲，每次脉冲间隔一秒。电击仪为BTX 830，融合液(0.25M山梨 糖醇，0.1mM乙酸钙，0.5mM乙酸镁，1g/L BSA)。电击后将去除极体 的卵母细胞移入mRD中洗涤三次，置38℃，5％ CO2，100％湿度培养箱 中培养。1小时后作第二次电击。将去除极体的卵母细胞移入含5mg/mL CHX(环己酰亚胺)和2mM 6-DMAP(二甲氨基嘌呤)的mRD中培养 1小时，然后移入mRD培养液培养2小时，然后移入50ml添加2.5％FBS 的B2培养液微滴中，置38℃，5％CO2，100％湿度培养，观察胚胎的发 育。通常4天后收集囊胚。
使用上述技术，成熟的兔卵母细胞经化学激活，发育为囊胚，并成功 地从孤雌囊胚中分离出孤雌胚胎干细胞即pES细胞。
兔核移植囊胚的构建
单个供体细胞注射进去核卵母细胞的卵周隙。为进行电融合，将去核 卵母细胞-成纤维细胞复合体移入融合液中，洗涤三次，然后移入融合槽内 的融合液(0.3M山梨糖醇溶液，添加0.5mM醋酸镁，0.1mM醋酸钙， 10mM Hepes，1mg/ml BSA)中，用毛细玻璃针拨动重构复合体，使去 核卵母细胞与成纤维细胞的接触面与电流的方向垂直，然后进行电击，参 数如下：直流电3000V/cm，时长20μs，三次，每次间隔一秒。电击后将 重构复合体移入mRD中洗涤三次，置38℃，培养1.5小时。随后，进行 同样的电击诱导激活。重构胚移入含5mg/mL CHX和2mM 6-DMAP的 mRD中，38℃培养1小时。然后胚胎在mRD中培养过夜，第二天移入 代孕母体内。或者在50ml的含2.5％FBS的B2培养液的微滴中，置38 ℃，5％CO2，100％湿度培养箱内培养4-5天，形成囊胚，或在第二天转 移到假孕的母兔体内。
胚胎移植受体母兔晚于卵母细胞质供体兔24h左右耳静脉注射HCG 80IU/只诱导排卵。8-15个4-细胞或8-细胞的重构胚经由输卵管伞转移入 两侧的输卵管内。兔胎儿自然分娩或在第31天剖腹产。
使用上述核移植技术，来自核供体兔耳朵皮肤的成纤维细胞被重编 程，发育至囊胚阶段。而后从囊胚的内细胞团中成功分离出核移植胚胎干 细胞即ntES细胞。
结果
兔ntES细胞(图9)和兔pES细胞(图11)均能在体外长期增殖(ntES，10 代；pES，20代)并保持正常核型。这两种细胞系都表达高水平的碱性磷酸 酶和多能标志OCT4(图8和10)。通过分析印记基因的表达和微卫星基因 分析，证实了两种细胞的核移植和孤雌来源(图12和13)。
实施例10.利用rbES细胞作为核供体产生克隆兔
在小鼠核移植试验中，ES细胞已被用来作为核供体细胞克隆出了活体 小鼠。因为ES细胞本身就是多能性的，以ES细胞作为核供体能够提高克 隆效率(Wakayama et al.，1999；Rideout et al.，2000)。我们发现，像小鼠 ES细胞一样，rbES也能作为核供体细胞，产生活的克隆兔。与去核卵母 细胞融合后，rbES细胞核能支持胚胎发育至囊胚阶段。rbES来源的核移 植胚胎移植入代孕母体内，胚胎持续发育并进而产生活体克隆小兔(图 14)。分化和未分化的均已被成功地用作为核供体而产生活体克隆小兔。
表4.RT-PCR引物序列、退火温度和产物大小
基因 引物序列 退火温度 (℃) 产物大小 (bp) OCT4 EBAF2 FGF4 TDGF1 β肌动蛋白 F5′CATGAGCAGCAAGGGAAAAC 3′ R5′GGGCGATGAACCATACCG 3′ F5′AAGTGGGCCGAGAACTGG 3′ R5′TGCCGTCCTCCTTTATGC 3′ F5′CATGAGCAGCAAGGGAAAAC 3′ R5′GGGCGATGAACCATACCG 3′ F5′GACGCAACTGTGAACATGATG 3′ R5′GCCAGGTAGAAAGGTCTGAGG 3′ F5’CACACGGTGCCCATCTACG 3’ R5’GCCATCTCCTGCTCGAAGTC 3’ 57 55 56 59 58 231 178 134 126 203
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(a)收集囊胚期的兔胚胎；
(b)在无血清培养基中培养从囊胚中分离出来的内细胞团；
(c)从内细胞团的生长物中挑选出未分化的兔胚胎干细胞，传至新的 培养基中；
(d)在体外长期传代兔胚胎干细胞，并使之保持未分化状态。
用以培养兔胚胎干细胞的培养基含有血清替代物，既可商购，也可自 制。培养基中优选添加生长因子，例如bFGF。
不同的品系或株系的兔子均可用作分离兔胚胎干细胞的来源。胚胎或 囊胚可通过自然交配获得，也可通过体外受精获得。兔胚胎干细胞也可从 兔体细胞核移植产生的囊胚中分离培养而来，核移植胚胎能成功地发育至 囊胚(50％-80％2-细胞胚胎能发育至囊胚)，从而可用于获得核移植胚胎 干细胞(ntES)。因为ntES的遗传背景与体细胞核供体相同，所以当分化 的ntES移植回核供体内不会被排斥，因此，兔将成为很好的治疗性克隆 的动物模型。或者，兔囊胚也能通过孤雌激活卵母细胞产生，并从中分离 出孤雌胚胎干细胞(pES)。本培养体系为研究孤雌胚胎干细胞的潜在运用 提供了模型。
从囊胚中分离内细胞团可以采用机械剥离法，也可采用免疫外科手术 法。
饲养层细胞可以是1)任何类型的来自小鼠、兔和其他哺乳动物的体 细胞；2)任何类型的由小鼠、兔和其他哺乳动物胚胎干细胞分化而来的细 胞；或者3)任何永生化的哺乳动物细胞系。例如，饲养层细胞可以来自 受孕12-15天的小鼠胚胎。
另外，可以通过形态观察来选择未分化的兔胚胎干细胞。
另一方面，本发明提供了利用上述方法建立起来的兔胚胎干细胞系。
所述rbES细胞系能够表达多能性相关的分子标志Oct3/4，在免疫缺 陷动物体内能形成畸胎瘤。
所述rbES细胞系能在无血清培养基中长期增殖(大于3个月)，保持 正常的核型，维持未分化的多能状态。
优选地，可采用许多技术对rbES细胞系进行基因改造。通过转染， 感染或电转化的方法，可将编码期望的肽的DNA导入到rbES基因组中。 在特定的内源性或外源性启动子的控制下，rbES能表达这些肽。在大多 数情况下，使用这些方法导入的DNA分子随机整合到rbES的基因组中。 或者，利用同源重组技术，能够精确和可控地敲入、敲出或改造基因(例 如，基因增加、缺失或修饰)。
通过生殖系传递或核移植技术，可以从rbES获得活的兔个体。在一 种方法中，将rbES注射入囊胚腔中(Schoonjans et al.，1996)或者与四倍 体胚胎聚集(Nagy et al.，1990；Nagy et al.，1993)。在胚胎环境中，未分化 的rbES将参与到三个胚层各种组织的发育中。或者，用rbES作为核供体， 可以通过核移植技术获得活的个体(Wilmut et al.，1997；Edwards et al.， 2003)。
因此，本发明的目的之一是：用基因改造或未改造的rbES作为核供 体，通过核移植技术，获得兔胚胎、兔胎儿、新生兔和成体兔。
在一个实施方案中，上述核移植方法包括下列步骤：
(a)将rbES细胞与去核的兔卵母细胞融合，或将rbES细胞注射到 去核的兔卵母细胞中；
(b)使用电脉冲和/或化学物质激活核移植单元；
(c)将处于着床前任何阶段的核移植单元移植入代孕母兔或其他代孕 哺乳动物母体的生殖系统中；
(d)使植入的胚胎在体内发育。
其中，“着床前阶段”包括1-细胞、2-细胞、4-细胞、8-细胞桑椹和囊 胚阶段。
优选地，植入的胚胎在体内进一步发育成兔胎儿、新生兔或成体兔。
在一个实施方案中，上述核移植方法可以产生带有特定基因突变的活 体兔，突变可以通过导致DNA序列改变的一个或几个碱基插入、缺失或 天然突变获得。
这就是说，可以将rbES技术同基因改造技术和核移植技术相结合， 构建能够产生具有特定基因型和表型的转基因兔的技术平台。例如，使用 特定的rbES细胞系作为核供体，通过核移植克隆可以产生具有相同遗传 背景的兔克隆群。这些兔品系与其同类系相似，可被广泛地用作为实验动 物。另外，用经过基因改造的rbES作为核供体，可以产生具有新基因型 的转基因兔，这种转基因兔可以在乳汁、血液或身体的其他部分产生所期 望的肽。例如，可以产生在乳汁中含溶酶体酸性α-葡萄糖苷酶(lysosomal acidα-glucosidase)(GAA)的兔基因型，这种乳汁可用作为饮食增补物治疗 遗传性的GAA缺陷患者。可以产生在乳汁或身体其他部分可以分泌生长 因子、酶或生物活性肽的特定兔基因型。可以操纵编码免疫球蛋白的兔基 因，使其产生人源化抗体。也可改造编码兔皮毛成分的基因，从而改变兔 毛的颜色、密度和直径等。
又在另一方面，本发明提供了通过上述核移植方法产生的兔突变体。 优选地，所述兔携带的突变或者引起免疫缺陷，或者诱导模拟人类疾病的 症状，或者影响或改变特定兔组织或器官的生物学特征.，从而使得所述组 织或器官表现出新的生物学特征。或者，在所述兔中，编码免疫球蛋白的 基因的DNA序列中带有变化，编码兔毛皮成分的基因的DNA序列中带有 突变，或者编码参与代谢过程的肽的基因的DNA序列中带有突变。
又在另一方面，本发明提供了利用上述转兔突变体来获得具有商业价 值的生物产品的方法。这种生物产品可以是治疗人类疾病的分子，包括但 不限于人源化抗体。本发明还涉及兔突变体在遗传、发育、生物学、药学 和医学研究中作为实验动物模型的用途，或其在药物研究、筛选、研发和 毒理测试、以及组织工程中的用途。
一旦改变rbES细胞的基因组，这种经遗传修饰的rbES就可以作为核 供体用以产生带有特定期望特征的活兔。使用这种方法，就可以产生许多 不同的兔突变体，类似于多种转基因小鼠的产生(Torres M.，1998)。可以优 先考虑创建携带参与肺和心血管疾病形成的基因突变的兔，以推进对这些 系统的研究。携带参与代谢路径的修饰基因的兔对药物筛选和毒理测试具 有重要作用。
通过干细胞技术创建兔品系将利于干细胞研究、组织工程和器官移 植。具有同源遗传背景的兔系之间的细胞或组织移植不会引起排斥反应。 突变对免疫系统功能至关重要的基因可以产生免疫缺陷的兔。而免疫缺陷 兔可以提供干细胞(比如人胚胎干细胞)在体内的行为的重要信息。通过 将人类细胞移植进入免疫缺陷兔体内，产生稳定的人兔细胞嵌合体，可以 促进药物筛选和毒理测试。如前所述，rbES同样可以从孤雌或核移植所产 生的囊胚中分离出来(Kaufman et al.，1983；Cibelli et al.，2002；Wakayama et al.，2001；Hwang et al.，2004)。这种rbES细胞及他们的亲本兔(为pES 提供卵母细胞的母兔，以及为核移植干细胞ntES提供核供体细胞的兔) 可用以研究pES和ntES在体内的行为。
所以，本发明的一个目的是通过将rbES注射入着床前的不同发育阶 段的兔胚胎中，产生嵌合体兔。这种rbES可以来自常观的兔胚胎/囊胚、 孤雌囊胚或核移植囊胚，并且可以经过基因改造或未改造。
本发明的实用性
本发明利用无血清培养体系建立的rbES细胞系能够以未分化的状态 在体外长期传代(大于100代)，并保持稳定核型。分子分析表明rbES细 胞具有许多与hES细胞相似的特性，即他们表达ES细胞典型的多能性分 子标志，还有在未分化ES细胞中高表达的分子。这些细胞在体外在成分 明确的培养条件下生长增殖，并且在体外和体内能分化成许多细胞类型。 rbES细胞具有分化为所有三个胚层的细胞和组织的潜能。
rbES表现出高克隆形成率，便于进行遗传操作。通过不同的方法，可 以对rbES进行一系列的基因改造，比如同源重组。基因改造或未改造的 rbES细胞可以作为核供体产生活的兔个体。干细胞技术、基因改造技术和 动物克隆技术相结合，将形成一个技术平台，有效地生产新的兔品系。这 些新品系的兔将为医学、生物学、药学研究提供独特的实验系统。这些新 品系兔也将产生具有经济价值的产品。
附图的简短说明
图1：rbES细胞的形态图
A.囊胚阶段的受精胚胎。B、C和D.来自rbES1、QZL2和LHR2 的rbES。在无血清培养基中，rbES细胞在辐照的小鼠饲养层上形成扁平 单层的克隆，大多数克隆有明显的边界，细胞核质比高，核仁明显。加入 血清促使rbES在凝胶包被的培养皿中贴壁和生长，但是rbES将很快分化 (E和F)。
图2：rbES细胞系长期培养后保持正常核型(rbES传代80次的核型 分析)。G带染色显示了雌性rbES细胞系的正常核型：44，XX。
图3A：兔Oct-4、TDGF1、FGF4和EBAF2基因的部分cDNA序列。 图3B：rbES表达多能分子标志及ES细胞中所富含的分子。rbES细胞系 稳定地表达Oct-4、EBAF2、FGF4和TDGF1(分别是泳道1、3、5、7)。 在逆转录步骤中未加入逆转录酶的样品作为基因组DNA污染的对照(分别 是泳道2、4、6、8和10)。β-肌动蛋白(泳道9)用作为体系内参。
图4：rbES细胞表达的标志的细胞化学和免疫组化分析。人ES细胞 (hES35a)表达抗SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81的抗体所识 别的标志，但不表达SSEA-1。小鼠ES(mES)只表达SSEA-1。相反，rbES 细胞(qzlES2)不表达这5种抗体所识别的分子。rbES表达OCT-4和高 水平的碱性磷酸酶活性。
图5：rbES分化形成的细胞和组织类型。A.由rbES细胞形成的类胚 体(EB)；B.由EB贴壁后向外长出的细胞中含有具典型神经细胞形态的 细胞，这些细胞的β-微管蛋白抗体免疫染色呈阳性；C.有些EB切片含有 肠状结构，α-胎蛋白抗体免疫染色呈阳性；D.其他EB切片CD31免疫染 色呈阳性，CD31是上皮细胞的标志，能够对血管样结构进行染色。
图6：rbES细胞形成的畸胎瘤的组织学分析。畸胎瘤含有多种分化组 织：A.角化复层扁平上皮(外胚层)；B.毛囊(外胚层)；C.肠上皮(内 胚层)；D.假复层纤毛柱状上皮(内胚层)；E.肌肉(中胚层)
图7：表达绿色荧光蛋白GFP的rbES细胞亚系(rES1-GFP2)。A和 B.稳定表达GFP的rbES细胞集落；C和D.从表达GFP的类胚体中中 长出的ES细胞。E和F.在分化后有些分化的细胞依然是GFP阳性。左 列(A、C和E)为荧光显微照片；右列(B、D和F)分别为同一视野的放大 照片。
图8：兔ntES表达的标志(免疫细胞化学染色)。兔ntES细胞不表 达SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81。兔ntES细胞表 达OCT-4和高水平的碱性磷酸酶。
图9：兔ntES细胞正常核型。G带染色显示了雄性兔ntES细胞系(第 9代)的正常核型：44，XY。
图10：pES细胞学和免疫组化染色。兔pES细胞不表达SSEA-1， SSEA-3，SSEA-4，TRA-1-60，TRA-1-81.兔ntES细胞表达OCT-4和高水 平的碱性磷酸酶。
图11：兔pES细胞的正常核型。G带染色显示了雌性pES细胞系(第 20代)的正常核型，44，XX。
图12：正常兔ES细胞(rbES)、兔ntES细胞和兔pES细胞中印迹基 因表达的RT-PCR分析。
A.正常rbES和pES细胞中H19和SNRPN的表达。pESB1，兔孤雌 胚胎干细胞B1；pESC1，兔孤雌胚胎干细胞C1；pratbitB，pESB1卵细 胞供体兔；prabbitC，pESC1卵细胞供体兔；MW表示DNA分子量标志 泳道；(-)，无逆转录酶的阴性RT对照。
B.兔ntES细胞中H19和SNRPN基因的表达。ntESA1，兔核移植胚胎 干细胞A1；ntrabbitA，ntESA1核供体兔；MW，分子量标志；(-)，无逆转 录酶的阴性RT对照。
图13：rbES，兔ntES和兔pES细胞的微卫星标志分析。
A为5L1C3基因座(位于5号染色体)的STR分析；
B为19L1A4基因座(位于19号染色体)的STR分析；
C为6L1F10基因座(位于6号染色体)的STR分析；
D为OCELAMB基因座(位于内皮细胞白细胞粘附分子1基因上)的 STR分析。
框内数字和相应的峰代表每一STR标志的PCR产物大小(bp)和多态性 的位置。5个电泳图代表5个DNA样品的分析：pESB1供体兔(1)、PESB1(2)、 ntESA1供体兔(3)、ntrESA1(4)以及作为对照的无关供体兔(5)。
图14：rbES细胞核移植到去核卵母细胞中所产生的活体小兔。实验表 明rbES细胞核在核移植实验中能支持胚胎发育至囊胚阶段。
图15：哺乳动物表达载体pQBI pgk的图谱。
pQBI pgk为在转化的哺乳动物细胞中表达GFP的表达载体，该载体 GFP-neo构建体的氨基端含GFP，以确保细胞既抗G418，又表达GFP。小 鼠pgk启动子和腺病毒的三联引导序列结合确保其在多种细胞类型尤其 是在ES细胞中长期稳定地表达。该载体的设计使得缺乏polyA信号序列的 表达盒易于切除和亚克隆。
实施例
以下将结合实施例和附图进一步阐述本发明，这些实施例绝不应当解 释为对本发明的限制。
实施例1.rbES细胞培养
在本实施例中，我们利用基本相同的分离和培养方法，从三个亚种(新 西兰，安哥拉，青紫兰)的兔囊胚中分离胚胎干细胞，其中，从新西兰白兔 获得一个细胞系，从安哥拉兔获得一个细胞系，从青紫兰兔获得三个细胞 系(图1和表1)。从三种不同的兔亚种中成功地对兔胚胎干细胞进行了建系 的结果表明本方法可同样地适用于其他兔亚种。
新西兰，安哥拉，青紫兰兔分别购自上海实验动物中心、北京市药品 检验所和南京金陵种兔场。自然交配4天后，用PBS将囊胚从子宫中冲出， 机械法或者免疫外科法(Davor et al.，1975)分离出内细胞团，接种到经55Cy γ射线照射的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层上。基本培养液含78％ DMEM/F-12，2mM L-谷氨酸，1％非必需氨基酸，0.1mM β-巯基乙醇， 20％KnockOut血清替代物(Invitrogen，Carlsbad，CA)，添加或不添加4-8 ng/ml人重组bFGF。
3-5天左右，内细胞团生长形成集落。最初长出的内细胞团通常含有异 类的细胞类型。6-8天后，机械法挑选出具有典型ES细胞形态(图1)的细胞 传代至新培养板中。
如图1所示，在无血清培养基中，rbES细胞在饲养细胞上形成扁平单 层的克隆。5个细胞系的群体倍增时间分别在大约12-16小时(表1)。细 胞核大，核质比高，这些特点与hES细胞相似。与hES细胞相比，核仁 小而不明显。大多数集落有明显的边界。在培养皿中，能观察到单个的rbES 细胞和小的新细胞集落的生长。rbES细胞早期采用机械法传代，1-2个月 后，使用胰酶消化的方法传代。即，用0.05％的胰酶消化细胞后，辅以轻 轻的吹打，使细胞成为小团块。NZ-1细胞系已使用胰酶消化的方法传代1 年以上，迄今仍保持正常核型(图2)。
所有rbES细胞系均在不合LIF的培养液中建立。因此，rbES细胞 多能性的维持不依赖于外源性的LIF。虽然rbES细胞系最初是在含bFGF 的培养液中建立的，但在随后的实验中很快就发现，在不添加外源性 bFGF的培养液中，rbES细胞也能很好的增殖并保持未分化状态。在含4 ng/ml bFGF的培养液中，rbES细胞群体倍增(PD)时间为15h，而在不 合bFGF的培养液中，rbES细胞群体倍增时间为20h(数据未显示)。所以， bFGF能够增加rbES细胞的增殖速度。也许rbES细胞依赖于内源性的 bFGF维持未分化状态的存活和增殖，这需要进一步的实验来加以证实。 在无血清培养基中，rbES已持续传代1年以上，仍保持未分化状态。在无 血清培养基中，rbES的生长似乎依赖于饲养层细胞。当传至无饲养层细胞 的凝胶包被的培养皿中时，rbES不能贴壁。在培养液中加入血清能促使 细胞贴壁和生长，但很快就会分化(图1，数据未显示)。血清中促使细胞 分化的因子仍未知。
表1.由三个兔亚种建立的rbES细胞系
亚种 囊胚数目 rbES细胞系数目 群体倍增时间(小时) 新西兰兔 5 1(rES1) 12 青紫蓝兔 7 3(qzl1，qzl2 qzl3) 15 安哥拉兔 7 2(LHR1，LHR2) 16
实施例2.rbES细胞表达的分子标志
RT-PCR
用Trizol(Invitrogen，Carlsbad，CA)提取总RNA，以DNase I于37℃ 处理20分钟以去除污染的基因组DNA。根据厂家提供的方法，使用莫洛尼 鼠白血病病毒逆转录酶(Promega，Madison，WI)和随机引物(Promega)进 行第一链的合成。引物序列如表4所示。使用下列参数进行PCR反应：94℃ 变性4分钟，随后35个扩增循环，包括94℃变性30秒，退火30秒，72℃延 伸40秒，之后在72℃进行5分钟终延伸。退火温度见表4。在逆转录步骤中 不加逆转录酶的样品用作为基因组DNA污染的对照。β-肌动蛋白用作为体 系内参。
结果
Oct-4是所有胚胎干细胞的多能性标志。TDGF1、FGF4和EBAF2在 ES细胞中高表达，而当ES分化时其表达下调。我们对兔Oct-4、TDGF1、 FGF4和EBAF2基因的部分序列进行了扩增、克隆和测序。结果示于图 3A之中。
rbES细胞表达Oct-4(图3B)。值得注意的是，在我们的培养体系中， rbES细胞能长期增殖(≥2year)，其能够保持未分化状态，并且表达Oct-4、 TDGF1、FGF4及EBAF2。
免疫组化
为了分析rbES细胞的标志物表达情况，将rbES细胞克隆在4％PFA (多聚甲醛)中室温固定15分钟。细胞以TBS-T缓冲液(20mM Tris-HCl， pH 7.4，0.15M NaCl，0.05％Tween-20)洗两遍，5-10分钟/次。0.1％Triton X-100/PBS室温处理细胞10分钟。再以TBS-T缓冲液洗两遍，5-10分钟 /次，然后以3％BSA/PBS(封闭液)孵育1h。表征rbES细胞所使用的 一抗为购自Chemicon(Temecula，CA)的anti-SSEA-1、anti-SSEA-3、 anti-SSEA-4、anti-TRA-1-60和anti-TRA-1-81以及购自Santa Cruz Biotechnology的(Santa Cruz，CA)anti-OCT-4。所有抗体以PBS稀释， 并与样品于4℃孵育过夜。次日，以TBS-T缓冲液洗三遍，5-10分钟/次。 加二抗，室温孵育1小时。所用的二抗为FITC缀合的驴抗山羊IgG、FITC 缀合的山羊抗小鼠IgG+IgM、FITC缀合的驴抗小鼠IgG和FITC缀合的 山羊抗大鼠IgG+IgM(Jackson Laboratories，West Grove，PA)。激光共聚 焦显微镜(Olympus)观察并拍照记录。为了检测碱性磷酸酶活性，将rbES 细胞以4％PFA室温固定10分钟，以缓冲液III(100mM Tris-HCl，100mM NaCl，50mM MgCl2，pH9.5)冲洗10分钟，与NBT/BCIP(缓冲液III 1∶100 稀释)室温暗反应15-30分钟。充分显色后终止反应，PBS洗一遍，观察并 拍照记录。
为了检测分化的rbES细胞的标志物表达，类胚体(EBs)悬浮培养20 天后，收集，制备冷冻切片。或者，EBs悬浮培养4-7后，转移到塑料载片 上贴壁培养。再继续培养7天，使分化细胞由EBs向外长出。载片上的细胞 4％PFA室温固定10-15分钟。加一抗4℃过夜进行抗体染色。所用的一抗为： 外胚层分子标志：β-微管蛋白III(1∶400，Sigma)、NSE(1∶5，DAKO)和波形 蛋白(1∶50，DAKO)；中胚层分子标志：anti-CD31(1∶100，DAKO)， anti-MHC(1∶100，Santa Cruz)和anti-结蛋白(1∶100，Santa Cruz)；内胚层 分子标志：anti-AFP(1∶500，Biogenex)，anti-白蛋白(1∶1000，DAKO)和 anti-c-met(1∶100，Santa Cruz)。样品与HRP缀合的二抗(1∶100，Jackson) 37℃孵育1小时。显色后，以溶于PBS之中的50％甘油封片，以配备有Spot digital camera(斑点数码相机)和软件的Olympus显微镜进行镜检分析。
结果
已知不同物种来源的ES细胞与抗SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60 和TRA-1-81的抗体的反应不同。例如，hES表达能被抗SSEA-3、SSEA-4、 TRA-1-60和TRA-1-81的抗体所识别的抗原，但不表达能被抗SSEA-1的抗 体所识别的抗原。小鼠ES细胞只表达这五种标志中的一种，即SSEA-1。 相反，rbES不表达能被这五种抗体识别的分子(图4)。尚无法确定是rbES 根本不表达类似于这些表面抗原的标志，还是rbES表达类似抗原，但不与 这些抗体交叉反应。如图4所示，rbES表达高水平的碱性磷酸酶。
实施例3.细胞克隆及群体倍增时间的计算
我们研究了三种rbES细胞系的克隆形成率。以0.05％胰蛋白酶将细 胞集落消化成单细胞。每个细胞系接种1000个细胞到培养皿中。5天后， 计算集落数量，克隆形成率以下列公式计算：克隆形成率(％)＝(克隆数 /1,000)×100％。如表2所示，三种rbES细胞系rbES1、Qzl2和LHR1 的克隆形成率分别为0.15±0.01％、0.18±0.04％和0.13+0.03％。rbES细胞 的克隆生长将会有利于遗传操作过程中rbES细胞的筛选。
表2.rbES细胞的克隆形成率
细胞系 克隆形成率(％) rbES1 0.15±0.01 Qzl2 0.18±0.04 LHR1 0.13±0.03
以记号笔在培养皿的底部标记小的(大约10个细胞左右)细胞集落， 每隔24小时照相，计算集落内的细胞数量(N)，以确定群体倍增(PD) 时间。PD时间值根据下列公式计算：PD(小时)＝时间总长/Log2(N2/N1)。 每株细胞至少计算三个PD值，然后求平均值。
在4ng/ml bFGF培养液中，5个1.bES细胞系的群体倍增时间为12至16 小时，如表1所示。而在不合bFGF培养液中，rbES细胞群体倍增时间为20 小时(数据未显示)。这表明，bFGF浓度升高能够促进rbES细胞增殖。
实施例4.体外分化
通过类胚体途径，rbES细胞能够在体外分化。以1mg/ml IV型胶原酶 37℃消化rbES细胞3-5分钟，轻轻吹打成小的细胞团，悬浮培养4-8天，培 养基包括如下成分：78％DMEM，20％FBS，2mM L-谷氨酸，1％非必需氨 基酸和0.1mM β-巯基乙醇。每两天换一次培养液。
rbES细胞在无饲养细胞、含血清的培养条件下悬浮培养，可迅速形成 外表光滑的EB(图5A)。EB经过贴壁培养后，可生长出许多形态各异的分 化细胞。免疫组化染色表明，分化的rbES细胞表达所有三个胚层的分子 标志(表3)。由EB贴壁生长出的细胞中有具典型神经细胞形态的细胞，这 种细胞呈神经丝H(神经组织相关标志，外胚层)阳性(图5B)。有些EB的 切片含有肠样结构，免疫组化染色显示呈α-胎蛋白阳性(图5C)。在其它EB 切片中可见血管状结构的周围有部分细胞呈CD31(血管内皮细胞相关标 志，中胚层)阳性。
表3.rbES细胞、兔ntES和兔pES细胞所表达的分化标志
外胚层 中胚层 内胚层 β-微管蛋白III NSE 波形蛋白 MHC 结蛋白 CD31 AFP 白蛋白 c-met 兔ES ++ ++ ++ ++ + + ++ ++ + 兔nrES ++ ++ ++ ++ + + ++ ++ + 兔pES ++ ++ ++ ++ + + ++ ++ +
实施例5.体内分化
为了检测rbES的体内分化潜能，将大约2-5×106形态上未分化的3种 rbES细胞注射进NOD-SCID小鼠后腿肌肉中(4周龄，购自中科院上海实验 动物中心)。10-12周后，所有3种rbES细胞系均形成实体畸胎瘤。
在肿瘤形成的8-10周内，对畸胎瘤取材进行切片，4％多聚甲醛固定， 苏木精和曙红染色后进行组织学分析。实体畸胎瘤含有丰富的组织类型， 如图6所示，这些畸胎瘤包含有来自三个胚层的组织，包括：角化复层扁平 鳞状上皮和毛囊(外胚层)；肌肉(中胚层)；以及肠上皮和假复层纤毛 柱状上皮(内胚层)。
从而，体内和体外实验都证实，在本发明的无血清培养体系中建立起 来的rbES细胞系具有发育的多能性，能发育成所有三个胚层的多种组织。
实施例6.遗传操作
将由CMV启动子驱动的含GFP基因的载体电转化到rbES细胞中。 新霉素抗性筛选得到数百个表达GFP基因的克隆。从中建立7个GFP+的 rbES细胞亚系，他们在体外保持未分化的增殖，并持续表达GFP(图7)。
实施例7.核型分析
将处于指数生长期的rbES细胞，加入200ng/ml终浓度的秋水仙素于 5％ CO2中于37℃孵育1.5-2小时。0.05％胰酶消化成单细胞，1,200rpm离 心5分钟(eppendorf centrifuge，5810R)，加入10ml 37℃预热的低渗液 (KCl 0.56g/100ml水+柠檬酸钠0.5g/100ml水)，37℃孵育30分钟。逐滴加 入2ml固定液(乙酸∶甲醇＝1∶3)于低渗液中，室温预固定5分钟。1,200rpm 离心5分钟。重悬于10ml固定液中，室温固定10分钟。再重复离心固定步 骤2-3次。最后一次固定后，离心，剩余适量固定液，重悬细胞，将细胞滴 加到-20℃预冷的载玻片上。室温老化2天后，65℃老化4小时。0.1％胰酶 (溶于0.8％的NaCl中)37℃消化5分钟，1％Giemsa染色15分钟，镜检，照 相，每个rbES细胞系至少计数20个中期染色体标本，并分析至少5个Giemsa 染色带的核型。
实施例8.rbES细胞的基因改造
利用哺乳动物表达载体pQBI pgk(Takara，Japan)作为转基因载体。 pQBI pgk载体结构如图15所示，GFP-NEO融合蛋白的表达在小鼠pgk启 动子和腺病毒三联引导序列的联合控制下。
Qiagen-cleaned large scale质粒DNA以限制酶SalI处理而线性化，以等 体积酚/氯仿抽提一次，以等体积氯仿抽提两次。1/10体积3M NaAc(pH 5.2)和2.5倍体积100％乙醇沉淀DNA，70％乙醇洗涤数次，重悬于灭菌 PBS中，浓度1μg/μl。
以0.05％胰酶/1ml EDTA消化细胞，1.0-1.5×107个rbES细胞重悬于10 ml培养液中。PBS洗两次，重悬于800μl PBS中，加入100μg线性化的DNA， 放置于4mm Biorad基因脉冲管中，室温静置20分钟。利用Biorad GenePulser II电转化系统，250V电压和500μF电容电转化。电转化后，将 脉冲管于室温静置15分钟。细胞重悬于培养液中，涂板到铺有饲养细胞的6 cm培养皿中，铺板密度1×106个细胞/皿。
第二天更换培养液。电转化48小时后，加入350μg/ml的G418。每天换 液，持续7天。挑选出保持未分化形态的克隆，机械划成50个细胞左右的小 块，传到3.5cm的培养皿中。
实施例9.从核移植和孤雌囊胚中建立rbES细胞系
兔孤雌囊胚的构建
新西兰成年母兔颈部皮下注射PMSG 150 IU/只(天津市华孚高新生 物技术公司，中国)以进行超数排卵。96小时后耳缘静脉注射HCG 100 IU/ 只(Zhongbao Inc.Tianjin，China)。HCG注射后15h后以冲卵液冲出M II卵母细胞，冲卵液为hRD培养液(50％RMPI 1640，50％DMEM， (Gibco)，补充有10％胎牛血清(FCS，Hyclone，Uhta，USA)，10mM HEPES)。将冲出的团状物移入600μl含100IU/ml透明质酸酶的hRD中。 置CO2培养箱38℃消化10分钟后，将分散的卵母细胞和颗粒细胞复合体 移入hRD，洗涤7次(50μl HRD液滴)。在新的hRD液滴中，用内径和透 明带外径大小相等的玻璃管吹打复合体，直至颗粒细胞完全脱落。脱颗粒 的卵母细胞洗涤6次，细胞移入mRD(10％FCS，20mM谷氨酸，223μM 丙酮酸钠，1％非必需氨基酸)，38℃，5％CO2，100％湿度培养箱中待用。
为了去除第一极体，将卵母细胞移入含7.5μg/ml松胞菌素B(Sigma) 的hHRD中37℃培养10分钟，极体以外径15-22μM的去核针吸出。
将去除极体的卵母细胞移入融合液中，洗涤三次，然后移入融合槽内 的融合液中进行电击激活。电击参数如下：直流电3.0KV/cm，时长20μs， 三次脉冲，每次脉冲间隔一秒。电击仪为BTX 830，融合液(0.25M山梨 糖醇，0.1mM乙酸钙，0.5mM乙酸镁，1g/L BSA)。电击后将去除极体 的卵母细胞移入mRD中洗涤三次，置38℃，5％ CO2，100％湿度培养箱 中培养。1小时后作第二次电击。将去除极体的卵母细胞移入含5mg/mL CHX(环己酰亚胺)和2mM 6-DMAP(二甲氨基嘌呤)的mRD中培养 1小时，然后移入mRD培养液培养2小时，然后移入50ml添加2.5％FBS 的B2培养液微滴中，置38℃，5％CO2，100％湿度培养，观察胚胎的发 育。通常4天后收集囊胚。
使用上述技术，成熟的兔卵母细胞经化学激活，发育为囊胚，并成功 地从孤雌囊胚中分离出孤雌胚胎干细胞即pES细胞。
兔核移植囊胚的构建
单个供体细胞注射进去核卵母细胞的卵周隙。为进行电融合，将去核 卵母细胞-成纤维细胞复合体移入融合液中，洗涤三次，然后移入融合槽内 的融合液(0.3M山梨糖醇溶液，添加0.5mM醋酸镁，0.1mM醋酸钙， 10mM Hepes，1mg/ml BSA)中，用毛细玻璃针拨动重构复合体，使去 核卵母细胞与成纤维细胞的接触面与电流的方向垂直，然后进行电击，参 数如下：直流电3000V/cm，时长20μs，三次，每次间隔一秒。电击后将 重构复合体移入mRD中洗涤三次，置38℃，培养1.5小时。随后，进行 同样的电击诱导激活。重构胚移入含5mg/mL CHX和2mM 6-DMAP的 mRD中，38℃培养1小时。然后胚胎在mRD中培养过夜，第二天移入 代孕母体内。或者在50ml的含2.5％FBS的B2培养液的微滴中，置38 ℃，5％CO2，100％湿度培养箱内培养4-5天，形成囊胚，或在第二天转 移到假孕的母兔体内。
胚胎移植受体母兔晚于卵母细胞质供体兔24h左右耳静脉注射HCG 80IU/只诱导排卵。8-15个4-细胞或8-细胞的重构胚经由输卵管伞转移入 两侧的输卵管内。兔胎儿自然分娩或在第31天剖腹产。
使用上述核移植技术，来自核供体兔耳朵皮肤的成纤维细胞被重编 程，发育至囊胚阶段。而后从囊胚的内细胞团中成功分离出核移植胚胎干 细胞即ntES细胞。
结果
兔ntES细胞(图9)和兔pES细胞(图11)均能在体外长期增殖(ntES，10 代；pES，20代)并保持正常核型。这两种细胞系都表达高水平的碱性磷酸 酶和多能标志OCT4(图8和10)。通过分析印记基因的表达和微卫星基因 分析，证实了两种细胞的核移植和孤雌来源(图12和13)。
实施例10.利用rbES细胞作为核供体产生克隆兔
在小鼠核移植试验中，ES细胞已被用来作为核供体细胞克隆出了活体 小鼠。因为ES细胞本身就是多能性的，以ES细胞作为核供体能够提高克 隆效率(Wakayama et al.，1999；Rideout et al.，2000)。我们发现，像小鼠 ES细胞一样，rbES也能作为核供体细胞，产生活的克隆兔。与去核卵母 细胞融合后，rbES细胞核能支持胚胎发育至囊胚阶段。rbES来源的核移 植胚胎移植入代孕母体内，胚胎持续发育并进而产生活体克隆小兔(图 14)。分化和未分化的均已被成功地用作为核供体而产生活体克隆小兔。
表4.RT-PCR引物序列、退火温度和产物大小
基因 引物序列 退火温度 (℃) 产物大小 (bp) OCT4 EBAF2 FGF4 TDGF1 β肌动蛋白 F5′CATGAGCAGCAAGGGAAAAC 3′ R5′GGGCGATGAACCATACCG 3′ F5′AAGTGGGCCGAGAACTGG 3′ R5′TGCCGTCCTCCTTTATGC 3′ F5′CATGAGCAGCAAGGGAAAAC 3′ R5′GGGCGATGAACCATACCG 3′ F5′GACGCAACTGTGAACATGATG 3′ R5′GCCAGGTAGAAAGGTCTGAGG 3′ F5’CACACGGTGCCCATCTACG 3’ R5’GCCATCTCCTGCTCGAAGTC 3’ 57 55 56 59 58 231 178 134 126 203
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