一种用于新生儿葡萄糖六磷酸脱氢酶缺乏症筛查的试剂盒及其制备方法
专利汇可以提供一种用于新生儿葡萄糖六磷酸脱氢酶缺乏症筛查的试剂盒及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种用于新生儿 葡萄糖 六 磷酸 脱氢酶缺乏症筛查的 试剂 盒 及其制备方法。本发明所述用于新生儿葡萄糖六磷酸脱氢酶缺乏症筛查的试剂盒由底物试剂干粉、底物复溶试剂、 铜 试剂、反应板以及 滤纸 干血片质控品组成。本发明所述试剂盒的检测结果准确性和灵敏度高， 稳定性 好，兼具经济、简便、高效等优点，应用于新生儿筛查工作中时，有利于提高杂合子的检出率，增加判断的准确性。，下面是一种用于新生儿葡萄糖六磷酸脱氢酶缺乏症筛查的试剂盒及其制备方法专利的具体信息内容。
1.一种用于新生儿葡萄糖六磷酸脱氢酶缺乏症筛查的试剂盒，其特征在于包括如下组分：
（1）16ml/瓶的G6P底物试剂干粉；
（2）16ml/瓶的6PG底物试剂干粉；
（3）35ml/瓶的铜试剂：用硫酸铜、酒石酸钾钠及碳酸钠制成；
（4）G6PD滤纸干血片质控品，C1 阳性，C2 阴性；
（5）35ml/瓶的底物复溶试剂：用MgCl2、双甘氨酸及Tris-Hcl制成；
（6）微孔白色反应板。
2.权利要求1所述用于新生儿葡萄糖六磷酸脱氢酶缺乏症筛查的试剂盒的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）制备G6P和6PG两种底物试剂干粉、底物复溶试剂、铜试剂；
（2）制备滤纸干血片质控品；
（3）分装上述底物试剂干粉、底物复溶试剂、铜试剂；
（4）贴标签；
（5）组装为成品试剂盒；
步骤（1）中，G6P底物试剂的制备是将1.2g的G6P加纯化水，充分搅拌溶解，待完全溶解后，加入1.6 g 的NADP·Na2，补足纯化水至100ml，混匀；6PG底物试剂的制备是将1.5 g的6PG加纯化水，充分搅拌溶解，待完全溶解后，加入1.6 g 的NADP·Na2，补足纯化水至
100ml，混匀；底物复溶试剂的制备是将0.2 g Tris和 5.4 g NaCl加纯化水，充分搅拌溶解，待完全溶解后，加入1.8 g MgCl2和2.5 g 双甘氨酸，补足纯化水至100ml，混匀；铜试剂溶液的制备是分别将0.03gCuSO4·5H2O、0.05gNa2CO3 和0.03g酒石酸钾钠加入到装有纯化水的容器中，待完全溶解后，补足纯化水至100ml，混匀；
步骤（2）中，所述滤纸干血片质控品的制备方法如下：将枸橼酸抗凝绵羊全血用低速离心机3000rmp，离心 10~15min分离出血浆和红细胞。
3.按红细胞∶血浆=1.1∶1.0调整红细胞压积；分别加入G6PD和6PGD纯品原料，使C1全血中G6PD/6PGD＜1.0，C2全血中G6PD/6PGD＞1.0；将C1、C2分别放在磁力搅拌器上不断搅拌，充分混匀；将裁好的 903#滤纸悬挂在架子上，用移液器将质控品滴加到滤纸片上。
4.取液量为50ul/血斑，对准中心滴下，室温阴干3~4小时，不可重叠摆放，阴干后装入贮存袋，袋内放干燥剂，放入2~8℃冰箱保存备用；
步骤（3）中将步骤（2）中配制好的G6P底物试剂、6GP底物试剂、底物复溶试剂、铜试剂进行分装，将分装好的G6P底物试剂、6GP底物试剂利用冻干机制成冻干粉。
5.权利要求1所述用于新生儿葡萄糖六磷酸脱氢酶缺乏症筛查的试剂盒的使用方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）试剂准备：G6P底物试剂干粉，6PG底物试剂干粉分别加16ml底物复溶试剂，混匀，静置20分钟；
（2）检验操作：
（a）加样：用打孔钳从样品滤纸干血片中打下下直径为 3mm或1/8 英寸的样本两份，打下纸片须被血液浸透，并依次分别加入G6PD和6PGD测试的空白微孔中，每孔一片，一一对应；
（b）加入底物：向检测G6PD荧光值的微孔中加入复溶好的G6P底物试剂150µl；向检测
6PGD荧光值的微孔中加入复溶好的6PG底物试剂150µl并加贴封片；
（c）孵育：在室温下，缓慢振荡30分钟；
（d）加入铜试剂：孵育完成后，立即加入150µl/孔冷的铜试剂工作液，混匀；
（e）检测：使用对应的程序进行检测，检测工作在15分钟内完成，激发波长355nm， 发射波长460nm；
（f）结果分析：将检测得到的G6PD的荧光值（S1）与6PGD的荧光值（S2），计算S1/S2的值，当S1/S2≤1.0时，结果判断为阳性，当S1/S2＞1.0时，结果判断为阴性。
6.权利要求1所述用于新生儿葡萄糖六磷酸脱氢酶缺乏症筛查的试剂盒的结果判断方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）检测：将加完铜试剂的微孔反应板使用对应的程序进行检测，检测工作在15分钟内完成，激发波长355nm，发射波长460nm；
（2）结果分析：将检测得到的G6PD的荧光值（S1）与6PGD的荧光值（S2），计算S1/S2的值，当S1/S2≤1.0时，结果判断为阳性，当S1/S2＞1.0时，结果判断为阴性。
一种用于新生儿葡萄糖六磷酸脱氢酶缺乏症筛查的试剂盒
及其制备方法
技术领域
背景技术
酶缺乏症（Glucose-6-phosphate dehydrogenase G6PD）是几乎所有高、低等生物重要看家
酶之一，分子量为59kDa，其活性形式由2个或4个亚单位组成，每个亚单位含515个氨基
酸。该酶催化细胞能量代谢过程磷酸己糖旁路途径的限速步骤，并在此过程中把NADP（辅
酶Ⅱ）还原为NADPH，后者为还原型谷胱甘肽合成所必需，是红细胞抗氧化反应中的重要因
子。
前已发现400多种G6PD变异株，由150多种G6PD基因的突变引起，突变的类型和频率呈
现明显的地域或群体特异性。此病主要见于非洲、地中海沿岸、中东、亚洲、太平洋诸岛、南
美洲等疟疾曾一度流行的热带和亚热带地区，普遍认为与疟疾的抗性选择有关，但一直缺
乏足够和必要的直接证据。我国是本病的高发区之一，呈南高北低的分布特点，患病率为
0.2-44.8%。主要分布在长江以南各省，以海南、广东、广西、云南、贵州、四川等省为高。G6PD
缺乏症发病原因是由于G6PD基因突变，导致该酶活性降低，红细胞不能抵抗氧化损伤而遭
受破坏，引起溶血性贫血。
多数患者，特别是女性杂合子，平时不发病，无自觉症状，部分患者可表现为慢性溶血性贫
血症状。常因食用蚕豆、服用或接触某些药物、感染等诱发血红蛋白尿、黄疸、贫血等急性溶
血反应。因G6PD缺乏诱发的严重的急性溶血性贫血因红细胞破坏过多，如不及时处理，可
引起肝、肾、或心功能衰竭，甚至死亡。60年代在广东兴宁地区在蚕豆收获季节曾爆发G6PD
缺乏症的流行，导致许多患者的死亡。G6PD缺乏症又是新生儿病理性黄疸的主要原因。据
中山医大的一项统计表明，患G6PD缺乏症的新生儿中，约50%的患儿会出现新生儿黄疸，其
中约12%可发展为核黄疸，导致脑部损害，引起智力低下。
可有效减低新生儿核黄疸的发生。输血是本病急性发作时最有效的疗法，其次是纠正酸中
毒、处理肾衰。轻中度溶血患者一般用补液治疗。
荧光斑点和荧光分析法，其中最常用的方法为荧光分析法，该法原理为G-6-P底物在G6PD
催化下转变6PG，同时伴随发生NADPH（可发荧光）增加，通过检测NADPH的量来测定葡萄糖
6磷酸脱氢酶活性。筛查血斑标本与底物试剂G6P和NADP在室温混合30min可发生上述反
应，加入铜溶液使反应终止，用荧光仪在波长355nm激发光和波长460nm发射光下测定反应
物荧光。通过标准曲线得出未知样本和质控品中G6PD浓度（U/gHb），G6PD活性低于正常值
者为G6PD缺乏。但是荧光分析法对于贫血，溶血，凝血及陈旧的血样标本假阳性率高，准确
率低。
公司生产的改良葡萄糖-6-磷酸脱氢酶测定试剂盒（定量比值法）其原理是：G6PD催化试剂
中的葡萄糖六磷酸（6PG）生成六磷酸葡萄糖酸（6PG），伴有还原型辅酶II（NADPH）的生成，
NADPH的H在PMS的递氢作用下，将氧化型的NBT（黄色）转变为还原型NBT（蓝色）。蓝色
的深浅与NADPH的生成量成正比关系，用分光光度计650nm比色（S1）。作为G6PD的同功酶
6PGD，也有将氧化型辅酶II（NADP+）转化成NADPH的作用，同法测得NADPH的量（S2），通过
S1/S2的比值得出NADPH的相对含量。
处吸光度上升的速率，可以计算出样品中G6PD的活性。由于样品中含有6PGD，它能催化6PG
生成五磷酸核酮糖，同时也把NADP+还原成NADPH，使吸光度上升，通过分别检测G6PD+6PGD
共同作用的吸光度变化速率和G6PD单独作用的变化速率，两者相减，求出真正的葡萄糖六
磷酸脱氢酶的活性。
发明内容
低且重复性好的用于新生儿葡萄糖六磷酸脱氢酶缺乏症筛查的试剂盒。
酸葡萄糖酸酯），同时伴随发生NADPH（可发荧光）增加，NADPH可以通过荧光仪在波长355nm
激发光和波长460nm发射光下测定其荧光强度。作为G6PD同功酶的6PGD也有将NADP转
化为NADPH的作用，而人类6PGD缺乏极为罕见。通过分别检测这两种酶的荧光强度，计算
比值G6PD/6PGD，以6PGD作为内质控，若比值降低即反应G6PD活性降低，可以正确判断葡萄
糖六磷酸脱氢酶缺乏症或减少。
（2）16ml/瓶的6PG底物试剂干粉；
（3）35ml/瓶的铜试剂：用硫酸铜、酒石酸钾钠及碳酸钠制成；
（4）G6PD滤纸干血片质控品，C1 阳性，C2 阴性；
（5）35ml/瓶的底物复溶试剂：用MgCl2、双甘氨酸及Tris-Hcl制成；
（6）微孔白色反应板。
（1）制备G6P和6PG两种底物试剂干粉、底物复溶试剂、铜试剂；
（2）制备滤纸干血片质控品；
（3）分装上述底物试剂干粉、底物复溶试剂、铜试剂；
（4）贴标签；
（5）组装为成品试剂盒；
步骤（1）中，G6P底物试剂的制备是将1.2g的G6P加纯化水，充分搅拌溶解，待完全溶
解后，加入1.6 g 的NADP·Na2，补足纯化水至100ml，混匀；6PG底物试剂的制备是将1.5
g的6PG加纯化水，充分搅拌溶解，待完全溶解后，加入1.6 g 的NADP·Na2，补足纯化水至
100ml，混匀；底物复溶试剂的制备是将0.2 g Tris和 5.4 g NaCl加纯化水，充分搅拌溶
解，待完全溶解后，加入1.8 g MgCl2和2.5 g 双甘氨酸，补足纯化水至100ml，混匀；铜试
剂溶液的制备是分别将0.03gCuSO4·5H2O、0.05gNa2CO3 和0.03g酒石酸钾钠加入到装有纯
化水的容器中，待完全溶解后，补足纯化水至100ml，混匀；
步骤（2）中，所述滤纸干血片质控品的制备方法如下：将枸橼酸抗凝绵羊全血用低速
离心机3000rmp，离心 10~15min分离出血浆和红细胞。按红细胞∶血浆=1.1∶1.0调整
红细胞压积；分别加入G6PD和6PGD纯品原料，使C1全血中G6PD/6PGD＜1.0，C2全血中
G6PD/6PGD＞1.0；将C1、C2分别放在磁力搅拌器上不断搅拌，充分混匀；将裁好的 903#滤
纸悬挂在架子上，用移液器将质控品滴加到滤纸片上。取液量为50ul/血斑，对准中心滴
下，室温阴干3~4小时，不可重叠摆放，阴干后装入贮存袋，袋内放干燥剂，放入2~8℃冰箱
保存备用；
步骤（3）中将步骤（2）中配制好的G6P底物试剂、6GP底物试剂、底物复溶试剂、铜试剂
进行分装，将分装好的G6P底物试剂、6GP底物试剂利用冻干机制成冻干粉。
（1）试剂准备：G6P底物试剂干粉，6PG底物试剂干粉分别加16ml底物复溶试剂，混匀，
静置20分钟；
（2）检验操作：
（a）加样：用打孔钳从样品滤纸干血片中打下下直径为 3mm或1/8 英寸的样本两份，
打下纸片须被血液浸透，并依次分别加入G6PD和6PGD测试的空白微孔中，每孔一片，一一
对应；
（b）加入底物：向检测G6PD荧光值的微孔中加入复溶好的G6P底物试剂150µl；向检测
6PGD荧光值的微孔中加入复溶好的6PG底物试剂150µl并加贴封片；
（c）孵育：在室温下，缓慢振荡30分钟；
（d）加入铜试剂：孵育完成后，立即加入150µl/孔冷的铜试剂工作液，混匀；
（e）检测：使用对应的程序进行检测，检测工作在15分钟内完成，激发波长355nm， 发
射波长460nm；
（f）结果分析：将检测得到的G6PD的荧光值（S1）与6PGD的荧光值（S2），计算S1/S2的
值，当S1/S2≤1.0时，结果判断为阳性，当S1/S2＞1.0时，结果判断为阴性。
（1）检测：将加完铜试剂的微孔反应板使用对应的程序进行检测，检测工作在15分钟
内完成，激发波长355nm，发射波长460nm；
（2）结果分析：将检测得到的G6PD的荧光值（S1）与6PGD的荧光值（S2），计算S1/S2的
值，当S1/S2≤1.0时，结果判断为阳性，当S1/S2＞1.0时，结果判断为阴性。
片样品中G6PD/6PGD荧光比值的测定，对杂合子的检出率高，大大的降低了样品的假阳性
率，为国际首创，填补国内空白。该方法采用特定设备，测定在355nm激发光激发下产生的
460nm发射荧光信号，较传统方法测定吸光度的变化，具有本底低、准确性高、重复性好的
优点同时具有较高的敏感性和特异性；采用微孔反应板作为检测载体，操作简便省时、花费
低，特别适于对大样本进行新生儿疾病筛查，免去了传统方法单独筛查的繁琐；试剂盒在设
计中还含有阴阳性对照质控品，为产品应用过程中的质量控制提供保证；以滤纸干血片作
为样本，无需离心和洗涤等样品前处理，大大减轻工作人员的负担，而且一人份血片可同时
可应用于筛查四种先天性遗传代谢疾病(先天性甲状腺机功能减退症、先天性肾上腺皮质
增生症、苯丙酮尿症和G6PD缺乏症)，非常值得在临床上应用推广（表1）。
方法速率A法 比值终点法 样品速率空白法 荧光比值法
用途诊断蚕豆病 诊断蚕豆病 诊断蚕豆病 诊断蚕豆病
优点保存时间长 不用离心，不用检测血一年有效期，双液体，不用配制使用滤纸干血片检测，方便样本的保存运输；可以同时检测红蛋白浓度。 直接使用。不用测定血红蛋白大量样本，可用于新生儿筛查；不用测定血红蛋白浓度；可浓度。 以随到随做。
缺点需检测血红全手工操作，操作时间要求使用压积红细胞。 需要30分钟的孵育时间。
蛋白浓度。 长，试剂配制后保存时
间短。
样本用生理盐水不用 不用 不用
前处洗涤红细胞
理 三次。
杂合低 高 高 高
子检
出率
具体实施方式
Company 公司；双甘氨酸（GLY-GLY）购于Sigma公司；G6PD购自WORTHINGTON公司；6PGD购
自PROSPEC公司。
（1）G6P底物试剂干粉：用G-6-P和NADP制成分装并冻干；
（2）6PG底物试剂干粉：用6-PG和NADP制成分装并冻干；
（3）铜试剂：用硫酸铜、酒石酸钾钠及碳酸钠制成；
（4）G6PD滤纸干血片质控品，C1 阳性， C2 阴性：用含抗凝绵羊全血红细胞制备成滤纸
干血片；
（5）底物复溶试剂：用MgCl2、Gly-Gly（双甘氨酸）及Tris-Hcl制成。
和6PGD纯品原料，使C1全血中G6PD/6PGD＜1.0，C2全血中G6PD/6PGD＞1.0。将C1、C2
分别放在磁力搅拌器上不断搅拌（避免产生气泡），充分混匀。将裁好的 903#滤纸悬挂在架
子上，用移液器将质控品滴加到滤纸片上。取液量为50ul/血斑，对准中心滴下。室温阴干
（3～4小时），不可重叠摆放。阴干后装入贮存袋（袋内放干燥剂），放入2～8℃冰箱可保
存备用。
解。待完全溶解后，加入1.6g 的NADP·Na2，补足纯化水至100ml，混匀。分装冻干即可。
可。
机3000rmp，离心 10～15min分离出血浆和红细胞。按比例（红细胞∶血浆=1.1∶1.0）
调整红细胞压积；分别加入G6PD和6PGD纯品原料，使C1全血中G6PD/6PGD＜1.0，C2全
血中G6PD/6PGD＞1.0。将C1、C2分别放在磁力搅拌器上不断搅拌（避免产生气泡），充分
混匀。将裁好的 903#滤纸悬挂在架子上，用移液器将质控品滴加到滤纸片上。取液量为
50ul/血斑，对准中心滴下。室温阴干（3～4小时），不可重叠摆放。阴干后装入贮存袋（袋
内放干燥剂），放入2～8℃冰箱可保存备用。
（8）成品组装。
后才能出厂。
试剂准备：
底物的复溶：G6P底物试剂干粉，6PG底物试剂干粉分别加16ml底物复溶试剂，混匀，静
置20分钟；
铜试剂的冷却：试剂使用前须放入4℃冰箱中冷却备用。
下纸片须被血液浸透)，并依次分别加入G6PD和6PGD测试的空白微孔中，每孔一片，一一对
应。控制打孔的一致性，使纸片尽量一致。
下：
灵敏度：测定由公司实验室建立的阳性参考品1套。阳性参考品为经临床检测确定为
G6PD缺陷症患者的标本，由100份标本组成。
检测结果 100 0
通过上表继续可得阳性符合率为100%。
检测确定G6PD正常的标本，由100份标本组成。
检测结果 0 100
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